JP2002502611A5

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Publication number: JP2002502611A5
Application number: JP2000530619A
Authority: JP
Filing date: 1999-02-05
Publication date: 2006-03-30

Description

Ｈoogewerf．Ａ. Ｊ.らは、ヒト血小板由来のヘパラナーゼを同定して、その酵素特性を試験した(Ｊ. Ｂiol. Ｃhem. ２７０：３２６８−３２７７，１９９５)。彼らが同定した、ヒト血小板由来のヘパラナーゼのＮ−末端アミノ酸配列は、ＣＸＣケモカイン（Chemokine）・ファミリーの一つである結合組織活性化ペプチド-III（ＣＴＡＰ−III）であり、その作用態様はヘパラン硫酸を２糖類に分解するエンド−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであったことを明かにした。彼らは、その考察の中で、ＣＴＡＰ−IIIの、ヘパラナーゼおよび好中球の化学誘引物質の両方に関する二面的機能に触れて、多くの病因におけるその関与を示唆している。例えば、ケモカインのヘパラナーゼ活性は、炎症を起こした内皮細胞の表面に固定されているケモカインのフォーカル・サイトを分解することによって炎症を下方制御し得る。脈管病理においては、ＣＴＡＰ−IIIによる脈管ヘパラン硫酸の分解がアンチトロンビンIII結合部位を取り除き、血栓形成を促進する。

Ｇilat, Ｄ.らは、ヘパラナーゼが生理学的ｐＨでＴ細胞接着分子として作用することを示した（Ｊ. Ｅxp. Ｍed. １８１：１９２９−１９３４，１９９５）。生理学的ｐＨで、比較的低活性の酵素であるヘパラナーゼはレクチン様のプロ接着分子として作用し、脈管外での休止Ｔ細胞の集積を組織し得る。従って、ヘパラナーゼ介在ＥＣＭ−ＣＤ４＋Ｔ細胞は、特異的に活性化された隣接免疫細胞によって誘発された共シグナルに直ちに反応することができる。

詳細な説明
本発明の一つの観点によれば、ＳＶ−４０でトランスフォームしたヒト線維芽細胞セルラインＡＴＣＣＣＣＬ７５.１から得られるヒトヘパラナーゼの生物活性を示すポリペプチド、またはその機能的誘導体、機能的フラグメントもしくは機能的アナログが提供される。特に、このようなポリペプチドは、ヘパラン硫酸を、特異的に、約６ｋＤから約２０ｋＤのサイズの範囲にある断片に分解することができるエンドグルクロニダーゼである。該ヒトセルラインは、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）から寄託番号７５．１のもとに入手できる、セルラインＷＩ−３８ＶＡ１３サブライン２ＲＡである。それは白人女性の正常胎児（妊娠３ヵ月）肺組織から得た二倍体セルラインであるＷＩ−３８線維芽細胞セルライン（ＡＴＣＣＣＣＬ７５.１）をＳＶ４０ウイルスでトランスフォームした誘導体である。

本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト癌細胞、胎盤、末梢血白血球または肺に由来するｃＤＮＡライブラリーから得られる。特に、個々に記載されているポリヌクレオチドはヒトＳＶ−４０でトランスフォームした線維芽細胞セルラインＡＴＣＣＣＣＬ７５.１由来のｃＤＮＡライブラリーから単離される。ｃＤＮＡインサートは３７２６塩基ペア（ｂｐ）の長さであり、全長５４３アミノ酸のタンパク質をコードするオープン・リーデイング・フレームを含み、その最初の凡そ２４アミノ酸はリーダー配列であり、最初の１５７アミノ酸はプロ配列である。従って、本発明のポリペプチドの成熟型は１５７アミノ酸のプロ配列（凡そ２４アミノ酸のリーダー配列を含む）が開裂された後の３８６アミノ酸からなる。このポリペプチドは、癌細胞のライソソームまたは細胞外周辺に見出される。

