NO179373B - Rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein, transformant som uttrykker et glykoprotein og fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein - Google Patents

Rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein, transformant som uttrykker et glykoprotein og fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein Download PDF

Info

Publication number
NO179373B
NO179373B NO863674A NO863674A NO179373B NO 179373 B NO179373 B NO 179373B NO 863674 A NO863674 A NO 863674A NO 863674 A NO863674 A NO 863674A NO 179373 B NO179373 B NO 179373B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
csf
dna
cells
fragment
plasmid
Prior art date
Application number
NO863674A
Other languages
English (en)
Other versions
NO179373C (no
NO863674L (no
NO863674D0 (no
Inventor
Tatsumi Yamazaki
Shigekazu Nagata
Masayuki Tsuchiya
Yuichi Hirata
Osami Yamamoto
Yasuo Sekimori
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP60269455A external-priority patent/JPS62129298A/ja
Priority claimed from JP60270838A external-priority patent/JPH06102021B2/ja
Priority claimed from JP61166709A external-priority patent/JPH0657152B2/ja
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of NO863674D0 publication Critical patent/NO863674D0/no
Publication of NO863674L publication Critical patent/NO863674L/no
Publication of NO179373B publication Critical patent/NO179373B/no
Publication of NO179373C publication Critical patent/NO179373C/no

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein. Oppfinnelsen vedrører også en transformant som uttrykker glykoproteinet samt en fremgangsmåte for fremstilling av glykoproteinet.
Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.
Når benmargceller som målceller og nyreceller eller føtale celler ble dyrket ved hjelp av en metode hvor man anvender et dobbelt lag mykagar, idet benmargcellene er i det øvre laget og nyre- eller føtale celler er tilstede i det underste laget, vil deler av cellene i det øvre laget vokse og differensiere seg slik at de danner nøytrofile granulocytter (i det påføl-gende betegnet granulocytter) eller monocyttiske makrofager. Denne observasjon har ført til antagelse om tilstedeværelse in vivo av faktorer som fremmer kolonidannelse (Pluznik og Sach, J. Cell. Comp. Physiol., 66, 319 (1965), og Bradley og Metcalf, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei., 44, 287 (1966)).
Disse faktorene, som samlet kalles CSF, er kjent for at de fremstilles ved hjelp av celler, slik som T-celler, monocyttiske makrofager, fibroblaster og endotelceller, som normalt er omfattende fordelt in vivo. Blant undergrupper av CSF omfattes: granulocytt-monocyttisk makrofag CSF (forkortet GM-CSF), som virker på stamcellene av granulocyttene eller mono-cyttmakrofagene på en slik måte at de stimulerer veksten av slike stamceller og induserer deres differensiering til å danne kolonier av granulocytter eller monocyttiske makrofager, monocyttisk makrofag CSF (forkortet M-CSF), som er istand til å danne kolonier av makrocyttiske makrofager, multipotent CSF (forkortet multi-CSF) som virker på multipotente stamceller som er mindre differensierte, og granulocytt-CSF (forkortet G-CSF) av den type som vedrøres av den foreliggende oppfinnelse og som er istand til å danne kolonier av granulocyttisk karakter. Det er nylig fremkommet at differensieringsfåsene av målceller er forskjellige fra den ene undergruppen av CSF til den andre (Asano, Taisha - Metabolism and Disease, 22, 249
(1985), og Yunis et al., Growth and Maturation Factors, utgitt av Guroff, John Wiley & Sons, NY, bind 1, 209 (1983)).
Derfor er rensing av de individuelle CSF undergruppene og et nærmere studium av deres kjemiske og biologiske egenskaper svært viktig for vurdering av de hematopoetiske mekanismer, og for analysering av de patomorfologiske aspekter av ulike hema-tologiske sykdommer. De biologiske virkninger av G-CSF som tildrar seg økende oppmerksomhet fra forskere, er deres evne til å indusere en differensiering av benmargsleukemiceller og øke funksjonene til fullt utviklede granulocytter, idet man har store forventninger til den potensielle kliniske anvende-lighet av G-CSF når det gjelder behandling og forebygging av leukemi.
Tidligere forsøk på å isolere og rense G-CSF er basert på en celledyrkingsmetode hvor G-CSF isoleres fra supernatanten av en cellekultur, men det gjenstår å fremstille homogen G-CSF i store mengder ved denne metode, fordi G-CSF bare kan fremstilles i små konsentrasjoner og omfattende renseprosedyrer kreves for å oppnå spormengder av G-CSF fra et stort volum av en kulturløsning. Derfor er det svært ønskelig å oppnå masse-fremstilling av G-CSF ved hjelp av rekombinant DNA-teknologi.
Et formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein med aminosyresekvens som vist i fig. 3(B)(II) eller 4(B)(II), som er kjennetegnet ved at den inneholder en DNA-sekvens som koder for det angitte glykoprotein og en DNA-sekvens som koder for hG-CSF-ledersekvensen som muliggjør sekresjon av det angitte glykoprotein, og som er under kontroll av transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som muliggjør ekspresjon i en egnet vertscelle.
Et ytterligere formål med den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en transformant som uttrykker et glykoprotein med en aminosyresekvens som vist i fig. 3(B)(II) eller 3
4(B) (II), som er kjennetegnet ved at den inneholder en rekombinant vektor.
Endelig er det et formål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein med human granulocyttkolonistimulerende faktor-aktivitet og med en aminosyresekvens som vist i fig. 3(B)(II) eller 4(B)(II), som er kjennetegnet ved at den omfatter: a) å konstruere en rekombinant vektor inneholdende en DNA-sekvens som koder for en human granulocyttkolonistimulerende faktor, b) å transformere en stamme av dyrkede pattedyrceller med den ovennevnte rekombinante vektor,
c) å dyrke transformantene, og
d) å utvinne målproduktet.
Fig. 1 viser sekvensene av tre forskjellige prober, IWQ, A
og LC,
Fig. 2 viser nukleotidsekvensen av et pHCS-1-innskudd. Fig. 3(A) viser nukleotidsekvensen av et cDNA-innskudd i
pBRG4,
Fig. 3(B) (I) viser aminosyresekvensen av en human G-CSF- forløper som utledet fra pBRG4 og cDNA, Fig. 3(B) (II) viser aminosyresekvensen av en fullt utviklet
human G-CSF som utledet fra pBRG4 cDNA,
Fig. 4(A) viser nukleotidsekvensen av et cDNA-innskudd i
pBRV2,
Fig. 4(B) (I) viser aminosyresekvensen av en human G-CSF- forløper som utledet fra pBRV2 cDNA, Fig. 4(B) (II) viser aminosyresekvensen av en fullt utviklet
human G-CSF som utledet fra pBRV2 cDNA,
Fig. 5 viser nukleotidsekvensen av et humant kromosomalt
gen som koder for human G-CSF,
Fig. 6 viser stedene på pBRG4- eller pBRV2-avledet humant
G-CSF cDNA hvor restriksjonsenzymet kutter,
Fig. 7 viser stedene på det humane kromosonale gen som koder for humant G-CSF hvor restriksjonsenzymet kutter, Fig. 8 er en delvis presentasjon av fremgangsmåten for fremstilling av en tac promoterinneholdende vektor (+VSE-linje), Fig. 9 er en presentasjon av fremgangsmåten for fremstilling av en PL promoterinneholdende vektor (+VSE-linje), Fig. 10 er en presentasjon av fremgangsmåten for fremstilling av en trp promotorinneholdende vektor (+VSE-linje), Fig. 11 er en delvis presentasjon av fremgangsmåten for fremstilling av en tac promoterinneholdende vektor (-VSE-linje), Fig. 12 er en presentasjon av fremgangsmåten for fremstilling av en PL promoterinneholdende vektor (-VSE-linje) , Fig. 13 er en presentasjon av fremgangsmåten for fremstilling av en trp promoterinneholdende vektor (-VSE-linje) ,
Fig. 14 viser skjematisk strukturen av pHGA410,
Fig. 15 er en presentasjon av fremgangsmåten for konstruksjon av rekombinantvektorer pTN-G4, pTN-G4VAa og pTN-G4VA(3 for ekspresjon, Fig. 16a og 16b viser to fremgangsmåter for konstruksjon av
pHGG4-dhfr,
Fig. 16c viser fremgangsmåten for konstruksjon av pG4DRl og
pG4DR2,
Fig. 17 viser skjematisk strukturen av pHGV2,
Fig. 18 er en presentasjon av fremgangsmåtene for konstruksjon av rekombinantvektorer pTN-V2, pTN-VACc og pTN-VAp for ekspresjon, Fig. 19a og 19b viser to fremgangsmåter for konstruksjon av
en rekombinantvektor pHGV2-dh.fr for ekspresjon,
Fig. 19c viser fremgangsmåten for konstruksjon av pV2DRl og
pV2DR2,
Fig. 2 0 viser skjematisk strukturen av pMLCE3a,
Fig. 21 viser skjematisk strukturen av pTNCE3a, og
Fig. 22 viser skjematisk strukturene av pD2 6SVCE3a og pDRCE3cc.
Genet som koder for et polypeptid med human G-CSF-aktivitet er et DNA (cDNA) som er komplementært til budbærer-RNA (mRNA) som er oppnådd i form av 15 - 17S fraksjoner ved hjelp av sukrosedensitetsgradientsentrifugering og som koder for et polypeptid med human G-CSF-aktivitet.
I forbindelse med den foreliggende oppfinnelse ble det oppnådd to linjer av dette cDNA. cDNA av den ene linjen innehar hele eller deler av et gen som koder for polypeptidet I eller II vist i fig. 3(B). Mer spesielt har dette cDNA nukleotidsekvensen angitt ved ATG i nukleotidstillingene 32 - 34 fra den 5'-terminale enden (se fig. 3(A)) og CCC i nukleotidstillingene 650 - 652, eller ved ACC i stillingene 122 - 124 og CCC i stillingene 650 - 652. Alternativt har cDNA nukleotidsekvensen som er vist i fig. 3(A) eller en del derav. cDNA av denne linje er heretter omtalt som cDNA (+VSE).
cDNA av den andre linjen innehar hele eller deler av et gen som koder for polypeptidet I eller II vist i fig. 4(B). Mer spesielt har dette cDNA nukleotidsekvensen angitt ved ATG i nukleotidstillingene 31 - 33 fra den 5'-terminale enden (se fig. 4(A)) og CCC i nukleotidstillingene 640 - 642, eller ved ACC i stillingene 121 - 123 og CCC i stillingene 640 - 642. Dette cDNA kan alternativt ha nukleotidsekvensen som er vist i fig. 4(A) eller en del derav. cDNA av denne linjen er heretter omtalt som cDNA(-VSE).
Genet som er beskrevet over kan oppnås ved hjelp av følgende fremgangsmåter: et mRNA kodet G-CSF fremstilles først fra pattedyrceller eller andre vertsceller som har evnen til å danne et polypeptid med G-CSF-aktivitet, mRNA omdannes deretter til en dobbeltrådet cDNA ved hjelp av tidligere kjente metoder, en samling rekombinanter som inneholder dette cDNA (samlingen omtales heretter som et cDNA-bibliotek) under-søkes deretter ved hjelp av kjente metoder.
Genet omfatter også et humant kromosomalt gen som koder for et polypeptid med human G-CSF-aktivitet. Dette humane kromosomale gen inneholder en nukleotidsekvens som deltar i transkripsjonskontroll og det inneholder også hele eller deler av nukleotidsekvensen vist i fig. 5.
Et kromosomalt gen kan oppnås ved at en samling rekombinanter
som inneholder et humant kromosomalt gen først fremstilles fra humane celler (samlingen omtales heretter som et humant kromosomalt genbibliotek), hvorpå det ovennevnte humane kromosomale genbibliotek undersøkes ved hjelp av kjente metoder.
Det humane kromosomale gen kan fremskaffes fra hvilken som helst type humane celler slik som celler fra lever eller nyre, eller dyrkede celler slik som tumorceller. Et humant kromosomalt genbibliotek kan fremstilles fra humane celler ved hjelp av kjente metoder (se Maniatis et al., Cell, 15, 687
(1978), og Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, sidene 269 ff. (1982)), som er vist i det følgende: Et humant kromosomalt DNA utvinnes fra slike kilder som human føtal lever ved hjelp av fenol eller andre passende kjemikalier, det oppnådde DNA spaltes delvis eller fullstendig ved hjelp av et passende restriksjonsenzym for å oppnå et DNA-fragment av passende lengde, DNA-fragmentet innføres i et X-fag vektor DNA-fragment ved hjelp av T4 DNA ligase eller andre passende ligaser, med en linker som inneholder restriksjons-stedet for et passende enzym, slik som EcoRI, eventuelt ved-heftet, hvorpå det oppnås A.-fag partikler ved hjelp av in vitro pakkemetode og deretter transformeres vertscellene, slik som E. coli, med de oppnådde A,-fag partiklene. Eksempler på en X-fag som kan anvendes som vektoren i de ovennevnte fremgangsmåter omfatter Charon 4A og EMBL-3 og EMBL-4.
Pattedyrceller som kan anvendes som en mRNA-kilde er en human munnhulecanceravledet cellestamme, CHU-2 (deponert ved Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, eller C.N.C.M., under deponeringsnummer 1-483). I stedet for slike tumorcellestammer, kan celler som er separert fra andre patte-dyr eller passende cellestammer anvendes. Fremstilling av mRNA kan oppnås ved en av metodene som allerede er foreslått for kloning av genene fra en rekke andre fysiologisk aktive proteiner, f.eks. oppnås hele RNA først ved behandling med et overflateaktivt middel og fenol i nærvær av en ribonuklease-inhibitor, slik som et vanadylribonukleosidkompleks (se Berger og Birkenmeier, Biochemistry, 18, 5143 (1979)) eller ved hjelp av CsCl densitetsgradientsentrifugering etterfulgt av behandling med guanidintiocyanat (se Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294 (1979)), hvorpå poly(A<+>) RNA (mRNA) oppnås ved at hele RNA underkastes "batch" adsorpsjon eller affinitetskolonnekromatografi på oligo(dT)-cellulose eller poly-U-Sepharose med Sepharose 2B anvendt som en bærer. Poly(A<+>) RNA kan videre fraksjonere ved hjelp av en passende metode, slik som sukrosedensitetsgradientsentrifugering. Den evne som det oppnådde mRNA har til å kode for et polypeptid med G-CSF-aktivitet kan undersøkes ved hjelp av en rekke metoder, f.eks. ved at mRNA oversettes til et protein og dets fysiologiske aktiviteter undersøkes, eller at proteinet identifiseres ved hjelp av et anti-G-CSF-antistoff. Mer spesielt' innføres mRNA i oocytter fra Xenopus laevis for gjen-nomføring av translasjon (se Gurdon et al., Nature, 233, 177
(1972)), eller translasjonsreaksjonene kan utføres med kanin-reticulocytter eller hvetekimer (Schleif og Wensink, Practical Methods in Molecular Biology, Springer-Verlag, NY
(1981)). G-CSF-aktiviteten kan måles ved å gjøre bruk av en mykagar dyrkingsmetode ved anvendelse av benmargceller, og teknikkene for utføring av denne metoden er gjennomgått (Metcalf, Hemopoietic Colonies, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NY (1977)).
En enkeltrådet cDNA syntetiseres, idet det oppnådde mRNA anvendes som et templat, en dobbeltrådet cDNA syntetiseres fra dette enkeltrådete cDNA, og det dobbeltrådete cDNA innføres i en passende vektor DNA for å danne et rekombinant plasmid. Dette rekombinante plasmid kan anvendes for å transformere en passende vert, f.eks. Escherichia coli, for å oppnå en gruppe av DNAer i transformantene (cDNA-bibliotek).
En dobbeltrådet cDNA kan oppnås fra mRNA ved hjelp av en av følgende to metoder: mRNA behandles med revers transkriptase og med oligo (dT), som er komplementær til poly(A)-kjeden på den 3'-terminale enden, anvendt som en primer, eller man syntetiserer et oligonukleotid som er i overensstemmelse med deler av aminosyresekvensen av G-CSF-proteinet, og et cDNA, som er komplementært til mRNA, syntetiseres ved behandling med en revers transkriptase, idet det syntetiserte oligonukleotid anvendes som en primer. En dobbeltrådet cDNA kan også oppnås ved hjelp av følgende metoder: mRNA spaltes og fjernes ved behandling med alkali og den oppnådde enkeltrådete cDNA behandles først med en revers transkriptase eller DNA-polymerase I (f.eks. Klenow-fragment), deretter med Sl nuklease, eller eventuelt kan mRNA behandles direkte med RNase H og DNA-polymerase (f.eks. E. coli polymerase I). For mer informa-sjon, se Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), og Gubler og Hoffman, Gene, 25, 263
(1983) .
Den oppnådde dobbeltrådete cDNA innføres i en passende vektor, som f.eks. en av plasmidvektorene av EK-typen som er eksemplifisert ved pSClOl, pDF41, ColEl, pMB9, pBR322, pBR327 og pACYCl, eller en av fagvektorene eksemplifisert ved X.gt, \ c, A,gtlO og XgtWES, hvoretter den rekombinante vektor anvendes for å transformere en E- coli stamme (f.eks. X1776, HB101, DH1 eller C600) for å oppnå et cDNA-bibliotek (se f.eks. Molecular Cloning, ibid.).
Den dobbeltrådete cDNA kan bindes til en vektor ved hjelp av følgende fremgangsmåter: en terminal ende på cDNA utstyres med en klebrig ende ved tilføyelse av et passende kjemisk syntetisert DNA-fragment, og en vektor-DNA, som er blitt spaltet ved hjelp av et restriksjonsenzym, bindes til ovennevnte cDNA ved behandling med en T4-fag DNA-ligase i nærvær av ATP. Alternativt tilføyes dC, dG-kjeder (eller dT, dA-kjeder) respektivt til den dobbeltrådete cDNA og en vektor-DNA som er blitt spaltet med et restriksjonsenzym, og man oppnår en løsning hvor begge DNAer er annealet (se Molecular Cloning, ibid.).
En vertscelle kan transformeres med den oppnådde rekombinant DNA ved hjelp av kjente metoder. Dersom vertscellen er E_. coli kan man anvende metoden etter Hanahan (J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)), hvori rekombinant DNA tilføyes til en kompetent celle som er fremstilt i nærvær av CaCl2, MgCl2 eller RbCl.
Screening for celler som innehar det ønskede gen kan utføres ved hjelp av flere metoder som omfatter: pluss-minus metoden som anvendes ved kloning av interferon cDNA (Taniguchi et al., Proe. Jpn. Acad. 55, Ser. B. 464 (1979)), hybridiseringstrans-lasjonsmetoden (Nagata et al., Nature, 284, 316 (1980)), og koloni- eller plaquehybridiseringsmetoden ved anvendelse av en oligonukleotidprøve som er syntetisert kjemisk på grunnlag av aminosyresekvensen av proteinet med human G-CSF-aktivitet (Wallace et al., Nucleic Acids Res., 9, 879 (1981), og Benton & Davis, Science, 196, 180 (1977)).
Fragmentet som inneholder det således klonede gen som koder for polypeptidet med human G-CSF-aktivitet, kan gjeninnføres i en passende vektor DNA med det formål å transformere andre prokaryotiske eller eukaryotiske vertsceller. Ved å innføre en passende promoter eller en ekspresjonsassosiert 'sekvens i vektoren, kan genet bli uttrykt i en individuell vertscelle.
Illustrerende prokaryotiske vertsceller omfatter Escherichia coli, Bacillus subtilis og Bae i1lus thermophilus. Genet som er av interesse kan uttrykkes i disse vertscellene ved at cellene transformeres med et replika (dvs en plasmidvektor som innehar en utgangs- og regulatorsekvens), som er avledet fra en art som er forenelig med vertscellen. En ønskelig vektor er en som har en sekvens som er istand til å utstyre den transformerte cellen med selektivitet for egenskaper som kommer til uttrykk (fenotype).
F. eks. kan E. coli transformeres med pBR322, som er en vektor som kan replikeres i E. coli (se Bolivar, Gene, 2, 95 (1975)). Denne vektoren inneholder både ampicillin- og tetracyklin-resistente gener, og begge disse egenskapene kan anvendes for å identifisere den transformerte cellen. Eksempler på en promoter som er nødvendig for genetisk ekspresjon i prokaryotiske vertsceller omfatter promoteren av (3-laktamasegenet (Chang et al., Nature, 275, 615 (1978)), laktosepromoteren (se Goeddel et al., Nature, 281, 544 (1979)) og tryptofanpro-moteren (se Goeddel et al., Nucleic Acid Res., 8, 4057 (1980)) osv. Hvilken som helst av disse promotere kan anvendes ved fremstilling av et polypeptid med human G-CSF-aktivitet.
En eukaryotisk mikroorganisme, slik som Saccharomyces cerevisiae, kan anvendes som en vertscelle og transformeres ved hjelp av en vektor, slik som plasmid YRp7 (se Stinchcomb et al., Nature, 282, 39 (1979)). Dette plasmid har TRPl-genet som en seleksjonsmarkør for gjærstammer som mangler evnen til å danne tryptofan, slik at transformantene kan utvelges når cellene dyrkes i fravær av tryptofan. Eksempler på en promoter som kan anvendes for genekspresjon omfatter en sur fosfatase genpromoter (Miyanohara et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 80, 1 (1983)), og en alkoholdehydrogenase genpromoter (Valenzuela et al., Nature, 298, 347 (1982)).
Vertscellen kan også avledes fra pattedyrceller slik som COS-celler, ovarieceller (CHO) fra kinesisk hamster, C-127-celler og Hela-celler. En illustrerende vektor som kan anvendes for å transformere disse cellene, er pSV2-gpt (se Mulligan og Berg, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 78, 2072 (1981)). Vek-torene som anvendes for å transformere disse cellene inneholder replikas jonsorigo, seleks jonsmarkør, en promoter på plassen foran det genet som skal uttrykkes, RNA-spleisested, polyadenyleringssignal, osv.
Illustrerende promotere som kan anvendes for genekspresjon i pattedyrceller omfatter promoterene av et retrovirus, polyomavirus, adenovirus, simianvirus 40 (SV40), osv. Dersom man anvender promoteren av SV-40 kan den ønskede genekspresjon lett oppnås i overensstemmelse med metoden etter Mulligan et al. beskrevet i Nature, 277, 108 (1979).
Illustrerende ori som kan anvendes omfatter dem som er avledet fra SV40, polyomavirus, adenovirus, bovint papillomavirus (BPV), osv. Illustrerende seleksjonsmarkører som kan anvendes omfatter fosfotransferase APH (3') II eller I (neo) gen, thymidinkinase (TK) gen, E. coli xanthinguaninfosforibosyl-transferase (Ecogpt) gen, dihydrofolatreduktase (DHFR) gen, osv.
For å oppnå polypeptider med human G-CSF-aktivitet fra de ovennevnte vertvektorsystemer kan følgende fremgangsmåter anvendes: genet som koder for peptidet med human G-CSF-aktivitet innføres på et passende sted i en av de ovennevnte vektorer, vertscellen transformeres med den resulterende rekombinante DNA og de oppnådde transformanter dyrkes. Det ønskede polypeptid kan isoleres og renses fra cellen eller kulturløsningen ved hjelp av kjente teknikker.
Eukaryotiske gener er generelt kjent for å utvise polymorfisme som er kjent når det gjelder det humane interferongen (se Nishi et al., J. Biochem., 97, 153 (1985)), og dette fenomen kan forårsake substitueringen av en eller flere aminosyrer eller en forandring i nukleotidsekvensen, men ingen forandring i aminosyresekvensen i det hele tatt.
G-CSF-aktiviteten kan også innehas av et polypeptid som mangler en eller flere av aminosyrene i aminosyresekvensen som er vist i fig. 3(B) eller 4(B), eller som har slike aminosyrer tilføyd dertil, eller et polypeptid hvor en eller flere av disse aminosyrene er erstattet av en eller flere aminosyrer. Det er også kjent at et polypeptid som er oppnådd ved omdannelse av hvert av cysteinkodonene i det humane interleukin-2.
(IL-2)-genet til et serinkodon, har interleukin-2-aktivitet (Wang et al., Science, 224, 1431 (1984)).
I det følgende er beskrevet fremgangsmåter for fremstilling av genet som koder for et polypeptid med human G-CSF-aktivitet, en rekombinant vektor som innehar det ovennevnte gen og en transformant som innehar denne rekombinante vektor, og et polypeptid eller et glykoprotein som har den humane G-CSF-aktivitet som er uttrykt i denne transformant.
