CS209691A3 - Synthetic peptides and their mixtures for the detection of hiv antibodies - Google Patents

Description

JUl/l. J- advokátní kancelářPatenty, ochranné zní nikyprůmyslové vzory, licence 11505 Praha 1, Štěpánská 16

Syntetické peptidy a jejich- směsi pro-detekci protilátekk HIV -Λ?;* s

Podstata, vynálezu' I*. <·

Vynález se týká nových cyklických peptidů a jejich,samostatné kombinace a současně lineárních peptidů spolus cyklickými pro detekci protilátek k HIV .

Dosavadní- stav techniky

Syndrom imunodeficience (AIDS) , komplex spojený sAIDS a takzvaný stav pre-AIDS jsou onemocnění, způso-bená retrovirem, virem' HIV ÍHuman Immunodeficiency Virus).Tento virus způsobující AIDS , HIV-1 , je dobře charakte-risován. a je také znám pod názvy HTLV-III LAV-1 a> ARV.jiný lidský patogenní reťrovirus HIV-2 .- (dříve, známý .ja-\' 'ko LAV-2) byl nyní nalezen u pacientů, postižených AIDSa pocházejících ze západní Afriky (viz napříkladWO 87/04459) . Nedávno bylo prokázáno (Guyader a kol.Nátuře 326 662 až 669 , 1987) , že tento virus HIV-2 obsahuje řadu sekvencí společných s HIV-1 a SIV (Si-mian Immunodeficiency Viruses) . Přestože jsou' při značení aminokyselin používány různé 2 tr— ν'% </'/ -Ξι*·_ι_ —7»'. •"v .ile.=I, - -le.u=.L,-trp=W, tyr=Y, ^Jsys.témy ’ číslování," v tomto .vynálezu jsme pro zjednodušení až hlediska snadnějšího porovnání, zvolili systém číslovánípublikovaný Ratnerem. a kol., Nátuře 313, 277-284, 1985 u HIV-I bílkovin a publikovaný Guyaderem a kol., Nátuře 326,662-669 (1987) pro bílkoviny HIV-2. Aminokyseliny jsou v tomto vynálezu značeny jednopísměnkovým kódem: ala=A, asn=N,asp=D,_. .cys=C,. . gln=Q., glu=E, ...gly^G, his=H., lys=K, met=M, phe=F, pro=P, ser=S, thr=T, —val-=V-. — -------———---

Na počátku byly v imunodiagnostických testech nastanovení protilátek v seru pacientů nakažených HIV-1,používány jako antigeny celé viry. Druhá generace testů již využívala polypeptidové sekven ce zí skaň é pomoc í_genové h o_ inžeňýřšXví“ CábřťďiTIa á^koL· Bió7Technology 4, 128-133 (1985) a Chang a kol. Bio/Technology 3, 905-909 (1985.) popisují např. použití virální proteinových fragmentů,syntetizovaných bakteriemi, s 82 a 102 aminokyselinovýmizbytky. EPA 202314 a 114243 · uvádí oblasti gp41 a gpl20, rekombinantní,které. jsou. polypeptidové imuno re aktivní buď samostatně nebo ve směsích. Shoeman a/'kol·.,' Anal.Biochem. 161,. 370-379 (1987) uvádí několik polypeptidů z gp41, jež jsou imunoreaktivní s protilátkamipřítomnými v seru pacientů nakažených HIV-I. Žádné z výšejmenovaných stanovení však není zcela přijatelné, vzhledemke své nedostatečné citlivosti. Při užití těchto testů jemožné, že virus přítomný v krvi unikne pozornosti, což můžepotencionálně vést k rozšiřováni nákazy mezi příjemcikrevních produktů prostřednictvím nositelů, u nichž infekcenebyla rozpoznána. Současně je problémem i nedostatečnáspecifita těchto testů, což může mít za.následek, že někteří žďráví\ jedinci mohou být chybně označeni za nositele AIDS.

Tyto ‘chyby mohou být způsobeny přítomností nečistot, alesoučasně svůj podíl mohou na tomto faktu nést i HIV podobnéλ epitopy (antigenní* determinanty)·,, které , však nejsou původci AIDS, ale jsou přítomny ve vzorcích antigenů. Např.

Gallaher, Cell 50, 327-328, 1987 popisuje oblast gp41 viru HIV-1, která má stejnou sekvenci pěti sousedníchaminokyselinových zbytků jako dýchací syncitial virus ačtyři stejně rozmístěné aminokyseliny jako F1 glykoproteinspalničkového viru. Potom, dokonce i vysoce purifikovanýrekombinantní polypeptid obsahující takovou oblast, nebojakékoli další společné oblasti, ještě objevené, by mohlybýt potencionálně odpovědné za chybné výsledky a průvodní ‘ JÍ? nepřijatelnou specifitu. Konečně tato první stanovení ?neumožňují detekci velmi nízkých koncentrací HIV protilátek.

To způsobuje.neschopnost těchto stanovení, aby byla použita , ve velmi ranných stádiích po nakažení a je příčinouopožděného ošetření a možnosti rozšířeni infekce *prostřednictvím krevních vzorků a jiných tělníčh tekutin, '? ještě před účinným rozpoznáním infekce AIDS. V současné době, ve snaze vyřešit výše uvedené problémy, jsou vyvíjeny metody a diagnostické prostředky,které využívají kratší HIV antigeny. Dále jsou k dispozici iempirické metody k identifikaci peptidových sekvencí,odpovídajících jedinečným a vysoce konservativním epitopůmHIV virů. Pomocí těchto metod lze například provéstselekci krátkých aminokyselinových sekvencí, které jsou .4 pravděpodobně odhaleny na povrchu nativního proteinu a mohoutak sloužit jako detekovatelný prostředek (viz Hopp a Wóods, 3 J. Immunol.Met. 88, 1—18, 1986). Tyto. metody .však nesjou . ·.<’ více* než .indikační. Nicméně jsou používány k identifikaciepitopů, přítomných na povrchu virů způsobujících AIDS.Různé syntetické peptidy pl8, p25, gp41 a gpl20 bílkovinjsou popsány v americkém patentu-US Patent 4, 629,783,International Patent Appl. PCT/U.S86/00831 a EPA 303224.Použití těchto peptidů je výhodné z hlediska jejich . .relativně jednoduché, a .levné, přípravy..- Mnohem_^ůleži_t_ě_jší___je.pak fakt, že při použití těchto peptidů je menší riziko ----s-t-anovení——chybných---vý-s-ledků-/-způsobených--přítomnost í- nečistot nebo existence epitopů, podobných virálnímbílkovinám, které však nesouvisí s onemocněním AIDS.

Zatímco tyto malé peptidy jsou výhodnější z hlediskavyšší specifity, než dřívější rekombinantní polypeptid nebo-použití celých yirálníčh-čaítič přo určení diagnos'y—ÁIĎŠ7-jejich využití je méně než uspokojivé při posuzování celkovécitlivosti stanovení, pravděpodobně proto, , že syntetizovanýepitop není schopen převzít, a udržet konformaci, která jerozpoznatelná AIDS. protilátkami. ..Ačkoliv počet vzorků sera,testovaných v každém z těchto případů, je velmi omezen, .specifita (několik chybných výsledků, pokud vůbec jsou) bylas malými syntetickými peptidy určena jako .velmi vysoká ; H(95$s-100%), avšak celková citlivost se pohybovala mezi80^-90¾. Pouze v jednom případě bylo dosaženo 100¾ . citlivosti, a to v případě kdy bylo testováno pouze 10vzorků. Např. Smith a kol., J.Clin.Microbiol.25, 1498-1504, 1987 uvádí dva překrývající se peptidy E32 a E34, které jsouvysoce imunoreaktivní. Žádná chybná stanovení nebylazjištěna při testování 240 seronegativních vzorků, avšak třiz 322, seropozitivních vzorků se nepodařilo určit (tzn.citlivost . 99,1¾). Wang a . kol.(Proč.Nati.Acad.Sci 83, popisuje krátký{SGKLICTTAVPWNAS)imunoreaktivní sAIDS. Specifita

Tento peptid jenakažených viry '•/*-^»615:9X6163, 1986) popisuje sérii překrývajících se peptidů '•'/.'(včetně aminokyselinových residuí peptidů E32 a .E34,popisovaných Smithem), mezi nimiž s jedním 21-merním (21- aminokyselin) peptidem bylo .dosaženo 100¾ specifity a 98¾citlivosti (u 228 seropositivních vzorků odebranýchpacientům nakažených AIDS bylo 224 stanoveno jako positivní.Americký patent č.120,027, přihlášený 13. listopadu 1987syntetický peptid v rozsahů 606-620bílkoviny gp41 (HIV-1) protilátkami pacientů, stanovení s tímto peptidem byla téžvynikající (63/63), avšak 6 seropositivních vzorků z 57nemohlo být stanoveno (citlivost 89¾).

Gnann a kol. (J.Virol.61, 2639-2641, 1987 a J.Infec.Dis. 156, 261-267, 1987) také popisuje serie překrývajících se peptidů domnělé imunodominantní oblastibílkoviny gp41 (HIV-1). Gnann. a kol. došel k závěru, že proimunoreaktivitu segmentu bílkoviny gp41-(HIV-1) byl nezbytnýzbytek cys-605. Autoři uvádějí, že peptid, který obsahujesekvenci SGKLIC (606-611), nebyl imunoreaktivní z žádným z22 testovaných vzorků positivního sera, zatímco po přídavkucysteinového residua k N-konci byla z části obnovenaimunoreaktivita, 21 vzorků sera ze 44 reagovalo s7-merním peptidem (48¾ citlivost).

