KR20030029894A

KR20030029894A - 포유동물 세포 배양물을 이용하여 인간의 트롬보포에틴폴리펩타이드를 제조하는 방법

Info

Publication number: KR20030029894A
Application number: KR10-2003-7003058A
Authority: KR
Inventors: 구지코브스키 알폰소 카요타; 포르토 칼로스 알베르토 로벨로; 알비수 오또 프란즈 프리취
Original assignee: 구지코브스키 알폰소 카요타; 포르토 칼로스 알베르토 로벨로; 알비수 오또 프란즈 프리취; 바티야니 딕히에로 칼로스 이그나시오 에드문도
Priority date: 2000-08-30
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2003-04-16
Also published as: US20040072326A1; ZA200302414B; NZ524924A; MXPA03002762A; DE60115063D1; DK1315805T3; AU2001282376B9; CN1451040A; AU8237601A; EP1315805A2; US7371569B2; AR035341A1; UY26317A1; EP1315805B1; AU2001282376B2; CA2457165A1; JP2004507269A; BR0113789A; WO2002018569A3; DE60115063T2

Abstract

시험관내 배양물에서 포유동물 세포에 의해 생물학적 활성인 인간 TPO를 생산하는 방법을 개시한다. 면역글로블린 인헨서에 결합된 면역글로불린 프로모터를 포함하는 DNA 작제물을 통해 인간 트롬보포에틴 유전자를 도입시켜 뮤린의 골수종 세포를 유전자 변형시킨다. 그 결과 수득되는 hTPO는 시험관내 및 생체내에서 거대핵 계열의 조혈 세포의 증식이나 발생을 자극하는 방법에 유용하다.

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Description

포유동물 세포 배양물을 이용하여 인간의 트롬보포에틴 폴리펩타이드를 제조하는 방법 {METHODS FOR PREPARING HUMAN THROMBOPOIETIN POLYPEPTIDES BY MAMMALIAN CELL CULTURES}

모든 정상인의 경우 혈액 세포는 "조혈"이라는 과정을 통해서 줄기 세포 유래의 골수에서 생산된다. 여러 단계의 증식과 분화가 일어난 후, 얻어지는 분화다능성의 선조 세포는 분화 없이 자기복제[엔도듀플리케이션(endoduplication)/오토레플리케이션(autoreplication)] 하거나 4가지 주요 분화방식으로 분류되는 일련의 선조 세포를 생산할 수 있다: a) 적혈구세포; b) 골수성 세포(다핵 백혈구 또는 단핵구); c) 림프구 세포(림프세포); 및 d) 거핵생성세포(거핵세포/혈소판 생성인자). 골수에 의해 생산되는 세포 종류와 양은 표적 세포 상의 막에 결합된 수용체를 통해 작용하는 복잡한 사이토킨 또는 성장인자 망조직에 의해 정밀하게 조절되는 과정이다. 이와 같은 사이토킨으로는 인터루킨(다른 TNF-α 중에서, IL-3, IL-6, IL-8, IL-11) 및 "콜로니 자극 인자"(과립구 콜로니 자극 인자 및 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자[각각 G-CSF 및 GM-CSF])로 불리는 당단백질 호르몬; 적혈구 선조세포 자극 인자로서 작용하는 에리트로포에틴 및 혈소판 선조인자 자극인자로서 작용하는 트롬보포에틴을 포함하는 이종성의 성장인자를 포함한다.

조혈 및 그 조절에 대한 연구 결과의 증가로 인하여 의학적 치료 분야에서 다양한 조혈성 사이토킨의 용도가 개발되었다. 이와 같은 관점에서, 의학적 치료 방법들은 다음과 같은 인자에 기초한 것을 포함한다:

- 만성 신부전에서 2차 빈혈증을 치료하기 위한에리트로포에틴(EPO),

- 화학치료를 받는 암환자 또는 골수 이식받는 암환자의 면역계 회복을 가속화시키기 위한 콜로니 자극인자(G-CSF/GM-CSF),

- 화학치료제와 함께 널리 사용되는 IL-2 및 인터페론-α. 인터페론은 일부 성공을 거둔 만성 간염 치료에 사용되고, IL-2는 항레트로바이러스제와 함께 AIDS 치료에 사용된다.

순환성의 혈액 혈소판은 골수에서 생성되고 혈액 응고에 중요한 역할을 한다. 혈소판은 조직 손상 부위에 부착하여 다른 세포들을 응집시켜 "초기 지혈전"을 형성시킨다. 또한, 응고 인자를 활성화시켜 섬유소 응괴가 형성되는 표면으로서 작용한다. 혈소판이 없는 경우에는 상기 기능들이 모두 이루어질 수 없어 출혈이 계속된다(1). 따라서, 혈소판의 생성은 골수 줄기 세포가 일반적으로 말초 혈액에서 순환하는 성숙 혈소판을 생성하는 거대핵 세포로 증식과 분화를 일으킨다는 것을 암시한다.

혈소판이 생성되는 생리적 과정에는 거대핵세포 계열 유래의 성장 및 발생 인자로서 "혈소판형성"으로 불리는 인자의 존재를 필요로 한다. 임상 의학에서 혈소판 수의 감소(혈소판감소증)는 2가지 관련 상황, 즉 a) 정상적인 혈소판 생성에 영향을 미치는 질환(원발성 혈소판감소증) 및 b) 암환자 또는 골수 이식 받은 환자들의 치료적 처리에서 유래하는 합병증 결과(속발성 혈소판감소증)와 연관된 주요 합병증이다. 이 환자들의 증가된 출혈 위험성은 실제로 관련된 생물학적 위험성(알러지, 감염, 면역 과민증)이 있는 상태에서 정상 공여자 유래의 혈소판 농축물의 투여를 필요로 한다. 1958년 최초로 켈레멘과 그의 동료들(2)이 혈소판감소증 동물에서 나타나는 트롬보포에틴 활성에 대하여 발표한 이후, 1994년에 이르러서 정제하여 여러 그룹으로 클로닝된 인자가 세포 수용체 Mpl(뮤린 골수증식성 백혈병 바이러스가 원인인 종양유전자)에 결합할 수 있는 당단백질로서 동정되었고(3), 이 후 이것은 거대핵세포형성 또는 혈소판형성을 특이적으로 자극할 수 있는 트롬보포에틴[또는 c-Mpl 리간드, 즉 메가포에틴 또는 거대핵세포 성장 및 발생 인자(MGDF)로도 불림]으로 동정되었다(4-8). 혈소판형성 활성이 있는 다른 인자로는 특이성이 없고 다형질발현 현상이 있는 IL-6 및 IL-11 등이 개시되었다(9). 각각 고용량의 IL-11 및 IL-6의 투여는 순환성 혈소판을 소량 증가시켰다(10). 인간 트롬보포에틴 (hTPO) 유전자는 일 복사체로서 염색체 3(3q26-27)에 위치하고 있다. 이 유전자는 21개 아미노산(aa)(63개 염기쌍)으로 이루어진 단일 펩타이드를 포함하는 353개 아미노산(10590 염기쌍의 오픈 리딩 프레임)의 단백질을 암호화한다. 성숙 단백질은 332aa(996bp)을 가지며 추정되는 분자량은 38kDa(비글리코실화형)이다. 70 내지 80kDa의 완전한 글리코실화 단백질을 생성하기 위한 6개의 N-글리코실화 부위와 아르기닌 153과 154 사이에 이 단백질을 2개의 도메인으로 분열시키는 절단 부위를 갖고 있다: a) 공지의 단백질과 상동성이 없는 고도의 글리코실화 c-말단 도메인 및 b) EPO와 23%의 동일성이 있는 153aa의 EPO 유사 또는 N-말단 도메인. 보존적 aa 치환하는 경우, 서열 보존성은 50% 정도이다. 중요한 사실은 비글리코실화 형태가 시험관내에서 완전한 활성을 나타내지만, 생체내에서는 혈행에서의 안정성 감소와 신속한 정혈작용으로 인해 완전한 활성을 나타내지 않는다는 점이다. 천연 분자(70 내지 80kDa) 외에도 여러 형태의 순환성 TPO가 부분 단백분해작용의 결과로서 존재한다는 것이 개시되어 있고, 그 예로는 모두 C-말단 도메인(9, 11 및 12)에서 절두된 형태인 30kDa, 25kDa 및 18kDa 형태가 있다. 현재 시판되는 FDA(미국식품의약청)의 승인을 얻은 혈소판형성 활성을 가진 유일한 인자는 인간 재조합 IL-11이다.

