HU209147B - Method for producing stimulating factor of human granulocytae colony - Google Patents

Description

A jelen találmány humán granulocita telep-stimuláló faktorral foglalkozik. Pontosabban, a jelen találmány egy olyan génnel foglalkozik, amely telep-stimuláló faktorként ható polipeptidet kódol (ezt a továbbiakban CSF-nek nevezzük); ez a faktor fajlagos stimuláló faktor, amely főleg a humán granulocitás sejtek telepeinek képződéséhez szükséges. A jelen találmány foglalkozik rekombináns vektorokkal, amelyekbe ez a gén be van iktatva, ezt a vektort tartalmazó transzformánsokkal, az említett transzformáns által termelt, CSF aktivitással bíró polipeptiddel vagy glikoproteinnek, és a CSF aktivitással bíró polipeptid vagy glikoprotein előállítási módszerével.

Amikor csontvelősejteket mint célsejteket és vesesejteket vagy magzati sejteket tenyésztünk két rétegű lágy agar tenyésztési módszerrel, ahol a csontvelősejtek képezik a felső réteget és a vese- vagy magzati sejtek az alsó réteget, a sejtek egy része a felső rétegben nő és differenciálódik, neutrofil granulociták (amelyeket az alábbiakban egyszerűen csak granulocitáknak nevezünk) vagy monocita makrofágok telepeit képezve. Ez a megfigyelés vezetett olyan faktorok in vivő jelenlétének feltételezésére, amelyek elősegítik telepek képződését [Pluznik és Sach: J. Cell. Comp. Physiol. 66, 319 (1965); Bradley és Metcalf: Aust. J, Exp. Bioi. Med. Sci. 44, 287 (1966)].

Ismeretes, hogy ezeket a faktorokat, amelyeket együttesen CSF-nek nevezünk, olyan sejtek termelik, mint a T-sejtek, monocitás makrofágok, fibroblasztok és endothelsejtek, amelyek normálisan kiterjedten el vannak oszolva in vivő. A CSF alosztályai között találhatók: a granulocita-monocitás makrofág CSF-ek (ennek rövidítése GM-CSF), amelyek a granulociták vagy monocitás makrofágok ős-sejtjeire olyan módon hatnak, hogy stimulálják az ilyen ős-sejtek növekedését és indukálják differenciálódásukat, hogy granulociták vagy monocitás makrofágok telepeit képezzék; a monocitás makrofág CSF (ennek rövidítése M-CSF), amely mindenekelőtt képes makrocitás makrofágok telepeit képezni; többféle hatású CSF (ennek rövidítése multi-CSF), amely a kevésbé differenciált többféle hatású ős-sejtekre hat; és a granulocita CSF (ennek rövidítése G-CSF) típusok, amelyekkel a jelen találmány foglalkozik, ezek alapvetően granulocita-telepeket képesek képezni. Nemrégiben arra a véleményre jutottak, hogy a célsejtek differenciálódásának stádiumai különböznek az egyik alosztály és másik alosztály között [Asano Taisha: Metabolism and Disease, 22, 249 (1985); Yunis és munkatársai: „Growth and Maturation Factors” (Növekedési és érési faktorok), Guroff szerkesztésében, John Wiley and Sons kiadásában, New York, 1. kötet, 209 (1983)].

Ezért az egyedi CSF alosztályok tisztítása, és kémiai és biológiai tulajdonságaik közelebbi tanulmányozásának elvégzése nagyon fontos a hemopoézis mechanizmusának felbecslése és különböző hematológiai betegségek patomorfológiás szempontjainak elemzése céljából.

A hGM-CSF előállítását és tisztítását ismerteti például a WO 86/03225 közzétételi számú PCT bejelentés, EP-183 350 közzétételi szájmú európai bejelentés, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(13), 4360-4364, 1985; Science, 228, 810-815, 1985; Cancer Cells, 3, 235-242,1985.

A G-CSF-nek az a biológiai hatása vonja magára a kutatók fokozott figyelmét, hogy indukálni képes a csontvelő leukémiás sejtjeinek diferenciálódását és erősíti az érett granulociták működését, így ígéretes lehet a G-CSF esetleges klinikai alkalmazása a leukémia kezelése és megelőzése terén.

A G-CSF izolálására és tisztítására eddig végzett kísérletek a sejttenyésztés módszerén alapulnak, ahol a GCSF-et a sejttenyészet felülúszójából izolálják; homogén G-CSF-et azonban még nem termeltek nagyobb mennyiségben ezzel a módszerrel, mivel a G-CSF csak kis koncentrációban állítható elő, és komplex tisztítási eljárások szükségesek, hogy nyomnyi mennyiségű G-CSFet nyerjenek nagy térfogatú tenyészoldatból. Ezért ugyancsak kívánatos, hogy a G-CSF tömegtermelését rekombináns DNS technológiával megoldjuk.

A jelen találmány egyik célja, hogy humán G-CSF aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló gént nyújtsunk.

A jelen találmány egy másik célja, hogy olyan rekombináns vektort nyújtsunk, amelybe az említett gén be van ültetve.

A jelen találmány további célja, hogy olyan transzformánst nyújtsunk, amelyet egy gazdaszervezetnek a fenti rekombináns vektorral végzett transzformálásával állítunk elő; a találmány tárgya még az a polipeptid vagy glikoprotein, amelyet ez a transzformáns előállít.

A jelen találmány még további tárgya az az eljárás, amely humán G-CSF aktivitással rendelkező polipeptid vagy glikoprotein előállításához vezet.

Az 1. ábra három különböző próba (vizsgálóminta), az IWQ, A és LC szekvenciáját mutatja be.

A 2. ábra a pHCS-1 beiktatás nukleotidszekvenciáját mutatja be.

A 3A ábra a pBRG4-ben levő cDNS beiktatás nukleotid-sorrendjét mutatja be.

A 3B (I) ábra egy humán G-CSF prekurzor aminosav-szekvenciáját mutatja be, amint ez a pBRG4 cDNS-ből levezethető.

A 3B (II) ábra a humán érett G-CSF aminosavszekvenciáját mutatja be, amint ez a pBRG4 cDNS-ből levezethető.

A 4/A ábra a pBRV2-ben levő cDNS beiktatás nukleotid-szekvenciáját mutatja be.

A 4/B (I) ábra egy humán G-GSF prekurzor aminosav-szekvenciáját mutatja be, amint ez a pBRV2 cDNS-ből levezethető.

A 4/B (II) ábra a humán érett G-CSF aminosavszekvenciáját mutatja be, amint ez a pBRV2 cDNS-ből levezethető.

• Az 5. ábra humán G-CSF-et kódoló humán kromoszomális gén nukleotidszekvenciáját mutatja be.

A 6. ábra a pBRG4- vagy pBRV2-eredetű humán G-CSF cDNS restrikciós hasítóhelyeit mutatja be.

A 7. ábra a humán G-CSF-et kódoló humán kromoszomális gén restrikciós hasítóhelyeit mutatja be.

HU 209 147 Β

A 8. ábra egy tac promotert tartalmazó vektor (+VSE vonal) előállításához szolgáló eljárás részleges bemutatása.

A 9. ábra egy PL promotert tartalmazó vektor (+VSE vonal) előállításához szolgáló eljárás bemutatása.

A 10. ábra egy trp promotert tartalmazó vektor (+VSE vonal) előállításához szolgáló eljárás bemutatása.

A 11. ábra egy tac promotert tartalmazó vektor (-VSE vonal) előállításához szolgáló eljárás részleges bemutatása.

A 12. ábra egy pL promotert tartalmazó vektor (-VSE vonal) előállításához szolgáló eljárás bemutatása.

A13. ábra egy trp promotert tartalmazó vektor (-VSE vonal) előállításához szolgáló eljárás bemutatása.

A 14. ábra vázlatosan bemutatja a pHGA410 szerkezetét.

A 15. ábra a pTN-G4, pTN-G4Vaa és pTNG4VaP kifejező rekombináns vektorok megalkotására szolgáló eljárások bemutatása.

A 16a és 16b ábrák két eljárást mutatnak be a pHGG4-dhfr megalkotására.

A 17. ábra vázlatosan bemutatja a pHGV2 szerkezetét.

A 18. ábra a pTN-V2, pTN-VAct és pTN-VAp kifejező rekombináns vektorok megalkotására szolgáló eljárások bemutatása.

A 19a és 19b ábrák két eljárást mutatnak be a pHGV2-dhff kifejező rekombináns vektor megalkotására.

A 19c ábra a pV2DRl és pV2DR2 megalkotásához szolgáló eljárásokat mutatja be.

A 20. ábra vázlatosan bemutatja a pMLCE3a szerkezetét.

A 21. ábra vázlatosan bemutatja a pTNCE3a szerkezetét.

A 22. ábra vázaltosan bemutatja a pD26SVCE3a és pDRCE3a szerkezetét.

A jelen találmány szerinti, humán G-CSF aktivitással bíró polipeptidet kódoló gén olyan DNS (cDNS), amely komplementer azzal a hírvivő RNS-sel (mRNS), amelyet szacharóz sűrűséggradiens-centrifugálással kapunk 15-17S frakcióként, és amely a humán G-CSF aktivitással bíró polipeptidet kódolja.

A jelen találmány feltalálói két ilyen cDNS-vonalat kaptak.

Az egyik vonal cDNS-e a 3B ábrában bemutatott I. vagy II. polipeptidet kódoló gén egészével vagy részével rendelkezik. Részletezve, ez a cDNS olyan nukleotidszekvenciával rendelkezik, amely az 5’ végtől számított 32-34 nuleotidhelyeknél levő ATG-vel (lásd 3A ábra) és a 650-652 nukleotidhelyeknél levő CCC-vel van behatárolva, vagy a 122-124 helyeknél levő ACCvel és a 650-652 helyeknél levő CCC-vel van behatárolva. Egy másik változatban a cDNS a 3A ábrában bemutatott nukleotidszekvenciával vagy ennek egy részével rendelkezik. Ennek a vonalnak a cDNS-ét ezután cDNS(+VSE)-nek nevezzük.

A másik vonal cDNS-e a 4B ábrában bemutatott I. vagy II. polipeptidet kódoló gén egészével vagy részével rendelkezik. Részletezve, ez a cDNS olyan nukleotid-szekvenciával rendelkezik, amely az 5’ végtől számított 31-33 helyeknél levő ATG-vel (lásd 4A ábra) és a 640-642 nukleotidhelyeknél levő CCC-vel van behatárolva, vagy a 121-123 helyeknél levő ACC-vel és a 640-642 helyeknél levő CCC-vel van behatárolva. Egy másik változatban ez a cDNS rendelkezhet a 4A ábrában bemutatott nukleotid-szekvenciával, vagy egy részével. Ennek a vonalnak a cDNS-ét ezután cDNS(-VSE)-nek nevezzük.

A fentebb leírt gént a következő eljárásokkal kaphatjuk meg: G-CSF-et kódoló mRNS-t készítünk emlős állati sejtekből, vagy más olyan gazdasejtekből, amelyek G-CSF aktivitással bíró polipeptid előállításának képességével rendelkeznek; az mRNS-t azután átalakítjuk az ismert módszerek bármelyikével kettős-szálú cDNS-sé; az ilyen cDNS-t tartalmazó rekombinánsok készletét (amely készletét a továbbiakban cDNS tárként nevezünk) ezt követően ismert eljárásokkal átvizsgálásnak vetjük alá.

A jelen találmány szerinti gének között találunk humán G-CSF aktivitással bíró polipeptidet kódoló humán kromoszomális gént is. Ez a humán kromoszomális gén olyan nukleotid-szekvenciát tartalmaz, amely részt vesz az átírási szabályozásban; és ez tartalmazza az 5. ábrában bemutatott nukleotid-szekvencia részét vagy egészét is.

Kromoszomális gént kaphatunk oly módon, hogy először humán sejtekből humán kromoszomális gént tartalmazó rekombinánsok készletét állítjuk elő (ezt a készletet a továbbiakban humán kromoszomális géntárnak nevezzük), majd ezt követően ezt a humán kromoszomális géntárt ismert eljárásokkal átvizsgálásnak vetjük alá.

A humán kromoszomális gént humán sejtek bármelyik típusából lehet szolgáltatni, ilyenek pl. a májból, vagy veséből, vagy tenyésztett sejtekből, mint pl. tumorsejtekből kivont sejtek. Humán kromoszomális géntárat lehet készíteni humán sejtekből az ismert módszerek bármelyikével [lásd Maniatis és munkatársai: Cell 75, 687 (1978); és Maniatis és munkatársai; Molecular Cloning (Molekuláris klónozás) c. könyv, Cold Spring Harbor Laboratory, 269 oldal (1982)], amelyek egyikét az alábbiakban mutatjuk be;

- humán kromoszomális DNS kivonása fenollal vagy más megfelelő vegyszerrel olyan forrásokból, mint pl. humán embriómájból; az extrahált DNS részleges vagy teljes emésztése megfelelő restrikciós enzimmel, hogy megfelelő hosszúságú DNS-töredéket kapjunk; a DNS-fragmentum beékelése egy lambdafág vektor DNS-fragmentumba T4 DNS ligázzal vagy más megfelelő ligázzal, és adott esetben összekötve egy olyan kapcsolóval, amely megfelelő enzimhez, pl. EcoRI-hez tartozó restrickiós (hasító)-helyet tartalmaz; ezt követően lambda-fág részecskék kinyerése in vitro pakolási módszerrel és gazdasejtek, pl. E. coli transzformálása az így létrejött lambda-fág részecskékkel.

A fenti eljárásokban vektorként haszálható lambda3

HU 209 147 Β fágokra példák lehetnek a Charon 4A, az EMBL-3 és EMBL-4.

Az emlős sejt, amelyet alkalmazhatok mRNS szolgáltatási forrásként, a CHU-2 humán szájüreg-rák eredetű sejt-törzs, amely a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes-nél (CNCM) 1-483 letéti számon van elhelyezve. Rá kell mutatnunk azonban, hogy az ilyen tumorsejtek helyett más olyan sejteket is lehet alkalmazni, amelyet emlősökből lehet elkülöníteni, vagy más megfelelően létrehozott sejt-törzseket is. Az mRNS előállítását az olyan módszerek valamelyikével lehet elvégezni, amelyet már javasoltak számos más, fiziológiailag aktív fehérje génjeinek klónozásához: így pl. a teljes RNS-t nyerjük ki először felületaktív anyaggal és fenollal végzett kezeléssel valamely ribonukleáz-inhibitor, pl. vanadil-ribonukleozid komplex jelenlétében [lásd Berger és Birkenmeier: Biochemistry, 18, 5143 (1979)], vagy CsCl sűrűséggradiens centrifugálással, amelyet guanidin-tiocianátos kezelés követ [lásd Chirgwin és munkatársai: Biochemistry 18, 5294 (1979)], majd a poli(A⁺)RNS-t (mRNS)-t úgy nyerjük ki, hogy a teljes RNS-t egy tételes adszorpciónak vagy affinitás oszlopkromatográfiának vetjük alá oligo(dT)-cellulózon vagy poli-U-Sepharose-on Sepharose 2B-vel, amelyet mint hordozót alkalmazunk. A poli(A⁺) RNS-t tovább frakcionáljuk megfelelő módszerrel, mint pl. szacharóz sűrűséggradiens centrifugálással. Az így kapott mRNS-nek azt a képességét, hogy G-CSF aktivitással bíró polipeptidet kódol, számos módszenei igazolhatjuk; így pl. az mRNS-t fehérjévé transzlatáljuk, és ennek fiziológiai aktivitását ellenőrizzük; egy más módszer szerint ennek a fehérjének az azonosságát anti-G-CSF antitest segítségével határozzuk meg. Még részletesebben, mRNS-t injektálunk Xenopus laevis oocitáiba a transzláció megvalósításához [lásd Gurdon és munkatársai: Natúré, 233, 177 (1972)], vagy transzlációs reakciókat hajthatunk végre nyúl-retikulocitákkal vagy búzacsírákkal [Schleiff és Wensink, „Practical Methods in Molecular Biology” (Gyakorlati módszerek a molekuláris biológiában), Springer-Verlag kiadása, New York (1981)]. A GCSF aktivitást a lágy agar tenyésztési módszert alkalmazva mérhetjük, a módszerben csontvelősejteket alkalmazva; ennek a módszernek a kivitelezése összefoglaló munkában olvasható [Metcalf: „Hemopoietic Colonies” (Vérképző telepek) Springer-Verlag kiadása, Berlin, Heidelberg, New York (1977)].

Az így kapott mRNS-sel, amelyet itt templátként alkalmazunk, egyszálú cDNS-t szintetizálunk; ebből az egyszálú cDNS-ből kettős szálú cDNS-t szintetizálunk; és a kettős szálú cDNS-t megfelelő vektor DNS-be iktatjuk, hogy rekombináns plazmidot képezzünk. Ezt a rekombináns plazmidot használhatjuk megfelelő gazdaszervezet, pl. Escherichia coli, transzformálására úgy, hogy transzformánsokban levő DNS-ek csoportját (cDNS tár) kapjuk.

Az mRNS-ből a következő két módszer valamelyikével kaphatunk kettős-szálú cDNS-t: az mRNS-t reverz transzkriptázzal kezeljük oligo(dT)-vel, amely komplementer a 3’ végnél levő poli(A) lánccal, az mRNS-t primerként alkalmazva; vagy egy olyan oligonukleotidot, amely a G-CSF fehérje aminosav-szekvenciája egy részének felel meg, szintetizálunk, és az mRNS-sel komplementer cDNS-t reverz transzkriptázzal végzett kezeléssel szintetizáljuk a szintetizált oligonukleotiddal, ezt primerként alkalmazva. A kettős-szálú cDNS-t az alábbi módszerekkel is megkaphatjuk: az mRNS-t elbontjuk és kivonjuk valamely alkáli-oldattal végzett kezeléssel és az így létrejött egyszálú cDNS-t először reverz transzkriptázzal vagy DNS polimerázzal (pl. Klenow-fragmenssel), majd SÍ-nukleázzal kezeljük; egy másik módszer szerint az mRNS-t közvetlenül lehet kezelni RN-áz H-val és DNS-polimerázzal (pl. E. coli polimeráz I-gyel). A további információkat illetően lásd: Maniatis és munkatársai „Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory (1982); Gubler és Hoffman, Gene, 25, 263 (1983).

Az így kapott kettősszálú cDNS-t megfelelő vektorba iktatjuk be, pl. az EK típusú plazmidvektorok egyikébe, ilyenek pl. a pSCIOl, pDF41, ColEl, pMB9, pBR322, pBR327 és pACYCl, vagy a fágvektorok egyikébe, ilyenek pl. a Xgt, Xc, XgtlO és XgtWES, majd ezután a rekombináns vektort felhasználjuk valamely E. coli törzs transzformálására (pl. X1776, HB101, DH1 vagy C600) úgy, hogy cDNS tárat nyerjünk (lásd pl. a „Molecular Cloning” c. fentebb idézett munkát).

A kettősszálú cDNS-t valamely vektorral a következő eljárásokkal egyesíthetjük: a cDNS egyik végét összekapcsolható véggel látjuk el megfelelő, kémiailag szintetizált DNS fragmentum odarögzítésével; és olyan vektor-DNS-t, amelyet előzőleg valamely restrikciós enzinmmel hasítottunk, hozzákapcsolunk a fenti cDNS-hez T4 fág DNS ligázos kezeléssel AtP jelenlétében. Egy másik módszer szerint dC-, illetve dG-láncokat (vagy dT-, illetve dA-láncokat) rögzítünk a kettősszálú cDNS-hez, és egy olyan vektor-DNS-hez, amelyet előzőleg valamely restrikciós enzimmel hasítottunk, és a két DNS-t tartalmazó oldatot hőkezeléses egyesítésnek vetjük alá (lásd a „Molecular Cloning” című fentebb idézett munkát).

Az így kapott rekombináns DNS-sel lehet a gazdasejtet transzformálni bármelyik ismert módszerrel. Ha a gazdaszervezet E. coli, a Hanahan által részletezett [J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)] módszert lehet alkalmazni, ahol a rekombináns DNS-t CaCl₂ MgCl₂ vagy RbCl₂ jelenlétében készített kompetens sejtekhez adjuk.

A kívánt gént magában foglaló sejtek átvizsgálását számos ismert módszerrel hajthatjuk végre, ilyenek pl. a következők: az interferon cDNS klónozásában alkalmazott plusz-mínusz módszer [Taniguchi és munkatársai: Proc. Jpn. Acad. 55, Ser. B, 464 (1979)], a hibridizációs-transzlációs vizsgálati módszer [Nagata és munkatársai: Natúré, 284,316 (1980)], és a telep- vagy tarfolt-hibridizáló módszer, amely a humán G-CSF aktivitással bíró fehérje aminosav-szekvencia alapján kémiailag szintetizált oligonukleotid próbát alkalmaz [Wallace és munkatársai: Nucleic Acids Rés, 9, 879 (1981); Benton és Davis; Science, 196,180 (1977)].

HU 209 147 Β

A humán G-CSF aktivitással bíró polipeptidet kódoló, így klónozott gént újra be lehet iktatni megfelelő vektor-DNS-be más prokarióta vagy eukarióta gazdasejtek transzformálása céljából. Megfelelő promoternek és kifejeződést okozó szekvenciának a vektorba bevezetésével a gént egyes gazdasejtekben ki lehet fejezni.

A példaként felhozható prokarióta gazdasejtek lehetnek az Escherichia coli, Bacillus subtilis és Bacillus thermophilus. A szóban forgó gént ezeken a gazdasejteken belül úgy lehet kifejezni, hogy olyan replikonnal (vagyis origót és regulátor-szekvenciát magába foglaló plazmidvektorrral) transzformáljuk ezeket, amely a gazdasejttel összeférő fágból származik. A kívánatos vektor olyan, amely a transzformált sejt felismerésére képes szekvenciával rendelkezik a kifejezett jellemző vonásra (fenotípus) való szelektivitással.

Példaként említjük az E. colit, amelyet pBR322-vel transzformálhatunk, ez a vektor replikációra képes E. coliban [lásd Bolivár: Gene, 2,95 (1975)]. Ez a vektor tartalmazza mind az ampicillin-, mind a tetraciklinrezisztencia génjeit, és ezeknek a tulajdonságoknak bármelyikét használhatjuk a transzformált sejt azonosítására. A promoterre, amely a genetikai kifejeződéshez szükséges prokarióta gazdaszervezetekben, példák lehetnek a β-laktamáz gén promoterje [Chang és munkatársai: Natúré, 275, 615 (1978)]; a laktóz-promoter [lásd Goeddel és munkatársai: Natúré, 281, 544 (1979)]; és a triptofán-promoter [lásd Goeddel és munkatársai: Nucleic Acid. Rés. 8, 4057 (1980)] stb. Ezeknek a promotereknek bármelyikét lehet alkalmazni a jelen találmány szerinti, humán G-CSF aktivitással bíró polipeptid előállításában.

Eukarióta mikroorganizmust, pl. Saccharomyces cerevisiae-t is lehet alkalmazni gazdasejtként, és olyan vektorral transzformálni, mint pl. az YRp7 plazmid [lásd Stinchcomb és munkatársai: Natúré, 282, 39 (1979)]. Ez a plazmid szelekciós markerként TRP1 génnel rendelkezik olyan élesztőkhöz, amelyeknek hiányzik a triptofán-termelő képessége, így a transzformánsokat triptofán távollétében végzett növesztést végrehajtva lehet kiválogatni. A promoterekre, amelyeket génkifejeződéshez lehet alkalmazni, példák lehetnek a savas foszfatáz-gén-promoter [Miyanohara és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80, 1 (1983)] és az alkohol-dihidrogenáz-gén promoter [Valenzuela és munkatársai: Natúré, 298, 347 (1982)].

A gazdásejt származhat emlős sejtekből is, lehet pl. COS-sejt, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejt, C-127 sejt és Hela sejt. Példaként bemutatható vektor, amelyet ezeknek a sejteknek a transzformálására lehet alkalmazni, a pSV2-gpt [lásd Mulligan és Berg: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072 (1981)]. Az ezeknek a sejteknek a transzformálására használt vektor tartalmaz origót, szelekciós markert, a kifejezendő gén helyét megelőző promotert, RNS hasítóhelyet, poliadenilező jelet stb.

Példaként bemutatható promoterek, amelyeket az emlős sejtekben való génkifejeződéshez lehet alkalmazni, retrovírus, poliómavírus, adenovírus, majom(simian)vírus 40(SV40) stb. promoterjei. Ha promoterként SV40-et alkalmazunk, a kívánt génkifejeződést könnyen el lehet érni Mulligan és munkatársai módszerével [Natúré, 277,108 (1979)].

Példaként bemutatható origók, amelyeket alkalmazhatunk, lehetnek az SV40-ből, polióma vírusból, adenovírusból, szarvasmarha papillóma vírusból (BPV) stb. származó origók. Példaként bemutatható szelekciós markerek, amelyeket alkalmazhatunk, lehetnek a foszfotranszferáz APH(3’)II. vagy I(neo)génje, a timidinkináz (TK) gén, az E. coli xantin-guanin foszforibozil-transzferáz(Ecogpt)gén, a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) gén stb.

Abból a célból, hogy humán G-CSF aktivitással bíró polipeptidet kapjunk a fentebb felsorolt gazdaszervezet vektorrendszerekből, a következő eljárást alkalmazhatjuk: a humán G-CSF aktivitással bíró pepiidet kódoló gént megfelelő helyen beiktatjuk a fentebb említett vektorok valamelyikébe, a gazdasejtet transzformáljuk az így létrejött rekombináns DNS-sel; és az így kapott transzformánst tenyésztjük. A kívánt polipeptidet izolálhatjuk a sejtből vagy a tenyészoldatból az ismert technikák bármelyikével.

Az eukarióta génekről általában úgy vélik, hogy polimorfizmust mutatnak, amint ez ismert a humán interferon gén esetében [lásd Nishi és munkatársai: J. Biochem. 97, 153 (1985)] és ez a tünet okozhatja egy vagy több aminosav helyettesítését vagy valamilyen változást a nukleotid-szekvenciában, de egyáltalán nem okozhat változást az aminosav-szekvenciában.

G-CSF aktivitással rendelkezhetnek olyan polipeptidek is, amelyekből hiányzik egy vagy több aminosav a 3B vagy 4B ábrában bemutatott aminosav-szekvenciához viszonyítva vagy amelyek ilyen aminosavakat többletben tartalmaznak, vagy olyan polipeptidek, amelyekben ezekből az aminosavakból egy vagy több helyettesítve van egy vagy több más aminosavval. Az is ismeretes, hogy egy olyan polipeptid, amelyet úgy kapnak, hogy a cisztein-kodonok mindegyikét a humán interleukin-2 (IL—2) génben szerinné alakítják át, rendelkezik az interleukin-2 aktivitásával (Wang és munkatársai: Science, 224, 1431 (1984). Ezért - feltéve, hogy a polipeptidek, akár természetben előfordulók, akár kémiailag szintetizáltak, rendelkeznek humán GCSF aktivitással - mindazok a gének, amelyek ezeket a polipeptideket kódolják, mindazok a rekombináns vektorok, amelyek ezeket a géneket tartalmazzák, mindazok a transzformánsok, amelyeket ilyen rekombináns vektorokkal kapunk, és mindazok a polipeptidek vagy glikoproteinek, amelyeket az ilyen transzformánsok tenyésztésével nyerünk, a jelen találmány oltalmi körén belül vannak.

Az alábbiakban körvonalazzuk a humán G-CSF aktivitással bíró polipeptideket kódoló, jelen találmány szerinti gének, az ezzel a génnel rendelkező rekombináns vektorok, az ezzel a rekombináns vektorral rendelkező transzformánsok, és az ebben a transzformánsban kifejezett, humán G-CSF aktivitással bíró polipeptidek vagy glikoproteinek előállítására szolgáló eljárásokat.

HU 209 147 Β (1) Vizsgálóminta készítése (Próba)

Homogén humán CSF fehérjét tisztítunk meg egy CHU-2 tumorsejt-vonal tenyészet felülúszóból, és ennek aminosav-szekvenciáját az N-végtől meghatározzuk (1. és 2. példa). Brómciánnal végzett elbontással és tripszines kezeléssel fragmentumokat kapunk, és ezeknek a fragmentumoknak az aminosav-szekvenciáját szintén meghatározzuk [3(i), (ii) és (iii) példák].

