DK172843B1 - Rekombinant kolonistimulationsfaktor-1 (CFS-1), DNA-sekvenser, der koder for sådanne polypeptider og modificerede former de - Google Patents

Description

DK 172843 B1 i

Opfindelsen angår brugen af rekombinantteknologi til fremstilling af lymfokiner, der almindeligvis produceres i lav koncentration. Nærmere bestemt angår opfindelsen kloningen og ekspressionen af en DNA-sekvens, der koder 5 for human kolonistimulationsfaktor-1 (CSF-1). Opfindelsen angår således DNA-sekvenser, der koder for sådanne poly-peptider og modificerede former deraf/ kloningsvektorer, ekspressionssystemer og værtsceller samt fremgangsmåder til fremstilling af sådanne polypeptider. Opfindelsen 10 agår endvidere rekombinant CSF-l-proteiner samt anvendelsen af CSF-1 til fremstilling af farmaceutiske sammensætninger samt sådanne sammensætninger.

Evnen hos visse faktorer, som produceres i meget lave 15 koncentrationer i forskellige væv, til at stimulere væksten og udviklingen af benmarvsstamceller til granulocyt-ter og/eller makrofager har været kendt i næsten 15 år. Tilstedeværelsen af sådanne faktorer i sera, urinprøver og vævsekstrakter fra forskellige arter kan påvises ved 20 at anvende in vitro analyser, som måler stimuleringen af kolonidannelse hos benmarvsceller udpladet i et halvfast dyrkningsmedium. Der kendes ingen ή} vivo analyser. Fordi disse faktorer inducerer dannelsen af sådanne kolonier, har faktorerne fået den samlede betegnelse kolonistimula-25 tionsfaktorer.

Det er senere blevet vist, at der er mindst 4 underklasser af human CSF-proteiner, som kan defineres i overensstemmelse med den type celler, der findes i de fremkomne 30 kolonier. Én underklasse, CFS-1, resulterer i kolonier, der hovedsagelig indeholder makrofager. Andre underklasser producerer kolonier, som både indeholder neutrofile granulocytter og makrofager, eller som udelukkende indeholder neutrofile granulocytter eller som indeholder neu-35 trofile og eosinofile granulocytter og makrofager.

2 DK 172843 B1

Der findes musefaktorer, som er analoge til de første tre af ovennævnte CSF'er. Ydermere inducerer en musefaktor, faldet IL-3, kolonier fra musebenmarvsceller, som indeholder alle disse celletyper plus megakaryocytter, eryth-5 rocytter og mastceller i forskellige kombinationer. Disse CSF'er er blevet omtalt i en oversigt af Dexter, T.M. Nature (1984) 309:746 og Vadas, M.A. et al., J.Immunol (1983) 130:793.

10 Den foreliggende opfindelse angår rekombinant produktion af proteiner, som er medlem af den første af disse underklasser, CSF-1. Denne underklasse er blevet yderligere karakteriseret og skildret ved hjælp af specifikke radio-immunassay og radioreceptorassay - f.eks. er antistoffer 15 rejst mod oprenset CSF-1 i stand til specifikt at undertrykke CSF-1 aktivitet uden at påvirke de biologiske aktiviteter af andre underklasser, og macrofagcellelinie J774 indeholder receptorer, som specifikt binder CSF-1.

En beskrivelse af disse analyser blev publiceret af Das, 20 S.K. et al., Dlood (1981) 58:630.

Der er blevet publiceret oprensningsmetoder for forskellige CSF-proteiner, og disse er beskrevet nedenfor.

25 Stanley, E.R. et al., J.Biol.Chem (1977) 252:4305 har omtalt oprensning af et CSF-protein fra L929 museceller til g en specifik aktivitet på ca. 1x10 enheder/mg, som også hovedsagelig stimulerede nacrofagproduktion. Waheed, A. et al. Blood (1982) 60:238 omtaler oprensningen af muse 30 L-celle CSF-1 til tilsyneladende homogenitet under anvendelse af en søjle med kaninantistof og anfører de første 25 aminosyrer af musesekvensen (Ben-Avram, C.M. et al. Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) (1985) 882:4486).

35 Stanley, E.R. et al., J.Biol.Chem (1977) 252:4305-4312 omtaler en oprensningsmetode for CSF-1 fra human urin, og 3 DK 172843 B1

Das, S.K. et al., Blood (1981) 58:630; J.Biol.Chem.

(1982) 257:13679 opnåede en human urin CSF-1 med en spe-cifik aktivitet på 5 x 10 enheder/mg, som kun producerede macrofagkolonier, og skitserede forholdet mellem 5 glycosylering af CSF-l-proteiner fremstillet fra dyrkede muse-L-celler og fra human urin og deres aktiviteter.

Wang, F.F. et al., J.Cell B.iochem (1983) 21:262, isole- g rede human urin CSF-1 til en specifik aktivitet på 10 enheder/mg. Waheed, A. et al. omtalte oprensning af human 10 urin CSF-1 til en specifik aktivitet på 0,7-2,3 x 107 enheder/mg på en søjle med kaninantistof (Exp. Hemat (1984) 12:434).

Wu, M. et al. J.Biol.Chem (1979) 254:6226 omtaler frem- 15 stillingen af et CSF-protein fra dyrkede, humane pancrea-tiske carcinomaceller (MIAPaCa), som resulterede i vækst af musegranulocytiske og macrofagiske kolonier. Det fremkomne protein havde en specifik aktivitet på ca. 7x101 enheder/mg.

20

Delvis oprensede præparationer af forskellige CSF'er er også blevet rapporteret fra human- og muselungecellekon-ditionerede medier (Fojo, S.S. et al., Biochemistry (1978) 1/7:3109; Burgess, A.W. et al., J.Biol.Chem. (1977) 25 252:1998); fra human T-lymfoblastceller (Lusis, A.J. et al., Blood (1981) 57:13; US patent nr. 4.438.032); fra human placentakonditioneret medium til tilsyneladende homogenitet og en specifik aktivitet på 7x10' enheder/mg (Wu, W. et al. Biochemistry (1980) 19:3846) .

30

En væsentlig vanskelighed med at gere CSF-proteiner i almindelighed og navnlig CSF-1 brugbare har været deres manglende tilgængelighed i distinkte og karakteriserbare former i tilstrækkelige mængder til at gøre deres anvend-35 else til terapeutisk brug praktisk eller bare mulig. Den foreliggende opfindelse afhjælper disse mangler ved at 4 DK 172843 B1 tilvejebringe oprenset human CSF-1 i brugbare mængder ved rekombinantteknikker.

Et CSF-protein af en anden underklasser, muse og human 5 GM-CSF er blevet oprenset, og cDNA'erne er blevet klonet.

Gough et al., Nature (1984) 309:763-767 har vist, at dette protein er forskelligt fra andre CSF’er, f.eks.

CSF-1. Muse IL-3 er blevet klonet af Fung, M.C. et al.,

Nature (1984) 307:233. Se også Yokota, T. et al. PNAS

10 (1984) 8_1: 1070-1074; Wong, G.G. et al. Science (1985) 228: 810-81; Lee, F. et al. PNAS (1985) 82:4360-4 364, og

Cantrell, Μ.Λ. et al. PNAS (1985) 82:6250-6254.

Forklaring af opfindelsen 15 I et aspekt angår den foreliggende opfindelse rekombinant CSF-l-protein, inklusiv de biologisk aktive proteiner, som indeholder modifikationer af den primære aminosyre-sekvens af det native proteins monomerer. CSF-l-protein i 20 rekombinerant form kan opnås i store mængder, kan fordelagtigt modificeres ved regulering af den posttranslato-riske modifikation, som udøves af værten, og kan tilsigtet modificeres på genniveau eller proteinniveau for at forøge dets ønskede egenskaber. F.eks. er muteiner med 25 fjernelse af væsentlige dele af den carboxyterminale tre-diedel af polypeptidet således aktive. Tilgængeligheden af CSF-1 i rekombinant form tilvejebringer således både fleksibilitet og visse mængdemæssige fordele, som gør det muligt at anvende proteinet terapeutisk på en måde, som 30 ikke er tilgængelig med hensyn til det native protein. 1 andre aspekter angår opfindelsen en isoleret DNA-se-kvens, som koder for rekombinant CSF-1-monomer, rekom-binante ekspressionssystemer for denne sekvens og vek-35 torer indeholdende disse, rekombinante værtsceller, som er transformeret med disse vektorer, og kulturer, som 5 DK 172843 B1 producerer det rekombinante protein. Opfindelsen angår ydermere fremgangsmåder til fremstilling af det rekombinante protein og materialer, som er væsentlige ved dets fremstilling.

5 I et yderligere aspekt angår opfindelsen anvendelsen af CSF-1 til fremstilling af farmaceutiske sammensætninger, der er anvendelige til farmaceutiske og terapeutiske formål .

10

Ydermere angår opfindelsen sammensætninger, som indeholder CSF-1, og som er brugbare i farmaceutiske og terapeutiske applikationer, samt fremgangsmåder til fremstilling af sådanne sammensætninger.

15

Kort beskrivelse af tegningen

Figur 1 viser de delvise aminosyresekvenser for CSE'-l fra human urin og fra L-929 museceller bestemt ud fra 20 oprensede native proteiner.

Figur 2 viser sekvensen af visse oligomerprober for muse-CSF-1.

Figur 3 viser sekvensen af oligomerprober, som blev anvendt til opnåelse af human genomisk CSF-1.

25 Figur 4 viser den sekventerede del af et 3,9 kb langt Hindlll- fragment, som koder for humane CSF-l-sekvenser og de deducerede aminosyresekvenser for exonområderne.

Figur 5 viser DNA'et og de deducerede aminosyresekvenser for en cDNA-klon, som koder for human CSF-l-monomer.

30 Figur 6 viser en sammenligning af aktiviteterne af CSF-1 og andre kolonistimulerende faktorer ved en forøgelse af en makrofagers evne til at dræbe tumorceller.

Figur 7 viser resultaterne af sucrosegradientfraktioner-ing af MIAPaCa mRNA.

35

Udførelsesformer for opfindelsen 6 DK 172843 B1 A. Definitioner "Kolonistimulationsfaktor-l (CSF-1)" refererer til et protein, som udviser det spektrum af aktivitet, som en 5 fagmand forbinder med CSF-1 - - dvs. at når det tilføres til det af Metcalf, D., J.Cell Physiol (1970) 76:89 be skrevne in vitro kolonistimulerende standardassay resulterer det primært i dannelsen af macrofagkolonier. Nativ CSF-1 er en glycosyleret dimer; dimerisering kan være 10 nødvendig for aktivitet. Både den dimere og den monomere form betragtes som liggende inden for opfindelsens og definitionens rammer. Den monomere form kan omdannes til dimeren ved at tilvejebringe intracellulære betingelser in vitro, og monomeren er i sig selv nyttig som et anti-15 gen til fremstilling af antistoffer mod CSF-1.

Der syntes at være nogen artsspecificitet: Human CSF-1 fungerer både på human- og musebenmarvsceller; muse-CSF-1 viser ikke aktivitet med humane celler. "Human" CSF-1 20 skal derfor være positive i den specifikke museradiore-ceptoranalyse ifølge Das, S.K. et al., Blood (1981) 58:630, skønt der ikke nødvendigvis er en fuldstændig korrelation. Proteinets biologiske aktivitet vil almindeligvis også blive hæmmet af neutraliserende antiserum 25 over for human urin CSF-1 (Das, S.K. et al, se ovenfor).

Under visse specielle omstændigheder (såsom f.eks. hvor en bestemt antistofpræparation genkender en CSF-1 epitop, der ikke er essentiel for biologisk aktivitet, og hvilken epitop ikke er til stede i den bestemte CSF-1-mutein, som 30 testes) bliver dette kriterium imidlertid ikke opfyldt.

Man har senere fundet visse andre egenskaber hos CSF-1, inklusiv dette proteins evne til at stimulere secerneringen af prostaglandiner af E-serien, inter-35 leukin-I og interferon fra modne makrofager (Moore, R. et al., Science (1984) 223: 178). Mekanismen for disse 7 DK 172843 B1 sidstnævnte aktiviteter er ikke forstået på nuværende tidspunkt og med hensyn til den foreliggende definition ligger kriteriet for at opfylde definitionen i evnen til at stimulere dannelsen af monocyt/macrofag-kolonier under 5 anvendelse af benmarvsceller fra de hensigtsmæssige arter som udgangsmaterialer, under de fleste omstændigheder (se ovenfor) hæmning af denne aktivitet med neutraliserende antiserum mod oprenset human urin CSF-1, og hvor det er hensigtsmæssigt for en artstype et positivt respons i ra-10 dioreceptorassayet (det er kendt, at CSF-1's proliferative effekt er begrænset til celler af enkernet, fago-cytisk afstamning (Stanley, E.R. The Lymphokines (1981),

Stewart, W.E., II et al. red. Humana Press, Clifton, NJ) , s.102-132), og at receptorer for CSF-1 er begrænset til 15 disse cellelinier (Byrne, P.V. et al. Cell Biol (1981) 91:848)) .

Som det er tilfældet for alle proteiner afhænger den præcise kemiske struktur af et antal faktorer. Eftersom 20 der i molekylet er ioniserbare amino- og carboxylgrupper kan et bestemt protein opnås som et surt eller basisk salt eller i neutral form. Alle sådanne præparationer, som bevarer deres aktivitet, når de anbringes i egnede miljømæssige omgivelser, er inkluderet i definitionen.

25 Ydermere kan den primære aminosyresekvens forøges ved derivatisering under anvendelse af sukkerenheder (glycosylering) eller ved hjælp af andre supplerende molekyler, såsom lipider, phosphat, acetylgrupper og lignende, navnlig ved konjugation med saccharider. Den 30 primære aminosyrestruktur kan også aggregere til dannelse af komplekser, mest hyppigt dimerer. Faktisk er nativ human urin CSF-1 rapporteret isoleret som en meget glyco-syleret dimer på 45 kd. Visse aspekter af en sådan forøgelse udføres ved hjælp af producentværtens post-35 translatoriske modifikationssystemer; andre sådanne modifikationer kan indføres in vitro. I alle tilfælde er 8 DK 172843 B1 sådanne modifikationer inkluderet i definitionen, så længe proteinets aktivitet, som defineret ovenfor, ikke ødelægges. Det forventes selvfølgelig, at sådanne modifikationer kvantitativt eller kvalitativt kan påvirke ak-5 tiviteten enten ved at forøge eller ved at formindske proteinets aktivitet i forskellige analyser.

Ydermere kan individuelle aminosyrerester i kæden modificeres ved oxidation, reduktion eller anden derivatiser-10 ing, og proteinet kan spaltes til opnåelse af fragmenter, som bevarer aktivitet. Sådanne ændringer, som ikke ødelægger aktiviteten, bevirker ikke, at proteinsekvensen falder uden for definitionen.

15 Der kan foretages modifikationer af den primære struktur i sig selv ved fjernelse, tilføjelse eller ændringer af aminosyrer inkorporeret i sekvensen under translation uden at ødelægge proteinets aktivitet. Sådanne substitutioner eller andre ændringer resulterer i proteiner med 20 en amtnosyresekvens, som falder inden for definitionen af proteiner "med en aminosyresekvens, der stort set er ækvivalent til sekvensen for CSF-1". Faktisk har CSF-1 proteiner fra mennesket og mus primære aminosyresekvens-er, som ikke er identiske, men ligner hinanden, og som 25 udviser høj homologi.

Af bekvemmelighedsgrunde betegnes aminosyresekvensen 1-224 vist på figur 5, mCSF-1 (CSF-l-monomeren). Figur 5 viser tilstedeværelsen af en formodet signalsekvens med 30 32 aminosyrerester, som formodentlig spaltes fra ved se cernering fra pattedyrceller; mCSF-1 repræsenteres ved aminosyren 1-224 vist på denne figur. Specielt inkluderet i definitionen af human CSF-1 er muteiner, hvis monomerer og dimerer er mCSF-1 og beslægtede former af mCSF-1, be-35 tegnet ved deres forskelle fra mCSF-1.

