CN106459177B - 高亲和力ny-eso t细胞受体 - Google Patents

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Abstract

提供了一种T细胞受体(TCR)及其与治疗剂的融合分子，所述TCR对SLLMWITQC‑HLA A2复合物的结合亲和力是野生型TCR的至少两倍，所述TCR可以单独使用，也可与治疗剂联用。

Description

高亲和力NY-ESO T细胞受体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及能够特异性识别衍生自NY-ESO-1蛋白多肽的T细胞受体(T cell receptor，TCR)。本发明还涉及所述受体的制备和用途。
背景技术
仅仅有两种类型的分子能够以特异性的方式识别抗原。其中一种是免疫球蛋白或抗体；另一种是T细胞受体(TCR)，它是由α链/β链或者γ链/δ链以异二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。免疫系统的TCR总谱的组成是在胸腺中通过V(D)J重组，然后进行阳性和阴性选择而产生的。在外周环境中，TCR介导了T细胞对主组织相容性复合体-肽复合物(pMHC)的特异性识别，因此其对免疫系统的细胞免疫功能是至关重要的。
TCR是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体，这种外源肽或内源肽可能会是细胞出现异常的唯一迹象。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
与TCR相对应的MHC I类和II类分子配体也是免疫球蛋白超家族的蛋白质但对于抗原的呈递具有特异性，不同的个体有不同的MHC，从而能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。
短肽SLLMWITQC源自于被多种肿瘤细胞表达的NY-ESO-1蛋白(Chen et al.，(1997)PNAS USA 94 1914-1918)。肿瘤细胞的I型HLA分子呈递包括SLLMWITQC在内的源自于NY-ESO-1的短肽。因此，SLLMWITQC-HLA A2复合物提供了一种TCR可靶向肿瘤细胞的标记。能够特异性结合SLLMWITQC-HLA A2复合物的TCR对肿瘤的治疗具有很高的应用价值。例如，能够靶向该肿瘤细胞标记的TCR可用于将细胞毒性剂或免疫刺激剂递送到靶细胞，或被转化入T细胞，使表达该TCR的T细胞能够破坏肿瘤细胞，以便在被称为过继免疫治疗的治疗过程中给予患者。对于前一目的，理想的TCR是具有较高的亲和力的，从而使该TCR能够长期驻留在所靶向的细胞上面。对于后一目的，则优选使用中等亲和力的TCR。因此，本领域技术人员致力于开发可用于满足不同目的的靶向肿瘤细胞标记的TCR。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对SLLMWITQC-HLA A2复合物具有较高亲和力的TCR。
本发明的再一目的是提供一种上述类型TCR的制备方法及上述类型TCR的用途。
本发明的第一方面，提供了一种T细胞受体(TCR)，其具有结合SLLMWITQC-HLA A2复合物的特性，并包含TCRα链可变域和/或TCRβ链可变域，相对于具有α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：75和β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：76的TCR：
(i)所述TCR在SEQ ID NO：75所示其α链可变域氨基酸和/或在SEQ ID NO：76所示其β链可变域氨基酸中发生突变；和
(ii)所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力是野生型TCR对SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力的至少两倍。
在另一优选例中，所述突变发生在α链和/或β链的一个或多个CDR区中。
在另一优选例中，所述突变发生在α链的CDR1和/或CDR3中，和/或所述突变发生在β链的CDR2和/或CDR3中。
在另一优选例中，所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力是野生型TCR对SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力的至少10倍；优选地至少20倍；更优选地，至少100倍。
在另一优选例中，所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的解离平衡常数KD≤3.2μM。
在另一优选例中，所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的解离平衡常数0.5μM≤KD≤3.2μM；优选地，1μM≤KD≤3.2μM；更优选地，1μM≤KD≤2μM。
在另一优选例中，所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的解离平衡常数KD≤500nM；优选地，10pM≤KD≤500nM。更优选地，10pM≤KD≤10nM。
在另一优选例中，所述突变发生在SEQ ID NO：75所示其α链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：27T、28S、29I、30N、51S、53E、54R、55E、91T、94A、95G、96K、97S和98T，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：75所示的编号；和/或
所述突变发生在SEQ ID NO：76所示其β链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：50N、51N、52N、53V、54P、95T、97G、98A、99Q、100P、101Q和102H，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
在另一优选例中，突变后的所述TCRα链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：27Y、27W、27H、27F或27N；28T、28Y、28D、28P、28N或28W；29P、29L、29T、29V或29A；30Q；51N；53S；54Q；55T；91N；94T、94N、94H、94I或94S；95A或95S；96R或96W；97W；98N、98D或98A；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：75所示的编号；和/或
突变后的所述TCRβ链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：50C或50Y；51H或51L；52G；53L；54V或54I；95S；97N；98G或98S；99N或99L；100A；101I；102V或102I；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
在另一优选例中，所述TCR的α链可变域氨基酸序列选自：SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90；和/或
所述TCR的β链可变域氨基酸序列选自：SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74。
在另一优选例中，所述TCR包括下表所示的α和β链可变域组合：
在另一优选例中，所述TCR是αβ异质二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，所述α和β链恒定域序列中具有半胱氨酸残基(所述半胱氨酸残基可以为天然的半胱氨酸残基或人工引入的半胱氨酸残基)，所述半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成二硫键。
在另一优选例中，所述二硫键为人工二硫键。
在另一优选例中，在所述TCR中，形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：
TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；
TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；
TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；和
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。
在另一优选例中，所述TCRα链可变域和/或β链可变域的疏水芯发生突变。
在另一优选例中，所述TCR是由α链可变域和β链可变域组成的单链TCR，所述α链可变域和β链可变域由一柔性短肽序列(linker)连接。
在另一优选例中，所述TCR的疏水芯突变发生在SEQ ID NO：75所示α链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：13I、19A、21M和79S；其中，氨基酸残基编号采用SEQID NO：75所示的编号；和/或
所述疏水芯突变发生在SEQ ID NO：76所示β链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：11E、13T和82S，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
在另一优选例中，疏水芯突变后的所述TCR的α链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：13V、19V、21I和79V，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：75所示的编号；和/或
疏水芯突变后的所述TCR的β链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：11L、13V和82V；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
在另一优选例中，所述TCR的α链可变域氨基酸序列选自：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、89；和/或
所述TCR的β链可变域氨基酸序列选自：SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33。
在另一优选例中，所述TCR包括下表所示的α和β链可变域组合：
在另一优选例中，所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。
在另一优选例中，与所述T细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合。
在另一优选例中，与所述T细胞受体结合的治疗剂为连接于所述TCR的α或β链的C-或N-末端的抗-CD3抗体。
在另一优选例中，所述与抗-CD3抗体结合的TCR的α链可变域氨基酸序列选自：SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、89、90；和/或
所述与抗-CD3抗体结合的TCR的β链可变域氨基酸序列选自：SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74。
在另一优选例中，所述TCRβ链与抗-CD3抗体结合后的氨基酸序列选自下组SEQ IDNO：100和101。
在另一优选例中，所述TCR与抗-CD3抗体结合后的氨基酸序列选自下组：SEQ IDNO：92、93、94、95、96、97、98和99。
本发明的第二方面，提供了一种多价TCR复合物，包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为本发明第一方面所述的TCR。
本发明的第三方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的TCR分子或者本发明第二方面所述的多价TCR复合物的核酸序列或其互补序列；
本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的所述的核酸分子。
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第四方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第三方面所述的核酸分子。
本发明的第六方面，提供了一种分离的细胞，所述细胞表达本发明第一方面所述的TCR。
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面所述的TCR、或本发明第二方面所述的TCR复合物、或本发明第六方面所述的细胞。
本发明的第八方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第一方面所述的TCR、或本发明第二方面所述的TCR复合物、或本发明第六方面所述的细胞、或本发明第七方面所述的药物组合物。
本发明的第九方面，提供了本发明第一方面所述的TCR、或本发明第二方面所述的TCR复合物、或本发明第六方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的T细胞受体的方法，包括步骤：
(i)培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第一方面所述的T细胞受体；
(ii)分离或纯化出所述的T细胞受体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1a-图1u分别显示了对SLLMWITQC-HLA A2复合物具有高亲和力的单链TCR的α链可变域氨基酸序列，突变的残基以黑体加下划线表示。
图2a-图2q分别显示了对SLLMWITQC-HLA A2复合物具有高亲和力的单链TCR的β链可变域氨基酸序列，突变的残基以黑体加下划线表示。
图3a-图3u分别显示了对SLLMWITQC-HLA A2复合物具有高亲和力的αβ异质二聚TCR的α链可变域氨基酸序列，突变的残基以黑体加下划线表示。
图4a-图4q分别显示了对SLLMWITQC-HLA A2复合物具有高亲和力的αβ异质二聚TCR的β链可变域氨基酸序列，突变的残基以黑体加下划线表示。
图5a和图5b分别显示了对SLLMWITQC-HLA A2复合物能够特异性结合的野生型TCRα与β链可变域氨基酸序列。
图6a和图6b分别显示了对SLLMWITQC-HLA A2复合物能够特异性结合的野生型TCRα与β链的胞外氨基酸序列。
图7a和图7b分别显示了参比TCRα与β链的胞外氨基酸序列。
图8a和图8b分别显示了单链模板TCRα链与β链可变域氨基酸序列。
图9a和图9b分别显示了单链模板TCRα链与β链可变域DNA序列。
图10a和图10b分别显示了分别显示了柔性连接短肽(linker)的氨基酸序列和DNA序列。
图11a和图11b分别显示了作为模板链的稳定性单链TCR分子的氨基酸序列和DNA序列。
图12显示了参比TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物的Biacore相互作用曲线。
图13a和13b分别显示了在单链TCR分子(α链可变域SEQ ID NO：2和β链可变域SEQID NO：27)N和C端与抗-CD3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
图14a和14b分别显示了在单链TCR分子(α链可变域SEQ ID NO：1和β链可变域SEQID NO：30)N和C端与抗-CD3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
图15a和15b分别显示了在单链TCR分子(α链可变域SEQ ID NO：89和β链可变域SEQID NO：26)N和C端与抗-CD3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
图16a和16b分别显示了在单链TCR分子(α链可变域SEQ ID NO：89和β链可变域SEQID NO：27)N和C端与抗-CD3scFv融合的融合分子的氨基酸序列。
图17显示了抗-CD3的scFv与αβ异质二聚TCR的β链(其可变域氨基酸序列为SEQ IDNO：69)融合的融合分子的氨基酸序列。
图18显示了抗-CD3的scFv与αβ异质二聚TCR的β链(其可变域氨基酸序列为SEQ IDNO：70)融合的融合分子的氨基酸序列。
图19和图20显示了本发明高亲和力单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子对效应细胞的激活作用。
图21-25显示了本发明高亲和力TCR与抗-CD3抗体的融合分子对效应细胞的特异性激活作用。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种识别SLLMWITQC短肽(衍生自NY-ESO-1蛋白)的高亲和性T细胞受体(TCR)，所述SLLMWITQC短肽以肽-HLA A2复合物的形式被呈递。相对于能够识别SLLMWITQC-HLA A2复合物的野生型TCR，本发明TCR在其α链可变域和/或β链可变域发生突变，并且本发明TCR对上述SLLMWITQC-HLA A2复合物的亲和力和/或结合半衰期是野生型TCR的至少两倍。
