JPS63500309A - インヒビンおよびその精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インヒビンおよびその精製法 本発明はブタの体材料から実質的に均一に単離されたインヒビン（ｉｎｈｉｂｉ ｎ）活性を有するタンパク質に関する。本発明はまたブタインヒビンの精製法に 関スる。

背景技術 性腺で産生されるが下垂体レベルで卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）の分泌を特 異的に抑制する水溶性物質としてのインヒビンの存在はマツクララ（ＭｃＣｕｌ 　Ｉａｇｈ）によって１９３２年に仮定された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、７６．１９− ２０）　ｏこのようなゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）の選択的抑制はおお いに関心を呼び、過去５０年間多くの実験室において精巣、精子、精巣調液、精 液血漿および卵巣の卵胞液の抽出物から各種生物検定法によりこの物質を単離し 性状決定する試みがなされてきた。分子ｆｆ１５，０００〜１００，０００ダル トンの範囲のインヒビン様物質の精製を主張する文献が数多く出現したが、追試 の結果これらの物質は均一でないか或は真のインヒビンに期待されるだけの高い 特異的活性を有していないことが明らかとなった〔デ・ジョング（ｄｅ　Ｊｏｎ ｇ）。

インヒビン活性を有する物質は哺乳動物、特に雄咄乳動物の受精能を抑制するの に使用できるかも知れない。

発明の要旨 本発明によると、いずれも分子量約３２．０００ダルトンでインヒビン活性を有 する２種類のタンパク質をブタ卵胞液から単離することに成功した。これら２種 類のタンパク質は微量配列分析法および分子生物学的手法により完全に性状決定 された。

タンパク質はブタの体から得られる材料から実質的に均一に単離されタンパク質 Ａおよびタンパク質Ｂと命名された。各タンパク質は分子量約３２，０００ダル トン（３２Ｋ）であって、分子量が各々１８，０００ダルトンおよび１４．００ ０ダルトンの２本のポリペプチド鎖からなり、２本の鎖はジスルフィド結合によ って結合されて生物的に活性なタンノくり質となっている。２種のタンパク質の ｉｓ、ｏｏｏダルトン（１８Ｋ）鎖のアミノ末端のアミノ酸残基配列はＳｅｒ− Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ− Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ− Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌであり、また１４， ０００ダルトン（１４Ｋ）鎖の両アミノ末端の最初の６個のアミノ酸残基は同一 、即ちＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙであることが微量配列 分析法により明らかとなった。タンパク質Ｂの１４に鎖の最初の１０個のアミノ 酸残基はＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ −Ａｓｎ−Ｌｅｕであることも確認された。タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂは 更なる微量配列分析法および分子生物学的手法を利用した結果完全に性状決定さ れた。各３２にタンパク質はＦＳＨの基礎分泌（ｂａｓａｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏ ｎ）を特異的に抑制するが黄体形成ホルモン（ＬＨ）の基礎分泌を抑制しない、 というインヒビン活性を示す。個々の鎖は生物学的に活性ではない。

ブタインヒビンの実質的均一、即ち分画中の総タンパク質の約９０重ｆｉ％の純 度への精製はヘパリンーセファロースアフィニティクロマトグラフイー、ゲル濾 過および逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含むタンパク 質分離法の組合せにより達成された。

質を以下に記載する条件において精製する第１工程を表すクロマトグラムである 。

（ａ）　ＰＦＦ（７）ヘパリンーセファロースアフイニテイクロマトグラフィー 。インヒビンタンパク質は０．０１　ｈ−１トリス−塩酸、ｐＨ７中のＩＭＮａ ＣΩにより溶出された。

（ｂ）ＰＦＦインヒビンタンパク質のセファクリルＳ−２００ゲル？濾過。第１ ａ図下部の黒色部分で示される溶出分画を集め、透析し次いでこのゲル濾過用に ８つの等量部分に分けた。カラムのうちの一つを各カラムの例として示した。

（Ｃ）　ゲルか過から回収したインヒビンタンパク質のＲＰ−ＨＰＬＣ精製。ゲ ル済過の活性領域部分（ｉｎ　ｖｉｔｒｏの生物アッセイで決定し、第１ｂ図に 黒色部分で示した）を集め、凍結乾燥し、０．２Ｎ酢酸に溶解した後バイダック （Ｖｙｄａｃ）　Ｃ４カラムに直接装填し、ＴＥＡＰ中のアセトニトリル緩衝液 系の図示したグラジェントを用いて９ｍｌ／３分で溶出した。第１ｃ図に図示し た２種のインヒビンタンパク質、タンパク質ＡのＲＰ−ＨＰＬＣ精製のクロマト グラムである。

（ａ）　第１ｃ図の黒色部分Ｂと称する活性分画を集め、その始めの容量の３倍 に希釈した後バイダックＣ４カラムに直接装填しトリフルオル酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ ）中のアセトニトリル緩衝液系の図示したグラジェントを用いて９ｍｌ／３分で 溶出した。

（ｂ）　第２ａ図の黒色部分で示される活性物質を集め、その始めの容量の３倍 に希釈し、同様にバイダックフェニルカラムでリン酸トリエチルアンモニウム（ ＴＥＡＰ）中のアセトニトリル緩衝液系の図示したグラジェントを用いて２ｍｌ ／２分で溶出して精製した。

（Ｃ）　第２ｂ図のクロマトグラムで表されるカラムと同様の多数のカラムから 得た活性物質を集めアクアポア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）　ＲＰ　−３００カラム上 でＴＦＡ中のアセト第３図は以下に示す方法による精製インヒビンタンパク質Ｂ のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅ）分析による実際の電気泳動の結果を示す。