9 DK 172843 B1

Af bekvemmelighedsgrunde vil aminosyresekvensen for mCSF-1 blive anvendt som en reference og andre sekvenser, som stort set er ækvivalente med denne med hensyn til CSF-1-aktivitet, vil blive betegnet under henvisning til den på 5 figur 5 viste sekvens. Substitionen af en bestemt aminosyre vil blive angivet ved reference til den aminosyrer-est, som den erstatter. Sergo-mCSF-l refererer f.eks. således til det protein, som har den i figur 5 viste sekvens med undtagelse af, at aminosyren i position 90 er 10 serin i stedet for cystein. Fjernelser (deletioner) angives med et V efterfulgt af tallet for de aminosyrer, der er fjernet fra den N-terminale sekvens eller ved tallet for tilbageblevne aminosyrer, når resterne fjernes fra den C-terminale sekvens, når antallet efterfølges af 15 et minustegn. V^CSF-1 refererer således til CSF-1 på figur 5, hvor de første 4 aminosyrer fra den N-terminale ende er blevet fjernet; Vno- refererer til CSF-1, hvor de sidste 94 aminosyrer efter aminosyre 130 er blevet fjernet. Nedenfor er f.eks. illustreret asp^gCSF-l (som inde-20 holder en asparaginsyrerest kodet af genet (figur 4) i position 59 i stedet for den tyrosinrest, som kodes af cDNA'et, og Vise-CSF-1, som kun omfatter aminosyrerne 1-158 i mCSF-1.

25 "Forbundet på funktionsdygtig måde" refererer til en sådan sammenstilling, at den normale funktion af komponenterne kan udføres. En kodende sekvens, der er "forbundet på funktionsdygtig måde" med styringssekvenser refererer til en konfiguration, hvor den kodende sekvens 30 kan udtrykkes under styring af disse sekvenser.

"Styringssekvens" refererer til DNA-sekvenser, som er nødvendige for ekspressionen af en på en funktionsdygtig måde forbundet kodesekvens i en bestemt værtsorganisme.

35 De styringssekvenser, som er egnede for prokaryoter, inkluderer f.eks. en promoter, eventuelt en operator- 10 DK 172843 B1 sekvens, et ribosombindingssted og muligvis andre endnu dårligt forståede sekvenser. Det er kendt, at eukaryo-tiske celler anvender promotorer, polyadenyleringssig-naler og enhancersekvenser.

5 "Ekspressionssystem" refererer til DNA-sekvenser, som indeholder en ønsket kodesekvens og styresekvenser forbundet på funktionsdygtig måde, således at værter, som er transformeret med disse sekvenser, er i stand til at pro-10 ducere de kodede proteiner. For at effektuere transformationen kan ekspressionssystemet være indført i en vektor; det relevante DNA kan imidlertid også være integreret i værtskromosomet.

15 Udtrykket "celle", "cellelinie" og "cellekultur” anvendes her ensbetydende og alle sådanne betegnelser inkluderer afkom heraf. "Transformenter" eller "transformerede celler" inkluderer således den primære cellekultur og kulturer hidrørende herfra uden hensyntagen til antallet af 20 overførsler. Det skal også forstås, at alt afkom ikke nødvendigvis er præcis identisk i DNA-indhold på grund af tilsigtede eller utilsigtede mutationer. Mutantafkom, som har den samme funktionalitet, som der screenes for i den oprindelige, transformerede celle, er inkluderet. Det vil 25 klart fremgå af sammenhængen, hvor distinkte betegnelser er tilsigtet.

B Generel beskrivelse CSF-1 proteinerne ifølge opfindelsen er i stand til både 30 at stimulere monocyt-precurser/macrofagcelleproduktion ud fra benmarvsstamceller, hvorved immunsystemets effektivitet forøges, og at stimulere sådanne funktioner hos disse differentierede celler, som secernering af lymfokiner i modne makrofager.

35 11 DK 172843 B1 I én anvendelsesform er disse proteiner nyttige som hjælpemidler til kemoterapi. Det er velkendt, at kemoterapeutisk behandling resulterer i undertrykkelse af immunsystemet. Det sker ofte, at skønt kemoterapeutisk 5 behandling med held ødelægger de tumorceller, mod hvilke de er rettet, resulterer behandlingerne i patientens død på grund af bivirkninger fra de kemotoxiske midler på cellerne i immunsystemet. Indgivelse af CSF-1 til sådanne patienter medfører på grund af CSF-1's evne til at 10 mediere og forøge væksten og differentieringen af benmarvsafledte forstadier til makrofager og monocytter og til at stimulere funktionen af modne makrofager og monocytter i en restimulering af immunsystemet til fore byggelse af denne bivirkning, og forhindrer således pa-15 tientens tilbøjelighed til at bukke under for sekundær infektion. Andre patienter, som vil blive hjulpet af en sådan behandling inkluderer de patienter, som behandles for leukæmi ved hjælp af benmarvstransplantationer; de er ofte i en immunundertrykt tilstand for at forhindre af-20 stødelse. For disse patienter kan immunundertrykkelsen også vendes ved indgivelse af CSF-1.

I almindelighed kan en hvilken som helst patient, som er udsat for immunundertrykkelse, hvad enten det skyldes 25 kemoterapi, benmarvstransplantation eller andre tilfældige former af immunundertrykkelse, såsom sygdom (f.eks. erhvervet immundefektsyndrom) drage fordel af tilgængeligheden af CSF-1 til farmakologisk brug. Ydermere kan patienter tilføres forøgede mængder af tidligere 30 differentierede makrofager til at supplere makrofagerne fra det medfødte system, hvor de tilførende makrofager produceres ved in vitro dyrkning af benmarvsceller eller andre egnede præparater behandlet med CSF-1. Disse præparater inkluderer præparater fra patientens egne 35 blodmonocytter, som kan dyrkes således og returneres til lokal eller systemisk behandling.

12 DK 172843 B1 CSF-l's evne til at stimulere makrofagers produktion af lymfokiner og til at forøge deres evne til at dræbe målceller gør også CSF-1 direkte anvendelig til behandling 5 af svulster og infektioner.

CSF-1 stimulerer museafledte makrofagers produktion af interferoner (Fleit, H.B. et al., J.Cell Physiol (1981) 108:347, og human, delvis oprensede CSF-1 fra MIAPaCa-10 celler stimulerer den poly-IC-inducerede produktion af interferon og TNF fra humane monocytter, som illustreret ovenfor. Ydermere stimulerer CSF-1 humane blodmonocytters produktion af myeloid CSF-1.

15 Nedenfor illustreres også evnen hos muse-CSF-l (fra L-celle konditioneret medium) til at stimulere normale C3H/HeN peritoneale makrofager fra mus til at dræbe musesarcoma TU5-målceller. Denne aktivitet er mest effektiv, når CSF-1 anvendes som forbehandling og under effek-20 torfasen. CSF-l's evne til at gøre dette er meget større end den, der udvises af andre kolonistimulationsfaktorer, som vist på figur 6 herefter. Ydermere forøger CSF-1 musecellers evne til at angribe vira.

25 Det bliver modstridende rapporteret, at muse CSF-1 stimulerer musemakrofager til at være cytostatiske over for P815 tumor celler (Wing, E.J. et al., J.Clin Invest (1982) 69:270), eller til ikke at dræbe andre leukæmimålceller (Ralph, P. et al., Cell Immunol (1983) 76:10) .

30 Nogawa, R.T. et al., Cell Immunol (1980) rapporterer, at CSF-1 kan stimulere makrofager til at indtage og dræbe gær.

CSF-1 kan således ud over at overvinde immunundertryk-35 kelse i sig selv anvendes til at ødelægge invaderende or- 13 DK 172843 B1 ganismer eller maligne celler indirekte ved at stimulere macrofagsecerneringer og aktivitet.

CSF-l ifølge opfindelsen kan formuleres på traditionelle 5 måder, som det er almindeligt at anvende inden for området til indgivelse af proteinsubstanser. Indgivelse ved injektion foretrækkes; formuleringer inkluderende opløsninger er suspensioner, emulsioner eller en fast sammensætning til genopløsning til injicerbare præparater.

10 Egnede excipienter inkluderer f.eks. Ringers opløsning,

Hank's opløsning, vand, salin, glycerol, dextrose-opløsninger og lignende. Ydermere kan CSF-l ifølge opfindelsen præinkuberes med præparationer af celler for at stimulere hensigtsmæssige svar, og enten kan hele 15 præparationen eller supernatanten herfra tilføres patienten. Som vist herefter er de materialer, der produceres som svar på CSF-l stimulation af forskellige typer af blodceller effektive over for de ønskede målceller, og egenskaberne hos selve disse blodceller til at 20 angribe vira eller svulster kan forøges. Patientens egne celler kan udtages og anvendes på denne måde, eller der f.eks. i inkubationen anvendes monocytter eller lymfocytter fra en anden person, som patienten er forligelig med.

25 Skønt man i nogen tid har kendt mønsteret for en aktivitet benævnt CSF-l er det protein, som er ansvarlig, aldrig blevet opnået i hverken tilstrækkelig renhed eller i tilstrækkelig mængde til at muliggøre sekvensbestemmelse eller i tilstrækkelig renhed eller mængde til at udgøre 30 en nyttig terapeutisk funktion. Fordi man hverken har haft et fuldstændigt rent protein i praktiske mængder, eller det DNA, der koder herfor, har det ikke været muligt at optimere modifikationer af strukturen ved at tilvejebringe sådanne ændringer, som de, der angives i 35 punkt A ovenfor, ej heller har det været muligt at anvende dette protein i terapeutisk sammenhæng.

14 DK 172843 B1

Med den foreliggende opfindelse afhjælpes disse mangler.

Gennem en række yderligere oprensningsprocedurer, er der opnået tilstrækkeligt rent CSF-1 fra human urin til at 5 tilvejebringe nogle aminosyresekvenser, hvilket har muliggjort konstruktionen af oligomere DNA-prober.

Proberne er nyttige til at opnå den kodende sekvens for hele proteinet. Ved en nedenfor illustreret fremgangsmåde anvendes prober, der med hensyn til den human N-terminale 10 sekvens er beregnet til at probe det humane genombiblio-tek for at opnå den korrekte kodende sekvensdel. Den humane, klonede gencmsekvens kan udtrykkes direkte under anvendelse af dens egnede styringssekvenser eller i konstruktioner, der er egnede til pattedyrsystemer, som er i 15 stand til at bearbejde intronområder. De genomiske sekvenser anvendes også som prober for et human cDNA-bib-liotek opnået fra en cellelinie, som producerer CSF-1, til opnåelse af cDNA, der koder for dette protein. Når cDNA'et er hensigtsmæssigt fremstillet kan det udtrykkes 20 direkte i COS-celler eller CV-l-celler og kan indbygges i vektorer, der er egnede til ekspression i en lang række værtsceller.

På denne måde kan der således tilvejebringes den fuld-25 stændige, kodende sekvens for human CSF-1, ud fra hvilken ekspressionsvektorer, som kan anvendes til en række værtssystemer, kan konstrueres, og den kodende sekvens udtrykkes. Den række af værter, som er tilgængelige sammen med ekspressionsvektorer, der er egnede for sådanne 30 værter, muliggør et valg mellem posttranslatoriske modifikationssystemer og blandt omgivelsesfaktorer, som giver konformationsregulering af det således producerede protein .

35 C. 1. Kontrolsekvenser og tilsvarende værter 15 DK 172843 B1 I generelle termer involverer produktionen af en rekom-bineret form af CSF-1 typisk følgende: Først opnås en DNA-sekvens, der koder for det modne {her 5 anvendt omfattende alle muteiner) protein, præproteinet, eller en fusion af CSF-1-proteinet med en yderligere sekvens, som ikke ødelægger dets aktivitet, eller med en yderligere sekvens, der kan fraspaltes under styrede betingelser (såsom behandling med peptidase) til frem-10 bringelse af et aktivt protein. Hvis sekvensen ikke er afbrudt af intronområder er det egnet til ekspression i enhver vært. Hvis der er intronområder, kan ekspression opnås i pattedyrsystemer eller andre eukaryotiske systemer, som er i stand til at modificere dem. Denne sekvens 15 skal være i en form, der kan udklippes og genvindes. Den udklippede eller genvundne kodesekvens anbringes derefter på funktionsdygtig måde sammen med egnede styresekvenser i en ekspressionsvektor, der kan replikeres. Vektoren anvendes til at transformere en egnet vært, og den trans-20 formerede vært dyrkes under gunstige betingelser til at effektivere produktionen af det rekombinerede CSF-1. CSF-1 isoleres eventuelt fra mediet eller fra cellerne; indvinding eller oprensning af proteinet er måske ikke nødvendig i nogle tilfælde, hvor nogle forureninger kan to-25 lereres. Fuldstændig renhed er f.eks. ikke nødvendig til in vitro dyrkning af celler, fra hvilke en lymfokinfaktor bliver isoleret til indgivelse i en patient. Men direkte anvendelse til behandling ved indgivelse i en patient vil selvfølgelig kræve oprensning af det fremstillede CSF-1.

30

Ethvert af de foregående trin kan udføres på en række måder. De ønskede kodende sekvenser kan f.eks. opnås ved at fremstille egnet cDNA fra cellulær messenger og manipulere cDNA'et til opnåelse af den fuldstændige 35 sekvens. Alternativt kan der opnås genomiske fragmenter, som anvendes direkte i egnede værter. Konstruktionerne af 16 DK 172843 B1 ekspressionsvektorer, som kan fungere i en række værter, fremstilles under anvendelse af egnede replikon'er og styringssekvenser, som anført nedenfor. Egnede restriktionssteder kan, hvis de ikke normalt er tilgængelige, 5 tilføjes til enderne af den kodende sekvens for at tilvejebringe et gen, som kan skæres ud, til indsættelse i disse vektorer.

Styringssekvenserne, ekspressionsvektorerne og transfor-10 mationsmetoderne afhænger af den type værtscelle, der anvendes til at udtrykke genet. Alment er prokaryote celler, gær eller pattedyrceller på nuværende tidspunkt brugbare som værter. Eftersom nativ CSF-1 secerneres som en glycosyleret dimer, foretrækkes værtssystemer, som er 15 i stand til at foretage den rigtige posttranslatoriske modifikation. Skønt prokaryote værtsceller almindeligvis er de mest effektive og bekvemme til produktion af rekom-binerede proteiner foretrækkes følgelig eukaryote celler, navnlig pattedyrceller, på grund af deres modifikations-20 evne. Rekombineret CSF-1 produceret af bakterier ville nødvendiggøre in vitro dimerisering. Ydermere er der større sikkerhed for, at den native signalsekvens vil blive genkendt af pattedyrværtscellerne, hvilket gør secernering mulig og dermed letter oprensningen.

25 C.1. Kontrolsekvenser og tilsvarende værter Prokaryoter repræsenteres hyppigst ved hjælp af forskellige stammer af E. coli. Der kan imidlertid også anvendes andre mikrobielle stammer, såsom bacilli, f.eks. Bacillus 30 subtilis, forskellige arter af Pseudomonas eller andre bakteriestammer. I sådanne prokaryotiske systemer anvendes plasmidvektorer, som indeholder replikationssteder og kontrolsekvenser hidrørende fra en art, som er forenelig med værten. F.eks. transformeres E. coli typisk 35 under anvendelse af derivater af pBR322, et plasmid afledt af en E. coli art af Bolivar et al., Gene (1977) 17 DK 172843 B1 2^:95. pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetra-cyklinresistens og tilvejebringer således yderligere markører, som enten kan bevares eller ødelægge konstruktionen af den ønskede vektor. Almindelig anvendte pro-5 karyotiske styringssekvenser, som her defineres til inkluderende promotorer til transkriptionsinitiering, evt. med en operator, sammen med sekvenser for ribosombindingssted, inkluderer sådanne almindeligt anvendte promotorer som β-lactamasepromotersystemet (penicilli-10 nase) og lactosepromotersystemet (lac) (Chang et al.,

Nature (1977) 198:1056 samt tryptophanpromotersystemet (trp) (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) f^:4057 og den lambda-afledte P^-promoter og N-genribosombin-dingsstedet (Shimatake et al., Nature (1981) 292:128), 15 som er blevet gjort anvendelig som en flytbar styringskassette, som fremført i beskrivelsen til US-patentan-søgning nr. 685.312, nu US-patent nr. 4 711 845 udstedt 8. december 1987, og som er en CIP af US-patentansøgning nr. 646.693, der nu er henlagt, og som var en CIP af den 20 henlagte ansøgning nr. 578.133, indleveret 8. februar 1984, og overdraget til samme assignatar. Der kan imidlertid anvendes et hvilket som helst tilgængeligt promo-tersystem, som er kompatibelt med prokaryoter.