(1) Fremstilling av probe
Et homogent humant CSF-protein ble renset fra supernatanten av en tumorcellelinjekultur, CHU-2, og dens aminosyresekvens fra den N-terminale enden ble bestemt. Fragmentene ble oppnådd ved nedbrytning med bromcyan og behandling med trypsin, og aminosyresekvensene av disse fragmentene ble også bestemt (Eksempel 3(i), (ii) og (iii)).
Fra de bestemte aminosyresekvenser ble tre nukleotidprober, (A), (LC) og (IWQ) syntetisert (eksempel 4) med aminosyresekvensene som vist i fig. 1. Probe (A) var av en blandet type og besto av 14 påfølgende nukleotider. Probe (IWQ) besto av 30 påfølgende nukleotider med deoksyinosin, og var en probe av den type som anvendes i kloning av det humane cholecysto-kiningen (Takahashi et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 82, 1931 (1985)). Probe (LC) var en probe som besto av 24 nukleotider som var syntetisert fra nukleotidene i 32 - 39-stillingene fra den N-terminale enden av aminosyresekvensen som er vist i eksempel 3(i) på grunnlag av nukleotidsekvensen vist i fig. 3.
Kjemisk syntese av nukleotidene kan oppnås ved å anvende den forbedrede fosfotriestermetoden i stedet for fastfasemetoden og er blitt gjort rede for av Narang (Tetrahedron, 39, 3-22
(1983) ) .
Prober som er basert på aminosyresekvenser i andre posisjoner enn dem i de ovennevnte prober kan også anvendes.
(2) Konstruksjon av et cDNA-bibliotek
CHU-2-celler ble homogenisert etter tilsetning av en guanidin tiocyanatløsning og totalt RNA ble oppnådd ved CsCl-densitets-gradientsentri fugering.
Poly(A<+>)-RNA ble isolert fra det totale RNA ved kolonnekromatografi på oligo(dT)-cellulose. Deretter ble enkeltrådet cDNA syntetisert med en revers transkriptase, og RNase H og E. coli DNA-polymerase I ble tilsatt for å oppnå en dobbeltrådet cDNA. En dC-kjede var festet til den oppnådde dobbeltrådete cDNA, som var forbundet med en vektor, pBR322, hvortil en dG-kjede var blitt festet ved Pst I kuttestedet. Den resulterende rekombinante DNA ble anvendt til å transformere en E. coli stamme, X1776, og et pBR322-linje cDNA-bibliotek ble konstruert (eksemplene 5 og 6).
På lignende måte ble den dobbeltrådete cDNA bundet til XgtlO vektoren med EcoRI-linkeren og et X.-fag linje cDNA-bibliotek ble konstruert (eksempel 7).
(3) Screening
Rekombinanter avledet fra pBR322-linje cDNA-biblioteket ble fiksert på et Whatman 541 filterpapir og et enslig klon kunne utvelges ved hjelp av kolonihybridisering med en <32>P-merket probe (IWQ). Ytterligere undersøkelser med Southern blot-metoden (Southern, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975) viste at dette klon også hybridiserte med probe (A). Nukleotidsekvensen til dette klon ble bestemt ved hjelp av dideoksymetoden (Sanger, Science, 214, 1205 (1981)).
Nukleotidsekvensen av det oppnådde cDNA innskudd er vist i fig. 2, hvorfra man kan se at dette innskudd besto av 308 basepar inkluderende prober (IWQ) og (A), og hadde en åpen leseramme som koder for 83 aminosyrer inneholdende den aminosyresekvensen som er vist i eksempel 3(iii). Det pBR322 avledete plasmid som inneholder disse 3 08 baseparene er i det etterfølgende omtalt som pHCS-1 (eksempel 8).
Et DNA-fragment som inneholdt de 308 baseparene oppnådd fra pHCS-1, ble radioaktivt merket ved hjelp av "nick"-transla-sjonsmetoden (se Molecular Cloning, ibid.) og, med dette fragment anvendt som en probe, ble det X.gtlO-avledete cDNA-bibliotek undersøkt ved hjelp av plaquehybridisering (Benton og Davis, Science, 196, 180 (1977)), og man oppnådde fem kloner. Nukleotidsekvensen til en klon som man antok inneholdt cDNA, ble bestemt ved den samme metoden som er beskrevet 1 det foregående (fig. 3(A)).
Som vist i fig. 3(A), hadde dette cDNA innskudd en eneste stor åpen leseramme.
Aminosyresekvensen som er kodet for av dette cDNA, kan utledes som vist i fig. 3(A).
En sammenligning med den N-terminale aminosyresekvensen av G-CSF-proteinet vist i eksempel 3(i) viste at dette cDNA inneholdt en nukleotidsekvens som er i overensstemmelse med både et signalpeptid kodet for av 90 basepar begynnende med ATG-sekvensen i nukleotidstillingene 32 - 34 fra den 5'-terminale enden og som slutter med GCC-sekvensen i nukleotidstillingene 119 - 121, og et modent G-CSF polypeptid som er kodet ved hjelp av 531 basepar som starter med ACC-sekvensen i nukleotidstillingene 122 - 124 og som slutter med CCC-sekvensen i nukleotidstillingene 650 - 652. Derfor besto polypeptidet med aminosyresekvens I som vist i fig. 3(B) av 2 07 aminosyrer, og polypeptidets molekylvekt ble beregnet til 22292,67 dalton. Polypeptidet med aminosyresekvens II besto av 177 aminosyrer, og dets molekylvekt ble beregnet til 18986,74 dalton (eksempel 9).
Det skal bemerkes at ATG i stillingene 32 - 34 eller 68 - 70 også kan betraktes til å være proteininitieringsstedet. Escherichia coli stamme X1776 inneholdende pBR322 som hadde dette cDNA (+VSE) i EcoRI-kuttestedet er blitt deponert ved The Fermentation Research Institute, The Agency of Industrial Science and Technology (FERM BP-954).
Fig. 6 viser restriksjonsenzymkuttestedene i dette gen.
Dette cDNA ble bundet til pBR327 (Soberon et al., Gene, 9, 287
(1980)) ved ECoRI-stedet og det resulterende plasmid er heretter betegnet som pBRG4.
Det oppnådde pBRG4 ble behandlet med et restriksjonsenzym, EcoRI, for å oppnå et DNA-fragment inneholdende cDNA på omkring 1500 basepar. Dette fragment ble radioaktivt merket ved hjelp av "nick"-translasjonsmetoden (se Molecular Cloning, ibid.) og, med dette radioaktivt merkede DNA-fragment anvendt som en probe, ble det <A>.gtlO-avledete cDNA-bibliotek screenet en gang til ved hjelp av plaquehybridisering (se Benton og Davis, ibid.) Ved denne plaquehybridisering ble to ark med X-fag-DNA fiksert nitrocellulosefilterpapir fremstilt, idet ett av disse arkene ble anvendt for den ovennevnte plaque-hybridiseringen og det annet ark ble utsatt for plaquehybridisering med den allerede beskrevne probe (LC). De fagene som ble positive for begge prober ble utvalgt. Et klon som hadde en "hellengde" cDNA ble utvalgt og nukleotidsekvensen av cDNA innskuddet som bestemt ved hjelp av dideoksymetoden, er vist i fig. 4 (A) .
Dette cDNA hadde en eneste stor åpen leseramme, og aminosyresekvensen som ville bli kodet for av dette cDNA ble utledet som vist i fig. 4(A).
Sammenligning med den N-terminale aminosyresekvensen av G-CSF-proteinet som er vist i eksempel 3(i) viste at dette cDNA inneholdt en nukleotidsekvens som både er i overensstemmelse med et signalpeptid kodet for av 90 basepar begynnende med ATG-sekvensen i nukleotidstillingene 31 - 33 fra den 5'-terminale enden og som slutter med GCC-sekvensen i nukleotidstillingene 118 - 120, og et modent G-CSF polypeptid kodet for av 522 basepar begynnende med ACC-sekvensen i nukleotidstillingene 121 - 123 og som slutter med CCC-sekvensen i nukleotidstillingene 640 - 642. Polypeptidet med aminosyresekvensen I som vist i fig. 4(B) besto derfor av 204 aminosyrer og dets molekylvekt ble beregnet til 21977,35 dalton. Polypeptidet med aminosyresekvens II besto av 174 aminosyrer og dets molekylvekt ble beregnet til 18671,42 dalton (eksempel 10).
Det skal bemerkes at ATG i stillingene 58 - 60 eller stillingene 67 - 69 også kan betraktes å være proteininitieringsstedet.
Escherichia coli stamme X177 6 inneholdende pBR322 og som hadde dette cDNA (-VSE) ved EcoRI-kuttestedet, er blitt deponert ved The Fermentation Research Institute, The Agency of Industrial Science and Technology (FERM BP-955).
Fig. 6 viser restriksjonsenzymkuttestedene for dette gen. Dette cDNA ble bundet til pBR32 7 ved EcoRI-stedet for å danne et plasmid som heretter omtales som pBRV2. (4) Screening av et humant kromosomalt genbibliotek Et humant kromosomalt genbibliotek som var fremstilt i overensstemmelse med fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis et al. (Molecular Cloning, ibid.) ble underkastet screening med det ovennevnte viste pHCS-1. Prober som kan anvendes i denne screening omfatter: et pHCS-l-avledet 308-bp DNA-fragment, et pBRG4-avledet ca. 1500-bp DNA-fragment, et pBRV2-avledet ca. 1500-bp DNA-fragment, et DNA-fragment av passende lengde inneholdende deler av en eller flere av disse DNA-fragmentene, såvel som de ovennevnte oligonukleotidprober (dvs (IWQ, (A) og (IC)). Anvendelse av pHCS-1 DNA-fragmentet er beskrevet i det følgende.
Dette DNA-fragment ble radioaktivt merket med <32>P i overensstemmelse med "nick"-translasjonsmetoden (se Roop et al., Cell, 15, 431 (1978)). Med det resulterende <32>P-merkede fragment anvendt som en probe, ble det humane kromosomale genbibliotek underkastet screening ved hjelp av plaquehybridisering (se Benton og Davis, ibid.) for å oppnå ti enkelt-stående kloner.
Etter isolering av DNA fra klonene ble et restriksjonsenzymkart fremstilt ved hjelp av kjente fremgangsmåter (Fritsch et al., Cell, 19, 959 (1980)).
Ved anvendelse av den samme DNA-prøven ble det utført Southern blotting (se Southern, ibid.), og det ble funnet at et DNA-fragment på omkring 4 kb, som var kuttet ut med EcoRI og Xhol, potensielt kunne inneholde et område som koder for det humane G-CSF polypeptid. Derfor ble det ca. 4 kb DNA-fragmentet innført i pBR327 ved EcoRI-stedet, under anvendelse av en EcoRI-linker for å oppnå pBRCE3(3. Med dette plasmid anvendt som en basis for DNA-sekvensering ble nukleotidsekvensen til ca. 3 kb delen av det ca. 4 kb DNA-fragmentet bestemt ved hjelp av dideoksymetoden. Som et resultat ble ovennevnte DNA-fragment funnet å være et gen som koder for det humane G-CSF polypeptid (fig. 5).
E. coli stammen X1776 inneholdende pBRCE3P (dvs plasmidet pBR327 som har ovennevnte ca. 4 kb DNA-fragment innskutt i EcoRI-stedet) er blitt deponert ved The Fermentation Research Institute, The Agency of Industrial Science and Technology (FERM BP-956).
Sammenligning mellom pBRG4 cDNA-innskuddet vist i fig. 3 og pBRV2 cDNA-innskuddet vist i fig. 4, viste at DNA-fragmentet inneholdt fem exondeler og at det kodet for aminosyresekvensene utledet fra pBRG4 og pBRV2.
Fig. 7 viser restriksjonsenzymkuttestedene for det oppnådde gen.
Dette DNA-fragment inneholdt det kromosomale gen av humant G-CSF, eller det innledende området som skal transkriberes til humant G-CSF mRNA, pluss en nukleotidsekvens som deltar i transkripsjonskontroll (Benoist og Chambon, Nature, 290, 304
(1981), og Breathnack og Chambon, Ann. Rev. Biochem., 50, 349
(1981)).
(5) Konstruksjon av en rekombinant vektor for ekspresjon
i E. coli
(A) + VSE- linje rekombinant vektor
Fra pBRG4-plasmidet oppnådd i (3) (eksempel 9) ble et cDNA-fragment av G-CSF polypeptidet kuttet ut med et restriksjonsenzym og en rekombinant vektor ble konstruert ved hjelp av en av de følgende metoder: (i) ved anvendelse av en annealet syntetisk linker ble fragmentet ligert med et fragment fremstilt fra en tac promoterinneholdende pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals)
(eksempel 12 og fig. 8),
(ii) tre fragmenter fremstilt fra en PL promoterinneholdende pPL-Å. (Pharmacia Fine Chemicals) ble ligert med en annealet syntetisk linker, og det ligerte produkt og cDNA-fragmentet ble underkastet refremstillingsprosedyrer for å konstruere en rekombinant vektor (eksempel 13,
fig. 9), eller
(iii) ved anvendelse av en annealet syntetisk linker ble fragmentet ligert med et fragment fremstilt fra et trp promoterinneholdende pOYI-plasmid (eksempel 14 og fig. 10).
(B) - VSE- linje rekombinant vektor
På samme måte som beskrevet over ble tre rekombinante vektorer
konstruert under anvendelse av plasmidet pBRV2 (eksempel 10) som vist i eksempel 19 og fig. 11, 12 og 13.
(6) Fremstilling av E. coli transformanter, samt dyrking og
ekspresjon
Ved anvendelse av tre rekombinante vektorer av hver av +VSE-og -VSE-linjene, ble E. coli stammen DHl, N4830 eller JM105 transformert ved hjelp av kalsiumklorid- eller rubidiumklorid-prosedyrer, som beskrevet i Molecular Cloning, ibid.
(eksempler 12, 13, 14 og 19). Hver av de oppnådde transformantene ble dyrket i et Luria-medium inneholdende ampicillin, idet induksjon deretter ble utført som påkrevet for å oppnå ekspresjon (eksemplene 15 og 20).
(7) Isolering og rensing av G-CSF polypeptid fra E. coli og
aminosyreanalyser derav
En kulturløsning av transformantene ble sentrifugert for å oppnå en cellepellet. De oppsamlede cellene ble behandlet med et lysozym og, etter lysis ved gjentatt nedfrysing og tining oppnås supernatanten. Alternativt ble cellene behandlet med guanidiumklorid, hvorpå supernatanten ble oppsamlet etter sentrifugering.
Supernatanten ble underkastet gelfiltrering på en Ultrogel ACA54-kolonne (LKB) og de aktive fraksjoner ble konsentrert ved hjelp av ultrafiltrering.
Deretter ble det tilsatt en vandig løsning av trifluoreddiksyre inneholdende n-propanol til konsentratet og, etter henstand på is, ble blandingen sentrifugert og adsorbert på en reversfase C18 kolonne. Etter eluering ble fraksjonene under-søkt med hensyn på aktivitet. De aktive fraksjonene ble oppsamlet og underkastet de samme renseprosedyrene som beskrevet ovenfor. De rensede fraksjonene ble frysetørket og pulveret ble oppløst og underkastet væskekromatografi basert på molekylstørrelse. De oppnådde polypeptidene ble underkastet SDS-polyakrylamidgelelektroforese og et eneste bånd ble bekreftet for det ønskede G-CSF polypeptid (eksemplene 16 og 20). Det oppnådde polypeptid viste human G-CSF-aktivitet (eksemplene 17 og 20). G-CSF-polypeptidet ble analysert ved hjelp av en aminosyreanalysemetode ved anvendelse av en Hitachi 835 automatisk aminosyreanalysator (Hitachi, Ltd.). Ved analysering av de N-terminale aminosyrene, ble det anvendt en gassfasesekvensator (for Edman-spalting), en høytrykks-væskekromatograf og en Ultrasphere-ODS kolonne (eksempler 18 og 21) . (8) Konstruksjon av rekombinante vektorer beregnet for
dyreceller
Rekombinante vektorer (avledet fra BPV) for anvendelse med C127- og NIH3T3-celler som vertsceller ble konstruert for både +VSE- og -VSE-linje cDNAene og for det kromosomale gen. Rekombinante vektorer (med dh.fr) for anvendelse med CHO-celler ble også konstruert for både +VSE- og -VSE-linje cDNAene og for det kromosomale gen. Rekombinante vektorer for anvendelse med COS-celler ble også konstruert. I det følgende er representative eksempler beskrevet og for ytterligere detaljer henvises til fremgangsmåteeksemplene. (A) Konstruksjon av rekombinante vektorer av + VSE- linjen cDNA (+VSE)-fragmentet oppnådd i (3) ble innført i en vektor pdKCR for å danne et plasmid pHGA410 (eksempel 22 og fig. 14) som ble delvis spaltet med EcoRI etterfulgt av behandling med DNA polymerase I (Klenow-fragment) for å oppnå butte ender.
En Hindlll-linker ble festet til DNA, som deretter ble behandlet med Hindlll og T4 DNA-ligase. Det behandlede DNA ble anvendt til å transformere E. coli stammen DH1 ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren (se Molecular Cloning, ibid.).
Det oppnådde plasmid ble betegnet pHGA410(H) (fig. 15).
pHGA410(H) ble behandlet med Sali og, etter dannelse av butte ender, ble det behandlet på nytt med Hindlll, og et Hindlll-Sall-fragment ble isolert. Et plasmid pdBPV-1, som hadde et transformert fragment av bovint papillomavirus, ble behandlet med Hindlll og PvuII og det største DNA-fragmentet ble separert og bundet til det separat fremstilte Hindlll-Sall-fragment. De to forenede fragmenter ble anvendt til å transformere E. coli stammen DH1 for å oppnå et plasmid, pTN-G4, som hadde det pHGA410-avledete CSF-cDNA (fig. 15 og eksempel 23) .
I kombinasjon med plasmidet pAdD2 6SVpA ble enten pHGA410-plasmidet eller pHGA410(H)-plasmidet anvendt for å konstruere pHGG4-dh.fr som var en rekombinant vektor (+VSE) for anvendelse sammen med CHO-celler (fig. 16a og 16b, og eksempel 25).
Et 2 kb DNA-fragment inneholdende dhfr-genet ble oppnådd fra pAdD26SVpA ved behandling med EcoRI og BamHI, og det isolerte fragment ble innført i pHGA410(H) ved Hindlll-stedet for å konstruere pG4DRl og pG4DR2 (fig. 16c og eksempel 25). (B) Konstruksjon av rekombinante vektorer av - VSE- linjen cDNA (-VSE)-fragmentet oppnådd i (3) ble innført i en vektor pdKCR for å danne et plasmid pHGV2 (eksempel 28), som delvis ble spaltet med EcoRI etterfulgt av behandling med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) for å danne butte ender. En Hindlll-linker ble festet til DNA, som deretter ble behandlet med Hindlll og T4 DNA-ligase. Det behandlede DNA ble anvendt til å transformere E. coli stammen DH1 ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren (se Molecular Cloning, ibid.). Det oppnådde plasmid ble kalt pHGV2(H) (fig. 18).
pHGV2(H) ble behandles med Sali og, etter dannelse av butte ender, ble det behandlet med Hindlll en gang til idet et HindIII-SalI-fragment ble oppnådd. Et plasmid pdBPV-1 som hadde et transformert fragment av bovint papillomavirus ble behandlet med Hindlll og PvuII og det største DNA-fragment ble fraseparert og bundet til det separat fremstilte Hindlll-Sall-fragment. De bundne fragmentene ble anvendt til å transformere E. coli stammen DH1, for å oppnå et plasmid, pTN-V2, som hadde det pHGV2-avledete CSF-cDNA (fig. 18 og eksempel 29) .
Ved lignende fremgangsmåter ble enten pHGV2-plasmidet eller pHGV2(H)-plasmidet i kombinasjon med plasmidet pAdD26SVpA anvendt for å konstruere pHGV2-dh.fr, som var en rekombinant vektor (-VSE) for anvendelse sammen med CHO-celler (fig. 19a og 19b, og eksempel 31).
Et DNA-fragment på ca. 2 kb inneholdende dhfr-genet ble isolert fra pAdD26SVpA ved behandling med EcoRI og BamHI og dette fragment ble innført i pHGV2(H) ved Hindlll-stedet for å konstruere pV2DRl og pV2DR2 (fig. 19c og eksempel 31).
(C) Konstruksjon av rekombinante vektorer inneholdende det kromosomale gen
Plasmidet pBRCE3(3, som var oppnådd i (4) og som inneholdt det kromosomale gen vist i fig. 5, ble behandlet med EcoRI.
pSVH<+>K<+->plasmidet, beskrevet av Banerji et al. i Cell, 27, 299
(1981), ble behandlet med Kpnl for å fjerne globingenet. Plasmidet ble videre underkastet delvis spalting med Hindlll for å fjerne en del av det siste gen av SV40. Fragmentene ble bundet sammen på ny for å danne en ekspresjonsvektor pML-E<+>.
Denne vektoren ble behandlet med restriksjonsenzymet EcoRI, og defosforylert med alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for å oppnå en vektor DNA, som ble koblet til det forannevnte kromosomale DNA-fragment ved hjelp av en T4DNA-ligase (Takara Shuzo., Ltd.) for å oppnå pMLCE3a, som var en rekombinant vektor for COS-celler (eksempel 34). Som vist i fig. 20, inneholdt dette plasmidet enhanceren til SV40-genet, replikasjonsutgangspunktet, pBR322-replikasjonsutgangspunktet og det pBR322-avledete P-laktamasegenet (Ampr) , og plasmidet hadde det humane G-CSF-kromosonale gen innlemmet nedstrøms fra enhanceren til SV40-genet.
En ekspresjonsvektor for C127-cellene ble konstruert ved de følgende prosedyrer. Et DNA-fragment, inneholdende det kromosomale CSF-gen ble kuttet ut med et passende restriksjonsenzym fra pMLCE3cc, som var ekspresjonsvektoren for COS-celler. Dette fragment ble koblet, ved hjelp av en T4DNA-ligase, til et DNA-fragment som inneholdt bovint papillomavirus (BPV) utgangspunktet og et DNA-fragment som inneholdt den SV40 tidlige promoter. Det oppnådde pTNCE3oc var en ekspresjonsvektor som hadde et kromosomalt CSF-gen koblet nedstrøms fra den SV40 tidlige promoter og som inneholdt en 65 % andel av BPV.
Ekspresjonsvektoren for CHO-cellene hadde to DNA-fragmenter koblet sammen ved hjelp av en T4DNA-ligase, idet det ene fragmentet inneholdt det kromosomale CSF-gen og den SV40 tidlige promoter, som i tilfellet med ekspresjonsvektoren for C127-celler, og det andre fragmentet inneholdt et pAdD2 6SVpA-avledet dhfr-gen. Den oppnådde pD2 6SVCE3(X var en ekspresjonsvektor som hadde det kromosomale CSF-gen nedstrøms av SV40-promoteren og dhfr-genet nedstrøms av adenovirusets sene hovedpromoter.
(9) Ekspresjon i dyreceller
To representative eksempler er beskrevet i det følgende, og relevante fremgangsmåteeksempler viser ytterligere detaljer.
(A) Ekspresjon i mus C127- celler
Plasmidet pTN-G4 eller pTN-V2 ble behandlet med BamHI. Det
behandlede plasmid ble anvendt til å transformere C127-celler (oppnådd ved dyrking), ved hjelp av kalsiumfosfatprosedyren. De transformerte cellene ble dyrket og kloner som fremstilte CSF med stor hastighet ble utvalgt. Glykoproteiner som inneholdt det uttrykte G-CSF ble isolert og renset fra kulturen av de transformerte cellene, og de ble funnet til å ha human G-CSF-aktivitet. Tilstedeværelsen av det ønskede glykoprotein ble også bekreftet ved hjelp av aminosyre- og sukkerinnholds-analyser av prøven.
For bestemmelse av sukkermengden ble CSF-prøven som var anvendt i aminosyreanalysen underkastet bestemmelse av amino-sukker ved hjelp av Elson-Margan-metoden, bestemmelse av nøytralt sukker ved hjelp av orcinolsulfatprosedyren eller bestemmelse av sialinsyre ved hjelp av tiobarbituratprose-dyren. Prosedyrene for hver bestemmelse er vist i Tohshitsu no Kagaku "Chemistry of Saccharides" (del 2 av to deler), kapittel 13, bind 4 av "A Course in Biochemical Experiments", utgitt av Tokyo Kagaku Dojin. Omdannelse av de målte verdiene til vektprosent viste at sukkerinnholdet av det oppnådde G-CSF var fordelt innen størrelsesområdet 1-20 vekt%, avhengig av type vertsceller, ekspresjonsvektorer og dyrkingsbetingelser.
