JPH07108916B2

JPH07108916B2 - インヒビンおよびその精製法

Info

Publication number: JPH07108916B2
Application number: JP61504032A
Authority: JP
Inventors: リング，ニコラス・チャイ‐クワン; イング，シャオ‐ヤオ; エシュ，フレッド・スティーヴン; ギルミン，ロジャー・チャールズ・ルイス
Original assignee: Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 1985-07-18
Filing date: 1986-07-17
Publication date: 1995-11-22
Anticipated expiration: 2010-11-22
Also published as: AU605105B2; EP0232326A1; DE3650088T2; WO1987000528A1; US4740587A; ATE112573T1; DE3650088D1; JPS63500309A; AU6149886A; EP0232326B1; EP0232326A4

Description

【発明の詳細な説明】本発明はブタの体材料から実質的に均一に単離されたイ
ンヒビン（inhibin）活性を有するタンパク質に関す
る。本発明はまたブタインヒビンの精製法に関する。

背景技術性腺で産生されるが下垂体レベルで卵胞刺激ホルモン
（FSH）の分泌を特異的に抑制する水溶性物質としての
インヒビンの存在はマックラウ（McCullagh）によって1
932年に仮定された(Science,76,19-20)。このようなゴ
ナドトロピン（性腺刺激ホルモン）の選択的抑制はおお
いに関心を呼び、過去50年間多くの実験室において精
巣、精子、精巣網液、精液血漿および卵巣の卵胞液の抽
出物から各種生物検定法によりこの物質を単離し性状決
定する試みがなされてきた。分子量5,000〜100,000ダル
トンの範囲のインヒビン様物質の精製を主張する文献が
数多く出現したが、追試の結果これらの物質は均一でな
いか或は真のインヒビンに期待されるだけの高い特異的
活性を有していないことが明らかとなった〔デ・ジョン
グ（de jong），Molecular & Cellular Endocrin.,13,1
-10(1979)〕。インヒビン活性を有する物質は哺乳動
物、特に雄哺乳動物の受精能を抑制するのに使用できる
かも知れない。

発明の要旨本発明によると、いずれも分子量約32,000ダルトンでイ
ンヒビン活性を有する２種類のタンパク質をブタ卵胞液
から単離することに成功した。これら２種類のタンパク
質は微量配列分析法および分子生物学的手法により完全
に性状決定された。

タンパク質はブタの体から得られる材料から実質的に均
一に単離されタンパク質Ａおよびタンパク質Ｂと命名さ
れた。各タンパク質は分子量約32,000ダルトン（32K）
であって、分子量が各々18,000ダルトンおよび14,000ダ
ルトンの２本のポリペプチド鎖からなり、２本の鎖はジ
スルフィド結合によって結合されて生物的に活性なタン
パク質となっている。２種のタンパク質の18,000ダルト
ン（18K）鎖のアミノ末端のアミノ酸残基配列はSer-Thr
-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-Ala-Leu-A
rg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Valであ
り、また14,000ダルトン（14K）鎖の両アミノ末端の最
初の６個のアミノ酸残基は同一、即ちGly-Leu-Glu-Cys-
Asp-Glyであることが微量配列分析法により明らかとな
った。タンパク質Ｂの14K鎖の最初の10個のアミノ酸残
基はGly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leuである
ことも確認された。タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂは
更なる微量配列分析法および分子生物学的手法を利用し
た結果完全に性状決定された。各32Kタンパク質はFSHの
基礎分泌（basal secretion）を特異的に抑制するが黄
体形成ホルモン（LH）の基礎分泌を抑制しない、という
インヒビン活性を示す。個々の鎖は生物学的に活性では
ない。

ブタインヒビンの実質的均一、即ち分画中の総タンパク
質の約90重量％の純度への精製はヘパリン−セファロー
スアフィニティクロマトグラフィー、ゲル過および逆
相高性能液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を含むタ
ンパク質分離法の組合せにより達成された。

図面の簡単な説明第1a,bおよびｃ図はブタ卵胞液（PFF）からインヒビン
タンパク質を以下に記載する条件において精製する第１
工程を表すクロマトグラムである。

（ａ）PFFのヘパリン−セファロースアフィニティクロ
マトグラフィー。インヒビンタンパク質は0.01Mトリス
−塩酸、pH7中の1M NaClにより溶出された。

（ｂ）PFFインヒビンタンパク質のセファクリルS-200ゲ
ル過。第1a図下部の黒色部分で示される溶出分画を集
め、透析し次いでこのゲル過用に８つの等量部分に分
けた。カラムのうちの一つを各カラムの例として示し
た。

（ｃ）ゲル過から回収したインヒビンタンパク質のRP
-HPLC精製。ゲル過の活性領域部分（in vitroの生物
アッセイで決定し、第1b図に黒色部分で示した）を集
め、凍結乾燥し、0.2N酢酸に溶解した後バイダック（Vy
dac）C4カラムに直接装填し、TEAP中のアセトニトリル
緩衝液系の図示したグラジエントを用いて9ml/3分で溶
出した。第1c図に図示した２種のインヒビンタンパク
質、タンパク質ＡおよびＢを回収した。

第2a、ｂおよびｃ図は以下に示す方法によるインヒビン
タンパク質ＢのRP-HPLC精製のクロマトグラムである。

（ａ）第1c図の黒色部分Ｂと称する活性分画を集め、そ
の始めの容量の３倍に希釈した後バイダックC4カラムに
直接装填しトリフルオル酢酸（TFA）中のアセトニトリ
ル緩衝液系の図示したグラジエントを用いて9ml/3分で
溶出した。

（ｂ）第2a図の黒色部分で示される活性物質を集め、そ
の始めの容量の３倍に希釈し、同様にバイダックフェニ
ルカラムでリン酸トリエチルアンモニウム（TEAP）中の
アセトニトリル緩衝液系の図示したグラジエントを用い
て2ml/2分で溶出して精製した。

（ｃ）第2b図のクロマトグラムで表されるカラムと同様
の多数のカラムから得た活性物質を集めアクアポア（Aq
uapore）RP-300カラム上でTFA中のアセトニトリル緩衝
液系の図示したグラジエントを用いて0.5ml/分で溶出す
ることにより濃縮した（第2c図）。

第３図は以下に示す方法による精製インヒビンタンパク
質Ｂのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（SDS-PAGE）分析による実際の電気泳動の結
果を示す。

（ａ）非還元的条件下におけるタンパク質Ｂの分析。

（ｂ）還元的条件下におけるタンパク質Ｂの分析。

分子量標準値は左に示した。

第４図はラット下垂体前葉細胞培養物からのFSHおよびL
Hの基礎分泌に及ぼす精製インヒビンタンパク質Ｂ
（○）および粗PFF基準物（△）の用量依存曲線を示
す。粗PFF基準物はPFFの木炭−ストリップ化（Chacoal-
stripped）および40％飽和硫酸アンモニウム沈殿物であ
る〔シュワルツ（Schwartz）,N.ら，Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 74,5721-5724（1977）〕。