A meghatározott aminosav-szekvenciákból három nukleotid vizsgálómintát szintetizálunk: az (A), (LC) és (IWQ) mintákat, amelyek az 1. ábrában bemutatott szekvenciával rendelkeznek (4. példa). Az (A) vizsgálóminta kevert típusú, és 14 egymást követő nukleotidból áll. Az (IWQ) vizsgálóminta 30 egymást követő nukleotidból áll dezoxi-inozinokkal; ez olyan típusú vizsgálóminta, amelyet a humán kolecisztokinin gén klónozásában alkalmaznak [Takahashi és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82, 1931 (1985)]. Az (LC) vizsgálóminta 24 nukleotidos vizsgálóminta, amelyet a 3i példában bemutatott aminosav-szekvencia N-végétől számított 32-39 helyzetű nukleotidokból szintetizáltunk a 3. ábrában bemutatott szekvencia alapján.

A nukleotidok kémiai szintézisét a szilárd fázisú módszerre alkalmas javított foszfotriészter módszert alkalmazva végezhetjük el, amellyel kapcsolatban Narang közölt összefoglaló munkát [Tetrahedron, 39, 322 (1983)].

Más vizsgálómintákat is alkalmazhatunk, amelyek a fentebb említett vizsgálómintáktól eltérő helyzeteknél levő aminosav-szekvenciákon alapulnak.

(2) cDNS-tár megalkotása

Guanidin-tiocianát oldatáhozzáadása után a CHU2 sejteket homogenizáljuk és a teljes RNS-t CsCl sűrűséggradiens centrifugálással nyerjük ki.

Poli(A⁺)RNS-t izolálunk a teljes RNS-ből oligo(dT)-cellulóz oszlopon végzett oszlopkromatográfiával. Ezután egyszálú cDNS-t szintetizálunk reverz transzkriptázzal, és RN-áz H-t és E. coli DNS-polimeráz I-et adunk ehhez, hogy kettősszálú cDNS-t kapjunk. dC-láncot rögzítünk az így kapott kettősszálú cDNS-hez, amelyet azután egy vektorral, a pBR322vel egyesítünk, amely vektorhoz előzőleg dG-láncot rögzítettünk PstI hasítási helyénél. Az így létrejött rekombináns DNS-t használjuk E. coli X1776 törzs transzformálására, ezzel pBR322 vonalú cDNS-tárt alkotunk meg (5. és 6. példa).

Hasonló módon a kettősszálű cDNS-t EcoRI kapcsolóval, λ-fág Vonalú cDNS-tárat alkotunk meg (7. példa).

(3) Átvizsgálás

A pBR322 vonalú cDNS-tárból származó rekombinánsokat Whatman 541 szűrőpapíron rögzítjük és egy egyedi kiónt tudunk kiválasztani ³²P-jelzett vizsgálómintával (IWQ) végzett hibridizációval. A Southemféle hibridizálási foltképző módszerrel végzett további vizsgálat [Southern: J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)] azt mutatja, hogy ez a klón hibridizálódik (A) vizsgálómintával is. Ennek a kiónnak a nukleotid-szekvenciáját didezoxi módszerrel határozzuk meg [Sanger: Science, 214, 1205(1981)].

Az így kapott cDNS-beiktatás nukleotid-szekvenciáját a 2. ábrán mutatjuk be, amelyből az látható, hogy ez a beiktatás 308 bázispárból áll, beleértve az (IWQ) és (A) vizsgálómintákat, és nyílt leolvasó kerettel rendelkezik, amely a 3(iii) példában bemutatott aminosav-szekvenciát tartalmazó 83 aminosavat kódolja. Azt a pBR322 eredetű plazmidot, amely ezt a 308 bázispárt tartalmazza, a továbbiakban pHCS-1nek nevezzük (8. példa).

A pHCS-l-ből kapott 308 bázispárt tartalmazó DNS fragmentumot bemetszéses (nick) transzlációs módszer segítségével radioaktív jelzéssel látjuk el (lásd a „Molecular Cloning” c. fentebb idézett munkát), és ezzel a fragmentummal, mint vizsgálómintával, a gtlO eredetű cDNS-tárat tarfolt-hibridizálással átvizsgáljuk [Benton és Davis, Science, 196, 180 (1977)], így kapunk öt kiónt. A kiónnak, amelyről úgy véljük, hogy cDNS-t tartalmaz, nuklotid-szekvenciáját ugyanazzal a módszerrel határozzuk meg, amelyet fentebb leírtuk (3A ábra).

Amint a 3 A ábrában bemutatjuk, ez a cDNS-beiktatás egyedi, nagy, nyílt leolvasó kerettel rendelkezik.

Az ezzel a cDNS-sel kódolt aminosav-szekvenciát ki lehet következtetni, amint ezt a 3A ábrán bemutatjuk.

A 3 (i) példában bemutatott G-CSF fehérje N-terminális aminosav-szekvenciájával való összehasonlítás feltárja, hogy ez a cDNS olyan nukleotid-szekvenciát tartalmaz, amely megfelel egy 90 bázispárral kódolt szignál peptidnek, amely az 5’ végtől számítva a 32-34 nukleotid-helyeknél levő ATG szekvenciával indul és a 119-121 helyeknél levő GCC szekvenciával végződik, és megfelel egy 531 bázispár által kódolt érett G-CSF polipeptidnek is, amely a 122-124 helyeknél levő ACC szekvenciával indul és a 650-652 helyeknél levő CCC szekvenciával végződik. Ezért a 3B ábrában bemutatott I. aminosav-szekvencia polipeptidje 207 aminosavból áll, és molekulatömegét 22292,67 daltonnak számítjuk. A II. aminosav-szekvencia polipeptidje 177 aminosavból áll és molekulatömegét 18986,74 daltonnak számítjuk (9. példa).

Meg kell jegyeznünk, hogy a 32-34 helyeknél és a 68-70 helyeknél levő ATG-t szintén tekinthetjük fehérje-.beindító helyeknek. Azt az Escherichia coli X1776 törzset, amelynek pBR322 plazmidja az EcoRI hasítási helynél ezzel a cDNS(+VSE)-vel rendelkezik, letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute-nál (Agency of Industrial Science and Technology) [Ferm’encátciós Kutatóintézet, Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség] FERM BP-954 letéti számon.

A 6. ábra mutatja be a gén restrikciós hasítóhelyeit.

Ezt a cDNS-t pBR327-tel [Soberon és munkatársai: Gene, 9, 287 (1980)] egyesítjük az EcoRI-helyen; az így létrejött plazmidot a továbbiakban pBRG4-nek nevezzük.

Az így kapott pBRG4-et EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, hogy mintegy 1500 bázispárból álló cDNS-t tartalmazó DNS fragmentumot kapjunk. Ezt a fragmentumot bemetszéses transzlációs módszerrel (lásd a korábban idézett „Molecular Cloning” c. kiadványt) radioaktí6

HU 209 147 Β van jelöljük, és ezt a radioaktívan jelzett DNS fragmentumot vizsgálómintaként alkalmazva, a gtlO eredetű cDNS-tárat ismét egyszer átvizsgáljuk tarfolt-hibridizálással (lásd Benőn) és Davis fentebb idézett munkáját). Ebben a tarfolt-hibirdizálásban λ-fág DNS-sel rögzített nitrocellulóz szűrőpapírból lemezt készítünk; ezeknek a lemezeknek egyikét a fentebb említett tarfolt-hibridizálási módszerben alkalmazzuk, míg a másik lemezt a már leírt vizsgálómintával (LC) vetjük alá tarfolt-hibridzálásnak. A fágokat, amelyek mindkét vizsgálómintánál pozitív eredményt mutatnak, kiválasztjuk. Egy olyan kiónt, amely „teljes hosszúságú” cDNS-sel rendelkezik, kiválasztunk; a cDNS-beiktatás nukleotid-szekvenciáját, amint ezt didezoxi módszerrel meghatároztuk, a 4A ábrán mutatjuk be.

Ez a cDNS egyedi nagy nyílt leolvasó kerettel rendelkezik, és az aminosav-szekvenciát, amelyet ez a cDNS kódolhat, kikövetkeztetjük, amint ezt a 4A ábrán bemutatjuk.

A G-CSF fehérje N-terminális aminosav-szekvenciájával végzett összehasonlítás feltárja, hogy ez a cDNS olyan nukleotid-szekvenciát tartalmaz, amely megfelel egy 90 bázispárral kódolt szignál pepiidnek, amely az 5'-terminálistól számítva a 31-33 nukleotidhelyeknél levő ATG szekvenciával indul és a 118-120 helyeknél levő GCC szekvenciával végződik, valamint megfelel egy 522 bázispár által kódolt érett G-CSF polipeptidnek, amely a 121-123 helynél levő ACC szekvenciával indul és a 640-642 helyeknél levő CCC szekvenciával végződik. Ezért a 4B ábrában bemutatott I. aminosav-szekvencia polipeptidje 204 aminosavból áll, és molekulatömegét 21977,35 daltonnak számítjuk. A II. aminosavszekvencia polipeptidje 174 aminosavból áll, és molekulatömegét 18671,42 daltonnak számítjuk (10. példa).

Meg kell jegyeznünk, hogy az 58-60 vagy 67-69 helyeknél levő ATG-t szintén tekinthetjük fehérje-beindító helynek. Azt az Escherichia coli XI776 törzset, amelynek pBR322 plazmidja az EcoRI hasítási helynél ezzel a cDNS(-VSE)-vel rendelkezik, letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute-nál (Agency of Industrial Science and Technology) [Fermentációs Kutatóintézet, Ipari Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség] FERM BP-955 letéti számon.

A 6. bára mutatja be a gén restrikciós hasítóhelyeit. Ezt a cDNS-t pBR327-tel egyesítjük az EcoRI helyen; az így létrejött plazmidot a továbbiakban pBRV2-nek nevezzük.

(4) Humán kromoszomális gén-tár átvizsgálása

Humán kromoszomális gén-tárat, amelyet a Maniatis és munkatársai által leírt eljárásnak megfelelően készítettünk (lásd a korábban idézett „Molecular Cloning” c. kiadványt), a fentebb bemutatott pHCS-l-gyel átvizsgálásnak vetünk alá. A vizsgálóminták, amelyeket az átvizsgálásban alkalmazhatunk, pl. az alábbiak lehetnek; pHCS-l-eredetű 308 bp-s DNS-fragmentum, pBRG-4-eredetű mintegy 1500 bp-s DNS-fragmentum; pBRV2-eredetű mintegy 1500 bp-s DNS fragmentum; a fenti DNS fragmentumokból egynek vagy többnek egy részét tartalmazó, megfelelő hosszúságú

DNS-fragmentum, valamint a korábban említett oligonukleotid vizsgálóminták [azaz (IWQ), (A) és (IC)]. A pHCS-1 DNS-fragmentum alkalmazásának esetét írjuk le az alábbiakban.

Ezt a DNS fragmentumot radioaktív jelzéssel látjuk el ³²P-vel bemetszéses (nick) transzlációs módszer szerint [lásd Roop és munkatársai: Cell, 15, 431 (1978)]. Az így létrejött, ³²P-vel jelzett fragmentummal, amelyet vizsgálómintaként alkalmazunk, a humán kromoszomális géntárat tarfolt-hibridizálással átvizsgálásnak vetjük alá (lásd Benton és Davis, fentebb idézett munka), így tízegynéhány kiónt kapunk.

A DNS kiónokból való kinyerése után restrikciós enzim térképet készítünk ismert eljárásokkal [Fritsch és munkatársai: Cell, 79,959 (1980)].

Az alkalmazottal azonos DNS-vizsgálómintával Southern-foltképzést (lásd Southern, fentebb idézett munka) hajtottunk végre, és úgy találtuk, hogy egy 4 kb-s DNS-fragmentum, amelyet EcoRI-gyel és Xholgyel hasítottunk ki, humán G-CSF polipeptidet kódoló területet tartalmazhat. Ezért a mintegy 4 kb-s DNS fragmentumot pBR327-be iktatjuk az EcoRI-helynél EcoRI-kapcsolót alkalmazva úgy, hogy a pBRCE3P-t kapjuk. Ezzel a plazmiddal, bázisszekvenciáló DNSként alkalmazva, a mintegy 4 kb-s DNS fragmentum mintegy 3 kb-s részének nukleotid-szekvenciáját didezoxi-módszerrel meghatározzuk. Ennek eredményeként az említett DNS-ről úgy találjuk, hogy ez olyan gén, amely a humán G-CSF polipeptidet kódolja (5. ábra).

A pBRCE3P-t (vagyis azt a pBR327-et, amely az említett mintegy 4 kb-s DNS-fragmentumot tartalmazza az EcoRI-helynél beiktatva) magában foglaló E. coli XI776 törzset letétbe helyeztük a Fermentation Research Institute-nál (Agency of Indusrial Technology) [Fermentációs Kutatóintézet, Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség] FERM BP-956 letéti számon.

Az összehasonlítás a 3. ábrában bemutatott pBRG4 cDNS beiktatás és a 4. ábrában bemutatott pBRV2 cDNS-beiktatás között feltárja, hogy a szóban forgó DNS-fragmentum öt exonrészt tartalmaz, és hogy ez a pBRG4-ből és pBRV2-ből levezetett aminosavakat kódolja.

A 7. ábra az így kapott gén restrikciós hasítóhelyeit mutatja be.

Ez a DNS-fragmentum tartalmazza a humán GCSF kromoszomális génjét, vagy a humán G-CSF mRNS-re átírandó megelőző területet és egy, az átírási szabályozásban részt vevő nukleotid-szekvenciát [Benoist és Chambon, Natúré, 290, 304 (1981); Breathnack és Chambon: Ann. Rév. Biochem. 50, 349 (1981)].

(5) Rekombináns vektor megalkotása E. coliban való kifejeződéshez.

(A) +VSE-vonalú rekombináns vektor

A (3) pontban (9. példa) kapott pBRG4 plazmidból a G-CSF polipeptid egy cDNS-fragmentumát restrikciós enzimmel kihasítjuk, és rekombináns vektort alkotunk meg a következő módszerek egyikével:

HU 209 147 Β (i) hőkezelt szintetikus kapcsolót alkalmazva a fragmenst tac promotert tartalmazó pBB223-3-ból (Pharmacia Fine Chemicals) készített fragmentummal ligáljuk (12. példa és 8. ábra);

(ii) a PL-promotert tartalmazó pPL lambdából készített három fragmentumot hőkezelt szintetikus kapcsolóval ligáljuk, és a ligálási terméket, valamint a cDNS-fragmentumot újrakészítési eljárásnak vetjük alá, hogy rekombináns vektort alkossunk meg (13. példa, 9. ábra); vagy (iii) hőkezelt szintetikus kapcsolót alkalmazva a fragmentumot olyan fragmentummal ligáljuk, amelyet trp promotert tartalmazó ρΟΥ I plazmidból készítettünk (14, példa és 10. ábra).

(B) -VSE vonalú rekombináns vektor

Hasonló módon, amint fentebb leírtuk, három rekombináns vektort alkotunk meg a pBRV2 plazmidot alkalmazva (10. példa), amint ezt a 19. példa, valamint a 11., 12. és 13. ábrák bemutatják.

(6) E. coli transzformánsok előállítása, valamint ezek tenyésztése és kifejeződése.

Mind a +VSE, mind a -VSE vonalak három-három rekombináns vektorát alkalmazva, E. coli DH1, vagy N4830 vagy JM105 törzset transzformálunk a kalciumkloridos vagy rubídium-kloridos módszerrel, amint ezt a fentebb idézett „Molecular Cloning” című kiadvány leírja (12., 13., 14. és 19. példák). A kapott transzformánsok mindegyikét ampicillint is tartalmazó Luriatápközben tenyésztjük, amit a kifejeződés kiváltásához szükséges mértékű indukció követ (15. és 20. példa).

(7) A G-CSF polipeptid kinyerése és tisztítása E. coliból, és ennek aminosav-elemzése.

A transzfománsok tenyészoldatát centrifugáljuk, hogy sejtüledéket kapjunk. Az összegyűjtött sejteket lizozimmal kezeljük és a ciklusos fagyasztás-felengedtetés által előidézett lízis után megkapjuk a felülúszót. Egy másik megoldás, hogy a sejteket guanídium-kloriddal kezeljük, centrifugáljuk és a felülúszót kinyerjük.

A felülúszót gélszűrésnek vetjük alá Ultrogél ACA54 oszlopon (LKB) és az aktív frakciókat koncentráljuk ultraszűrő berendezéssel.

Ezt követően trifluor-ecetsav n-propanolt tartalmazó vizes oldatát adjuk a koncentrátumba, és miután jégen állni hagyjuk, a keveréket centrifugáljuk és fordított fázisú C18 oszlopon adszorbeáljuk. Eluálás után a frakciókat aktivitásra ellenőrizzük. Az aktív frakciókat összegyűjtjük és a tisztítás azonos módszerének vetjük alá, amelyet korábban.Jeírtunk. A tisztított frakciókat fagyasztva szárítjuk és a port feloldjuk, és molekulaméreten alapuló nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiának (HPLC) vetjük alá. A kapott polipeptideket SDS-poliakrilamidos gélelektroforézisnek vetjük alá, és a kívánt G-CSF polipeptidhez tartozó egyedi csíkot igazoljuk (16. és 20. példa). Az így kapott polipeptid humán G-CSF aktivitást mutat (17. és 20. példa). A G-CSF polipeptid elemzését Hitachi 835 Automatic Amino Acid Analyzer (Hitachi Ltd.) berendezést alkalmazó aminosav-elemzési módszertel végezzük. Az Nterminális aminosavak elemzéséhez gázfázisú szekvencia-meghatározót (Edman lebontáshoz), nagy nyomású folyadék-kromatográfiás berendezést és Ultrasphere-ODS oszlopot alkalmazunk (18. és 21. példák).

(8) Rekombináns vektorok megalkotása állati sejtekhez

BPV-ből származó rekombináns vektorokat C127 és N1H3T3 sejtekkel, mint gazdasejtekkel való alkalmazáshoz alkotunk meg a +VSE és -VSE vonalú cDNS-ek mindegyikéhez és a kromoszomális génhez. Rekombináns vektorokat alkotunk meg (dhfr-rel) CHO sejtekkel való alkalmazáshoz is a +VSE és -VSE vonalú cDNS-ek mindegyikéhez és a kromoszomális génhez. Rekombináns vektorokat alkotunk meg COS sejtekkel való alkalmazáshoz is. A következőkben reprezentatív példákat írunk le, és további részletek a vonatkozó gyakorlati példákból kereshetők ki.

(A) +VSE vonal rekombináns vektorainak megalkotása

A (3) részben kapott cDNS(+VSE)-töredéket pdKCR-vektorba iktatjuk be, hogy elkészítsük a pHGA 410 plazmidot (22. példa és 14. ábra), amelyet részlegesen emésztünk EcoRI-gyel, ezt követi a DNS polimeráz I-gyel (Klenow-fragmens) végzett kezelés, hogy tompa végeket kapjunk. Valamilyen HindlII-kapcsolót rögzítünk a DNS-re, amelyet ezt követően HindlII-mal és T4 DNS ligázzal kezelünk. A kezelt DNS-t alkalmazzuk az E. coli DH1 törzs transzformálására a rubídium-kloridos eljárással (lásd a fentebb idézett „Molecular Cloning” című kiadványt). Az így létrejött plazmidot pHGA410(H)-nak nevezzük (15. ábra).

A pHGA410(H)-t Sall-gyel kezeljük, és miután a tompa végeket kialakítottuk, ismét HindlII-mal kezeljük, így Hindlll-Sall fragmentumot nyerünk ki. pdBPV-1 plazmidot, amely szarvasmarha papillóma vírus transzformált fragmentumával rendelkezik, HindlII-mal és PvuII-vel kezelünk, a nagyobbik DNSfragmentumot elkülönítjük és a külön készített Hindlll—Sáli fragmentummal egyesítjük. Az egyesített fragmentumokat használjuk E. coli DH1 törzs transzformálására, hogy a pTN-G4 plazmidot kapjuk, amely a pHGA410 eredetű CSF-cDNS-sel rendelkezik (15. ábra és 23. példa).

Vagy a pHGA410 plazmidot, vagy a pHGA410(H) plazmidot, a pAdD26SVpA plazmiddal együtt, alkalmazzuk a pHGG4dhfr megalkotásához, amely (+VSE) rekombináns vektor CHO sejtekkel való alkalmazásához (16a és b ábrák, 25. példa).

A dhfr gént tartalmazó 2 kb-s DNS-fragmentumot pAdD26SVpA-ból nyerjük ki EcoRI-gyel és BamHIgyel végzett kezeléssel, és a kinyert fragmentumot pHGA410(H)-ba iktatjuk a HindlII-helynél, így alkotjuk meg a pG4DRl-et és pG4DR2-et (16c ábra és 25. példa).

(B) A-VSE vonal rekombináns vektorainak megalkotása

A (3) részben kapott cDNS(-VSE) fragmentumot pdKCR vektorba iktatjuk be, így készítve el a pHGV2plazmidot (28. példa), amelyet azután részlegesen emésztünk EcoRI-gyel, ezt követi a kezelés DNS-polimeráz I-gyel (Klenow-fragmentum), hogy tompa vége8

HU 209 147 Β két alakítsunk ki. Valamilyen HindlII-kapcsolót rögzítünk a DNS-hez, amelyet ezt követően HindlII-mal és T4 DNS ligázzal kezelünk. A kezelt DNS-t használjuk E. coli DH1 törzs transzformálására rubídium-kloridos eljárással (lásd a korábban idézett „Molecular Cloning” című kiadványt). Az így létrejött plazmidot pHGV2(H)-nak nevezzük (18. ábra).

A pHGV2(H)-t Sall-gyel kezeljük, és miután tompa végűvé alakítottuk, megint csak HindlII-mal kezeljük, és a HindlII-Sall fragmentumot kinyerjük. A szarvasmarha papillóma vírus egy transzformált fragmentumával rendelkező pdBPV-1 plazmidot HindlII-mal és PvuII-vel kezeljük, a nagyobbik fragmentumot elkülönítjük, és ezt egyesítjük a külön elkészített HindlIISall fragmentummal. Az egyesített fragmentumokat használjuk E. coli DH1 törzs transzformálására, hogy a pTN-V2 plazmidot kapjuk, amely a pHGV-2 eredetű CSF-cDNS-sel rendelkezik (18. ábra és 29. példa).

Hasonló módszereket alkalmazva, vagy a pHGV2 vagy a pHGV2(H) plazmidot a pAdD26SVpA plazmiddal együtt alkalmazva használjuk fel a pHGC2dhfr plazmid megalkotására, amely (-VSE) rekombináns vektor a CHO sejtekhez való felhasználásra (19a és b ábrák, és 31. példa).

Egy dhfr gént tartalmazó mintegy 2 kb-s DNS fragmentumot nyerünk ki a pAdD26SVpAS-ból EcoRIgyel és BamHI-gyel végzett kezeléssel, és a kinyert fragmentumot pHGV2(H)-ba iktatjuk a HindlII-helynél, ilyen módon alkotva meg a pV2DRl-et és pV2DR2-t (19c ábra és 31. példa).

(C) Kromoszomális gént tartalmazó rekombináns vektor megalkotása

A pBRCE3p plazmidot, amelyet a (4) pontban kaptunk, és amely az 5. ábrában bemutatott kromoszomális gént tartalmazza, EcoRI-gyel kezeljük.

A Banerji és munkatársai által leírt (Cell, 27, 299 (1981)] pSVH⁺K⁺ plazmidot Kpnl-gyel kezeljük, hogy a globin-gént eltávolítsuk. A plazmidot azután további részleges HindlII emésztésnek vetjük alá, így eltávolítjuk az SV40 késői gén egy részét. A fragmentumokat ezután újraegyesítjük, így a pML-E⁺ kifejező vektort kapjuk.

Ezt a vektort EcoRI restrikciós enzimmel és alkalikus foszfatázzal kezeljük (Takara Shuzo Co., Ltd),. hogy egy vektor DNS-t kapjunk, amelyet azután a fentebb említett kromoszomális DNS-fragmentumhoz kapcsolunk T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo Co., Ltd) segítségével, így kapjuk a pMLCE3a-t, amely COS sejtekhez szolgáló rekombináns vektor (34. példa).

Amint ezt a 20. ábrában bemutatjuk, ez a plazmid tartalmazza az SV40-gén fokozóját (enhancer), az SV40 replikációs origóját, a pBR322 replikációs origóját, és a pBR322 eredetű β-laktamáz gént (Amp^r), és rendelkezik a humán G-CSF kromoszomális génnel az SV40-gén fokozójától „lefelé” összekapcsolva.

Egy C127 sejtekhez szolgáló kifejező vektort alkotunk meg a következő eljárásokkal. A CSF kromoszomális gént tartalmaz DNS fragmentumot megfelelő restrikciós enzimmel kihasítjuk pMLCE3ct-ból, amely COS sejtekhez szolgáló kifejező vektor. Ezt a fragmentumot T4 DNS-ligáz segítségével olyan DNS-fragmentummal egyesítjük, amely a szarvasmarha papillóma vírus (BPV) origóját tartalmazza, és olyan DNS fragmentummal, amely az SV40 korai promotert tartalmazza. Az így létrejött pTNCE3a olyan kifejező vektor, amely kromoszomális CSFgénnel rendelkezik az SV40 korai promotertől „lefelé” összekapcsolva, és amely a BPV 65%-nyi részét tartalmazza.

A CHO sejtekhez szolgáló kifejező vektor két DNS-töredékkel rendelkezik, amely egymással T4 DNS-ligáz segítségével van összekapcsolva; az egyik fragmentum tartalmazza a kromoszomális CSF gént és az SV40 korai promoterjét, mint a Cl27 sejtekhez szolgáló kifejező vektor esetében, és a másik töredék pAdD26SVpA eredetű dhfr gént tartalmaz. Az így létrejött pD26SVCE3ct olyan kifejező vektor, amely kromoszomális CSF génnel rendelkezik az SV40 promotertől „lefelé”, és dhfr génnel az adenovírus fő késői promoterétől „lefelé”.

(9) Kifejeződés állati sejtekben

Az alábbiakban két reprezentáns példát írunk le: további részletek a vonatkozó gyakorlati példákból kereshetők ki (A) Kifejeződés C-127-es egérsejtekben pTN-G4 vagy pTN-V2 plazmidot kezelünk BamHI-gyel. A kezelt plazmidot használjuk C127 sejtek (amelyeket előzőleg tenyésztéssel növesztettünk) transzformálására a kalcium-foszfátos eljárással. A transzformált sejteket tenyésztjük és a nagy CSF termelési sebességgel rendelkező kiónokat kiválasztjuk. A kifejezett G-CSF-et tartalmazó glikoproteineket kinyerjük és a transzformált sejtek tenyészoldatából megtisztítjuk; úgy találjuk, hogy ezek humán G-CSF aktivitással rendelkeznek. A kívánt glikoprotein jelenlétét a minta aminosav- és cukortartalom elemzésével és igazoljuk.

A cukortartalom-elemzés céljából az aminosavelemzésben alkalmazott CSF mintát az alábbi cukorelemzésnek vetjük alá: amino-cukor meghatározás Elson-Margan módszerei, semleges cukor meghatározás az orcin-szulfátos módszerrel, vagy a szialinsav meghatározása a tiobarbiturátos módszerrel. Az egyes meghatározásokhoz szolgáló módszereket az alábbi kiadvány mutatja be: „Tohshitsu no Kagaku” „Chemistry of Saccharides” (a kétrészes kiadvány 2. része,

4. kötet, 13. fejezet, „A Course in Biochemical Experirtients” (Tanfolyam biokémiai kísérletekhez), Tokyo Kagaku Dojin kiadása. A mért értékek átszámítása tömegszázalékra feltárja, hogy a kapott G-CSF cukortartalma az 1-20 tömeg% tartományban oszlik el, a gazdasejtek és a kifejező vektorok típusától, valamint a tenyésztési körülményektől függően.

