MXPA01002248A - Anticuerpos de alta afinidad. - Google Patents

Abstract

Anticuerpos monoclonales de alta afinidad, en donde la afinidad se caracteriza por: (incubar la primera y segunda muestras del anticuerpo en pozos de placa microtitulo recubiertos con antigeno a una concentracion seleccionada para estar dentro de la parte lineal de una curva estandar a pH 7.2 durante 1 hora a 37¦C; (ii) eliminar el anticuerpo sin enlazar de ambas muestras; (iii) incubar la primera muestra con PBS a pH 7.2 durante 1 hora a 37¦C, y reducir el pH de la segunda muestra a pH 3 o por debajo e incubar durante 1 hora a 37¦C; (iv) eliminar el anticuerpo sin enlazar de ambas muestras; (v) incubar ambas muestras con anti-anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37¦C; (vi) eliminar el conjugado sin enlazar de ambas muestras; y (vii) agregar el sustrato PNPP a las muestras, midiendo 1a absorbancia de las muestras a 405 nm, y determinar 1a cantidad de anticuerpo enlazado a antigeno, en donde la cantidad enlazada en la segunda muestra es >50% de aquella de la primera muestra.

Description

ANTICUERPOS DE ALTA AFINIDAD DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a anticuerpos y su uso terapéutico. Los anticuerpos se han considerado durante mucho tiempo como herramientas potencialmente poderosas en el tratamiento de cáncer y otras enfermedades. Sin embargo, aunque ha habido algunas excepciones notables, este potencial aún no se ha realizado generalmente. Esta relativa falta de éxito puede deberse, al menos en parte, al uso de anticuerpos monoclonales derivados de roedores, que raramente tienen afinidades mayores de 10~9 M. Los anticuerpos que tienen este nivel de afinidad son de limitada utilidad terapéutica, puesto que ha probado ser difícil entregar suficiente anticuerpo al objetivo para efectuar actividad biológica útil. El enlace del anticuerpo a un antígeno es reversible, y a las concentraciones de anticuerpo prácticas para uso in vivo, la disociación será favorecida sobre la asociación. En principio, es posible oponer la disociación del antígeno incrementando la concentración de anticuerpos. Sin embargo, esto puede conducir a afectos secundarios clínicos inaceptables y también incrementaría los costos asociados con la terapia. La presente invención se basa en la realización de los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, pueden producirse los cuales sean "ácido-resistente" y que esta propiedad está asociada con el enlace de alta afinidad de un anticuerpo por su antígeno. • De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo 5 de alta afinidad tiene afinidad caracterizada por: (i) incubar la primera y segunda muestra del anticuerpo en pozos de placa de microtítulo recubiertos con antígeno a una concentración seleccionada para estar dentro de la parte de respuesta lineal de una curva estándar a pH 10 7.2 durante 1 hora a 37°C; (ii) eliminar el anticuerpo sin enlazar de ambas muestras; (iii) incubar la primera muestra PBS a pH 7.2 durante 1 hora a 37°C, y reducir el pH de la segunda muestra 15 a pH 3 o por debajo e incubar durante 1 hora a 37°C. (iv) eliminar el anticuerpo sin enlazar de ambas muestras; (v) incubar ambas muestras con conjugado de antianticuerpo de fosfatasa alcalina durante una 1 hora a 37°C; 20 (vi) eliminar el conjugado sin enlazar de ambas muestras; y (vii) agregar sustrato PNPP a las muestras, medir la absorbancia de las muestras a 405 nm, y determinar la cantidad de anticuerpo enlazado a antígeno, en donde la 25 cantidad unida en la segunda muestra es >50% de aquella de la «^^^MHttüft^^b primera muestra. Preferiblemente, el pH máximo en la etapa (iii) es 2.5, más preferiblemente 2.0. • Se espera que los anticuerpos o fragmentos de 5 anticuerpo con las propiedades "ácido-resistente" favorezcan la asociación más que la diisociación y que por lo tanto tengan tiempos de localización más largos en los sitios objetivo, lo cual resulta en una concentración más alta de anticuerpos localizados en los sitios objetivos. 10 En particular, esta invención se refiere a la producción de un fragmento de anticuerpo Fv de cadena sencilla de alta afinidad. Este ScFv tiene ventajas particulares porque permite mejor selección a un sitio in vivo . 15 DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO La Figura 1 ilustra los resultados logrados para la ácido resistencia de anticuerpos monoclonales de oveja y ratón y Fvs de cadena sencilla con afinidad a antígeno carcinoembriónico a diversos valores de pH . 