Gnann a kol. (J.Virol) také uvažuje o možnosti, žecysteinové zbytky v pozicích 605 a 611 bílkoviny gp41(HIV-1) by mohly hrát roli u antigenní konformace této oblasti, 1» pravděpodobně utvářením cyklické struktury přes disulfidickévazby. Nikde však nebyla demonstrována. existencesyntetického .peptidů, kde. by dvě cysteinové skupiny byly 6

i,ιA

ΠC . . . ., a „„i’,, spojeny disulfidickými vazbami. 2 ' J · . . ’ 11 . ’ Citlivost stanovení s peptidy popisovanými Gnannem a g

kol., vhodnými pro identifikaci HIV-1 protilátek není 100%. * J

Např. Gnann a kol. (J.Virol.61, 2639-2641, (1987)) uvádí, žé j zatímco s pomocí jejich 600-611 aminokyselinové sekvence \ · bylo určeno 22 z 22 seropositivních vzorků, při podobných ; . testech. ..prováděných v Centru pro_.kontrolu chorob (Centerg_____ _ ; for Disease Control, Atlanta, Ga) se stejnou 12-ti i - --ami-noky-sel-i-novou—sekvencí— (-6 00-^14-)-,—byl—1—z é—7-9-positivních --------L----’ vzorků stanoven chybně. Gnann a kol. dále uvádí vJ.Infect.Dis.156, 261-267, 1987, že tatáž 12-ti aminokyselinová sekvence byla reaktivní se 131 ze 132 vzorků _sera, odebraného pacientům ze Spojených států, infikovaných__

Gnann a kol. , Science 237, 1346-1349, 1987 dálepopisuje krátký syntetický lineární peptid se sekvencí vrozsahu 592τ603 residuí bílkoviny gp42 (HIV-2), která .obsahuje dva cys zbytky v oblasti, homologní k 605-611oblasti gp41(HIV-1). Tento peptid reagoval, s ,5 z 5seropozitivních vzorku pacientů nakažených HIV-2. , V literatuře jsou uváděny i jiné peptidy obsahující aminokyseliny 605-611 bílkoviny gp41 (HIV-1). Patent WO86/06414 popisuje peptid X(39), který je kódován oblastí odpřibližně bp7516 přes bp7593, a peptid XIII(79), kterýje kódován oblastí v rozsahu od bp 7543 přes bp 7593, obaobsahují sekvenci sedmi aminokyselin 605-611. Tyto peptidyjsou popisovány jako lineární a nepředpokládá se jakákolicyklická struktura. WO 87/06005 uvádí, že serie syntetických ’ c' peptidů obklopující sekvenci Cys(605)-Cys(611) . residuí. obalového proteinu HIV-1 (gp41) prochází po solubilizaci. v. “ -.neutrálním* nebo. alkalickém vodném pufru sérií spontánníchoxidativních. transformací. Uvažuje se, že výsledkem jsou,pokud se peptidy užijí v ELISA-testech, náhodná směslineárního monomeru, cyklického monomeru, 'lineárních nebocyklických dimerů a lineárních polymerů různých délek.Patent však ve skutečnosti neukázal přítomnost cyklickýchkomponent a nebyly charakterizovány různé jiné dimery apolymery, které mohly být přítomny. Mimoto se uvažuje, žepolymerní formy jsou nejdůležitějšími složkami proreaktivitu při ELISA-testech. Dále přes možnou existenci komplexních směsí různýchoxidativních forem peptidů, peptidy dříve popisovanéneumožňují včasnou detekci AIDS infekce, tak jak jepožadováno. Např. Gnann akol (J.Virol( uvádí, že pokud jsouvzorky HIV-1 positivních ser zředěny 500x, některé z těchtovzorků jsou pak stanoveny jako negativní, což svědčí o nízkécitlivosti stanovení s pep-tidem při detekci HIV.

Tyto problémy se projevily při použití peptidů, kterébyly chemicky .cyklizoványvytvořením disulfidického můstkumezi důležitými cysteinovýrai residui. Např. viz M.Lacroix akol. , Comparative Performance of Cyclic Versus LineárPeptides In An ELISA Eor HIV-1 a HIV-2 Specific Antibodies(Provedení srovnání cyklických versus lineárních peptidů prodetekci HIV-1 a HIV-2 specifických protilátek v * ,,τ.-,; c1 J, i ELISA-testech), č.3147, AIDS konference červen 1989,

Montreal, Canada; a WO 89/03344. Tento vynález vede ke zlepšení účinku těchtoHIV-1 a HIV-2 protilátek. cyklických peptidů při stanovení

Krt

ěéďWpQDSTATA VYNÁLEZU

jtfý , '.ί ~r M • í.<‘

Podstatou tohoto vynálezu je popis nových sériípeptidů, které jsou zejména přizpůsobeny pro 100% detekciHIV-1 a HIV-2 protilátek a které je možné použít přistanoveních, kdy protilátky jsou přítomny v séru i ve velminízkých koncentracích.

Jestliže podrobněji specifikujeme nové peptidy tohoto „vynále.zu,_jsou selektovány ze značně čistých peptidú, které mají vzorec I nebo II: a-e-x-CSGKLIC-y-f-b' (I) ~ ---------------------605-^6-1-1---------------------------------- kde: x je nezávisle vybráno z jedné z následujícíchanalogových aminokyselinových sekvencí bílkoviny gp41-HIV-l: KILAVERÝLKDQQLLGIWG- (586-604) ; KKILAVERYLKDQQLLGIWG- (585-604), . aminokyselinových sekvencí odpovídajících těm, které jsouodvozeny od homologních oblastí dalších HIV-1 isolátu, aaminokyselinových sekvencí lišících se od výše uvedenýchkonservativními substitucemi, např. takové aminokyselinové -sekvence, které ' jsou charakterizovány přítomností alespoň t jednoho lysinového zbytku v posici 586 nebo současně vposicích 585 a 586; = y-- jestliže .je’ přítomno, je nezávisle vybráno ze ·*.-· skupiriy skládající se z: T1’ -"' .

-T ΊΤ

-TTA

-TTAV

-TTAVP

-TTAVPW

-TTAVPWN

-TTAVPWNA

-TTAVPWNAS

-TTAVPWNASW

-TTAVPWNASWS

-TTAVPWNASWSN

-TTAVPWNASWSNK

-TTAVPWNASWSNKS

-TTAVPWNASWSNKSL

-TTAVPWNASWSNKSLE -TTAVPWNASWSNKSLEQ-TTÁVPWNASWSNKSLEQI, :'< aminokyselinových sekvencí odpovídajících těm sekvencím,které jsou odvozeny od homologních oblastí dalších HIV-1isolátů a aminokyselinových sekvencí odlišujících se od výše . uvedených konservativními substitucemi; e a f, jestliže jsou přítomny, jsou nezávisle vybrány ze skupiny obsahující aminokyselinové sekvence jakéhokoli zi epitopů oblasti, jež zahrnuje posice aminokyselin od posic 586 do 629 bílkoviny gp41 HIV-1 nebo oblasti aminokyselinové .· sekvence, zahrnující posice od 578 do 613 bílkoviny gp36 íl (h Í.í s £ 10 <?t^HÍVr2/<amxnokyselinové sekvence, které odpovídají těm a jsou - - . ΐ·\ V ’ ~ odvozené z homologních oblastí dalších HIV-1 a HIV-2' isolátů, aminokyselinové sekvence, které se liší od výšeuváděných konservativními substitucemi, nebo jakýchkoli kombinací těchto epitopú; a představuje aminokyselinový konec nebo substituentúčinný jako spojovací činidlo a/nebo může sloužit k tomu, žepeptid se stane použitelnějším jako imunodiagnostické _______činidl_o__bez__změněných__antig_enních_ vlastností;_a_* b představuje.karboxylový konec nebo substituent, který je účinný jako jako spojovací činidlo a/nebo může sloužit ktomu, že se peptid stane použitelnějším jako.imunodiagnostické, činidlo bez změněných antigenních i (II) í a-e-xl-CAFRQVC-yl-f-b 597 603 '. kde:' .t. x1 je nezávisle vybráno z jedné z následujích sekvenčních aminokyselinových analogů aminokyselinovésekvence bílkoviny gp36-HIV-2: KVTAIEKYLQDQARLNSWG (578-598)KKVTAIEKYLQDQARLNSWG (577-596), aminokyselinových sekvencí, které odpovídají těm sekvencím,odvozeným od homologních oblastí jiných HIV-2 isolátů aaminokyselinových' sekvenci," které se liší od výše uváděných i Λ., 11 onseřvativními substitucemi, takové sekvence jsou %;sVq.-; charakterizovány přítomností alespoň jednoho lysinového'.' s-: zbytku v posici 578 nebo současně v posicích 577 a 578; yr, jestliže je přítomno,skupiny skládající se z:

H

-HT je nezávislé vybráno ze

-HTT

-HTTV

-HTTVP

-HTTVPW

-HTTVPWV

-HTTVPWVN

-HTTVPWVND -HTTVPWVNDS, aminokyselinových, sekvencí, které . odpovídají těm, jež jsouodvozené . od homologních oblastí jiných HIV-2 isolátů, aaminokyselinových sekvencí,, které.se liší od (výše uvedenýchkónsérvativními substitucemi; á e, f, a, b, jsou definovány stejným; dříve popsanýmzpůsobem. V jiném případě, jsou nové peptidy, popisovné v tomtovynálezu selektovány ze značně čistých peptidů, které majívzorec III a IV: I-i a-e-x2-CSGKLIC-y-f-b (III) 2 kde x , pokud je přítomno, je nezávisle vybráno ze skupiny

t 12 skládající’se z: .. G- · ' WG- ' IWG- GIWG- LGIWG- LLGIWG- _,______:_QLLGIW.G-______:_:______ QQLLGIWG- DQQLLGIWG- . KDQQLLGIWG-LKDQQLLGIWG- " . ---------- Y-mg-Qt-ifg-i-we-’ —- - - -- - -- RYLKDQQLLGIWG- ERYLKDQQLLGIWG- VERYLKDQQLLGIWG- AVERYLKDQQLLGIWG-. LAVERYLKDQQLLGIWG-ILAVERYLKDQQLLGIWG- . RILAVERYLKDQQLLGIWG- aminokyselinových sekvencí, které odpovídají těm, jež byly odvozeny od homologních oblastí jiných HIV-1 isolátů, a aminokyselinových sekvencí lišících se od výše uvedených konservativními substitucemi; a y, e, f, a, b jsou definovány stejným výše uvedeným způsobem, jsou přítomny buď e, či f nebo obě sekvence; a , 13 ’ a-e-V-CAFRQVC-y^f-b (IV) 597 603 kde x , jestliže je přítomno, je nezávisle vybráno zeskupiny skládající se z: G- ' ' , WG- SWG- NSWG- LNSWG- RLNSWG- ARLNSWG- QARLNŠWG- DQARLNSWG- QDQARLNSWG- LQDQARLNSWG- YLQDQARLNSWG-.. KYLQDQARLNSWG- ·'·· EKYLQDQARLNSWG- IEKYLQDQARLNSWG- AIEKYLQDQARLNSWG- TAIEKYLQDQARLNSWG- VTAIEKYLQDQARLNSWG- RVTAIEKYLQDQARLNSWG- aminokyselinových sekvencí, které odpovídají těm, které jsouodvozeny od homologních oblastí jiných HIV-2 isolátů, aaminokyselinových sekvencí, které se liší od výšepopisovaných konservativními substitucemi; a 14 y1, e', f, a, b, jsou’ definovány stejným ' dříve .uvedeným způsobem, jsou přítomny buď e, či f, nebo obě tyto sekvence.

Obzvláště preferovaným pept.idem, který má vzorec I jeBCH-408 a jeho sekvence má následující strukturu: 586 605 611 619 V tomto peptidu jsou inkorpórovány, v f posici 619aminokyselinová sekvence epitopu, která je umístěna v posici606-610 (SGKLI) bílkoviny gp41 HIV-1, a v posici 586 lysin.. _Ob zvi á š .t ě _p.r.e ferovaným peptidem, který, má vzorec II je__ BCH-417 a jeho sekvence má-ňašTěďujici-šťfukťuřn: ....... ‘ a-KVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDSAFRQV-b. 578 597 603 613 V tomto peptidu jsou inkorporovány, v f posici 613aminokyselinová sekvence epitopu, která je umístěna v posici598-602 (AFRQV) bílkoviny gp36 HIV-2, a. v posici 578 jelysin.

PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU Výběr peptidu pro syntézu

Peptidy tohoto vynálezu byly syntetizovány na základěodvození od publikovaných aminokyselinových sekvencí HIV-1 a í 15 'HIVé-2h··'-Mělo by být však zřejmé, že sekvence odvozené od · *. 'V ' . hómólógních oblastí jiných HIV-1 a HIV-2 isolátů'mohou· též. být užity, aniž by došlo k odchýlení z rámce tohoto vynálezu. ' ·

Epitopy v těchto nativních sekvencích byly vybrány propoužití jako e a f v peptidech tohoto vynálezu s použitímrůzných fyzikálně-chemických principů, které slouží jakopomůcka k předpovídání, jaké části polypeptidu jsounejpravděpodóbněji povrchově orientovány a tím pádem majíimunogenní vlastnosti. Ty zahrnují stanovení hydrofilicitypodle Hoppa a Woodse (Proč.Nati.Acad.Sci. 78, 3824-3828, 1981), a další způsoby stanovení popisované Kytem aDoolittlem (J.Mol.Biol. 157, 105-132, 1982). Také empirická ř predikce proteinové konformace (Chou . a Fasman,Ann.Rev.Biochem. 47, 251-276, 1978) je užitečným vodítkem pro předurčení těch částí polypeptidu, které pravděpodobněmají imunogenní vlastnosti. e a f epitopy peptidů tohoto vynálezu zahrnují, alenejsou pouze omezeny na, WGCAF (identifikovaný Norrbym. akol., AIDS Research and Human Retroviruses, VoL· 5, No. 5,1989); KD, SGKL, a LEDQ (identifikované, Norrbym a kol.,AIDS, Vol.3, . No. 1 (1989); LKDQ, CSGKLI, a IWG(identifikované Mathiesenem a kol., Immunology, 67., 1-7, (1989); a ARILAVERYLKD a SGKLICTTAVPWNAS (identifikovanéDopelem a kol., Jol. of Vir.Meth. 25, 167-178 (1989).

Patent také zahrnuje popis modifikací peptidů tohotovynálezu, v důsledku kterých jsou peptidy lépe využitelnéjako imunodiagnostická činidla, aniž by však došlo ke změnějejich antigenních vlastností. Takové modifikace zahrnují: - připojení cysteinového zbytku na amino. nebo 16 4 V kárboxy· konec, aby se usnadnilo spojení peptidu s nosnou ^bílkovinou a heterobifunkčními cross-linking činidly (činidla způsobující . prokřížení), jako _ je sulfosuk cinimidyl-4- { p-maleimidofenyl)butyrát, vhodné činidlo pro usnadnění těchto spojení - připojení určitých aminokyselin na amino nebo —karboxy—konec-,—aby-se—usnadnilo .vzájemné.,spojováni peptidumezi sebou, umožnilo připojení na nosič nebo větší peptid,nebo aby dosTo k modif ikaci—fy-z-i-k-ái-ní-eh- -nebo- chemických..vlastností peptidu. K takovým změnám dochází např. popřídavku tyrosinu, kyseliny glutamové, nebo kyselinyaspartamové, které mohou být užity jako spojovací články ^7^-(-l-i-nk-e-r-y-)—př-ipoj-ené^estero.v_o.u vazbou, lysinu, který jepřipojen jako Schiffova base nebo přes amino-skupíňu·;-á derivatizaci amino konce acylací, amidacíthioglykolové kyseliny, amidací karboxy konce za použitínapř. amoniaku, methylaminu. Výsledkem těchto modifikacíjsou změny výsledného, náboje peptidu, ale mohou také usnadnit tvorbu kovalentní . vazby peptidu na pevný nosič,nebo jiný peptid. V důsledku těchto modifikací pravděpodobně .nedochází ke změnám imunoreaktivity peptidu. '.-Peptidy tohoto vynálezu mohou být také modifikovány změnami spočívajícími v insercích, delecích, či substitucíchv sekvencích peptidů, a to buď konservativních, nebonekonservativních, které by mohly vést k uplatnění určitýchvýhod při jejich použití. Preferované jsou následujícíkonservativni zrněný, které zahrnují: gly, ala; val, ile,leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; ala,ser; ala, thr; ala, val; ala, pro; ala, glu; leu, gin; gly,phe; ile, ser; , a ile, met. . Methionin,.. aminokyselina, která 17 „ f má" sklon' ke spontánní oxidaci, může být také obvyklenahrazena norleucinem, aniž by došlo ke změně antigenicity. . -Vhodné může být také připojení "přívěsek" k peptidůmtohoto vynálezu, který obsahuje malý počet (1-10)hydrofóbních aminokyselin. Takové přívěsky mohou ulehčitpasivní adsorpci peptidu na pevný nosič. Tato modifikace pakmůže být provedena buď na karboxy nebo amino konci.

Preferovanou naadovanou sekvencí je phe-ala-phe-ala.-phe.

Preferovanými cyklickými peptidy tohoto vynálezu, kterémají vzorec I, jsou takové, u nichž x, y, e, f jsoudefinovány následujícím způsobem: j}A., 1 x: KILAVERYLKDQQLLGIWG, y: TTAVPWNAS, e a f nejsou přítomny(BCH-87ck); x: KKILAVERYLKDQQLLGIWG, y: TTAVPWNAS, e a f nejsou přítomny(BCH-266); a x: KILAVERYLKDQQLLGIWG, y: TTAVPWNA, ’ί V '5 f: SGKLI, e není přítomno (BCH-408), BCH-408 je nejvíce * preferován.

Preferovanými cyklickými peptidy tohoto vynálezu, kterémají vzorec II, jsou takové, u nichž x1,· y1, e, f, jsoudefinovány následujícím způsobem: x1: KVTAIEKYLQDQARLNSWG, y1: ’ HTTVPWVNDS a e, f nejsou přítomny (BCH-202ck); x1: KKVTAIEKYLQDQARLNSWG, y1: HTTVPWVNDS a e, f nejsou přítomny (BCH-265); a x1: KVTAIEKYLQDQARLNSWG, y1: HTTVPWVNDS a f: AFRQV a e není přítomno (BCH-417), peptid BCH-417 jenejvíce preferován TABULKA 1 uvádí úplné aminokyselinové sekvence těchtopreferovaných peptidů (zanedbány možné a, b) 18 TABULKA 1 — Sekvence peptidů í í, »ť g HIV-1:

BCH-87ck: KILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS

BCH-2 6‘6":-KKI ΚΑνΕΚΥΕΚΕ>δΘΙ±-6ΤWGC S GKTJCTTAV-PWNA S i

BCH-408: KILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASGKLI HIV-2:

BCH-202ck: KVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDS

BCH-265: KKVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDS

Γ —I

BCH-417: KVTAIEKYLQDQARLNSWGCAFRQVCHTTVPWVNDSAFRQV Příprava lineárních a cyklických peptidů Při přípravě peptidů tohoto vynálezu se dává přednostobecné synthese peptidů v pevné fázi. Pro synthesu mohouvšak být použity i jiné, dobře známé metody. Pryskyřičnýmnosičem je jakákoli vhodná, obecně při synthese peptidů v 1 19 *' pevné'fázi používaná, pryskyřice. S výhodou jsou používányp-benzylalkoholpolystyren a p-methylbenzyldrylaminová . pryskyřice. Po napojení první chráněné aminokyseliny nanosič ňá bázi pryskyřice se ochranná aminoskupina odstranístandardními metodami, obecně používanými při synthesepeptidů na nerozpustném nosiči. Po odstranění této ochrannéaminoskupiny, zbývající chráněná α-amino, a jestliže je tonutné, i chráněné aminokyseliny postranního řetězce jsoupostupně spojovány takovým způsobem, aby byl získánpožadovaný výsledný produkt. Jiná možnost, při spojovánínásobných aminokyselinových skupin před napojenímaminokyselinové sekvence na nosič, spočívá v použitímetodiky uplatňované v roztoku.

Po stanovení techniky následuje výběr příslušnéhočinidla zprostředkující spojení Např. vhodnými spojovacímičinidly jsou N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a to buďsamotný nebo v přítomnosti 1-hydroxyberizotriazolu. Jinoupoužitelnou metodou při spojování je použitípremodifikovaných symetrických anhydridů chráněných,aminokyselin. Nezbytnou α-amino chránící skupinou, použitou pro každou aminokyselinu, která je zavedena, doprodlužujícího se polypeptidového řetězce je9-fluoroenylmethyloxykarbonylová skupina (FMOC). Lze všakpoužívat jakoukoli jinou vhodnou chránící skupinu, avšakpouze tehdy nedojde-li k její degradaci za podmínek reakce aje-lisnadno selektivně odstranitelná v přítomnosti jiných, vrostoucí molekule přítomných ochranných skupin.

Kriteria, kterými se řídí výběr ochranných skupin proaminokyseliny postranního řetězce, jsou následující: (a) stabilita ochranné skupiny vůči různým činidlům za podmínek 20 " reakce, ’ selektivních pro odstranění α-amino ochranné skupiny * fí v každém kroku synthesy, (b) zachování strategických ;] vlastností ochranné skupiny (tj. za podmínek reakce nepodlehnout štěpení) á (c) možnost odstranění ochranné f skupiny na závěr synthesy polypeptidu a za podmínek, kteréjiným způsobem neovlivní strukturu polypeptidu.

Plně chráněné peptidy navázané na nosiči na basipryskyřicejsou štěpeny z p-benzyloxyalkoholové pryskyřice 50 ---_60-%r oz tokem_kys.e 1 iny_trifluoroctové v methylenchloridu po _________2 dobu 1 až 6 hodin při teplotě místnosti v přítomnosti látek, " které mají schopnost zachycovat vznikající vedlejší produkty i: (čistidla), např. anisolu, thioanisolu, ethylmethylsulfidu, _1,2-ethanedithiolu a podobných činidel. Ochranné skupiny, -------------—— působením HF. '

Cyklické peptidy popisované v tomto vynálezu jsou ; připraveny přímou oxidativní konverzí chráněných nebonechráněných SH-skupin na disulfidovou vazbu následujícímidobře, známými technikami petidové synthesy. Preferovaná j metoda zahrnuje přímou oxidaci volných SH-skupin { hexakyanoželezitanem draselným. Předpokládá se, že takové ’ cyklické peptidy zachovávají rigidnější konformaci, která ' l { může podporovat vazbu s HIV protilátkami.

Peptidové směsi a polymery Větší peptidy jsou v rámci tohoto vynálezu tvořenykovalentním spojováním jednoho nebo více peptidů, které jsouv tomto vynálezu popisovány. Jsou. uvažovány i polymery (a to" 5 21 . tiomopolymery i kopolymery) těchto peptidů. V.' rozsahu i tohoto vynálezu jsou i j iné cyklické peptidya1 směsi cyklických peptidů, popisovaných v tomto vynálezu adalší od HIV odvozené cyklické/ a lineární péptidy. Bylozjištěno, že tyto směsi jsou zodpovědné za překvapivěvysokou citlivost stanovení HIV-1 a HIV-2 protilátekpřítomných ve vzorcích sera, které jsou postupně zřeďovány av serokonverzních řadách (HIV-1). Dále bylo zjištěno, že připoužití těchto směsí lze dosáhnout vysoké specifitystanovení, čímž dochází k minimálnímu počtu chybnýchstanovení.

