SI21397A - Faktor, ki stimulira humano kolonijo granulocitov - Google Patents

Abstract

Predmetni izum zagotavlja gen, ki kodira polipeptid, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo (hmani G-CSF), rekombinantni vektor vgrajenega omenjenega gena, transformat, ki omenjeni vektor vsebuje ter polipeptid ali glikoprotein, ki ima humano G-CSF aktivnosti in je proizveden s pomočjo omenjenega transformata, ter postopek za pridobivanje polipeptida ali glikoproteina s humano G-CSF aktivnostjo. Gen iz predmetnega izuma vključuje dve liniji cDNA, ki sta komplementarni s prenašalno RNA (mRNA), ki kodira polipeptid s humano H-CSF aktivnostjo, obsega pa tudi humani kromosomski gen, ki kodira polipetid s humano G-CSF aktivnostjo.ŕ

Description

FAKTOR, KI STIMULIRA HUMANO KOLONIJO GRANULOCITOV

Področje tehnike

Predmetni izum spada v področje molekularne biologije.

Tehnični problem

Predmetni izum se nanaša na faktor, ki stimulira humano kolonijo granulocitov. Ta izum se natančneje nanaša na kodirni gen za polipeptid, ki poseduje aktivnost faktorja stimuliranja kolonije (vnaprej bo označevan kot CSF), ki je specifičen stimulirni faktor, potreben v glavnem za grajenje kolonij humanih granulocitnih celic.

Predmetni izum se nanaša tudi na rekombinantni vektor prisoten v omenjenem genu, transformant, ki omenjeni gen vsebuje, polipeptid ali glikoprotein, ki ima CSF aktivnost, če je pridobljen iz omenjenega transformanta ter postopek za pridobivanje polipeptidov in giikoproteinov, ki imajo CSF aktivnost.

Stanje tehnike

Ko se celice kostnega mozga kakor celice mete in celice ledvic ali celice embrija kultivirajo z dvoslojnim mehkim agarje s celicami kostnega mozga v zgornjem sloju in celicami ledvic ali embrija v spodnjem sloju, del celic zgornjega sloja raste in se diferencira tako, da gradi kolonije nevtrofilnih granulocitov (nadalje enostavno granulociti) ali pa monocitnih makrofagov. To opažanje navaja na predpostavko prisotnosti in vivo faktorjev, ki pomagajo pri grajenju kolonij /Pluznik in Sach, J. Celi. Comp. Physioi., 66, 319(1965); ter Bradley in Metcalf, Aust. J.Exp. Biol.Med.Sci., 44, 287 (1966)/.

Znano je, da se ti faktorji, ki so skupno označeni kakor CSF lahko proizvedejo s celicami kakršne so T celice, monocitni makrofagi, fibroblasti ter endotelne celice, ki so normalno in vivo zelo razširjene. CSF vključuje naslednje podrazrede: granulocit-monocitni makrofagni CSF (označen kakor GM-CSF) , ki deluje na STEM celice granulocitov in monocite na tak način, da stimulira rast takih STEM celic in povzroča njihovo diferenciacijo tako, da gradijo kolonije granulocitov in monocitnih makrofagov CSF (označeni kakor G-CSF), ki deluje na slabo diferencirane multipotentne STEM celice; ter granulocit CSF (označen kakor G-CSF) tipa opisanega s tem izumom, ki je v principu sposoben za grajenje granulocitnih kolonij. Nedavno je bilo omenjeno, da se diferenciacije celic mete razlikujejo od enega podrazreda do drugega /Asano, Taisha-Metabolism and disease, 22, 249 (1985); ter Yunis et al., Growth and maturation factors, izdajalca Guroff, John Willey and Sons,

NY, vol.l, 209 (1983)/.

Zaradi tega je pojasnjevanje posameznih podrazredov CSF in izvajanje študijev njihovih kemijskih ter bioloških lastnosti zelo pomembno za preučevanje hematopoeznih mehanizmov in analiziranja patomorfoloških aspektov različnih hematoloških obolenj. Biološka dejstva G-CSF povzročajo povečano pozornost raziskovalcev zaradi svoje sposobnosti povzročanja diferenciacij levkemijskih celic kostnega mozga in jačanja funkcij zrelih granulocitov ter potencialno daje možnost uspešne klinične uporabe na področjih zdravljenja in preventivo levkemije.

Do sedaj so bili opravljeni poskusi za .izolacijo in prečiščevanje G-CSF osnovani na postopku kultivacije celic, kjer se G-CSF izolira iz supernatanta celične kulture, a homogeni G-CSF še ni bil proizveden v velikih količinah, saj se G-CSF lahko dobi le v majhnih koncentracijah in z 2ahevnimi postopki prečiščevanja iz velikega volumna tekočine kulture se dobijo le sledi G-CSFja. Zaradi tega je zaželjena pridobitev postopka rekombinantne DNA tehnologije za masovno proizvodnjo G-CSF.

Opis rešitve tehničnega problema s primeri izvajanja

Predmet tega izuma je omogočanje kodirnega gena polipeptida, ki ima humano G-CSF aktivnost.

Drugi cilj tega izuma je omogočanje rekombinantnega vektorja vgrajenega v omenjeni gen.

Nadaljni cilj tega je pridobivanje transformanta, ki se pridobi s transformiranjem gostitelja z omenjenim rekombinantnim vektorjem, ter polipeptida ali glikoproteina, ki se pridobi s pomočjo omenjenega transformanta.

Nadaljni cilj tega izuma je omogočanje postopka za pridobivanje polipeptida ali glikoproteina, ki ima humano G-CSF aktivnost.

Slika 1 prikazuje nize treh različnih sond IWQ, A ter LC;

Slika 2 prikazuje nulkleotidni niz pHCS-1 dela;

Slika 3 (A) prikazuje nukleotidni niz cDNA dela v pBRG4;

Slika 3(B)(I) prikazuje amino kislinski niz humanega G-CSF predhodnika izvedenega iz pBGR4 cDNA;

Slika 3(B)(Il)prikazuje amino kislinski niz humanega zrelega G-CSF izvedenega iz pBRG4 cDNA;

Slika 4 (A) prikazuje nukieotidni niz cDNA dela v pBRV2;

Slika 4(B) I prikazuje amino kislinski ni2 humanega G-CSF predhodnika izvedenega iz pBRV2 cDNA;

Slika 4(B) II prikazuje amino kislinski niz humanega zrelega G-CSF izvedenega iz pBRV2 cDNA;

Slika 5 prikazuje nukieotidni niz humanega kromosomskega kodirnega gena za humani G-CSF;

Slika 6 prikazuje restrikcijski encim mesta prekinjanja pBRG4- aii pBRV2-izvedene humanega G-CSF cDNA;

Slika 7 prikazuje restrikcijski encim mesta prekinjanja humanega kromosomskega gena, ki je kodirni gen za humani G-CSF.

Slika 8 je delna predstavitev postopka za pridobivanje tac promotorja (pospeševalca; Op. prev), ki vsebuje vektor (+VSE linija);

Slika 9 je predstavitev postopka za pridobivanje P_L promoterja, ki vsebuje vektor (+VSE linija);

Slika 10 je predstavitev postopka za pridobivanje trp promotorja, ki vsebuje vektor (+VSE linija;)

Slika 11 je delni prikaz postopka za pridobivanje tac promotorja, ki vsebuje vektor (-VSE linija;)

Slika 12 je predstavitev postopka za pridobivanje P_L promotorja, ki vsebuje vektor (-VSE linija);

Slika 13 je predstavitev postopka za pridobivanje trp promotorja, ki vsebuje vektor (-VSE linija);

Slika 14 prikazuje shematsko strukturo pHGA410;

Slika 15 je predstavitev postopka za konstrukcijsko izražanje rekombinantnih vektorjev pTN-G4, pTN-G4VA ter pTN-ot, G4VAp;

Sliki 16a in 16b prikazujeta dva postopka za grajenje pHGG4-dhfr;

Slika 16c prikazuje postopke za grajenje pG4DRl in pG4DR2;

Slika 17 shematsko prikazuje strukturo pHGV2;

Slika 18 je predstavitev postopka za konstrukcijsko izražanje rekombinantnih vektorjev, pTN-V2, pTN-VAa ter ρΤΝ-νΑβ;

Sliki 19a in 19b prikazujeta dva postopka za konstruktivno izražanje rekombinantnega vektorja pHGV2-dhfr.

Slika 19c prikazuje postopke za grajenje pV2DRl in pV2DR2;

Slika 20 shematsko prikazuje strukturo pMLCEa ;

Slika 21 shematsko prikazuje strukturo pTNCE3ct;

Slika 22 shematsko prikazuje strukture pD2 6SVCE3ot ter pDRCE3a.

Kodirni gen za poiipeptid, ki ima humano G-CSF aktivnost je glede na ta izum DNA (cDNA), ki je komplementaren s prenosno RNA (mRNA), ki pridobljen kot 15.do 17. frakcija centrifugiranega gradienta z gostoto saharoze in ki kodira poiipeptid s humano G-CSF aktivnostjo.

Ti iznajditelji so dobili dve liniji cDNA.

cDNA ene linije ima ves ali del kodirnega gena za poiipeptid I ali II prikazan na sliki 3(B). Natančneje ima ta cDNA nukleotidni niz risan z ATG na 32-34 nukleotidnih položajih s 5¹- terminusa (glej sliko 3(A)/ in CCC na 650-652 nukleotidnih položajih ali z ACC na 122-124 položajih in CCC na 650-652 položajih. Alternativno ima cDNA nukleotidni niz prikazan na sliki 3(A) ali njegov del. cDNA te linije je tu nižje označen kakor cDNA (+VSE).

cDNA druge linije ima cel ali del kodirnega gena za poiipeptid I ali II prikazanih na sliki 4 (B) . Natančneje ima ta nukleotidni niz, oblikovan z ATG na 31-33 nukleotidnih položajih s 5* terminusa/ glej sliko 4(A)/ in 2 CCC na 640-642 nukleotidnih položajih, ali z ACC na 121-123 položajih in z CCC na 640-642 položajih. Alternativno ima lahko ta cDNA nukleotidni niz prikazan na sliki 4(A) ali pa njegov del. cDNA te linije je nižje označen kakor cDNA (-VSE).

Zgoraj opisani gen lahko dobimo, če sledimo naslednji proceduri:

mRNA kodiran G-CSF najprej pridobimo iz animalnih celic sesalcev ali drugih celic gostiteljev s sposobnostjo proizvodnje polipeptidov, ki ima G-CSF aktivnost; mRNA se tedaj prevede v dvoverižno cDNA z enim izmed znanih postopkov; set rekombinantov, ki vsebujejo to cDNA (le ta je nadalje označevan kakor cDNA knjižnica) se nato podvrže presejanju z znanimi postopki.

Gen opisan v tem izumu vključuje humani kromosomski kodirni gen za polipeptid, ki ima humano G-CSF aktivnost. Ta humani kromosomski gen vsebuje nukleotidni gen, ki ima MDSO v transkripcijski kontroli in prav tako vsebuje cel ali del nukieotidnega niza prikazanega v sliki 5.

Kromosomski gen se lahko dobi primarno s pripravljanjem iz humanih celic seta rekombinantov, ki vsebujejo humani kromosomski gen (set bo nadalje označevan kot knjižnica humanega kromosomskega gena), ter z nadalnjim testiranjem omenjenega gena s pomočjo znanih metod.

Humani kromosomski gen se lahko pridobi iz kateregakoli tipa humanih celic, kakršne so celice ekstrahirane iz jeter ali ledvic ali pa kultiviranih celic kakršne so tumorske celice. Knjižnica humanega kromosomskega gena se lahko dobi iz celic s katerimkoli znanim postopkom / glej Maniatis et al., Celi, 15,

-7687 (1987); ter Maniatis et al., Molecular cloning, Cold Spring Harbor laboratory, p, 269 ff. (1982), ki so ilustrirani nižje:

Ekstrakt humanega kromosomskega DNA iz takega izvora kakršen so humana jetra zarodka s fenolom aii drugimi ustreznimi kemikalijami; popolno ali delno razgrajevanje ekstrahirane DNA z ustreznim restrikcijskim encimom tako, da se dobi DNA odgovarjajoče dolžine? vstavljanje DNA dela v λ-fag vektorja DNA fragmentu z T4 ligazo ali drugimi ustreznimi ligazami z vezivom, ki vsebuje restrikcijsko mesto za odgovarjajoči encim kakršen je EcoRI, ki se po izboru pripne; zatem se dobi λ-fag delca s postopkom pakiranja in vitro I transformiranjem celic gostitelja kakrčne so E. Coii s pridobivanjem λ-fagnih delcev.

Primeri λ-fagov uporabnih kakor vektor v zgornjih postopkih vključujejo Charon 4A, EMBL-3 in EMBL-4.

Celica sesalca, ki se jo lahko uporabi kakor izvor mRNA oskrbe je humana rakasta celica vrste CHU-2, vzeta iz ustne votline, (hranjena v Collection Nationale de Cultures de Mikroorganismes ali C.N.C.M., pod številko 1-483). Potrebno pa je povedati, da se namesto teh tumornih celic lahko uporablja tudi katerakoli druga vrsta celic vzeta iz organizmov sesalcev. Pridobivanje mRNA se lahko izvede z katerokoli znano metodo za kloniranje gena drugih fizioloških aktivnih proteinov: na primer, cela RNA se prvotno dobi s tretiranjem s površinsko aktivno substanco in fenolom v prisotnosti ribonukleoznega inhibitorja kakršen je vanadil-ribonukleozid kompleks /glej Berger in Birkenmeier, Biochemistry, 18, 5143 (1979)/ ali CsCl z gradientom gostote centrifugiranja, ki je spremljan z tretiranjem z gvanidin tiocianatom /glej Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294 (1979)/, tako se dobi poli (A⁺) RNA (mRNA) s tretiranjem cele RNA s stopnjevito adsorbcijo ali vplivom kromatografije na stolpcu na oligo(dT)-celulozi ali poli-II-saharozi 2B uporabljeni kakor nosilec. Poli (A⁺) se lahko nadalje frakcionira z ustreznim postopkom. Sposobnost tako pridobljene mRNA za kodiranje za polipeptid, ki ima G-CSF aktivnost se lahko potrdi s pomočjo večjega števila metod; na primer mRNA se prevaja v protein katerega fiziološke aktivnost se nato preverjajo; alternativno se identiteta tega proteina odredi s pomočjo anti-G-CSF antitelesa. Natančneje povedano, se mRNA vpeljuje v oocite Xenophs Laevis-a zaradi izvajanja translacije /glej Gurdon et al._f Nature, 233, 177 (1972)/, ali pa se translacija izvede s pomočjo retikulocitov zajca ali kalčki pšenice /Schleif in Wensink, Practical Methods in Molecular Biology, SpringerVerlag, NY (1981)/. G-CSF aktivnost se lahko testira s pomočjo metode kultiviranja na mehkem agarju z uporabo celic kostnega mozga, ki je opisan /Metcalf, Hemopoietic Colonies, SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, NZ (1977)/.

Enojna cDNA sintetizirana s tako dobljeno mRNA se uporablja kakor salona; dvojna cDNA se sintetizira iz te enojne cDNA; in dvojna cDNA se uvaja v ustrezajoči vektor DNA tako, da gradi rekombinantni vektor. Ta rekombinantni plazmid se lahko uporabi za transformacijo ustreznega gostitelja, kakršen je Esherichia Coli, tako da se dobi skupina DNAjev v transformantih (cDNA knjižnica).

Dvojna cDNA se lahko dobi iz mRNA na enega od sledečih načinov: mRNA se tretira z reverzno transkriptazo z oligo(dT), ki je komplementarna poli(A)-verigi na 3'-terminusu vzetim kot primer; ali pa z oligonukleotidom, ki odgovarja delu aminokislinskega niza G-CSF, ki se sintetizira, cDNA, ki pa je komplementarna z mRNA pa se sintetizira z tretiranjem z reverzno transkriptazo s sintetiziranim oligonukleotidom uporabljanim kakor iniciator. Dvojna cDNA se lahko pridobi tudi na naslednji način: mRNA se razgradi in odstrani z tretiranjem z bazo, pridobljena enojna cDNA pa se tretira najprej z reverzno transkriptaze ali DNA polimerazo I (npr. Klenow fragment), ter nato z Sl nukleusom; alternativno se mRNA lahko tretira neposredno z RNAzo H in DNA polimerazo (npr. E. Coli polimeraza 1). Za nadaljne informacije poglejte Manitatis et al., Molecular Cioning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); ter Gubler in Hoffman, Gene, 25, 263 (1983).

Tako pridobljena dvojna cDNA se nato uvede v odgovarjaajoči vektor kakršen je, na primer, eden od Ek-tipa plazmidnih vektorjev označenih kakor pSClOl, pDF41, ColEl, pMB9, pBR322, pBR327 ter pACVCl ali eden od fagov vektorja označenih kakor Xgt, Xc, XgtlO ter XgtWES, nato pa se rekombinantni vektor uporabi za transformacijo vrste E. Coli (npr. Χ1776, HB101, DH1 ali C600), tako da se dobi knjižnica cDNA (glej, naprimer, Molecular Cioning, isto).

Celica gostitelja se lahko s tako dobljenim rekombinantom DNA prevede s pomočjo katerekoli znane metode. Če je celica gostitelja E. COLI, se lahko postopek, ki ga je opisal Hanahan (J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)/ uporabi tako, da se rekombinantna DNA doda ustrezni celici, dobljeni v prisotnosti CaCl₂, MgCl₂ ali RbCl.

Testiranje celic, ki željene gene gojijo se lahko i2vede s pomočjo večih metod, ki vključujejo: plus-minus metoda uporabna v klonirajočem interferonu cDNA /Taniguchi et al., Proč. Jpn. Acad., 55, Ser.B.,464(1979)/, metoda preverjanja hibridizacijetranslacije /Nagata et al., Nature, 284, 316 (1980)/ in kolonija ali metoda hibridizacijskega okuževanja, ki uporablja oligonukleotidni vzorec kemijsko sintetiziran na osnovi aminokislinskega niza proteinov, ki imajo humano G-CSF

-1010 aktivnost /Wallace et al·., Nucleic Acids Res., 9, 879 (1981); ter Benton in Davis, Science, 196, 180 (1970)/.

Fragment, ki vsebuje tako kloniran kodirni gen za polipeptid, ki ima humano G-CSF aktivnost se lahko ponovno vstavi v ustrezni DNA vektor v namen prevajanja drugih prokariontskih ali evkarionskih celic gostiteljev. 2 uvajanjem ustreznega promotorja in izražanja niza povezanega v vektor, se gen lahko izrazi v individualni celici gostitelja.

Ilustrativne prokariontske celice gostiteljev vključujejo Esherichia coli, Bacillus subtillis, Bacillus thermophilus. Gen se lahko v teh gostite!jskih ceiicah izrazi s transformacijo s pomočjo replikona (npr. plazmidni vektor, ki ima začetek ter regulator ni2a), ki se izvede iz vrst kompatibilnih z gostiteljem. Zazeljeni vektor je tisti, ki ima niz sposoben za transformacijo celice s selektivnostjo za izraženo lastnost (fenotip).

Na primer, E. coli se lahko prevede s pBR322, ki je vektor sposoben za kopiranje v E. coli /glej Bolivar, Gene 2, 95 (1975)/. Ta vektor vsebuje tako ampicilin- ter tetraciklinodporne gene, katerih lastnosti se lahko izkoristijo za identifikacijo transformiranih celic. Primeri promotorjev, ki so za genetsko izražanje v prokariontskih gostiteljih nujno potrebni vključujejo promotor β-laktaze gen/Chang et al., Nature, 275, 615 ¢1978)/, laktoza promotor/ glej Goeddel et al., Nature, 281, 544 (1979) ter triptofan promotor /glej Goeddel et al., Nucleic Acid Res., 8, 4057 (1980)/ in tako naprej. Glede na ta izum se lahko za produkcijo polipeptidov s humano G-CSF aktivnostjo iahko uporablja katerikoli izmed teh promotorjev.

-11Evkariontski mikroorganizem kakršen je Saccharomyces cerevisiae, se lahko uporabi kakor celica gostitelj in se transformira z vektorjem kakršen je plazmid Yrp7 /glej Stinchcomb et al. Nature, 282, 39 (1979)/. Ta plazmid ima TRPI gen kakor selektivni označevalec za vrste kvasovk s sposobnosjo proizvodnje triptofana, tako da se transformanti lahko izberejo z vzgajanjem v odsotnosti triptofana. Primerji promotorja, ki se lahko uporabijo za preiskovanje gena vključujejo kisli fosfatazni gen promotor /Miyanohara et al., Proč. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 1 (1983)/ ter alkoholdehidrogenazni gen promotor /Valezuela et al., Naturae, 298, 347 (1982)/.

Celica gostitelja se lahko pridobi tudi iz celic sesalcev kakršne so COS celice, celice jajčnikov Kitajskih hrčkov (CHO), C-127 celice in Hela celice. Ilustrativni vektor, ki se lahko uporabi zaradi transformiranja teh celic je pSV2-gpt /glej Mulligan in Berg; Proč. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 2072 (1981)/. Vektorji uporabljani za transformiranje teh celic vsebujejo začetek, selekcijski marker, promotor, ki je predhodnik položaja, kjer bo gen izražen, RNA, ki mesto spaja, poliadenilacijski signal, itd.

Ilustrativni promotorji, ki se lahko uporabljajo za izražanje gena v celicah sesalcev vključujejo promotorje retrovirus, polynoma virus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), itd. Če se uporablja promotor SV40, se lahko zaželjeno izražanje gena doseže z metodo Mulligana et al., opisani v Nature, 277, 108 (1979).

Ilustrativni začetki, ki se lahko uporabljajo vključujejo tiste izvedene iz SV40, polynoma virusa, adenovirusa, papiloma virusa goveda(BVP), itd. Ilustrativni selekcijski marker, ki se lahko uporabi vključuje fosfotransferaza APH (3') II ali I (neo) gen,

-1212 timidin kinaza (TK) gen, E. coli ksantinguanin fosforiboziltransferazni (Ecogpt) gen, dihidro folat reduktazni (DHFR) gen, itd.

Za pridobivanje polipeptida s humano G-CSF aktivnostjo iz zgoraj navedenih gostitelj-vektor sistemov se lahko uporabljajo naslednji postopki: kodirni gen za polipeptid, ki ima humano GCSF aktivnost se nastavi na pravo mesto v enega izmed prej omenjenih vektorjev; gostiteljska celica se transformira z dobivanjem rekombinanta DNA; tako dobljeni transformanti se nato kultivirajo. Željeni polipeptid se lahko iz celice izolira in prečisti ali raztopine kulture s katerokoli znano tehniko.

Za evkariontske gene na splošno velja, da kažejo polimorfizem, kakor je znano v primeru humanega interferon gena /glej Nishi et al., J.Biochem., 97, 153 (1985)/ in ta fenomen lahko izzove substitucijo ene ali večih aminokislin v nukleotidnem nizu ne pa tudi spremembe v celotnem aminokislinkem nizu.

G-CSF aktivnost lahko poseduje tudi polipeptid, ki mu manjka ena ali več aminokislin v nizu aminokislin na slikah 3(B) ali 4 (B) ali tisti, ki ima take aminokisline dodane, ali pa polipeptid, ki ima eno ali več takih amino kislin zamenjanih z eno ali večimi amino kislinami. Znano je tudi, da ima polipeptid, dobljen s prevajanjem vsakega izmed cistein kodonov v humani interlevkin-2 (IL—2) gen v serin kodon aktivnost interlevkina-2 /wang et al., Science 224, 1431 (1984)/. Zaradi tega so vse dotlej, dokler imajo tako naravni kakor sintetični polipeptid! humano G-CSF aktivnost, vsi geni, ki kodirajo te polipeptide, rekombinantni vektorji s temi geni in polipeptidi ali glikoprotein, ki so dobljeni s pomočjo kultiviranja takih transformantov spadajo pod okrilje tega izuma.

-1313

Nižje so navedeni podatki za pridobivanje genov tega izuma, ki kodirajo polipeptid s humano G-CSF aktivnostjo, rekombinantni vektor z omenjenim genom ter transformant, ki ta rekombinantni gen vsebuje ter polipeptid ali glikoprotein s humano G-CSF aktivnostjo izraženo v tem transformantu.

(1) Priprava sonde

Homogeni humani CSF protein je prečiščen iz supernatanta kulture celice tumora linije, CHU-2, nakar se odredi njegovaminokislinski niz od N terminusa. Fragmenti se dobijo z razgradnjo s pomočjo bromociana in z tretiranjem s tripsinom, nakar se aminokislinske nize teh fragmentov določi /Primer 3(1), (ii) in (iii)/.

Iz določenih amino kislinskih nizov se sintetizirajo tri nukleotidne sonde, (A), (LC) in (IWQ), ki imajo nize prikazane na sliki 1 (primer 4). Sonda (A) je bila iz zmesi sestavljene iz 14-ih sukcesivnih nukleotidov. Sonda (IWQ) je sestavljena iz 30 sukcesivnih nukleotidov z deoksinozinom in je bila enakega tipa kakor sonda uporabljena v kloniranju humanega holcistokinin gena /Takahashi et al., Proč. Natl. Acad. Sci., USA 82, 1931 (1985)/. Sonda (LC) je bila 24-nukleotidna sonda sintetizirana iz nukleotidov na 32-39 položajih od N terminusa amino kislinskega niza prikazanega v primeru 3(1) na osnovi nukleotidnega niza prikazanega v sliki 3.

Kemijske sinteze nukleotidov se lahko izvajajo z uporabo izboljšane fosfodiesterske metode v trdni fazi, ki jo je opisal Narang /Tetrahedron, 39, 3-22 (1983)/.

Sonde osnovane na aminokislinskih nizih na položajih, ki niso enaki tistim v vnaprej navedenih sondah se lahko tudi izkoristijo.

-1414 (2) Grajenje cDNA knjižnice

CHU-2 celice so homogenizirane po dodatku raztopine guanidin tiocianata in skupne RNA pridobljene s pomočjo CsCl centrifugirajočega gradienta gostote.

Poli (A⁺) RNA se izolira iz skupne RNA s pomočjo kromatografije na stolpcu iz oligo (dT)-celuloze. Za tem se z uporabo reverzne transkriptaze sintetizira enoverižna cDNA ter nato z dodajanjem RNAze H in E. coli DNA polimeraze I sintetizira dvojnoverižna cDNA. dC veriga se tako dobljeni verigi cDNA pripne, ki se nato spoji z vektorjem pBR322, na katerem je dG veriga pripeta na Pst I mesto pripajanja. Dobljeni rekombinant DNA se uporablja za transformacijo vrste E. coli, Χ1776 in tako je pBR322-vrsta cDNA nadgrajena (Primeri 5 in b).