일반적으로, 본 발명은 다음과 같은 것에 관한 것이다.

제1 관점으로, 본 발명은 포유동물 숙주 세포에서 복제할 수 있는 발현 벡터를 제공한다. 이 벡터는 다음의 작동가능하게 결합된 구성요소를 포함한다: 1) 전사 프로모터; 2) 천연 hTPO의 분비 리더 또는 시그널 펩타이드를 암호화하는 제1 DNA 분절; 3) 완전한 hTPO 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 DNA 분절; 4) 전사 인헨서; 5) 폴리아데닐화 시그널 및 6) 전사 터미네이터.

제2 관점으로, 본 발명은 전술한 바와 같은 DNA 작제물을 함유하는 배양된 진핵세포주를 제공한다. 세포주로는 포유동물 세포가 바람직하다.

제3 관점으로, 본 발명은 형질세포 기원의 뮤린 세포주를 전술한 발현 벡터로 형질감염시키는 것을 포함하는 hTPO 생산 방법을 제공한다. 즉 상기 세포주는 천연 대응물과 동일한 생물학적 활성의 인간 재조합 hTPO(rhTPO)를 합성하여 분비할 수 있는 능력이 있어야 한다.

도 1 은 발현벡터 pK-eTPO 구조의 도식적 지도,

도 2 는 클론 2A4로부터 선발된 서브클론 16의 Anti-hTPO 웨스턴 블롯,

도 3 은 인간 hTPO로부터 상청액에 의해 배양된 시험관내 CD41의 유동세포분석 결과이다.

본 발명을 상세히 설명하기 이전에 본 발명의 이해를 돕기 위하여 본 발명에 사용된 일부 용어와 절차에 대하여 간략하게 설명하면 다음과 같다:

-트롬보포에틴(TPO): 정상 개체의 간세포와 신장세포에서 주로 생성되는 당단백질로서, 혈소판 생성을 자극하는 동종 유래의 Mpl 수용체에 특이적으로 결합할 수 있다. Mpl 수용체는 분화다능성 줄기 세포인 거대핵세포 및 혈소판에 주로 존재한다. 어간 "h"는 인간 TPO(hTPO)를 나타내는 것이다. hTPO란 용어는 천연 분자의 정성적인 생물학적 활성(수용체 결합 및 생체내 혈소판 생성 자극)을 나타내는 전장의 트롬보포에틴 분자를 포함한다.

-재조합 단백질: 특정 기원의 세포가 정상적으로는 생산하지 않는 단백질을 생산하기 위하여 재조합 DNA 기법을 통해 유전자 변형된 경우에는 재조합 단백질이라는 용어가 필요하다. 일반적으로 어간 "r"은 재조합 생체분자인 것을 의미한다.

-cDNA(상보성 데옥시리보핵산): DNA 폴리머라제가 RNA를 주형으로 이용하여(역전사효소) 역전사라고 불리는 과정에 의해 수득되는 리보핵산(RNA)의 상보성 복사체를 나타낸다. cDNA는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다.

-발현 벡터: 당해의 폴리펩타이드를 암호화하는 분절이 전사를 위한 추가 분절에 작동가능하게 결합되어 있는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 상기 추가 분절로는 프로모터와 터미네이터 서열이 있다. 발현 벡터는 또한 1 또는 그 이상의 복제 오리진, 1 또는 그 이상의 선택 마커, 인헨서, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA에서 유래하는 것이거나 또는 그 두 인자를 모두 포함할 수 있다. "작동가능하게 결합된"이란 용어는 분절들이 일제히 목적한 용도를 위해 기능하도록 배열된 것, 예를 들어 전사가 프로모터에서 개시하여 암호 분절을 통해 터미네이터로 진행되는 것을 나타낸다. 숙주에서의 발현 벡터의 복제는 자율적이거나 숙주 게놈에 통합되어 이루어질 수도 있다.

-리더 또는 시그널 서열: 분비성 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이다. 시그널 서열은 또한 리더(leader) 또는 프리프로(prepro) 서열이라고도 불린다. 분비성 펩타이드는 세포로부터 성숙한 폴리펩타이드 또는 단백질의 분비를 유도하는 작용을 하는 아미노산 성려이다. 분비성 펩타이드는 소수성 아미노산으로 이루어진 코어를 특징으로 하며, 일반적으로(절대적인 것은 아님) 새로 합성된 단백질의 아미노 말단에서 발견되어진다. 흔히 분비성 펩타이드는 분비되는 동안 1 또는 그 이상의 절단 과정에 의해 성숙 단백질로부터 절단된다. 이와 같은 분비성 펩타이드는 분비 경로를 통해 통과할 때 성숙 단백질에서 분비성 펩타이드로 절단을 허용하는 가공 부위를 갖고 있다.

-프로모터: 유전자 전사를 개시하고 대응하는 전령 RNA를 생성하기 위하여RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 DNA 서열을 의미한다.

-형질감염: 진핵 세포에 의해 정상적으로 생성되지 않는 단백질을 생성할 수 있는 DNA 작제물을 도입시킴으로써 그 세포를 유전자 변형시키는 과정을 의미한다. 그 결과 얻어지는 세포는 "형질감염된 세포"라고 한다.

본 발명은 생물학적 활성이 확인된 인간 재조합 TPO를 수득하기 위한 물질 및 그 일반적 실험 과정이 다음과 같은 상기 인간 재조합 TPO를 수득하기 위해 사용되는 방법을 제공한다:

1. 간담즙 수술을 받은 지원한 공여자로부터 수득한 정상인의 간으로부터 총 RNA를 분리하였다.

2. 이 RNA로부터 역전사 과정에 의해 총 cDNA를 수득하고, 이 cDNA로부터 특정 프라이머(표 II)를 사용하여 hTPO의 전체 서열을 증폭시켰다.