（ａ）　非還元的条件下におけるタンパク質Ｂの分析。

（ｂ）　還元的条件下におけるタンパク質Ｂの分析。

分子量標準値は左に示した。

第４図はラット下垂体前葉細胞培養物がらのＦＳＨおよびＬＨの基礎分泌に及ぼ す精製インヒビンタンパク質Ｂ（○）および粗ＰＦＦ基準物（△）の用世依存曲 線を示す。

粗ＰＦＦ基準物はＰＦＦの木炭−ストリップ化（Ｃｈａｃｏａｌ　−５ｔｒｉｐ ｐｅｄ）および４０％飽和硫酸アンモニウム沈殿物であるのＲＰ−ＨＰＬＣ精製 のクロマトグラムである。

（ａ）　第１ｃ図の黒色部分Ａと称する活性分画を集め、その始めの容量の３倍 に希釈した後、バイダック０４カラムに直接装填しトリフルオル酢酸（Ｔ　Ｆ　 Ａ）中のアセトニトリル緩衝液系の図示したグラジェントを用いて９ｍｌ／３分 で溶出した。

（ｂ）　第５ａ図の黒色部分で示される活性物質を集め、その始めの容量の３倍 に希釈し、同様にパイダックフェニルカラムでリン酸トリエチルアンモニウム（ ＴＥＡＰ）中のアセトニトリル緩衝液系の図示したグラジェントを用いて２ｍｌ ／２分で溶出して精製した。

（Ｃ）　第５ｂ図のクロマトグラムで表されるカラムと同様の多数のカラムから 得た活性物質を集めアクアポアＲＰ−３００カラム上でＴＦＡ中のアセトニトリ ル緩衝液系程を経て２種類の３２，０００ダルトンのペプチドがブタ卵胞液（Ｐ 　Ｆ　Ｆ）から実質的に均一に単離された。各タンパク質（タンパク質Ａおよび タンパク質Ｂ）は各々１８におよび１４にの２本の鎖からなり、完全な分子中に おける２本の鎖はジスルフィド結合により互に結合されており、２本の鎖の間の 結合は生物活性の為に必要である。全タンパク質のアミノ酸分析を各々行い、各 鎖のアミノ−末端のアミノ酸残基配列を微量配列決定法により決定した。各タン パク質の１８に鎖のアミノ−末端配列はＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅ ｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−３ｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅ ｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌ ｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌであることが見出された。更に研究した結果、いず れの１８に鎖も１３４個のアミノ酸残基からなる全く同じ配列と遊離酸Ｃ−末端 とを有していることがわかった。

微量配列分析法によりまず、１４に鎖のアミノ−末端配列については、双方の鎖 の最初の６個のアミノ酸残基は同じであり、且つタンパク質Ｂの１４に鎖の最初 の１０個のアミノ酸残基はＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕであることを示した。更に配列分析を行うこと により、次の１５アミノ酸残基はＸ　ｕ　−Ｘ　１２−　Ａ　ｒ　ｇ　−Ｇ　１ 　ｎ　−Ｇ　１　ｎ　−Ｐ　ｈ　ｅ　−Ｐｈｅ−Ｉ　ｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｘ２３−Ｇｌｙ−Ｔｒｐであり、ここでＸ１１は多分Ｓｅｒであ り、Ｘ　は多分ＣｙｓでありそしてＸ２３はＩｌｅまたはＬｅｕであることが明 らかとなった。その後、Ｘ１１とＸ１２はいずれもＣｙｓでありそしてＸ２３は Ｉｌｅであることが決定された。鎖の配列決定を行いうる能力からしてタンパク 質は総タンパク質の少なくとも約９０重量％の純度に精製されたことを示し、ま た最終のクロマトグラフィーによる精製工程におけるタンパク質の鋭い溶出ピー クもそれを支持した。

３本の鎖のいずれのＣ−末端も遊離酸である。更に微量配列分析法によりタンパ ク質Ａの１４に鎖のＮ−末端はＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌ ｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌ ｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌ ｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−１１ｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏの配列 を有することが明らかとなった。

タンパク質Ａは今や完全に性状決定され、１１６個のアミノ酸残基の鎖（１４に 鎖）（この鎖は少なくとも１個の内部ジスルフィド結合を有していると思われる ）と１または複数のジスルフィド結合によって結合された１３４個のアミノ酸残 基の鎖（１８に鎖）を含むことが明らがとなった。タンパク質Ｂは相同な１４に 鎖に結合した同一の１８に鎖を有している。

各３２にタンパク質は酸性で４．８のｐＫａ値を有し、一般に水性媒質に溶解す る。各タンパク質はコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ）に対す る限定的親和力によって決定されたように、一部分グリコシル化されている。各 ３２にタンパク質はラット脳下垂体前葉単層培養系においてＦＳＨの基礎分泌を 特異的に抑制するインヒビン活性を示す。タンパク質Ｂはコンピュータープログ ラムＢ　ｌ０ＰＲＯＧで計算したところ、４５０　ｐｇ／ｍｌの半数有効量（ｈ ａｌｆ　−ｍａｘｉｍｕｍｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｄｏｓｅ　；　Ｅ　Ｄ５ｏ）を 示し、タンパク質Ａは９００ｐｇ／ｍｌのＥ　Ｄ　５ｏを示した。各３２にタン パク質は哺乳動物、特に雄の受精能を抑制するために有用である。

各３２にタンパク質はウシ卵胞液から単離された５６，０００ダルトン（５６Ｋ ）のタンパク質に似た性質を有している。該ウシからのタンパク質は互いにジス ルフィド結合で結合した分子ｆｆ１４４，０００および１４，０００ダルト＞　 （４４におよび１４Ｋ）より報告されたウシの４４に鎖の最初の３個のアミノ− 末端残基は今回単離されたいずれのブタ３２にタンパク質の２本の鎖のいずれと も異なっているが、ウシ５６にペプチドの１．４に鎖の２番目および３番目の残 基はいずれのブタ３２にペプチドの１４に鎖のものとも同じである。ブタ３２に タンパク質とウシ５６にタンパク質との関係については、もしそれがあるとして も今回明らかとはならなかった。