NA podoben način se na XgtlO vektor iz E.coli pripne dvojna veriga cDNA s pmočjo veziva in λ-fag linija cDNA je nagrajena (Primer 7).

(3) Testiranje

Rekombinanti izvedeni iz pBR322-linije cDNA knjižnice se fiksirajo na Whattman 541 filtrirnem papirju, enojni klon pa se lahko izvede s pomočjo hibridizacije kolonije z 32P-obelešeno sondo (IWQ). Nadaljnje preučevanje s Southern vpijajočo metodo /Southern, J.Mol.Biol., 98, 503 (1975)/ kaže, da se ta klon tudi hidrolizira s sondo (A). Nukleotidni niz tega klona je odrejen s pomočjo dideoksi metode /Sanger, Science, 214, 1205 (1981)/.

Nukleotidni niz dobljenega cDNA dela je prikazan v sliki 2, iz katere je razvidno, da ta del sestavlja 308 osnovnih parov, ki vključujejo sonde (IWQ) in (A) , ter ima odprt bralni okvir, ki

-1515 kodira za 83 amino kislin, ki vsebujejo aminokislinski niz prikazan v primeru 3 (iii). pBR322 izveden plazmid, ki vsebuje teh 308 osnovnih parov je nižje označen kakor pHCS-1 (primer 8) .

DNA fragment, ki vsebuje 308 osnovnih parov, dobljen iz pHCS-1 se radioakivno obeleži s pomočjo metode trasnslacijskega vreza (glej Molecular Cloning, ibid) in se uporablja kakor sonda, λ gtlO- izvedena cDNA knjižnica pa se preseje s pomočjo zarezne hibridizacije /Benton in Davis, Science, 196, 180 (1977)/ tako, da se dobi 5 klonov. Nukleotidni niz klonov, za katerega se domneva, da vsebuje cDNA se odredi z isto metodo kakor je to opisano naprej /Slika 3(A)/.

Kot je pokazano v sliki 3(A), ima ta cDNA enojni široko odprt bralni okvir.

Amino kislinski niz kodiran s tem cDNA se lahko prikaže kakor na sliki 3(A).

Primerjava z N-terminalnim amino kislinskim nizom G-CSF proteina prikazanega v primeru 3(1) prikazuje, da ta cDNA vsebuje nukleotidni niz, ki odgovarja signalnemu peptidu kodiranem s pomočjo 90ih osnovnioh izhodnih parov z ATG ni2om na 32-34 nukleotidnih položajih s 5’ terminusa in končanih z GCC nizom na 119-121 položajih in zrelemu G-CSF polipeptidu kodiranemu s pomočjo 531 osnovnih izhodnih parov z ACC nizom na 122-124 položajih in, ki se končuje z CCC nizom na 650-652 položajih. Zaradi tega je polipeptid aminokislinskega niza I, prikazanega na sliki 3 (B), sestavljen iz 207 amino kislin in ima molekulsko maso enako 22292,67 daltonov. Polipeptid aminokislinskega niza II je sestavljen iz 177 amino kislin in ima izračunano molekulsko maso 18986,74 Daltonov (Primer 9).

-1616

Potrebno je povedati, da se lahko ATG na položajih 32-34 ali na položajih 68-70 tudi tretira kakor začetno mesto proteina. Escherichia coli vrsta Χ1776, ki goji pBR322, ki ima cDNA +(VSE) na EcoRI mestu prekinjanja se hrani v Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, (FERM BP.954).

Slika 6 prikazuje mesto prekinjanja restrikcijskega encima gena.

Ta cDNA se spoji na pBR327 /Sorberon et al., Gene, 9, 287 (1980)/ na EcoRI položaju, dobljeni plazmid pa bo nadalje označevan kakor pBRG4. Tako dobljen pBRG4 se tretira z restrikcijskim encimom, EcoRI, tako da se dobi DNA fragment, ki vsebuje od okoli 1500 osnovnih parov. Ta fragment je obeležen z radioaktivnimi izotopi s pomočjo metode tanslacijskega urezovanja (glej Molecular Cloning, isto). S tako obeleženim DNA fragmentom, ki se uporabi kakor sonda, se XgtlO-izvedena cDNA knjižnica ponovno testira s pomočjo hibridizacije okužbe (glej Benton in Davis, isto). V tej hibridizaciji okužbe se pripravita dva trakova nitroceluloznega papirja na katerih je fiksirana λ-fagna DNA; eden od obeh trakov se uporabi za zgoraj omenjeno hibridizacijo okužbe, druga pa se podvrže hibridizaciji okužbe z že omenjeno sondo (LC). Izbrani so fagi, ki so bili pozitivni za obe sondi. Klon, ki ima polno dolžino cDNA se izbere in nukleotidni niz dela cDNA, ki se odredi z dioksi metodo je prikazan na sliki 4(A).

Ta cDNA ima enojen široko odprt bralni okvir in amino kislinski niz, ki naj bi bil s to cDNA kodiran se izvede kakor je to prikazano na sliki 4(A).

Primerjanje z N-terminanim aminokislinskim nizom G-CSF proteina prikazanega v primeru 3(1) pokaže, da ta cDNA vsebuje

-1717 nukleotidni niz, ki ustreza tudi signalnemu peptidu kodiranemu z 90-imi baznimi pari in se začenja z ATG nizom na 31-32 nukleotidnih položajih s 5'-konca in knčuje s GCC nizom na 118120 položajih in zrelemu g-CSF peptidu kodiranemu z 522 baznimi pari, ki se začenja z ACC nizom na 121-123 položajih in se končuje s CCC nizom na 640-642 poološajih. Zaradi tega je polipeptid amino kislinskega niza I prikazanega na sliki 4(B) sestavljen iz 204 aminskih kislin katerega izračunana molekulska masa je 21977,35 Daltonov. Polipeptid aminokislinskega niza II je sestavljen iz 174 amino kislin njegova izračunana molekulska masa pa je 18671,42 Daltonov (primer 10).

Potrebno je povedati, da se lahko ATG na položajih 58-60 ali na položajih 67-69 prav tako razume kakor proteinsko začetno mesto.

Escherichia coli vrste Χ1776, ki vzgaja pBR322, ki ima to cDNA na EcoRI mestu prekinjanja se hrani v Fermentation Research Institute, The Agency of Industrial Science and Technology” (FERM BP-955).

Slika 6 prikazuje mesto prekinjanja restrikcijskega encima gena. Ta cDNA je pričvrščena na pBR327 na EcoRI mestu tako, da se gradi plazmid, ki bo vnaprej označevan kakor pBRV2.

(4) Testiranje knjižnice humanega kromosomskega gena

Knjižnica humanega kromosomskega gena, ki se dobi s postopki, ki so jih opisali Maniatis et al. (molecular Cloning, isto) se podvrže testiranju z pHCS-1, ki je prikazan naprej. Sonde, ki se lahko uporabijo za testiranjer vključujejo: pHCS-1 izveden 308-bp DNA fragment, pBRG4-izveden z 1500-bp fragment, pBRV2izveden z 1500 bp DNA fragment, DNA fragment ustrezne dolžine

-1818 vsebuje del enega ali večih DNA fragmentov, kakor tudi zgoraj omenjenih nukleotidnih sond /npr. (IWQ), (A) ter (IC)/. Spodaj je opisan primer uporabljanja pHCS-1 DNA fragmenta.

TA DNA fragment je s pomočjo tanslacijskega zarezovanja označen s ³²p /glej Roop et al., Celi, 15, 431 (1987)/. Z dobljenim 32p-obeleženim fragmentom uporabljanim kakor sonda, se knjižnica humanega kromosomskega gena podvrže testiranju s pomočjo hibridizacijske zareze (glej Benton in Davis, isto), tako da se dobi deset vzporednih klonov.

Po ločevanju DNA iz klonov se pripravi shema encimov z znanimi postopki (Fritsch et al·., Celi, 19, 959 (1980)/.

Z isto DNA sondo je bilo izvedeno Southeron vpijanje (glej Southeron, isto), s čimer se je odkrilo, da se DNA fragment dolg okoli 4 kb izreže iz AcoRI in Khol, ki potencialno vsebujejo regijo za kodiranje humanega G-CSF polipeptida.

Zaradi tega se 4-kb fragment vstavi v pBR327 na EcoRI mestu z uporabo EcoRI veziva tako, da se dobi pBRCE3p. S tem plazmidom uporabljanim kakor baznim nizom DNA, se s pomočjo dioksi metode odredi nukleotidni niz 3-kb dela 4-kb DNA fragmenta.

Ugotovljeno je bilo,da omenjeni fagment je kodirni gen za humani G-CSF polipeptid (slika 5).

E. coli vrste Χ1776 ki vzgaja pBRCE3p (t.j. plazraid pBR327, ki omenjeni 4-kb DNA fragment nameščen na EcoRI mesto) se hrani v Fermentation Research Institute, the Agency of Industriai Science and Technology (FERM BP-956).

Primerjava med pBRG-4 cDNA delom prikazanem v sliki 3 in pBRV cDNA delom prikazanem v sliki 4 kaše, da diskontinuirani del

-1919

DNA vsebuje pet delov eksonov zaradi česar kodira amino kislinske nize izvedene iz pBRG4 in pBRV2,

Slika 7 prikazuje mesto prekinjanja restrikcijskega encima dobljenega encima.

Ta DNA fragment vsebuje kromosomski gen humanega G-CSF ali pa področje, ki mu predhodi, se transkribira v humano G-CSF mRNA, plus nukieotidni niz, ki sodeluje v transkripcijskem nadzoru /Benoist in Chambon, Ann. Rev. Biochem., 50, 349 (1981)/.

5) konstrukcija rekombinantnega vektorja za izražanje v E.coli (A) +VSE linija rekombinantni vektor

Iz pBRG4 plazmida dobljenega v (3) (primer 9), se z restrikcijskim encimom izreže cDNA fragment G-CSF peptida, rekombinantni vektor pa se izdela na enega izmed sledečih načinov:

(i) z uporabo kaljenega sintetičnega veziva se fragment poveze s fragmentom dobljenim iz tac promoterja, ki vsebuje pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals) (Primer 12 in slika 8);

(ii) trije fragmenti pridobljeni iz P_L promoterja, ki vsebuje pPL-lambda (Pharmacia Fine Chemicals) se povežejo s kaljenim sintetičnim vezivom, proizvod povezovanja ter cDNA fragment pa se nadalje podvržejo ponovnemu postopku pridobivanja, tako da se gradi rekombinantni vektor (Primer 13, slika 9); ali (iii) z uporabo kaljenega sintetičnega veziva, se fragment poveže s fragmentom priodobljenim iz trp promoterja, ki vsebuje pOYI plazmid (Primer 14, slika 10).

(B) -VSE linija rekombinantni vektor

-2020

Na enak način, kakor je bilo opisano zgoraj se z uporabo plazmida pBRV2 izdelajo trije rekombinantni vektorji (Primer 10), kakor je to prikazano v primeru 19 in slikah 11, 12, 13.

(6) Pridobivanje E.coli transformanta, ter kultiviranje in izražanje tega

Z uporabo treh rekombinantnih vektorjev se vsaka +VSE in -VSE linija E.coli vrste DH1, N4830 ali JM105 transformirajo s pomočjo kalcijevega klorida ali rubidijevega klorida v postopku, ki je bil opisan v Molecular Cloning, isto (Primeri 12, 13, 14 in 19). Vsakega od dobljenih transformantov se kultivira v Luria okolju, ki vsebuje ampicilin z izvajanjem indukcije, kakor to zahteva željeno izražanje (Primeri 15 in 20) .

(7) Ločevanje in prečiščevanje G-CSF poiipeptida iz E. coli in analiza njegovih amino kislin

Raztopina kulture transformantov se centrifugira, tako da se dobi tableta celic. Zbrane celice se tretirajo s pomočjo lizocima in zatem s pomočjo cikličnega zamrzovanja in topljenja nakar se loči supernatant.

Supernatant se nato tretira z gel filtracijo na Ultrogel ACA54, kloni (LKB) in aktivne frakcije pa se koncentrirajo z ultrafiltracij sko napravo.

Nato smo vodno raztopina trifluoroMLEČNE kisline, ki vsebuje npropanoi dodali koncentratu, in ga nato postavili v led. Zmes se nato centrifugira in adsorbira na reverzno faznem C18 stolpcu. Po eluiranju se preuči aktivnost frakcij. Aktivne frakcije se zberejo in podvržejo istemu postopku prečiščevanja,

-2121 ki je opisan v nadaljnem tekstu. Prečiščene frakcije nato na suho zamrznemo, prah pa se raztopi in podvrže HP natančni kromatografiji, ki je zasnovana na velikosti molekul. Dobljeni poiipeptidi se nato podvržejo elektroforezi na SDS poliakrilamid gelu s čimer se najdejo posebni trakovi za željeni G-CSF polipeptid (Primeri 16 in 20). Tako dobljeni poiipeptidi kažejo humano G-CSF aktivnost (Primeri 17 in 20). G-CSF poiipeptid se analizira s postopkom za analizo amino kislin s Hittachi 835 Automatic Amine Acid Analyzer-jem (Hittachi, Ltd.). Za analize N-terminalov amino kislin se uporabljajo plinsko-fazni analizerji nizov (za Edmanovo razpadanje), napravo za natančno kromografijo pri visokih pritiskih ter Ultrasferni-ODS stolpec (Primeri 18 in 21).

(8) Grajenje rekontoinantnih vektorjev za animalne celice

Rekombinantni vektorji (izvedeni iz BPV) za uporabo z C127 in NiH3T3 celicami gostiteljev so izdelani za vsako izmed +VSE in -VSE linij cDNA in kromosomski gen. Rekombinantni vektorji (z dhfr) za uporabo z CHO celicami se prav tako izdelajo za vsako +VSE in -VSE linijo cDNA ter za kromosomski gen. Rekombinantni vektorji za uporabo s COS celicami se prav tako izdelajo. Nižje so podrobno opisani reprezentativni primeri z naznako delavnih primerov.

(A) Grajenje rekombinantnih vektorjev +VSE in -VSE linij cDNA fragment dobljen v (3) se namesti v vektor pdKCR, tako da se gradi plazmid pHGA 410 (Primer 22 in slika 14), ki je delno razgrajen z EcoRI in nato tretiran s polimerazo I (Kienow fragment), tako da se gradijo odprti konci. Vezivo Hindlll je vezano na DNA, ki se nato tretira z Hindlll in T4DNA ligazo. Tretirana DNA se uporabi za transformacijo E.coli vrste DH1 v postopku, ki uporablja rubidijev klorid (Glej Molecular

-2222

Cloning, isto). Dobljeni plazmid se imenuje pHGA410(H) (slika 15) .

pHGA410(H) se tretira s Šali nakar se naredijo odprti konci, nato pa se ga dodatno tretira s Hindlll s čimer ločimo HindllŠali fragment. Plazmid pdBPV-1, ki vsebuje transformiran fragment papiloma virusa goveda se tretira z Hindlll in PvuII s čimer ločimo velike DNA fragmente in jih pripnemo na posebej pripravljen Hindlll-Sall fragment. Pripenjanje fragmenta se pripravi zaradi transformiranja E.coli vrste DHl, tako da se dobi plazmid pTN-G4, ki ima pHGA410 izvedeno CSF-cDNA (slika 15 in primer 23).

Plazmid pHGA410(H) se tretira s Šali, s čimer tvorimo odprte konce, nato pa se taistega še enkrat tretira z Hindlll s čimer ločimo Hindlll-Sall fragment. Plazmid pdBPV-1, ki ima transformiran fragment papiloma virusa goveda se tretira s Hindlll in PvuII, s čimer se veliki DNA fragment razdvojijo in ločeno pripnejo s posebej pripravljenim Hindlll-Sall fragmentu. Pripenjanje fragmenta se opravi zaradi transformiranja E.coli vrste DHl, tako da se dobi plazmid pTn-G4, ki ima pHGA410i2vedeno CSF-cDNA (slika 15 in primer 23).

Plazmid pHGA410 ali pHGA410(H) se v kombinaciji s plazmidom pAdD26SVpA uporabi tako, da se nadgradi pHGG4-dhfr, ki je bil rekombinantni vektor (+VSE) za uporabo s CHO celicami (slike 16a in b ter primer 25).

2-kb DNA fragment, ki vsebuje dhfr gen se izloči iz pAdD26SVpA z tretiranjem z EcoRI in BamHI, dobljeni fragment se namesti v v pHGA410(H) na Hindlll mestu, tako da se gradi pG4DRI in pGDR2 (slika 16c in primer 25).

(B) Grajenje -VSE linije rekombinantnih vektorjev

-2323 cDNA (-VSE) linija fragment pridobljen v (3) se namesti v vektor pdKCR tako, da se gradi plazmid pHGV2 (primer 28), ki je delno razgrajen z EcoRI in nato tretiran s DNA polimerazo 1 (Klenow fragment), tako da se gradijo odprti konci. Vezivo Hindlll je pripojeno na DNA, ki se zatem tretira s Hindlll in T4DNA ligazo. Tretirana DNA se uporablja za transformiranje E.coli vrste DH1 v postopku, ki vključuje rubidijev klorid (glej Molecular Cloning, isto). Pridobljeni plazmid se imenuje pHGV2(H) (slika 18).

pHGV2(H) se tretira s Šali, za čimer se gradijo odprti konci, s ponovnim tretiranjem s Hindlll pa se loči Hindlll-Sall fragment. Plazmid pdBPV-1, ki ima transformiran fragment papiloma virusa goveda se tretira s Hindlll in PvuII, loči pa se velik fragment DNA, ki se pripne na posebej pripravljen Hind-III-Sall fragment. Pripravljeni fragment se uporabi za transformiranje E.coli vrste DH1, tako da se dobi plazmid, pTNV2, ki ima pHGV2-izvedeno CSF-cDNA (slika 18 in primer 29).

S podobnimi postopki se pHGV2 ali p HGV2(H) v kombinaciji s pla2midom pAdD26SVpA uporabi za grajenje pHGV2-dhfr, ki je bil rekombinantni vektor (-VSE) za uporabo s CHO celicami (slike 19a in b ter primer 31).

DNA fragment dolg okoli 2kb, ki vsebuje dhfr gen se loči iz pAdD26SCpA z uporabo EcoRI in BamHI, dobljeni fragment pa se namesti v pHGV2(H) na Hindlll mestu tako, da se gradi pV2DRl in pV2DR2 (slika 19c in primer 31).

(C) Grajenje rekombinantnih vektorjev, ki vsebujejo kromosomski gen

Plazmid pBRCE3, ki je bil pridobljen v (4) in ki vsebuje kromosomski gen prikazan na sliki 5 se tretira s EcoRI.

-2424 pSVH⁺K⁺ plazmid, ki ga je opisal Banerji et al., Celi, 27, 299 (1981) se tretira s KpnI, tako da se odstrani globin gen. Plazmid se nadalje delno razgradi s Hindlll, tako da se odstrani del zaostalega gena SV40. Fragmente nato ponovno spojimo, tako da se izgradi pML-E⁺ vektor izražanja.

Ta vektor tretiramo z restrikcijskim encimom EcoRI in defosforiliziramo z alkalno fosfatazo (Takara Shuzo Co., Ltd.) tako, da dobimo vektor DNA, ki je vezan z zgoraj omenjenim kromosomskim DNA fragmentom s pomočjo T4DNA ligaze (Takara Shuzo Co., Ltd.) tako, da se dobi pMLCE3, ki je bil rekombinantni vektor za COS celice (Primer 34). Kakor je prikazano na sliki 20, vsebuje ta plazmid ojačevalec SV40 gena, replikator začetka SV40, replikator začetka pBR322 in pBR322izveden X-laktimaza gen (Amp^r) in ima humani G-CSF kromosomski gen pripojen nižje od ojačevalca SV40 gena.

Vektor izražanja za C127 celice je izdelan po naslednjem postopku. DNA fragment, ki vsebuje kromosomski CSF gen je izvlečen ven z ustreznim encimom iz pMLCE3a, ki ima vektor izražanja za COS celice. Ta fragment je pripojen s T4DNa ligazo na DNA fragment, ki vsebuje promotor za SV40. Dobljeni pTNCE3a je bil vektor izražanja, ki ima kromosomski CSF gen vezan pod SV40 promotorjem, ki vsebuje 65% dela BPV-a.

Vektor izražanja CHO celic ima dva DNA fragmenta povezana skupaj s T4DNA ligazo; en fragment vsebuje kromosomski CSF gen in zgodnjej ši promotor SV40 v primeru zs ekspresij ski vektor za C177 celice ter drugi fragment, ki vsebuje pAdD26SVpA-izveden dhfr gen. Dobljeni pD26SVCE3a je bil ekspresijski vektor, ki ima kromosomski CSF gen pod SV40 promotorjem, dhfr gen pod zadnjim promotorjem adenovirusa.

-2525 (9) Izražanje v anlmalnih celicah

Dva reprezentativna primera sta prikazana nižje, za nadaljne deatlje pa poglejte ustrezne delovne primere.

(A) Izražanje v celicah CL27 miši

Plazmid pTN-G4 ali pTN-V2 je tretiran s BamHI. Tretirani palazmid se uporabi za transformacijo C127 celic (predhodno vzgojenih s kultivacijo) s postopkom, ki vklučuje kalcijev fosfat. Transformirane celice se kultivirajo, izberejo pa se kloni z visoko hitrostjo produkcije CSF-jev. Glikoproteini, ki vsebujejo izražen G-CSF se iz raztopine kulture transformiranih celic ločijo in prečistijo. Pri takih je bilo najdeno, da posedujejo humano G-CSF aktivnost. Prisotnost šeljenega glikoproteina se potrdi tudi z analizo amino kislin in sladkorja v vzorcu.

Za analizo vsebine sladkorja, se vzorec CSF,ki je bil uporabljan za analizo amino kislin podvrže odrejevanju aminokislin s pomočjo Elson-Marganove metode, odrejevanju nevtralnih sladkorjev s pomočjo orcinol sulfatnega postopka ali pa odrejevanju sialinske kisline s pomočjo tiobarbituaratskega postopka. Vsi postopki odrejanja so prikazani v Tohshitsu no Kagu ”Chemistry of Saccharides (Del 2 drugega dela), Chapter 13, vol.4 of a Course in Biochemical Experiments, ki je bila objavljena v Tokyo Kagaku Dojin. Prevajanje izmerjenih vrednosti v masne procente je pokazalo, da je dobljena vsebina sladkorja v obsegu 1-20%, odvisno od tipa celic gostitelja, vektorja izražanja in pogojev kultivacije.

(B) Izražanje v COS celicah

-2626

COS celice, ki so izvedene iz CV-L celic opic in ki se transformirajo z SV40-začetkom deficientnega mutanta, tako da izratijo veliki T antigen SV40-a /glej Glutzman et al., Celi, 32, v (5) (C) in ki vsebuje humani kromosomski G-CSF gen.

Supernatant kulture COS celice kaže humano G-CSF aktivnost (primer 35).

Nekatere COS celice so bile izločene in podvržene mRNA analizi, ki je pokazala prisotnost dveh mRNA, kar odgovarja aminokislinskim nizom prikazanim v slikah 3(A) in 4(A).

Primeri

Ta izum bo nadalje podrobno opisan z obzirom na delovne primere, kjer je dan naslednji vzorčni primer za ilustracijo postopka raziskovanja CSF aktivnosti.

Vzorčni primer: Raziskovanje CSF aktivnosti

Naslednje metode se uporabljajo za ugotavljanje CSF aktivnosti (spodaj obeležene kakor CSA) v tem izumu.

CSA raziskovanje (a) S humanimim celicami kostnega mozga

Za kultivacijo se uporablja enojni sloj mehkega agarja v skladu z metodo Bradley,T.R. in Metcalf, D.Aust.J.Exp. Biol.Med. Sci., 44, 287-300,1966). Natančneje opisano, se v stekleničko za kultivacijo (premer 55 mm) vlije 0.2 ml seruma embrija goveda, 0.1 ml vzorca, 0.1 ml suspenzije humanih ceiic kostnega mozga (1-2 10⁵ nukieusov celic) ter 0.2 ml modificirane MsCoy-eve 5A raztopine kulture, ki vsebuje 0.75% agarja. Raztopino koaguliramo in kultiviramo na 37°C v 5% CO² /95% zraku ter 100% vlažnosti. Deset dni pozneje, se ugotovi število oblikovanih

-2727 kolonij (ena kolonija se sestoji iz vsaj 50 celic), CSA pa se ugotovi tako, da je ena enota aktivnosti potrebna za grajenje ene kolonije.

(b) s celicami kostnega mozga miši

Zmeša se serum konja (0.4 ml), 0.1 ml vzorca suspenzije celic C3H/He kostnega mozga mišje samice (0.5-1 10⁵ nukleusov celic in 0.4 ml modificiranega McCoy-eve 5A raztopine kulture, ki vsebuje 0.75% agarja. Zmes se nato vlije na plastično posodico za kulturo tkiva (polmera 35 mm), koagulira in 5 dni kultivira vna 37°C v 5% CO₂/95% zraku pri 100% vlažnosti. Nato se določi število nadgrajenih kolonij (ena kolonija vsebuje vsaj 50 celic), CSA pa se ugotovi tako, da enota aktivnosti ustreza grajenju ene kolonije.

Raztopina modificirane McCoy-eve 5A kulture, ki je bila uporabljena v obeh primerih (a) in (b), ter suspenzija humanih celic kostnega mozga uporabljena v (a) se dobijo z naslednjimi postopki.

Raztopina modificirane McC0y-eve 5A kulture (dvojno koncentrirane) gramov raztopine McCoy-eve kulture (Gibco), 2, 55g MEM amino kislinskega vitaminskega okolja (Nissui Seiyaku Co., Ltd.),

2.18 g Natrijevega bikarbonata ter 50.000 enot kalijevega penicilina G se raztopi dvakrat v 500 ml destilirane vode, raztopina pa se nato aseptično filtrira prek Millipore filtrov (0.22pm).

Suspenzija humanih celic kostnega mozga

Tekočina kostnega mozga pridobljena iz zdravega osebka s sterilno punkturo se razredči 5 krat s pomočjo RPMI 1640 raztopine kulture in se postavi nad raztopino Fikol-okužbe

-2828 (Pharmacia Fine Chemicals) ter nato centrifugira na 400 g 30 minut pri 25°C. Izloči se sloj interfacialnih celic gostote manjše od 1.077. Celice se sperejo, koncentracija pa se poviša do 5 10⁶ celic/ml z RPMI 1640raztopino kulture, ki vsebuje 20% seruma embrija goveda, nasute v 25 cm³ veliko plastično stekleničko za kulturo tkiva, nakar se jih inkubira 30 minut v C0₂ inkubatorju. Nezlepljene celice se izločijo v supernatantu ter nato prenesejo v plastično stekleničko veliko 25 cm³, kjer se inkubirajo 2.5 ur. Te celice v supernatantu se zberejo in uporabijo v preiskovanju.