第5a、ｂおよびｃ図は以下に示す方法によるインヒビン
タンパク質ＡのRP-HPLC精製のクロマトグラムである。

（ａ）第1c図の黒色部分Ａと称する活性分画を集め、そ
の始めの容量の３倍に希釈した後、バイダックC4カラム
に直接装填しトリフルオル酢酸（TFA）中のアセトニト
リル緩衝液系の図示したグラジエントを用いて9ml/3分
で溶出した。

（ｂ）第5a図の黒色部分で示される活性物質を集め、そ
の始めの容量の３倍に希釈し、同様にバイダックフェニ
ルカラムでリン酸トリエチルアンモニウム（TEAP）中の
アセトニトリル緩衝液系の図示したグラジエントを用い
て2ml/2分で溶出して精製した。

（ｃ）第5b図のクロマトグラムで表されるカラムと同様
の多数のカラムから得た活性物質を集めアクアポアRP-3
00カラム上でTFA中のアセトニトリル緩衝液系の図示し
たグラジエントを用いて0.5ml/分で溶出することにより
濃縮した（第5c図）。

好適な態様の詳細な記載多工程を経て２種類の32,000ダルトンのペプチドがブタ
卵胞液（PFF）から実質的に均一に単離された。各タン
パク質（タンパク質Ａおよびタンパク質Ｂ）は各々18K
および14Kの２本の鎖からなり、完全な分子中における
２本の鎖はジスルフィド結合により互に結合されてお
り、２本の鎖の間の結合は生物活性の為に必要である。
全タンパク質のアミノ酸分析を各々行い、各鎖のアミノ
−末端のアミノ酸残基配列を微量配列決定法により決定
した。各タンパク質の18K鎖のアミノ−末端配列はSer-T
hr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-Ala-Leu
-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Valで
あることが見出された。更に研究した結果、いずれの18
K鎖も134個のアミノ酸残基からなる全く同じ配列と遊離
酸Ｃ−末端とを有していることがわかった。

微量配列分析法によりまず、14K鎖のアミノ−末端配列
については、双方の鎖の最初の６個のアミノ酸残基は同
じであり、且つタンパク質Ｂの14K鎖の最初の10個のア
ミノ酸残基はGly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Le
uであることを示した。更に配列分析を行うことによ
り、次の15アミノ酸残基はX₁₁-X₁₂‐Arg-Gln-Gln-Phe-P
he-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu-X₂₃‐Gly-Trpであり、ここでX
₁₁は多分Serであり、X₁₂は多分CysでありそしてX₂₃はIl
eまたはLeuであることが明らかとなった。その後、X₁₁
とX₁₂はいずれもCysでありそしてX₂₃はIleであることが
決定された。鎖の配列決定を行いうる能力からしてタン
パク質は総タンパク質の少なくとも約90重量％の純度に
精製されたことを示し、また最終のクロマトグラフィー
による精製工程におけるタンパク質の鋭い溶出ピークも
それを支持した。

３本の鎖のいずれのＣ−末端も遊離酸である。更に微量
配列分析法によりタンパク質Ａの14K鎖のＮ−末端はGly
-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-Cys-Cys-Lys-L
ys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Trp-Asn
-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Proの配列を有することが明らか
となった。

タンパク質Ａは今や完全に性状決定され、116個のアミ
ノ酸残基の鎖（14K鎖）（この鎖は少なくとも１個の内
部ジスルフィド結合を有していると思われる）と１また
は複数のジスルフィド結合によって結合された134個の
アミノ酸残基の鎖（18K鎖）を含むことが明らかとなっ
た。タンパク質Ｂは相同な14K鎖に結合した同一の18K鎖
を有している。

各32Kタンパク質は酸性で4.8のpKa値を有し、一般に水
性媒質に溶解する。各タンパク質はコンカナバリンＡ
（concanavalin A）に対する限定的親和力によって決定
されたように、一部分グリコシル化されている。各32K
タンパク質はラット脳下垂体前葉単層培養系においてFS
Hの基礎分泌を特異的に抑制するインヒビン活性を示
す。タンパク質ＢはコンピュータープログラムBIOPROG
で計算したところ、450pg/mlの半数有効量（half-maxim
um effective dose;ED₅₀）を示し、タンパク質Ａは900p
g/mlのED₅₀を示した。各32Kタンパク質は哺乳動物、特
に雄の受精能を抑制するために有用である。

各32Kタンパク質はウシ卵胞液から単離された56,000ダ
ルトン（56K）のタンパク質に似た性質を有している。
該ウシからのタンパク質は互いにジスルフィド結合で結
合した分子量44,000および14,000ダルトン（44Kおよび1
4K）の２本の鎖からなる。ロバートソン（Robertson）
ら，Bio.Chem.Biophys.Res.commun. 176,220-226（198
5）により報告されたウシの44K鎖の最初の３個のアミノ
−末端残基は今回単離されたいずれのブタ32Kタンパク
質の２本の鎖のいずれとも異なっているが、ウシ56Kペ
プチドの14K鎖の２番目および３番目の残基はいずれの
ブタ32Kペプチドの14K鎖のものとも同じである。ブタ32
Kタンパク質とウシ56Kタンパク質との関係については、
もしそれがあるとしても今回明らかとはならなかった。

各32Kタンパク質は最近ヒト精液血漿から単離され性状
決定された“α−インヒビン”〔ラマシャルマ（Ramash
arma）,K.ら，Science 223,1191-1201（1984）；リ（L
i）,C.H.ら，Proc.Natl.Acad.Sic.USA82,4041-4044（19
85）〕および“β−インヒビン”〔セイダー（Seida
h）,N,FEBS Letter 175,349-354（1985）〕とは全く異
なっている。“α−インヒビン”は92アミノ酸残基の親
分子に全て由来する一本鎖ポリペプチドであると報告さ
れている。しかしながら、α−インヒビン−52の31アミ
ノ酸からなるNH₂−末端フラグメントも天然産物もいず
れもラット脳下垂体前葉細胞培養物において基礎FSH−
放出活性を抑制しなかった〔ヤマシロ（Yamasiro）,D.
ら，Proc.Natl.Acad.Sic.USA81,5349-5402（1984）〕。
“β−インヒビン”は文献記載内容によるとCOOH末端の
67-94フラグメントに活性中心を有する94個のアミノ酸
からなる一本鎖ポリペプチドであると記載されている。
〔アーバッティ（Arbatti）,N.ら，FEBS Lettres 181,5
7-63（1985）〕。このフラグメントを合成したが、５μ
g/mlの濃度までではラット脳下垂体前葉細胞培養物アッ
セイにおいてFSHの基礎分泌の抑制に対して不活性であ
ることが判った。前掲のラマシャルマらおよびリらのこ
れら２つの実験室においてインヒビン活性のために用い
た生物検定法は本明細書で記載するものとは実質的に異
る。