各３２にタンパク質は最近ヒト精液血漿から単離され性状決定された“α−イン ヒビン″　〔ラマシャルマ（１９８５））とは全く異なっている。″α−インヒ ビン″は９２アミノ酸残基の親分子に全て由来する一本鎖ポリペプチドであると 報告されている。しかしながら、α−インヒビンー５２の３１アミノ酸からなる ＮＨ２−末端フラグメントも天然産物もいずれもラット脳下垂体前葉細胞培養物 において基礎ＦＳＨ−放出活性を抑制しなかった〔ヤマシロ（Ｙａｍａｓｉｒｏ ）、　Ｄ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｉｃ、　ＵＳＡ　８１ ゜５３４９−５４０２　（１９８４）　）。“β−インヒビン”は文献記載内容 によるとＣ０ＯＨ末端の８７−９４フラグメントに活性中心を有する９４個のア ミノ酸からなる一本鎖ポリペプチドであると記載されている。〔アーバッティ（ Ａｒｂａｔｔｉ）、　Ｎ、ら。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｒｅｓ　１８１．　５７−８３　（１９８５）　］　、この フラグメントを合成したが、５μｇ／ｍｌの濃度までではラット脳下垂体前葉細 胞培養物アッセイにおいてＦＳＨの基礎分泌の抑制に対して不活性であることが 判った。前掲のラマシャルマらおよびりらのこれら２つの実験室においてインヒ ビン活性のために用いた生物検定法は本明細書で記載するものとは実質的に異る 。

本発明によるインヒビン精製過程においては、ヘパリンーセファロースアフィニ ティクロマトグラフィー、ゲル濾過および固定相および／または移動相に各種条 件を用いる少なくとも１回、好ましくは数回のＲＰ−ＨＰＬＣを含む連続的精製 工程によってブタインヒビンはブタの体、特にブタ卵胞液（ＰＦＦ）から得られ る粗抽出物から単離されるが、他の適当な体材料の抽出物も使用できる。同じ精 製工程は組換えＤＮＡ法により得られる粗抽出物から目的とする咽乳動物インヒ ビンタンパク質を得るのにも利用できる。

ブタインヒビンを始めて実質的に純粋に単離した好適な工程においては、ＰＦＦ をまずヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーで精製し、次 いでセファクリルＳ−２００ゲル上のゲル濾過そして続いて異なる移動相グラジ ェントおよび／または誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）シリカ支持体を用い る４回の連続ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。比較的に低い疎水性を有する固定 相を用いるのが好ましく、（３−Ｃ８カラムが好適であり、Ｃ３−Ｃ５およびフ ェニルカラムが特に好適である。移動相の溶質特性は好適には有機成分、特にア セトニトリルの濃度を変えることにより調整される。１回のＲＰ−ＨＰＬＣ精製 であってもゲノ晴濾過した物質の純度を有意に増すが、一般には２回もしくはそ れ以上、好ましくは４回のＲＰ−ＨＰＬＣ精製をヘパリン−セファロースクロマ トグラフィーおよびゲル濾過による連続処理に続いて行う。

精製工程のための出発材料はカリフォルニア州、ウッドランド、Ｊ、Ｒ，サイエ ンティフィック社から入手した凍結ＰＦＦであった。凍結ＰＦＦ約１８ｇをイン ヒビン生成物を単離するために２５０ｍ１のバッチに分けた。精製の第１工程は ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーであって、この工程 ではタンパク質は適用条件下にセファロース−結合ヘパリン分子に吸着され、吸 着されたインヒビン物質は１１！ｆＮａＣΩ溶出液によって回収される。この工 程は粗エキスの精製工程をおおいに促進する。

何故なら、この方法はＰＦＦのような比較的大容量の粗エキスをかなり速く処理 することができ、且つ粗エキスの活性の少なくとも９０％の全イン上ビン活性を 示すタンパク質を回収することができるからである。

精製工程を通じてインヒビンの生物活性はラット脳下垂体前葉の単層培養物〔ヴ エール（Ｖａｌｅ）、　１１５ら。

ＥｎｄＯｅｒｉｎＯＩＯｇ！Ｙ　旦、５６２−５７２　（１９７２）］を用いる ｊｎ　ＶｉｔｒＯの生物アッセイによりモニターした。簡単に述べると、生後２ １１日目酸ラットの脳下垂体前葉を集め酵素的に分散し、１日目に２４ウエルの 組織培養プレート（カリフォルニア州、オックスナード、ファルコン　プラスチ ック社）上でＨＤＭＥＭ（カリフォルニア州、サンタクララ。

ＧＩＢＣＯラボラドリース社）中の１０％ウシ胎児血清におく。２日目に培地を ＨＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中の１％ウシ胎児血清に変え試料を加える。更に４８時間イン キュベーションを続行する。次いで培地を回収し、ＬＨおよびＦＳＨ濃度をＮＩ ＡＤＤＫＤ社の脳下垂体ホルモンプログラムより入手した物質を用いるラジオイ ムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）により測定する。このアッセイにおいてはインヒビン タンパク質は培地のみをインキュベーションする対照群と比較して、ＦＳＨの基 礎放出のみを抑制し、ＬＨの放出を抑制しない。

各種カラムの分画中のインヒビン活性を検定するには、０．０１〜０．１容量％ のアリコートを採り、水１００μｇ中の、ヒト血清アルブミン１００μｇを加え た後、溶媒をスピード−バク（Ｓｐｅｅｄ　−Ｖａｃ）＃縮型にューヨーク州、 ヒックスビル。

５ａｖａｎｔ社）により蒸発させた。残渣をＨＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中の１％ウシ胎児 血清３ｍｌ中に再溶解し、Ｍｉｌｌｅｘ　−ＧＳ　Ｏ，２２μｍフィルター（マ サチューセッツ州、ベッドフォード。