(B) Ekspresjon i COS- celler
COS-celler, som var avledet fra ape CV-l-celler og som var
blitt transformert ved hjelp av SV40-mutant uten ori for å uttrykke det store T-antigen av SV40 (se Gluzman et al., Cell, 32, 175 (1981)), ble transformert ved hjelp av vektoren pMLCE3cc som var oppnådd i (5) (C) og som inneholdt det humane kromosomale G-CSF-gen. Supernatanten fra kulturen av COS-cellene viste human G-CSF-aktivitet (eksempel 35).
COS-cellene ble isolert og underlagt mRNA-analyser, som viste tilstedeværelse av to mRNAer, som er overensstemmende med aminosyresekvensene som er avbildet i henholdsvis fig. 3(A) og fig. 4 (A) .
EKSEMPLER
Før oppfinnelsen beskrives i større detalj i de etterfølgende eksempler er det følgende referanseeksempel tilveiebragt for å illustrere metodene for måling av CSF-aktiviteten.
Referanseeksempel: Måling av CSF-aktivitet.
De følgende metoder ble anvendt for bestemmelser av CSF-aktiviteten (i det følgende benevnt CSA).
CSA-måling
(a) Med humane benmarqceller:
Ettlags celledyring på mykagar ble utført i overensstemmelse med metoden etter Bradley, T.R. og Metcalf, D. (Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei., 44, 287-300, 1966). Mer spesielt ble 0,2 ml bovint føtalt serum, 0,1 ml prøve, 0,1 ml av en ikke-adherent human benmargcellesuspensjon (1 - 2 x IO<5> nukleære celler), 0,2 ml av en modifisert McCoy's 5A dyrkingsløpsning og 0,4 ml av en modifisert McCoy's 5A dyrkingsløsning inneholdende 0,75 % agar, blandet, overført til plastskåler beregnet for vevskultur (35 mm<0>), koagulert og dyrket ved 37°C i 5 % C02/95 % luft og ved 100 % fuktighet. Ti døgn senere ble antall dannede kolonier talt (idet en koloni består av minst 50 celler) og CSA ble bestemt, idet en enhet er aktiviteten som kreves for dannelse av en koloni.
(b) Med benmarqceller fra mus:
Hesteserum (0,4 ml), 0,1 ml prøve, 0,1 ml av en C3H/He suspensjon av benmargceller fra mus (hunnkjønn) (0,5 - 1 x IO<5 >nukleære celler) og 0,4 ml av en modifisert McCoy's 5A dyr-kingsløsning inneholdende 0,75 % agar ble blandet, overført til plastskåler beregnet for vevskultur (35 mm<®>), koagulert og dyrket i 37<*>C i 5 % C02/95 % luft ved 100 % fuktighet. Antall kolonier som dannes ble talt (idet en koloni besto av minst 50 celler) og CSA ble bestemt, idet en enhet er den påkrevede aktivitet for dannelse av en koloni.
Den modifiserte McCoy's 5A dyrkingsløsning som anvendes i hver av metodene (a) og (b) og den ikke-adherente humane benmargcellesuspensjon som anvendes i (a) ble fremstilt ved følgende prosedyrer.
Modifisert McCoy's 5A dyrkingsløsning (dobbelkonsentrasjon)
12 g av McCoy's 5A dyrkingsløsning (Gibco), 2,55 g MEM amino-syrevitaminmedium (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), 2,18 g natrium-bikarbonat og 50.000 enheter kaliumpenicillin G ble oppløst to ganger i 500 ml destillert vann og løsningen ble aseptisk filtrert gjennom et Millipore-filter (0,22 (im).
Ikke-adherent human benmargcellesuspensjon
Et benmargsfluid oppnådd fra en frisk person ved sternal-punksjon ble fortynnet fem ganger med en RPMI 1640 dyr-kingsløsning, utplatet over en Ficoll-Pague-løsning (Pharmacia Fine Chemicals) og sentrifugert ved 400 x g i 30 minutter ved 25'C. Man oppnådde et mellomliggende cellelag (spesifikk tetthet < 1,077). Cellene ble vasket, innstilt til en konsentrasjon på 5 x IO<6> celler/ml ved hjelp av en RPMI 1640 dyrkingsløsning inneholdende 20 % bovint føtalt serum, over-ført til en 25 cm<2> plastflaske beregnet for vevskulturen og inkubert i 30 minutter i en C02 inkubator. Ikke-adherente celler ble oppnådd i supernatanten som ble overført til en plastflaske (25 cm<2>) og inkubert i to og en halv time. Ikke-adherente celler i supernatanten ble samlet og anvendt i et forsøk.
EKSEMPEL 1: Tilveiebringelse av CHU-2
En tumor fra en pasient med oral cancer, hvori en utpreget økning i antall nøytrofiler var observert, ble transplantert inn i nu/nu mus. Ti dager etter transplantasjonen var vekt-økningen av tumoren og antall nøytrofiler utpreget. Tolv dager etter transplantasjonen ble tumoren tatt ut under sterile betingelser, skåret i terninger på 1 - 2 mm<3> og dyrket på følgende måte.
Ti til femten terninger av tumoren ble innført i et 50 ml plastsentrifugerør. Etter tilsetning av 5 ml av en trypsin-løsning (inneholdende 0,25 % trypsin og 0,02 % EDTA), ble røret rystet i ti minutter i et varmebad ved 37'C og supernatanten ble fjernet. Ytterligere 5 ml av den samme trypsin-løsningen ble tilsatt og trypsinnedbrytning ble utført under omrøring i 15 minutter ved 37'C. Den oppnådde cellesuspen-sjonssupernatant ble lagret på is etter at trypsin var blitt inaktivert ved tilsetning av 1 ml bovint føtalt serum.
Etter at disse prosedyrene var gjentatt en gang ble den oppnådde cellesuspensjon kombinert med den tidligere oppnådde suspensjon og sentrifugert ved 15.000 rpm i ti minutter for å oppnå en cellepellet. Pelleten ble vasket to ganger med F-10 inneholdende 10 % av bovint føtalt serum og ble deretter over-ført til en plastflaske beregnet for dyrking (25 cm<2>) for å gi en cellekonsentrasjon på 5 x IO<6> celler/flaske. Etter inkubering over natten i en C02 inkubator (5 % C02 og 100 % fuktighet) sammen med en F-10 dyrkingsløsning inneholdende 10 % av bovint føtalt serum, ble supernatanten fjernet sammen med de ikke-adherente cellene, og dyrkingen fortsatte etter tilsetning av en frisk dyrkingsløsning. Seks dager etter at dyrkingen startet var flasken full av celler og dyrkingsløs-ningen ble byttet ut med en frisk løsning. Neste dag ble dyrkingsløsningen fjernet og kolben ble fylt med 2 ml av et anti-mus erytrocyttantistoff (Cappel) fortynnet fem ganger med RPMI 1640 og 2 ml av et marsvinkomplement (Kyokutu Seiyaku Co., Ltd.) fortynnet to og en halv gang med RPMI 1640. Etter inkubering i 20 minutter ved 37'C ble kulturen vasket to ganger med F-10 inneholdende 10 % av et bovint føtalt serum, og fibroblastene som var avledet fra nu/nu musene ble fjernet. Deretter ble en F-10 dyrkingsløsning inneholdende 10 % av et bovint føtalt serum tilsatt, og dyrkingen fortsatte i ytterligere to døgn. Deretter ble cellene underkastet kloning ved hjelp av den begrensende fortynningsmetoden.
EKSEMPEL 2: Isolering av CSF
Cellene som ble oppnådd i eksempel 1 ble dyrket i form av en meget tykk populasjon i to flasker beregnet for dyrking (150 cm2) . Cellene ble utvunnet, suspendert i 500 ml av en F-10 dyrkingsløsning inneholdende 10 % bovint føtalt serum, overført til en rotasjonskolbe av glass på 1580 cm<2> (Belco) og deretter dyrket ved en omdreining på 0,5 rpm. Når cellene hadde vokst til en fullstendig tykk populasjon på innerveggen av rotasjonskolben ble dyrkingsløsningen erstattet med serumfritt RPMI 1640. Etter dyrking i fire døgn ble supernatanten fra kulturen utvunnet og dyrkingen fortsatte etter tilsetning av F-10 inneholdende 10 % bovint føtalt serum. Etter dyrking i tre døgn ble dyrkingsløsningen igjen utbyttet med serumfritt RPMI 1640 og supernatanten ble utvunnet fire døgn senere. Ved gjentagelse av disse prosedyrene ble det oppnådd 500 ml serum-fri kultursupernatant pr. flaske hver uke. I tillegg tillater denne metoden at supernatanten kan utvinnes, mens cellene
beholdes over en betydelig forlenget periode.
En batch som består av 5.000 ml supernatant fra kulturen ble blandet med 0,01 % Tween 20 og konsentrert omtrent 1000 ganger ved hjelp av ultrafiltrering med Hollow Fiber DC-4 og Amicon PM-10 (Amicon). Konsentratet ble renset ved følgende trinn: (i) En andel (5 ml) av den konsentrerte supernatanten fra kulturen ble underkastet gelfiltrering på en Ultrogel AcA54 kolonne (4,6 cm<0> x 90 cm<L>, LKB) ved en strømningshastig-het på ca. 50 ml/time med 0,01 M Tris-HCl buffer (pH 7,4), inneholdende 0,15 M NaCl og 0,01 % Tween 20 (Nakai Kagaku Co., Ltd.). Kolonnen var blitt kalibrert med bovint serumalbumin (Mw, 67.000), ovoalbumin (Mw, 45.000) og cytokrom C (Mw, 12.400). Etter endt gelfiltrering ble 0,1 ml av hver av fraksjonene fortynnet ti ganger og undersøkt med hensyn på aktive fraksjoner ved hjelp av ovennevnte CSA-målemetode (b). Fraksjonene for Ve = 400 - 700 ml ble funnet å utvise makrofag-dominant CSA, mens fraksjonene for Ve = 800 - 1200 ml viste granulocyttdominant CSA. Derfor ble de sistnevnte fraksjonene samlet og konsentrert til et volum på ca. 5 ml ved hjelp av ultrafiltrering på PM-10 (Amico). (ii) Til de konsentrerte fraksjonene ble det tilsatt en vandig løsning av 0,1 % trifluoreddiksyre inneholdende 30 % n-propanol (for bestemmelse av aminosyresekvens, tilgjengelig fra Tokyo Kasei K.K.). Etter at blandingen hadde stått på is i omtrent 15 minutter ble presipitatet fjernet ved sentrifugering i ti minutter ved 15.000 rpm. Supernatanten ble adsorbert på en jl-Bondapak C18 kolonne (8 mm x 30 cm for semiforberedende anvendelse, Waters) som var innstilt til likevekt med en vandig løsning inneholdende n-propanol og trifluoreddiksyre, kolonnen ble eluert kontinuerlig med en vandig løsning av 0,1 % trifluoreddiksyre som inneholdt n-propanol med en lineær konsentrasjonsgradient på 30 - 60 %.
En høytrykksvæskekromatograf, Hitachi Model 685-50 (Hitachi, Ltd.), og en detektor, Hitachi Model 638-41 (Hitachi, Ltd.) ble anvendt for å bestemme absorpsjonen ved 250 nm og 280 nm samtidig. Etter eluering ble 10 |il av hver av fraksjonene fortynnet 100 ganger og undersøkt med hensyn på aktive fraksjoner ved hjelp av den ovenfor nevnte metoden for CSA-måling (b). Toppene som var eluert med 40 % n-propanol ble funnet å inneha CSA-aktivitet, og de ble derfor samlet, kromatografert på nytt under de samme betingelser og målt med hensyn på CSA ved hjelp av den tidligere nevnte metode. Igjen ble CSA-aktivitet observert i toppene som var eluert med 40 % n-propanol. Derfor ble disse toppene samlet (fire fraksjoner = 4 ml) og frysetørket.
(iii) Det frysetørkede pulveret ble løst i 2 00 |il av en vandig løsning av 0,1 % trifluoreddiksyre inneholdende 40 % n-propanol, og løsningen ble underkastet høytrykksvæskekromato-graf i på en TSK-G 3000SW-kolonne (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd., 7,5 mm x 60 cm). Eluering ble utført med den samme vandige løsningen og ved en strømningshastighet på 0,4 ml/min og fraksjonene ble oppdelt i porsjoner på 0,4 ml ved hjelp av en fraksjonssamler, FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemicals). Hver av fraksjonene ble undersøkt med hensyn på CSA ved hjelp av de samme metoder som beskrevet over og aktiviteten ble observert i fraksjonene for retensjonstider på 37 - 38 minutter (i overensstemmelse med MW på ca. 2 x IO<4>). De aktive fraksjonene ble isolert og renset på en analytisk u-Bondapak C18 kolonne (4,6 mm x 30 cm). Hovedtoppene ble isolert og frysetørket. Den oppnådde prøve ble analysert ved hjelp av metoden for CSA-måling (A), og det ble funnet human G-CSF-aktivitet.
EKSEMPEL 3: Bestemmelse av aminosyresekvens
(i) Bestemmelse av den N- terminale aminosyresekvens Prøven ble underkastet Edman-nedbrytning ved hjelp av en gassfasesekvensator (Applied Biosystems) og den oppnådde PTH-aminosyre ble analysert ved hjelp av rutineprosedyrer
som høytrykksvæskekromatografi (Beckman Instruments) og Ultrasphere-ODS kolonne (Beckman Instruments). Kolonnen
(5 (lm, 4,6 mm<®> x 250 mm<L>) ble ekvilibrert med en utgangsbuf f er (vandig løsning inneholdende 15 mM natriumacetatbuffer (pH 4,5 og 40 % acetonitril)) og injisert sammen med prøven (oppløst i 20 |il av utgangsbuf feren) . Separasjon ble utført ved hjelp av isokratisk eluering med utgangsbufferen. Strøm-ningshastigheten var 1,4 ml/min og kolonnetemperaturen ble holdt på 40'C. Påvisning av PTH-aminosyren ble oppnådd ved å benytte seg av absorpsjonene i UV-området ved 2 69 nm og 32 0 nm. Standard prøver av PTH-aminosyren (Sigma) i stør-relsesorden 2-nmol ble separert på samme måte for å bestemme deres retensjonstider, som var sammenlignbare med dem som ble oppnådd for prøven som ble undersøkt. Som et resultat ble prøven funnet til å ha følgende aminosyresekvens for 40 amino-syrerester fra den N-terminale enden:
(ii) Nedbrytning med bromcyan
Prøven ble oppløst i 70 % maursyre. 200 ekvivalent mengder bromcyan, som var blitt renset ved hjelp av sublimasjon, ble tilsatt. Blandingen fikk stå over natten ved 37<*>C. Reaksjonsproduktet ble frysetørket og fraksjonert ved hjelp av HPLC på en TSK G3000SW-kolonne (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) i den hensikt å oppnå fire topper. Toppene ble kalt CN-1, CN-2, CN-3 og CN-4 i avtagende rekkefølge med hensyn på molekylvekten. De første to toppene (CN-1 og CN-2) ga de beste utbyttene, og deres aminosyresekvenser ble analysert med en automatisk gassfasesekvensator (Applied Biosystems) under de samme betingelser som ble anvendt i (i).
CN-1 ble funnet å være et peptid fra den N-terminale enden av G-CSF-proteinet, og CN-2 hadde følgende aminosyresekvens:
(iii) Nedbrytning med trypsin
Prøven ble løst i 0,1 M Tris-HCl buffer (pH 7,4) inneholdende 8 M urea, og løsningen ble blandet med 0,1 M Tris-HCl buffer (pH 7,4) inneholdende 0,1 % 2-merkaptoetanol, for å få en endelig ureakonsentrasjon på 2 M. Et TPCK-behandlet trypsin (Sigma) ble tilsatt slik at forholdet prøve/enzym var 50:1. Blandingen fikk stå i fire timer ved 25<*>C, og etter tilsetning av en lik mengde TPCK-behandlet trypsin, fikk blandingen stå i ytterligere 16 timer ved 25'C. Deretter ble reaksjonsproduktet underlagt revers-fase kolonnekromatografi med høy hastighet på en C8 kolonne (Yamamura Kagaku K.K.), idet elueringen ble utført med 0,1 % TFA inneholdende n-propanol som hadde en lineær densitetsgradient på 5 - 60 %. En rekke forskjellige topper ble oppnådd når absorpsjonen ble målt ved 280 nm, og hovedtoppen ble analysert med hensyn til sin aminosyresekvens ved hjelp av en automatisk gassfasesekvensator (Applied Biosystems) og ved de samme forhold som ble anvendt i (i). Hovedtoppen ble funnet å være et peptid med følgende sekvens som inneholdt deler av CN-2-fragmentet vist i (ii) :
EKSEMPEL 4: Fremstilling av DNA-probe
(i) Syntese av probe ( IWQ)
30 påfølgende nukleotider (se fig. 1) ble fremstilt på grunnlag av sekvensen av ti aminosyrer (Ile-Trp-Gln-Gln-Met-Glu-Glu-Leu-Gly-Met) som var inkludert i aminosyresekvensen oppnådd i eksempel 3 (iii). Med hensyn til fig. 1 skal det bemerkes at nukleotidet i 9-stilling fra den 5'-terminale enden er en ekvimolar blanding av dA og dG. Startnukleotidene var for det meste dimerer, men mononukleotider ble også anvendt om nødvendig. En kolonne utstyrt med glassfilter var fylt med 20 mg av startnukleotidresin Ap-d(G) (Yamasa Shoyu Co., Ltd.). Etter flere vaskinger med metylenklorid ble 4,4'-dimetoksytritylgruppen eliminert ved behandling med en løsning av metylenklorid inneholdende 3 % trikloreddiksyre. Deretter ble kolonnen vasket flere ganger med 1 ml metylenklorid.
Etter at kolonnen var vasket med vannfritt pyridin for å erstatte løsningsmiddelet ble 20 mg av en nukleotiddimer, (DMTr)ApTp(NHR3) , (Nippon Zeon, NHR3 = trietylammonium, DMTr = dimetoksytrityl) og 0,2 ml pyridin tilsatt, og det indre av kolonnen ble vakuumtørket med en vakuumpumpe. Deretter ble 20 mg 2,4,6-trimetylbenzensulfonyl-3-nitrotriazolid (MSNT fra Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) og 0,2 ml vannfritt pyridin tilsatt, og det indre av kolonnen ble byttet ut med en nitrogengass. Nukleotidresinet ble kondensert med dimeren ved reaksjon i 45 minutter ved romtemperatur og med tilfeldig rysting. Etter fullført reaksjon ble kolonnen vasket med pyridin og de ureagerte OH-gruppene ble acetylert med en pyridinløsning inneholdende overskudd av eddiksyreanhydrid og 4-dimetylaminopyridin. Etter at kolonnen var vasket med pyridin, ble følgende dimerer eller monomerer kondensert, i den angitte rekkefølge, ved at ovennevnte prosedyrer gjentas: (DMTr)Ip(NHR3) , (DMTr)GpGp(NHR3) , (DMTr)lp(NHR3) , en ekvimolar blanding av (DMTr)CpTp(NHR3) og (DMTr)TpTp(NHR3) , en ekvimolar blanding av (DMTr)ApAp(NHR3) og (DMTr)ApGp(NHR3) , en ekvimolar blanding av (DMTr)ApGp(NHR3) og (DMTr)GpGp(NHR3) , (DMTr)GpAp(NHR3) , (DMTr)TpGp(NHR3) , en ekvimolar blanding av (DMTr)ApAp(NHR3) og (DMTr)GpAp(NHR3 ) , (DMTr)CpAp(NHR3 ) , en ekvimolar blanding av (DMTr)ApAp(NHR3) og (DMTr)ApGp(NHR3) ,
(DMTr) GpCp (NHR3) , (DMTr) TpGp (NHR3) , (DMTr) lp (NHR3 ) og (DMTr)ApTp(NHR3) , idet alle disse nukleotidene er tilgjengelige fra Nippon Zeon unntatt (DMTr)lp(NHR3) som var tilgjengelig fra Yamasa Shoyu Co., Ltd. Etter at siste trinn av reaksjonen var fullført ble resinet vasket påfølgende med pyridin, metylenklorid og eter, uten acetylering, og deretter tørket. Det tørkede resin ble løst i 1,7 ml av en blanding av pyridin (0,5 ml), vann (0,2 ml) og dioksan (1 ml) inneholdende 1 M tetrametylguanidin og 1 M a-pikolinaldoksim. Suspensjonen fikk stå over natten ved romtemperatur og ble konsentrert til 100 - 200 (il under vakuum. Konsentratet ble blandet med en liten mengde (to til tre dråper) pyridin og 2 - 3 ml konsentrert vandig ammoniakk, og blandingen ble oppvarmet til 55'C i seks timer. Etter ekstrahering med etylacetat ble vannlaget fraseparert og konsentrert under vakuum. Konsentratet ble løst i en løsning av 50 mM trietylammoniumacetat (pH 7,0) og løsningen ble underkastet kromatografi på en C18 kolonne (1,0 x 15 cm, Waters), idet elueringen ble gjennomført med acetonitril (lineær densitetsgradient på 10 - 3 0 %) i en løsning av 50 mM trietylammoniumacetat (pH 7,0). Hovedfrak-sjonen eluert ved en acetonitrilkonsentrasjon på omkring 25 % ble konsentrert under vakuum.
Til konsentratet ble det tilsatt 80 % eddiksyre og blandingen fikk stå i 30 minutter ved romtemperatur. Etter ekstrahering med etylacetat ble vannlaget fraseparert og konsentrert under vakuum. Det oppnådde konsentrat ble videre renset ved hjelp av høytrykksvæskekromatografi på en C18 kolonne (fra Senshu Kagaku K.K., SSC-ODS-272, 6<0> x 200 mm). Elueringen ble gjennomført med acetonitril (10 - 20 % lineær densitetsgradient) i en løsning av 50 mM trietylammoniumacetat (pH 7,0). Et syntetisk DNA ble oppnådd i en mengde som ikke var mindre enn 10A260 enheter.
Analysering ved hjelp av Maxam-Gilbert sekvensanalysemetoden (Meth. Enzym., 65, 499 (1980)) viste at det oppnådde oligonukleotid hadde nukleotidsekvensen som er vist i fig. 1.
(ii) Syntese av probe ( A)
14 påfølgende nukleotider (se fig. 1) ble oppnådd på grunnlag av sekvensen på fem aminosyrer (Met-Pro-Ala-Phe-Ala), som er inkludert i aminosyresekvensen som ble oppnådd i eksempel 3(iii) .
Synteseprosedyrene var de samme som dem som ble anvendt i fremstillingen av probe (IWQ), og de følgende nukleotider ble kondensert til en nukleotidresin Ap-d(T) (Yamasa Shoyu Co., Ltd.) i følgende rekkefølge: (DMTr)CpAp(NHR3) , (DMTr)GpGp(NHR3 ) , en ekvimolar blanding av (DMTr)CpAp(NHR3) , (DMTr)CpTp(NHR3 ) , (DMTr)CpGp(NHR3) og (DMTr)CpCp(NHR3 ) , en ekvimolar blanding av (DMTr)ApGp(NHR3), (DMTr)TpGp(NHR3) , (DMTr) GpGp (NHR3 ) og (DMTr) CpGp (NHR3 ) , (DMTr) ApAp (NHR3 ) , en ekvimolar blanding av (DMTr)CpAp(NHR3) og (DMTr)CpGp(NHR3) og (DMTr)Gp(NHR3) , idet alle nukleotidene var tilgjengelige fra Nippon Zeon. Et syntetisk DNA ble oppnådd i en mengde på ca. 10A26o enheter. Analysering ved hjelp av Maxam-Gilbert sekvensbestemmelsemetoden viste at det oppnådde oligonukleotid hadde nukleotidsekvensen som er vist i fig. 1.
(iii) Syntese av probe ( LC)
Automatisk DNA-syntese ble utført ved hjelp av en DNA-syntetisator, modell 380A fra Applied Biosystems. Denne teknikken som baserer seg på prinsippene beskrevet av Caruthers et al. (J. Am. Chem. Soc, 103, 3185 (191)), omtales generelt som fosforamidittprosedyren.
