CN110627937B - 仿细胞膜聚合物的制备方法、及其修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种仿细胞膜聚合物的制备方法，包括以下步骤：（1）制备2‑溴‑2‑甲基丙酸‑4‑甲酰基苯酯；（2）制备仿细胞膜聚合物；同时，本发明还公开所述仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖‑金自组装载药纳米粒子的制备方法及其应用，制备方法包括以下步骤：将壳聚糖溶于醋酸‑氨水缓冲溶液中，然后向其中加入氯金酸和药物，混合搅拌；在匀速搅拌状态下，将其中滴加交联剂，搅拌；再加入所述仿细胞膜聚合物，搅拌；离心，将离心得到的沉淀用超纯水洗涤，然后超声分散，冷冻干燥，得到仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖‑金自组装载药纳米粒子。本发明提供的仿细胞膜聚合物，能修饰制备壳聚糖‑金自组装载药纳米粒子，兼具诊断、治疗肿瘤的双功能。

Description

仿细胞膜聚合物的制备方法、及其修饰壳聚糖-金自组装载药 纳米粒子的制备方法和应用
技术领域
本发明属于高分子生物医学材料技术领域，具体涉及仿细胞膜聚合物的制备方法、及其修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法和应用。
背景技术
壳聚糖是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体通过 β-l，4-糖苷键连接起来的直链状高分子化合物，在分子中的C-2，C-3和C-6位置上分别有一个氨基基团和两个羟基基团。可与其他阴离子型高分子通过离子键联接形成网状结构的大分子，如果将药物包埋于其中或者共价联接于其上，可以形成载体和药物的复合体系。与其它高分子物质相比，壳聚糖作为载体材料还具有以下优点：(1) 良好的生物相容性、可降解性和出色的细胞膜穿透性，并且降解产物无毒；(2)可通过其分子中的羟基和胺基将其改性为两亲性分子，有利于同时提高对疏水的或亲水的药物的亲和性，促进药物在体液中的溶解度；(3) 可以通过细胞的胞吞作用而使药物穿过细胞膜，进入细胞质中；(4) 通过增强渗透和潴留效应( Enchancedpermeability and retention effect，EPR)，提高药物的组织选择性，减少药物的毒副作用；(5) 载体中的药物( 含靶向因子) 进入体内后可通过靶向因子使药物准确地作用于靶点组织。正由于上述诸多优点，越来越多的研究者们对以壳聚糖为载体的纳米载药系统开展了广泛研究。壳聚糖又是一种阳离子多糖材料，而通常肿瘤细胞具有比正常细胞表面更多的负电荷，因此，壳聚糖微球对肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用，还具有一定的直接抑制肿瘤细胞的作用，通过活化免疫系统显示具有抗癌活性，与现有的抗癌药物合用可增强药物的抗癌效果。因此，壳聚糖微球是抗癌药物的理想载体，近年来受到广泛关注。
纳米金(Au NPs)是指金的微小颗粒，其直径在 1-100 nm，属于典型的等离子体纳米颗粒。在众多的无机纳米颗粒中，金纳米颗粒脱颖而出，因为其优于其它材料的一些特点在生物医药领域应用广泛：(I) Au NPs的合成方法简单高效，可大量合成不同形状、不同粒径的 Au NPs；且制备过程一般以水为介质，使得 Au NPs 在生物医学领域的应用更方便；(II)与其他的金属纳米颗粒相比，Au NPs 的化学惰性更具优势，其生物相容性更适用于生物体。研究表明，在临床试验允许的剂量浓度范围内，Au NPs 对多种类型的细胞都未表现出明显的生物毒性或生物免疫反应；(III) Au NPs 的形状、粒径、表面化学易于调控，以最大程度地提高目标细胞对Au NPs 的内吞率；(IV) Au NPs易于化学修饰，可在其表面键接(如Au-S)其他的功能分子，包括治疗药物、靶向分子或具有良好生物相容性的生物试剂。基于以上优势，Au NPs 在生物成像、药物负载、生物传感、肿瘤治疗等领域都得到广泛关注。
发明内容
为了解决现有技术中纳米运输载体功能单一的问题，实现纳米药物运输载体对于肿瘤的同时诊断以及治疗，本发明提供一种仿细胞膜聚合物的制备方法、所述仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法和应用。