术语
T细胞受体(T cell receptor，TCR)
可以采用国际免疫遗传学信息系统(IMGT)来描述TCR。本领域技术人员知悉该系统的公开数据库。天然αβ异源二聚TCR具有α链和β链。广义上讲，各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。通过独特的IMGT的TRAJ和TRBJ确定TCR的连接区，通过IMGT的TRAC和TRBC确定TCR的恒定区。
各可变区包含嵌合在框架序列中的3个CDR(互补决定区)，其中一个是CDR3，由可变区和连接区重组而成，被称为超变区。根据框架、CDR1和CDR2序列以及部分确定的CDR3序列，α链可变区(Vα)可分成几类，β链可变区(Vβ)也分成几类。在IMGT命名法中，TRAV和TRBV的不同编号分别指代不同Vα类型和Vβ的类型。在IMGT系统中，α链恒定结构域具有以下的符号：TRAC*01，其中“TR”表示T细胞受体基因；“A”表示α链基因；C表示恒定区；“*01”表示等位基因1。β链恒定结构域具有以下的符号：TRBC1*01或TRBC2*01，其中“TR”表示T细胞受体基因；“B”表示β链基因；C表示恒定区；“*01”表示等位基因1。在β链的形式中，存在两个可能的恒定区基因“C1”和“C2”。
TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域。可变域由连接的可变区和连接区构成。因此，在本申请的说明书和权利要求书中，“TCRα链可变域”指连接的TRAV和TRAJ区，“TCRα链恒定域”指胞外TCRα链恒定区或C-末端截短的TCRα链恒定区。同样地，“TCRβ链可变域”指连接的TRBV和TRBD/TRBJ区，“TCRβ链恒定域”指胞外TCRβ链恒定区或C-末端截短的TCRβ链恒定区。
对SLLMWITQC-HLA A2复合物能够特异性结合的野生型TCR(本发明中简称为“野生型TCR”)的α与β链可变区在IMGT中具有下列编号：
α链：TRAV17
β链：TRBV12-4
野生型TCR的α与β链可变域氨基酸序列(SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：76)如图5所示，其α与β链胞外氨基酸序列(SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78)如图6所示。
发明详述
本发明提供具有结合SLLMWITQC(SEQ ID NO：91)HLA-A2复合物特性的包含TCRα可变域和/或TCRβ可变域的T细胞受体(TCR)，相对于具有α链和β链可变域氨基酸序列SEQ IDNO：75和SEQ ID NO：76的TCR，其特征在于，(i)所述TCR在SEQ ID NO：75所示其α链可变域氨基酸和/或在SEQ ID NO：76所示其β链可变域氨基酸中发生突变；和(ii)所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的亲和力是野生型TCR对SLLMWITQC-HLA A2复合物的亲和力的至少两倍。其中，在上述(i)中α链可变域和/或β链可变域氨基酸残基中的突变发生在α和/或β可变域的一个或多个互补决定区(CDR)中，所述突变能够使本发明TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的相互作用力更高和/或解离速率更慢。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的T细胞受体(TCR)，相对于具有α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：75和β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：76的TCR：
(i)所述TCR在SEQ ID NO：75所示其α链可变域氨基酸和/或在SEQ ID NO：76所示其β链可变域氨基酸中发生突变；和
(ii)所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力是野生型TCR对SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力的至少两倍。
根据本领域技术人员熟知的定点突变的方法，将野生型TCR的胞外α链恒定区的157T(即，IMGT中TRAC的48T)突变为157C，β链恒定区的169S(即，IMGT中TRBC1的57S)突变为169C，即得到参比TCR，其氨基酸序列分别如图7a和7b所示，突变后的半胱氨酸残基以加粗字母表示。上述半胱氨酸取代能使参比TCR的α与β链的恒定区之间形成人工链间二硫键，以形成更加稳定的可溶性TCR，从而能够更加方便地评估TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力和/或结合半衰期。应理解，TCR可变区的CDR区决定了其与pMHC复合物之间的亲和力，因此，上述TCR恒定区的半胱氨酸取代并不会对TCR的结合亲和力和/或结合半衰期产生影响。所以，本发明中测得的参比TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力即为野生型TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力。同样地，如果测得本发明TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力是参比TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力的至少两倍，即等同于本发明TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力是野生型TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力的至少两倍。
可通过任何合适的方法测定结合亲和力(与解离平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)。应了解，TCR的亲和力翻倍将导致KD减半。T1/2计算为In2除以解离速率(Koff)。因此，T1/2翻倍会导致Koff减半。优选采用相同的试验方案检测给定TCR的结合亲和力或结合半衰期数次，例如3次或更多，取结果的平均值。在优选的实施方式中，采用本文实施例中的表面等离振子共振(BIAcore)方法进行这些检测。该方法检测到参比TCR对SLLMWITQC-HLA A2复合物的解离平衡常数KD为6.4μM，即野生型TCR对SLLMWITQC-HLA A2复合物的解离平衡常数KD也为6.4μM。
可采用任何合适的方法进行突变，包括但不限于依据聚合酶链式反应(PCR)的那些、依据限制性酶的克隆或不依赖连接的克隆(LIC)方法。许多标准分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(PCR)诱变和依据限制性酶的克隆的更多细节可参见Sambrook和Russell，(2001)分子克隆-实验室手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版)CSHL出版社。LIC方法的更多信息可见(Rashtchian，(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1)：30-6)。
产生本发明的TCR的方法可以是但不限于从展示此类TCR的噬菌体颗粒的多样性文库中筛选出对SLLMWITQC-HLA-A2复合物具有高亲和性的TCR，如文献(Li，et al(2005)Nature Biotech 23(3)：349-354)中所述。
应理解，表达野生型TCRα和β链可变域氨基酸的基因或者表达略作修饰的野生型TCR的α和β链可变域氨基酸的基因都可用来制备模板TCR。然后在编码该模板TCR的可变域的DNA中引入产生本发明的高亲和力TCR所需的改变。
在本发明的一些优选实施方式中，本发明TCR在SEQ ID NO：75所示的α链可变域氨基酸残基27T、28S、29I、30N、51S、53E、54R、55E、91T、94A、95G、96K、97S和98T中有一个或多个发生突变(采用SEQ ID NO：75所示的编号)和/或在SEQ ID NO：76所示的β链可变域氨基酸残基50N、51N、52N、53V、54P、95T、97G、98A、99Q、100P、101Q和102H中有一个或多个发生突变(采用SEQ ID NO：76所示的编号)。例如，突变后的TCRα链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：27Y、27W、27H、27F或27N；28T、28Y、28D、28P、28N或28W；29P、29L、29T、29V或29A；30Q；51N；53S；54Q；55T；91N；94T、94N、94H、94I或94S；95A或95S；96R或96W；97W；98N、98D或98A；和/或突变后的TCRβ链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：50C或50Y；51H或51L；52G；53L；54V或54I；95S；97N；98G或98S；99N或99L；100A；101I；102V或102I。更具体地，α链可变域中所述突变的具体形式包括T27Y/W/H/F/N、S28T/Y/D/P/N/W、I29P/L/T/V/A、N30Q、S51N、E53S、R54Q、E55T、T91N、A94T/N/H/I/S、G95A/S、K96R/W、S97W或T98N/D/A中的一组或几组；β链可变域中所述突变的具体形式包括N50C/Y、N51H/L、N52G、V53L、P54V/I、T95S、G97N、A98G/S、Q99N/L、P100A、Q101I和H102V/I中的一组或几组。
本发明的高亲和性TCR包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90之一和/或β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74之一。因此，含有野生型TCR的α链可变域氨基酸序列(SEQ ID NO：75)的TCRα链可与包含SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74之一的TCRβ链结合。或者，含有野生型TCR的β可变域氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的TCRβ链可与包含SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90之一的TCRα链结合。又或者，包含TCRα链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90之一的TCRα链可与包含TCRβ链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74之一的TCRβ链结合。
基于本发明的目的，本发明TCR是具有至少一个TCRα和/或TCRβ链可变域的部分。它们通常同时包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域。它们可以是αβ异源二聚体或是单链形式或是其他任何能够稳定存在的形式。在过继性免疫治疗中，可将αβ异源二聚TCR的全长链(包含胞质和跨膜结构域)进行转染。本发明TCR可用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂或与其他分子结合制备双功能多肽来定向效应细胞，此时TCR优选为可溶形式。
对于稳定性而言，一方面，本发明TCR可以是在其α和β链恒定域的残基之间引入人工二硫键的TCR。半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域间形成人工链间二硫键。半胱氨酸残基可以取代在天然TCR中合适位点的其他氨基酸残基以形成人工链间二硫键。例如，取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基来形成二硫键。引入半胱氨酸残基以形成二硫键的其他位点还可以是：TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*0I外显子1的Ala19；或TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。即半胱氨酸残基取代了上述α与β链恒定域中任一组位点。可在本发明TCR恒定域的一个或多个C末端截短最多15个、或最多10个、或最多8个或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨酸残基来达到缺失天然二硫键的目的，也可通过将适宜的半胱氨酸残基突变为另一氨基酸来达到上述目的。
如上所述，本发明的TCR可以包含在其α和β链恒定域的残基间引入的人工二硫键。应注意，恒定域间含或不含上文所述的引入的人工二硫键，本发明的TCR均可含有TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列可通过存在于TCR中的天然二硫键连接。
对于稳定性而言，另一方面，本发明TCR还包括在其疏水芯区域发生突变的TCR，这些疏水芯区域的突变优选为能够使本发明TCR的稳定性提高的突变，如在公开号为WO2014/206304的专利文献中所述。这样的TCR可在其下列可变域疏水芯位置发生突变：(α和/或β链)可变区氨基酸第11，13，19，21，53，76，89，91，94位，和/或α链J基因(TRAJ)短肽氨基酸位置倒数第3，5，7位，和/或β链J基因(TRBJ)短肽氨基酸位置倒数第2，4，6位，其中氨基酸序列的位置编号按国际免疫遗传学信息系统(IMGT)中列出的位置编号。本领域技术人员知晓上述国际免疫遗传学信息系统，并可根据该数据库得到不同TCR的氨基酸残基在IMGT中的位置编号。
本发明中疏水芯区域发生突变的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的α与β链的可变域而构成的高稳定性单链TCR。应注意，本发明中柔性肽链可以是任何适合连接TCRα与β链可变域的肽链。本发明实施例1中构建的用于筛选高亲和性TCR的模板链即为上述含有疏水芯突变的单链TCR。该单链模板TCR的α链可变域氨基酸序列(SEQ ID NO：81)与β链可变域氨基酸序列(SEQ ID NO：82)如图8所示，相应的DNA序列(SEQ ID NO：83和84)如图9所示。其柔性连接肽链(linker)的氨基酸序列(SEQ ID NO：85)和DNA序列(SEQ ID NO：86)如图10所示。以此筛选出对SLLMWITQC-HLA-A2复合物具有高亲和性的由α链可变域和β链可变域构成的单链TCR。
本发明的对SLLMWITQC-HLA-A2复合物具有高亲和性的αβ异质二聚体的获得是通过将筛选出的高亲和性单链TCR的CDR区的突变引入到野生型TCRα与β链的相应位置而得到。
在本发明的一些实施例中，采用SEQ ID NO：75所示的编号，本发明TCR的α链可变域疏水芯氨基酸残基13I(即IMGT中列出的α链可变区第13位)、19A(即IMGT中列出的α链可变区第19位)、21M(即IMGT中列出的α链可变区第21位)和79S(即IMGT中列出的α链可变区第94位)中有一个或多个发生突变和/或采用SEQ ID NO：76所示的编号，所述TCRβ链可变域疏水芯氨基酸残基11E(即IMGT中列出的β链可变区第11位)、13T(即IMGT中列出的β链可变区第13位)和82S(即IMGT中列出的β链可变区第94位)中有一个或多个发生突变。
在本发明的一些优选实施例中，采用SEQ ID NO：75所示的编号，本发明α链可变域疏水芯包含氨基酸残基13V、19V、21I或79V中的一个或多个和/或采用SEQ ID NO：76所示的编号，所述TCR可变域疏水芯包含氨基酸残基11L、13V或82V中的一个或多个。更具体地，所述TCRα可变域疏水芯的突变形式包括I13V、A19V、M21I或S79V中的一组或几组；所述TCR可变域疏水芯的突变形式包括E11L、T13V和S82V中的一组或几组。
本发明的高亲和性TCR还包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、89之一和/或β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33之一。因此，上述高稳定性单链TCRα链可变域(SEQ ID NO：81)可与氨基酸序列为SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31或33的TCRβ链可变域结合。或者，上述高稳定性单链TCRβ链可变域(SEQ ID NO：82)可与氨基酸序列为SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37或89的TCRα可变域结合。又或者，TCRα链可变域SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37或89之一与TCRβ链可变域SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31或33之一结合。