3. 인간 트롬보포에틴의 발현과 생성을 유도하기 위하여 진핵 세포에 도입될 수 있는 형태로 hTPO의 특정 cDNA를 함유하는 발현 벡터를 작제하였다.

4. 이 벡터를 통상적인 전기침투 기법으로 시험관내에서 배양할 수 있는 포유동물 세포주에 도입시켰다.

5. 세포가 증식되는 인공 배지에 네오마이신 항생제를 첨가하였다. 네오마이신 항생제에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 보유하는 발현 벡터가 성공적으로 혼입된 세포를 선발하였다.

6. 한계 희석법으로 발현 벡터를 보유하는 각 세포를 선별하였다. 재조합 인간 트롬보포에틴을 유의적 함량으로 생산하는 세포를 "클론"이라 부른다.

7. 클론의 생물학적 활성을 배양 상청액을 이용하여 시험관내 및 생체내 분석을 통해 a) 시험관내 배양물에서 조혈 전구체에서 거대핵세포로의 분화; b) TPO 의존성 세포주의 증식; c) 혈소판감소증 동물에서 순환성 혈액 혈소판의 증가(혈소판 자극의 생체내 자극)을 양자택일로 유도하는 성질에 대하여 시험하였다.

NM 000460으로 표시된 뉴클레오타이드 서열 및 성숙 hTPP에 상응하는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열은 표 I에 나타내었다(5). 이 서열 NM 000460과 서열번호 1은 여러 대립유전자 변형체가 존재할 수 있는 hTPO의 하나의 대립유전자를 나타낸 것이다. 이와 같은 변형체는 클로닝된 세포, 인간 조직 또는 DNA 제조물로부터 수득할 수 있다. 이 서열을 사용하여 특정 TPO 물질을 증폭시키고 이후 클로닝과 정제에 필요한 프라이머를 수득한다. 본 발명에서는 정상 간 조직에서 시그널 펩타이드를 포함하는 전체 hTPO에 상응하는 cDNA를 클로닝하여 얻었다. 본 발명에서는 이 서열의 부분 단편이나 변형된 단편을 사용하지 않았다.

전술한 바와 같은 본 발명에서 작제한 발현 벡터(포유동물 세포에서 복제가능한)는 a) 인간 B 림프구의 게놈 라이브러리에서 얻어지는 인간 면역글로불린의 카파쇄 유래의 가변 유전자로부터 얻은 전사 프로모터; b) hTPO의 특정 시그널 펩타이드를 암호화하는 DNA의 제1 분절; c) 전장의 성숙 hTPO 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA의 제2 분절; d) 인간 카파 유전자(인간 B 림프구의 게놈 라이브러리에서 수득) 유래의 인트론 영역에서 얻은 전사 인헨서; e) 폴리아데닐화 시그널; f) 전사 종결인자; g) 박테리아계에서 선택 마커로 사용되는 앰피실린 내성 유전자의 전체 서열; h) 진핵세포계에서 선택 마커로 사용되는 네오마이신 내성 유전자의 전체서열; i) 박테리아에서 팽창시키기 위한 박테리아 복제 오리진을 연속적으로 포함한다. 성숙 hTPO 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분절의 전사 및 형질도입 결과 직접 얻어지는 생성물은 무엇보다도 "N-결합된 글리코실화 또는 O-결합된 글리코실화"라고 불리는 화학적 결합을 통한 탄수화물의 결합을 비롯하여 상이한 화학적 그룹을 첨가하는 도입후 프로세싱에 따라 달라질 수 있다. 이와 같은 도입후 변형의 정확한 특성은 대부분 재조합 hTPO를 생산하는데 사용된 숙주 세포의 종류에 따라 결정되지만, 이것에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에 사용하기에 적합한 숙주 세포로는 유전자조작으로 이종 DNA를 발현할 수 있고, 배양물에서 증식할 수 있으며 효율적인 분비 경로를 갖고 있는 모든 종류의 진핵세포를 포함한다. 이와 같은 조건을 충족시키는 바람직한 세포는 당해 기술분야에 공지되어 있고 미국 매릴랜드주 로크빌에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)와 같은 인정받은 기탁기관에서 입수용이한 뮤린의 골수종 세포 유래의 세포가 있다. 참고적으로 세포주 X-63[P63X63Ag.563(ATCC 번호 CRL-1580)] 및 SP2(ATCC 번호 CRL-1581 및 CRL-8287)가 있다. hTPO 폴리펩타이드를 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위하여 hTPO 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열과 함께 분비 리더를 암호화하는 DNA 서열을 사용한다. 본 발명에서 사용한 시그널 펩타이드는 천연 hTPO(표 I에 제시된 서열번호 1에 진한 글씨로 나타낸 아미노산 서열)에 상응하는 것이다. 일반적으로, 강한 전사 프로모터가 필요한데, 그 예로는 참고적으로 본 명세서에 제시된 면역글로불린, SV40, 아데노바이러스 또는 사이토메갈로바이러스 유래의 바이러스 프로모터 등이 있다.

약물 선발은 발현 벡터가 성공적으로 혼입된 포유동물 배양 세포를 선발하는데 널리 사용되는 방법이다. 이와 같은 세포를 일반적으로 "형질감염체"라고 부른다. 선발제의 존재하에 배양되어 당해의 유전자를 자손에게 계승시킬 수 있는 세포를 "안정한 형질감염체"라고 부른다. 바람직한 선발용 마커는 항생제 네오마이신에 대한 내성을 암호화하는 유전자이다. 선발은 G-418 등과 같은 네오마이신형 약물의 존재하에 실시한다. 또한, "증폭"이라고 불리는 당해 유전자의 발현율을 증가시키는 선발계를 사용할 수도 있다. "증폭"은 소량의 선발제의 존재하에 형질감염체를 배양한 뒤 도입된 유전자의 생성물을 다량으로 생산하는 세포를 선발하기 위한 선발제의 함량을 증가시켜 실시한다. 사용할 수 있는 다른 약물 내성 유전자로는 하이그로마이신, 다중 약물 내성 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소 및 퓨로마이신 아세틸트란스퍼라제 등이 있다.

외인성 DNA를 포유동물 세포로 혼입시키기 위한 방법에는 여러가지가 있다. 특히 a) 인산칼슘 매개의 형질감염; b) 전기침투(14); c) DEAE-덱스트란 매개의 형질감염(Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987) 및 d) 양이온성 지질 매개의 형질감염이 있다. 본 발명에 사용되는 바람직한 방법은 전기침투이다. 형질감염된 세포는 혼입된 외인성 DNA를 가진 세포를 선발하는데 필요한 항생제는 물론 세포 성장에 필요한 필수 영양소를 포함하는 통상의 배지에서 배양시킨다.

본 발명에 따라 제조한 hTPO 폴리펩타이드는 혈소판 생성을 증가시키기에 바람직하다면 치료적으로 사용할 수 있으며, 그 예로는 재생불량성 빈혈, 척수이형성증후군, 화학요법이나 선천성 혈소판감소증을 비롯한 여러 질환에 의해 유도되는 혈소판감소증의 치료에 사용할 수 있다.