25 Ud over bakterier kan der som værter anvendes eukary- otiske mikrober, såsom gær. Laboratoriestammer af Sac-charomyces cerevisiae, bagegær, anvendes mest, skønt en række andre stammer er almindeligt tilgængelige. Skønt der illustreres vektorer, som anvender ”2-mikron replika-30 tionsorigin", Broach, J. R., Meth Enz (1983) 101:307 kendes andre plasmidvektorer, som er egnede til gærekspression (se f.eks. Stinchcomb et al., Nature (1979) 282:39, Tschempe et al., Gene (1980) Π):157 og Clarke, L. et al, Meth. Enz. (1983) 101:300). Styringssekvenser for 35 gærvektorer inkluderer promotorer for syntesen af glyco-lytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. (1968) 18 DK 172843 B1 7:149; Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900).

Yderligere kendte promotorer inkluderer promotoren for 3-phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al, J. Biol. Chem.

(1980) 255:2073), og promotorer for andre glycolytiske 5 enzymer, såsom glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphatisomerase, 3-phosphoglyceratmutase, py-rovatkinase, triosephosphatisomerase, prophoglucose- isomerase og glucokinase. Andre promotorer, som har den 10 yderligere fordel, at transkriptionen styres af vækstbetingelser, er promoterområderne for alkoholdehydrogenase 2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme og enzymer, som er ansvarlige for udnyttelse af maltose og galactose (Holland, 15 samme steds). Det antages også, at termineringssekvenser er ønskelige i 3'-enden af de kodende sekvenser. Sådanne termineringssekvenser findes i det ikke-translaterede 3'-område efter de kodende sekvenser i gærafledte gener.

Mange af de illustrerede vektorer indeholder styrings-20 sekvenser hidrørende fra enolasegenet indeholdende plasmid peno46 (Holland, M.J. et al., J. Biol. Chem. (1981) 256:1385) eller LEU2-genet opnået fra YEpl3 (Broach, J. et al., Gene (1978) £:121), men enhver vektor, som indeholder en gærkompatibel promoter, replikationsorigin og 25 andre styringssekvenser, er egnede.

Det er naturligvis også muligt at udtrykke gener, der koder for polypeptider, i eukaryotiske værtscellekulturer hidrørende fra multicellulære organismer. Se f.eks. Tis-30 sue Culture. Nyttige værtscellelinier inkluderer musemye-lomaer N51, VERO og HeLa-celler og kinesiske hamsterova-rieceller (CHO-celler) . Ekspressionsvektorer for sådanne celler inkluderer almindeligvis promotorer og styringssekvenser, som er kompatible med pattedyrceller, såsom 35 f.eks. de almindeligt anvendte tidlige og sene promotorer fra simianvirus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature (1978) 19 DK 172843 B1 273:113) eller andre virale promotorer, såsom de, der hidrører fra polyoma, adenovirus 2, bovinpapillomavirus eller fuglesarcomavira eller immunoglobulinpromotorer og varmechokpromotorer. Generelle aspekter for pattedyr-5 celleværtssystemtransformationer er blevet beskrevet af

Axel: US patent nr. 4.399.216. Det viser sig nu, at også "enhancer"-områder er vigtige til optimering af ekspression; disse er almindeligvis sekvenser, der findes opstrøms promoterområdet. Replikationsorigin kan om nød-10 vendigt opnås fra virale kilder. Integration i kromosomet er imidlertid en almindelig mekanisme for DNA-replikation i eukaryoter. Planteceller er nu også tilgængelige som værter, og der findes styringssekvenser, som er kompatible med planteceller, såsom nopalinsyntetasepromoter-15 sekvensen og polyadenyleringssignalsekvenser (Depicker, Λ. et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1:561).

C. 2 . Transformationer

Afhængig af den anvendte værtscelle udføres transformation ved hjælp af standardmetoder, der er egnede til 20 sådanne celler. Calciumbehandlingen, som udnytter calci-umchlorid, og er beskrevet af Cohen, S.N.,

Proc. Natl.Acad.Sci. (USA) (1972) 69:2110 anvendes til prokaryote eller andre celler, som indeholder væsentlige cellevægbarrierer. Infektionen med Agrobacterium tumefa-25 ciens (Shaw, C.H. et al., Gene (1983) 23:315) anvendes for visse planteceller. For pattedyrceller uden sådanne cellevægge foretrækkes calciumphosphatpræcipitationsme-toden af Graham og van der Eb, Virology (1978) 52:546.

Transformationer i gær udføres ifølge metoden af Van So-30 lingen, P. et al, J.Bact. (1977) 130:946 og Hsiao, C.L., et al., Proc.Natl.Acad. Sci. (USA) (1979) 76:3829.

C. 3. Probering af mRNA ved hjælp af Northern-blot-ana-lyse; probe af cDNA eller genomiske biblioteker 35 RNA fraktioneres til Northern-blot-analyse ved agarose- slabgelelektroforese under fuldt denaturerende betingel- 20 DK 172843 B1 ser med formaldehyd (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning (1982) Cold Spring Harbor Press, s.202-203) eller 10 mM methylmercuri (CH^HgOH) (Bailey, J.M. et al.,

Anal. Biochem. (1976) 7^:75-85, og Sehgal, P.B. et al., 5 Nature (1980) 288:95-97) som denatureringsmiddel. For methylmercurigeler fremstilles 1,5% geler ved at smelte agarose i elektroforesebufferen (running buffer) (100 mM borsyre, 6 mM natriumborat, 10 mM natriumsulfat, 1 mM EDTA, pH 8,2), afkøle den til 60°C og tilsætte 1/100 10 volumen af 1M CH^HgOH. RNA'et opløses i 0,5 x elektroforesebuf fer og denatureres ved inkubering i 10 mM methylmercuri ved 10 minutter ved stuetemperatur. Der tilsættes glycerol (20%) og bromphenolblåt (0,05") til påsætning af prøverne. Prøverne underkastes elektroforese i 15 500-600 voltÆLimer med recirkulering af bufferen. Efter elektroforese vaskes gelen i 40 minutter i 10 mM 2-mer-captoethanol for at afgifte methylmercurien, og der udføres Northern-blot-analyse ved at overføre RNA'et fra gelen til et membranfilter.

20

Et cDNA-bibliotek eller et genomisk bibliotek screenes under anvendelse af koloni- eller plaquehybridiseringsme-toden. Bakteriekolonier eller plaque for fager løftes over på dobbelte nitrocellulosefilterpapirer (S & S type 25 BA-85). Plaque'ene eller kolonierne analyseres, og DNA'et fikseres til filteret ved sekventiel behandling i 5 minutter med 500 mM NaOH, 1,5 M NaCl. Filtrene vaskes 2 gange i 5 minutter hver gang med 5 x standardsalincitrat (SSC) og lufttørres og bages ved 80°C i 2 timer.

30

Gelerne til Northern-blot-analyse eller de dobbelte filtre til c DNA eller genomisk screening hybridiseres ved 25-42°C i 6-8 timer med 10 ml pr. filter af DNA-hybridi-seringsbuffer uden probe (0-50% formamid, 5-6 x SSC, pH 35 7,0, 5x Denhardt’s opløsning (polyvinylpyrrolidin plus

Ficoll og bovinserumalbumin; 1 x = 0,02* af hver), 20-50 21 DK 172843 B1 mM natriumphosphatbuffer ved pH 7,0, 0,2¾ SDS, 20 pg/ml poly-U (når cDNA proberes) og 50 ng/ml denatureres lak-sesperm-DNA. Prøverne blev derefter hybridiseret ved inkubering ved den egnede temperatur i ca. 24 til 36 5 timer under anvendelse af hybridiseringsbuffer indeholdende kinasebehandlet probe (for oligomerer). Længere cDNA-fragmentprober eller genomiske fragmentprober blev mærket ved nick-translation eller primerforlængelse.

10 Betingelserne for både præhybridisering og hybridisering afhænger af den ønskede stringenthed og varierer f.eks. med probelængde. Typiske betingelser for forholdsvis lange prober (f.eks. mere end 30-50 nukleotider) anvender en temperatur på 42-55°C og hybridiseringsbuffer inde-15 holdende ca. 20-50?· formamid. For lavere stringentheder, som bruges ved oligomerprober på ca. 15 nukleotider, anvendes lavere temperaturer på ca. 25-42°C og lavere formamidkoncentrationer (0-20%) . E'or længere prober kan filtrene vaskes, f.eks. 4 gange i 30 minutter, hver gang 20 ved 40-55°C med 2 x SSC, 0,2% SDS og 50 mM natriumphosphatbuf fer ved pH 7, derefter vaskes 2 gange med 0,2 x SSC og 0,2% SDS, lufttørres og autoradiograferes ved -70°C i 2 til 3 dage. Vaskebetingelserne er noget mindre barske for kortere prober.

25 C.4 Vektorkonstruktion

Konstruktion af egnede vektorer indeholdende de ønskede kode- og styringssekvenser anvender standardmetoder til ligering og behandling med restriktionsenzymer, hvilket 30 er velkendt inden for faget. Isolerede plasmider, DNA-sekvenser eller syntetiserede oligonukleotider spaltes, forsynes med en hale og genligeres i den ønskede form.

Stedspecifikt DNA-spaltning udføres ved at behandle med 35 det egnede restriktionsenzym (eller -enzymer) under betingelser, som er alment forstået inden for området, og 22 DK 172843 B1 for hvilke detaljerede oplysninger er specificeret af producenten af disse kommercielt tilgængelige restriktionsenzymer. Se f.eks. New England Biolabs, Product Catalog. Alment spaltes omkring 1 pg plasmid eller DNA-5 sekvens med 1 enzymenhed i ca. 20 μΐ bufferopløsning; i eksemplerne her anvendes typisk et overskud af restriktionsenzym for at sikre fuldstændig fordøjelse af DNA-substratet. Inkubationstider på fra ca. 1 time til 2 timer ved ca. 37°C kan bruges, skønt variationer tol- 10 ereres. Efter hver inkubering fjernes protein ved ek straktion med phenol/chloroform og kan efterfølges af etherekstraktion, og nukleinsyren udvindes fra vandige fraktioner ved præcipitering med ethanol. Om ønsket kan størrelsesseparationen af de spaltede fragmenter udføres 15 ved polyacrylamidgelelektroforese eller agarosegelelek- troforese under anvendelse af standardmetoder. En generel beskrivelse af størrelsesseparationer findes i Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

20 Restriktionsspaltede fragmenter kan forsynes med stumpe ender ved at behandle med det store fragment af E. coli DNA-polymerase I (Klenow) under tilstedeværelse af 4 de-oxynukleotidtriphosphater (dNTP’er) under anvendelse af inkuberingstider fra ca. 15 til 25 minutter ved fra 20 25 til 25°C i 50 mM Tris pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl^, 6 mM DTT og 5-10 μΜ dNTP’er. Klenow-fragmentet udfylder ved klæbrige 5'-ender, men fjerner fremstikkende 3'-enkelt-strenge, selv om de 4 dNTP'er er til stede. Om ønsket kan selektiv præparation udføres ved kun at tilføre den ene 30 eller udvalgte dNTP'er inden for de begrænsninger, der dikteres af naturen af de klæbrige ender. Efter behandling med Klenow-fragmentet ekstraheres blandingen med phenol/chloroform og ethanol præcipiteres. Behandling under hensigtsmæssige betingelser med Sl-nuklease resul-35 terer i hydrolyse af ethvert enkeltstrenget område.

23 DK 172843 B1

Syntetiske oligonukleotider kan fremstilles ved triester-metoden ifølge Matteucci et al., (J.Am.Chem.Soc. (1981) 103:3185-3191) eller ved at anvende automatiserede syntesemetoder. Kinasebehandling af enkeltstrenge forud for 5 annealing eller forud for mærkning opnås ved at anvende et overskud, f.eks. ca. 10 enheder polynukleotidkinase til 1 nmol substrat i nærværelse af 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2/ 5 mM dithiothreitol, 1-2 mM ATP. Hvis kinasebehandlingen er til brug ved mærkning af probe, vil 32 10 ATP'en indeholde yp med høj specifik aktivitet.

Ligeringer udføres i 15-30 μΐ volumener under følgende standardbetingelser og temperaturer: 20 mM Tris-Cl pH

7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 mg/ml BSA, 10 mM - 50 mM

15 NaCl og enten 40 μΜ ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheder T4-DNA ligase ved 0°C {for ligering af "klæbrige ender") eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheder T^-DNA ligase ved 14°C (for ligering af "stumpe ender"). Intermolekylære ligeringer med "klæbrige ender" udføres sædvanligvis ved to-20 tal-DNA-koncentrationer på 33-100 pg/ml (5-100 nM total slutkoncentration). Intermolekylære ligeringer med stumpe ender (hvortil der sædvanligvis anvendes 10-30 gange molært overskud af linkere) udføres ved 1 μΜ total slutkoncentration.

25 I vektorkonstruktion, hvortil anvendes "vektorfrag menter", behandles vektorfragmentet sa?dvanligvis med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) for at fjerne 5'-phos-phaten og forhindre genligering af vektoren. ΒΛΡ- fordøj eiser udføres ved pH 8 i ca. 150 mM Tris i + +2 30 nærværelse af Na og Mg under anvendelse af ca. 1 enhed BAP pr. pg vektor ved 60° i ca. 1 time. For at udvinde nukleinsyrefragmenterne ekstraheres præparationen med phenol/chloroform og ethanol præcipiteres. Alternativt kan genligering forhindres i vektorer, som er blevet dob-35 beltfordøjet med yderligere restriktionsenzymfordøjelse af de ikke-ønskede fragmenter.

24 DK 172843 B1 C.5. Modifikation af DNA-sekvenser

For dele af vektorer hidrørende fra cDNA eller genomisk DNA, som kræver sekvensmodifikationer, anvendes sted-5 specifik, primerstyret mutagenisering. Denne metode er nu en standardmetode inden for området og udføres under anvendelse af et syntetisk primeroligonukleotid komplementært til et enkeltstrenget fag-DNA, som skal mutage-niseres med undtagelse af begrænset manglende parring, 10 hvilket repræsenterer den ønskede mutation. I korthed anvendes det syntetiske oligonukleotid som en primer for at styre syntese af en streng, der er komplementær til fagen, og det fremkomne dobbeltstrengede DNA transformeres ind i en værtsbakterie, hvor fagen kan formeres.

15 Kulturer af den transformerede bakterie udplades i topagar, som tillader plaquedannelse ud fra enkeltceller, som rummer fagen. Teoretisk vil 50¾ af de nye plaque indeholde fagen med den muterede form i enkeltstreng; 50% vil have den oprindelige sekvens. Plaque'ene hybridiseres 20 med kinasebehandlet syntetisk primer ved en temperatur, som tillader hybridisering af en eksakt parring, men ved hvilke fejlparringen ved den oprindelige streng er tilstrækkelig til at forhindre hybridisering. Plaque, som hybridiserer med proben, opsamles derefter, dyrkes og 25 DNA'et udvindes. Detaljer og stedspecifikke mutageniser-ingsmetoder beskrives nedenfor i specifikke eksempler.

C.6 Konstruktionsverifikation I den nedenfor anførte konstruktioner bekræftes korrekte 30 ligeringer for plasmidkonstruktion ved først at transformere E.coli stamme MM294 eller en anden egnet vært med ligeringsblandingen. Vellykkede transformanter udvælges med ampicillin, tetracyklin eller ved anden antibiotisk resistens eller under anvendelse af andre markører, som 35 er afhængig af plasraidkonstruktionsmåden, sådan som man kender det inden for området. Plasmider fra transforman- 25 DK 172843 B1 terne fremstilles derefter ifølge fremgangsmåden beskrevet af Clewell, D.B. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) (1969) ^2:1159, eventuelt efterfulgt af chloramphenicol- amplifikation (Clewell, D.B., J.Bacteriol. (1972), 5 110:667). Det isolerede DNA analyseres ved restriktions analyse og/eller sekventeres ved dideoxymetoden ifølge Sanger, F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) (1977), 74:5463, som yderligere beskrevet af Messing et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:309 eller ved metoden ifølge 10 Maxam et al., Methods in F.nzymology (1980) 65:499.