20 Los anticuerpos monoclonales ácidos resistentes de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse usando diversa técnicas. Por ejemplo, puede aplicarse la tecnología clásica de hibridoma, que comprende la fusión de B-linfocitos de animales inmunizados que secretan anticuerpos de alta 25 afinidad con un socio fusionado apropiado. Un método alternativo es purificar el ARNm de linfocito seleccionado y usar la técnica de PCR para amplificar los genes de anticuerpos requeridos. La tecnología de exhibición de Fagos y otras técnicas para la exhibición de fragmentos de anticuerpos también pueden usarse para obtener los genes de anticuerpos de bibliotecas nativas o inmunizadas después de los procedimientos de selección apropiados. El gen de anticuerpo puede co-expresarse con o de otra forma unirse químicamente a toxinas, radioisótopos o enzimas o cualesquier otras moléculas deseables para proporcionar una proteína fusionada con fuertes características de enlace. En una alternativa adicional, los anticuerpos pueden producirse por animales transgénicos como se describe en la US-A-5770429. El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo, que comprende cadenas pesadas y ligeras, y regiones constantes y variaoles. Alternativamente, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo F(ab')2, Fab, Fv o fragmentos Fv de cadena sencilla, con la condición de que al menos parte de la región variable este presente lo cual confiere la propiedad de "ácido resistencia". El anticuerpo también puede ser un anticierpo animal, quimérico o humanizado. Un método adecuado para producir anticuerpos humanizados se describe en la WO-A-92/15S99. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo es un fragmento Fv de cadena sencilla, el fragmento Fv de cadena sencilla comprende regiones variables de cadena pesada y cadena ligera enlazadas por un péptido • adecuado . 5 Los anticuerpos de la presente invención pueden definirse por sus propiedades ácido resistentes, las cuales pueden caracterizarse por una prueba de inmunosorbente enlazado a enzima lavada con ácido (EIA) , como se describió anteriormente. Típicamente el valor de A405 obtenido por EIA 4fc 10 representará un enlace de anticuerpo de >50% para una muestra pH 3 o por debajo, comparado con el valor para la muestra a pH 7.2. Preferiblemente, el valor de 0s de una muestra pH 2 representará un enlace de anticuerpo de >60% más preferiblemente 70% de lo obtenido a pH 7.2. 15 El animal que se somete a inmunización no es un roedor, pero se selecciona para dar anticuerpos de alta afinidad. Cualquier mamífero grande puede usarse y los animales adecuados incluyen conejos, cabras, vacas y ovejas.

• Puede usarse un anticuerpo de la invención en 20 terapia y puede formularse en composiciones adecuadas con un excipiente, diluyente o portador fisiológicamente aceptable. Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. Ejemp'lo 1 Se inmunizaron ovejas con antígeno 25 carcinoembriónico (CEA) en adyuvante de Freund completo, después se impulsaron tres veces con antígeno en adyuvante de Freund incompleto. Los animales se sacrificaron después del impulso final y se removieron los nodulos linfáticos. • Las células de nodulos linfáticos se lavaron 5 después y se fusionaron con socio de fusión de heteromieloma de oveja SFP3.2. Las células fusionadas se sembraron a una densidad total de aproximadamente 106 por ml en un medio que contiene HAT (Life Technologies) . Estas muestras se seleccionaron después por hibridomas que secretan anticuerpos JB 10 de alta afinidad al antígeno especificado usando una EIA normal y una EIA lavada con ácido. Las pruebas de selección EIA estándar se llevaron a cabo como sigue: Placas de prueba Maxisorb (NUNC) se recubrieron con 15 CEA (0.4 µg/ml en solución salina regulada con fosfatos a pH 7.2), 100 µl por pozo y se dejaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron después tres veces usando una solución salina regulada con fosfatos a pH 7.2 con detergente Tween 20 • 0.01%. Cualesquier sitio reactivos restantes o de las placas 20 se bloquearon por la adición de 200 µl por pozo de proteína de leche libre de grasa al 0.2% en PBS a pH 7.2 a 37°C durarte *í hora. Las placas se lavaron después en PBS como se describió anteriormente y 45 µl de la muestra de anticuerpo se agregaron a los pozos de las placas. Las muestras se 25 incubaron durante 1 