本発明によるインヒビン精製過程においては、ヘパリン
−セファロースアフィニティクロマトグラフィー、ゲル
過および固定相および／または移動相に各種条件を用
いる少なくとも１回、好ましくは数回のRP-HPLCを含む
連続的精製工程によってブタインヒビンはブタの体、特
にブタ卵胞液（PFF）から得られる粗抽出物から単離さ
れるが、他の適当な体材料の抽出物も使用できる。同じ
精製工程は組換えDNA法により得られる粗抽出物から目
的とする哺乳動物インヒビンタンパク質を得るのにも利
用できる。

ブタインヒビンを始めて実質的に純粋に単離した好適な
工程においては、PFFをまずヘパリン−セファロースア
フィニティークロマトグラフィーで精製し、次いでセフ
ァクリルS-200ゲル上のゲル過そして続いて異なる移
動相グラジエントおよび／または誘導体化（derivatize
d）シリカ支持体を用いる４回の連続RP-HPLCにより精製
する。比較的に低い疎水性を有する固定相を用いるのが
好ましく、（3-C8カラムが好適であり、C3-C5およびフ
ェニルカラムが特に好適である。移動相の溶質特性は好
適には有機成分、特にアセトニトリルの濃度を変えるこ
とにより調整される。１回のRP-HPLC精製であってもゲ
ル過した物質の純度を有意に増すが、一般には２回も
しくはそれ以上、好ましくは４回のRP-HPLC精製をヘパ
リン−セファロースクロマトグラフィーおよびゲル過
による連続処理に続いて行う。

精製工程のための出発材料はカリフォルニア州、ウッド
ランド、J.R.サイエンティフィツク社から入手した凍結
PFFであった。凍結PFF約18lをインヒビン生成物を単離
するために250mlのバッチに分けた。精製の第１工程は
ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフ
ィーであって、この工程ではタンパク質は適用条件下に
セファロース−結合ヘパリン分子に吸着され、吸着され
たインヒビン物質は1M NaCl溶出液によって回収され
る。この工程は粗エキスの精製工程をおおいに促進す
る。何故なら、この方法はPFFのような比較的大容量の
粗エキスをかなり速く処理することができ、且つ粗エキ
スの活性の少なくとも90％の全インヒビン活性を示すタ
ンパク質を回収することができるからである。

精製工程を通じてインヒビンの生物活性はラット脳下垂
体前葉の単層培養物〔ヴェール（Vale）,W.ら，Endocri
nology 91,562-572（1972）〕を用いるin vitroの生物
アッセイによりモニターした。簡単に述べると、生後21
日目の雌ラットの脳下垂体前葉を集め酵素的に分散し、
１日目に24ウェルの組織培養プレート（カリフォルニア
州，オックスナード，ファルコンプラスチック社）上
でHDMEM（カリフォルニア州，サンタクララ,GIBCOラボ
ラトリース社）中の10％ウシ胎児血清におく。２日目に
培地をHDMEM中の１％ウシ胎児血清に変え試料を加え
る。更に48時間インキュベーションを続行する。次いで
培地を回収し、LHおよひFSH濃度をNIADDKD社の脳下垂体
ホルモンプログラムより入手した物質を用いるラジオイ
ムノアッセイ（RIA）により測定する。このアッセイに
おいてはインヒビンタンパク質は培地のみをインキュベ
ーションする対照群と比較して、FSHの基礎放出のみを
抑制し、LHの放出を抑制しない。

各種カラムの分画中のインヒビン活性を検定するには、
0.01〜0.1容量％のアリコートを採り、水100μｌ中のヒ
ト血清アルブミン100μｇを加えた後、溶媒をスピード
−バク（Speed-Vac）濃縮器（ニューヨーク州，ヒック
スビル,Savant社）により蒸発させた。残渣をHDMEM中の
１％ウシ胎児血清3ml中に再溶解し、Millex-GS 0.22μ
ｍフィルター（マサチューセッツ州，ベッドフォード,M
illipore社）で過し、２回測定した、精製工程におけ
る生物アッセイをスピードアップするために、インヒビ
ン活性により作動するFSH分泌の基礎抑制のみを測定
し、インヒビンタンパク質がクロマトグラフ中で移動す
ると予期される領域のみでプロットした。

ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフ
ィーを実施するために、凍結PFF500mlビンを解凍し、細
胞片をベックマンJ2-21遠心分離機（カリフォルニア
州，パロアルト,Beckmanインスツルメント社）中でJA-2
0ローターを用い、10,000rpmで30分間遠心分離した。上
清（250ml）の半量を4lのエーレンマイヤーフラスコ中
で0.1M NaClを含む0.01Mトリス−塩酸（pH7）2250mlを
加えることにより容量を10倍に希釈し、ラビット（Rabb
it）４チャンネル蠕動ポンプ（カリフォルニア州，エメ
リーヴィル,Rabininインスツルメント社）と８本のシラ
スチックチューブを用いてカラム当り40ml/時の速度
で、８本のヘパリン−セファロースカラム（3.5×9cm;
ニュージャージー州，ピスカタウェイ,Pharmaciaファイ
ンケミカルズ社）に同時にポンプ注入した。全液体をヘ
パリン−セファロースに注入した後、８本のカラムを同
時に0.1M NaClを含む0.01Mトリス−塩酸（pH7）3.5lで
同様に洗浄した。インヒビン活性を有する吸着タンパク
質は上述したように８本のカラムを1M NaClを含む0.01M
トリス−塩酸（pH7）1.3lで同時に洗浄することにより
溶出され、洗浄物を16mlずつの分画に分取した。第1a図
はPFFからインヒビン活性物質を溶出する際の典型的な
溶出パターンを示す。インヒビン活性は上述したin vit
roの生物アッセイによりモニターした。カラムを0.01M
トリス−塩酸中の2M NaCl（pH7）1.6lで更に洗浄するこ
とにより再生し、残りのPFF250mlを精製するために、0.
1M NaClを含む0.01Mトリス−塩酸3.5lで再平衡化した。

次いで、得られた物質をゲル過によって分画し、その
分子量によってタンパク質を分離した。８本のヘパリン
−セファロースカラムにより抽出したインヒビン活性を
有する分画を集め（400ml）、28.6mm内筒径のスペクト
ラポア（Spectrapor）No.3膜チューブ（Mrカットオフ:
3,500）（カリフォルニア州，ロスアンゼルス,Spectrum
メディカルインダストリース社）中で30％酢酸16lに対
して一夜透析してNaClを除去した。残った液体を上記の
如く遠心分離して白色沈殿を除き、上清を等量に８分割
し、８本のセファクリルS-200スーパーファインカラム
（５×100cm;ニュージャージー州，ピスカタウェイ,Pha
rmaciaファインケミカルス社）に供した。各カラムを20
ml/22分の速度で30％酢酸で溶出し、280nmのUV吸収およ
び生物アッセイによりカラムの分画をモニターした。