C. 7. Værter eksemplificeret Værtsstammer anvendt ved kloning og ekspression her er som følger: 15

For kloning og sekventering og for ekspression af konstruktionen under styring af de fleste bakteriepromotorer blev E.coli stamme MM294 hidrørende fra E.coli Genetic Stock Center GCSC nr.6135 anvendt som værten. For eks-20 pression under styring af PLNRBS~promoteren blev E.coli stamme K12 MC1000 lambda lysogen, N^N53cI857 SusP80, ATCC 39531 anvendt.

For M13-fagrekombinanter blev E.coli stammer, som er føl-25 somme overfor faginfektion, såsom E.coli K12 stamme DG98, anvendt. DG98-stammen er blevet deponeret hos ATCC 13. juli 1984 og har deponeringsnummer 39768.

Pattedyrekspression er blevet opnået med COS-7 og CV-1-30 celler.

D. Foretrukne udførelsesformer

Det rekombinante CSF-1 ifølge opfindelsen kan betragtes som et sæt af muteiner, som har lignende, men ikke nød-35 vendigvis identiske primære aminosyresekvenser, som alle udviser eller specifikt spaltes til et mutein, som viser 26 DK 172843 B1 det aktivitetsmønster, som er karakteristisk for CSF-1, dvs. de er i stand til at stimulere benmarvsceller til at differentiere til hovedsagelig monocytter og er inden for de begrænsninger, der er anført i definitionsafsnittene 5 ovenfor immunoreaktive med antistoffer rejst rood nativ CSF-1 og med receptorer, som er forbundet med CSF-1 aktivitet. Visse udforelsesformer for disse muteiner foretrækkes imidlertid.

10 Den på fig.5 viste primære sekvens for mCSF-1 har den nødvendige aktivitet og er selvfølgelig blandt foretrukne udførelsesformer. Ligeledes foretrukne er muteiner, hvor visse dele af sekvensen er blevet ændret enten ved fjernelse eller konservativ substitution af en eller flere 15 aminosyrer i raCSF-1. Ved en "konservativ" aminosyresub-stitution menes en, som ikke ændrer proteinets aktivitet og karakteristika og almindeligvis er den karakteriseret ved kemisk lighed mellem sidekæderne i de to rester, som udveksles. F.eks. erstattes sure rester konservativt med 20 andre sure rester, basiske med basiske, hydrofobe med hydrofobe, fyldige med fyldige osv. Den grad af lighed, som er nødvendig, afhænger selvfølgelig af, hvor kritisk den aminosyre, som substitueres, er, og dens natur. I almindelighed er foretrukne substitutioner for cysteinrester 25 således serin og alanin; for asparaginsyrerester glu-taminsyre; for asparaginsyrerester glutaminsyre; for ly-sin- eller argininrester, histidin, leucin, isoleucin eller valin; for tryptophanrester, phenylaianin eller tyrosin osv.

30

Områder i CSF-1 proteinet, som er mest tolerante overfor ændring, inkluderer de områder med kendt lav homologi mellem human-og musearter (resterne 15-20 og 75-84); områder, som udviser følsomhed overfor proteolytisk spalt-35 ning (resterne 51 og 52 og resterne 191-193); cysteinrester, der ikke deltager i disulfidbinding eller som 27 DK 172843 B1 ikke er absolut nødvendig for aktivitet (resterne 158-224) .

Der foretrækkes derfor navnlig de CSF-1 muteiner, som el* 5 karakteriseret ved fjernelsen eller konservativ substitution af en eller flere aminosyrer og/eller en eller flere sekvenser af aminosyrer mellem positionerne 158 og til og med 224 i mCSF-1. Ligeledes foretrækkes de, der er karakteriseret ved fjernelsen eller konservativ substitu-10 tion af en eller flere aminosyrer i positionerne 51 og 52 og/eller positionerne 191, 192 og 193 i mCSF-1. Eftersom de udviser områder med tilsyneladende lav homologi er et andet foretrukket sæt af udførelses former karakteriseret ved fjernelsen eller konservativ substitution af en eller 15 flere af aminosyrerne ved positionerne 15-20 og/eller 75-84 i mCSF-1. Ligeledes foretrukne er de muteiner, som er karakteriseret ved fjernelsen eller konservativ substitution af cysteinresten ved en hvilken som helst position, som ikke er essentiel for dannelse af disulfidbindinger.

20 Ligeledes foretrukne er de proteiner, som er karakteriseret ved fjernelsen eller substitutionen af tyrosin-resten ved position 59 i mCSF-1; navnlig substitution med en asparaginsyrerest.

25 E. Kloning og ekspression af human CSF-1 I det følgende illustreres de metoder, som anvendes til opnåelse af den kodende sekvens for human CSF-1, til anbringelse af denne sekvens i ekspressionsvektorer og til opnåelse af ekspression af det ønskede protein.

30 E.1. Oprensning af nativ human CSF-1 og probedesign Human urin CSF-1 blev delvis oprenset ved hjælp af standardmetoder, som beskrevet af Das, S.K. et al., Blood (1981) 58:630 efterfulgt af affinitetsoprensningstrin un-35 der anvendelse af rottemonoklonalt antistof mod muse-CSF-1, betegnet YYG106, fastgjort til en Sepharose B-søjle 28 DK 172843 B1 (Stanley, E.R., Methods Enzymol. (1985) 116:564). Slut- trinnet i oprensningen var HPLC med omvendt fase i et puffersystem af 0,1 TFA/30'é acetonitril - 0,1?· TFA/60? acetonitril.

5

For MlAPaCa CSF-1, som blev produceret serumfrit ved induktion med phorbolmyristinacetat, blev cellesupernatant-en udsat for calciumphosphatgelkromatografi (ifølge Das, se ovenfor)), efterfulgt af affinitetskromatografi under 10 anvendelse af linselectin (i stedet for ConA-affinitets-trinnet ifølge Das) og derefter et inununoaffinitetstrin, hvortil anvendes det monoklonale YYG206 antistof konjugeret til Sepharose B og IIPLC med omvendt fase som ovenfor beskrevet.

15

Urin- og MIAPaCa-proteinerne, som var blevet oprenset til homogenitet, blev underkastet aminosyresekventering under anvendelse af Edman-nedbrydning på et automatisk sekven-teringsapparat. Der blev bestemt en tilstrækkelig lang N-20 terminal sekvens af human CSF til at gøre det muligt at konstruere de på fig. 3 viste prober.

E.2. Fremstil!ing af den human-genomiske sekvens En human genomisk sekvens, som koder for CSF-1, blev op-25 nået fra det humane Maniatis genomiske bibliotek i λ-fag Charon 4 under anvendelse af prober, der var udformet til at kode for den N-terminale sekvens af det humane protein. Biblioteket blev konstrueret ved at anvende delvis fordøjelse med Haelll/Alul af det humane genom, ligering 30 til EcoRI-linkere og indsættelse af fragmenterne i EcoRI-fordøjet Charon 4 fag. En Charon 4A-fag indeholdende CSF-1-sekvensen vurderet ved hybridisering til en probe som nedenfor beskrevet og betegnet pHCSF-1, blev deponeret hos The American Type Culture Collection (ATCC) 2. april 35 1985 og har deponeringsnummer 40177. Ved senere under søgelse af denne fag viste det sig, at der var sket om- 29 DK 172843 B1 bytninger og/eller deletioner, og de korrekte sekvenser blev ikke bevaret. Derfor fik en alternativ koloni, som var opnået fra det genomiske bibliotek på samme måde og formeret for at bekræfte stabilitet ved replikation, be-5 tegneisen pHCSF-a og blev deponeret hos ATCC 21. maj 1985 og fik deponeringsnummeret 40185. pHCSF-la indeholdt en 18 kb lang indføjelse og var i stand til at frembringe restriktionsenzymfordøjelser, som også hybridiserede til proben, og blev anvendt til sekvensbestemmelse og kon-10 struktion af yderligere prober som anført nedenfor.

Hvis den CSF-l-kodende sekvens er til stede i fuld længde kan dens tilstedeværelse påvises ved ekspression i COS-7 celler, som beskrevet af Gluzman, Y., Cell (1981) 23:175.

15 Testfragmentet klones ind i et plasmid hidrørende fra pBR322, som er blevet modificeret til at indeholde SV-40 replikationsorigin (pGRI Ringold, G., J.Mol.Appl. Genet (1982) 1.:165-175). De resulterende højkopiantal-vektorer transformeres i COS-7-celler, og ekspression af CSF-1-20 genet analyseres efter 24, 48 og 72 timer ved hjælp af radioreceptoranalysemetoden ifølge Das (se ovenfor). Ekspression er under styring af de native CSF-l-styrings-sekvenser. HindiIl-fordøjelse af den ca. 18 kb lange indføjelse i pHCSF-la testet på denne måde blev ikke ud-25 trykt, hvilket indicerer, at HindiIl-fordøjelsen strækker sig ind i genet. Dette blev bekræftet ved efterfølgende kortlægning (mapning).

Til initiel sekventering blev der imidlertid opnået et 30 3, 9 kb langt Hindi Il-fragment fra pHCSF-la fagen, og det blev klonet i M13-kloningsvektorer.

Hindlll-fragmentet er blevet delvis sekventeret, og resultaterne er vist på fig. 4 sammen med en deduceret pep-35 tidsekvens. Den indeholder korrekte codoner for den del af det humane CSF-l-protein, for hvilket aminosyre- 30 DK 172843 B1 sekvensen er blevet bestemt som anført i figur 1. Tilstedeværelsen af et intronområde på ca. 1400 bp blev deduceret ud fra den tilgængelige aminosyresekvens.

Baseret på den genomiske sekvens, der koder for amino-5 syreerne 24-34 (se den angivne del i figurerne 4 og 5) blev der konstrueret en 32-mer probe for cDNA-bibliote- ket, og den blev anvendt som beskrevet nedenfor.

Angivet i større detaljer blev Maniatis-biblioteket 10 proberet under anvendelse af 2 blandinger af oligomerer vist på fig. 3 til opnåelse af den genomiske klon, pHCSF-la. EK14 og EK15 blev udvalgt skønt de andre oligomerer, som er vist, også kan anvendes. En probe i "fuld længde" for den N-terminale sekvens, EK14, blev anvendt som en 15 blanding af seksten 35-merer. En kortere oligomer, EK15, blev anvendt som en blanding af 64 18-merer. Fager, som hybridiserede med begge kinasebehandlede prober, blev opsamlet og dyrket ved infektion af E. coli DG98 eller en anden kompetent stamme.

20

Specifikke betingelser for probering med EK14 og EK15 er som følger: For EK14 indeholdt bufferen 15?.· formamid, 6 x SSC, pH 7,0, 5x Denhardt’s opløsning, 20 mM natriumphos-phat, 0,2% SDS og 50 pg/ml denatureret laksesperm-DNA.

25 Præhybridisering og hybridisering udførtes ved 42°C, og filtrene blev vasket i 2 gange SSC ved 52°C. For EK15 blev anvendt lignende betingelser for hybridisering og præhybridisering med undtagelse af, at formamid-koncen-trationen var 0»; vask foregik ved en lavere temperatur, 30 4 2°C.

Den ca. 18 kb lange DNA-indføjelse isoleret fra den positivt hybridiserende fag pHCSF-la blev behandlet med Hindlll, og fragmenterne blev underkastet elektroforese 35 på agarosegel ifølge Southern-metoden. Replika af gelerne blev overført på nitrocellulosefiltre, og filtrene blev 31 DK 172843 B1 proberet igen med EK14 og EK15. Begge prober hybridi-serede til et 3,9 kb langt fragment.

Det positive fragment blev udskåret fra gelen, elueret og 5 subklonet i Hind!Il-behandlet M13mpl9 for dideoxysekven-tering. En delvis sekvens ses på fig.4. Understregningen svarer præcis til den tidligere bestemte N-terminale sekvens af human CSF-1; aminosyreresterne markeret med en stjerne er homologe til musesekvensen.

10 På figur 4 er det 1,4 kb lange intronområde mellem codon'erne for aminosyreerne 22 og 23, som deduceret ud fra den humane sekvens bestemt på det oprensede protein, vist i ikke-translateret form. Sekvensen opstrøms de N-15 terminale rester indeholder den formodede leder; translationen af den del af denne leder, som ligger umiddelbart ved siden af det modne protein, som forsøgsvis blev verificeret ved de indledende sekventeringsresultater af cDNA-klonen (se nedenfor), vises. Opstrømsdelene er imid-20 lertid ikke vist i translateret form. Ved at sammenligne med cDNA'et bekræftes det, at disse dele omfatter en in-tron.

Yderligere sekventering for at opnå ca. 13 kb af det 18 25 kb lange gen viser, at genet indeholder 9 exonområder adskilt med 8 intronområder. Områderne for det cDNA, som koder for det modne protein, svarer nøjagtig til de geno-miske exoncodon'er med undtagelse af codon 59, hvilket er yderligere omtalt nedenfor.

30

Der blev opnået en yderligere M13-subklon ved at fordøje det 3,9 kb lange Hindlll-fragment med PstI til frembringelse af et 1 kb langt Pstl/Pstl-fragment, som inkluderer den kendte N-terminale sekvens og ca. 1 kb af 35 yderligere opstrømssekvens.

32 DK 172843 B1 E.3. cDNA, som koder for human CSF-1

Den human afledte pankreatiske carcinomacellelinie MIA-PaCa-2 blev anvendt som en kilde for mRNA for at validere probér og for at frembringe et cDNA-bibliotek indehold-5 ende en intron-fri form af sekvensen, der koder for human CSF-1. MIAPaCa-cellelinien producerer CSF-1 på et niveau på ca. 10 gange under niveauet for L-929-museceller.

Negativ kontrol mRNA blev fremstillet ud fra MIAPaCa-cel-10 ler og opbevaret i serumfrit medium, det vil sige under betingelser, hvor de ikke producerer CSF-1. Celler producerende CSF-1 blev opnået ved at reinducere CSF-l-pro-duktion efter fjernelse af serum.

15 Celler blev dyrket i rulleflasker, indtil de dannede et sammenhængende lag under anvendelse af Dulbecco's modificerede Eagles' medium (DMEM) indeholdende 10% føtal kalveserum, og producerede CSF-1 ved 2000-6000 enheder pr. ml. Cellekulturerne blev vasket og reinkuberet serumfrit 20 for at undertrykke CSF-l-dannelse. For negative kontroller blev der ikke produceret påviselig CSF-1 efter 1 dag eller 2 dage. Reinducerede celler blev opnået ved at tilsætte phorbolrnyristinacetat (100 ng/ml) til opnåelse af en produktion efter flere dage på 1000-2000 enheder/ml.

25 mRNA'et blev isoleret ved lysering af cellerne i isoto-nisk buffer med 0,5% ΝΡ-Ί0 i nærværelse af ribonukleosid-vanadylkompleks (Berger, S.L. et al., Biochemistry (1979) 1J3:5143) efterfulgt af phenol/chloroforn-ekstrakti.on, 30 ethanolpræcipitering og oligo-dT-chromatografi, og der opnåedes en beriget mRNA-præparation. Cellerne blev nærmere beskrevet vasket to gange i PBS (phosphatbufret sa-lin) og resuspenderet i IHB (140 mM NaCl, 10 mM Tris, 1,5 mM MgC^, pH 8) indeholdende 10 mM vanadyladenosinkom-35 pleks (Berger, S.L., et al., se ovenfor).