혈소판감소증은 순환성 혈액 혈소판 수의 감소를 특징으로 하며 피부 및 점막 출혈 증가로서 확인된다. 혈소판 수의 감소는 예를 들어 혈소판 생성 결함, 비정상적 혈소판 분배, 대량 수혈에 의한 희석성 상실 또는 비정상적 혈소판 파괴 등에 의해 일어날 수 있다. 또한, 특정 악성종양이 혈소판 생산과 혈소판 분배를 손상시킬 수 있다. 악성세포를 사멸시키는데 사용되는 방사선 요법 역시 혈소판 선조 세포를 사멸시킨다. 혈소판감소증은 또한 약물이나, 신생아 동종이계면역성 또는 혈소판 수혈 동종이계면역성에 의해 유도되는 다양한 혈소판 자가면역 질환에 의해 유발될 수도 있다. hTPO 폴리펩타이드는 수혈의 필요성을 감소시키거나 제거하여 혈소판 동종이계면역성의 발병률을 감소시킬 수 있다. 혈소판의 비정상적 파괴는 1) 혈관 이식편 또는 외상을 입은 조직에서의 혈소판 소비 증가; 또는 2) 약물에 의해 유도된 혈소판감소증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP), 자가면역 질환, 백혈병과 림프종 등의 혈액 질환 또는 골수와 연관된 전이성 암으로부터 나타날 수 있다. hTPO의 다른 징후로는 예를 들어 화학요법이나 AZT를 이용한 HIV 감염의 치료시 나타나는 재생불량성 빈혈증 및 약물에 의해 유도된 골수 억제가 있다.

rhTPO는 또한 SCF, IL-3, IL-6, IL-11 또는 GM-CSF와 같은 다른 사이토킨들과도 관련이 있을 수 있다. rhTPO의 치료적 용량은 1일당 0.1 내지 100 ㎍/㎏ 범위(바람직하게는 1일당 0.5 내지 50 ㎍/㎏ 범위)이다. 정확한 용량은 각각의 특정 케이스 마다 임상적 평가로 결정해야 한다. rhTPO는 화학요법이나 골수 이식 후28일 동안 투여하거나 또는 혈소판 수가 20,000/㎕ , 바람직하게는 50,000/㎕ 을 초과할 때까지 투여한다.

rhTPO 폴리펩타이드는 조혈 세포의 분화 및 발생에 관한 시험관내 연구에 중요한 도구로서, 예컨대 세포 분화의 기작을 해명하고 성숙 세포 계열을 결정하는데 유용하며, 또한 세포 배양물에서 증식제로서 유용하게 사용될 수 있다.

rhTPO 폴리펩타이드는 또한 자기유래의 골수 배양물과 같은 생체외에서 사용될 수 있다. 간략히 설명하면, 화학요법과 선택적으로 1 또는 그 이상의 다른 사이토킨과 함께 rhTPO 폴리펩타이드의 치료를 받기 이전의 환자로부터 골수를 분리한다. 처리된 골수를 화학요법 후 환자에게 투여하여 골수 회복 속도를 가속화시킨다. 또한, rhTPO 폴리펩타이드는 골수 또는 말초혈액 선조 세포(PBPC)의 생체외 증식을 위해 사용할 수도 있다. 화학요법으로 치료하기 전에 골수를 줄기 세포 인자(SCF) 또는 G-CSF로 자극하여 말초 혈행내로 조기 선조세포를 방출시킬 수 있다. 이와 같은 선조세포를 말초 혈액으로부터 수거하여 농축한 뒤, 배양물 상태에서 1종 또는 그 이상의 rhTPO 폴리펩타이드로 처리하고, 경우에 따라 비제한적으로 SCF, G-SCF, IL-3, GM-CSF, IL-6 또는 IL-11을 비롯한 1종 또는 그 이상의 다른 사이토킨을 더불어 처리하여 거대핵세포가 고농도인 배양물로 분화 및 증식시킨 다음, 고용량의 화학요법 치료를 받은 환자에게 투여할 수 있다.

다른 가능한 rhTPO의 용도로는 자가면역성 혈소판감소증에서 입증된 바 있는 항TPO 항체의 존재를 측정하기 위한 여러 진단법에 사용할 수 있는 용도가 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명은이에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1

hTPO의 특정 cDNA를 수득하기 위한 정상인의 간 조직 유래의 mRNA 제조

정상인의 간조직 단편(50mgrs)을 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 이 과정은 구아니딘 티오시아네이트 페놀-클로로포름을 이용한 고전적 방법을 사용하여 실시하였다. 총 RNA의 순도와 농도는 260/280 흡광도비로 측정하였다.

실시예 2

hTPO에 특이적인 mRNA를 이용한 cDNA 합성(역전사)

역전사에 의한 cDNA의 제1 가닥의 합성은 합성 올리고(dT)_12-18및 역전사효소(SuperScript^TMII, Gibco-BRL-Life Technologies)를 사용하여 총 RNA 5㎍으로부터 실시하였다. 이 분석에서는 5x 완충액(250mM Tris-HCl pH 8.3; 350mM KCl; 15mM MgCl₂; 0.1M DTT) 4㎕; 올리고(dT) 500㎍/㎖, 1㎕; 0.1M DTT 2㎕; 10mM dNTP 1㎕; 총 ARN 5㎍ 및 최종 20㎕의 H₂O를 함유하는 총 부피가 20㎕ 인 용액에서실시하였다.

실시예 3

전체 hTPO를 암호화하는 특정 cDNA의 증폭

당해의 서열을 "네스티드(nested) PCR" 기법(폴리머라제 연쇄 반응)을 사용하여 증폭시켰다. 구체적으로, 특이성과 충실성이 높은 성숙 단백질을 암호화하는 서열을 증폭시키기 위하여 이중쌍 프라이머와 열안정성 DNA 폴리머라제 복합물을 디자인하여 실시하였다. 이와 같은 관점에서 고 충실성의 증폭계를 사용하였다. 이 시스템은 Taq 폴리머라제와 Pow DNA 폴리머라제(EHF; Expand^TMHigh Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim)를 적당히 혼합하여 구성하였다. 2회의 증폭에서 사용한 프라이머의 서열은 표 II에 제시하였다. 증폭 반응은 다음 성분을 첨가하여 총 100㎕ 부피의 용액중에서 실시하였다:

- 2㎕ (dNTP 200μM)

- 3㎕(10mM 순방향 프라이머)

- 3㎕(10mM 역방향 프라이머)

- 10㎕(10x 완충액)

- 0.75㎕(열안정성 폴리머라제 EHF)

- 5㎕(cDNA)

- 76.25㎕(H₂O)

1차 증폭은 외부 프라이머 TPO_EXT-FOW와 TPO_EXT-REV(표 II A 참조)를 사용하여 다음과 같은 30회의 증폭 사이클(미리 95℃에서 2분동안 항온처리함)로 반응시켜 실시하였다:

- 1 내지 10회 사이클 : 95℃, 30초; 58℃,30초; 72℃,120초.

- 10 내지 20회 사이클 : 95℃,30초; 58℃,30초; 72℃,240초.

- 20 내지 30회 사이클 : 95℃,30초; 58℃,30초; 72℃,360초.