Takové směsi obsahují alespoň jeden’ cyklický peptid®obecného vzorce I nebo III (preferovány jsou BCH-87ck,BCH-266 nebo BCH-408 a přednost se dává více BCH-408) vkombinaci s alespoň jedním cyklickým peptidem obecnéhovzorce II nebo IV (preferovány jsou BCH-202ck, BCH-265 neboBCH-417, přednost se dává -více BCH-417).. .. ..

Stanovení HIV protilátek '

Peptidy a směsi peptidů popisované v tomto vynálezujsou použitelné f jako diagnostická činidla pro stanoveníprotilátek spojených' s AIDS dobře známými metodami. Tytometody zahrnují ELISA-test, hemoaglutinaci, single-dot amulti-dot metody a stanovení. Hlavní výhodou při použití jespecifita těchto peptidů a vysoká citlivost stanoveníprotilátek proti AIDS residuim, obzvláště pak jejichschopnost stanovit, ve srovnání s dosud známými antigeny,velmi nízké hladiny AIDS infekce. 22

Jednou z používaných metod pro stanovení protilátek ' s £ proti HIV-1 a HIV-2 je tzv. "Western Blotting" analysa p (přesávání proteinů) (Towbin H., Staehelin T. a Gordon J.f * jí

Proč.Nati.Acad.Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)). Při použití této techniky je peptid nebo peptidy tohoto vynálezu 5 í? naneseny na nitrocelulosový papír. Nitrocelulosový papír je - ......nasycen a potom -je -na -něj--aplikováno .s.enmP.JiteM. má__být_. ________________? stanoveno. Po promytí se na nitrocelulosový papír aplikuje ;; -gn-Zymeni—-značená-^· protilátka—proti—lidskému—I-gG^—Enzymová--—-- aktivita je pak stanovována pomocí vhodného substrátu. ;/·

Samozřejmě i jiné způsoby značení, např. radioaktivní, nebo £ fluorescenční mohou být použity. -P-re-ferovanou,-obecnou_a_klasickou technikou pro_£ stanovení protilátek proti HIV-1 nebo HIV”2"^ využívající £ peptid nebo peptidovou směs tohoto vynálezu, je ELISA-test. Při tomto stanovení jsou např. peptid, peptidová směs nebo p' Γγ kombinace popisované v tomto . vynálezu, adsorbovány nebo £ kovalentně navázány na., jamky mikrotitračních destičky. Do i.i jamky je aplikováno sérum nebo. složka, jež má být stanovena. jí

Po promytí. je.do jamek přidána protilátka proti lidskému IgG '*4- nebo IgM značené peroxidasou. Stanovení aktivity peroxidasy,. '· se provádí s příslušným substrátem, např. s o-fenyldiaminem. &amp;

Peroxidasa může být nahrazena jinou značkou např.radioaktivní fluorescenční, chemiluminiscenční nebo značkouemitující infračervené světlo, aniž by došlo ke změněpoužitelnosti názorného stanovení. Při ELISA-testu je možné použít individuální peptidy f nebo jejich kombinaci. Použití kombinace je výhodnější, £ protože to při stanovení protilátek dovoluje kombinovat £ nejúčinnější peptidy a. současně vyloučit ,ty, které by i 23 -způsobovaly chybné odezvy. V průběhu těchto studií byloobjeveno, že některé vzorky séra dávají správné pozitivnívýsledky s použitím směsí peptidů, zatímco s použitímindividuálních peptidů jako an.tigenů jsou . odezvy :rozporuplné. Proto v souladu s tímto vynálezem se prostanovení HIV-1 a HIV-2 protilátek dává nejvíce přednostkombinaci peptidových antigenů.

Jinou metodou pro stanovení protilátek proti HIV-1 a HIV-2 pomocí peptidů nebo směsi peptidů, popisovaných vtomto vynálezu, je enzymově-imunologické stanovení nazvané"Sendvičová metoda s dvěma antigeny" (Double-Antigen-Sandwich-Method". Tato metoda je založena na práci

Maioliniho, jak je popsáno v publikaci Immunological Methods20. 25-34 (1978). Podlé této metody je sérum nebo jinásložka, která má být stanovena, uvedena do kontaktu s pevnoufází nosiče, který je potažen peptidem nebo směsí peptidůtohoto vynálezu (záchytná vrstva), a s peptidem nebo směsí, *'peptidů tohoto vynálezu, které jsou značeny peroxidasou *<·;(snímací vrstva). .Imunologická reakce se provádí v jednomnebo dvou krocích; Jestliže’je imunologická reakce prováděnave dvou krocích, je vhodnější volit promývací krok mezidvěma inkubacemi, je možné jej provést i po imunologickéreakci, či reakcích. Potom je aktivita peroxidasy stanovenapomocí příslušného substrátu, např. o-fenyldiaminu. V tomtostanovení mohou být též použity jiné enzymy a chromogeny,včetně těch jež byly již popsány.

Vhodnými pevnými nosiči jsou organické a anorganicképolymery, jako jsou škrob, dextrany, přírodní a modifikovanécelulosy, polyethyleny, polystyreny, polyakrylamidy,agarosy, .magnetity, prášky porésního skla, 24 - v;-·' pblyvinyldieňflučrid (kynar) a latex/ vnitřní stěna nádob;.........- | ·./' * : např.. zkumavek, titračních destiček, či kyvet, skleněného i í

syntetického materiálu stejně dobře i povrch pevných částic, ,.A např. skleněné a syntetické tyčinky, tyčinky se zesíleným $ koncem, tyčinky ukončené lalokem nebo lamelou. Obzvláště ... vhodnými pevnými nosiči jsou skleněné nebo syntetické

.....kuličky.. . ...... ...... . ................ _ J

Peptidy a směsi peptidů popisované v tomto vynálezu ? — -jsou—n-e-jen—pou-žite-l-né—při— stanovení~pr-otilá.tek_p.r.o_ti_Hiy±L_;_. , ;; nebo HIV-2, ale také nepřímo pro stanovení samotných HIV-1 a ř HIV-2, protože tyto peptidy buď samotné, jako polymery nebo navázané na .příslušný nosič jsou použitelné při získávání g _protilátek, obzvláště monoklonálních protilátek proti HIV-1_f ’ a HIV^2~ Takové prot~i'í~á'tky^mohorr^byt^^zTskáňý—po-háb-čk-Ova-n-í > savců nebo ptáků dostatečným množstvím peptidu nebo směsipeptidů tohoto vynálezu a izolací zmiňovaných protilátek zesera těchto zvířat. Ke zvířatům, která jsou vhodná prozískávání protilátek patří savci jako jsou králíci, koně, 5

.....· kozy, guinejská prasata, krysy, myši, krávy ovce atd. , J

Peptidy nebo směsi peptidů popisované v tomto vynálezu j mohou, být použity pro kvantitavní stanovení HIV-1 a HIV-2 infekce různými obecně známými metodami. Při jednom z ΐ takových postupů jsou smíchány a pak ponechány stát vzorek stanovovaného sera, radioznačený cyklický peptid nebo směsi peptidů tohoto vynálezu a současně neznačený peptid nebo směs peptidů tohoto vynálezu. Komplex protilátka/antigen je separován od nenavázaných činidel známými technikami, tj. působením síranu amonného, polyethylenglykolu, a druhé i protilátky buď v přebytku nebo vázané na nerozpustný nosič, i ďextranem potažené dřevěné uhlí a podobně. 'Koncentrace ; 25 značeného peptidu nebo směsi peptidů . tohoto vynálezu je' stánovena buď ve vázáné nebo v nevázané fázi a obsah HIV-1 a ‘ HIV-2 ve vzorku může být potom určen odečtením koncentraceznačené složky z kalibrační křivky způsobem známým jako'"perse".

Jinou vhodnou kvantitativní metodou je "Sendvičovámetoda se dvěma antigeny" (Doublé-Antibody^-Sandwich-Assay).Při stanovení touto metodou je na stanovovaný vzorekpůsobeno dvěma různými protilátkami proti peptidu nebo směsipeptidů tohoto vynálezu, získaných z různých zvířat, např.ovce nebo králíka. Jinou možností je příprava monoklonálníchprotilátek dobře známou Koehlerovou a Milsteinovou technikou,pro výrobu monoklonálních protilátek. Pro rozlišenímonoklonálních protilátek proti témuž antigenu, ale různýmepitopům se používá metoda popsána Stahlim a kol.(J.ofImunological Methods 32, 297-304 (1980). Je též vhodné použit polyklonální antiserum a monoklonální protilátku.

Jedna z těchto protilátek je značená a druhá jenanesena na pevný nosič. Vhodné pevné nosiče jsou ty, kteréjiž bylý'dříve v tomto vynálezu uvedený. Vhodnými značkamijsou enzymy, např. peroxidasa, radioaktivní nebo fluorescenční značky. Preferovaným pevným nosičem je * syntetická kulička, enzymem, určeným pro značení, je křenová i peroxidasa.

Vzorek séra je potom inkubován s protilátkou navázanouna pevný nosič a značenou protilátkou. Je možné, vzoreknejdříve uvést do styku s protilátkou navázanou na pevnýnosič a po promytí ho nechat reagovat za vytvoření vazby seznačenou protilátkou. Je ovšem také možné vzorek nechatreagovat s protilátkou navázanou na pevný nosič a až po 26

=.určiťév .době i se značenou ' protilátkou; Přednost je však: dávána.postupu, kdy se na vzorek působí společně protilátkou navázanou na pevný nosič i značenou protilátkou.

Po proběhnuti imunologických reakcí se provádí promývací krok. Po promytí je značka stanovena známýmpostupem. V případě, že použitou značkou je peroxidasa, je ..její____ .stanovení.. .provedeno , se_____substrátem, např. o-fenyldiaminem nebo s tetramethylbenzidinem. Množství -značené-siožk-y—je-pak—úměrné-množs-tv.í-an.tigenu.(.ů)__přítomných__._ ve vzorku.

Metody a stanovení pro určení a kvantifikaci HIV-1,HIV-2 nebo protilátek proti HIV-1 nebo HIV-2 jak byly výše _popsány.,_mohou být použity ve formě testovacích setů, které v nádobce obsahují cyklický péptrd^^ťóhoťd-^-vynáíez-UT-^·peptidové směsi nebo jejich kombinace, nebo protilátky protiHIV-1 nebo HIV-2 elicitované cyklickým peptidem nebo směsícyklických.a lineárních peptidů tohoto vynálezu.