33 DK 172843 B1

Der tilsattes et ikke-ionisk detergent af ethylenoxidpo-lyraertypen (NP-40) til 0,5¾ for at lysere de cellulære membraner, men ikke kernemembranerne. Kerner blev fjernet ved centrifugering ved 1000 x g i 10 minutter. Superna-5 tanten efter fjernelse af kernerne blev tilsat til 2 volumener TE mættet phenolchloroform (1:1) (TE = 10 mM

Tris, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), pH 7,5) og indstillet til 0,5% natriumdodecylsulfat (SDS) og 10 mM EDTA. Supernatanten blev genekstraheret 4 gange, og 10 der blev udført faseseparation ved centrifugering ved 2000 x g i 10 minutter. RNA'et blev præcipiteret ved at indstille prøven til 0,25 M NaCl·, tilsætte 2 voluminer 100¾ ethanol og opbevare prøven ved -20°C. RNA'et blev bundfældet ved 5000 x g i 30 minutter, blev vasket med 15 70% og 100% ethanol og blev derefter tørret. Polyadeny- leret (poly-A+) messenger-RNA (mRNA) blev opnået fra det totale cytoplasmiske RNA ved kromatografi på oligo-dT-cellulose (Aviv, J., et al., Proc.Natl.Acad. Sci. (1972) 69:1408-1412). RNA'et blev opløst i ETS (10 mM Tris, 1 20 mM EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5) ved en koncentration på 2 mg/ml. Denne opløsning blev opvarmet til 65°C i 5 minutter, og afkøles derefter hurtigt til 4°C. Efter at RNA-opløsningen er bragt til stuetemperatur, indstilles den til 0, 4 M NaCl og føres langsomL gennem en oligo-dT-cel-25 lulosesøjle, som tidligere er ækvilibreret med bindingsbuffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5, 0,05% SDS). Gennemløbet fores over søjlen endnu 2 gange. Søjlen vaskes derefter med 10 voluminer bindingsbuffer. Poly-A+ mRNA elueredes med aliquoter af ETS, ekstraheres 1 gang 30 med TE-mættet phenolchloroform og præcipiteres ved tilsætning af NaCl til 0,2 M og 2 voluminer 100% ethanol.

RNA genpræcipiteredes 2 gange, vaskedes 1 gang i 70% og derefter i 100¾ ethanol før tørring.

35 Total mRNA blev underkastet centrifugering i en sucrose-gradient på 5-20 vægt% i 10 mM Tris HC1, pH 7,4, 1 mM

34 DK 172843 B1 EDTA og 0,5% SDS under anvendelse af en Beckman SW40 rotor ved 20°C og 27.000 omdrejninger pr. minut i 17 timer. mRNA-fraktionerne blev derefter genvundet fra gradienten ved ethanolpræcipitering og injiceret i Xenopus-oocytter 5 i standardtranslationsassay'et. Oocytprodukterne af mRNA-fraktionerne blev analyseret i benmarvsprolifereringsas-sayet (som bekrevet af Moore, R.N., et al., J. Immunol (1983) 131:2374, og selve fraktionerne blev analyseret ved dot-blot-hybridisering til en 32-mer probe svarende 10 til DNA'et i det andet exonområde af den genomiske sekvens (exon Il-probe) . (Streger over sekvensen i figurerne 4 og 5 viser exon-II-proben). Disse resultater opsummeres i figur 7.

15 Den stiplede linie på figur 7A viser svaret i benmarvs-prolifereringsanalysen af supernatanterne fra Xenopus-oo-cytterne; figur 7b viser dot-blot-resultaterne. Den fraktion, der hybridiseredes stærkest, 11, svarer til en størrelse, der er lidt større end 18S-markøren, medens de 20 mest aktive fraktioner 8 og 9 svarer til 14-16 S. Fraktionerne 8, 9 og 11 blev anvendt til at frembringe et beriget cDNA-bibliotek som beskrevet herefter.

(mRNA'et blev også fraktioneret på en denatureret formal-25 dehydgel, overført til nitrocellulose og proberet med en exon-II-probe. Der blev fundet adskillige distinkte slags med størrelser i området fra 1,5 kb til 4,5 kb, selv under stringente hybridiseringsbetingelser. For at eliminere muligheden for multiple gener, der koder for CSF-1, 30 blev fordøjelse af genomisk DNA med forskellige restriktionsenzymer udsat for Southern-blot og proberet under anvendelse af pcCSF-17 DNA. Restriktionsmønsteret var i overensstemmelse med tilstedeværelsen af kun et gen, som koder for CSF-1.) 35 35 DK 172843 B1

Den mRNA-berigede pulje blev fremstillet ved at kombinere mRNA'et fra gradientfraktionerne 8 og 9 med den højeste benmarvsprolifereringsaktivitet, selv om deres evne til at hybridisere til en probe er forholdsvis lav {14S -5 16S) med fraktion (11), som hybridiserede stærkest til proben (lidt støre end 18S). Højmolekylære fraktioner, som også hybridiserede til exon-II-proben, blev ikke inkluderet, fordi tilsvarende mRNA fra ikke-inducerede MIA-PaCa-celler også hybridiserede til exon-II-proben.

10 cDNA-biblioteker blev fremstillet ud fra total eller beriget rnRNA på 2 måder. Ved en metode anvendtes XggtlO-fagvektorer og er beskrevet af Huynh, T.V. et al., i DNA Cloning Techniques: Λ Practical Approach IRL Press, Ox-15 ford 1984, D. Gloves, red.

En foretrukken metode udnytter oligo-dT-priming af poly-A-haler og AMV revers transkriptase anvendende metoden ifølge Okayama, H. et al., Mol.Cell Biol. (1983) 2;280-20 289. Denne metode resulterer i en højere andel af kloner i fuld længde end dannelse af haler med poly-dG og effektiv udnyttelse som værtsvektor-dele i 2 vektorer beskrevet der, og som let kan opnås fra forfatterne, pcDVl og pLl. De fremkomne vektorer indeholder indføjelsen mellem 25 vektorfragmenter indeholdende proximale BamHI- og Xhol-restriktionssteder; vektoren indeholder pBR322-replikati-onsorigin og genet for Amp-resistens og SV40-styringsele-menter, hvilket resulterer i, at vektoren har evne til effektivt at udtrykke de indføjede sekvenser i COS-7 cel-30 ler.

Et bibliotek på 300.000 kloner opnået fra ovennævnte berigede MIAPaCa-mRNA ved hjælp af metoden ifølge Okayama og Berg blev derefter proberet under betingelser med høj 35 stringenthed under anvendelse af exon-II-proben. 10 kolonier, som hybridiserede med proben, blev opsamlet og ko- DK 172843 B1 36 lonierne blev renset. Disse kloner blev analyseret for tilstedeværelsen af CSF-1 kodende sekvenser ved forbigående ekspression i COS-7 celler. Kloningsvektoren, som indeholder SV40-promotoren, blev i sig selv anvendt i 5 transformationen af COS-7 celler.

Plasmid-DNA blev oprenset fra de 10 positive kloner under anvendelse af en CsCl-gradient, og COS-7 cellerne blev transficeret under anvendelse af en modifikation (Wang, 10 A.M. et al., Science (1985) 228:149) af calciumphosphat-copræcipiteringsmetoden. Efter inkubering i 3 dage blev CSF-l-produktionen analyseret ved at udsætte dyrkningssu-pernatanterne for radioreceptoranalysen udført stort set som angivet af Das, S.K. et al, Blood (1981) 5(3:630 og en 15 kolonistimulerende analyse (benmarvsproliferation) udført stort set som omtalt af Prystowsky, M.B. et al.,

Am. J.Pathol· (1984) 114: 149. Ni ud af de ti opsamlede kloner viste ikke forbigående CSF-l-produktion i COS-7 celler. En klon, som udviste ekspression, blev dyrket, 20 plasmid-DNA'et blev isoleret og det indføjede stykke blev sekventeret. DNA-sekvensen sammen med den deducerede ami-nosyresekvens er vist på figur 5. cDNA'et i fuld længde er 1,64 kb og koder for et modent CSF-l-protein på 224 aminosyrer. Klonen fik betegnelsen CSF-17 med Cetus depo-25 neringsnummer CMCC 2347, og den blev deponeret hos American Type Culture Collection 14. juni 1985 med deponer-ingsnummer 53149. Plasmidet, som bærer det CSF-l-kodende DNA, blev betegnet pcCSF-17.

30 E.4. Forbigående ekspression af CSF-1

Ekspressionen af plasmid-DNA fra CSF-17 (pcCSF-17) i COS-7 celler blev bekræftet og kvantificeret under anvendelse af benmarvsproliferationsanalysen, kolonistimulationsanalysen og radioreceptoranalysen. Det skal erindres, at 35 specificiteten af benmarvsproliferationsanalysen for CSF-1 ligger alene i CSF-l-antiserum'ets evne til at formind- 37 DK 172843 B1 ske aktivitet; den for kolonistimulationsanalysen ligger i de opnåede koloniers natur. Begge analyser viser, at CSF-l-produktionen er af en størrelsesorden på adskillige tusinde enheder pr. ml.

5

Benmarvsproli f eration

Til benmarvsstimulationsanalysen, som måler proteinets biologiske aktivitet, blev benmarvsceller fra Ba.lb/C-mus behandlet med seriefortyndinger af supernatanter efter 72 10 timer, og proliferation af cellerne blev målt ved optagelse af mærket thymidin, stort set som beskrevet af Moore, R.N. et al, J. Immunol. (1983) 131:2374;

Prystowsky, M.B. et al., fim . J . Patliol. (1984) 114 :149. Me diet fra inducerede MIAPaCa-celler blev anvendt som kon-15 trol. Specificitet for CSF-1 blev bekræftet ved evnen hos kaninantisera rejst mod human urin-CSF-1 til at undertrykke thymidinoptagelse. I tabel 1 vises resultater for COS-7-cellesupernatanter transficeret med pcCSF-17 (CSF-17-supernatant) ved en fortynding på 1:16.

20 TABEL 1 *H-thymidin-inkorporering (cpm)

Ingen til- Normal Antiserum mod sætninger serum human CSF-1 25 Medium 861 786 2682 MIAPaCa-supernatant 12255 16498 3302 CSF-17-supernatant 16685 21996 2324 (Antiserum mod human CSF-1 blev fremstillet som beskrevet 30 af Das et al., se ovenfor).

MIAPaCa-supernatanten (ved fortynding 1:16 anvendt ovenfor) indeholdt 125 enheder/ml CSF aktivitet svarende til 2000 enheder/ml i den ufortyndede supernatant, hvor 1 en-35 hed kolonistimulationsaktivitet defineres som den mængde CSF, der er nødvendig for at producere 1 koloni ud fra 10 5 38 DK 172843 B1 benmarvsceller pr. ml i analysen ifølge Stanley, E.R. et al., J.Lab.Clin.Med. (1972) 79:657).

Disse resultater viser, at den enmarvsstimulerende akti-5 vitet er forbundet med CSF-1, eftersom thymidinoptagelse hæmmes af antiserum mod CSF-1. Regression af resultaterne i denne benmarvsproliferationsanalyse opnået ved 4 fortyndinger liggende mellem 1:8 og 1:64 gav en estimeret aktivitet for CSF-1 i CSF-17-supernatanter på 2358 enhed-10 er/ml, hvilket blev formindsket til 424 enheder/ml i nærværelse af antiserum, men viste en tilsyneladende forøgelse til 3693 enheder/rol i nærværelse af ikke-immunse-rum. Dette var sammenlignelig med niveauerne vist i radioreceptoranalysen nedenfor.

15

Kolonistimulering

Direkte analyse af CSF-17-supernatanterne for kolonistimulering (Stanley, E.R. et al., J-Lab.Clin.Med. (se ovenfor) ) viste 4287 enheder/ml, hvilket stort set var upå-20 virket af tilstedeværelsen af ikke-immunserum, men blev reduceret til 0 enheder/ml i nærværelse af kaninantistof mod human CSF-1. Dette skal sammenlignet med 2562 enheder/ml i MIAPaCa-supernatanterne. 85" af de pCSF-17-trans-formerede, C0S-7-supernatant-inducerede kolonier havde 25 mononukleær morfologi; MIAPaCa-supernatant-inducerede kolonier udviste et forhold på 94’, makrofager og 6% gra-nulocyt ter.

Radioreceptoranalyse 125 30 Radioreceptoranalysen måler konkurrence mellem T-mær-ket CSF-1 og testforbindelsen for specifikke receptorer på J774.2 musemacrofagceller. MIAPaCa-supernatent, som var analyseret for kolonistimulationsaktivitet som ovenfor, blev anvendt som en standard (2000 enheder/ml). CSF-35 1-koncentrationen i den pcCSF-17-transformerede C0S-7-su- 39 DK 172843 B1 pernatant fandtes at være 2470 enheder/ml baseret på en 1:10 fortynding og 3239 enheder/ml baseret på en 1:5 fortynding.

5 Der blev således i alle analyser fundet sammenlignelige værdier for CSF-l-koncentrationen i mediet fra C0S-7-cel-ler transformeret med pcCSF-17.

E.5. Stabil ekspression af CSF-1 10 Med COS-7-systemet tilvejebringes rekombinant CSF-1 ved at muliggøre replikation og ekspression fra vektorsekvenser. Det er et forbigående ekspressionssystem.

15 Den humane CSF-l-sekvens kan også udtrykkes stabilt i prokaryote eller eukaryote systemer. Alment giver prokaryote værter en nemmere produktion, medens eukaryote værter gør det muligt at anvende den native signalsekvens og udføre ønsket post-translatorisk modifikation. Dette kan 20 være specielt vigtigt i tilfælde med CSF-1, eftersom det native protein er en dimer. Bakterier producerer CSF-1 som en monomer, som derefter skal udsættes for dimeriser-ingsbetingelser efter ekstraktion.

25 Prokaryotisk ekspression.

Til prokaryotisk ekspression ændres cDNA-k.lonen eller den genomiske sekvens med intronområder fjernet ved f.eks. stedspecifik mutagenisering for at anbringe en ATG-start-codon umiddelbart opstrøms glutaminsyren i den N-termi-30 nåle ende og et Hind-III-genkende.lsessted umiddelbart opstrøms ATG-codon'en for at tilvejebringe et hensigtsmæssigt sted til indføjelse i de nedenfor anførte standard-værtekspressionsvektorer. Dette kan gøres direkte ved en indføjelse ved stedspecifik mutagenisering med en synte-35 tisk oligomer indeholdende en ny sekvens, som er komplementær med den ønskede AAGCTTATG, flankeret af nukleotid- 40 DK 172843 B1 sekvenser, som er komplementære til den native leder og de N-terminale kodesekvenser.

I det opnåede DNA udskæres under anvendelse af metoden 5 ifølge Okayama og Berg det DNA-fragment, som indeholder hele den kodende sekvens, fra pcCSF-17 ved fordøjelse med Xhol (ved stedet bevaret fra værtkloningsvektoren), fragmentet isoleres fra agarosegelelektroforese og genvindes ved elektroeluering. Til udførelse af mutageniseringen 10 behandledes værtbakteriofagen M13mpl8-DNA også med Sall og ligeredes med det oprensede fragment under standardbetingelser og overførtes i frosne kompotente E.coli K12 stamme DG98 . Cellerne udpladedes på medier indeholdende 5x10 ^ M isopropylthiogalactosid (IPTG) opnået fra Sigma 15 Chem. (St. Louis, MO) og 40 fig/ml X-gal. Ikke-komplemen-terende hvide plaque opsamledes i frisk medie. Minikulturer screenedes for rekombineret enkeltstrenget fag-DNA af den forventede størrelse, og strukturen af den ønskede rekombinerede fag bekræftedes ved anvendelse af 20 restriktionsanalyse.

En 34-mer komplementær til den N-lerminale ende og ledersekvensen af de kodende dele af CSF-l-sekvensen, men indeholdende det komplementære til den ønskede AAGCTTATG-25 sekvens syntetiseredes og oprensedes i overensstemmelse med procedurerne fremført i punkt C. 4. En del af denne 34-mer præparation mærkedes radioaktivt ifølge en modificering af metoden af Maxam og Gilbert (Maxam, Λ. et al.,

Methods in Enzymoloqy (1980) ^8:521, Academic Press) som 30 anført i C.4. ovenfor.

For at udføre mutageniseringen fremstilledes den ovenfor fremstillede rekombinante fag i E.coli stamme K12 DG98, og det enkeltstrengede fag-DNA oprensedes. Et pmol en-35 keltstrenget fag-DNA og 10 pmol af den ovennævnte syntetiske nukleotidprimer (ikke kinasebehandlet) annealedes ! 41 DK 172843 B1 ved opvarmning i 1 minut ved 67°C, og derefter 30 minutter ved 37°C i 15 μΐ 20 mM Tris-Cl, pH 8, 20 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 20 mM 2-mercaptoethano.l. Det annealede DNA inkuberedes med DNA-polymerase-I (Klenow) og 500 μΜ 5 dNTP'er i 30 minutter, 0°C og bragtes derefter til 37°C.