Primer 1: Snovanje CHU-2

Tumor pacienta z rakom v ustni votlini, kjer je naglašena rast, ki se opazi po številu nevtrofilcev se transplantira v nu/nu miši. Po 12 dneh po transplantaciji se tumor aseptično ekstrahira, nareže na kocke 1-2 mm³ ter kultivira na naslednji način. 10 do 15 kockic tumorja postavimo v plastično centrifugalno epruveto veličine 50 ml. Po dodajanju 5 ml raztopine tripsina (ki vsebuje 0.25% tripsina in 0.02% EDTA) epruveto stresamo 10 minut v topli kopeli na 37°C nakar se supernatant odvrže. Nato dodamo drugih 5 ml iste raztopine tripsina, razgradnja s tripsinom pa se vrši ob 15 minutnem mešanju na 37°C. Izločimo suspenzijo celic supernatanta in jo pustimo v ledu za tem, ko se tripsin deaktivira s pomočjo 1 ml seruma embrija goveda. Po ponovnem ponavljanju tega postopka se izloči suspenzija celic, ki se nato kombinira s predhodno dobljeno suspenzijo celic in se centrifugira na 15000 obr/min 10 minut tako, da se dobi tableta celic. Tableto se dvakrat izpere z F-10, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda, nakar jo prestavimo v 25 cm³ plastično stekleničko, tako da je koncentracija celic enaka 5xl0⁶ celic/steklenička. Po celonočni inkubaciji v CO² inkubatorju (5% CO² pri 100% vlažnosti) s F-10

-2929 raztopino kulture, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda, se supernatant odstrani skupaj s celicami, s celicami, ki se ne zlepijo, kultivacija pa se nadaljuje s sveže dodano raztopino kulture. 6 dni po začetku kultiviranja se steklenička napolni s celicami, raztopina kulture pa se nadomesti s svežo.

Naslednjega dne se raztopina kulture odvrže, steklenička pa se napolni s 2 ml antitelima eritrocitov anti-miši (Cappel), ki je 5 krat razredčen z RPMI 1640 ter 2 ml komplementa gvinejska prašiča (Kyokuto Seiyaku Co., Ltd.), ki je razredčen z 2,5 RPMI 1640. Po inkubaciji trajajoči 20 minut na 37°C, se kultura dvakrat izpere s F-10 raztopino, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda ter nu/nu miši, s čimer se izvedeni fibroblasti odstranijo. Nato se doda F-10 raztopina kulture, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda, kultiviranje pa se nadaljuje še dva dni. Za tem se izločijo iste celice, ki se nato podvržejo kloniranju s pomočjo metode mejnega razredčevanja.

Dobljenih 11 klonov je bilo pregledanih za CSF aktivnostjo in eden klon (CHU-2) je kazal aktivnost, ki je bila okoli 10 krat večja od tistih v drugih klonih*

Primer 2: Izolacija CSF

Celice osnovane v primeru 1 so zrastle v zelo gosti populaciji v dveh stekleničkah za kultiviranje (150 cm³) . Celice so bile izločene, suspenzirane v 500 ml F-10 raztopine kulture, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda, prenesene v stekleno rotirajočo stekleničko veličine 1580 cm² (Belco; Bi. znamka;

Op. prev.), ter z rotiranjen kultivirane na 0.5 obr/min. Ko je bilo odkrito, da so celice izrastle v zelo gosti populaciji na notranji steni rotirajoče stekleničke, je bila raztopina kulture zamenjana z RPMI 1640, ki ne vsebuje seruma. Po 4 dneh kultivacije, je bil supernatant kulture izločen, kultiviranje pa se je nadaljevalo s F-10, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda, ki je bil dodan. Po 3 dneh kultiviranja, je bila

-3030 raztopina kulture ponovno zamenjana z RPMI 1640, ki ne vsebuje seruma. Supernatant kulture je bil po 4 dneh odstranjen. S ponavljanjem tega postopka smo dobili po 500 ml supernatanta brez seruma vsak teden. Nadalje omogoča ta postopek ločevanje supernatanta kulture, s celicami, ki se vzdržujejo nad znatno podaljšanim obdobjem.

Serija, ki vsebuje 5.000 ml supernatanta kulture in je bila dobljena z mešanjem z 0.01% Tween 20 in koncentrirana okoli 1000 krat z ultrafiltracijo s Hollow Fiber DC-4 ter Amicon PM10 (Amicon). Koncentrat je bil prečiščen v sledečih stopnjah.

(i) Del (5 ml) koncentriranega supernatanta je bil podvržen gel filtraciji na Ultrogel AcA54 stolpcu (polmera 4.6 cm in dolžine 90 cm; LKB) pri pretoku veličine 50 ml/h z 0.01M Tris-HCl pufrom(pH 7.4), ki vsebuje 0.15M NaCI ter 0.01% Tween 20 (Nakai kagaku Co., Ltd.). Stolpec je bil kalibriran z albuminskim serumom goveda (M; 67000), ovalbuminom (M 45000} ter citokromom C (M 12400). Po kočani filtraciji smo 0.1 ml vsake frakcije razredčeno 10 krat, nakar smo testirali aktivnost po zgoraj navedenih metodah preiskovanja CSA (b). V frakcijah 400-700 ml je bilo najdeno, da kažejo makrofagno-dominantno CSA, medtem, ko so frakcije 800-1200 ml kazale granulocitno-dominantno CSA. Zaradi tega so bile slednje frakcije zbrane, ter koncentrirane na ultrafiltracijski napravi PM-10 (Amico) na volumen 5 ml.

(ii) V koncentrirane frakcije smo dodali vodno raztopino 0.1% trifluoro ocetne kisline, ki vsebuje 30% n-propanola (za določanje amino kislinskega niza; dobljene od Tokyo Kasei K.K.). Zmes smo nato pustili stati v ledu približno 15 minut, obloge smo odstranili s centrifugiranjem med 10 minutami na 15000 obr/min. Supernatant je bil nato adsorbiran na u-Bondpak C18 stolpcu (8 mm x 30 cm za polpreparatno uporabo; Waters) ter

-3131 uravnotežen z vodno raztopino, ki vsebuje n-propanoi ter trifluoroocetno kislino; stolpec je bil neprestano eluoran z vodno raztopino 0.1% trifluoroocetne kisline, ki vsebuje npropanol, ki ima linearni koncentracijski gradient velik 3060%. Naprava za tekočinsko kromatografijo na visokem pritisku, Hitachi model 685-50 (Hitachi, Ltd.) ter detektor, Hitachi model 638-41 (Hitachi, Ltd.) so bili uporabljani za absorbcije na 220 nm ter 280 nm istočasno. Po eluiranju, je bilo 10 μΐ vsake frakcije razredčeno 100 krat, ki so bile nato testirane na aktivne frakcije z zgoraj navedenimi postopki za raziskovanje CSA (b). Najdeno je bilo, da imajo VRHOVI, eluirani s 40% n-propanolom, OSA aktivnost, 2aradi česar so bili ti zbrani ter ponovno podvrženi krtomatografiji pod istimi pogoji ter preiskani na CSA z istimi metodami. CSA aktivnost je bila ponovno opažena z vrhi na 40% n-propanola. Zaradi tega smo te vrhe zbrali (4 frakcije = 4 ml) in jih suho zamrznili.

(iii) Suho zmrznjen prah smo raztopili v 200 μΐ vodni raztopini 0.1% trifluoroocetne kisline, ki vsebuje 40% n-propanola. Raztopina se podvrže tekoči kromatografiji pod visokim pritiskom na TSK-G 3000SW stolpcu (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.; 7.5mm x 60 cm). Eluiranje se vrši z isto vodno raztopino pri pretoku 0.4 ml/min, frakcije pa se s pomočjo zbiralca frakcij FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemicals) odvzemajo v porcijah po 0.4 ml. Vsaka frakcija se razišče na CSA z istimi metodami kakršne so opisane v nadaljnjem tekstu, aktivnost pa je bila opažena v frakcijah z retenzijskim časom od 37-38 minut (ki odgovarja molekulski masi 2 10⁴) . Aktivne frakcije se izločijo in prečistijo na analitičnem u-Bondpak C18 stolpcu (4.6 mm x 30 cm). Glavne vrhove smo ločili ter suho zamrznili. Dobljen vzorec se preišče z metodo CSA preiskovanja (a); za tega je bilo najdeno, da ima humano G-CSF aktivnost.

-3232

Primer 3: Določanje amino kislinskega niza (I) Določanje N-terminala amino kislinskega niza

V2orec se podvrže Edmanovemu razgrajevanju s plinsko-faznim sekvencerjem (Primernjen Biosiostemi), dobljena PTH amino ksilina pa se analizira z rutinskim postopkom z aparaturo za tekočinsko kromatografijo ob visokem pritisku (Beckman Instruments). Stolpec (5 pm; 4.6 mm x 250 mm) se uravnoteži z začetnim pufrom (vodna raztopina, ki vsebuje 15mM natrijevega acetatnega pufra fpH 4.5 ter 40% acetonitrila) in vnesenim vzorcem (raztoplenim v 20 pl začetnega pufra). Ločevanje se izvrši s pomočjo enojnega eluiranja z začetnim pufrom. Pretok je bil 1,4 mi/min, stolpec pa je bil segret na temperaturo 40°C. Detekcija PTH amino kisline je bila izvršena z uporabo adsorbcije UV svetlobe v območju 269 nm in 320 nm. Standardni vzorci PTH amino kisline (Sigma) v 2-nmol porcijah se ločijo na isti črti zaradi urejanja njenega retencijskega časa, ki se primerja s tistim za preiskovani vzorec. Ugotovili smo, da ima vzorec naslednji amino kislinsko zaporedje sestavljeno iz 40 ostankov iz N-konca:

H₂N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser(10)

Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys” (20)

Leu-Glu-Gln-Val-Arg-Lys-Ile-Gln-Gly(30)

Asp-Gly-Ala-Ala-Leu-Gln-Glu-Lys-Leu(40)

Cys-Ala-Thr-Tyr-Lys(ii) Razgrajevanje z uprabo bromciana

-3333

Vzorec se raztopi v 70% mravljični kislini. Raztopini se doda 200 ekvivalentnih količin bromciana, ki je bil očiščen s sublimacijo. Zmes se preko noči pusti stati na temperaturi 37°C zaradi reagianja. Produkt reakcije se na suho zamrzne in frakcionira s pomočjo HPLC (visoko tlačna tekočinska kromatografija; Op. prev) na TSK G3000SW stolpcu (Znamka; Op. prev.- Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), tako da smo dobili 4 vrhe. Vrhovi so bili poimenovani CN-1, CN-2, CN-3, CN-4, glede na padajoče molekulske mase. Prva dva vrha (CN-1 in CN-2) imata boljše prinose, njihovi amino kislinski nizi pa so bili analizirani z avtomatskim plinsko-faznim zaporednikom (Uporabljeni Biosistemi) pod istimi pogoji kakor tudi v (I).

Ugotovljeno je bilo, da je CN-1 peptid iz N-terminala G-CSF proteina, CN-2 pa je naslednji amino kislinski niz:

Pro-Ala-Phe-Ala-Ser-Ala-PheGln-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-ValLeu-Val-Ala-Ser-His-Leu-Gln(iii) Razgradnja s tripsinom

Vzorec je bil raztopljen v 0.1 M tris-HCl pufru (pH 7.4), ki vsebuje 8 M uree. Raztopino smo zmešali z 0.1 M Tris-HCl pufrom (pH 7.4), ki vsebuje 0.1% 2-merkaptoetanola, tako da omogoča končno koncentracijo uree na 2M. TPCK-tretiran tripsin (Sigma) se doda tako, da je razmerje ed vzorcem in encimom bute 50:1. Zmes se pusti 4 ure na 25°C. Po dodatku iste količine TPCKtretiranega tripsina se 2mes dodatno pusti na isti temperaturi v času 16 ur. Ta tem se produkt reakcije podvrže reverzno-fazni hitri kromatografiji na stolpcu C (Yamamura Kagaku K.K.), z eluiranjem izvedenim z 0.1% TFA, ki vsebuje n-propanol, ki ima linearni gradient gostote s 5 do 60%. Čeprav se z merjenjem

-3434 adsorbcije pri 280 nm dobi več vrhov, se glavni vrh analizira na svoj amino kislinski niz z uporabo avtomatskega plinskega faznega sekvencerja (Primenjeni Biosistemi) pod enakimi pogoji kakor v (I). Ugotovljeno je bilo, da.je glavni vrh peptid, ki vsebuje naslednji niz, ki vsebuje del CN-2 fragmenta prikazanega v (ii):

Gln-Leu-Asp-Val-Ala-Asp-Phe-Ala-ThrThr-Ile-Trp-Gln-Gln-Met-Glu-Glu-LeuGly-Met-Ala-Pro-Ala-Leu-Gln-Pro-ThrGln-Gly-Ala-Met-Pro-Ala-Phe-Ala-SerPrimer 4: Pripravljanje DNA sonde:

(I) Sinteza sonde (IWQ) sukcesivnih nukleotidov (glej sliko 1), se dobi na osnovi 10 amino kislin (Ile“Trp“Gln-Met-Glu-Glu-LeU”Gly-Met) vključenih v amino ksilinski niz pridobljen v primeru 3(iii). Potrebno bo dati komentar o označevanju nukleotidov prikazanih na sliki 1; na primer, nukleotid na 9-položaju s 5'-terminala je ekvimolarna zmes dA n dG. Začetni nukleotidi so največkrat dimeri, a se prav tako uporabljajo tudi monomeri, če je tako zahtevano. Zavarovani stekleni fiitrirni stolpec se napolni z 20 ng začetne nukleotidne smole, Ap-d(G) (Yamas Shoyu Co,, Ltd.). Po ponovnem izpiranju s metilen kloridom se 4,4'dimetiioksitritilna skupina z metiliranjem eliminira z raztopino metilen klorida, ki vsebuje 3% trikloroocetno kislino. Za tem se stolpec večkrat izpere z lml metilen klorida. Stolpec se nato spere z anhidriranim piridinom zaradi iztiskanja topila, 10 mg nukleotidnega dimera (DMTr) ApTp (NHR₃), (Nippon Zeon; NHR3-trietilamonij; DMTr=dimetoksitritil) nakar se doda 0.2 ml piridina, notranjost stolpca pa se vakumsko osuši z uporabo vakumske črpalke). Za tem se doda 20 mg 2,4,6-3535 trimetilbenzosulfonil-3-nitrotriazolida (MSNT Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 0.2 ml anhidriranega piridina, notranjost stolpca pa se iztisne s plinastim dušikom. Nukleotidna smola se kondenzira z dimerno reakcijo v toku 45 minut na sobni temperaturi z občasnim mešanjem. Po končani reakciji se stolpec izpere s piridinom, nezreagirane OH skupine pa se acetilirajo z raztopino piridina, ki vsebuje višek acetanhidrida ter 4-dimetilamino piridina. Po izpiranju stolpca s piridinom se kondenzirajo naslednji dimeri ali monomeri po zapisanem zaporedju. To se opravi s ponavljanjem zgoraj navedenih postopkov; (DMTr)Ip(NHR₃), (DMTr)GpGp(NHR₃), (DMTr) Ip (NHR₃) , ekvimolarna zmes (DMTr)CpTp(NHR₃) in (DMTr) TpTp (NHR₃), ekvimolarna zmes (DMTr) ApAp (NHR₃), (DMTr) ApGp (NHR₃) , {DMTr) GpAp (NHR₃) , (DMTr) TpGp (NHR₃) , ekvimolarna zmes (DMTr) ApAp (NHR₃) ter (DMTr) GpAp (NHR₃), (DMTr)CpAp(NHR₃), ekvimolarna zmes (DMTr) ApAP (NHR₃) in (DMTr) ApGp (NHR₃) , (DMTr) GpCp (NHR₃) , (DMTr) TpGp (NHR₃), (DMTr) Ip (NHR₃) in (DMTr) ApTp (NHR₃) , s tem, da so vsi izmes naštetih nukleotidov razpoložljivi pri Nippon Zeon, razen za (DMTr) Ip (NHR₃), ki je na razpolago pri Yamasa Shoyu Co., Ltd.

Po koncu reakcije v zadnj i stopnji se smola i zpere s pomočj o piridina, nato z metilen kloridom in končno z etrom brez acetiliranja. Temu sledi postopek sušenja. Posušena smola se suspendira v 1.7 ml zmesi piridina (0.5 ml) vode (0.2 ml) in dioksana (1 ml), ki vsebuje IM tetrametilgvanidina in IM vrholinaldoksima. Suspenzija se pusti stati preko noči na sobni temperaturi, nato pa se koncentrira na 100-200 μΐ pod vakuumom. Koncentrat se zmeša z majhno količino (2-3 kapljice) piridina in s 2-3 ml koncentriranega vodnega amoniaka. Ta zmes se greje na 55°C 6 ur. S uporabo ekstrakcije z etil acetatom, se vodni sloj loči in koncentrira v vakuumu. Koncentrat se raztopi v raztopini 50 mM trietil amonijevega acetata (pH 7), raztopina pa se nato podvrže kromatografiji na stolpcu C-18 (1.0 x 15 cm;

-3636

Waters), z eluiranjem, ki se vrši z acetonitrilom (linearni gradient gostote od 10-30%} v raztopini 50mM trietil amonijevega acetata (pH 7). Eluirana VRH frakcija pri koncentraciji acetonitrila pri približno 25% se koncentrira pod vakumom.

Koncentratu se doda 80% ocetna kislina, nakar se zmes pusti stati 30 minut na sobni temperaturi. Z uporabo ekstrakcije z etilnim acetatom se loči vodni sloj, ki se koncentrira pod vakumom. Dobljeni koncentrat se nadalje prečisti z HPLC na stolpcu C-18 (od Senshu Kagaku K.K.; SSC-ODS-272; 6 mm x 200 mm). Eluiranje se vrši z acetonitrilom (10.20% linearni gradient jitrosti) v raztopini 50mM trietil amonijevega acetata (pH 7). Sintetična DNA se pridobi v prinosu, ki ni manjši od 1OA₂6o enot.

Analiza z Maxim-Gilbertovo sekvenčno metodo/Meth. Enzym,, 65, 499 (1980)/ kaže, da ima dobljeni oligonukleotid nukleotidni niz prikazan na sliki 1.

(ii) Sinteza sonde (A) sukcesivnih nukleotidov (glej sliko 1) se dobi na osnovi niza 5 amino kislin (Met-Pro-Ala-Phe-Ala) vključenih v amino kisiionski niz dobljen v primeru 3(iii).

Sinteza je podobna tisti uporabljeni za pripravo sonde {IWQ). Sledeči nukleotidi se kondenzirajo na nukleotidni smoli,

Ap-d(T) (Yamasa Shoyu Co.,Ltd.) v naslednjem zaporedju:

(DMTr) CpAp (NHR₃) , (DMTr) GpGp (NHR₃) , ekvimolarna zmes, (DMTr) CpAp (NHR₃) , (DMTr) CpTp (NHR₃) , (DMTr) CpGp (NHR₃) in (DMTr)CpCp(NHR₃) , ekvimolarna zmes, (DMTr)ApGp(NHR₃) , (DMTr)CpGp(NHR₃) , (DMTr) GpGp (NHR₃) in (DMTr) CpGp (NHR₃) ,

-3737 (DMTr) ApAp (NHR₃), ekvimolarna zmes, (DMT-r) CpAp (NHR₃) in (DMTr)CpGp(NHR₃) in (DMTr)Gp(NHR₃) z vsemi nukleotidi dobljenimi pri Nippon Zeon (trgovec-proizvajalec). Sintetična DNA je tako pridobljena v donosu okoli IOA260 enot. Analiza s pomočjo Maxim-Gilbert sekvenčne metode kaze, da ima dobljeni oligonukleotid nukleotidni niz prikazan na sliki 1.

(iii) Sinteza sonde (LC)

Izvrši se avtomatska DNA sinteza z DNA sintetizerjem, Model 380A Applied Biosystems. Ta tehnika je osnovana na principih, ki so jih postavili Caratherus et al.,/J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)/. Na splošno se ta tehnika označuje kakor fosfornoamidni postopek.

Fosforamidit iz (DMTr)-dT, predhodno aktiviran s tetrazolom, se kondenzira v dG-S (S: nosilec), kjer se 5'-dimetoksinitrilna skupina (DMTr) deblokira. Za tem se nezreagirane hidroksilne skupine acilirajo in oksidirajo z jodom v prisotnosti vode, tako da se gradi fosforilna skupina. Po deblokiranju DMTr skupine, se kondenzzacija izvede na enak način ni sintetiziranih 24 nukleotidov, ki imajo svoje zaporedje prikazano na sliki 1. Ti nukleotidi so od svojega nosilca ločeni, deblokirani in prečiščeni z reverzno faznim HPLC na stolpcu C-18 (Shenshu Kagaku Co., Ltd.; SSC-ODS-272).

Primer 5: Kultiviranje in ločevanje CHU-2 celic

Zasnovane CHU-2 celice so izrastle v popolnoma gosti populaciji v dveh stekleničkah za kultiviranje (150 cm²), nakar sos bile izločene in susendirane v 500 ml RPMI 1640 raztopine kulture, I vsebuje 10% seruma embrija goveda. Nato so bile premeščene v stekleno rotiajočo se steklenico veliko 1580 cm² (Belco) in kultivirane ob mešanju dolgem 4 dni pri 0.5 obr/min. Ko je bilo ugotovljeno, da imajo izrastle celice na notranji steni steklenice popolnoma gosto populacijo, je bila raztopina

-3838 kulture iz steklenice odstranjena, v steklenico pa smo dolili 100 ml fiziološke slane raztopine, segrete na 37°C, ki vsebuje 0.02% EDTA. Po gretju v trajanju 2 minut na 37°C, se celice ločijo od notranje stene steklenice s pipetiranjem. Dobljena suspenzija celic se centrifugira na 1500 obr/min 10 minut tako, da se dobi tableta celic. Celice se nato ponovno suspendirajo v 5 ml fiziološke slane raztopine, ki ne vsebuje EDTA. Suspenzija se centrifugira na 1500 obr/min 10 minut, tako da se dobi tableta celic (mase okoli 0.8 g). Tako dobljene celice se pustijo zamrznjene na -80°C, dokler se jih ne podvrže postopku ekstrakcije RNA.

2) Prečiščevanje mRNA

Izolirana mRNA iz CHU-2 celic dobljenih v 1) so bile zasnovane s postopki, ki so bili v bistvu enaki tistim opisanim v knjigi Molecular Cloning” Maniatis et al., Cold Spring Harbor, str. 196, 1982. Zamrznjene CHU-2 celice (vlažne mase 3,8 g) se suspendirajo v 20 ml raztopine 6M gvanidina / (M guanidinium izotiociananta, 5mM natrijevega citrata (pH 7), 0.1M βmerkaptoetanola in 0.5% natrijev sarkozil sulfata/ suspenzija se dobro meša 2-3 minute. Zmes se podvrže 10 kratnemu izvlečevanju in nameščanju z injekcijo (kapaciteta 20 ml), ki ima iglo 18G. Okoli 6 ml viskozne gvanidiniumske raztopine, ki vsebuje raztopljene celice se razširi na 6 ml blazinici 5,7M CsCl v 0.1M EDTA (pH 7.5) v Beckman CW40 Ti polialloomer epruveti za centrifugiranje, tako da se epruveta povsem napolni. S postopki, ki bodo opisani nadalje se pripravijo 4 epruvete, ki se centrifugirajo na 30000 obr/min 15 ur na 20°C. Dobljene tablete se trikrat izperejo v vvodi z majhno količino 70% etanola.

Tablete dobljene iz posebnih epruvet se kombinirajo, raztopijo v 550 μΐ vode in obdelajo tako, da se omogoči 0.2M koncentracija NaCl. Po tretiranju z 1:1 zmesjo fenola in

-3939 kloroforma in s samim kloroformom, se doda 2,5 volumna etanola, tako da se STAL0ŽI celotna RNA (okoli 10,1 mg skupne RNA se dobi iz 3,8 g vlažnih celic).

Poli (A⁺)RNA se prečisti iz skupne RNA s pomočjo naslednjih postopkov afinativne kromatografije, ki izrablja prednost vezanja poli(A) verige na 3' terminalu mRNA. Adsorbcija na oligo(dT)-celulozi (Tip 7 P-L Biokemikalija) se doseže s prepuščanjem skupne RNA v nosilnem pufru (ki vsebuje lOmM TrisHCl (pH 7.5), 0.5M NaCl, lmM EDTA ter 0.1% SDS raztopine) skozi oligo(dT)-celulozni stolpec po tem, ko se raztopina segreva 5 minut na 65°C. Kolona se uravnoteži z istim nosilnim pufrom. Eiuiranje poli (A⁺) RNA se vrši z TE raztopino (ki vsebuje lOmM Tris-HCl (pH 7.5) in lmM EDTA). Neadsorbirani efluent se ponovno spusti skozi stolpec in eluat, ki se dobi s ponavljanjem istih postopkov se izmeša z eluatom dobljenim v prvem eluiranju. Na ta način je bilo dobljenih 400μς poli (A⁺) RNA. Tako dobljena mRNA se frakcionira po velikosti delcev s pomočjo centrifugacijskega gradienta saharoze v skladu s postopki, ki so bili opisani v laboratorijskem priročniku (Practical Methods in Molecular Biology, Springer-Veriag, New York, heidelberg, Berlin (1981).

Natančneje, se gradient gostote 5-25% saharoze tvori v Beckman SW40 Ti centrifugalni cevi. Izdelani sta bili dve raztopini saharoze z raztapljanjem 5% in 25% raztopine saharoze, ki ne vsebujejo RNaze (Schwarz/Mann) v raztopino, ki vsebuje 0.1M NaCl, lOmM Tris-HCl (pH 7.5), lmM EDTA in 0.5% SDS.

800 pg mRNA /poli (A⁺)-RNA/ dobljene glede na metodo že opisano, se raztopi v 200-500 ml Ul TE raztopine. Raztopina se segreva 5 minut na 65°C, nakar se na hitro ohladi in postavi v gradient gostotne raztopine saharoze, ki so bili centrifugirani na 30000

-4040 obr/min 20 ur. 0.5 ml frakcije zberemo in izmerimo adsorbcijo pri 260 nm. Velikosti frakcionirane RNA se ugotovijo na osnovi položajev standardov RNA (ribosa RNAs 28S, 18S in 5S).