(B) Kifejeződés COS sejtekben

COS sejteket, amelyek majom CV-1 sejtekből származnak, és amelyeket előzőleg SV40-origó hiányos mutánssal transzformáltunk, hogy az SV40 nagyméretű T antigénjét kifejezzék [lásd Gluzman és munkatársai: Cell, 32, (1981)], pMLCE3 vektorral transzformálunk, amelyet az (5) (C) részben kaptunk és

HU 209 147 Β amely tartalmazza a humán kromoszomális G-CSF gént. A COS sejtek tenyésztésének felülúszója mutatja a humán G-CSF aktivitást (35. példa).

A COS sejteket kinyerjük és mRNS elemzésnek vetjük alá; ez két mRNS jelenlétét mutatja, amelyek megfelelnek a 3A, illetve 4A ábrákban bemutatott aminosav-szekvenciáknak.

Példák

Mielőtt a jelen találmányt részletesebben leírnánk a gyakorlati példákat illetően, az alábbi referenciapéldát adjuk meg a CSF aktivitás mérési módszereinek bemutatása céljából.

Referenciapélda

A CSF aktivitás meghatározása

A következő módszert alkalmazzuk, hogy a CSF aktivitást meghatározzuk (a CSF aktivitást a következőkben CSA-nak nevezzük) a jelen találmányban.

CSA meghatározás (a) Humán csontvelősejtekkel:

Egyrétegű lágy agaron végzünk tenyésztést Bradley

T. R. és Metcalf D. módszerével [Aust. J. Exp. Bioi. Med. Sci. 44,287-300 (1966)]. Konkrétan 0,2 ml borjúembrió szérumot, 0,1 ml humán csontvelő nem-összetapadó sejt szuszpenziót [1-2X10⁵ központi (nukleáris) sejt], 0,2 ml módosított McCoy 5A tenyésztőoldatot és 0,4 ml olyan módosított McCoy 5A tenyésztő-oldatot, amely 0,75% agart tartalmaz, összekeverünk, szövettenyésztéshez szolgáló műanyag tálba (35 mm átmérő) öntjük, megalvasztjuk és 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük 5% CO₂/95% levegő keverékben, 100%-os nedvességtartalomnál. Tíz nappal később a képződött telepek számát meghatározzuk (egy telep legalább 50 sejtet tartalmaz), és az SCA meghatározásához egységül azt az aktivitást vesszük, amely egy telep képződéséhez szükséges.

(b) Egércsontvelő-sejtekkel:

Ló-szérumot (0,4 ml), 0,1 ml mintát, 0,1 ml C3H/He (nőstény) egércsontvelő sejtszuszpenziót (0,5-lxl0⁵) központi sejt), és 0,4 ml módosított McCoy 5A tenyésztő-oldatot, amely 0,7% agart tartalmaz, összekeverünk, szövettenyésztéshez szolgáló műanyag tálba (35 mm átmérő) öntjük, megalvasztjuk, és 5 napon át tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten, 5% CO₂/95% levegő keverékben, 100% nedvességtartalomnál. A képződött telepek számát megszámoljuk (egy telep legalább 50 sejtet tartalmaz), és a CSA meghatározásához egységül azt az aktivitást vesszük, amely 1 telep képződéséhez szükséges.

A módosított McCoy 5A tenyésztő-oldatot, amelyet mind az (a), mind a (b) módszerben alkalmazunk, és az (a) módszerben alkalmazott nem-tapadó humán csontvelő sejtszuszpenziót az alábbi eljárásokkal készítjük. Módosított McCoy 5A tenyésztő-oldat (dupla koncentráció).

g McCoy 5A tenyésztő-oldatot (Gibco), 2,55 g MÉM aminosav-vitamin tápközeget (Nissu Seiyaku Co., Ltd), 2,18 g nátrium-bikarbonátot és 50000 egység kálium-penicillin G-t feloldunk két részletben

500 ml desztillált vízben és az oldatot aszeptikusán szűrjük Millipor szűrőn keresztül (0,22 pm).

Humán csontvelő nem-összetapadó sejtszuszpenzió

Egészséges személytől mellcsonti punkcióval nyert csontvelő-folyadékot ötszörösére hígítjuk RPMI 1640 tenyésztő-oldatban, Ficoll-Paque oldatra (Pharmacia Fine Chemicals) rétegezzük, és 400 g-nál centrifugáljuk 30 percen át 25 °C hőmérsékleten. A határfelületi sejtréteget (sűrűség < 1,077) kinyerjük. A sejteket mossuk, 5xl0⁶ sejt/ml koncentrációra állítjuk be RPMI 1640 tenyésztő oldattal, amely még 20% borjúembrió szérumot is tartalmaz, majd 25 cm²-es, szövettenyésztéshez szolgáló műanyag-edénybe öntjük, és 30 percen át inkubáljuk CO₂ inkubátorban. A nem összetapadó sejteket a felülúszóban kinyerjük, műanyag edénybe (25 cm²) öntjük, és 2 és 1/2 órán át inkubáljuk. A felülúszóban levő nem-összetapadó sejteket összegyűjtjük és a mérésben felhasználjuk.

1. példa

A CHU-2 kialakítása

Szájrákban szenvedő betegből, ahol a neutrofilek számában hangsúlyozott növekedés volt észlelhető, tumort ültetünk át nu/nu egerekbe. Mintegy 10 nappal az átültetés után jelentős növekedést tapasztalhatunk a tumor tömegében és a neutrofilek számában. 12 nappal az átültetés után a tumort aszeptikusán kivesszük, 12 mm³-es kockákra daraboljuk, és a következő módon tenyésztjük.

10-15 tumor-kockát helyezünk 50 ml-es műanyag centrifugacsőbe. 5 ml tripszin-oldat (amely 0,25% tripszint és 0,02% EDTA-t tartalmaz) hozzáadása után a csövet 10 percen át rázatjuk meleg fürdőben 37 °C hőmérsékleten, és a felülúszót eldobjuk. Azonos tripszinoldat további 5 ml-ét adjuk hozzá, és tripszines emésztést hajtunk végre keverés mellett 15 percen át 37 °C hőmérsékleten. A felülúszó sejtszuszpenziót kinyerjük és jégen tároljuk, miután a tripszint 1 ml borjúembriószérum hozzáadásával inaktiváltuk.

Miután ezeket a folyamatokat még egyszer megismételtük, a sejt-szuszpenziót kinyerjük, az előzőleg kapott szuszpenzióval egyesítjük, és 15 000 ford/perccel 10 percen át centrifugáljuk, hogy sejt-üledéket kapjunk. Az üledéket kétszer mossuk 10% borjú-embrió szérumot tartalmazó F-10-zel, és ezután műanyag tenyésztő-edénybe (25 cm²) helyezzük, 5xl0⁶ sejl/edény koncentrációt biztosítva. Egy éjszakán át CO₂ inkubátorban végzett inkubálás után (5% CO₂ és 100% nedvességtartalom) 10% borjúembrió-szérumot tartalmazó F-10 tenyésztő-oldattal, a felülúszót eltávolítjuk a nem-összetapadó sejtekkel együtt, és a tenyésztést folytatjuk tenyésztő-oldat friss adagjával. Hat nappal a tenyésztés megkezdése után az edény sejtektől telítetté válik, és a tenyésztő-oldatot friss oldattal helyettesítjük. A következő napon a tenyésztő-oldatot eldobjuk és az edényt megtöltjük 2 ml RPMI 1640-nel ötszörösére hígított anti-egéreritrocita antitesttel (Cappel) és 2 ml RPMI 1640-nel 2,5-szeresére hígított tengerimalac komplementtel (Kyokuto Seiyaku Co. Ltd). 20 percen át 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás

HU 209 147 Β után a tenyészetet kétszer mossuk 10% borjúembriószérumot tartalmazó F-10-zel, és a nu/nu egér eredetű fibroblasztokat eltávolítjuk. Ezt követően 10% borjúembrió-szérumot tartalmazó F-10 tenyészoldatot adunk hozzá és a tenyésztést további két napon át folytatjuk. Ezután néhány sejtet kinyerünk és klónozásnak vetünk alá a korlátozó hígításos módszerrel.

Az így létrejött 11 kiónt CSF aktivitásra átvizsgáljuk; egy klón, a CHU-2 mintegy tízszer olyan nagy aktivitást mutat, mint a többi klón.

2. példa

CSF izolálása

Az 1. példában létrehozott sejteket teljesen sűrű populációban növesztünk két tenyésztő-edényben (150 cm²). A sejteket kinyerjük, 500 ml, 10% borjúembrió-szérumot tartalmazó F-10 tenyésztő-oldatban szuszpendáljuk, átvisszük 1580 cm²-es forgó üvegpalackba (Belco), és forgatva tenyésztjük 0,5 fordulat/perccel. Amikor a sejtekről úgy találjuk, hogy teljes sűrűségű populációban kinőttek a forgó palac belső falán, a tenyésztő-oldatot szérummentes RPMI 1640nel helyettesítjük, 4 napos tenyésztés után a tenyészet felülúszóját kinyerjük, és a tenyésztést tovább folytatjuk, miután 10% borjúembrió-szérumot tartalmazó F10-et adtunk hozzá. 3 napos tenyésztés után a tenyésztő oldatot ismét szérummentes RPMI 1640-nel helyettesítjük, és a tenyészet felülúszóját 4 nappal később kinyerjük. Ezeket az eljárásokat megismételve 500 ml/palack szérummentes tenyészet-felülúszót kapunk hetenként. Ezenkívül ez a módszer lehetővé teszi a tenyészet felülúszó kinyerését, míg a sejtek jelentősen megnyújtott időtartamon át fennmaradnak.

Egy tételt, amely a kapott tenyészet-felülúszó 5000 ml-ét tartalmazza, összekeverünk 0,01% Tween 20-szal, és mintegy 1000-szeresére koncentráljuk Hollow Fiber DC-4-gyel és Amicon ΡΜ-10-zel (Amicon) végzett ultraszűrés útján. A koncentrátumot az alábbi lépések szerint tisztítjuk.

(i) A koncentrált tenyészet-felülúszó 5 ml-es adagját gélszűrésnek vetjük alá Ultrogel AcA54 oszlopon (4,6 cm átmérő, 90 cm magasság, LKB) mintegy 50 ml/óra átfolyási sebességgel 0,01 mól/I-es trisz-HCl pufferral (pH 7,4), amely 0,15 mól/1 NaCl-t és 0,01% Tween 20-at (Nakai Kagaku Co., Ltd) is tartalmaz. Az oszlopot szarvasmarha szérum-albuminnal (molekulatömeg: 67000), olvalbuminnal (molekulatömeg 45000), és citokróm C-vel (molekulatömeg 12400) kalibráljuk. A gélszűrés elvégzése után a frakciók mindegyikéből 0,1 ml-t tízszeresére hígítunk, és átvizsgáljuk aktív frakciókra a CSA meghatározás (b) fentebb leírt módszerével. A Ve = 400-700 ml-hez tartozó frakciókról úgy találjuk, hogy makrofág-domináns CSA-t mutatnak, míg a Ve=800-1200 ml-hez tartozó frakciók granulocita-domináns CSA-t mutatnak. Ezért az utóbbi frakciókat összegyűjtjük és ultraszűrő berendezéssel (PM-10 Amicon) mintegy 5 ml-re koncentráljuk.

(ii) A koncentrált frakciókhoz 30% n-propanolt tartalmazó 0,1 %-os trifluor-ecetsav oldatot adunk - (az aminosav-szekvencia meghatározásához, rendelkezésre áll a Tokyo Kaséi K. K.-nál). Miután a keveréket mintegy 15 percen át jégen állni hagytuk, a csapadékot 10 perces, 15000 ford./perccel végzett centrifugálással eltávolítjuk.

A felülúszót μ-Bondapak C18 oszlopon adszorbeáljuk (8 mmx30 cm, fél-preparatív használatra; Waters gyártmány), amelyet előzőleg n-propanolt és trifluorecetsavat tartalmazó vizes oldattal kiegyensúlyoztunk; az oszlopot folytonosan eluáljuk 0,1 %-os vizes trifluor-ecetsav oldattal, amely n-propanolt tartalmaz, 30-60% lineáris koncentrációval. Nagy nyomású folyadékkromatográfiás berendezést [Hitachi Model 685-50 (Hitachi Ltd.)], és egy detektort [Hitachi Model 638-41 (Hitachi Ltd.)] alkalmazunk, hogy meghatározzuk az abszorpciókat 220 nm-nél és 280 nm-nél egyidejűleg. Eluálás után mindegyik frakcióból 10 μΐ-t 100-szorosára hígítunk, és aktív frakciókra átvizsgáljuk a CSA meghatározás (b) fentebb leírt módszerével. A 40% n-propanollal eluált csúcsokról úgy találjuk, hogy rendelkeznek CSA aktivitással, így ezeket összegyűjtjük, újra kromatografáljuk azonos körülmények között, és CSA-ra meghatározzuk azonos módszerrel. A CSA aktivitást ismét a 40% n-propanolnál lévő csúcsokban figyeljük meg. Ezért ezeket a csúcsokat öszszegyűjtjük (4 frakció = 4 ml) és fagyasztva szárítjuk.

(iii) A fagyasztva szárított port feloldjuk 200 μΐ, 40% n-propanolt tartalmazó 0,1 %-os trifluor-ecetsav vizes oldatban, és az oldatot nagy nyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá TSK-G 3000SW oszlopon (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd;

7,5 mmx60 cm). Az eluálást azonos vizes oldattal hajtjuk végre 0,4 ml/perc átfolyási sebességnél, és a frakciókat 0,4 ml-es adagokban vesszük le FRAC-100 frakció-gyűjtővel (Pharmacia Fine Chemicals). A levett frakciók mindegyikét ellenőrizzük CSA aktivitásra ugyanazon a módon, amint fentebb leírtuk, és aktivitást figyelünk meg a 37-38 perc retenciós időhöz tartozó frakciókban (ez kb. 2xl0⁴ molekulatömegnek felel meg). Az aktív frakciókat kinyerjük és analitikai μBondapak C18 oszlopon (4,6 mmx30cm) tisztítjuk. A fő csúcsokat kinyerjük és fagyasztva szárítjuk. A kapott mintát a CSA meghatározás (a) módszerével meghatározzuk; úgy találjuk, hogy ez humán G-CSF aktivitással rendelkezik.

3. példa

Az aminosav-szekvencia meghatározása (i) Az N-terminális aminosav-szekvencia meghatározása

A mintát Edman-lebontásnak vetjük alá gáz-fázisú szekvencia elemzővel (Applied Biosystems), és az így létrejött PTH aminosavat elemezzük rutin-eljárással nagy nyomású folyadék-kromatográfiás berendezéssel (Beckman Instruments) és Ultrasphere-ODS oszloppal (Beckman Instruments). Az oszlopot (5 pm; 4,6 mm átmérő, 250 m magasság) indító pufferral [15 mmól/1 nátrium-acetát puffért (pH 4,5) és 40% acetonitrilt tartalmazó vizes oldat] kiegyensúlyozzuk, és a mintával (20 μΐ indító pufferban feloldva) injektáljuk. Szepará11

HU 209 147 Β lást hajtunk végre az indító pufferral végzett izokratikus elúcióval. Az átáramlási sebesség 1,4 ml/perc és az oszlop hőmérsékletét 40 °C-on tartjuk. A PTH aminosav kimutatását úgy érjük el, hogy a 269 nm és 320 nm közti UV-tartományban vizsgáljuk az abszorpciókat. A PTH aminosavak (Sigma) standard mintáit 2 nmólos adagokban ugyanezen a vonalon különítjük el, hogy meghatározzuk retenciós időiket, amelyeket összehasonlítunk a vizsgálandó minta retenciós időivel. Ennek eredményeképpen úgy találjuk, hogy az N-terminálistól számított 40 gyök az alábbi aminosavszekvenciával rendelkezik:

H₂N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser(10)

Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys(20)

Leu-Glu-Gln-Val-Arg-Lys-Ile-Gln-Gly(30)

Asp-Gly-Ala-Ala-Leu-Gln-Glu-Lys-Leu(40)

Cys-Ala-Thr-Tyr-Lys(ii) Lebontás brómciánnal

A mintát 70%-os hangyasavban feloldjuk. Az oldathoz 200 ekvivalens mennyiségű brómciánt adunk, amelyet előzőleg szublimációval megtisztítottunk. A keveréket egy éjszakán át állni hagyjuk 37 °C hőmérsékleten, hogy a reakció végbemenjen. A reakcióterméket fagyasztva szárítjuk és HPLC-vel frakcionáljuk TSK G 3000SW oszlopon (Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.), így négy csúcsot kapunk. A négy csúcsot CN-l-nek, CN-2-nek, CN-3-nak és CN-4-nek nevezzük el a molekulatömeg csökkenő sorrendjében. Az első két csúcs (CN-1 és CN-2) jobb hozamú, és ezek aminosav-szekvenciáját automatikus gáz-fázisú szekvencia-elemzővel elemezzük (Applied Biosystems) azonos körülmények között, mint amelyet az (i) pontban alkalmaztunk.

A vizsgálat eredményeképpen úgy találjuk, hogy a G-CSF fehérje N-terminálisáról szánnazó peptid és a CN-2 a következő aminoav-szekvenciával rendelkezik:

Pro-Ala-Phe-Ala-Ser-Ala-PheGln-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-ValLeu-Val-Ala-Ser-His-Leu-Gln(iii) Lebontás tripszinnel

A mintát feloldjuk 8 mól/1 karbamidot tartalmazó 0,1 mól/l-es trisz-HCl pufferban (pH 7,4), és az oldatot összekeverjük 0,1% 2-merkapto-etanolt tartalmazó 0,1 mól/l-es trisz-HCl pufferral (pH 7,4), hogy végső karbamid-koncentrációként 2 mól/l-t kapjunk. TPCKval kezelt tripszirít.(Sigma) adunk hozzá úgy, hogy a minta/enzim hányados 50:1 legyen. A keveréket 4 órán át 25 °C hőmérsékleten tartjuk, és azonos mennyiségű TPCK-val kezelt tripszin hozzáadása után a keveréket további 16 órán át 25 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután a reakcióterméket nagy sebességű fordított fázisú oszlopkromatográfiának vetjük alá C8 oszlopon (Yamamura Kagaku K.K) úgy, hogy az eluálást n-propanolt tartalmazó 0,1%-os TFA-val hajtjuk végre, ahol az n-propanol lineáris sűrűség-gradiense 5-60%. Noha számos csúcsot kapunk az abszorpciót 280 nm-nél mérve, a fő csúcs aminosav-sorrendjét automatikus gáz-fázisú szekvencia-elemzővel (Applied Biosystems) elemezzük azonos körülmények között, ahogyan ezt az (i) részben alkalmaztuk. Ennek eredményeképpen a fő csúcsról úgy találjuk, hogy az alábbi szekvenciával rendelkező peptid, amely az (ii) részben bemutatott CN-2 fragmentum részét tartalmazza:

Gln-Leu-Asp-Val-Ala-Asp-Phe-Ala-ThrThr-Ile-Trp-Gln-Gln-Met-Glu-Glu-LeuGly-Met-Ala-Pro-Ala-Leu-Gln-Pro-ThrGln-Gly-Ala-Met-Pro-Ala-Phe-Ala-Ser4. példa

DNS vizsgálóminta készítése (i) Az (IWQ) vizsgálóminta készítése egymást követő nukleotidot (lásd 1. ábra) készítünk 10 aminosav (Ile-Trp-Gln-Gln-Met-Glu-Glu-LeuGly-Met) szekvenciájának alapján, ez a szekvencia benne foglaltatik a 3(iii) példában kapott aminosav szekvenciában. Szükséges néhány megjegyzést fűzni az 1. ábrában bemutatott nukleotid-jelölésekkel kapcsolatban; így pl. 5’ terminálistól számított 9. helyzetnél levő nukleotid dA és dG ekvimoláris mennyisége. A kiindulási nukleotidok többnyire dimerek, de mononukleotidokat is használunk ha szükséges. Üvegszűrővel felszerelt oszlopot 20 ml kiindulási nukleotid gyantával, Ap-d(G)-vel terhelünk meg (Yamasa Shoyu Co., Ltd). Metilén-kloriddal végzett ismételt mosás után a 4,4’-dimetoxi-tritil csoportot 3% triklór-ecetsavat tartalmazó metilén-klorid oldattal való kezeléssel eltávolítjuk. Ezt követően az oszlopot többször mossuk 1 ml metilén-kloriddal. Miután az oszlopot vízmentes piridinnel átmostuk, hogy kiűzzük az oldószert, 20 mg nukleotid dimert (DMTr)ApTp(NHR₃)-at (Nippon Zeon; NHR₃ = trietil-ammónium; DMTr=dimetoxi-tritil) és 0,2 ml piridint adunk hozzá, és az oszlop belső terét vákuumban szárítjuk vákuum-szivattyú segítségével. Ezt követően 20 mg 2,4,6-trimetil-benzol-szulfonil-3nitro-triazolidot (MSNT, Wako Pure Chemical Industries, Ltd) és 0,2 ml vízmentes piridint adunk hozzá, és az oszlop belső terét nitrogéngázzal kiszorítjuk. A nukleotid-gyantát a dimerrel kondenzáljuk 45 perces reakcióval szobahőmérsékleten, alkalmanként megrázogatva. A reakció teljessé válása után az oszlopot piridinnel mossuk és az el nem reagált OH csoportokat acetilezzük olyan piridin-oldattal, amely fölöslegben tartalmaz ecetsav-anhidridet és 4-dimetil-amino-piridint. Az oszlop piridines mosása után a következő dimereket vagy monomereket kondenzáljuk a leírt sorrendben, megismételve a fentebb leírt eljárást:

(DMTr)Ip(NHR₃), (DMTr)GpGp(NHR₃), (DMTr)Ip(NHR₃), (DMTr)CpTp(NHR₃) és (DMTr)TpTp(NHR₃) ekvimoláris keveréke, (DMTr)ApAp(NHR₃) és (DMTr)ApGp(NHR₃) ekvimoláris keveréke, (DMTr)ApGp(NHR₃) és (DMTr)GpGp(NHR₃) ekvimoláris keveréke, (DMTr)GpAp(NHR₃), (DMTr)TpGp(NHR₃), (DMTr)ApAp(NHR₃) és (DMTr)GpAp(NHR₃) ekvimoláris keveréke, (DMTr)CpAp(NHR₃), (DMTr)ApAp(NHR₃) és (DMTr)ApGp(NHR₃) ekvimoláris keveréke, (DMTr)GpCp(NHR₃),

HU 209 147 Β (DMTr)TpGp(NHR₃), (DMTr)Ip(NHR₃) és (DMTr)ApTp(NHR₃); mindezek a nukleotidok a Nippon Zeon-nál kaphatók, a (DMTr)(Ip(NHR₃) kivételével, amely a Yamasa Shoyu Co., Ltd-nél kapható. A reakció teljessé válása után az utolsó lépésben, a gyantát egymás után mossuk piridinnel, metilén-kloriddal és éterrel acetilezés nélkül, majd szárítjuk. A szárított gyantát 0,5 ml piridin, 0,2 ml víz és 1 ml dioxán összesen 1,7 ml-es keverékében szuszpendáljuk, amely 1 mól/1 tetrametil-guanidint és szintén 1 mól/1 α-pikolin-aldoxim-t tartalmaz. A szuszpenziót szobahőmérsékleten állni hagyjuk egy éjszakán át, majd vákuumban 100-200 μΐ-re koncentráljuk. A koncentrátumot kis mennyiségű (2-3 csepp) piridinnel és 2-3 ml koncentrált vizes ammónia-oldattal összekeverjük, és a keveréket 55 °C hőmérsékleten 6 órán át melegítjük. Etil-acetátos extrahálás után a vizes réteget elkülönítjük és vákuumban koncentráljuk. A koncentrátumot feloldjuk 50 mmól/l-es tríetilammónium-acetát (pH 7,0) oldatban, és az oldatot kromatografáljuk C18 oszlopon (1,0x15 cm, Waters gyártmány), az eluálást aceonitrillel (10-30% lineáris sűrűség-gradiens) végezve 50 mmól/literes trietil-ammónium-acetátban (pH 7,0). A mintegy 25% acetonitril koncentrációnál eluált csúcsfrakciót vákuumban koncentráljuk.

A koncentrátumhoz 80% ecetsavat adunk és a keveréket 30 percen át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Etil-acetáttal végzett extrahálás után a vizes réteget elkülönítjük és vákuumban koncentráljuk. Az így létrejött sűrítményt nagy nyomású folyadék-kromatográfiával tovább tisztítjuk C-18 oszlopon (Senshu Kagaku K. K.; SSC-ODS-272; átmérő: 6 mm, magasság 200 mm). Elúciót végzünk acetonitrillel (10-20%-os lineáris sűrűség-gradiens) 50 mmól/l-es trietil-ammónium-acetát oldatban. Szintetikus DNS-t kapunk 10A_26O egységnél nem kisebb kitermeléssel.

A Maxam-Gilbert szekvenálási módszerrel végzett elemzés [Meth. Enzym. 65,499 (1980)] feltárja, hogy a kapott oligonukleotid az 1. ábrában bemutatott nukleotid-szekvenciával rendelkezik.

(ii) Az (A) vizsgálóminta szintézise egymást követő nukleotidot kapunk (lásd 1. ábra) 5 aminosav (Met-Pro-Ala-Phe-Ala) szekvenciája alapján, amely a 3 (iii) példában kapott aminosav-szekvencián belül megtalálható.

A szintézis-eljárások hasonlóak az (IWQ) vizsgálóminta előállításánál alkalmazottakhoz, és a következő nukleotidokat kondenzáljuk egy nukleotid gyantára, Ap-d(T)-re (Yamasa Shoyu Co., Ltd.) az alább leírt sorrend szerint:

(DMTr)CpAp(NHR₃); (DMTr)GpGp(NHR₃);

(DMTr)CpAp(NHR₃), (DMTr)CpTp(NHR₃), (DMTr)CpGp(NHR₃) és (DMTr)CpCp(NHR₃) ekvimoláris keveréke; (DMTr)ApGp(NHR₃), (DMTr)TpGp(NHR₃), (DMTr)GpGp(NHR₃) és (DMTr)CpGp(NHR₃) ekvimoláris keveréke;

(DMTr)ApAp(NHR₃); (DMTr)CpAp(NHR₃) és (DMTr)CpGp(NHR₃) ekvimoláris keveréke, és (DMTr)Gp(NHR₃). Mindezek a nukleotidok a Nippon Zeon-nál kaphatók. Szintetikus DNS-t kapunk mintegy 1OA_26o egység kitermeléssel. A MaxamGilbert szekvencia-elemzési módszerrel végzett vizsgálat feltárja, hogy a kapott oligonukleotid az 1. ábrában bemutatott nukleotid-szekvenciával rendelkezik.

(iii) Az (LC) vizsgálóminta szintézise

Automatikus DNS szintézist hajtunk végre DNS szintetizáló berendezéssel, az Applied Biosystems Módéi 380A berendezésével. Ezt a technikát, amely a Caruthers és munkatársai által leírt [J. Am. Chem. Soc. 103, 3185 (1981)] alapul, általában foszforamidit eljárásnak nevezik.

A (DMTr)-dT foszforamidit formáját, amelyet előzőleg tetrazollal aktiváltunk, dG-S-sel kondenzáljuk (S: támasz-anyag), ahol az 5’-dimetoxi-tritil csoport (DMTr) blokkolása megszűnik. Ezután a nem reagált hidroxil-csoportokat acetilezzük és jóddal oxidáljuk víz jelenlétében, hogy foszforil-csoportot állítsunk elő. A DMTr csoport blokkolásának feloldása után a kondenzálást azonos módon ismételjük, amíg szintézissel az 1. ábrában bemutatott szekvenciával rendelkező 24 nukleotidot nem kapunk. Ezeket a nukleotidokat a támasz-anyagból lehasítjuk a blokkolást megszüntetjük, és fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk C-18 oszlopon (Senshu Kagaku Co., Ltd.; SSC-ODS-272).