本发明的TCR也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个本发明TCR相结合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚结构域来产生四聚体，或多个本发明TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明的TCR复合物可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用于产生具有此类应用的其他多价TCR复合物的中间体。
本发明的TCR可以单独使用，也可与偶联物以共价或其他方式结合，优选以共价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物(为诊断目的，其中所述TCR用于检测呈递SLLMWITQC-HLA-A2复合物的细胞的存在)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.抗体Fc片段(Mosquera等，2005，免疫学杂志(The Journal Of Immunology)174，4381)；5.抗体scFv片段(Zhu等，1995，癌症国际期刊(Internaticnal Journal of Cancer)62，319)；6.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；7.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；8.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；9.纳米磁粒；10.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；11.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
与本发明TCR结合的抗体或其片段包括抗-T细胞或NK-细胞决定抗体，如抗-CD3或抗-CD28或抗-CD16抗体，上述抗体或其片段与TCR的结合能够对效应细胞进行定向来更好地靶向靶细胞。一个优选的实施方式是本发明TCR与抗-CD3抗体或所述抗-CD3抗体的功能片段或变体结合。具体地，本发明的TCR-抗CD3单链抗体融合体包括选自下组的TCRα链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、89、90和选自下组的TCRβ链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74。更具体地，本发明TCR与抗-CD3单链抗体融合体的氨基酸序列可以选自下列氨基酸序列之一SEQ ID NO：92、93、94、95、96、97、98和99。更具体地，本发明TCRβ链与抗-CD3单链抗体融合体的氨基酸序列可选自下列氨基酸序列之一：100和101。
本发明还涉及编码本发明TCR的核酸分子。本发明的核酸分子可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。例如，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明附图中所示的核酸序列相同或是简并的变异体。举例说明“简并的变异体”的含义，如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：81的蛋白序列，但与SEQ ID NO：83的序列有差别的核酸序列。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的核酸分子的载体，以及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。
本发明还包括表达本发明TCR的分离细胞，特别是T细胞。有许多方法适合于用编码本发明的高亲和力TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180：6116-6131)。表达本发明高亲和性TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如，Rosenberg等.，(2008)NatRev Cancer8(4)：299-308)。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有药学上可接受的载体以及本发明TCR、或本发明TCR复合物、或呈递本发明TCR的细胞。
本发明还提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明TCR、或本发明TCR复合物、或呈递本发明TCR的细胞、或本发明的药物组合物。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Ash(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)；另外，本发明中所述突变的具体形式的表述方式如“N30Q”代表第30位的N被Q取代，同理，“T27Y/W/H/F/N”代表第27位的T被Y取代或被W取代或被H取代或被F取代或被N取代。其他以此类推。
在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。因此，本发明TCR还包括本发明TCR的至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地1个氨基酸(尤其是位于CDR区之外的氨基酸)，被性质相似或相近的氨基酸所替换，并仍能够保持其功能性的TCR。
本发明还包括对本发明TCR略作修饰后的TCR。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：本发明TCR的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在本发明TCR的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的TCR。这种修饰可以通过将TCR暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的TCR。
本发明的TCR、TCR复合物或本发明TCR转染的T细胞可与药学上可接受的载体一起在药物组合物中提供。本发明的TCR、多价TCR复合物或细胞通常作为无菌药物组合物的一部分提供，所述组合物通常包括药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。其可采用单位剂型提供，通常在密封的容器中提供，可作为试剂盒的一部分提供。此类试剂盒(但非必需)包括使用说明书。其可包括多个所述单位剂型。
此外，本发明的TCR可以单用，也可与其他治疗剂结合或偶联在一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991))中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药，优选为胃肠外包括皮下、肌肉内或静脉内。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有针剂、口服剂等。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明TCR可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明TCR或TCR复合物或呈递本发明TCR的细胞，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定，最终由医师决定合理的用量。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明以疏水芯突变的单链TCR分子为模板筛选出了对所述SLLMWITQC-HLA-A2复合物具有高亲和力的TCR。
(2)本发明的TCR对所述SLLMWITQC-HLA-A2复合物的亲和力和/或结合半衰期是野生型TCR的至少两倍。
(3)本发明的高亲和力的TCR对所述SLLMWITQC-HLA-A2复合物的亲和力和/或结合半衰期可以达到野生型TCR的102-105倍以上。
(4)本发明的高亲和力TCR与抗-CD3抗体的融合分子对效应细胞的激活作用要远远高于野生型TCR与抗-CD3抗体的融合分子对效应细胞的激活作用。
(5)本发明的高亲和力TCR与抗-CD3抗体的融合分子对效应细胞具有特异性的激活作用。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料和方法
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，E.coli DH5α购自Tiangen、E.coli BL21(DE3)购自Tiangen、E.coli Tuner(DE3)购自Novagen、质粒pET28a购自Novagen。
实施例1 疏水芯突变的稳定性单链TCR模板链的产生
本发明人利用定点突变的方法，构建了以一个柔性短肽(linker)连接TCRα与β链可变域而构成的稳定性单链TCR分子(参见专利文献WO2014/206304)，其氨基酸及DNA序列分别为SEQ ID NO：87和SEQ ID NO：88，如图11所示。并以该单链TCR分子为模板进行高亲和性TCR分子的筛选。该模板链的α可变域(SEQ ID NO：81)及β可变域(SEQ ID NO：82)的氨基酸序列如图8所示；其对应的DNA序列分别为SEQ ID NO：83和84，如图9所示；柔性短肽(linker)的氨基酸序列及DNA序列分别为SEQ ID NO：85和86，如图10所示。
将携带模板链的目的基因经Nco I和Not I双酶切，与经过Nco I和Not I双酶切的pET28a载体连接。连接产物转化至E.coli DH5α，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行PCR筛选，对阳性重组子进行测序，确定序列正确后抽提重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)，用于表达。
实施例2 实施例1中构建的稳定性单链TCR的表达、复性和纯化
将实施例1中制备的含有重组质粒pET28a-模板链的BL21(DE 3)菌落全部接种于含有卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃继续培养4h。5000rpm离心15min收获细胞沉淀物，用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解细胞沉淀物，6000rpm离心15min回收包涵体，再用Bugbuster(Merck)进行洗涤以除去细胞碎片和膜组分，6000rpm离心15min，收集包涵体。将包涵体溶解在缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，8M尿素)中，高速离心去除不溶物，上清液用BCA法定量后进行分装，于-80℃保存备用。
向5mg溶解的单链TCR包涵体蛋白中，加入2.5mL缓冲液(6M Gua-HCl，50mM Tris-HCl pH 8.1，100mM NaCl，10mM EDTA)，再加入DTT至终浓度为10mM，37℃处理30min。用注射器向125mL复性缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.1，0.4M L-精氨酸，5M尿素，2mM EDTA，6.5mMβ-mercapthoethylamine，1.87mM Cystamine)中滴加上述处理后的单链TCR，4℃搅拌10min，然后将复性液装入截留量为4kDa的纤维素膜透析袋，透析袋置于1L预冷的水中，4℃缓慢搅拌过夜。17小时后，将透析液换成1L预冷的缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0)，4℃继续透析8h，然后将透析液换成相同的新鲜缓冲液继续透析过夜。17小时后，样品经0.45μm滤膜过滤，真空脱气后通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP，GE Healthcare)，用20mM Tris-HClpH 8.0配制的0-1M NaCl线性梯度洗脱液纯化蛋白，收集的洗脱组分进行SDS-PAGE分析，包含单链TCR的组分浓缩后进一步用凝胶过滤柱(Superdex 7510/300，GE Healthcare)进行纯化，目标组分也进行SDS-PAGE分析。
用于BIAcore分析的洗脱组分进一步采用凝胶过滤法测试其纯度。条件为：色谱柱AgilentBio SEC-3(300A，φ7.8×300mm)，流动相为150mM磷酸盐缓冲液，流速0.5mL/min，柱温25℃，紫外检测波长214nm。
实施例3 结合表征
BIAcore分析
使用BIAcore T200实时分析系统检测TCR分子与SLLMWITQC-HLA-A2复合物的结合活性。将抗链霉亲和素的抗体(GenScript)加入偶联缓冲液(10mM醋酸钠缓冲液，pH 4.77)，然后将抗体流过预先用EDC和NHS活化过的GM5芯片，使抗体固定在芯片表面，最后用乙醇胺的盐酸溶液封闭未反应的活化表面，完成偶联过程，偶联水平约为15,000RU。
使低浓度的链霉亲和素流过已包被抗体的芯片表面，然后将SLLMWITQC-HLA-A2复合物流过检测通道，另一通道作为参比通道，再将0.05mM的生物素以10μL/min的流速流过芯片2min，封闭链霉亲和素剩余的结合位点。采用单循环动力学分析方法测定其亲和力，将TCR用HEPES-EP缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20，pH 7.4)稀释成几个不同的浓度，以30μL/min的流速，依次流过芯片表面，每次进样的结合时间为120s，最后一次进样结束后让其解离600s。每一轮测定结束后用pH 1.75的10mM Gly-HCl再生芯片。利用BIAcore Evaluation软件计算动力学参数。
上述SLLMWITQC-HLA-A2复合物的制备过程如下：
a.纯化
收集100ml诱导表达重链或轻链的E.coli菌液，于4℃8000g离心10min后用10mlPBS洗涤菌体一次，之后用5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents(Merck)剧烈震荡重悬菌体，并于室温旋转孵育20min，之后于4℃，6000g离心15min，弃去上清，收集包涵体。
将上述包涵体重悬于5ml BugBuster Master Mix中，室温旋转孵育5min；加30ml稀释10倍的BugBuster，混匀，4℃6000g离心15min；弃去上清，加30ml稀释10倍的BugBuster重悬包涵体，混匀，4℃6000g离心15min，重复两次，加30ml 20mM Tris-HCl pH 8.0重悬包涵体，混匀，4℃6000g离心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵体，SDS-PAGE检测包涵体纯度，BCA试剂盒测浓度。
b.复性
将合成的短肽SLLMWITQC(北京赛百盛基因技术有限公司)溶解于DMSO至20mg/ml的浓度。轻链和重链的包涵体用8M尿素、20mM Tris pH 8.0、10mM DTT来溶解，复性前加入3M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA进一步变性。将SLLMWITQC肽以25mg/L(终浓度)加入复性缓冲液(0.4ML-精氨酸、100mM Tris pH 8.3、2mM EDTA、0.5mM氧化性谷胱甘肽、5mM还原型谷胱甘肽、0.2mM PMSF，冷却至4℃)，然后依次加入20mg/L的轻链和90mg/L的重链(终浓度，重链分三次加入，8h/次)，复性在4℃进行至少3天至完成，SDS-PAGE检测能否复性成功。
c.复性后纯化
用10体积的20mM Tris pH 8.0作透析来更换复性缓冲液，至少更换缓冲液两次来充分降低溶液的离子强度。透析后用0.45μm醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，然后加载到HiTrap Q HP(GE通用电气公司)阴离子交换柱上(5ml床体积)。利用Akta纯化仪(GE通用电气公司)，20mM Tris pH 8.0配制的0-400mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白，pMHC约在250mMNaCl处洗脱，收集诸峰组分，SDS-PAGE检测纯度。
d.生物素化
用Millipore超滤管将纯化的pMHC分子浓缩，同时将缓冲液置换为20mM Tris pH8.0，然后加入生物素化试剂0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM MgOAc、50μM D-Biotin、100μg/ml BirA酶(GST-BirA)，室温孵育混合物过夜，SDS-PAGE检测生物素化是否完全。
e.纯化生物素化后的复合物
用Millipore超滤管将生物素化标记后的pMHC分子浓缩至1ml，采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pMHC，利用Akta纯化仪(GE通用电气公司)，用过滤过的PBS预平衡HiPrepTM16/60 S200 HR柱(GE通用电气公司)，加载1ml浓缩过的生物素化pMHC分子，然后用PBS以1ml/min流速洗脱。生物素化的pMHC分子在约55ml时作为单峰洗脱出现。合并含有蛋白质的组分，用Millipore超滤管浓缩，BCA法(Thermo)测定蛋白质浓度，加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)将生物素化的pMHC分子分装保存在-80℃。