第1b図はセファクリルS-200カラム中で精製されたイン
ヒビン物質の溶出パターンを示す。ほぼ等量の活性を有
する２つの溶出ゾーンを検出したが、そのうちの１つは
Mr約30,000で溶出し他方はMr約12,000で溶出した。しか
しながら、UV吸収で検出したタンパク質濃度に基くと、
低分子量ゾーンの方がはるかに高い特異的活性を有して
いた。結果として、この領域を更にRP-HPLCにより精製
した。

８本のS-200カラムから得られる低分子量のインヒビン
タンパク質を集めて凍結乾燥した。凍結乾燥物質（40m
g）を0.2N酢酸40ml中に溶解し、Millex-HA0.45μｍフィ
ルター（マサチューセッツ州，ベッドフォード,Millipo
reコーポレーション）で過した。液を直接バイダッ
ク５μｍ−粒径C4カラム（１×25cm;カリフォルニア
州，ヘスペリア，ザ・セパレーション・グループ）に供
し、第1c図に示すようにTEAP緩衝液のグラジエントによ
り展開した。TEAP系においては、緩衝液Ａは0.25Nリン
酸トリエチルアンモニウム（pH3）からなり、緩衝液Ｂ
は緩衝液中の80％アセトニトリルである。全液を装填
した後、UV吸収がベースラインに達するまでカラムを水
性緩衝液Ａで洗浄した。インヒビン活性を示す分画をス
ペクトロフロー（Spectroflow）757UVディテクター（ニ
ュージャージー州，ラムゼイ,Kratosアナリティカルイ
ンスツルメンツ社），ソルテック（Soltec）220レコー
ダー（カリフォルニア州，サンバレー,Soltecインコー
ポレーション）およびレディラック（Redirac）2112フ
ラクションコレクター（メリーランド州，ギャザースバ
ーグ,LKBインスツルメンツ社）を備えたベッグマン332
グラジエント液体クロマトグラフィーシステム（カリフ
ォルニア州，バークレー,Beckmanインスツルメンツ社）
で分離した。実質的にインヒビン活性を有する２つのゾ
ーンを検出し、そのうち最初の溶出ゾーン（インヒビン
タンパク質Ａ）は後の溶出ゾーン（インヒビンタンパク
質Ｂ）よりも高い活性を示した（第1c図参照）。

各カラムからのインヒビンタンパク質Ｂを集め、２回の
RP-HPLC工程により更に精製した。第１の工程では、バ
イダック５μｍ−粒径C4カラム（１×25cm）とトリフル
オル酢酸（TFA）緩衝液系を用い（第2a図）、第２の工
程ではバイダック５μｍ−粒径フェニルカラム（１×25
cm）とTEAP緩衝液系を使用した（第2b図）。TFA系で
は、緩衝液Ａは水999ml中にトリフルオル酢酸1mlを含有
し、緩衝液Ｂは水199mlおよびアセトニトリル800ml中に
トリフルオル酢酸1mlを含有する。最終的に２〜３のバ
ッチから得たインヒビンタンパク質ＢをアクアポアRP-3
00 10μｍ−粒径カラム（0.46×25cm;カリフォルニア
州，サンタクララ,Brownleeラブス社）およびTFA緩衝液
系を用いて第2c図に示すように濃縮した。結局、合計約
60μｇのインヒビンタンパク質ＢをPFF18lから精製し
た。

各カラムからのインヒビンタンパク質Ａを集め、２回の
RP-HPLC工程により更に精製した。第１の工程では、バ
イダック５μｍ−粒径C4カラム（１×25cm）とトリフル
オル酢酸（TFA）緩衝液系を用い（第5a図）、第２の工
程ではバイダック５μｍ−粒径フェニルカラム（１×25
cm）とTEAP緩衝液系を使用した（第5b図）。TFA系で
は、緩衝液Ａは水999ml中にトリフルオル酢酸1mlを含有
し、緩衝液Ｂは水199mlおよびアセトニトリル800ml中に
トリフルオル酢酸1mlを含有する。最終的に２〜３のバ
ッチから得たインヒビンタンパク質ＡをアクアポアRP-3
00 10μｍ−粒径カラム（0.46×25cm;カリフォルニア
州，サンタクララ,Brownleeラブス社）およびTFA緩衝液
系を用いて第5c図に示すように濃縮した。結局、合計約
600μｇのインヒビンタンパク質ＡをPFF18lから精製し
た。

実質的に均一なタンパク質ＡおよびＢのアミノ酸分析は
ボーレン（Bohlen）P.,らAnal.Biochem. 126,144-156
（1982）に記載の方法により行い、結果を表１に示す。

表 1 ブタ卵胞からの精製インヒビンタンパク質のアミノ酸組
成アミノ酸タンパク質A^* タンパク質B^* Asx 18.5±1.6 21.0±1.1 Thr 11.5±0.5 13.5±0.6 Ser 16.3±1.4 18.1±0.7 Glx 21.3±1.4 22.5±0.5 Gly 19.9±1.9 22.4±0.7 Ala 19.7±1.4 22.0±0.6 Val 14.1±1.8 14.4±0.4 Met 6.1±0.4 5.8±0.3 Ile 14.6±1.7 10.3±0.2 Leu 27.3±2.1 27.8±0.8 Tyr 10.7±1.3 11.4±0.4 Phe 11.6±1.4 10.0±0.2 His 14.1±1.2 7.9±0.6 Trp 4.4±0.3 3.9±0.4 Lys 11.9±0.9 5.4±0.2 Arg 13.9±0.6 15.8±0.4 Cys^** 14.4±0.2 14.2±0.9 Pro 29.2±0.9 29.6±1.1 ＊４回の分析の平均±SD（標準偏差）に対応し、32,000
ダルトンのタンパク質に正規化した値。