5. példa

CHU-2 sejtek tenyésztése és mRNS előállítása

1. CHU-2 sejtek tenyésztése és kinyerése

Kialakított CHU-2 sejteket növesztünk teljes sűrűségű populációban két tenyésztőedényben (150 cm²), kinyerjük, és 500 ml RPMI 1640 tenyésztő oldatban szuszpendáljuk, amely 10% borjúembrió szérumot is tartalmaz, átvisszük gördülő üvegpalackba (1580 cm², Belco), és gördülő tenyésztésnek vetjük alá 4 napon át 0,5 fordulat/perccel. Amikor a sejtekről úgy találjuk, hogy teljes sűrűségű populációt alkotnak a gördülő palack belső falán, a tenyésztő oldatot a gördülő palackból eltávolítjuk, a palackba 100 ml előmelegített (37 °C) fiziológiás sóoldatot töltünk, amely 0,02% EDTA-t is tartalmaz. 37 °C hőmérsékleten 2 percen át végzett melegítés után a sejteket az üveg belső faláról elkülönítjük pipettázással. Az így létrejött sejtszuszpenziót 1500 fordulat/perccel centrifugáljuk 10 percen át, hogy sejtüledéket kapjunk. A sejteket újra szuszpendáljuk 5 ml EDTA-mentes fiziológiás sóoldatban. A szuszpenziót 1500 fordulat/perccel centrifugáljuk 10 percig, hogy sejtüledéket kapjunk (nedves tömeg, mintegy 0,8 g). Az így kapott sejteket -80 °C hőmérsékleten fagyasztva tároljuk, amíg ezt az RNS kivonására szolgáló eljárásnak alávetjük.

2. Az mRNS tisztítása

Az 1. pontban kapott CHU-2 sejtekből az mRNS izolálását olyan eljárásokkal hajtjuk végre, amelyek lényegében azonosak azzal, amelyet a „Molecular Cloning” c. kiadványban [Maniatis és munkatársai, Cold Spring Harbor, 196. oldal (1982)] leírtak. A fagyasztott CHU-2 sejteket (nedves tömeg 3,8 g) 20 ml oldatban szuszpendáljuk, amely 6 mól/1 guanidint [6 mól/1

HU 209 147 Β guanidínium-izotiocianát, 5 mmól/1 nátrium-szarkozil szulfát] tartalmaz, és a szuszpenziót alaposan felkeverjük örvényeltetéssel 2-3 percen át. A keveréket 10 cikluson keresztül beszívás-kinyomási folyamatnak vetjük alá injekciós tűn át (térfogat: 20 ml), amely 18G-s tűvel van felszerelve. Mintegy 6 ml viszkózus guanidínium-oldatot, amely a szétzúzott sejteket tartalmazza, 5,7 mól/1 CsCl [0,1 mól/1 EDTA-ban (pH 7,5)] 6 ml-es párnájára rétegezzük Beckman SW40TÍ poliallomer centrifugacsőben olyan módon, hogy a cső tele legyen a tartalommal. Négy centrifugacsövet készítünk a fentebb leírt eljárás szerint, és 3000 ford./percnél centrifugáljuk 15 órán át 20 °C hőmérsékleten. Az így létrejött üledéket háromszor mossuk kis mennyiségű 70%-os etanollal.

A megfelelő csövekből kapott üledéket egyesítjük, feloldjuk 550 μΐ vízben, és 0,2 mól/1 NaCI koncentrációra állítjuk be. Fenol-kloroform 1:1 keverékkel, majd egyedül kloroformmal történő kezelés után

2,5 térfogat etanolt adunk hozzá, hogy kicsapjuk a teljes RNS-t (a mintegy 10,1 mg teljes RNS-t 3,8 g nedves sejtből kapjuk).

Poli(A⁺)RNS-t tisztítunk a teljes RNS-ből az affínitás-kromatográfia alábbi eljárásaival, kihasználva, hogy az mRNS 3’ terminálisához poli(A) lánc kötődik. Az adszorpciót az oligo(dT)-cellulózra (P-L Biochemicals 7. típus) úgy hajtjuk végre, hogy a teljes RNS-t átengedjük oligo(dT)-cellulóz oszlopon ráterhelő pufferban [amely 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 0,5 mól/1 NaCl-t, 1 mmól/1 EDTA-t, és 0,1% SDS oldatot tartalmaz], az oldatot előzőleg 65 °C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük. Az oszlopot előzőleg ugyanezzel a ráterhelő pufferral egyensúlyozzuk ki. A poli(A⁾⁺RNS eluálását TE oldattal hajtjuk végre [amely 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5) és 1 mmól/1 EDTA-t tartalmaz]. A nem adszorbeált elfolyó folyadékot újra ráterheljük az oszlopra, és ennek a folyamatnak az ismétlésével kapott eluátumot összekeverjük az először lefutott eluátummal. Ennek az eljárásnak eredményeképpen 400 μg poli(A⁺)RNS-t kapunk.

Az így készített mRNS-t szacharóz sűrűséggradiens centrifugálással méret szerint frakcionáljuk Schleif és Wensink laboratóriumi kézikönyvben [„Practical Methods in Molecular Biology” (Gyakorlati módszerek a molekuláris biológiában), Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin (1981)] leírt eljárással összhangban.

A fentieket részletesebben ismertetve, 5-25% szacharóz sűrűséggradienst alakítunk ki Beckman SW40 Ti centrifugacsőben. Két szacharózoldatot készítünk, 5% és 25% ribonukleáz-mentes szacharózt (Schwarz/Mann) feloldva 0,1 mól/1 NaCl-t, 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 1 mmól/1 EDTA-t és 0,5% SDS-t tartalmazó oldatban. A már leírt módszerrel készített 800 pg mRNS-t [poli(A⁺)RNS] feloldjuk 200-500 μΐ TE oldatban. Az oldatot 65 °C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük, és miután lehűtöttük, a szacharóz sűrűséggradiens oldatokra helyezzük, amelyeket 3000 fordulat/perccel centrifugálunk 20 órán át. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtünk és abszorpciójukat 260 cm-nél mérjük.

A frakcionált RNS-ek méretét standard RNS-ek (28S, 18S, és 5S riboszóma RNS-ek) helyzetének alapján határozzuk meg. Ugyanakkor az egyes frakciók GCSF aktivitását Xenopus laevis oocitáival vizsgáljuk az alábbi eljárással. Először az egyes frakciók mRNSéből vizes oldatot készítünk 1 pg/μΐ koncentrációban; Xenopus-ból (mintegy 1 éves korú) oocitákat veszünk, és az mRNS oldatot ezekbe injektáljuk olyan módon, hogy 50 mg mRNS-t injektálunk 1 oocitába; tíz ilyen oocitát helyezünk 96 üreges mikrotitráló lemez mindegyik üregébe; az oocitákat 48 órán át szobahőmérsékleten tenyésztjük 100 μΐ Barth-tápközegben [88 mól/1 NaCI; 1 mmól/1 KC1; 2,4 mmóVl NaHCO₃; 0,82 mmól/1 MgSO₄; 0,33 mmól/1 Ca(NO₃)₂; 0,41 mmól/1 CaCl₂; 7,5 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,6); 10 mg/1 penicillin; és 10 mg/1 sztreptomicin-szulfát]; a tenyészet felülúszóját kinyerjük, koncentráljuk és tisztítjuk olyan mértékig, hogy alkalmas legyen G-CSF aktivitás meghatározásához.

A G-CSF aktivitásról úgy találjuk, hogy a 15-17S frakciókban van jelen.

6. példa cDNS szintézise (pBR-vonalú cDNS-tár megalkotása)

Az 5. példában kapott poli(A⁺)RNS-ből cDNS-t szintetizálunk Land és munkatársai módszerével [Nucleic Acids Rés. 9,2251 (1981)] a Gublerés Hoffmann módszerével [Gene, 25,263 (1983)] módosított formában.

1. Egyszálú cDNS szintézise

Eppendorf-csövet (űrméret: 1,5 ml) reagensekkel töltünk meg a következő sorrendben: 80 μΐ reakciópuffer (500 mmól/1 KC1, 50 mmól/1 MgCl₂, 250 mmól/1 trisz-HCl, pH 8,3); 20 pL 200 mmól/l-es ditiotreitol; 32 pl 12,5 mmól/l-es dNTP (ez

12,5 mmól/l-t tartalmaz dATP, dGTP, dCTP és dTTP mindegyikéből); 10 pl a-³²P-dCTP (Amersham PB 10205); 32 pl oligo(dT),₂_₁₈ (P-L Biochemicals, 500 pg/ml); 20 pl poli(A⁺)RNS (2,1 pg/μΐ); és 206 pl desztillált víz. Az összesen 400 pl reakcióoldatot 65 °C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük, majd 42 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percig. A melegített oldathoz 120 egység reverz transzkriptázt (Takara Shuzo Co., Ltd) adunk. A reakciót további 2 órán át folytatjuk 42 °C hőmérsékleten, majd 2 μ RN-áz inhibitort (Bethesda Research Laboratories), 20 pl TE oldatot, 16 pl 100 mmól/l-es nátrium-pirofoszfátot és 48 egység (4 pl) reverz transzkriptázt adunk hozzá, és a reakciót 46 °C hőmérsékleten 2 órán át folytatjuk. A reakciót 0,5 mól/1 EDTA (8 pl) és 10% SDS (8 pl) hozzáadásával leállítjuk. Az ezt követő fenol/kloroformos kezeléssel és etanolos kicsapással (kétszer) egyszálú cDNS-t kapunk.

2. dC-lánc ragasztása az egyszálú cDNS-hez

Az 1. pontban kapott egyszálú cDNS-t desztillált vízben feloldjuk. Az oldathoz 60 pl dC-lánc-átadó puffért adunk [400 mmól/1 kálium-kakodilát, 50 mmól/1 trisz-HCl (pH 6,9), 4 mmól/1 ditiotreitol, 1 mmól/1 CoCl₂ és 1 mmól/1 dCTP], és az oldatot 37 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percen át. A reakcióoldat14

HU 209 147 Β hoz 3 μΐ terminális transzferázt (27 egység/μΐ, P-L Biochemicals) adunk és a keveréket 37 °C hőmérsékleten melegítjük, 2,5 percen át. Fenol/kloroformos kezelés (egyszer) és etanolos kicsapás (kétszer) után a dCfarokkal ellátott cDNS-t feloldjuk 40 μΐ TE oldatban, amely 10 mól/1 NaCl-t is tartalmaz.

3. Kettősszálú cDNS szintézise μΐ 2. pontban készített DNS-oldathoz 4 μΐ oligo (dG)]2_i₈-at (200 pg/ml; P-L Biochemicals) adunk, és a keveréket először 65 °C hőmérsékleten 5 percig melegítjük, majd 42 °C hőmérsékleten 30 percig. Miközben a reakcióoldatot 0 °C hőmérsékleten tartjuk, az alábbiakat adjuk hozzá: 80 pl puffer [100 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5), 20 mmól/1 MgCl₂, 50 mmól/1 (NH₄)₂SO₄, és 500 mmól/1 KC1]; 4 pl 4 mmól-os dNTP (amely 4 mmól/l-t tartalmaz dATP, dCTP, dGTP és dTTP mindegyikéből); 60 pl 1 mmól/l-es β-NAD; 210 pl desztillált víz; 20 pl E. coli DNS-polimeráz I (Takara Shuzo Co., Ltd); 15 pl E. coli DNS-ligáz (Takara Shuzo Co., Ltd); és 15 pl E. coli RN-áz H (Takara Shuzo Co., Ltd), és a keveréket reagáltatjuk 12 °C hőmérsékleten 1 órán át. 4 mmól/1 dNTP (4 pl) hozzáadását követően a reakciót 25 °C hőmérsékleten folytatjuk 1 órán át. Az ezt követő fenol-kloroformos kezeléssel és etanolos kicsapással (egyszer) mintegy 8 pg kettősszálú cDNS-t kapunk. Ezt a kettősszálú cDNS-t feloldjuk TE oldatban, és 1,2%-os agaróz gél elektroforézisnek vetjük alá. A mintegy 560 bp-2kbp közti méretnek megfelelő fragmenseket Whatman DE81-en adszorbeáljuk, és mintegy 0,2 g kettősszálú cDNS-t nyerhetünk ki eluálással.

4. dC-lánc hozzáragasztása a kettősszálú cDNS-hez

A 3. pontban készített kettősszálú cDNS-t feloldjuk 40 pl TE oldatban. Miután 8 pl dC-farok hozzáadó puffért, amelynek típusát a 2. pontban határoztuk meg, hozzáadtunk, a keveréket 37 °C hőmérsékleten 2 percig melegítjük. 1 pl terminális transzferáz (27 egység/pl) hozzáadása után a keveréket reagáltatjuk 37 ’C hőmérsékleten 3 percen át. Ezután a reakcióoldatot azonnal lehűtjük 0 °C hőmérsékletre, és a reakciót 1 pl 0,5 mól/l-es EDTA hozzáadásával leállítjuk. Fenolkloroformmal végzett kezelés és etanolos kicsapás után a kapott csapadékot 10 pl TE oldatban szuszpendáljuk.

5. pBR-vonalú cDNS-klóntár megalkotása pl kereskedelemben kapható, oligo(dG)-farokkal ellátott pBR322 vektort (Bethesda Research Laboratories; 10 ng/pl) és 2 pl dC farokkal ellátott kettósszálú cDNS-t, amelyet a 4. pontban nyertünk, 75 pl 0,1 mól/l-es NaCl-t tartalmazó TE oldatban hőkezelünk. A hőkezelés (annealing) három stádiumból áll: melegítés 65 °C hőmérsékleten 5 percen át, ezt követi a melegítés 40 °C hőmérsékleten 2 órán át, végül következik a lehűtés szobahőmérsékletre.

Maniatis és munkatársai laboratóriumi kézikönyvében leírt módszenei összhangban [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 249. oldal (1982)] (itt más rutintechnikákat is lehet alkalmazni), kompetens sejteket készítünk E. coli XI776 törzsből, és a hőkezelt plazmiddal transzformáljuk, hogy transzformánsokat állítsunk elő.

7. példa cDNS szintézis (λ-fág klóntár megalkotása)

1. Egyszálú cDNS szintézise

Az 5. példában leírt eljárással összhangban 3,8 g fagyasztott CHU-2 sejtet tisztítunk kétszer oligo(dT)cellulóz oszlopon, majd feldolgozzuk, így kapunk 400 pg poli(A⁺)RNS-t.

100 pl TE oldatot, amelyben 12 pg poli(A⁺)RNS van feloldva, 10 pg aktinomicin D-t (Sigma) tartalmazó reakciócsőbe helyezünk. A csövet ezután megtöltjük reagensekkel a következő sorrendben: 20 pl reverz transzkriptáz puffer [250 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,3), 40 mmól/1 MgCl₂,250 mmól/1 KC1]; 20 pl 5 mmól/l-es dNTP (amely egyaránt 5 mmól/l-t tartalmaz dATP-ből, dGTP-ből, dCTP-ből és dTP-ből); 20 pl oligo(dT)₁₂_i₈ (0,2 pg/ml; P-L Biochemicals); 1 pl 1 mól-es ditiotreitol; 2 pl RN-azin (30 egység/pl; Promega Biotech); 10 pl reverz transzkriptáz (10 egység/pl); Sikogaku Kogyo Co., Ltd); 1 pl a-³²P-dATP (10 pCi, Amersham); és 16 pl víz. Az összesen 100 pl térfogatot kitevő reakcióoldatot 42 °C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át, és a reakciót, 0,5 mól/l-es EDTA (5 pl) és 20%-os SDS (1 pl) hozzáadásával leállítjuk. Az ezt követő fenol/kloroformos kezeléssel (100 pl) és etanolos kicsapással (kétszer) mintegy 4 pg egyszálú cDNSt kapunk.

2. Kettősszálú cDNS szintézise

Az 1. pontban kapott cDNS-t feloldjuk 29 pl TE-oldatban, és reakcióoldatot készítünk az alábbi reagensek hozzáadásával a leírt sorrendben: 25 pl polimeráz puffer [400 mmól/1 Hepes (pH 7,6), 16 mmól/1 MgCl₂, 63 mmól/1 β-merkapto-etanol és 270 mmól/1 KC1]; 10 pl 5 mmól/l-es dNTP; 1 pl 15 mmól/l-es β-NAD; 1 pl a-³²P-dATP (10 pCi/pl); 0,2 pl E. coli DNS ligáz (60 egység/pl; Takara Shuzo Co., Ltd); 5,0 pl E. coli DNS polimeráz I (New England Biolabs; 10 egység/pl); 0,1 pl RN-áz H (60 egység/pl; Takara Shuzo Co., Ltd); és 28,7 pl desztillált víz.

A reakcióoldatot 14 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáljuk, hagyjuk szobahőmérsékletre beállni, és ezen inkubáljuk további 1 órán át. Ezután a reakciót 0,5 mól/l-es EDTA (5 pl) és 20%-os SDS (1 pl) hozzáadásával leállítjuk, és fenol/kloroformos kezelést és etanolos kicsapást végzünk. A kapott DNS-t feloldjuk 20 pl 0,5 mmól/l-es EDTA-ban, majd reakcióoldatot képzünk a következők hozzáadásával; 3 pl Klenowpuffer [500 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,0) és 50 mmól/1 MgCl₂); 3 pl 5 mmól/l-es dNTP, és 4 pl víz. 1 pl DNSpolimeráz (Klenow-fragmens, Takara Shuzo Co., Ltd) hozzáadása után a reakcióoldatot 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percen át. '

Az inkubált reakcióoldatot felhígítjuk 70 pl TE-oldattal és a reakciót 0,5 mól/1 EDTA (5 pl) és 20%-os SDS (1 pl) hozzáadásával leállítjuk. Az ezt követő fenol/kloroformos kezeléssel és etanolos kicsapással mintegy 8 pg kettősszálú cDNS-t kapunk.

3. A kettősszálú cDNS metilezése

A 2. pontban szintetizált cDNS vizes oldatát (30 pl) összekeverjük 40 pl metilező pufferral [500 mól/1 triszHCl (pH 8,0), 50 mmól/1 EDTA]; 20 pl SAM oldattal

HU 209 147 Β [800 μηηόΐ/ΐ S-adenozil-L-metil-metionin (SAM), 50 mmól/1 β-merkapto-etanol]; és 100 μΐ vízzel. A keverékhez 15 μΐ EcoRI-metilázt (New England Biolabs; 20 egység/μΙ) adunk, hogy a reakcióoldat összesen 200 μΙ-t tegyen ki. 37 °C hőmérsékleten 2 órán át végzett inkubálást követően fenolos és éteres kezelést, valamint etanolos kicsapást hajtunk végre, hogy a DNS-t kinyerjük.

4. EcoRI kapcsoló (linker) hozzáadása

Mintegy 1,2 μg metilezett kettősszálú DNS-hez

1,5 μΐ ligáz puffért [250 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5) és 100 mmól/1 MgCl₂); 0,5 μΐ előzetesen foszforilezett EcoRI-kapcsolót (10 mer; Takara Shuzo Co., Ltd);

1,5 μΐ 10 mmól/l-es ATP-t; 1,5 μΐ 100 mmól/l-es ditiotreitolt; és 2 μΐ H₂O-t adunk hozzá, hogy összesen 15 μΐ térfogatú reakciókeveréket kapjunk. Miután 0,7 μΐ T₄ DNS ligázt (3,4 egység/μΙ; Takara Shuzo Co., Ltd) adtunk hozzá, a reakciót egy éjszakán át végezzük 4 °C hőmérsékleten. Ezután a ligázt 65 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett melegítéssel inaktiváljuk. A reakcióoldatot 50 μΙ-re egészítjük ki 100 mmól/l-es trisz-HCl (pH 7,5), 5 mmól/1 MgCl₂, 50 mmól/1 NaCl és 100 μg/ml zselatin hozzáadásával. EcoRI (3,5μ1; 10 egység/μΙ) hozzáadása után a reakciót 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 2 órán át. Ezt követően 2,5 μΐ 0,5 mól/l-es EDTA-t és 0,5 μΐ 20%-os SDS-t adunk hozzá, ezt követi a fenol/kloroformos kezelés és etanolos kicsapás, ilyen módon nyerjük ki a DNS-t. Ezután az el nem reagált EcoRI kapcsolót Ultrogél AcA34-en (LKB) végzett gélszűréssel vagy agaróz gélelektroforézissel eltávolítjuk, így mintegy 0,5-0,7 μg, kapcsolóval kiegészített kettősszálú cDNS-t kapunk.

5. A kettősszálú cDNS egyesítése LgtlO vektorral

A kapcsolóval kiegészített kettősszálú cDNS-t összekeverjük 2,4 μg előzetesen EcoRI-gyel kezelt XgtlO vektorral (Vector Cloning System), 1,4 μΐ ligáz pufferral (250 mmól/1 trisz-HCl és 100 mmól/1 MgCl₂) és 6,5 μΐ desztillált vízzel, és a keveréket 42 ’C hőmérsékleten 15 percig melegítjük. Ezután 1 μΐ 10 mmól/1 ATP-t, 1 μΐ 0,1 mól/1 ditiotreitolt és 0,5 μΐ T₄ DNS ligázt adunk hozzá, hogy 15 μ! teljes térfogatot érjünk el, és a reakciót 12 °C hőmérsékleten egy éjszakán át folytatjuk.

6. In vitro „pakolás”

Az 5. részben készített rekombináns DNS mintegy harmadát „becsomagoljuk” in vitro „csomagoló” készlettel (Promega Biotech), hogy fág tarfoltokat kapjunk.

8. példa

A pBR-vonalú klóntárt átvizsgálása (IWQ) vizsgálómintával

Whatman 541 papírt helyezünk telep-nővesztő agar tápközegre, és 37 °C hőmérsékleten 2 órán át állni hagyjuk. A szűrőpapírt ezután Taub és Thompson módszerével [Anal. Biochem. 726,222 (1982)] kezeljük az alábbi módon.

A telepeket, amelyeket az 541. típusú papírra átvittünk, 37 ’C hőmérsékleten egy éjszakán át tovább növesztjük olyan agar tápközegen, amely kloramfenikolt (250 μg/l) is tartalmaz.

Az 541. típusú papírt kivesszük és szobahőmérsékleten hagyjuk állni 3 percig egy másik szűrőpapír-íven, amelyet előzőleg 0,5 n NaOH oldattal impregnáltunk. Ezt a folyamatot még kétszer megismételjük. Két hasonló menetet hajtunk végre 3 percig, 0,5 mól/1 triszHCl (pH 8) oldatot alkalmazva. 4 ’C hőmérsékleten a kezelést 0,05 mól/1 trisz-HCl (pH 8) oldattal végezzük 3 percen át, majd 1,5 mg/ml-es lizozim-oldattal [amely 0,05 mól/1 trisz-HCl-t (pH 8) és 25% szacharózt is tartalmaz) 10 percen át, utána 37 °C hőmérsékleten kezelést hajtunk végre lxSSC oldattal (0,15 mól/1 NaCl és 0,015 mól/1 nátrium-citrát) 2 percig, és lxSSC oldattal, amely 200 μg/ml K proteinázt is tartalmaz, 30 percig, végül szobahőmérsékleten kezelést hajtunk végre lxSSC oldattal 2 percig, és 95%-os etanol-oldattal 2 percig. Az utolsó lépést kétszer ismételjük. Ezután az 541. típusú papírt megszárítjuk. A szárított 541. típusú papírt 30 percre szobahőmérsékleten fenol/kloroform/izoamilalkohol 25:24:1 arányú keverékébe merítjük [amely 100 mmól/1 trisz-HCl-lel (pH

8.5) , 100 mmól/1 NaCl-lel és 10 mmól/1 EDTA-val van kiegyensúlyozva]. Ezt követően hasonló eljárásokat ismételünk meg háromszor 5xSSC oldattal 3 percre, majd kétszer 95%-os etanol-oldattal 3 percre. Ezután a szűrőpapírt megszárítjuk.

A vizsgálómintát (IWQ) rutineljárásokkal ³²P-vel megjelöljük (lásd a „Molecular Cloning” c. kiadványt), és telephibridizálást hajtunk végre Wallace és munkatársai módszere alapján [Nucleic Acids Rés. 9, 879 (1981)]. Előhibridizálást hajtunk végre 65 ’C hőmérsékleten 4 órán át előhibridizáló pufferban, amely 6xNET-et [0,9 mól/1 NaCl, 0,09 mól/1 trisz-HCl (pH

7.5) , és 6 mmól/1 EDTA], 5xDenhardt oldatot, 0,1% SDS-t és 0,1 mg/ml denaturált DNS-t (borjúembrió csecsemőmirigy) tartalmaz. Ezután a hibridizálást egy éjszakán át 56 ’C hőmérsékleten végezzük hibridizáló pufferban (ennek összetételét lásd följebb), amely lxlO⁶ cpm/ml radioaktívan jelzett vizsgálómintát (IWQ) is tartalmaz. A reakció teljessé válása után az 541. típusú papírt kétszer mossuk 6xSSC oldattal (amely 0,1% SDS-t is tartalmaz) 30 percen át szobahőmérsékleten, majd 56 ’C hőmérsékleten mossuk

1,5 percen át. A mosott 541. típusú papírt azután autoradiográfiának vetjük alá.

A plazmidot a pozitív kiónokból elkülönítjük és Southern-foltképzésnek vetjük alá (IWQ) vizsgálómintával. Hibridizálást és autoradiográfiát végzünk azonos körülmények között, ahogyan fentebb leírtuk.

Hasonló Southem-hibridizálást hajtunk végre az (A) vizsgálómintával is. A fentebb leírt összetételű hibridizáló puffért alkalmazva hibridizálást hajtunk végre először 49 ’C hőmérsékleten 1 órán át. Miután hagytuk lehűlni 39 ’C hőmérsékletre, a hibridizálást tovább folytatjuk ezen a hőmérsékleten 1 órán át. Miután a reakció teljessé vált, a nitrocellulóz szűrőt kétszer mossuk 6xSSC oldattal, amely 0,1% SDS-t tartalmaz, 30 percen át szobahőmérsékleten, majd 39 ’C hőmérsékleten mossuk 3 percig. A mosott papírt autoradiográfiának tesszük ki.

A fentiek eredményeképpen egyetlen kiónt találunk

HU 209 147 Β pozitívnak. A didezoxi-módszerrel végzett nukleotidszekvencia-elemzés feltárja, hogy ez a klón 308 bázispárból összetevődő DNS-sel rendelkezik, amely tartalmazza mind az (IWQ), mind az (A) vizsgálóminta részleteit. Az ezt a beiktatott részt tartalmazó, pBR322 eredetű plazmidot pHCS-1-nek nevezzük.

9. példa λ-fág vonalú klóntár átvizsgálása pHCS-eredetű

DNS vizsgálómintával

Tarfolt-hibridizálást hajtunk végre Benton és Davis módszerével [Science, 196,180 (1977)]. A 8. példában kapott pHCS-l-et Sau3A-val és EcoRI-gyel kezeljük, hogy egy mintegy 600 bp-s DNS-fragmentumot kapjunk. Ezt a DNS-fragmentumot radioaktív jelzéssel látjuk el bemetszéses (nick) transzláció segítségével a rutin-eljárásokkal összhangban. Nitrocellulóz szűrőt (S and S) helyezünk a fág-tarfolt-növesztő agar tápközegre, hogy a fágokat a szűrőre átvigyük. A fág DNS 0,5 mól/l-es NaOH-val történő denaturálása után a szűrőpapírt a következő folyamatokkal kezeljük: kezelés 0,1 mól/l-es NaOH-t és 1,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal 20 másodpercig; két kezelés 0,5 mól/1 triszHCl-t (pH 7,5) és 1,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal 20 másodpercig; végül kezelés 120 mmól/1 NaCl-t, 15 mmól/1 nátrium-citrátot, 13 mmól/1 KH₂PO₄-et és 1 mmól/1 EDTA-t (pH 7,2) tartalmazó oldattal 20 másodpercig.

A szűrőt ezután szárítjuk és 80 °C hőmérsékleten melegítjük 2 órán át, hogy a DNS-t immobilizáljuk. Elő-hibridizálást végzünk egy éjszakán át 42 °C hőmérsékleten elő-hibridizáló pufferban, amely 5xSSC-t, 5xDenhardt-oldatot, 50 mmól/1 foszfát puffért, 50% formamidot, 0,25 mg/ml denaturált DNS-t (lazac sperma DNS) és 0,1% SDS-t tartalmaz. A hibridizálást ezután 42 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 20 órán át hibridizáló pufferban, amely 4xl0⁵ cpm/ml pHCS-1 vizsgálómintát tartalmaz, amelyet előzőleg radioaktív jelzéssel láttunk el bemetszéses (nick) transzláció alkalmazásával. Ez a hibridizáló puffer 5xSSC, 5xDenhardt-oldat, 20 mmól/1 foszfát-puffer (pH 6,0), 50% formamid, 0,1% SDS, 10% dextrán-szulfát és 0,1 mg/ml denaturált DNS (lazac sperma DNS) keveréke.