仿细胞膜聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯：将溴代异丁酰溴的二氯甲烷溶液预冷至0℃，在N2环境下，向其中逐滴加入含有0.8mmol/mL羟基苯甲醛和1.6mmol/mL三乙胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后室温下反应24h，过滤，滤液用1 mol/L的盐酸溶液和饱和碳酸钠溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，真空浓缩，将得到的固体用正己烷重结晶，得白色微晶，真空干燥；
（2）制备仿细胞膜聚合物：在Schlenk反应瓶中加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、配体2,2’-联吡啶、引发剂2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯、甲醇，冷冻抽气3次，然后在液氮环境下打开充气阀，向反应瓶中加入CuBr后关闭反应瓶，冷冻抽气三次，在25℃的水浴条件下反应16h，然后用丙酮进行沉淀，将沉淀物用超纯水溶解后置于截留分子量为1000Da的透析袋中透析，将透析得到的截留物冷冻干燥，即得到苯甲醛封端的仿细胞膜聚合物。
优选地，步骤（1）中所述羟基苯甲醛、溴代异丁酰溴、三乙胺的摩尔比为1:1.1:2。
优选地，步骤（2）中所述2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、2,2’-联吡啶、2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯、CuBr投加的摩尔比为30:2:1:1。
仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（一）将壳聚糖溶于pH=7.4的醋酸-氨水缓冲溶液中，然后向其中加入氯金酸和药物，混合搅拌1-2h；
（二）在匀速搅拌状态下，将向步骤（一）的混合溶液中滴加交联剂，室温搅拌12-24h；
（三）将所述仿细胞膜聚合物加入步骤（二）得到的混合溶液中，室温搅拌12-24h；
（四）离心，将离心得到的沉淀用超纯水洗涤，然后超声分散，冷冻干燥，得到仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子；
其中，所述仿细胞膜聚合物是通过上述制备方法制备得到的；
所述壳聚糖是分子量低于6000的低分子量水溶性壳聚糖。
优选地，所述药物为疏水性药物；
更优选地，所述药物为阿霉素或紫杉醇。
优选地，所述交联剂为戊二醛、三聚磷酸钠、京尼平中的至少一种。
优选地，所述壳聚糖与氯金酸的摩尔比为10：（1-5），所述壳聚糖、药物、仿细胞膜聚合物的质量比为10：（1-4）：（5-30），所述壳聚糖与交联剂的质量比为10：(0.5-2)，所述壳聚糖与缓冲液的投加比例为2mg：1mL。
优选地，所述离心的转速为4000-8000rpm、时间为5-30min。
优选地，步骤（二）中所述滴加的滴速为40~160 μL/min。
仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子在生物医学中的应用，其中，所述应用为制备诊断和治疗肿瘤的药物，或者细胞成像试剂；其中，所述仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子是通过上述制备方法制备得到的。
本发明制备的仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子为核壳结构，其中，核层为以交联的壳聚糖作为载体包裹药物和纳米金粒子的载药纳米粒子，壳层为仿细胞膜聚合物包覆的亲水层。
本发明的优点：
本发明提供的苯甲醛封端的仿细胞膜聚合物，能修饰制备壳聚糖-金自组装载药纳米粒子，所述纳米粒子对药物进行包载，壳聚糖对肿瘤低pH环境相应进而对其释药行为进行控制，同时，纳米金的荧光特性使所述纳米粒子能细胞成像，所以，制备得到的仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子兼具诊断、治疗肿瘤的双功能。
附图说明
图1 是仿细胞膜聚合物的核磁共振氢谱图。
图2 是仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的透射电镜图。
图3 是仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的体外药物释放曲线。