En fosforamidittform av (DMTr)-dT som var preliminært aktivert med tetrazol ble kondensert til dG-S (S: bærer) hvori 5'-dimetoksytritylgruppen (DMTr) var avbeskyttet. Deretter ble de ureagerte hydroksygruppene acetylert og oksydert med jod i nærvær av vann for å danne en fosforylgruppe. Etter avbeskyt-telse av DMTr-gruppen ble kondenseringen gjentatt på samme måte, inntil 24 nukleotider med sekvensen som er vist i fig. 1 var syntetisert. Disse nukleotidene ble spaltet fra bæreren, avbeskyttet, og renset ved hjelp av revers-fase høytrykks-væskekromatografi på en C18 kolonne (Senshu Kagaku Co., Ltd., SSC-ODS-272).
EKSEMPEL 5: Dyrking av CHU-2-celler og fremstilling av
mRNA
1) Dyrking og utvinning av CHU-2-celler
Etablerte CHU-2-celler ble dyrket i en fullstendig kompakt populasjon i to dyrkingsflasker (150 cm2) , utvunnet og løst i 500 ml av en RPMI 1640 dyrkingsløsning inneholdende 10 % bovint føtalt serum, overført til en rotasjonsflaske av glass på 1580 cm<2> (Belco), og dyrket i fire døgn ved en rotasjons-hastighet på 0,5 rpm. Når cellene hadde vokst slik at de dannet en fullstendig tett populasjon på innsiden av veggen i rotasjonsflasken ble dyrkingsløsningen fjernet fra rotasjonsflasken, som ble fylt med 100 ml av en forvarmet (37°C) fysiologisk saltvannsoppløsning inneholdende 0,02 % EDTA. Etter oppvarming i to minutter ved 37"C ble cellene fjernet fra innsiden av flaskeveggen ved hjelp av pipettering. Den oppnådde cellesuspensjon ble sentrifugert ved 1500 rpm i ti minutter, idet man oppnådde en cellepellet. Cellene ble resuspendert i 5 ml av en fysiologisk saltvannsoppløsning uten EDTA. Suspensjonen ble sentrifugert ved 1500 rpm i ti minutter for å oppnå en cellepellet (våtvekt ca. 0,8 g). De oppnådde cellene ble lagret ved en temperatur på -80'C inntil de ble underkastet prosedyrer for ekstraksjon av RNA.
2) Rensing av mRNA
Isolering av mRNA fra CHU-2-cellene som var oppnådd i 1) ble gjennomført ved hjelp av prosedyrer som hovedsakelig var de samme som dem som er beskrevet i Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, side 196 (1982). De frosne CHU-2-cellene (våtvekt, 3,8 g) ble suspendert i 20 ml av en løsning av 6 M guanidin (6 M guanidinisotiocyanat, 5 mM natriumcitrat (pH 7,0), 0,1 M (3-merkaptoetanol og 0,5 % natriumsarcosylsul-fat) og suspensjonen ble blandet i en Vortex-blander i to til tre minutter. Blandingen ble oppsugd og sprøytet ut ti ganger ved hjelp av en sprøyte (kapasitet 20 ml) som var utstyrt med en 18G nål. Omkring 6 ml av den viskøse guanidinløsningen som inneholdt de ødelagte cellene ble lagt lagvis på et 6 ml underlag av 5,7 M CsCl i 0,1 M EDTA (pH 7,5) i et Beckman SW40 Ti polyallomer sentrifugerør på en slik måte at røret ble helt fullt. Fire sentrifugerør ble fylt på den ovennevnte måte og sentrifugert ved 30.000 rpm i 15 timer ved 20'C. De oppnådde pelleter ble vasket tre ganger med en liten mengde 70 % etanol.
Pelletene som ble oppnådd fra de respektive rørene ble kombinert, løst i 550 |il vann og bearbeidet for å tilveiebringe en NaCl-konsentrasjon på 0,2 M. Etter behandling med en blanding av fenol og kloroform i forholdet 1:1 og deretter med kloroform alene, ble 2,5 volumdeler etanol tilsatt for å pre-sipitere total RNA (ca. 10,1 mg total RNA ble oppnådd fra 3,8 g våte celler).
Poly(A<+>)-RNA ble renset fra total RNA ved hjelp av de følgende affinitetskromatografiprosedyrer, idet man benytter seg av at en poly(A)-kjede er fastgjort på den 3'-terminale enden av mRNA. Adsorpsjon på oligo(dT)-cellulose (type 7 fra P-L-Biochemical) ble oppnådd ved at total RNA ble ført gjennom en oligo(dT)-cellulosekolonne i en bærerbuffer (inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA og 0,1 % SDS-løsning), etter at løsningen var blitt oppvarmet i fem minutter ved 65'C. Kolonnen var blitt ekvilibrert med den samme bærerbuffer. Eluering av poly(A<+>)-RNA ble utført med en TE-løsning (inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA). Den ikke-adsorberte effluent ble ført gjennom kolonnen på nytt, og eluatet oppnådd ved å gjenta de samme prosedyrer som nevnt over ble blandet med eluatet fra første gjennom-kjøring. Det ble oppnådd 400 |ig poly (A+)-RNA.
Det oppnådde mRNA ble fraksjonert med hensyn på størrelse ved hjelp av sukrosedensitetsgradientsentrifugering i overensstemmelse med prosedyrene som er beskrevet i laboratorie-manualene til Schleif og Wensink, Practical Methods in Molecular Biology, Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1981).
Mer spesielt ble en 5 - 2 5 % sukrosedensitetsgradient fremstilt i et Beckman SW40 Ti sentrifugerør. To sukroseløsninger ble fremstilt ved at 5 % og 25 % RNase-fri sukrose (Schwarz/Mann) ble oppløst i en løsning inneholdende 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA og 0,5 % SDS.
800 Hg av mRNA (poly(A+)-RNA) , fremstilt ved hjelp av den ovennevnte metode, ble løst i 200 - 500 (il av en TE-løsning. Løsningen ble oppvarmet i fem minutter ved 65'C, hvorpå den etter avkjøling ble plassert på sukrosedensitetsgradient-løsningene som ble sentrifugert ved 30.000 rpm i 2 0 timer. Fraksjoner på 0,5 ml ble tatt ut, og absorpsjonen ved 2 60 nm ble målt. Størrelsen på de fraksjonerte RNAer ble bestemt på grunnlag av lokaliseringen av standard RNAer (Ribosom RNA 2 8S, 18S og 5S). Samtidig ble G-CSF-aktiviteten for hver fraksjon undersøkt med oocytter av Xenopus laevis ved hjelp av følgende prosedyrer. mRNA fra hver fraksjon ble først tilveiebragt i form av en vandig løsning med en konsentrasjon på 1 jig/jil, og oocytter ble deretter tatt fra Xenopus (omkring ett år gammel) og mRNA-løsningen ble injisert på en slik måte at 50 ng mRNA ble injisert i en oocytt, idet ti slike oocytter ble plassert i hver av de 96 brønnene på en mikrotiterplate. Oocyttene ble deretter dyrket i 48 timer ved romtemperatur i 100 fil av et Barth-medium (88 mM NaCl, 1 mM KC1, 2.4 mM NaHC03, 0,82 mM MgS04, 0,33 mM Ca(N<0>3)2, 0,41 mM CaCl2,
7,5 mM Tris-HCl (pH 7,6), penicillin, 10 mg/L, og strepto-mycinsulfat, 10 mg/L), supernatanten fra kulturen ble utvunnet, konsentrert og renset tilstrekkelig for måling av G-CSF-aktivitet.
G-CSF-aktiviteten ble funnet å være tilstede i 15 - 17S fraksjoner.
EKSEMPEL 6: Syntese av cDNA (konstruksjon av pBR-
linje cDNA-bibliotek)
cDNA ble syntetisert fra poly (A+)-RNA oppnådd i eksempel 5 ved metoden etter Land et al. (Nucleic Acids Res., 9, 2251 (1981))
i modifisert form etter metoden av Gubler og Hoffman (Gene, 25, 263 (1983)).
1) Syntese av enkeltrådet cDNA
Et Eppendorf-rør (totalvolum 1,5 ml) fikk tilført reagenser i følgende rekkefølge: 80 (Xl reaksjonsbuffer (500 mM KCl, 50 mM MgCl2, 250 mM Tris-HCl, pH 8,3), 20 Ul 200 mM ditiotreitol,
32 ul 12,5 mM dNTP (inneholdende 12,5 mM av hver av dATP, dGTP, dCTP og dTTP), 10 ul a-<32>P-dCTP (PB 10205 fra Amercham), 32 ul oligo(dT) 12-i8 <fra P-L-Biochemicals, 500 ug/ml), 20 ul poly(A<+>)-RNA (2,1 ug/ul) og 206 fil destillert vann. Reak-sjonsløsningen på totalt 400 fil ble oppvarmet i fem minutter ved 65°C og deretter i fem minutter ved 42'C. Til den opp-varmede løsningen ble det tilsatt 12 0 enheter av en revers transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Etter at løsningen var oppvarmet ved 42'C i to timer ble det tilsatt 2 (il av en RNase-inhibitor (Bethesda Research Laboratories) , 20 fli av en TE-løsning, 16 fil 100 mM natriumpyrof osf at og 48 enheter (4 jll) av en revers transkriptase, og reaksjonen ble gjennom-ført ved 46'C i to timer. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,5 M EDTA (8 fil) og 10 % SDS (8 fli) . Etter behandling med fenol/kloroform og utfelling med etanol (to ganger) ble en enkeltrådet cDNA oppnådd. 2) Kobling av dC-kjede til det enkeltrådete cDNA Enkeltrådet cDNA som var oppnådd i 1), ble løst i destillert vann. Til løsningen ble det tilsatt 60 fil av en dC-kjede-koblingsbuffer (400 mM kaliumcacodylat, 50 mM Tris-HCl (pH 6,9), 4 mM ditiotreitol, 1 mM CaCl2 og 1 mM dCTP), og blandingen ble oppvarmet i fem minutter ved 37<*>C. Til reak-sjonsløsningen ble 3 fil av en terminal transferase (27 enheter /fil, P-L Biochemicals) , tilsatt og blandingen ble oppvarmet i 2,5 minutt ved 37'C. Deretter ble blandingen behandlet med fenol/kloroform (en gang) og presipitering ble foretatt med etanol (to ganger). Det oppnådde cDNA med en dC-hale ble løst i 40 ul av en TE-løsning inneholdende 100 mM NaCl.
3) Syntese av dobbeltrådet cDNA
Til 40 ul av DNA-løsningen fremstilt i 2), ble det tilsatt
4 ul oligo(dG)12_18 (200 ug/ml, P-L Biochemicals), og blandingen ble først oppvarmet i fem minutter ved 65°C, deretter i 30 minutter ved 42°C. Mens oppløsningen ble holdt ved en temperatur på 0°C, ble det tilsatt 80 ul av en buffer (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM MgCl2, 50 mM (NH4)2S04, og 500 mM KC1), 4 ul 4 mM dNTP (inneholdende 4 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP) , 60 ul 1 mM (3-NAD, 210 ul destillert vann, 20 ul E. coli DNA polymerase I (Takara Shuzo Co., Ltd.), 15 [il
E. coli DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) og 15 ul E. coli RNase H (Takara Shuzo Co., Ltd.), og blandingen fikk reagere i en time ved 12'C. Deretter ble det tilsatt 4 mM dNTP (4 ul) og reaksjonen fikk fortsette i en time ved 25'C. Deretter ble løsningen behandlet med fenol/kloroform og utfelt med etanol (en gang), idet omkring 8 ug av en dobbeltrådet cDNA ble oppnådd. Denne dobbeltrådete cDNA ble oppløst i en TE-løsning og underkastet 1,2 % agarosegelelektroforese. Fragmenter som var i overensstemmelse med en størrelse på ca. 560 bp til 2 kbp, ble adsorbert på Whatman DE81, og omkring 0,2 ug av den dobbeltrådete cDNA kunne utvinnes ved eluering.
4) Kobling av dC-kjede til den dobbeltrådete cDNA
Den dobbeltrådete cDNA fremstilt i 3) ble løst i 40 ul av en TE-løsning. Etter tilsetning av 8 ul av en dC-hale. koblings-buffer som beskrevet i 2) ble blandingen oppvarmet ved 37'C i to minutter. Etter tilsetning av 1 ul av en terminal transferase (27 enheter/ul), ble blandingen reagert i tre minutter ved 37"C. Deretter ble reaksjonsløsningen umiddelbart avkjølt til 0'C, og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1 (il 0,5 mM EDTA. Etter behandling med fenol/kloroform og presipitering med etanol, ble det oppnådde presipitat løst i 10 (il av en TE-løsning.
5) Konstruksjon av pBR-linje cDNA-bibliotek
4 ul av en vanlig tilgjengelig oligo(dG)-halet pBR322 vektor (Bethesda Research Laboratories, 10 ng/ul) og 2 ul av den dobbeltrådete cDNA oppnådd i punkt 4) som hadde en dC-hale ble annealet i en TE-løsning inneholdende 75 ul 0,1 M NaCl. Annealingen omfattet tre trinn: oppvarming i fem minutter ved 65'C, deretter oppvarming i to timer ved 40°C etterfulgt av avkjøling til romtemperatur.
I overensstemmelse med metoden som er beskrevet i laboratorie-manualen til Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, side 249 ff. (1982)) (andre rutineteknikker kan også anvendes her), ble kompetente celler fremstilt fra E. coli stammen X177 6, og transformert med annealet plasmid for fremstilling av transformanter.
EKSEMPEL 7: Syntese av cDNA (konstruksjon av et
X.-fagbibliotek)
1) Syntese av enkeltrådet cDNA
I overensstemmelse med fremgangsmåtene som er beskrevet i eksempel 5, ble 3,8 g frosne CHU-2-celler renset to ganger på en oligo(dT)-cellulosekolonne og deretter bearbeidet for å oppnå 400 ug poly (A+)-RNA. 12 ug poly(A<+>)-RNA ble løst i en TE-løsning (10 ul) som ble plassert i et reagensrør inneholdende 10 ug actinomycin D (Sigma). Deretter ble røret tilført reagenser i følgende rekkefølge: 20 ul av en revers transkripsjonsbuffer (250 mM Tris-HCl (pH 8,3), 40 mM MgCl2, 250 mM KC1), 20 Ul 5 mM dNTP (inneholdende 5 mM av hver av dATP, dGTP, dCTP og dTTP), 20 ul oligo(dT)12_18 (0,2 ug/ml, P-L Biochemicals), 1 ul 1 M ditiotreitol, 2 ul RNasin (30 enheter/ul, Promega Biotech), 10 ul av en revers transkriptase (10 enheter/ul, Seikagaku Kogyo Co., Ltd.), 1 ul (X-<32>P-dATP (10 uCi, Amerscham) , og 16 ul vann. Reaksjonsløsningen med et totalt volum på 100 ul ble oppvarmet i to timer ved 42'C og reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av 0,5 M EDTA (5 ul) og 20 % SDS
(1 ul). Ved påfølgende behandling med fenol/kloroform (100 ul) og presipitering med etanol (to ganger) ble omtrent 4 ug av en enkeltrådet cDNA oppnådd.
2) Syntese av dobbeltrådet cDNA
cDNA oppnådd i 1) ble løst i 29 ul av en TE-løsning og en reaksjonsløsning ble fremstilt ved tilsetning av følgende reagenser i den nevnte rekkefølge: 25 ul polymerasebuffer (400 mM Hepes (pH 7,6), 16 mM MgCl2, 63 mM p-merkaptoetanol og 270 mM KC1), 10 Ul 5 mM dNTP, 1,0 Ul 15 mM (3-NAD, 1,0 Ul OC-<32>P-dATP (10 uCi/ul), 0,2 Ul E. coli DNA-ligase (60 enheter/fli, Takara Shuzo Co., Ltd.), 5,0 ul E. coli DNA-polymerase I (New England Biolabs, 10 enheter/ul), 0,1 ul RNase H (60 enheter/Ul, Takara Shuzo Co., Ltd.), og 28,7 ul destillert vann.
Reaksjonsløsningen ble inkubert ved 14'C i en time, deretter ble temperaturen i løsningen regulert til romtemperatur, hvorpå løsningen ble inkubert ytterligere en time. Deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 0,5 M EDTA (5 ul) og 20 % SDS (1 ul), og løsningen ble behandlet med fenol/kloroform og presipitert med etanol. Det oppnådde DNA ble oppløst i 20 ul 0,5 mM EDTA og en reaksjonsløsning ble fremstilt ved tilsetning av 3 ul av en Klenow-buffer (500 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 50 mM MgCl2) , 3 ul 5 mM dNTP og 4 ul vann. Etter tilsetning av 1 ul av en DNA-polymerase (Klenow-fragment, Takara Shuzo Co., Ltd.), ble reaksjonsløsningen inkubert i 15 minutter ved 3 0'C.
Den inkuberte reaksjonsløsningen ble fortynnet med 7 0 ul av en TE-løsning, og reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,5 M EDTA (5 ul) og 20 % SDS (1 ul). Deretter ble løsningen behandlet med fenol/kloroform og presipitert med etanol, idet omkring 0,8 ug av en dobbeltrådet cDNA ble oppnådd.
3) Metylering av dobbeltrådet cDNA
En vandig løsning (30 ul) av dobbeltrådet cDNA syntetisert i punkt 2) ble blandet med 40 (il av en buffer som anvendes for metylering (500 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA), 20 ul av en SAM-løsning (800 (IM S-adenosyl-L-metylmetionin (SAM) , 50 mM P-merkaptoetanol), og 100 ul vann. Til blandingen ble det tilsatt 15 ul av en EcoRI-metylase (New England Biolabs, 2 0 enheter/ul), for å oppnå et totalt volum for reaksjonsblandingen på 200 ul. Blandingen ble inkubert i to timer ved 37'C, etterfulgt av behandling med fenol og eter og presipitering med etanol for utvinning av DNA.
4) Addisjon av EcoRI-linker
Til omkring 1,2 ug av den metylerte dobbeltrådete DNA ble det tilsatt 1,5 ul av en ligasebuffer (250 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 100 mM MgCl2), 0,5 ul av en preliminær fosforylert EcoRI-linker (lOmer, Takara Shuzo Co., Ltd.), 1,5 fil 10 mM ATP,
1,5 ul 100 mM ditiotreitol og 2 ul H20 for å fremstille en reaksjonsløsning med totalvolum 15 ul.
Etter tilsetning av 0,7 ul T4 DNA-ligase (3,4 enheter/ul, Takara Shuzo Co., Ltd.), ble reaksjonen utført ved 4'C over natten. Deretter ble ligasen inaktivert ved oppvarming til 65'C i ti minutter. Reaksjonsløsningen ble tilsatt 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 100 ug/ml gelatin, til et totalvolum på 50 ul. Deretter ble EcoRI
(3,5 ul, 10 enheter/ul) tilsatt, og reaksjonen ble utført ved 37"C i to timer. Deretter ble 2,5 ul 0,5 M EDTA og 0,5 ul 20 % SDS tilsatt, etterfulgt av behandling med fenol/kloroform og presipitering med etanol for å utvinne DNA. Deretter ble ureagert EcoRI-linker fjernet ved gelfiltrering på Ultrogel AcA34 (LKB) eller agarosegelelektroforese, slik at omkring 0,5
- 0,7 ug av dobbeltrådet cDNA med linker ble utvunnet.
5) Kobling av dobbeltrådet cDNA til XgtlO-vektor Den dobbeltrådete cDNA med linker ble blandet med 2,4 ug av en X,gtl0-vektor som var behandlet med EcoRI (Vector Cloning System), 1,4 ul av en ligasebuffer (250 mM Tris-HCl og 100 mM MgCl2) og 6,5 ul destillert vann, og blandingen ble oppvarmet ved 42<*>C i 15 minutter. Deretter ble 1 ul 10 mM ATP, 1 ul 0,1 M ditiotreitol og 0,5 ul T4 DNA-ligase tilsatt til et totalt volum på 15 ul, og reaksjonen ble gjennomført over natten ved temperatur 12'C.
6) In vitro pakking
Omkring en tredjedel av det rekombinante DNA fremstilt i punkt 5) ble pakket med et in vitro pakkingskit (Promega Biotech), for å oppnå fagplaques.
EKSEMPEL 8: Screening av pBR-linje bibliotek med probe
(IWQ)
Whatman 541-papir ble plassert på et kolonivoksende agarmedium som ble plassert ved 37'C i to timer. Filterpapiret ble deretter behandlet ved hjelp av den følgende metode etter Taub og Thompson (Anal. Biochem., 126, 222 (1982)).
Koloniene som var overført på 541-papiret ble dyrket videre på et agarmedium inneholdende kloramfenikol (250 ug/ul) over natten ved 37'C.
541-papiret ble deretter lagt på et annet filterpapirark, som var impregnert med en løsning av 0,5 N NaOH, ved romtemperatur i tre minutter. Denne prosedyre ble gjentatt to ganger. To lignende behandlinger ble utført i tre minutter, under anvendelse av en løsning av 0,5 M Tris-HCl (pH 8). Ved 4'C ble papiret behandlet med en løsning av 0,05 M Tris-HCl (pH 8) i tre minutter, og med 1,5 mg/ml av en lysozymløsning (inneholdende 0,05 M Tris-HCl (pH 8) og 25 % sukrose) i ti minutter, deretter, ved 37°C, ble papiret behandlet med en løsning av 1 x SSC (0,15 M NaCl og 0,015 M natriumcitrat) i to minutter, og med en 1 x SSC-løsning inneholdende 200 ug/ml proteinase K i 30 minutter, hvorpå papiret til slutt ble behandlet med en 1 x SSC-løsning i to minutter og med en 95 % etanolløsning i to minutter ved romtemperatur. Det siste trinnet ble gjentatt to ganger. Deretter ble 541-papiret tørket. Det tørkede 541-papiret ble nedsenket i en blanding av fenol/kloroform/isoamylalkohol i forholdet 25:24:1 (innstilt til likevekt med 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM NaCl og 10 mM EDTA) i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble lignende prosedyrer gjentatt tre ganger med en 5 x SSC-løsning i tre minutter, deretter to ganger med en 95 % etanolløsning i tre minutter. Filterpapiret ble deretter tørket.
Proben (IWQ) ble merket med <32>P i overensstemmelse med rutineprosedyrer (se Molecular Cloning) og kolonihybridisering ble utført i overensstemmelse med metoden etter Wallace et al.
(Nucleic Acids Res., 9, 879 (1981)). Prehybridisering var gjennomført ved 65'C i fire timer i en hybridiseringsbuffer inneholdende 6 x NET (0,9 M NaCl, 0,09 M Tris-HCl (pH 7,5), og 6 mM EDTA), 5 x Denhardt's løsning, 0,1 % SDS og 0,1 mg/ml denaturert DNA (kalvetymus). Deretter ble hybridisering utført over natten ved 56'C i en hybridiseringsbuffer (sammen-setningen av bufferen er som nevnt over), inneholdende 1 x IO<6 >cpm/ml av den radioaktivt merkede probe (IWQ). Etter full-føring av reaksjonen ble 541-papiret vasket to ganger med en 6 x SSC-løsning (inneholdende 0,1 % SDS) i 3 0 minutter ved romtemperatur og deretter vasket ved 56<*>C i 1,5 minutt. Det vaskede 541-papiret ble deretter underkastet autoradiografi.
Plasmidet ble separert fra de positive klonene og underkastet Southern blotting med proben (IWQ). Hybridisering og autoradiografi ble gjennomført ved de samme betingelser som beskrevet over.
Likeledes ble Southern blotting utført med proben (A). Ved anvendelse av en hybridiseringsbuffer med en sammensetning som vist over, ble hybridisering først gjennomført ved 49'C i en time. Etter henstand ved 39'C ble hybridiseringen fortsatt ved den samme temperatur i en time. Etter at reaksjonen var fullført ble et nitrocellulosefilter vasket to ganger med 6 x SSC, inneholdende 0,1 % SDS, i 30 minutter ved romtemperatur og deretter vasket ved 39"C i tre minutter. Det vaskede papir ble underkastet autoradiografi.
Resultatet var at et eneste klon ble funnet å være positivt. Nukleotidsekvensering ved hjelp av dideoksymetoden viste at dette klonet hadde et DNA som besto av 308 basepar inneholdende deler av både probe (IWQ) og probe (A). Det pBR322-avledete plasmid som inneholdt dette innskudd ble kalt pHCS-1.