hora a 37°C y después se lavaron como se describió previamente. El anticuerpo enlazado se detectó usando anticuerpo de burro anti-oveja conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma A5187 diluido 1/5000 en PBS a pH 7.2 con 1% BSA) . Las placas se lavaron después y se agregó 100 µl por pozo de solución de PNPP (Sigma N2770) . La absorbancia se midió usando un espectrofotómetro a 405nm con solución salina regulada con fosfatos como un control. Las pruebas de selección EIA lavadas con ácido se llevaron a cabo como sigue: El recubrimiento y enlace de las muestras de anticuerpos fue como se describió para la EIA estándar anterior. Sin embargo, después de la incubación con las muestras de anticuerpos, las placas se lavaron y se agregó 200 ul por pozo de HCl (10 mM de solución Patrón) a pH 2 durante 1 hora a 37°C. Después de tres lavados el anticuerpo que permanece unido al antígeno se detectó usando anticuerpo de burro anti-oveja conjugado con fosfatasa alcalina y PNPP como se describió anteriormente. Para asegurar que se estaba haciendo una comparación apropiada entre los anticuerpos a diferentes concentraciones, cada muestra se seleccionó para dar un valor de A405 de aproximadamente 1.0 en la EIA normal (es decir en la parte de respuesta lineal de la curva de EIA) . Tres hibridomas (1D2, 6G11 y 6H9) secretaron anticuerpos que dieron una retención mayor del 50% de enlace en la EIA lavada con ácido, en comparación al enlace EIA no lavada con ácido. Ejemplo 2 Un fragmento Fv de cadena sencilla se produjo del hibridoma 6H9 anterior, como sigue: Se purificó ARNm de las células de hibridoma cultivadas usando oligo-dT celulosa. Se sintetizó ADN de hebra sencilla complementario al ARNm (ADNc) por transcripción inversa. Los cebadores universales, diseñados de las regiones constantes de los genes de anticuerpos de cadena pesada y ligera de oveja se usaron en reacciones separadas de transcripción inversa para sintetizar el ADNc para las regiones variables de anticuerpos. El ADNc se amplificó después por la reacción en cadena de polimerasa para hacer ADN de doble hebra usando los cebadores diseñados de las secuencias de estructuras variables de cadena pesada y ligera. Se usaron reacciones en cadena de polimerasa separadas para amplificar las regiones de cadena pesada y ligera. Los productos se analizaron después por electrofóresis en gel de agarosa y las bandas de ADN equivalente a los genes de cadena ligera y pesada se cortaron del gel y se purificaron. Se mezclaron cantidades equimolares de ADN de cadena pesada y ligera variable junto con un oligonucleótido de ADN enlazante. O el ADN enlazante codificado para la secuencia de aminoácidos (Gly4Ser)3 con nucleótidos adicionales complementarios al extremo 3' de la región variable de cadena pesada y el extremo 5' de la región variable de cadena ligera. Las tres moléculas de ADN se desnaturalizaron, se templaron y se extendieron en la primera etapa (sin cebadores) de una reacción de PCR de dos etapas de manera que los fragmentos se unieron, ensamblando con eso el Fv de cadena sencilla. El ADN de Fv de cadena sencilla se amplificó en la segunda etapa de PCR usando un par de cebadores derivados de los límites de la región variable de cadena pesada y ligera con la adición de los sitios de reconocimiento de enzima de restricción para A1 44Í y Notl. El producto del gen Fv de cadena sencilla se analizó por electroforesis en gel de agarosa y se purificó. El Fv de cadena sencilla se digirió después con las enzimas de restricción A1 44Í y Notl y se clonó dentro de un vector de expresión. El vector se uso después para transformar E. Coli HB 2151, y se permitió ocurrir la expresión de la proteína. El vector se diseño para incluir una marca hexa-histidina en el límite COOH del SFv. Fv de cadenas sencillas se purificó usando cromatografía de afinidad de quelato de níquel y se analizó por SDS-PAGE. La secuencia de aminoácidos para la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera se describe en la secuencias de identificación Números 2 y 4, respectivamente. Una EIA lavada con ácido también se llevó a cabo para determinar las propiedades ácido resistentes del Fv de cadena sencilla. La EIA lavada con ácido se llevo a cabo como sigue: Se prepararon placas microtítulo recubiertas con antígeno carcinoembriónico (CEA) como se describió previamente. Muestras de Fv de cadena sencilla (6H9) se diluyeron a un rango de concentraciones entre 1 