图4 是仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子与宫颈癌细胞（Hela）共孵育12小时后激发共聚焦荧光图。
具体实施方式
实施例1
仿细胞膜聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯：三口圆底烧瓶中，依次加入溴代异丁酰溴的二氯甲烷溶液15mL，预冷至0℃，在N2环境下，20min内向其中逐滴加入含有0.8mmol/mL羟基苯甲醛和1.6mmol/mL三乙胺的二氯甲烷溶液24.5mL，滴加完毕后室温下反应24h，过滤，滤液用75mL 、1 mol/L的盐酸溶液和150mL饱和碳酸钠溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，真空浓缩，将得到的固体用正己烷重结晶，得白色微晶，真空干燥；其中，所述羟基苯甲醛、溴代异丁酰溴、三乙胺的摩尔比为1:1.1:2；
（2）制备仿细胞膜聚合物：在Schlenk 反应瓶中加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱4.2 mmol、配体2,2’-联吡啶0.28 mmol、引发剂2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯0.14mmol、甲醇6mL, 冷冻抽气3次，然后在液氮环境下打开充气阀，向反应瓶中加入CuBr 0.14mmol后关闭反应瓶，冷冻抽气三次，在25℃的水浴条件下反应16h，然后用丙酮进行沉淀，将沉淀物用超纯水溶解后置于透析袋中透析，将透析得到的截留物冷冻干燥，即得到苯甲醛封端的仿细胞膜聚合物，其结构式如下：
Figure 1553DEST_PATH_IMAGE001
。
称重法确定原料转化率为86.76%，凝胶渗透色谱（GPC）测定所得苯甲醛封端的仿细胞膜聚合物的分子量为5971 g/mol，分散度为1.17。
以氘水为去质子化溶剂测定苯甲醛封端的仿细胞膜聚合物的1H NMR核磁图谱，如图1所示，化学位移值为7.32 ppm、7.95 ppm和10.01ppm处的出峰为聚合物末端苯甲醛上氢的特征峰，化学位移3.25 ppm为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱中季铵盐上甲基氢的特征峰，3.8ppm以及4.0-4.4ppm处的出峰为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱中亚甲基上氢的特征峰。
实施例2
仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（一）将壳聚糖溶于pH=7.4的醋酸-氨水缓冲溶液中，然后向其中加入氯金酸和药物阿霉素，混合搅拌2h；
（二）在匀速搅拌状态下，将向步骤（一）的混合溶液中滴加交联剂，滴加的滴速为100 μL/min，室温搅拌12h；所述交联剂为三聚磷酸钠和京尼平按照质量比2:1形成的混合物；
（三）将所述仿细胞膜聚合物加入步骤（二）得到的混合溶液中，室温搅拌12h；
（四）将步骤（三）的产物在8000rpm的转速下离心15min，将离心得到的沉淀用超纯水洗涤，然后超声分散，冷冻干燥，得到仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子；
其中，所述壳聚糖与氯金酸的摩尔比为10：3，所述壳聚糖、药物、仿细胞膜聚合物的质量比为10：2：10，所述壳聚糖与交联剂的加入比例为 10:2；所述壳聚糖与缓冲液的投加比例为2mg：1mL；
所述仿细胞膜聚合物是实施例1制备得到的；
所述壳聚糖是分子量低于6000的低分子量水溶性壳聚糖。
制备得到的仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子，其粒径为158.9±1.3 nm，分散系数为0.124±0.032，电位为25.5±1.2 mV，载药量为14.6%，包封率为51.0%，含金量为12.5%。
将制备得到的仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子做透射电镜，由图2可知，所述纳米粒子成球状，具有明显的核壳结构。
实施例3
仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（一）将壳聚糖溶于pH=7.4的醋酸-氨水缓冲溶液中，然后向其中加入氯金酸和药物紫杉醇，混合搅拌1h；