EKSEMPEL 9: Screening av A-fag-linje bibliotek med
pHCS-1 avledet DNA-prøve
Plaquehybridisering ble utført i overensstemmelse med metoden etter Benton og Davis (Science, 196, 180 (1977)). pHCS-1, som ble oppnådd i eksempel 8, ble behandlet med Sau3A og EcoRI for å oppnå et DNA-fragment på ca. 600 bp. Dette DNA-fragment ble radioaktivt merket ved hjelp av nick-translasjon i overensstemmelse med kjente prosedyrer. Et nitrocellulosefilter (S & S) ble plassert på det fagplaquevoksende agarmedium med den hensikt å overføre fagene på filteret. Etter denaturering av fag-DNA med 0,5 M NaOH ble filterpapiret behandlet ved hjelp av følgende prosedyrer: behandling med 0,1 M NaOH og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, to behandlinger med 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, og endelig behandling med 12 0 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat, 13 mM KH2P04 og 1 mM EDTA (pH 7,2) i 2 0 sekunder.
Filteret ble deretter tørket og oppvarmet i to timer ved 80'C for å immobilisere DNA. Prehybridisering ble utført over natten ved 42'C i en prehybridiseringsbuffer inneholdende 5 x SSC, 5 x Denhardfs løsning, 50 mM f osf atbuf f er, 50 % formamid, 0,25 mg/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier) og 0,1 % SDS. Deretter ble hybridiseringen utført ved 42<*>C i 2 0 timer i en hybridiseringsbuffer inneholdende 4 x IO<5> cpm/ml av pHCS-1 proben, som var blitt merket radioaktivt ved hjelp av nick-translasjon. Denne hybridiseringsbufferen var en blanding av 5 x SSC, 5 x Denhardfs løsning, 2 0 mM fosfatbuffer (pH 6,0), 50 % formamid, 0,1 % SDS, 10 % dekstransulfat og 0,1 mg/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier).
Det hybridiserte nitrocellulosefilter ble vasket i 20 minutter med 2 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved romtemperatur, deretter med 0,1 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved 44<*>C i 30 minutter, og endelig i ti minutter med 0,1 x SSC ved romtemperatur. Påvisning ved hjelp av autoradiografi ble deretter utført.
Resultatet var at fem positive kloner (Gl - G5) ble oppnådd. Klonet som inneholdt en "full-lengde" cDNA ble undersøkt med hensyn på dets DNA-nukleotidsekvens ved hjelp av dideoksymetoden, og nukleotidsekvensen som er vist i fig. 3(A) ble identifisert. Dette cDNA ble kuttet ut av A.gt 10-vektoren og festet til pBR327 (Soberon et al., Gene, 9, 287 (1980)) ved EcoRI-stedet for å danne et plasmid som kunne fremstilles i større mengder. Dette plasmid ble kalt pBRG4.
EKSEMPEL 10: Screening av A-fag-linje bibliotek med
en pBRG4-avledet DNA-probe og probe (LC) Plaquehybridisering ble utført i overensstemmelse med metoden etter Benton og Davis (se Science, ibid.) anvendt i eksempel 9. Et nitrocellulosefilter (S & S) ble plassert på et fagplaquevoksende agarmedium for å overføre fagene på filteret. Etter denaturering av fag DNA med 0,5 M NaOH, ble filteret behandlet ved hjelp av følgende prosedyrer: behandling med 0,1 M NaOH og 1,5 M NaCl i 2 0 sekunder, deretter to behandlinger med 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, og til slutt behandling med 120 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat, 13 mM KH2P04 og 1 mM EDTA (pH 7,2) i 2 0 sekunder. Filteret ble deretter tørket, og oppvarmet i to timer ved 80'C, for å immobilisere DNA. To ark av det samme filter ble fremstilt ved hjelp av den ovennevnte fremgangsmåte, og deretter underkastet screening med den pBRG4-avledete DNA-probe og proben (LC).
Screening med den pBRG4-avledete DNA-proben ble utført ved hjelp av følgende prosedyrer. pBRG4 ble behandlet med EcoRI for å oppnå et DNA-fragment på ca. 1500 bp. Dette DNA-fragment ble merket radioaktivt ved hjelp av nick-translasjon i overensstemmelse med kjente fremgangsmåter. Ett av de to nitrocellulosefilterne ble underkastet prehybridisering over natten ved 42'C i en prehybridiseringsbuffer inneholdende 5 x SSC, 5 x Denhardfs løsning, 50 mM f osfatbuf fer, 50 % formamid, 0,25 mg/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier) og 0,1 % SDS. Deretter ble filteret underkastet hybridisering i 20 timer ved 42'C i en hybridiseringsbuffer, inneholdende den radioaktivt merkede DNA-proben (ca. 1 x IO<6> cpm/ml) på ca. 1500 bp. Denne hybridiseringsbufferen var en blanding av 5 x SSC, 5 x Denhardfs løsning, 20 mM fosfatbuffer (pH 6,0), 50 % formamid, 0,1 % SDS, 10 % dekstransulfat og 0,1 mg/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier). Det hybridiserte nitrocellulosefilteret ble vasket i 20 minutter ved romtemperatur med 2 x SSC inneholdende 0,1 % SDS, deretter i 3 0 minutter ved 44 *C med 0,1 x SSC inneholdende 0,1 % SDS og endelig i ti minutter ved romtemperatur med 0,1 x SSC. Påvisning ved hjelp av autoradiografi ble deretter utført.
Screening med proben (LC) ble utført ved hjelp av følgende prosedyrer. Det andre filteret var forbehandlet med 3 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved 65'C i to timer. Deretter ble en prehybridisering utført ved 65°C i to timer i en løsning inneholdende 6 x NET, 1 x Denhardfs løsning, og 100 ug/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier). Hybridisering ble deretter utført over natten ved 63°C i en hybridiseringsbuffer inneholdende den radioaktivt merkede probe (LC) (2 x IO<6 >cpm/ml). Denne hybridiseringsbuffer var også en blanding av 6 x NET, 1 x Denhardfs løsning og 100 Ug/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier). Det hybridiserte nitrocellulosefilter ble vasket tre ganger (20 minutter hver gang) med 6 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved romtemperatur, deretter vasket med 6 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved 63'C i to minutter.
Filteret ble tørket og påvisning ble utført ved hjelp av autoradiografi.
I screeningen som er beskrevet over ble kloner som var positive til begge prober utvalgt, og klonet som inneholdt en "full-lengde" cDNA ble undersøkt med hensyn på dets nukleotidsekvens ved hjelp av dideoksymetoden. Klonet ble funnet å ha nukleotidsekvensen som er vist i fig. 4(A). Dette cDNA ble kuttet ut av A.gt 10-vektoren og festet til pBR327 ved EcoRI-stedet for å fremstille et plasmid pBRV2.
EKSEMPEL 11: Screening av humant kromosomalt genbibliotek
1) Konstruksjon av et humant kromosomalt genbibliotek
Det humane kromosomale genbibliotek som var tilveiebragt av Dr. Maniatis på Harvard University var blitt fremstilt ved de følgende prosedyrer: hele det kromosomale DNA ble ekstrahert fra den humane føtale lever med fenol eller andre passende kjemikalier og delvis kuttet med restriksjonsenzymene Haelll og Alul, de oppnådde DNA-fragmentene ble behandlet ved hjelp av sukrosedensitetsgradientsentrifugering for å konsentrere fragmentene som hadde kjedelengder på omkring 18 - 25 kb, de konsentrerte fragmentene ble deretter koblet til DNA-armen i E. coli fag-X Charon 4A, idet kortkjedete syntetiske nukleotider som hadde kuttestedene til restriksjonsenzymet EcoRI var innført, for å fremstille infeksiøse fag-DNA rekombinanter. Flere rensede fag-X partikler ble dannet ved hjelp av såkalt pakking i den hensikt å tilveiebringe øket infeksiøshet. Det fremstilte humane genbibliotek er teoretisk betraktet til å være et sett rekombinanter inneholdende humane DNAer med kjedelengder på 18 - 25 kb, som inneholdt praktisk talt alle humane gener.
2) Screening av det humane kromosomale genbibliotek med den
pHCS-1 avledete DNA-probe
Plaquehybridisering ble utført i overensstemmelse med metoden etter Benton og Davis (Science, 196, 180 (1977)). pHCS-1 oppnådd i eksempel 8 ble behandlet med Sau3A og EcoRI for å oppnå et DNA-fragment på ca. 600 bp. Dette DNA-fragment ble merket radioaktivt ved hjelp av nick-translasjon i overensstemmelse med vanlige prosedyrer. Et nitrocellulosefilter (S & S) ble plassert på det fagplaquevoksende agarmedium for å overføre fagene på filteret. Etter at fag-DNA var denaturert med 0,5 NaOH, ble filterpapiret behandlet ved hjelp av føl-gende prosedyrer: behandling med 0,1 M NaOH og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, deretter to behandlinger med 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, og til slutt behandling med 120 mM NaCl, 15 mM. natriumcitrat, 13 mM KH2P04 og 1 mM EDTA (pH 7,2) i 20 sekunder.
Filteret ble deretter tørket og oppvarmet ved 80'C i to timer for å immobilisere DNA. Prehybridisering ble utført over natten ved 42'C i en prehybridiseringsbuffer som inneholdt 5 x SSC, 5 x Denhardfs løsning, 50 mM f osf atbuf fer, 50 % formamid, 0,25 mg/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier) og 0,1 % SDS. Deretter ble hybridisering utført ved 42'C i 2 0 timer i en hybridiseringsbuffer inneholdende 4 x 10<5> cpm/ml pHCS-1 probe, som var blitt radioaktivt merket ved hjelp av nick-translasjon. Denne hybridiseringsbuffer var en blanding av 5 x SSC, 5 x Denhardfs løsning, 20 mM fos f atbuf fer (pH 6,0), 50 % formamid, 0,1 % SDS, 10 % dekstransulfat og 0,1 mg/ml denaturert DNA (DNA fra laksespermier).
Det hybridiserte nitrocellulosefilteret ble deretter vasket i 2 0 minutter med 2 x SSC inneholdende 0,1 % SDS ved romtemperatur, deretter med 0,1 x SSC inneholdende 0,1 % SDS i 30 minutter ved 44°C og til slutt med 0,1 x SSC ved romtemperatur i ti minutter. Påvisning ved hjelp av autoradiografi ble deretter utført.
Som et resultat ble noe over ti positive kloner oppnådd. Rekombinant DNA ble fremstilt fra disse klonene ved hjelp av metoden etter Maniatis (Cell, 15, 687 (1978)). De oppnådde DNAer ble behandlet med restriksjonsenzymer, slik som EcoRI, Baml og Bglll, analysert ved hjelp av agarosegelelektroforese, og deretter ble deres restriksjonsenzymkart fremstilt i overensstemmelse med metoden etter Fritsch et al. (se Cell, ibid.).
Southern-hybridisering ble utført idet proben var det radioaktivt merkede pHCS-l-avledete DNA-fragment, som var identisk med det som ble anvendt i de ovennevnte screeningprosedyrene. Et DNA-fragment på ca. 8 kbp, og som var kuttet med EcoRI ble utvalgt fra klonene som hybridiserte med proben. Dette fragment ble subklonet til EcoRI-stedet i pBR327. Det subklonede DNA ble underkastet enda en behandling med restriksjonsenzymer, og Southern-hybridisering ble deretter utført gjen-tatte ganger. Et DNA-fragment på ca. 4 kbp, som var kuttet ut med EcoRI og Xhol, ble funnet å inneholde et gen som koder for det humane G-CSF polypeptid. Dette DNA-fragment ble undersøkt med hensyn på sekvensen av fragmentets ca. 3 kbp-del ved hjelp av dideoksymetoden, og nukleotidsekvensen som er vist i fig. 5 ble identifisert. Dette DNA-fragment hadde restriksjonsenzym-kuttesteder som vist i fig. 7.
Screening av humane kromosomale gener ble også utført ved anvendelse av pBRG4-avledet DNA og pBRV2-avledet DNA som prober. I hvert tilfelle ble et DNA-fragment på 1500 bp som var blitt behandlet med EcoRI direkte radioaktivt merket ved hjelp av nick-translasjon på samme måte som beskrevet over, eller, som et alternativ, ble et DNA-fragment på ca. 700 bp, og som var oppnådd ved påfølgende behandlinger med EcoRI og Dral, radioaktivt merket ved hjelp av nick-translasjon. Den fremstilte proben ble anvendt i plaquehybridisering, som ble utført under de samme betingelser som beskrevet over. Utvalgte kloner ble undersøkt ved hjelp av Southern-hybridisering for å oppnå et DNA-fragment som hadde nukleotidsekvensen som er vist i fig. 5. Det oppnådde plasmid ble kalt
PBRCE3P-
EKSEMPEL 12: Konstruksjon av E. coli rekombinant vektor (+VSE) og transformasjon (ved anvendelse av tac
promoterinneholdende vektor)
1) Konstruksjon av rekombinant vektor
(i) Fremstilling av vektor
5 ug av en tac promoterinneholdende vektor pKK223-3 (Pharmacia) ble behandlet med åtte enheter av EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) i to timer ved 37'C i 30 ul av en reaksjonsløsning (40 mM Tris-HCl), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 7 mM 2-merkaptoetanol).
Deretter ble de tilsatt 3 ul av en alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) og behandlingen ble gjennomført ved 60"C i 30 minutter. Det ble oppnådd et DNA-fragment etter tre behandlinger med fenol, en behandling med eter og presipitering med etanol, idet alle behandlingene ble utført i overensstemmelse med kjente prosedyrer.
Det oppnådde DNA-fragment ble løst i en 50 jil blanding som besto av 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Etter tilsetning av 3 ul av en E. coli DNA-polymerase I - Klenow-fragment (Takara Shuzo Co., Ltd.), ble reaksjonen utført i to timer ved 14"C for å oppnå butte ender.
(ii) Fremstilling av en syntetisk linker
3 |lg av oligonukleotidene som hadde sekvensene til syntetiske linkere, CGAATGACCCCCCTGGGCC og CAGGGGGGTCATTCG, ble fosforylert ved at reaksjonen ble utført i 40 ul av en reaksjonsløs-ning (bestående av 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-merkaptoetanol og 1 mM ATP) ved 37'C i 60 minutter, og i nærvær av fire enheter T4-polynukleotidkinase.
Hver av de fosforylerte oligonukleotidene (0,2 ug) ble løst i 2 0 ul av en 100 mM NaCl-inneholdende TE-løsning (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA). Etter behandling ved 65°C i ti minutter ble oligonukleotidene annealet ved sakte avkjøling til romtemperatur.
(iii) Fremstilling av G- CSF cDNA- fragment
60 ug av pBRG4 som var fremstilt i eksempel 9, og som inneholdt det cDNA som er vist i fig. 3(A), ble behandlet med 100 enheter av et restriksjonsenzym Apal (New England Biolabs) og 50 enheter av Dral (Takara Shuzo Co.,Ltd.) i tre timer ved 37'C i 200 ul av en reaksjonsløsning bestående av 6 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, og 6 mM 2-merkaptoetanol. Omkring 2 ug av et Apal-Dral-fragment (ca. 590 bp) ble oppnådd ved 1,2 % agarosegelelektroforese.
(iv) Ligering av fragmenter
Omkring 0,1 ug av hvert av fragmentene fremstilt i (i) til (iii) ble oppløst i 20 ul av en ligeringsløsning (66 mM Tris-HCl, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP). Etter tilsetning av 175 enheter T4 DNA-ligase fikk løsningen stå over natten ved 4'C for å oppnå en rekombinant vektor (fig. 8).
2) Trans formasj on
Ved anvendelse av 20 ul av en reaksjonsløsning inneholdende den rekombinante vektor fremstilt i (iv), ble E. coli stamme JM105 transformert ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren (se T. Maniatis et al., Molecular Cloning, s. 252 (1982)). Plasmidet ble separert fra en ampicillinresistent cellekoloni-kultur av transformanter, og behandlet med restriksjonsenzymene BamHI, AccII og Apal for å bekrefte at transformantene var de man hadde til hensikt å fremstille.
EKSEMPEL 13: Konstruksjon av E. coli rekombinant vektor (+VSE) og transformasjon (under anvendelse av
en PL-promoterinneholdende vektor)
1) Konstruksjon av rekombinant vektor
(i) Vektorfremstilling
100 ug av en PL promoterinneholdende vektor pPL-A. (Pharmacia) ble behandlet over natten ved 37"C med 50 enheter av et restriksjonsenzym BamHI i 100 ul av en reaksjonsløsning (10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 10 mM DTT).
Ved å underkaste reaksjonsløsningen for 1 % agarosegelelektroforese ble omtrent 49 ug av et tilnærmet 4 kb fragment og omkring 11 ug av et tilnærmet 1,2 kb fragment oppnådd. 4 kb fragmentet ble løst i 100 ul av en TE-buffer (sammenset-ningen av bufferen er som over) og defosforylert ved reaksjon med en alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) ved 60°C i 60 minutter. Det andre fragmentet med en lengde på omkring 1,2 kb ble oppløst i 20 ul av en buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 6 mM KCl og 1 mM DTT) og behandlet over natten med 20 enheter av restriksjonsenzymet MboII (New England Biolags) ved 37'C.
Ved 4 % polyakrylamidgelelektroforese ble omkring 0,9 ug av et BamHI-MboII-fragment (ca. 200 bp) og omkring 1,9 ug av et MboII-BamHI-fragment (ca. 310 bp) oppnådd.
(ii) Fremstilling av syntetisk linker
Oligonukleotidene som hadde sekvensene til syntetiske linkere, TAAGGAGAATTCATCGAT og TCGATGAATTCTCCTTAG, ble fosforylert og annealet som i (ii) i eksempel 12, for å fremstille en syntetisk S/D-linker.
(iii) Fremstilling av ekspresjonsvektor
En tiendedel av 1 |ig av fragmentet med ca. 4 kb, 0,05 ug av hver av BamHI-MboII-fragmentet med 0LPL-området og MboII-BamHI-fragmentet med tL^-området (de tre fragmentene som var fremstilt i (i)), og 0,1 ug av annealet syntetisk S/D-linker fremstilt i (ii) ble underkastet en reaksjon over natten ved 12°C i 40 ul av en reaksjonsløsning (66 mM Tris-HCl, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, og en 1 mM ATP) i nærvær av 175 enheter T4 DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). 20 ul av reaksjonsløs-ningen ble anvendt for å transformere E. coli stammen N99CI<+>
(Pharmacia) ved hjelp av kalsiumkloridprosedyren (se Molecular Cloning, ibid.).
Transformantene ble dyrket og plasmidet ble utvunnet fra kulturen av deres ampicillinresistente kolonier. Behandling av plasmidet med restriksjonsenzymene EcoRI, BamHI og Smal viste at man hadde tilveiebragt det ønskede plasmid. 2 ug av dette plasmid ble reagert med et restriksjonsenzym Clal (New England Biolabs) ved 37<*>C i to timer i 20 ul av en buffer (10 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl). Deretter ble enzymet inaktivert ved oppvarming ved 65'C i ti minutter. 1 ul av reaksjonsløsningen ble reagert over natten ved 12'C med 175 enheter T4 DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) i en ligeringsløsning, som hadde en sammensetning som beskrevet over. Reaksjonsløsningen ble deretter anvendt for å transformere E. coli stamme N99CI<+> (Pharmacia). Plasmidet ble gjenvunnet fra kulturen bestående av ampicillinresistente kolonier av transformantene, og behandlet med EcoRI og BamHI, for å bekrefte at det ovennevnte plasmid var det ønskede plasmid.
(iv) Fremstilling av en G- CSF- ekspresion rekombinant vektor og transformanter
Ekspresjonsplasmidet fremstilt i (iii) ble behandlet med restriksjonsenzymet Clal. Etter dannelse av butte ender ble plasmidet behandlet som i eksempel 12 for å fremstille en rekombinant vektor som hadde fått innført et G-CSF cDNA-fragment . Denne vektoren ble anvendt for å transformere E. coli stamme N4830 (Pharmacia Fine Chemicals) ved hjelp av kalsiumkloridprosedyren som er beskrevet i Molecular Cloning (ibid.) Identifisering av de ønskede transformantene ble utført som i eksempel 12 (fig. 9).
EKSEMPEL 14: Konstruksjon av E. coli rekombinant vektor (+VSE) og transformasjon (under anvendelse av
trp-promoterinneholdende vektor)
1) Konstruksjon av rekombinant vektor
(i) Vektorfremstill ing
Et plasmid, pOYl, ble fremstilt ved at en tryptofanpromoter
som inneholdt HpaII-TaqI-fragmentet (ca. 330 bp) ble innført i pBR322 på Clal-stedet. 10 ug av dette plasmidet ble behandlet med syv enheter av restriksjonsenzymet Clal og åtte enheter av PvuII ved 37 'C i tre timer i 30 ul av en reaksjonsløsning som utgjøres av 10 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl.
Deretter ble det tilsatt 2 ul av en alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.), og reaksjonen ble gjennomført ved 60<*>C i en time.
Et DNA-fragment (ca. 2,5 ug) med en lengde på omkring 2,6 kb, ble isolert fra reaksjonsløsningen ved hjelp av 1 % agarosegelelektroforese.
(ii) Fremstilling av en syntetisk linker
Oligonukleotidene som hadde sekvensene til syntetiske linkere, CGCGAATGACCCCCCTGGGCC og CAGGGGGGTCATTCG, ble fosforylert og annealet som i (ii) i eksempel 12, for å fremstille en syntetisk linker.
(iii) Fremstilling av rekombinant vektor
Omtrent 1 ug av vektorfragmentet fremstilt i (i), omtrent 1 ug av den syntetiske linker fremstilt i (ii) og omtrent 1 ug av G-CSF cDNA-fragmentet fremstilt i (iii) i eksempel 12, ble reagert med 175 enheter T4 DNA-ligase over natten ved 12 *C i 20 ul av en ligerende løsning som var sammensatt som beskrevet 1 eksempel 12 1) (iv), for å oppnå en rekombinant vektor (fig. 10).
2) Transformasjon
2 0 ul av reaksjonsløsningen fremstilt i (iii) ble anvendt for å transformere E. coli PHI ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren som er beskrevet i Molecular Cloning, ibid.
Som i eksempel 12 ble plasmidet utvunnet fra ampicillinresistente kolonier av transformantene, og en behandling av dette plasmidet med restriksjonsenzymene Apal, Dral, Nrul og Pstl viste at man hadde oppnådd de ønskede transformantene.
EKSEMPEL 15: Dyrking av transformanter
1) Dyrking av transf ormantene (med tac) som ble oppnådd i
eksempel 12
Transformantene ble dyrket over natten ved 37<*>C, og 1 ml av kulturen ble tilsatt til 100 ml av et Luria-medium inneholdende 25 ug/ml eller 50 ug/ml ampicillin. Dyrkingen ble gjennomført ved 37°C i to til tre timer.
Dyrkingen fortsatte i to til fire timer ved 37'C etter tilsetning av isopropyl-(3-D-tiogalaktosid, til en endelig konsentrasjon på 2 mM.
2) Dyrking av transf ormantene (med PL) som ble oppnådd i
eksempel 13
Transformantene ble dyrket over natten ved 28<*>C, og 1 ml av kulturen ble tilsatt til 100 ml av et Luria-medium inneholdende 2 5 eller 50 ug/ml ampicillin. Dyrkingen ble utført ved 2 8'C i omkring fire timer.
Deretter ble dyrkingen fortsatt ved 42 "C i to til fire timer.
3) Dyrking av transformantene (med trp) som ble oppnådd i
eksempel 14
Transformantene ble dyrket over natten ved 37"C og 1 ml av kulturen ble tilsatt til 100 ml av et M9 medium inneholdende 0,5 % glukose, 0,5 % Casamino-syrer (Difco) og 25 eller 50 ug/ml ampicillin. Dyrkingen ble utført i fire til seks timer ved 37 'C. Etter tilsetning av 50 Jig/ml 3-|3-indolakryl-syre (IAA) ble dyrkingen fortsatt ved 37'C i fire til åtte timer.
EKSEMPEL 16: Utvinning og rensing av G-CSF polypeptidet fra
E. coli
1) Utvinning
De tre artene av transformanter som var dyrket i eksempel 15 ble underlagt følgende utvinningsprosedyrer.
Kulturen (100 ml) ble sentrifugert for å oppnå en cellepellet som ble suspendert i 5 ml av en blanding av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 30 mM NaCl.
Deretter ble 0,2 M fenylmetylsulfonylfluorid, 0,2 M EDTA og et lysozym tilsatt, i konsentrasjoner på henholdsvis 1 mM, 10 mM og 0,2 mg/ml, og suspensjonen fikk stå ved 0'C i 3 0 minutter.
Cellene ble lysert ved at de ble frosset og tint tre ganger, eventuelt etterfulgt av sonikering. Lysatet ble sentrifugert for å oppnå supernatanten. Alternativt ble lysatet behandlet med 8 M guanidinhydroklorid, slik at lysatets endelige konsentrasjon var 6 M guanidinhydroklorid, etterfulgt av sentrifugering ved 30.000 rpm i fem timer og utvinning av supernatanten.