A hibridizált nitrocellulóz szűrőt 20 percig mossuk 0,1% SDS-t tartalmazó 2xSSC-vel szobahőmérsékleten, majd 30 percig mossuk 0,1% SDS-t tartalmazó 0,lxSSC-vel 44 '°C hőmérsékleten, végül 10 percig mossuk 0,lxSSC-vel szobahőmérsékleten. Ezután végezzük a kimutatást autoradiográfia segítségével.

A fenti műveletek eredményeképpen öt pozitív kiónt (G1-G5) kapunk. A „teljes hosszúságú” cDNS-t tartalmazó klón DNS nukleotid szekvenciáját didezoxi-módszerrel ellenőrizzük, és a 3A ábrában bemutatott nukleotid-szekvenciát azonosítjuk. Ezt a cDNS-t kihasítjuk a ÁgtlO vektorból és pBR327-tel [Soberon és munkatársai: Gene, 9, 287 (1980)] egyesítjük az EcoRI helynél, olyan plamidot alakítva ki, amelyet nagy mennyiségben lehet előállítani. Ezt a plazmidot pBRG4-nek nevezzük.

10. példa λ-fág vonalú klóntár átvizsgálása pBRG4-eredetű

DNS vizsgálómintával és (LC) vizsgálómintával

Tarfolt-hibridizálást hajtunk végre Benton és Davis módszerével (Science, fentebb idézett munka), amelyet a 9. példában is alkalmaztunk. Nitrocellulóz szűrőt (S and S) helyezünk a fág tarfolt növesztő agar tápközegre, hogy a fágokat a szűrőre vigyük. A fág DNS 0,5 mól/l-es NaOH-val történő denaturálása után a szűrőt a következő eljárásokkal kezeljük: kezelés 0,1 mól/1 NaOH-t és 1,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal 20 másodpercig; majd két kezelés 0,5 mól/1 triszHCl-t (pH 7,5) és 1,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal 20 másodpercig, végül kezelés 120 mmól/1 NaCl-t 15 mmól/1 nátrium-citrátot, 13 mmól/1 KH₂PO₄-et és 1 mmól/1 EDTA-t (pH 7,2) tartalmazó oldattal 20 másodpercig. A szűrőt ezután szárítjuk, és 80 °C hőmérsékleten melegítjük 2 órán át, hogy a DNS-t immobilizáljuk. Két ívet készítünk ugyanebből a szűrőből olyan módon, ahogyan ezt fentebb leírtuk, és pBRG4eredetű DNS-vizsgálómintával és (LC) vizsgálómintával való átvizsgálásnak vetjük alá.

A pBRG4-eredetű DNS-mintával való átvizsgálást az alábbi módszerrel hajtjuk végre. A pBRG4-et EcoRI-gyel kezeljük, hogy egy mintegy 1500 bp-s DNS fragmentumot kapjunk. Ezt a DNS-fragmentumot radioaktív jelzéssel látjuk el bemetszéses (nick) transzlációval, a rutin-eljárásokkal összhangban. A két nitrocellulóz szűrő egyikét elő-hibridizálásnak vetjük alá egy éjszakán át 42 °C hőmérsékleten elő-hibridizáló pufferban, amely 5xSSC-t, 5xDenhardt-oldatot, 50 mmól/1 foszfát-puffért, 50% formamidot, 0,25 mg/ml denaturált DNS-t (lazac sperma DNS) és 0,1% SDS-t tartalmaz. Ezután a szűrőt hibridizálásnak vetjük alá 42 °C hőmérsékleten 20 órán át hibridizáló pufferban, amely radioaktívan jelzett, mintegy 1500 bp-s DNS vizsgálómintát tartalmaz (kb. lxlO⁶ cpm/ml). Ez a hibridizáló puffer 5xSSC, 5xDenhardt-oldat, 20 mmól/1 foszfát-puffer (pH 6,0), 50% formamid, 0,1% SDS, 10% dextrán-szulfát és 0,1 mg/ml denaturált DNS (lazac sperma DNS) keveréke. A hibridizált nitrocellulóz szűrőt 20 percen át mossuk 0,1% SDS-t tartalmazó 2xSSC-vel szobahőmérsékleten, majd 30 percen át 0,1% SDS-t tartalmazó 0,lxSSC-vel 44 °C hőmérsékleten, végül 10 percen át 0,lxSSC-vei szobahőmérsékleten. Ezután akimutatást végezzük el autoradiográfiával.

. Az (LC) vizsgálómintával történő átvizsgálást az alábbi eljárások szerint hatjuk végre. A második szűrőt előzetesen 65 °C hőmérsékleten 2 órán át kezeljük 0,1% SDS-t tartalmazó 3xSSC-vel. Ezután elő-hibridizálást hajtunk végre 65 °C hőmérsékleten 2 órán át olyan oldatban, amely 6xNET-et, lxDenhardt-oldatot és 100 pg/ml denaturált DNS-t (lazac sperma DNS) tartalmaz. A hibridizálást ezután egy éjszakán át végezzük 63 °C hőmérsékleten a radioaktívan jelzett (LC) vizsgálómintát (2xl0⁶ cpm/ml) tartalmazó hibridizáló pufferban. Ez a hibridizáló puffer is 6xNET, lxDenhardt-oldat és 100 pg/ml denaturált DNS (lazac sperma DNS) keveréke. A hibridizált nitrocellulóz

HU 209 147 Β szűrőt háromszor mossuk szobahőmérsékleten (2020 percig) 0,1% SDS-t tartalmazó 6xSSC-vel, majd mossuk ugyancsak 0,1% SDS-t tartalmazó 6xSSC-vel 63 °C hőmérsékleten 2 percig.

A szűrőt megszárítjuk és a kimutatást autoradiográfiával végezzük el.

A fentebb leírt átvizsgálásban azokat a kiónokat választjuk ki, amelyek mindkét vizsgálómintához pozitívak, és azt a kiónt, amely „teljes hosszúságú” cDNS-t tartalmaz, megvizsgáljuk nukleotid-szekvenciára a didezoxi-módszerrel. Úgy találjuk, hogy a 4A ábrában bemutatott nukleotid-szekvenciával rendelkezik. Ezt a cDNS-t kihasítjuk a XgtlO vektorból és pBR327-tel egyesítjük az EcoRI helyen, így készítve el a pBRV2 plazmidot.

77. példa

Humán kromoszomális géntár átvizsgálása 1, Humán kromoszomális géntár megalkotása

A humán kromoszomális géntárat, amelyhez dr. Maniatis (Harvard University) szívességéből jutottunk hozzá, a következő eljárásokkal készítették: a teljes kromoszomális DNS-t fenollal vagy más megfelelő vegyszerrel vonták ki emberi embriómájból és részben emésztették HaelII és Alul restrikciós enzimekkel; az így létrejött DNS fragmentumokat szacharóz sűrűséggradiens centrifugálással kezelték, hogy a mintegy 1825 kb hosszúságú lánccal rendelkező fragmentumokat koncentrálják; a koncentrált fragmentumokat az E. coli XCharon 4A fág DNS-ével egyesítették, olyan rövidláncú szintetikus nukleotidok beiktatásával, amelyek EcoRI restrikciós hasítóhelyekkel rendelkeznek, így fertőző fág DNS rekombinánsokat készítettek; a nagyobb fertőzőképesség biztosítása érdekében finomabb fág részecskéket alkottak meg (in vitro) pakolással. Az így előállított humán géntárat elméletileg úgy lehet tekinteni, mint 18-25 kb lánchosszúságú humán DNSeket tartalmazó rekombináns készletet, amely tartalmazza gyakorlatilag az összes humán gént.

Humán kromoszomális gén-klóntár átvizsgálása a pHCS-1 eredetű DNS vizsgálómintával

Tarfolt-hibridizálást hajtunk végre Benton és Davis módszerével [Science, 796,180 (1977)]. A 8. példában kapott pHCS-1-et Sau3A-val és EcoRI-gyel kezeljük, hogy mintegy 600 bp-s DNS fragmentumot kapjunk. Ezt a DNS-fragmentumot radioaktív jelzéssel látjuk el bemetszéses (nick) transzlációval a rutin-eljárásokkal összhangban. Nitrocellulóz szűrőt (S and S) helyezünk a fág-tarfolt-növesztő agar tápközegre, hogy átvigyük a fágokat a szűrőre. A fág-DNS 0,5 mól/1 NaOH-val történő denaturálása után a szűrőpapírt a következő eljárásokkal kezeljük: kezelés 0,1 mól/1 NaOH-t és

1,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal 20 másodpercig; két kezelés 0,5 mól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5) és 1,5 mól/1 NaCl-t tartalmazó oldattal 20 másodpercig, végül kezelés 120 mmól/1 NaCl-t, 15 mmól/1 nátrium-citrátot, 13 mmól/1 KH₂PO₄-et és 1 mmól/1 EDTA-t (pH 7,2) tartalmazó oldattal 20 másodpercig.

A szűrőt ezután szárítjuk és 80 °C hőmérsékleten 2 órán át melegítjük, hogy a DNS-t immobilizáljuk.

Elő-hibridizálást hajtunk végre egy éjszakán át 42 °C hőmérsékleten előhibridizáló pufferban, amely 5xSSC-t, 5xDenhardt-oldatot, 50 mmól/1 foszfát-puffért, 50% formamidot, 0,25 mg/ml denaturált DNS-t (lazac sperma DNS) és 0,1% SDS-t tartalmaz. Ezután hibridizálást hajtunk végre 42 °C hőmérsékleten 20 órán át hibridizáló pufferban, amely 4xl0⁵ cpm/ml pHCS-1 vizsgálómintát is tartalmaz, amelyet előzőleg bemetszéses (nick) transzláció segítségével radioaktívan megjelöltünk. Ez a hibridizáló puffer 5xSSC, 5xDenhardt-oldat, 20 mmól/1 foszfát puffer (pH 6,0), 50% formamid, 0,1% SDS, 10% dextrán-szulfát és 0,1 mg/ml denaturált DNS (lazac sperma DNS) keveréke.

A hibridizált nitrocellulóz szűrőt 20 percig mossuk 0,1% SDS-t tartalmazó 2xSSC-vel szobahőmérsékleten, majd 30 percig 0,1% SDS-t tartalmazó 0,lxSSCvel 44 °C hőmérsékleten, végül 10 percig 0,lxSSC-vel szobahőmérsékleten. Ezután végezzük a kimutatást autoradiográfiával.

Ennek eredményeképpen több mint 10 pozitív kiónt kapunk. Ezekből a kiónokból rekombináns DNS-eket készítünk Maniatis és munkatársai módszerével [Cell, 75, 687 (1978)]. Az így kapott DNS-eket restrikciós enzimekkel kezeljük, mint például EcoRI-gyel, BamHI-gyel és BglII-vel, agaróz gélelektroforézissel elemezzük, és elkészítjük restrikciós térképüket Fritsch és munkatársainak módszerével (lásd Cell, fentebb idézett munka).

Southern-hibridizálást hajtunk végre a radioaktívan jelzett pHCS-1 eredetű DNS-sel, mint vizsgálómintával, amely azonos azzal, amelyet a fentebb leírt átvizsgálási módszerben alkalmaztunk. Mintegy 8 kbp-s DNS fragmentumot, amelyet EcoRI-gyel hasítunk, kiválasztunk a kiónok közül, amelyek hibridizálódnak a vizsgálómintával. Ezt a fragmentumot szubklónozzuk a pBR327 EcoRI-helyére. A szubklónozott DNS-t második kezelésnek vetjük alá restrikciós enzimekkel, és Southem-hibridizálásnak vetjük alá ismételten. Egy mintegy 4 kbp-s DNS fragmentumról, amelyet EcoRIgyel és Xhol-gyel hasítunk ki, úgy találjuk, hogy egy olyan gént tartalmaz, amely a humán G-CSF polipeptidet kódolja. Ennek a DNS fragmentumnak mintegy 3 kbp részét szekvencia-meghatározásnak vetjük alá didezoxi módszerrel, és az 5. ábrán bemutatott nukleotid-szekvenciát azonosítjuk. Ez a DNS fragmentum a

7. ábrán bemutatott restrikciós hasítóhelyekkel rendelkezik.

Humán kromoszomális gének átvizsgálását is elvégezzük, pBRG4-eredetű DNS-t ..és pBRV2-eredetű DNS-t alkalmazva vizsgálómintaként. Mindkét esetben egy 1500 bp-s DNS fragmentumot, amelyet EcoRI-gyel kezeltünk, közvetlenül jelzünk radioaktívan bemetszéses (nick) transzlációval a fentebb leírtakkal azonos módon; vagy egy másik módszer szerint egy' mintegy 700 bp-s DNS fragmentumot, amelyet EcoRI-gyel és Dral-gyel egymás után végzett kezeléssel kapunk, radioaktívan jelzünk bemetszéses (nick) transzlációval. Az így készített vizsgálómintát használjuk tarfolt-hibridizálásban, amelyet azonos körülmények között végzünk, mint ahogyan ezt korábban

HU 209 147 Β leírtuk. A kiválasztott kiónokat Southem-hibridizálással elemezzük, így az 5. ábrában bemutatott nukleotidszekvenciával rendelkező DNS-töredéket kapjuk. Az így kapott plazmidot pBRCE3-nak nevezzük.

72. példa

E. coli rekombináns vektor (+VSE) megalkotása és transzformálás (tac-promotert tartalmazó vektort alkalmazva)

1. Rekombináns vektor megalkotása (i) Vektor előállítás mikrogramm tac-promotert tartalmazó vektort (pKK 233-3; Pharmacia) kezelünk 8 egység EcoRIgyel (Takara Shuzo Co., Ltd) 2 órán át 37 °C hőmérsékleten 30 μΐ reakcióoldatban (40 mmól/1 trisz-HCl, 7 mmól/1 MgCl₂, 100 mmól/1 NaCl, és 7 mmól 2-merkapto-etanol).

Ezt követően 3 μΐ alkalikus foszfatázt (Takara Shuzo Co., Ltd) adunk hozzá és a kezelést 60 °C hőmérsékleten folytatjuk 30 percen át. DNS-fragmentumot nyerünk ki három fenolos kezeléssel, egy éteres kezeléssel, és etanolos kicsapással, mindegyik folyamatot a rutin-eljárásokkal összhangban végezve.

A kinyert DNS-fragmentumot feloldjuk 50 μΐ keverékben, amely 50 mmól/1 trisz-HCl-ből, 5 mmól/1 MgCl₂-ből, 10 mmól/1 DTT-bőI és 1-1 mmól/1 dATPből, dCTP-ből, dGTP-ből és dTTP-ből áll, 3 pl E. coli DNS-polimeráz I - Klenow-fragmentum (Takara Shuzo Co., Ltd) hozzáadása után 14 °C hőmérsékleten 2 órán át tartó reakciót hajtunk végre, hogy tompa végeket alakítsunk ki.

(ii) Szintetikus kapcsolók készítése

3-3 mikrogramm oligonukleotidot, amelyek CGAATGACCCCCCTGGGCC, illetve

CAGGGGGGTCATTCG szintetikus kapcsolókkal rendelkeznek, foszforilezzük, reakciót hajtva végre 40 μΐ reakcióoldatban (amely 50 mmól/1 trisz-HCl-ből, 10 mmól/1 MgCl₂-ből, 10 mmól/1 2-merkapto-etanolból és 1 mmól/1 ATP-ből áll) 37 °C hőmérsékleten 60 percen át 4 egység T4 polinukleotid-kináz jelenlétében.

A foszforilezett oligonukleotidok mindegyikét (0,2 μg) feloldjuk 20 μΐ 100 mmól/1 NaCl-t tartalmazó TE oldatban [10 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,0) és 1 mmól/1 EDTA]. 65 °C hőmérsékleten 10 percen át végzett kezelés után az oligonukleotidokat szobahőmérsékletre való lassú hűtéssel hőkezeljük.

(iii) G-CSF cDNS fragmentum előállítása mikrogramm 9. példában készített pBRG4-et, amely a 3A ábrában bemutatott cDNS-t tartalmazza, kezelünk 100 egység Apai restrikciós enzimmel (New England Biolabs) és 50 egység Dral-gyel (Takara Shuzo Co., Ltd) 37 °C hőmérsékleten 3 órán át 200 μΐ reakcióoldatban, amely 6 mmól/1 trisz-HCl-ből, 6 mmól/1 MgCl₂-ből és 6 mmól/1 2-merkapto-etanolból áll. Mintegy 2 pg Apal-Dral fragmentumot (mintegy 590 bp) nyerünk ki 1,2%-os agaróz gélelektroforézissel.

(iv) Fragmentumok ligálása

Mintegy 0,1-0,1 pg-ot az (i)—(ii) pontokban készített fragmentumokból feloldunk 20 pl ligáló oldatban (66 mmól/1 trisz-HCl, 6,6 mmól/1 MgCl₂, 10 mmól/1 DTT, és 1 mmól/1 ATP). 175 egység T4 DNS-ligáz hozzáadása után az oldatot egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten tartjuk, hogy egy rekombináns vektort (8. ábra) kapjunk.

2. Transzformálás pl, az (iv) pontban készített rekombináns vektort tartalmazó reakcióoldatot használva E. coli JM105 törzset transzformálunk a rubídium-kloridos módszerrel [lásd Manistis T. és munkatársai: Molecular Cloning, 252. oldal (1982)]. A plazmidot a transzformánsok ampicillin-rezisztens teleptenyészetéből különítjük el, és BamHl, AccII és Apai restrikciós enzimekkel kezeljük, hogy igazoljuk, hogy a transzformánsok az előállítani szándékozottak.

13. példa

E. coli rekombináns vektor (+VSE) megalkotása és transzformálás (PL promotert tartalmazó vektort alkalmazva).

1. Rekombináns vektor megalkotása (i) Vektor-készítés

100 mikrogramm PL-promotert tartalmazó pPLlambda-vektort (Pharmacia) kezelünk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten 50 egység BamHl restrikciós enzimmel 100 pl reakcióoldatban [10 mmól/1 tirsz-HCl (pH 7,6), 7 mmól/1 MgCl₂, 100 mmól/1 NaCl, és 10 mmól/1 DTT],

A reakcióoldatot 1%-os agaróz gélelektroforézisnek alávetve körülbelül 49 pg-nyí, mintegy 4 kb-s fragmentumot és körülbelül 11 pg mennyiségű, mintegy 1,2 kb-s fragmentumot nyerünk ki.

A 4 kb-s fragmentumot 100 pl TE pufferben feloldjuk (összetételét lásd fentebb) és defoszforilezzük alkalikus foszfatázzal (Takara Shuzo Co., Ltd) végzett reakcióval 60 °C hőmérsékleten 60 percen át.

A másik, mintegy 1,2 kb hosszúságú fragmentumot 20 pl pufferban (10 mmól/1 trisz-HCl, 10 mmól/1 MgCl₂ 6 mmól/1 KC1 és 1 mmól/1 DTT) oldjuk fel, és egy éjszakán át kezeljük 20 egység MboII restrikciós enzimmel (New England Biolabs) 37 °C hőmérsékleten.

4%-os poliakrilamid gélelektroforézissel mintegy 0,9 pg BamHI-MboII fragmentumot (kb. 200 bp) és mintegy 1,9 pg MboII-BamHI fragmentumot (mintegy 310 bp) nyerünk ki.

(ii) Szintetikus kapcsoló előállítása

TAAGGAGAATTCATCGAT és

TCGATGAATTCTCCTTAG szekvenciával rendelkező szintetikus kapcsolókat tartalmazó oligonukleotidokat foszforilezünk, és hőkezeljük, mint a 12. példa (ii) részében, így szintetikus S/D kapcsolókat állítunk elő.

(iii) Kifejező vektor előállítása tized mikrogramm, mintegy 4 kb-s fragmentumot, 0,05 pg-ot az O_lPl területtel rendelkező BamHIMbol fragmentumból és ugyanennyit a tLj területtel rendelkező MboII-BamHI fragmentumból [ezt a három fragmentumot az (i) pontban állítottuk elő], és 0,1 pg hőkezelt szintetikus S/D kapcsolót [amelyet az (ii) pontban állítottunk elő] reagáltatunk egy éjszakán

HU 209 147 Β át 12 °C hőmérsékleten 40 μΐ reakcióoldatban (66 mmól/1 trisz-HCl, 6,6 mmól/1 MgCl₂, 10 mmól/1 DTT és 1 mmól/1 ATP) 175 egység T₄ DNS-ligáz (Takara Shuzo Co., Ltd) jelenlétében. 20 μΐ reakcióoldatot használunk fel E. coli N99CI⁺ törzs (Pharmacia) transzformálására a kalcium-kloridos eljárással (lásd a korábban idézett „Molecular Cloning” c. munkát).

A transzformánsokat tenyésztjük és a plazmidot az ampicillin-rezisztens telepek tenyészeteiből kinyerjük. A plazmid kezelése EcoRI, BamHI és Smal restrikciós enzimekkel azt mutatja, hogy ez az előállítani szándékozott plazmid.

E plazmid két mikrogrammját Clal restrikciós enzimmel reagáltatjuk (New England Biolabs) 37 °C hőmérsékleten 2 órán át 20 μΐ pufferban (10 mmól/1 triszHCl, 6 mmól/1 MgCl₂ és 50 mmól/1 NaCl). Az enzimet ezután inaktiváljuk 65 °C hőmérsékleten 10 percig hőkezelve.

mikroliter reakcióoldatot reagáltatunk egy éjszakán át 12 °C hőmérsékleten 175 egység T₄ DNS-ligázzal (Takara Shuzo Co., Ltd) ligáló oldatban, amelynek összetételét fentebb leírtuk. A reakcióoldatot ezután E. coli N99CI⁺ törzs (Pharmacia) transzformálására használjuk. A plazmidot a transzformánsok ampicillin-rezisztens telepeinek tenyészetéből kinyerjük, és EcoRIgyel, valamint BamHI-gyel kezeljük, hogy igazoljuk: az adott plazmid azonos az előállítani szándékozott plazmiddal.

(iv) G-CSF-et kifejező rekombináns vektor és transzformánsok előállítása

Az (iii) részben előállított kifejező plazmidot Clal restrikciós enzimmel kezeljük. Tompa végek kialakítása után a plazmidot úgy dolgozzuk fel, amint ezt a 12. példában leírtuk, hogy olyan rekombináns vektort készítsünk, amelybe G-CSF cDNS fragmentum van beiktatva. Ezt a vektort használjuk E. coli N4830 törzs (Pharmacia Fine Chemicals) transzformálására a kalciumkloridos eljárással, amely a fentebb többször idézett „Molecular Cloning” c. kiadványban van leírva. A kívánt transzformánsok azonosítását úgy hajtjuk végre, mint a 12. példában (9. ábra).

14. példa

E. coli rekombináns vektor (+VSE) megalkotása és transzformálás (trp promotert tartalmazó vektort alkalmazva)

1. Rekombináns vektor megalkotása (i) Vektor készítése

A pOYl plazmidot elkészítjük olyan módon, hogy Hpall-Taql fragmentumot (mintegy 330 bp) tartalmazó triptofán promotert iktatunk pBR322-be a Clal helynél, 10 mikrogrammot ebből a plazmidból 7 egység Clal restrikciós enzimmel és 8 egység PvuII-vel kezelünk 37 °C hőmérsékleten 3 órán át 30 μΐ reakcióoldatban, amely 10 mmól/1 trisz-HCl-ből, 6 mmól/1 MgCl₂ből és 50 mmól/1 NaCl-ből áll.

Ezt követően 2 μΐ alkalikus foszfatázt (Takara Shuzo Co., Ltd) adunk hozzá és a reakciót 60 °C hőmérsékleten folytatjuk 1 órán át.

Egy, mintegy 2,6 kb hosszúságú DNS-fragmentumot (mintegy 2,5 μg) nyerünk ki a reakcióoldatból 1%-os agaróz gélelektroforézissel.

(ii) Szintetikus kapcsoló készítése

A szintetikus kapcsolók

CGCGAATGACCCCCCTGGGCC és CAGGGGGGTCATTCG szekvenciájával rendelkező oligonukleotidokat foszforilezünk és hőkezelünk úgy, mint a 12. példa (ii) részében, így készítünk szintetikus kapcsolót.

(iii) Rekombináns vektor készítése

Mintegy 1 μg, (i) pontban készített vektor-töredéket, mintegy 1 pg (ii) pontban készített szintetikus kapcsolót és mintegy 1 pg, 12. példa (iii) pontjában készített G-CSF cDNS-fragmentumot reagáltatunk 175 egység T4 DNS-ligázzal egy éjszakán át 12 °C hőmérsékleten 20 pl ligáló oldatban, amelynek összetétele a 12. példa 1. pont (iv) részében található, így rekombináns vektort (10. ábra) kapunk.

2. Transzformálás pl, (iii) részben kapott reakcióoldatot alkalmazunk E. coli DH1 transzformálására a rubídium-kloridos eljárással, amint ez a korábban idézett „Molecular Cloning” c. kiadványban le van írva.

Úgy, mint a 12. példában, a plazmidot a transzformánsok ampicillin-rezisztens telepeiből nyerjük ki, és ennek a plazmidnak a kezelése Apai, Dral, Nrul és PstI enzimekkel azt mutatta, hogy a kívánt transzformánsokat kapjuk.

15. példa

Transzformánsok tenyésztése

1. A 12. példában kapott, tac-cal rendelkező transzformánsok tenyésztése

A transzformánsokat egy éjszakán át tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten, és 1 ml tenyészetet adunk 100 ml Luria tápközeghez, amely még 25 pg/ml vagy 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A tenyésztést 23 órán át végezzük 37 °C hőmérsékleten.

A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten folytatjuk 24 órán át, miután annyi izopropil-P-D-tiogalaktozidot adunk hozzá, hogy ennek koncentrációja 2 mmól/1 legyen.

2. A 13. példában kapott, P_L-lel rendelkező transzformánsok tenyésztése

A transzformánsokat egy éjszakán át tenyésztjük 28 °C hőmérsékleten, és 1 ml tenyészetet adunk 100 ml Luria tápközeghez, amely még 25 pg/ml vagy 50 p/ml ampicillint is tartalmaz. A tenyésztést mintegy 4 órán át végezzük 28 °C hőmérsékleten.

A tenyésztést ezután 42 °C hőmérsékleten folytatjuk 2-4 órán át.

3. A 14. példában kapott, trp-vel rendelkező transzformánsok tenyésztése

A transzformánsokat egy éjszakán át tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten, és 1 ml tenyészetet adunk 100 ml M9 tápközeghez, amely 0,5% glükózt, 0,5% kazamino-savat (részlegesen hidrolizált kazein, Difco) és 25 pg/ml vagy 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A tenyésztést 4-6 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük. 50 pg/ml 3-3-indol-akrilsav (IAA) hozzá20

HU 209 147 Β adása után a tenyésztést 4-8 órán át folytatjuk 37 °C hőmérsékleten.

16. példa

G-CSF polipeptid kinyerése és tisztítása E. coliból

1. Kinyerés.

A 15. példában tenyésztett három fajta transzformánst a következő kinyerési eljárásoknak vetjük alá.

A tenyészetet (100 ml) centrifugáljuk, hogy sejtüledéket kapjunk, amelyet azután 5 ml olyan keverékben szuszpendálunk, amely 20 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5) és 30 mmól/1 NaCl-t tartalmaz.

Ezután 0,2 mól/l-es fenil-metil-szulfonil-fluoridot 1 mmól/l-es, 0,2 mól/l-es EDTA oldatot 10 mmól/l-es és lizozimot 0,2 mg/l-es koncentrációban adunk hozzá, majd a szuszpenziót 30 percen át állni hagyjuk 0 °C hőmérsékleten.

A sejteket lizáljuk fagyasztás/felengedtetés három ciklusát alkalmazva, ezt követi kívánt esetben az ultrahangos kezelés. A lizátumot centrifugáljuk, hogy a felülúszót megkapjuk. Egy másik módszer szerint a lizátumot 8 mól/1 guanidin hidrokloriddal kezeljük olyan módon, hogy végső koncentrációja 6 mól/1 guanidin-hidroklorid legyen, ezt követi a centrifugálás 30000 fordulat/percnél 5 órán át, majd a felülúszó kinyerése.