实施例4 高亲和性单链TCR的产生
噬菌体展示技术是产生TCR高亲和力变体文库以筛选高亲和力变体的一种手段。将Li等((2005)Nature Biotech 23(3)：349-354)描述的TCR噬菌体展示和筛选方法应用于实施例1中的单链TCR模板。通过突变该模板链的CDR区来建立高亲和性TCR的文库并进行淘选。本领域技术人员通过阅读上述文献可以获得所述建库及筛选方法。即通过使用具有所需的一个或多个密码子变化的引物和作为模板的含相关DNA的质粒来实现。经过几轮淘选后的噬菌体文库均和相应抗原有特异性结合，从中挑取单克隆，并进行序列分析。
采用实施例3中BIAcore方法分析TCR分子与SLLMWITQC-HLA-A2复合物的相互作用，筛选出了亲和力和/或结合半衰期是野生型TCR的至少两倍的高亲和性TCR，即筛选出的高亲和性TCR结合SLLMWITQC-HLA-A2复合物的解离平衡常数KD小于等于野生型TCR结合SLLMWITQC-HLA-A2复合物的解离平衡常数KD的二分之一，结果如下表1所示。利用上述方法检测到参比TCR与SLLMWITQC-HLA-A2复合物相互作用的KD值为6.4μM，其相互作用曲线如图12所示，即野生型TCR与SLLMWITQC-HLA-A2复合物相互作用的KD值也为6.4μM。
具体地，采用SEQ ID NO：75中所示的编号，这些高亲和力TCR突变体的α链可变域在下列一个或多个位点的氨基酸发生突变27T、28S、29I、30N、51S、53E、54R、55E、91T、94A、95G、96K、97S、98T和/或采用SEQ ID NO：76中所示的编号，这些高亲和力TCR突变体的β链可变域在下列一个或多个位点的氨基酸发生突变50N、51N、52N、53V、54P、95T、97G、98A、99Q、100P、101Q、102H。
更具体地，采用SEQ ID NO：75中所示的编号，这些高亲和力TCR的α链可变域包含选自下组的一个或多个氨基酸残基27Y、27W、27H、27F或27N；28T、28Y、28D、28P、28N或28W；29P、29L、29T、29V或29A；30Q；51N；53S；54Q；55T；91N；94T、94N、94H、94I或94S；95A或95S；96R或96W；97W；98N、98D或98A；和/或采用SEQ ID NO：76中所示的编号，这些高亲和力TCR的β链可变域包含选自下组的一个或多个氨基酸残基50C或50Y；51H或51L；52G；53L；54V或54I；95S；97N；98G或98S；99N或99L；100A；101I；102V或102I。
高亲和性单链TCR的α链可变域(SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、29、32、34、35、36、37、89)和β链可变域(SEQ ID NO：15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、33)的氨基酸序列的具体例子分别如图1a-u和图2a-q所示。
表1
实施例5 高亲和性αβ异质二聚TCR的产生
将实施例4中筛选到的高亲和力的单链TCR的CDR区突变引入到野生型TCR的可变域的相应位点中，并通过BIAcore来检测其与SLLMWITQC-HLA-A2复合物的亲和力。上述CDR区高亲和力突变点的引入采用本领域技术人员熟知的定点突变的方法。上述野生型TCR的α链与β链胞外氨基酸序列分别如图6a(SEQ ID NO：77)和6b(SEQ ID NO：78)所示，不含为在细菌中有效启动表达而引入的前导甲硫氨酸。应注意，为获得更加稳定的可溶性TCR，以便更方便地评估TCR与SLLMWITQC-HLA A2复合物之间的结合亲和力和/或结合半衰期，本发明在上述野生型TCR的α和β链的恒定区中分别引入了一个半胱氨酸残基以形成人工链间二硫键。引入半胱氨酸残基后的胞外TCRα与β链的氨基酸序列分别如图7a(SEQ ID NO：79)和7b所示(SEQ ID NO：80)，引入的半胱氨酸残基以加粗字母表示。
通过《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三版，Sambrook和Russell)中描述的标准方法将待表达的TCRα和β链的胞外序列基因经合成后分别插入到表达载体pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位点分别是NcoI和NotI。CDR区的突变通过本领域技术人员熟知的重叠PCR(overlap PCR)引入。插入片段经过测序确认无误。
实施例6 αβ异质二聚TCR的表达、复性和纯化
将TCRα和β链的表达载体分别通过化学转化法转化进入表达细菌BL21(DE3)，细菌用LB培养液生长，于OD600＝0.6时用终浓度0.5mM IPTG诱导，TCR的α和β链表达后形成的包涵体通过BugBuster Mix(Novagene)进行提取，并且经BugBuster溶液反复多次洗涤，包涵体最后溶解于6M盐酸胍，10mM二硫苏糖醇(DTT)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，20mM Tris(pH8.1)中。
溶解后的TCRα和β链以1∶1的质量比快速混合于5M尿素，0.4M精氨酸，20mM Tris(pH 8.1)，3.7mM cystamine，6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)中，终浓度为60mg/mL。混合后将溶液置于10倍体积的去离子水中透析(4℃)，12小时后将去离子水换成缓冲液(20mMTris，pH 8.0)继续于4℃透析12小时。透析完成后的溶液经0.45μM的滤膜过滤后，通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP，5ml，GE Healthcare)纯化。洗脱峰含有复性成功的α和β二聚体的TCR通过SDS-PAGE胶确认。TCR随后通过凝胶过滤层析(HiPrep 16/60，Sephacryl S-100HR，GE Healthcare)进一步纯化。纯化后的TCR纯度经过SDS-PAGE测定大于90％，浓度由BCA法确定。
实施例7 BIAcore分析结果
采用实施例3中所述方法检测引入高亲和力突变点的αβ异质二聚TCR与SLLMWITQC-HLA-A2复合物的亲和力。
将高亲和性单链TCRα与β链中CDR区的突变分别引入到SEQ ID NO：75和/或SEQ IDNO：76的相应位置，得到新的TCRα和β链可变域氨基酸序列，分别如图3和图4所示。由于TCR分子的CDR区决定了其与相应的pMHC复合物的亲和力，所以本领域技术人员能够预料引入高亲和力突变点的αβ异质二聚TCR也具有对SLLMWITQC-HLA-A2复合物的高亲和力。选择其中3组TCR，进行验证。利用实施例5中所述方法构建表达载体，利用实施例6中所述方法对上述引入高亲和力突变的αβ异质二聚TCR进行表达、复性和纯化，然后利用BIAcore T200测定其与SLLMWITQC-HLA-A2复合物的亲和力，如下表2所示。
表2
由上表2可知，引入CDR区突变的αβ异质二聚TCR保持了对SLLMWITQC-HLA-A2复合物的高亲和力。
实施例8 抗-CD3抗体与高亲和性单链TCR的融合体的表达、复性和纯化
我们选择了几种高亲和性单链TCR分子与抗CD3抗体的单链抗体(scFv)进行融合，构建了融合分子。选择的高亲和性单链TCR分子包括：(1)由α链可变域SEQ ID NO：2和β链可变域SEQ ID NO：27而构成的单链TCR分子，其与抗-CD3的scFv在单链TCR分子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分别如图13a和13b所示。(2)由α链可变域SEQ ID NO：1和β链可变域SEQ ID NO：30而构成的单链TCR分子，其与抗-CD3的scFv在TCR分子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分别如图14a和14b所示。(3)由α链可变域SEQ ID NO：89和β链可变域SEQID NO：26而构成的单链TCR分子，其与抗-CD3的scFv在单链TCR分子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分别如图16a和16b所示。(4)由α链可变域SEQ ID NO：89和β链可变域SEQID NO：27而构成的单链TCR分子，其与抗-CD3的scFv在单链TCR分子的N和C端融合的融合分子的氨基酸序列分别如图16a和16b所示。上述融合分子的氨基酸序列中含有为在细菌中有效表达而引入的前导甲硫氨酸。融合分子的制备过程如下：
融合蛋白的表达
将表达质粒转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，涂布LB平板(卡那霉素50μg/ml)置于37℃培养过夜。次日，挑克隆接种至10ml LB液体培养基(卡那霉素50μg/ml)培养2-3h，按体积比1∶100接种至1L LB培养基(卡那霉素50μg/ml)中，继续培养至OD600为0.5-0.8，然后使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导目的蛋白的表达。诱导4小时以后，以6000rpm离心10min收获细胞。PBS缓冲液洗涤菌体一次，并且分装菌体，取相当于200ml的细菌培养物的菌体用5ml BugBuster Master Mix(Novagen)裂解细菌，以6000g离心15min收集包涵体。然后进行4次洗涤剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。然后，用缓冲液如PBS洗涤包涵体以除去洗涤剂和盐。最终，将包涵体用含8M尿素的Tris缓冲溶液溶解，并测定包涵体浓度，将其分装后置于-80℃冷冻保存。
融合蛋白的重折叠
从-80℃超低温冰箱中取出约10mg包涵体解冻，加二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为10mM，在37℃中温育30min到1小时以确保二硫键完全打开。然后将包涵体样品溶液分别滴入200ml 4℃预冷重折叠缓冲液(100mM Tris pH 8.1，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素，6.5mMβ-mercapthoethylamine，1.87mM Cystamine)，4℃缓慢搅拌约30分钟。复性溶液用8倍体积预冷的H2O透析16-20小时。再用8倍体积的10mM Tris pH 8.0透析两次，4℃继续透析约8小时，透析后样品过滤后进行以下纯化。
融合蛋白的第一步纯化
经过透析的重折叠物(10mM Tris pH 8.0中)使用POROS HQ/20阴离子交换层析预装柱(Applied Biosystems)，在AKTA纯化仪(GE Healthcare)用0-600mM NaCl进行梯度洗脱。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析各个组分，然后合并。
融合蛋白的第二步纯化
将第一步纯化合并的样品溶液浓缩以供此步纯化，利用在PBS缓冲液中预平衡的Superdex 75 10/300GL凝胶过滤层析预装柱(GE Healthcare)纯化融合蛋白，考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE分析出峰的组分，然后合并。
实施例9 抗-CD3抗体与高亲和性αβ异质二聚TCR的融合体的表达、复性和纯化
将抗-CD3的单链抗体(scFv)与αβ异质二聚TCR融合，制备融合分子。抗-CD3的scFv与TCR的β链融合，该TCRβ链可以包含任一上述高亲和性αβ异质二聚TCR的β链可变域，本实施例选用SEQ ID NO：69和SEQ ID NO：70的高亲和性TCRβ链可变域。融合分子的TCRα链可以包含任一上述高亲和性αβ异质二聚TCR的α链可变域，本实施例选用SEQ ID NO：39和SEQ IDNO：90所示的α链可变域。抗-CD3的scFv与TCR的β链融合分子的氨基酸序列分别如17和18所示，氨基酸序列中含有为在细菌中有效表达而引入的前导甲硫氨酸。
融合分子表达载体的构建
1.α链表达载体的构建
将携带αβ异质二聚TCR的α链的目的基因经Nco I和Not I双酶切，与经过Nco I和Not I双酶切的pET28a载体连接。连接产物转化至E.coli DH5α，涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行PCR筛选，对阳性重组子进行测序，确定序列正确后抽提重组质粒转化至E.coli Tuner(DE3)，用于表达。
2.抗-CD3(scFv)-β链表达载体的构建
通过重叠(overlap)PCR的方法，设计引物将抗-CD3 scFv和高亲和性异质二聚TCRβ链基因连接起来，中间的连接短肽(linker)为GGGGS，并且使抗-CD3的scFv与高亲和性异质二聚TCRβ链的融合蛋白的基因片段带上限制性内切酶位点Nco I(CCATGG)和Not I(GCGGCCGC)。将PCR扩增产物经Nco I和Not I双酶切，与经过Nco I和Not I双酶切的pET28a载体连接。连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑取阳性克隆进行PCR筛选，对阳性重组子进行测序，确定序列正确后抽提重组质粒转化至E.coli Tuner(DE3)感受态细胞，用于表达。
融合蛋白的表达、复性及纯化
将表达质粒分别转化进入E.coli Tuner(DE3)感受态细胞，涂布LB平板(卡那霉素50μg/mL)置于37℃培养过夜。次日，挑克隆接种至10mL LB液体培养基(卡那霉素50μg/mL)培养2-3h，按体积比1∶100接种至1L LB培养基中，继续培养至OD600为0.5-0.8，加入终浓度为1mM IPTG诱导目的蛋白的表达。诱导4小时以后，以6000rpm离心10min收获细胞。PBS缓冲液洗涤菌体一次，并且分装菌体，取相当于200mL的细菌培养物的菌体用5mL BugBusterMaster Mix(Merck)裂解细菌，以6000g离心15min收集包涵体。然后进行4次洗涤剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。然后，用缓冲液如PBS洗涤包涵体以除去洗涤剂和盐。最终，将包涵体用含6M盐酸胍，10mM二硫苏糖醇(DTT)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，20mM Tris，pH 8.1缓冲溶液溶解，并测定包涵体浓度，将其分装后置于-80℃冷冻保存。
溶解后的TCRα链和抗-CD3(scFv)-β链以2：5的质量比快速混合于5M尿素(urea)，0.4M L-精氨酸(L-arginine)，20mM Tris pH 8.1，3.7mM cystamine，6.6mMβ-mercapoethylamine(4℃)，终浓度α链和抗-CD3(scFv)-β链分别为0.1mg/mL，0.25mg/mL。
混合后将溶液置于10倍体积的去离子水中透析(4℃)，12小时后将去离子水换成缓冲液(10mM Tris，pH 8.0)继续于4℃透析12小时。透析完成后的溶液经0.45μM的滤膜过滤后，通过阴离子交换柱(HiTrap Q HP 5ml，GE healthcare)纯化。洗脱峰含有复性成功的TCRα链与抗-CD3(scFv)-β链二聚体的TCR通过SDS-PAGE胶确认。TCR融合分子随后通过尺寸排阻色谱法(S-100 16/60，GE healthcare)进一步纯化，以及阴离子交换柱(HiTrap Q HP5ml，GE healthcare)再次纯化。纯化后的TCR融合分子纯度经过SDS-PAGE测定大于90％，浓度由BCA法测定。
实施例10 高亲和性单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子对T细胞的激活实验
本实施例比较了本发明高亲和力单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子以及野生型TCR与抗-CD3抗体的融合分子对呈递SLLMWITQC-HLA-A2复合物的肿瘤细胞系的反应，从而激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。利用ELISPOT实验检测IFN-γ的产量作为T细胞激活的读出值。
选择本发明的高亲和力单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子，进行上述ELISPOT实验。所选融合分子包括：高亲和力单链TCR融合体1(所用Vα为SEQ ID NO：89；Vβ为SEQ DINO：26)、高亲和力单链TCR融合体2(所用Vα为SEQ ID NO：89；Vβ为SEQ DI NO：27)、高亲和力单链TCR融合体3(所用Vα为SEQ ID NO：2；Vβ为SEQ DI NO：26)、高亲和力单链TCR融合体4(所用Vα为SEQ ID NO：2；Vβ为SEQ DI NO：27)、高亲和力单链TCR融合体5(所用Vα为SEQ IDNO：3；Vβ为SEQ DI NO：26)、高亲和力单链TCR融合体6(所用Vα为SEQ ID NO：4；Vβ为SEQ DINO：28)、高亲和力单链TCR融合体7(所用Vα为SEQ ID NO：3；Vβ为SEQ DI NO：27)、高亲和力单链TCR融合体8(所用Vα为SEQ ID NO：29；Vβ为SEQ DI NO：30)，以及野生型TCR融合体(所用Vα为SEQ ID NO：75；Vβ为SEQ DI NO：76)。