＊＊システインは過蟻酸酸化した後のシステイン酸とし
て測定した。

最後のRP-HPLC精製により得られたインヒビンタンパク
質Ｂをラエムリ（Laemmli）,V.,Nuture 227,680-685（1
970）の方法によって1mm厚さの15％アクリルアミドゲル
で還元および非還元条件下に分析した。タンパク質は銀
染色試薬（カリフォルニア州，リッチモンド,BIO-RAD）
によって検出した。標準物質として次の分子量基準物質
を使用した：ウシ血清アルブミン（Mr＝67,000）、卵ア
ルブミン（Mr＝43,000）、α−キモトリプシノーゲン
（Mr＝25,700）およびリゾチーム（Mr＝14,500）。非還
元条件下では、ゲル上に装填する前に水20μｌ中のイン
ヒビンタンパク質２μｇを試料緩衝液（20％グリセロー
ル（v/v）を含む0.152Mトリス−塩酸、pH6.8,4％ドデシ
ル硫酸ナトリウムおよび0.04％ブロムフェノールブル
ー）20μｌと共に37℃で１時間インキュベートした。電
気泳動は室温で200V,6時間で実施した。還元条件下で
は、試料をゲル上に装填する前にタンパク質２μｇをま
ず0.02Mジチオトレイトール20μｌと共に15分間インキ
ュベートし、次いで試料緩衝液20μｌを加えて更に１時
間インキュベートした。電気泳動バッファー中に0.005M
ジチオトレイトールを含む以外は上記の方法で電気泳動
を実施した。非還元条件下のSDS-PAGEでは、インヒビン
タンパク質ＢはMr32,000の位置に単一バンドを示した
（第3a図参照）。還元条件下では、インヒビンタンパク
質は２本のバンドに別れ、一方はMr18,000の位置にそし
て他方はMr14,000の位置であった（第3b図）。タンパク
質Ａを同様に電気泳動に付したところ、同様の２本のバ
ンドとMr8,000の位置に１本のバンドを示したが、これ
は不純物であると思われた。

32Kのインヒビンタンパク質ＡおよびＢの18Kおよび14K
鎖のNH₂−末端配列分析は、まず還元条件下にSDS-PAGE
で２本の鎖を分離し、次いで分離したタンパク質鎖をGF
/Cペーパー上に電気ブロッティング（electro-blottin
g）し、更にこれを切り抜いて直接微量配列分析に付し
た。簡単に説明すると、各インヒビンタンパク質（12〜
15μｇ）を上記した如く還元条件下に0.5mm厚さの15％
アクリルアミドゲル（８×10cm）上で電気分解した。電
気分解後にゲルを直ちに室温で0.5％酢酸中の0.5％NP-4
0（ミズーリ州，セントルイス,Sigmaケミカル）で３回
洗浄した。次いでゲルをあらかじめブロッティングバッ
ファー（0.5％ NP-40含有２％酢酸）で短時間湿らせた
２枚のトリフルオル酢酸活性化GF/Cペーパー（ニュージ
ャージー州，クリフトン,Whatman）の間にはさんだ。タ
ンパク質が第１のペーパーに完全に吸着されない場合に
は更に１枚の活性化GF/Cペーパーをカソード側におい
た。GF/Cペーパーの外側をワットマンNo.3紙で保護
し、プラスチックグリッド（カルフォルニア州，リッチ
モンド,BIO-RAD）で固定した２枚のスコッチブライト
（Scotch-Brite）パッドの間に全てのアッセンブリ（as
sembly）を挿入した。これをブロッティングバッファー
中で一定電圧60Vで４℃,16時間電気泳動し、陽性に荷電
したタンパク質をGF/Cペーパー上で移動させた。電気的
に移動したタンパク質鎖はクーマシーブルー染色により
検出した。染色されたタンパク質バンドから直径1.2cm
の円を切り抜き、これを直接上記の微量配列分析に供し
た。

エッシュ（Esch）,F.Anal.Biochem. 136,39-47（1984）
に記載するように、NH₂−末端で始まる完全インヒビン
タンパク質の微量配列分析はおよそ等濃度の２種の残基
のあることを各分析が示しており、このことは各タンパ
ク質が２本の鎖からなることを示す。完全および還元イ
ンヒビンタンパク質の多数回にわたる配列分析の結果に
基いて、各インヒビンタンパク質の18K鎖のNH₂−末端の
アミノ酸残基はSer-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-
Ser-Pro-Ala-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Gl
u-Glu-Pro-Ala-Valである。インヒビンタンパク質Ｂの1
4K鎖のNH₂−末端残基はGly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-T
hr-Asn-Leu-Cys-Cys-Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe
-Arg-Leu-Ile-Gly-Trp−であり、インヒビンタンパク質
Ａの14K鎖のNH₂−末端残基はGly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-
Lys-Val-Asn-Ile-Cys-Cys-Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Se
r-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Trp-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-
Pro-.である。

インヒビンタンパク質の３本の鎖の配列の実質的部分が
いったん解明されると、この鎖をコードするmRNAを単離
し、組換DNA法によってcDNAを合成することもできる。
メッセンジャーRNA（mRNA）はインヒビンを産生する卵
巣の卵胞から得られ、次いで逆転写によりmRNAからcDNA
を合成する。cDNAはクローニングベクターに挿入され、
クローニングベクターを用いて適当な宿主を形質転換
し、cDNAライブラリーを創製する。

３種類のインヒビン鎖の既知部分的アミノ酸配列に基い
て、各鎖に対応するcDNAを検出するために標識オリゴヌ
クレオチドを合成する。遺伝コードの縮重のため、混合
ハイブリダイゼーションプローブを用意しプローブとし
て使用する。次いでこれらのプローブを用いててライブ
ラリー中から鎖をコードする遺伝子配列を有するcDNAク
ローンを選択する。cDNAライブラリーは、インヒビンま
たはインヒビン鎖のうちの１つに対して生じた抗体を用
いる免疫学的発現アッセイによってスクリーニングする
こともできる。免疫学的発現アッセイはハイブリダイゼ
ーションプローブによるスクリーニングの確認に使用す
ることもできる。

選択したクローンからcDNAを切り出しプロモーター配列
の制御下に適当なベクターに挿入し、該ベクターは組換
えインヒビン鎖の発現用セルライン中に形質転換され
る。適当な鎖のペアに対する遺伝子を含む複数のベクタ
ーが同じセルラインに形質転換することが考えられる
が、簡単化のために各鎖の発現用ベクターを別個にセル
ライン中に形質転換することが好ましい。次いで個々の
インヒビン鎖を細胞物質および／または細胞培養培地か
ら単離して生物活性なインヒビンの製造用中間体として
用いることができる。適当量の18Kおよび14K鎖を次いで
各鎖間のジスルフィド結合を促進する酸化条件に付して
インヒビンを製造する。