Ｍｊ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ｐｏｒｅ社）で濾過し、２回測定した、精製工程における生 物アッセイをスピードアップするために、インヒビン活性により作動するＦＳＨ 分泌の基礎抑制のみを測定し、インヒビンタンパク質がクロマトグラフ中で移動 すると予期される領域のみでプロットした。

ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーを実施するために、 凍結Ｐ　Ｆ　Ｆ　５００ｍ１ビンを解凍し、細胞片をベックマンＪ２−２１遠心 分離機（カリフォルニア州、パロアルト、　Ｂｅｃｋｍａｎインスツルメント社 ）中でＪ　Ａ　−２０ｏ−ターを用い、ｉｏ、ｏｏｏｒｐｍで３０分間遠心分離 した。上清（２５０ｍｌ）の半量を４Ωのエーレンマイヤーフラスコ中で０．１ Ｍ　ＮａＣｇを含む０．０１Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ７）　２２５０ｍ１を加え ることにより容量を１０倍に希釈し、ラビット（Ｒａｂｂｉｔ）　４チヤンネル 嬬動ポンプ（カリフォルニア州、エメリーヴイル、　Ｒａｂｉｎｉｎインスツル メント社）と８本のシラスチックチューブを用いてカラム当り４０ｍ１／時の速 度で、８本のヘパリン−セファロースカラム（３，５Ｘ９ｃｍ；ニューシャーシ ー州、ビス力夕ウエイ、　Ｐｈａｒｍａｅｉａファインケミカルズ社）に同時に ポンプ注入した。全液体をヘパリン−セファロースに注入した後、８本のカラム を同時に０．１Ｍ　ＮａＣｇを含む０．０１　Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ７）　３ ．５９で同様に洗浄した。インヒビン活性を有する吸着タンパク質は上述したよ うに８本のカラムを１〜ＩＮａ　（Ｊ７を含む０．０１　Ｍ　）リス−塩酸（ｐ Ｈ７）１．３ｇで同時に洗浄することにより溶出され、洗浄物を１６ｍ１ずつの 分画に分取した。第１ａ図はＰＦＦからインヒビン活性物質を溶出する際の典型 的な溶出パターンを示す。インヒビン活性は上述したｉｎ　ｖｉｔｒｏの生物ア ッセイによりモニターした。カラムを０．ＯＩＭ）リス−塩酸中の２Ｍ　ＮａＣ ｇ（ｐＨ７）　１．６ｇで更に洗浄することにより再生し、残りのＰ　Ｆ　Ｆ　 ２５０ｍ１を精製するために、０．ＩＭ　ＮａＣｇを含む０　、０１　Ｍ　＋− リス−塩酸３．５ｇで再平衡化した。

次いで、得られた物質をゲル濾過によって分画し、その分子量によってタンパク 質を分離した。８本のヘパリン−セファロースカラムにより抽出したインヒビン 活性を有する分画を集め（４００ｍｌ）　、２８．Ｅｉｍｍ内筒径のスペクトラ ポア（Ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ）Ｎｏ、　３膜チユーブ（Ｍｒカットオフ：　３， ５００）（カリフォルニア州、ロスアンゼルス、　ｓｐｅｃｔｒｕｍメディカル インダストリース社）中で３０％酢酸１６ｇに対して一夜透析してＮａＣｇを除 去した。残った液体を上記の如く遠心分離して白色沈殿を除き、上清を等量に８ 分割し、８本のセファクリルＳ−２００スーパーフアインカラム＜　５　Ｘ　１ ００ｃｍ；ニューシャーシー州、ピスカタウエイ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａファイ ンケミカルス社）に供した。各カラムを２０ｍ１／２２分の速度で３０％酢酸で 溶出し、２８０ｎｍのＵＶ吸収および生物アッセイによりカラムの分画をモニタ ーした。

第１ｂ図はセファクリルＳ−２００カラム中で精製されたインヒビン物質の溶出 パターンを示す。はぼ等量の活性を有する２つの溶出ゾーンを検出したが、その うちの１つは＞ｉｒ約３０，０００で溶出し他方はＭｒ約１２，０００で溶出し た。しかしながら、ＵＶ吸収で検出したタンパク質濃度に基くと、低分子量ゾー ンの方がはるかに高い特異的活性を有していた。結果として、この領域を更にＲ Ｐ−ＨＰＬＣにより精製した。

８本のＳ−２００カラムから得られる低分子量のインヒビンタンパク質を集めて 凍結乾燥した。凍結乾燥物質（４０ｍｇ）を０．２Ｎ酢酸４０ｍ１中に溶解し、 Ｍｉｌｌｅｘ　−ＨＡｏ、４５μｍフィルター（マサチューセッツ州、ベッドフ ォード。

Ｍｉ　ｌ　ｌ　１ｐｏｒｅコーポレーシヨン）でン濾過した。ろ液を直接バイダ ック５μｍ−粒径０４カラム（ＩＸ２５ｃｍ；カリフォルニア州、ヘスペリア、 ザ・セパレーション・グループ）に供し、第１ｃ図に示すようにＴＥＡＰ緩衝液 のグラジェントにより展開した。ＴＥＡＰ系においては、緩衝液Ａは０．２５Ｎ リン酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ３）からなり、緩衝液Ｂは緩衝液中の８０ ％アセトニトリルである。全２戸液を装填した後、ＵＶ吸収がベースラインに達 するまてカラムを水性緩衝液Ａで洗浄した。インヒビン活性を示す分画をスペク トロフｏ　−（Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｏｗ）　７５７ＵＶデイテクターにュージャ ージー州、ラムゼイ、　Ｋｒａｔｏｓアナリテイカルインスツルメンツ社）、ツ ルチック（Ｓｏｌｔｅｃ）　２２０レコーター（カリフォルニア州、サンバレー 、　５ｏｌｔｅｃインコーポレーシヨン）およびレディラック（Ｒｅｄｉｒａｃ ）２１１２フラクシヨンコレクター（メリーランド州、ギヤザースバーグ。