2. Tisztítás (i) Az 1. pontban kapott felülúszót gélszűrésnek vetjük alá Ultrogél AcA54 oszlopon (4,6 cm átmérőx90 cm magasság; LKB) 50 ml/óra átáramlási sebességnél 0,01 mól/1 trisz-HCl pufferral (pH 7,4), amely 0,15 mól/l NaCl-t és 0,01% Tween 20-at (Nakai Kagaku Co., Ltd) is tartalmazhat.

A frakciókat, amelyek CSA vizsgálat (b) eljárása szerint (amelyet korábban ebben a leírásban már ismertettünk) végzett elemzés alapján aktivitást mutatnak, kiválasztjuk és kb. 5 ml térfogatra koncentráljuk ultraszűrő berendezéssel (pM-10; Amicon).

(ii) A koncentrált frakciókhoz n-propanolt adunk (olyan minőségűt, amely az aminosav-szekvencia elemzéshez alkalmas; Tokyo Kasé; Co., Ltd), valamint trifluor-ecetsavat, és a keveréket úgy állítjuk be, hogy a végső koncentráció n-propanolra 30%, trifluor-ecetsavra 0,1% legyen, A beállított keveréket jégen hagyjuk mintegy 15 percen át, majd 15 000 fordulat/percnél centrifugáljuk 10 percen át, hogy a csapadékot eltávolítsuk. A felülúszót μ-Bondapak C18 oszlopon adszorbeáljuk (fél-preparatív minőségű; Waters; 8 mmx30 cm), amelyet előzőleg n-propanolt tartalmazó vizes oldattal (lásd fentebb) egyensúlyoztunk ki. Az oszlopot folytonosan eluáljuk 0,1% trifluor-ecetsav vizes oldatával, amely n-propanolt tartalmaz 30-60% lineáris koncentrációgradienssel. Hitachi Model 68550 (a Hitachi Ltd. nagy nyomású folyadékkromatográfja) és Hitachi Model 638-41 készüléket (a Hitachi Ltd. detektora) alkalmazva az adszorpciókat 220 nmnél és 280 nm-nél egyidejűleg mérjük. Eluálás után az egyes frakciók 10 μΐ-es alikvotjait 100-szorosra hígítjuk, és a hígításokat átvizsgáljuk aktív frakciókra a CSA vizsgálat (b) módszerével. Aktivitást figyelünk meg azokban a csúcsokban, amelyeket a 40% n-propanolnál eluálunk. Ezeket a csúcsokat egyesítjük és újra kromatografáljuk azonos körülmények között, mint amelyet fentebb alkalmaztunk, és a frakciókat aktivitásukra ellenőrizzük a (b) módszerrel. Az aktivitást ismét a 40% n-propanolnál levő csúcsokban találjuk. Ezeket az aktív csúcsokat összegyűjtjük (négy frakció = 4 ml), és fagyasztva szárítjuk.

(iii) A fagyasztva szárított port feloldjuk 0,1%-os trifluor-ecetsav 200 μΐ-nyi vizes oldatában, amely 40% n-propanolt is tartalmaz, és az oldatot nagy nyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá TSK-G3000SW oszlopon (7,5 mmx60 cm: Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd). Az eluálást 0,4 ml/perc áramlási sebességgel hajtjuk végre 0,1%-os vizes trifluor-ecetsav oldattal, amely 40% propánok tartalmaz, és 0,4 ml-es frakciókat veszünk FRAC-100 frakció-kollektorral (Pharmacia Fine Chemicals). A frakciókat ellenőrizzük CSA-ra, amint fentebb leírtuk, és az aktív frakciókat kinyerjük. Ezeket tovább tisztítjuk analitikai μ-Bondapak C18 oszlopon (4,6 mmx30 cm), és a fő csúcsot kinyerjük és fagyasztva szárítjuk.

Az így kapott fehérjét 2-merkapto-etanollal kezeljük és SDS-poliakrilamid gél-(15,0%)elektroforézisnek (15 mV, 6 óra) vetjük alá. Coomassie-kékkel végzett festéssel a kívánt G-CSF polipeptidet egyetlen csíkként tudjuk azonosítani.

17. példa

A G-CSF aktivitás (+VSE) meghatározása

A 16. példában kapott CSF mintát a CSF meghatározás (a) módszerével határozzuk meg, amelyet ebben a leírásban korábban már ismertettünk. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja be.

1. táblázat

	Humán neutrofil telepek (telep/csésze)
Tisztított humán G-CSF (20 ng)	73
A 15. példában kapott CSF minta (50 ng)	68
Vak	0

18. példa

Aminosav-elemzés (+VSE)

1. Az aminosav-összetétel elemzése

A 16. példában tisztított CSF mintát rutin-eljárásokkal hidrolizáljuk, és a hidrolizátum fehérje-részének aminosav-összetételét aminosav-elemzés olyan módszerével végezzük, amely Hitachi 835 (Hitachi Ltd) automatikus aminosav-elemzőt alkalmaz. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. A hidrolízist a következő körülmények között végezzük:

(i) 6 n HCI, 110 °C, 24 óra, vákuumban;

(ii) 4 n metánszulfonsav + 0,2% 3-(2-amino-etil)indol, 110 °C, 24 óra, 48 óra, 72 óra, vákuumban.

A mintákat 1,5 ml olyan oldatban oldjuk, amely 40% n-propanolt és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmaz. 0,1 ml-t kitevő alikvotokat szárítunk száraz nitrogén21

HU 209 147 Β gázban, és az (i) vagy (ii) pontban felsorolt reagensek hozzáadása után a tartályokat vákuumban leforrasztjuk, ezt követi a tartalom hidrolízise.

A 2. táblázatban bemutatott értékek mindegyike négy mérés átlaga. 24 órás érték (i)-nél, és 24, 48 és 72 órás értékek (ii)-nél, kivéve a Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Val, lle és Trp értékeket, amelyeket az alábbi módszerekkel számítunk ki [lásd „Tampaku Kagaku (protein Chemistry) (Fehérje kémia) II”, A Course in Biochemical Experiments (Munkamenet biokémiai kísérletekben) Tokyo Kagaku Dohjin]:

- Thr-hez, Ser-hez, 1/2 Cys-hez és Met-hez a (ii) kísérletnél mért 24, 48 és 72 órás értékek idő-függő profilját 0 órára extrapoláljuk.

- Val-hoz és Ile-hez az (ii) kísérletnél mért 72 órás értéket alkalmazzuk.

- Trp-hez az (ii) kísérletnél mért 24, 48 és 72 órás értékek átlagát alkalmazzuk.

2. táblázat

Aminosav elemzési adatok

Aminosav	Mól%
Asp (Asp + Asn)	2,3
Tip	4,0
Ser	8,5
Glu (Glu + Gin)	15,2
Pro	7,3
Gly	7,9
Alá	10,7
1/2 Cys	2,8
Val	4,5
Met	2,0
lle	2,3
Leu	18,3
Tyr	1,7
Phe	3,4
Lys	2,3
His	2,8
Trp	1,1
Arg	2,9

2. N-terminális aminosavak elemzése

A mintát Edman-lebontásnak vetjük alá gáz-fázisú szekvencia-elemzővel (Applied Biosystems) és a kapott PTH aminosavat rutin-eljárásokkal elemezzük nagy nyomású folyadékkromatografáló berendezéssel (Beckman Instruments) és Ultrasphere-ODS oszloppal (Beckman Instruments). Miután az oszlopot (5 pm;

4,6 mm átmérőx250 mm) kiegyensúlyoztuk indító pufferral [15 mmól/1 nátrium-acetát puffért (pH 4,5) és 40% acetonitilt tartalmazó vizes oldat], a mintát (amelyet 20 μΐ indító pufferban oldottunk fel) injektáljuk és elkülönítést hajtunk végre indító pufferral végzett izokratikus eluálással. Ezeknek a műveleteknek a során az áramlási sebességet 1,4 ml/perc értéken tartjuk, és az oszlop hőmérséklét 40 °C hőmérsékleten. A PTH aminosav kimutatását a 269 nm és 320 nm közti ultraibolya tartományban levő abszorpciót alkalmazva végezzük. PTH aminosavak (Sigma) standard mintáit (egyenként 2 nmól mennyiségben) különítjük el ugyanezen a vonalon, hogy meghatározzuk retenciós időiket, amelyeket azután összehasonlítunk a minták retenciós időivel az N-terminális aminosavak azonosítása céljából. Ennek eredményeképpen PTH-metionint és PTH-treonint mutatunk ki.

19. példa

E. coli rekombináns vektor (-VSE) megalkotása és transzformáció

1. tac promotert tartalmazó vektor alkalmazása

A 12. példa eljárásait ismételjük meg azzal a kivétellel, hogy a „9. példában készített pBRG4, amely a 3 A ábrában bemutatott cDNS-t tartalmazza” [lásd a 12. példában az (iii) részt] szövegrész helyettesítve van a „10. példában készített pBRV2, amely a 4A ábrában bemutatott cDNS-t tartalmazza” szövegrésszel. Akárcsak a 12. példában, a kapott transzformánsokról igazoljuk, hogy ezek a kívánt transzformánsok (11. ábra).

2. PL promotert tartalmazó vektor alkalmazása

A 13. példa eljárásait ismételjük meg, cDNS(-VSE)-t alkalmazva, és a kapott transzformánsokról igazoljuk, hogy ezek a kívánt transzformánsok (12. ábra).

3. trp promotert tartalmazó vektor alkalmazása

A 14. példa eljárásait ismételjük meg, cDNS(-VSE)-t alkalmazva, és a transzformánsokról igazoljuk, hogy ezek a kívánt transzformánsok (13. ábra).

20. példa

G-CSF aktivitás (-VSE) meghatározása

A 19. példában kapott háromféle transzformánst tenyésztjük a 15. példában leírt módszerrel. A tenyésztett E. coli sejtekből G-CSF polipeptideket nyerünk ki és tisztítunk a 16. példában leírt módszerrel, azzal az eredménnyel, hogy humán G-CSF polipeptidet kapunk egyetlen csíkként.

Az így kapott CSF mintát a CSF aktivitás meghatározás (a) módszerével határozzuk meg, amelyet korábban ebben a leírásban már ismertettünk. Az eredményeket a 3. táblázat mutatja be.

3. táblázat

	Humán neutrofil telepek (telep/csésze)
Tisztított humán G-CSF (20 ng)	73
A 19. példában kapott CSF minta (50 ng)	73
Vak	0

21. példa

Aminosav-elemzés (-VSE)

1. Az aminosav-összetétel elemzése

A 20. példában tisztított CSF minta aminosav-ösz22

I

HU 209 147 Β szetételét a 18. példa 1. részében leírt módszerrel elemezzük. Az eredményeket a 4. táblázat mutatja be.

4. táblázat

Aminosav-elemzési adatok

Aminosav	Mól%
Asp (Asp + Asn)	2,3
Thr	4,0
Ser	8,1
Glu (Glu + Gin)	15,0
Pro	7,5
Gly	8,1
Alá	11,0
1/2 Cys	2,9
Val	4,1
Met	2,0
lle	2,2
Leu	18,8
Tyr	1,7
Phe	3,4
Lys	2,3
His	2,7
Trp	1,1
Arg	2,8

2. N-terminális aminosavak elemzése

A mintát N-terminális aminosav-elemzésnek vetjük alá a 18. példa 2. részében leírt módszerrel. Ennek eredményeképpen PTH-metionint és PTH-treonint mutatunk ki.

22. példa pHGA410 vektor előállítása (állati sejtekhez való felhasználáshoz, +VSE vonal)

A 9. példában előállított EcoRI fragmentumot, amely a 3A ábrában bemutatott cDNS-sel rendelkezik, Dral restrikciós enzimmel kezeljük 37 °C hőmérsékleten 2 órán át, ezt követi a kezelés DNS-polimer I Klenow-fragmentumával (Takara Shuzo Co., Ltd), hogy tompa végeket alakítsunk ki. 1 mikrogramm BglII kapcsolót (8-mer, Takara Shuzo Co., Ltd) foszforilezünk ATP-vel és egyesítjük DNS-fragmentumok külön kapott keverékének mintegy 1 pg-jával. Az egyesített fragmentumokat BglII restrikciós enzimmel kezeljük, és agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá. Ezt követően csak a legnagyobb DNS-fragmentumot nyerjük ki.

Ez a DNS-fragmentum mintegy 710 bázispárból áll, amely humán G-CSF polipeptid kódoló részt tartalmaz (lásd 6. ábra). pdKCR vektort [Fukunaga és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 5086 (1984)] kezelünk BamHI restrikciós enzimmel, majd ezt követően defoszforilezzük alkalikus foszfatázzal (Takara Shuzo Co., Ltd). A kapott vektor DNS-t egyesítjük a 710 bp-s cDNS-fragmentummal T4 DNS-Iigáz (Takara Shuzo Co., Ltd) jelenlétében, így állítjuk elő a pHGA410-et (14. ábra). Amint a 14. ábrában bemutatjuk, ez a plazmid tartalmazza az SV40 korai gén promoterét, az SV40 replikációs origóját, a nyúl β-globin gén egy részét, a pBR322 replikációs beindító (iniciációs) területét, és a pBR322 eredetű β-laktamáz gént (Amp^r), a humán G-CSF génnel, amely az SV40 korai gén promoterjétől „lefelé” van összekapcsolva.

23. példa

Rekombináns vektor (+VSE) megalkotása C127 sejtek transzformációjában való felhasználáshoz

1. pHGA410(H) megalkotása

A 22. példában előállított pHGA410 plazmid (14. ábra) 20 mikrogrammját feloldjuk 50 mmól/1 triszHCl-t (pH 7,5), 7 mmól/1 MgCl₂-t, 100 mól/1 NaCl-t, 7 mmól/1 2-merkapto-etanolt és 0,01% szarvasmarha szérumalbumint (BSA) tartalmazó reakcióoldatban. EcoRI restrikciós enzimet adunk hozzá (10-15 egység, Takara Shuzo Co., Ltd) és a reakcióoldatot 37 °C hőmérsékleten tartjuk mintegy 30 percen át, hogy EcoRIgyel való részleges emésztést idézzünk elő. Ezt követően a DNS-fragmentumot két kezelésnek vetjük alá fenol/kloroform 1:1 keverékkel, majd egyszer éterrel kezeljük, és etanollal kicsapatjuk.

A kapott DNS-fragmentumot feloldjuk 50 μΐ olyan oldatban, amely 50 mmól/1 trisz-HCl-ből, 5 mmól/1 MgCl₂-ből, 10 mmól/1 DTT-ből, és 1-1 mmól/1 dATPből, dCTP-ből, dGTP-ből és dTTP-bőI áll. Miután 5 μΐ E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumot (Takara Shuzo Co., Ltd) adtunk hozzá, az oldatot 14 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, hogy tompa végeket alakítsunk ki.

Az ezt követő 0,8%-os agaróz gélelektroforézissel 6 pg, mintegy 5,8 kbp hosszúságú DNS-fragmentumot nyerünk ki.

A kinyert DNS-fragmentumból 5 mikrogrammot újra feloldunk 50 μΐ reakcióoldatban, amely 50 mmól/1 triszHCl-ből (pH 7,6), 10 mmól/1 MgCl₂-ből, 10 mmól/1 DTT-ből és 1 mmól/1 ATP-ből áll. Miután 2 pg HindlII kapcsolót (Takara Shuzo Co., Ltd) és 100 egység T4 DNS ligázt (Takara Shuzo Co., Ltd) adtunk hozzá, a reakciót egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten végezzük.

Ezt követően kezeléseket hajtunk végre fenollal és éterrel, majd kicsapást etanollal. A csapadékot feloldjuk 10 mmól/1 trisz-HCl-ből (pH 7,5), 7 mmól/1 MgCl₂-ből és 60 mmól/1 NaCl-ből álló oldatban, és az oldatot 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3 órán át 10 egység HindlII jelenlétében. T4 DNS ligázzal végzett újabb kezelés után az így létrejött DNS-t E. coli DH1 törzs transzformálásához alkalmazzuk a rubídium-kloridos eljárással (lásd korábban idézett „Molecular Cloning” c. munkát). A transzformánsok ampcillin-rezisztens (amp^r) telepeiből sejteket választunk ki, amelyek olyan plazmidot tartalmaznak, amely pHGA410-zel lényegében azonos, azzal az eltéréssel, hogy HindlII van beiktatva az EcoRI helynél. Az így kapott plazmidot pHGA410(H)-nak nevezzük (lásd 15. ábra).

2. pTN-G4 kifejező rekombináns vektor megalkotása mikrogramm így kapott pHGA410(H) plazmidot feloldunk 10 mmól/1 trisz-HCl-ből (pH 7,5),

HU 209 147 Β mmól/1 MgCl₂-ből, 175 mmól/1 NaCI-ből, 0,2 mmól/1 EDTA-ból, 7 mmól/1 2-merkapto-etanolból és 0,01% szarvasmarha szérumalbum inból álló reakcióoldatban. Miután 20 egység Sall-et (Takara Shuzo Co., Ltd) adtunk hozzá, a reakcióoldatot 37 °C hőmérsékleten 5 órán át inkubáljuk. Fenolos kezelés és etanolos kicsapást követően inkubálást végzünk ugyanúgy, mint az 1. részben, mintegy 2 órán át 14 °C hőmérsékleten DNS-polimeráz Klenow-fragmentum (Takara Shuzo Co., Ltd) jelenlétében, ilyen módon tompa végeket alakítva ki. Anélkül, hogy agaróz gélelektroforézissel DNS-kinyerésnek vetnénk alá, a reakcióoldatot közvetlenül etanollal végzett kicsapásnak vetjük alá. Az így létrejött DNS-fragmentumot HindlII-mal kezeljük, és 5 pg HindlII-SalI fragmentumot (mintegy

2,7 kbp) nyerünk ki 1%-os agaróz gélelektroforézissel. Egy másik, külön lépésben szarvasmarha papillóma vírussal (BPV) rendelkező pdBPV-1 plazmidot [ezt a plazmidot dr. Howley szíves ajándékaként kaptuk, ez a következő irodalmi helyen van leírva; Sarver N., Sbyrne J. C. és Howley Ρ. M.: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 79, 7147-7151 (1982)] kezelünk HindlII-mal és PvuII-vel, amint ezt Nagata és munkatársai leírták [Fukunaga, Sokawa és Nagata: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5086-5090 (1984)], így egy 8,4 kb-s DNSfragmentumot kapunk. Ezt a 8,4 kb-s DNS-fragmentumot és a külön kapott HindlII-SalI DNS-fragmentumot (mintegy 2,7 kb) ligáljuk T4 DNS-ligáz segítségével. A ligálási terméket használjuk E. coli DH1 törzs transzformálására a rubídium-kloridos eljárással (amely a fentebb idézett „Molecular Cloning” c. kiadványban van leírva), és a pHGA410-eredetű G-CSF cDNS-sel rendelkező plazmidot tartalmazó E. coli telepeket kiválasztjuk. Ezt a plamidot pTN-G4-nek nevezzük (15. ábra).

II. típusú adenovírust [Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids, and Enzymes), 1982. december 27, Kyoritsu Shuppan] hasonlóképpen kezelünk, hogy olyan ApVA plazmidot kapjunk, amely egy VAI-gyel és VAII-vei rendelkező mintegy 1700 bp-s Sall-HindlII fragmentumot tartalmaz, és a VAI-et és VAII-t tartalmazó fragmentumot ebből a plazmidból kinyerjük. Ezt a fragmentumot pTNG4-be iktatjuk be a HindlII helynél, így kapjuk a pTNG4VAa-t és pTNG4VA3-t (15. ábra). Az adenovírus VA génje miatt ezek a plazmidot az SV40 korai promoteréből származó átírási termék fokozott kifejeződésére képesek.

24. példa L. „

C127 sejtek transzformálása és G-CSF kifejeződése ezekben (+VSÉ)

Mielőtt egér C127 sejtek transzformálására használnánk, a 23. példában kapott pTN-G4-et BamHI restrikciós enzimmel kezeljük. 20 mikrogramm pTN-G4 plazmidot 100 pl-nyi reakcióoldatban feloldunk [10 mmól/1 trisz-HCl (pH 8,0), 7 mmól/1 MgCl₂, 100 mmól/1 NaCl, 2 mmól/1 2-merkapto-etanol, és 0,01% BSA] és 20 egység BamHI-gyel (Takara Shuzo Co., Ltd) kezeljük, ezt követi a fenolos és éteres kezelés, és az etanolos kicsapás.

Egér C127I sejteket növesztünk Dulbecco-féle minimál eszenciális tápközegben, amely 10% borjúembrió-szérumot is (Gibco) tartalmaz. Az 5 cm átmérőjű lemezeken kinövő C127I sejteket kalciumfoszfátos eljárással [lásd Haynes J. és Weissmann C.: Nucleic Acids Rés. 11, 687-706 (1983)] a külön elkészített DNS lemezenként 10 pg-jával transzformáljuk. Glicerines kezelés után a sejteket 37 °C hőmérsékleten 12 órán át inkubáljuk.

Az inkubált sejteket három friss lemezre (5 cm átmérő) visszük át, és a tápközeget hetenként kétszer cseréljük. A 16. napon a gócokat friss lemezekre viszszük és sorozattenyésztésnek vetjük alá Dulbecco minimál eszenciális tápközegen, amely 10% borjúembrió-szérumot (Gibco) is tartalmaz, így választunk ki olyan kiónokat, amelyek nagy G-CSF termelési sebességgel rendelkeznek. Ezek a kiónok a G-CSF-et mintegy 1 mg/1 szinten termelik. További klónozás olyan kiónokat hoz létre, amelyek a G-CSF termelésére 10 mg/1, vagy magasabb szinten képesek. A C127I sejteken kívül az NIH3T3 sejteket szintén lehet gazdasejtként alkalmazni.

25. példa

G-CSF kifejeződése CHO sejtekben (+VSE)

1. pHGG4-dhfr megalkotása mikrogramm, 22. példában kapott pHGA410 plazmidot feloldunk 100 μΐ reakcióoldatban, amely 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 7 mmól/1 MgCl₂-t, 175 mmól/1 NaCl-t, 0,2 mmól/1 EDTA-t, 0,7 mmól/12merkapto-etanolt és 0,01% BSA-t tartalmaz. A reakciót egy éjszakán át végezzük 37 °C hőmérsékleten 20 egység Sáli restrikciós enzim (Takara Shuzo Co., Ltd) jelenlétében, ezt követi a fenolos, majd éteres kezelés és az etanolos kicsapás.

A DNS-csapadékot feloldjuk 100 μΐ reakcióoldatban, amely 50 mmól/1 trisz-HCl-ből, 5 mmól/1 MgCl₂ből, 10 mmól/1 DTT-böl, és 1-1 mmól/1 dATP-ből, dCTP-bőI, dGTP-ből és dTTP-ből áll, és a reakciót 14 °C hőmérsékleten 2 órán át végezzük E. coli DNSpolimeráz Klenow-fragmentum jelenlétében (10 μΐ; Takara Shuzo Co., Ltd), ezt követi a fenolos, majd éteres kezelés és etanolos kicsapás.

A csapadékban levő DNS-hez EcoRI kapcsolót rögzítünk a következő módon: a DNS-t feloldjuk 50 μΐ reakcióoldatban, amely 50 mmól/1 trisz-HCl-ből (pH 7,4), 10 mmól/1 DTT-ből, 0,5 mmól/1 spermidinből, 2 mmól/1 ATP-ből, 2 mmól/1 hexamin-kobalt-kloridból és 20 pg/ml BSA-ból áll. A reakciót 4 °C hőmérsékleten hajtjuk végre 12-16 órán át EcoRI kapcsoló (Takara Shuzo Co., Ltd) és 200 egység T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo Co., Ltd) jelenlétében. Fenollal végzett kezelés, éténél végzett mosás és etanolos kicsapás után, amelyeket mind rutin eljárásokkal összhangban végzünk, a DNS-csapadékot részlegesen emésztjük EcoRI-gyel, és 3 pg, mintegy 2,7 kbp hosszúságú DNS-fragmentumot nyerünk ki 1%-os agaróz gélelektroforézissel.

A pAdD26SVpA plazmidot [Kaufman R. G. és Sharp P. A.: Mól. Cell. Bioi. 2, 1304-1319 (1982)]

HU 209 1 47 Β kezelünk EcoRI-gyel, és defoszforilezzük bakteriális alkalikus foszfatázzal (BAP) végzett kezeléssel. Részletesebben: 20 pg pAdD26SVpA-t és 20 egység EcoRI-et adunk a reakcióoldatba [50 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5), 7 mmól/1 MgCl₂, 100 mmól/1 NaCl, 7 mmól/1 2-merkapto-etanol, és 0,01% BSA] és a reakciót 37 °C hőmérsékleten 10 órán át végezzük. Ezt követően 5 egység BAP-t adunk a reakcióoldathoz és a reakciót 68 °C hőmérsékleten 30 percig végezzük. Fenollal végzett kezelést követően a pAdD26SVpA EcoRI fragmentumát elektroforézissel nyerjük ki mintegy 5 pg hozammal.

A mintegy 2,7 kbp hosszúságú fragmentumot és a pAdD26SVpA-t, amelyek mindegyike 0,5 pg tömegű, hőkezeléssel egyesítünk. Az így létrejött plazmidot alkalmazzuk E. coli DH1 törzs transzformálására a rubídium-kloridos módszerrel, és a pHGG4-dhfr plazmidot tartalmazó telepeket kiválasztjuk. A kapott plazmidot pHGG4-dhfr-nek nevezzük (16a ábra).

Egy másik módszer a következő: a pHGA410 plazmidot Sall-gyel kezeljük és EcoRI-gyel részlegesen emésztjük anélkül, hogy EcoRI kapcsolót rögzítenénk hozzá. Mintegy 2,7 kbp hosszúságú DNS-fragmentumot nyerünk ki és E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentummal kezeljük, hogy tompa végeket hozzunk létre. Tompa végekkel rendelkező EcoRIfragmentumot készítünk pAdD26SVpA-ból a fentiekben leírtak szerint. Ezt az EcoRI-fragmentumot és a külön készített fragmentumot (mintegy 2,7 kbp) T4 DNS-ligázzal kezeljük, így készítjük el a pHGG4dhfr-t.

A 23. példában elkészített pHGA410(H)-t HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel kezeljük, amint ezt a 23. példa 2. részében leírtuk, és a HindlII—Sáli fragmentumot egyesítjük a fentebb leírt pAdD26SVpA tompavégű EcoRI-fragmentummal. Ezt a módszert is lehet alkalmazni a pHGG4-dhfr előállításához (16b ábra).

2. pG4DRl és pG4DR2 megalkotása pg, 1. részben említett pAdD26SVpA plazmidot feloldunk 50 pl reakcióoldatban, amely 50 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 7 mmól/1 MgCl₂-t, 100 mmól/1 NaCl-t, 7 mmól/1 2-merkapto-etanolt és 0,01% BSA-t tartalmaz, 10-10 egység EcoRI és BamHI restrikciós enzim hozzáadása után a reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 10 órán át, ezt követi a fenolos kezelés és az éteres mosás. Mintegy 2 kb-s DNS-fragmentumot nyerünk ki 1%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen végzett elektroforézissel. A kinyert DNS-fragmentúmot DNS-polimeráz klenow-fragmentummal kezeljük rutin-eljárásokkal, hogy tompa végeket alakítsunk ki. A tompa végű DNS-fragmentumot fenolos kezelésnek vetjük alá, éterrel mossuk, és etanollal kicsapjuk.

A 23. példa 1. részében kapott pHGA410(H) plazmid 10 mikrogrammját feloldjuk 50 pl reakcióoldatban, amely 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 7 mmól/1 MgCl₂-t és 60 mmól/1 NaCl-t tartalmaz. A reakciót 37 °C hőmérsékleten 6 órán át végezzük 10 egység Hindim jelenlétében. DNS-fragmentumot nyerünk ki elektroforézissel 1%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen, az elektroforézist rutin módszerekkel végezve.