Peptidy, jejich; směsi a kombinace, popisované v tomto:vynálezu, jsou také použitelné jako aktivní složky vakcín ž schopných indukovat ochrannou imunitu proti HIV-1 a HIV-2 v .i hostitelích, citlivých k infekci tímto virem. Předepsané- způsoby aplikace, dávky antigenu, počet a frekvence očkováníse bude individuálně měnit a- bude odpovídat těm, které jsouběžně používány v případě vyvolání imunitní reakce k jinýmvirovým infekcím. Např. vakcíny jsou .farmaceuticky přijatelné látky, které obsahují alespoň jeden peptid,popisovaný v tomto vynálezu, jeho analogy, směsi, nebo..kombinace, v množství účinném pro savce, včetně člověka, unichž působení touto látkou vede ke zvýšené produkciprotilátek v množství jež je dostatečné pro ochranu daného 27 '^5»sayce’?před' HIV-1 nebo HIV-2 infekcí po určitou dobu. 7 "ť ^Vakcíny jsou připravovány podle známých metod. Složení vakciny popisované v tomto vynálezu je vhodně a podleobecných právidel kombinováno s · nosiči, které jsou.přijatelné z fyziologického hlediska. Takovými jsoufyziologický roztok farmaceutického stupně čistoty, tetanovýtoxoid a ústřicový hemokyanin. Vakcina popisovaná v tomto'vynálezu může též obsahovat adjuvans nebo další látkypřispívající k posílení imunitní odpovědi, jako jsoupreparáty kamence, liposomy nebo imunomodulátory. Dále mohoutyto vakciny obsahovat další antigeny,' které vedle ochrannéfunkce proti HIV-1 a. HIV-2 mohou zajišťovat imunitu vůčijiným virům (např. HTLV-I a HTLV-II, cytomegaloviru) apatogenům. Množství těchto dalších antigenů je opět závisléna savčím individuu a průběhu nemoci. Antigen by však mělbýt přítomen v množství, které by bylo účinné pro zvýšeníhladiny protilátek na koncentraci, jež je dostatečná proochranu savce před patogenem či virem po určitou dobu. ,z< ftada testovaných sér

Aby bylo možné dokumentovat· překvapivě dobroucitlivost stanovení a specifitu peptidů tohoto vynálezu,byla s peptidy názorně testována řada vzorků sér.

Hodnoty absorbancí (0.D.-optical density) byly získánypři vlnové délce 450nm a hodnoty blanku naměřené s pufrem, / ,/určeným pro zřeďování vzorku nebyly odečítány.

Vzorky NEIA-2*2, BBI-1-162 až 168, 87B140, 87L139, 87V103 jsou všechny na HIV protilátky negativní. Vzorek i í 28 j ; LSPQ-S9-1; je positivní--(HIV-1). Serie označené CAP-113. až. .... 1 CAP-12O jsou souborem sedmi HIV-1 positivních vzorků plasmy,postupně zřeďovaných HlV-negativní plasmou, CAP-113 jeHlV-negativní plasmou: .zřeďen 50x,: CAP-114 je zředěn lOOx, CAP-115 je zředěn 200x atd. Podobně serie označené CAP-222až CAP-230 jsou souborem sedmi HIV-2 potvrzenýchseropositivních vzorků plasmy. CAP-222 je zředěn 50xHlV-negativní plasmou, CAP-223 je zředěn lOOx atď. Před __proveden í m_ stanovení je každý vzorek včetně CAP-serií, dále 50x zředěn zřeďovacím pufrem. V těchto testech je hraniční(mezní) hodnota určující seropositivitu definována jako sumahodnoty absorbance pro vzorek NEIA-2*2 plus 0,100. Výsledky

Cyklické peptidy tohoto vynálezu byly navázány atestovány dříve popsaným ELISA-testem. TABULKA 2 porovnávácitlivost peptidu BCH-87c . (586 (arginin)) vzhledem kcitlivosti peptidu BCH-87ck (586 (lysin)) a peptidu BCH-265(586 (lysin )-585 (lysin)) při progresivně se zvyšujícímzřeďování protilátky ve vzorcích sera. Bylo zjištěno, žesubstituce argininu lysinem v aminokyselinovém místěoznačeném číslem 586 zvyšuje citlivost při detekci HIV-1protilátek. Další zvýšení citlivosti bylo dosaženo přídavkemlysinu v místě 585. TABULKA 3 porovnává aktivitu BCH-87c,BCH-87ck, BCH-266 a BCH-408 při progresivně se zvyšujících,zředěních. Z TABULKY 3 je patrné, že peptid BCH-408, kdedůležitý epitop přítomný v posici 606-610 (SGKLI) jeopakovaně" přítomen na jeho " c-konci, .vykazuje vynikající 29 ι·^Γΐ?ν.citlivost ve srovnání s jinými peptidy. J- í-’ < S HIV-2 peptidy bylo zjištěno, že substituce argininu lysinem v posici 578 zvyšuje citlivost stanovení HIV-2protilátek. Další zvýšení citlivosti je dosaženo dalšímlysinem v posici 577. TABULKA 4 porovnává citlivost peptiduBCH-202c (578(arginiň)) vzhledem k citlivosti peptiduBCH-202ck (578(lysin)) a peptidu BCH-266 (598(lysin)-577(lysin)) při progresivně se zvyšujícímzřeďování protilátky ve vzorku sera.

Byly připraveny peptidové koktejly pro stanovení směsiHIV-1 a HIV-2 protilátek. Z TABULKY 5 je patrná citlivostsměsí peptidových koktejlů BCH-87c a BCH-202c (argiňin) *versus BCH-87ck a BCH-202ck (lysin). Peptidový koktejl, kdeje arginin nahrazen lysinem vykazuje vyšší citlivost přidetekci HlV-protilátek. .Ί $ 30 -TABULKA< 2 -τ HIVtI .. . Tesť- 314 BC-87C absorbance 450nm E 5 Vzorek BCH-87ck BCH-266 ΐ pufr 0,017 0, 016 0,014 s 1 NEIA-2*2 0, 045 0, 050 0, 069 j BBI-1-162 0, 010 0,015 ; 0,028 BBI-1-169 0, 095 0,090 0, 138 r BBI-1-172 0, 012 0, 019 0,030 £ CAP-113 >2, 8 >2, 8 >2, 8 A í CAP-114 >2, 8 >2, 8 >2,8 L- e ----w ^CA-P—11.5-—-------—---------1^9--35-----------2^5:95- -- - ------>_2,_8--------------------------- CAP-116 1, 275 1,871 2,376 CAP-117 0,739 1,158 1,569 j .. CAP-118 0,433 0, 679 0, 934 ? íu £ . .. CAP-119 0,231 0, 392 0,567 ř ř i. ; CAP-120 0,137 0, 229 0, 376 r í i CAP-222' 0,059 . 0, 069 · . 0,095 CAP-223 0, 053 0, 060 0, 075 L • fcP T5S:?.CAP“224 . 0, 051 0, 054 ' 0, 084 i CAP-225 0, 049 0, 050 0, 135 ř i CAP-226 0, 046 0, 050 0,140 ř l' CAP-227 0, 041 0, 043 0,085 >, CAP-228 0, 038 0,042 0,091 i r CAP-230 0, 043 0, 049 0, 123 < j, ί ř i j-i Γ í i' $

F 31 ? ' ... TABULKA 3 - HIV-1 ’’· · <4 .. · > : '«-Test? 350 absorbance 450nm vzorek BCH-87C BCH-87ck BCH-266 BCH-408 pufr 0,016 J 0, 032‘ 0, 013 0,015 NEXA-2*2 0, 027 0,034 0,023 0, 035 2-87-V-103 . 0, 020 0, 015 0,020 0, 014 2-87-L-139 0, 158 0, 409 0, 147 0, 025 89-D-307 0, 026 0, 022 0, 030 0, 029 CAP-10 >2, 8 >2, 8 >2,8 >2, 8 CAP-11 >2, 8 >2, 8 >2, 8 >2, 8 CAP-12 2, 432 2,735 >2, 8 >2, 8 CAP-13 1,488 1, 676 2, 021 2, 319 CAP-14 0,866 1, 089 1, 248 1,433 CAP-15 0, 449 0,643 0, 680 0, 835 CAP-16 0, 262 0,274 0, 366 0, 455 CAP-17 0,141 0, 191 0,198 0,244 CAP-18 0,099 0, 114 .0, 116 : 0,156 CAP-19 0,068 0,053 0, 056 0, 102 32 - .ii . . • 7 v ,·/1 ·. - TABULKA 4 - HIV-2 - - í^.-j-h· «. .w,;^ £ V 5: /Test 226 absorbance 450 nm vzorek BC-202c BCH202ck BCH-265 pufr 0, 015 0, 014 0, 015 -:- ' NEIA-2'*2 ’ 0,020 - 0/027” ---------- —-0/022" BBI-1-162 0, 018 0,033 0,059 BBI-1-169 0, 018 0,028 0,076 BBI-1-172 0,019 0,024 0,050 CAP-113 1, 795 >2, 8 >2,8 CAP-114 1,070 2, 015 2, 134 CAP-115 0,611 /,19> 1 f «3 3 v CAP-116 0., 325 0, 642 0, 718 CAP-117 0, 174 0, 365 0, 410 CAP-118 0,089 0,189 0, 190 .CAP-119 0,057 0, 082 0, 117 CAP-120 0, 041 0,084 0, 094 ' :·' CAP-222 >2, 8 ·? >2,8 >2,8 . .· CAP-223 >2, 8 . >2,8 >2, 8 Λίΐς CAP-224 2, 313 >2,8 >2, 8 ' ·- ‘ CAP-225 1,448 2, 418 2, 480 CAP-226 0,758 1,436 1,674 CAP-227 0, 448 0,745 0, 960 CAP-228 0, 233 0, 409 0, 363 CAP-230 0, 139 0, 279 0,272 33 5 ;>' TABULKA 5 - HIV-1 , 'Λ r- .-Tv.' - i* " ,,j'' ’ · ' ·,<-1·:·..\ " f. - .· ’ Provedení srovnáni dvou peptidových koktejlu

Test 310 absorbance 450nm BC-S7c BCH-87ck vzorek' BC-202C ' ' BCH-202ck puf r 0, 015 0, 013 NEIA-2*2 0, 034 0, 062 BBI-1-162 0,044 0,034 BBI-1-163 0, 032 0, 042 BBI-1-164 0,052 0,077 BBI-1-165 0,038 0, 059 BBI-1-166 0,045 0, 081 BBI-1-167 0, 020 0, 064 BBI-1-168 0, 031 0, 041 87-B-140 0,005 0, 015 87-L-139 0,025 0,068 87-V-103 0,022 0,035 CAP-113 >2,8 >2,8 ČÁP-114 2, 634 >2, 8 CAP-115 1,720 >2, 8 CAP-116 0, 965 2,459 CAP-117 · : . 0, 548- 1,685 CAP-118 "·· '·· : 0,302 ··'··'· 1,036 'CAP-119 0,158 0, 609 CAP.-120 0,104 0,341 .CAP-222 >2, 8 >2, 8 CAP-223 2,470 >2, 8 ’CAP-224 1,709 · >2,8 CAP-225 1,003 2, 441 CAP-226 0,554 1, 733 CAP-227 0,289 1, 001 CAP-228 0, 169 0, 611 CAP-230 0, 086 0, 343 LSPQ-S9-1 0, 123 1, 273 BBI-A-01 0,067 0, 078 :BBI-A-02 0,114 0,130 BBI-A-03 0, 180 1, 069 BBI-A-04 2,401 >2, 8 34 pokračování TABULKY 5

Test 310 absorbance 450nra vzorek -BBI-A-05 BBI-A-06 BBI-A-07 BBI-A-08 BBI-A-09 BBI-C-20 BBI-C-21 BBI-C-22 BBI-C-24 -BB-I-G-25- ~BBT=Č-2'6-:- BC-87c BCH-87ck '' BC-202c BCH-202ck >2,8 >2, 8 >2, 8 >2, 8 >2.,„8_;____ --->-2/8----—---- >2, 8 >2, 8 >2, 8 >2,8 0, 019 0, 050 0, 017 0, 048 0, 030 0,121 0,210 1,748 -0.,372-------------- ------- 27:45-2- ------------------------------- 0,374 2,353 35

Obecné pracovní postupy syntézy a využití peptidůtohoto vynálezu jsou níže popsány.