Aliquoter (0,05 eller 0,25 pmol) fjernes efter 5 minutter, 20 minutter og 45 minutter, og overføres til E.coli K12 stamme DG98 og udpladedes.

10 Efter vækst afkøledes pladerne til 4°C og plaque løftedes med Pall-membraner opnået fra Biodyne eller S&S-filtere (1-2 minutter i det første filter, derefter over 10 minutter i det andet filter. Filtrene denatureredes i 2,5 M NaCl, 0, 5 M NaOH (5 minutter). Det denaturerende medium 15 neutraliseredes med 3 M natrumacetat til pH 5,5 eller med 1 M Tris-Cl, pH 7,5 indeholdende 1 M NaCl, filtrene bagtes ved 80°C i vakuum i 1 time og præhybridiseredes derefter ved høj stringenthed. Filtrene proberedes derefter med den kinasebehandlede, syntetiske 34-mer fremstillet 20 ovenfor ved høj stringenthed, vaskedes og autoradiograferedes natten over ved -70°C.

RF-formen af den ønskede, muterede fag behandledes med EcoRI, forsynedes med stumpe ender med Klenow, og fordøj-25 edes derefter med Hindlll for at udskære genet som et HindilI/stumpendet fragment. (På helt analog måde kan den CSF-l-kodende sekvens fra pMCSF opnås og modificeres).

Dette fragment, som indeholder den humane (eller muse) 30 CSF-l-kodende sekvens ligeredes derefter med Hindlll/BamHI (stump) fordøjet pPLOP eller pTRP3 (se nedenfor) for at anbringe den kodesekvens, som indeholder ATG-startcodon umiddelbart nedenstrøms P^- henholdsvis trp-promotoren. De fremkomne plasmider transformeredes i 35 E.coli MC1000 lambda lysogen eller MM294, og cellerne dyrkes under ikke-inducerende betingelser og induceredes DK 172843 B1 42 derefter på en måde, der er hensigtsmæssig for promotoren. Cellerne høstedes ved centrifugering, behandledes med ultralyd, og det frigjorte CSF-1 opløstes. Tilstedeværelsen af human (eller muse) CSF-1 bekræftedes ved at under-5 kaste sonikatet den ovenfor anførte kolonistimulations-analyse.

Eukaryotisk ekspression

Okayama-Berg-plasmidet pcCSF-117 indeholdende det cDNA, 10 som koder for human CSF-1 under styring af SV-40 promotoren, kan også anvendes til at udføre stabil ekspression i CV-l-abeceller, den stamcellelinie, hvorfra COS-7-linien hidrører. CV-l-værtsabecellerne blev dyrket til sammenflydning og derefter cotransformeret under an-15 vendelse af 10 ug pcCSF-17 og forskellige mængder (1, 2, 5 og 10 ug) af pRSV-NE02 (Gorman, C. et al., Science (1983) 221:551-553) pr. 500.000 celler. Transformanterne blev dyrket i DMEM med 10¾ FBS-medium indeholdende 100 jig/ml G418 antibiotika, overfor hvilket pRSV-NE02- 20 plasmidet giver resistens. CV-l-cellelinien viste en _ c i2 ø G418-transformationshyppighed på 10 ' kolonier pr. 10 pr. ug DNA.

CV-1-cellerne blev cotransformeret som ovenfor beskrevet 25 og selekteret i G418-holdigt medium. Resistente kloner blev testet for stabilitet af den G418-resistente fænotype ved dyrkning i G418-frit medium og derefter tilbageføring til G418-holdigt medium. Disse kulturers evne til at overleve, nar de føres tilbage til antibiotikaholdigt 30 medium lader formode, at pRSV-NE02-DNA'et var permanent integreret i cellegenomet. Eftersom celler, der er stabilt transformeret med et markørplasinid, har ca. SO'i sandsynlighed for at have integreret DNA'et af et co-transficerende plasmid, vil ca. halvdelen af disse celler 35 også indeholde pcCSF-17-DNA i deres kromosomale DNA.

43 DK 172843 B1

Adskillige kloner af den G418-resistente pulje af CV-1-celler, som blev påvist som ovenfor anført at være stabilt transformeret, blev opsamlet og dyrket i et dobbeltsæt flasker til næsten sammenvoksning. Ilver flaske af 5 dobbeltsæt blev inficeret med SV40-virus med en infekti-onsmultiplicitet på 5, og mediet blev høstet 6 dage efter infektion for analyse for CSF-1 under anvendelse af ra- dioimmunanalyse. Immunanalysen er baseret på konkurrence i med I-mærket MIAPaCa CSF-1 for "kanin 52" polyklonalt 10 antiserum rejst mod oprenset human urin CSF-1.

En af de selekterede CV-1 kloner udviste 2335 enheder/ml produktion af CSF-1 ifølge denne analyse, hvorimod celler, der ikke var inficeret med SV40, udviste mindre end 15 20 enheder/ml. Kontroller, hvortil anvendtes COS-7-celler transformeret med 10 pg pcCSF-17, viste 2400 enheder/ml CSF-l-produktion uden SV-40-infektion.

Den CSF-1-producerende CV-1 cellelinie indeholder pcCSF-20 17-DNA'et stabilt integreret i dets genom og kan således anvendes til stabil produktion af CSF-1 efter infektion med SV-40. Infektionen antages at "befri" pcCSF-17-DNA'et fra genomet og tilvejebringer SV-40 T-antigen nødvendig for replikation af det befriede DNA. Uden SV40 infektion 25 bliver det integrerede pcCSF-17-DNA ikke effektivt udtrykt .

Optimering af ekspressionen af den CSF-1 kodende sekvens af CV-1 (CSF-17) cellelinien viste 6500-8000 enheder/ml, 30 når det blev testet med radioimmunanalysen 6 dage efter SV40 infektion under anvendelse af en infektionsmultipli-citet på mindst 1, og et medium indeholdende 10¾ FBS. Undersøgelse af ekspressionsnivauer ved multiplicitet på 10 udviste en sammenlignelig produktion, men produktionen 35 blev nedsat ved fjernelse af FBS fra mediet på anden dag efter infektion.

4 4 DK 172843 B1

Ved den alternative metode kan egnede styringssystemer og værtsvektorer, som tillægges ekspression i eukaryote værter, anvendes til opnåelse af CSF-l-kodende indføjelser.

5 Der kan f.eks. anvendes CHO-celler og egnede vektorer som beskrevet i US patentansøgning nr. 438.991, indleveret 1. november 1982, overdraget til samme assignatar og inkorporeret her ved henvisning.

10 E.6. Aktivitet af C5F-1

Yderligere definition af CSF-l-aktiviteten blev tilvejebragt under anvendelse af delvis oprenset MIAPaCa CSF-1 eller muse-L-celle CSF-1 som modeller for det CV-l-produ-cerede rekombinante materiale. Det blev vist, at CSF-1 15 forøgede produktionen af interferon og tumornekrosefaktor {TNF) af inducerede humane monocytter ved op til 10 gange. Det blev også påvist, at CSF-1 stimulerede macro-fag antitumortoxicitet.

20 Stimulering af TNF-produktion hos humane monocytter MIAPaCa-CSF-1 blev oprenset fra supernatanten ved calci-umphosphatgelfiltrering og linselectinkromatografi. Til analyse for lymfokinproduktion blev perifere blodtilknyttede celler inkuberet i dobbelt sæt af flasker, som hver η 25 indeholdt 10 celler. En flaske blev behandlet med 1000 enheder/ml CSF-1 oprenset som ovenfor anført. Efter 3 dage blev cellerne høstet og vasket og resuspenderet til en cellekoncentration på 5 x ΙΟ"5 pr. ml og udpladet i plader med 24-brønde ved 0,5 ml/brønd. Brøndene blev be- 30 handlet med 10 pg/ml LPS og 20 ng/ml PMA i 48 timer, og supernatanterne blev høstet for TNF-analyse. Celler, som var behandlet med CSF, udviste TNF-secerneringer, som var ca. 9 gange højere end for ubehandlede celler (1500 enheder/ml sammenlignet med 162 enheder/ml).

35

Stimulering af interferon-produktion hos humane 45 DK 172843 B1 monocytter I et analogt forsøg for at bestemme CSF-l's virkning på interferonproduktion blev perifere blodtilknyttede celler inkuberet 3 dage i nærværelse og fravær af 1000 enhe-5 der/ml CSF-1 som beskrevet ovenfor, de blev hostet, re-suspenderet ved 5 x 10^ pr. ml og udpladet på en plade med 25 brønde som ovenfor beskrevet. Cellerne blev induceret til interferonproduktion ved at tilsætte forskellige mængder poly-IC. Supernatanterne blev analyseret for 10 interferonproduktion ved deres cytopatiske virkning på VSV-inficerede GM-2504-celler. De CSF-l-stimulerede celler viste en produktion på 100 enheder/ml, når de blev induceret med 50 pg/ml poly-IC som beskrevet af McCormick, F. et al., Mol .Cell .Biol. (1984) 4^:166, hvorimod 15 ubehandlede celler, som var induceret på lignende måde, producerede mindre end 3 enheder/ml.

Stimulering af myeloid CSF-produkti on hos humane monocyt-ter 20 Monocytter blev inkuberet ±CSF-1 i 3 dage og derefter induceret til produktion af myeloid CSF som beskrevet i tabel 1. Ved de tre viste repræsentative forsog anvendtes blod fra forskellige donorer.

DK 172843 B1 46 TABEL 2

Myeoloid CSF (enheder/ml) IExp 1___Εχρ · 2__Exp. 3 _

-CSF -t CSF -CSF t CSF -CSF +CSF

Medium 10 0 _0_ 0 0 0 0, 1 pg/ml LPS | - -__0__0__0___80±17 1 pg/ml LPS 0_____700172 40i20 200t20 103112 377157 0,1 pg/ml LPS - - 617150 9931101 1120182 1280160 + 2 ng/ml PMA _______ 1 pg/ml LPS h 263143 9831252 360192 14001180 537147 10801122 2 ng/ml PMA ______ _ _ 2 ng/ml PMA -__370117 29716 183115 380152 [716176 _ b

Stimulering af muse-makrofagers evne til at dræbe tumorceller:

Sammenligning med andrekolonistimulationsfaktorer 10 For at analysere macrofag-stimulering blev muse-CSF-1 opnået fra L-celle-konditioneret medium anvendt som en model for det rekombinanl producerede CSF-1 fra pcCSF-17 i en analyse, som viste stimulering af musemakrofagers evne til at dræbe sarcomamålceller. I denne analyse blev nor-15 male 2-timers vedhængende C3H/HeN-museperitoneale makrofager inkuberet 1 dag in vitro med og uden CSF-1 og der- 3 efter blandet i et forhold på 20:1 med H-thymidin-mær-kede musesarcoma-TU5-celler sammen med 107. vol./vol. conA-induceret (10 ng/ml) miltlymfokin (LK), som 20 indeholder gammainterferon. Frigørelsen af mærket thyrai-din over de efterfølgende 48 timer blev anvendt som et mål for tumorcelledrab. Effekten af at tilsætte CSF-1 som muse-L-celle-konditioneret medium indeholdende 1200 enheder/ml CSF-1 er vist i den efterfølgende tabel.

47 DK 172843 B1

Behandling Forøgelse på

Dag Dag Drab grund af CSF-1 0-+1 l->3 % % 13 5 — LK 3 9 CSF-l+LK 49 26 CSF-1 LK 51 31 CSF-1 CSF-l+LK 60 54 10 — — 3 LK 35 CSF-l+LK 47 34 CSF-1 — 7 CSF-1 LK 49 40 15 CSF-1 CSF-l+LK 69 97

Forøgelse af evnen til at dræbe målcellerne blev bemærket, hvad enten CSF-1 blev tilsat under den indledende 1.

20 dags vækst eller under induktionsperioden; de mest dramatiske virkninger blev imidlertid observeret, når CSF-1 var til stede begge disse perioder.

Muligheden for at stimuleringen af monocytter og 25 makrofager skyldtes kontaminerende bakteriel lipopolysac-charid (LPS) blev udelukket: LPS-indholdet i det tilførte CSF-1 var lavt (<0,3 ng/3000 enheder CSF-1, ved Limulus amoebocyt-lysatassay); aktiviteten blev fjernet ved påsætning på en søjle med antistof mod CSF-1; polymyxin B 30 blev anvendt til at neutralisere LPS; makrofagerne fra C3H/lIeJ-mus svarede på CSF-1 men ikke på LPS.

CSF-GM blev fremstillet ud fra 6 muselunger opnået 5 timer efter IV-indgivelse af 5 pg LPS. Lungerne blev hakket 35 i stykker og inkuberet i 3 dage i serumfrit medium, og supernatanten blev udtomt for CSF-1 ved at anvende en 4 8 DK 172843 B1 YYG106 affinitetssøjle (CSF-l-indhold reduceret fra 270 enheder/ml til 78 enheder/ntl) . CSF-G blev fremstillet ud fra LDl-serumfrit medium behandlet på samme måde. Både CSF-GM og CSF-G indholdet blev analyseret ved 2000 enhed-5 er/ml ved kolonistimulationsanalysen.

De peritoneale makrofager blev inkuberet med 40“ af hver af de ovennævnte medier eller med L-cellemedium analyseret ved 2000 enheder/ml CSF-1 i 1 dag og derefter inkuber-10 et i 48 timer enten med yderligere medium eller med LK og analyseret for evne til at dræbe TUS som ovenfor beskrevet .

Resultaterne er vist på figur 6. Medens CSF-1 viste mar-15 kant toxicitetsforøgelse overfor TUS havde hverken CSF-G eller CSF-GM nogen effekt.

Stimulering af muse-antiviral aktivitet

Adhærente, thioglycolat-fremkaldte musemakrofager blev 20 inkuberet med CSF-1 i 3 dage og inficeret med VSV natten over. Der blev tilsat polymyxin B for at teste prøver mod blokering af LPS-induktion af interferon. Den efterfølgende tabel viser krystalviolet farvning af celler, som forbliver adhærente.

49 DK 172843 B1 TABEL 3

Behandling Krystalviolet

- Polymyxin B -i Polymyxin B

5 (gennemsnit)(S.D.)

Medium/Nr. VSV 0,158 ± 0,019

Medium + VSV 0,0583 ± 0,02 0, 049 ± 0,009 CSF-1625 enhed- 10 er/ml + VSV 0,139 ± 0,018 0,177 ± 0,04 1250 + VSV 0,167 ± 0,6 0,205 ± 0,07 2500 + VSV 0,160 ± 0,06 0,219 ± 0,04 5000 + VSV 0,150 ± 0,03 0,202 ± 0,06 15 CSF-l-behandlede celler viste derfor beskyttelse af macrofagen mod VSV.

E . 7 . Formul a t i on af CS F-_l

Det humane CSF-1 fremstillet ved rekombination kan formu-20 leres til indgivelse under anvendelse af farmaceutiske standardprocedurer. CSF-1 vil almindeligvis blive fremstillet i injicerbar form og kan anvendes enten som den eneste aktive bestanddel eller i kombination med andre proteiner og andre forbindelser med komplementerende el-25 ler lignende aktivitet. Sådanne andre forbindelser kan inkludere alternative antitumormidler, såsom adriamyein, eller lymfokiner, såsom IL-1, -2 og -3, alfa-, beta-, og gamma-interferoner og tumornecrosefaktor. Virkningen af den CSF-l-aktive bestanddel kan forøges eller forbedres 30 ved tilstedeværelsen af sådanne yderligere komponenter.

Som beskrevet ovenfor kan CSF-1 vekselvirke på gunstig måde med egnede blodceller, og sammensætningerne ifølge opfindelsen inkluderer derfor en inkubationsblanding af sådanne celler med CSF-1, eventuelt i nærværelse af yder-35 ligere lymfokiner. Der kan enten anvendes 50 DK 172843 B1 supernatantfraktioner af sådanne inkubationsblandinger eller hele blandingen indeholdende cellerne såvel.