Istočasno se G-CSF aktivnost vsake frakcije preišče z oociti Xenophus laevis-a z naslednjimi postopki. Najprej, se RNA vsake frakcije prevede v vodno raztopino, ki ima koncentracijo 1μς/μ1; Oociti se vzamejo Wenophusu (staremu približno 1 leto), mRNA raztopina pa se namesti na tak način, da se 50 ng mRNA namesti v en oocit; deset takih oocitov se vstavi v vsako od 96 odprtin mikrotiter pladnja; oociti se kultivirajo 48 ur na sobni temperaturi v 100μ1 Barth medija (88 ml NaCI, 1 mM Kcl,

2.4 mM NaHCOa, 0.82 mM MgSO₄, 0.33 mM Ca(NO₃)₂, 0.41 mM CaCl₂,

7.5 mM Tris Hcl (pH 7.6), 10 mg/1 penicilina in 10 mg/1 streptimicin sulfata); loči se supernatant kulture, ki se koncentrira in prečisti do ustrezne stopnje za peučevanje stopnje G-CSF aktivnosti.

G-CSF aktivnost je bila prisotna v 17S frakcijah.

Primer 6: Sinteza cDNA (Grajenje pBR-linije cDNA knjižnice)

Od poli(A⁺) RNA dobljene v primeru 6 se sintetizira cDNA s postopkom Land-a et al. /Nucleic Acids res., 9, 2551 (1981)/, ki sta ga modificirala Gubler in Hoffman (Gene, 25, 263 (1983)/.

(1) Sinteza enojne cDNA

Eppendorfov-ova cev (kapaciteta 1.5 ml) se napolni z reagenti po naslednjem zaporedju: 80 μΐ frakcijskega pufra (500 mM Kcl, 50 mM MgCl₂, 250 mM Tris-HCl s pH=8.3(; 20μ1 200 mM ditiotrietioia, 32μ1 12.5 mM dNPT (ki vsebuje po 12.5 mM od dATP, dGTP, dCTP in dTTP), 10μ1 a-³²P-dCTP (PB 10205 Amerscha) μΐ oligo (dT) 12*18 (od P-L Biokemikalija; 500 pg/ml) , 20 μς poli (A⁺) RNA (2.1 μς/μΐ) ter 206 μΐ destilirane vode. Vsega

-4141 skupaj 400 μΐ reakcijske raztopine grejemo 5 minut na 65°C, ter nato 5 minut na 42°C. Topli raztopini se doda 120 enote reverzne transkriptaze (Takara Shuzo Co., Ltd). S Spremljanjem reakcije še 2 uri na 42°C, se doda tudi 2μ1 TE raztopine, Ϊ6 μΐ lOOmM natrijevega pirofosfata in 48 enot (4 μΐ) reverzne transkriptaze, nakar se reakcija vrši dalje še dve uri na 46°C. reakcija se naglo zaustavi z dodajanjem 0.5M EDTA (8μ1) in 10% SDS (8μ1). Nato se s tretiranjem z enol/kloroformom in TALOŽENJEM z etanolom (dvakrat) dobi enojna veriga cDNA.

(2) Spajanje dC-verige na enojno cDNA

Enojna cDNA dobljena v (1) se raztopi v destilirani vodi. Raztopini se doda 60 μΐ dC-verige z dodajanjem pufra /400 mM kalijevega lakodilata, 50mM Tris-HCl (pH 6.9), 4mM ditiotrietola, lmM CoCl₂ in lmM dCTP/ in zmes se 5 minut greje na 37°C. Reakcijski zmesi se doda še 3μ1 terminalne transferaze (27 enot/μΙ; P-l .Biokemikalije) nato pa se zmes 2.5 minut greje na 37°C. Z nadaljnjim tretiranjem s fenol/kloroformom (enkrat) in s TALOŽENJEM z etanolom (dvakrat), se dC-končni del cDNA raztopi v 40 μΐ TE raztopine, ki vsebuje 100 mM NaCI.

3)Sinteza dvojne cDNA

V 40 μΐ raztopine dobljene v 2), dodamo 4 μΐ oligo (dG) ₁₂-i₈ (200 pg/ml; P-L Biokemikalije), nakar zmes najprej 5 minut segrevamo na 65°C nato pa še 30 minut na 42°C. Med tem, ko se reakcijska raztopina obdržuje na 0°C, se mu doda 80 μΐ pufra (100 mM TrisHCl (pH 7.5), 20 mM MgCl₂, 50 mM (NH₄)₂SO₄ in 500 mM Kcl/, 4 μΐ 4mM dNTP (ki vsebuje po 4 mM dATP, dCTP, dGTP in dTTP), 60 μΐ lmM β-NAD, 210 μΐ destilirane vode, 20 μΐ E.coli Dna polimeraze I (Takara Shuzo Co.,Ltd.), 15μ1 E.coli DNA ligaze (Takara Shuzo

-4242

Co., Ltd.). Zmes nato podvržemo reakciji na 1°C v trajanju 1 ure. Po dodatku 4 mM dNTP (4 gl) se reakcija pusti vršiti še 1 uro na 25°C. Nadalje z tretiranjem s fenoi/kloroformom in TALOŽENJEM z etanolom (enkrat) dobimo okoli 8gg dvojne cDNA. To dvojno cDNA nato raztopimo v TE raztopini in jo nato podvržemo 1.2% agarozni gel elektroforezi. Fragmenti, ki odgovarjajo velikosti približno 569 bp do 2 kbp, se adsorbirajo na Whatman DE81, odkoder z eluiranjem dobimo približno 0.2 gg dvojne cDNA.

4) Pričvrščevanje dC-verige in dvojne cDNA

Dvojna cDNA dobljena v 3) se raztopi v 40 gl TE raztopine.

Nato ji dodamo 8 μΐ dC-končnega pufra tipa navedenega v 2) ter zmes segrevamo 3 minute na 37°C. Po tem se reakcijska zmes takoj ohladi na 0°C, reakcija pa se zaustavi z dodajanjem 1 μΐ 0.5 M EDTA. Po tretiranju s fenolo/kloroformom in TALOŽENJEM z etanolom, se dobljeni TALOG suspendira v 10 μΐ TE raztopine.

5) Grajenje pBR-linije cDNA knjižnice mikrolitre komercialnega oligo(dG)-končnega pBR322 vektorja (Bethesda Research Laboratories; 10 ng/μΙ) in 2 μΐ dC-končne dvojne cDNA dobljene v 4) se kali v TE raztopini, ki vsebuje 75 gg 0.1 M NaCI. Kaljenje obsega tri stopnje: segrevanje na 65°C tokom 5 minut; nato segrevanje na 40°C tokom 2 ur in hlajenje na sobno temperaturo.

Po metodi opisani v laboratorijskem priročniku Manitatis-a et al·./ Molecular Clonigng Cold Spring Harbor, str. 249 ff.

(1982)/(uporabijajo se lahko tudi druge rutinske tehnike), se odgovarjajoče celice pridobijo iz E.coli vrste Χ1776. Te so transferirane s kaljenim plazmidom tako, da se dobijo transformanti.

-4343

Primer 7: Sinteza cDNA (grajenje knjižnice X£age)

1) Sinteza enojne cDNA

Glede na postopke opisane v primeru 5, smo predelali 3.8 g zamrznjenih CHU-2 celic prečiščenih dvakrat na oligo (dT)celuloznem stolpcu tako, da se dobi 400 pg poli (A⁺) RNA.

TE raztopina {10 pl) , ki ima v sebi raztopljene 12 pg poli(A⁺) RNA, se postavi v reakcijsko epruveto, ki vsebuje 10 pg aktinomicina D (Sigma). Za tem epruveto dopolnimo z reagenti po sledečem zaporedju: 20 pl pufra reverzne transkriptaze /250 mM Tris-HCl (pH 8.3); 40 mM MgCl₂; 250 mM Kcl/; 20 pl 5 mM dNTP (ki vsebuje po 5 mM dATP, dGTP, dCTP in dTTP); 20 pl oligo (dT) 12-ie (0.2 pg/ml; P-L Biokemikalije) ; 1 pl IM ditiotrietiola; 2 pl RNasin-a (30 enot/pl; Promega Biotech); 10 pl reverzne transkriptaze (10 enot/pl; Seikagaku Kogyo Co.,Ltd.): 1 pl a-³²P-ATP (10 pCi; Amerscham); in 16 pl vode. Skupni volumen reakcijske zmesi je bil 100 pl. Zmes se je 2 uri grela na 42°C, nato pa se je reakcija zaustavila z dodajanjem 0.5 M EDTA (5 pl) in 20% SDS (lpi). Z tretiranjem s fenol/klorom (100 pl) in obarjanjem z etanolom (dvakrat), smo dobili okoli 4 pg enojne cDNA.

2) Sinteza dvojne cDNA cDNA dobljeno v 1) smo raztopili v 29 pl TE raztopine in reakcijsko raztopino dobili z dodajanjem naslednjih reagentov po naslednjem vrstnem redu: 25 pl pufra polimeraze 1 400 mM Hepes (pH 7,6); 16 mM MgCl₂ , 63 mM 5-merkaptoetanola in 270 mM Kcl; 10 μΐ 5mM dNTP; 1,0 μΐ 15 mM β-NAD; 1,0 μΐ alfa³² P-dATP (10 pCi v 0,2 pl E.coli DNA polimeraze I )New England Biolabs;

-4444 enot/ μΐ); 0,1 μΐ Rnase Η (60 enot/μΙ; Takara Shuzo Co., Ltd.,); in 28,7 μΐ destilirane vode.

Reakcijsko mešanico smo inkubirali 1 uro pri 14°C in jo nato pustili pri sobni temperaturi še eno uro, nakar smo reakcijo zaustavili z dodajanjem 0,5 M EDTA (5μ1) in 20% SDS (Ιμΐ) in jo nato obdelali s fenol/kloroform, usedanje pa smo izvedli z etanolom. Dobljena DNA je raztopljena v 20 μΐ 0,5 M EDTA, z dodajanjem 3 μΐ Klenow pufer / 500 mM Trias-HCl (pH 8,0) in 50 mM Μ9θ1₂/3μ1 5mM dNTP in 4 μΐ vode, pa je pripravljena reakcijska reztopina. Nato smo dodali še 1 μΐ DNA polimeraze (Klenow fragmente Takar Suhozo Co., Ltd) in reakcijsko raztopino 15 minut inkubirali pri 30°C.

Inkubirano reakcijsko raztopino smo razredčili s 70 μΐ TE raztopine in reakcijo ustavili z dodajanjem 0,5 M EDTA (5 μΐ) in 20% SDS (1 μΐ). Po obdelavi s fenol kloroformom in usedanjem s etanolom smo dobili okoli 8 μς dvojne cDNA.

3) Metilacija dvojne cDNA

Vodeno raztopino (30 μΐ) dvojne cDNA sintetizirane v 2) smo zmešali s 40 μΐ metilacijskega pufra/500 mM Tris-HCl (pH 8,0); 50 mM EDTA/, 20 μΐ raztopine S-adenozil-L~metilmetionina (v nadaljnjem besedilu SAM raztopina)/ 800 μΜ raztopine SAM; 50 mM β-merkaptoetola in 100 μΐ vode. Mešanici smo dodali 15 μΐ EcoRI metilaze (proizvajalca New England Biolabs; 20 enot/μΙ) , da smo dobili reakcijsko raztopino skupne prostornine 200 μΐ. Po dve urni inkubaciji pri 37°C, obdelavi s fenolom in etrom in usedanjem z etanolom smo izločili DNA.

4) Dodatek EcoRI veziva

V okoli 1.2 μ9 metilirane dvojne cDNA, se 1.5 μΐ pufra ligaze/ 250 mM Tris-HCl (pH 7.5) in 100 mM MgCl₂/, 0.5 μΐ

-4545 predhodno fosforiziranega EcoRI veziva (10 mer; takara Shuzo Co., Ltd.), 1.5 pl 10 mM ATP, 1.5 μΐ 100 mM ditiotrietiola in 2 pl vode doda tako, da znaša skupne volumen raztopine 15 pl. Po dodatku 0.7 pl T₄DNA ligaze (3.4 enote/ μΐ; Takara Shuzo Co., Ltd.) se reakcijo pusti teči preko noči pri 4°C. Za tem se ligaza deaktivira s segrevanjem na 65°C tekom 10 minut. Reakcijska raztopina se privede na skupni volumen 50 μΐ z dodajanjem 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 50 mM NaCI in 100 μg/ml želatine. Po dodajanju EcoRI (3.5 pl; 10 enot/ μΐ) , se reakcija vrši 2 uri na 37°C. Za tem se doda 2.5 μΐ 0.5 M EDTA in 0.5 μΐ 20% SDS, nakar se raztopina tretira s fenol/kloroformom in obarja z etanolom, tako da se izloči DNA. Za tem, se nereagirani EcoRI odstrani s filtriranjem gela na ULTRAGEL AcA34 (LKB) ali z agaroza-gelno elektroforezo, tako da se Izloči okoli 0.5-0.7 pg dvojne cDNA kateri je bilo dodano veživo.

5) Pripajanje dvojne cDNA na Xgtl0 vektor

Dvojna cDNA, kateri je bilo dodano vezivo se zmeša z 2.4 pg predhodno z EcoRI tretiranem vektorjem XgtlO vektorjem (Vektor Cioning System), 1.4 pg pufra ligaze (250 mM Tris-HCl in 100 mM MgCl₂) in 6.5 pl destilirane vode, nakar se 15 minut greje na 42°C. nato dodamo Ιμΐ mM ATP, 1 μΐ 0.1 M ditiotrietiola in 0.5 μΐ T₄DNA ligaze, tako da se izgradi 15 pl skupnega volumna reakcijske zmesi, ki je bila prek noči puščena na 12°C.

6) Pakiranje in vitro

Okoli 30 rekombinantnih DNA dobljenih v 5), se pakira in vitro s pakirnim priborom (proizvajalca Promega Biotech), tako da se dobi fag okužba.

-4646

Primer 8: Testiranje knjižnice pBR-linije s sondo (IWQ)

Whatman 541 papir smo postavili na agarsko podlogo za rast kolonije, kjer je bil puščen 2 uri na 37°C. Za tem smo filtrirni papir tretirali na naslednji način, Taub in Thomson/ Anal. Biochem., 126, 222 (1982)/.

Kolonije prenesene na 541 papir so nadalje rastle na agarni podlagi, ki vsebuje kloramfenicil (250 μς/1 μΐ) prek noči na 37°C.

Papir 541 smo vzeli ven in ga pustili na sobni temperaturi 3 minute na drugem listu filtrirnega papirja, ki je bil impregniran s 0.5 N NaOH raztopine. Ta postopek je bil ponovljen dvakrat. Podoben postopek je bil izveden dakrat po 3 minute z uporabam 0.5 M Tris.HCI (pH 8) v toku 3 minut, z 1.5 mg/ml raztopino lizocima, ki vsebuje 0.05 M Tris-HCl (pH 8) in 25% saharoze, v toku 10 minut; nato smo papir pri 37°C tretirali z raztopino 1 x SSCD (0.15 M NaCI in 0.015 M natrijevega citrata) v toku 2 minut in s 1 x SSC raztopino, ki vsebuje 200 pg/ml proteinaze K tokom 30 minut; končno so se tretiranja vršila na sobni temperaturi z uporabo 1 x SSC raztopine v toku 2 minut in s 95% raztopino etanola v trajanju 2 minut. Zadnja stopnja je bila ponovljena dvakrat. Za tem smo papir 541 osušili. Osušeni papir 541 smo potopili v 25:24:1 zmes fenola/kloroforma/izoamilalkohola uravnoteženega s 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM NaCI in 10 mM EDTA/ tokom 30 minut na sobni temperaturi. Nato so bili podobni postopki ponovljeni trikrat s 5 x SSC raztopino v toku 3 minut in dvakrat s 95% raztopino etanola v trajanju 3 minut. Za tem je bil filtrirni papir osušen.

Sonda (IWQ) je bila obeležena s ³²P po rutinskem postopku (glej Molecular Cloning), hibridizacija kolonije pa je bila izvedena po metodi Wallace-a et al. /Nucleic Acid Res., 9, 879 (1981)/.

-4747

Prehibridizacija se je vršila 4 ure na 65°C v hibridizacijskem pufru, ki vsebuje 6 χ NET /0.9 M NaCl; 0.09 M Tris-HCl (pH 7.5); in 6 mM EDTA/, 5 x Denhardt-ova raztopina, 0.1% SDS in 0.1 mg/ml denaturirane DNA (timus teleta), nato se je hibridizacija vršila preko niči na 56°C v hibridizacijskem pufru (pripravljanje tega je opisano naprej), ki vsebuje 1 x 10⁶ cpm/ml radioobeležene sonde (IWQ). Po okončani reakciji, je bil papir 541 izpran dvakrat z 6 x SSC raztopino, (ki vsebuje 0.1% SDS) tokom 30 minut na sobni temperaturi ter tokom 1.5 minute na temperaturi 56°C. Tako izpran papir je bil nato autoradiografiran.

Plazmid je bil ločen od klonov in podvržen Southern vpijanju s sondo (IWQ). Hibridizacija in autoradiografija sta bili izvseni pod istimi pogoji kakor je opisano nadalje.

Podobno, je bilo Southern vpijanje izvršeno tudi s sondo (A). Z uporabo hibridizacijskega pufra, ki je bil izdelan tako, kakor bo opisano nadalje, se je hibridizacija izvajala najprej na 49°C tokom 1 ure. Po stanju na 39°C, se je hibridizacija nadaljevala na tej temperaturi še 1 uro. Po končani reakciji, je bil nitrocelulozni papir dvakrat izpran z 0.1% SDS, ki vsebuje 6 x SSC tokom 30 minut na sobni temperaturi, nato pa je bil 3 minute izpiran pri 39°C. Izpran papir je bil poslan na autoradiografijo.

Najden je bil en pozitiven klon. Preiskovanje nukleotidnega niza z dideoksi metodo kaže, da je imel ta klon DNA sestavljeno iz 308 baznih parov, ki obsegajo dele sond (IWQ) in (A). pBR322 izveden plazmid, ki ta del vsebuje je bil imenovan pHCS-1.

Primer 9: Testiranje knjižnice Kfagov linije z pHCS-1 izvedeno DNA sondo

Hibridizacija okužbe se je izvrševala po metodi Bentona in Davisa/ Science, 196, 180 (1977)/. pHCS-1 dobljen v primeru 8

-4848 je bil tretiran s Sau3A in EcoRI, tako da je bil dobljen fragment DNA dolg približno 600 bp. Ta DNA fragment je bil radijsko obeležen s translacijskim zarezovanjem glede na rutinske metode. Nitrocelulozni filter (S & S) je bil postavljen na fagno agarno podlogo za vzgoj okužbe zaradi prenašanja faga na filter. Po denaturaciji faga s 0.5 M NaOH, je bil filtrirni papir tretiran na naslednji način: tretiranje s 0.5 M NaOH in 1.5 M NaCI tokom 20 sekund; dvakratno tretiranje z 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) in 1.5 M NaCI v trajanju 20 sekund; končno tretiranje s 120 mM NaCI, 15 mM natrijevega citrata, 13 mM KH₂PO₄ in 1 mM EDTA (pH 7.2) v trajanju 20 sekund. Filter se nato posuši in 2 uri greje na 80°C zaradi imobilizacije DNA. Prehibridizacija se je vršila preko noči na 42°C v prehibridizacijskem pufru, ki vsebuje 5 x SSC, 5 x Denhardt-ovo raztopino, 50 mM fosfatnega pufra, 50% formamida, 0.35 mg/ml denaturirane DNA (DNA sperme lososa) in 0.1% SDS. Nato se je hibridizacija vršila na 42°C v času 20 ur v hibridizacijskem pufru, ki vsebuje 4 x 10^s cpm/ml pHCS-1 sonde, ki je bila radioaktivno obeležena s pomočjo translacijskega zarezovanja. Ta hibridizacijski pufer je bil zmes 5 x Dehnhardt-ove raztopine, 20 mM fosfatnega pufra (pH 6), 50% formamida, 0.1% SDS, 10% dekstranovega sulfata in 0.1 mg/ml denaturirane DNA (DNA sperme lososa).

Hibridiziran nitrocelulozni filter je bil Izpiran z 2 x SSC, ki vsebuje 0.1% SDS na sobni temperaturi 20 minut, nato pa 30 minut z 0.1 x SSC, ki je vsebobval 0.1% SDS na 44°C ter končno 10 minut z 0.1 x SSC na sobni temperaturi. Nato smo izvršili autografsko detekcijo. Dobljeno je bilo 5 pozitivnih klonov (G1-G5). Klon, ki je vseboval celo dolžino niza cDNA je bil preiskovan zaradi ugotavljanja DNA nukieotidnega niza z dideoksi metodo. Identificiran je bil nukleotidni niz prikazan na sliki 3(A). Ta cDNA je bila po izrezovanju Xgtl0 vektorja pripeta na pBR327 /Sorberon et al., Gene, 9, 287 (1980)/ na

-4949

EcoRI mesto, tako da se je gradil plazmid, ki se lahko dobi v večjih količinah. Ta plazmid je bil imenovan pBRG4.

Primer 10: Testiranje knjižnice Ifaga linije z pBRG4-izvedeno sondo in (LC) sondo

Hibridizacija okužbe je bila izvedena po postopku Benton in Davis (glej Science, isto) uporabljeni v primeru 9. Nitrocelulozni filter (S & S) je bil postavljen v fagno agarsko okolje za vzgajanje okužbe zaradi prenašanja faga na filter.

Po denaturaciji fagne DNA z 0.5 M NaOH, je bil filter tretiran z naslednjimi postopki: tretiranje s 0.1 M NaOH in 1.5 NaCI v trajanju 20 sekund; nato dvakratno tretiranje s 0.5 M Trsi-HCl (pH 7.5) in 1.5 M NaCI v trajanju 20 sekund; ter nazadnje tretiranje s 120 mM NaCI, 15 mM natrijevega citrata, 13 mM KH₂PO₄ in 1 mM EDTA (pH 7.2) v trajanju 20 sekund. Filter smo nato posušili in ogrevali 2 uri na 80°C zaradi imobilizacije DNA. Dva lista istega filtrirnega papirja sta bila pripravljena na način, ki bo opisan nadalje, nakar sta bila podvržena obravnavi z pBRG4-izvedeni DNA sondi in sondi (LC).

Testiranje s pBRG4-izvedeno sondo je bilo izvršeno na naslednji način. pBRG44 je bil tretiran z EcoRI tako, da je bila dobljen DNA fragmedt dolg okoli 1500 bp. Ta fragment je bil radioaktivno obeležen s translacijskim zarezovanjem glede na rutinske postopke. Eden od dveh nitroceluloznih filtrov je bil podvržen prehibridizaciji v prehibridizacijskem pufru, I vsebuje 5 x SSC, 5 x Denhardt-ovo raztopino, 50 mM fosfatnega pufra, 50% formaldehida, 0.25 mg/ml denaturirane DNA (DNA sperme lososa) in 0.1% SDS. Prehibridizacij a se je vršila prek noči na 42°C. Nato je bil filter podvržen hibridizaciji na 42°C v trajanju 20 ur v hibridizacijskem pufru, ki je vseboval radioaktivno obeleženo DNA sondo (okoli 1 10⁶ cpm/ml) dolžine okoli 1500 bp. Hibridizacijski pufer je mešanica 5 x SSC, 5 x Dehnhardt-ove raztopine, 20 mM fosfatnega pufra fpH 6), 50%

-5050 formamida, 0.1% SDS, 10% dekstranovega sulfata in 0.1 mg/ml denaturirane DNA (DNA sperme lososa). Hibridiziran nitrocelulozni filter se 20 minut izpira z 2 x SSC, ki vsebuje 0.1% SDS na sobni temperaturi, nato 30 minut z 0.1 x SSC, ki vsebuje 0.1% SDS na 44°C nato pa 10 minut z 0.1% SSC na sobni temperaturi. Izvrši se detekcija s pomočjo avtoradiografije. Testiranje s sondo (LC) se izvrši s pomočjo naslednjih postopkov. Drugi filter smo predhodno obdelali z x SSC, ki vsebuje 0.1% SDS 2 uri na 65°C. Nato se je vršila prehibridizacija 2 uri na 65°C v raztopini, ki vsebuje 6 χ NET, 1 x Dehnhardt-ovo raztopino in 100 gg denaturirane DNA (DNA sperme lososa). Hibridizacija se je nato vršila prek noči na 63°C v hibridizacijskem pufru, ki je vsebovbal radioaktivno obeleženo sondo (LC) (2 χ 10⁶ cpm/ml) . Ta hibridizacij ski pufer je prav tako zmes 6 x NET, 1 x Dehnhardtove raztopine in 100 gg/ml denaturirane DNA (DNA sperme lososa). Hibridiziran nitrocelulozni filter je bil tirkrat spran (vsakič po 20 minut) s 3 x SSC, ki vsebuje 0.1% SDS na sobni temperaturi, nato pa spran 2 minuti na 63°C z 6 x SSC, ki vsebuje 0.1% SDS.

Filter je bil nato osušen in detektiran avtoradiografsko.

V testiranju opisanem naprej, so bili kloni, ki so bili pozitivni v obeh sondah ločeni in klon, ki je imel celotno dolžino verige cDNA je bil preiskan z dideoksi metodo zaradi določanja nukleotidnega niza. najdeno je bilo, da ima nukleotidni niz prikazan na sliki 4(A). Ta DNA je bila odsekana od KgtlO vektorja in pridružena pBR327 na EcoRI mestu tako, da gradi plazmid pBRV2.

Primer 11: Testiranje knjižnice humanega kromosomskega gena

1) Grajenje knjižnice humanega kromosomskega gena

Knjižnica humanega kromosomskega gena dobljena zahvaljujoč se Dr. Manitastis-u iz Harvard University je bila pripravljena z naslednjimi postopki: celotna DNA kromosoma je bila

-5151 ekstrahirana iz jeter humanega embrija s fenolom ali drugimi ustrezajočimi kemikalijami in je bila delno razgrajena z restrikcijskimi encimi Haelll in Alul; dobljeni DNA fragmenti so bili tretirani s pomočjo centrifugalnega gradienta gostote saharoze, tako da je bil koncentrat fragmenta, ki ima verige dolg okoli 18-25 kb; koncentrirani fragmenti so bili pričvrščeni na arm DNA E.coli faga λ Charon 4A s sintetičnimi nukleotidi kratkih verig, ki so bili nameščeni na z restrikcijskim encimom EcoRI pretrgana mesta, tako da so se gradili infektirani fak DNA rekombinanti; da bi zmanjšali infektivnost, so se s pakiranjem dobili delci čistejšega λ faga. Tako dobljena knjižnica humanega gena se teoretično tretira kakor set rekombinantov, ki vsebujejo humane DNA z verigami dolžine od 18-25 kb, ki jih vsebujejo praktično vsi humani geni.