Pracovní postup ' 1: Příprava pryskyřic nesoucíchaminokyselinový zbytek chráněný Na-FMOC K suspenzi p-benzylalkoholové pryskyřice v CH2C12: DMF(4:1) byl za teploty 0GC přidán daný aminokyselinový zbytekchráněný Να-FMOC ve směsi methylenchloridu (CH2C12) adimethylformamidu. Výsledná směs byla ručně míchána po dobuněkolika sekund, pak byl přidán Ν', N' -dicyklohexylkarbodiimid(DCC) a katalytické množství 4-(dimethylamino)pyridinu. Tatosměs byla dalších 30 minut míchána při teplotě 0°C a dálepřes noc při laboratorní teplotě. Přefiltrovaná pryskyřicebyla úspěšně promyta CH2C12, DMF a isopropanolem (každýmčinidlem celkem třikrát) a nakonec Cí^Clj. Pryskyřice bylasuspendována v CH2C12 a vychlazena v ledové lázni, dále byldo promíchávané suspense přidán redestilovaný pyridin a takébenzoylchlorid. Suspenze bylá dále míchána 30 minut přiteplotě 0°C a dále 60 minut při laboratorní teplotě., Pofiltraci byla·pryskyřice promyta CH2C12, DMF a isopropanolem(každým z nich celkem třikrát) a nakonec dvakrátpetroletherem. Nakonec byla pryskyřice vakuově vysušena dokonstantní hmotnosti.

Metodou podle Meienhofera a kol. (Int.J.Peptide ProteinRes., 13, 35, 1979) byl spektrofotometricky stanoven stupeňsubstituce na pryskyřici. 36 .-Pracovní postup-2: - Připojování následujících-aminokyselin 4 .>+λιΓ ,·ν '4. 71 »

Pryskyřice nesoucí první aminokyselinový zbytek, chráněný. Να-FMOC byla. umístěna do reakční nádoby peptidovéhosyntetizátoru Biosearch 9600 a následujícím způsobem zpracována: 1) Promytí DMF (po dobu 20 sec,, 4x) 2) Předpromytí 30% piperidinem v DMF (3min) _____ - _3) Zbavení ochranné skupiny 30% piperidinem v DMF____ . (7 min.) 4) Promytí DMF (8x po dobu 20 sec. ) 5) Kontrola přítomnosti volných aminoskupinKaiserovým testem (musí být pozitivní) — --------------^6-)—M-írné —t-řep á-n-í—p e p tidové=p rys kyrie e-p o=do bu =1—až" ------------ 2 hodin s 8 ekvivalenty dané aminokyseliny,chráněné Να-FMOC, s 1-Hydroxybenzotriazolem abenzotriazol-l-yl-oxy-tris(dimethylamino)fosfo-niumhexafluorofosfátem, to vše rozpuštěno v f suchém redestilovaném ĎMF, obsahujícím 16 ekvivalentů 4-methylmorfolinu 7) Promytí DMF (6x po dobu 20 sec. )

Po dokončení 7. kroku byla část odebrána na stanovení " Λ ' ninhydrinovým testem. V případě negativního výsledku přitomto stanovení byl celý postup opakován od kroku 1) s dalšíaminokyselinou. V případě, že výsledek byl positivní neboslabě positivní, bylo nutné se vrátit zpět a opakovat kroky 6) a 7). Výše uvedené schéma je možné použít pro připojení každéaminokyseliny peptidu, popsaného v tomto vynálezu. OchranaΝα-skupiny pomocí FMOC může-být;také použita v případě každé ; . 37 zbývající aminokyseliny.po celou dobu syntézy. ; Radioaktivně značené peptidy mohou být připraveny 1 ’ ’ ·' ‘ 3 ihkorporací aminokyselin značených [H ] s použitím výšeuvedeného postupu.

Po připojení poslední aminokyseliny je pomocí kroků 1-7odstraněn Na-FMOC z N-koncového zbytku. Peptidová pryskyřiceje promyta CH^Cl^ á vysušení ve vakuu je získán surovýchráněný peptid.

Pracovní postup 3: Zbavení ochrany a odštěpení peptidů zpryskyřice

Chráněná peptidová pryskyřice byla suspendována v 55¾roztoku kyseliny trifluoroctové (TFA) v CH2C12, obsahujícím2,5¾ ethandithiol a 2,5¾ anisol. Směs byla prosycena N2 abyla 1, 5 hodiny míchána při laboratorní teplotě.. Pak bylasměs přefiltrována a pryskyřice promyta CH2C12· Znovu bylopakován postup s TFA, na pryskyřici bylo působeno 20¾ TFA vCH2C12 5 minut při laboratorní- teplotě. Směs -bylapřefiltrována a pryskyřice promyta 20¾ TFA v CH2C12 a dále"byla promyta. CH2C12· Oba filtráty byly spojeny a odpařeny vevakuu při teplotě nižší než 35°C, zbytek byl rozmělněn sesuchým dimethyletherem. Pevná fáze byla rozpuštěna v 10¾vodném roztoku kyseliny octové a lyofilizována s cílem získat surový produkt.

Ty peptidy, které obsahovaly zbytky arg a cys, jsoudále zbavovány ochrany působením HF při teplotě 0°C po dobu1 hodiny v přítomnosti anisolu a dimethylsulfidu. Peptidybyly dále extrahovány působením 10¾ kyseliny octové, promyty 38 dimét.hýletherem a ilyofilizovány;za vzniku surových peptidů.

Pracovní postup 4: Purifikace peptidů

Surové peptidy byly preparativně purifikoványvysokotlakou kapalinovou chromatografií (HPLC) na koloněVydac (2,5x25mm) za použití nebo jako reverzní fáze sgradientem mobilní fáze. Absorbance eluátu byla měřena přivlnové délce 220nm, poté byl eluát analyzován HPLC. Důležitéfrakce byly spojeny, odpařeny a lyofilizovány. Totožnostsyntetických peptidů byla ověřena chromatografií s reverznífází a aminokyselinovou analýzou.

Pracovní postup 5:

Cyklizace peptidů

Roztok hexakyanoželezitanu draselného (Ο,ΟΙΜ, pH 7,0)byl pomalu přidán do roztoku do vodného, roztoku srozpuštěným lineárním peptidem (0,5mM) při pH 7,0. Po 24 \ hodinách stání při laboratorní teplotě bylo pH sníženo na hodnotu 5,0 a roztok byl ponechán 30 minut v přítomnostiiontoměničové pryskyřice (Bio-Rad Ag-3-X4a, Cl-forma).Suspenze byla zfiltrována a filtrát lyofilizován za vznikusurového cyklického peptidů. Peptid byl preparativněpurifikován HPLC s reversní fásí a charakterizovánaminokyselinovou analýzou. Důkaz toho, že došlo k cyklizaci,byl proveden porovnáním pohyblivosti cyklického peptidů sestartovním lineárním peptidem při HPLC redukcí alikvotu

. /-ITfI-T *1 "Ί rtVAV, Λ v. n -r~. 4- J» »-L pcp L1UU zpět na lineární peptid a dále potvrzením 39 :-7yAzmizeni.. volných , sulfhydrylových skupin (Ellmanuv test), kekterému*'došlo po cyklizaci.

Pracovní postup 6: Vazba peptidú na hovězí sérový albumin(BSA) nebo ústřicový hemokyanin (KLH)

Na BSA nebo KLH byly navázány peptidy předemderivatizované buď.sulfosukcinimidyl 4-(p-maleimidofenyl)~butyrátem (Sulfo-SMPB) nebo sulfosukcinimidyl 4-(N-maleiimi-domethyl)cyklohexan-l-karboxylátem (Sulfo-SMCC).

Vodný roztok sulfo-SMPB nebo sulfo-SMCC (Piercechemikálie) byl přidán do roztoku BSA nebo KLH rozpuštěnýchv 0, 02M pufru fosforečnanu sodného (pH 7,0). Směs bylatřepána při laboratorní teplotě 45 minut. Takto aktivovanýnosič byl ihned aplikován na kolonu se Sephadexem G-25,ekvilibrovanou 0,lM pufru fosforečnanu sodného (pH 6,0) přiteplotě 4°C.

Frakce prvního vrcholu, měřené při 280nm, odpovídajícívzorku aktivovaného nosiče byly spojeny a sebrány do baňky s . kulatým dnem, do. které byl přidán roztok peptidu v 0, OSMui pufru fosforečnanu sodného (pH 6,2). Směs byla prosycenadusíkem a přes noc inkubována při laboratorní teplotě.Účinnost vazebného procesu byla určována pomocí peptidu značeného H a aminokyselinovou analýzou konjugátu. ‘ Pracovní postup 7: Detekce protilátek k HIV ELISA-testem

Do všech jamek mikrotitrační destičky bylo aplikováno 40 •tS3Š^^O.dúÍ^roztoku· obsahujícího peptid nebo směs peptidu v' «to*** ·.·* * .'" '· · * ''’ '..*2sSr^kóň'ceňtfaci (5yg/ml) a ty byly ponechány přes noc. ÝW·. "Poté byly jamky vyprázdněny a dvakrát pr omytypromývacím pufrem (Tris, 0,043M; NaCl, 0,5M; thimerosal, 0, Olw/v; Tween 20, 0, 05% v/v; pH 7,4). Potom byly jamky saturovány 0,35ml promývacího pufru po dobu jedné hodiny při 37°C a dále jednou promyty__tímtopufrenr___Vzorky ...sera.,_______ určené k analýze jsou rozpuštěny v pufru (promývací pufr' s __kaseinem,_0,_0_5_%_.w/v)..___Př.ed_‘_aplikací--naředěnýc-h—v-zor-ků--séra—— (0,lml) na destičku byly jamky opláchnuty promývacím pufrem. Vše bylo ponecháno inkubovat 1 hodinu při laboratorníteplotě. Jamky byly vyprázdněny, dvakrát rychle promyty aponechány dvě minuty v promývacím pufru. Do každé jamky bylo ....... ^^-dánoz:=;^^^l=;^va^él5neho~:xTÓztokú CafiňiŤiTím způsobem přečištěná kozí protilátka proti lidskému IgG značenáperoxidasou, 0,5mg v 5ml 50% glycerolu) rozpuštěného vroztoku 1% w/v BSA v promývacím pufru a dále byly destičky . inkubovány jednu hodinu při laboratorní teplotě. Jamky byly -..•...potom vyprázdněny a dvakrát rychle promyty promývacím.pufrem, "-následovalo pětinásobné prómývání stějným pufrem po'."' .dobu 2 minut. Roztok substrátu (3, 3', 5, 5'-tetramethylbénzi- din, 8mg/ml DMSO] byl rozpuštěn ve 100 objemech 0,1M ·citrát-acetátového pufru, pH 5,6 obsahujícího 0,1% v/v 30%peroxidu vodíkua poté přidán do každé jamky (0,lml). Po 10‘minutách bylo do každé jamky přidáno o,lml 2N H2SO4 a bylaměřena absorbance při 450nm. Všechna stanovení byla . prováděna duplicitně. ÍL^rv 40a