ＬＫＢインスツルメンツ社）を備えたべ・ソゲマン３３２グラジ工ント液体クロ マトグラフィーシステム（カリフォルニア州、バークレー、　Ｂｅｃｋｍａロイ ンスツルメンツ社）で分離した。実質的にインヒビン活性を有する２つのゾーン を検出し、そのうち最初の溶出ゾーン（インヒビンタンノくり質Ａ）は後の溶出 ゾーン（インヒビンタンパク質Ｂ）よりも高い活性を示した（第１Ｃ図参照）。

各カラムからのインヒビンタンパク質Ｂを集め、２回のＲＰ−ＨＰＬＣ工程によ り更に精製した。第１の工程では、バイダック５μｍ−粒径０４カラム（Ｉ　Ｘ 　２５ｃｍ）とトリフルオル酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）緩衝液系を用い（第２ａ図）、 第２の工程ではバイダック５μｍ−粒径フェニルカラム（ＩＸ２５ｃｍ）とＴＥ ＡＰ緩衝液系を使用した（第２ｂ図）　。ＴＦＡ系では、緩衝液Ａは水９９９ｍ １中に１−リフルオル酢酸１ｍｌを含有し、緩衝液Ｂは水１９９ｍ１およびアセ トニトリル８００ｍ１中にトリフルオル酢酸１ｍｌを含有する。最終的に２〜３ のバッチから得たインヒビンタンパク質ＢをアクアボアＲＰ　−３００１０μｒ ｎ−粒径カラム（０，４８Ｘ２５ｃｍ　；カリフォルニア州、サンタクララ、　 Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ラプス社）およびＴＦＡ緩衝液系を用いて第２ｃ図に示すよ うに濃縮した。

結局、合計約６０μｇのインヒビンタンパク質ＢをＰＦＦ１８ｇから精製した。

各カラムからのインヒビンタンパク？−Ｔ　Ａを集め、２回のＲＰ−ＨＰＬＣ工 程により更に精製した。第１の工程では、バイダック５μｍ−粒径Ｃ４カラム（ Ｉ　Ｘ　２５ｃｍ）とトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）緩衝液系を用い（第５ａ図） 、第２の工程ではバイダック５μｍ−粒径フェニルカラム（１×２５ｃｍ）とＴ ＥＡＰ緩衝液系を使用した（第５ｂ図）。

ＴＦＡ系では、緩衝液Ａは水９９９ｍ１中にトリフルオル酢酸１ｍｌを含有し、 緩衝液Ｂは水１９９ｍ１およびアセトニトリル８００　ｍｌ中にトリフルオル酢 酸１ｍｌを含有する。最終的に２〜３のバッチから得たインヒビンタンパク質Ａ をアクアポアＲＰ　−３００１０μｍ−粒径カラム（０，４６Ｘ２５ｃｍ　；カ リフォルニア州、サンタクララ、　Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ラプス社）およびＴＦＡ 緩衝液系を用いて第５ｃ図に示すように濃縮した。

結局、合計約６００μｇのインヒビンタンパク質ＡをＰＦＦ１８ｇから精製した 。

実質的に均一なタンパク質ＡおよびＢのアミノ酸分析はボーレン（Ｂｏｈｌｅｎ ）　Ｐ、、らＡｎａｌ、　Ｂｉｏｅｈｅ［Ｉｌ、１２６．１４４ｌ４４−１５６ （１９に記載の方法により行い、結果を表１に示す。

表　１ ブタ卵胞からの精製インヒビンタンパク質のアミノ酸組成Ａ　ｓ　ｘ　１８．５ ±Ｌ、６　２１．０±１．ＩＴｈｒ　１１．５±０．５　１３．５±０．６Ｓ　 ｅ　ｒ　Ｌ６．３±１．４　］、８．１±０．７Ｇ　１　ｘ　２１．３±１．４ 　２２．５±０．５Ｇ　１　”ｌ／　１９．９±１９　２２．４±０．７Ａ　ｌ 　ａ　１９．７±１．４　２２．０±０，６Ｖａｌ　１４．１±１．８　１４． ４±０．４Ｍｅｔ　６．１±０．４　５．８±０，３Ｉ　１　ｅ　１４．６±１ ．７　１０．３±０．２Ｌ　ｅ　ｕ　２７．３±２．１　２７．８±０，８Ｔｙ ｒ　１０．７±１．３　１１．４±０．４Ｐ　ｈ　ｅ　１１．６±１．４　１０ ．０±０．２Ｈｉ　ｓ　１４．１±１．２　７．９±０．６Ｔ　ｒ　ｐ　４．４ ±０．３　３．９±０．４Ｌ　Ｙ　Ｓ　１１．９±０．９　５．４±０．２Ａ　 ｒ　ｇ　１３．９±０．６　１５．８±０．４Ｃｙ　ｓ　”　１４．４±０．２ 　１４．２±０．９Ｐ　ｒ　ｏ　２９．２±０．９　２９．６±１．１本　４回 の分析の平均±ＳＤ（標準偏差）に対応し、測定した。

最後のＲＰ−ＨＰＬＣ精製により得られたインヒビンタンパク質Ｂをラエムリ　 （Ｌａｅｍｍｌｉ）、Ｖｌ、　Ｎｕｔｕｒｅ　２２７゜６８０−６８５　（１９ ７０）の方法によって１ｍｍ厚さの１５％アクリルアミドゲルで還元および非還 元条件下に分析した。タンパク質は銀染色試薬（カリフォルニア州、リッチモン ド。

Ｂ　Ｉ　Ｏ−ＲＡＤ）によって検出した。標準物質として次の分子二基準物質を 使用した：ウシ血清アルブミン（Ｍｒ＝８７．０００）　、卵アルブミン（Ｍｒ 　＝４３，０００）　、α−キモトリプシノーゲン（Ｍｒ　＝２５，７００）お よびリゾチーム（Ｍｒ　＝１４．５００）。非還元条件下では、ゲル上に装填す る前に水２０μρ中のインヒビンタンパク質２μｇを試料緩衝液（２０％グリセ ロール（ｖ／ｖ）を含む０．１５２　Ｎ４　）リス−塩酸、ｐＨ８，８。