F. Muse-CSF-1 5 En intronløs DNA-sekvens, som koder for muse-CSF-1, blev fremstillet under anvendelse af en musefibroblastcelleli-nie, som producerer store mængder af CSF-1. L-929-linien, som kan opnås fra ATCC, blev anvendt som en kilde for mRNA til fremstilling af et cDNA-bibliotek. Under anvend-10 else af oligomere prober konstrueret på basis af den kendte muse-N-terminal og CNBr-spaltet interne peptidsekvens, blev dette cDNA-bibliotek proberet for at finde hele den kodende sekvens for museformen af proteinet. Muse-CSF-1 antages at være ca. 80? homolog med det humane 15 materiale på grund af homologien mellem de N-terminale sekvenser, evnen hos både den humane CSF-l-præparation og CSF-l-præparationen fra mus til at stimulere macrofagko-lonier ud fra benmarvsceller og den begrænsede krydsreaktivitet med hensyn til radioreceptor og radioimmunassay 20 (Das, S.K. et al., Blood (1981), 58:630).

F.l. Proteinoprensning

Muse-CSF-1 blev oprenset ved standardmetoder, der ligner dem, der er blevet omtalt af Stanley, E.R. et al., 25 J.Immunol.Meth (1981) £2:253-284 og af Wang, F.F. et al., J.Cell. Biochem (1983) 21:263-275 eller SDS-gelelektrofo-rese som opsummeret af Hunkapiller, M.W. et al., Science (1984) 226:304.

30 Aminosyrerne 1-39 i musesekvensen blev opnået under udnyttelse af cyagenbromidspaltningen ved position 10 til udstrækning af nedbrydningsprocessen. Et internt spaltningsprodukt fra museproteinet blev også opnået og se-kventeret.

35 51 DK 172843 B1

Den totale sammensætning for museproteinet blev opnået som nedenfor vist. Disse resultater viser korrekt relativ mol% for de aminosyrer, som udviser god genfindingsprocent; antallet er imidlertid ikke absolutte, eftersom 5 histidin og cystein ikke blev genfundet i et godt udbytte.

Aminosyre Molprocent Rester/12 5

Asp 20,1 25,1 10 Glu 20, 0 25,0

His

Ser 6,0 7,5

Thr 5,9 7,4

Gly 5,4 6,8 15 Ala 6,8 8,5

Arg 3,0 3,8

Pro 6,7 8,4

Val 5,3 6,6

Met 1,1 1,4 20 Ile 3,9 4,9

Leu 8,5 10,6

Phe 6,0 7,5

Lys 3,5 4,4

Tyr 4,1 5,1 25

Omdannelsen til rester/125 var baseret på en tilnærmelse af sekvenslængden ud fra molekylvægt.

F.2. Fremstilling af muse CSF-l-DNA 30 Aminosyresekvensen 5-13 af muse-CSF-1 og den interne sekvens blev anvendt som basis for probekonstruktion.

Der blev fremstillet 3 sæt oligomerer svarende til musesekvensen. Der blev fremstillet en sekvens til at kode 35 for "område A" - dvs. aminosyrerne 9-13; der blev fremstillet en anden til at kode for "område B" - dvs. amino- DK 172843 B1 52 syrerne 5-9 som vist på figur 2; der blev fremstillet et tredie område til at kode for positionerne 0-6 i en intern sekvens, "område C. På grund af codon-overtallighed er hver af disse klasser af oligonterer meget degenere-5 rede. Således er antallet af 15-mere konstrueret på basis af område A 48; antallet af 14-inere konstrueret på basis af område B (under udeladelse af det sidste nukleotid af codon'et for histidin) også 48; antallet af 20-mere konstrueret på basis af område C er 32. Sagt med andre ord 10 kan en 15-mer konstrueret til at kode for område Λ have en fejlparring i 4 af de 15 positioner; en bestemt 14-mer konstrueret med hensyn til område B kan have en fejlparring i 6 positioner; en bestemt 20-mer konstrueret med hensyn til område C kan have en fejlparring i 5 position-15 er.

Som beskrevet nedenfor kan der ved en hensigtsmassig pro-Lokoludformning findes en beriget messenger-RNA-fraktion for produktionen af det ønskede, berigede muse-cDNA-bib-20 liotek, og de præcise, korrekte oligomerer til brug som prober kan også sikres.

Total mRNA blev ekstraheret og oprenset fra L-929-muse-celler. L-929-museceller blev dyrket i 8 dage på DME-me-25 dium og derefter høstet ved centrifugering.

Total cytoplasmisk ribonukleinsyre (RNA) blev isoleret fra cellerne efter samme protokol som anført ovenfor for MIAPaCa-mRNA.

30 mRNA'et blev fraktioneret på geler for Northern-blot-ana-lyse som beskrevet i afsnittet C.3. De 15 mere sekvenser svarende til område A blev delt i 4 grupper med 12 i hver. Hver af disse grupper blev anvendt til at hybridi-35 sere under lav stringenthed med både kontrol og muse-L-929 mRNA slabgeler, og de fremkomne mønstre blev under- 53 DK 172843 B1 søgt ved radioautografi. Under de betingelser med lav stringenthed, som blev anvendt, skete hybridisering til fraktioner, som ikke indeholdt den korrekte sekvens, såvel som til dem, der gjorde det. Fordi kontrolcellelinien 5 er forskellig fra L-929-linien på andre måder end mangel på frembringelse af CSF-1 skete hybridisering også på en række steder, der ikke havde relation til CSF-1 i L-929-cellegelerne, som ikke er til stede i kontrollerne.

10 Sammenlignelige sæt af kontrolgeler og L-929-geler blev proberet med segreganter af de 48 14-mere, som repræsenterer område B, og segreganter fra de 32 20-mere, som repræsenterer område C. Kun de bånd af messenger-RNA, som hybridiserer eksklusivt i L-929-slabgelerne for enten om-15 raderne A eller B, og C-prober kom i betragtning.

Det RNA-bånd, som fortsatte med at bindes til en af 15-raer blandingerne i Λ-oinrådet eller til en af 14-mer blandingen i område B eller af 20-mer blandingen i område 20 C under betingelser med stigende større stringenthed blev udvalgt.

Da det korrekte mRNA-bånd var blevet fundet blev hver 15-mer i område A grupperne anvendt til at probere ved for-25 skellige stringenthedsbetingelser. Den gruppe, som bandt ved den højeste stringenthed, indeholder antagelig den korrekte 15-mer, som er nøjagtig komplementær til det fremstillede mRNA. Den korrekte 15-mer blev sikret ved yderligere opspaltning af præparationen, indtil der blev 30 fundet en enkelt oligomer, som bandt ved den højeste stringenthed. En lignende fremgangsmåde blev anvendt til at sikre den korrekte 14-mer eller 20-mer, som bandtes til område B eller C. Disse specifikke oligomerer er derefter tilgængelige som prober i et muse-cDNA-bibliotek, 35 som fremstilles ud fra den mRNA-berigede fraktion.

DK 172843 B1 54

Den mRNA-fraktion, som er identificeret som indeholdende den sekvens, der koder for CSF-1, opnås derefter på en præparativ skala. I denne præparation blev poly-A+-mRNA fraktioneret på en sucrosegradient i 10 mM Tris-HCl, pH 5 "7,4, 1 mM EDTA og 0,5% SDS. Efter centrifugering i en

Beckman SW40 rotor ved 30.000 omdr. pr. minut i 17 timer blev mRNA-fraktioner udvundet fra gradienten ved ethanol-præcipitering. RNA-fraktioner udvundet fra gradienten blev injiceret i Xenopus-oocytter i et standardtranslati-10 onsassay, og produkterne blev analyseret for CSF-1 under anvendelse af radioimmunassay med antistoffer rejst mod muse-CSF-1. Fraktioner, for hvilke der blev opnået positive resultater, blev hældt sammen og anvendt til at konstruere cDNA-biblioteket. Disse samme fraktioner hybridi-15 serede til de oligomere prober.

Andre metoder til fremstilling af cDNA-biblioteker er selvfølgelig velkendte inden for faget. En, nu klassisk, metode udnytter oligo-dT-primer, reverse transkriptase, 20 påsætning af en hale på det dobbeltstrengede cDNA med poly-dG og annealing i en egnet vektor, såsom pBR322 eller et derivat heraf, som er blevet spaltet ved det ønskede restriktionssted og påsat en hale med poly-dc. En detaljeret beskrivelse af denne alternative metode findes 25 f.eks. i US patentansøgning nr. 564.224, indleveret 20. december 1983 og overdraget til samme assignatar, og inkorporeret her ved henvisning.

I den her anvendte metode denatureredes det berigede mRNA 30 (5 ug) ved behandling med 10 mM methylmercuri ved 22°C i 5 minutter og blev afgiftet ved tilsætning af 100 mM 2-mercaptoethanol (Payvar, F. et al., J.Biol.Chem (1979) 254 ;7636-7642) . Plasmid pcDVl blev spaltet med Kpnl, påsat en hale med dTTP og annealet til det denaturerede 35 mRNA. Dette oligo-dT-primede mRNA blev behandlet med revers transkriptase, og den nyligt syntetiserede DNA- 55 DK 172843 B1 streng blev påsat en hale med dCTP. Endelig blev den uønskede del af pcDVl-vektoren fjernet ved spaltning med Hindlll. Separat blev PLI spaltet med PstI, påsat en hale med dGTP, spaltet med Hindu I og derefter blandet med det 5 poly-T-forlængede mRNA/cDNA-kompleks forlænget med pcDVl-vektorfrakmentet, ligeret med E.coli ligase, og blandingen blev behandlet med DNA-polymerase I (Klenow) E.coli ligase og RNase II. De fremkomne vektorer blev transformeret i E.coli K12 MM294 til AmpR.

10

Det fremkomne cDNA-bibliotek blev derefter screenet under anvendelse af oligomerprober identificeret som komplementære til den mRNA-kodende sekvens som ovenfor beskrevet.

Kolonier, som hybridiserede til prober fra områderne A 15 eller B og C, blev opsamlet og dyrket; plasmid DNA blev isoleret, og plasmider indeholdende tilføjelser af tilstrækkelig størrelse til at kode for hele sekvensen for CSF-1, blev isoleret. Sekvensen af det indsatte stykke af hver af disse plasmider blev bestemt, og en plasmid-præ-20 paration indeholdende hele den kodende sekvens inkluderende områderne A og B i opstrømsdelen, betegnes pcMCSF.

F. 3. Ekspression af muse CSF-1-DNA

På en måde, der ligner den, der er anført ovenfor for hu-25 man cDNA, blev muse-cDNA testet for forbigående ekspression i COS-celler og anvendt til ekspression i stabilt transformeret CV-1. Ydermere blev de hensigtsmæssige HindIII/ATG-kodende sekvenser indføjet opstrøms det modne protein ved mutagenisering, og de kodende sekvenser blev 30 indsat i pPLOP eller pTRP3 for prokaryotisk ekspression.

G. Værtsvektorer pPLOP er en værtsekspressionsvektor med P^-promoteren og N-genribosombindingsstedet ved siden af et HindIII-re-35 striktionsspaltningssted, hvilket således tillader hensigtsmæssig indføjelse af en kodende sekvens med en ATG- DK 172843 B1 56 startcodon med et foranstillet HindITI-genkendelsessted.

Rygraden i denne vektor er et temperatur følsomt højkopi-antalplasmid hidrørende fra pCS3. pPLOP blev deponeret hos ATCC 18. december 1984 og har deponeringsnummer 5 39947.

pTRP3 er en værtsekspressionsvektor indeholdende en trp-promoter umiddelbart opstrøms et Ilindlll-restriktionsgen-kendelsessted, hvilket således tillader indføjelse af en 10 kodende sekvens på analog måde som ovenfor nævnt for pPLOP. Rygraden i pTRP3 er pBR322. pTRP3 blev deponeret hos ATCC 18. december 1984 og har deponeringsnummer 39946.

15 Konstruktion af pPLOP Replikationsorigi n pCS3 tilvejebringer et replikationsorigin, som giver et højt kopiantal af pPLOP-værtsvektoren ved høje temperaturer. Den konstruktion beskrives indgående i be-20 skrivelsen til US patentansøgning nr. 541.948, indleveret 14. oktober 1983, inkorporeret her ved henvisning. pCS3 blev deponeret 3. juni 1982 og fik ATCC nr. 39142.

pCS3 hidrører fra pEW27 og pOP9. pEW27 er beskrevet af E.

25 M. Wong, Proc.Natl. Acad .Sci (USA) (1982) ^9:3570. Den indeholder mutationer nær dens replikationsorigin, hvilket giver temperaturregulation af kopiantallet. Som følge af disse mutationer sker replikationen i et højt kopiantal ved høje temperaturer, men i et lavt kopiantal ved 30 lave temperaturer.

pOP9 er et højkopiantalplasmid ved alle temperaturer, som blev konstrueret ved i pBR322 at indsætte EcoRI/PvuII-fragmentet indeholdende origin fra Col El-type plasmid 35 pOP6 (Gelfand, D. et al, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) (1978) 75:5869). Før indsættelse blev dette fragment modificeret 57 DK 172843 B1 på følgende måde: 50 ug af pOP6 blev fuldstændigt fordøjet med 20 enheder af hver af BamHI og Sstl. For at eliminere de fremstikkende Sstl 3'-ender og "udfylde" BamHI 5'-enderne blev det fordøjede pOP6 DNA behandlet med 5 E.coli DNA- polymerase I (Klenow i en to-trinsreaktion, først ved 20°C for at eliminere den fremstikkende Sstl-3'-ende og derefter ved 9°C for at reparere 5'-enden. Det stumpendede fragment blev fordøjet og 0,02 pmol blev anvendt til at transformere kompetente DG75 (O'Farrell, P., 10 et al., J. Bacteriology (1978) 134: 645-654). Transfor manterne blev selekteret på L-plader indeholdende 50 μ/ml ampicillin og blev screenet for en deletion på 3,3 kb, bag af et Sstl-genkendelsessted og tilstedeværelse af et nyligt formet BamHI-genkendelsessted.

15

En transformant, betegnet pOP7, blev udvalgt, og BamHI-genkendelsesstedet blev fjernet ved at fordøje 25 pg pOP7 med 20 enheder BamHI, reparere med E.coli DNA-polymerase I fragment (Klenow) og genligere med T4 DNA-ligase. Kom-20 petent DG75 blev behandlet med 0,1 pg af DNA'et og transformanterne blev selekteret på L-plader indeholdende 50 pg/ml ampicillin. Transformanter blev screenet for tab af BamHI-genkendelsesstedet. pOP8 blev selekteret. For at opnå pOP9 blev Aval(repareret)/EcoRI TetR-fragmentet fra 25 pBR322 fremstillet og isoleret og ligeret til det isolerede 3560 bp lange PvuII(partielt)/EcoRI fragment fra pOP8.

Ved ligering af 1,42 kb EcoRI/Aval(repair) TetR (fragment 30 A) og 3,56 kb EcoRI/PvuII AmpR (fragment B) blev anvendt 0,5 pg af fragment B og 4,5 pg af fragment A i en Lo-trins-reaktion for at begunstige intermolekylær ligering af EcoRI-enderne.

35 Kompetente DG75 blev transformeret med 5 μΐ af ligeringsblandingen, og transformanter blev selekteret på ampicil- DK 172843 B1 58

D U

linholdige plader (50 pg/ml). pOP9 isoleret fra Amp Tet -transformanter viste høj kopiantal, colicinresistens, enkelte genkendelsessteder for EcoRI, BamHI, PvuII,

Hindlll, 2 genkendelsessteder for Hindi og en passende 5 størrelse og Ilaelll-fordøjelsesmønster .

For at opnå pCS3 blev 50 ug pEW27-DNA fordøjet fuldstændig med PvuII og EcoRI. På lignende måde blev 50 ug pOP9 fordøjet fuldstændig med PvuII og EcoRI, og det 3,3 kb 10 lange fragment blev isoleret.

0,36 ug (0, 327 pmol) pF.W27-f ragment og 0,35 \xq (0,16 pmol) p0P9-fragment blev ligeret og anvendt til at trans-formere E. col i MM294. Amp Tet trans formenter blev se-15 lekteret. Kolonier, som var lykkedes, blev initielt screenet ved 30°C og 41°C på beta-lactamase assayplader og derefter for plasmid DNA-niveauer efterfulgt af vækst ved 30°C og 41°C. En transformant, der udviste et gunstigt resultat, betegnet pCS3, blev bekræftet ved sekven-20 tering.