上記の分子生物学的手法は分離したインヒビン鎖をコー
ドする遺伝子配列の読取り、従ってタンパク質鎖の完全
性状決定にも使用することができる。今やタンパク質Ａ
は完全に性状決定され、116個のアミノ酸残基鎖（14K
鎖）と１または複数のジスルフィド結合により結合した
134個のアミノ酸残基鎖（18K鎖）を含むことが判明し
た。134−残基鎖は以下の配列： H-Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-
Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Al
a-Val-His-Ala-Asp-Cys-His-Arg-Ala-Ser-Leu-Asn-Ile-
Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Asp-Arg-Trp-Ile-Val-Hi
s-Pro-Pro-Ser-Phe-Ile-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gly-Gly-
Cys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Ser-Va
l-Pro-Gly-Ala-Pro-Pro-Thr-Pro-Val-Gln-Pro-Leu-Leu-
Leu-Val-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala-Leu-Pr
o-Gly-Thr-Met-Arg-Ser-Leu-Arg-Val-Arg-Thr-Thr-Ser-
Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-Pro-As
n-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH を有している。116−残基鎖は以下の配列： H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-Cys-Cys-
Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Tr
p-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr-His-Ala-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Glu-Cys-Pro-Ser-His-Ile-Ala-Gl
y-Thr-Ser-Gly-Ser-Ser-Leu-Ser-Phe-His-Ser-Thr-Val-
Ile-Asn-His-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-His-Ser-Pro-Phe-Al
a-Asn-Leu-Lys-Ser-Cys-Cys-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Arg-
Pro-Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Il
e-Ile-Lys-Lys-Asp-Ile-Gln-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-
Cys-Gly-Cys-Ser-OH を有している。この性状決定はPFFから得られた精製タ
ンパク質の初期の分析と合致する。第１の鎖のアミノ酸
残基の数と18Kの実測値との不一致は上記したグリコシ
ル化の存在によって説明される。分子量約3000ダルトン
の炭水化物部分は第１鎖の36位にあるAsn残基の側鎖に
結合しているものと信じられる。

タンパク質Ｂも性状決定され、18K鎖はタンパク質Ａと
同じ配列を有していると信じられる。14K鎖は以下の115
個のアミノ酸残基配列を有していることが判明した。

H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leu-Cys-Cys-
Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu-Ile-Gly-Tr
p-Ser-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Thr-Gly-Tyr-Tyr-Gly-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Gl
y-Val-Pro-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Phe-His-Thr-Ala-Val-
Val-Asn-Gln-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-Leu-Asn-Pro-Gly-Th
r-Val-Asn-Ser-Cys-Cys-Ile-Pro-Thr-Lys-Leu-Ser-Thr-
Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Phe-Asp-Asp-Glu-Tyr-Asn-Ile-Va
l-Lys-Arg-Asp-Val-Pro-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-
Gly-Cys-Ala-OH. この性状決定はPFFから得られた精製タンパク質の初期
の分析と一致する。

従って本発明は生物活性なジスルフィド−結合ダイマー
を製造する中間体として有用な約115残基〜約134残基の
ポリペプチドまたは比較的短いタンパク質を提供する。
更に詳しくは、本発明は以下の３種類のポリペプチドを
提供する。

（ａ）H-Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pr
o-Ala-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-
Pro-Ala-Val-His-Ala-Asp-Cys-His-Arg-Ala-Ser-Leu-As
n-Ile-Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Asp-Arg-Trp-Ile-
Val-His-Pro-Pro-Ser-Phe-Ile-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gl
y-Gly-Cys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-
Ser-Val-Pro-Gly-Ala-Pro-Pro-Thr-Pro-Val-Gln-Pro-Le
u-Leu-Leu-Val-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala-
Leu-Pro-Gly-Thr-Met-Arg-Ser-Leu-Arg-Val-Arg-Thr-Th
r-Ser-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-
Pro-Asn-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH; （ｂ）H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leu-Cy
s-Cys-Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu-Ile-
Gly-Trp-Ser-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Thr-Gly-Tyr-Ty
r-Gly-Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Pro-Ala-Tyr-Leu-
Ala-Gly-Val-Pro-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Phe-His-Thr-Al
a-Val-Val-Asn-Gln-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-Leu-Asn-Pro-
Gly-Thr-Val-Asn-Ser-Cys-Cys-Ile-Pro-Thr-Lys-Leu-Se
r-Thr-Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Phe-Asp-Asp-Glu-Tyr-Asn-
Ile-Val-Lys-Arg-Asp-Val-Pro-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Gl
u-Cys-Gly-Cys-Ala-OH; （ｃ）H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-Cy
s-Cys-Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-
Gly-Trp-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr-Hi
s-Ala-Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Glu-Cys-Pro-Ser-His-Ile-
Ala-Gly-Thr-Ser-Gly-Ser-Ser-Leu-Ser-Phe-His-Ser-Th
r-Val-Ile-Asn-His-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-His-Ser-Pro-
Phe-Ala-Asn-Leu-Lys-Ser-Cys-Cys-Val-Pro-Thr-Lys-Le
u-Arg-Pro-Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-
Asn-Ile-Ile-Lys-Lys-Asp-Ile-Gln-Asn-Met-Ile-Val-Gl
u-Glu-Cys-Gly-Cys-Ser-OH 例えば、134−残基のポリペプチドは他の短鎖ポリペプ
チドの１つと結合して生物活性なジスルフィド−結合ヘ
テロダイマーを形成することができる。

薬学的に許容される担体と組合せて医薬組成物を形成す
る実質的に純粋な32Kインヒビンまたはその無毒性塩
は、受胎能を抑制するためにヒトを含む哺乳動物に静脈
内、皮下、経皮、筋肉内または経口的に投与することが
できる。インヒビン投与は雌哺乳動物に受胎能の減少を
誘導し、雄哺乳動物には精子形成の減少を誘導する。十
分量のインヒビンの投与は哺乳動物に不妊症を誘導す
る。インヒビンは不妊症の診断にも使用できる。

このようなペプチドはしばしば薬学的に許容される無毒
性塩、例えば酸付加塩または亜鉛、鉄などの金属錯体
（これらも本発明の目的にとっては塩と考えられる）の
形で投与される。酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化
水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、
クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、ア
スコルビン酸塩、シュウ酸塩が挙げられる。活性成分を
錠剤形で投与する場合には、錠剤はトラガカント、コー
ンスターチまたはゼラチンのような結合剤、アルギン酸
のような崩壊剤およびステアリン酸マグネシウムのよう
な滑沢剤を含んでいてもよい。液体形の投与が望ましい
場合には、甘味料および／または着香料を用いることが
でき、また等張食塩水、リン酸緩衝液に溶解して静脈内
投与することもできる。

インヒビンは内科医の指導の下に投与されるべきであ
り、通常医薬組成物は有効量のペプチドと慣用の薬学的
に許容される担体とを組合せてなる。投与量はタンパク
質が投与される特定の目的に依って変化し、タンパク質
が雄避妊薬として標準的に投与される場合の投与量レベ
ルは体重1kg当り約0.1〜約1mgの範囲である。

インヒビンの精製法は主としてPFFからの単離によって
説明したが、インヒビンはその他の粗エキスからも同様
に精製され得る。“粗エキス”という語は本明細書中で
は卵胞液に加えてその他の哺乳動物体材料の抽出物を意
味し、また哺乳動物インヒビンタンパク質の製造のため
に当業界の技術水準にある方法によって形質転換された
原核生物（例えば大腸菌）および真核生物〔例えばサッ
カロミセス・セレビシエ（S.cerevisiae）〕等の実験室
微生物を含む生物体の抽出物も意味する。