2) Testiranje knjižnice humanega kromosomskega gena s pHCS-1 izvedeno DNA sondo

Hibridizacija okužbe je bila izvedena z uporabo Benton-Daviseve metode /Science, 196, 180 (1977)/. pHCS-1 dobljen v primeru 8 je bil tretiran s Sau3A in EcoRI tako, da je bil dobljen fragment dolg okoli 800 bp. Ta DNA fragment je bil radioaktivno obeležen s pomočjo translacijske zareze glede na rutinske postopke. Nitrocelulozni filter (S & S) je bil postavljen v fagno agarno okolje za vzgojo okužbe zaradi prenašanja faga na filter. Po denaturaciji faga DNA z 0.5 M NaOH, smo filtrirni papir tretirali po naslednjih postopkih: tretiranje z 1.5 M NaCl 20 sekund, dvakratno tretiranje z 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) in 1.5 M NaCl tokom 20 sekund; končno, tretiranje z 120 mM NaCl, 15 mM natrijevega citrata, 13 mM KH₂PO₄ ter nazadnje z 1 mM EDTA (pH 7.2) v trajanju 20 sekund.

Filter je bil nato posušen in ogrevan na 80°C v trajanju 2 ur zaradi imobilizacije DNA. Prehibridizacija se je vršila preko

-5252 noči na 42°C v prehibridizacijskem pufru, ki vsebuje 5 x SSC, 5 x Dhnhardt-ovo raztopino, 50 mM fosfatnega pufra, 50% formamida, 0.25 mg/ml denaturirane DNA {DNA sperme lososa) in 0.1% SDS. Nato je bila vržena 20 urna hibridizacija na 42°C v hibridizacijskem pufru, ki vsebuje 4 χ 10⁵ cpm/ml pHCS-1 sonde, ki je bila radioaktivno obeležena s translacijskim zarezovanjem. Ta hibridizacijski pufer je bil zmes 5 x SSC, 5 x Dehnhardtove raztopine, 20 mM fosfatnega pufra (pH 6), 50% formamida, 0.1% SDS, 10% dekstranovega sulfata in 0.1 mg/ml denaturirane DNA (DNA sperme lososa).

Hibridiziran nitrocelulozni filter je bil izpiran 20 minut z 2 x SSC, ki je vsebovala 0.1% SDS, na sobni temperaturi nato pa 30 minut z 0.1 x SSC, ki vsebuje 0.1% SDS na 44°C in končno 10 minut z 0.1 x SSC na sobni temperaturi. Detekcija je bila nato vršena z avtoradiografijo.

Dobljeno je bilo 10 razparjenih pozitivnih klonov. Rekombinanti DNA do bili dobljeni iz teh klonov z Manitatisovo metodo /Celi, 15, 687 (1987)/. Dobljene DNA so bile tretirane z restrikcijskimi encimi kakršni so EcoRI, BemHI in Bglll, analizirane z agarozno gel elektroforezo, mapa njihovega restrikcijskega encima pa je bila dobljena po metodi Fritsch et al. (glej Celi, isto).

Southern hibridizacija je bila izvajana s sondo, ki je bila radioaktivno obeležena s pHCS-1 izvedenim DNA fragmentom, ki je isti kakor tisti uporabljen v zgoraj preiskanem testiranju. DNA fragment dolžine približno 8 kbp, ki je bil razsekan z EcoRI je bil izbran iz klonov, ki so bili hibridizirani s sondo.

Fragment, ki je bil podkloniran v EcoRI na mestu pBR327. podklonirana DNA je bila podvržena drugemu tretiranju z restrikcijskimi encimi, Southern hibridizacija pa je bila izvršena večkrat. Za DNA fragment dolžine 4 kbp, ki je bil razsekan z EcoRI in Xhol je bilo odkrito, da vsebuje gen, ki kodira humani G-CSF polipeptid. Ta DNA fragment je bil preiskan

-5353 zaradi ugotavljanja niza njegovega 3-kbp z dideoksi metodo, identificiran pa je bil niz prikazan na sliki 5. Ta fragment ima mesto prekinjanja restrikcijskega encima prikazano na sliki

7.

Testiranje humanih kromosomskih genov je bilo izvajano tui z uporabo pBRG4-izvedene DNA in pBRV2-izvedene DNA kakopr sonda.

V obeh primerih je bil DNA fragment dolžine 1500 bp, ki je bil tretiran s EcoRI je bil neposredno radioaktivno obeležen s transkacijskim zarezovanjem na zgoraj opisani način ali pa, alternativno, DNA fragment dolžine 700 bp, ki je bil dobljen z izmeničimi tretiranji z EcoRI in Dral in je bil radioobeležen s translacijskim zarezovanjem. Tako dobljena sonda se uporablja pri hibridizaciji okužbe, ki je bila izvršena pod enakimi pogoji, kakršni so opisani nadalje. Izbrani kloni so bili analizirani s Southern hibridizacijo, tako da je bil dobljen DNA fragment, ki ima nukleotidni niz prikazan na sliki 5. Tako dobljen plazmid je bil imenovan pBRCE3.

Primer 12: Grajenje E.coli rekombinantnega vektorja (+VSE) In transformacija (z uporabo tac promotor ja, ki vsebuje vektor)

l)Grajenje rekombinantnega vektorja (i) Pripravljanje vektorja mikrogramov tac promotorja, ki vsebuje vektor pKK223-3 (pharmacia) je bilo tretiranega z 8 enotami EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) v trajanju 2 ur na 37°C v 30 μΐ reakcijske raztopine (40 mM Tris-HCl, 7 mM MgCl₂, 100 mM NaCl in 7 mM 2merkaptoetanola).

Ta tem smo dodali 3 μΐ alkalne fosfataze (Takara Shuzo Co., Ltd.), tretiranje pa se je vršilo na 60°C v trajanju 30 minut. DNA fragment je bil izločen s trojnim tretiranjem s fenolom in enoj nim tretiranjem z etrom in obarjanjem z etanolom. Vse se je vršilo glede na rutinske postopke.

-5454

Izločeni fragment DNA je bil raztopljen v 50 mikrolitrih zmesi, ki je bila sestavljena iz 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 10 mM DTT in po 1 mM dATP, dCTP, dGTP in dTTP. Po dodajanju 3 μΐ E.coli DNA polimeraze I- Klenow fragment (Takara Shuzo Co., Ltd.), je bila reakcija izvajana na 14°C v trajanju 2 ur, tako da se se gradili odprti konci.

(ii) Pridobivanje sintetičnega veziva

Tri mikrograme oiigonukleotidov, ki ima nize sintetičnih veziv CGAATGACCCCCCTGGGCC in CAGGGGGGTCATTGG, je bila fosforizirana z izvajanjem reakcije v 40 μΐ reakcijske raztopine (sestavljenega iz 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM 2-merkaptoetanola in 1 mM ATP) na 37°C v trajanju 60 minut v prisotnosti 4 enot T₄ polinukleotidne kinaze.

Vsak izmed fosforiziranih oligonukleotidiv (0.2 pg) je bil raztopljen v 20 μ! 100 mM NaCl-ki vsebuje TE raztopino/ 10 mM Tris-HCl (pH 8) in 1 mM EDTA/. Po tretiranju na 65°C v trajanju 10 minut, so bili oligonukleotidi KALJENI s počasnim hlajenjem na sobno temperaturo.

(iii) Pridobivanje G-CSE' cDNA fragmenta mikrogramov pBRG4 dobljenega v primeru 9, ki vsebuje cDNA prikazan na sliki 3(A) je bilo tretiranega s 100 enotami restrikcijskega encima Apal (New England Biolabs) in 50 enotami Dral (Takara Shuzo Co., Ltd.) na 37°C v trajanju 3 ur v 200 μΐ reakcijske zmesi sestavljene iz 6 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl₂ in 6 mM 2-merkaptoetanola. Okoli 2 μg Apal-Dral fragmenta (okoli 590 bp) je bilo ločenega s pomočjo 1.2% agarozne gel elektroforeze.

-5555 (iv) Vezanje fragmenta

Po okoli 0.1 mikrograma vsakega izmed fragmentov dobljenih v (i) do (iii) je bilo raztopljenih v 20 μΐ raztopine za vezanje (66 mM Tris-HCl, 6.6 mM MgCl₂, 10 mM DTT in 1 mM ATP). Po dodatku 175 enot T₄ ligaze je bila raztopina preko noči puščena na 4°C, tako da je bil dobljen rekombinantni vektor.

2)Transformiranje

Z uporabo 20 pl reakcijske zmesi, ki vebuje rekombinantni vektor dobljen v (iv), je bila E.coli vrste OM105 transformirana v postopku z rubidijevim kloridom (glej T. Manitatis et al., Molecular Cloning, str. 252 (1982)/. Plazmid je bil ločen od amplicilin-rezistentne kolonije kulture transformanta in je bil tretiran z restrikcijskimi encimi BamHI, AccII in Apal zaradi potrjevanja, da transformanti so tisti, ki smo j ih želeli.

Primer 13: Grajenje E.Coli rekombinantnega vektorja (+VSE) in transformacija (z uporabo PL promotorja, ki vsebuje vektor)

1)Grajenje rekombinantnega vektorja (i) Pridobivanje vektorja

100 mikrogramov PL promotorja, ki vsebuje vektor pPL-lambda (Pharmacia) se prek noči tretira s 50 enotami restrikcijskega encima BamH v 100 pl reakcijske zmesi /10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 7 mM MgCl_2/ 100 mM NaCl in 10 mM DTT/ na temperaturi 37°C.

Z uvajanjem reakcijske raztopine v 1% agarozno gel elektroforezo, se izloči okoli 49 pg približno 4 kbp fragmenta in okoli 11 pg približno 1.2 kbp fragmenta.

4-kbp fragment se raztopi v 100 pl TE pufra (njegova sestava je opisana naprej) in nato defosforilizira v reakciji z alkalno fosfatazo (Takara Shuzo Co., Ltd.) na 60°C v trajanju 60 minut.

-5656

Drugi fragment dolg okoli 1.2 kb je bil raztopljen v 20 μΐ pufra (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ in 1 mM DTT) in tretiran z 20 enotami restrikcijskega encima MboII prek noči na 37°C (New England Biolabs).

S 4% poliakrilamidno gel elektroforezo smo izločili okoli 0.9 gg BamHI-MboII fragmentov (okoli 200 bp) ter okoli 1.9 gg MboII-BamHI fragmentov.

(ii) Pridobivanje sintetičnega veziva

Oligonukleotidi, ki imajo nize sintetičnih veziv

TAAGGAGAATTCATCGAT in TCGATGAATTCTCCTTAG so bili fosforilizirani in kaljeni kakor v (ii) v primeru 12, tako da se dobi sintetično S/D vezivo.

(iii) Pridobivanje vektorja izražanja

0.1 gg okoli 4-kb fragmenta, po 0.05 gg BamHI fragmenta, ki ima O_LP_L področje in MboII-BamHI fragmenta, ki ima tL_x področje /trije fragmenti dobljeni v (I)/ in 0.1 gg kaljenega sintetičnega S/D veziva dobljenega v (ii) se podvrže reakciji prek noči na 12°C v 40 μΐ reakcijske zmesi (66 mM Tris-HCl, 6.6 mM MgCl₂, 10 mM DTT in 1 mM ATP) v prisotnosti 175 enot T₄DNA ligaze (Takara Shuzo Co, Ltd.). 20 gl reakcijske raztopine se uporabi za transformacijo E.coli vrste N99CI⁺ (Pharmacia) v postopku, ki vključuje kalcijev klorid (glej Molecular Cloning, isto).

Transformanti so bili kultivirani in iz njihove kulture ampicilin-rezistentnih kolonij je bil izločen plazmid. Tretiranje plazmida z restrikcijskimi encimi EcoRI, BamHI in Smal kaže, da je bil to željeni plazmid.

Dva mikrograma tega plazmida je reagiralo z restrikcijskim encimom Cial (New England Biolabs) na 37°C v trajanju 2 ur v 20

-5757 μΐ pufra (10 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl₂ in 50 mM NaCI) . Za tem je bil encim deaktiviran z 10 minutnim segrevanjem na 65°C.

En mikroliter reakcijske raztopine je prek noči reagiral na 12°C z 175 enotami T₄DNA ligaze (Takara Shuzo Co., Ltd.) v raztopini za vezanje, ki ima svojo sestavo opisano naprej. Reakcijska zmes je bila nato uporabljena za transformiranje E.coli vrste N99cl⁺ (Pharmacia). Plazmid je bil izločen iz kulture ampicilin-re2istentnih kolonij transformantov, nakar je bil tretiran z EcoRI in BamHI, tako da smo potrdili, da je bil dobljeni plazmid tudi željen! plazmid.

(iv) Pridobivanje G-CSF izražavajočega rekombinantnega vektorja in transformantov

Plazmid izražanja pridobljen v (iii) je bil tretiran z restrikcijskim encimom Clal. Po ustvarjanju odprtih koncev, je bil plazmid obdelovan kakor v primeru 12, tako da smo dobili rekombinantni vektor danega cDNA fragmenta G-CSF-ja. Ta vektor je bil uporabljen za transformiranje E.coli vrste N4830 (Pharmacia Fine Chemicals) v postopku ki vključuje kalcijev klorid, kar je bilo opisano v Molecular Cloning, isto. Identifikacija željenih transformantov je bila izvršena kakor v primeru 12 (slika 9).

Primer 14: Grajenje E.coli rekombinantnega vektorja (+VSE) in transformacija (z uporabo trp promotorja, ki ima vektor)

1) Grajenje rekombinantnega vektorja (i) Pripravljanje vektorja

Plazmid pOZl, dobljen z vnašanjem triptofan promotorja, ki vsebuje Hpall-TagI fragmenta (okoli 330 bp) v pBR322 na Clal mesto. Deset mikrogramov tega plazmida je bilo tretirano s 7 enotami restrikcijskega encima Clal in 8 enotami PvuII na 37°C v trajanju 3 ur v 30 μΐ reakcijske zmesi sestavljene iz 10 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl₂ ter 50 mM NaCI.

-5858

Nato smo dodali 2 μΐ alkalne fosfataze (proizvajalca Takara Shuzo Co._f Ltd.) in reakcija je bila izvajana na 60°C v trajanju 1 ure.

Z elektroforezo je bil iz reakcijske raztopine 1% agaroza/gel izločen DNA fragment (okoli 2.5 μς) dolg približno 2.6 kb.

(ii) Pridobivanje sintetičnega veziva

Oiigonukleotidi, ki imajo nize sintetičnih veziv

CGCGAATGACCCCCCTGGGCC ter CAGGGGGGTCATTCG so bili fosfolirizirani in kaljeni kot je opisano v (ii) v primeru 12, tako da je bilo pridobljeno sintetično vezivo.

(iii) Pridobivanje rekombinantnega vektorja

Okoli 1 μφ vektorskega fragmenta dobljenega v (I), okoli 1 pg sintetičnega veziva pridobljenega v (ii) in okoli 1 μς G-CSF fragmenta dobljenega v (iii) v primeru 12 je reagiralo s 175 enotami T₄DNA ligaze prek noči na 12°C v 20 μΐ raztopine za vezanje, ki ima sestavo opisano v primeru 12, 1) (iv), tako da se dobi rekombinantni vektor (slika 10).

2) Transformacija

Dvajset mikrolitrov reakcijske zmesi dobljene v (iii) je bilo uporabljene za transformiranje E.coli DH1 v postopku, ki vključuje rubidijev klorid in je bil opisan v Molecular Cloning, isto.

Kakor v primeru 12, je bil palzmid izločen iz ampicilinrezistentnih kolonij transformantov, tretiranje tega piazmida z restrikcijskimi encimi Apal, Dral, Nrul in Pstl pa kaže na to, da so dobljeni željeni transformanti.

-5959

Primer 15: Kultiviranje transformantov

1) Kultiviranje transformantov (s tac) dobljenih v primeru 12 Transformanti so bili kultivirani preko noči na 37°C, 1 ml kulture je bil nato dodan 100 ml Luria okolja, ki vsebuje 25 pg/ml aii 50 pg/ml ampicilina. Kultiviranje se je izvajalo 2-3 ure na 37°C. Kultiviranje se je nato nadaljevalo pri 37°C v trajanju 2-4 ur po dodajanju izopropil-p-D-tiogalaktoze, tako da se je ustvarila končna koncentracija velika 2 mM.

2) Kultiviranje transformantov (z P_L) dobljenim v primeru 13 Transformanti so bili preko noči kultivirani pri 28°C. Nato je bil 1 ml kulture dodan 100 ml Luria okolja, ki vsebuje 25 ali 50 pg ampicilina. Kultiviranje se je vršilo okoli 4 ure na 28°C. Kultiviranje se je nadaljevalo 2-4 ure pri 42°C.

3) Kultiviranje transformantov (s trp) dobljenih v primeru 14 Transformanti so bili kultivirani prek noči pri 37°C, nato pa je bil 1 mM kulture dodan 100 ml M9 okolja, ki vsebuje 0.5% glukoze, 0.5% Casamino kislin (Difco; Blag. znamka; Op. prev.) in 25 ali 50 pg/ml ampicilina. Kultiviranje je bilo vršeno 4-6 ur pri 37°C. Po dodajanju 50 pg/ml 3-p-indolakrilne kisline (IAA) se je kultiviranje nadaljevalo 4-8 ur na 37°C.

Primer 16: Ločevanje in prečiščevanje G-CSF polipeptidov iz £.coli

1) Ločevanje

Tri vrste transformantov kultiviranih v primeru 15 je bilo podvrženih naslednjim postopkom ločevanja.

Kultura (100 ml) je bila centrifugirana tako, da je bila dobljena tableta celic, ki je bila nato suspendirana v 5 ml zmesi 20 mM Tris-HCI (pH 7.5) in 30 mM NaCI.

-6060

Nato so bili dodani 0.2 M fenilmetilsulfonil fluorida, 0.2 M EDTA in lizocim v odgovarjajočih koncentracijah veličin 1 mM, mM in 0.2 mg/ml, nato pa je bila suspenzija puščena 30 minut na 0°C. Celice so bile lizirane s pomočjo v treh ciklih zamrzovanja/topijenja. Nato je bil lizat centrifugiran tako, da je bil dobljen supernatant. Alternativno se lahko lizat tretira z 8 M guanidin hidrokloridom, tako da njegova končna koncentracija znaša 6 M gvanidin hidroklorida, nato pa se ga centrifugira na 30000 obr/min v trajanju 5 ur nakar se izloči supernatant.

2) Prečiščevanje (i) Supernatant dobljen vi) se podvrže gel filtraciji na Ultrogel AcA54 stolpcu (premera 4.6 cm x 90 cm dolžine) pri pretoku okoli 50 ml/uro z 0.01 M Tris-HCI pufra (pH 7.4), ki vebuje 0.15 M NaCI in 0.01% Tween 20 (Nakar Kagaku Co., Ltd.). Frakcije, ki so kazale aktivnost pri analizi z metodo CSA preiskovanja (b) (opisana predhodno v tej specifikaciji) so bile izbrane in koncentrirane do volumna okoli 5 ml z ultrafiltracijsko napravo pM-10 (Amicon).

(ii) Koncentriranim frakcijam je bil dodan n-propanol (s čistočo ugodno za preiskovanje amino kislinskega niza; Tokyo Kasei Co.,Ltd.) in trifluoroocetno kislino. Zmes je bila obdelana tako, da sta bili končni koncentraciji obeh sestavin 30% in 0.1%. Obdelana zmes je bila puščena v ledu okoli 15 minut nato pa centrifugirana na 15000 obr/min v trajanju 10 minut zaradu ločevanja oborine. Supernatant je bil adsorbiran na u-Bondpak C18 stolpcu (polpreparatorska kvaliteta; Waters; 8 mm x 30 cm), ki je bila uravnotežena z vodno raztopino, ki vsebuje n-propanol (glej naprej) in trifluoroocetno kislino. Stolpec je bil neprestano eluiran z vodno raztopino 0.1% trifluoroocetne kisline, ki vsebuje n-propanol z linearnim gradientom gostote od 30-60%. Z Hitachi Model 685-50 (HPLC

-6161 aparaturo Hitachi, Ltd.) in Hitachi Model· 638-41 (detektorjem Hitachi, Ltd.), ki so bili uporabljani, je bila istočasno merjena tudi adsorbcija na 220 nm in 280 nm. Po eluiranju, je bilo po 10 μΐ alikvota vsake frakcije razredčeno 100 krat, raztopine pa so bile testirane na aktivne frakcije z metodo CSA peiskovanja (b). Opažena je bila aktivnost na vrhovih, ki so bili eluirani s 40% n-propanolom. Ti vrhovi so bili kombinirani in ponovno kromatografirani pod istimi pogoji kakor naprej, frakcije pa so bile preiskane na svojo aktivnost z metodo (b). Aktivnost je bila ponovno najdena v vrhovih za 40% n-propanol. Ti aktivni vrhovi so bili zbrani (4 frakcije=4 mi) in suho zamrznjeni.

(iii) Suho zamrznjen prah je bil raztopljen v 200 μΐ vodne raztopine 0.1% trifluoroocetne kisline, ki vsebuje 40% npropanol. Raztopina je bila nato podvržena HPLC na TSK-G3000SW stolpcu (7.5 mm x 60 cm; Tokyo Soda Manufacturing Co., Ltd.). Eluiranje je bilo vršeno pri pretoku velikem 0.4 ml/min z vodno raztopino 0.1% trifluoroocetne kisline, ki vsebuje 40% n-propanola. Frakcije velike 0.4 ml so bile zbrane s kolektorjem frakcij, FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemicals). Le te so bile nato preiskane na CSA, kakor bo opisano nadalje, in izločene frakcije so bile izločene. Te so bile nadalje prečiščevane na μ-Bondpak C18 stolpcu (4.6 mm x 30 cm) in izločen je bil glavni vrh, ki je bil nato suho zamrznjen.

Tako dobljeni protein je bil tretiran s 2-merkaptoetanolom, ter nato podvržen SDS-poliakrilgel (15%) elektroforezi (15 mV, 6 ur). Po barvanju z Coomassie Blue, je bil željeni G-CSF polipeptid identificiran kakor enojna vrvica.

Primer 17: Preiskovanje G-CSF aktivnosti (+VSE)

CSF vzorec dobljen v primeru 16 je bil preiskan glede na metodo CSF preiskovanja (a) opisani predhodno v tej specifikaciji. Rezultati so prikazani v spodnji tabeli 1:

-6262

TABELA 1

	Humane nevtrofilne kolonije (kolonij na posodico)
Prečiščeni humani G-CSF (20 ng)	73
CSF vzorec dobljen v
Primeru 15 (50 ng)	68
Kontrola	0

Primer 18: Analiza amino kislin (+VSE)

1) Analiza sestave amino kislin

CSF prečiščen v primeru 16 je bil hidroliziran z rutinskimi postopki. Sestava amino kislin proteinskega dela hidrolizata je bila analizirana z metodo analize amino kislin z avtomatskim analizatorjem amino kislin, Hitachi 835 (Hitachi Ltd.). Rezultati so prikazani v tabeli 2. Hidroliza je bila vršena pod naslednjimi pogoji:

(i) 6 N Hcl, 110°C, 24 ur v vakumu (ii) 4 N metansuifonska kislina + 0.2% 3-(2-aminometil)indol, 110°C, 24 ur, 48 ur, 72 ur, v vakumu

Vzorec je bil raztopljen v raztopini (1.5 ml), ki vsebuje 40% n-propanola in 0.1% trifluorocetno kislino. Alikvoti vsake mase 0.1 ml so bilo posušeni s suhim plinastim dušikom in po dodajanju reagentov navedenih v (i) ali (ii), so bile posode v vakumu potopljene in hidrolizirane.

Vsaka od vrednosti prikazanih v tabeli 2 je sredna vrednost 4 merjenj, vrednost za 24 ur (i) in vrednost za 24.48 in 72 ur (ii), z izjemo tega, da so bile vsebnosti Thr, Ser, l/2Cys,

Met, Val, Ile in Trp izračunane z naslednjimi metodami (glej

-6363

Tampaku Kagaku (Protein Chemsitry) II Course in Biochemical Ezperiments, Tokyo Kagaku Dohjiin);

Za Thr, Ser, l/2Cys in Met je bila časovna odvisnost profila od 24, 48 in 72 ur za (il) ekstrapolirana iz 0 ur.

Za Val in Ile je bila uporabljena 72 urna vrednost za (ii) .

Za Trp je bila uporabljena srednja vrednost izmed 24, 48, 72 ur iz (ii).

Tabela 2:

Podatki analize amino kislin

Amino kislina Mol %

Asp (Asp+Asn) 2.3 Thr 4.0 Ser 8.5 Glu (Glu+Gln) 15.2 Pro 7.3 Gly 7.9 Ala 10.7 1/2 Cys 2.8 Val 4.5 Met 2.0 Ile 2.3 Leu 18.3 Tyr 1.7 Phe 3.4 Lys 2.3 His 2.8 Trp 1.1 Arg 2.9

-6464

2) Analiza N-terminalnih amino kislin

Vzorec je bil podvržen Edman-ovi razgradnji s plinsko faznim preiskovalcem niza (Applied Biosystems), nakar je bila dobljena PTH amino kislina analizirana z rutinskimi postopki s HPLC napravo (Beckman Instruments) in Ultrasphere-ODS stolpcem (Beckman Instruments). Za tem je bil stolpec (5 pm; premer 4.6 mm in dolžine 250 mm) uravnotežen z začetnim pufrom/ vodna raztopina ki vsebuje 15 mM natrijevega acetatnega pufra (pH 4.5) in 40% acetonitrila/. Vstavljen je bil vzorec (raztopljen v 20 pl začetnega pufra) in izvršeno je bilo enkratno eluiranje z začetnim pufrom. Med to operacijo je bil pretok stalno obdržan na 1.4 ml/min temperatura stolpca pa na 40°C. Detekcija PTH amino kisline je bila izvršena z uporabo absorbcije v ultravijoličnem pasu na 269 nm in 320 nm. Standardni vzorci (sviki mase 2 nmol) PTH amino kisline (Sigma) so bili ločeni na isti liniji zaradi ugotavljanja njihovega retencijskega časa, ki so bili primerjani s tistimi za vzorec s ciljem identifikacije N-terminalnih amino kislin. Na ta način sta bila detektirana PTH-metionin in PTH-treonin.