- 최종 신장 단계: 72℃,10분.

2차 증폭은 1차 증폭 반응에서 사용한 cDNA 5㎕ 를 1차 증폭 반응물의 2㎕ 대신 사용하는 것을 제외하고는 동일한 조건하에 내부 프라이머 TPO_FOW및 TPO_REV(표 II B 참조)를 사용하여 실시하였다. 95℃에서 2분 동안 항온처리한 뒤, 20회 사이클의 증폭 반응 조건은 다음과 같다:

- 1회 내지 10회 사이클: 95℃, 30초; 62℃,30초; 72℃,120초.

- 10 내지 15회 사이클 : 95℃,30초; 62℃,30초; 72℃,240초.

- 15 내지 20회 사이클 : 95℃,30초; 62℃,30초; 72℃,360초.

- 최종 신장 단계: 72℃,10분.

실시예 4

클로닝할 hTPO의 증폭 cDNA의 정제 및 제조

증폭된 생성물은 저융점(1%)의 아가로스 겔을 이용한 전기영동으로 분리 및 동정하였다. 1107 염기쌍의 밴드를 함유하는 겔 단편을 절단하여 DNA를 분리 및 정제하였다(Nucleiclean, Sigma). 이것은 아가로스를 용해시킬 수 있으면서 요오드화나트륨 포화 매질에서 DNA를 강하게 결합시키기 위하여 섬유유리 미소구의 용적을 이용하는 기법을 이용하여 실시하였다(16). DNA는 페놀/클로로포름으로 추출하고, 세척한 뒤, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 H₂O 10㎕에 재현탁시켰다. A-T 벡터에 클로닝하기 위해 3'OH 말단에 아데닌 뉴클레오타이드를 첨가하기 위하여, 정제한 단편을 Taq DNA 폴리머라제, 완충액 및 dATP와 함께 72℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 페놀/클로로포름 추출법을 사용하여 단편을 다시 추출하고 정제한 뒤, 에탄올로 침전시킨 다음 H₂O 20㎕ 에 재현탁시켰다. cDNA 단편을 결합시키고 A-T 클로닝 벡터계에 클로닝하였다.

실시예 5

A-T 클로닝 벡터계로의 증폭된 cDNA 단편의 클로닝

실시예 4에서 얻은 정제한 단편을 pCR2.1 플라스미드(Original TA Cloning Kit; Invitrogen)에 결합시켰다. 결합은 다음과 같이 식염수 배지에서 T4 DNA 리가제(Boehringer Mannheim), pCR2 벡터 및 정제한 cDNA hTPO를 사용하여 실시하였다:

- 실시예 4에서 정제한 TPO 단편 2㎕

- 10x 결합 완충액 1㎕

- pCR2.1 벡터(25ng/㎕)

- T4 DNA 리가제(4 유닛) 1㎕

- H₂O 4㎕.

효소적 결합반응은 14℃에서 16시간 동안 항온처리하여 실시하였다.

이와 같이 결합된 플라스미드를 이용하여 컴피턴트 대장균 균주(One Shot^TMTOP10F'; Invitrogen)를 형질전환시켰다. 이 벡터를 사용하여, a) 앰피실린 내성 유전자의 존재를 이용하여, 플라스미드를 포함하는 박테리아 콜로니를 동정하고; b) hTPO를 암호화하는 cDNA 삽입체를 함유하는 플라스미드를 가진 박테리아 콜로니를 동정하며[ 이는 IPTG(이소프로필티오-β-갈락토사이드) 유도성인 벡터 중의 lacZα 유전자의 존재에 따라 X-Gal 가수분해에 의해 백/청을 나타내는 박테리아 콜로니를 추적하여 동정함] ; c) LB(루리아-버타니) 미량배양에 의하여 양성 박테리아 콜로니로부터 다량의 플라스미드(미량제조물)를 분리하여 제한 분석을 실시하고, M13 프라이머를 사용하여 삽입체를 서열분석하여 서열을 입증한다.

제한 분석 후 10개의 양성 콜로니를 수득하여, 상호관련있게 pCR2 TPO-1 에서부터 pCR2 TPO-10으로 지칭하였다.

분리한 콜로니는 다음과 같이 3 그룹으로 구별하였다:

- 종래 TPO2라고 불린 이성체(17)와 동일한 12 염기가 결실된(4aa) hTPO의 대응 서열과 정합하는 클론 pCR2-1, 2-2, 2-4 및 2-9.

- 아미노산 치환 없이 천연 hTPO의 전체 서열과 정합하는 클론 pCR2-5, 2-6,2-7, 2-8 및 2-10.

- 전술한 이성체 TPO3(17)과 동일한 116bp의 결실이 있는 hTPO의 대응 서열과 정합하는 클론 pCR2-9.

삽입체는 정확하기 동정하기 위하여 생거와 동료(18)의 방법에 따라 서열분석하였다. 서열분석은 DNA 양가닥 상에서 완전하게 실시하였다.

클론 pCR2 TPO-5에 상응하는 플라스미드 제조물을 선택하여 다음 실험을 계속하였다.

실시예 6

성숙 hTPO(pK-eTPO)를 암호화하는 서열을 가진 벡터 디자인

다음과 같은 특성을 가진 진핵세포 발현 벡터를 작제하였다:

1. 네오마이신(G-418)을 함유하는 배지에서 양성의 형질감염된 세포를 선발하기 위한 네오마이신 내성 유전자(Neo^r)

2. 면역글로불린 유전자의 프로모터 서열

3. 제한 부위 ClaI 및 NotI을 함유하는 클로닝된 영역

4. 인간 면역글로불린 전사 인헨서

5. 대장균의 원핵세포 복제 오리진(colE1 ori)

6. 앰피실린 내성 유전자(Amp^r)

7. SV40 유래의 진핵세포 복제 오리진(SV40 ori)

이 섹터들은 모두 논리적으로 정렬시켜 대응 rhTPO 유전자를 정확하게 전사 및 도입시켰다. 발현 벡터의 작제는 pK로 확인하고 도 1에 도식으로 나타내었다.

실시예 7

성숙 hTPO를 암호화하는 서열을 사용한 진핵세포 발현 벡터의 작제(pK-eTPO)

hTPO를 암호화하는 DNA 단편을 보유하고 서열이 완전히 확인된 pK 발현 벡터의 작제는 pK-eTPO라 불렀다. 모든 기능적 분절을 포함하는 pK-eTPO 구조의 도식적 지도는 도 1에 제시하였다. 작제는 다음과 같은 실험 단계들로 실시하였다:

단계 1

먼저, ClaI 및 NotI 제한 부위를 포함하는 발현 프라이머를 디자인하였고(표 II C 참조), Cla-eTPO_FOW및 Not-eTPO_REV라고 지칭하였다. 이 프라이머들은

1) pCR2 TPO-5에서 얻은 클로닝 벡터에 함유된 hTPO를 암호화하는 서열을 증폭시키고,

2) 효소적 결합 반응 후 pK 벡터내에 시그널 펩타이드를 비롯하여 hTPO를 암호화하는 전체 서열을 도입시키기 위하여 2개의 제한 부위(ClaI 및 NotI)를 도입시킨다.