2) Rensing
(i) Supernatanten som var oppnådd i 1) ble underkastet gelfiltrering på en Ultrogel AcA54 kolonne (4,6 cm<0> x 90 cm<L>, LKB) ved en strømningshastighet på ca. 50 ml/time med 0,01 M Tris-HCl-buffer (pH 7,4) inneholdende 0,15 M NaCl og 0,01 % Tween 20 (Nakai Kagaku Co., Ltd.)
Fraksjonene som viste aktivitet ved analyse med CSA-analysemetoden (b) beskrevet tidligere ble selektert og konsentrert til et volum på ca. 5 ml ved hjelp av et ultrafiltrerings-apparat, pM-10 (Amicon). (ii) Til de konsentrerte fraksjonene ble det tilsatt n-propanol (av en kvalitet som er passende for sekvensbestem-melse av aminosyre, Tokyo Kasei Co., Ltd.) og trifluoreddiksyre, og blandingen ble behandlet slik at sluttkonsentra-sjonene av n-propanol og trifluoreddiksyre var henholdsvis 3 0 % og 0,1 %. Blandingen fikk stå på is ca. 15 minutter og deretter sentrifugert ved 15.000 rpm i ti minutter for å fjerne presipitatet. Supernatanten ble adsorbert på en u-Bondapak C18 kolonne (av semipreparativ type, Waters, 8 mm x 30 cm), som var innstilt til likevekt med en vandig løsning inneholdende n-propanol (se over) og trifluoreddiksyre. Kolonnen ble kontinuerlig eluert med en vandig løsning av 0,1 % trifluoreddiksyre inneholdende n-propanol med en lineær densitetsgradient på 30 - 60 %. Ved anvendelse av Hitachi-modell 685-50 (apparat for høytrykksvæskekromatografi fra Hitachi Ltd.) og Hitachi-modell 638-41 (detektor fra Hitachi Ltd.) ble adsorpsjonene ved 220 nm og 280 nm målt samtidig. Etter eluering ble en prøvemengde på 10 ul fra hver fraksjon fortynnet 100 ganger og de fortynnede løsningene ble undersøkt med hensyn på aktive fraksjoner ved hjelp av CSA-analysernetoden (b). Det ble observert aktivitet i toppene som var eluert med 40 % n-propanol. Disse toppene ble kombinert og kromatografert på nytt ved samme betingelser som over, og fraksjonene ble undersøkt med hensyn på aktivitet ved hjelp av metode (b). Igjen ble det funnet aktivitet i toppene med 40 % n-propanol. Disse aktive toppene ble samlet (fire fraksjoner = 4 ml) og frysetørket. (iii) Det frysetørkede pulver ble løst i 2 00 ul av en vandig løsning av 0,1 % trifluoreddiksyre inneholdende 40 % n-propanol, og løsningen ble underkastet høytrykksvæskekromato-grafi på TSK-G3000SW-kolonne (7,5 mm x 60 cm, Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.). Eluering ble gjennomført ved en strømningshastighet på 0,4 ml/min med en vandig løsning av 0,1 % trifluoreddiksyre inneholdende 40 % propanol, idet fraksjoner på 0,4 ml ble tatt ut ved hjelp av en fraksjonssamler, FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemicals). Fraksjonene ble under-søkt med hensyn på CSA som beskrevet over og de aktive fraksjonene ble oppsamlet. De ble så renset på en analytisk (i-Bondapak C18 kolonne (4,6 mm x 30 cm) og hovedtoppen ble utvunnet og frysetørket.
Det oppnådde protein ble behandlet med 2-merkaptoetanol og underkastet SDS-polyakrylamidgel (15,0 %) elektroforese (15 mV, seks timer). Ved farging med Coomassie-blått kunne det ønskede G-CSF polypeptid identifiseres som et eneste bånd.
EKSEMPEL 17: Måling av G-CSF aktivitet (+VSE)
CSF-prøven som ble oppnådd i eksempel 16 ble analysert i overensstemmelse med CSF-analysemetoden (a), som er beskrevet tidligere. Resultatene er vist i tabell 1.
EKSEMPEL 18: Aminosyreanalyse (+VSE)
1) Analyse av aminosyresammensetning
CSF-prøven som var renset i eksempel 16 ble hydrolysert ved hjelp av vanlige prosedyrer, og aminosyresammensetningen av proteindelen av hydrolysatet ble undersøkt ved hjelp av en automatisk aminosyreanalysator, Hitachi 835 (Hitachi Ltd.). Resultatene er vist i tabell 2. Hydrolyse ble utført under følgende betingelser:
(i) 6 N HC1, 110<*>C, 24 timer, i vakuum,
(ii) 4 N metansulfonsyre +0,2 % 3-(2-aminoetyl)indol,
110<*>C, 24 timer, 48 timer, 72 timer, i vakuum.
Prøven ble oppløst i en løsning (1,5 ml) inneholdende 40 % n-propanol og 0,1 % trifluoreddiksyre. Prøver på 0,1 ml ble tørket med tørr nitrogengass og, etter tilsetning av reagensene angitt i (i) eller (ii), ble prøverørene forseglet i vakuum, etterfulgt av hydrolyse av prøvene.
Hver av verdiene vist i tabell 2 var gjennomsnittet av fire målinger, 24 timers verdi for (i) og 24, 48 og 72 timers verdier for (ii), med unntak av at innholdene av Thr, Ser, ^ys, Met, Val, Ile og Trp ble beregnet ved hjelp av følgende metoder (se Tampaku Kagaku, (Protein Chemistry) II, A Course in Biochemical Experiments, Tokyo Kagaku Dohjin): For Thr, Ser, ^ys og Met ble den tidsavhengige profilen av 24, 48 og 72 timers verdiene for (ii) ekstrapolert ved null timer.
For Val og Ile ble 72 timers verdien for (ii) anvendt. For Trp ble gjennomsnittet av 24, 48 og 72 timers verdiene for (ii) anvendt.
2) Analyse av N-terminale aminosyrer
Prøven ble underkastet Edman nedbrytning med en gassfasesekvensator (Applied Biosystems) og PTH-aminosyren som ble oppnådd ble analysert ved hjelp av rutineprosedyrer med en høytrykksvæskekromatograf (Beckman Instruments) og Ultrasphere-ODS-kolonne (Beckman Instruments).
Etter at kolonnen (5 Jim, 4,6 mm<0> x 250 mm) var innstilt til likevekt med en utgangsbuffer (en vandig løsning inneholdende 15 mM natriumacetatbuffer (pH 4,5) og 40 % acetonitril), ble prøven (oppløst i 20 ul av utgangsbufferen) injisert og man oppnådde separasjon ved hjelp av isokratisk eluering med utgangsbufferen. Under elueringen var strømningshastigheten 1,4 ml/min og kolonnetemperaturen var 40'C. Påvisning av PTH-aminosyren ble gjennomført ved anvendelse av absorpsjon i det ultrafiolette området ved 269 nm og 320 nm. Standard prøver (hver på 2 nmol) av PTH-aminosyre (Sigma) var også blitt separert på samme måte for å bestemme deres retensjonstider, som så ble sammenlignet med den angjeldende prøves retensjons-tid i den hensikt å identifisere de N-terminale aminosyrer. Resultatet var at PTH-methionin og PTH-threonin ble påvist.
EKSEMPEL 19: Konstruksjon av e. coli rekombinant vektor
(-VSE) og transformasjon
1) Anvendelse av en tac promoterinnholdende vektor Fremgangsmåtene i overensstemmelse med eksempel 12 ble gjentatt med unntak av at "pBRG4 fremstilt i eksempel 9 som inneholdt cDNA vist i fig. 3(A)" (se (iii) i eksempel 12) ble byttet med "pBRV2 fremstilt i eksempel 10, som inneholdt cDNA vist i fig. 4(A)". Som i eksempel 12 viste det seg at de oppnådde transf ormantene var de man ønsket å fremstille
(fig. 11).
2) Anvendelse av PL promoterinneholdende vektor Fremgangsmåtene i eksempel 13 ble gjentatt ved anvendelse av cDNA (-VSE) og de oppnådde transformantene viste seg å være dem man ønsket å fremstille (fig. 12). 3) Anvendelse av trp promoterinneholdende vektor Fremgangsmåtene i eksempel 14 ble gjentatt ved anvendelse av cDNA (-VSE), og de oppnådde transformatorene viste seg å være dem man ønsket å fremstille (fig. 13).
EKSEMPEL 20: Måling av G-CSF-aktivitet (-VSE)
De tre transformanttypene som ble oppnådd i eksempel 19 ble dyrket ved hjelp av metoden som er beskrevet i eksempel 15.
Fra de dyrkede E. coli-cellene ble G-CSF polypeptider utvunnet og renset ved hjelp av metoden som er beskrevet i eksempel 16, og med det resultat at humant G-CSF polypeptid ble oppnådd som et eneste bånd.
Den oppnådde CSF-prøven ble målt ved hjelp av metoden for måling av CSF-aktivitet (a) som er beskrevet i det foregående. Resultatene er vist i tabell 3.
EKSEMPEL 21: Aminosyreanalyse (-VSE)
1) Analyse av aminosyresammensetning
Aminosyresammensetningen av CSF-prøven som var renset i eksempel 20 ble undersøkt ved hjelp av metoden som er beskrevet i 1) i eksempel 18. Resultatene er vist i tabell 4.
2) Analyse av N-terminale aminosyrer
Prøven ble underkastet analyse av N-terminale aminosyrer i overensstemmelse med metoden som er beskrevet i 2) i eksempel 18. Resultatet var at PTH-methionin og PTH-threonin ble påvist.
EKSEMPEL 22: Fremstilling av pHGA410 vektor (for anvendelse
med dyreceller, +VSE-linje)
EcoRI-fragmentet fremstilt i eksempel 9 som hadde den cDNA som er vist i fig. 3(A), ble behandlet med et restriksjonsenzym, Dral, ved 37<*>C i to timer, etterfulgt av behandling med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I (Takara Shuzo Co., Ltd.) for å danne butte ender. 1 ug av Bglll-linker (8mer, Takara Shuzo Co., Ltd.) ble fosforylert med ATP og koblet til omkring 1 (lg av den separat oppnådde blanding av DNA-fragmenter. De koblede fragmentene ble behandlet med et restriksjonsenzym, Bglll, og underkastet agarosegelelektroforese. Bare det største DNA-fragment ble isolert.
Dette DNA-fragmentet var ekvivalent med omkring 710 bp inneholdende en human G-CSF polypeptid kodedel (se fig. 6). En vektor pdKCR (Fukunaga et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81, 5086 (1984)) ble behandlet med et restriksjonsenzym, BamHI, og deretter defosforylert med en alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Den oppnådde DNA-vektor ble koblet til 710 bp cDNA-fragmentet i nærvær av T4 DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.), i den hensikt å fremstille pHGA410 (fig. 14). Som vist i fig. 14 inneholdt dette plasmidet promotoren til det SV40 tidlige gen, replikasjonsutgangspunktet til SV40, deler av (3-globingenet fra kanin, det replikeringsinitierende området av pBR322 og det pBR322-avledete P~laktamasegenet (Ampr) , idet det humane G-CSF-genet var festet nedstrøms av promoteren av det SV40 tidlige gen.
EKSEMPEL 23: Konstruksjon av rekombinant vektor (+VSE) for
anvendelse i transformasjon av C127-celler
1) Konstruksjon av pH6A410 (H)
20 ug av plasmidet pHGA410 (fig. 14) fremstilt i eksempel 22, ble oppløst i en reaksjonsløsning som inneholdt 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % bovint serumalbumin (BSA). Et restriksjonsenzym, EcoRI (10 - 15 enheter, Takara Shuzo Co., Ltd.) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen fikk stå ved 37°C i omkring 30 minutter for å oppnå delvis kutting ved hjelp av EcoRI. Deretter ble
DNA-fragmentet underkastet to behandlinger med en 1:1 blanding av fenol/kloroform, en behandling med eter, og presipitering med etanol.
Det oppnådde DNA-fragment ble løst i 50 ul av en løsning bestående av 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Etter tilsetning av 5 ul av Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), ble løsningen inkubert ved 14"C i to timer for å fremstille butte ender.
Ved hjelp av 0,8 % agarosegelelektroforese ble det oppnådd
6 ug av et DNA-fragment med en lengde på omkring 5,8 kbp.
5 ug av det oppnådde DNA-fragmentet ble oppløst på nytt i
50 ul av en reaksjonsblanding bestående av 50 mM Tris-HCl (pH ,7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP. Etter tilsetning av 2 ug av Hindlll-linker (Takara Shuzo Co., Ltd.) og 100 enheter av T4 DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.), ble reaksjonen utført over natten ved 4'C.
Deretter ble prøven behandlet med fenol og eter og presipitert med etanol. Presipitatet ble oppløst i 30 ul av en løsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, og løsningen ble inkubert ved 37'C i tre timer i nærvær av ti enheter Hindlll. Etter en ny behandling med T4 DNA-ligase ble det oppnådde DNA anvendt for å transformere E. coli stammen DH1 ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren (se Molecular Cloning, ibid.). Fra ampicillinresistente (Amp<r>) kolonier av transformantene ble celler utvalgt som inneholdt et plasmid som var identisk med pHGA410, med unntak av at Hindlll var innført på EcoRI-stedet. Det oppnådde plasmidet ble kalt pHGA410 (H) (fig. 15).
2) Konstruksjon av ekspresjonsrekombinantvektoren pTN-G4
20 ug av det oppnådde pHGA410 (H) ble løst i 50 ul av en reak-sjonsløsning bestående av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 175 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, 7 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % bovint serumalbumin. Etter tilsetning av 2 0 enheter Sali (Takara Shuzo Co., Ltd.) ble reaksjonsløsningen inkubert ved 37'C i fem timer. Etter behandling med fenol og presipitering med etanol fortsatte inkuberingen som angitt il) i omkring to timer ved 14 °C, i nærvær av Klenow-fragmentet av DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), for å danne butte ender. Reaksjonsløsningen ble deretter umiddelbart presipitert med etanol, uten at den var underkastet DNA-utvinning ved hjelp av agarosegelelektroforese. Det oppnådde DNA-fragment ble behandlet med Hindlll, og 5 g av Hindlll-Sall-fragmentet (ca. 2,7 kbp) ble utvunnet ved hjelp av 1 % agarosegelelektroforese. I et eget trinn ble et plasmid pdBPV-1 med et bovint papillomavirus (PBV) (dette plasmid var mottatt fra Dr. Howley og er beskrevet i Sarver, N. Sbyrne, J.C. & Howley, P.M., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 79, 7147-7151 (1982)), behandlet med Hindlll og PvuII, som beskrevet av Nagata et al.
(Fukunaga, Sokawa og Nagata, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81, 5086-5090 (1984)), for å oppnå et 8,4 kb DNA-fragment. Dette 8,4 kb DNA-fragment og HindIII-SalI-DNA-fragmentet (ca.
2,7 kb) som var oppnådd separat, ble ligert ved hjelp av T4
DNA-ligase. Ligeringsproduktet ble anvendt for å transformere E. Coli^stammen DH1 ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren, som er beskrevet i Molecular Cloning, ibid., idet E. coli kolonier som inneholdt et plasmid med pHGA410-avledet G-CSF cDNA ble
utvalgt. Dette plasmid ble kalt pTN-G4 (fig. 15).
Adenovirus type II (Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes), 27. desember 1982, Kyoritsu Shuppan) ble samtidig behandlet for å oppnå et plasmid, ApVA, med et Sali-Hindlll-fragment på ca. 1700 bp som inneholdt VAI og VAII, idet et fragment inneholdende VAI og VAII ble utvunnet fra dette plasmidet. Dette fragmentet ble innført i pTNG4 på Hindlll-stedet, for å oppnå pTN-G4VA(X og pTN-G4VA[3 (fig. 15). På grunn av VA-genet fra adenoviruset var disse plasmidene i stand til å øke ekspresjonen av et transkripsjonsprodukt fra den tidlige promoter av SV40.
EKSEMPEL 24: Transformasjon av C127-celler og G-CSF-ekspresjon (+VSE)
Før det ble anvendt for å transformere museceller C127, ble pTN-G4 oppnådd i eksempel 23 behandlet med et restriksjonsenzym BamHI. 20 ug av plasmidet pTN-G4 ble oppløst i 100 ul av en reaksjonsløsning (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 2 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % BSA) og behandlet med 20 enheter av BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), etterfulgt av behandling med fenol og eter og presipitering med etanol.
Museceller C127I ble dyrket i et Dulbeccos minimumsmedium inneholdende 10 % bovint føtalt serum (Gibco). C127I-cellene som vokste på platene (5 cm<0>) ble transformert med 10 ug pr. plate, av det DNA som var fremstilt separat ved hjelp av kalsiumfosfatprosedyren (se Haynes, J. & Weissmann, C., Nucleic Acids res., 11, 687-706 (1983)). Etter behandling med glyserol ble cellene inkubert ved 37'C i tolv timer.
De inkuberte cellene ble overført på tre friske plater (5 cm<0>) og mediet ble byttet ut to ganger pr. uke. Ved den 16. dag ble koloniene overført på friske plater og underkastet serie-dyrking på et Dulbeccos minimumsmedium inneholdende 10 % bovint føtalt serum (Gibco), i den hensikt å utvelge kloner som hadde høy G-CSF produksjonshastighet. Disse klonene fremstilte G-CSF i en konsentrasjon på omkring 1 mg/l. Ytterligere kloning ga kloner som var i stand til å fremstille G-CSF i konsentrasjoner på 10 mg/l eller høyere. I tillegg til C127I-cellene kunne NIH3T3-celler også anvendes som vertsceller.
EKSEMPEL 25: Ekspresjon av G-CSF i CHO-celler (+VSE)
1) Konstruksjon av pHGG4-dhfr
20 ug av plasmidet pHGA410 som ble oppnådd i eksempel 22, ble oppløst i 100 (il av en reaksjonsløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 175 mM NaCl, 0,2 mM EDTA,
0,7 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % BSA. Reaksjonen ble utført over natten ved 37'C, i nærvær av 20 enheter av restriksjonsenzymet Sali (Takara Shuzo Co., Ltd.), etterfulgt av behand-
linger med fenol og eter og presipitering med etanol.
Presipitatet bestående av DNA ble oppløst i 100 ul av en reak-sjonsløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP, og reaksjonen ble utført ved 14'C i to timer i nærvær av Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase (10 ul, Takara Shuzo Co., Ltd.), etterfulgt av behandlinger med fenol og eter, og presipitering med etanol.
En EcoRI-linker ble festet til DNA i presipitatet ved hjelp av følgende prosedyrer: DNA ble oppløst i 50 ul av en reak-sjonsløsning bestående av 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM DTT, 0,5 mM spermidin, 2 mM ATP, 2 mM heksaminkoboltklorid og 20 ug/ml BSA. Reaksjonen ble utført ved 4'C i 12 - 16 timer i nærvær av EcoRI-linkeren (Takara Shuzo Co., Ltd.) og 200 enheter av T4 DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Etter behandling med fenol, vasking med eter og presipitering med etanol, idet dette ble utført i overensstemmelse med kjente prosedyrer, ble DNA-presipitatet delvis kuttet med EcoRI og 3 ug av et DNA-fragment med en lengde på omkring 2,7 kbp ble utvunnet ved hjelp av 1 % agarosegelelektroforese.
Plasmidet pAdD26SVpA (Kaufman, R.G. & Sharp, P.A., Mol. Cell. Biol., 2, 1304-1319 (1982)) ble behandlet med EcoRI og defosforylert ved behandling med en bakteriell alkalisk fosfatase (BAP). Mer spesielt ble 20 ug av pAdD2 6SVpA og 20 enheter EcoRI tilsatt til en reaksjonsløsning (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % BSA), og reaksjonen ble utført ved 37'C i ti timer. Deretter ble fem enheter BAP tilsatt til reaksjonsløsningen, og reaksjonen ble utført ved 68'C i 30 minutter. Etter behandling med fenol ble EcoRI-fragmentet av pAdD26SVpA utvunnet ved hjelp av elektroforese i et utbytte på omtrent 5 ug.
Fragmentet med en lengde på omkring 7,2 kbp og plasmidet pAdD26SVpA, hver med en vekt på 0,5 ug, ble annealet. Det oppnådde plasmid ble anvendt for å transformere E. coli-stammen DH1 ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren, og koloniene som inneholdt plasmidet pHGG4-dhfr ble utvalgt. Det oppnådde plasmid ble kalt pHGG4-dhfr (fig. 16a).
Den alternative prosedyren var som følger: plasmidet pHGA410 ble behandlet med Sali og delvis kuttet med EcoRI uten at noen EcoRI-linker var festet. Et DNA-fragment med en lengde på omkring 2,7 kbp ble utvunnet og behandlet med Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase, for å danne butte ender. Et EcoRI-fragment med butte ender ble fremstilt fra pAdD2 6SVpA som beskrevet over. Dette EcoRI-fragmentet og fragmentet som var fremstilt separat (ca. 2,7 kbp), ble behandlet med T4 DNA-ligase for å fremstille pHGG4-dh.fr.
pHGA410 (H) som fremstilt i eksempel 23, ble behandlet med restriksjonsenzymene Hindlll og Sali, som beskrevet i 2) i eksempel 23, og Hindlll-Sall-fragmentet ble festet til det buttendede EcoRI-fragmentet av pAdD2 6SVpA beskrevet over. Denne metoden kunne også anvendes for å fremstille pHGG4-dhfr (fig. 16b).
2) Konstruksjon av pG4DRl og pG4DR2
10 ug av plasmidet pAdD26SVpA som angitt i 1) ble løst i 50 ml av en reaksjonsløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % BSA. Etter tilsetning av ti enheter av hver av restriksjonsenzymene EcoRI og BamHI ble reaksjonen utført ved 37'C i ti timer, etterfulgt av behandling med fenol og vasking med eter. Et DNA-fragment på ca. 2 kb ble utvunnet ved hjelp av elektroforese gjennom en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt. Det oppnådde DNA-fragment ble behandlet med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase ved hjelp av rutineprosedyrer, for å danne butte ender. Det buttendede DNA-fragmentet ble underkastet behandling med fenol, vasket med eter og presipitert med etanol. 10 ug av plasmidet pHGA410 (H) som var oppnådd il) i eksempel 23, ble løst i 50 ul av en reaksjonsløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 60 mM NaCl. Reaksjonen ble utført ved 37'C i seks timer i nærvær av ti enheter Hindlll. Et DNA-fragment ble utvunnet ved elektroforese gjennom en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt, som var fremstilt ved rutineprosedyrer. Det oppnådde DNA-fragment ble deretter behandlet med BAP og butte ender ble dannet ved behandling med Klenow-fragmentet. Etter behandling med fenol og vasking med eter ble DNA-fragmentet bundet ved de butte endene til det tidligere oppnådde DNA-fragment på ca. 2 kb med en T4 DNA-ligase ved hjelp av følgende prosedyrer: 1 ug av hvert DNA-fragment ble oppløst i 30 Ul av en reaksjonsløsning inneholdende 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl2, 5 mM DTT og 1 mM ATP, reaksjonen ble utført ved 6°C i tolv timer i nærvær av 50 enheter av en T4 DNA-ligase. Ligeringsproduktet ble anvendt for å transformere E. coli-stammen DH1. Det ble oppnådd pG4DRl og pG4DR2 som vist i fig. 16c.
3) Transformasjon og ekspresjon
CHO-celler (dhfr~-stamme, mottatt fra Dr. L. Chasin av Colombia University) ble dyrket i et oc-minimum essensielt medium inneholdende 10 % kalveserum (oc-MEN, tilsatt adenosin, deoksyadenosin og thymidin) på plater (9 cm<0>, Nunc). De dyrkede cellene ble transformert ved hjelp av kalsiumfosfatprosedyren (Wigler et al., Cell, 14, 725 (1978)) på følgende måte.