哺乳動物発現系は、Ｇluzman, Ｃell, ２３：１７５（１９８１）によって記載されたサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株およびその他の対応するベクターを発現し得るセルライン、例えば、C127、3T3、CHO、HeLa および BHK セルラインを含む。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、組換授受部位、転写終結部位、転写終結配列、および５’フレイキング非転写配列を含む。ＳＶ４０ウイルス・ゲノムから由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、組換およびポリアデニル化部位が、必要な非転写遺伝因子を提供するために用いられ得る。

中期染色体分裂へのｃＤＮＡクローンの蛍光インシテュハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)は、一段階で正確な染色体位置を提供するのに使用できる。この方法は、５００または６００塩基ほど短いｃＤＮＡで使用できる；しかし、２,０００bpより大きいクローンは、単純な検出で十分なシグナル強度を有する独得な染色体位置に結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは、ＥＳＴが由来したクローンの使用を必要とし、長いほど良い。例えば、２,０００bpが良く、４,０００はさらに良く、４,０００以上は恐らく手ごろな時間で良好な結果を得るのに必要ではない。この方法のレビューのために、Ｈuman Ｃhromosomes^* a Ｍanual of Ｂasic Ｔechniques. Ｐergamon Ｐress, Ｎew Ｙork (１９８８)参照。

罹患および非罹患個体の比較は、一般に、ｃＤＮＡ配列に基づいたＰＣＲで分離されるまたは検出可能な染色体から見ることができる欠乏または転座のような染色体における構造的変化の捜査を含む。最後に、数名の個体由来の遺伝子の完全配列決定が変異の存在の確認および多形性からの変異の区別に必要である。

一本鎖抗体の製造を記載する方法(例えば、米国特許第４,９６４,７７８号)を、本発明の免疫原ポリペプチドに対する一本鎖抗体の産生に適合できる。
本発明のポリペプチドに特異的な抗体を更に使用して、ポリペプチドに結合することによりポリペプチドの生理作用を阻害するのに使用し得る。この方法において、抗体は、例えば、このようなポリペプチドのｍＲＮＡおよびポリペプチドそれ自体がＳＶ−４０トランスフォーム転換線維芽細胞で増加するため、癌の処置の治療に使用し得る。

このため、本発明は本発明のポリペプチド、特にその各々の好ましい態様を含むＳＶ−４０形質転換ヒト線維芽セルラインＡＴＣＣＣＣＬ７５.１、またはその機能的誘導体、またはその機能的アナログヒトヘパラナーゼの生理作用を示すポリペプチドの不足または欠乏、または該ペプチドの過剰な活性または過剰発現に由来する疾病の診断法にも関し、該方法はこのような状態を有することが疑われるヒトを含む動物由来の細胞または組織または体液を本発明の抗体と接触させることを含む。

アンタゴニストおよび阻害剤は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組合わせを含むがこれらに限定されない薬学的に許容される担体との組成物として用い得る。本発明のポリペプチドの阻害剤の投与は、好ましくは全身的である。ポリスルホン酸化ナフチルウレアであるスラミンは、マウス黒色腫ヘパラナーゼおよびその浸潤を強く阻害することが示された(Nakajima, M. et al., J. Biol. Chem. 266, p9661-9666, 1991)。２,３−Ｏ脱硫酸ヘパリンはヌードマウスで、ヘパラナーゼ、皮下ヒト膵臓アデノーマの腫瘍生育を阻害し、C57BL/66Nマウスの生存期間を、B16-F10黒色腫実験的肺転移アッセイで延ばした(Lapierre, F., et al., Glycobiology vol. 6, 335-336)。