A kinyert DNS-fragmentumot ezt követően BAP-vel kezeljük, és tompa végeket alakítunk ki Klenow-fragmentummal végzett kezeléssel. A fenolos kezelést és éteres mosást követően a DNS-fragmentumot a tompa végeknél az előzőleg kapott, mintegy 2 kb-s DNS-fragmentummal egyesítjük T4 DNS-ligáz segítségével a következő eljárásokkal: a DNS fragmentumokból 11 pg-ot feloldunk 30 pl, 66 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 6,6 mmól/1 MgCl₂-t, 5 mmól/1 DTT-t és 1 mmól/1 ATP-t tartalmazó reakcióoldatban, és a reakciót 6 °C hőmérsékleten 12 órán át végezzük 50 egység T4 DNS ligáz jelenlétében. A ligálási terméket használjuk E. coli DH1 törzs transzformálására. Ennek eredményeképpen a 16c ábrában bemutatott pG4DRl-et és pG4DR2-t kapjuk.

3. Transzformálás és kifejeződés

CHO sejteket [dhfr-törzs: az ATCC CCL 61 sejteket átalakítva kaptuk Urlaud és mtsai, Proc. Natl. Acad Sci. USA 77 (7), 4216-4220 (1980) módszerével] tenyésztünk 10% borjúembrió-szérumot tartalmazó alfa-minimál eszenciális tápközegben (a-MEN, adenozinnal, dezoxi-adenozinnal és timidinnel kiegészítve) lemezeken (9 cm átmérő, Nunc). A tenyésztett sejteket kalcium-foszfátos eljárással [Wigler és munkatársai: Cell, 14, 725 (1978)] tenyésztjük a következő módon:

Hordozó DNS-t (borjú csecsemőmirigy DNS) adunk megfelelő mennyiségben 1 pg, 1. pont szerint készített pHGG4-dhfr plazmidhoz, és a keveréket feloldjuk 375 pl TE oldatban, ezt követi 125 pl 1 mól/l-es CaCl₂ hozzáadása. Miután az oldatot jégen hűtöttük 3-5 percig, 500 pl 2xHBS-t (50 mmól/1 Hepes, 280 mmól/1 NaCl és 1,5 mmól/1 foszfát-puffer) adunk az oldathoz. További jégen való lehűtés után az oldatot elkeverjük 1 ml CHO sejttenyészettel, lemezekre visszük, és 9 órán át inkubáljuk CO₂ inkubátorban. A tápközeget a lemezekről eltávolítjuk, és TBS-sel (triszpufferes konyhasó-oldat) végzett mosást, 20% glicerint tartalmazó TBS hozzáadását és újra-mosást követően nem szelektív tápközeget (ez a fentebb leírt a-MEN tápközeg, azzal a kivétellel, hogy ki van egészítve nukleotidokkal) adunk hozzá. 2 napos inkubálás után a tenyészet tízszeres hígítását szelektív tápközegre (vagyis -nukleotid kiegészítés nélküli tápközegre) visszük át. A tenyésztést folytatjuk olyan módon, hogy a tápközeget minden 2. napon friss szelektív tápközegre cseréljük ki, és az így létrejött telepeket kiválasztjuk és olyan friss lemezekre visszük: át, ahol a sejtek 0,02 pmöl/1 metotrexát (MTX) jelenlétében nőnek, ezt követi a klónozás 0,05 pmól/1 MTX jelenlétében, amely később 0,1 pmól/l-re lett növelve.

A CHO sejtek transzformálását végre lehet hajtani pHGG4-gyel és pAdD26SVpA-val történő együttes transzformálással [lásd Schahill és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4654-4658 (1983)].

A CHO sejteket a következő módon is transzformálhatjuk: pG4DRl-et vagy pG4DR2-t, amelyet a 2. pontban állítottunk elő, előzetesen kezelünk Sall-gyel, illetve KpnI-gyel, hogy DNS fragmentumokat kapjunk; és ezekből a fragmentumokból 10—10 pg-ot al25

HU 209 147 Β kalmazunk a CHO sejtek transzformálására a fentiek szerint; a transzformált sejteket folyamatos tenyésztésnek vetjük alá szelektív tápközegek sorozatán, amint ezt fentebb leírtuk; mintegy 7 nappal később legalább 100 elkülönült telep jelenik meg lemezenként; ezeket a telepeket egy tömegben friss lemezre visszük át és folytonos tenyésztésnek vetjük alá szelektív tápközegek sorozatában, 0,01 gmól/l MTX jelenlétében, amelynek következtében tízegynéhány telep jelenik meg; ugyanazt az eljárást megismételjük más MTX koncentrációkkal is, ahol a koncentráció fokozatosan növekszik 0,03 gmól/l-re, 0,05 μτηόΐ/l-re és 0,1 μτηόΐ/l-re, és a túlélő telepeket kiválasztjuk; a telepkiválasztást hasonló módon hajthatjuk végre akkor is, amikor a kapott tízegynéhány telepet egyenként választjuk ki és növekvő MTX koncentrációknál tenyésztésnek vetjük alá.

Egy olyan rekombináns vektort, amely „policisztronos gén”-t tartalmaz, szintén alkalmazhatunk CHO sejtek transzformálására. Erre az alternatív módszerre az alábbi példát adjuk meg: pAdD26SVpA-t Pstl-gyel kezelünk és a kinyert két fragmentumot pBRG4-eredetö CSF cDNS-fragmentummal egyesítjük úgy, hogy olyan rekombináns vektor jöjjön létre, amelybe az adenovírus promoter, CSF cDNS, DHFR és az SV40 poli(A) helye van beiktatva a leírt sorrendben. Ezt a rekombináns vektort használjuk CHO sejtek transzformálására.

26. példa

G-CSF aktivitás (+VSE) vizsgálata

A 24., illetve 25. példában kapott C-27 sejtek, illetve CHO sejtek tenyészeteinek felülúszóit pH 4-re állítjuk be 1 n ecetsavval. Azonos térfogat n-propanol hozzáadása után az így létrejött csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót C8 fordított fázisú hordozóval (Yamamura Kagaku K. K) töltött nyitott oszlopon (átmérő 1 cm, magasság 2 cm) átengedjük, és eluálást végzünk 50%-os n-propanollal. Az eluátumot kétszeresére hígítjuk vízzel és fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá YMC-C8 oszlopon (Yamamura Kagaku K. K), ezt követi az eluálás 0,1% TFA-t tartalmazó n-propanollal (30-60% lineáris sűrűséggradiens). A frakciókat, amelyeket mintegy 40% n-propanol koncentrációnál eluálunk, kinyerjük, fagyasztva szárítjuk és feloldjuk 0,1 mól/l-es glicin pufferban (pH 9). Ezeknek az eljárásoknak az eredményeképpen a C127 és CHO sejtekben levő humán G-CSF-et mintegy hússzorosan koncentráljuk.

Kontrollként sejteket transzformálunk humán GCSF cDNS-től mentes plazmidokkal, és tenyészetük felülúszóit koncentráljuk a fentebb leírt eljárásokkal. A minták humán G-CSF aktivitásait a humán G-CSF aktivitás mérésnek az ebben a bejelentésben korábban leírt (a) módszere szerint mérjük. Ha a kifejeződés hatékonysága megfelelően nagy, a tenyészet felülúszóit közvetlenül is lehet vizsgálni koncentrálás nélkül. Az eredményeket az 5. táblázatban foglaljuk össze, ahol az adatok a koncentrált mintákon alapulnak.

5. táblázat

Humán G-CSF aktivitás mérése

Humán neutrofil telepek (telep/csésze)
Tisztított humán G-CSF (20 ng)	96
BPV	pdBPV-l-gyel transzformált C127 sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	0
pdBPV-1-gyei transzformált 3T3 sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	0
pTNG4-gyel transzformált C127 sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	82
pTNG4-gyel transzformált 3T3 sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	85
dhfr	pAdD26SVpA-val transzformált CHO sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	0
pHGG4-dhfr-rel transzfonnált CHO sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	110
pG4DRl-gyel transzformáit CHO sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	105

27. példa

Aminosav-elemzés és cukorelemzés (+VSE)

1. Az aminosav-összetétel elemzése

A 26. példában készített nyers CSF mintát tisztítjuk a 2(iii) példában leírt eljárásokkal. A tisztított CSF mintát rutin eljárásokkal hidrolizáljuk, és a hidrolizátum fehérjerészét aminosav-összetételre ellenőrizzük az aminosavelemzés speciális módszerével, Hitachi 835 automatikus aminosav-analizáló berendezéssel (Hitachi, Ltd). Az eredmények a 6. táblázatban láthatók. A hidrolízist az alábbi körülmények között végezzük.

(i) 6 n HCI, 110 °C, 24 óra, vákuumban;

(ii) 4 n metánszulfonsav + 0,2% 3-(2-amino-etil)indol, 110 °C, 24 óra, 48 óra, 72 óra, vákuumban.

A mintát 1,5 ml oldatban oldjuk fel, amely 40% n-propanolt és 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmaz. 0,1 ml-es alikvotokat szárítunk száraz nitrogéngázzal, és az (i) vagy (ii) pontban felsorolt reagensek hozzáadása után a tartályokat vákuumban leforrasztjuk, ezt követi a béltartalom hidrolízise.

A 6. táblázatban bemutatott értékek mind a négy mérés átlagát képviselik, 24 órás értéket az (i)-nél és 24, 48 és 72 órás értékeket (ii)-nél azzal a kivétellel, hogy a Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Val, Ile és Trp tartalmat az alábbi módszerrel számoljuk ki [lásd „Tampaku Kagaku (Protein Chemistry) (Fehérje kémia) II”, A Coürse in Biochemical Experiments (Munkamenet a biokémiai kísérletekben), Tokyo Kagaku Dohjin]:

- Thr, Ser, 1/2 Cys és Met aminosavaknál az (ii) szerint felvett 24, 48 és 72 órás idő-függő profilt extrapoláljuk 0 órára.

HU 209 147 Β

- Val és Ile aminosavaknál az (ii) szerinti 72 órás értéket használjuk.

- Trp-nél az (ii) szerinti 24, 48 és 72 órás értékek átlagát használjuk.

6. táblázat

Aminosav-elemzési adatok

Aminosav	Mól%
Asp (Asp + Asn)	2,3
Thr	3,9
Ser	8,5
Glu (Glu + Gin)	15,3
Pro	7,4
Gly	7,8
Alá	10,8
1/2 Cys	2,8
Val	4,5
Met	1,7
Ile	2,3
Leu	18,6
Tyr	1,7
Phe	3,4
Lys	2,3
His	2,8
Trp	1,1
Arg	2,8

2. Cukorösszetétel-elemzés

Belső standardot (25 mmól inozit) adunk 200 ng tisztított CSF mintához, amelyet az 1. szerinti aminosav-összetétel elemzéshez használunk. 1,5 n HCl-t tartalmazó 500 μΐ metanololdat hozzáadása után a reakciót 90 °C hőmérsékleten 4 órán át folytatjuk N₂-vel átöblített, zárt csőben. Miután a csövet kinyitottuk, ezüst-karbonátot (Ag₂CO₃) adunk hozzá, hogy a béltartalmat semlegesítjük. Ezután 50 μΐ ecetsav-anhidridet adunk hozzá és a csövet megfelelő időn át rázzuk. Ezután a csövet egy éjszakán át sötétben tartjuk szobahőmérsékleten. A felső réteget mintacsőbe helyezzük és nitrogén gázzal szárítjuk. Metanolt adunk a csapadékhoz és a keveréket mossuk és enyhén centrifugáljuk. A felső réteget ugyanabba a mintacsőbe visszahelyezzük és szárítjuk. 50 μΐ TMS reagens (piridin, hexametil-diszilazán és trimetil-klór-szilán 5:1:1 arányú keveréke) hozzáadása után 40 °C hőmérsékleten 20 percig reakciót hajtunk végre, és a reakcióterméket mélyhűtőben tároljuk. Standardot készítünk 25 mmól inozitot kombinálva 50-50 mmól galaktózzal (Gál), Nacetil-galaktóz-aminnal (GalNAc), sziálsavval és más megfelelő reagensekkel.

Az így készített mintákat gázkromatográfiás elemzésnek vetjük alá a következő körülmények között.

Az elemzés körülményei

Oszlop: 2% OV-17 VINportHP, 60-80 pórusméret, 3 m, üveg.

Hőmérséklet: 110 °C-ról emelkedik 250 °C-ra 4 °C/perccel.

Hordozó gáz (N₂) nyomás: kezdetben

1,2-1,6 kg/cm² végén 2-2,5 kg/cm²

Érzékenység: 10³ ΜΩ tartomány, 0,1-0,4 volt. Nyomás: H₂,0,8 kg/cm²;

levegő: 0,8 kg/cm².

Minta betáplálás: 2,5-3,0 μΐ.

Az elemzés eredményeképpen galaktózt, N-acetilgalaktózamint és sziálsavat azonosítunk a jelen találmány szerinti CSF mintában.

28. példa pHGV2 vektor előállítása (állati sejtekhez való alkalmazásra, -VSE vonal)

A 10. példában készített EcoRI fragmentumot, amely a 4A ábrában bemutatott cDNS-sel rendelkezik, Dral restrikciós enzimmel kezeljük 37 °C hőmérsékleten 2 órán át, ezt követi a kezelés DNS-polimeráz I Klenow-fragmentummal (Takara Shuzo Co., Ltd), hogy tompa végeket alakítsunk ki. 1 mikrogramm BglII kapcsolót (8-mer, Takara Shuzo Co., Ltd) foszforilezünk ATP-vel és egyesítjük DNS-fragmentumok külön kapott keverékének mintegy 1 μg-jával. Az egyesített fragmentumokat BglII restrikciós enzimmel kezeljük, és agaróz gélelektroforézisnek vetjük alá. Ezt követően csak a legnagyobb DNS-fragmentumot nyerjük ki.

Ez a DNS-fragmentum ekvivalens egy humán GCSF polipeptidet kódoló részt tartalmazó mintegy 700 bázispárral (lásd 6. ábra). pdKCR vektort [Fukanaga és munkatársai: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81, 5086 (1984)] kezelünk BamHI restrikciós enzimmel, majd defoszforilezzük alkalikus foszfatázzal (Takara Shuzo Co., Ltd). A kapott vektor-DNS-t egyesítjük a mintegy 700 bp-s cDNS fragmentummal T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo Co., Ltd) jelenlétében, így pHGV2-t állítunk elő (17. ábra). Amint a 17. ábrában bemutatjuk, ez a plazmid tartalmazza az SV40 korai gén promoterjét, az SV40 replikációt iniciáló területét, a nyúl β-globin gén egy részét, a pBR322 replikációt iniciáló területét és a pBR322-eredetű β-laktamáz gént (Amp^r), a humán GCSF gén az SV40 korai gén promoterétől „lefelé” kapcsolódik.

29. példa

Rekombináns vektor (-VSE) megalkotása C-27 sejtek transzformálásához való felhasználáshoz

1. pHGV2(H) megalkotása mikrogram, a 28. példában megalkotott pHGV2 plazmidot (17. ábra) kezelünk a 23. példa 1. részében leírt eljárással, hogy a pHGV2(H)-nak nevezett plazmidot kapjuk (18. ábra).

HU 209 147 Β

2. A pTN-V2, pTNVAa és ρΤΝΥΑβ kifejezendő rekombináns vektorok megalkotása pg pHGV2(H) felhasználásával a 23, példa 2. részében leírt eljárásokat megismételjük, hogy a pHGV2-eredetű G-CSF cDNS-sel rendelkező plazmidot magában foglaló E. colit kiválasszuk. Ezt a plazmidot pTN-V2-nek nevezzük (18. ábra).

II. típusú adenovírust [Tampakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids, and Enzymes) (Fehérjék, Nukleinsavak és Enzimek) 1982. december, 27. Kyoritsu Shuppan] hasonlóképpen kezelünk, hogy a ApVA plazmidot megkapjuk, amely tartalmaz egy mintegy 1700 bp-s Sall-HindlII fragmentumot, amely Val-et és VAII-t foglal magában, és egy VAI-et és VAII-t tartalmazó fragmentumot kinyerünk ebből a plazmidból. Ezt a fragmentumot beiktatjuk pTN-V2be a HindlII helynél, így kapjuk meg a pTNVAa-t és ρΤΝνΑβ-t (18. ábra). Az adenovírus VA génje miatt ezek a plazmidok az átírási termék fokozott kifejeződésére képesek az SV40 korai promoteréből.

30. példa

C127 sejtek transzformálása és benne a G-CSF kifejeződése (-VSE)

A 29. példában kapott pTN-V2-t BamHI restrikciós enzimmel kezeljük, mielőtt felhasználnánk az egér C127 sejtek transzformálására.

Egér C127I sejteket transzformálunk az így készített DNS-sel, hogy G-CSF-et fejezzünk ki (lásd 24. példa), és a nagy G-CSF termelési sebességgel rendelkező kiónokat kiválasztjuk. Ezek a kiónok a G-CSF-et mintegy 1 mg/1 szinten termelik.

További klónozással olyan kiónokat tudunk kiválasztani, amelyek 10 mg/1 szinten képesek G-CSF-et termelni. Hasonló módon C127 sejteket transzformálunk a 29. példában kapott pTNVAa-val és ρΤΝΥΑβval, és a transzformánsokat olyan kiónokra választjuk ki, amelyet nagy G-CSF termelésre képesek; pTNVAa esetében olyan kiónokat kaphatunk, amelyek a G-CSF-et 20 mg/1 vagy nagyobb mennyiségben termelik, míg kisebb termelékenységgel (néhány mg/1) bíró kiónokat kapunk ρΤΝνΑβ-val végzett transzformációval.

A C127I sejteken NIH3T3 sejtek is használhatók gazdasejtekként.

31. példa

G-CSF kifejezése CHO sejtekben (-VSE)

1. A pHGV2-dhfr'rnegalkotása

Mintegy 2,7 kbp hosszúságú DNS-fragmentumot készítünk 20 pg pHGV2 plazmidból (28. példa), a 25. példa 1. részében leírt eljárásokkal. Ezt a fragmentumot (0,5 pg) és a pAdD26SVpA EcoRI-fragmentumát (0,5 pg) összeforrasztjuk. Az így létrejött plazmidot használjuk E. coli DH1 törzs transzformálására a rubídium-kloridos módszerrel, és a pHGV2-dhfr plazmidot magában foglaló telepeket kiválasztjuk. A kapott plazmidot pHGV2-dhfr-nek nevezzük (19a ábra).

Egy alternatív eljárás a következő: a pHGV2 plazmidot Sall-gyel kezeljük és részlegesen emésztjük EcoRI-gyel anélkül, hogy bármiféle EcoRI kapcsoló lenne hozzárögzítve. Egy mintegy 2,7 kbp hosszúságú DNS-fragmentumot nyerünk ki, és ezt E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával kezeljük, hogy tompa végeket hozzunk létre. A pAdD26SVpA-ból tompa végű EcoRI fragmentumot készítünk, amint fentebb leírtuk. Ezt az EcoRI-fragmentumot és a külön elkészített fragmentumot (mintegy 2,7 kbp) T4 DNS-ligázzal kezeljük, így készítjük el a pHGV2-dhfr-t.

A 29. példa 1. részében előállított pHGV2(H)-t HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel kezeljük, amint ezt a 29. példa 2. részében leírtuk, és a HindlII-Sall fragmentumot a pAdD26SVpA fentebb leírt tompa végű EcoRI fragmentumával egyesítjük. Ezt a módszert lehet alkalmazni a pHGG4-dhfr elkészítéséhez (19b ábra).

2. pV2DRl és pV2DR2 megalkotása pg, az 1. részben említett pAdD26SVpA plazmidot feloldunk 50 pl reakcióoldatban, amely 50 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 7 mmól/1 MgCl₂-t, 100 mmól/1 NaCl-t, 7 mmól/1 2-merkapto-etanolt és 0,01% BSA-t tartalmaz. A reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 10 órán át 10-10 egység EcoRI és BamHI restrikciós enzim jelenlétében. Ezután fenolos kezelést és éteres mosást végzünk rutin-eljárások alkalmazásával. Mintegy 2 kb-s DNS-fragmentumot nyerünk ki 1%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen végzett elektroforézissel. A kinyert DNS-fragmentumot DNS-polimeráz Klenow-fragmentummal kezeljük rutin-eljárásokkal, hogy tompa végeket alakítsunk ki. A tompa végű DNS-fragmentumot fenolos kezelésnek vetjük alá, éterrel és etanollal kicsapjuk.

pg, 29. példa 1. részében kapott pHGV2(H) plazmidot feloldunk 50 pl reakcióoldatban, amely 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 7 mmól/I MgCl₂-t és 60 mmól/1 NaCl-t tartalmaz. A reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 6 órán át 10 egység HindlII jelenlétében. DNS-fragmentumot nyerünk ki 1%-os, alacsony olvadáspontú agaróz gélen végzett elektroforézis segítségével, amelyet rutin-eljárással hajtunk végre. A kinyert DNS-fragmentumot ezután BAP-vel kezeljük, és tompa végeket alakítunk ki Klenow-fragmentummal végzett kezeléssel. Fenolos kezelés és éteres.mosás után a DNS-fragmentumot tompa végénél egyesítjük a korábban kapott, mintegy 2 kb-s DNS-fragmentummal T4 DNS-ligáz segítségével a következő eljárásokkal: 1-1 pg DNS-fragmentumot feloldunk 30 pl reakcióoldatban, amely 66 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5), 6,6 mmól/1 MgCl₂-t, 5 mmól/1 DTT-t és 1 mmól/1 ATP-t tartalmaz, és reakciót végzünk 6 °C hőmérsékleten 12 órán át 50 egység T4 DNS-ligáz jelenlétében. A ligálási terméket használjuk fel E. coli DH1 törzs transzformálására. Ennek eredményeképpen a 19c ábrán bemutatott pV2DRl-et és pV2DR2-t kapjuk.

Transzformálás és kifejeződés

CHO sejteket transzformálunk pHGV2-dhfr plazmiddal G-CSF kifejeződés céljából a 25. példa a 3. részében leírtakkal összhangban.

A CHO sejtek transzformálását végre lehet hajtani

HU 209 1 47 Β pHGV2-vel és pAdD26SVpA-val végzett együttes transzformálással is.

CHO sejteket transzformálhatunk az alábbiak szerint is: pV2DRl-et vagy pV2DR2-t, amelyeket a

2. pont szerint készítettünk, előzetesen kezelünk Sa11-gyel, illetve KpnI-gyel, hogy DNS-fragmentumokat kapjunk, és ezekből a fragmentumokból 10 pg-ot használunk fel, hogy CHO sejteket transzformáljunk a fentiek szerint; a transzformált sejteket folyamatos tenyésztésnek vetjük alá szelektív tápközegek sorozatában olyan módon, ahogyan ezt már korábban leírtuk; mintegy 7 nappal később legalább 100 elkülönült telep jelenik meg lemezenként; ezeket a telepeket egy tömegben friss lemezre visszük át és folytonos tenyésztésnek vetjük alá szelektív tápközegek sorozatában 0,01 pmól/1 MTX jelenlétében, amelynek következtében tízegynéhány telep jelenik meg; ugyanezt az eljárást megismételjük más MTX koncentrációkkal is, ahol a koncentráció fokozatosan növekszik 0,02 pmól/l-re, 0,05 pmól/l-re és 0,1 pmól/l-re, és a túlélő telepeket kiválasztjuk; a telepkiválasztást hasonló módon hajtjuk végre akkor is, amikor a kapott tízegynéhány telepet egyenként választjuk ki és növekvő MTX koncentrációknál tenyésztésnek vetjük alá.

Egy olyan rekombináns vektort, amely „policisztronos gén”-t tartalmaz, szintén alkalmazhatunk CHO sejtek transzformálására. Erre az alternatív módszerre az alábbi példát adjuk meg. pAdD26SVpA-t Pstl-gyel kezeljük és a kinyert két fragmentumot pBRV2-eredetű CSF cDNS-fragmentummal egyesítjük úgy, hogy olyan rekombináns vektort alkossunk meg, amelybe az adenovírus promoter, a CSF cDNS, a DHFR és az SV40 poli(A) helye van beiktatva a leírt sorrendben. Ezt a rekombináns vektort használjuk CHO sejtek transzformálására.

32. példa

G-CSF aktivitás (-VSE) meghatározása

A 26. példában leírt eljárásokkal humán G-CSF-et kapunk Cl27 sejtek és CHO sejtek tenyészeteinek felülúszóiból, mely sejteket a 30., illetve 31. példában kaptuk. Az egyes kinyert minták humán G-CSF aktivitásait a 26. példában leírt módon határozzuk meg. Az eredményeket a 7. táblázat mutatja be.

7. táblázat

Humán G-CSF aktivitás meghatározása

	Humán neutrofil telepek (telep/csésze)
Tisztított humán G-CSF (20 ng)	96
BPV	pDBPV-l-gyel transzformált C127 sejtek tenyészete (hússzorosan koncentrált)	0
pdBPV-l-gyel transzformált 3T3 sejtek tenyészete (hússzorosan koncentrált)	0
pTN-V2-vel transzformált Cl27 sejtek tenyészete (hússzorosan koncentrált)	107
pTN-V2-vel transzformált 3T3 sejtek tenyészete (hússzorosan koncentrált),,	103
dhfr	pAdD26SVpA-val transzformált CHO sejtek tenyészete (hússzorosan koncentrált	fe· 0
pHGV2-dhfr-rel transzformált CHO sejtek tenyészete (hússzorosan koncentrált),,,
pV2DRl-gyel transzformált CHO sejtek tenyészete (hússzorosan koncentrált)	113

HU 209 147 Β

33. példa

Aminosav-elemzés és cukorelemzés (-VSE)

1. Az aminosav-összetétel elemzése

A 32. példában készített nyers CSF mintát a 2. példa (iii) részében leírtak szerinti módszerrel összhangban tisztítjuk. A tisztított CSF mintát aminosavösszetétel elemzésnek vetjük alá, a 27. példa 1. részében leírt eljárásokkal. Az eredményeket a 8. táblázat mutatja be.

8. táblázat

Aminosav elemzési adatok

Aminosav	Mói%
Asp (asp + Asn)	2,3
Thr	4,0
Ser	8,1
Glu (Glu + Gin)	15,1
Pro	7,5
Gly	8,0
Alá	10,9
1/2 Cys	2,8
Val	3,9
Met	1,7
Ile	2,3
Leu	18,9
T^r	1,7
Phe	3,5
Lys	2,3
His	2,9
Trp	1,2
Arg	2,9

2. A cukor-összetétel elemzése

A tisztított CSF-mintát, melyet az 1. részben az aminosav-összetétel elemzésében használunk, cukor összetételére is analizáljuk ugyanazokkal az eljárásokkal és ugyanazon körülmények között, melyeket a 27. példa 2. részében leírtunk. Ennek az elemzésnek az eredményeképpen galaktóz, N-acetil-galaktózamin és sziálsav jelenléte igazolódott a jelen találmány szerinti CSF mintában.

34. példa

Kromoszomális gént tartalmazó rekombináns vektor megalkotása COS-sejtekben való kifejeződéshez

A pBRCE3P plazmidot, amelyet all. példában nyertünk, és amely tartalmazza az 5. ábrában bemutatott kromoszomális gént, EcoRI-gyel kezeljük. A Banerji és munkatársai által leírt pSVH⁺K⁺ plazmidot [Cell, 27, 299 (1981)] KpNI-gyel kezeljük, hogy a globingént eltávolítsuk. A plazmidot továbbá részleges emésztésnek vetjük alá HindlII-mal, így eltávolítjuk az SV40 késői gén egy részét. A fragmentumokat újraegyesítjük, így állítjuk elő a pML-E⁺ kifejező vektort.

Ezt a vektort EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, és alkalikus foszfatázzal (Takara Shuzo Co., Ltd) defoszforilezzük, hogy egy vektor-DNS-t kapjunk, amelyet a fentebb említett kromoszomális DNS-hez kapcsolunk T4 DNS-ligáz (Takara Shuzo Co., Ltd) segítségével, így kapjuk a pMLCE α-t. Amint ez a 20. ábrában látható, ez a plazmid az SV40 gén fokozóját (enhancer), az SV40 replikációs origóját, a pBR322 replikációs origóját és a pBR322-eredetű β-laktamáz gént tartalmazza (Amp^r), és a humán G-CSF kromoszomális génnel rendelkezik az SV40 gén fokozójától „lefelé” összekapcsolva.