ELISPOT实验所用试剂如下：试验培养基、洗涤缓冲液、PBS和人IFN-γELISPOTPVDF-酶促试剂盒、靶细胞、效应细胞以及高亲和力单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子(如实施例8所述制备，可以用试验培养基来对其进行稀释)。
靶细胞的制备过程如下：本实施例所用的靶细胞是IM9细胞(HLA-A2阳性和NY-ESO-1抗原阳性)。利用75004250离心机(Thermo公司)以500g，5分钟离心1次来洗涤充足的靶细胞(20,000个细胞/孔)。然后将细胞以4×105个细胞/毫升重悬在试验培养基中。
效应细胞的制备过程如下：本实施例中所用的效应细胞(T细胞)是CD8阳性T细胞(通过负选择(利用CD8负分离试剂盒，MACS，目录号130-094-156)从PBL获得)。解冻效应细胞，置于试验培养基中，然后利用75004250离心机(Thermo公司)以500g，5分钟离心进行洗涤。然后将细胞以4倍所需终浓度重悬在试验培养基中。
ELISPOT平板准备过程如下：每孔加入35％酒精50微升以预湿润板底，以每块平板10毫升无菌PBS稀释100微升抗-IFNγ捕捉抗体。然后将100微升的稀释捕捉抗体等份加入各孔。4℃下温育平板过夜。温育后，洗涤平板(程序1，平板类型2，96孔板洗涤仪；BioTech)以除去捕捉抗体。然后将含有10％血清的1640培养基以100μl/孔加入各孔并在室温下温育平板2小时以封闭平板。然后从平板中洗去培养基(程序1，平板类型2，96孔板洗涤仪；BioTech)，通过在纸巾上轻弹和轻拍ELISPOT平板以除去任何剩余的洗涤缓冲液。
ELISPOT实验步骤如下：按以下顺序将试验的各个组分加入ELISPOT平板：50μl靶细胞4×105个细胞/毫升(得到总共20,000个靶细胞/孔)、50μl试剂(高亲和力TCR-抗-CD3融合分子；不同浓度)、50μl培养基(试验培养基)以及50μl效应细胞(1000个CD8+细胞/孔)，然后温育平板过夜(37℃，5％CO2)。随后洗涤平板并进行二级检测和显影，干燥平板1小时，再利用免疫斑点平板读数计(ELISPOT READER system；AID公司)计数膜上形成的斑点。
实验结果如图19和20所示，该结果显示本发明的高亲和力单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子对T细胞的激活作用要远远高于野生型TCR与抗-CD3抗体的融合分子对T细胞的激活作用。
实施例11 高亲和性αβ异质二聚TCR与抗-CD3抗体的融合分子对T细胞的激活实验
本实施例比较了本发明高亲和力αβ异质二聚TCR与抗-CD3抗体的融合分子以及野生型TCR与抗-CD3抗体的融合分子对呈递SLLMWITQC-HLA-A2复合物的肿瘤细胞系的反应，从而激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力。利用ELISPOT实验检测IFN-γ的产量作为T细胞激活的读出值。ELISPOT实验所用试剂、靶细胞及效应细胞的制备、具体实验步骤可参照实施例10。其中，高亲和力异质二聚TCR与抗-CD3抗体的融合分子如实施例9所述制备，可以用试验培养基来对其进行稀释。
选择本发明的高亲和力单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子，进行上述ELISPOT实验。所选融合分子包括：高亲和力异质二聚TCR融合体1(所用Vα为SEQ ID NO：39；Vβ为SEQDI NO：69)、高亲和力异质二聚TCR融合体2(所用Vα为SEQ ID NO：90；Vβ为SEQ DI NO：69)，以及野生型TCR融合体(所用Vα为SEQ ID NO：75；Vβ为SEQ DI NO：76)。
实验结果如图21所示，同样地，该结果显示本发明高亲和力异质二聚TCR与抗-CD3抗体的融合分子对T细胞的激活作用要远远高于野生型TCR与抗-CD3抗体的融合分子对T细胞的激活作用。
实施例12 高亲和力TCR融合分子的特异性检测
本实施例验证了本发明高亲和力TCR与抗-CD3抗体的融合分子对效应细胞的特异性激活作用。选择几组融合分子进行ELISPOT实验，检测IFN-γ的产量作为T细胞激活的读出值。
ELISPOT实验所用试剂如下：试验培养基、洗涤缓冲液、PBS和人IFN-γELISPOTPVDF-酶促试剂盒、靶细胞、效应细胞、高亲和力单链TCR与抗-CD3抗体的融合分子(如实施例8所述制备，可以用实验培养基来对其进行稀释)以及高亲和力αβ异质二聚TCR与抗-CD3抗体的融合分子(如实施例9所述制备，可以用实验培养基来对其进行稀释)。
靶细胞的制备过程如下：本实施例所用的靶细胞是IM9细胞(HLA-A2阳性和NY-ESO-1抗原阳性)。对照组的靶细胞是293T细胞(HLA-A2阳性和NY-ESO-1抗原阴性)。利用75004250离心机(Thermo公司)以500g，5分钟离心1次来洗涤充足的靶细胞(20,000个细胞/孔)。然后将细胞以4×105个细胞/毫升重悬在实验培养基中。
所用效应细胞及ELISPOT实验的具体步骤可参照实施例10。图21-25分别为高亲和力单链TCR融合体2、高亲和力单链TCR融合体5、高亲和力单链TCR融合体6、高亲和力单链TCR融合体7以及高亲和力异质二聚TCR融合体2的ELISPOT实验结果图。上述实验结果图显示了本发明的高亲和力TCR融合分子对效应细胞的特异性激活作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合SLLMWITQC-HLA A2复合物的特性，并包含TCRα链可变域和/或TCRβ链可变域，相对于具有α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：75和β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO：76的TCR，其特征在于：
(i)所述TCR在SEQ ID NO：75所示其α链可变域氨基酸和/或在SEQ ID NO：76所示其β链可变域氨基酸中发生突变；和
(ii)所述TCR对所述SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力是野生型TCR对SLLMWITQC-HLA A2复合物的结合亲和力的至少两倍。
2.如权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述突变发生在α链和/或β链的一个或多个CDR区中。
3.如权利要求1或2所述的T细胞受体，其特征在于，所述突变发生在α链的CDR1和/或CDR3中，和/或所述突变发生在β链的CDR2和/或CDR3中。
4.如以上任一权利要求所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体对SLLMWITQC-HLA A2复合物的解离平衡常数KD≤3.2μM。
5.如以上任一权利要求所述的T细胞受体，其特征在于，所述突变发生在SEQ IDNO：75所示其α链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：27T、28S、29I、30N、51S、53E、54R、55E、91T、94A、95G、96K、97S和98T，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：75所示的编号；和/或
所述突变发生在SEQ ID NO：76所示其β链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：50N、51N、52N、53V、54P、95T、97G、98A、99Q、100P、101Q和102H，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
6.如以上任一权利要求所述的T细胞受体，其特征在于，突变后的所述TCRα链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：27Y、27W、27H、27F或27N；28T、28Y、28D、28P、28N或28W；29P、29L、29T、29V或29A；30Q；51N；53S；54Q；55T；91N；94T、94N、94H、94I或94S；95A或95S；96R或96W；97W；98N、98D或98A；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：75所示的编号；和/或
突变后的所述TCRβ链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：50C或50Y；51H或51L；52G；53L；54V或54I；95S；97N；98G或98S；99N或99L；100A；101I；102V或102I；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
7.如以上任一权利要求所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR的α链可变域氨基酸序列选自：SEQ ID NO：38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、90；和/或
所述TCR的β链可变域氨基酸序列选自：SEQ ID NO：58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74。
8.如以上任一权利要求所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR包括下表所示的α和β链可变域组合：
9.如以上任一权利要求所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR是αβ异质二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成二硫键。
10.如权利要求9所述的T细胞受体，其特征在于，半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成人工二硫键。
11.如权利要求10所述的T细胞受体，其特征在于，在所述TCR中，形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：
TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；
TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；
TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；和
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。
12.如权利要求1-8中任一所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCRα链可变域和/或β链可变域的疏水芯发生突变。
13.如权利要求12所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR是由α可变域和β可变域组成的单链TCR，所述α可变域和β可变域由一柔性短肽序列(linker)连接。
14.如权利要求13所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR的疏水芯突变发生在SEQ ID NO：75所示α链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：13I、19A、21M和79S；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：75所示的编号；和/或
所述疏水芯突变发生在SEQ ID NO：76所示β链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：11E、13T和82S，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
15.如权利要求14所述的T细胞受体，其特征在于，疏水芯突变后的所述TCR的α链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：13V、19V、21I和79V，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：75所示的编号；和/或
疏水芯突变后的所述TCR的β链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：11L、13V和82V；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO：76所示的编号。
序列表
<110> 广州市香雪制药股份有限公司
<120> 高亲和力 NY-ESO T细胞受体
<130> P2016-1666
<150> CN201510067001.2
<151> 2015-02-06
<160> 101
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
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Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val
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130 135 140
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp
145 150 155 160
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
165 170 175
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
180 185 190
Ala Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 78
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 78
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Thr Ile
85 90 95
Gly Ala Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu
100 105 110
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
180 185 190
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
195 200 205
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
210 215 220
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp
<210> 79
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 79
Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Gly Ala Gly Lys
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro Asn Ile Gln
100 105 110
Lys Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
115 120 125
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
130 135 140
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
145 150 155 160
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
165 170 175
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
180 185 190
Ala Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200
<210> 80
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 80
Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly
1 5 10 15
Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Thr Ile
85 90 95
Gly Ala Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu
100 105 110