ＤＮＡの“消化”は、ＤＮＡの特定配列にのみ作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的開裂を意味する。本明細書で使用の種々の制限酵素が商品として利用可能であり、その反応条件、共同因子および他の必要条件は当業者が記載のように使用した。フロー分析目的で、典型的に１マイクログラムのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを約２単位の酵素と、約２０μリットルの緩衝液中で使用する。プラスミド構築のためのＤＮＡフラグメントの単離の目的で、典型的に５から５０マイクログラムのＤＮＡを２０から２５０単位の酵素で、大容量で消化させる。特定の制限酵素のための適当な緩衝液および基質量は、製造者により特記されている。約１時間、３７℃でのインキュベーションを通常使用するが、提供者の指示に従って変化し得る。消化後、反応物を直接ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、所望のフラグメントを単離する。

“オリゴヌクレオチド”は、化学的に合成し得る一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは二本相補的鎖ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。このような合成オリゴヌクレオチドは５'リン酸を有さず、したがってキナーゼの存在下でＡＴＰによるリン酸の添加なしでは他のオリゴヌクレオチドとライゲートしない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていないフラグメントとライゲートする。

“ライゲーション”は二つの二本鎖核酸の間のホスホジエステル結合の形成の過程を意味する。特記しない限り、ライゲーションは０.５マイクログラムのほぼ当モル量のライゲートするＤＮＡフラグメント当たり１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにより既知の緩衝液および条件を使用して達成し得る。特記しない限り、形質転換はＧraham, Ｆ., and Ｖan Ｄer Ｅb. Ａ., Ｖirology, ５２：４５６−４５７（１９７３）の方法に記載のように行う。

実施例
実施例１
本発明のポリペプチドの発現および精製
配列番号１に概説のような本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、最初に、挿入フラグメントを合成するために、５'および３'末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、５'−ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＣＡＡＧ−３'の配列を有し、メチオニン開始コドンから出発するポリペプチドの２０ヌクレオチドに続いてＥcoＲＩ制限酵素部位を含む。３'プライマー配列は５'−ＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣ−３'であり、ＸhoＩ部位に相補的な配列およびポリペプチドコード配列の最後の２１ヌクレオチドを含む。制限酵素部位は、pGastBac1(Ｇibco ＢＲＬ, Ｒockville, ＭＤ, Ｕ．Ｓ．Ａ．）の制限部位に対応する。プラスミドベクターは抗生物質耐性(Ａmpr)、複製の細菌起源(ori)および細菌トランスポゾンＴｎ７を含む。pFastBac1ベクターをＥcoＲＩおよびＸhoＩで消化し、挿入フラグメントをリーディングフレームを維持するベクターにライゲートする。次いで、ライゲーション混合物をE. coli株DH10Bの形質転換に使用する。形質転換体はAmpを含むLBプレートでの生育の能力により選択する。次いで、所望の構築物を含むクローンを、DH10Bacを所望のヘパラナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドベクターでトランスフェクトすることによりＢacmid ＤＮＡに転移させる。ヘパラナーゼ遺伝子含有転移Ｂacmid ＤＮＡを、Ｋａｎ、Ｇｅｎ、Ｔｅｔ、Ｂｌｕｏ−ｇａｌおよびＩＰＴＧ含有ＬＢプレートでのＢｌｕｏ−ｇａｌによるＢｌｕｅ／Ｗｈｉｔｅ選択により選択する。所望の遺伝子を含むＢacmid ＤＮＡを単離し、次いで、CellFECTIN試薬(またＧＩＢＣＯＢＲＬから入手可能)で昆虫セルラインＳｆ９にトランスフェクトする。組換えバキュロウイルスの回収をトランスフェクション３日後に行う。ポリペプチドの発現を昆虫Ｔｎ細胞をヘパラナーゼコード配列含有組換えバキュロウイルスで感染させることにより行う。感染Ｔｎ細胞の培養上清を回収し、ヘパラナーゼを親和性クロマトグラフィーにより精製する。簡単に、上清をヘパリン−セファロースカラムに充填し、次いでヘパラナーゼを０.１５から１.０ＭのＮａＣｌの勾配溶液により溶出する。