35. példa

Humán G-CSF kromoszomális gén kifejeződése

COS sejtekben

COS-1 sejteket transzformálunk (ATCC CRL 1650), amelyeket előzőleg mintegy 70% sűrűségig növesztettünk Petri-csészékben (9 cm átmérő, Nunc) 10% borjúszérumot tartalmazó DMEM tápközeget alkalmazva (Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg, amely a Nissui Seiyaku K. K.-nál kapható „Nissui” védjegy alatt). A transzformálást vagy a kalciumfoszfátos eljárással [Wigler és munkatársai: Cell. 14, 725 (1978)], vagy a DEAE-dextrán-klorokin módszerrel [lásd pl. Gordon és munkatársai: Science, 228, 810 (1985)] hajtjuk végre.

A transzformálást a kalcium-foszfátos eljárással a következőképpen hajtjuk végre: 160 gg, 34. példában készített pMLCE3a plazmidot feloldunk 320 μΐ TE oldatban, és desztillált víz hozzáadása után (3,2 ml) 504 μΐ 2 mól/l-es CaCl₂-t adunk hozzá.

Az így létrejött oldathoz 4 ml 2xHBS-t (50 mmól/1 Hepes, 280 mmól/1 NaCl, 1,5 mmól/1 foszfát puffer, pH 7,12) adunk, és a keveréket jégen hűtjük 20-30 percen át. A lehűtött keveréket csep30

HU 209 147 Β penként a tápközeghez adjuk 1 ml/Petri csésze mennyiségben, ahhoz a csészéhez, amelyben a COSsejtek nőttek. 4 órán át 37 °C hőmérsékleten, CO₂ inkubátorban végzett tenyésztés után a sejteket szérummentes DMEM tápközegben mossuk, azután mintegy 3 percig állni hagyjuk szobahőmérsékleten 5 ml DMEM tápközegben, amely 20% glicerint tartalmaz, és újra mossuk szérummentes DMEM tápközegben. Miután a szérummentes DMEM tápközeget eltávolítottuk, 10 ml, 10% borjúszérumot tartalmazó DMEM tápközeget adunk hozzá, és a tenyésztést egy éjszakán át végezzük CO₂ inkubátorban. Miután a tápközeget friss, azonos típusú tápközeggel helyettesítettük, a tenyésztést további három napig folytatjuk.

A DEAE-dextrán-klorokin módszerrel a transzformálást a következőképpen végezzük: akárcsak a kalcium-foszfátos módszerrel, COS-1 sejteket tenyésztünk, hogy 70% sűrűségig növekedjenek, és mossuk kétszer szérummentes DMEM tápközeggel, a mosott sejtekhez 250 pg/ml DEAE-dextránt tartalmazó szérummentes DMEM tápközeget és 2 pg/ml 34. példában készített, pMLCE aplazmidot adunk, és tenyésztést végzünk 37 ’C hőmérsékleten 12 órán át; a sejteket ezután kétszer mossuk szérummentes DMEM tápközeggel, és további tenyésztésnek vetjük alá 37 °C hőmérsékleten 2 órán át 10% borjúszérumot és 1 mmól/1 klorokint tartalmazó DMEM tápközegben; ezután a sejteket kétszer mossuk szérummentes DMEM tápközeggel és tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten további 3 napon át 10% borjúszérumot tartalmazó DMEM tápközegben.

A COS-1 sejtek így kapott tenyészetének felülúszóját pH 4-re állítjuk be 1 n ecetsavval. Azonos térfogat n-propanol hozzáadása után az így létrejött csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót C8 fordított fázisú hordozóval (Yamamura Kagaku K. K) töltött nyitott oszlopon (1 cm átmérő, 2 cm hosszúság) engedjük át, és az eluálást 50%-os n-propanollal végezzük. Az eluátumot kétszeresére hígítjuk vízzel és fordított fázisú nagy nyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá YMC-C8 oszlopon (Yamamura Kagaku K. K.), ezt követi az eluálás 0,1 % TFA-t tartalmazó n-propanollal (30-60% lineáris sűrűséggradiens). A frakciókat, amelyeket mintegy 40% n-propanol koncentrációnál eluálunk, fagyasztva szárítjuk és feloldjuk 0,1 mól/1 glicin pufferban (pH 9). Ezeknek az eljárásoknak az eredményeképpen a COS-1 sejttenyészet felülúszójában a humán G-CSF-et mintegy 20-szorosára koncentráljuk.

Kontrollként COS-1 sejteket G-CSF kromoszomális génektől mentes pML-E⁺-vel transzformálunk a fentebb leírt eljárásokkal, és az így létrejött tenyészet felülúszóját koncentráljuk.

A kapott minták humán G-CSF aktivitását a jelen leírásban „Módszer humán G-CSF aktivitásának mérésére (a)” címen korábban leírt módszerrel határozzuk meg. Az eredményeket a 9. táblázatban foglaljuk össze.

9. táblázat

	Humán neutrofil telepek (telep/csésze)
Tisztított humán G-CSF (20 ng)	18
pML-E+-vel transzformált COS- sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	0
pMLCEa-val transzformált COS sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	23
pMLCEa-val transzformált COS sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	19

36. példa

G-CSF (kromoszomális gén) RNS elemzése

8xl0⁶ sejt/lemez (9 cm átmérő) sejtkoncentrációra tenyésztett COS sejteket transzformálunk 80 pg pMLCE3a plazmiddal. 48 óra múlva a teljes RNS-t kipreparáljuk Chirgwin módszerével [Biochemisty, 18, 5294-5299 (1979)].

A 9. példában kapott pBRG4 plazmidot AhalII restrikciós enzimmel hasítjuk, és az így létrejött pBRG4eredetű DNS fragmentumot radioaktívan megjelöljük [γ-³²Ρ] ATP-vel, T4 polinukleotid kinázt alkalmazva, így egy mintegy 2,8 kb-s DNS fragmentumot kapunk, amely tartalmazza a G-CSF cDNS-t. A fragmentumot kinyerjük és mint DNS vizsgálómintát alkalmazzuk. Miután a DNS vizsgálómintát (l,5xl0^scpm; 2,8xl0⁶cpm/pg DNS) denaturáljuk, összekeverjük 20 pg, COS sejtekből készített teljes RNS-sel. Hibridizálást hajtunk végre 45 °C hőmérsékleten 15 órán át. A keveréket 200 egység/ml vagy 400 egység/ml SÍ nukleázzal (P. L. Biochemicals) kezeljük, Weaver és Weissmann módszerével [Nucleic Acid Rés. 7, 1175— 1193 (1979)], ezt követi a 4%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézis 8,3 mól/1 karbamid jelenlétében. Ezután végezzük el a kimutatást autoradiográfiával.

Ennek eredményeképpen 722 bp-nek megfelelő csíkot figyelünk meg, mint radioaktívan erősen jelzett csíkot a COS sejtekben, amelyből egy 487 bp-nek megfelelő csík is kimutatható.

Ezért a COS-sejtek RNS-éről úgy találjuk, hogy mind a +VSE, mind a -VSE vonal G-CSF mRNS-ét tartalmazza.

37. példa

Aminosav-elemzés és cukorelemzés (Kromoszomális gén).

1. Az aminosav-összetétel elemzése

A 35. példában készített nyers CSF mintát megtisztítjuk a 2(iii) példában leírt eljárásokkal összhangban. A megtisztított CSF minta aminosav-összetételét a 27. példa 1. részben leírt eljárásokkal elemezzük. Az eredményeket a 10. táblázat mutatja be.

HU 209 147 Β

10. táblázat

Aminosav-elemzési adatok

Aminosav	M61%
Asp (Asp + Asn)	2,3
Thr	4,9
Ser	8,3
Glu (Glu + Gin)	15,3
Pro	7,4
Gly	7,9
Ala	10,8
1/2 Cys	2,8
Val	4,3
Met	1,7
Ile	2,3
Leu	18,7
iyr	1,7
Phe	3,4
Lys	2,3
His	2,9
Trp	1,1
Arg	2,9

2. A cukor-összetétel elemzése

Az 1. pontban leírt aminosav-összetétel elemzésben használt tisztított CSF mintát alávetjük cukor-elemzésnek is azonos eljárásokkal és azonos körülmények között, mint ahogyan ezt a 27. példa 2. részében leírtuk. Az elemzés eredményeképpen galaktóz, N-acetilgalaktózamin és sziálsav jelenléte bizonyított a jelen találmány szerinti CSF mintában.

38. példa

Humán G-CSF kromoszomális gén kifejeződése

C127 sejtekben

A 34. példában kapott pMLCEa plazmidot EcoRI-gyel kezeljük, és egy mintegy 4 kb-s fragmentumot kinyerünk a korábban már idézett „Molecular Cloning” c. munkában leírt eljárások szerint. A kinyert fragmentumot használjuk a kromoszomális G-CSF gén forrásaként.

A fragmentumot DNS-polimeráz I Klenow fragmentummal kezeljük, hogy tompa végeket hozzunk létre (A).

Az SV40-promotert (mintegy 0,4 kb-s EcoRIEcoRI fragmentum) kihasítjuk a pHGA410 plazmidból (amelyet a 22. példában állítottunk elő) a korábban már idézett „Molecular Cloning” c. munkában leírt eljárások szerint, és ezt követően DNS-polimeráz Klenowfragmentummal kezeljük (B).

Külön lépésben szarvasmarha papillóma vírussal (BPV) rendelkező pdBPV-1 plazmidot (ezt a plamidot dr. Howley ajándékaként kaptuk, és ez az alábbi irodalmi helyen van leírva: Sarver N., Sbyme J. C. és Howley P. M.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7147-7151 (1982)] HindlII-mal és Pvuü-vel kezeljük, hogy mintegy 8,4 kb-s DNS fragmentumot kapjunk. Ezt a fragmentumot DNS-polimeráz I Klenow fragmentumával kezeljük, és bakteriális alkalikus foszfatázzal defoszforilezzük (C),

Az (A), (B) és (C) lépésekből származó, különkülön 0,1 pg mennyiségű DNS-fragmentumokat feloldjuk 20 pl reakcióoldatban [50 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,6), 10 mmól/1 MgCl₂, 10 mmól/1 DTT, 1 mmól/1 ATP] és a reakciót egy éjszakán át végezzük 4 °C hőmérsékleten 180 egység T4 DNS ligáz segítségével.

A reakcióoldatot ezt követően a rubídium-kloridos eljárással kezeljük, amint ez a fentebb idézett „Molecular Cloning” c. munkában le van írva, így kapjuk meg a pTNCE3a plazmidot (21. ábra).

A kromszomális G-CSF gén forrásaként használt (A) DNS fragmentumot helyettesíteni lehet egy mintegy 1,78 kb-s DNS-fragmentummal, amelyet az alábbi lépéseket tartalmazó eljárással kapunk: 20 pg pMLCE3a-t feloldunk 100 pl 10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 8,0), 7 mmól/1 MgCl₂-t, 100 mmól/1 NaCl-t, 7 mmól/1 2-merkapto-etanolt, és 0,01% BSA-t tartalmazó keverékben; az oldatot 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 5 órán át 20 egység Stul jelenlétében, és 1,2% agaróz gélen elektroforézisnek vetjük alá.

Az így kapott pTNCE3a-t használjuk C127I egérsejtek transzformálására, mint a 24. példában, és azokat a kiónokat, amelyek a humán G-CSF kromoszomális gént kifejezik, és amelyeknek nagy kapacitása van G-CSF előállítására, kiválasztjuk.

39. példa

Humán G-CSF kromoszomális gén kifejeződése

CHO sejtekben

Akárcsak a C127 sejtek esetében, a pMLCE3a plazmidot Stul-gyel kezeljük, és egy mintegy 1,78 kb-s DNS fragmentumot kinyerünk; egy másik módszer szerint ugyanezt a plazmidot EcoRI-gyel kezeljük és mintegy 4 kb-s EcoRI fragmentumot nyerünk ki. Bármelyik fragmentum alkalmas kromoszomális G-CSF gén forrásaként való felhasználásra.

A forrásként szolgáló fragmentumot DNS-polimeráz I Klenow fragmentummal kezeljük (a).

Akárcsak a 38. példában, az SV40 promotert (EcoRI-EcoRI fragmentum) kihasítjuk a pHGA41032

HU 209 147 Β bői, hogy egy mintegy 0,4 kb-s fragmentumot kapjunk, amelyet hasonlóképpen kezelünk DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával (b).

Külön lépésben a pAdD26SVpA plazmidot [Kaufman R. G. és Sharp P. A.: Mól. Cell. bioi, 2, 1304-1319 (1982)] EcoRI-gyel, majd DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával kezeljük, végül bakteriális alkalikus foszfatázos kezeléssel defoszforilezzük (c).

A fenti (a), (b) és (c) lépésekből származó fragmentumok egyenként 0,1 pg mennyiségeit feloldjuk 20 pl reakcióoldatban [50 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,6), 10 mmól/1 MgCl₂, 10 mmól/1 DTT, 1 mmól/1 ATP], és a reakciót egy éjszakán át végezzük 4 °C hőmérsékleten 180 egység T4 DNS-ligáz jelenlétében.

A reakcióoldatot ezután a rubídium-kloridos módszerrel kezeljük, amint ezt a „Molecular Cloning” c. munkában leírták, így transzformálunk E. coli DH1 törzset. Az így létrejött Tet^r telepek közül kiszűrjük azokat, amelyek a pD26SVCE3a plazmidot tartalmazzák.

Amint ez a 22. ábrán látható, a pD26SVCE3a plazmid rendelkezik a CSF génnel az SV40 korai génhez kapcsolva, és a dhfr génnel az adenovírus vezető késői promotertől „lefelé” kapcsolva.

A pAdD26SVpA plazmidot EcoRI-gyel és BamHIgyel kezeljük, mint a 25. példa 2. részében, így olyan (mintegy 2 kb-s) DNS fragmentumot kapunk, amely tartalmazza a dhfr gént. Ezt a fragmentumot az (a) fragmentumhoz és a pHGA410(H) EcoRI-Sall fragmentumához kötjük, így alkotjuk meg a pDRCE3a Amp^r kifejező vektort (22. ábra).

CHO-sejteket transzformálunk az így kapott pD26SVCE3a és pDRCE3a plazmidokkal, mint a 25. példában. MTX jelenlétében végzett növesztéssel ismételt szelekciót végzünk, így G-CSF-et termelő törzsek kiónjait kapjuk.

40. példa

Humán kromoszomális gént kifejező transzformánsok G-CSF aktivitásának meghatározása A 38., illetve 39. példában kapott C127, illetve

CHO sejtek felülúszóit olyan módon dolgozzuk fel, mint a 26. példában, így humán G-CSF-et kapunk, és ennek aktivitását meghatározzuk. Az eredményeket a 11. táblázatban mutatjuk be.

//. táblázat

Humán G-CSF aktivitás meghatározása

	Humán neurofil telepek (telep/csésze)
Tisztított humán G-CSF (20 ng)	85
BPV	pdBPV-l-gyel transzformált Cl27 sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	0
pTNCE3-mal transzformált C127 sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	83

	Humán neurofil telepek (telep/csésze)
dhfr	pAdD26SVpA-val transzformált CHO-sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	0
pD26SVCE3-mal transzformált CHOsejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	85
pDRCE3-mal transzformált CHO-sejtek tenyészete (20-szorosan koncentrált)	86

41. példa

A transzformánsok molekulatömege és izoelektromos pontja

A 16., 20., 27., 33. és 37. példákban az aminosavösszetétel elemzéséhez használt tisztított CSF mintákat molekulatömegükre és izoelektromos pontjukra való mérésnek vetjük alá a következő eljárásokkal.

1. Molekulatömeg

A CSF molekulatömegét nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamidos gélelektroforézissel (SDS-PAGE) határozzuk meg. Az eletkroforézishez szolgáló készülék PROTEAN™ (16 cm, a Bio-Rad Corporation terméke), poliakrilamid fedőgélből (T=15%, C = 2,6%) álló 140 mmxl60mmxl,5 mm méretű gélt, és koncentráló gélt (T = 3%, c = 20%) alkalmazva. Denaturált CSF mintát készítünk a következő eljárással: CSF-et forralunk 3 percen át, 2% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,46 mól/l-es 2merkapto-etanol oldatban. Miután 4 pg minta elektroforézisét végrehajtottuk 30 mA konstans árammal 4 órán át, a gélt eltávolítjuk és 0,25%-os Coomassie Brillant Blue R250-nel (a Sigma Chemical Co. terméke) festjük a csíkok kimutatására. A következő anyagokat alkalmazzuk molekulasúly-markerként hasonló kezelés után foszforiláz B (molekulatömeg: 92500), szarvasmarha szérumalbumin (BSA, molekulatömeg: 67000), ovalbumin (ÓVA, molekulatömeg: 45000), szénsav-anhidráz (molekulatömeg: 31000), szójabab tripszin inhibitor (molekulatömeg: 21500), és lizozim (molekulatömeg: 14400).

Ennek eredményeképpen 18 500±1000 molekulatömegnek megfelelő egyedi csíkot mutatunk ki a 16. példában [E. coli/cDNS (+VSE)] és 20. példában [E. cóli/cDNS (-VSE)] kapott CSF minták mindegyikénél, és egy 19000+1000 molekulatömegnek megfelelő egyedi csíkot mutatunk ki a 27. példában [Cl27, CHO/cDNS (+VSE)], a 33. példában [C127, CHO/cDNS (-VSE)] és a 37. példában (COS/CDNS) kapott CSF minták mindegyikében.

2. Izoelektromos pont

A jelen találmány szerinti CSF izoelektromos pontját lapos ágyas, izoelektromos-elektroforetikus berendezéssel (FBE-3000, a Pharmacia Fine Chemicals terméke) határozzuk meg. 2 órás elektroforézis után melyet 30 watt állandó árammal

HU 209 147 Β (V_max = 2000 volt) Pharmalyte-et (pH 4—6,5, Pharmacia Fine Chemicals) és 4 mól/1 karbamidot tartalmazó poliakrilamid gélnek (T = 5%, C = 3%, 115 mmx230 mm) végzünk, a CSF-et 30% metanol/10% triklór-ecetsav/35% szulfoszalicilsav keverékkel rögzítjük, és megfestjük Coomassie Brillant Blue R250-nel. A „Low pl Kit”-et (kis pl-jű készlet, pH 2,5-6,5, a Pharmacia Fine Chemicals terméke) alkalmazzuk izoelektromos pont-markerként.

A pH 4-6,5 közötti csík-elkülönítés elemzése pl=6,1-nek megfelelő egyedi csíkot ad a 16. és 20. példákban kapott CSF minták mindegyikénél, és pl=5,5; 5,8; és 6,1-nek megfelelő három elkülönült csíkot ad a 27., 33. és 37. példákban kapott CSF minták mindegyikénél.

42. példa

Humán G-CSF védőhatása mikrobiális fertőzés ellen

Vizsgálati módszer

1. Védelem Pseudomonas aeruginosa által okozott fertőzés ellen.

Endoxant (a Shionogiand and Co., Ltd. védjegye) adunk be intraperitoneálisan 8-9 hetes ICR egerekbe (hím; 35,3±1,38 g testsúly) 200 mg/kg adagban. Az egereket ezután három csoportba osztjuk; két csoportnak négy szubkután injekciót adunk (egy injekció 0,1 ml-es adagot jelent) 24 órás időközönként humán G-CSF-et (25 000 vagy 50 000 egység/egér) tartalmazó oldat [1% propanol és 0,5% (tömeg/térfogat) egér szérumalbumin fiziológiás konyhasóoldatban] formájában, míg a másik csoportnak csak a fenti oldat oldószerét adjuk azonos ütemezésben. Három órával az utolsó injekció után az összes csoport egereit megfertőzzük Pseudomonas aeruginosa GNB139-cel szubkután injekció [3,9xl0⁵ CFU/egér (CFU = telepképző egység)] formájában. A fertőzés után 21 órával az első két csoportnak a humán GCSF-et (25 000 vagy 50000 egység/egér) tartalmazó oldat újabb szubkután injekcióját adjuk, míg a másik csoportnak ismét csak az oldószert adjuk. A humán G-CSF védőhatást az olyan egerek számának ellenőrzésével határozzuk meg, amelyek 10 nappal a fertőzés után életben vannak.

Sejtszuszpenzió készítése

Pseudomonas aeruginosa GNB-139-et tenyésztünk egy éjszakán át 37 ’C hőmérsékleten rázatva Heart Infusion (szív-kivonat, a Difco márkaneve) folyékony tápközegben. A tenyészetet fiziológiás konyhasó-oldatban szuszpendáljuk.

2. Védelem Candida által okozott fertőzés ellen

Endoxant (a Shionogi and Co., Ltd. márkaneve) adunk be intraperitoneálisan 8 hetes ICR egerekbe (hím; 40,5±l,60 g testsúly) 200 mg/kg adagban. Az egereket ezután két csoportba osztjuk; az egyik csoportnak négy szubkután injekciót adunk (mindegyik 0,1 ml-t tesz ki) 24 órás időközönként humán GCSF-et (50000 egység/egér) tartalmazó oldatban [1% propanol és 10% (tömeg/térfogat) ICR egér szérumalbumin fiziológiás konyhasóoldatban], míg a másik csoportnak csak a fenti oldat oldószerét adjuk a fenti ütemezés szerint. Négy órával az utolsó injekció után mindegyik csoport egereit megfertőzzük Candida albicans U-50-l-gyel [ez olyan törzs, amelyet fehérvérűségben szenvedő betegek vizeletéből izoláltak; a Bacterological Laboratory, Tohuku University, School of Medicine (Tohoku Egyetem, Orvosi Kar, Bakteriológiai Laboratórium) ajándéka] intravénás injekció (5,6xl0⁵ CFU/egér) formájában. A humán G-CSF védőhatását az olyan egerek számának ellenőrzésével határozzuk meg, amelyek 10 nappal a fertőzés után életben vannak. Sejtszuszpenzió készítése

Candida albicans U-50-l-et tenyésztünk egy éjszakán át 37 ’C hőmérsékleten rázatva élesztőkivonatot tartalmazó Sabouraud folyékony tápközegben (2% glükóz a Junsei Pure Chemicals Co., Ltd-től; 10% Trypticase Peptone, amely a BBLK márkaneve; 5% élesztőkivonat a Difco-tól; pH 5,6). A tenyészetet kétszer mossuk fiziológiás sóoldattal és fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk.

Védelem a Listeria, sejten belüli parazita, által okozott fertőzés ellen

Endoxant (a Shionogi and Co., Ltd. márkaneve) adunk be intraperitoneálisan 7 hetes ICR egereknek (hím; 34,7 g+1,24 g testsúly) 200 mg/kg adagban. Az egereket azután két csoportba osztjuk: az egyik csoportnak négy szubkután injekciót adunk (mindegyik 0,1 ml-t tesz ki) 24 órás időközönként humán G-CSF-et (50 000 egység/egér) tartalmazó oldatban [1% n-propanol és 10% (tömeg/térfogat) ICR egér szérumalbumin fiziológiás konyhasóoldatban], míg a másik csoportnak csak a fenti oldat oldószerét adjuk a fenti ütemezés szerint. Négy órával az utolsó injekció után mindegyik csoport egereit megfertőzzük Listeria monocytogenes 46-tal (Microbiological Laboratory, a Tohoku University, School of Medicine ajándéka) Ι,ΟχΙΟ⁷ CFU/egér mennyiségben, intravénás injekció formájában. A humán G-CSF védőhatását az olyan egerek számának ellenőrzésével határozzuk meg, amelyek 12 nappal a fertőzés után életben vannak.

Sejtszuszpenzió készítése

Listeria monocytogenes 46-ot tenyésztünk egy éjszakán át 37 ’C hőmérsékleten rázatva Brain-Heart Infusion (agyszív kivonat, a Difco márkaneve) folyékony tápközegben. A tenyészetet fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk.

Eredmények (i) Az 1., 2., és 3. vizsgálatokat a 16. példában kapott E. coli G-CSF (+VSE) polipeptiddel végezzük el. Az eredményeket a 12., 13. és 14. táblázatokban adjuk meg.

HU 209 147 Β

72. táblázat

Hatás Pseudomonas aeruginosa ellen

Csoport	CSF koncentráció (egy- ség/egér/nap)	Élő egér/vizsgált egér
Oldószer	0	0/10
CSF-et tartalmazó oldószer	25000	6/10
CSF-et tartalmazó oldószer	50000	8/10

13. táblázat

Hatás Candida albicans ellen

Csoport	CSF koncentráció (egység/egér/nap)	Élő egér/vizsgált egér
Oldószer	0	0/10
CSF-et tartalmazó oldat	50000	10/10

14. táblázat

Hatás Listeria monocytogenes ellen

Csoport	CSF koncentráció (egység/egér/nap)	Élő egér/vizsgált egér
Oldószer	0	0/10
CSF-et tartalmazó oldat	50000	10/10

(ii) Az 1. vizsgálatot a 20. példában kapott E. coli G-CSF (-VSE) polipeptiddel végeztük el. Az eredményeket a 15. táblázat mutatja be.

75. táblázat

Hatás Pseudomonas aeruginosa ellen

'‘N Csoport	CSF koncentráció (egység/egér/nap)	Élő egér/vizsgált egér
Oldószer	0	0/10
CSF-et tartalmazó oldat	25000	6/10
CSF-et tartalmazó oldat	50000	8/10

(iii) Az 1. vizsgálatot elvégezzük CHO sejt eredetű, tisztított humán G-CSF mintával (+VSE), amely azonos azzal, amelyet a 27. példában az aminosav-összetétel elemzésében alkalmaztunk. Az eredményeket a 16. táblázat mutatja be.

76. táblázat

Hatás Pseudomonas aeruginosa ellen

Csoport	CSF koncentráció (egység/egér/nap)	Élő egér/vizsgált egér
Oldószer	0	0/10
CSF-et tartalmazó oldat	25000	9/10
CSF-et tartalmazó oldat	50000	10/10

Lényegében azonos eredményeket érünk el, amikor az 1. vizsgálatot Cl27 sejt eredetű, tisztított humán G-CSF mintával végezzük el, amely azonos azzal, amelyet a 27. példában az aminosav-összetétel elemzésében alkalmaztunk.

(iv) Az 1. vizsgálatot hajtjuk végre CHO-sejt eredetű, tisztított humán G-CSF mintával (-VSE), amely azonos azzal, amelyet a 33. példában az aminosavösszetétel elemzésében alkalmaztunk. Az eredményeket a 17. táblázatban mutatjuk be.

77. táblázat

Hatás Pseudomonas aeruginosa ellen

Csoport	CSF koncentráció (egység/egér/nap)	Élő egér/vizsgált egér
Oldószer	0	0/10
CSF-et tartalmazó oldat	25000	9/10
CSF-et tartalmazó oldat	50000	10/10

Lényegében azonos eredményeket érünk el, amikor az 1. vizsgálatot C127 sejt eredetű, tisztított humán G-CSF mintával végezzük el, amely azonos azzal, amelyet a 33. példában az aminosav-összetétel elemzésében alkalmaztunk.

Claims (1)

1. Eljárás humán granulocita kolónia stimuláló faktor (hG-CSF) előállítására - amelynek aminosav-szekvenciája a következő:

   (Met)_nThr Pro Leu Gly Pro Alá Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val

   Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Alá Alá Leu Gin

   Glu Lys Leu (Val Ser Glu)_nCys Alá Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly

   His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Alá Pro Leu Ser

   Ser Cys Pro Ser Gin Alá Leu Gin Leu Alá Gly

   Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu

   Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Alá Leu Glu Gly Ile

   Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu

   Gin Leu Asp Val Alá Asp Phe Alá Thr Thr Ile

   Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Alá Pro

   Alá Leu Gin Pro Thr Gin Gly Alá Met Pro Alá

   Phe Alá Ser Alá Phe Gin Arg Arg Alá Gly Gly

   Val Leu Val Alá Ser His Leu Gin Ser Phe Leu

   Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Alá

   Gin Pro ahol m értéke 0 vagy 1, és n értéke 0 vagy 1-, azzal jellemezve, hogy egy, a tárgyi körben megadott szekvenciájú hG-CSF-et kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns vektorral transzformált eukarióta vagy prokarióta gazdasejteket megfelelő körülmények között, alkalmas tápközegen tenyésztünk, és a hG-CSF terméket a sejtekből és/vagy a tápközegből kinyerjük.