pCR TPO-5에 함유되어 있고 ClaI 제한 부위와 NotI 제한 부위를 포함하도록 변형시킨 hTPO 증폭 단편은 eTPO-5라 지칭하였다. 증폭 반응은 다음과 같은 성분을 포함하는 총 부피 50㎕의 용액(Taq DNA 폴리머라제 키트; Gibco BRL-Life Technologies)에서 실시하였다:

- 2.5㎕(dNTP 10mM)

- 2.5㎕(Cla-eTPO_FOW10mM)

- 2.5㎕(Not-eTPO_REV10mM)

- 5㎕(10X 완충액)

- 0.5㎕(Taq 폴리머라제)

- 5㎕(pCR2 TPO-5 1/100,000 희석액)

- 1.5㎕ MgCl₂(50mM)

- 30.5㎕(H₂O)

항온처리 조건: 95℃에서 4분간 1회 사이클; 95℃에서 30초, 65℃에서 30초, 72℃에서 30초간 25회 사이클; 마지막으로 72℃에서 10분간 1회 신장 사이클.

단계 2

증폭된 생성물을 분리하고 저융점(1%) 아가로스 겔에서의 전기영동 기법을 사용하여 동정하였다. 1090bp의 밴드를 함유하는 겔 부분을 절단하고, DNA를 분리 정제하였다(Nucleiclean, Sigma). 이것은 아가로스를 용해시킬 수 있으면서 요오드화나트륨 포화 매질에서 DNA를 강하게 결합시키기 위하여 섬유유리 미소구의 용적을 이용하는 기법을 이용하여 실시하였다(16). DNA는 페놀/클로로포름으로 추출하고, 세척한 뒤, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 H₂O 15㎕에 재현탁시켰다.

단계 3

정제된 eTPO 단편을 pCR2-1 벡터에 결합시켜 다음과 같은 반응 도식에 따라 천연 hTPO와 상기 단편의 완전한 동일성을 입증하기 위한 효소적 제한 분석과 뉴클레오타이드 서열분석을 실시하였다:

- 1㎕ eTPO 단편

- 1㎕ 10X 결합 완충액

- 2㎕ pCR2.1 벡터(25ng/㎕)

- 1㎕ T4 DNA 리가제(4 유닛)

- 5㎕ H₂O

이 반응액을 4℃에서 16시간 동안 항온처리하였다. 그 결과 얻어지는 결합 생성물을 사용하여 컴피턴트 대장균 균주(One Shot^TMTOP10F'; Invitrogen)를 형질전환시키고 판매자의 기술적 설명에 따라 증식시켰다. eTPO 삽입체를 보유하는 정확한 플라스미드를 함유하는 6개의 박테리아 콜로니를 동정하고 분리하였다. 이것을 pCR2-eTPO 1 내지 6이라고 불렀다. 이들 각각을 앰피실린을 첨가한 LB 배지에서 미량배양하여 플라스미드 물질을 분리하였다(미량제조물).

단계 4

삽입체 eTPO-1 내지 6을 동정하고 서열분석하였다. 이는 BamHI 제한 프로필을 사용하여 실시한 뒤, 자동 서열분석기(ALF-EXPRESS; Pharmacia)를 이용하여 생거와 동료들(18)이 제시한 방법에 따라 서열분석하여 양 DNA 가닥의 전체 뉴클레오타이드 서열을 증명하였다. 표 I은 서열 NM000460(Sauvage et al., 1994)과 비교했을 때 pCR2-eTPO2 플라스미드에 상응하는 "ETPO"로 확인된 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 것이다. 제시된 바와 같이 수득된 서열은 참조군으로 사용한 서열과 동일하였다. pCR2-eTPO2 플라스미드를 선발하여 후속 단계를 실시하였다.

단계 5

진핵세포의 pK 발현 벡터를 ClaI 및 NotI으로 효소적 분해한 뒤, eTPO 단편에 결합시켰다. 분해를 일으키기 위하여 다음과 같은 효소적 반응액을 37℃에서 4시간 동안 항온처리하였다:

- 벡터 pK 플라스미드 제조물 10.0㎕

- Cla I 효소 제조물(Sigma) 2.0㎕

- Not I 효소 제조물(Sigma) 1.5㎕

- 10X 완충액 5.0㎕

- H₂O 31.5㎕

효소 분해후 선형화된 벡터를 저융점 아가로스 겔(1%)을 이용한 전기영동 기법에 따라 분리하고 동정하였다. 벡터를 포함하고 있는 영역을 절단하여 DNA를 투석막을 이용한 전기용출로 분리 및 정제하였다. 페놀/클로로포름으로 DNA를 추출하고, 세척한 뒤 에탄올 침전시키고 마지막으로 H₂O 15㎕에 재현탁시켰다.

단계 6

pCR2-eTPO2를 ClaI 및 NotI으로 효소적 분해하여 eTPO 단편을 수득하였다. 분해를 일으키기 위하여 다음과 같은 효소적 반응액을 37℃에서 4시간 동안 항온처리하였다:

- pCR2-eTPO2 플라스미드 제조물 5.0㎕

- Cla I 효소 제조물(Sigma) 2.0㎕

- Not I 효소 제조물(Sigma) 1.5㎕

- 10X 완충액 5.0㎕

- H₂O 36.5㎕

효소 분해후 선형화된 벡터를 저융점 아가로스 겔(1%)을 이용한 전기영동 기법에 따라 eTPO2 단편으로부터 분리하였다. eTPO2 단편을 포함하고 있는 겔 영역을 절단하고, 아가로스를 용해시킬 수 있으면서 요오드화나트륨 포화 매질에서 DNA를 강하게 결합시키기 위하여 섬유유리 미소구의 용적을 이용하는 기법을 이용하여 DNA를 분리 및 정제하였다(16). DNA는 페놀/클로로포름으로 추출하고, 세척한 뒤, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 H₂O 15㎕에 재현탁시켰다.

단계 7

eTPO-2 정제된 단편과 pK 벡터의 결합은 공급자의 기술적 설명에 따라서 T4 DNA 리가제(Pharmacia)를 사용하여 실시하였다. 결합 생성물은 pK-eTPO라 불렀으며, 페놀/클로로포름 추출법을 사용하여 정제하고, 에탄올로 침전시킨 뒤 마지막으로 H₂O 15㎕에 재현탁시켰다.

단계 8

작제된 pK-eTPO를 이용한 대장균(균주 XL1)의 형질감염은 전기침투로 실시하였다. 1㎜ 큐벳에 단계 7에서 얻은 정제한 결합물 2㎕와 함께 전기컴피턴트 XL-1 균주 40㎕를 첨가하였다. 저항이 129Ω이고 정전용량이 50μM인 1380v 펄스를 5msec 동안 유발시켰다. 이 자극 후 LB 배지 800㎕를 첨가하였다. 200rpm으로 진탕되는 진탕식 항온배양기에서 37℃에서 45분간 항온처리한 후 LB 아가 앰피실린 접시에 접종하였다.