ng/ml y 100 ng/ml en PBS a pH 7.2 conteniendo 1% de albúmina de suero bovino (BSA) . Se agregaron muestras de 100 µl a los pozos de placa microtítulo y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las placas se lavaron después, 200 µl por pozo de citrato agregado, y las placas se incubaron durante 1 hora a 37°C. En este caso, las preparaciones acidas se hicieron usando una solución patrón de citrato 100 mM diluida a valores de pH de 4.0, 3.5, 3.0, 2.5 y 2.0 en la mezcla de reacción. Se uso PBS a pH 7.2 como un control de referencias. Las placas se lavaron después y se agregaron 100 µl por pozo de anticuerpo anti-tetra-histidina de ratón (Qiagen) (100 ng/ml diluida en PBS a pH 7.2, con 1% de BSA) y se incubó durante una 1 hora a 37°C. Después del lavado de placa, las muestras se incubaron durante 1 hora a 37°C, con 100 µl por pozo de cabra antiratón conjugado con fosfatasa alcalina (SIGMA A3688 diluida 1/1000 en PBS con 1% de BSA a pH 7.2) . Las placas se lavaron después, se trataron con PNPP como se describió previamente y la absorbancia se midió usando un espectrofotómetro a 405 nm. Como un control para la resistencia de ácido, se incubaron muestras de sFv con PBS a pH 7.2 para generar una • curva de respuesta EIA para las muestras SFv. La región 5 lineal, una concentración de 10-20ng/ml de la muestra SFv dio una absorbancia de (A405) de 1.0-1.5 y por lo tanto se uso para determinar la cantidad de anticuerpo enlazado en las muestras lavadas con ácido como un porcentaje de la cantidad enlazada en la muestra de referencia. 10 Las propiedades ácido resistentes del anticuerpo completo 6H9 y el Fv de cadena sencilla 6H9 se compararon con el anticuerpo completo del antígeno anti-carcinoembriónico derivado de ratón, A5B7 y el Fv MFE de cadena sencilla. Los resultados se muestran en la Figura 1, con el enlace antígeno 15 de los anticuerpos derivados de ratón estando reducidos susta.ncialmente a pH 3.5 y menos del 5% a pH 2.5. En contraste, los anticuerpos 6H9 retienen >70% del antígeno a pH 3.5, >60% a pH 2.5 y >50% a pH 2.0. •

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal de alta afinidad, en donde la afinidad está caracterizada por: • (i) incubar la primera y segunda muestra del 5 anticuerpo en pozos de placa de microtítulo recubiertos con antígeno a una concentración seleccionada para estar dentro de la parte de respuesta lineal de una curva estándar a pH 7.2 durante 1 hora a 37°C; (ii) eliminar el anticuerpo sin enlazar de ambas 10 muestras; (iii) incubar la primera muestra PBS a pH 7.2 durante 1 hora a 37°C, y reducir el pH de la segunda muestra a pH 3 o por debajo e incubar durante 1 hora a 37°C. (iv) eliminar el anticuerpo sin enlazar de ambas 15 muestras; (v) incubar ambas muestras con conjugado de antianticuerpo de fosfatasa alcalina durante una 1 hora a 37 °C; (vi) eliminar el conjugado sin enlazar de ambas • muestras; y 20 (vii) agregar sustrato PNPP a las muestras, medir la absorbancia de las muestras a 405 nm, y determinar la cantidad de anticuerpo enlazado a antígeno, en donde la cantidad unida en la segunda muestra es >50% de aquella de la primera muestra. 25 2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de anticuerpo enlazado en la segunda muestra es >60% del enlazado en la primera muestra. 3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 y la reivindicación 2, caracterizado porque el pH en la etapa (iii) se reduce a pH 2.5-pH 2.0. 4. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque no es de roedor . 5. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque tiene afinidad por un antígeno asociado con tumor. 6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el antígeno es antígeno carcinoembriónico . 7. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque es un Fv, ' Fv de cadena sencilla, F(ab')2 Fv o fab. 8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido definida en SEC. DE IDENT. No. 2 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido definida en la SEC. DE IDENT. No. 4, o una variante de la misma teniendo al menos las mismas propiedades determinadas por las etapas definidas en la reivindicación 1. 9. La molécula de polinucleótido que codifica un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótido definida en la SEC. DE IDENT. No. 1 y 3, o una variante de las mismas. 10. El vehículo de clonación caracterizado porque comprende la molécula de polinucleotido de conformidad con la reivindicación 9.