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu
180 185 190
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
195 200 205
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
210 215 220
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp
<210> 81
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 81
Ala Gln Gln Val Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu Ser
1 5 10 15
Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val Arg
65 70 75 80
Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Gly Ala Gly Lys
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn
100 105
<210> 82
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 82
Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Leu Ser Val Lys Thr Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu
20 25 30
Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg
50 55 60
Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln
65 70 75 80
Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Thr Ile
85 90 95
Gly Ala Gln Pro Gln His Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val Asp
100 105 110
<210> 83
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 83
gctcaacaag tcgaagaaga cccgcaagcc ctgaatgtcc aagaaagcga aaatgtgacc 60
atcaactgct cctacaaaac ctcaatcaac aatctgcagt ggtatcgtca aaactccggc 120
cgcggtctga cgcatctgat tctgatccgt tctaatgaac gcgaaaaaca cagtggccgt 180
ctgcgcgtca ccctggatac cagcaaaaaa tcttctagtc tgtacatcac caacgtgcgt 240
ccgaacgata gcggtaccta cttttgcgcg acggacggcg ccggtaaatc gaccttcggc 300
aagggtacga aactgagcgt gaccaac 327
<210> 84
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 84
gatgcgggta ttacccagtc gccgcgtcat ctgagcgtga aaacgggcca gagcgtgacc 60
ctgcgctgta aaccgatcag tggtcacgac tacctgtttt ggtaccgtca gaccccgggt 120
cgcggtctgg aactgctgat ttatttcaac aataacgttc cgatcgatga ctccggcatg 180
ccggaagatc gcttttcagc aaaaatgccg aatgcttcct tctcaacgct gaaaatccaa 240
ccggtcaccc cgtcggacag cgcactgtac ctgtgcgcaa gcaccattgg cgctcagccg 300
caacatttcg gtccgggcac ccgtctggaa gtggat 336
<210> 85
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 85
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr Gly
20
<210> 86
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 86
ggcggtggct ctgaaggtgg cggtagtgaa ggcggtggct ccgaaggtgg cggttcagaa 60
ggcggtacgg gc 72
<210> 87
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 87
Ala Gln Gln Val Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu Ser
1 5 10 15
Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val Arg
65 70 75 80
Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Gly Ala Gly Lys
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Leu
130 135 140
Ser Val Lys Thr Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser
145 150 155 160
Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu
165 170 175
Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly
180 185 190
Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser
195 200 205
Thr Leu Lys Ile Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu
210 215 220
Cys Ala Ser Thr Ile Gly Ala Gln Pro Gln His Phe Gly Pro Gly Thr
225 230 235 240
Arg Leu Glu Val Asp
245
<210> 88
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 多核苷酸
<400> 88
gctcaacaag tcgaagaaga cccgcaagcc ctgaatgtcc aagaaagcga aaatgtgacc 60
atcaactgct cctacaaaac ctcaatcaac aatctgcagt ggtatcgtca aaactccggc 120
cgcggtctga cgcatctgat tctgatccgt tctaatgaac gcgaaaaaca cagtggccgt 180
ctgcgcgtca ccctggatac cagcaaaaaa tcttctagtc tgtacatcac caacgtgcgt 240
ccgaacgata gcggtaccta cttttgcgcg acggacggcg ccggtaaatc gaccttcggc 300
aagggtacga aactgagcgt gaccaacggc ggtggctctg aaggtggcgg tagtgaaggc 360
ggtggctccg aaggtggcgg ttcagaaggc ggtacgggcg atgcgggtat tacccagtcg 420
ccgcgtcatc tgagcgtgaa aacgggccag agcgtgaccc tgcgctgtaa accgatcagt 480
ggtcacgact acctgttttg gtaccgtcag accccgggtc gcggtctgga actgctgatt 540
tatttcaaca ataacgttcc gatcgatgac tccggcatgc cggaagatcg cttttcagca 600
aaaatgccga atgcttcctt ctcaacgctg aaaatccaac cggtcacccc gtcggacagc 660
gcactgtacc tgtgcgcaag caccattggc gctcagccgc aacatttcgg tccgggcacc 720
cgtctggaag tggat 735
<210> 89
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 89
Ala Gln Gln Val Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu Ser
1 5 10 15
Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val Arg
65 70 75 80
Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Asn Asp Gly Asn Ala Arg
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn
100 105
<210> 90
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 90
Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly
1 5 10 15
Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn Leu
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu
35 40 45
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr
50 55 60
Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg
65 70 75 80
Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Asn Asp Gly Asn Ala Arg
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Asp Gly Thr Thr Leu Thr Val Lys Pro
100 105
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 91
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 92
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 92
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser
180 185 190
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Gln Val
245 250 255
Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu Ser Glu Asn Val Thr
260 265 270
Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn Leu Gln Trp Tyr Arg
275 280 285
Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn
290 295 300
Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val Arg Pro Asn Asp Ser
325 330 335
Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Gly Asn Ala Arg Trp Thr Phe Gly
340 345 350
Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr
370 375 380
Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Leu Ser Val Lys Thr
385 390 395 400
Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr
405 410 415
Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile
420 425 430
Tyr Phe Tyr His Gly Leu Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp
435 440 445
Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Met Lys Ile
450 455 460
Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Thr
465 470 475 480
Ile Gly Ala Asn Ala Ile Val Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val
485 490 495
Asp
<210> 93
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 93
Met Ala Gln Gln Val Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu
1 5 10 15
Ser Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile
35 40 45
Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val
50 55 60
Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val
65 70 75 80
Arg Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Gly Asn Ala
85 90 95
Arg Trp Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His
130 135 140
Leu Ser Val Lys Thr Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile
145 150 155 160
Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Tyr His Gly Leu Val Ile Asp Asp Ser
180 185 190
Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe
195 200 205
Ser Thr Met Lys Ile Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr
210 215 220
Leu Cys Ala Ser Thr Ile Gly Ala Asn Ala Ile Val Phe Gly Pro Gly
225 230 235 240
Thr Arg Leu Glu Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro
290 295 300
Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
325 330 335
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr
340 345 350
Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
385 390 395 400
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
405 410 415
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
420 425 430
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val