2개의 양성 콜로니를 분리하고 LB 앰피실린 배지에서 하룻밤동안 미량배양물로 증식시켰다. 통상의 방법("미량제조물")을 사용하여 플라스미드를 추출하고, 증폭 및 제한 효소 분석을 사용하여 삽입체를 입증하였다. 이와 같이 하여 pK-eTPO의 정제 플라스미드 분획을 수득하였다.

실시예 8

PvuI을 이용한 pKeTPO 벡터의 선형화 및 형질감염된 포유동물 세포주의 선발

pK-eTPO를 수득한 후 X-63으로 알려진 뮤린 골수종 유래의 포유동물 세포주(P3X63Ag8.653, ATCC No CRL1580)를 선발하였으나, 사실상 포유동물 유래의 모든 세포를 이 발현 플라스미드와 함께 사용할 수 있다. 여러 세포주 중에서 상기 세포주를 선발한 이유는 다음과 같은 잇점 때문이다: a) 면역글로불린 전사 인헨서에 결합된 면역글로불린 유전자의 프로모터를 포함하기 때문에 본 발명에서 디자인된 발현 벡터에 완전하게 적합한 고효율의 단백질 합성 및 분비 시스템을 갖고 있다. 또한, 태내 송아지 혈청(FBS) 10%가 보충된 RPMI-1640과 같은 시험관내 배양 배지에서 무한 증식할 수 있다. 다음과 같은 반응액에 따라 Pvu I (Boehringer Mannheim)로 pKeTPO 벡터를 선형화시켰다:

- 플라스미드 pKeTPO 분획 20㎕

- 완충액 H(10x) 5㎕

- PvuI 2㎕

- H₂O 23㎕

이 반응액을 37℃에서 4시간 동안 항온처리하고 생성물을 페놀/클로로포름추출법으로 정제한 뒤 에탄올로 침전시키고 마지막으로 H₂O 10㎕에 회수하였다.

실시예 9

pKeTPO 벡터를 이용한 X-63 세포의 형질감염

실시예 8에 기재된 포유동물 세포(X-63)를 10% FBS가 보충된 RPMI-1640(Gibco BRL-Life Technologies)에서 시험관내 증식시킨 뒤, FBS가 첨가되지 않은 RPMI-1640으로 세척하였다. 그 다음, FBS가 첨가되지 않은 RPMO 1640 800㎕에 세포 1.5x10⁶을 재현탁시켰다. 그 다음, 세포 800㎕를 2㎜ 전기침투 큐벳에 넣고 pKeTPO 플라스미드 10㎍을 첨가하였다. 전기침투(BTX Electroporation System 600; Genetronics Biomedical LTD)는 다음과 같은 조건하에 13msec 동안 실시하였다:

- C: 1200μF; R: 48Ω; V: 210V; E: 1.050kV/㎝

전기침투된 세포를 20% FBS가 보충된 RPMI 1640에서 37℃와 5% CO₂하에 24시간 동안 배양하였다.

실시예 10

rhTPO를 생산하는 클로닝된 세포의 선별 및 선발

실시예 9에 기재된 바와 같이 세포를 형질감염시킨 후, 네오마이신(1㎎/㎖)으로 3가지 배양 그룹으로 분류하였다. 기본 배양 배지로는 10% FBS와 스트렙토마이신-페니실린(각각 50mcg/㎖ 및 100UI/㎖), 2mM L-글루타민, 1μM 피루브산 나트륨 및 10mM Hepes가 보충된 RPMI 1640(성장배지)을 사용하였다. 배양 배지를 매주 변화시키면서 15일간 증식시킨 후, 상청액 중의 rhTPO 분비량을, 항hTPO 항체(RDI;Research Diagnostics, Inc.)를 이용한 웨스턴 블롯을 실시하여 분석하였다. 음성 대조군으로는 pK 카파 벡터로 형질감염된 X-63 세포의 상청액을 사용하였다. 이 절차는 rhTPO 삽입체 대신 인간의 면역글로불린 카파쇄를 포함하는 TPO를 사용하여 동일하게 실시하였다.

배양물 II의 상청액은 rhTPO에 대해 약한 양성을 보였고, 한계희석(세포 희석: 0.3 세포/웰를 20% FBS와 1㎎/㎖ 네오마이신이 보충된 RPMI 1640을 이용하여 96웰 평판에 주입함)으로 클로닝을 실시하였다. 15일 후, 58개의 네오마이신 내성 클론을 분리하였다. 상청액을 처리하여 웨스턴 블롯으로 rhTPO 존재를 평가하였다. 이 분석 결과 rhTPO를 생산하고 분비하는 16개 클론의 존재를 확인하였다. 배양 상청액에서 유의적인 양의 rhTPO가 검출되는 2A4라고 지칭한 클론을 분리하고 다시 한계 희석으로 클로닝하여 클론성을 확인하였다.

도 2에 도시된 바와 같이, 웨스턴 블롯 분석 후 2A4로부터 서브클론 16을 선발하여 서브클론 24A-16으로 지칭하였다. 중단함이 없이 8주간 배양한 후 서브클론 24A-16을 이용한 rhTPO의 생산 안정성을 시험하였다(도 2). 24A-16으로 지칭한 X-63 세포 유래의 클론이며 안정한 방식의 가용성 rhTPO의 생산자는 클론 X-63 eTPO라 지칭하였다.

실시예 11

X-63 eTPO 발현계에서 생산되는 rhTPO의 존재 및 생물학적 활성 분석

생물학적 활성 시험 분석은 10% FBS가 보충된 RPMI 1640의 존재하에 0.6x10⁶세포/배양물의 농도인 X-63eTPO 배양물 상청액을 사용하여 시험관내에서 실시하였다:

- ELISA를 이용하여 TPO 농도의 측정: 인간 TPO용 키트(Quantikine, R&D Systems)를 사용하여 ELISA 시험을 실시하였다. 표준 배양 조건에서 대략적인 농도는 0.5mcg/㎖인 것을 확인하였다.

- Baf-mpl 세포주를 이용한 시험관내 생물분석: Baf-mpl 세포주(부다페스트 조약하에 1994년 9월 28일자로 ATCC No CRL-11723으로 기탁된 것임)는 Mpl 수용체(TPO 수용체)로 형질감염된 뮤린 세포주 Baf-BO3에 해당하는 것이다. 친세포주 Baf-BO3은 IL-3에 의존적이고 형질감염된 세포주 Baf-mpl은 IL-3이나 TPO에 의존적이다. 이 분석은 여러 농도의 사이토킨이나 48시간동안 시험한 상청액의 존재하에 세포를 항온배양하여 실시하였다. 그 다음 [3_H]-티미딘과 12시간 동안 항온배양한 후 세포를 여지 상에 수거한 뒤 액체 섬광 계수기로 방사능활성을 측정하는 바이엘에 넣었다. Baf-mpl 세포(30,000세포/웰) 상에 여러 농도, 즉 10%, 3%, 1%, 0.3%, 0.1%, 0.03%, 0.01% 및 0.003%의 시험 상청액을 3반복으로 96웰 평판에 첨가하여 2가지 실험을 실시하였다. 10ng/㎖, 3ng/㎖, 1ng/㎖, 0.3ng/㎖, 0.1ng/㎖, 0.03ng/㎖, 0.01ng/㎖ 및 0.003ng/㎖ 농도의 표준 TPO를 사용하여 용량 의존적 곡선을 작성하였다. 세포주가 분석된 사이토킨에 반응하는지를 확인하기 위하여 IL-3을 이용한 내부 대조군 시험을 실시하였다. 음성 대조군은 성장인자 무첨가하에 사용하였다. 이와 동일하게 친세포주 Baf-BO3에 대해서도 실험을 실시하여 시험된 상청액에서 나타나는 IL-3 효과를 분류하였다. 실험 결과 X63eTPO의 상청액 배양물에서 0.4mcg/㎖의 rhTPO 표준 활성을 나타내는 유사한 결과를 확인하였다.