Pracovní postup 6 ; Příprava peptidových koktejlů \ Feptiáové koktejly byly připraveny; smícháním stejnýc:objemů roztoků dvou peptidů, každého v koncentraci10 /ur/iLl . Jeden koktejl byl směsí peptidů-·' ΈΟΗ^ΙΟΟο a druhý;, koktejl byl; επιοεη/ -iOOck . Každý koktejl byl použit k překrytí dvou sérií ’ destiček, jak bylo dříve popsáno. BCH-S7C a .BO^-bTck' 3<

f S •p.VĎSÍ.1'' V'. v*

Claims (23)

1. 41

   PATENTOVĚ NÁROKY _1- Značně čistý peptid, vyznačuj í c í ť—í-m; žé_má_násTěďu"j'ící—vzorec: . s_e a-e-x-CSGKLIC-y-f-b605 611 kde: ' . x je nezávisle vybráno z jedné z následující skupiny: KILAVERYLKDQQLLGIWG- (586-604)KKILAVERYLKDQQLLGIWG- (585-604), aminokyselinových sekvencí odpovídajících těm, které jsouodvozeny od homologních oblastí dalších HIV-1 isolátů, aaminokyselinových sekvencí lišících se od výše uvedenýchkonservativními substitucemi, např. takové aminokyselinovésekvence, které jsou charakterizovány přítomností alespoň 42 JSy-íjédnoho lysinového zbytku v posici 586 nebo současně vMí posicích 585 a 586; -V1·? J . . . y, jestliže je přítomno, je nezávisle vybráno zeskupiny skládající se z: -T -TT -TTA -TTAV -TTAVP -TTAVPW -TTAVPWN -TTAVPWNA -TTAVPWNAS -TTAVPWNASW -TTAVPWNASWS -TTAVPWNASWSN -TTAVPWNASWSNK ’ ' -TTAVPWNASWSNKS -TTAVPWNASWSNKSL-TTAVPWNASWSNKSLE ' ' -TTAVPWNASWSNKSLEQ. -TTAVPWNASWSNKSLEQI, aminokyselinových sekvencí odpovídajících těm sekvencím,které jsou odvozeny od homologních oblastí dalších HIV-1isolátů a aminokyselinových sekvencí odlišujících se od výšeuvedených konservativními substitucemi; e a f, jestliže jsou přítomny, jsou nezávisle vybrányze. skupiny obsahující aminokyselinové sekvence jakéhokoli, z 43 epitopů; oblasti, jež zahrnuje posice, aminokyselin od posic586 do. 629 bílkoviny gp41 HIV-1 nebo oblasti aminokyselinovésekvence, zahrnující posice od 578 do 613 bílkoviny gp36HIV-2, aminokyselinové sekvence, které odpovídají těm a jsouodvozené z homologních oblastí dalších HIV-1 a HIV-2isolátů, aminokyselinové sekvence, které se liší od výše .uváděných ., kons.er.v.ativními -subs-ti-tucemi-,— -nebo— ja-k-ýehkol-i- —kombinací těchto epitopů; a představuje aminokyselinový konec nebo substituentúčinný jako spojovací činidlo a/nebo může sloužit k tomu, žepeptid se stane použitelnějším jako imunodiagnostickéčinidlo bez změněný_ch_an.tig.enní.ch_vlastností-;—a-- b představuje karboxylový konec nebo substituent, kterýje účinný jako jako spojovací činidlo a/nebo může sloužit ktomu, že se peptid stane použitelnějším jakoimunodiagnostické činidlo bez změněných antigenníchvlastností. ......
2. 2. Značně čistý peptid vyznačující se t í m, žemá vzorec : a-e-x^CAFRQVC-y^f-b ' (II) 597 603 kde.: x1 je nezávisle vybráno ze skupiny, skládající se z: 44 ***

   KVTAIEKYLQDQARLNSWG>.( 578-598) i , -i. λ ->r j. , · ' ' kkvtaiekylqďqárlnswg; (577-596), aminokyselinových sekvencí, které odpovídají těm sekvencím,odvozeným od homolognich oblastí jiných HIV-2 isolátú aaminokyselinových sekvencí, které se liší od výše uváděnýchkonservativními substitucemi, takové sekvence jsoucharakterizovány přítomností alespoň jednoho lysinovéhozbytku v posici 578 nebo současně v posicích 577 a 578; .y*, jestliže je přítomno, je nezávisle vybráno zeskupiny skládající se z: H -HT -HTT .-HTTV -HTTVP -HTTVPW -HTTVPWV -HTTVPWVN -HTTVPWVND -HTTVPWVNDS, aminokyselinových sekvencí, které odpovídají těm, jež jsouodvozené od homolognich oblastí jiných HIV-2 isolátů, aaminokyselinových sekvencí, které se liší od výše uvedenýchkonservativními substitucemi; a e, a f, jestliže jsou přítomny, jsou nezávisle vybrány zeskupiny obshhující aminokyselinovou sekvenci jakéhokoli zepitopů oblasti v rozmezí posic aminokyselinové sekvence 586 45 . , do-' 629j;.gp41- HIV-1 nebo-oblasti: v- rozsahu; aminokyselin odT 578 J 'άο'·>.,613' gp36 HIV-2, aminokyselinových sekvencí jimodpovídajících nebo sekvencí odvozených od homologníchoblastí jiných HlVrl nebo HIV-2 isolátů,. aminokyselinovýchsekvencí odlišujících se od výše uvedených konservativnímisubstitucemi, a jakýchkoli kombinací těchto epitopů. a představuje aminokyselinový konec nebo substituent_____ účinný jako spojovací činidlo a/_nebo_může_s 1 ouž i t-k -1omu> -že peptid se stane použitelnějším jako imunodiagnostickéčinidlo bez změněných antigenních vlastností; a b představuje karboxylový konec nebo substituent, kterýú.č-i-nný-=g:ako^jako=spG>3-ovac-í—čiňxdTo—áyněbo^může^l^žTt^k tomu, že se peptid stane použitelnějším jakoimunodiagnostické činidlo bez změněných antigenníchvlastností. . 3. Peptid podle nároku i v y z n a č u j í c í s e t í m, že x má sekvenci KILAVERYLKDQQLLGIWG a y TTAVPWNAS,. e a,, f \ , nejsou přítomny. '. * fc.
3. 4. Peptid podle nároku lvyzn.ačuj í c.í se tím,že x má sekvenci KKILAVERYLKDQQLLGIWG a y má sekvenciTTAVPWNAS, e a f nejsou přítomny.
4. 5. Peptid podle nároku'1 vy zná č u j í_c í s e tím, 46 že.^x?Mmá, sekvenci .-KILAVERYLKDQQLLGIWG, y máTTAVPWNAS, f má sekvenci SGKLI a e není přítomno. ' ->ν· ·* . t· / sekvenci
5. 6. Peptid podle nároku 2vyznačující se tím,že x1 má sekvenci KVTAIEKYLQDQARLNSWG a y1 má sekvenciHTTVPWVNDS, e a f nejsou přítomny.
6. 7. Peptid podle nároku 2vyz‘načující setím,že x1 má sekvenci KKVTAIEKYLQDQARLNSWG a y1 má sekvenciHTTVPWVNDS, e a f nejsou přítomny.
7. 8. Peptid podle nároku 2vyznačující se tím,že x1 má sekvenci KVTAIEKYLQDQARLNSWG a y1 má sekvenciHTTVPWVNDS, f má sekvenci AFRQV a e není přítomno.
8. 9. Značně čistý peptid v y z n a č u j í.c í se' t i m,.žemá vzorec: / i—i a-e-xa-CSGKLIC-y-f“b (III) 2 kde x , pokud je přítomno, je nezávisle vybráno ze skupinyskládající se z: 47 ,"---- ---. .....’^G— - ..... - - \ ‘ wg- IWG- • GIWG- LGIWG- LLGIWG- QLLGIWG- QQLLGIWG- _L________________DQQLLGIWG- :____ KDQQLLGIWG-LKDQQLLGIWG-1 YLKDQQLLGIWG- RYLKDQQLLGIWG- ........— —---------------" E-RY-hK-DeGE-LG-I-WG- VERYLKDQQLLGIWG- AVERYLKDQQLLGIWG- LAVERYLKDQQLLGIWG- ILAVERYLKDQQLLGIWG- RILAVERYLKDQQLLGIWG- aminokyseíinových sekvencí, které odpovídají těm, jež bylyodvozeny od homologních oblastíL jiných HIV-1 isolátů, aaminokyselinových sekvencí lišících se od výše uvedenýchkonservativními substitucemi; y, jestliže je přítomno je nezávisle vybráno ze skupinyskládající se z: 48