435 440 445
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr
450 455 460
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
465 470 475 480
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
485 490 495
Lys
<210> 94
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 94
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser
180 185 190
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Gln Val
245 250 255
Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu Ser Glu Asn Val Thr
260 265 270
Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Tyr Thr Pro Gln Asn Leu Gln Trp Tyr Arg
275 280 285
Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn
290 295 300
Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val Arg Pro Asn Asp Ser
325 330 335
Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Gly Thr Ala Arg Trp Asn Phe Gly
340 345 350
Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr
370 375 380
Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Leu Ser Val Lys Thr
385 390 395 400
Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr
405 410 415
Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile
420 425 430
Tyr Phe Tyr His Gly Leu Ile Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp
435 440 445
Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile
450 455 460
Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Thr
465 470 475 480
Ile Gly Ala Asn Ala Ile Val Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val
485 490 495
Asp
<210> 95
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 95
Met Ala Gln Gln Val Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu
1 5 10 15
Ser Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Tyr Thr Pro Gln Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile
35 40 45
Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val
50 55 60
Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val
65 70 75 80
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85 90 95
Arg Trp Asn Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His
130 135 140
Leu Ser Val Lys Thr Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile
145 150 155 160
Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Tyr His Gly Leu Ile Ile Asp Asp Ser
180 185 190
Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe
195 200 205
Ser Thr Leu Lys Ile Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr
210 215 220
Leu Cys Ala Ser Thr Ile Gly Ala Asn Ala Ile Val Phe Gly Pro Gly
225 230 235 240
Thr Arg Leu Glu Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro
290 295 300
Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
325 330 335
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr
340 345 350
Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
385 390 395 400
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
405 410 415
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
420 425 430
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val
435 440 445
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr
450 455 460
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
465 470 475 480
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
485 490 495
Lys
<210> 96
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 96
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser
180 185 190
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Gln Val
245 250 255
Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu Ser Glu Asn Val Thr
260 265 270
Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn Leu Gln Trp Tyr Arg
275 280 285
Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn
290 295 300
Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val Arg Pro Asn Asp Ser
325 330 335
Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Asn Asp Gly Asn Ala Arg Trp Thr Phe Gly
340 345 350
Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr
370 375 380
Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Leu Ser Val Lys Thr
385 390 395 400
Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr
405 410 415
Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile
420 425 430
Tyr Phe Tyr His Gly Leu Ile Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp
435 440 445
Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile
450 455 460
Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Thr
465 470 475 480
Ile Gly Ala Asn Ala Ile Ile Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val
485 490 495
Asp
<210> 97
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 97
Met Ala Gln Gln Val Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu
1 5 10 15
Ser Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile
35 40 45
Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val
50 55 60
Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val
65 70 75 80
Arg Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Asn Asp Gly Asn Ala
85 90 95
Arg Trp Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His
130 135 140
Leu Ser Val Lys Thr Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile
145 150 155 160
Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Tyr His Gly Leu Ile Ile Asp Asp Ser
180 185 190
Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe
195 200 205
Ser Thr Leu Lys Ile Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr
210 215 220
Leu Cys Ala Ser Thr Ile Gly Ala Asn Ala Ile Ile Phe Gly Pro Gly
225 230 235 240
Thr Arg Leu Glu Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Leu Ile Asn Pro
290 295 300
Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
325 330 335
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr
340 345 350
Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
385 390 395 400
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
405 410 415
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420 425 430
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val
435 440 445
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450 455 460
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
465 470 475 480
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
485 490 495
Lys
<210> 98
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 98
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser
180 185 190
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Gln Val
245 250 255
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260 265 270
Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn Leu Gln Trp Tyr Arg
275 280 285
Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn
290 295 300
Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser
305 310 315 320
Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val Arg Pro Asn Asp Ser
325 330 335
Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Asn Asp Gly Asn Ala Arg Trp Thr Phe Gly
340 345 350
Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Thr
370 375 380
Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Leu Ser Val Lys Thr
385 390 395 400
Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr
405 410 415
Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile
420 425 430
Tyr Phe Tyr His Gly Leu Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp
435 440 445
Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Met Lys Ile
450 455 460
Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Thr
465 470 475 480
Ile Gly Ala Asn Ala Ile Val Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Glu Val
485 490 495
Asp
<210> 99
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 99
Met Ala Gln Gln Val Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Asn Val Gln Glu
1 5 10 15
Ser Glu Asn Val Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Lys Trp Thr Leu Gln Asn
20 25 30
Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Thr His Leu Ile
35 40 45
Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val
50 55 60
Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Thr Asn Val
65 70 75 80
Arg Pro Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Phe Cys Ala Asn Asp Gly Asn Ala
85 90 95
Arg Trp Thr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Thr Asn Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Glu Gly Gly Thr Gly Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His
130 135 140
Leu Ser Val Lys Thr Gly Gln Ser Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile
145 150 155 160
Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Arg Gly
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Tyr His Gly Leu Val Ile Asp Asp Ser
180 185 190
Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe
195 200 205
Ser Thr Met Lys Ile Gln Pro Val Thr Pro Ser Asp Ser Ala Leu Tyr
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Leu Cys Ala Ser Thr Ile Gly Ala Asn Ala Ile Val Phe Gly Pro Gly
225 230 235 240
Thr Arg Leu Glu Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
245 250 255
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260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val
275 280 285
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290 295 300
Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr
305 310 315 320
Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
325 330 335
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr
340 345 350
Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
355 360 365
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
385 390 395 400
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
405 410 415
Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
420 425 430
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val
435 440 445
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr
450 455 460
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
465 470 475 480
Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
485 490 495
Lys
<210> 100
<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 100
Met Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly
20 25 30
Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys
50 55 60
Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser
180 185 190
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Gly Val
245 250 255
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260 265 270
Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg
275 280 285
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Leu Ile Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys
305 310 315 320
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325 330 335
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385 390 395 400
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420 425 430
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Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
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<211> 494
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 多肽
<400> 101
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Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala
65 70 75 80
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85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr
165 170 175
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180 185 190
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210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala Gly Val
245 250 255
Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly Gln Glu Val Thr
260 265 270
Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asp Tyr Leu Phe Trp Tyr Arg
275 280 285
Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Tyr His Gly
290 295 300
Leu Val Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys
305 310 315 320
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325 330 335
Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Thr Ile Gly Ala Asn Ala
340 345 350
Ile Val Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Asn
355 360 365
Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu
370 375 380
Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe
385 390 395 400
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405 410 415
His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala
420 425 430
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435 440 445
Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
450 455 460
Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro
465 470 475 480
Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp
485 490

Claims (23)

1.一种T细胞受体(TCR)，其具有结合SLLMWITQC-HLA A2复合物的特性，并包含TCRα链可变域和/或TCRβ链可变域，其特征在于，所述TCR包括下表所示的α和β链可变域组合：
或者，所述TCR包括下表所示的α和β链可变域组合：
2.如权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体对SLLMWITQC-HLA A2复合物的解离平衡常数KD≤3.2μM。
3.如权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR是αβ异质二聚TCR，其具有α和β链恒定域序列，其半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成二硫键。
4.如权利要求3所述的T细胞受体，其特征在于，半胱氨酸残基在所述TCR的α和β链恒定域之间形成人工二硫键。
5.如权利要求4所述的T细胞受体，其特征在于，在所述TCR中，形成人工二硫键的半胱氨酸残基取代了选自下列的一组或多组位点：
TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser77；
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser17；
TRAC*01外显子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Asp59；
TRAC*01外显子1的Ser15和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu15；
TRAC*01外显子1的Arg53和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser54；TRAC*01外显子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ala19；和
TRAC*01外显子1的Tyr10和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Glu20。
6.如权利要求1-5中任一所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCRα链可变域和/或β链可变域的疏水芯发生突变。
7.如权利要求6所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR是由α可变域和β可变域组成的单链TCR，所述α可变域和β可变域由一柔性短肽序列连接。
8.如权利要求7所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR的疏水芯突变发生在SEQ IDNO:75所示α链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：13I、19A、21M和79S；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:75所示的编号；和/或
所述疏水芯突变发生在SEQ ID NO:76所示β链可变域的选自下组的一个或多个氨基酸残基位点：11E、13T和82S，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:76所示的编号。
9.如权利要求8所述的T细胞受体，其特征在于，疏水芯突变后的所述TCR的α链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：13V、19V、21I和79V，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:75所示的编号；和/或
疏水芯突变后的所述TCR的β链可变域包括选自下组的一个或多个氨基酸残基：11L、13V和82V；其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO:76所示的编号。
10.如权利要求9所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR包括下表所示的α和β链可变域组合：
11.如权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。
12.如权利要求11所述的T细胞受体，其特征在于，与所述T细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或它们的组合。
13.如权利要求12所述的T细胞受体，其特征在于，与所述T细胞受体结合的治疗剂为连接于所述TCR的α或β链的C-或N-末端的抗-CD3抗体。
14.如权利要求13所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCRβ链与抗-CD3抗体结合后的氨基酸序列选自下组SEQ ID NO:100和101。
15.如权利要求13所述的T细胞受体，其特征在于，所述TCR与抗-CD3抗体结合后的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:92、93、94、95、96、97、98和99。
16.一种多价TCR复合物，其特征在于，包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为上述权利要求中任一项所述的TCR。
17.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-15中任一项所述的T细胞受体的核酸序列或其互补序列。
18.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求17中所述的核酸分子。
19.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求18中所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求17中所述的核酸分子。
20.一种分离的细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1-15中任一项所述的TCR。
21.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1-15中任一项所述的TCR、或权利要求16中所述的TCR复合物、或权利要求20中所述的细胞。
22.权利要求1-15任一项所述的T细胞受体、权利要求16中所述的TCR复合物或权利要求20中所述细胞的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
23.一种制备权利要求1-15中任一所述的T细胞受体的方法，其特征在于，包括步骤：
(i)培养权利要求19所述的宿主细胞，从而表达权利要求1-15中任一所述的T细胞受体；
(ii)分离或纯化出所述的T细胞受体。
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