４％ドデシル硫酸ナトリウムおよび０．０４％ブロムフェノールブルー）２０μ Ωと共に３７℃で１時間インキュベートした。

電気泳動は室温で２００　Ｖ、６時間で実施した。還元条件下では、試料をゲル 上に装填する前にタンパク質２μｇをまず０．０２Ｍジチオトレイトール２０μ Ωと共に１５分間インキュベートし、次いで試料緩衝液２０μｇを加えて更に１ 時間インキュベートした。電気泳動バッファー中に０．００５　Ｍジチオトレイ トールを含む以外は上記の方法で電気泳動を実施した。非還元条件下の５ＤＳ− ＰＡＧＥでは、インヒビンタンパク質ＢはＭｒ　３２．０００の位置に単一バン ドを示した（第３ａ図参照）。還元条件下では、インヒビンタンパク質は２本の バンドに別れ、一方はＮ・ｉｒ　１ｇ、０００の位置にそして他方はＮ・１ｒ　 １４，０００の位置であった（第３ｂ図）。タンパり質Ａを同様に電気泳動に付 したところ、同様の２本のバンドとＭｒ　８，０００の位置に１本のバンドを示 したが、これは不純物であると思われた。

３２にのインヒビンタンパク質ＡおよびＢの１８におよび１４に鎖のＮＦ２−末 端配列分析は、まず還元条件下に５ＤＳ−ＰＡＧＥで２本の鎖を分離し、次いで 分離したタンパク質鎖をＧＦ／Ｃペーパー上に電気プロッティング（ｅｌｅｃｔ ｒｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）　Ｌ、更にこれを切り抜いて直接微量配列分析に付し た。簡単に説明すると、各インヒビンタンパク質（１２〜１５μｇ）を上記した 如く還元条件下に０．５　ｍｍ厚さの１５％アクリルアミドゲル（８Ｘ　ｌＯｃ ｍ）上で電気分解した。電気分解後にゲルを直ちに室温で０．５％酢酸中の０． ５％ＮＰ−４０（ミズーリ州、セントルイス、　Ｓｉｇｍａケミカル）で３回洗 浄した。次いでゲルをあらかじめプロッティングバッファー（０，５％　ＮＰ− ４０含有２％酢酸）で短時間湿らせた２枚のトリフルオル酢酸活性化ＧＦ／Ｃペ ーパーにュージャージー州、クリフトン、　Ｗｈａｔｍａｎ）の間にはさんだ。

タンパク質が第１のペーパーに完全に吸着されない場合には更に１枚の活性化Ｇ Ｆ／Ｃペーパーをカソード側においた。ＧＦ／Ｃペーパーの外側をワットマンＮ ｏ、　３消紙で保護し、プラスチックグリッド（カルフォルニア州。

リッチモンド、ＢＩＯ−ＲＡＤ）で固定した２枚のスコッチブライト（Ｓｃｏｔ ｃｈ　−Ｂｒ１ｔｅ）パッドの間に全てのアッセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を 挿入した。これをプロッティングバッファー中て一定電圧６０■で４°Ｃ１１６ 時間電気泳動し、陽性に荷電したタンパク質をＧＦ／Ｃペーパー上で移動させた 。

電気的に移動したタンパク質鎖はクーマシーブルー染色により検出した。染色さ れたタンパク質バンドから直径１．２ｃｍの円を切り抜き、これを直接上記の微 量配列分析に供した。

ニッシュ（Ｅｓｃｈ）、　Ｆ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３８．３９− ４７（１９８４）に記載するように、ＮＦ２−末端で始まる完全インヒビンタン パク質の微量配列分析はおよそ等濃度の２種の残基のあることを各分析が示して おり、このことは各タンパク質が２本の鎖からなることを示す。完全および還元 インヒビンタンパク質の多数回にわたる配列分析の結果に基いて、各インヒビン タンパク質の１８に鎖のＮ　Ｈ２−末端のアミノ酸残基はＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌ ａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒ ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌである。インヒビンタンパク質Ｂ の１４に鎖のＮＦ２−末端残基はＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇ ｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇ ｌｙ−Ｔｒｐ−であり、インヒビンタンパク質Ａの１４に鎖のＮＦ２−末端残基 はＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ −１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ −Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓ ｐ−Ｔｒｐ−Ｉ　ｌｅ−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−、である。

し、組換Ｄ　Ｎ　Ａ法によってｃＤＮＡを合成することもできる。メツセンジャ ーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）はインヒビンを産生ずる卵巣の卵胞から得られ、次いで 逆転写によりｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡはクローニングベクタ ーに挿入され、クローニングベクターを用いて適当な宿主を形質転換し、ｃＤＮ Ａライブラリーを創製する。

３種類のインヒビン鎖の既知部分的アミノ酸配列に基いて、各鎖に対応するｃＤ ＮＡを検出するために標識オリゴヌクレオチドを合成する。遺伝コードの縮重の ため、混合ハイブリダイゼーションプローブを用意しプローブとして使用する。

次いでこれらのプローブを用いててライブラリー中から鎖をコードする遺伝子配 ９’ｌを有するｃＤＮＡクローンを選択する。ｃＤＮＡライブラリーは、インヒ ビンまたはインヒビン鎖のうちの１つに対して生じた抗体を用いる免疫学的発現 アッセイによってスクリーニングすることもできる。免疫学的発現アッセイはハ イブリダイゼーションプローブによるスクリーニングの確認に使用することもで きる。