Et bærer-DNA (kalvethymus-DNA) ble tilsatt i en passende mengde til 1 ug av plasmidet pHGG4-dh.fr fremstilt i 1) , og blandingen ble oppløst i 375 ul av en TE-løsning, etterfulgt av tilsetning av 125 ul 1 M CaCl2. Etter avkjøling av løsningen på is i tre til fem minutter ble 500 ul av 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl og 1,5 mM fosfatbuffer) tilsatt til løsningen. Etter ny avkjøling på is ble løsningen blandet med 1 ml av kulturen av CHO-celler, overført på plater, og inkubert i ni timer i en C02-inkubator. Mediumet ble fjernet fra platene og, etter vasking med TBS (Tris-bufret saltopp-løsning), tilsetning av 20 % glyserolholdig TBS og vasking på nytt, ble et ikke-selektivt medium (a-MEN-medium beskrevet over, med unntak av at mediumet var tilsatt nukleotider) tilsatt. Etter inkubering i to døgn ble kulturen fortynnet ti ganger og overført på et selektivt medium (ikke tilsatt nukleotider). Dyrkingen fikk fortsette, idet mediumet ble byttet ut med et friskt selektivt medium hvert annet døgn, og de oppnådde kolonier ble selektert og overført på friske plater hvor cellene vokste i nærvær av 0,02 UM methotrexat (MTX) , etterfulgt av kloning ved vekst i nærvær av 0,05 JIM MTX, som senere ble øket til 0,1 UM.
Transformasjonen av CHO-celler kan også gjennomføres ved kotransformasjon med pHGG4 og pAdD26SVpA (se Scahill et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 80, 4654-4658 (1983)).
CHO-celler ble også transformert ved hjelp av følgende prosedyrer: pG4DRl eller pG4DR2, som var fremstilt i 2), ble først behandlet med henholdsvis Sali og Kpnl for å oppnå DNA-fragmenter, og 10 ug av disse fragmentene ble anvendt for å transformere CHO-celler som nevnt over. De transformerte cellene ble underkastet kontinuerlig dyrking i en serie av selektive medier på samme måte som beskrevet over. Syv døgn senere ble det oppnådd ikke mindre enn 100 adskilte kolonier pr. plate. Disse koloniene ble overført i sin helhet til en frisk plate og underkastet kontinuerlig dyrking i en serie av selektive medier i nærvær av 0,01 UM MTX, hvorpå det fremkom noe over ti kolonier. De samme prosedyrene ble deretter gjentatt idet MTX-konsentrasjonen i serie av selektive medier ble øket til 0,02 UM, 0,05 |1M og 0,1 UM, og koloniene som overlevde ble selektert. Koloniseleksjon kunne oppnås på en lignende måte selv når de noe over ti oppnådde koloniene ble selektert individuelt og underkastet dyrking med økende MTX-konsentrasj oner.
En rekombinant vektor som innehar et "polycistronisk gen" kan også anvendes for å transformere CHO-celler. Et eksempel på denne alternative metoden er som følger: pAdD26SVpA ble behandlet med Pstl og de to fragmentene som ble utvunnet ble bundet til et pBRG4-avledet CSF cDNA-f ragment for å bygge opp en rekombinant vektor hvor adenoviruspromoteren, CSF cDNA, DHFR og poly(A)-stedet til SV40 ble innført i ovennevnte rekkefølge. Denne rekombinante vektor ble anvendt for å transformere CHO-celler.
EKSEMPEL 26: Måling av G-CSF-aktivitet (+VSE) Supernatantene fra kulturene av C127-celler og CHO-celler, som var oppnådd i henholdsvis eksempel 24 og 25, ble innstilt til en pH 4 med 1 N eddiksyre. Etter tilsetning av like volumdeler n-propanol, ble det oppnådde presipitat fjernet ved hjelp av sentrifugering. Supernatanten ble ført gjennom en åpen kolonne (l<0> x 2 cm<L>) som var fylt med en C8 revers-fase bærer (Yamamura Kagaku K.K.) og eluering ble utført med 50 % n-propanol. Eluatet ble fortynnet to ganger med vann og underkastet revers-fase høytrykksvæskekromatografi på YMC-C8 kolonne (Yamamura Kagaku K.K.), etterfulgt av eluering med n-propanol (30 - 60 % lineær densitetsgradient) inneholdende 0,1 % TFA. Fraksjonene som ble eluert ved n-propanolkonsen-trasjoner på omkring 40 % ble utvunnet, frysetørket og oppløst i 0,1 M glycinbuffer (pH 9). Som et resultat ble det humane G-CSF i C127 og CHO-cellene konsentrert omkring 2 0 ganger.
Som en kontroll ble celler transformert med humane G-CSF cDNA-frie plasmider og supernatantene fra disse kulturene ble konsentrert i overensstemmelse med de ovennevnte prosedyrer. De humane G-CSF aktivitetene i prøvene ble målt ved hjelp av metoden for human G-CSF aktivitetsmåling (a), som er beskrevet tidligere. Dersom ekspresjonsvirkningsgraden er tilstrekkelig høy kan supernatantene fra kulturene måles direkte uten forut-gående konsentrering. Resultatene er vist i tabell 5, hvor
dataene er basert på konsentrerte prøver.
EKSEMPEL 27: Aminosyreanalyser og sukkeranalyser (+VSE)
1) Analyser av aminosyresammensetning
Den urene CSF-prøven fremstilt i eksempel 2 6 ble renset i overensstemmelse med prosedyrer som er beskrevet i eksempel 2(iii). Den rensede CSF-prøven ble hydrolysert ved hjelp av vanlige prosedyrer, og proteindelen av hydrolysatet ble undersøkt med hensyn på aminosyresammensetning ved hjelp av en spesiell metode for aminosyreanalyse med en Hitachi 835 automatisk aminosyreanalysator (Hitachi, Ltd.). Resultatene er vist i tabell 6. Hydrolyse ble utført under følgende betingelser:
(i) 6 N HC1, 100'C, 24 timer, i vakuum,
(ii) 4 N metansulfonsyre +0,2 % 3-(2-aminoetyl)indol,
110'C, 24 timer, 48 timer, 72 timer, i vakuum.
Prøven ble oppløst i en løsning (1,5 ml) inneholdende. 40 % n-propanol og 0,1 % trifluoreddiksyre. Prøver på 0,1 ml ble tørket med en tørr nitrogengass, og etter tilsetning av reagensene som er oppført i (i) eller (ii) ble rørene forseglet i vakuum, etterfulgt av hydrolyse av innholdet.
Hver av verdiene som er vist i tabell 6 var gjennomsnittet av fire målinger, 24 timers verdi for (i) og 24, 48 og 72 timers verdier for (ii), med unntak av at innholdene av Thr, Ser,
^ys, Met, Val, Ile og Trp ble beregnet ved hjelp av følgende metoder (se "Tampaku Kagaku (Protein Chemistry) II", A Course in Biochemical Experiments, Tokyo Kagaku Dohjin): For Thr, Ser, tøCys og Met ble den tidsavhengige profilen for 24, 48 og 72 timers verdiene for (ii) ekstrapolert
med hensyn til 0 timer.
For Val og Ile, ble 72 timers verdien for (ii) anvendt. For Trp, ble gjennomsnittet av 24, 48 og 72 timers verdiene for (ii) anvendt.
2) Analyse av sukkersammensetningen.
En standard (25 nmol inositol) ble tilsatt til 200 ng av den rensede CSF-prøven som ble anvendt ved analysering av aminosyresammensetningen 1). Etter tilsetning av en metanolløsning (500 ul) inneholdende 1,5 N HCL, ble reaksjonen utført ved 90"C i fire timer i et N2-spylt, lukket rør. Etter at røret var åpnet, ble sølvkarbonat (Ag2C03) tilsatt for å nøytralisere innholdet. Derettere ble 50 ul eddiksyreanhydrid tilsatt og røret ble rystet en passende tid. Deretter fikk røret stå over natten i et mørkt rom ved romtemperatur. Det øvre laget ble deretter overført til et prøverør og tørket med nitrogengass. Til presipitatet ble det tilsatt metanol og blandingen ble vasket og lett sentrifugert. Det øvre
laget ble overført til det samme prøverøret og tørket.
Etter tilsetning av 50 Ul av et TMS-reagens (5:1:1
blanding av pyridin, heksametyldisilazan og trimetylklor-silan), ble reaksjonen utført ved 40'C i 20 min. og reaksjonsproduktet ble lagret i frossen tilstand. En standard ble fremstilt ved å kombinere 25 nmol inositol med 50 nmol av både galaktose (Gal), N-acetylgalaktosamin (Gal NAc), sialinsyre og andre passende reagenser.
De fremstilte prøvene ble deretter underkastet gasskromato-grafianalyse under følgende betingelser:
Analysebetingelser
Kolonne: 2 % OV - 17 VINport HP, 60-80 mesh, 3 m glass Temperatur: økning fra 110 til 2 50 °C ved 4°C/min. Bærergass (N2) trykk: utgangstrykk 1,2 - 1,6 kg/cm<2>
sluttrykk 2-2,5 kg/cm<2>
Sensitivitet: IO<3> MQ-område, 0,1 - 0,4 volt
Trykk: H2, 0,8 kg/cm2
luft, 0,8 kg/cm<2>
Injisert prøvemengde: 2,5 - 3,0 [il.
Som et resultat av analysen, ble galaktose, N-acetylgalaktosamin og sialinsyre, identifisert i CSF-prøven.
EKSEMPEL 28: Fremstilling av pHGV2-vektor (for anvendelse
med dyreceller, -VSE-linje)
EcoRI-fragmentet som er fremstilt i eksempel 10 og som hadde cDNA som vist i fig. 4 (A), ble behandlet med restriksjonsenzymet Dral ved 37<*>C i 2 timer, etterfulgt av behandling med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I (Takara Shuzo Co. , Ltd.), for å danne butte ender. 1 ug av Bglll-linkeren (8mer, Takara Shuzo Co., Ltd.) ble fosforylert med ATP og bundet til omkring 1 ug av den separat oppnådde blanding av DNA-fragmenter. De bundne fragmenter ble behandlet med restriksjonsenzymet Bglll, og underkastet agarosegelelektroforese. Bare det største DNA-fragmentet ble deretter utvunnet.
Dette DNA-fragmentet var ekvivalent med omkring 700 bp inneholdende en human G-CSF-polypeptid kodende del (se fig. 6). En vektor pdKCR (Fukunaga et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81, 5086 (1984)) ble behandlet med restriksjonsenzymet BamHI og deretter defosforylert med en alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Den oppnådde DNA-vektor ble bundet til det omtrent 700 cDNA-fragmentet i nærvær av T4 DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.), for å oppnå pHGV2 (fig. 17). Som vist i fig. 17, inneholdt dette plasmid promotoren av det SV40 tidlige gen, det replikasjonsinitierende området av SV40, deler av [3-globingenet fra kanin, det replikas jonsinitierende området av pBR322 og det pBR322-avledede (3-laktamasegenet (Ampr) , med det humane G-CSF-genet festet nedstrøms av promotoren av det SV40 tidlige gen.
EKSEMPEL 29: Konstruksjon av rekombinant vektor (-VSE) for
anvendelse i transformasjon av C127-celler
1) Konstruksjon av pHGV2(H).
20 ug av plasmidet pHGV2 (fig. 17) fremstilt i eksempel 28, ble behandlet ved hjelp av fremgangsmåter som angitt il) i eksempel 23, for å fremstille plasmidet pHGV2(H) (fig. 18). 2) Konstruksjon av ekspresjons-rekombinant-vektorer pTN-V2,
pTNVAOC og pTNVAP
Ved anvendelse av 20 ug av pHGV2(H), ble prosedyrene som er beskrevet i 2) i eksempel 23 gjennomført på nytt for å velge ut E. coli som inneholdt et plasmid med det pHGV2-avledede G-CSF cDNA. Dette plasmid ble kalt pTN-V2 (fig. 18).
Adenovirus type II (Tampakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes), 27. desember 1982, Kyoritsu Shuppan) ble behandlet på lignende måte for å oppnå et plasmid ApVA, som inneholdt et ca. 1700 bp SalI-HindIII-fragment som inneholdt VAI og VAII, og et fragment inneholdende VAI og VAII ble utvunnet fra dette plasmid. Dette fragmentet ble innført i pTN-V2 på Hindlll-stedet for å oppnå pTNVAcc og pTNVAØ (fig. 18). På grunn av adenovirusets VA-gen, var disse plasmidene i stand til å øke ekspresjonen av et transkripsjonsprodukt fra den tidligere promoter av SV40.
EKSEMPEL 30: Transformasjon av C127-celler og G-CSF-ekspresj on (-VSE).
pTN-V2 oppnådd i eksempel 2 9 ble behandlet med restriksjonsenzymet BamHI, før det ble anvendt for å transformere musecellene C127.
Musecellene C127I ble transformert med det således fremstilte DNA for å uttrykke G-CSF (eksempel 24), og kloner med en høy produksjonshastighet av G-CSF ble utvalgt. Disse klonene produserte G-CSF i en konsentrasjon på omkring 1 mg/l.
Ved ytterligere kloning, kunne kloner som var i stand til å produsere G-CSF i en konsentrasjon på 10 mg/l utvelges. På en lignende måte, ble C127-celler transformert med pTNVAcc og pTNVAP oppnådd i eksempel 29, og transformantene ble utvalgt med hensyn på kloner som hadde stor evne til G-CSF-dannelse. Når det gjelder pTNVAcc, kunne kloner som var i stand til å danne G-CSF i konsentrasjoner på 20 mg/l eller mer oppnås, mens kloner med en lavere produktivitet (noen få mg/l) ble oppnådd ved transformasjon med pTNVAp.
I tillegg til C127l-cellene, kunne NIH3T3-celler også anvendes som vertsceller.
EKSEMPEL 31: Ekspresjon av G-CSF i CHO-celler (-VSE)
1) Konstruksjon av pHGV2-dh.fr.
Et DNA-fragment med en lengde på omkring 2,7 kbp ble fremstilt fra 20 ug av plasmidet pHGV2 (eksempel 28) ved hjelp av prosedyren som er beskrevet i 1) i eksempel 25. Dette fragmentet (0,5 ug) og EcoRI-fragmentet fra pAdD26SVpA
(0,5 ug) ble annealet. Det oppnådde plasmid ble anvendt for å transformere E. coli-stammen DH1 ved hjelp av rubidiumkloridprosedyren, og koloniene med pHGV2-dhfr-plasmidet ble utvalgt. Det oppnådde plasmidet ble kalt pHGV2-dhfr (fig. 19a).
Alternative prosedyrer var følgende: plasmidet pHGV2 ble behandlet med Sali og delvis kuttet med EcoRI uten at noen EcoRI-linker var festet. Et DNA-fragment med en lengde på 2,7 kbp ble utvunnet og behandlet med Klenow-fragmentet av E. coli DNA-polymerase for å danne butte ender. Et buttendet EcoRI-fragment ble fremstilt fra pAdD26SVpA som beskrevet over. Dette EcoRI-fragmentet og fragmentet som var fremstilt separat (ca. 2,7 kbp) ble behandlet med T4 DNA-ligase for å fremstille pHGV2-dhfr.
pHGV2 (H) fremstilt i 1) i eksempel 29, ble behandlet med restriksjonsenzymer, Hindlll og Sali, som beskrevet i 2) i eksempel 29, og Hindlll-Sall-fragmentet ble bundet til det buttendete EcoRI-fragmentet av pAdD2 6SVpA beskrevet over. Denne metoden kunne også anvendes for å fremstille pHGG4-dhfr (fig. 19b).
2) Konstruksjon av pV2DRl og pV2DR2.
10 ug av plasmidet pAdD26SVpA omtalt i 1), ble oppløst i 50 ml av en reaksjonsløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % BSA. Reaksjonen ble utført ved 37<*>C i 10 timer i nærvær av 10 enheter av hver av restriksjonsenzymene EcoRI og BamHI. Behandling med fenol og vasking med eter ble utført ved hjelp av vanlige prosedyrer. Et DNA-fragment på ca. 2 kb ble utvunnet ved hjelp av elektroforese gjennom en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt. Det oppnådde DNA-fragmentet ble behandlet med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase ved hjelp av vanlige prosedyrer for å danne butte ender. Det buttendete DNA-fragmentet ble underkastet behandling med fenol, vasking med eter og presipitering med etanol. 10 ug av plasmidet pHGV2 (H) oppnådd i 1) i eksempel 29, ble oppløst i 50 ul av en reaksjonsløsning inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 60 mM NaCl. Reaksjonen ble utført ved 37'C i 6 timer i nærvær av 10 enheter Hindlll. Et DNA-fragment ble utvunnet ved hjelp av elektroforese gjennom en 1 % agarosegel med lavt smeltepunkt, som var fremstilt ved hjelp av rutineprosedyrer. Det oppnådde DNA-fragmentet ble deretter behandlet med BAP og butte ender ble dannet ved behandling med Klenow-fragmentet. Etter behandling med fenol og vasking med eter, ble DNA-fragmentet festet ved de butte endene til det tidligere oppnådde ca. 2 kb DNA-fragment med en T4 DNA-ligase, ved hjelp av følgende prosedyrer: 1 Jig av hvert DNA-fragment ble oppløst i 30 ul av en reaksjonsløsning inneholdende 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl2, 5 mM DTT og 1 mM ATP, reaksjonen ble utført ved 6'C i 12 timer i nærvær av 50 enheter av en T4 DNA-ligase. Ligeringsproduktet ble anvendt for å transformere E. coli-stammen DH1. Resultatet var at pV2DRl og pV2DR2 vist i fig. 19 c) ble oppnådd.
3) Transformasjon og ekspresjon.
CHO-celler ble transformert med plasmidet pHGV2-dhfr for G-CSF-ekspresjon i overensstemmelse med prosedyren som er beskrevet i 3) i eksempel 25.
Transformasjonen av CHO-celler kan også gjennomføres ved kotransformasjon med pHGV2 og pAd2 6SVpA.
CHO-celler ble også transformert ved hjelp av følgende prosedyrer: pV2DRl eller pV2DR2 som var fremstilt i 2), ble først behandlet med hhv. Sali og Kpnl for å oppnå DNA-fragmenter, og 10 ug av disse fragmenter ble anvendt for å transformere CHO-celler som nevnt over. De transformerte cellene ble underkastet kontinuerlig dyrking i en serie av selektive medier på samme måte som beskrevet over. Omkring syv døgn senere ble det oppnådd ikke mindre enn 100 typiske kolonier pr. plate. Alle koloniene ble overført til en frisk plate og underkastet kontinuerlig dyrking i en serie av selektive medier i nærvær av 0,01 UM MTX, hvorpå noe over ti kolonier fremkom. De samme prosedyrene ble gjentatt med MTX-konsentrasjoner på 0,02 UM, 0,05 UM og 0,1 UM, og koloniene som overlevde ble selektert. Koloniseleksjon kunne på lignende måte gjennomføres selv når de oppnådde noe over ti koloniene var selektert individuelt og underkastet dyrking ved økende MTX-konsentrasjoner.
En rekombinant vektor med et "polycistronisk gen" kan også anvendes for å transformere CHO-celler. Et eksempel på denne alternative metoden er som følger: pAdD26SVpA ble behandlet med Pstl og de oppnådde to fragmentene ble bundet til et pBRV2-avledet CSF cDNA-fragment for å danne en rekombinant vektor hvor adenoviruspromoteren, CSF cDNA, DHFR og poly(A)-stedet av SV40 var innskutt i den ovennevnte rekkefølge. Denne rekombinante vektoren ble anvendt for å transformere CHO-celler.
EKSEMPEL 32: Måling av G-CSF-aktivitet (-VSE)
Ved hjelp av prosedyren som er beskrevet i eksempel 26, ble det oppnådd human G-CSF fra supernatantene av kulturer av C127-celler og CHO-celler, som var oppnådd i hhv. eksempel 30 og 31. Den humane G-CSF-aktivitet i hver av prøvene ble målt som i eksempel 26. Resultatene er vist i tabell 7.
EKSEMPEL 33: Aminosyreanalyser og sukkeranalyser (-VSE).
1) Analyse av aminosyresammensetning.
Den urene CSF-prøven som er fremstilt i eksempel 32, ble renset i overensstemmelse med prosedyrene som er beskrevet i 2(iii). Den rensede CSF-prøven ble underkastet analyse av aminosyresammensetning ved prosedyrene som er beskrevet il) i eksempel 27. Resultatene er vist i tabell 8.
2) Analyse av sukkersammensetningen.
Den rensede CSF-prøven som ble anvendt ved analyse av aminosyresammensetningen i 1), ble også underkastet analyse av sukkersammensetningen ved hjelp av de samme prosedyrer og ved de samme betingelser som dem som er beskrevet i 2) i eksempel 27. Resultatet av analysen var at tilstedeværelsen av galaktose, N-acetylgalaktosamin og sialinsyre i CSF-prøven ble bekreftet.
EKSEMPEL 34: Konstruksjon av rekombinant vektor inneholdende
kromosomalt gen for ekspresjon i COS-celler. Plasmidet pBRCE3(3 som ble oppnådd i eksempel 11 og som inneholdt det kromosomale gen som er vist i fig. 5, ble behandlet med EcoRI. pSVH<+>K<+->plasmidet som er beskrevet av Banerji et al. i Cell, 27, 299 (1981) ble behandlet med Kpnl
for å fjerne globingenet. Plasmidet ble videre underkastet delvis kutting med Hindlll, for å fjerne en del av det SV40 sene gen. Fragmentene ble sammenføyd på nytt for å fremstille en ekspresjonsvektor pML-E<+>.
Denne vektoren ble behandlet med restriksjonsenzymet EcoRI, og defosforylert med en alkalisk fosfatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for å oppnå en vektor DNA, som ble bundet til det ovennevnte kromosomale DNA ved hjelp av en T4 DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) for å oppnå pMLCE3a. Som vist i fig. 20, inneholdt dette plasmidet SV40-genets enhancer, SV40-genets replikasjonsutgangspunkt, replikasjonsutgangspunktet av pBR322 og det pBR322-avledede (i-laktamasegenet (Ampr) , og plasmidet hadde det humane G-CSF kromosomale genet koblet nedstrøms fra SV40-genets enhancer.
EKSEMPEL 35: Ekspresjon av humant G-CSF kromosomalt gen i
COS-celler.
COS-l-celler (mottatt fra Dr. Gluzman ved Cold Spring Harbor Laboratory, USA) som var blitt dyrket til en tetthet på omkring 70 % i Petri-skåler (9 cm<®>, Nunc) ved anvendelse av et DMEM-medium (Dulbecco's modifiserte Eagle's medium tilgjengelig fra Nissui Seiyaku K.K., betegnet "Nissui") som inneholdt 10 % kalveserum, ble transformert ved hjelp av kaliumfosfat-prosedyren (Wigler et al., Cell, 14, 725 (1978)) eller ved DEAE-dekstran:kloroquin-metoden (se f.eks. Gordon et al., Science, 228, 810 (1985)).
Transformasjon ved hjelp av kalsiumfosfatprosedyren ble utført som følger: 160 Ug av plasmidet pMLCE3ct fremstilt i eksempel 34, ble oppløst i 320 ul av en TE-løsning og etter tilsetning av destillert vann (3,2 ml), ble det tilsatt 504 ul 2 M CaCl2.
Til den oppnådde oppløsningen, ble det tilsatt 4 ml 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1,5 mM fosfatbuffer, pH 7,2), og blandingen ble avkjølt på is i 20 til 30 min. Den avkjølte blandingen ble tilsatt dråpevis til mediumet i en mengde på 1 ml pr. Petri-skål der det var vekst av COS-l-celler. Etter dyrking i fire timer ved 37'C i en C02-inkubator, ble cellene vasket med et serumfritt DMEM-medium, hvoretter cellene deretter fikk stå i omkring 3 min. ved romtemperatur i 5 ml av et DMEM-medium inneholdende 20 % glyserol, hvorpå cellene ble vasket på nytt med et serumfritt DMEM-medium. Etter at det serumfrie DMEM-mediumet var fjernet, ble det tilsatt 10 ml av et DMEM-medium inneholdende 10 % kalveserum, og dyrkingen ble fortsatt over natten i en C02-inkubator. Etter at mediumet var erstattet med et nytt medium av samme type, ble dyrkingen fortsatt i ytterligere tre døgn.
Transformasjon ved DEAE-dekstran:kloroquin-metoden ble utført på følgende måte: som i kalsiumfosfatprosedyren, ble COS-1-cellene dyrket til en tetthet på 70 % og vasket to ganger med et serumfritt DMEM-medium. Deretter ble det til de vaskede cellene tilsatt et serumfritt DMEM-medium inneholdende 250 ug/ml av DEAE-dekstran og 2 ug/ml av plasmidet pMLCE3cc fremstilt i eksempel 34 og dyrkingen ble fortsatt i tolv timer ved 37'C. Deretter ble cellene vasket to ganger med et serumfritt DMEM-medium og underkastet ytterligere dyrking i to timer ved 37'C i et DMEM-medium inneholdende 10 % kalveserum og 1 mM kloroquin. Deretter ble cellene vasket to ganger med et serumfritt DMEM-medium og dyrket i ytterligere tre døgn ved 37<*>C i et DMEM-medium inneholdende 10 % kalveserum.