（二）在匀速搅拌状态下，将向步骤（一）的混合溶液中滴加交联剂，滴加的滴速为40 μL/min，室温搅拌24h；所述交联剂为戊二醛；
（三）将所述仿细胞膜聚合物加入步骤（二）得到的混合溶液中，室温搅拌24h；
（四）将步骤（三）的产物在4000rpm的转速下离心30min，将离心得到的沉淀用超纯水洗涤，然后超声分散，冷冻干燥，得到仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子；
其中，所述壳聚糖与氯金酸的摩尔比为10：5，所述壳聚糖、药物、仿细胞膜聚合物的质量比为10：4：30，所述壳聚糖与交联剂的质量比为10：1，所述壳聚糖与缓冲液的投加比例为2mg：1mL；
所述仿细胞膜聚合物是实施例1制备得到的；
所述壳聚糖是分子量低于6000的低分子量水溶性壳聚糖。
制备得到的仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子，其粒径156.1±1.8 nm，分散系数为0.150±0.011，电位为27.4±0.6 mV，载药量为10.5 %，包封率为52.5%，含金量为11.9 %。
实施例4
仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（一）将壳聚糖溶于pH=7.4的醋酸-氨水缓冲溶液中，然后向其中加入氯金酸和药物阿霉素，混合搅拌2h；
（二）在匀速搅拌状态下，将向步骤（一）的混合溶液中滴加交联剂，滴加的滴速为160 μL/min，室温搅拌18h；所述交联剂为三聚磷酸钠；
（三）将所述仿细胞膜聚合物加入步骤（二）得到的混合溶液中，室温搅拌18h；
（四）将步骤（三）的产物在6000rpm的转速下离心5min，将离心得到的沉淀用超纯水洗涤，然后超声分散，冷冻干燥，得到仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子；
其中，所述壳聚糖与氯金酸的摩尔比为10：1，所述壳聚糖、药物、仿细胞膜聚合物的质量比为10：1：5，所述壳聚糖与交联剂的质量比为10：0.5，所述壳聚糖与缓冲液的投加比例为2mg：1mL；
所述仿细胞膜聚合物是实施例1制备得到的；
所述壳聚糖是分子量低于6000的低分子量水溶性壳聚糖。
制备得到的仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子，其粒径176.2±0.5 nm，分散系数为0.077±0.014，电位为23.4±0.4 mV，载药量为7.7 %，包封率为23.5%，含金量为9.2 %。
对比例
不添加氯金酸，其他同实施例2，制备仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：
仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
（一）将壳聚糖溶于pH=7.4的醋酸-氨水缓冲溶液中，然后向其中加入药物阿霉素，混合搅拌2h；
（二）在匀速搅拌状态下，将向步骤（一）的混合溶液中滴加交联剂，滴加的滴速为100 μL/min，室温搅拌12h；所述交联剂为三聚磷酸钠和京尼平按照质量比2:1形成的混合物；
（三）将所述仿细胞膜聚合物加入步骤（二）得到的混合溶液中，室温搅拌12h；
（四）将步骤（三）的产物在8000rpm的转速下离心15min，将离心得到的沉淀用超纯水洗涤，然后超声分散，冷冻干燥，得到仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子；
其中，所述壳聚糖与氯金酸的摩尔比为10：3，所述壳聚糖、药物、仿细胞膜聚合物的质量比为10：2：10，所述壳聚糖与交联剂的加入比例为 10:2；所述壳聚糖与缓冲液的投加比例为2mg：1mL；
所述仿细胞膜聚合物是实施例1制备得到的；
所述壳聚糖是分子量低于6000的低分子量水溶性壳聚糖。
一. 性能检测
1. 体外药物释放曲线：
选择DOX为模型药物，将实施例2和对比例得到的纳米粒子分别在生理条件（pH7.4）以及模拟肿瘤组织的酸性条件（pH 4.0）进行体外药物释放实验；结果见图3；
由图3可知，实施例2所得载药纳米粒子药物释放行为具有pH敏感性：在生理条件下释放较慢，在模拟肿瘤组织的酸性条件则加快释放，这一行为有利于杀灭肿瘤细胞，且减小对正常细胞的伤害；结果同时表明含有金的纳米粒子（实施例2）相对于不含金的纳米粒子（对比例）具有较低的累积释放率，这将有利于提高对于肿瘤的治疗效果。
2. 细胞成像