Primer 19: Grajenje E.coli rekombinantnega vektorja (-VSE) in transformacij a

1) Uporaba tac promotorja, ki vsebuje vektor

Postopki iz primera 12 so bili ponovljeni z razliko tega, da je bil pBRG4, dobljen v primeru 9, ki vsebuje cDNA prikazano na sliki 3 (A) /glej (iii) v primeru 12/ je zamrznjen z pBRV2 dobljenim v primeru 10, ki vsebuje cDNA prikazano na sliki 4(A). Kakor v primeru 12, so bili dobljeni transformanti potrjeni kakor zazeljeni (slika 11).

2) Uporaba PL promotorja, ki vsebuje vektor

-6565

Postopki iz primera 13 so bili pnovljeni z uporabo cDNA (-VSE), dobljeni transformanti pa so bili potrjeni kakor zazeljeni (slika 12).

3) Uporaba trp promotorja, ki vsebuje vektor

Ponovljeni so bili postopki iz primera 14 z uporabo cDNA (VSE), dobljeni transformanti pa so bili potrjeni kakor zazeljeni (slika 13).

Primer 20: Preiskovanje G-CSF aktivnosti (-VSE)

Tri vrste transformantov dobljenih v primeru 19 so bili kultivirani z metodo opisano v primeru 15. Iz kultiviranih E.coli, so bili po metodi opisani v primeru 16 izločeni in prečiščeni G-CSF polipeptidi, tako da je bil dobljen humani GCSF polipeptid kakor enojna vrvica.

Tako dobljen CSF vzorec je bil raziskan z metodo preiskovanja CSF aktivnosti (a), ki je bila opisana predhodno v tej speciikaciji. Rezultati so prikazani v tabeli 3.

Tabela 3:

		Humane nevtrofilne kolonije
		(kolonij na posodico)
Prečiščeni	humani G-CSF (20 ng)	73
CSF vzorec	dobljen v primeru 19	(50 ng) 73
Kontrola		0

Primer 21: Analiza amino kislin (-VSE)

1) Analiza sestave amino kislin

Sestava amino kislin CSF vzorca prečiščenega v primeru 20 je bil analiziran z metodo opisano vi) v primeru 18. Rezultati so prikazani v tabeli 4.

-6666

Tabela 4:

Amino kisline Mol %

Asp (Asp+Asn) 2.3 Thr 4.0 Ser 8.1 Glu (Glu+Gln) 15.0 Pro 7.5 Gly 8.1 Ala 11.0 1/2 Cys 2.9 Val 4.1 Met 2.0 Ile 2.2 Leu 18.8 Tyr 1.7 Phe 3.4 Lys 2.3 His 2.7 Trp 1.1 Arg 2.8

2) Analiza N-terminalnih amino kislin

Vzorec je bil podvržen analizi N-terminalnih amino kislin po metodi opisani v 2) v primeru 18. Na ta način so bile detektirane PTH-metionin in PTH-treonin.

Primer 22: Pridobivanje pHGA410 vektorja (za uporabo z animalnimi celicami +VSE linije)

EcoRI fragment dobljen v primeru 9, čigar cDNA je prikazana na sliki 3(A) je bil tretiran z restrikcijskim encimom Dral pri

-6767

37°C v trajanju 2 ur, nato pa še s Klenowim fragmentom DNA polimeraze I (Takara Shuzo Co, Ltd.), tako da so se gradili odprti konci. En mikrogram veziva Bglll (8raer, Takara Shuzo Co., Ltd.) je fosforiziral z ATP in je bil pripet na 1 gg posebej pridobljene zmesi DNA fragmentov. Pripeti fragmenti so bili tretirani z restrikcijskim encimom Bglll in so bili nato podvrženi agarozni gel elektroforezi. Nato je bil izločen le največji DNA fragment.

Ta DNA fragment je bil ekvivalenten z okoli 710 baznimi pari, ki vsebuje humani G-CSF polipeptid kodirnega dela (glej sliko 6). Vektor pdKCR /Fukunga et al·., Proč. Natl. Acad. Sci., Usa, 81, 5086 (1984)/ je bil tretiran z restrikcijskim encimom Barall, nato pa defosforiliziran z alkalno fosfatazo (Takara Shuzo Co., Ltd.). Vektor DNA dobljen s pripenjanjem na 710 bp cDNA fragmenta v prisotnosti T₄DNA iigaze (Takara Shuzo Co., Ltd.) tako, da se dobi pHGA410 (slika 14). Kakor je prikazano na sliki 14, vsebuje ta plazmid promotor predhodnega gena SV40, replikacijo replikanta začetka SV40, del zajčjega β-globin gena, replikacijo iniciacijskega področja pBR322 in pBR322 izveden β-laktamazni gen (Amp^r) , s humanim genom pripetim pod promotorjem SV40 predhodnega gena.

Primer 23: Grajenje rekombinantnega vektorja (+VSE) za uporabo v transformaciji C 127 celic

1) Grajenje pHGA410 (H)

Dvajset mikrogramov piazmida pHGA410 (slika 14) dobljenega v primeru 22 smo raztopili v reakcijski raztopini sestavljeni iz 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl₂, 100 mM naCl, 7 mM 2merkaptoetanola in 0.01% albuminskega seruma goveda(BSA). Dodan je bil tudi restrikcijski encim EcoRI (10-15 enot; Takara Shuzo Co., Ltd.) in reakcijska raztopina je bila držana na 37°C v času 30 minut zaradi delne razgradnje z EcoRI. Za tem je bil DNA fragment podvržen dvema tretirama z 1:1 zmesjo

-6868 fenola/kloroforma, eni obravnavi z etrom in obarjanju z etanolom.

Dobljeni DNA fragment smo raztopili v 50 μΐ raztopine sestavljene iz 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 10 mM DTT in po en mM dATP, dCTP, dGTP in d TTP. Nato smo dodali 5 μΐ Klenow fragmenta E.coli DNA polimeraze (Takara Shuzo Co., Ltd.) in raztopina je bila inkubirana na 14°C v trajanju 2 ur, tako da so se gradili odprti konci.

Nato je bilo s pomočjo 0.8% agarozne gel elektroforeze izločeno 6 gg DNA fragmenta dolžine okoli 5.8 kbp.

Pet mikrogramov izločene ga DNA fragmenta je bilo raztopljenega v 50 μΐ reakcijske zmesi sestavljene iz 50 mM Tris-HCl ipH 7.6), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT in 1 mM ATP. Po dodatku 2 gg Hindlll veziva (Takara Shuzo Co., Ltd.) je bila reakcija puščena vršiti se prek noči na 4°C.

Nadalje smo vršili obravnave s fenolom in etrom in obarjanja z etanolom. Oborina je bila raztopljena v 30 μΐ raztopine sestavljene iz 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl₂ in 60 mM NaCI. Raztopina je bila nato inkubirana 3 ure na 37°C v prisotnosti 10 enot Hindlll. Po ponovni obravnavi s T₄DNA ligazo, je bila dobljena DNA uporabljena za transformiranje E.coli vrste DHl v postopku, ki vključuje rubidijev klorid (glej Molecular Cloning, isto). Iz ampicilin-rezistentne (Amp^r) , je bila izbrana kolonija transformiranih celic, ki so gojile plazmid, ki je bil identičen z pHGA410 razen v tem, da je bil Hindlll nameščen na mestu EcoRI. Tako dobljen plazmid je bil imenovan pHGA410 (H) (slika 15).

2) Grajenje rekombinantnega vektorja izražanja pTN-G4

Dvajset mikrogramov dobljenega pHGA410 (H) je bilo raztopljenega v 50 μΐ reakcijske raztopine, ki je sestavljena iz 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCi₂, 175 mM NaCI, 0.2 mM

-6969

EDTA, 7 mM 2-merkaptoetanola in 0.01% seruma albumina goveda.

Po dodatku 20 enot Šali (Takara Shuzo Co., Ltd.), je bila reakcijska zmes inkubirana na 37°C v trajanju 5 ur. Po tretiranju s fenolom in obarjanju s etanolom, se je inkubacija vršila kakor vi) v trajanju 2 ur na 14°C v prisotnosti Klenov/ fragmenta DNA polimeraze (Takara Shuzo Co., Ltd.) tako, da so se gradili odprti konci. Brez predhodnega ločevanja DNA s pomočjo agaroza gelne elektroforeze, je bila reakcijska zmes takoj podvržena obarjanju z etanolom. Dobljeni DNA fragment je bil tretiran z Hindlll in 5 gg Hindlll-Sall fragmenta (okoli 2.7 kbp) je bilo izločenega s pomočjo 1% agaroza gel elektroforeze. V posebni stopnji, je bil plazmid pdBPV-1, ki ima papilloma virus goveda(BPV) /ta plazmid je bil dobljen zahvaljujoč Dr. Howleyu in je bil opisan v Sarvewr,N, Sbyrne, J.C.& Howley, P.M., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 79, 7147-7151 (1982)/ tretiran s Hindlll in Pvul, kakor je to opisal Nagata et al./Fukunga, Sokawa in Nagata, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81, 5086-5090 (1984), tako da se dobi 8.4 kb DNA fragment. Ta 8.4 kb DNA fragment in posebej ločen Hindlll-Sall DNA fragment (okoli 2.7 kb) jepovezan s T₄DNA ligazo. Proizvod povezovanja je bil uporabljen za transformiranje E.coli vrste DH1 s pomočjo postopka, ki vključuje rubidijev klorid in je bil opisan v Molecular Cloning, isto. Ločene so bile E.coli kolonije, ki gojijo plazmid, ki ima pHGA410-izveden G-CSF cDNA. Ta plazmid je bil imenovan pTN-G4 (slika 15).

Adenovirus tipa II / Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic acids and Encymes), 27, December, 1982, Kyoritsu Shuppan/ je bil tretiran podobno, tako da je bil· dobljen plazmid, pVA, ki je vseboval okoli 1700-bp Sall-Hindlll fragmenta. Iz tega plazmida so bili izločeni VAI in VAH ter fragment, ki vsebuje VAI in VAII. Ta fragment je bil nameščen v pTNG4 na Hindlll mesto, tako da je bil dobljen pTNGSVAa in pTNG4VAp (slika 15). Zaradi tega je VAN gen adenovirusa teh

-7070 plazmidov sposoben pokazati izražanje transkripcijskega proizvoda iz starejšega promotorja SV40.

Primer 24; Transformacija celic C127 in G-CSF izražanje (+VSE)

Preden je bil uporabljen za transformiranje C127 celic, je bil pTN-G4 dobljen v primeru 23 tretiran z restrikcijskim encimom BamHI. Dvajset mikrogramov plazmida pTN-G4 je bilo raztopljenega v 100 μΐ reakcijske raztopine /10 mM Tris-HCl (pH 8), 7 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 2 mM 2-merkaptoetanola in 0.01% BSA/ nakar je bila tretirana z 20 enotami BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), nato pa je bila tretirana s fenolom in etrom in obarjana z etanolom.

C127 celice miši gojene v Dulbecovem minimalnem osnovnem okolju, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda(Gibco). C127 celice gojene na pladnju premera 5 cm so bile transformirane z 10 μg na pladenj, posebno pridobljene DNA v postopku s kalcijevim fosfatom /glej Haynes, J. & Weissman C., Nucleic Acids res., 11, 687-706 (1983)/. PO tretiranju z glicerolom so bile celice inkubirane na 37°C v času 12 ur.

Inkubirane celice so bile transformirane na treh svežih pladnjih premera 5 cm, okolje pa se je menjavalo dvakrat tedensko. 1(dne so bile FOKE prenesene na sveže pladnje in so bile serijski kultivaciji na Dulbecovem minimalnem osnovnem okolju, ki vsebuje 10% seruma embrija goveda(Gibco), tako da so bili ločeni kloni, ki so imeli visoko hitrost produkcije G-CSF. Ti kloni so proizvedli okoli 1 mg/1 G-CSF. Nadaljnje kloniranje je dalo narast v klonih, ki so bili sposobni proizvodnje G-CSF na nivoju 10 mg/1 ali več. kakor dodatek v C127 celicah, se NIH3T3 lahko prav tako uporabljajo kakor gostiteljske celice.

-7171

Primer 25: Izražanje G-CSF v CHO celicah (+VSE)

1) Grajenje pHGG4-dhfr

Dvajset mikrogramov pla2mida pHGA410 dobljenega v primeru 22 je bilo raztopljenega v 100 μΐ reakcijske zmesi, ki je vsebovala 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl₂, 175 mM NaCI, 0.2 mM EDTA, 0.7 mM 2-merkaptoetanola ter 0.01% BSA. Reakcija se je vršila prek noči na 37°C v prisotnosti 20 enot restrikci j skega encima Šali (Takara Shuzo Co., Ltd.), nato pa je bila vršena tretira s fenolom in etrom tel obarjanje z etanolom.

Oborina DNA je bila raztopljena v 100 μΐ reakcijske zmesi, ki je bil sestavljen iz 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 10 mM DTT in po 1 mM dATP, dCTP, dGTP in dTTP. Reakcija se je vršila pri 14°C 2 uri v prisotnosti Klenow fragmenta in E.coli DNA polimeraze (10 μΐ; Takara Shuzo Co., Ltd.), nato pa je bila raztopina tretirana še s fenolom in etrom ter dodatno obarjana z etanolom.

EcoRI vezivo je bilo pripeto na DNA v oborini v naslednjih postopkih:

DNA raztopljena v 50 μΐ reakcijske raztopine sestavljene iz 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM DTT, 0.5 mM spermidina, 2 mM ATP, 2 mM heksamin-kobalt klorida in 20 ng/ml BSA. Reakcija je potekala pri 4°C v trajanju 12-16 ur v prisotnosti EcoRI veziva (Takara Shuzo Co., Ltd.) in 200 enot T₄DNA ligaze (Takara Shuzo Co., Ltd.). Po tretiranju s fenolom, izpiranju z etrom in obarjanju z etanolom se je vse vršilo glede na rutinske postopke. DNA oborina je bila delno razgrajena z EcoRI, s pmočjo agaroza gel elektroforee pa je bilo izločenega 3ng DNA fragmenta dolžine približno 2.7 kbp.

Plazmid pAdD26SVpA /Kaufman, R.G. & Sharp, P.A., Mol. Celi Biol., 2, 1304-1319 (1982)/ je bilo tretiran z bakterijsko alkalno fosfatazo (BAP). Natančneje, je bilo 20 ng pAdD26SVpA in 20 enot EcoRI dodano reakcijski raztopini /50 mM Tris-HCl

-7272 (ρΗ 7.5), 7 mM MgCl₂, 100 mM NaCI, 7 mM 2-merkaptoetanola in 0.01% BSA/. Reakcija je potekala pri 37°C 10 ur. Nato je bilo reakcijski zmesi dodano 5 enot BAP, reakcija pa se je vršila pri 68°C v trajanju 30 minut. PO tretiranju s fenolom, je bil EcoRI fragment pdD26SVpA ločen z elektroforezo v doprinosu velikem okoli 5 pg.

Fragmernt dolžine okoli 2.7 kbp in pAdD26SVpA, vsak mase 0.5 μς sta bila KALJENA. Dobljeni plazmid se je uporabil zaradi transformacije E.coli vrste DH1 v postopku z rubidijevim kloridom, kolonije vzgajalcev plazmida pHGG4-dhfr pa so bile ločene. Dobljeni plazmid je bil imenovan pHGG4-dhfr (slika 16a) .

Alternativni postopek je naslednji: Plazmid pHGA 410 se tretira s Šali in se delno razgradi z RcoRI brez dodajanja EcoRI veziva. DNA fragment dolžine okoli 2.7 kbp se izloči in tretira s Klenov fragmentom E.coli DNA polimeraze tako, da se ustvarijo odprti konci. EcoRI fragment, ki ima odprte konce se dobi iz pAdD26SVpA na način, ki je opisan naprej. TA EcoRI fragment in posebej pripravbljeni fragment (okoli 2.7 kbp) se tretira s T₄DNA ligazo tako, da se dobi pHGG4-dhfr.

pHGA410 (H) dobljen v primeru 23 se tretira z restrikcijskimi encimi Hindlll in Šali, kakor je opisano v 2), primer 23. Hindlll-Sall fragment se pripoji na odprt konec EcoRI fragmenta, kakor bo to opisano naprej. TA metoda se lahko uporablja tudi za pridobivanje pHGG4-dhfr (slika 16b).

2) Grajenje pG4DRI in pG4DR2

Deset mikrogramov plazmida pAdD26SVpA omenjenega v 1) je bilo raztopljenega v 50 ml reakcijske raztopine, ki vsebuje 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl₂, 100 mM NaCI, 7 mM 2merkaptoetanola in 0.01% BSA. Po dodajanju po 10 enot vsakega izmed restrikcijskih encimov EcoRI in BamHI, se je reakcija vršila na 37°C v trajanju 10 ur, nato pa se je tretiranje

-7373 nadaljevalo s fenolom in izpiranjem z etrom. S pomočjo elektroforeze prek 1% agaroznega gela z nizko točko topljenja je bil izoliran DNA fragment dolžine okoli 2 kbp. Izolirani DNA fragment je bil tretiran s Klenowim fragmentom DNA polimeraze v rutinskih postopkih tako, da so se gradili odprti konci. DNA fragment z odprtimi konci je bil nato tretiran s fenolom, izpran z etrom in obarjan z etanolom.

Deset mikrogramov plazmida pHGA410 (H) dobljenega v 1), primer 23, je bilo raztopljenega v 50 μΐ reakcijske zmesi, ki je vseboval 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl₂ in 60 mM NaCl. Reakcija se je vršila 6 ur na 37°C v prisotnosti 10 enot Hindlll. DNA fragment je bil izoliran z elektroforezo iz 1% agaroznega gela z nizko točko topljenja izvršeno z rutinskimi postopki. Izoliran fragment DNA je bil nato tretiran z BAP in z tretiranjem s Klenowim fragmentom so se ustvarili odprti konci. Nato se je fraagment, po tretiranju s fenolom in izpiranju z etrom, pripel na odprte konce predhodno dobljenega 2-kb DNA fragmenta s T₄DNA ligazo glede na opisani postopek: po 1 gg vsakega DNA fragmenta je bilo raztopljenega v 30 μΐ reakcijske raztopine, ki je vseboval 66 mM Tris-HCl {pH 7.5), 6.6 mM MgCl_z, 5 mM DTT in 1 mM ATP. Reakcija se je vršila pri 6°C v trajanju 12 ur in prisotnosti T₄DNA iigaze. Produkt povezovanja je bil uproabljen za transformiranje E.coli vrste DH1. Na ta način so bili dobljeni pG4DRl in pGADR2, prikazani na sliki 16c.

3) Transformiranje in izražanje

CHO celice (dhfr vrsta; dobljena zaradi ljubeznivosti Dr. L. Chasin-a iz Kolumbijske Univerzitete) so bile kultivirane zaradi vzgajanja na alfa-minimalni osnovni podlagi, ki vsebuje 10% seruma goveda(α-MEN dopolnjeni z adenozinom, deoksiadenozinom in timidinom) na pladnju premera 9 cm (Nune). Kultivirane celice so bile transformirane v postopku, ki

-7474 uporablja tudi kalcijev fosfat /Wigler et al., Celi, 14, 725 (1987)i na naslednji način.

Nosilec DNA (timus DNA teleta) se doda v ustrezni količini v 1 pg plazmida pHGG4-dhfr dobljenega v 1), zmes pa se nato raztopi v 375 μΐ TE raztopine, kar je nadalje spremljano z dodajanjem 125 μΐ 1 M CaCl₂-Raztopina se je hladila na ledu tokom 3-5 minut, nato pa se ji je dodalo 500 μΐ 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCI in 1.5 mM fosfatnega pufra). Po ponovnem hlajenju na ledu je bila raztopina izmešana z 1 ml kulture CHO celic, prenesenih na pladnje ter je bila inkubirana 9 ur v C0₂ inkubatorju. Okolje je bilo nato izločeno iz pladnja in izprano z TBS (Tris puferni salin). Sledilo je dodajanje 20% glecerola ki je vseboval TBS, nakar je bilo okolje ponovno izprano, nato pa je bilo dodano neselektivno okolje (α-MEN okolje opisano zgoraj brez dopolnjevanja z nukleotidi), Po drugem dnevu inkubacije se je 10 krat razredčena kultura prenesla v selektivno okolje (ki ni bila dopolnjena z nukleotidi). Kultiviranje se je nadaljevalo tako, da se je okolje zamenjevalo z novim selektivnim okoljem vsaka 2 dneva, dobljene kolonije pa se se izbrali in prenesle na sveže pladnje, kjer so celice rastle v prisotnosti 0,02 μΜ metotreksata (ΜΤΧ), kar je bilo spremljano s kloniranjem prek rasti v prisotnosti 0.05 μΜ ΜΤΧ, kar je bilo nato nadalje povečano na 0.1 μΜ ΜΤΧ.

Transformacija CHO celic se lahko prav tako vrši s pomočjo kontratransformacije s pHGG4 in pAdD26SVpA /glej Scahill et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 80, 4654-4658 (1983)/.

CHO celice se transformirajo tudi z naslednjimi postopki: pG4DRl ali pG4DR2, ki so bili dobljeni v 2) so bili predhodno tretirani respektivno s Šali in KpnI zaradi pridobivanja DNA fragmentov in 10 pg teh fragmentov je bilo uporabljenih zaradi transformiranja CHO celic kakor naprej; transformirane celice so bile podvržene kontinuiranemu kultiviranju v seriji

-7575 selektivnih okolij na naprej opisan način; okoli 7 dni kasneje, se je na vsakem pladnju pojavilo ne manj kakor 100 ločenih kolonij; te kolonije so bile prenesene v masi na svež pladenj, kjer so bile podvržene nadaljnji kultivaciji v seriji selektivnih okolij v prisotnosti 0.01 mM ΜΤΧ, dokler se ni pojavilo 10 neparnih kolonij; isti postopki so bili ponovljeni tudi z ΜΤΧ koncentracijami okoii 0.02, 0.05 iin 0.1 μΜ, kolonije, ki so preživele pa so bile izbrane; selekcija kolonij se lahko vrši na podoben način tudi ko dobljenih 10 neparnih kolonij se podvrže kultivaciji z rastočimi ΜΤΧ koncentracijami. Rekombinantni vektor, ki goji policistronski gen”, se prav tako lahko uporabi za transformiranje CHO celic. Sledi primer te alternativne metode: pAdD26SVpA se tretira s Pstl, nakar se izolirata dva fragmenta, ki se pričvrstita na pBRG4-izveden CSF cDNA fragment tako, da se gradi rekombinantni vektor , kjer so adeno virus promotor, CSF cDNA, DHFR in poli(A) namesto SV40 nameščeni v napisanem zaporedju. Ta rekombinantni vektor se uporablja za transformiranje CHO celic.

Primer 26: Preiskovanje G-CSF aktivnosti (+VSE)

Supernatanti kultur celic C127 in CHO celic, ki so bile dobljene v primerih 24 in25, so bili podvrženi ustreznemu pH=4 z IM ocetno kislino. Po dodatku enakega volumna n-propanola, je bila dobljena oborina odstranjena s centrifugiranjem.

Supernatant je bil prepuščen prek odprtega stolpca (premera 1 cm in dolžinae 2 cm) napolnjenega s C8 reverzno faznim nosilcem (Yamamura Kagaku K.K.), eluiranje pa je bilo izvršeno s 50% propanolom. Eluat je bil razredčen dvakrat z vodo, nakar je bil podvržen reverzno fazni HPLC na YMC-C8 stolpcu (Yamamura Kagaku K.K.), nato pa se je eluiranje vršilo s pmočjo n-propanola (3060% linearni gradient gostote), ki vsebuje 0.1% TFA. Frakcije, ki so bile eluirane z n-propanolom koncentracije okoli 40% so bile izolirane , suho zamrznjene in raztopljene v 0.1 M glicin

-7676 pufru (pH 9). Zaradi teh postopkov je bil humani G-CSF v celicah C127 in CHO celicah koncentriran okoli 20 krat.

Kakor kontrola so bile celice transformirane s humanim G-CSF cDNA-prostimi plazmidi, supernatanti njihovih kultur pa so bili koncentrirani glede na postopke opisane nadalje. Aktivnosti humanega G-CSF vzorca so bile preiskovane z metodo preiskovanja humane G-CSF aktivnosti (a) opisane prej v tej specifikaciji.

Če je učinkovitost dovolj visoka, se lahko supernatante kultur neposredno preiskujejo brez predhodnega koncentriranja. Rezultati so podani v tabeli 5, kjer so podatki osnovani na koncentracijskih vzorcih.

Tabela 5: Raziskovanja humane G-CSF aktivnosti

Humane nevtrofilne kolonije
	(kolonij	na posodico)
Prečiščeni	humani G-CSF (20 ng)	96
	Kultura celic C127, transformiranih s pdBPV-1 (koncentrirana 20x)	0
BPV	Kultura 3T3 celic, transformiranih s pdBV-1 (koncentrirana 20x)	0
	Kultura C127 celic, transformirana s pTNG-4 (koncentrirana 20x)	82
	Kultura 3T3 celic, transformiranih s pTNG-4	85

-7777

	Kultura CHO celic, transformiranih
s pAdD26SVpA	(koncentrirano 20x)	0
	Kultura CHO	celic transformiranih
dhf r	s pHGG4-dhfr	(20 kratna koncentracija)	110
	Kultura CHO	celic transformiranih
	s pG4DRl (20	kratna koncentracija)	105

Primer 27; Analiza amino kislin in sladkorja (+VSE)

1) Analiza sestave amino kisline

Surovi CSF vzorec dobljen v primeru 26 je bil prečiščen s postopki opisanimi v primeru (iii). Prečiščeni vzorec CSF je bil hidroliziran z rutinskimi postopki , protein dela hidrolizata pa je bil preiskovan preiskovan za amino kislinsko sestavo s posebno metodo analize amino kislin s Hitachi 835 avtomatskim analizerjem amino kislin (proizvajalca Hitachi, Ltd.). Rezultati so prikazani v tabeli 6. Hidroliza je bila vršena pod naslednjimi pogoji:

(I) & N Hcl, 110°C, 24 ur v vakumu (ii) 4 N metansulfonska kislina +0.2% 3-(2-aminoetil)indol·, 110°C, 24 ur, 48 ur, 12 ur, v vakumu.

Vzorec je bil raztopljen v raztopini (1.5 ml), ki vsebuje 40% n-propanola in0.1% trifluoroocente kisline. Alikvote raztopine, vsaka po 0.1 ml, so bile posušene s suhim plinastim dušikom po dodajanju reagensov navedenih v (i) ali (ii), posode z raztopino pa so bile zataljene v vakumu, kar je bilo naalje spremljano s hidrolizo vsebine.