Fremstilling af PJJi<H;--indføjelsen

Den DNA-sekvens, som indeholder PL~fagpromotor og ribo sombindingsstedet for N-genet (NRBC.)< blev opnået fra 25 pFC5, og i sidste ende fra et derivat af pKC30 beskrevet af Shimatake og Rosenberg, Nature (1981), 292:128. pKC30 indeholder et 2,34 kb langt fragment fra lambda-fag klonet i Hindlll/Bamlll-vektorfragmentet fra pBR322. PT-pro- li motoren og NRBS optager et segment i pKC30 mellem et gen-30 kendelsessted for Bglll og HpaT. Derivatet af pKC30 har fået Bglll-genkendelsesstedet omdannet til et EcoRI-gen-kendelsessted.

Bglll-genkendelsesstedet umiddelbart forud for PL-promo-35 toren blev omdannet til et EcoRI-genkendelsessted på 59 DK 172843 B1 følgende måde: pKC30 blev fordøjet med Bglll, repareret med Klenow-fragment og dNTP'er og ligeret med T4-ligase til en EcoRI-linker (opnåelig fra New England Biolabs) og transformeret i E.coli K12 stamme MM294 lambda+. Plasmid-

R R

5 er blev isoleret fra Amp Tet transformanter, og den ønskede sekvens blev bekræftet ved restriktionsanalyse og sekventering. Det fremkomne plasmid, pFC3, blev fordøjet dobbelt med Pvul og Hpal til opnåelse af et isoleret ca.

540 bp langt fragment og behandlet med Klenow-fragment og 10 dATP, efterfulgt af behandling af Sl-nuklease til frembringelse af et stupendet fragment med den terminale 3'-sekvens -AGGAGAA, hvor -AGGAGA delen er NRBS'et. Dette fragment blev behandlet med EcoRI til frembringelse af et 347 basepar langt DNA-fragment med 5'-EcoRI (klæbrig) og 15 Hinfl (delvis repareret, SI stump) -3'-termini.

For at færdiggøre pFC5 blev ρβΙ-Ζ15 anvendt til at skabe et HindiIl-genkendelsessted 3' for NRBS· ρβ1-Ζ15 blev deponeret 13. januar 1984, ATCC nr. 39578, og blev frem-20 stillet ved at fusionere en sekvens indeholdende ATG plus 140 bp af β-IFN fusioneret til lac Z i pBR322. I ρβ1-Ζ15 blev EcoRI-genkendelsesstedet fra pBR322 bevaret, og det indsatte stykke indeholdt et HindiIT-genkendelsessted umiddelbart forud for ATG-startcodon for β-IFN. ρβΓ-Ζ15 25 blev restriktionsbehandlet med llindlll, repareret med

Klenow-fragment og dNTP’er og blev derefter fordøjet med EcoRI. Det fremkomne EcoRI/ Hindlll (repareret) vektorfragment blev ligeret med det ovenfor nævnte EcoRI/Hinfl (repareret) fragment, og ligeringsblandingen blev anvendt 30 til at transformere MC1000-39531. Trans formenter indeholdende den gunstige konstruktion blev identificeret ved evne til at vokse på lactose minimale plader ved 34° C, men ikke ved 30°C. (Transformationer blev udpladet på X-gal-Amp plader ved 30°C og 34°C og på minimal-lactose 35 plader ved 30°C og 34°C). Transformanter med den korrekte konstruktion er blå på X-gal-Amp plader ved begge tempe- 60 DK 172843 B1 raturer, men på minimal lactoseplader vokser de kun ved 34°C). Den vellykkede konstruktion blev betegnet pFC5.

Færdiggørelse af pPLOP

5 pCS3 blev modificeret til frembringelse af P^- og NRBg~ styringssekvenser. pCS3 blev fordøjet med Hindlll og derefter fordøjet med EcoRI. Vektorfragmentet blev ligeret med en isoleret EcoRI/ Hindlll fra pFC5 indeholdende P^N „„„ og transformeret i E.coli MM294. Den korrekte kon

Kdj — “ 10 struktion af det isolerede plasmid blev bekræftet ved restriktionsanalyse og sekventering, og plasmidet blev betegnet pPLOP.

Fremsti 1ling af pTRP3 15 For at konstruere værtsvektoren indeholdende trp-styr-ingssekvenser efter et Hindlll genkendelsessted blev trp-promotor/operator/ribosom-bindingsstedsekvensen, som mangler attenueringsområdet, opnået fra pVH153, hidrørende fra C. Yanofsky, Stanford University. Trp-sekvenser 20 er tilgængelige fra en række af sådanne plasmider, kendt inden for fagområdet. pVH153 blev behandlet med Hhal {som skærer under efterladelse af en eksponeret klæbrig 3'-ende umiddelbart 5' for trp-promotoren) det blev lavet stumpendet med Klenow og delvis fordøjet med Taql. Det 99 25 bp lange fragment svarende til restriktionen ved Taql-genkendelsesstedet 6 nukleotider forud for ATG-startcodonen af trp-lederen blev isoleret og ligeret til EcoRI(repareret)/Clal-fordøjet pBR322 til frembringelse af pTRP3.

30 2. april 1985 har ansøger hos American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) deponeret fagen pHCSF-1 i E.coli DG98, deponeringsnummer 40171. 21. maj 1985 blev pHCSF-la, betegnet CMCC 2312 i Cetus-samlingen og 61 DK 172843 B1 pHCSF-1 λ Charon 4Λ til deponering, deponeret hos ATCC og har deponeringsnummer 40185.

24. juni 1985 blev CSF-17 i E.coli MM294, betegnet CMCC 5 2347 deponeret hos ATCC og har deponeringsnuimner 53149.

Disse deponeringer blev foretaget under bestemmelserne ifølge Budapest-traktaten vedrørende international anerkendelse af deponering af mikroorganismer af hensyn til patentprocedure og regulativerne herunder (Budapesttrak-10 taten). Dette sikrer opbevaring af en levende kultur i 30 år fra deponeringsdatoen. Deponeringerne vil være tilgængelige fra ATCC under betingelserne ifølge Budapest-trak-taten og underkastet en aftale mellem ansøger og ATCC, som sikrer permanent og ubegrænset tilgængelighed ved ud-15 stedelse af det relevante US patent. Assignatar indvilliger heri, at hvis den deponerede kultur dør eller går tabt eller bliver ødelagt, når den dyrkes under egnede betingelser, vil den ved underretning herom straks blive erstattet med en levende prøve af den samme kultur.

20 Tilgængeligheden af deponeringerne skal ikke betragtes som en licens til at udøve opfindelsen i strid med de rettigheder, der er givet fra myndighederne fra en hvilken som helst regering i overensstemmelse med dets patentlove .

25

Opfindelsens rækkevidde skal ikke betragtes som begrænset af de illustrerede udførelsesformer anført her, men skal bestemmes i overensstemmelse med de tilhørende krav.

Claims (49)

1. 62 DK 172843 B1
2. 1. Isoleret DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for et CSF-l-polypeptid, der har aminosyrese- 5 kvensen af resterne 1-224 vist i figur 5, eller en modificeret form af denne aminosyresekvens ved fjernelse, tilføjelse eller ændring, idet dimerer af dette polypep-tid primært stimulerer dannelse af makrofagkolonier ved in vitro CSF-l-analyse. 10
3. 2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den koder for human-CSF-l-monomer.
4. 3. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, 15 aL CSF-l-polypeptid har en aminosyresekvens, der i det væsentlige svarer til den af nativ human-mCSF-1, (human-monomer-CSF-1) .
5. 4. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, 20 at CSF-l-polypeptid har en aminosyresekvens, som er karakteriseret ved, at en eller flere aminosyrer mellem positionerne 150 til og med 224 i mCSE'-l, som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller underkastet konservativ substitution. 25
6. 5. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at CSF-l-polypeptid har en aminosyresekvens, som er karakteriseret ved, at en eller flere af aminosyrerne i positionerne 51 og 52 og/eller positionerne 191, 192 og 193 30. mCSF-1, som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller underkastet konservativ substitution.
7. 6. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at CSF-l-polypeptid har en aminosyresekvens, som er ka- 35 rakteriseret ved, at en eller flere af aminosyrerne i positionerne 15-20 og/eller positionerne 75-84 i mCSF-1, 63 DK 172843 B1 som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller underkastet konservativ substitution.
8. 7. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, 5 at CSF-l-polypeptid har en aminosyresekvens, som er karakteriseret ved, at cysteinenheden i position 59 i mCSF- I, som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller erstattet.
9. 8. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at CSF-l-polypeptid har en aminosyresekvens, som er udvalgt fra gruppen bestående af mCSF-1, V^g-CSF-l, Vj^q-CSF-1, gln^CSF-l og asp^g-mCSF-1.
10. 9. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den koder for et protein med den aminosyresekvens, som kodes i pHC5F-la eller pcCSF-17.
11. 10. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at CSF-l-polypeptidet har en N-terminal aminosyresekvens, som er udvalgt fra gruppen bestående af Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Leu-GlnSer-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-25 Thr-Ser-Cys-Gln-Ile-ThrPhe-Glu-Phe-Val-Asp-Gln-Glu-Gln-Leu og
12. 30 Lys-Glu-Val-Ser-Glu-His-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Asn-Gly-His-Leu-LysVal-Leu-Gln-Gln-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-Thr-Ser. II. Replikativ kloningsvektor, kendetegnet 35 ved, at den omfatter en DNA-sekvens, som koder for et hu- man-CSF-l-polypeptid eller et muse-CSF-l-polypeptid, hvor 64 DK 172843 B1 polypeptidet primært stimulerer dannelse af makrofagkolo-nier ved in vitro CSF-l-analysen, samt en replicon, som kan fungere i en encellet organisme.
13. 12. Vektor ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den sekvens, der koder for CSF-l-polypeptidet, koder for et protein, som har en ami nosyresekvens, der i det væsentlige svarer til den for human mCSF-1.
14. 13. Vektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den sekvens, der koder for CSF-l-polypeptidet, koder for et protein, som har en aminosyresekvens, der er udvalgt blandt mCSF-1, V15g-CSF-1, V^q-CSF-1, gln^CSF-l og asp 5gCSF-l-polyypeptidet. 15
15. 14. Replikativ kloningsvektor, kendetegnet ved, at den omfatter DNA-sekvensen ifølge krav 10 og en replicon, der kan fungere i en encellet organisme.
16. 15. Ekspressionssystem, kendetegnet ved, at det indeholder DNA'et ifølge krav 1 forbundet på funktionsdygtig måde med egnede styresekvenser.
17. 16. Ekspressionssystem ifølge krav 15, kendeteg-25 net ved, at den rekombinante DNA-sekvens koder for hu- man-CSF-1, som har en aminosyresekvens, der stort set svarer til sekvensen for human-mCSF-1.
18. 17. Ekspressionssystem ifølge krav 15, kendeteg-30 net ved, at den rekombinante DNA-sekvens koder for hu- man-CSF-l-polypeptidet, som har en aminosyresekvens, der er udvalgt fra gruppen bestående af mCSF-1, V15g-CSF-1, Vi50-CSF-1, gln^CSF-l og asp^gCSF-l. 65 DK 172843 B1
19. 18. Ekspressionssystem ifølge krav 15, kendetegnet ved, at den rekombinante DNA-sekvens, der koder for CSF-l-polypeptid, koder for et protein med en amino-syresekvens, som kodes i pHCSF-la eller pcCSF-17. 5
20. 19. Ekspressionssystem ifølge krav 15 eller 16, kendetegnet ved, at det er anbragt i en vektor, som er i stand til at replikere i passende værtsceller.
21. 20. Ekspressionssystem, kendetegnet ved, at det omfatter DNA-sekvensen ifølge krav 10 forbundet funktionsdygtigt til passende styresekvenser.
22. 21. Rekombinante værtsceller, kendetegnet ved, 15 at de er transformeret med ekspressionssystemet ifølge krav 15 eller 16.
23. 22. Rekombinante værtsceller, kendetegnet ved, at de er transformeret med et ekspressionssystem, som om- 20 fatter DNA-sekvensen ifølge krav 10 forbundet funktionsdygtigt til passende styresekvenser.
24. 23. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant CSF-l-polypeptid, kendetegnet ved, at cellerne 25 ifølge krav 21 dyrkes.
25. 24. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er anbragt i klon pHCSF-la.
26. 25. DNA ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er anbragt i klon pcCSF-17.
27. 26. Fremgangsmåde til fremstilling af rekombinant CSF-l-polypeptid, kendetegnet ved, at rekombinante 35 værtsceller, som er transformeret med et ekspressionssy- 66 DK 172843 B1 stem, som omfatter DNA-sekvensen ifølge krav 10 forbundet funktionsdygtigt til passende styresekvenser, dyrkes.
28. 27. CSF-l-polypeptid, kendetegnet ved, at det 5 er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 23 eller 26.
29. 28. Rekombinant kolonistimuleringsfaktor-1 (CSF-1)-protein, kendetegnet ved, at det er dimeren 10 af mCSF-1 eller proteiner, der er i det væsentlige ækvivalente dermed.
30. 29. Protein ifølge krav 28, kendetegnet ved, at det er human-CSF-1. 15
31. 30. Protein ifølge krav 29, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens, som i det væsentlige svarer til human-mCSF-1.
32. 31. Protein ifølge krav 30, kendetegnet ved, at en eller flere aminosyrer mellem positionerne 158 til og med 224 i mCSF-1, som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller konservativt substitueret.
33. 32. Protein ifølge krav 30, kendetegnet ved, at en eller flere af aminosyrerne i positionerne 51 og 52 og/eller positionerne 191, 192 og 193 i mCSF-1, som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller konservativt substitueret. 30
34. 33. Protein ifølge krav 30, kendetegnet ved, at en eller flere af aminosyrerne i positionerne 15-20 og/eller positionerne 75-84 i mCSF-1, som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller konservativt substitu-35 eret. 67 DK 172843 B1
35. 34. Protein ifølge krav 30, kendetegnet ved, at tyrosinenheden i position 59 i mCSF-1, som den er vist i figur 5, er blevet fjernet eller substitueret.
36. 35. Protein ifølge krav 30, kendetegnet ved, at det er udvalgt fra gruppen bestående af mCSF-1, Y^g-mCSfc'-l, V150-mCSF-l, gln^-mCSF-l og asp5g-mCSF-l.
37. 36. Protein ifølge krav 28, kendetegnet ved, 10 at det har en N-terminal aminosyresekvens, som er udvalgt fra gruppen bestående af Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-His-Leu-GlnSer-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-15 Thr-5er-Cys-Gln-Ile-Thr-Phe-Glu-rhe-Val-Asp-G.ln-Glu-Gln-Leu og
38. 20 Lys-Glu-Val-Ser-Glu-His-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Asn-Gly-His-Leu-LysVal-Leu-Gln-Gln-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-Glu-Thr-Ser.
39. 37. Protein ifølge krav 28, kendetegnet ved, 25 at det er i det væsentlige fri for glycosylering.
40. 38. Anvendelse af CSF-ltil frmstilling af en sammensætning til øget produktion af interferon fra monocytter.
41. 39. Anvendelse af CSF-1 til fremstilling af en sammensæt ning til øget produktion af toxiske faktorer, såsom TNF, fra monocytter.
42. 40. Anvendelse af CSF-1 til fremstilling af en sammensæt-35 ning til oget drab af målceller ved hjælp af makrofager. 68 DK 172843 B1
43. 41. Anvendelse af CSF-1 til fremstilling af en sammensætning til øget produktion af GM-CSF fra monocytter.
44. 42. Anvendelse af CSF-1 til fremstilling af en sammensæt-5 ning til induktion af resistens over for virale infektioner i makrofager.
45. 43. Anvendelse af CSF-1 til fremstilling af en sammensætning til styrkning af et individs immunsystem. 10
46. 44. Sammensætning til styrkelse af immunsystemet i pattedyr, kendetegnet ved, at den omfatter re-kombinant CSF-1 iblandet mindst en yderligere bestanddel.
47. 45. Sammensætning ifølge krav 44, kendeteg net ved, at den yderligere bestanddel er en farmaceutisk excipiens.
48. 46. Sammensætning ifølge krav 44, kendetegnet 20 ved, at den yderligere bestanddel er en cellekultursuper- natant.
49. 47. Sammensætning ifølge krav 44, kendetegnet ved, at den yderligere bestanddel er en cellekultur.