本発明はその好ましい態様について説明され、それは本
発明の発明者にとっての現時点における最良の態様を示
すが、請求の範囲に記載の発明の範囲を逸脱することな
く当業者に自明な各種変更や修飾がなされうることが理
解されるべきである。

本発明の特定の面を以下の請求の範囲に強調する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者エシュ，フレッド・スティーヴンアメリカ合衆国カリフォルニア州92507, オーシャンサイド，ファイアー・マウンティン・ドライブ 2929，ナンバー 63 (72)発明者ギルミン，ロジャー・チャールズ・ルイスアメリカ合衆国カリフォルニア州92037, ラ・ホ−ラ，エンセリア・ドライブ 7316 (56)参考文献Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ＆ＢｉｏｐｈｙｈｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ（1985−６− 14）Ｖｏｌ．129，Ｎｏ．２，Ｐ．396− 403

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】総タンパク質の約90重量％の純度を有する
32,000ダルトンのタンパク質ダイマーであって、pKaが
約4.8であり、分子量約18,000ダルトンの第１ポリペプ
チド鎖および分子量約14,000ダルトンの第２ポリペプチ
ド鎖からなり、該第１鎖および第２鎖はジスルフィド結
合によって互いに結合して生物学的に活性なダイマータ
ンパク質を形成しており、該生物学的に活性なダイマー
タンパク質は、卵胞刺激ホルモン（FSH）の基礎分泌を
特異的に抑制するが黄体形成ホルモン（LH）の基礎分泌
を抑制せず、該18,000ダルトンのポリペプチドは以下の
配列： H-Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-
Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Al
a-Val-His-Ala-Asp-Cys-His-Arg-Ala-Ser-Leu-Asn-Ile-
Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Asp-Arg-Trp-Ile-Val-Hi
s-Pro-Pro-Ser-Phe-Ile-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gly-Gly-
Cys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Ser-Va
l-Pro-Gly-Ala-Pro-Pro-Thr-Pro-Val-Gln-Pro-Leu-Leu-
Leu-Val-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala-Leu-Pr
o-Gly-Thr-Met-Arg-Ser-Leu-Arg-Val-Arg-Thr-Thr-Ser-
Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-Pro-As
n-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH を有し、該ポリペプチドは任意にグリコシル化されてい
てもよく、かつ、該14,000ダルトンのポリペプチドは以
下の配列； H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-Cys-Cys-
Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Tr
p-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr-His-Ala-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Glu-Cys-Pro-Ser-His-Ile-Ala-Gl
y-Thr-Ser-Gly-Ser-Ser-Leu-Ser-Phe-His-Ser-Thr-Val-
Ile-Asn-His-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-His-Ser-Pro-Phe-Al
a-Asn-Leu-Lys-Ser-Cys-Cys-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Arg-
Pro-Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Il
e-Ile-Lys-Lys-Asp-Ile-Gln-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-
Cys-Gly-Cys-Ser-OH; または、以下の配列： H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leu-Cys-Cys-
Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu-Ile-Gly-Tr
p-Ser-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Thr-Gly-Tyr-Tyr-Gly-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Gl
y-Val-Pro-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Phe-His-Thr-Ala-Val-
Val-Asn-Gln-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-Leu-Asn-Pro-Gly-Th
r-Val-Asn-Ser-Cys-Cys-Ile-Pro-Thr-Lys-Leu-Ser-Thr-
Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Phe-Asp-Asp-Glu-Tyr-Asn-Ile-Va
l-Lys-Arg-Asp-Val-Pro-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-
Gly-Cys-Ala-OH を有することを特徴とするタンパク質ダイマー。
【請求項２】タンパク質が粗抽出物材料からヘパリン分
子への吸着により部分的に精製されたものである、請求
の範囲第１項の分子量32,000ダルトンのタンパク質ダイ
マー。
【請求項３】FSHの分泌に影響を与えるが、LHの分泌に
は影響を与えない、生物学的に活性なダイマーの製造に
有用なポリペプチドまたはそのフラグメントであって、
以下のポリペプチド（ａ）、（ｂ）および（ｃ）：（ａ） H-Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-
Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Al
a-Val-His-Ala-Asp-Cys-His-Arg-Ala-Ser-Leu-Asn-Ile-
Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Asp-Arg-Trp-Ile-Val-Hi
s-Pro-Pro-Ser-Phe-Ile-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gly-Gly-
Cys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Ser-Va
l-Pro-Gly-Ala-Pro-Pro-Thr-Pro-Val-Gln-Pro-Leu-Leu-
Leu-Val-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala-Leu-Pr
o-Gly-Thr-Met-Arg-Ser-Leu-Arg-Val-Arg-Thr-Thr-Ser-
Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-Pro-As
n-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH; （ｂ） H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-Cys-Cys-
Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Tr
p-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr-His-Ala-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Glu-Cys-Pro-Ser-His-Ile-Ala-Gl
y-Thr-Ser-Gly-Ser-Ser-Leu-Ser-Phe-His-Ser-Thr-Val-
Ile-Asn-His-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-His-Ser-Pro-Phe-Al
a-Asn-Leu-Lys-Ser-Cys-Cys-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Arg-
Pro-Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Il
e-Ile-Lys-Lys-Asp-Ile-Gln-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-
Cys-Gly-Cys-Ser-OH; （ｃ） H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leu-Cys-Cys-
Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu-Ile-Gly-Tr
p-Ser-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Thr-Gly-Tyr-Tyr-Gly-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Gl
y-Val-Pro-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Phe-His-Thr-Ala-Val-
Val-Asn-Gln-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-Leu-Asn-Pro-Gly-Th
r-Val-Asn-Ser-Cys-Cys-Ile-Pro-Thr-Lys-Leu-Ser-Thr-
Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Phe-Asp-Asp-Glu-Tyr-Asn-Ile-Va
l-Lys-Arg-Asp-Val-Pro-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-
Gly-Cys-Ala-OH; ならびにこれらのフラグメントからなる群より選択され
るポリペプチドまたはそのフラグメント。
【請求項４】哺乳類において不妊症を誘導するための組
成物であって、生理学的に許容される担体中に、有効量
の、総タンパク質の約90重量％の純度を有する32,000ダ