   -ΤττΤΤΑ : . ·.. ; · >.·.·.·· · : -TTAV . ’··' ' , ·;··..· -TTAVP-TTAVPW ' -TTAVPWN -TTAVPWNA -TTAVPWNAS -TTAVPWNASW -TTAVPWNASWS -TTAVPWNASWSN -TTAVPWNASWSNK -TTAVPWNASWSNKS -TTAVPWNASWSNKSL -TTAVPWNASWSNKSLE -TTAVPWNASWSNKSLEQ -TTAVPWNASWSNKSLEQI, ’’ aminokyselinových sekvencí, odpovídajících těm sekvencím,které jsou odvozeny od homologních oblasti dalších HIV-1isolátů a aminokyselinových sekvencí odlišujících se od výšeuvedených konservativními substitucemi; e a f, jestliže jsou přítomny, jsou nezávisle vybrány zeskupiny obsahující aminokyselinovou sekvenci jakéhokoli zepitopú oblasti v rozmezí posic aminokyselinové sekvence 586do 629 gp41 HIV-1 nebo oblasti v rozsahu aminokyselin od 578do 613 gp36 HIV-2, aminokyselinových sekvencí jimodpovídajících nebo sekvencí odvozených od homologních i 49 jiných. HIV-1. nebo : HXVt2 isolátů, aminokyselinovýchodlišujících se od výše uvedených konservativními .><.·· ,i· · ’ " •f =i;.^substitucemi, a jakýchkoli kombinací těchto epiťopů. a představuje aminokyselinový konec nebo substituentúčinný jako spojovací činidlo a/nebo může sloužit k tomu, žepeptid se stane použitelnějším jako imunodiagnostickéčinidlo bez změněných antigenních vlastností; a —:--,-. --—:--1 *---; b představuje karboxylový konec nebo substituent, který i je účinný jako jako spojovací činidlo a/nebo může sloužit k tomu, že seimunodiagnostické ...... - , vlastností------------ - peptid stane použitelnějším jakočinidlo bez změněných antigenních
9. 10. Značně čistý peptid vyznačující se tím,že má vzorec: a-e-x3-CAFRQVC-y1-rf-b (IV) 597 603 ?"a. •'i·'·/'. - .3^/· - . 3 · kde x , jestliže je přítomno, je nezávisle vybráno zeskupiny skládající se z: «1 50 κ G~ ' WG- SWG- , ' NSWG-* . .. LNSWG- RLNSWG- ARLNSWG- QARLNSWG-' DQARLNSWG- QDQARLNSWG- LQDQARLNSWG- 'YLQDQARLNSWG-KYLQDQARLNSWG- EKYLQDQARLNSWG- IEKYLQDQARLNSWG- AIEKYLQDQARLNSWG- TAIEKYLQDQARLNSWG- VTAIEKYLQDQARLNSWG- RVTAIEKYLQDQARLNSWG- aminokyselinových sekvencí, které odpovídají těm, které jsou ;;;Y‘odvo2eny od, homologních oblastí jiných HIV-2 isolátú, a"·* 'aminokyselinových sekvencí, které se liší od výše popisovaných konservativnimi substitucemi; a y1, jestliže je přítomno, je nezávisle vybráno ze skupinyskládající se z: 51 • , . -HTTV • -HTTVP <*. -HTTVPW. -HTTVPWV -HTTVPWVN...........—· '----------- ------------ . -HTTVPWVND -HTTVPWVNDS”, ' " aminokyselinových sekvencí odpovídajícím těm, které jsouodvozené od homologních oblastí HIV-2 isolátů aaminokyselinových sekvencí odlišujících se od výše uvedených ------------...—konservativhími- amihoky.se Ι^^όνγ^ί^Β.υΚΞΐ.ίλίηοβ^ΓΓ_________________________— e a f, jestliže jsou přítomny, jsou nezávisle vybrány zeskupiny obsahující aminokyselinovou sekvenci jakéhokoli zepitopů oblasti v rozmezí posic aminokyselinové sekvence 586do 629 gp41 HIV-1 nebo oblasti v rozsahu aminokyselin od 578do ..613 gp36 HIV-2, aminokyselinových., šekveiící jimodpovídajících nebo sekvencí odvozených od homologníchi oblastí jiných HIV-1 nebo HIV-2 isolátů, /aminokyselinovýchsekvencí odlišujících se od výše uvedených konservativními substitucemi, a jakýchkoli kombinací těchto epitopů. a představuje aminokyselinový konec nebo substituentúčinný jako spojovací činidlo a/nebo může sloužit k tomu, žepeptid se stane použitelnějším jako imunodiagnostickéčinidlo bez změněných antigenních vlastností; a 52 '? ’ y, . ..i. . . · , fťž^e^išzrb 5 představuje karboxylový-konec nebo substituent, který'účinný jako jako spojovací* činidlo a/nebo. může sloužit k tonu, že se peptid staneimunodiagnostické . činidlo bezvlastností. použitelnějším jakozměněných antigenních
10. 11. Směs vyznačující se tím, že obsahuje dvanebo více peptidů vybraných ze skupiny skládající se zpeptidú uvedených v kterémkoli z nároků 1, 2, 9, 10.
11. 12. Směs podle nároku ll vyznačující setím, že obsahuje alespoň peptid: a-KILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASGKLI-b (BCH-408)586 605 611 619 /aminokyselinové \sekvence odpovídající těm, které jsouodvozeny od homologních oblastí jiných HIV-1 isolátů. a ‘ . ...x /aminokyselinové- sekvence odlišující se' ód výše uvedenýchΐ -konservativními aminokyselinovými substitucemi, takováí aminokyselinová sekvence je např. charakterizována i. ' přítomností lysinu v posici 586. 4 ?. 13. Směs podle nároku llvyznačující se tím, Γ .že obsahuje alespoň následující peptid: '*· 53 aTKVTAIEKYLQDQARLNSWCAFRQVCHTTVPWVNDSAFRQV-b (BCH-417)•578- 597 603 613 konservativními aminokyselinová aminokyselinové sekvence odpovídající těm, které jsouodvozeny od homologních oblastí jiných HIV-2 isolátů aaminokyselinové sekvence odlišující se od výše uvedenýchaminokyselinovými substitucemi, takovásekvence je např. charakterizována „pří.tomno.sj;í_„l.ys.inu_.v_posici__5„7A..
12. 14. Směs podle nároku llvyznaču. jící se tím,. | že obsahuje alespoň následující peptid: a-KILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNAS-b (BCH-8.7ck), 586 605 611 620 aminokyselinové sekvence odpovídající těm, které jsou . i ;< odvozeně od homologních oblastí jiných HIV-1 isolátů a . aminokyselinových sekvencí odlišujících se od výše uvedených konservativními substitucemi aminokyselin, jako jsou např - aminokyselinové sekvence charakterizované přítomností lysinuv posici 586.
13. 15. Směs podle nároku llvyznačující se tím, * 1 *že obsahuje alespoň následující peptid: ........ . 54 a-KVTAIEKYLQDQARLNS.WGCAFRQVCHTTVPWVNDS-b578 597 603 613 (BCH-202ck) konservativními aminokyselinová aminokyselinové sekvence odpovídající těm, které jsouodvozeny od homologních oblastí jiných HIV-2 isolátů aaminokyselinové sekvence odlišující se od výše uvedenýchaminokyselinovými substitucemi, taková,sekvence je např. charakterizována přítomností lysinu v posici 578,
14. 16. Prostředky pro. detekci přítomnosti protilátek, vybranýchze skupiny obsahujícíHIV-1 protilátky;. HIV-2 protilátky, ajejich směsí ve stanovovaném vzorku, vyznačujícís e použitím peptidu připraveném podle jakéhokoli z nároků 1až 10. nebo směsi připravené podle jakéhokoli z nároků 11. až15.
15. 17. Metoda vyznačující setím, že pomocí nílze stanovit přítomnost protilátek selektovaných ze skupinyobsahující HIV-1 protilátky, HIV-2 protilátky a jejich směsive stanovovaném vzorku, zahrnující krok, kdy alikvotstanovovaného vzorku se uvede do kontaktu s peptidempřipraveném podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 nebo sesměsí, která byla připravena podle kteréhokoli z nároků 11až 15. 1 ‘ «W» Ť* .Jí »« »-; -'.?. ,·/>·?^~~—Srs-··*-^' *-·TgKAs&amp;ř?-?^ a- --.2 ΜαΙύ «w^ifr^Metodalpodle nároku 17, *:· ·'· '* /.ji'•.A..“ -,t : í d, že je vybránahemoaglutinace, single-dot 55 vy z n~a~č u- j í c í s-eze skupiny metod- ELISA-test,nebo multi-dot metody. »
16. 19. Protilátka vyznačující setím, že jeschopná imunologické, křížovéreakce s peptidem připravenýmpodle kteréhokoli z nároků 1-10, nebo jeho směsí.
17. 20. Protilátka podle nároku 19, vyznačující setím, že je protilátkou monoklonální, nebo jde o směs-7tn-i-něný-ch_monoklonálních protilátek. _,_
18. 21. Prostředky vyznačující se schopnostídetekce přítomnosti antigenú vybraných ze skupiny obsahující . . ; HIV-1. antigeny,. HIV-2 antigeny a jejich směsi ve/ , stanovovaném vzorku,, „prostředky . jsou , charakterizovány /-/ obsahem protilátek podle nároků 19'nebo 20. ' , j -v :-Λ * c
19. 22. Metoda vyznačující se schopností detekcepřítomnosti antigenú, vybraných ze skupiny obsahující HIV-1antigeny, HIV-2 antigeny a jejich směsi ve stanovovanémvzorku. Tato. metoda obsahuje i krok kdy je alikvotstanovovaného vzorku uveden do kontaktu s protilátkou,i připravenou podle nároků 19 nebo 20. -r-S»' -* . 56

    -.·* . · ·? * Z-1'-’ΐ.. r: . - Jr ίτΖί-i. . x. Γ·'ι · t · ‘ ' ^ ,ř»RV"-?23Ví;Farmaceuticky akceptovatelná kompozice vyznačuj i ->.·?>,. ar ·7*γ.π·Έ=1 t j-.·»,?· . - - -·. t í . m,. že .obsahuje peptid připravený podlekteréhokoli z nároků 1-10, nebo směs připravenou podle nárokuj 11-15,-zmíněný peptid nebo směs jsou přítomny vmnožství, které je účinné pro savce, včetně člověka.Působení této kompozice vede- ke zvýšené tvorbě protilátektak, aby mohlo, dojít k dostatečné ochraně savce proti HIV-1nebo HIV-2 po určitou dobu.
20. 24. Farmaceuticky akceptovatelná kompozice podle nároku 23vyznačující se tím, že obsahuje fyziologickypřijatelný nosič.
21. 25. Farmaceutická kompozice podle Nároku 23, vyznaču-jící se tím, že obsahuje adjuvans .'nebo látkuposilující imunitní odpověď. fc*»t ir
22. 26... Farmaceutická kompozice podle nároku 23,. v y z n a č u' - 1 i-Λ*1. ' * .<· -jj , j -í c^í se t í m, že obsahuje druhý antigen k pathogenujinému než jsou HIV-1, nebo HIV-2 viry. Tento druhý antigenje přítomen v množství, jež je dostatečné pro zvýšeníhladiny protilátek, účinných pro ochranu savce před infekcipathogenem po určitou dobu. A '
23. 27. Způsob vyznačující setím, že pomocí něj* . lze ochránit· savce, včetně lidí před infekcí HIV-1 nebo 57 3Ζ:ι,.··μ. « τ^'," •^Λίϊί.'Υ iV,^3tí«* - . . ·Ό*λ -£>' Ο^Λν^ΰ.ϊ·.· líJím i^jixggi;—Τ*ί~ť·.sshř.-fcx. .· - W » i--®- 1. — -τ-----· —íp>· 1 ; i;v i. f. j‘ i 1 2 i 1 i&amp;řš^sls HTV— T&amp;n^bfřiši i n vm-i τ ,HiK Hl^^né^olsjiriýiiiipathogehein';,;Způsob.ochrany zahrnuje, i krok, “· ·ΐ· ν<ν·«*“··>·-·>*’·· · .·’ »> ·:Γ=&amp;?ν:·£:*'«*?;·" ; · _ ^· _ř U.~ i-’ e * podr obeni působení. farmaceutické kompozice podlez nároků 23 až2· 26. ««.A.;· _

    J Λ.—'**· - ST’-,k JP "- U . ] ~ — *· i Ů. 1

    ·> xii£‘v'.·? «'./>’*

    ·*- τ . .·? / Λ &amp;<lu7 gjjUr, JormiSa Traptová