Vsaka izmed vrednosti prikazanih v tabeli 6 je srednja vrednost 4 merjenj, 24 vrednosti za (i) ter 24, 48 in 72 urne vrendosti

-7878 za (ii), z izjemo tega, da vsebujejo Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Val, Ile in Trp, so bili izračunani glede na naslednji postopek (glej Tampaku Kagaku: Protein Chemistry Ii; A course in Biochemical Eksperimenta, Tokyo Kagaku Dohjin);

Za Thr, Ser, 1/2 Cys, Met je časovna odvisnost profila od 24, in 72 urnih vrednosti na (ii) ekstrapolirana na 0 ur.

Za Val in Ile je bila uporabljena 72 urna vrednost za (ii).

Za Trp je bila uproabljena srednja vrednost 24, 48, 72 urnih vrednosti za (ii).

Tabela 6: Podatki analize amino kislin

Amino kisline Mol%

Asp (Asp+Asn) 2.3 Thr 3.9 Ser 8.5 Glu (Glu+Gln) 15.3 Pro 7.4 Gly 7.8 Ala 10.8 1/2 Cys 2.8

Val

4.5

Met

Ile

1.7

2.3

Leu

18.6

Tyr

Phe

1.7

3.4

Lys

His

2.3

2.8

Trp

Arg

1.1

2.8

-7979

2) Analiza vsebnosti sladkorja

Notranji standard (25 nmol inozitola) je bilo dodanega 200 ng prečiščenega CSF vzorca uporabljenega za analizo sestave amino kislin 1). Po dodajanju raztopine metanola (pl), ki vsebuje 1.5 N Hcl, je bila reakcija vršena na 90°C v trajanju 4 ur v prečiščenem N₂ v zaprti epruveti. Epruveta se je nato odprla in dodan je bil srebrov karbonat (Ag₂CO₃) zaradi nevtralizacije vsebine. Nato smo dodali 50 pl acetanhidrida ter epruveto stresali nekaj časa. Epruveta je bila nato prek noči puščena na sobni temperaturi. Zgornji sloj je bil postavljen v epruveto v vzorci in posušen s plinastim dušikom. Oborini je bil dodan metanol, zmes pa je bila nato izprana in centrifugirana na svetlobi. Zgornji sloj je bil dan v isto epruveto vzorcev in je bil posušen. Po dodatku 50 pl TMS reagenta (5:1:1 zmes piridina, heksametil disilizana in trimetilklorosilizana), se je reakcija opravljala na 40°C v trajanju 2 minut, reakcijski produkt pa je bil postavljen v zamrzovalno skrinjo za globoko zamrzovanje. Standard je bil dobljen s kombniranjem 25 nmol inozitola s po 50 nmoli galaktoze (Gal), N-acetil galaktozamina (Gal Nac), sialinske kisline in nekega drugega ustreznega reagenta.

Tako dobljeni vzorci so bili podvrženi plinski analizi pod naslednjimi pogoji:

Stolpec:

Temperatura:

Pogoji analize

2% OV-17 VINport HP, 0.25-0.18 mm, 3 m, steklo zvišana od 110°C na 250°C po 4°C/min.

Nosilni plin (N₂) tlak: začetni 0.12-0.16 Pa

Občutljivost: Tlak:

Vzorec končni 0.2-0.25 Pa

10³ M področje, 0.1-0.4 Voltov H₂, 0.08 Pa zrak, 0.08 Pa

2.5-3.0 pl

-8080

Na ta način sta bila v CSF vzorcu tega izuma identificirana gaiaktozam N-acetil galaktozamin in sialinska kislina.

Primer 28: Pridobivanje pHGV2 vektorja (za uporabo z animalnimi celicami, -VSE linija)

EcoRI fragment dobljen v primeru 10, ki ima cDNA prikazano v sliki 4(A), je bil tretiran z restrikcijskim encimom Dral v trajanju 2 ur na temperaturi 37°C, nato pa s Klenow fragmentom DNA polimeraze I (Takara Shuzo Co., Ltd.) tako, da so se gradili odprti konci. EN mikrogram veziva Bglll (8mer; Takara Shuzo Co., Ltd.) je fosforilizirai z ATP in je bil pripet na okoli 1 pg posebno dobljene zmesi DNA fragmentov. Pripojeni fragmenti so bili tretirani z restrikcijskim encimom Bglll ter so bili nato podvrženi agaroza gel elektroforezi. Nato je bil izoliran le največji DNA fragment.

Ta DNA fragment je bil ekvivalenten z okoli 700 bp, ki vsebuje kodirni del humanega G-CSF. Vektor pdKCR /Fukunaga et al.,

Proč. Natl, Acad. Sci., USA 81, 5086 (1984)/ je bil tretiran z restrikcijskim encimom MaMHI, nato pa defosforiliziran z alkalno fosfatazo (Takara Shuzo Co., Ltd.). Dobljeni vektor DNA je bil pripet na okoli 700 cDNA fragment v prisotnosti T₄DNA ligaze (Takara Shuzo Co., Ltd.), tako da je bil dobljen pHGV2 (slika 17). Kakor je prikazano na sliki 17, vsebuje ta plazmid promotor SV40 predhodnega gena, replikacijo začetne regije SC40 dela, β-globin gena zajca, replikacijo začetne regije pBR322 in pBR322-izvedenega β-laktamaza gena (Amp^r) , s humanim G-CSF genom spojenim pod promotorjem za SV40 predhodni gen.

-8181

Primer 29: Grajenje rekombinantnega vektorja (-VSE) za uporabo v transformiranju celic C127

1) Grajenje pHGV2(H)

Dvajset mikrogramov plazmida pHGV2 (slika 17} dobljenega v primeru 28 se tretira s postopkom opisanim v 1) v primeru 23 tako, da se gradi plazmid imenovan pHGV2(H) (slika 18).

2) Grajenje rekombinantnih vektorjev izražanja pTN-V2, pTNVAa in pTNVAp.

Z uporabo 20 gg pHGV2(H), so bili ponovljeni postopki opisani v 2) v primeru 2 zaradi izbiranja E.coli gojenega plazmida ki ima pHGV2-izvedeno G-CSF cDNA. Ta plazmid je bil imenovan pTN-V2 (slika 18).

Adenovirus tip II /Tampakushitsu, Kakusan Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes), 27, December, 1982, Kyoritsu Shuppan/ so bili podobno tretirani tako, da se dobi plazmid, ApVA, ki vsebuje okoli 1700 bp Sall-Hindlll del, ki vzgaja VAI in VAH ter fragment, ki vsebuje VAI in VAII je bil izločen iz tega plazmida. Ta fragment je bil nameščen v pTN-2 na HindlH mesto, tako da so bili dobljeni pTNVAa in pTNVAp (slika 18). Zaradi VA gena adenoviroze je ta plazmid sposoben ojačati izražanje transkripcije produkta iz predhodnega promotorja SV40.

Primer 30: Transformiranje celic C127 in G-CSF izražanje v (-VSE) pTN-V2 dobljen v primeru 29 je bil tretiran z restrikcijskim encimom BamHI, preden je bil uporabljen za transformiranje celic miši C127.

Celice C127 miši so bile transformirane s tako dobljeno DNA zaradi izražanja G-CSF (glej primer 24), izbrani pa so bili kloni, ki posedujejo visoko hitrost proizvodnje G-CSF. Ti kloni proizvajajo G-CSF z okoli 1 mg/1.

-8282

Z nadaljnjim kloniranjem se lahko izolirajo kloni s sposobnostjo proizvajanja G-CSF od okoli 10 mg/1. Na podoben način se C127 celice transformirajo z pTNVAa in pTNVAp dobljene v primeru 29, izbrani pa so transformanti za klone, ki imajo visoko sposobnost G-CSF produkcije; tako se lahko dobijo kloni z pTNVAa, ki so sposobni proizvesti G-CSF v doprinosu okoli 20 mg/1 ali več, medtem, ko se z pTNVAp dobijo kloni, ki posedujejo nižjo produktivnost (nekaj mg/1). Razen celic C127 se lahko uporabljajo tudi NIH3T3 celice.

Primer 31: Izražanje G-CSP v CHO celicah (-VSE)

1) Grajenje pHGV2-dhfr

DNA fragment dolžine okoli 2.7 kbp je bil pridobljen iz 20 gg plazmida pHGV2 (primer 28) s postopki opisanimi v 1) v primeru 25. Ta fragment (0.5 gg) in EcoRI fragment pAdD26SVpA (0.5 gg) se PREKALIJO. Dobljeni plazmid se uporabi za transformiranje E.coli vrste DH1 v postopku, ki uporablja rubidijev klorid, nato pa so bile izbrane kolonije, ki vzgajajo pHGV2-dhfr plazmid. Dobljeni plazmid je bil imenovan pHGV2-dhfr (slika 19a) .

Alternativni postopek je naslednji: plazmid pHGV2 tretiramo s Šali, da se delno razgradi z EcoRI brez pripenjanja nekega veziva EcoRI. DNA fragment dolžine okoli 2.7 kbp se izplira in tretira s Klenow fragmentom E.coli DNA polimeraze tako, da se gradijo odprti konci. Odprti konci EcoRI fragmenta se pridobijo iz pAdD26SVpA, kakor bo to opisano naprej. Ta EcoRI fragment in ločeno pripravljen fragment (dolžine okoli 2.7 kbp) se tretirajo s T₄DNA ligazo tako, da se gradi pHGV2-dhfr. pHGV2 (H) dobljen v 1) v primeru 29 se tretira z restrikcijskim encimom Hindlll in Sandll, kakor je bilo opisano v 2) v primeru 29, nato pa se Hindlll-Sall fragment pričvrsti na odprte konce EcoRI fragmenta pAdD26SVpA opisanega naprej. Ta metoda se lahko uporabi tudi za pripravljanje pHGG4-dhfr (slika 19b).

-8383

2) Grajenje pV2DRl in pV2DR2

Deset mikrogramov plazmida pAdD26SVpA omenjenega vi) je bilo raztropljenega v 50 ml reakcijske raztopine, ki vsebuje 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl₂, 100 mM NaCI, 7 mM 2merkaptoetanola in 0.01% BSA. Reakcija se je izvajala na 37°C v treajanju 10 ur v prisotnosti 10 enot vsakega izmed naslednjih encimov: EcoRI in BamHI. Nato je prišlo na vrsto tretiranje s fenolom in izpiranje z etrom, ki sta se vršila po rutinskih postopkih. DNA fragment dolžine okoli 2 kbp je bil izoliran z elektroforezo skozi 1% agaroza gel· z nizko točko topljenja. Izolirani DNA fragment je bil tretiran s Klenov/ fragmentom DNA polimeraze z rutinskim postopkom, tako da so se gradili odprti konci. DNA fragment odprtih koncev je bil podvržen tretiranju s fenolom, izpiranju z etrom in obarjanju z etanolom.

Deset mikrogramov plazmida pHGV2(H) dobljenega v 1) v primeru 29 smo raztopili v 50 μΐ reakcijske raztopine, kije vsebovala 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl₂ ter 60 mM NaCI. Reakcija je bila izvajana pri 37°C v trajanju 6 ur v prisotnosti 10 enot Hindlll. DNA fragment je bil izoliran z elektroforezo skozi 1% agaroza gel z nizko točko topljenja, v rutinskih postopkih. Izolirani fragment je bil nato tretiran z BAP, odprti konci pa so bili nadgrajeni v obravanju s Klenov/ fragmentom. Prek tretiranja s fenolom in izpiranja z etrom je bil DNA fragment pričvrščen na odprte konce predhodno dobljenega 2-kb DNA fragmenta s T₄DNA ligazo v naslednjem postopku: 1 gg vsakega fragmenta je bil raztopljen v 30 gl reakcijske raztopine, ki ej vseboval 66 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6.6 mM MgCl₂, 5 mM DTT in 1 mM ATP. Reakcija se je vršila pri 6°C v trajanju 6 ur v prisotnosti 50 enot T₄DNA ligaze. Produkt vezanja je bil uporabljen za transformiranje E.coli vrste >DH1. Na ta način so bili dobljeni pV2DRl in pV2DR2, prikazani na sliki 19c.

3) Transformiranje in izražanje

-8484

CHO celice so bile transformirane s plazmidom pHGV2-dhfr za izražanje G-CSF, s postopki opisanimi v 3) v primeru 25. Transformiranje CHO celic se lahko iz vrši tudi s kontratransformacijo s pHGV2 in pAdD26SVpA.

CHO celice so bile transformirane z naslednjim postopkom: pV2DRl ali pV2DR2, ki sta bila pridobljena v 2), sta bil predhodno respektivno tretirana s Šali in KpmI, tako da so bili dobljeni fragmenti DNA. 10 gg teh fragmentov je bilo uporabljenih za transformiranje CHO celic kakor bo opisano naprej; transformirane celice so bile podvržene nadaljevanemu kultiviranju v seriji selektivnih okolij, na način, ki bo opisan naprej, okoli 7 dni kasneje pa se je na pladnju pojavilo ne manj kakor 100 ločenih kolonij; te kolonije so bile masovno prenešenena svež pladenj, kjer so bile podvržene nadaljevanemu kultiviranju v serijah selektivnih okolij v prisotnosti 0.01 μΜ ΜΤΧ, dokler se ni pojavilo 10 neparnih kolonij, enaki postopki so bili ponovljeni s koncentracijami ΜΤΧ, ki so bile serijsko višane do 0.02 μΜ, 0.05 μΜ in 0.1 μΜ. Nato so se preživele kolonije izolirale. Selekcija kolonij se lahko vrši na enak način celo, če je 10 neparnih kolonij dobljeno z individualno selekcijo in se jih podvrže kultiviranju z rastočimi mTX koncentracijami.

Rekombinantni vektor, ki goji policistronski gen, se prav tako lahko uporabi za transformiranje CHO celic. Primer alternativne metode je nasieddnji: pAdD26SVpA se tretira s Pstl, nakar se izolirata dva fragmenta, ki se pričvrstita na pBRV2-izveden CSF cDNA fragment tako, da gradijo rekombinantne vektor kjer so virus promotor, CSF cDNA, DHFR in poli (A) namesto SV40 nameščeni v opisanem zaporedju. Ta rekombinantni vektor se nato uporablja za transformiranje CHO celic.

-8585

Primer 32: Preiskovanje G-CSF aktivnosti (-VSE)

S postopki opisanimi v primeru 26, humani G-CSF pridobljen iz supernatanta kulture celic C127 in CHO celic, ki so bie respektivno dobljene v primerih 30 in 31. Humana G-CSF aktivnost vsakega izmed dobljenih vzorcev je bila preiskovana po vzoru v primeru 26. Rezultati so prikazani v tabeli 7.

Tabela 7: Preiskovanje humane G-CSF aktivnosti

Humane nevtrofilne kolonije (kolonij na posodico)

Prečiščeni humani G-CSF (20 ng) 96

	Kultura C127 transformirana
s pdBPV-1 (koncentrirano 20x)	0
BPV	Kultura 3T3 celic transformiranih s pdBPV-1(koncentrirano 20x)	0
	Kultura C127 celic transformiranih s pTN-V2 (koncentrirano 20x)	107
	Kultura 3T3 celic transformiranih s pTN-V2 (koncentrirano 20x)	103
	Kultura CHO celic transformiranih s pAdDSV26pA (koncentrirano 20x)	0
dhf r	Kultura CHO celic transformiranih s pHGV2-dhfr (koncentrirano 20x)	ni

-8686 dhf r

Kultura CHO celic transformiranih s pV2DRl (koncentrirano 20x)

113

Primer 33: Analiza amino kislin in sladkorja (-VSE)

1) Analiza sestave amino kisline

Surov CSF vzorec dobljen v primeru 32 je bil prečiščen po postopkih opisanih v primeru 2(iii) . Prečiščen vzorec je bil nato poslan v analizo amino kislinske sestave prek postopkov opisanih v 1) v primeru 27. Rezultati so prikazani v tabeli 8.

Tabela 8: Rezultati amino kislinske sestave:

Amino kisline Mol%

Asp (Asp+Asn) 2.3 Thr 4.0 Ser 8.1 Glu (Glu+Gln) 15.1 Pro 7.5 Gly 8.0 Ala 10.9 1/2 Cys 2.8 Val 3.9 Met 1.7 Ile 2.3 Leu 18.9 Tyr 1.7 Phe 3.5 Lys 2.3 His 2.9 Trp 1.2 Arg 2.9

-8787

2) Analiza sestave sladkorja

Prečiščen CSF vzorec uproabljen v analizi sestave amino kislin v 1) je bil poslan tudi v analizo vsebnosti sladkorja, ki uporablja iste postopke in pogoje, kakor je bilo opisano v 2) v primeru 27. Na ta način je bila potrjena v vzorcu tega izuma prisotnost galaktoze, N-acetil galaktozamina in sialinske kisline.

Primer 34: Grajenje rekombinantnega vektorja, ki vsebuje kromosomski gen za izražanje v COS celicah

Plazmid pBRCE3p, ki je bil dobljen v primeru 11 in ki vsebuje kromosomski gen prikazan na sliki 5 je bil tretiran z EcoRI. pSVH⁺K⁺ plazmid, ki ga je opsial Banerji et al., in Celi, 27,

299 (1981) je bil tretiran s KpnI, da bi s tem odstranili globinski gen. Plazmid je bil nato podvržen delni razgradnji s Hindlll zaradi odstranjevanja dela zaostalega gena SAMO. Fragmenti so bili ponovno spojeni tako, da je bil dobljen vektor izražanja pML-E⁺.

Ta vektor je bil tretiran z restrikcijskim encimom EcoRI, nato pa defosforiliziran z alkalno fosfatazo (Takara Shuzo Co.,

Ltd), tako da je bil dobljen vektor DNA, ki je bil pričvrščen na zgoraj omenjeno kromosomsko DNA s pomočjo T₄DNA ligaze (Takara Shu2o Co., Ltd), tako da je bil dobljen pMLCE3. Kakor je prikazano na sliki 20, vsebuje ta plazmid ojačevalec gena SAMO, repliko začetka SAMO, repliko začetka pBR322 in pBR322izvedeno β-laktamaza gen (Amp^r) ter humani G-CSF kromosomski gen pričvrščen pod ojačevalcem SAMO gena.

Primer 35: Izražanje humanega G-CSF kromosomskega gena v COS celicah

COS-1 celice (dobljene zahvaljujoč ljubeznivosti Dr. Giuzman-a iz Cold Spring Harbor Laboratory, USA), ki so zrastle do gostote približno 70% v Petri skodelicah (premera 9 cm, Nune) z

-8888 uprabo DMEM okolja (Dulbec-ova modifikacija Eagle-ovega okolja nabavljenega pri Nissui Seiyaku K.K. pod trgovskim imenom Nissui”), ki vsebuje 10% seruma teleta, so bile transformirane v postopku, ki uporablja kalcijev fosfat /Wigler et al., Celi, 14, 725 (1987)/ ali pa DEAE-dekstran: klorihinska metoda /glej , na primer, Gordon et al., Science, 228, 810 (1985)/. Tansformiranje v postopku s kalcijevim fosfatom se je vršilo kakor sledi: 160 gg plazmida pMLCE3 dobljenega v primeru 34 je bilo raztopljenega v 320 gg TE raztopine, po dodajanju destilirane vode (3.2 ml) pa je bilo dodanega še 504 gl 2 M CaCl₂.

V dobljeno raztopino smo dodali še 4 ml 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1.5 mM fosfatnega pufra s pH 7.12), nakar je bila zmes hlajena v ledu tokom 20-30 minut. Ohlajena zmes je bila po kapljicah dodana okolju v količini 1 ml na Petri skodelico, kjer so se vzgajale COS-1 celice. Po 4 urnem kultiviranju pri 37°C v C0₂ inkubatorju, so bile celice izprane z DMEM okoljem brez seruma, nato pa so bile puščene stati okoli 3 minute na sobni temperaturi v 5 ml DMEM okolja, ki vsebuje 20% glicerola. Končno so bile ponovno izprane z DMEM okoljem brez seruma. Po odstranjevanju DMEM okolja, ki ne vsebuje seruma, je bilo dodanega še 10 ml DMEM okolja, ki vsebuje 10% seruma teleta, nato pa se je kultiviranje vršilo prek noči v C0₂ inkubatorju. Okolje je bilo nato zamenjano s svežim okoljem istega tipa, kultiviranje pa se je nadaljevalo še 3 dni.

Transformiranje z metodo DEAE-dekstrana:klorohina je bilo izvršeno na naslednji način: Kakor v postopku s kalcijevim fosfatom, so bile COS-1 celice kultivirane tako, da so izrastle do gostote 70%, nato pa so bile dvakrat izprane zu DMEM okoljem, ki ne vsebuje seruma; izpranim celicam je bilo dodano DMEM okolje, ki ni vsebovalo seruma, je pa vsebovalo 250 gg/ml DEAE-dekstrana in 2 gg /ml plazmida pMLCE3 dobljenega v primeru 34. Kultiviranje se je nato vršilo na 37°C v trajanju

-8989 ur; nato so bile celice izprane dvakrat z DMEM okoljem, ki ni vsebovalo seruma, nakar so bile podvržene nadaljnji kultivaciji na 37°C v trajanju 2 ur v DMEM okolju, ki vsebuje 10% seruma teleta in 1 mM klorohina; nato so bile celice dvakrat izprane z DMEM okoljem brez seruma in kultivirane na 37°C še tri dni v DMEM okolju, ki je vsebovalo 10% seruma teleta,

Supernatant tako dobljene kulture COS-1 celic je bil nastavljen na pH 4 z IN ocetno kislino. Po doajanju istega volumna n-propanola je bila dobljena oborina odstranjena s centrifugiranjem. Supernatant je bil prepuščen prek odprtega stolpca, premera 1 cm in dolžine 2 cm, ki je bila napolnjena s C8 reverzno-faznim nosilcem (Yamamura Kagaku K.K.), eluiranje pa se je izvršilo s 50% propanolom. Eluat je bil nato razredčen dvakrat z vodo, nakar je bil podvržen reverzno fazni HPLC na YMC-C8 stolpcu (Yamamura Kagaku K.K.) z eluiranjem z npropanolom (30.60% linearnega gradienta gostote), ki je vseboval 0.1% TFA. Frakcije, ki so bile eluirane z n-propanolom s koncentracijami okoli 40% so bile izolirane, suho zamrznjene in raztopljene v 0.1M glicidnem pufru (pH 9). Kot rezultat tega postopka je bil humani G-CSF v supernatantu kultuire COS-1 celic koncentriran okoli 20 krat.

Kakor kontrola so bile COS-1 celice transformirane z G-CSF hromosomskim genom prosti pML-E⁺ z zgoraj opisanimi postopki. Supernatant dobljene kulture je bil nato koncentriran.

Humana G-CSF aktivnost dobljenih vzorcev je bila raziskovana s pomočjo Method of Human G-CSF Activity Assay (a) opisanim predhodno v tej specifikaciji. Rezultati so podani v tabeli 9.

-9090

Tabela 9

Humane nevtrofilne kolonije
	(kolonij	na posodico)
Prečiščeni humani G-CSF		18
Kultura COS celic, transformiranih s pML-E+ (koncentrirano 20x)		0
Kultura COS celic transformiranih s pMLCE3a (koncentrirano 20x)		23
Kultura COS celic transformiranih s pMLCE3a (koncentrirano 20x)	19

Primer 36: RNA analiza G-CSF (kromosomskega gena)

COS celice kultivirane do koncentracije 8 χ 10⁶ celic na pladenj (premera 9 cm) so bile transformirane z 80 μς piazmida pMLCE3a. Po 48 urah, je bila skupna RNA dobljena glede na postopek Chirgwin-a /Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)/. Plazmid pBRG4 dobljen v primeru 9 je bil razklenjen z restrikcijskim encimom Ahalll. Tako dobljen pBRG4-izvedeni DNA fragment je bil radioaktivno obeležen z /γ³²-Ρ/ΑΤΡ z uporabo T polinukleotidne kinaze, tako da je bil dobljen okoli 2.8 kb fragment, ki je vseboval G-CSF cDNA. Fragment je bil izoliran in uproabljen kakor DNA sonda. Po denaturaciji DNA sonde (1.5 x 10⁵ Č.p.m., 2.8 x 106 č.p.m./ pg DNA), je bila ta zmešana z 20 pg skupne RNA dobljene iz COS celic s hibridizacijo v trajanju 15 ur. Zmes je bila razgrajena 2 200-400 enotami/ml Sl nukleaze (p.L. Biochemicals) glede na postopek Weaver in Weissmann /

-9191

Nucleic Acid Res., 7, 1175-1193 (1979), kar je bilo spremljano s 4% poliakrilamid gel elektroforezo v prisotnosti 8.3 M uree. Nato je bila izvršena detekcija s pomočjo avtoradiografije.

Pri tem je bila opažena vrvica, ki ustreza 722 bp, kakor močno radioobeležena vrvica v COS celicah, prav tako pa je bila detektirana tudi ustrezajoča vrvica za 487 bp.

Zato je bilo ugotovljeno, da RNA COS celic vsebuje G-CSF +VSE in -VSE linije.

Primec 37: Analiza amino kisline in analiza sladkorja (kromosomskega gena)

Surovi CSF vzorec dobljen v primeru 35 je bil prečiščen glede na postopke opisane v primeru 2 (iii). Prečiščeni CSF vzorec je bil podvržen analizi sestave amino kislin s postopki opisanimi v 1) v primeru 27. Rezultati so opisani v tabeli 10.

Tabela 10: Podatki analize amino kislin:

Amino kisline	Mol%
Asp (Asp+Asn)	2.3
Thr	4.9
Ser	8.3
Glu (Glu+Gln)	15.3
Pro	7.4
Gly	7.9
Ala	10.8
1/2 Cys	2.8
Val	4.3
Met	1.7
lle	2.3
Leu	18.7
Tyr	1.7
Phe	3.4
Lys	2.3

-9292

His

Trp

Arg

2.9

1.1

2.9

2) Analiza sestave sladkorja

Prečiščeni vzorec uporabljen v analizi sestave amino kislin v

1) je bil prav tako podvržen tudi analizi sestave sladkorja z enakimi postopki in enakimi pogoji, kakor so opisani v 2) v primeru 27. KoT rezultat te analize je bila potrjena prisotnost galaktoze, N-acetil galaktozamina in sialinske kisline v CSF vzorcu tega izuma.

Primer 38: Izražanje humanega G-CSF kromosomskega gena v C127 celicah

Plazmid pMLCEa dobljen v primeru 24 je bil tretiran z EcoRI, nato pa je bil s postopki opsianimi v Molecular Cloning, isto, izločen fragment dolžine okoli 4 kbp. Izolirani fragment je bil uporabljen kakor izvor kromosomskega G-CSF gena.

Fragment je bil tretiran s Klenow fragmentom DNA polimeraze I tako, da so se gradili odprti konci (A).