利用含有实施例2制备的仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的DMEM培养基来培养宫颈癌细胞（Hela），培养12小时，培养结果见图4，可以清楚的观察到Hela细胞的形态和高度聚集的红色荧光，在Hela细胞中可以很容易观察到来自仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的明亮红色荧光，表明Hela细胞被成功标记。由此可知，仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子具有明亮的红色荧光，可用作高对比度肿瘤细胞成像试剂，用于肿瘤细胞成像以及诊断。

Claims (7)

1.仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（一）将壳聚糖溶于pH=7.4的醋酸-氨水缓冲溶液中，然后向其中加入氯金酸和药物，混合搅拌1-2h；
（二）在匀速搅拌状态下，将向步骤（一）的混合溶液中滴加交联剂，室温搅拌12-24h；
（三）将所述仿细胞膜聚合物加入步骤（二）得到的混合溶液中，室温搅拌12-24h；
（四）离心，将离心得到的沉淀用超纯水洗涤，然后超声分散，冷冻干燥，得到仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子；
其中，所述仿细胞膜聚合物是通过以下方法制备得到的：
（1）制备2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯：将溴代异丁酰溴的二氯甲烷溶液预冷至0℃，在N2环境下，向其中逐滴加入含有0.8mmol/mL羟基苯甲醛和1.6mmol/mL三乙胺的二氯甲烷溶液，滴加完毕后室温下反应24h，过滤，滤液用1 mol/L的盐酸溶液和饱和碳酸钠溶液洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，真空浓缩，将得到的固体用正己烷重结晶，得白色微晶，真空干燥；
（2）制备仿细胞膜聚合物：在Schlenk反应瓶中加入2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、配体2,2’-联吡啶、引发剂2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯、甲醇，冷冻抽气3次，然后在液氮环境下打开充气阀，向反应瓶中加入CuBr后关闭反应瓶，冷冻抽气三次，在25℃的水浴条件下反应16h，然后用丙酮进行沉淀，将沉淀物用超纯水溶解后置于截留分子量为1000Da的透析袋中透析，将透析得到的截留物冷冻干燥，即得到苯甲醛封端的仿细胞膜聚合物；
所述壳聚糖是分子量低于6000的低分子量水溶性壳聚糖；
所述药物为疏水性药物；
所述壳聚糖与氯金酸的摩尔比为10：（1-5），所述壳聚糖、药物、仿细胞膜聚合物的质量比为10：（1-4）：（5-30），所述壳聚糖与交联剂的质量比为10：(0.5-2)，所述壳聚糖与缓冲液的投加比例为2mg：1mL。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述羟基苯甲醛、溴代异丁酰溴、三乙胺的摩尔比为1:1.1:2。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、2,2’-联吡啶、2-溴-2-甲基丙酸-4-甲酰基苯酯、CuBr投加的摩尔比为30:2:1:1。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述药物为阿霉素或紫杉醇。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述交联剂为戊二醛、三聚磷酸钠、京尼平中的至少一种。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述离心的转速为4000-8000rpm、时间为5-30min。
7.仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子在生物医学中的应用，其特征在于：所述应用为制备诊断和治疗肿瘤的药物，或者细胞成像试剂；其中，所述仿细胞膜聚合物修饰壳聚糖-金自组装载药纳米粒子是通过权利要求1所述制备方法制备得到的。
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