選択したクローンからｃＤＮＡを切り出しプロモーター配列の制御下に適当なベ クターに挿入し、該ベクターは組換えインヒビン鎖の発現用セルライン中に形質 転換される。

適当な鎖のペアに対する遺伝子−を含む複数のベクターが同じセルラインに形質 転換することが考えられるが、簡単化のために各鎖の発現用ベクターを別個にセ ルライン中に形質転換することが好ましい。次いて個々のインヒビン鎖を細胞物 質および／または細胞培養培地から単離して生物活性なインヒビンの製造用中間 体として用いることができる。

適当量の１８におよび１４に鎖を次いで各踏量のジスルフィド結合を促進する酸 化条件に付してインヒビンを製造する。

上記の分子生物学的手法は分離したインヒビン鎖をコードする遺伝子配列の読取 り、従ってタンパク質鎖の完全性状決定にも使用することができる。今やタンパ ク質Ａは完全に性状決定され、１１６個のアミノ酸残基鎖（１４に鎖）と１また は複数のジスルフィド結合により結合した１３４個のアミノ酸残基鎖（１８に鎖 ）を含むことが判明した。１３４−残基鎖は以下の配列： Ｈ−３ｅｔ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒ ｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒ’ｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｈ ｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ ｓｎ−Ｉ　ｌｅ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ− Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−８ｅｒ− Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ− Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ− Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ− Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ− Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ］、ｙ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ　Ａｒｇ −Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ −３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｃｙｓ　−Ｉ　 １ｅ−ＯＨ を有している。１１６−残基鎖は以下の配列：Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃ ｙｓ　−Ａｓｐ−Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ −Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−１１ｅ−１１ｅ −Ａｌａ−Ｐｒｏ−３ｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ −Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−１１ｅ −Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ −Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ −Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ −Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−８ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ −Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−１１ｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ −Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ を有している。この性状決定はＰＦＦから得られた精製タンパク質の初期の分析 と合致する。第１の鎖のアミノ酸残基の数と１８にの実測値との不一致は上記し たグリコジル化の存在によって説明される。分子量約３０００ダルトンの炭水化 物部分は第１鎖の３６位にあるＡｓｎ残基の側鎖に結合しているものと信じられ る。

タンパク質Ｂも性状決定され、１８に鎖はタンパク質Ａと同じ配列を有している と信じられる。１４に鎖は以下の１１５個のアミノ酸残基配列を有していること が判明した。

Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｉ　 ｌｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−３ｅｒ− Ａｓｐ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｉ　ｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ −Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｃｙｓ −Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ −５ｅｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ −Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ −Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ −１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ −Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ −１１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎｌｖｉｅ ｔ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−ＯＨ 。

この性状決定はＰＦＦから得られた精製タンパク質の初期の分析と一致する。

従って本発明は生物活性なジスルフィド−結合ダイマーを製造する中間体として 有用な約１１５残基〜約１３４残基のポリペプチドまたは比較的短いタンパク質 を提供する。更に詳しくは、本発明は以下の３種類のポリペプチドを提供する。

（ａ）　Ｈ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒ ｏ−Ｔｒｐ−３ｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖａ ｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｌｅ ｕ−Ａｓｎ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒ ｐ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−３ｅ ｒ−Ｐｈｅ　−Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｈｉ　５−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ｈｌｓ−Ｇｌ ｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓ ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒ ｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌ ｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａ ｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒｌｖｉｅｔ−Ａｒｇ−３ｅｒ− Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ −Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ −Ｃｙｓ−１１ｅ−ＯＨ； （ｂ）　Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈ ｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−３ｅ ｒ−Ａｓｐ−Ｔ’ｒｐ−１１ｅ−Ｉ　ｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ− Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−３ｅｒ− Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ａｌａ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ− Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｃｙｓ− Ｃｙｓ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ− ３ｅｒ−ｈｉｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ −Ａｓｎ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ ｌｖｉｅｔ　−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａ ｌａ−ＯＨ； （ｅ）　Ｈ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａ ｌ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓ ｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｉ　１ｅ−Ｉ　ｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｙ− Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ− Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ− Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−６ｅｒ−Ｔｈｒ− Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａ１ａ＝Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−３ｅｒ− Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ− Ｍｅｔ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ− Ｇｌｎ−Ａｓｎ−１１ｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｎ− Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｉ　１ｅ−Ｖａｌ、−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙ ｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ 例えば、１３４−残基のポリペプチドは他の短鎖ポリペプチドの１つと結合して 生物活性なジスルフィド−結合へテロダイマーを形成することができる。

薬学的に許容される担体と組合せて医薬組成物を形成する実質的に純粋な３２に インヒビンまたはその無毒性塩は、受胎能を抑制するためにヒトを含む哺乳動物 に静脈内、皮下、経皮、筋肉内または経口的に投与することができる。

インヒビン投与は照明乳動物に受胎能の減少を誘導し、雌補乳動物には精子形成 の減少を誘導する。十分量のインヒビンの投与は哺乳動物に不妊症を誘導する。

インヒビンは不妊症の診断にも使用できる。

このようなペプチドはしばしば薬学的に許容される無毒性塩、例えば酸付加塩ま たは亜鉛、鉄などの金属錯体（これらも本発明の目的にとっては塩と考えられる ）の形で投与される。酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、 リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リン ゴ酸塩、アスコルビン酸塩、シュウ酸塩が挙げられる。活性成分を錠剤形で投与 する場合には、錠剤はトラガカント、コーンスターチまたはゼラチンのような結 合剤、アルギン酸のような崩壊剤およびステアリン酸マグネシウムのような滑沢 剤を含んでいてもよい。液体形の投与が望ましい場合には、甘味料および／また は着香料を用いることかでき、また等張合塩水、リン酸緩衝液に溶解して静脈内 投与することもできる。

インヒビンは内科医の指導の下に投与されるべきであり、通常医薬組成物は有効 量のペプチドと慣用の薬学的に許容される担体とを組合せてなる。投与量はタン パク質が投与される特定の目的に依って変化し、タンパク質が雄避妊薬として標 準的に投与される場合の投与量レベルは体重１ｋｇ当り約０．１〜約ＩＩＩＩｇ の範囲である。