Promotor SV40 (okoli 0.4 kb EcoRI-EcoRI fragment) je bil izsekan od plazmida pHGA410 (dobljenega v primeru 22) s postopki opisanimi v Molecular Cloning, isto, nato pa je bil tretiran s Klenov/ fragmentom DNA polimeraze (B).

V ločeni stopnji je bil plazmid pdBPV-1, ki ima papilloma virus goveda(BPV) /ta plazmid je bil dobljen zahvaljujoč ljubeznivosti dr.Howley-a in je bil opisan v Sarver N., Sbyrne, J.C. & Howley, P.M. Proč. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 7147-7151 (1982)/ tretiran s Hindlll in PvulI, tako da je bil dobljen DNA fragment dolžine okoli 8*4 kbp. Ta fragment je bil nato tretiran s Klenov/ fragmentom DNA polimeraze I in nato defosfoliriziran z bakterijsko alkalno fosfatazo (C).

-9393

DNA fragmenti (A), (B), (C), vsak z maso 0.1 pg je bil raztopljen v 20 pl reakcijske raztopine /50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP/, nakar je bila reakcija izvajanja prek noči na 4°C v prisotnosti 180 enot T₄DNA ligaze. Reakcijska raztopina je bila nato tretirana z rubidijevim kloridom v postopku opisanem v Molecular Cioning, isto, tako da je bil dobljen plazmid pTNCE3a (slika 21).

DNA fragment (A), ki je bil uporabljen kakor izvor kromosomskega G-CSF gena se lahko zamenja z DNA fragmentom dolžine okoli 1.87 kbp, ki je bil dobljen po naslednjih postopkih: 20 pg pMLCE3a je bil raztopljen v 100 pl zmesi 10 mM Tris-HCl (pH 8), 7 mM MgCl₂, 100 mM NaCI, 7 mM 2merkaptoetanola in 0.01% BSA; raztopina je bila inkubirana na 37°C 5 ur v prisotnosti 20 enot Stul, nakar je bila podvržena elektroforezi skozi 1.2% agarozni gel.

Tako dobljen plazmid pTNCE3a je bil uporabljen za transformiranje C127 celice miši kakor v primeru 24. Izolirani so bili kloni, ki izražajo humani G-CSF kromosomski gen in ki imajo visoko kapaciteto za proizvajanje G-CSF.

Primer 39: Izražanje humanega G-CSF kromosomskega gena v CHO celicah

Kakor v primeru izražanja v C127 celicah, se plazmid pMLCE3a tretira s Stul, nakar se izloči DNA fragment dolžine okoli 1.78 kbp; alternativno se isti plazmid tretira z EcoRI in izloči se EcoRI fragment dolžine okoli 4 kb. Oba fragmenta sta ugodna kakor izvor kromosomskega G-CSF gena.

Izvor fragmenta se tretira s Kienowim fragmentom DNA polimeraze I (a) .

-9494

Kakor v primeru 38, se promotor SV4 0 (EcoRI-EcoRI fragment) izseka iz pHGA410 tako, da se dobi fragment dolg okoli 0.4 kbp, ki se podobno tretira s Klenow fragmentom DNA polimeraze (b).

V ločeni stopnji, se plazmid pAdD26SVpA /Kaufman, R.G.& Sharp, P.A., Mol. Celi. Biol., 2, 1304-1319 (1982)/ tretira z EcoRI, nato pa s Klenov/ fragmentom DNA polimeraze nakar se ga končno defosforilizira s obdelavo z bakterijsko alkalno fosfatazo (c). Fragmenti (a), (b) in (c), vsak z maso 0.1 μς se raztopijo v 20 μΐ reakcijske zmesi /50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP/ nakar se reakcijo pusti izvajati preko noči na 4°C v prisotnosti 180 enot T₄DNA ligaze. Reakcijska zmes se nato tretira z rubidijevim kloridom v postopku opisanem v Molecular Cloning, isto, tako da se transformirajo E.coli vrste DH1. Dobljene Tet^r kolonije se testirajo za vsebnostjo pD26SVCE3a. Kot je prikazano na sliki 22, ima plazmid pD26SVCE3a CSF gen povezan na zgodnji SV40 gen ter dhfr gen vezan pod principalno zadnjega promotorja adenoviroze.

Plazmid pAdD26SVpA je bil tretiran z EcoRI in BamHI kakor v 2) v primeru 25, tako da je bil dobljen DNA fragment (okoli 2 kb), ki vsebuje dhfr gen. Ta gen je vezan na fragment (a) in EcoRISall fragment pHGA410 (H), tako da se gradi Amp^r vektor izražanja pDRCE3a (slika 22) .

CHO celice se s tako dobljenimi plazmidi pD26SVCE3a in pDRCE3a transformirajo, kakor v primeru 25. S ponovljeno selekcijo skozi rast v prisotnosti ΜΤΧ klonov se dobi vrsta, ki producira G-CSF.

Primer 40: Preiskovanje G-CSF aktivnosti transformantov (ki izražajo kromosomski gen)

Supernatanti kultur celic C127 in CHO celic, ki so bili dobljeni v primerih 38 in 39, so bili obdelani kakor kaže

-9595

primer 26, tako, da je bil dobljen humani G-CSF katerega aktivnost je bila preiskana. Rezultati so prikazani v spodnji tabeli 11.
Tabela 11:	Preiskovanje humane G-CSF aktivnosti
Humane nevtrofilne kolonije (kolonij/posodico)
Prečiščeni	humani G-CSF (20 ng)	85
	Kultura C127 celic, transformiranih s pdBPV-1 (koncentrirano 20x)	0
BPV	Kultura C127 celic, transformiranih s pTNCE3a (koncentriranih 20x)	83
	Kultura CHO celic transformiranih s pAdD26SVpA (koncentr. 20x)	0
dhf r	Kultura CHO celic transformiranih s pD26SVpA (koncentr. 20x)	85
	Kultura CHO celic transformiranih s pDRCE3a (koncentr. 20x)	86

Primer 41: Molekulska masa in izoelektrična točka transf ormantov

Prečiščeni CSF vzorci uporabljeni v analizah sestave amino kislin v primerih 16, 20, 27, 33 in 37 so bili podvrženi

-9696 merjenju molekulskih mas in izoelektričnih točk z uporabo naslednjih postopkov.

1) Molekulska masa

Molekulska masa CSF-ja je bila določena z natrijevim dodecilsulfatpoliakriiamidno gel elektroforezo (SDE-PAGE). Oprema za elektroforezo je bila PROTEAN™ (16 cm, proizvod Biorad Corp.) z uporabo gela izdelanega Iz gela poliakrilamidne plošče (T=15%, C=2.6%) dimenzij 140 mm x 160 mm x 1.5 mm in koncentratra gela (T=3%, C=20%). Denaturirani CSF vzorec je bil dobljen po naslednjem postopku: CSF je bil kultiviran 3 minute v raztopini, ki je vseboval 2% natrijevega dodecilsulfata v 0.46 M 2-merkaptoetanolu. Po opravljanju elektroforeze z 4 pg vzorca s konstantnim tokom 30 mA v trajanju 4 ur , je bil gel ločen in obarvan s 0.24% Cpomassie Brilliant Blue R 250 (proizvod firme Sigma Chemical Co.) za detekcijo traku. Naslednje substance so bile uporabljene kakor oznake molekulske mase po podobnih tretmanih: fosforilaza B (mol. mase 92500), albuminski serum goveda(BSA, mol.m. 67000) ovalbumin (OVA, mol.m. 45000), ogljikova anhidraza (mol.m. 31000), sojin tripsin inhibitor (mol.m. 21500) ter lizocim (mol.m. 14400).

Na ta način je bila enojna vrvica, ki je odgovarjala molekulski masi 185000+/-1000 identificirana za vsaekga od CSF vzorcev dobljenih v primeru 18 (E.coli cDNA (+VSE)) in primeru 20 /E.coli cDNA (-VSE)/; ter enojna vrvica, ki je odgovarjala molekulski masi 19000+/-1000 in je bila identificirana za vsak vzorec dobljen v primeru 27 /C127, CHO/cDNA (-VSE)/, primer 33 /C127, CHO/cDNA (-VSE) in primer 37 (COS/gDNA).

2) Izoelektrična točka

Izoelektrična točka CSF tega izuma je bila določena s pomočjo RAVNOG POSTOLJA, izoelektrične aparature, FBE-3000 (proizvod Pharmacia Fine Chemicals). Po dveh urah elektroforeze pri konstantni moči 30 W (Vmax=2000 V) na poliakrilamidnem gelu

-9797 (Τ=5%, 03%, 115 mm χ 230 mm), ki vsebuje Framalit (pHM-6.5, Pharmacia Fine Chemicals) in 4 M uree, se CSF fiksira s 30% metanolom/ 10% trikloroocetno kislino/ 35% sulfosalicilno kislino, ter se obarva s Coomassie Brilliant Blue R-250. Nizek pl kit (pH: 2.5-6.5, proizvod Pharmacia Fine Chemicals) se uporablja kakor marker izoelektrične točke.

Analiza razdvojevanja trakov pri pH od 4 do 6.5 daje enojno vrvico, ki ustreza pl)6.1 za vsakega od CSF vzorcev dobljenih v primerih 16 in 20, ter daje tri ločene trakove, ki odgovarjajo za pl=5.5, 5.8 in 6.5 ta vsakega izmed vzorcev dobljenih v primerih 27, 33 in 37.

Primer 42: Zaščitni efekt humanega G-CSF proti mikrobiološkim infekcijam

Metoda raziskovanja

1) Zaščita proti infekciji s Pseudomas aeruginosa

Endoksan (blagovna znamka proizvajalca Shinogi & Co., Ltd.) je bil vnesen interaperionalno v 8-9 tednov stare miši (samci; 35.3+/-1.38 g telesne teže) v dozi 200 mg/kg. Miši so bile nato razdeljene v tri skupine (dve skupini sta dobili podkožno 4 injekcije topljenca (doze 0.1 ml) na vsakih 24 ur/ 1% propanol in 0.5% (x/v) albumin seruma miši v fiziološki raztopini), ki vsebuje humani G-CSF (25000 ali 50000 enot na miš), med tem ko je bil dano drugi skupini le topilo po istem razporedu. Tri ure po zadnji injekciji so bile miši vsake skupine inficirane s Pseudomonas aeruginosa GNB-139 s podkožno injekcijo (3.9 x 105 CFU/ miš). Enaindvajset ur po inficiranju je bila dana mišim prve skupine druga podkožna injekcija toila, ki je vsebovalo humani G-CSF (250000 ali 50000 enot/miš), drugi skupini pa je bilo dano le topilo.

Zaščitni efekt humanega G-CSF je bil ugotovljen s štetjem števila miši, ki so ostale žive 10 dni po inficiranju.

-9898

Priprava suspenzij celic

Pseudomonas aeruginosa GNB-139 je bila kultivirana prek noči z mešanjem pri 37°C v srčnem infuzijskem tekočem sredstvu znamke Difco (blag. znamka: Op. prev). Kultura je bila suspendirana v fiziološki slani raztopini.

2) Zaščita proti infekciji s Candida

Endoksan je bil vnesen intraperitonealno v 8 tednov stare ICR miši (samci; 40.5+/-1.6 g telesne teže) v dozi 200 mg/kg. Miši so bile razdeljene v dve skupini; eni skupini so bile dane 4 podkožne injekcije raztopine topila (1% propanoi in 10% m/v)

ICR seruma miši v fiziološki raztopini /ki je vseboval Humani G-CSF (50000 enot na miš)(doze 0.1 ml) na vsakih 24 ur, medtem, ko je bilo drugi skupini dano le topilo v istem razporedju. Štiri ure po zadnji injekciji, so bili miši vsake skupine inficirane s Candida albicans U-50-1 (vrsta izolirana iz urina ali levkemičnih pacientov; zahvaljujoč ljubeznivosti

Bakteriološkega laboratorija, Tohoku University, Schooi of medicine) z intravenozno injekcijo (5.6 χ 10⁵ CFU/miš).

Zaščitni efekt humanega G-CSF je bil raziskovan s štetjem miši, ki so bili živi deset dni po inficiranju.

Pripravljanje suspenzije celic

Candida albicans U-50-1 je bila kultivirana prek noči na 37°C s stresanjem, v ekstraktu kvasa, ki vsebuje Sabouraud-tekoče okolje (2% dekstro2e iz Junsei Pure Chemicals Co., Ltd.; Triptokase Peptona, trgovsko ime BBL; 5% ekstrakta kvasa od Difco; pH 5.6). Kultura je bila dvakrat izprana s fiziološko raztopino in suspendirana v fiziološko raztopino.

-9999

3) Zaščita proti infekcijam z intraceličnim parazitno Listeria Endotoksan (blagovna znamka proizvajalca Shinogi & Co., Ltd.) je bil vnesen intraperitonealno v 7-tednov stare ICR miši; 34, 7+/-1, 24 g telesne teže) v dozi 200 mg/kg. Miši so bile razdeljene v dve skupini; eni skupini so bile dane 4 podkožne injekcije, 0.1 ml doza) na vsakih 24 ur raztopine /1% npropanola in 10% (m/v) ICR seruma miši v fiziološki raztopini/, ki vsebuje humani G-CSF (50000 enot/miš), med tem, kc je bilo drugi skupini dano le topilo po istem razporedu. Štiri ure po zadnji injekciji so bile miši vsake skupine inficirane z Listeria monocytogenees 46 (zahvaljujoč ljubeznivosti Mikrobiološkega laboratorija, Tohoku University, School of medicine) z intravenoznimi injekcijami velikosti 1 χ 10⁷ CFU/miš. zaščitni efekt humanega G-CSF je bil ugotovljen s štetjem miši, ki so bile žive 12 dni po inficiranju.

Pripravljanje suspenzije celic

Disteria monocytogenes 46 se preko noči z mešanjem na 37°C kultivira v Možgansko-srčnem infuzijskem tretjem okolju Difco. Kultura se suspendira v fiziološko raztopino.

Rezultati:

i) Raziskave 1, 2 in 3 so bile izvedene z E.coli G-CSF (+VSE) polipeptidom pridobljenim v primeru 16. Rezultati so prikazani v tabelah 12, 13 in 14.

-100100

Tabela 12: Učinek proti Pseudontonas aeruginosa

Skupina	CSF koncentracija (enota miš/dni)	Žive miši/ preiskane miši
Topilo	0	0/10
CSF-ki vsebuje topilo	25.000	6/8
CSF-ki vsebuje topilo	50.000	8/10

Tabela	13: Učinek proti Canrii da a1bičana
Skupina	CSF koncentracija	Žive miši/
	(enota/miš/dan)	preiskane miši
Topilo	0	0/10
CSF-ki	vsebuje topilo 50.000	10/10

Tabela	14: Učinek proti Listeria monocytogenes
Skupina	CSF koncentracija		Žive miši/
	(enota/miš/dan)	preiskane miši
Topilo	0		0/10
CSF-ki	vsebuje topilo 50.000		10/10

ii) Preiskavo 1 smo izvedli z E.coli G-CSF (-VSE) polipeptidom dobljenim v primeru 20. Rezultati so prikazani v tabeli 15.

-101101

Tabela 15: Učinek proti Pseudomonas aeruginosa

Skupina

CSF koncentracija (enota/miš/dan)

Žive miši/ preiskane miši

Topilo 0 CSF-ki vsebuje topilo 25.000 CSF-ki vsebuje topilo 50.000

0/10

6/10

8/10 iii) Preiskava 1 je bila izvedena z iz CHO celic izvedenim prečiščenim humanim G-CSF vzorcem (+VSE), ki je bil isti kakor tisti uporabljen v analizi aminokislinske sestave v primeru 27. Rezultati so prikazani v tabeli 16.

Tabela 16: Učinek proti Pseudomonas aeruginosa

Skupina

CSF koncentracija (enota/miš/dan)

Žive miši/ preiskane miši

Topilo 0 CSF-ki vsebuje topilo 25000 CSF-ki vsebuje topilo 50000

0/10

9/10

10/10

V bistvu enake rezultate dobimo, če raziskavo 1 opravimo s C127 izvedenimi celicami, prečiščenega humanega G-CSF vzorca (+VSE), ki je enak tistemu uporabljenemu v analizi amino kislinske sestave v primeru 33. Rezultati so prikazani v tabeli 17.

-102102

Tabela 17: Učinek proti Pseudoroona aeruginosa

Skupina	CSF koncentracij a (enota/miš/dan)	Žive miši/ preiskane miši
Topilo	0	0/10
CSF-ki vsebuje	topilo 25.000	9/10
CSF-ki vsebuje	topilo 50.000	10/10

V bistvu enake rezultate smo dobili, ko smo preiskavo 1 izvršili s C127 izvedenimi celicami prečiščenega humanega G-CSF vzorca, ki je bil enak tistemu uporabljenemu v analizi amino kislinske sestave v primeru 33.

Claims (57)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Gen, značilen po tem, da je kodirni gen za polipeptid, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti za kolonijo humanega granulocita.
2. 2. Gen, po zahtevku 1, značilen po tem, da je DNA komplementarna z kirirsko RNA, ki se pridobi kakor 15. do 17. frakcija centrifugacijskega gradienta gostote saharoze in, ki kodira polipeptid, ki vsebuje stimulacijski faktor za kolonijo humanega granulocita.
3. 3. Gen po zahtevku 1, značilen po tem, da je to humani kromosomski gen.
4. 4. Gen po zahtevku 3, značilen po tem, da omenjeni kromosomski gen vsebuje nukleotidni niz, ki sodeluje v transkripcijski kontroli.
5. 5. Gen po zahtevku 1, ki kodira celoten ali le del polipeptida, značilen po tem, da ima naslednji niz:

   Met Ala Gly Pro Ala Thr Gin Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gin Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gin Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Giy Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu {Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala

   -104104

   Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val· Ser Tyr

   Arg Val Leu Arg His Leu Aia Gin Pro
6. 6.Gen po zahtevku 1, ki kodira celoten ali del polipeptida, značilen po tem, da ima omenjeni polipeptid naslednji niz:

   (kjer je m = 0 ali 1) Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu (Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro • 7. Gen po zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuj e celoten , ali del naslednjega nukleotidnega niza, kjer je m 0 ali 1: ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CGT CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG (GTG AGT GAG) m TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC

   -105105

   GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC CTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC 8. Gen , po zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje celoten ali del naslednjega nukleotidnega niza, kjer je m 0 ali 1

   ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG (GTG AGT GAG)_m TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GTC CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG

   CCC

   -106106
7. 9. Gen po zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje del ali celoten nukleotidni niz prikazan na priloženi sliki 3(A).
8. 10. Gen po zahtevku 1, značilen po tem, da vsebuje del ali celoten nukleotidni niz prikazan na priloženi sliki 4(a).
9. 11. Gen po zahtevku 1, značilen po tem, da ima omenjeni humani kromosomski gen celoten ali del nukleotidnega niza prikazanega v sliki 5.
10. 12. Gen, po kateremkoli izmed zahtevkov 1 do 11, značilen po tem, da je spojen z mikroorganizmi ali virus-izvedenimi replikami.
11. 13. Rekombinantne vektor, značilen po tem, da vsebuje gen, ki kodira polipeptid, ki ima stimulatorni faktor aktivnosti za kolonijo humanega granulocita.
12. 14. Rekombinantni vektor po na zahtevku 13, značilen po tem, da je omenjeni gen komplementaren s prenašalno RNA, ki je dobljena kot 15. do 16. frakcija centrifugalnega gradienta z gostoto saharoze in ki kodira polipeptid, ki ima stimulirajoči faktor aktivnosti na kolonijo humanih granulocitov.
13. 15. Rekombinantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da je omenjeni gen kromosomski gen.
14. 16. Rekombinantni vektor po zahtevku 15, značilen po tem, da omenjeni kromosomski gen vsebuje nukleotidni niz, ki sodeluje pri transkripcijski kontroli.
15. 17. Rekombinantni vektor, po zahtevku 13, značilen po tem, da je omenjeni gen kodirni za ves ali za del polipeptidnega niza prikazanega v zahtevku 5.
16. 18. Rekombninantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da je omenjeni gen kodirni za ves ali ze del polipeptidnega niza prikazanega v zahtevku 6.
17. 19. Rekombinantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da ima omenjeni gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega v zahtevku 7.

    -107107
18. 20. Rekombinantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da ima omenjeni gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega v zahtevku 8.
19. 21. Rekombninantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da ima omenjeni gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega na priloženi sliki 3(A).
20. 22. Rekombinantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da ima omenjeni gen del ali celoto nukleotidnega niza prikazanega na priloženi sliki 4(A).
21. 23. Rekombinantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da ima omenjeni humani kromosomski gen celoto ali del nukleotidnega niza prikazanega na priloženi sliki 5.
22. 24. Rekombinantni vektor po kateremkoli izmed zahtevkov od 13 do 23, značilen po tem, da je bil uporabljen skupaj z E.coli.
23. 25. Rekombinantni vektor po kateremkoli izmed zahtevkov od 13 do 23, značilen po tem, da se lahko uporablja z animalnimi celicami.
24. 26. E.coli rekombninantni vektor po zahtevku 13, značilen po tem, da omenjeni gen kodira celoto ali del polipeptidnega

    niza, kjer je m 0 ali 1 Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Giy Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu (Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala

    -108108

    Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala

    Gin Pro
25. 27. Transformant, značilen po tem, da vsebuje rekombinantni vektor, ki vzgaja gen, ki kodira polipeptid, ki ima stimulatorni faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo.
26. 28. Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da je omenjeni gen DNA komplementaren z prenašalno RNA, ki se dobi kot

    15. do 17. frakcija centrifugalnega gradienta z gostoto saharoze in ki kodira polipeptid, ki vsebuje stimulatorni faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo.
27. 29. Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da omenjeni gen kodira cel ali del polipeptidnega niza prikazanega v zahtevku 5.
28. 30. Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da omenjeni gen kodira cel ali del nukleotidnega niza prikazanega v zahtevku 6.
29. 31. Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da ima omenjeni gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega v zahtevku 7.
30. 32. Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da ima omenjeni gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega v zahtevku 8.
31. 33. Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da ima omenjeni gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega na sliki 3(A).
32. 34. Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da ima omenjeni gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega na priloženi sliki 4(A).

    -109109
33. 35*Transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da ima omenjeni humani kromosomski gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega na priloženi sliki 5.
34. 36. E.coli transformant po kateremkoli izmed zahtevkov od 27 do 35, značilen po tem, da je dobljen s transformacijo z rekombinantnim vektorjem E.coli.
35. 37. Transformant animalnih celic po kateremkoli izmed zahtevkov od 27 do 35, značilen po tem, da je bil pridobljen s transformacijo z rekombinantnim vektorjem za uporabo z animalnimi celicami.
36. 38. E.coli transformant po zahtevku 27, značilen po tem, da je pridobljen s transformacijo z rekombinantnim vektorjem

    E.coli po zahtevku 26.
37. 39. Polipeptid, značilen po tem, da predstavlja cel ali del aminokislinskega niza prikazanega nižje, kjer je m 0 ali 1 in n je 0 ali 1:

    (Met)_n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu (Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu

    -110110

    Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro
38. 40. Polipeptid po zahtevku 39, značilen po tem, da ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo.
39. 41. Polipeptid, ki vsebuje substanco, ki ima stimulacijski faktor na humano gramulocitno kolonijo, značilen po tem da jo pridobiva iz transformanta, ki vsebuje rekombinantni vektor, ki vzgaja gen, ki kodira polipeptid, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo.
40. 42. Polipeptid, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano gramulocitno kolonijo, značilen po tem, da je predstavljen z delom amino kislinskega niza prikazanega na sliki 3(B) (II).
41. 43. Polipeptid, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo, značilen po tem, da je predstavljen z delom amino kislinskega niza prikazanega na sliki 4(B) (II).
42. 44. Glikoprotein, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na granulocitno humano kolonijo, značilen po tem, da vsebuje sladkor in polipeptid, ki obsega cel ali del naslednjega amino kislinskega niza:

    Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys lle Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu (Val Ser Glu) m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly lle Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly lle Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin

    -111111

    Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin

    Pro
43. 45. Glikoprotein, ki vsebuje substanco, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo, značilen po tem, da je pridobljen iz animalnih celic, ki so bile transformirane z rekombinantnim vektorjem za uporabo z animalnimi celicami in vzgajajo gen, ki kodira polipeptid, ki vsebuje stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo.
44. 46. Postopek za pridobivanje poiipeptida ali giikoproteina, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo, značilen po tem, da obsega:

    a)pridobivanje gena, ki kodira polipeptid, ki ima stimulacijski faktor aktivnosti na humano granulocitno kolonijo,

    b) pridobivanje rekombinantnega vektorja nameščenega v omenjeni gen,

    c) transformiranje celic gostitelja z omenjenim vektorjem,

    d) kultivacijo transformanta ter,

    e) ločevanje željenega poiipeptida ali giikoproteina iz kultur.

    -112112
45. 47. Postopek je po zahtevku 46, značilen po tem, da je omenjeni gen DNA komplementaren s prenašalno RNA, katero pridobimo kot 15. do 17. frakcijo centrifugalnega gradienta z gostoto saharoze in ki kodira poiipeptid, ki ima stimulacijski faktor na humano granulocitno kolonijo.
46. 48. Postopek je po zahtevku 46, značilen po tem, da je omenjeni gen je humani kromosomski gen.
47. 49. Postopek je po zahtevku 46, značilen po tem, da omenjeni kromosomski gen vsebuje osnovni niz, ki sodeluje pri transkripcij ski kontroli.
48. 50. Postopek je po zahtevku 46, značilen po tem, da omenjeni gen kodira cel ali del polipeptidnega niza prikazanega v zahtevku 5.
49. 51. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da omenjeni gen kodira cel ali del polipeptidnega niza prikazanega v zahtevku 6.
50. 52. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da je omenjeni gen E.coli rekombinantni vektor po zahtevku 26.
51. 53. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da ima omenjeni gen del ali celoto nukleotidnega zapisa prikazanega v zahtevku 7.
52. 54. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da ima omenjeni gen celoto ali del nukleotidnega niza prikazanega v zahtevku 8.
53. 55. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da ima omenjeni gen del ali celoto nukleotidnega niza prikazanega na sliki 3(A).
54. 56. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da omenjeni gen vsebuje cel ali del nukleotidnega niza prikazanega na priloženi sliki 4(A).
55. 57. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da ima omenjeni humani kromosomski gen cel ali del nukleotidnega niza prikazanega na priloženi sliki 5.

    -113113
56. 58. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da je polipeptid predstavljen z delom ali celoto amino kislinskega niza prikazanega v zahtevku 39.
57. 59. Postopek po zahtevku 46, značilen po tem, da glikoprotein vsebuje sladkor in polipeptid, ki je v predstavljen s celim ali z delom amino kislinskega niza prikazanega v zahtevku 44.