ルトンの哺乳類インヒビンタンパク質ダイマーを含み、
該タンパク質ダイマーは、pKaが約4.8であり、分子量約
18,000ダルトンの第１ポリペプチド鎖および分子量約1
4,000ダルトンの第２ポリペプチド鎖からなり、該第１
鎖および第２鎖はジスルフィド結合によって互いに結合
して生物学的に活性なダイマータンパク質を形成してお
り、該生物学的に活性なダイマータンパク質は、卵胞刺
激ホルモン（FSH）の基礎分泌を特異的に抑制するが黄
体形成ホルモン（LH）の基礎分泌を抑制せず、該18,000
ダルトンのポリペプチドは以下の配列： H-Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-
Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Al
a-Val-His-Ala-Asp-Cys-His-Arg-Ala-Ser-Leu-Asn-Ile-
Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Asp-Arg-Trp-Ile-Val-Hi
s-Pro-Pro-Ser-Phe-Ile-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gly-Gly-
Cys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Ser-Va
l-Pro-Gly-Ala-Pro-Pro-Thr-Pro-Val-Gln-Pro-Leu-Leu-
Leu-Val-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala-Leu-Pr
o-Gly-Thr-Met-Arg-Ser-Leu-Arg-Val-Arg-Thr-Thr-Ser-
Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-Pro-As
n-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH を有し、該ポリペプチドは任意にグリコシル化されてい
てもよく、かつ、該14,000ダルトンのポリペプチドは以
下の配列： H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-Cys-Cys-
Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Tr
p-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr-His-Ala-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Glu-Cys-Pro-Ser-His-Ile-Ala-Gl
y-Thr-Ser-Gly-Ser-Ser-Leu-Ser-Phe-His-Ser-Thr-Val-
Ile-Asn-His-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-His-Ser-Pro-Phe-Al
a-Asn-Leu-Lys-Ser-Cys-Cys-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Arg-
Pro-Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Il
e-Ile-Lys-Lys-Asp-Ile-Gln-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-
Cys-Gly-Cys-Ser-OH; または、以下の配列： H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leu-Cys-Cys-
Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu-Ile-Gly-Tr
p-Ser-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Thr-Gly-Tyr-Tyr-Gly-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Gl
y-Val-Pro-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Phe-His-Thr-Ala-Val-
Val-Asn-Gln-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-Leu-Asn-Pro-Gly-Th
r-Val-Asn-Ser-Cys-Cys-Ile-Pro-Thr-Lys-Leu-Ser-Thr-
Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Phe-Asp-Asp-Glu-Tyr-Asn-Ile-Va
l-Lys-Arg-Asp-Val-Pro-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-
Gly-Cys-Ala-OH を有することを特徴とする組成物。
【請求項５】タンパク質が粗抽出物材料からヘパリン分
子への吸着により部分的に精製されたものである、請求
の範囲第４項に記載の組成物。
【請求項６】ヒト以外の哺乳類において不妊症を誘導す
る方法であって、有効量の、総タンパク質の約90重量％
の純度を有する32,000ダルトンの哺乳類インヒビンタン
パク質ダイマーを投与することを含み、該タンパク質ダ
イマーは、pKaが約4.8であり、分子量約18,000ダルトン
の第１ポリペプチド鎖および分子量約14,000ダルトンの
第２ポリペプチド鎖からなり、該第１鎖および第２鎖は
ジスルフィド結合によって互いに結合して生物学的に活
性なダイマータンパク質を形成しており、該生物学的に
活性なダイマータンパク質は、卵胞刺激ホルモン（FS
H）の基礎分泌を特異的に抑制するが黄体形成ホルモン
（LH）の基礎分泌を抑制せず、該18,000ダルトンのポリ
ペプチドは以下の配列： H-Ser-Thr-Ala-Pro-Leu-Pro-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ala-
Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Al
a-Val-His-Ala-Asp-Cys-His-Arg-Ala-Ser-Leu-Asn-Ile-
Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Asp-Arg-Trp-Ile-Val-Hi
s-Pro-Pro-Ser-Phe-Ile-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gly-Gly-
Cys-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Pro-Asn-Leu-Pro-Leu-Ser-Va
l-Pro-Gly-Ala-Pro-Pro-Thr-Pro-Val-Gln-Pro-Leu-Leu-
Leu-Val-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala-Leu-Pr
o-Gly-Thr-Met-Arg-Ser-Leu-Arg-Val-Arg-Thr-Thr-Ser-
Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-Pro-As
n-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH を有し、該ポリペプチドは任意にグリコシル化されてい
てもよく、かつ、該14,000ダルトンのポリペプチドは以
下の配列： H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Lys-Val-Asn-Ile-Cys-Cys-
Lys-Lys-Gln-Phe-Phe-Val-Ser-Phe-Lys-Asp-Ile-Gly-Tr
p-Asn-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Ser-Gly-Tyr-His-Ala-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Glu-Cys-Pro-Ser-His-Ile-Ala-Gl
y-Thr-Ser-Gly-Ser-Ser-Leu-Ser-Phe-His-Ser-Thr-Val-
Ile-Asn-His-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-His-Ser-Pro-Phe-Al
a-Asn-Leu-Lys-Ser-Cys-Cys-Val-Pro-Thr-Lys-Leu-Arg-
Pro-Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Tyr-Asp-Asp-Gly-Gln-Asn-Il
e-Ile-Lys-Lys-Asp-Ile-Gln-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-
Cys-Gly-Cys-Ser-OH; または、以下の配列： H-Gly-Leu-Glu-Cys-Asp-Gly-Arg-Thr-Asn-Leu-Cys-Cys-
Arg-Gln-Gln-Phe-Phe-Ile-Asp-Phe-Arg-Leu-Ile-Gly-Tr
p-Ser-Asp-Trp-Ile-Ile-Ala-Pro-Thr-Gly-Tyr-Tyr-Gly-
Asn-Tyr-Cys-Glu-Gly-Ser-Cys-Pro-Ala-Tyr-Leu-Ala-Gl
y-Val-Pro-Gly-Ser-Ala-Ser-Ser-Phe-His-Thr-Ala-Val-
Val-Asn-Gln-Tyr-Arg-Met-Arg-Gly-Leu-Asn-Pro-Gly-Th
r-Val-Asn-Ser-Cys-Cys-Ile-Pro-Thr-Lys-Leu-Ser-Thr-
Met-Ser-Met-Leu-Tyr-Phe-Asp-Asp-Glu-Tyr-Asn-Ile-Va
l-Lys-Arg-Asp-Val-Pro-Asn-Met-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-
Gly-Cys-Ala-OH を有することを特徴とする方法。
【請求項７】タンパク質が粗抽出物材料からヘパリン分
子への吸着により部分的に精製されたものである、請求
の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】インヒビン活性を有する実質的に均一なタ
ンパク質を得る方法であって、該タンパク質が粗抽出物
材料からヘパリン分子への吸着により部分的に精製され
ることを特徴とする方法。
【請求項９】インヒビン活性を有する実質的に均一なタ
ンパク質を得る請求の範囲第６項記載の方法であって、インヒビン活性を有する粗抽出物材料を用意し、該抽出
物材料をゲル濾過および少なくとも１つの逆相高性能液
体クロマトグラフィーカラムを用いた逆相高性能液体ク
ロマトグラフィーによる分画を含む一連の精製工程に供
し、該一連の工程が（ａ）インヒビンタンパク質がヘパリン分子に吸着する
条件下に、ヘパリン分子が結合する支持体媒質中に該抽
出物材料をさらす；および（ｂ）次いで該インヒビンタンパク質を該ヘパリン分子
から溶出する；の各工程を含むことを特徴とする方法。