インヒビンの精製法は主としてＰＦＦからの単離によって説明したが、インヒビ ンはその他の粗エキスからも同様に精製され得る。“粗エキス″という語は本明 細書中では卵胞液に加えてその他の哺乳動物体材料の抽出物を意味し、また補乳 動物インヒビンタンパク質の製造のために当業界の技術水準にある方法によって 形質転換された原核生物（例えば大腸菌）および真核生物〔例えばサツカロミセ ス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））等の実験室微生物を含む生物 体の抽出物も意味する。

本発明はその好ましい態様について説明され、それは本発明の発明者にとっての 現時点における最良の態様を示すが、請求の範囲に記載の発明の範囲を逸脱する ことなく当業者に自明な各種変更や修飾がなされうろことが理解されるべきであ る。

本発明の特定の面を以下の請求の範囲に強調する。

第１ａ図 第１Ｃ図 第３図 Ｂ　ｓ ＦＳＨ（ｎｇ／ｍｌ・４８ＭＩＪ）− ＬＨ（ｎｇ／ｍｌ−４８ＢＳ：Ｗ）−−−−−卑５ａ閲 孔５Ｃ回 国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．総タンパク質の少なくとも約９０重量％の純度を有する３２，０００ダルト ンのタンパク質であって、該タンパク質のｐＫａは約４．８であり、該タンパク 質は分子量約１８，０００ダルトンの第１ポリペプチド鎖と分子量約１４，００ ０ダルトンの第２ポリペプチド鎖とからなり、該第１鎖と第２鎖とは活性タンパ ク質中ではジスルフィド結合によって互いに結合しており、該第１鎖は【配列が あります】で始まるアミノ−末端配列を有しておりそして該第２鎖は【配列があ ります】 で始まるアミノ−末端配列を有し、該タンパク質は卵胞刺激ホルモンの基礎分泌 を特異的に抑制するが黄体形成ホルモンの基礎分泌を抑制しない、上記タンパク 質。
2. ２．第２鎖が【配列があります】 で始まるアミ ノ−末端配列を有する請求の範囲第１項記載のタンパク質。
3. ３．第２鎖が【配列があります】 （ただし、Ｘは未知のアミノ酸残基である）で始まるアミ−末端配列を有する請 求の範囲第１項記載のタンパク質。
4. ４．第２鎖が以下の配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第１項記載のタンパク質。
5. ５．第２鎖が以下の配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第１項記載のタンパク質。
6. ６．アミノ酸組成がおよそＡｓｘ２１．０，Ｔｈｒ１３．５，Ｓｅｒ１８．１， Ｇｌｘ２２．５，Ｇｌｙ２２．４，Ａｌａ２２．０，Ｖａｌ１４．４，Ｍｅｔ５ ．８，Ｉｌｅ１０．３，Ｌｅｕ２７．８，Ｔｙｒ１１．４，Ｐｈｅ１０．０，Ｈ ｉｓ７．９，Ｔｒｐ３．９，Ｌｙｓ５．４，Ａｒｇ１５．８，Ｃｙｓ１４．２， およびＰｒｏ２９．６である請求の範囲第１項記載のタンパク質。
7. ７．アミノ酸組成がおよそＡｓｘ１８．５，Ｔｈｒ１１．５，Ｓｅｒ１６．３， Ｇｌｘ２１．３，Ｇｌｙ１９．９，Ａｌａ１９．７，Ｖａｌ１４．１，Ｍｅｔ６ ．１，Ｉｌｅ１４．６，Ｌｅｕ２７．３，Ｔｙｒ１０．７，Ｐｈｅ１１．６，Ｈ ｉｓ１４．１，Ｔｒｐ４．４，Ｌｙｓ１１．９，Ａｒｇ１３．９，Ｃｙｓ１４． ４，およびＰｒｏ２９．２である請求の範囲第１項記載のタンパク質。
8. ８．第１鎖が以下の配列： 【配列があります】 を有し、且つグリコシル化されている請求の範囲第１項記載のタンパク質。
9. ９．第１鎖が以下の配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第５項記載のタンパク質。
10. １０．第２鎖が以下の配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第１項記載のタンパク質。
11. １１．第１鎖が以下の配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第１０項記載のタンパク質。
12. １２．インヒビン活性を有する抽出物材料を用意し、インヒビンタンパク質がヘ パリン分子に吸着する条件下に、ヘパリン分子が結合する支持体媒質中に該抽出 物をさらし、次いで該インヒビンタンパク質を該ヘパリン分子から溶出し、 該溶出インヒビンタンパク質をゲル濾過してインヒビン活性を有する分画を選択 し、そして 該ゲル濾過分画物を少なくとも１回の逆相高性能液体クロマトグラフィーカラム 上で分画する、ことからなる粗抽出物からインヒビン活性を有する実質的に均一 なタンパク質を得る方法。
13. １３．該ゲル濾過分画物を異なる固相条件および／または液相条件の少なくとも ２回の連続的逆相高性能液体クロマトグラフィーカラム上で分画する請求の範囲 第１２項記載の方法。
14. １４．逆相高性能液体クロマトグラフィーの少なくとも１回をＣ３−Ｃ５カラム で実施する請求の範囲第１２項記載の方法。
15. １５．粗抽出物をブタ体材料から得る請求の範囲第１２項記載の方法。
16. １６．体材料がブタ卵胞液である請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．２本の鎖がジスルフィド結合によって内部結合した、組換えＤＮＡ法等に より製造される合成タンパク質であって、第１鎖が以下の配列： 【配列があります】 を有し、そして第２鎖が以下の配列： 【配列があります】 または以下の配列： 【配列があります】 を有する上記合成タンパク質。
18. １８．以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される、生物活性ダイマーの製 造に用いる化学中間体として有用な合成ポリペプチド。 （ａ）【配列があります】 （ｂ）【配列があります】 （ｃ）【配列があります】
19. １９．以下の配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第１８項記載のポリペプチド。
20. ２０．以下の配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第１８項記載のポリペプチド。