- CD34⁺골수 세포 유래의 거대핵 선조세포의 시험관내 증식 및 분화: 골수 세포 CD34⁺는 피콜-하이파크(Ficoll-Hypaque)를 이용한 농도구배 원심분리를 통해 수득한 뒤 면역자기적으로 선발하였다(Miltenyi, MiniMACS). 이 세포들을 거대핵 세포 계열로 분화시키는 조건하에 액체 배양하였다. 이 조건은 TPO의 존재하에 트란스페린, 인슐린, 소혈청알부민, 리포좀이 보충된 FBS 무첨가 이스코브(Iscove) 배양 배지를 이용하는 것이다. CD34⁺골수세포를 여러 희석율의 표준 rhTPO 또는 X-63eTPO 클론의 상청액과 24웰 평판(10,000 세포/웰)에서 배양하였다. 10일 후 세포 증식을 측정하고(세포수), 이 세포를 FITC가 접합된 항CD41 모노클론 항체로 표지하여 거대핵세포의 비율을 수득하고, 유동세포분석기로 분석하였다. 4가지 다른 농도의 rhTPO를 시험하였다(20ng/㎖,10ng/㎖, 5ng/㎖, 2.5ng/㎖). 세포의 70%가 거대핵세포 계열(CD41 양성 세포)인 것으로 관찰되었다. X63eTPO 상청액을 3가지 다른 농도, 즉 10%, 5% 및 2.5% 로 시험하였다. 각각 세포수의 3배, 2배 및 1.5배의 증가가 관찰되었다. 거대핵세포 증식과 관련하여 세포 증식에 관한 상청액의 농도에 따라 거대핵세포의 절대적 수치는 다르지만, 3가지 경우 모두 75%의 CD⁺41 세포를 산출하였다. 유동세포분석기로 분석한 대표적 결과는 도 3에 제시하였고, 그 결과로부터 2.5% 상청액 배양물이 5ng/㎖의 표준 hTPO에 의해 유도된 것과 동등한 발현율을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

면역글로블린 인헨서에 결합된 면역글로불린 프로모터를 포함하는 DNA 작제물을 통해 인간 트롬보포에틴 유전자를 도입시켜 유전자변형시킨 뮤린의 골수종 세포로부터 수득되는 hTPO는 시험관내 및 생체내에서 거대핵 계열의 조혈 세포의 증식이나 발생을 자극할 수 있어 시험관내 및 생체내에서 거대핵 계열의 조혈 세포의 증식이나 발생을 자극하는 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

SEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPO

M E L T E L L L V V M L L L T ACATATCGATTTCTCACAATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCA................................................- - - - - - - - - - - - - - - -R L T L S S P A P P A C D L R V L S K L L RAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAAACTGCTTCGT..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -D S H V L H S R L S Q C P E V H P L P T P VGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGCCAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTC..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -L L P A V D F S L G E W K T Q M E E T K A QCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAG..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -D I L G A V T L L L E G V M A A R G Q L G PGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGACAACTGGGACCC..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -T C L S S L L G Q L S G Q V R L L L G A L QACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAG..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -S L L G T Q L P P Q G R T T A H K D P N A IAGCCTCCTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATC..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -F L S F Q H L L R G K V R F L M L V G G S TTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACC..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -L C V R R A P P T T A V P S R T S L V L T LCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTCACACTG..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

SEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPOSEQ NO1NM 000460ETPO

N E L P N R T S G L L E T N F T A S A R T TAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACTGCCTCAGCCAGAACTACT..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -G S G L L K W Q Q G F R A K I P G L L N Q TGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCCAAGATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACC..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -S R S L D Q I P G Y L N R I H E L L N G T RTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGT..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -G L F P G P S R R T L G A P D I S S G T S DGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACCCTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGAC..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -T G S L P P N L Q P G Y S P S P T H P P T GACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTCCAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGA..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Q Y T L F P L P P T L P T P V V Q L H P L LCAGTATACGCTCTTCCCTCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTT..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -P D P S A P T P T P T S P L L N T S Y T H SCCTGACCCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCC..................................................................- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Q N L S Q E G #CAGAATCTGTCTCAGGAAGGGTAAGCGGCCGCTCT...................................- - - - - - - -

(.) 핵산 서열

(-) 아미노산 서열

(#) 종결코돈

A. 네스티드 PCR의 1차 증폭에 사용되는 프라이머- TPO_EXT-FOW.(외부 순방향 프라이머)CAG GAA GGA TTC AGG GGA GAG G- TPO_EXT-REV. (외부 역방향 프라이머)GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA CB. 네스티드 PCR의 2차 증폭에 사용되는 프라이머- TPO_FOW. (내부 순방향 프라이머)AGC CAC GCC AGC CAG ACA CCC C- TPO_REV. (내부 역방향 프라이머)GCA GTG TCT GAG AAC CTT ACC CC.ClaIy NotI제한부위를 hTPO를 암호화하는 DNA 단편으로 삽입하는데 사용되는 프라이머- Cla-eTPO_FOW.CAT ATC GAT TTC TCA CAA TGG AGC TGA CTG AAT TGC TCC- Not-eTPO_REV.GAG GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC AGA TTC TGG G

Claims

다음과 같은 구성인자들이 정확하고 효율적으로 전사를 일으킬 수 있는 방식으로 구성되어 있는, 포유동물 세포에서 복제할 수 있는 발현 벡터:

a) 인간 면역글로불린의 가변 유전자에 상응하는 전사 프로모터

b) 시그널 펩타이드(분비 리더)를 비롯하여 전체 hTPO 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분절

c) 인간 카파 유전자의 면역글로불린 전사 인헨서 DNA 분절

d) 전사 터이네이터

e) 폴리아데닐화 시그널

f) 항생제 네오마이신형 약물에 내성을 부여하는 유전자

g) 항생제 앰피실린에 내성을 부여하는 유전자

h) 대장균의 복제 오리진(ColEI ori).
제1항에 기재된 발현 벡터에 의해 안정하게 형질감염되어 배양 배지로 성숙 rhTPO 폴리펩타이드를 생물학적 활성 형태로 생산 분비할 수 있는 뮤린 골수종 유래의 배양 세포주, X-63(ATCC: PeX63Ag8.6533, CRL 1580).
제2항에 기재된 세포주에 의해 생산되고 시험관내 및 생체내에서 모두 생물학적 활성인 것으로 확인된 hTPO에 상응하는 재조합 폴리펩타이드.