Supernatanten fra den oppnådde kulturen av COS-l-celler ble innstilt til pH 4 med 1 N eddiksyre. Etter tilsetning av det samme volum n-propanol, ble det oppnådde presipitatet fjernet ved sentrifugering. Supernatanten ble ført gjennom en åpen kolonne (1° x 2 cm<L>) som var fylt med en C8 revers-fase-bærer (Yamamura Kagaku K.K.) og elueringen ble utført med 50 % n-propanol. Eluatet ble fortynnet to ganger med vann og underkastet revers-fase høytrykksvæskekromatografi på en YMC-C8 kolonne (Yamamura Kagaku K.K.) etterfulgt av eluering med n-propanol (30 - 60 % lineær densitetsgradient) inneholdende 0,1 % TFA. Fraksjonene som var eluert med n-propanolkonsen-trasjoner på omkring 40 %, ble utvunnet, frysetørket og oppløst i 0,1 M glycidinbuffer (pH 9). Resultatet av disse prosedyrene var at det humane G-CSF i supernatanten av C0S-1-cellekulturen, var konsentrert omtrent 2 0 ganger.
Som en kontroll, ble COS-l-celler transformert med PML-E<+> uten G-CSF kromosomalt gen, ved hjelp av ovennevnte prosedyrer, og supernatanten fra den endelige kultur ble konsentrert.
De humane G-CSF-aktiviteter av de oppnådde prøvene ble målt ved hjelp av "Method of Human G-CSF Activity Assay (a)", som er beskrevet tidligere. Resultatene er vist i tabell 9.
EKSEMPEL 36: RNA-analyse av G-CSF (kromosomalt gen). COS-cellene som ble dyrket til en cellekonsentrasjon på 8 x IO<6> celler/plate (9 cm<0>) ble transformert med 80 ug av plasmidet pMLCE3a. Etter 48 timer, ble det totale RNA fremstilt i overensstemmelse med prosedyren etter Chirgwin (Biochemistry, 18 5294 - 5299 (1979)).
Plasmidet pBRG4 som ble fremstilt i eksempel 9, ble kuttet med restriksjonsenzymet Ahalll og det oppnådde pBRG4-avledede DNA-fragmentet ble radioaktivt merket med (y-<32>P)ATP ved anvendelse av T4 polynukleotidkinase, for å oppnå et DNA-fragment på ca. 2,8 kb inneholdende G-CSF cDNA. Fragmentet ble utvunnet og anvendt som en DNA-probe. Etter at DNA-proben (1,5 x IO<5> c.p.m., 2,8 x IO<6> c.p.m./ug DNA) var denaturert, ble den blandet med 20 ug av det totale RNA som var fremstilt fra COS-cellene. Det ble gjennomført hybridisering ved 45°C i 15 timer. Blandingen ble kuttet med 200 enheter/ml eller 400 enheter/ml Sl nuklease (P.L. Biochemicals) i overensstemmelse med prosedyren etter Weaver og Weissmann (Nucleic Acid Res., 7, 1175 - 1193 (1979)), etterfulgt av elektroforese med 4 % polyakrylamidgel i nærvær av 8,3 M urea. Påvisning ved hjelp av autoradiografi ble deretter gjennomført.
Som et resultat ble det observert et bånd tilsvarende 722 bp i form av et sterkt radioaktivt merket bånd i COS-cellene, hvorfra et bånd tilsvarende 487 bp også ble påvist.
RNA fra COS-cellene ble derfor funnet til å inneholde G-CSF mRNA av både +VSE og -VSE linje.
EKSEMPEL 37: Aminosyreanalyse og sukkeranalyse
(Kromosomalt gen).
1) Analyse av aminosyresammensetning.
Den urene CSF-prøven fremstilt i eksempel 35 ble renset i overensstemmelse med prosedyrene som er beskrevet i eksempel 2(iii). Den rensede CSF-prøven ble underkastet analyse av aminosyresammensetningen ved hjelp av prosedyrer som er beskrevet i 1) i eksempel 27. Resultatene er vist i tabell 10.
2) Analyse av sukkersammensetning.
Den rensede CSF-prøven som ble anvendt ved analyse av aminosyresammensetningen i 1) ble også underkastet analyse av sukkersammensetningen ved hjelp av de samme prosedyrer og under de samme betingelser som dem som er beskrevet i 2) i eksempel 27. Resultatet av disse analysene var at tilstedeværelsen av galaktose, N-acetylgalaktosamin og sialinsyre i CSF-prøven ble bekreftet.
EKSEMPEL 38: Ekspresjon av humant G-CSF-kromosomalt gen i
C127-celler.
Plasmidet pMLCE3a som var fremstilt i eksempel 34, ble behandlet med EcoRI og et fragment på ca. 4 kb ble utvunnet ved hjelp av prosedyrer som er beskrevet i Molecular Cloning, ibid. Det oppnådde fragmentet ble anvendt som en kilde for det kromosomale G-CSF-gen.
Fragmentet ble behandlet med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I for å danne butte ender (A).
SV40 promotoren (ca. 0,4-kb EcoRI-EcoRI-fragment) ble fjernet fra plasmidet pHGA410 (som ble fremstilt i eksempel 22), ved hjelp av prosedyren som er beskrevet i Molecular Cloning ibid. , og ble deretter behandlet med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase (B).
I et eget trinn ble et plasmid pdBPV-1, som hadde et bovint papillomavirus (BPV) (dette plasmid ble mottatt med takk fra Dr. Howley og er beskrevet i Sarver, N. Sbyrne, J.C. & Howley, P.M., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 79, 7147 - 7151 (1982)), behandlet med Hindlll og PvuII for å oppnå et DNA-fragment på ca. 8,4 kb. Dette fragmentet ble behandlet med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I og defosforylert med en bakteriell alkalisk fosfatase (C).
DNA-fragmentene (A), (B) og (C) , hvert med en vekt på 0,1 (lg, ble oppløst i 20 |ll av en reaksjonsløsning (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) og reaksjonen ble utført over natten ved 4'C i nærvær av 180 enheter av en T4 DNA-ligase.
Reaksjonsløsningen ble deretter behandlet med rubidiumkloridprosedyren som er beskrevet i Molecular Cloning, ibid., for å oppnå plasmidet pTNCE3a (fig. 21).
DNA-fragmentet (A), som ble anvendt som en kilde for kromosomalt G-CSF-gen, kan eventuelt byttes ut med et DNAfragment på ca. 1,78 kb som er oppnådd ved hjelp av følgende prosedyrer: 2 0 (lg pMLCE3a oppløses i 100 jll av en blanding av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-merkaptoetanol og 0,01 % BSA, løsningen inkuberes ved 37<*>C i fem timer i nærvær av 2 0 enheter Stul og underkastet elektroforese gjennom en 1,2 % agarosegel.
Det oppnådde plasmidet pTNCE3a ble anvendt for å transformere C127 I museceller som i eksempel 24 og kloner som uttrykte det humane G-CSF kromosomale gen og som hadde stor evne til å produsere G-CSF, ble utvalgt.
EKSEMPEL 39: Ekspresjon av human G-CSF kromosomalt gen i
CHO-celler.
Som for ekspresjon i C127-celler, ble plasmidet pMLCE3a behandlet med Stul og et DNA-fragment på ca. 1,78 kb ble utvunnet. Alternativt, ble det samme plasmidet behandlet med EcoRI og et EcoRI-fragment på omkring 4 kb ble utvunnet. Hvert fragment var passende for anvendelse som en kilde for det kromosomale G-CSF-genet.
Fragmentet som ble anvendt som en kilde ble behandlet med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I (a).
Som i eksempel 38, ble SV40 promotoren (EcoRI-EcoRI-fragment) kuttet ut fra pHGA410 for å oppnå et fragment på omkring 0,4 kb, som på lignende måte ble behandlet med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase (b).
I et separat trinn, ble plasmidet pAdD26SVpA (Kaufman, R.G. & Sharp, P.A., Mol. Cell. Biol., 2, 1304 - 1319 (1982)) behandlet med EcoRI, deretter med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase og endelig defosforylert ved behandling med en bakteriell alkalisk fosfatase (c).
Fragmentene (a), (b) og (c), hvert med en vekt på 0,1 ug, ble oppløst i 20 ul av en reaksjonsløsning (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) og reaksjonen ble utført over natten ved 4'C i nærvær av 180 enheter av en T4 DNA-ligase.
Reaksjonsløsningen ble deretter behandlet ved hjelp av rubudiumkloridprosedyren som er beskrevet i Molecular Cloning, ibid. for å transformere E. coli-stammen DH1. De oppnådde Tet<r->koloniene ble screenet med hensyn til dem som inneholdt plasmidet pD26SVCE3(X.
Som vist i fig. 22, har plasmidet pD26SVCE3oc CSF-genet koblet til det SV40 tidlige gen og dhfr-genet koblet nedstrøms fra adenovirusets sene hovedpromoter.
Plasmidet pAdD2 6SVpA ble behandlet med EcoRI og BamHI som i 2) i eksempel 25, for å oppnå et DNA-fragment (ca. 2 kb) som inneholdt dhfr-genet. Dette fragmentet ble bundet til fragment (a) og EcoRI-Sall-fragmentet av pHGA410 (H) for å danne en Amp<r> ekspresjonsvektor pDRCE3(X (fig. 22) .
CHO-cellene ble transformert med de oppnådde plasmidene pD2 6SVCE3cc og pDRCE3(X, som i eksempel 25. Ved gjentatt utvelgelse ved dyrking i nærvær av MTX, ble klonene av en G-CSF-produserende stamme oppnådd: EKSEMPEL 40: Måling av G-CSF-aktiviteten av transformantene (ekspresjon av humant kromosomalt gen). Supernatantene fra kulturer av C127-celler og CHO-celler som var oppnådd i hhv. eksempel 38 og 39, ble bearbeidet som i eksempel 26 for å oppnå human G-CSF, og aktiviteten ble målt. Resultatene er vist i tabell 11.
EKSEMPEL 41: Transformantenes molekylvekt og isoelektriske
punkt.
De rensede CSF-prøvene som ble anvendt ved analyse av aminosyresammensetningen i eksemplene 16, 20, 27, 33 og 37 ble underkastet målinger av deres molekylvekter og isoelektriske punkt ved hjelp av følgende prosedyrer.
1) Molekylvekt.
Molekylvekten av CSF ble bestemt ved hjelp av natriumdodecyl-sulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Elektro-foreseutstyret var en PROTEAN™ (16 cm, fra Bio-Rad Corporation) , med anvendelse av en gel som besto av en polyakrylamid"slab"gel (T = 15 %, C = 2,6 %) som målte 140 mm x 160 mm x 1,5 mm, og en konsentrerende gel (T = 3 %,
C = 20 %). En denaturert CSF-prøve ble fremstilt ved hjelp av følgende prosedyrer: CSF ble oppvarmet i 3 min. i en løsning inneholdende 2 % natriumdodecylsulfat i 0,46 M 2-merkaptoetanol. Etter at 4 ug av prøven var underkastet elektroforese med en konstant strøm på 3 0 mA i fire timer, ble gelen fjernet og farget med 0,25 % Coomassie Brilliant Blue R 250 (fra Sigma Chemical Co.) for å påvise bånd. Følgende forbindelser ble anvendt som molekylvektsmarkører etter lignende behandlinger: fosforylase B (mol. vekt 92.500), bovint serumalbumin (BSA, mol. vekt 67.000), ovalbumin (OVA, mol. vekt 45.000), karbon-anhydrase (mol. vekt 31.000), soyabønnetrypsininhibitor (mol. vekt 21.500) og lysozym (mol. vekt 14.400).
Resultatet var at et eneste bånd tilsvarende en molekylvekt på 185.000 ± 1.000 ble detektert for hver av CSF-prøvene som var oppnådd i eksempel 16 (E. coli/cDNA (+VSE)) og eksempel 20 (E. coli/cDNA (-VSE)), og et eneste bånd tilsvarende molekylvekt på 19.000 ± 1.000 ble detektert fra hver av CSF-prøvene oppnådd i eksempel 27 (C127, CHO/cDNA (+VSE)), eksempel 33 (C127, CHO/cDNA (-VSE)) og eksempel 37 (COS/gDNA).
2) Xsoelektrisk punkt.
Det isoelektriske punkt for CSF ble bestemt ved hjelp av et "flat bed" isoelektrisk elektroforetisk apparat, FBE-3000 (fra Pharmacia Fine Chemicals). Etter elektroforese i 2 timer med en konstant effekt på 30 watt (Vmax = 2.000 volt) på en polyakrylamidgel (T = 5 %, C = 3 %, 115 mm x 23 0 mm) inneholdende Pharmalyte (pH = 4 - 6,5, Pharmacia Fine Chemicals) og 4M urea, ble CSF fiksert med 30 % metanol/10 % trikloreddiksyre/35 % sulfosalisylsyre, og farget med Coomassie Brilliant Blue R-250. Et lav PI kit (pH: 2,5 - 6,5, fra Pharmacia Fine Chemicals) ble anvendt som en markør for det isoelektriske punkt.
Analyse av båndseparasjonen ved pH 4 - 6,5, ga et eneste bånd tilsvarende pl = 6,1 for hver av CSF-prøvene oppnådd i eksempel 16 og 20, og viste tre adskilte bånd tilsvarende pl .= 5,5, 5,8 og 6,1 for hver av CSF-prøvene oppnådd i eksempel 27, 33 og 37.
EKSEMPEL 42: Beskyttende effekt av human G-CSF mot mik-robielle infeksjoner.
Testmetode
1. Beskyttelse mot infeksjon med Pseudomonas aeruginosa Endoxan (handelsnavn fra Shionogi & Co., Ltd.) ble tilført intraperitonealt til 8-9 uker gamle ICR-mus (hankjønn; med kroppsvekt 35,3 ± 1,38 g) i en dose på 200 mg/kg. Musene ble deretter oppdelt i tre grupper. To av gruppene ble gitt fire subkutane injeksjoner (hver 0,1 ml dose) med 24 timers intervaller, av et løsningsmiddel (1 % propanol og 0,5 % (w/v) serumalbumin fra mus i fysiologisk saltvann) inneholdende human G-CSF (25.000 eller 50.000 enheter/mus), mens den siste gruppen kun fikk tilført løsningsmiddelet som angitt over.
Tre timer etter den siste injeksjonen ble musene i hver gruppe infisert med Pseudomonas aeruginosa GNB-13 9 ved subkutan injeksjon (3,9 x IO<5> CFU/mus). 21 timer etter infeksjonen, ble de første to gruppene gitt en ny subkutan injeksjon av løsningsmiddelet inneholdende human G-CSF (25.000 eller 50.000 enheter/mus) idet den tredje gruppen kun fikk tilført løs-ningsmiddelet .
Den beskyttende effekten til human G-CSF ble undersøkt ved at antall mus som var i live 10 dager etter infeksjonen ble talt.
Fremstilling av cellesuspensjon.
Pseudomonas aeruginosa GBN-139 ble dyrket over natten med rysting ved 37 *C i et Heart Infusion flytende medium (Difco). Kulturen ble deretter suspendert i en fysiologisk saltoppløs-ning.
2. Beskyttelse mot infeksjon med Candida.
Endoxan (handelsnavn fra Shionogi & Co., Ltd.) ble tilført intraperitonealt til 8 uker gamle ICR-mus (hankjønn; med kroppsvekt 40,5 ± 1,60 g) i en dose på 200 mg/kg. Musene ble deretter oppdelt i to grupper. Den ene gruppen ble gitt fire subkutane injeksjoner (hver 0,1 ml dose) med 24 timers intervaller, av et løsningsmiddel (1 % propanol og 10 % (w/v) ICR museserum i fysiologisk saltløsning) inneholdende human G-CSF (50.000 enheter/mus), mens den andre gruppen kun fikk tilført det ovennevnte løsningsmiddel. Fire timer etter den siste injeksjonen, ble musene i hver gruppe infisert med Candida albicans U-50-1 (stamme isolert fra urin fra pasienter med leukemi; fra Bacteriological Laboratory, Tohoku University, School of Medicine) ved intravenøs injeksjon
(5,6 x IO<5> CFU/mus). Den beskyttende effekten av det humane G-CSF ble undersøkt ved at antall mus som var i live ti dager etter infeksjonen ble talt.
Fremstilling av cellesuspensjon.
Candida albicans U-50-1 ble dyrket over natten med rysting ved 37"C i et Sabouraud-flytende medium inneholdende gjærekstrakt (2 % dekstrose fra Junsei Pure Chemicals Co., Ltd.; 10 % Tryptocase Pepton, handelsnavn fra BBL; 5 % gjærekstrakt fra Difco; pH 5,6). Kulturen ble vasket to ganger med fysiologisk saltvann og suspendert i fysiologisk saltvann.
3. Beskyttelse mot infeksjon med intracellulær parasittisk
Listeria
Endoxan (handelsnavn fra Shionogi & Co., Ltd.) ble tilført intraperitonealt til 7 uker gamle ICR-mus (hankjønn; med kroppsvekt 34,7 ± 1,24 g) i en dose på 200 mg/kg. Musene ble deretter oppdelt i to grupper. Den ene gruppen ble gitt fire subkutane injeksjoner (hver med dose 0,1 ml) med 24 timers intervaller av et løsningsmiddel (1 % n-propanol og 10 % (w/v) ICR-museserum i fysiologisk saltvann) inneholdende human G-CSF (50.000 enheter/mus), mens den andre gruppen bare ble gitt løsningsmiddelet som angitt ovenfor. Fire timer etter den siste injeksjonen, ble musene i hver gruppe infisert med Listeria monocytogenes 46 (fra Microbiological Laboratory, Tohoku University, School of Medicine) ved intravenøs injeksjon av 1,0 x IO<7> CFU/mus. Den beskyttende effekten av human G-CSF ble undersøkt ved at antall mus som var i live tolv dager etter infeksjonen ble talt.
Fremstilling av cellesuspensjon.
Listeria monocytogenes 4 6 ble dyrket over natten med rysting ved 37<*>C i et Brain-Heart Infusion flytende medium (handelsnavn fra Difco). Kulturen ble deretter suspendert i fysiologisk saltvann.
Resultater
i) Forsøkene 1, 2 og 3 ble utført med E. coli G-CSF (+VSE) polypeptidet oppnådd i eksempel 16. Resultatene er vist i
tabellene 12, 13 og 14.
ii) Forsøk 1 ble utført med E. coli G-CSF (-VSE) polypeptidet oppnådd i eksempel 20. Resultatene er vist i tabell 15. iii) Forsøk 1 ble utført med en CHO-celle avledet, renset human G-CSF-prøve (+VSE), som var den samme som den som ble anvendt ved analyse av aminosyresammensetning i eksempel 27. Resultatene er vist i tabell 16.
De samme resultatene ble stort sett oppnådd når forsøk 1 ble utført med en C127-celle avledet, renset human G-CSF-prøve som var den samme som den som ble anvendt ved analyse av aminosyresammensetning i eksempel 27.
iv) Forsøk 1 ble utført med en CHO-celle avledet, renset human G-CSF-prøve (-VSE), som var den samme som den som ble anvendt ved analyse av aminosyresammensetning i eksempel 33. Resultatene er vist i tabell 17.
De samme resultatene ble hovedsakelig oppnådd da forsøk 1 ble utført med en C127-celle avledet, renset human G-CSF-prøve, som var den samme som den som ble anvendt ved analyse av aminosyresammensetning i eksempel 33.

Claims (4)

1. Rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein med aminosyresekvens som vist i fig. 3(B)(II) eller 4(B)(II), karakterisert ved at den inneholder en DNA-sekvens som koder for det angitte glykoprotein og en DNA-sekvens som koder for hG-CSF-ledersekvensen som muliggjør sekresjon av det angitte glykoprotein, og som er under kontroll av transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser som muliggjør ekspresjon i en egnet vertscelle.
2. Rekombinant vektor som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nevnte DNA-sekvens er forbundet med et replikon avledet fra en mikroorganisme eller virus.
3. Transformant som uttrykker et glykoprotein med en aminosyresekvens som vist i fig. 3(B)(II) eller 4(B)(II), karakterisert ved at den inneholder en rekombinant vektor som angitt i krav 1 og 2.
4. Fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein med human granulocyttkolonistimulerende faktor-aktivitet og med en aminosyresekvens som vist i fig. 3(B)(II) eller 4(B)(II), karakterisert ved at den omfatter: a) å konstruere en rekombinant vektor som angitt i kravene 1 og 2 inneholdende en DNA-sekvens som koder for en human granulocyttkolonistimulerende faktor, b) å transformere en stamme av dyrkede pattedyrceller med den ovennevnte rekombinante vektor, c) å dyrke transformantene, og d) å utvinne målproduktet.
NO863674A 1985-09-17 1986-09-15 Rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein, transformant som uttrykker et glykoprotein og fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein NO179373C (no)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP20606685 1985-09-17
JP20963885 1985-09-20
JP21715085 1985-09-30
JP26945685 1985-12-02
JP60269455A JPS62129298A (ja) 1985-12-02 1985-12-02 新規ポリペプチド
JP27083985 1985-12-03
JP60270838A JPH06102021B2 (ja) 1985-12-03 1985-12-03 新規なポリペプチド
JP61166709A JPH0657152B2 (ja) 1985-09-17 1986-07-17 Ｃｓｆ遺伝子類
JP61166710A JPS62236497A (ja) 1985-09-17 1986-07-17 顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質の製造方法

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO863674D0 NO863674D0 (no) 1986-09-15
NO863674L NO863674L (no) 1987-03-18
NO179373B true NO179373B (no) 1996-06-17
NO179373C NO179373C (no) 1996-09-25

Family

ID=27577507

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO863674A NO179373C (no) 1985-09-17 1986-09-15 Rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein, transformant som uttrykker et glykoprotein og fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein

Country Status (7)

Country Link
CA (1) CA1341389C (no)
DK (1) DK175336B1 (no)
FI (1) FI104982B (no)
HU (1) HU209147B (no)
IE (1) IE63992B1 (no)
IL (1) IL80058A (no)
NO (1) NO179373C (no)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112012017979B1 (pt) 2010-01-19 2021-10-13 Hanmi Science Co., Ltd. Formulações líquidas para conjugado de g-csf de ação prolongada
KR101831300B1 (ko) 2010-10-29 2018-02-23 한미사이언스 주식회사 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
FI863757A0 (fi) 1986-09-17
DK443286A (da) 1987-03-18
NO179373C (no) 1996-09-25
AU6298086A (en) 1987-03-19
HU209147B (en) 1994-03-28
DK175336B1 (da) 2004-08-30
FI863757A (fi) 1987-03-18
IE862427L (en) 1987-03-17
IL80058A (en) 1992-11-15
AU598477B2 (en) 1990-06-28
DK443286D0 (da) 1986-09-16
IE63992B1 (en) 1995-06-28
CA1341389C (en) 2002-10-01
NO863674L (no) 1987-03-18
NO863674D0 (no) 1986-09-15
FI104982B (fi) 2000-05-15
HUT42132A (en) 1987-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0220520B1 (en) Human granulocyte colony stimulating factor
EP0215126B1 (en) Human granulocyte colony stimulating factor
NO314902B1 (no) Biologisk funksjonelt plasmid eller virus-DNA-vektor som koder for en analog av granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), samtprokaryot eller eukaryot vertscelle
JPH06319557A (ja) リンホカインの生産および精製
JPH0657156B2 (ja) 新糖蛋白質の製法
EP0254399A2 (en) B-Cell stimulating factor
NO179373B (no) Rekombinant vektor istand til å uttrykke et glykoprotein, transformant som uttrykker et glykoprotein og fremgangsmåte for fremstilling av et glykoprotein
Clark-Lewis et al. Molecular structure and biological activities of P cell-stimulating factor (interleukin 3)
JPH0659220B2 (ja) ヒトインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコードする遺伝子
KR920002312B1 (ko) 인체 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자
AU2001282376B2 (en) Methods for preparing human thrombopoietin polypeptides by mammalian cell cultures
RU2057809C1 (ru) Способ получения фактора, стимулирующего образование колоний гранулоцитов
HRP920628A2 (en) Human granulocyte colony stimulating factor
IE930852L (en) Human granulocyte colony stimulating factor
AU2001282376A1 (en) Methods for preparing human thrombopoietin polypeptides by mammalian cell cultures
SI21397A (sl) Faktor, ki stimulira humano kolonijo granulocitov

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired