DK175336B1 - DNA-sekvens, som koder for et peptid med granulocytstimulerende virkning, rekombinantvektor og transformant indeholdende denne sekvens, samt fremgangsmåde til fremstilling af polypeptidet - Google Patents

Description

· -T...l-,’ga:^^gB^"g"^~ 1 - ' —-i,. ,. j.^i i ..,ν^Ν-.^ι DK 175336 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med virkningen som en human granulocyt kolonistimulerende faktor (herefter forkortet som CSP). Den foreliggende opfindelse angår også en re-5 kombinantvektor, hvori denne DNA-sekvens er indfejet, en transformant indeholdende denne vektor og en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid eller glycoprotein med denne CSF-virkning.

Når benmarvsceller, som målceller, og nyreceller 10 eller foetale celler blev dyrket ved dyrkningsmetoden med dobbeltlaget blød agar, idet benmarvscellerne var i det øverste lag og nyrecellerne eller de foetale celler i det neders te lag, groede en del af cellerne i det øverste lag og differentierede til dannelse af kolonier !5 og neutrofile granulocyter (herefter blot betegnet som granulocyter) - eller monocytiske makrophager. Denne iagttagelse har ført til den antagelse, at der in vivo forekommer faktorer, som fremmer dannelsen af kolonier [Pluznik og Sach, J. Cell. Comp. Physiol., 6i5, 319 20 (1965); og Bradley og Metcalf, Aust. J. Exp. Biol. Med.

Sci. , AA, 287 (1966) ].

Det er kendt, at disse faktorer, der kollektivt betegnes som CSP, dannes af celler, såsom T-celler, monocytiske makrophager, fibroblaster og endothelceller,

25 som normalt er vidt udbredte in vivo. Blandt underklasser af CSF hører: granulocyt-monocytisk makrophag-CSF

(forkortet som GM-CSF), der virker på stamcellerne for granulocyter eller monocytiske makrophager på en sådan måde, at de stimulerer væksten af sådanne stamceller 30 og inducerer differentiering af disse til dannelse af I DK 175336 B1 kolonier af granulocyter eller monocytiske makrophager; monocytisk makrophag-CSF (forkortet M-CSF), som først og fremmest er i stand til at danne kolonier af makrocytiske H makrophager; multipotent CSF (forkortet multi-CSF), der Λ*

5 virker på mindre differentierede multipotente stamceller; og I

I granulocyt-CSF (forkortet G-CSF) af den type der er behand- I

let i den foreliggende opfindelse, og som først og fremmest I

er i stand til at danne granulocytkolbnier. I

Fornyligt er multipotent CSF blevet oprenset fra

10 cellelinie og karakteriseret (L. Welte et al. 1985, Proc. I

I Nat Acad. Sci. USA, 82: 1526-1530).

Ligeledes er en human analog til muse G-CSF blevet I

identificeret og oprenset (N.A. Nicola et al. 1985, Nature I

314: 625-628) . Det er fornylig fremført, at målcellers I

15 differentieringstrin varierer fra en underklasse af CSF til I

en anden [Asano, Taisha Metabolism and Disease, 22, 249 I

I (1985); og Yunis et al-, "Growth and Maturation Factors", I

udgivet af Guroff, John Wiley and Sons, NY, vol. 1, 209 I

I (1983)] .

20 Derfor er oprensning af de enkelte CSF-underklasser og I

nærmere undersøgelse af deres kemiske og biologiske egen- I

skaber meget vigtig med henblik på vurdering af de mekanis-

mer, der fremkalder dannelse af blodlegemer, og analyse af I

H forskellige hæmatologiske sygdommes patomorfologiske I

25 aspekter. De biologiske virkninger af G-CSF, der tiltrækker I

sig større og større opmærksomhed fra forskere, er deres I

evne til at fremkalde differentiering af benmarvs 1 eukæmice 1 -

ler og at forstærke de færdigdannede granulocyters virkninger, og I

man har haft mange forventninger til den potentielle kliniske I

30 nytte af G-CSF inden for behandling og forebyggelse af leukæmi. I

De forsøg, der hidtil er gjort, på at isolere og rense G-CSF I

er baseret på celledyrkningsmetoden, ved hvilken G-CSF isoleres I

fra supernatanten af en cellekultur, men homogent G-CSF er endnu I

ikke fremstillet i støre mængder ved denne fremgangsmåde, idet G- I

35 CSF kun kan fremstilles i lav koncentration, og komplekse rens- I

ningsmetoder er nødvendige til opnåelse af spormængder af G-CSF ud I

fra et stort volumen af kulturmediet. Derfor har det været stærkt I

ønsket at opnå massefremstilling af G-CSF ved rekombinant DNS- I

teknologi. I

3 DK 175336 B1

Et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en DNA sekvens, der koder for et polypep-tid med human G-CSF-virkning.

Et andet formål med den foreliggende opfindelse ’ 5 er at tilvejebringe en rekombinantvektor indeholdende denne DNA-sekvens.

Yderligere et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en transformant, som er fremstillet ved transformering af en vært med denne rekom-10 binantvektor.

Yderligere et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid eller glycoprotein med human G-CSF-virkning.

15 Fig. 1 viser sekvenserne af tre forskellige pro ber, IWQ, A og LC; fig. 2 viser nucleotidsekvensen af et pHCS-l-in- sert; fig. 3(A) viser nucleotidsekvensen af et cDNA-20 insert i pBRG4; fig. 3(B) (I) viser aminosyresekvensen af en human G-CSF-precursor, som udledt fra pBRG4-cDNA; fig. 3(B) (II) viser aminosyresekvensen af humant færdigdannet G-CSF, som udledt fra pBRG4-cDNA; 2 5 fig. 4(A) viser nucleotidsekvensen af et cDNA- insert i pBRV2; fig. 4(B) (i) viser aminosyresekvensen af en human G-CSF-precursor, som, udledt fra pBRV2-cDNA; fig. 4(B) (II) viser aminosyresekvensen af humant 30 færdigdannet G-CSF, som udledt fra pBRV2-cDNA; fig. 5 viser nucleotidsekvensen af et humant chromasomalt gen, der koder for humant G-CSF; fig. 6 viser restriktionsenzymernes spaltningssteder for humant G-CSF-cDNA, afledt af pBRG4 eller 35 pBRV2; I DK 175336 B1

I fig. 7 viser restriktionsenzymernes spaltnings- I

steder for det humane chromosomale gen, der koder for I

humant G-CSF; I

fig. 8 er en delvis præsentation af fremgangs- 4 I

5 måden til fremstilling af en tac-promotorholdig vektor I

I (+VSE-linie); I

fig. 9 er en præsentation af fremgangsmåden til I

I fremstilling af en Pjj-promotorholdig vektor (+VSE-li- I

I nie); I

10 fig. 10 er en præsentation af fremgangsmåden til I

H fremstilling af trp-promotorholdig vektor (+VSE-linie); I

fig. 11 er en delvis præsentation af fremgangs- I

måden til fremstiling af en tac-promotorholdig vektor I

I (-VSE-linie); I

I 15 fig. 12 er en præsentation af fremgangsmåden til I

I fremstiling af en Ρι,-promotorholdig vektor (-VSE-linie); I

fig. 13 er en præsentation af fremgangsmåden til I

I fremstilling af en trp-promotorholdig vektor (-VSE-li- I

I nie); I

I 20 fig. 14 viser skematisk strukturen af pHGA410; I

fig. 15 er en præsentation af fremgangsmåden til I

I konstruktion af ekspressionsrekombinantvektorer, pTN-G4, I

I pTN-G4VAtt og pTN-64VAØ; I

fig. 16a og 16b viser to fremgangsmåder til kon- I

I 25 struktion af pHGG4-dhfr; I

fig. 16c viser fremgangsmåderne til konstruktion I

I af pG4DRl og pG4DR2; I

I fig. 17 viser skematisk strukturen af pHGV2; I

I fig. 18 er en præsentation af fremgangsmåderne I

30 til konstruktion af ekspressionsrekombinantvektorerne, I

I pTN-V2, pTN-VAe og pTN-VA/5; I

fig. 19a og 19b viser to fremgangsmåder til kon- I

I struktion af en ekspressionsrekombinantvektor pHGV2- I

I dhfr; I

I 35 fig. 19c viser fremgangsmåderne til konstruktion I

I af pV2DRl og pV2DR2; I

5 DK 175336 B1 fig. 20 viser skematisk strukturen af pMLCE3a; fig. 21 viser skematisk strukturen af pTNCE3a; og fig. 22 viser skematisk strukturerne af p, pD26SVCE3a og pDRCE3a.

5 DNA-sekvensen, der koder for et polypeptid med den humane G-CSF-virkning ifølge den foreliggende opfindelse, er et DNA (cDNA), som er komplementært til mes-senger-RNA'et (mRNA), der opnås som 15-17S-fraktionerne ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering, og som 10 koder for et polypeptid med den humane G-CSF-virkning. Ifølge den foreliggende opfindelse har man opnået to linier af dette cDNA.

Den ene linie's cDNA har hele eller en del af et gen, der koder for polypeptidet I eller II vist i fig.

15 3(B). Mere specifikt har dette cDNA nucleotidsekvensen afbildet fra ATG ved 32-34 nucleotidpositioner fra 5'-terminus [se fig. 3(A)] til CCC ved 650-652 nucleotidpositioner, eller fra ACC ved 122-124 positioner til CCC ved 650-652 positioner. Alternativt har cDNA'et 20 nucleotidsekvensen vist i fig. 3(A) eller en del deraf. Denne linie’s cDNA betegnes herefter cDNA (+VSE).

Den anden linie's cDNA har hele eller en del af genet, der koder for polypeptidet I eller II, vist i fig. 4(B). Mere specifikt har dette cDNA nucleotidse-25 kvensen afbildet fra ATG ved 31-33 nucleotidpositioner fra 5'-terminus [se fig. 4(A)] til CCC ved 640-642 nucleotidpositioner eller fra ACC ved 121-123 positioner til CCC ved 640-642 positioner. Alternativt kan dette cDNA have nucleotidsekvensen vist i fig. 4(A) eller en 30 del af denne. Denne linie's cDNA betegnes herefter cDNA (-VSE).

DNA-sekvensen, beskrevet ovenfor, kan opnås ved de følgende fremgangsmåder: Et mRNA-kodet G-CSF fremstilles først ud fra pattedyrs- eller menneskeceller el-35 ler andre værtsceller med evne til at danne et polypeptid med G-CSF-virkning. mRNA'et konverteres dernæst til

I DK 175336 B1 I

I 6 I

I et dobbeltstrenget cDNA ved en hvilken som helst af de I

kendte fremgangsmåder, hvorefter en mængde rekombinanter I

I indeholdende dette cDNA (denne mængde betegnes herefter I

I som et cDNA-bibliotek) udsættes for screening ved kendte I

I 5 fremgangsmåder. 'I

I DNA-sekvensen ifølge den foreliggende opfindelse I

I omfatter også en human kromosomal DNA-sekvens, der koder “ I

for et polypeptid med den humane G-CSF-virkning. Den hu- I

mane kromosomale DNA-sekvens indeholder en nucleotidsek- I

I 10 vens, der tager del i transkriptionsregulering, og det I

I indeholder desuden hele eller en del af nucleotidsekven- I

I sen vist i fig. 5. I

I Et kromosomalt gen kan opnås ved først ud fra I

humane celler at fremstille en mængde rekombinanter I

I 15 indeholdende et humant kromosomalt gen (mængden beteg- I

nes herefter som et humant, kromosomalt genbibliotek), I

I og dernæst at udsætte dette humane kromosomale gen- I

I bibliotek for screening ved kendte fremgangsmåder. I

I Det humane kromosomale gen kan tilvejebringes I

20 fra en hvilken som helst type humane celler, såsom cel- I

I ler ekstraheret fra leveren eller nyrene eller dyrkede I

I celler, såsom tumorceller. Et humant kromosomalt gen- I

bibliotek kan fremstilles ud fra humane celler ved en I

I hvilken som helst af de kendte fremgangsmåder [se Mania- I

I 25 tis et al., Cell, 15, 687 (1978); og Maniatis et al., I

I Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 269 I

I ff. (1982)], som illustreret nedenfor; I

I Et humant, kromosomalt DNA ekstraheres fra en I

I kilde, såsom human, foetal lever, med phenol eller I

30 andre egnede kemikalier; det ekstraherede DNA udsættes I

for delvis eller fuldstændig digestion ved hjælp af et I

I passende restriktionsenzym til opnåelse af et DNA-frag- I

I ment med en passende længde; DNA-fragmentet indføjes i I

et λ-phagvektor-DNA-fragment ved hjælp af en T4-DNA- I

I 35 ligase eller andre egnede ligaser, idet en linker inde- I

I holdende restriktionsstedet for et passende enzym, såsom I

7 DK 175336 B1

EcoRl eventuelt vedhæftes. Derefter opnås λ-phagpartik-ler ved in vitro pakningsmetoder, og værtsceller, såsom E. coli, transformeres med de opnåede λ-phagpartikler.

. ' Eksempler på λ-phagpartikler, der kan anvendes 5 som vektor ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåder omfatter Charon 4A og EMBL-3 og EMBL-4.

MammaliaceIler, der kan anvendes som kilde til mRNA, er en human, mundhulecancer-afledt cellestamme, CHU-2 (deponeret ved Collection Nationale de Cultures de 10 Microorganismes, eller C.N.C.M., under accessionsnummeret 1-483). Det må imidlertid forstås, at celler, der kan udvindes fra pattedyr eller mennesker, eller en hvilken som helst anden passende, etableret cellestamme kan anvendes i stedet for sådanne tumorce1lestammer.

15 Fremstiling af mRNA kan opnås ved en af de fremgangsmåder, der allerede er foreslået til kloning af gener for adskillige andre fysiologisk aktive proteiner: F.eks.

opnås hele RNA'et først ved behandlinger med et overfladeaktivt middel og phenol i tilstedeværelse af en ribo-20 nucleaseinhibitor, såsom et vanadyl-ribonucleosidkom-pleks [se Berger and Birkenmeier, Biochemistry, 18, 5143 (1979)] eller ved CsCl-densitetsgradientcentrifugering efter behandling med guanidinthiocyanat [se Chirgwin et al.. Biochemistry, 1.8, 5294 (1979)], hvorefter poly(A+)~ 25 RNA (mRNA) opnås ved at udsatte hele RNA'et for batch-adsorption eller affinitetskolonnechromatografi på oligo(dT)-cellulose eller poly-D-Sepharose under anvendelse af Sepharose 2B som bærer. Poly(A+)-RNA'et kan fraktioneres yderligere ved en passende fremgangsmåde, 30 såsom saccharosedensitetsgradientcentrifugering. Evnen af det således opnåede mRNA til at kode for et polypep-tid med G-CSF-virkning kan bekræftes ved adskillige fremgangsmåder. F.eks. translateres mRNA'et til et protein, og dets fysiologiske virkninger undersøges. Alter-35 nativt bestemmes identiteten af dette protein ved hjælp af en anti-G-CSF-antistof. Mere specifikt indsprøjtes I DK 175336 B1

I I

I mRNA i oocyter af Xenopus laevls til fremkaldelse af I

I translation [se Gurdon et al.. Nature, 233, 177 (1972)], I

I eller translationsreaktioner kan udfares med kaninreti- I

I kulocyter eller hvedekim [Schleif and Wenslnk, "Practi- i I

I 5 cal Methods in Molecular Biology", Springer-Verlag, NY I

I (1981)]. G-CSF-Virkningen kan testes ved anvendelse af I

blød-agar-dyrkningsmetoden under anvendelse af benmarvs- I

I celler, og teknikker til udførelse af denne fremgangs- I

I måde er gennemgået [Metcalf, "Hemopoietic Colonies", I

I 10 Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, NY (1977)]. I

Et enkeltstrenget cDNA syntetiseres under anven- I

I delse af det således opnåede mRNA som skabelon. Et dob- I

I beltstrenget cDNA syntetiseres ud fra dette enkeltstren- I

gede cDNA, og det dobbeltstrengede cDNA indføjes i et I

15 passende vektor-DNA til dannelse af et rekombinantplas- I

mid. Dette rekombinantplasmid kan anvendes til transfor- I

mation af en egnet vært, såsom Escherichia coli, og her- I

ved opnås en gruppe af DNA-molekyler i transformanterne I

I (cDNA-bibliotek). I

20 Et dobbeltstrenget cDNA kan opnås ud fra mRNA1 et I

ved en af de følgende to frerogangsmåder: mRNA*et behand- I

les med en revers transkriptase under anvendelse af oli- I

go(dT), som er komplementært til poly(A)-kæden ved I

I 3'-terminus, som primer, eller et oligonucleotid, der I

25 svarer til en del af aminosyresekvensen af G-CSF-protei- I

net, syntetiseres, og et cDNA, der er komplementært til I

I mRNA'et syntetiseres ved behandling med en revers tran- I

I skriptase under anvendelse af det syntetiserede oligo- I

I nucleotid som primer. Et dobbeltstrenget cDNA kan også I

I 30 opnås ved de følgende fremgangsmåder: mRNA dekomponeres I

I og fjernes ved behandling med en base, og det opnåede I

enkeltstrengede cDNA behandles først med en revers I

I transkriptase eller DNA-polymerase I (f.eks. et Klenow I

I fragment), og dernæst med Sl-nuclease. Alternativt kan I

I 35 mRNA*et behandles direkte med RNase H og DNA-polymerase I

I (f.eks. E. coli-polymerase I). For yderligere informa- I

it__· *--- -·· : .r'-j.iiL«-':;? _ · - : '· -- - ϋ-;_· ^ ^ r -~Λ -g· . ... -i DK 175336 B1 9 tion se Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory (1982); og Gubler and Hoffman,

Gene, 2b, 263 (1983) .

Det således opnåede dobbeltstrengede cDNA indfø-5 jes i en passende vektor, f.eks. en af EK-type plasmid-vektorerne, som følgende er typiske eksempler på: pSCIOl, pDF41, ColEl, pMB9, pBR322, pBR327 og pACYCl, eller en af phagvektorerne, som følgende er typiske eksempler på: Agt, Ac, Agt10 og AgtWES, hvorefter rekom-10 binantvektoren anvendes til transformation af en stamme af JL- cole (f.eks. X1776, HB101, DH1 eller C600) for således at opnå et cDNA-bibliotek (se f.eks. "Molecular Cloning", ibid.).

Det dobbeltstrengede cDNA kan bindes til en vek-15 tor ved de følgende fremgangsmåder: Et terminus af cDNA'et forsynes med en ende, der kan bindes til vektoren ved vedhæftning af et passende, kemisk syntetiseret DNA-fragment, og et vektor-DNA, som er skåret over med et restriktionsenzym, bindes til dette cDNA ved behand-20 ling med en T4-phag-DNA-ligase i tilstedeværelse af ATP.

Alternativt vedhæftes dC, dG-kæder (eller dT, dA-ksder) til henholdsvis det dobbeltstrengede cDNA og et vektor-DNA, som er blevet skåret over med et restriktionsenzym, og en opløsning indeholdende begge DNA-molekyler bliver 25 annealed (se "Molecular Cloning", ibid.).

En værtscelle kan transformeres med det således opnåede rekombinant-DNA ved en hvilken som helst af de kendte fremgangsmåder. Hvis værtscellen er L coli. kan fremgangsmåden beskrevet af Hanahan [J. Mol. Biol., 166.

30 557 (1983)] anvendes, ved hvilken rekombinant DNA sættes til en kompetent celle fremstillet i tilstedeværelse af CACI2 > MgCl2 eller RbCl.

Screening for cellerne, der indeholder det ønskede gen, kan udføres ved adskillige fremgangsmåder, der 35 omfatter: Plus-minusmetoden anvendt ved kloning af in- terferon-cDNA [Taniguchl et al., Proc. Jpn. Acad., 55.

I DK 175336 B1 I

I 10 I

I Ser. B., 464 (1979)], hybridiserings-translations-assay- I

I metoden [Nagata et al.. Nature, 284. 316 (1980)] og ko- I

I loni- eller plaguehybrldlserlngsmetoden under anvendelse I

I af en oligonucleotidprobe, som er kemisk syntetiseret på I

I 5 basis af aminosyresekvensen af proteinet med den humane I

I G-CSP-virknlng [Wallace et al., Nucleic Acids Res., 9, I

I 879 (1981); og Benton & Davis, Science, 196, 180 I

I (1977)]. I

I Fragmentet, der indeholder det således klonede I

I 10 gen, der koder for polypeptidet med human G-CSF-virk- I

I ning, kan genindføjes i et passende vektor-DNA med hen- I

I blik på transformation af andre prokaryotiske eller eu- I

I karyotiske værtsceller. Ved indføjelse af en passende I

I promotor og en ekspressionsassocieret sekvens i vekto- I

I 15 ren kan genet eksprimeres i en individuel værtscelle. I

I Eksempler på prokaryotiske værtsceller omfatter I

I Escherichia coli, Bacillus subtills og Bacillus thermo- I

I philus. Genet af interesse kan eksprimeres i disse I

I værtsceller ved at transformere dem med et replikon I

I 20 (f.eks. en plasroidvektor indeholdende en begyndelses- I

I og regulatorsekvens), som opnås ud fra en celleart for- I

I ligelig med værten. En ønskelig vektor er en vektor med I

I en sekvens, der er i stand til at bibringe den transfor- I

I merede celle selektivitet for eksprimerede karaktertræk I

I 25 (fenotype). I

I Som eksempel kan E^ coli transformeres med I

I pBR322, der er en vektor, som er i stand til at replike- I

I re i E_;_ coli [se Bolivar, Gene, 2, (1975)]. Denne vektor I

I indeholder både ampicillin- og tetracyclin-resi- I

I 30 stensgener, og begge disse egenskaber kan anvendes til I

I identifikation af den transformerede celle. Eksempler på I

I promotoren, der er nødvendig til genekspression i pro- I

I karyotiske værter, omfatter promotoren for Ø-lactamase- I

I genet [Chan et al., Nature, 275, 615 (1978)], lactose- I

I 35 promotoren [se Goeddel et al., Nature, 281, 544 (1979)] I

I og tryptophanpromotoren [se Goeddel et al., Nucleic Acid I

11 DK 175336 B1

Res., 8, 4057 (1980)] osv. En hvilken som helst af disse promotorer kan anvendes ved fremstilling af et polypep-tid med den humane G-CSF-virkning ifølge den foreliggende opfindelse.

5 En eukaryotisk mikroorganisme, såsom saccharomv- ces cerevlsiae kan anvendes som værtscelle og transformeres med en vektor, såsom plasmid YRp7 [se Stinch-comb et al., Nature, 282, 39 (1979)]. Dette plasmid har TRPl-genet som en selektionsmarkør for gærstammer, der 10 mangler evnen til at danne tryptophan, således at transformanterne kan vælges ved at udføre dyrkningen uden tilstedeværelse af tryptophan. Eksempler på promotoren, der kan anvendes til genekspression, omfatter en sur phosphatase-genpromotor [Miyanohara et al., Proc. Natl.

15 Acad. Sci., USA, 80, 1 (1983)] og en alkoholdehydrogena-se-genpromotor [Valenzuela et al., Nature, 298. 347 (1982)].

Værtscellerne kan også opnås ud fra mammaliacel-cer, såsom COS-celler, kinesiske hamsterovarieceller 20 (CHO-celler), C-127-celler og Hela-celler. Et eksempel på en vektor, der kan anvendes til transformation af disse celler, er pSV2-gpt [se Mulligan and Berg; Proc.

Natl. Acad. Sci., USA, 78, 2072 (1981)]. Vektorerne, der anvendes til transformation af disse celler, indeholder 25 begyndelsessted, selektionsmarkør, en promotor, der ligger før genet, der skal eksprimeres, RNA-splejsnings-sted, polyadenyleringssignal, osv.

Eksempler på promotorer, der kan anvendes til genekspression i mammallaceller, omfatter promotorerne 30 af en retrovirus, polyomavirus, adenovirus, simianvirus 40 (SV40) , osv. Hvis promotoren af SV40 anvendes, kan den ønskede genekspression let opnås efter fremgangsmåde ifølge Mulligan et al., beskrevet i Nature, 277. 108 (1979).

35 Eksempler på begyndelsessteder, der kan anvendes omfatter dem, der opnås ud fra SV40, polyomavirus, ade-

I DK 175336 B1 I

I 12 I

novirus, bovin papillomavirus (BPV), osv. Eksempler på I

I selektionsmarkører, der kan anvendes, omfatter phospho- I

I transferase-APH (3*) II- eller I-(neo)-genet, thymidin- I

I kinasegenet (TK-genet), E. coli-xanthinquanidin-phospho- I

I 5 rlbosyltransferasegenet (Ecogpt-genet), dlhydrofolat- I

I reduktasegenet (DHFR-genet), osv. I

I Til opnåelse af polypeptider med human G-CSF- I

I virkning ud fra de ovenfor opremsede værts-vektorsyste- I

I mer, kan de følgende fremgangsmåder anvendes: Genet, I

I 10 der koder for peptIdet med den humane G-CSF-virkning I

indføjes på et passende sted i en af de ovennævnte I

I vektorer, værtscellen transformeres med det resulterende I

I rekombinant-DNA, og de opnåede transformanter dyrkes. I

I Det ønskede polypeptid kan isoleres og oprenses fra I

I 15 cellen eller kulturopløsningen ved en hvilken som helst I

I af de kendte metoder. I

I Eukaryotiske gener anses i almindelighed for at I

I udvise polymorph!, som det er kendt for det humane in- I

I terferongen [se Nlshi et al., J. Biochem. 97, 153 I

I 20 (1985)], og dette fænomen kan forårsage substitution af I

I en eller flere aminosyrer eller en ændring i nucleotld- I

I sekvensen, men overhovedet ingen ændring i aminosyrese- I

I kvensen. I

I G-CSF-Virkningen kan også besiddes af et polypep- I

I 25 tid, der mangler en eller flere af aminosyrerne i amino- I

I syresekvensen vist i fig. 3(B) eller 4(B), eller hvor I

I sådanne aminosyrer er føjet til, eller et polypeptid, I

I hvori en eller flere af disse aminosyrer er erstattet af I

I en eller flere aminosyrer. Det er også kendt, at et po- I

I 30 lypeptid, der opnås ved konvertering af hver af cystein- I

I codonerne 1 det humane interleukin-2-gen (IL-2-gen) til I

I et serincodin, har interleukin-2's virkning [Wang et I

I al., Science, 224. 1431 (1984)]. Alle generne, der koder I

I for disse polypeptider, rekombinantvektorer, indeholden- I

I 35 de disse gener, transformanter, opnået ved hjælp af så- I

I danne rekombinantvektorer, og polypeptiderne eller gly- I

13 DK 175336 B1 coproteinerne, der opnås ved dyrkning af sådanne trans-formanter, er derfor omfattet af den foreliggende opfindelses rammer, sålænge polypeptiderne, hvadenten de forekommer naturligt eller syntetiseres kemisk, har den 5 humane G-CSF-virkning.

I det følgende angives hovedtrækkene ved fremgangsmåderne til fremstilling af genet ifølge den foreliggende opfindelse, der koder for et polypeptid med den humane G-CSF-virkning, en rekombinantvektor indeholdende 10 dette gen og en transformant indeholdende denne rekombinantvektor, og et polypeptid eller glycoprotein med den humane G-CSF-virkning, eksprimeret i denne transformant .

(1) Probefremstilling.

15 Et homogent, humant CSF-protein blev oprenset fra supernåtanten af en kultur af tumorcellelinien, CHU-2, og dets amlnosyresekvens fra N-termlnussen blev bestemt. Fragmenter blev opnået ved dekomponering med bromocyan og behandling med trypsin, og aminosyresekvenserne af 20 disse fragmenter blev også bestemt [eksempel 3(i), (ii) og (iii)].

Ud fra de bestemte aminosyresekvenser syntetiseredes tre nucleotidprober, (A), (LC) og (IWQ) med se kvenserne, vist i fig. 1 (eksempel 4). Probe (A) var den 25 blandede type, sammensat af 14 successive nucleotider.

Probe (IWQ) var sammensat af 30 successive nucleotider med deoxyinosin og var en probe af typen anvendt ved kloningen af det humane cholecystokiningen [Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 1931 (1985)].

30 Probe (LC) var en 24-nucleotiders probe, der blev syntetiseret fra nucleotiderne ved 32-39 positioner fra N-terminussen af aminosyresekvensen vist i eksempel 3(i) på basis af nucleotidsekvensen vist i fig. 3.

Kemisk syntese af nucleotiderne kan opnås ved at 35 anvende den forbedrede phosphotriestermetode i forbindelse med fastfasemetoden og har været gennemgået af Na-rang [Tetrahedron, 39, 3-22 (1983)].

I DK 175336 B1 H Probér baseret på aminosyresekvenser ved andre positioner end positionerne i de ovenfor beskrevne pro- ber kan også anvendes.

(2) Konstruktion af cDNA-bibliotek.

5 CHU-2 celler blev homogeniseret efter tilsætning

af en guanidinthlocyanatoplosning, og det totale RNA

blev opnået ved CsCl-densitetsgradientcentrifugering.

Poly(A+)-RNA blev isoleret fra det totale RNA ved kolonnechromatografi på oligo(dT)-cellulose. Derefter 10 blev et enkeltstrenget cDNA syntetiseret ved hjælp af en revers transkriptase; og RNase H og L coli-PNA-polvme- rase I blev tilsat til opnåelse af et dobbeltstrenget cDNA. En dC-kæde blev vedhæftet til det opnåede dobbelt- strengede cDNA, som blev bundet til en vektor, pBR322, 15 til hvilken en d6-kæde var vedhæftet ved Pst I-overskæ- ringsstedet. Det resulterende rekombinant DNA blev an- vendt til transformation af en stamme af E^ coli. X1776, og et pBR322-linie-cDNA-bibliotek blev konstrueret (ek- sempe1 5 og 6).

20 På samme måde blev det dobbeltstrengede cDNA bun- det til AgtlO-vektoren ved hjælp af EcoRI-linkeren, og et λ-phag-linie-cDNA-bibliotek blev konstrueret (eksem- I pel 7).

(3) Screening.

25 Rekombinanter opnået ud fra pBR322-linie-cDNA- I biblioteket blev fikseret på Whatmann 541-filterpapir, og en enkelt klon kunne udvælges ved kolonihybridise- I ring med 32p-mærket probe (IWQ). Yderligere undersøgel- ] ser ved Southern blotting-metoden [Southern, J. Mol.

I 30 Biol-, 98, 503 (1975)] viste, at denne klon også hybri- I diserede med probe (A). Nucleotidsekvensen af denne klon I blev bestemt ved dideoxymetoden [sanger, Science, 214, I 1205 (1981)].

I Nucleotidsekvensen af det opnåede cDNA-insert er I 35 vist i fig. 2, af hvilken man kan se, at dette insert bestod af 308 basepar, herunder proberne (IWQ) og (A), 15 DK 175336 B1 og havde en åben læseramme, der kodede for 83 aminosyrer, indeholdende aminosyresekvensen vist i eksempel 3(lii). Det pBR322-afledte plasmid indeholdende disse 308 basepar betegnes i det følgende som pHCS-1 (eksempel 5 8).

Et DNA-fragment, indeholdende de 308 basepar opnået ud fra pHCS-l, blev radiomærket ved "nick translationsmetoden" (se Molecular Cloning, ibid.),og med dette fragment anvendt som probe blev det AgtlO-afledte cDNA-10 bibliotek screenet ved plaque-hybridiserlng [Benton and Davis, Science, 196, 180 (1977)] til opnåelse af fem kloner. Nucleotidsekvensen af en klon, som man formodede indeholdt cDNA, blev bestemt ved den samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor (fig. 3(A)).

15 Som vist i fig. 3(A), havde dette cDNA-insert en enkelt stor åben læseramme.

Aminosyresekvensen, som dette cDNA koder for, kan udledes som vist i fig. 3(A).

Sammenligning med den N-terminale aminosyrese-20 kvens af G-CSP-proteinet i eksempel 3(i) viste, at dette cDNA indeholdt en nucleotidsekvens, der svarede til både et signalpeptid, som 90 basepar, der starter med ATG-sekvensen ved 32-34 nucleotidpositioner fra 5’-terminus og ender ved GCC-sekvensen ved 119-221 positioner, 25 koder for, og et færdigdannet G-CSP-polypeptid, som 531 basepar, der starter med ACC-sekvensen ved 122-124 positioner og ender CCC-sekvensen ved 650-652 positioner, koder for. Derfor bestod polypeptidet med aminosyresekvensen vist i fig. 3(B) af 207 aminosyrer, og dets 30 molekylvægt blev beregnet til 22292,67 dalton. Polypeptidet med aminosyresekvensen II bestod af 177 aminosyrer, og dets molekylvægt blev beregnet til 18986,74 dalton (eksempel 9).

Det skal bemærkes, at ATG'et ved 32-34 positioner 35 eller ved 68-70 positioner også kan betragtes som værende proteinets startsted. Escherichia coli stamme X1776

I DK 175336 B1 I

I 16 I

I indeholdende pBR322, som havde dette cDNA (+VSE) ved I

I EcoRI-overskæringsstedet, blev deponeret ved Fermenta- I

I tion Research Institute, the Agency of Industrial I

I Science and Technology (FERM BP-954). I

I 5 Fig. 6 viser restriktionsenzymernes overskærings- I

I steder for dette gen. I

I Dette cDNA blev bundet til pBR327 [soberon et I

I al., Gene, 9, 287 (1980)] ved EcoRl-stedet, og det re- I

sulterende plasmid betegnes i det følgende som pBRG4. I

I 10 Det således opnåede pBRG4 blev behandlet med et I

I restriktionsenzym, EcoRI, til opnåelse af et DNA-frag- I

I ment indeholdende cDNA med ca. 1500 basepar. Dette frag- I

I ment blev radiomærket ved "nick translationsmetoden" I

I (se Molecular Cloning, ibid.), og med dette radiomærkede I

I 15 DNA-fragment som en probe, blev det XgtlO-afledte cDNA- I

I bibliotek screenet en gang til ved plague-hybridisering I

I (se Benton and Davis, ibid.). Ved denne plaque-hybridi- I

I sering, fremstilledes to stykker λ-phag-DNA-fikseret I

I nitrocellulosefilterpapir. Et af disse stykker blev an- I

I 20 vendt til den ovennævnte plague-hybridisering, og det I

andet blev udsat for plague-hybridisering med den alle- I

I rede beskrevne probe (LC). Phagerne, der var positive I

I overfor begge prober, blev udvalgt. En klon, som havde I

I et cDNA af fuld længde, blev udvalgt, og nucleotidsek- I

I 25 vensen af cDNA-insertet, bestemt ved dideoxymetoden, er I

I vist i fig. 4(A). I

I Dette cDNA havde en enkelt, stor, åben læseramme, I

I og aminosyresekvensen, som dette cDNA ville kode for, I

I blev udledt som vist i fig. 4(A). I

I 30 Sammenligning med den N-terminale aminosyrese- I

I kvens af G-CSF-proteinet i eksempel 3(i), viste, at I

I dette cDNA indeholdt en nucleotidsekvens, der svarede I

I til både et signalpeptid, som 90 basepar, startende med I

I ATG-sekvensen 31-33 nucleotidpositioner fra 5'-terminus I

I 35 og endende med GCC-sekvensen efter 118-120 positioner, I

I koder for, og et færdigdannet G-CSF-polypeptid, som 522 I

17 DK 175336 B1 basepar, startende med ACC-sekvensen efter 121-123 positioner og endende med CC-sekvensen efter 640-642 positioner, koder for. Derfor bestod polypeptidet med amino-syresekvensen I, vist i fig. 4(B), af 204 aminosyrer, og 5 dets molekylvægt beregnedes til 21977,35 dalton. Polypeptidet med aminosyresekvensen II bestod af 174 aminosyrer, og dets molekylvægt blev beregnet til 18671,42 dalton (eksempel 10).

Det skal bemærkes, at ATG ved 58-60 positioner 10 eller ved 67-69 positioner også kan betragtes som værende proteinstar tstedet.

Escherichia coli stamme X1776 indeholdende pBR322, som havde dette cDNA (-VSE) ved EcoRI-overskæ-ringsstedet, deponeredes ved Fermentation Research In-15 stitute, the Agency of Industrial Science and Technology (FERM BP-955).

Fig. 6 viser genets overskæringssteder for restriktionsenzymer. Dette cDNA blev bundet til pBR327 ved EcoRI-stedet til dannelse af et plasmid, der herun-20 der betegnes som pBRV2.

(4) Screening af et humant kromosomalt genbibliotek.

Et humant kromosomalt genbibliotek, der blev fremstillet i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet af Maniatis et al. (Molecular Cloning, ibid.), 25 blev udsat for screening med pHCS-1 vist ovenfor. Prober, der kan anvendes ved screeningen, omfatter: Et pHCS-l-afledt 308-basepars DNA-fragment, et pBRG4-afledt ca. 1500-basepars DNA-fragment, et pBRV2-afledt ca. 1500 basepars DNA-fragment, et DNA-fragment med en passende 30 længde og indeholdende del(e) af et eller flere af disse DNA-fragmenter, og de tidligere nævnte oligonucleotid-prober [dvs. (IWQ), (A) og (IC)]. Tilfældet med anvendelse af pHCS-1-DNA-fragmentet beskrives i det følgende.

Dette DNA-fragment blev radiomærket med 32P i 35 overensstemmelse med "nick-translationsmetoden" [se Roop et al., Cell, lj>, 431 (1978)]. Med det resulterende

I DK 175336 B1 I

I 18 I

32P-mærkede fragment anvendt som en probe, underkaste- I

I des det humane, kromosomale genbibliotek screening ved I

I plaguehybridisering (se Benton and Davis, ibid.) til I

I opnåelse af godt ti kloner. I

I 5 Efter udvinding af DNA fra klonerne fremstilledes I

I et enzymrestriktionskort ved kendte fremgangsmåder I

I [Pritsch et al.. Cell, 19, 959 (1980)]. I

I Under anvendelse af den samme DNA-probe udførtes I

I Southern blotting (se Southern, ibid.), og det viste I

I 10 sig, at et DNA-fragment på ca. 4 kb, der blev klippet ud I

I med EcoRI og Xhol, muligvis kunne indeholde en region, I

I der kodede for det humane G-CSF-polypeptid. DNA-fragmen- I

I tet med 4 kb blev derfor indføjet i pBR327 ved EcoRI- I

I stedet under anvendelse af en EcoRI-linker til opnåelse I

I 15 af pBRCE3£. Under anvendelse af dette plasmid som et ba- I

I sesekvensbestemmende DNA, bestemtes nucleotidsekvensen I

I af delen med ca. 3 kb af dette DNA-fragment med ca. 4 kb I

I ved dideoxymetoden. Som et resultat af dette fandtes I

I dette DNA-f ragment at være et gen, der kodede for det I

20 humane G-CSF-polypeptid (fig. 5). I

I E_j_ coli stamme X1776 indeholdende pBRCE30 (dvs. I

I plasmidet pBR327 med dette DNA-fragment med ca. 4 kb I

I indføjet i EcoRI-stedet) blev deponeret ved Fermenta- I

I tion Research Institute, the Agency of Industrial Scien- I

I 25 ce and Technology (FERM BP-956). I

Sammenligning mellem pBRG4-cDNA-insertet vist i I

I fig. 3 og pBRV2-cDNA-insertet vist i fig. 4 viste, at I

I det diskuterede DNA-fragment indeholdt fem exondele, og I

I at det kodede for aminosyresekvenserne udledt fra pBRG4 I

I 30 og pBRV2. I

I Fig. 7 viser restriktionsenzymernes overskærings- I

I steder ved den opnåede gen. I

I Dette DNA-fragment indeholdt det chromosomale gen I

I for human G-CSF, eller en forudgående region, der kan I

I 35 transkriberes til humant G-CSF-mRNA, plus en nucleotid- I

I sekvens, der tager del i transkriptionsreguleringen I

19 DK 175336 B1 [Benoist and Chambon, Nature, 290, 304 (1981); og

Breathnack and Chambon, Ann, Rev. Biochem., 50, 349 (1981)].

(5) Konstruktion af en rekomblnantvektor til ekspres-5 sion i E_j_ coli.

(A) +VSE-linierekombinantvektor.

Ud fra pBRG4-plasmidet opnået i (3) (eksempel 9), 10 blev et cDNA-fragment for G-CSF-polypeptidet skåret ud med et restriktionsenzym, og en rekombinantvektor blev konstrueret ved en af de følgende fremgangsmåder: (i) Under anvendelse af en "annealed" syntetisk linker blev fragmentet ligeret med et fragment,fremstillet 15 ud fra en tac-promotorholdig pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals) (eksempel 12 og fig. 8), (ii) tre fragmenter, fremstillet ud fra PL~promotorhol-dig pPL-λ (Pharmacia Fine Chemicals), blev ligeret med en "annealed" syntetisk linker, og ligerings- 20 produktet og cDNA-fragmentet blev underkastet re-preparationsprocedurer til konstruktion af en rekombinantvektor (eksempel 13, fig. 9), eller (iii) fragmentet blev under anvendelse af en "annealed" syntetisk linker ligeret med et fragment, fremstil- 25 let ud fra et trp-promotorholdigt pOYI-plasmid (eksempel 14 og fig. 10).

(B) -VSE-linierekombinantvektor.

30 På samme måde som beskrevet ovenfor konstruere des tre rekombinantvektorer under anvendelse af plasmi-det pBRV2 (eksempel 10) som vist i eksempel 19 og fig.

11, 12 og 13.

I DK 175336 B1 I

I 20 I

I (6) Fremstilling af E^_ coli-transformanter og dyrkning I

I og ekspression deraf. I

I Under anvendelse af tre rekombinantvektorer af I

I hver af +VSE- og -VSE-linierne transformeredes coli I

I 5 stamme DH1, N4830 eller JM105 ved calciumchlorid- eller I

I rubidiumchloridmetoden beskrevet i Molecular Cloning, I

I ibid, (eksemplerne 12, 13, 14 og 19). Hver af de opnåe- I

I de transformanter blev dyrket i ampicillinholdigt Luria- I

I medium, idet induktion dernæst udførtes efter behov til I

I 10 opnåelse af ekspression (eksemplerne 15 og 20). I

I (7) Udvinding og rensning af G-CSF-polypeptid fra co- I

I li og aminosyreanalyse deraf. I

I En kulturopløsning af transformanterne blev een- I

I trifugeret til opnåelse af en cellepille. De opsamlede I

I 15 celler blev behandlet med et lysozym, og efter lyse ved I

I en cyclus af frysning og optøning blev supernatanten op- I

I samlet. Alternativt blev cellerne behandlet med guanidi- I

I niumchlorid og centrifugeret, og supernatanten blev op- I

I samlet. I

I 20 Supernatanten blev underkastet gelfiltrering på I

I en Ultrogel ACA54-kolonne (LKB), og de aktive fraktioner I

I blev koncentreret ved hjælp af et ultrafiltreringsappa- I

I ratur. I

I Dernæst tilsattes en vandig opløsning af tri- I

25 fluoreddikesyre indeholdende n-propanol til koncentra- I

I tet, og efter henstand i is blev blandingen centrifuge- I

I ret og adsorberet på en revers fase C18-kolonne. Efter I

I eluerlng blev fraktionerne undersøgt for deres aktivi- I

I tet. De aktive fraktioner blev opsamlet og underkastet I

I 30 samme rensningsprocedurer som beskrevet ovenfor. De ren- I

I sede fraktioner blev frysetørret, og pulveret blev op- I

I løst og udsat for KPLC baseret på mo leky Istørre Ise. De I

I opnåede polypeptider blev underkastet SDS-polyacrylamid- I

I gelelektroforese, og et enkelt bånd for det ønskede G- I

35 CSF-polypeptid blev bekræftet (eksempel 16 og 20). Det I

I således opnåede polypeptid udviste human G-CSF-aktivitet I

21 DK 175336 B1 (eksemplerne 17 og 20). G-CSF-polypeptidet blev analyseret ved en aminosyreanalysemetode med et Hitachi 835 automatisk aminosyreanalyseapparat (Hitachi, Ltd.)· Til analyse af de n-terminale aminosyre anvendtes et appa-5 rat til sekvensbestemmelse i gasfase (til Edman nedbrydning) , HPLC-apparatur og Ultrasphere-ODS-kolonne (eksemplerne 18 og 21).

(8) Konstruktion af rekombinantvektorer for dyreceller.

Rekombinantvektorer (opnået ud fra PBV) til an-10 vendelse med 0127- og NIH3T3-celler som værtsceller blev konstrueret for hver af +VSE- og -VSE-linie-cDNA-moleky-lerne og det chromosomale gen. Rekombinantvektorer (med dhfr) til anvendelse med CHO-celler blev også konstrueret for hver af +VSE- og -VSE-linie-cDNA-molekylerne og 15 for det chromosomale gen. Rekombinantvektorer til anvendelse med COS-celler blev også konstrueret. I det følgende beskrives repræsentative eksempler, og for nærmere detaljer skal der henvises til de relevante udførelseseksempler .

20 (A) Konstruktion af rekombinantvektorer af +VSE-linien.

cDNA-(+VSE)-fragmentet opnået i (3) blev indføjet i en vektor, pdKCR, til fremstilling af plasmidet 25 pHGA4lO (eksempel 22 og fig. 14), som blev delvist digesteret med EcoRI og derefter behandlet med DNA-polymera-se I (Klenow fragment) til dannelse af ender uden sammenbindende evne. Et linker-Hindlll blev hæftet til DNA'et, som dernæst blev behandlet med Hindlll og 30 T4-DNA-ligase. Det behandlede DNA blev anvendt til transformation af coli stamme DH1 ved rubidiumchlo-ridmetoden (se Molecular Cloning, ibid.). Det opnåede plasmid blev navngivet pHGA410 (H) (fig. 15).

pHGA4lo(H)’et blev behandlet med Sall, og efter 35 dannelse af ender uden sammenbindende evne blev det behandlet med Hindlll en gang til, og et Hindlll-Sall-

I DK 175336 B1 I

I 22 I

I fragment blev udvundet. Plasmidet pdBFV-1 med et trans- I

I formeret fragment af bovin papillomavirus blev behandlet I

I med Hindlll og PvuII, og det største DNA-fragment blev I

I skilt fra og bundet sammen med det separat fremstillede I

I 5 Hindlll-Sall-fragment. De sammenbundne fragmenter blev I

I anvendt til transformation af E.coli stamme DH1 til op- I

I nåelse af plasmidet pTN-64, som havde det pHGA410-af- I

I ledte CSF-cDNA (fig. 15 og eksempel 23). I

I Hver af plasmiderne, pHGA410 eller pHGA410(H) I

I 10 i kombination med plasmidet pAdD26SVpA blev anvendt til I

I konstruktion af pHGG4-dhfr, som var en rekombinantvek- I

I tor (+VSE) til anvendelse med CHO-celler (fig. 16a og b I

og eksempel 25). I

I Et DNA-fragment med 2 kb og Indeholdende dhfr- I

I 15 genet blev udvundet fra pAdD26SVpA ved behandling med I

I EcoRI og BamHI, og det udvundne fragment blev indføjet i I

I pHGA410(H) ved Hlndlll-stedet til fremstilling af I

I pG4DRl og pG4DR2 (fig. 16c og eksempel 25). I

I 20 (B) Konstruktion af -VSE-1inierekombinantvektorer. I

I cDNA-(-VSE)-fragmentet opnået i (3) blev indføjet I

I i vektoren pdKCR til dannelse af plasmidet pHGV2 (eksem- I

pel 28), som blev delvist digesteret med EcoRI og der- I

I 25 naest behandlet med DNA-polymerase I (Klenow fragment) I

til dannelse af ender uden sammenbindende evne. Et lin- I

I ker Hindlll blev hæftet til DNA'et, som dernæst blev I

I behandlet med Hindlll og T4-DNA-ligase. Det behandlede I

I DNA blev anvendt til transformation af E_^ coli stamme I

I 30 DH1 ved rubidiumchloridmetoden (se Molecular Cloning, I

ibid.). Det resulterende plasmid blev navngivet pHGV2(H) I

I (fig. 18). I

I pHGV2(H) blev behandlet med Sall, og efter dan- I

I nelse af ender uden sammenbindende evne blev det be- I

I 35 handlet med Hindlll en gang til, og et Hindlll-Sall- I

I fragment blev opsamlet. Plasmidet pdBPV-l med et trans- I

23 DK 175336 B1 formeret fragment af bovin papillomavirus blev behandlet med Hindlll og PvuII, og det største DNA-fragment blev skilt fra og bundet til det separat fremstillede HindIII-SalI-fragment. De sammenbundne fragmenter blev 5 anvendt til transformation af coli stamme DH1 til opnåelse af plasmidet pTN-V2, som havde det pHGV2-afledte CSF-cDNA (fig. 18 og eksempel 29).

Ved lignende fremgangsmåder anvendtes enten plasmid pHGV2 eller pHGV2(H) i kombination med plasmidet 10 pAdD26SVpA til konstruktion af pHGV2-dhfr, som var en rekombinantvektor (-VSE) til anvendelse ved CHO-celler (fig. 19a og b og eksempel 31).

Et DNA-fragment på ca. 2 kb indeholdende dhfr-genet blev udvundet fra pAdD26SVpA ved behandling med 15 EcoRl og BamHI, og det udvundne fragment blev indføjet i pHGV2(H) ved Hindlll-stedet til konstruktion af pV2DRl og pV2DR2 (fig. 19c og eksempel 31).

(C) Konstruktion af rekombinantvektorer indeholdende det 20 kromosomale gen.

Plasmidet ρΒΚ0Ε3β, der blev opnået i (4), og som indeholdt det kromosomale gen, vist i fig. 5, blev behandlet med EcoRl.

25 pSVH+K+-plasmidet beskrevet af Banerji et al. i

Cell, 27, 299 (1981) blev behandlet med Kpnl til fjernelse af globingenet. Plasmidet blev endvidere underkastet delvis digestion med Hindlll til fjernelse af en del af SV40's sene gen. Fragmenterne blev igen bundet 30 sammen til fremstilling af ekspressionsvektoren pML-E+.

Denne vektor blev behandlet med restriktionsenzymet EcoRl og dephosphoryleret med en alkalisk phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) til opnåelse af et vektor-DNA, som blev bundet til det førnævnte kromosomale DNA-35 fragment ved hjælp af en T4-DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) til opnåelse af pMLCE3a, der var en rekombi-

I DK 175336 B1 I

I 24 I

I nantvektor for COS-celler (eksempel 34). Som vist i fig. I

I 20 Indeholdt dette plasmid forstærkeren for SV40-genet, I

I replikationsbegyndelsesstedet af SV40, replikationsbe- I

I gyndelsesstedet af pBR322 og det pBR322-af ledte /5-laet a- I

I 5 masegen (Ampr) og havde det humane G-CSF-kromosomale I

gen bundet efter forstærkeren for $V40-genet. I

I En ekspressionsvektor for C127-celler blev kon- I

strueret ved de følgende fremgangsmåder. Et DNA-fragment I

I indeholdende det kromosomale CSF-gen blev med et pas- I

I 10 sende restriktionsenzym skåret ud fra pMLCE3a, som var I

I en ekspressionsvektor for COS-celler. Dette fragment I

I blev ved hjælp af en T4-DNA-ligase bundet til et DNA- I

I fragment indeholdende begyndelsesstedet for bovin papil- I

I lomavirus (BPV) og et DNA fragment indeholdende SV40's I

I 15 tidlige promotor. Det resulterende pTNCE3a var en eks- I

I pressionsvektor, der havde et kromosomalt CSF-gen bun- I

det efter SV40's tidlige promotor, og som indeholdt en I

I 65¾1s del af BPV. I

Ekspressionsvektoren for CHO-celler havde to DNA- I

I 20 fragmenter bundet sammen ved hjælp af en T4-DNA-ligase. I

I Det ene fragment indeholdt det kromosomale CSF-gen og I

I SV401 s tidlige promotor, som for ekspressionsvektoren I

I for C127-celler, og det andet fragment indeholdt et I

I pAdD26SVpA-afledt dhfr-gen. Det resulterende pD26SVCE3a I

I 25 var en ekspressionsvektor, der havde det kromosomale I

I CSF-gen efter SV40-promotoren og dhfr-genet efter den I

I vigtigste sene adenoviruspromotor. I

(9) Ekspression i dyreceller. I

I To repræsentative eksempler er beskrevet i det I

I 30 følgende, medens yderligere detaljer ses af de relevante I

I udførelseseksempler. I

25 DK 175336 B1 (A) Ekspression i muse-C127-celler.

Plasmidet pTN-G4 eller pTN-V2 blev behandlet med BamHI. Det behandlede plasmid blev anvendt til transfor-5 mation af C127-celler (i forvejen fremstillet ved dyrkning) ved calciumphosphatmetoden. De transformerede celler blev dyrket, og kloner med høj CSF-dannelseshastig-hed blev udvalgt. Glycoproteiner indeholdende det eks-primerede G-CSF blev opsamlet og oprenset fra kulturop-10 løsningen af de transformede celler og fandtes at have human G-CSF-virkning. Forekomsten af det ønskede glycoprotein blev også bekræftet ved aminosyreanalyse og analyse af prøvens sukkerindhold.

Til analyse af sukkerindhold blev CSF-prøven, an-15 vendt ved aminosyreanalysen, underkastet bestemmelse af aminosukker ved Elson-Margan-metoden, bestemmelse af neutralsukker ved orcinol-sulfatmetoden eller bestemmelse af sialsyre ved thiobarbituratmetoden. Fremgangsmåderne for hver af bestemmelserne er vist i "Tohshitsu no 20 Kagaku "Chemistry of Saccharides" (del 2 af to dele dele)", Chapter 13, vol. 4 af "A Course in Biochemical Experiments", udgivet af Tokyo Kagaku Dojin. Omdannelse af de målte værdier til vægtprocent viste, at det opnåede G-CSF's sukkerindhold var fordelt indenfor området 25 1-20 vægt* afhængigt af typen af værtsceller, ekspressionsvektorer og dyrkningsbetingelserne.

(B) Ekspression i COS-celler.

30 COS-celler, der var opnået ud fra abe-CV-l-cel- ler, og som var transformeret med en SV40-begyndelses-steddefficiensmutant til eksprimering af det store T-an-tigen af SV40 [se Gluzman et al.. Cell. 32, 175 (1981)], blev transformeret med vektoren pMLCE3a, som var opnået 35 i (5)(C), og som indeholdt det humane kromosomale I DK 175336 B1 I 26

G-CSF-gen. Supernatanten af kulturen af COS-celler udvi- I

ste human G-CSF-virkning (eksempel 35). I

COS-cellerne blev opsamlet og underkastet mRNA- I

analyse, som viste forekomsten af to mRNA-molekyler, der I

5 svarede til aminosyresekvenserne afbildet i henholdsvis I

I fig. 3A og 4A. I

I Eksempler I

I Inden den foreliggende opfindelse beskrives mere I

10 detaljeret med henvisning til udførelseseksempler gives I

det følgende referenceeksempel til belysning af frem- I

I gangsmåderne til testning af CSF-virkningen. I

I Referenceeksempel I

I 15 Testning af CSF-virkning. I

I De følgende fremgangsmåder blev anvendt til be- I

stemmelse af CSF-virkningen (herefter forkortet CSA) i I

forbindelse med den foreliggende opfindelse. I

I CSA-test. I

20 (a) Med humane benmarvsceller: I

Enkeltlaget dyrkning i blød agar blev udført ef- I

I ter fremgangsmåden ifølge Bradley, T.R. og Metcalf, D. I

I (Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44, 287-300, 1966). I

I Mere specifikt blev 0,2 ml bovint, foetalt serum, 0,1 ml I

25 af prøven, 0,1 ml af en suspension af humane ikke-adhæ- I

I rente benmarvsceller (1-2 x 105 celler med nucleus), 0,2 I

I ml modificeret McCoy's 5A-kulturopløsning og 0,4 ml mo- I

I dificeret McCoy's 5A-kulturopløsning indeholdende 0,75¾ I

I agar blandet, hældt i en plastikskål til vxvsdyrkning I

I 30 (35 mm diameter), koaguleret og dyrket ved 37°C i 5¾ I

I C02/95% luft og ved 100¾ fugtighed. Ti dage senere blev I

I antallet af dannede kolonier talt (en koloni består af I

I mindst 50 celler), og CSA blev bestemt med en enhed som I

I den aktivitet, der krævedes til dannelse af en koloni. I

27 DK 175336 B1 (b) Med musebenmarvsceller: 0,4 ml hesteserum, 0,1 ml af prøven, 0,1 ml af en suspension af hunlige C3H/He-musebenmarvsceller (0,5-1 x 10® celler med nucleus) og 0,4 ml modificeret 5 McCoy's 5A-kulturopløsning indeholdende 0,75¾ agar blev blandet, hældt i en plastikskål til vævedyrkning (35 mm diameter), koaguleret og dyrket i 5 dage ved 37°C i 5¾ 002/95¾ luft og ved 100¾1s fugtighed. Antallet af dannede kolonier blev talt (en koloni bestod af mindst 50 10 celler), og CSA blev bestemt med en enhed som aktiviteten til dannelse af en koloni.

Den modificerede McCoy's 5A-kulturopløsning anvendt ved hver af fremgangsmåderne (a) og (b) og suspensionen af humane, ikke-adhærente benmarvsceller anvendt 15 i (a) blev fremstillet ved de følgende fremgangsmåder. Modificeret McCoy's 5A-kulturopløsninq (dobbeltkoncentrat ion) .

12 g McCoy's 5A-kulturopløsning (Gibco), 2,55 g MEM-aminosyre-vitaminmedium (Nissui Seiyaku Co., Ldt.), 20 2,18 g natriumhydrogencarbonat og 50.000 kaliumpenicillin G-enheder blev opløst to gange i 500 ml destilleret vand, og opløsningen blev filtreret aseptisk gennem et Milliporefilter (0,22 μιη) .

Suspension af ikke-adhærente, humane benmarvsceller.

25 En benmarvsvæske opnået fra en rask person ved sternal punktur blev fortyndet fem gange med en RPMI 1640-kulturopløsning, dyrket på plader over en Ficoll-Paque-opløsning (Fharmacia Fine Chemicals) og centrifugeret ved 400 x g i 30 minutter ved 25°C. Cellelaget i 30 grænsefladen (specifik massefylde <1,077) blev opsamlet. Cellerne blev vasket, Indstillet til en koncentration på 5 x 106 celler/ml med en RPMI 1640-kulturopløsning indeholdende 20¾ bovint, foetalt serum, hældt i en 25 cm2 plastkolbe til vævsdyrkning og inkuberet i 30 minutter i 35 en C02~inkubator. Ikke-adhærente celler blev opsamlet i supernatant en, hældt i en plastkolbe (25 cm2) og inku- I DK 175336 B1 I 28 beret 1 2\ time. Ikke adhærente celler i supernatanten blev opsamlet og anvendt ved testning.

Eksempel l I 5 Tilvejebringelse af CH0-2.

En tumor fra en patient med oral cancer, i hvil- H ken en udtalt forøgelse i antallet af neutrofiler ob- serveredes, blev transplanteret til nu/nu-mus. Ti dage efter transplantationen var forøgelsen af tumorens vægt 10 og antallet af neutrofiler udtalt. Tolv dage efter transplantationen blev tumoren udtaget aseptisk, skåret i terninger på 1-2 mm3 og dyrket på følgende måde.

Ti til femten terninger af tumoren blev lagt i et 50 ml plastcentrifugerør. Efter tilsætning af 5 ml 15 trypsinopløsning (indeholdende 0,25% trypsin og 0,02% EDTA) blev røret rystet i 10 minutter i et 37°C varmt bad, og supernatanten blev fjernet. Yderligere 5 ml af samme trypsinopløsning blev tilsat, og trypsindiges- tion blev udført under omrøring I 15 minutter ved 37°C.

20 Supernatantcellesuspensionen blev opsamlet og opbevaret i is, efter trypsinet var inaktiveret ved tilsætning af 1 ml bovint, foetalt serum.

Efter gentagelse af disse procedurer, blev celle- suspensionen opsamlet, hældt sammen med den tidligere 25 opnåede suspension og centrifugeret med 15.000 omdrej- I ninger pr. minut i 10 minutter til opnåelse af en celle- pille. Pillen blev vasket to gange med F-10, indeholden- I de 10% bovint, foetalt serum, og derefter fyldt i en plastkulturkolbe (25 cm2) til opnåelse af en cellekon- I 30 centration på 5 x 106 celler/kolbe. Efter inkubation I natten over i en C02~inkubator (5% CO2 og 100%·s fug- I tighed) med en F-10 kulturopløsning, indeholdende 10% bovint, foetalt serum, blev supernatanten fjernet sammen I med ikke-adhærente celler, og dyrkningen blev fortsat I 35 med tilførsel af frisk kulturopløsning. Seks dage efter I dyrkningens start var flasken fuld af celler, og kul- 29 DK 175336 B1 turopløsningen blev udskiftet med en frisk. Den næste dag blev kulturopløsningen fjernet, og 2 ml antimuse-erythrocytantistof (Cappel) fortyndet 5 gange med RPMI 1640 og 2 ml marsvinekomplement (Kyokuto Seiyaku Co., 5 Ltd.) fortyndet 2,5 gange med RPMI 1640 blev fyldt i kolben. Efter inkubation i 20 minutter ved 37°C blev kulturen vasket 2 gange med F-10, indeholdende 10¾ bovint, foetalt serum, og fibroblasterne opnået ud fra nu/nu-musene blev fjernet. Dernæst tilsattes en F-10 10 kulturopløsning indeholdende 10¾ bovint, foetalt serum, og dyrkningen fortsattes i yderligere 2 dage. Derefter blev nogle af cellerne opsamlet og underkastet kloning ved grænsefortyndingsmetoden.

De resulterende 11 kloner blev undersøgt for de-15 res CSF-aktivitet, og 1 klon (CHU-2) udviste en aktivitet, der var ca. 10 gange højere end de andre kloners aktivitet.

Eksempel 2 20

Isolation af CSF.

Cellerne tilvejebragt i eksempel 1 blev dyrket i en fuldstændig tæt population i to kulturkolber (150 25 cm2). Celler blev opsamlet, suspenderet i 500 ml af en F-10 kulturopløsning indeholdende 10¾ bovint# feotalt serum, overført til en glasrulleflaske på 1580 cm2 (Bel-co), og dyrket under rulning med fem omdrejninger pr. minut (opm). Når cellerne fandtes at have groet i en 30 fuldstændig tæt population på rulleflaskens inderside, blev kulturopløsningen udskiftet med et serumfrit RPMI 1640. Efter 4 dages dyrkning blev supernatanten af kulturen opsamlet, og dyrkningen fortsattes med tilsætning af F-10 indeholdende 10¾ bovint, foetalt serum. Efter 3 35 dages dyrkning blev kulturopløsningen igen udskiftet med serumfrit RPMI 1640, og supernatanten af kulturen blev I DK 175336 B1 30

H opsamlet 4 dage senere. Ved gentagelse af disse proce- I

durer, opnåedes 500 ml af den serumfri supernatant af kulturen pr. flaske hver uge. Desuden muliggjorde denne fremgangsmåde opsamling af supernatanten af kulturen un- H 5 der bevarelse af cellerne i en væsentligt forlænget periode.

En portion bestående af 5000 ml af den opnåede supernatant af kulturen blev blandet med 0,01% Tween 20 og koncentreret ca. 1000 gange ved ultrafiltrering med 10 hulfiber DC-4 og Amicon PM-10 (Amicon). Koncentratet blev renset ved de følgende trin.

(i) En portion på 5 ml af den koncentrerede superna- tant af kulturen blev underkastet gelfiltrering på en

Ultrogel AcA54-kolonne (4,6 cm diameter x 90 cm længde; 15 LKB) ved en strømningshastighed på ca. 50 ml/time med

0,01 M Tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 0,15 M

NaCl og 0,01% Tween 20 (Nakai Kagaku Co., Ltd.). Kolon- nen var kalibreret med bovint serumalbumin (molvægt

H 67.000), ovoalbumln (molvægt 45.000) og cytochrom C

20 (molvægt 12.400). Efter afslutning af gelfiltreringen, blev 0,1 ml af hver af fraktionerne fortyndet 10 gange H og screenet for de aktive fraktioner ved den ovenfor be- skrevne CSA-test (b). Fraktionerne for Ve = 400-700 ml fandtes at udvise makrophag-dominerende CSA, mens frak- 25 tionerne for Ve - 800-1200 udviste granulocytdominerende CSA. Derfor blev de sidstnævnte fraktioner opsamlet og koncentreret til et volumen på ca. 5 ml på et ultrafil- treringsapparatur med PM-10 (Amico).

I (il) Til de koncentrerede fraktioner sattes en vandig

30 opløsning af 0,1% trifluoreddikesyre indeholdende 30% I

n-propanol (til bestemmelse af aminosyresekvensen; kan I fås fra Tokyo Kasei K.K.). Efter man havde ladet blan- I dingen henstå i is i ca. 15 minutter, blev bundfaldet fjernet ved centrifugering i 10 minutter ved 15.000 opm.

I 35 Supernatanten blev adsorberet til en μ-Bondapak C18-ko- I lonne (8 mm x 30 cm til semipræparat ionsanvende Ise; 31 DK 175336 B1

Waters) ækvilibreret med en vandig opløsning Indeholdende n-propanol og trifluoreddikesyre. Kolonnen blev elu-eret kontinuerligt med en vandig opløsning af 0,1¾ tri-fluoreddikesyre, som indeholdt n-propanol med en lineær 5 koncentrationsgradient fra 30-60¾. Et HPLC-apparatur,

Hitachi Model 685-50 (Hatachi, Ltd.), og en detektor,

Hitachi Model 638-41 (Hitachi, Ltd.), anvendtes til samtidig bestemmelse af absorptionerne ved 220 nm og 280 nm. Efter eluering blev 10 μΐ af hver af fraktionerne 10 fortyndet 100 gange og screenet for de aktive fraktioner ved den ovenfor beskrevne CSA-test (b). Toppene, elueret med 40¾ n-propanol, viste sig at have CSA-aktivitet, hvorfor de blev opsamlet, igen chromatograferet under de samme betingelser og testet for CSA ved samme fremgangs-15 måde. Igen observeredes CSA-aktivitet i toppene ved 40¾ n-propanol. Derfor blev disse toppe opsamlet (4 fraktioner » 4 ml) og frysetørret.

(iii) Det frysetørrede pulver blev opløst i 200 μΐ af en vandig opløsning af 0,1¾ trifluoreddikesyre indehol-20 dende 40¾ n-propanol, og opløsningen blev underkastet HPLC på TSK-G 3000SW-kolonne (Tokyo Soda Manufacturing Co., Ltd.; 7,5 mm x 60 cm). Elueringen blev udført roed samme vandige opløsning ved en lav strømningshastighed på 0,4 ml/min, og fraktionerne blev taget i 0,4 ml por-25 tioner med en fraktionskollektor, FRAC-100 (Pharmacia Pine Chemicals). Hver af de opsamlede fraktioner blev undersøgt for dens CSA ved den samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor, og aktiviteten blev observeret i fraktionerne med retentionstider på 37-38 minutter (sva-30 rende til en molvægt på ca. 2 x 104). De aktive fraktioner blev opsamlet og renset på en analytisk μ-Bondapak C18-kolonne (4,6 mm x 30 cm). Hovedtoppene blev opsamlet og frysetørret. Den opnåede prøve blev testet ved CSA-testmetoden (a). Den viste sig at have human G-CSF-35 virkning.

I DK 175336 B1 I

I 32 I

I Eksempel 3 I

I Aminosyresekvensbestemmelse. I

I 5 (i) Bestemmelse af N-terminalaminosyresekvens. I

I Prøven blev underkastet Edman nedbrydning ved I

I hjælp af et apparat til sekvensbestemmelse i gasfase I

I (Applied Biosystems), og den resulterende PTH-aminosyre I

I 10 blev analyseret ved rutinemetoder ved hjælp af et HPLC- I

I apparatur (Beckman Instruments) og Ultrasphere-ODS-ko- I

I lonne (Beckman Instruments). Kolonnen (5 Mm; 4,6 mm dia- I

I meter x 250 mm længde) var ækvilibreret med en startpuf- I

I fer [vandig opløsning indeholdende 15 mM natriumacetat- I

I 15 puffer (pH 4,5) og 40* acetonitril], og prøven blev ind- I

I sprøjtet (opløst i 20 μΐ af startpufferen). Separationen I

I blev udført efter isokratisk eluering med startpufferen. I

H Strømningshastigheden var 1,4 ml/min, og kolonnetempera- I

turen blev holdt på 40°C. Detektionen af PTH-aminosyren I

20 blev opnået ved hjælp af absorptionerne i UV-området ved I

I 269 nm og 320 nm. Standardprøver af PTH-aminosyre (Sig- I

ma) i 2 nmol portioner blev adskilt på det samme appa- I

ratur til bestemmelse af deres retentionstider, som blev I

sammenlignet med retentionstiderne for prøven, der skul- I

25 le testes. Som resultat heraf viste prøven sig at have I

I den følgende aminosyresekvens for de 40 rester fra N- I

terminussen: I

I h0N - Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - I

I 2 (10) . I

30 Leu - Pro - Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - I

(20)

Leu - Glu - Gin - Val - Arg - Lys - Ile - Gin - Gly - I

I (30)

Asp - Gly - Ala - Ala - Leu - Gin - Glu - Lys - Leu - I

(40)

I Cys - Ala - Thr - Tyr - Lys - I

I 35 I

33 DK 175336 B1 (li) Dekomponering med bromocyan.

Prøven blev opløst i 70¾ myresyre. Til opløsningen sattes 200 ækvivalenter af bromocyan, der havde været renset ved sublimation. Man lod blandingen henstå 5 natten over ved 37°C til reaktion. Reaktionsproduktet blev frysetørret og fraktioneret ved HPLC på en TSK G3000SW-kolonne (Tokyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) til opnåelse af fire toppe. Toppene blev navngivet CN-1, CN-2, CN-3 og CN-4 i rækkefølge efter faldende molekyl-10 vægt. De første to toppe (CN-1 og CN-2) havde størst udbytter, og deres aminosyresekvenser blev analyseret ved hjælp af et automatisk apparat til sekvensbestemmelse i gasfase (Applied Biosystems} under de samme betingelser som anvendt i (i).

15 Som et resultat heraf viste CN-1 sig at være et peptid fra N-terminussen af G-CSF-proteinet, og CN-2 havde den følgende aminosyresekvens:

Pro - Al$· - Phe - Ala - Ser - Ala - Phe -Gin - Arg “ Arg - Ala - Gly - Gly - Val -20 Leu _ vai - Ala - Ser - His - Leu - Gin - 1

Dekomponering med trypsin.

Prøven blev opløst i 0,1 M Tris-HCl-puffer (pH

7,4 indeholdende 8 M urinstof, og opløsningen blev blan-25 det med 0,1 M Tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 0,1¾ 2-mercaptoethanol til opnåelse af en siuturinstofkoncentration på 2 M. En TPCK-behandlet trypsin (Sigma) tilsattes, således at prøve-enzymforholdet var 50:1. Blandingen blev holdt i 4 timer ved 25°C og efter tilsætning 30 af en ligeså stor mængde TPCK-behandlet trypsin holdt i yderligere 16 timer ved 25°C. Derefter blev reaktionsproduktet udsat for revers-fase-kolonnechromatografi med stor hastighed på C8-kolonne (Yamamura Kagaku K.K.), idet elueringen udførtes med 0,1¾ TFA indeholdende 35 n-propanol med en lineær densitetsgradient på 5-60¾.

Idet adskillige toppe opnåedes ved måling af absorptio- I DK 175336 B1 I 34 I nen ved 280 nm, blev hovedtoppen analyseret for dens I amlnosyresekvens ved hjælp af et automatisk apparat til I sekvensbestemmeIse i gasfase (Applied Biosystems) under de samme betingelser som anvendt i (i). Som et resultat I 5 heraf viste hovedtoppen sig at være et peptid med den følgende sekvens, som indeholdt en del af CN-2-fragmen- I tet vist i (ii): I Gin - Leu - Asp - Val - Ala - Asp - Pbe - Ala - Thr -

Thr - Ile - Trp - Gin - Gin - Met - Glu - Glu - Lea - I 1° Gly - Met - Ala - Pro - Ala - Leu - Gin - Pro - Thr - I Gin - Gly - Ala - Met - Pro - Ala - Phe - Ala - Ser - I Eksempel 4 I 15

Fremstilling af DNA-probe.

(i) Syntese af probe (IWQ).

Tredive successive nucleotider (se fig. 1) blev 20 fremstillet på basis af sekvensen af 10 minosyrer (Ile- I Trp-Gln-Gln-Met-Glu-Glu-Leu-Gly-Met) indeholdt i amino- syresekvensen opnået i eksempel 3(iii). Det vil være nødvendigt at give en kommentar til opskrivningen af nu- cleotiderne vist i fig. 1. Nucleotidet 9-positioner fra 25 5'-terminus er f.eks. en ækvimolær blanding af dA og d6.

Startnucleotiderne var hovedsagelig dimere, men mononu- I cleotiderne anvendtes også, når det var krævet. 20 mg af .

I startnucleotidharpiksen, Ap-d(G) (Yamasa Shoyu Co.,

Ltd.) tilførtes til en kolonne forsynet med et glasfil- 30 ter. Efter gentagen vaskning med methylenchlorid, blev 4,4*dimethoxytritylgruppen elimineret ved behandling med I en opløsning af methylenchlorid indeholdende 3% tri- chloreddikesyre. Dernæst blev kolonnen vasket adskilli- I ge gange med 1 ml methylenchlorid. Efter kolonnen var I 35 vasket med vandfrit pyridin til uddrivning af opløs- I ningsmidlet, tilsattes 20 mg af en nucleotiddimer, 35 DK 175336 B1 (DMTr )ApTp(NHR3) , (Nippon Zeon; NHR3 = triethylammonium; DMTr = dimethoxytrityl) og 0,2 ml pyridin, og kolonnens indre blev vakuumtørret ved hjælp af en vakuumpumpe.

Dernæst tilsattes 20 mg 2,4,6-trimethylbenzensulfonyl-5 3-nitrotriazolid (MSNT fra Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) og 0,2 ml vandfrit pyridin, og kolonnens indhold blev drevet ud ved hjælp af nitrogengas. Nucleotid-harpiksen blev kondenseret med dimeren ved omsætning i 45 minutter ved stuetemperatur under lejlighedvis om-10 rystning. Efter afslutning af reaktionen blev kolonnen vasket med pyridin, og de uomsatte OH-grupper blev ace-tyleret med en pyridinopløsning indeholdende eddikesyre-anhydrid i overskud og 4-dimethylaminopyridin. Efter vaskning af kolonnen med pyridin, kondenseredes de føl-15 gende dimere eller monomere i den angivne rækkefølge ved gentagelse af de ovenfor beskrevne fremgangsmåder: (DMTr)lp(NHR3), (DMTr)GpGp(NHR3), {DMTr)lp(NHR3), en æk- vimolær blanding af (DMTr)CpTp(NHR3) og (DMTr)TpTp-(NHR3), en ækvimolær blanding af (DMTr)ApAp(NHR3) og 20 (DMTr)ApGp(NHR3), en ækvimolær blanding af (DMTr)ApGp-(NHR3) og (DMTr)GpGp(NHR3), (DMTr)GpAp(NHR3), (DMTr)-TpGp(NHR3), en ækvimolær blanding af (DMTr)ApAp(NHR3) og (DMTr)GpAp(NHR3), (DMTr)CpAp(NHR3), en ækvimolær blanding af (DMTr)ApAp(NHR3) og (DMTr)ApGp(NHR3), 25 (DMTr)GpCp(NHR3), (DMTr)TpGp(NHR3), (DMTr)lp(NHR3) og (DMTR)ApTp(NHR3), idet alle disse nucleotider kunne fås fra Nippon Zeon, undtagen (DMTr)lp(NHR3), der kunne fås fra Yamasa Shoyo Co., Ltd. Efter afslutning af reaktionen i sluttrinnet, blev harpiksen vasket successivt med 30 pyridin, methylenchlorid og ether uden acetylering og derefter tørret. Den tørrede harpiks blev suspenderet i 1,7 ml af en blanding af 0,5 ml pyridin, 0,2 ml vand og 1 ml dioxan indeholdende 1 M tetramethylguanidin og 1 M o-picolinaldoxim. Man lod suspensionen henstå natten 35 over ved stuetemperatur og koncentrerede den til 100— 200 μΐ under vakuum. Koncentratet blev blandet med I DK 175336 B1 I 36

I en lille mængde (2-3 dråber) pyrldin og 2-3 ml koncen- I

I treret, vandig ammoniak, og blandingen blev opvarmet til I

I 55°C i 6 timer. Efter ekstraktion med ethylacetat blev I

den vandige fase skilt fra og koncentreret under vakuum. I

I 5 Koncentratet blev opløst i en opløsning af 50 mM tri- I

I ethylammoniumacetat (pH 7,0), og opløsningen blev under- I

I kastet chromatografi på C-18-kolonne (1,0 x 15 cm; Wa- I

ters), Idet elueringen udførtes med acetonitril (lineær I

I densitetsgradient fra 10-30%) i en opløsning af 50 mM I

I 10 triethylammoniumacetat (pH 7,0). Topfraktionen elueret I

I ved en acetonitrilkoncentration på ca. 25% blev koncen- I

treret under vakuum. I

Til koncentratet sattes 80% eddikesyre, og man I

lod blandingen henstå i 30 minutter ved stuetemperatur. I

H 15 Efter ekstraktion med ethylacetat, blev den vandige fa- I

se skilt fra og koncentreret under vakuum. Det resulte- I

rende koncentrat blev renset yderligere ved HPLC på I

C-18-kolonne (fra Senshu Kagaku K.K.; SSC-0DS-272, 6 mm I

I diameter x 200 mm) . Elueringen udførtes med acetonitril I

I 20 (10-20% lineær densitetsgradient) i en opløsning af 50 I

mM triethylammoniumacetat (pH 7,0). Syntetisk DNA opnåe- I

I des i et udbytte på mindst 10A26o~enhe<*er I

I Analyse ved Maxam-Gilbert sekvensbestemmelsesme- I

I toden [Meth. Enzym., 65, 499 (1980)] viste, at det op- I

I 25 nåede oligonucleotid havde nucleotidsekvensen vist i I

I fig. 1. I

I (ii) Syntese af probe (A). I

I Fjorten successive nucleotider (se fig. 1) blev I

opnået på basis af sekvensen af 5 aminosyrer (Met-Pro- I

I 30 Ala-Phe-Ala) indeholdt i aminosyresekvensen opnået i ek- I

I sempel 3(iii) . I

I Syntesemetoderne var lig metoderne anvendt ved I

I fremstilling af probe (IWQ), og de følgende nucleotider I

I blev kondenseret til nucleotidharpiksen, Ap-d(T) (Yama- I

35 sa Shoyu Co., Ltd.) i den angivne rækkefølge: I

I (DMTr)CpAp(NHRg), (DMTr)GpGp(NHR3), en ækvimolær bian- I

I ding af I

37 DK 175336 B1 (DMTr)CpAp(NHR3), (DMTr)GpGp(NHR3), en ækvimolær blanding af _ ^(DMTc)CpAp(NHRj), (DMTr )CpTp(NHR3), (DMTr)CpGp(NHRj) og (DMTr)CpCp(NHR3) / en aEkvimolær blanding af (DMTr) ApGpiNHR^), δ (DMTr)TpGp(NHR3) , (DMTr ).GpGp (NHRj) og (DMTr)CpGp(NHR3) , (DMTr)ApAp(NHRj), en a^viirolsr blanding af " (DMTr)CpAp(NHR3) <50 (DMTr>CpGp(NHR3), og (DMTr )Gp (NHR3), .

idet alle nucleotiderne kunne fås fra Nippon Zeon. Et 10 syntetisk DNA opnåedes i et udbytte på ca. 10A26o“enhe-der. Analyse ved Maxam-Gilbert sekvensbestemmelsesmetoden viste, at det opnåede oligonucleotid havde nucleo-tidsekvensen vist i fig. 1.

(iii) Syntese af probe (LC).

15 Automatisk DNA-syntese udførtes ved hjælp af et DNA-synteseapparatur, Model 380A fra Applied Biosystems.

Denne teknik, der er baseret på principperne beskrevet af Caruthers et al. [J. Am. Chem. Soc., 103. 3185 (1981)] betegnes i almindelighed som phosphoramiditme-20 toden.

En phosphoramiditformn af (DMTr)-dT, der i forvejen var aktiveret med tetrazol, blev kondenseret til dG-S (S: bærer), hvori blokerende grupper var fjernet fra 51-dimethoxytritylgruppen (DMTr). Derefter blev de 25 uomsatte hydroxylgrupper acetyleret og oxideret med iod i tilstedeværelse af vand til dannelse af en phosphoryl-gruppe. Efter fjernelse af blokerende grupper fra DMTr-gruppen, blev kondensationen gentaget på samme måde, indtil 24 nucleotider med sekvensen vist i fig. 1 var 30 syntetiseret. Disse nucleotider blev spaltet fra bæreren, blokerende grupper blev fjernet, og de blev renset ved revers fase-HPLC på C-18-kolonne (Senshu Kagaku Co.,

Ltd.; SSC-ODS—272).

35 I DK 175336 B1

I 38 I

Eksempel 5 I

I Dyrkning af CHU-2-celler og fremstiling af mRNA. I

51) Dyrkning og opsamling af CHU-2-celler. I

I Tilvejebragte CHU-2-celler blev dyrket i en fuld- I

stændig tat population i to kulturkolber (150 cm2), op-

samlet, suspenderet i 500 ml af en RPMI 1640 kulturop- I

løsning indeholdende 10¾ bovint, foetalt serum, ove'r-

10 ført til en glasrulleflaske på~1580 cm2 (Belco) og dyr- I

ket under rulning med 0,5 omdrejninger pr. minut i 4 I

I dage. Når cellerne viste sig at have groet i en fuld-

stændig tat population på indersiden af rulleflasken, I

blev kulturopløsningen fjernet fra rulleflasken, hvori I

15 der blev fyldt 100 ml af en forvarmet (37°C) fysiologisk I

saltopløsning indeholdende 0,02¾ EDTA. Efter opvarmning I

til 37°C i 2 minutter blev cellerne skilt fra indervæg- I

gen af flasken ved pipettering. Den resulterende celle- I

suspension blev centrifugeret med 1500 omdrejninger pr.

20 minut i 10 minutter til opnåelse af en cellepille. Cel- I

lerne blev resuspenderet i 5 ml af en EDTA-fri fysiolo- I

gisk saltopløsning. Suspensionen blev centrifugeret ved I

I 1500 omdrejninger pr. minut i 10 minutter til opnåelse I

I af en cellepille (våd vægt ca. 0,8 g). De således opnåe- I

25 de celler blev opbevaret, frosset til -80°C, indtil de I

I blev underkastet procedurerne til ekstraktion af RNA. I 1

2) Oprensning af mRNA. I

I Isolation af mRNA fra CHU-2-cellerne opnået i I

I 30 punkt 1) blev udført ved fremgangsmåder, der var i det I

I væsentlige de samme som dem, der er beskrevet i "Mole- I

I kular Cloning", Maniatis et al., Cold Spring Harpor, I

I side 196, 1982. De frosne CHD-2-celler (våd vægt 3,8 g) I

blev suspenderet i 20 ml af en opløsning af 6 M guani- I

35 din [6 M guanidiniumisothiocyanat, 5 mM natriumcitrat I

I (pH 7,0), 0,1 M Ø-mercaptoethanol og 0,5¾ natriumsarco- I

39 DK 175336 B1 sylsulfat], og suspensionen blev blandet godt ved hvirvelstrømsblanding i 2-3 minutter. Blandingen blev underkastet 10 cycler af sugning og udsprøjtning med en en-gangssprøjte (kapacitet 20 ml) forsynet med 18G-kanyle.

5 Ca. 6 ml af den viskose guanidiniumopløsning indeholdende sønderdelte celler blev lagt i et lag på eh 6-ml's stødpude af 5,7 M CsCl i 0,1 M EDTA (pH 7,5) i et Beckman SW40-Ti-polyallomercentrifugerør på en sådan måde, at røret blev fyldt med indholdet. Fire centrifugerør 10 blev præpareret ved den ovennævnte fremgangsmåde og centrifugeret ved 30.000 omdrejninger pr. minut i 15 timer ved 20°C. De resulterende piller blev vasket tre gange med en lille mængde 70% ethanol.

Pillerne opnået fra de respektive rør blev for-15 enet, opløst i 550 μΐ vand og oparbejdet til tilvejebringelse af en NaCl-koncentration på 0,2 M. Efter behandling med en 1:1 blanding af phenol og chloroform og med chloroform alene tilsattes 2,5 voluminer ethanol til bundfældning af det totale RNA (ca. 10,1 mg totalt RNA 20 blev opnået ud fra 3,8 g våde celler).

Poly(A+)-RNA blev oprenset fra det totale RNA ved de følgende affinitetschromatografimetoder, der udnytter fordelen ved bindingen af poly(A)-kæden til 3'-terminus af mRNA'et. Adsorption på oligo(dT)-cellulose (type 7 25 fra P-L-Biochemicals) blev opnået ved passage af det totale RNA gennem en oligo(dT)-cellulosekolonne i en ladende puffer [indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA og 0,1¾ SDS-opløsning] , efter opløsningen havde været opvarmet til 65°C i 5 minutter. Ko-30 lonnen var ækvilibreret med den samme ladende puffer. Eluering af poly(A+)-RNA blev udført med en TE-opløsning [indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og l mM EDTA]. Den ikke adsorberede effluent blev igen fyldt gennem kolonnen, og eluatet opnået ved gentagelse af de samme proce-35 durer blev blandet med det først opnåede eluat. Som et resultat heraf opnåedes 400 ug af poly(A+)-RNA'et.

I DK 175336 B1 I 40

Det således fremstillede mRNA blev fraktioneret efter størrelse ved saccharosedensitetsgradientcentrifu- gering efter fremgangsmåden beskrevet i laboratoriemanu- alen ifølge Schleif og Wensink, "Practical Methods in 5 Molecular Biology", Springer-Verlag, New York, Heidel- berg, Berlin (1981).

Nærmere angivet skabtes en 5-25%1s saccharoseden- sitetsgradient i et Beckman SW40 Ti-centrifugerør. To saccharoseopløsninger fremstilledes ved opløsning af 5% 10 og 25% RNase-fri saccharose (Schwarz/Mann) i en opløs- I ning indeholdende 0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), I 1 mM £DTA og 0,5% SDS.

I 800 mg af mRNA'et [poly(A+)-RNA] fremstillet ved den allerede beskrevne fremgangsmåde blev opløst 1 200- 15 500 μΐ af en TE-opløsning. Opløsningen blev opvarmet til 65°C i 5 minutter og efter at være kølet' , blev den pla- ceret på saccharosedensitetsgradientopløsninger, som blev centrifugeret ved 30.000 omdrejninger pr. minut i 20 timer. Fraktioner, der hver var på 0,5 ml, blev op- 20 samlet, og deres absorption ved 260 nm blev målt. Stør- relserne af de fraktionerede RNA-molkyler blev bestemt på basis af positionerne af standard RNA-molekyler (ribosomale RNA-molekyler 28S, 18S og 5S). Samtidig blev G-CSF-aktiviteten af hver fraktion undersøgt med oocy- 25 ter fra Xenopus laevis ved de følgende fremgangsmåder.

Først blev RNA'et fra hver fraktion oparbejdet til en I vandig opløsning med en koncentration på 1 μg/μl, oocy- ter blev udtaget fra Xenopus (ca. 1 år gammel), og mRNA- opløsningen blev injiceret på en sådan måde, at 50-ng I 30 mRNA blev injiceret i en oocyt, ti sådanne oocyter blev I placeret i hver af 96 brønde i en mikrotiterplade, oocy- I terne blev dyrket i 48 timer ved stuetemperatur i 100 μΐ I af et Barth-medium [88 mM NaCl; 1 mM KC1; 2,4 mM NaHC03;

I 0,82 mM MgS04; 0,33 mM Ca(N03)2; 0,41 mM CaCl2; 7,5 mM

35 Tris-HCl (pH 7,6); penicillin, 10 mg/L; og streptomycin- I sulfat, 10 mg/L], hvorefter supernatanten af kulturen 41 DK 175336 B1 blev opsamlet, koncentreret og renset til en kvalitet, der er egnet til testning af G-CSP-aktivitet.

G-CSF-Aktiviteten viste sig at være til stede i 15-17 S-fraktionerne.

5

Eksempel 6

Syntese af cDNA (konstruktion af pBR-linie-cDNA-biblio-tek.

Od fra poly(A+) RNA'et opnået i eksempel 5 syn-10 tetiseredes cDNA ved fremgangsmåden ifølge Land et al.

[Nucleic Acids Res., 9, 2251 (1981)], modificeret ved fremgangsmåden ifølge Gubier og Hoffman [Gene, 25, 263 (1983)].

15 1) Syntese af enkeltstrenget cDNA.

X et Eppendorf-rør (kapacitet 1,5 ml) fyldtes de følgende reagenser i den nævnte rækkefølge: 80 μΐ af en reaktionspuffer (500 mM KCl, 50 mM MgCl2, 250 mM Tris-HC1, pH 8,3); 20 μΐ 200 mM dithiothreitol, 32 μΐ 12,5 mM 20 dNTP (indeholdende 12,5 mM af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP), 10 μΐ a-32-P-dCTP (PB 10205 fra Amerscham), 32 μΐ oligo(dT)^2-18 (fra P-L Biochemicals; 500 μg/ml), 20 μΐ poly(A+) RNA (2,1 μg/μl) , og 206 μΐ destilleret vand. I alt 400 μΐ af reaktionsopløsningen blev opvarmet 25 til 65°C i 5 minutter og derefter opvarmet til 42°C i 5 minutter. Til den opvarmede opløsning sattes 120 enheder af revers transkriptase (Takara Shuzo Co., Ltd.).

Efter omsætning i yderligere 2 timer ved 42°C tilsattes 2 μΐ af en RNase-inhibitor (Bethesda Research Laborato-30 ries), 20 μΐ af en TE-opløsning, 16 μΐ af 100 mM na triumpy rophosphat og 48 enheder (4 μΐ) af en revers transkriptase, og omsætningen blev udført ved 46°C i 2 timer. Reaktionen blev stilnet ved tilsætning af 0,5 M EDTA (8 μΐ) og 10% SDS (8 μΐ). Ved efterfølgende behand-35 Ung med phenol/chloroform og udfældning med ethanol (2 gange), opnåedes et enkeltstrenget cDNA.

I DK 175336 B1

I I

I 2) Vedhæftning af dC-kæden til det enkeltstrengede cDNA. I

H Det enkeltstrengede cDNA opnået i punkt 1) blev I

I opløst i destilleret vand. Til opløsningen sattes 60 μΐ I

af en dC-kæde-adderende puffer [400 mM potassiumcacody- I

I 5 lat, 50 mM Tris-HCl (pH 6,9), 4 mM dithiothreitol, 1 mM I

CoCl2 og 1 mM dCTP] , og blandingen blev opvarmet til I

37°c i 5 minutter. Til reaktionsopløsningen sattes 3 μΐ I

I af en terminaltransferase (27 enheder/μΐ; P-L Biochemi- I

I cals), og blandingen blev opvarmet til 37°C i 2,5 minut- I

10 ter. Efter behandling med phenol/chloroforom (1 gang) og I

I udfældning med ethanol (2 gange) blev cDNA'et med dc- I

hale opløst i 40 μΐ TE-opløsning indeholdende 100 ml I

I NaCl. I

15 3) Syntese af dobbeltstrenget cDNA. I

Til 40 μΐ af DNA-opløsningen, fremstillet i punkt I

2), sattes 4 μΐ oligo (dG)12-i8 (200 J*g/ml; P-L Bioche- I

micals), og blandingen blev opvarmet først til 65°C i 5 I

I minutter og dernæst til 42°C i 30 minutter. Mens reak- I

20 tionsopløsningen blev holdt ved 0°C, tilsattes 80 μΐ af I

I en puffer [100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM MgCl2, 50 mM I

I (NH4)2S04 og 500 mM KCl] , 4 μΐ 4 mM dNTP (indeholdende I

4 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP), 60 μΐ 1 mM β- I

I NAD, 210 μΐ destilleret vand, 20 μΐ af E. coli DNA- I

25 polymerase I (Takara Shuzo Co., Ltd.), 15 μΐ af E. coli I

DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) og 15 μΐ af E. coli I

I RNase H (Takara Shuzo Co., Ltd.), og blandingen blev un- I

I derkastet omsætning ved 12®C i 1 time. Efter tilsætning I

I af 4 mM dNTP (4 μΐ) , udførtes omsætningen ved 25°C il I

I 30 time. Ved efterfølgende behandling med ethanol-chloro- I

I form og udfældning med ethanol (en gang), opnåedes ca. 8 I

I μg dobbeltstrenget cDNA. Dette dobbeltstrengede cDNA I

I blev opløst i en TE-opløsning og underkastet elektrofo- I

I rese i 1,2% agarosegel. Fragmenterne svarende til en I

35 størrelse på ca. 560 bp til 2 kbp blev adsorberet på I

Whatman DE81, og ca. 0,2 μ? af det dobbeltstrengede cDNA I

43 DK 175336 B1 kunne opsamles ved eluering.

4) Vedhæftning af dC-kæde til det dobbeltstrengede cDNA.

Det dobbeltstrengede cDNA fremstillet i 3) blev 5 opløst i 40 μΐ af en TE-opløsning. Efter tilsætning af 8 μΐ af en dC-hale-adderende puffer af typen angivet i 2) blev blandingen opvarmet til 37eC i 2 minutter. Efter tilsætning af 1 μΐ af en terminal-transferase (27 enheder /μΐ), blev blandingen underkastet omsætning ved 37°C 10 i 3 minutter. Derefter blev reaktionsopløsningen øjeblikkelig afkølet til 0°C, og reaktionen blev stilnet ved tilsætning af 1 μΐ 0,5 M EDTA. Efter behandling med phenol/chloroform og udfældning med ethanol, blev det opnåede bundfald suspenderet i 10 μΐ af en TE-opløsning.

15 5) Konstruktion af pBR-linie-cDNA-bibliotek.

Fire mikroliter af en kommerciel pBR322 vektor med oligo(dG)-hale (Bethesda Research Laboratories; 10 ng/μΐ) og 2 μΐ af det dobbeltstrengede cDNA med dc-hale opnået i 4) blev annealed i en TE-opløsning indehol-20 dende 75 μΐ 0,1 M NaCl. Annealingen bestod af tre trin: Opvarmning til 65°C i 5 minutter, efterfølgende opvarmning til 40°C i 2 timer og dernæst afkøling til stuetemperatur .

I overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet i 25 laboratoriemanualen ifølge Maniatis et al. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, p 249 ff. (1982)] (andre rutinemetoder kunne også anvendes her) blev kompetente celler fremstillet ud fra E. coli stamme X1776 og transformeret med det annealede plasmid til opnåelse af 30 transformanter.

Eksempel 7

Syntese af cDNA (konstruktion af Aphag-bibliotek) 35 l) Syntese af enkeltstrenget cDNA.

I overensstemmelse med fremgangsmåderne, beskrevet i eksempel 5, blev 3,8 g frosne CHU-2-celler renset I DK 175336 B1 I 44

to gange på en oligo(dT)-cellulosekolonne og dernæst I

I oparbejdet til opnåelse af 400 poly(A+)-RNA. I

En TE-opløsning (10 μΐ), hvori 12 pg af poly(A+) I

I RNAet var opløst, blev placeret i et reaktionsrør inde- I

I 5 holdende 10 μg actinomycin D (Sigma). Derefter fyldtes I

følgende reagenser i den angivne rækkefølge i røret: 20 I

I μΐ af en revers transkriptionspuffer 1250 mM Tris-HCl

I (pH 8,3); 40 mM MgCl2; 250 mM KCl] ; 20 μΐ 5 mM dNTP

I (indeholdende 5 mM af hver af dATP, dGTP, dCTP og dTTP); I

I 10 20 μΐ oligo(dT)12-i8 <0,2 μg/ml; P-L Biochemicals); i μΐ

I 1 M dithiothreitol; 2 μΐ RNasin (30 enheder/μΐ; Promega I

I Biotech); 10 μΐ af en revers transcriptase (10 units/μΐ; I

I Seikagaku Kogyo Co., Ltd.); 1 μΐ af a-32P~dATP (10 μΟΙ; I

Amerscham) og 16 μΐ vand. Reaktionsopløsningen, der I

15 ialt havde et volumen på 100 μΐ, blev holdt ved 42°C 1 2

timer, og reaktionen blev stilnet ved tilsætning af 0,5 I

I M EDTA (5 μΐ) og 20% SDS (1 μΐ). Ved efterfølgende be-

handling med phenol/chloroform (100 μΐ) og udfældning I

med ethanol (to gange), opnåedes ca. 4 pg enkeltstrenget I

I 20 cDNA.

2) Syntese af dobbeltstrenget cDNA.

I cDNAet opnået i 1) blev opløst i 29 μΐ af en TE- I opløsning, og en reaktionsopløsning fremstilledes ved I 25 tilsætning af de følgende reagenser i den angivne række-

I følge: 25 μΐ af en polymerasepuffer [400 mM Hepes (pH

I 7,6); 16 mM MgCl2, 63 mM β-mercaptoethanol, og 270 mM

I KCl], 10 μΐ 5 mM dNTP; 1,0 μΐ 15 mM β-NAD; 1,0 μΐ α-32- I P-dATP (10 μα/μΐ); 0,2 μΐ E. coli DNA-ligase (60 enhe- I 30 der/μΐ; Takara Shuzo Co., Ltd.); 5,0 μΐ E. coli DNA- I polymerase 1 (New England Biolabs; 10 enheder/μΐ); 0,1 I μΐ RNase H (60 enheder/μΐ; Takara Shuzo Co., Ltd.) og I 28,7 μΐ destilleret vand.

Reaktionsopløsningen blev inkuberet ved 14°C i 1 I 35 time, ladet stige til stuetemperatur og inkuberet i M yderligere 1 time. Dernæst blev reaktionen stilnet ved 45 DK 175336 B1 tilsætning af 0,5 M EDTA (5 μΐ} og 20% SOS (1 μΐ), og behandling med phenol/chloroform og udfældning med ethanol blev udført. Det opnåede DNA blev opløst i 20 μΐ 0,5 mM EDTA, og en reaktionsopløsning blev fremstillet ved 5 tilsætning af 3 μΐ af en Klenow puffer [500 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 50 mM MgCl2] , 3 μΐ 5 mM dNTP og 4 μΐ vand.

Efter tilsætning af 1 μΐ DNA-polymerase (Klenow fragment; Takara Shuzo Co., Ltd.), blev reaktionsopløsningen inkuberet ved 30°C i 15 minutter.

10 Den inkuberede reaktionsopløsning blev fortyndet med 70 μΐ TE-opløsning, og reaktionen blev stilnet ved tilsætning af 0,5 M EDTA (5 μΐ) og 20% SDS (1 μΐ) . Ved efterfølgende behandling med phenol/chloroform og udfældning med ethanol opnåedes ca. 8 μg af et dobbelt-15 strenget cDNA.

3) Methylering af dobbeltstrenget cDNA.

30 μΐ vandig opløsning af det dobbeltstrengede cDNA syntetiseret i 2) blev blandet med 40 μΐ af en me-20 thyleringspuffer [500 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM EDTA], 20 μΐ af en SAM opløsning [800 μΜ S-adenosyl-L-methyl-methionin (SAM), 50 mM /3-mercaptoethanol] og 100 μΐ vand. Til blandingen sattes 15 μΐ af en EcoRI-methylase (New England Biolabs, 20 enheder/μΐ) til fremstilling af 25 en reaktionsopløsning med et volumen på ialt 200 μΐ.

Efter inkubation ved 37°C i 2 timer udførtes behandling med phenol og ether og udfældning med ethanol til udvinding af DNAet.

30 4) Tilsætning af EcoRI-linker.

Til ca. 1,2 μg af det methylerede dobbeltstrengede DNA sattes 1,5 μΐ af en ligasepuffer [250 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 100 mM MgCl2], 0,5 μΐ af en i forvejen phosphoryleret EcoRI-linker (lOmer, Takara Shuzo Co., 35 Ltd.), 1,5 μΐ 10 mM ATP, 1,5 μΐ 100 mM dithiothreitol, og 2 μΐ H20 til fremstilling af en reaktionsblanding med I DK 175336 B1 I 46 et volumen på ialt 15 μΐ. Efter tilsætning af 0,7 μΐ T4-DNA-ligase (3,4 enheder/μΐ, Takara Shuzo Co., Ltd.) udførtes omsætningen natten over ved 4°C. Derefter blev ligasen inaktiveret ved opvarmning til 65°C i 10 minut- 5 ter. Reaktionsopløsningen blev oparbejdet til et total-

volumen på 50 μΐ ved tilsætning af 100 mM Tris-HCl (pH

H 7,5), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 100 μg/ml gelatine. Ef- ter tilsætning af EcoRI (3,5 μΐ, 10 enheder/μΐ), udfør- tes omsætningen ved 37°C 1 2 timer. Dernæst tilsattes 10 2,5 μΐ 0,5 M EDTA og 0,5 μΐ 20% SDS, efterfulgt af be- handling med phenol/chloroform og udfældning med ethanol til udvinding af DNAet. Derefter blev uomsat EcoRI-lin- ker fjernet ved gelfiltrering på Ultrogel AcA34 (LKB) eller agarosegelelektroforese, til udvinding af ca.

15 0,5-0,7 μg af det linker-adderede dobbeltstrengede cDNA.

5) Binding af dobbeltstrenget cDNA til XgtlO-vektor.

Det linker-adderede dobbeltstrengede cDNA blev blandet med 2,4 pg af i forvejen EcoRI-behandlet 20 XgtlO-vektor (Vector Cloning system), 1,4 μΐ af en liga- sepuffer (250 mM Tris-HCl og 100 mM MgCl2) og 6,5 μΐ H destilleret vand, og blandingen blev opvarmet til 42°C i fem minutter. Derefter tilsattes 1 μΐ 10 mM ATP, 1 μΐ I 0,1 M dithiothreitol og 0,5 μΐ T4-DNA-ligase til opnåel- 25 se af et totalvolumen på 15 μΐ, og omsætningen blev ud- ført natten over ved 12°C.

6) In vitro pakning.

H Ca. en trediede1 af rekombinant DNA molekylerne I 30 fremstillet i 5) blev pakket ved hjælp af et in vitro I pakningssæt (Promega Biotech) til opnåelse af phagpla- I ques.

DK 175336 B1 47

Eksempel 8

Screening af pBR-linie-bibliotek med Probe (IWQ).

5 Whatman 541-papir blev anbragt på et koloni- vskst-agarmedium og ladet henstå ved 37°C i 2 timer. Pilterpapiret blev dernæst behandlet ved den følgende fremgangsmåde ifølge Taub og Thompson (Anal. Biochem., 126. 222 (1982)).

10 Kolonierne overført til 541-papiret blev endvide re dyrket på et agarmedium indeholdende chloramphenicol (250 μg/μl) natten over ved 37eC.

541-papiret blev udtaget og ladet henstå ved stuetemperatur i 3 minutter på et andet filterpapir, der 15 var Imprægneret med 0,5 N NaOH-opløsning. Denne procedure blev gentaget to gange. To lignende forløb udførtes i 3 minutter ved anvendelse af en opløsning af 0,5 M Tris-HCl (pH 8) . Ved 4®C udførtes behandlingerne med en opløsning af 0,05 M Tris-HCl (pH 8) 13 minutter og med 20 1,5 mg/ml af en lysozymopløsning (indeholdende 0,05 M Tris-HCl (pH 8) og 25¾ saccarose) i 10 minutter, hvorefter behandlinger blev udført ved 37°C med en opløsning af 1 x SSC (0,15 M NaCl og 0,015 M natriumcitrat) i 2 minutter, og med en 1 x SSC-opløsning Indeholdende 200 25 ug/ml proteinase K i 30 minutter, og endelig udførtes behandlinger ved stuetemperatur med en 1 x SSC-opløsning i 2 minutter, og med 95¾ ethanolopløsning i 2 minutter. Sluttrinet blev gentaget to gange. Derefter blev 541-papiret tørret. Det tørrede 541-papir blev neddyppet i 30 en 25:24:1-blanding af phenol/chloroform/isoamylalkohol (ekvilibreret med 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 100 mM NaCl og 10 mM EDTA) i 30 minutter ved stuetemperatur. Dernæst blev lignende procedurer gentaget 3 gange med en 5 x SSC-opløsning i 3 minutter, og dernæst to gange med en 35 95¾ ethanolopløsning i 3 minutter. Dernæst blev filterpapiret tørret.

I DK 175336 B1

I 48 I

Proben (IWQ) blev mærket med 32P 1 overensstem- I

melse med rutinemetoder (se Molecular Cloning), og kolo- I

nihydridisering udførtes i overensstemmelse med frem- I

gangsmåden ifølge Wallace et al. (Nucleic Acids Res., 9, I

I 5 879 (1981)). Prehybridisering udførtes ved 65°C i 4 ti- I

I mer i en hybridiseringspuffer indeholdende 6 x NET (0,9 I

M NaCl; 0,09 M Tris-HCl (pH 7,5) og 6 mM ETA), 5 x Den- I

I hårdt's opløsning, 0,1% SDS og 0,1 mg/ml denatureret DNA I

(calvethymus). Derefter udførtes hybridisering natten I

10 over ved 56°C i en hybridiseringspuffer (se dens sammen- I

sætning ovenfor) indeholdende 1 x 106 cpm/ml af den I

radiomærkede probe (IWQ). Efter afslutning af reaktionen I

blev 541-papiret vasket 2 gange med en 6 x SSC-opløsning I

I (indeholdende 0,1% SDS) i 30 minutter ved stuetemperatur I

I 15 og dernæst ved 56°C i 1,5 minutter. Det vaskede 541-pa- I

pir blev underkastet autoradiografi. I

Plasmidet blev skilt fra positive kloner og un- I

derkastet Southern blotting med proben (IWQ). I

Hybridisering og autoradiografi blev udført under I

20 de samme betingelser som beskrevet ovenfor. I

I På samme måde udførtes Southern blotting med I

proben (A). Under anvendelse af en hybridiseringspuffer I

med sammensætningen vist ovenfor udførtes hybridisering I

først ved 49eC i 1 time. Efter henstand til 39°C udført- I

I 25 es hybridisering endvidere ved denne temperatur i 1 I

time. Efter afslutning af reaktionen blev et nitrocellu-

I losefilter vasket to gange med 6 x SSC indeholdende 0,1% I

SDS i 30 minutter ved stuetemperatur og dernæst ved 39°C

13 minutter. Det vaskede papir blev underkastet auto-

I 30 radiografi. I

Som et resultat heraf fandtes en enkelt klon at I

I være positiv. Nucleotidsekvensbestemmelse ved dideoxyme- I

I toden viste, at denne klon havde et DNA bestående af 308 I

I basepar og indeholdende delene af både proben (IWQ) og I 35 proben (A). Det pBR322-afledte plasmid indeholdende

I dette insert blev navngivet pHCS-i. I

DK 175336 B1 49

Eksempel 9

Screening af APhag-linie-bibliotek med DNA-probe opnået ud fra pHCS-l.

5

Plaquehybridisering udførtes efter fremgangsmåden Ifølge Benton and Davis (Science, 196. 180 (1977)).

pHCS-l'et opnået i eksempel 8 blev behandlet med Sau3A og EcoRI til opnåelse af et DNA-fragment på ca. 600 bp.

10 Dette DNA fragment blev radiomærket ved "nick translation" ved rutinemetoder. Et nitrocellulosefilter (S & S) blev placeret på et agarmedium med phagplague-vækst til overførsel af phager til filtret. Efter denaturering af phag-DNAet med 0,5 M NaOH, blev filterpapiret behandlet 15 ved de følgende metoder: Behandling med 0,1 M NaOH og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, to behandlinger med 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, og endelig behandling med 120 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat, 13 mM KH2PO4 og 1 mM EDTA (pH 7,2) i 20 sekunder.

20 Filterpapiret blev dernæst tørret og opvarmet til 80°C i 2 timer til immobilisering af DNA'et. Pre-hybridisering blev udført natten over ved 42°C i en pre-hybridiseringspuffer indeholdende 5 x SSC, 5 x Denhardt's opløsning, 50 mM phosphatpuffer, 50% forma- 25 mid, 0,25 mg/ml denatureret DNA (laksesperm-DNA) og 0,1% SDS. Derefter udførtes hybridisering ved 42°C i 20 timer i en hybridiseringspuffer indeholdende 4 x 105 cpm/ml pHCS-l-probe, der var radiomærket ved "nick translation". Hybridiseringspufferen var en blanding af 30 5 x SSC, 5 x Denhardt's opløsning, 20 mM phosphatpuffer (pH 6,0), 50% formamid, 0,1% SDS, 10% dextransulfat og 0,1 mg/ml denatureret DNA (laksesperm-DNA).

Det hybridiserede nitrocellulosefilter blev vasket i 20 minutter med 2 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved 35 stuetemperatur, og derefter i 30 minutter med 0,1 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved 44°C og endelig i 10 minutter I DK 175336 B1 I 50 med 0,1 x SSC ved stuetemperatur. Dernæst udførtes de- tektion ved autoradiografi.

Som et resultat heraf opnåedes 5 positive doner (GI - G5). Klonen Indeholdende et cDNA af fuld længde 5 blev undersøgt for DNA-nucleotidsekvens ved dideoxyme- toden, og nucleotidsekvensen vist i fig. 3(A) blev iden- tificeret. Dette cDNA blev skåret ud af AgtlO-vektoren og bundet til pBR327 (Soberon et al., Gene, 9, 287 (1980)) ved EcoRI-stedet til dannelse af et plasmid, som 10 kunne fremstilles i stor skala. Dette plasmid kaldes I pBRG4.

Eksempel 10 15 Screening af Xphag-linie-bibliotek med DNA-probe opnået ud fra pBRG4 og probe (LC).

Plaquehybridisering blev udført efter fremgangs- måden ifølge Benton og Davis (se Science, ibid.) anvendt 20 i eksempel 9. Et nitrocellulosefilter (S & S) blev an- bragt på agarmediet med phagplague-vækst til overførsel I af phagerne til filteret. Efter denaturering af phag I DNA'et med 0,5 M NaOH, blev filtret behandlet ved de

følgende metoder: Behandling med 0,1 M NaOH og 1,5 M

25 NaCl i 20 sekunder, dernæst to behandlinger med 0,5 M

Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 H NaCl i 20 sekunder og endelig

behandling med 120 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat, 13 mM

I KH2PO4 og 1 mM EDTA (pH 7,2) i 20 sekunder. Filtret blev dernæst tørret og opvarmet til 80°C i 2 timer til immo- I 30 bilisering af DNA'et. To stykker af det samme filter I blev fremstillet på samme måde som beskrevet ovenfor og I underkastet screening ved hjælp af DNA-proben opnået ud fra pBRG4 og proben (LC).

Screening med DNA-proben opnået ud fra pBRG4 blev 35 udført ved den følgende metode. pBRG4-plasmidet blev be- I handlet med EcoRI til opnåelse af et DNA fragment på ca.

51 DK 175336 B1 1500 bp. Dette DNA fragment blev radiomærket ved "nick translation" ved rutinemetoder. Det ene af de to nitrocellulosefiltre blev underkastet prehybridesering natten over ved 42°C i en prehybridiseringspuffer indeholdende 5 5 x SSC, 5 x Denhardt's opløsning, 50 mM phosphatpuffer, 50% formamid, 0,25 mg/ml denatureret DNA (laksesperm-DNA) og 0,1% SDS. Derefter blev filtret underkastet hy-bridisering ved 42°C i 20 timer i en hybridiseringspuf-fer indeholdende den radiomærkede DNA-probe (ca. 1 x 10® 10 cpm/ml) med ca. 1500 bp. Denne hybridiseringspuffer var en blanding af 5 x SSC, 5 x Denhardt's opløsning, 20 mM phosphatpuffer (pH 6,0), 50% formamid, 0,1% SDS, 10% dextransulfat og 0,1 mg/ml denatureret DNA (laksesperm-DNA). Det hybridiserede nitrocellulosefilter blev vasket 15 i 20 minutter med 2 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved stuetemperatur, dernæst i 30 minutter med 0,1 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved 44°C og endelig i 10 minutter med 0,1 x SSC ved stuetemperatur. Dernæst udførtes detektion ved autoradiografi.

20 Screening med proben (LC) udførtes dernæst ved den følgende metode. Det andet filter var i forvejen behandlet med 3 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved 65°C i 2 timer. Dernæst udførtes prehybridisering ved 65°C i 2 timer i en opløsning indeholdende 6 x NET, 1 x Den-25 hårdt's opløsning og 100 Mg/ml denatureret DNA (lakse-sperm-DNA). Hybridisering udførtes dernæst natten over ved 63°C i en hybridiseringspuffer indeholdende den radiomærkede probe (LC) (2 x 10® cpm/ml). Denne hybridiseringspuf fer var også en blanding af 6 x NET, 1 x 30 Denhardt's opløsning og 100 Mg/ml denatureret DNA (laksesperm-DNA). Det hybridiserede nitrocellulosefilter blev vasket tre gange (af hver 20 minutter's varighed) med 6 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved stuetemperatur, og dernæst med 6 x SSC Indeholdende 0,1% SDS ved 63°C i 2 35 minutter.

Filtret blev tørret, og detektion udførtes ved autoradiografi.

I DK 175336 B1 I 52

Ved screeningen beskrevet ovenfor udvalgtes klon- I

I er, som var positive overfor begge prober, og klonen in- I

I dehoIdende et cDNA af fuld længde blev undersøgt for I

dets nucleotidsekvens ved dideoxymetoden. Det viste sig I

I 5 at have nucleotidsekvensen vist i fig. 4(A). Dette cDNA I

I blev skåret ud af AgtlO-vektoren og bundet til pBR327 I

I ved EcoRI stedet til dannelse af plasmidet pBRV2. I

Eksempel 11 I

I 10 I

I Screening af humant, kromosomalt genbibliotek. I

I 1) Konstruktion af humant, kromosomalt genbibliotek. I

I 15 Det humane, kromosomale genbibliotek, der var I

tilvejebragt ved imødekommenhed fra Dr. Maniatis fra I

H Harvard University var fremstillet ved de følgende me- I

I toder: Det hele kromosomale DNA blev ekstraheret fra I

human, foetal lever med phenol eller et andet passende I

I 20 kemikalium, og digesteret delvist med restriktionsenzy- I

I merne, Haelll og Alul. De resulterende DNA fragmenter I

blev behandlet ved saccarosedensitetsgradientcentrifug- I

ering til koncentrering af fragmenterne med kædelsngder I

I på ca. 18-25 kb, og de koncentrerede fragmenter blev I

I 25 bundet til arm-DNA'et fra E. coli phag-X-Charon 4A, I

hvori kortkædede syntetiske nucleotider med overskæ- I

ringssteder for restriktionsenzymet EcoRI var indføjet, I

til fremstilling af infektiøse phag-DNA-rekombinanter. I

Med henblik på tilvejebringelse af øget infektionsevne, I

I 30 blev mere rensede phag-A-partikler dannet ved pakning I

I {''packaging”)· Det således fremstillede humane genbib- I

I liotek betragtes teoretisk som værende en samling re- I

I komb irvant er indeholdende humane DNA-molekyler med kæde- I

I længder på 18-25 kb, som indeholt praktisk talt alle I

35 humane gener. I

53 DK 175336 B1 2) Screening af det humane, kromosomale genbibliotek med DNA-proben opnået ud fra pHCS-l.

Plaquehybridisering udførtes efter fremgangsmåden ifølge Benton and Davis (Science, 196, 180 (1977)).

5 pHCS-l'et opnået i eksempel 8 blev behandlet med Sau3A og BcoRI til opnåelse af et DNA-fragment på ca. 600 bp.

Dette DNA fragment blev radiomærket ved "nick translation" ved rutinemetoder. Et nitrocellulosefilter (S & S) blev placeret på et agarmedium med phagplaque-vækst til 10 overførsel af phager til filtret. Efter denaturering af phag-DNAet med 0,5 M NaOH, blev filterpapiret behandlet ved de følgende metoder: Behandling med 0,1 M NaOH og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, to behandlinger med 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 M NaCl i 20 sekunder, og ende-15 lig behandling med 120 mM NaCl, 15 mM natriumcitrat, 13 mM KH2PO4 og 1 mM EDTA (pH 7,2) i 20 sekunder.

Filterpapiret blev dernæst tørret og opvarmet til 80°C i 2 timer til immobilisering af DNA'et. Pre-hybridisering blev udført natten over ved 42°C i en pre-20 hybrid!seringspuffer, indeholdende 5 x SSC, 5 x

Denhardt’s opløsning, 50 mM phosphatpuffer, 50% forma mid, 0,25 mg/ml denatureret DNA (laksesperm-DNA) og 0,1% SDS. Derefter udførtes hybridisering ved 42°C i 20 timer i en hybridiseringspuffer indeholdende 4 x 105 cpm/ml 25 pHCS-l-probe, der var radiomærket ved "nick translation". Hybridiseringspufferen var en blanding af 5 x SSC, 5 x Denhardt's opløsning, 20 mM phosphatpuffer (pH 6,0), 50% formamid, 0,1% SDS, 10% dextransulfat og 0,1 mg/ml denatureret DNA (laksesperm-DNA).

30 Det hybridiserede nitrocellulosefilter blev va sket i 20 minutter med 2 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved stuetemperatur, og derefter i 30 minutter med 0,1 x SSC indeholdende 0,1% SDS ved 44°C og endelig i 10 minutter med 0,1 x SSC ved stuetemperatur. Dernæst udførtes de-35 tektion ved autoradiografi.

Som et resultat heraf opnåedes godt 10 positive kloner. Rekombinant-DNA molekyler blev fremstillet ud I DK 175336 B1 I 54 fra disse kloner ved fremgangsmåden ifølge Maniatis (Cell/ 15, 687 (1978)). De opnåede DNA molekyler blev behandlet med restriktionsenzymer, såsom EcoRI, BamHI og

Bglll og analyseret ved agarosegel-elektroforese, og 5 deres restriktionsenzymkort blev fremstillet ved frem- gangsmåden ifølge Fritsch et al. (se Cell, ibid.).

Southern hybridisering udførtes ved anvendelse af det radiomærkéde DNA-fragment, opnået ud fra pHCS-1 som probe, hvilket fragment var det samme som det der blev 10 anvendt ved de ovenfor beskrevne screeningsmetoder. Et DNA-fragment på ca. 8 kbp, der blev skåret ud med EcoRI, blev udvalgt fra klonerne, der hybridiserede med proben.

Dette fragment blev subklonet til EcoRI-stedet af pBR327. Det subklonede DNA blev underkastet en anden be- 15 handling med restriktionsenzymer, og Southern hybridise- ring blev udført gentagne gange. Et DNA fragment på ca.

4 kbp, der var skåret ud med EcoRI og Xhol viste sig at indeholde et gen, der kodede for det humane G-CSF-poly- peptid. Dette DNA fragment blev undersøgt for sekvensen 20 for dets ca. 3-kbp-del ved dideoxymetoden, og nucleotid- sekvensen vist i fig. 5 blev identificeret. Dette DNA- fragment havde restriktionsenzymoverskæringstederne vist i fig. 7.

Screening af humane, kromosomale gener udførtes I 25 også under anvendelse af DNA'et opnået ud fra pBRG4 og DNA'et opnået ud fra pBRV2 som prober. I begge tilfælde I blev et DNA fragment på 1500 bp, der havde været be- handlet med EcoRI, direkte radiomærket ved "nick trans- lation" ved fremgangsmåden beskrevet ovenfor,eller al- 30 ternativt blev et DNA fragment på ca. 700 bp, der var I opnået ved successive behandlinger med EcoRI og Dral, I radiomærket ved "nick translation". De således fremstil- I lede prober blev anvendt ved plaquehybridisering, der I blev udført under de samme betingelser som beskrevet I 35 ovenfor. Udvalgte kloner blev analyseret ved Southern hybridisering til opnåelse af et DNA fragment med nu- 55 DK 175336 B1 c leo tidsekvensen vist i fig. 5. Det således opnåede plasmid kaldes pBRCE30.

Eksempel 12 5

Konstruktion af E. coli rekombinantvektor (+VSE) og transformation (under anvendelse af Tac-promotorholdig vektor.

1) Konstruktion af rekombinant vektor.

10 (i) Vektor fremstilling.

Fem mikrogram tac-promotorholdig vektor pKK223-3 (Pharmacia) blev behandlet med 8 enheder af EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) i 2 timer ved 37°C 15 i 30 μΐ af en reaktionsopløsning (40 mM Tris-HCl, 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 7 mM 2-mercaptoetha-nol.

Dernæst tilsattes 3 μΐ af en alkalisk phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.),og behandlingen udførtes 20 ved 60°C i 30 minutter. Et DNA-fragment opsamle des ved tre behandlinger med phenol, en behandling med ether og udfældning med ethanol ved rutinemetoder .

Det udvundne DNA-fragment blev opløst i en 50 μΐ 25 blanding bestående af 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2/ 10 mM DTT og 1 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP. Efter tilsætning af 3 μΐ af en E. coli-DNA-polymerase I (Klenow fragment(Takara Shuzo Co.,

Ltd.)), udførtes omsætningen ved 14°C i 2 timer 30 til dannelse af ender uden sammenbindende evne.

(ii) Fremstilling af en syntetisk linker.

Tre mikrogram oligonucleotider med syntetiske linkeres sekvenser, CGAATGACCCCCCTGGGCC og 35 CAGGGGGGTCATTCG, blev phosphoryleret ved udførsel af omsætning i 40 μΐ af en reaktionsopløsning I DK 175336 B1 I 56

(bestående af 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM

2-mercaptoethanol og 1 mM ATP) ved 37°C i 60 mi- nutter 1 tilstedeværelse af 4 enheder af T4-polynucleotidkinase.

5 Hver af de phosphorylerede oligonucleotider (0,2 μg) blev opløst i 20 μΐ af en 100 mM NaCl-holdig

TE-opløsning (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM

I EDTA) . Efter behandling ved 65°C i 10 minutter blev ollgonucleotiderne annealed ved langsom af- 10 køling til stuetemperatur.

(iii) Fremstilling af et G-CSF cDNA fragment.

H 60 mikrogram af pBRG4-plasmldet fremstillet i ek- sempel 9, som indeholdt cDNA'et vist i fig. 3 15 (A) , blev behandlet med 100 enheder af restrik- tionsenzymet Apal (New England Biolabs) og 50 enheder Oral (Takara Shuzo Co., Ltd.) ved 37°C i 3 timer i 200 μΐ af en reaktionsopløsning be-

stående af 6 mM Tris-HCl, 6 mM MgCl2, og 6 mM

20 2-mercaptoethanol. Ca. 2 μg af et Apal-Dral-frag- ment (ca. 590 bp) blev opsamlet ved 1,2% agarose- gel-elektroforese.

(iv) Ligation af fragmenter.

I 25 Ca. 0,1 μg af hver af fragmenterne fremstillet i (i) til (iii) blev opløst i 20 μΐ af en liga- I tionsopløsning (66 mM Tris-HCl, 6,6 mM MgCl2, 10 I mM DTT og 1 mM ATP) . Efter tilsætning af 175 I enheder af T4-DNA-ligase blev opløsningen holdt I 30 ved 4°C natten over til opnåelse af en rekombi- I nantvektor (fig. 8).

I 2) Transformation

Under anvendelse af 20 μΐ af en reaktionsopløsn- ing indeholdende rekombinantvektoren fremstillet i (iv)

I 35 blev E. coli βtamme JM105 transformeret ved rubidium- I

I chloridmetoden (se T. Maniatis et al., Molecular Clo- 57 DK 175336 B1 ning, p. 252 (1982)). Plasmidet blev separeret fra en ampicillinresistent kolonikultur af transformanterne og behandlet med restriktionsenzymerne BamHI, AccII og Apal for at bekræfte, at transformanterne var de tilsigtede.

5

Eksempel 13

Konstruktion af E_;_ -coli-rekombinantvektor (+VSE) og transformation (under anvendelse af PL-promotorholdig 10 vektor).

1) Konstruktion af rekombinantvektor.

(i) Vektorfremstilling.

15 100 Mg af af en PL-promotorholdig vektor, pPL-λ (Pharmacia) blev behandlet natten over ved 37°C med 50 enheder af restriktionsenzymet BamHI i 100 μΐ af en reaktionsopløsning \l0 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 10 mM DTT].

20 Ved at underkaste reaktionsopløsningen elek- troforese i 1% agarosege1 opsamledes ca. 49 pg af et fragment med ca. 4 kb og ca. 11 pg af et fragment med ca. 1,2 kb.

Fragmentet med 4 kb blev opløst i 100 μΐ af 25 en TE-puffer (se dens sammensætning ovenfor) og dephosphoryleret ved omsætning med en alkalisk phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) ved 60°C i 60 minutter.

Det andet fragment med en længde på ca.

30 1,2 kb blev opløst i 20 μΐ af en puffer (10 mM

Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 6 mM KC1 og 1 mM DTT) og behandlet natten over med 20 enheder af restriktionsenzymet MboII (New England Biolabs) ved 37eC.

35 Ved elektroforese i 4% polyacrylamidgel op samledes ca. 0,9 Mg af et BamHI-MboII-fragment I DK 175336 B1 I 58 B (ca. 200 bp) og ca. lf9 ug af et MboII-BamHI- fragment (ca. 310 bp).

(ii) Fremstilling af en syntetisk linker.

B 5 Oligonucleotider med sekvenserne for synte- I

B tiske linkere, TAAGGAGAATTCATCGAT og

B TCGATGAATTCTCCTTAG, blev phosphoryleret og I

I annealed som i (ii) i eksempel 12 til fremstil- I

I ling af en syntetisk S/D-linker. I

I 10

B (iii) Fremstilling af en ekspressionsvektor. I

B En tiendedel m9 af fragmentet med ca. 4 kb, I

0,05 pg af hver af BamHI-MboII-f ragmentet med I

B °LpL“re9ionen og MboII-BamHI-fragmentet med tL^- I

B 15 regionen [de tre fragmenter fremstillet i U)) og

B 0,1 Mg af den annealede syntetiske S/D-linker I

B fremstillet i (ii) blev underkastet omsætning I

B natten over ved 12°C 1 40 μΐ af en reaktionsop- I

B løsning (66 mM Tris-HCl, 6,6 mM MgCl2* 10 mM DTT I

B 20 og 1 mM ATP) i tilstedeværelse af 175 enhder af I

B T4-DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). 20 μΐ af I

B reaktionsopløsningen blev anvendt til transfor- I

B mation af coli-stamme N99CI+ (Pharmacia) ved I

B calciumchloridmetoden (se Molecular Cloning, I

B 25 ibid.).

B Transformanterne blev dyrket, og plasmidet I

B blev opsamlet fra kulturen af deres ampicillin- I

fl resistente kolonier. Behandling af plasmidet med I

I restriktionsenzymerne EcoRI, BamHI og Smal, viste I

30 at det var det tilsigtede plasmid. I

I 2 Mg af dette plasmid blev omsat med et re- I

striktlonsenzym Clal (New England Biolabs) ved I

37°c i 2 timer i 20 μΐ af en puffer (10 mM Tris- I

I HC1, 6 mM MgCl2 og 50 mM NaCl). Derefter blev en- I

I 35 zymet inaktiveret ved opvarmning til 65eC i 10 I

I minutter. I

59 DK 175336 B1 1 μΐ af reaktionsopløsningen blev omsat natten over ved 12°C med 175 enheder T4-DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) i en ligationsopløsning med den ovenfor beskrevne sammensætning. Reak-5 tionsopløsningen blev dernæst anvendt til trans formation af E^. coli-stamme N99cl+ (Pharmacia). Plasmidet blev opsamlet fra kulturen af ampicil-linresistente kolonier af transformanterne og behandlet med EcoRl og BamHI til bekræftelse af, at 10 dette plasmid var det tilsigtede.

(iv) Fremstilling af 6-CSF-eksprimerende rekombinant-vektor og transformanter.

Ekspressionsplasmidet fremstillet i (iii) 15 blev behandlet med en restriktionsenzym, Clal,

Efter dannelse af ender uden sammenbindende evne, blev plasmidet dernæst behandlet som i eksempel 12 til fremstilling af en rekombinantvektor, hvori et cDNA-fragment for G-CSF var indføjet.

20 Denne vektor blev anvendt til transformation af E. coli-stamme N4830 (Pharmacia Fine Chemicals) ved calciumchloridmetoden beskrevet i Molecular Cloning (ibid.). Identifikation af de ønskede transformanter blev opnået som i eksempel 12 25 (fig. 9).

Eksempel 14

Konstruktion af col i-rekombinan tvektor (+VSE) og 30 transformation (under anvendelse af trp-promotorholdig vektor).

1) Konstruktion af rekombinantvektor.

35 (i) Vektorfremstilling.

Plasmidet pOYl blev fremstillet ved indføjelse af tryptophanpromotorholdigt Hpall-Taql-frag- I DK 175336 B1 I 60

H ment (ca. 330 bp) i pBR322 ved Clal-stedet. 10 I

pg af dette plaemid blev behandlet med 7 enheder I

af restriktionsenzymet Clal og 8 enheder af I

EVu.II ved 37°C i 3 timer i 30 μΐ af en reaktions- I

5 opløsning bestående af 10 mM Tris-HCl, 6 mM I

MgCl2 og 50 mM NaCl. I

Dernæst tilsattes 2 μΐ af en alkalisk phospha- I

tase (Takara Shuzo Co., Ltd.), og omsætningen ud- I

førtes ved 60°C i 1 time. I

10 Et DNA-fragment (ca. 2,5 pg) med en længde på I

I ca. 2,6 kb blev opsamlet fra reaktionsblandingen I

ved elektroforese i 1% agarosegel. I

I (ii) Fremstilling af syntetisk linker. I

I Oligonucleotider med sekvenserne for de syn- I

I 15 tetiske linkere, CGCGAATGACCCCCCTGGGCC og I

I CAGGGGGGTCATTCG, blev phosphoryleret og annealed I

som i (ii) i eksempel 12 til fremstilling af en I

I syntetisk linker. I

I 20 (iii) Fremstilling af en rekombinantvektor. I

I Ca. 1 pg af vektorfragmentet fremstillet i I

I (i), ca. 1 pg af den syntetiske linker fremstil- I

I let i (ii) og ca. 1 pg af G-CSF-cDNA-fragmentet I

fremstillet i (iii) i eksempel 12 blev omsat med I

I 25 175 enheder af T4-DNA-ligase natten over ved 12eC I

I i 20 pi af en ligationsopløsning med sammensæt- I

I ningen beskrevet i eksempel 12, l)(iv), til op- I

I nåelse af en rekombinantvektor (fig. 10). I

I 30 2) Transformation. I

I 20 pi af reaktionsopløsningen fremstillet i (iii) I

I blev anvendt til transformation af coli DH1 ved rubi- I

I diumchloridmetoden beskrevet i Molecular Cloning, ibid. I

I Som i eksempel 12 blev plasmidet opsamlet fra I

I 35 ampicillinresistente kolonier af transformanterne, og I

I behandlingen af dette plasmid med restriktionsenzymerne I

............... . .-i·.-. -- -- / - / -’.- ''"i-;, "ivr ^νΑ>ν^-·ΜΜΜ»ΙίΙ»«ΗΜ^Μ DK 175336 B1 61

Apal, Dral, Nrul og PstI viste, at de ønskede transfor-manter blev opnået.

Eksempel 15 5 Dyrkning af transformanter..

1) Dyrkning af transformanterne (med tac) opnået i eksempel 12.

10 Transformanterne blev dyrket natten over ved 37°C, og 1 ml af kulturen sattes til 100 ml af et Luria medium indeholdende 25 pg/ml eller 50 ug/ml ampicillin.

Dyrkning . udførtes i 2-3 dage ved 37°C.

Dyrkningen fortsattes ved 37“c i 2-4 timer efter 15 tilsætning af isopropyl-ø-D-thiogalactosid til opnåelse af en slutkoncentration på 2 mM.

2} Dyrkning af transformanterne (med ) opnået i eksempel 13.

20

Transformanterne blev dyrket natten over ved 28°C, og 1 ml af kulturen sattes til 100 ml af et Luria-medium indeholdende 25 eller 50 pg/ml ampicillin. Dyrkningen udførtes i ca. 4 timer ved 28°C.

25 Dyrkningen fortsattes i 2-4 timer ved 42ec.

3) Dyrkning af transformanterne (med trp) opnået i eksempel 14. 1 2 3 4 5 6

Transformanterne blev dyrket natten over ved 2 37°C, og 1 ml af kulturen sattes til 100 ml af et M9-me- 3 dium indeholdende 0,5¾ glucose, 0,5¾ casaminosyrer 4 (Difco) og 25 eller 50 pg/ml ampicillin. Dyrkningen ud 5 førtes i 4-6 timer ved 37°C. Efter tilsætning af 50 pg/ 6 ml 3-5-indolacrylsyre (IAA), fortsattes dyrkningen i 4-8 timer ved 37°C.

I DK 175336 B1 I 62

Eksempel 16

Udvinding og oprensning af G-CSF-polypeptid fra E_^ coli.

51) Udvinding.

De tre slags transformanter dyrket i eksempel 15 H blev underkastet de følgende udvindingsprocedurer.

H 100 ml af kulturen blev centrifugeret til opnåel- 10 se af en cellepille, som blev suspenderet i 5 ml af en blanding af 20 mM Trls-HCl (pH 7,5) og 30 mM NaCl.

Dernæst tilsattes 0,2 M phenylmethylsulfonyl- fluorid, 0,2 M EDTA og et lysozym i koncentrationer på H henholdsvis 1 mM, 10 mM og 0,2 mg/ml, og man lod suspen- 15 sionen stå i 30 minutter ved 0°C.

Cellerne blev lyseret ved tre cycler af frysning/ optøning, eventuelt efterfulgt af lydbehandling. Lysatet blev centrifugeret til opnåelse af supernatanten. Alter- nativt blev lysatet behandlet med 8 M guanidin-hydro- H 20 chlorid, således at dets slutkoncentration var 6 M gua- nidinhydrochlorid, og dernæst centrifugeret ved 30.000 omdrejninger pr. minut i 5 timer, hvorefter supernatan- en opsamledes.

I 25 2) Oprensning.

I (i) Supernatanten opnået i 1) blev underkastet gelfiltrering på en U1trogel AcA54-kolonne (4,6 I cm i diameter x 90 cm i længde; LKB) ved en

I 30 strømningshastighed på ca. 50 ml/time med 0,01 M

I TrisHCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 0,15 M NaCl I og 0,01% Tween 20 (Nakai Kagaku Co., Ltd.).

I Fraktionerne, der udviste aktivitet ved ana- I lyse ved CSA-testmetoden (b) (beskrevet tidlige- I 35 re i den nærværende beskrivelse) blev udvalgt og 63 DK 175336 B1 koncentreret til et volumen på ca. 5 ml med et ultrafiltreringsapparatur, pM-10 (Amicon).

(ii) Til de koncentrerede fraktioner sattes n-pro- 5 panol (af en renhed egnet til aminosyresekvens- bestemmelse; Tokyo Kasei Co., Ltd.) og trifluor-eddikesyre, og blandingen blev oparbejdet, således at slutkoncentrationerne af n-propanol og trifluoreddikesyre var henholdsvis 30¾ og 0,1¾.

10 Man lod den oparbejdede blanding henstå i is i ca. 15 minutter og centrifugerede ved 15.000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter til fjernelse af bundfaldet. Supernatanten blev adsorberet på en μ-Bondapak C18-kolonne (semipræparativ kvali-15 tet, Waters, 8 mm x 30 cm), der var ækvilibreret med en vandig opløsning indeholdende n-propanol (se ovenfor) og trifluoreddikesyre. Kolonnen blev elueret kontinuerligt med en vandig opløsning af 0,1¾ trifluoreddikesyre indeholdende n-propanol 20 ned en lineær densitetsgradient på 30-60¾. Under anvendelse af et Hitachi Model 685-50 (HPLC-appa-rat fra Hitachi, Ltd.) og Hitachi Model 638-41 (detektor fra Hitachi, Ltd.) måltes adsorptionerne ved 220 nm og 280 nm samtidig. Efter eluering 25 blev en delmængde på 10 μΐ af hver fraktion for tyndet 100 gange, og de fortyndede blandinger blev screenet for aktive fraktioner ved CSA-test-metoden (b). Aktivitetén observeredes i toppene, der blev elueret med 40¾ n-propanol. Oisse toppe 30 blev forenet og chromatograferet igen under de samme betingelser som anvendt ovenfor, og fraktionerne blev undersøgt for deres aktivitet ved metoden (b). Igen fandtes aktiviteten i toppene for 40¾ n-propanol. Disse aktive toppe blev op-35 samlet (fire fraktioner = 4 ml) og frysetørret.

I DK 175336 B1 I 64 (iii) Det frysetørrede pulver blev opløst i 200 μΐ af en vandig 0,1%'s opløsning af trifluoreddike- syre indeholdende 40% n-propanol, og opløsningen I blev underkastet HPLC på TSK-G3000SW-kolonne 5 (7,5 mm x 60 cm; Toyo Soda Manufacturing Co.,

Ltd.). Eluering udførtes med en strømningshastig- hed på 0,4 ml/min. med en vandig 0,1%'s opløsning af trifluoreddikesyre indeholdende 40% propanol, og 0,4 ml's fraktioner blev opsamlet ved hjælp af H 10 en fraktionskollektor FRAC-100 (Pharmacia Fine

Chemicals). Fraktionerne blev undersøgt for deres CSA som beskrevet ovenfor, og de aktive fraktio- ner blev opsamlet. De blev renset yderligere på en analytisk μ-Bondapak Cle-kolonne (4,6 mm x I 15 30 cm), og hovedtoppen blev opsamlet og frysetør- I ret.

H Det således opnåede protein blev behandlet med H 2-mercaptoethanol og underkastet SDS-polyacryl- I amidgelelektroforese (15,0%) (15 mV, 6 timer).

I 20 Efter farvning oed Coomassie blå kunne det ønske- I de G-CSF-polypeptid identificeres som et enkelt

I bånd. I

I Eksempel 17 I 25

I Testning af G-CSF-aktivitet (+VSE). I

CSF-Prøven opnået i eksempel 16 blev testet ved I

I CSF-testmetoden (a) beskrevet tidligere i den nærværen- I

I 30 de beskrivelse. Resultaterne er vist i tabel l. I

DK 175336 B1 65

Tabel 1

Humane neutrofile kolo- _______nier (kolonier/skål) 5 Renset.humant G-CSF (20 na)_73_ CSF-Prøve opnået i eksempel 15_(50 nq)_68__

Blind_0_ 10 Eksempel 18

Aminosyreanalyse (+VSE).

1) Analyse af aminosyresammensætning.

15 CSF-Prøven oprenset i eksempel 16 blev hydrolyseret ved rutinemetoder, og aminosyresammensætning af proteindelen af hydrolysatet blev analyseret ved en ami-nosyreanalysemetode ved hjælp af et automatisk aminosy-20 reanalyseapparat, Hitachi 835 (Hitachi Ltd.)· Resultaterne er vist i tabel 2. Hydrolysen blev udført under de følgende betingelser: (i) 6 N HC1, i10°C, 24 timer i vakuum.

(li) 4 N methansulfonsyre + 0,2¾ 3-(2-aminoethyl)-25 indol, 110°C, 24 timer, 48 timer, 72 timer i vakuum.

Prøven blev opløst i 1,5 ml af en opløsning indeholdende 40¾ n-propanol og 0,1¾ trifluoreddikesyre. Delmængder, der hver udgjorde 0,1 ml, blev tørret med en 30 tør nitrogengas, og efter tilsætning af reagenserne opremset i (i) eller (ii) blev beholderne lukket i vakuum, hvorefter deres indhold blev hydrolyseret.

Hver af værdierne vist i tabel 2 er gennemsnit af fire målinger, 24 timers værdien for (i) og 24, 48 og 72 35 timers værdierne for (ii), bortset fra, at indholdet af Thr, Ser, M Cys, Met, Val, Ile og Trp blev beregnet ved I DK 175336 B1 I 66 H de følgende fremgangsmåder (se "Tampaku Kagaku (Protein I Chemistry) II, A Course in Biochemical Experiments, To- kyo Kagaku Dohjin):

Por Thr, Ser, H Cys og Met blev den tidsafhængi- 5 ge profil af 24, 48 og 72 timers værdierne for (il) eks- trapoleret ved 0 timer.

For Val og Ile anvendtes 72 timers værdien for I (li).

I For Trp anvendtes gennemsnittet af 24, 48 og 72 10 timers værdierne for (ii).

67 DK 175336 B1

Tabel 2

Aminosyreanalysedata

Aminosyrer Mol % 5 Asp (Asp + Asn) 2,3

Thr 4,0

See 8,5

Glu (Glu + Gin) 15,2 10 Pro 7,3

Gly 7,9

Ala 10,7 1/2 Cys 2,8 15

Val 4,5

Met 2,0

Ile 2,3 2o Leu I8>3

Tyr 1,7

Phe 3,4

Lys 2,3 25 His 2,8 '

Trp 1,1

Arg 2,9 -—i- 1 35 I DK 175336 B1 I 68 2) Analyse af N-terminale aminosyrer.

Prøven blev underkastet Edman nedbrydning ved et apparat til sekvensbestemmelse i gasfase (Applied Bio- systems), og den opnåede PTH-aminosyre blev analyseret 5 ved rutinemetoder ved hjælp af et HPLC-apparat (Beckman

Instruments) og Ultrasphere-ODS-kolonne (Beckman In-

struments) . Efter kolonnen (5 μιη; 4,6 mm i diameter x I

250 mm) var ækvilibreret med en startpuffer (en vandig I

opløsning indeholdende 15 mM natriumacetatpuffer (pH I

10 4,5) og 40% acetonitril), blev prøven (opløst i 20 μΐ af I

startpufferen) indsprøjtet, og separationen blev opnået I

ved isokratisk eluering med startpufferen. Under disse I

operationer blev strømningshastigheden holdt på 1,4 I

H ml/min. og kolonnetemperaturen på 40°C. Detektion af I

I 15 PTH-aminosyren udførtes ved anvendelse af absorption i I

det ultraviolette område ved 269 nm og 320 nm. Stan- I

dardprøver (hver indeholdende 2 nmol) af PTH-aminosyre I

I (Sigma) blev adskilt ved samme fremgangsmåde til bestem- I

melse af deres retentionstider, som blev sammenlignet I

20 med retensionstiderne for prøven med henblik på identi- I

fikation af de N-terminale aminosyrer. Som et resultat I

heraf påvistes PTH-methionin og PTH-threonin. I

I Eksempel 19 I

I 25

Konstruktion af E_j. coli-rekombinan tvektor (-VSE) og I

transformation. I

1) Under anvendelse af tac-promotorholdig vektor. I

I 30 I

I Fremgangsmåden ifølge eksempel 12 blev gentaget, I

bortset fra at "pBRG4-plasmidet fremstillet i eksempel 9 I

I og indeholdende cDNA'et vist i fig. 3 (a)" [se (iii) i I

I eksempel 12] blev erstattet med "pBRV2 fremstillet i ek- I

I 35 sempel 10 og indeholdende cDNA'et vist i fig. 4 (a)". I

I Som i eksempel 12 blev de opnåede transformanter verifi- I

I ceret som de ønskede transformanter (fig. 11). I

69 DK 175336 B1 2) Under anvendelse af PL-promotorholdig vektor.

Fremgangsmåden Ifølge eksempel 13 blev gentaget under anvendelse af cDNA (-VSE), og de opnåede transfor-5 manter blev verificeret som de ønskede transformanter (fig. 12).

3) Under anvendelse af trp-promotorholdig vektor.

10 Fremgangsmåden ifølge eksempel 14 blev gentaget under anvendelse af cDNA (-VSE), og transformanterne blev verificeret som de ønskede transformanter (fig.

13) .

15 Eksempel 20

Testning af G-CSF-aktivitet (-VSE).

De tre slags transformanter opnået i eksempel 19 20 blev dyrket ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 15.

Fra de dyrkede jE^ coli-celler blev G-CSF-polypeptider udvundet og oprenset ved fremgangsmåden beskrevet, i .eksempel 16, med det resultat, at humant G-CSF-polypeptid blev opnået som et enkelt bånd.

25 Den således opnåede CSF-prøve blev testet ved CSF-aktivitetstestmetoden (a) beskrevet tidligere. Resultaterne er vist i tabel 3.

I DK 175336 B1 I 70

I Tabel 3 I

Humane neutrofile kolonier I

____(kolonier/skål)_ I

I 5 Renset humant G-CSF (20 nq)_73_ I

I CSF-Prøve opnået i I

eksempel 19_ (50 ng)_73_ I

I Blind _0_

10 Eksempel 21 I

Aminosyreanalyse (-VSE). I

1) Analyse af aminosyresammensætning. I

I 15

Aminosyresammensætningen af CSF-prøven oprenset i I

eksempel 20 blev analyseret ved fremgangsmåden beskrevet I

i 1) i eksempel 18. Resultaterne er vist i tabel 4. I

71 DK 175336 B1

Tabel 4

Aminosyreanalysedata

Aminosyrer Mol % 5 '----:-

Asp (Asp + Asn) 2,3

Thr 4,0

Ser 8,1

Glu (Glu + Gin) 15,0

Pro 7,5

Gly 8,1

Ala 11,0 15 1/2 Cys 2,9

Val 4,1

Met 2,0

Ile 2,2 20 Leu 18,8

Tyr 1,7

Phe 3,4

Lys 2,3 25

His 2,7

Trp 1,1

Arg 2,8 30 2) Analyse af N-terminal aminosyrer.

Prøven blev underkastet analyse af de N-terminale aminosyrer ved fremgangsmåden beskrevet i 2) i eksempel 18. Som et resultat heraf påvistes PTH-methionin og PTH-35 threonin. _ I DK 175336 B1

I 72 I

I Eksempel 22 I

I Fremstilling af pHGA410-vektor (til anvendelse ved dyre- I

I celler, +VSE-linie). I

I I

I EcoRI-fragmentet fremstillet 1 eksempel 9, som I

I havde cDNA'et vist i fig. 3 (a), blev behandlet med re- I

I striktionsenzymet Dral ved 37°C i 2 timer og dernæst be- I

I handlet med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase I (Ta- I

I 10 kara Shuzo Co., Ltd.) til dannelse af ender uden sammen- I

I bindende evne. 1 μg Bglll-linker (8mer, Takara Shuzo I

I Co., Ltd.) blev phosphoryleret med ATP og bundet til ca. I

1 Mg af den separat opnåede blanding af DNA-fragmenter. I

I De bundne fragmenter blev behandlet med restriktions- I

I 15 enzymet Bglll og underkastet agarosegelelektroforese. I

Dernæst opsamledes kun det største DNA-fragment. I

I Dette DNA-fragment svarede til ca. 710 basepar I

I indeholdende en del, der kodede for humant G-CSF-poly- I

peptid (se fig. 6). Vektoren pdKCR [Fukunaga et al., I

I 20 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5086 (1984)] blev be- I

I handlet med restriktionsenzymet BamHI og derefter de- I

I phosphoryleret med en alkalisk phosphatase (Takara Shuzo I

I Co., Ltd.). Det opnåede vektor-DNA blev bundet til cDNA- I

I fragmentet med 710 bp i tilstedeværelse af T4-DNA~liga- I

I 25 se (Takara Shuzo Co., Ltd.) til fremstilling af pHGA410 I

(fig. 14). Som vist i fig. 14 indeholdt dette plasmid I

I promotoren for det tidlige SV40-gen, replikationsbe- I

I gyndelsesstedet for SV40, en del af kanin-Ø-globingenet, I

I replikationsinitieringsregionen af pBR322 og Ø-lactama- I

I 30 segenet (Ampr) opnået ud fra pBR322, med det humane I

I G-CSF-gen bundet nedstrøms for promotoren for det tid- I

I lige SV40-gen. I

73 DK 175336 B1

Eksempel 23

Konstruktion af rekombinantvektorer (+VSE) til anven-5 delse ved transformation af C127-celler.

1) Konstruktion af pHGA410 (H).

20 μς af plasmidet pHGA410 (fig. 14) fremstillet 10 i eksempel 22 blev opløst i en reaktionsopløsning bestående af 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol og 0,01% bovint serumalbumin (BSA). Restriktionsenzymet EcoRI (10-15 enheder,

Takara Shuzo Co., Ltd.) tilsattes, og reaktionsopløsnin-15 gen blev holdt ved 37°C i 30 minutter til fremkaldelse af delvis digestion med EcoRI. Dernæst blev DNA-fragmen-tet underkastet to behandlinger med en 1:1 blanding af phenol/chloroform, en behandling med ether og udfældning med ethanol.

20 Det opnåede DNA-fragment blev opløst i 50 μΐ af en opløsning bestående af 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 1° mM DTT og 1 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP.

Efter tilsætning af 5 μΐ af Klenow-f ragmentet af E. coli-DNA-polvmerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) blev opløs-25 ningen inkuberet ved 14°C i 2 timer til dannelse af ender uden sammenbindende evne.

Ved efterfølgende elektroforese i o,8%'s agarose-gel opsamledes 6 Mg af et DNA-fragment med en længde på ca. 5,8 kbp.

30 5 Mg af det opsamlede DNA-fragment blev opløst i 50 μ! af en reaktionsblanding bestående af 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP. Efter tilsætning af 2 MSF af Hindi 11-linker (Takara Shuzo Co.,

Ltd.) og 100 enheder af T4-DNA-ligase (Takara Shuzo Co., 35 Ltd.) udførtes omsætningen natten over ved 4°C.

Dernæst udførtes behandlinger med phenol og ether og udfældning med ethanol. Bundfaldet blev opløst i 30 I DK 175336 B1 I 74 μΐ af en opløsning bestående af 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 60 mM NaCl, og opløsningen blev inkuberet ved 37°C i 3 timer i tilstedeværelse af 10 enheder af

Hindlll. Efter genbehandling med T4-DNA-ligase blev det 5 resulterende DNA anvendt til transformation af Ε_^ coli- stamme OHI ved rubidiumchloridmetoden (se Molecular Clo- ning, ibid.). Fra ampicillinresistente (Ampr) kolonier af transformanterne udvalgtes celler, som indeholdt et plasmid, der var identisk med pHGA4lO, bortset fra at 10 Hindlll var indføjet ved EcoRI-stedet. Det således op- nåede plasmid blev navngivet pHGA410 (H) (fig. 15).

I 2) Konstruktion af ekspressionsrekombinantvektor pTN-G4.

15 20 ug af det således opnåede pHGA410 (H) blev op-

H løst i 50 μΐ af en reaktionsopløsning bestående af 10 mM I

I Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 175 mM NaCl, 0,2 mM EDTA, I 7 mM 2-mercaptoethanol og 0,01% bovint serumalbumin.

I Efter tilsætning af 20 enheder af Sall (Takara Shuzo I 20 Co., Ltd.) blev reaktionsopløsningen inkuberet ved 37 “c

I i 5 timer. Efter behandling med phenol og udfældning med I

I ethanol udførtes inkubering som il) i ca. 2 timer ved I

I 14ftC i tilstedeværelse af Klenow-fragmentet af DNA-poly- I

I merase (Takara Shuzo Co., Ltd.) til dannelse af ender I

25 uden sammenbindende evne. Reaktionsopløsningen blev I

I øjeblikkeligt, uden at være underkastet DNA-opsamling I

I ved agarosegelelektroforese, underkastet udfældning med I

ethanol. Det resulterende DNA-fragment blev behandlet I

I med Hindlll, og 5 g Hindlll-Sall-fragment (ca. 2,7 kbp) I

30 blev opsamlet ved elektroforese i 1% agarosegel. Et se- I

I parat trin behandledes i plasmidet pdBPV-1, der inde- I

I holdt en bovin papillomavirus (BPV) [dette plasmid op- I

nåedes ved imødekommenhed fra Dr. Howley og er beskrevet I

I i Sarver, N, Sbyrne, J. C. & Howley, P. M., Proc. Natl. I

I 35 Acad. Sci., OSA, 79, 7147-7151 (1982)], med Hindlll og I PvuXI, som beskrevet af Nagata et al. [Pukunaga, Sokawa 75 DK 175336 B1 and Nagata, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 81^, 5086-5090 (1984)] til opnåelse af et DNA-fragment med 8,4 kb.

Dette DNAf ragment med 8,4 kb og det separat opnåede Hindlll-SallDNA-fragment (ca. 2,7 kb) blev ligeret ved 5 hjælp af T4-DNA-ligase.

Ligationsproduktet blev anvendt til transformation af coli-stamme DH1 ved rubidiumchloridmetoden beskrevet i Molecular Cloning, ibid. . E_;_ coli-ko-lonier, indeholdende et plasmid med G-CSF-cDNA’et opnået 10 ud fra PH6A410, udvalgtes. Plasmidet blev navngivet pTN-G4 (fig. 15).

Adenovirus, type II [Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids, and Enzymes), 27, December, 1982, Kyoritsu Shuppan] blev behandlet på samme måde til 5 opnåelse af plasmidet ApVA, der indeholdt et Sall-Hindlll- fragment med ca. 1700 bp og indeholdende VAI og VAII, og et fragment indeholdende VAI og VAII blev udvundet fra dette plasmid. Dette fragment blev indføjet i pTNG4 ved Hindlll-stedet til opnåelse af pTNG4VAa og 20 pTNG4VAØ (fig. 15). På grund af VA-genet af adenovirus, var disse plasmider i stand til øget ekspression af et transkriptionsprodukt fra SV40’s tidlige promotor.

Eksempel 24 25

Transformation af C127-celler og G-CSF-ekspression deri (+VSE).

Inden det blev anvendt til transformation af 30 muse-C127-celler, blev pTN-G4-plasmidet opnået i eksempel 23 behandlet med restriktionsenzymet BamHI. 20 pg af plasmidet pTN-G4 blev opløst i 100 μΐ af en reaktionsopløsning [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgClj, 100 mM

NaCl, 2 mM 2-mercaptoethanol og 0,01¾ BSA] og behandlet 35 med 20 enheder af BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) efterfulgt af behandling med phenol og ether og udfældning med ethanol.

I DK 175336 B1 I

i 76 I

Muse-C127I-celler blev dyrket i et Dulbecco's I

I minimalessentielmedium indeholdende 10% bovint, foe- I

I talt serum (Gibco). C127I-cellerne, der groede på pla- I

der (5 cm diameter), blev transformeret med 10 Mg pr. I

5 plade af det separat fremstillede DNA ved calciumphos- I

phatmetoden [se Haynes, J. & Weissmann, C., Nucleic I

I Acids Res., 11_, 687-706 (1983)]. Efter behandling med I

I glycerol blev cellerne inkuberet ved 37°C i 12 timer. I

I De inkuberede celler blev overført til 3 friske plader I

10 (5 cm diameter), og mediet blev udskiftet to gange pr. I

uge. På 16. dagen blev midterpunkterne overført til I

I friske plader og underkastet seriedyrkning på et Dulbec- I

co's minimalessentielmedium indeholdende 10% bovint, I

I . foetalt serum (Gibco), for således at udvælge kloner med I

15 høj G-CSF-produktionsevne. Disse kloner producerede I

I G-CSF i en mængde på ca. 1 mg/1. Yderligere kloning gav I

anledning til kloner, der var i stand til at producere I

I G-CSF i mængder på 10 mg/1 eller mere. Foruden C127I- I

I cellerne kunne NXH3T3-celler også anvendes som værts- I

I 20 celler. I

I Eksempel 25 I

I Ekspression af G-CSF i CHO-celler (+VSE). I

I 25 I

I 1) Konstruktion af pHGG4-dhfr. I

I 20 Mg af plasmidet pHGA410 opnået i eksempel 22 I

blev opløst i 100 m1 af en reaktionsopløsning indehol- I

I 30 dende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2/ 175 mM NaCl, I

I 0,2 mM EDTA, 0,7 mM 2-mercaptoethanol og 0,01% BSA. I

Omsætningen udførtes natten over ved 37°C i tilstedevæ- I

I relse af 20 enheder af restriktionsenzymet Sall (Takara I

I Shuzo Co., Ltd.), efterfulgt af behandling med phenol og I

35 ether og udfældning med ethanol. I

I Det udfældede DNA blev opløst i 100 μΐ af en re- I

I ' aktionsopløsning bestående af 50 mM Tris-HCl, 5 mM I

77 DK 175336 B1

MgCl2* 10 mM DTT og 1 mM af hver af dATP, dCTP, dGTP og dTTP, og omsætningen udførtes ved 14ftC i 2 timer i tilstedeværelse af Klenow-fragmentet af coli-DNA-polyme-rase (10 μΐ; Takara Shuzo Co., Ltd.) og efterfulgtes af 5 behandlinger med phenol og ether og udfældning med ethanol .

En EcoRI-linker blev bundet til DNA'et i bundfaldet ved følgende metoder: DNA'et blev opløst i 50 μΐ

af en reaktionsopløsning bestående af 50 mM Tris-HCl 10 (pH 7,4), 10 mM DTT, 0,5 mM spermidin, 2 mM ATP, 2 mM

hexamin-cobaltchlorid og 20 μg/ml BSA. Omsætningen udførtes ved 4°C i 12-16 timer i tilstedeværelse af EcoRI-linker (Takara Shuzo Co., Ltd.) og 200 enheder af Γ4-DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.). Efter behandling 15 med phenol, vaskning med ether og udfældning med ethanol ved rutinemetoder, blev DNA-precipitatet udsat for partiel digestion med EcoRI, og 3 μg af et DNA-fragment med en længde på ca. 2,7 kbp blev opsamlet ved elektro-forese i 1% agarosegel.

20 Plasmidet pAdD26SVpA [Kaufman, R. 6. & Sharp, P.

A., Mol. Cell Biol., 2, 1304-1319 (1982)] blev behandlet med EcoRI og dephosphoryleret ved behandling med en bakteriel alkalisk phosphatase (BAP). Mere specifikt tilsattes 20 μg pAdD26SVpA og 20 enheder EcoRI til en re-25 aktionsopløsning [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol og 0,01¾ BSA], og omsætning udførtes ved 37°C i 10 timer. Dernæst tilsattes 5 enheder BAP til reaktionsopløsningen, og omsætningen udførtes ved 68°C i 30 minutter. Efter behandling 30 med phenol opsamledes EcoRI-fragmentet af pAdD26SVpA ved elektroforese i et udbytte på ca. 5 ug.

Fragmentet med en længde på ca. 2,7 kbp og pAdD26SVpA'et, der hver vejede 0,5 μg, blev annealed.

Det opnåede plasmid anvendtes til transformation af E^ 35 coli-stamme DHl ved rubidiumchloridmetoden, og kolonierne, indeholdende plasmidet af pHGG4-dhfr, blev udvalgt.

I DK 175336 B1 I 78

I Det opnåede plasmid blev navngivet pHGG4-dhfr (fig. I

I 16a). I

Den alternative fremgangsmåde var som følger: I

H Plasmidet pHGA410 blev behandlet med Sall og udsat for I

5 delvis digestion med EcoRI, uden nogen EcoRI-linker var I

I vedhæftet. Et DNA-fragment med en længde på ca. 2.7 kbp I

I blev opsamlet og behandlet med Klenow-fragmentet af E^ I

coli-DNA-polvmerase til dannelse af ender uden sammen- I

bindende evne. Et EcoRI-fragment med ender uden sammen- I

I 10 bindede evne blev fremstillet ud fra pAdD26SVpA som be- I

I skrevet ovenfor. Dette EcoRI-fragment og det separat I

fremstillede fragment (ca. 2,7 kbp) blev behandlet med I

I T4-DNA-ligase til fremstilling af pHGG4-dhfr. I

I pHG410 (H) fremstillet i eksempel 23 blev behand- I

I 15 let med restriktionsenzymerne Hindlll og Sall, som be- I

H skrevet i 2) i eksempel 23, og HindIII-SalI-fragmentet I

H blev bundet til EcoRI-fragmentet af pAdD26SVpA med ender I

uden sammenbindende evne, beskrevet ovenfor. Denne frem- I

I gangsmåde kunne også anvendes til fremstilling af pHGG4- I

I 20 dhfr (fig. 16b).

I 2) Konstruktion af pG4DRl og pG4DR2. I

10 Mg af plasmidet pAdD26SVpA nævnt i 1) blev op- I

I 25 løst i 50 ml af en reaktionsopløsning indeholdende 50 mM I

I Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM 2-mer-

I carptoethanol og 0,01¾ BSA. Efter tilsætning af 10 enhe- I

I der af hver af restriktionsenzymerne EcoRI og BamHI, ud- I

førtes omsætning ved 37°C i 10 timer, og den efterfulg- I

I 30 tes af behandling med phenol og vaskning med ether. I

I Et DNA-fragment på ca. 2 kb blev opsamlet ved elektro- I

I forese gennem en 1%'s agarosege1 med lavt smeltepunkt.

I Det opsamlede DNA-fragment blev behandlet med Klenow- I

fragmentet af DNA-polymerase ved rutinemetoder til dan-

I 35 nelse af ender uden sammenbindende evne. DNA-fragmenter- I

I ne med ender uden sammenbindende evne blev underkastet 79 DK 175336 B1 behandling med phenol, vaskning med ether og udfældning med ethanol.

10 μg af plasmidet pPHGA410 (H) opnået i 1) i eksempel 23 blev opløst i 50 μΐ af en reaktionsopløsning 5 indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 60 mM NaCl. Omsætningen blev udført ved 37°C i 6 timer i tilstedeværelse af 10 enheder af Hindlll. Et DNA-fragment blev opsamlet ved elektroforese gennem en 1%'s aga-rosegel med lavt smeltepunkt ved rutinemetoder. Det op-10 samlede DNA-fragment blev dernæst behandlet med BAP, og ender uden sammenbindende evne blev dannet ved behandling med Klenow-fragmentet. Efter behandling med phenol og vaskning med ether blev DNA-fragmentet bundet ved ender uden sammenbindende evne til det tidligere opnåede 15 DNA-f ragment med ca. 2 kb med en T4-DNA-ligase ved følgende fremgangsmåder: 1 μg af hvert DNA-fragment blev opløst i 30 μΐ af en reaktionsopløsning indeholdende 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl2, 5 mM DTT og 1 mM ATP, og omsætningen blev udført ved 6°C i 12 timer i 20 tilstedeværelse af 50 enheder af en T4-DNA-ligase. Ligationsproduktet blev anvendt til transformation af E_j_ co-1i-stamme DH1. Som et resultat heraf opnåedes pG4DRl og pG4DR2 vist i fig. 16c.

25 3) Transformation og ekspression.

CHO-celler (dhfr-stamme, venligst fremskaffet af Dr. L. Chasin fra Columbia University) blev dyrket i a-mlnimalessentieltmedium indeholdende 10% kalveserum 30 (o-MEN tilsat adenosin, deoxyadenosin og thymidin) i plader (9 cm i diameter, Nunc). De dyrkede celler blev transformeret ved calciumphosphatmetoden [Wigler et al.,

Cell, 14, 725 (1978)] ved den følgende fremgangsmåde.

Et bærer-DNA (kalvethymus-DNA) tilsattes i en 35 passende mængde til 1 g af plasmidet pHGG4-dhfr fremstillet i 1), og blandingen blev opløst i 375 μΐ af en I DK 175336 B1

I 80 I

TE-opløsning, hvorefter 125 μΐ 1 M CaCl2 tilsattes. I

Efter afkøling af opløsningen i is i 3-5 minutter, til- I

I sattes 500 μΐ 2 x HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl og 1,5 I

mM phsophatpuffer) til opløsningen. Efter genafkøling på I

5 is blev opløsningen blandet med 1 ml af kulturen af CH0- I

celler, overført til plader og inkuberet i 9 timer 1 en I

C02~inkubator. Mediet blev fjernet fra pladen, og efter I

vaskning med TBS (Tris-pufret saltvand), tilsætning af I

20¾ glycerolholdig TBS og vaskning igen tilsattes et I

10 ikke-selektivt medium (a-MEN-mediet beskrevet ovenfor, I

bortset fra, at det var tilsat nucleotider). Efter to I

dages inkubation overførtes en ti ganges fortynding af I

kulturen til et selektivt medium (ikke tilsat nucleoti- I

der). Dyrkningen fortsattes, idet mediet blev udskiftet I

15 med frisk,selektivt medium hveranden dag, og de resulte- I

rende kolonier blev udvalgt og overført til friske pla- I

der, hvor cellerne voksede i tilstedeværelse af 0,02 μΜ I

methotrexat (MTX), hvorefter der udførtes kloning ved I

vækst i tilstedeværelse af 0,05 μΜ MTX, hvilken koncen- I

H 20 tration senere blev øget til 0,1 μΜ. I

Transformationen af CHO-celler kan også udføres I

ved cotransformation med pH664 og pAdD26SVpA [se Scahill I

I et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 4554-4658 I

(1983)]. I

I 25 CH02~Celler blev også transformeret ved den I

følgende fremgangsmåde: pG4DRl eller pG4DR2, der var I

fremstillet i 2), blev indledningsvis behandlet med hen- I

I holdsvis Sall og Kpnl til opnåelse af DNA-fragmenter, I

og 10 pg af disse fragmenter blev anvendt til transfor- I

30 mation af CHO-celler som ovenfor. De transformerede cel- I

ler blev underkastet fortsat dyrkning i en serie af se- I

I lektive medier ved metoden beskrevet ovenfor. Ca. 7 dage I

I senere forekom mindst 100 adskilte kolonier pr. plade. I

I Disse kolonier blev overført kvantitativt til friske I

I 35 plader og underkastet fortsat dyrkning i en serie af se- I

I lektive medier i tilstedeværelse af 0,01 μΜ MTX, hvorved I

81 DK 175336 B1 godt 10 kolonier fremkom. Den samme fremgangsmåde blev gentaget, idet MTX-koncentrationen successivt blev øget til 0,02 μΜ, 0,05 μΜ og 0,1 μΜ, og de kolonier, der overlevede, blev udvalgt. Koloniselektion kunne opnås på 5 samme måde, selv når de godt 10 opnåede kolonier blev udvalgt individuelt og underkastet dyrkning ved stigende MTX-koncentrationer.

En rekombinantvektor, der Indeholder et "poly-cistrongen" kan også anvendes til transformation af CH0-10 celler. Et eksempel på denne alternative fremgangsmåde er som følger: pAdD26SVpA blev behandlet med Pstl, og de opsamlede to fragmenter blev bundet til et CSF-cDNA-fragment opnået ud fra pBRG4 til konstruktion af en rekombinantvektor, hvori adenoviruspromotoren, CSF-cDNA, 15 DHFR og poly (A)-stedet af SV40 var indføjet i den angivne rækkefølge. Rekombinantvektoren blev anvendt til transformation af CHO-celler.

Eksempel 26 20 Testning af G-CSF-aktivitet (+VSE).

Supernatanterne af kulturer af C127-celler og CHO-celler, der blev opnået i henholdsvis eksempel 24 og 25, blev indstillet til en pH-værdi på 4 med l N eddikesyre. Efter tilsætning åf et ligeså stort volumen n-pro-25 panol blev det resulterende bundfald fjernet ved centrifugering. Supernatanten blev ledet gennem en åben kolonne (1 cm diameter x 2 cm længde) fyldt med en C8-revers-fase-bærer (Yamamura Kagaku K.K.), og eluering blev udført med 50¾ n-propanol. Eluatet blev fortyndet to gange 30 med vand og underkastet revers-fase-HPLC på YMC-C8-ko-lonne (Yamamura Kagaky K.K.) efterfulgt af eluering med n-propanol (30-60¾1s lineær densitetsgradient) indeholdende 0,1¾ TFA. Fraktionerne, som blev elueret med n-propanolkoncentrationer på ca. 40¾ blev opsamlet, fry-35 setørret og opløst i 0,1 M glycinpuffer (pH 9). Som et resultat af disse procedurer, blev det humane G-CSF i C127- og CHOcellerne koncentreret ca. 20 gange.

I DK 175336 B1 B 82 B Som kontrol blev celler transformeret med plas- B mider, fri for human G-CSFcDNA, og supernatanterne af B kulturer af disse blev koncentreret ved fremgangsmåden i B beskrevet ovenfor. De humane G-CSF-aktiviteter af prø- B 5 verne blev testet ved fremgangsmåden (a) til testning af B human G-CSF-aktivitet, beskrevet tidligere. Hvis eks- B pressionseffektiviteten er tilstrækkelig høj, kan super- B natanterne af kulturerne testes direkte uden at være B koncentreret. Resultaterne er sammenfattet i tabel 5, B 1° hvori talværdierne er baseret på koncentrerede prøver.

DK 175336 B1 83

Tabel 5

Testning af human G-CSF-aktivitet ~ ' Humane neutrofile kolonier δ__kolonier/skål_

Renset humant G-CSF (20 ng)_96_

Kultur af C127-celler transformeret med pdBPV-1 0 {koncentreret 20 gange) 10 ----—— -

Bpv Kultur af 3T3-celler transformeret med pdBPV-1 0 (koncentreret 20 gange)

Kultur af C-i2 7-celler transformeret med pTNG4 82 (koncentreret 20 gange)

Kultur af 3T3-celler transformeret med pTNG4 85 (koncentreret 20 gange)

Kultur af CHO-celler 20 transformeret med pAdD26SVpA 0 (koncentreret 20 gange)_

Kultur af CHO-celler transformeret med pHGG4-dhfr 110 dhfr (koncentreret 20 gange)

Kultur af CHO-celler 25 transformeret med pG4DRl 105 ' (koncentreret 20 gange)

Eksempel 27 30 Aminosyre- og sukkeranalyse (+VSE).

1) Analyse af aminosyresammensætning.

Den rå CSF-prøve fremstillet i eksempel 26 blev 35 renset ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 2(i i i).

Den rensede CSF-prøve blev hydrolyseret ved rutinerneto- I DK 175336 B1 I 84 der, og proteindelen af hydrolysatet blev undersøgt for dens aminosyresammensætning ved en speciel aminosyreana- lysemetode ved hjælp af et Hitachi 835 automatisk amino- syreanalyseapparat (Hitachi, Ltd.). Resultaterne er vist 5 i tabel 6. Hydrolysen blev udført under de følgende be- tingelser: (i) 6 N HC1, 110°C, 24 timer i vakuum.

(il) 4 H methansulfonsyre + 0,2¾ 3-(2-amino- ethyl)indol, 110°C, 24 timer, 48 timer, 72 10 timer i vakuum.

Prøven blev opløst i en opløsning (1,5 ml) inde-

H holdende 40¾ n-propanol og 0,1¾ trifluoreddikesyre. Del- I

mængder, der hver udgjorde 0,1 ml, blev tørret med en I

tør nitrogengas, og efter tilsætning af reagenserne op-

15 remset i (i) eller (ii) blev beholderne lukket i vakuum, I

hvorefter indholdet blev hydrolyseret. I

Hver af værdierne vist i tabel 6 var et gennem- I

snit af fire målinger, 24 timers værdien for (i) og 24,

48 og 72 timers værdierne for (ii), bortset fra at ind- I

20 holdet af Thr, Ser, fc Cys, Met, Val Ile og Trp blev be- I

regnet ved de følgende metoder (se "Tampaku Kagaku I

(Protein Chemistry) II", A Course in Biochemical Experi-

ments, Tokyo Kagaku Dohjin): I

For Thr, Ser, H Cys og Met blev den tidsafhæn- I

25 gige profil for 24, 48 og 72 timers værdierne for (ii) I

ekstrapoleret til 0 timer. I

I For Val og Ile anvendtes 72 timers værdien for I

I (ii)·

I For Trp anvendtes gennemsnittet af 24, 48 og 72 I

I 30 timers værdierne for (ii). I

85 DK 175336 B1

Tabel 6

Aminosyreanalysedata 5 Aminosyrer Mol%.

Asp (Asp + Asn) 2,3

Thr 3,9

Ser 8,5 10

Glu (Glu + Gin) 15,3

Pro 7,4

Gly 7,8 j g Ala 10,8 1/2 Cys 2,8

Val 4,5

Met 1,7 20 Ile 2,3

Leu 18,6

Tyr 1,7

Phe 3,4 25

Lys 2,3

His 2,8

Trp 1,1

Arg 2,8 30 ______]_ 35 I DK 175336 B1 I 86 Η 2) Analyse af sukkersammensætning.

H En intern standard (25 nmol inositol) sattes til 200 ng af den rensede CSF-prøve anvendt ved analy- sen af aminosyresammensætningen 1). Efter tilsætning af 5 en methanolopløsning (500 μΐ) indeholdende 1,5 N HCl, udførtes omsætningen ved 90°C i 4 timer i et lukket rør renset med N2. Efter åbning af røret tilsattes sølvcar- bonat (Ag2C03) til neutralisation af indholdet. Derefter tilsattes 50 μΐ eddikesyreanhydrid, og røret blev rystet 10 i et tilstrækkeligt tidsrum. Dernæst lod man røret hen- stå natten over i mørke ved stuetemperatur. Den øvre fa- se blev puttet i et prøverør og tørret med nitrogengas.

I Methanol tilsattes til bundfaldet, og blandingen blev vasket og centrifugeret let. Den øvre fase blev puttet i I 15 samme prøverør og tørret. Efter tilsætning af 50 μΐ TMS- reagens (5:1:1-blanding af pyridin, hexamethyldisilazan og trimethylchlorsilan) udførtes omsætningen ved 40"c i I 20 minutter, og reaktionsproduktet blev opbevaret i en I dybfryser. En standard blev fremstillet ved blanding af 20 25 nmol inositol med 50 nmol af hver af galactose (Gal), N-acetylgalactosamin (Gal NAc), sialsyre og et hvilken som helst andet passende reagens.

De således fremstillede prøver blev underkastet gaschromatografisk analyse under de følgende betingel- I 25 ser: 87 DK 175336 B1

Analvsebetlnaelser

Kolonne: 2% OV - 17 VINport HP, 60-80 mesh.

3 m, glas

Temperatur: stiger fra 110 til 250°C med 4°C/ 5 min.

Bærergastryk først 1.2-1,6 kg/cm2 (N2-tryk): til sidst 2-2,5, kg/cm2 Følsomhed: 103 MQ område, 0,1-0,4 volt

Tryk: H2, 0,8 kg/cm2, luft 0,8 kg/cm2 10 Tilført prøve: 2,5-3,0 μΐ.

Som et resultat af analysen identificeredes galactose, N-acetylgatactosamin og sialsyre i CSF-prøven ifølge den foreliggende opfindelse.

15

Eksempel 28

Fremstilling af pHGV2-vektor (til anvendelse ved dyreceller, -VSE-linie).

20

EcoRI-fragmentet fremstillet i eksempel io, som indeholdt cDNA'et vist fig. 4(A), blev behandlet med restriktionsenzymet Dral ved 37°C i 2 timer og dernæst med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase i (Takara Shuzo Co., 25 Ltd.) til dannelse af ender uden sammenbindende evne. Et mikrogram Bglll-linker (8mer, Takara Shuzo Co., Ltd.) blev phosphoryleret med ATP og bundet til ca. 1 pg af den separat opnåede blanding af DNA-fragmenter. De bundne fragmenter blev behandlet med restriktionsenzymet 30 Bglll og underkastet agarosegelelektroforese. Dernæst opsamledes kun det største DNA-fragment.

Dette DNA-fragment svarede til ca. 700 basepar indeholdende en del, der kodede for humant G-CSF-poly-peptid (se fig. 6). Vektoren pdKCR [Fukunaga et al., 35 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5086 (1984)] blev be- I DK 175336 B1

I 88 I

I handlet med restriktionsenzymet BamHI og dernæst dephos- I

phoryleret med en alkalisk phosphatase (Takara Shuzo I

Co., Ltd.). Det opnåede vektor-DNA blev bundet til cDNA- I

fragmentet med ca. 700 basepar 1 tilstedeværelse af T4- I

5 . DNA-ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) til fremstilling af I

I pHGV2 (fig. 17). Som vist i fig. 17 indeholdt dette I

plasmid promotoren for det tidlige SV40-gen, den repli- I

kat ionsstartende region for SV40, en del af kanin-β- I

globlngenet, den replikationsstartende region af pBR322 I

10 og β-lactamasegenet (Ampr) opnået ud fra pBR322, idet I

det humane G-CSF-gen var bundet efter promotoren for I

I det tidlige SV40-gen. I

I Eksempel 29 I

I 15 I

I Konstruktion af rekombinantvektor (-VSE) til anvendelse I

I ved transformation af C127-celler. I

I 1) Konstruktion af pHGV2(H). I

I 20 I

I 20 Mg af plasmidet pHGV2 (fig. 17) fremstillet i I

eksempel 28 blev behandlet ved fremgangsmåden beskrevet I

I i 1) i eksempel 23 til fremstilling af et plasmid kaldt I

I pHGV2(H) (fig. 18). I

I 25 I

2) Konstruktion af ekspressionsrekombinantvektorerne I

I pTN-V2, pTNVAa og pTNVAØ. I

I Under anvendelse af 20 Mg af pHGV2{H)-plasmidet I

I 30 blev fremgangsmåden beskrevet 12) i eksempel 23 gen- I

I taget til udvælgelse af coli indeholdende et plasmid I

I med G-CSF-cDNA opnået ud fra pHGV2. Dette plasmid blev I

I navngivet pTN-V2 (fig. 18). I

I Adenovirus, type II, [Tampakushitsu, Kakusan, I

I 35 Koso (Proteins, Nucleic Acids, and Enzymes), 27, Decern- I

I ber, 1982, Kyoritsu Shuppan] blev behandlet på samme I

89 DK 175336 B1 måde til opnåelse af et plasmid, ApVA, der indeholdt et SalIHindIII-fragment med ca. 1700 bp indeholdende VAI og VAII, og et fragment indeholdende VAI og VAII blev udvundet fra dette plasmid. Fragmentet blev indføjet i 5 pTN'V2 ved Hindlll-stedet til opnåelse af pTNVAa og pTNVAØ (fig. 18). På grund af VA-genet af adenovirus, var disse plasmider i stand til forøget ekspression af et transkriptionsprodukt fra den tidlige promotor for SV40.

10

Eksempel 30

Transformation af C127-celler og G-CSF-ekspression deri (-VSE).

15 pTN-V2-Plasmidet opnået i eksempel 29 blev behandlet med restriktionsenzymet BamHI, inden det blev anvendt til transformation af muse-C127-celler.

Muse-C127I-celler blev transformeret med det så-20 ledes fremstillede DNA til eksprimering af G-CSF (se eksempel 24) , og kloner med høj 6-CSF-produktionsevne blev udvalgt. Disse kloner dannede G-CSF i en mængde på ca. 1 mg/L.

Ved yderligere kloning kunne kloner, der var i 25 stand til at danne G-CSF i en mængde på 10 mg/L, udvælges. På samme måde blev C127-celler transformeret med pTNVAa og pTNVØ, opnået i eksempel 29, og transforman-ter med kloner med høj G-CSF-produktionsevne blev udvalgt. For pTNVAa kunne kloner, der var i stand til at 30 danne G-CSF i udbytter på 20 mg/L eller mere, opnås, mens kloner med en lavere produktivitet (få mg/L) blev opnået ved transformation med pTNVAø.

Foruden C127I-cellerne kunne NIH3T3-celler også anvendes som værtsceller.

I DK 175336 B1 I

I 90 I

I Eksempel 31 I

I Ekspression af G-CSF i CHO-celler (-VSE). I

I 51) Konstruktion af pHGV2-dhfr. I

I Et DNA-fragment med en længde på ca. 2,7 kbp blev I

I fremstillet ud fra 20 μg af plasmidet pHGV2 (eksempel I

I 28) ved fremgangsmåden beskrevet il) i eksempel 25. I

I 10 Dette fragment (0,5 μg) og EcoRI-fragmentet af I

I pAdD26SVpA (0,5 μg) blev annealed. Det resulterende I

I plasmid blev anvendt til transformation af coli-stam- I

I me DH1 ved rubidiumchloridmetoden, og kolonierne inde- I

I holdende plasmidet af pHGV2-dhfr blev udvalgt. Det op- I

I 15 nåede plasmid blev navngivet pHGV2-dhfr (fig. 19a). I

I Den alternative fremgangsmåde var som følger: I

I Plasmidet pHGV2 blev behandlet med Sall og delvis dige- I

I steret med EcoRI, uden nogen EcoRI-linker var vedhæftet. I

I Et DNA-fragment med en længde på ca. 2,7 kbp blev op- I

I 20 samlet og behandlet med Klenow-fragmentet af coli- I

I DNA-polymerase til dannelse af ender uden sammenbindende I

evne. Et EcoRI-fragmeht med ender uden sammenbindende I

I evne blev fremstillet ud fra pAdD26SVpA som beskrevet I

I ovenfor. Dette EcoRI-fragment og det separat fremstille- I

25 de fragment (ca. 2,7 kbp) blev behandlet med T4-DNA-11- I

I gase til fremstilling af pHGV2-dhfr. I

I pHGV2 (H)-Plasmidet fremstillet il) i eksempel I

I 29 blev behandlet med restriktionsenzymerne, Kindlll og I

Sall, som beskrevet i 2) i eksempel 29, og Hindlll-Sall- I

I 30 fragmentet blev bundet til EcoRI-fragmentet med ender I

I uden sammenbindende evne af pAdD26SVpA, beskrevet oven- I

I for. Denne fremgangsmåde kunne også anvendes til frem- I

I stilling af pHGG4-dhfr (fig. 19b). I

91 DK 175336 B1 2) Konstruktion af pV2DRl og pV2DR2.

10 Mg af plasraidet pAdD26SVpA omtalt i 1) blev opløst i 50 ml af en reaktionsopløsning indeholdende 50 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 7 mM

2-mercaptoethanol og 0,01% BSA. Omsætningen blev udført ved 37°C i 10 timer i tilstedeværelse af 10 enheder af hver af restriktionsenzymerne EcoRI og BamHI. Behandling med phenol og vaskning med ether udførtes derfor ved ru-10 tinemetoder. Et DNA-fragment med ca. 2 kb blev opsamlet ved elektroforese gennem en 1% agarosegel med lavt smeltepunkt. Det opsamlede DNA-fragment blev behandlet med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase ved rutinemetoder til dannelse af ender uden sammenbindende evne. DNA-15 Fragmentet med ender uden sammenbindende evne blev underkastet behandling med phenol, vaskning med ether og udfældning med ethanol.

10 pg af plasmidet pHGV2(H) opnået il) i eksempel 29 blev opløst i 50 μΐ af en reaktionsopløsning in-20 deholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 7 mM MgCl2 og 60 mM NaCl. Omsætningen udførtes ved 37°C i 6 timer i tilstedeværelse af 10 enheder af Hindlll. Et DNA-fragment blev opsamlet ved elektroforese gennem en 1% agarosegel med lavt smeltepunkt ved rutinemetoder. Det opsamlede DNA-25 fragment blev dernæst behandlet med BAP, og ender uden sammenbindende evne blev dannet ved behandling med Kle-now-fragmentet. Efter behandling med phenol og vaskning med ether blev DNA-fragmentet* bundet ved enderne uden sammenbindende evne til det tidligere opnåede DNA-frag-30 ment med ca. 2 kb ved hjælp af T4-DNA-ligase ved den følgende fremgangsmåde: 1 ug af hvert DNA-fragment blev opløst i 30 μΐ af en reaktionsopløsning indeholdende 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl2. 5 mM DTT og 1 mM

ATP, og omsætningen blev udført ved 6°C i 12 timer i 35 tilstedeværelse af 50 enheder af T4-DNA-ligase. Liga-

I DK 175336 B1 I

I 92 I

I tionsproduktet blev anvendt til transformation af I

I coli-stamme DH1. Som et resultat heraf opnåedes pV2DRl I

I og pV2DR2 vist i fig. 19c. I

I 53) Transformation og ekspression. I

I CHO-Celler blev transformeret med plasmidet I

I pHGV2-dhfr til G-CSF-ekspression ved fremgangsmåden be- I

I skrevet 13) i eksempel 25. I

I 10 Transformationen af CHO-celler kan også udføres I

I ved cotransformation med pHGV2 og pAdD26SVpA. I

I CHO-Celler blev også transformeret ved den føl- I

I gende fremgangsmåde: pV2DRl eller pV2DR2, der blev frem- I

I stillet i 2), blev indledningsvis behandlet med hen- I

I 15 holdsvis Sall og Kpnl til opnåelse af DNA-fragmenter, og I

10 ug af disse fragmenter blev anvendt til transforma- I

I tion af CHO-celler som ovenfor. Transformerede celler I

I blev underkastet fortsat dyrkning i en serie af selek- I

I tive medier ved fremgangsmåden beskrevet ovenfor. Ca. 7 I

I 20 dage senere forekom mindst 100 adskilte kolonier pr. I

I plade. Disse kolonier blev overført kvantitativt til en I

I frisk plade og underkastet fortsat dyrkning i en serie I

I af selektive medier i tilstedeværelse af 0,01 μΜ MTX, I

hvorved godt 10 kolonier fremkom. Den samme fremgangs- I

I 25 måde blev gentaget, idet MTX-koncentrationen successivt I

blev øget til 0,02 μΜ, 0,05 μΜ og 0,1 μΜ, og kolonierne, I

I der overlevede, blev udvalgt. Koloniselektion kunne op- I

I nås på en lignende måde, selv når de 10 opnåede kolonier I

I blev udvalgt individuelt og underkastet dyrkning med I

I 30 stigende MTX-koncentrationer. I

I En rekombinantvektor, der indeholder et "poly- I

I cistrongen" kan også anvendes til transformation af CHO- I

I celler. Et eksempel på denne alternative fremgangsmåde I

I er som følger: pAdD26SVpA blev behandlet med PstI, og I

I 35 de opsamlede to fragmenter blev bundet til et CSF-cDNA- I

I fragment opnået ud fra pBRV2 til konstruktion af en re- I

93 DK 175336 B1 kombinantvektor, hvori adenoviruspromotoren, CSF-cDNA, DHFR og poly(A)-stedet af SV40 var indføjet i den angivne rækkefølge. Denne rekombinantvektor anvendtes til transformation af CHO-celler.

5

Eksempel 32

Testning af G-CSF-aktivitet {-VSE).

10 Ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 26 blev humant G-CSF opnået fra supernatanter af kulturer af C127-celler og CHO-celler, som var opnået i henholdsvis eksempel 30 og 31. Den humane G-CSF-aktivitet af hver af de opsamlede prøver blev testet som i eksempel 26. Re-15 sultaterne er vist i tabel 7.

I DK 175336 B1

I 94 I

Tabel 7 I

I Testning af human G-CSF-aktivitet I

Humane neutrofile I

I 5 kolonier I

_kolonier/skål_ I

I Renset humant G-CSF (20 ng)_96_ I

I Kultur af C127-celler I

transformeret med I

pdBPV-1 0 I

I 10 (koncentreret 20 gange) I

I Bpv Kultur af 3T3-celler I

I transformeret med I

pdBPV-1 0 I

(koncentreret 20 gange) I

I Kultur af Cd27*-celler I

I 15 transformeret med pTN-v2 ι07 I

I {koncentreret 20 gange) I

I Kultur af 3T3-celler I

transformeret med pTN-v.2 103 I

(koncentreret 20 gange) I

I 2o Kultur af CHO-celler I

I transformeret med pAdD26SVpA 0 I

I (koncentreret 20 gange)_ I

I Kultur af CHO-celler I

I transformeret med pHGv2~dhfr 111 I

dhfr (koncentreret 20 gange) I

I 25 Kultur af CHO-celler I

I transformeret med pV2DRl 113 I

I (koncentreret 20 gange) I

I 30 I

I 35 I

95 DK 175336 B1

Eksempel 33

Aminosyre- og sukkeranalyse (-VSE).

5 1) Analyse af aminosyresammensætning.

Den rå CSF-prøve fremstillet i eksempel 32 blev renset ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 2(iii).

Den rensede CSF-prøve blev underkastet analyse af amino-10 syresammensætning ved fremgangsmåden beskrevet il) i eksempel 27. Resultaterne er vist i tabel 8.

I DK 175336 B1 I

I 96 I

I Tabel 8 I

I Aminosyreanalysedata I

I 5 Aminosyrer Mol % I

I Asp (Asp + Asn) 2r3 I

I Thr 4,0 I

I 10 Ser M I

I Glu (Glu + Gin) 15,1 I

I Pro 7,5 I

I Gly 8,0 I

I 15 Ala 10,9 I

I 1/2 Cys 2,8 I

I Val 3,9 I

I Met 1,7 I

I 20 Ile 2,3 I

I Leu 18,9 I

I Tyr 1,7 I

I Phe 3,5 I

I 25 I

I Lys 2,3 I

I His 2,9 I

I Trp 1,2 I

I 30 Ar9 2»9 I

I 35 I

97 DK 175336 B1 2) Analyse af sukkersammensætning.

Den rensede CSF-prøve anvendt ved analyse af ami-nosyresammensætningen 11) blev også underkastet analyse 5 for dens sukkersammensætning ved samme fremgangsmåde og under samme betingelser som beskrevet i 2) i eksempel 27. Som et resultat af denne analyse verificeredes forekomsten af galactose. N-acetylgalactosamid og sialsyre i CSF-prøven ifølge den foreliggende opfindelse.

10

Eksempel 34

Konstruktion af rekombinantvektor indeholdende kromosomalt gen til ekspression i COS-celler.

15

Plasmidet pBRCE30, der blev opnået i eksempel 11, og som indeholdt det kromosomale gen vist 1 fig. 5, blev behandlet med EcoRI. pSVH+K+-plasmidet beskrevet af Banerji et al. i Cell, 2/7, 299 (1981) blev behandlet med 20 Kpnl til fjernelse af globingenet. Plasmidet blev desuden underkastet partiel digestion med Hindlll til fjernelse af en del af det sene gen af SV40. Fragmenterne blev igen bundet til fremstilling af en ekspressionsvektor pML-E+.

25 Denne vektor blev behandlet med restriktionsen zymet EcoRI og dephosphoryleret med en alkalisk phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) til opnåelse af en vektor-DNA, som blev bundet til det førnævnte kromosomale DNA ved hjælp af en T4-DNA-ligase (Takara Shuzo Co. , Ltd. ) 30 til opnåelse af pMLCE3a. Som vist i fig. 20 indeholdt dette plasmid forstærkeren for SV40-genet, replikationsbegyndelsesstedet af SV40, replikationsbegyndelsesstedet af pBR322 og Ø-lactamasegenet (Ampr) opnået ud fra pBR322, og det havde det kromosomale gen for humant 35 G-CSF bundet efter forstærkeren for SV40-genet.

I DK 175336 B1 I

I 98 I

I Eksempel 35 I

I Ekspression af kromosomalt gen for humant G-CSF i COS- I

celler. I

I 5 I

I COS-l-Celler (tilvejebragt ved imødekommenhed fra I

I Dr. Gluzman fra Cold Spring Harbor Laboratory, U.S.A.), I

I der havde været dyrket til en tæthed på ca. 70¾ i Petri- I

I skåle (9 cm diameter, Nunc) under anvendelse af et DMEM- I

10 medium (Dulbecco's modificerede Eagle's medium, der kan I

fås fra Nissui Seiyaku K.K. under varemærket "Nissui") I

I indeholdende 10¾ kalveserum, blev transformeret enten I

ved calciumphosphatmetoden [Wigler et al., Cell, 1^4, I

I 725 (1978)] eller DEAE-dextran:chloroquin-metoden [se I

I 15 f.eks. Gordon et al., Science, 228, 810 (1985)]. I

Transformation ved calciumphosphatmetoden blev I

I udført som følger: 160 pg af plasmidet pMLCE3a fremstil- I

I let i eksempel 34 blev opløst i 320 μΐ TE-opløsning, og I

I efter tilsætning af destilleret vand (3,2 ml), tilsattes I

I 20 504 μΐ 2 M CaCl2. I

I Til den resulterende opløsning sattes 4 ml 2 x I

I HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1,5 mM phosphatpuffer, I

I pH 7,12), og blandingen blev afkølet på is i 20-30 mi- I

I nutter. Den afkølede blanding sattes dråbevist til me- I

25 diet i en mængde på 1 ml pr. Petri-skål, hvor der havde I

I været vækst af C0S-1-cellerne. Efter dyrkning i 4 timer I

I ved 37°C i en C02-inkubator blev cellerne vasket med et I

I serumfrit DMEM-medium, hvorefter man lod dem henstå i I

ca. 3 minutter ved stuetemperatur i 5 ml af et DMEM- I

I 30 medium indeholdende 20¾ glycerol og igen vaskede med et I

I serumfrit DMEM-medium. Efter fjernelse af det serumfrie I

I DMEM-medium tilsattes 10 ml af et DMEM-medium indehol- I

I dende 10¾ kalveserum, og dyrkningen udførtes natten over I

I i en C02-inkubator. Efter mediet var udskiftet med et I

I 35 frisk medium af samme type, udførtes dyrkning i yder- I

I ligere 3 dage. I

I

99 DK 175336 B1

Transformation ved DEAE-dextran:chloroquinmeto-den udførtes som følger: Som ved calciumphosphatmetoden blev COS-l-celler dyrket til en densitet på 70¾ og vasket to gange med et serumfrit DMEM-medium. Til de va-5 skede celler sattes et serumfrit DMEM-medium indeholdende 250 ug/ml DEAE-dextran og 2 Mg/ml af plasmidet pMLCE3o, fremstillet i eksempel 34, og dyrkningen udførtes ved 37°C i 12 timer. Dernæst blev cellerne vasket to gange med et serumfrit DMEM-medium og underkastet yder-10 ligere dyrkning ved 37 °C i 2 timer i et DMEM-medium indeholdende 10% kalveserum og 1 mM chloroquin. Derefter blev cellerne vasket to gange med et serumfrit DMEM-medium og dyrket ved 37°C i yderligere 3 dage i et DMEM-medium indeholdende 10% kalveserum.

15 Supernatanten af den således opnåede kultur af C0S-l-celler blev indstillet til en pH-værdi på 4 med 1 N eddikesyre. Efter tilsætning af et ligeså stort volumen n-propanol blev det resulterende bundfald fjernet ved centrifugering. Supernatanten blev ledt gennem en 20 åben kolonne (1 cm diameter x 2 cm længde) fyldt med en C8-revers-fase-bærer (Yamamura Kagaku K.K.), og eluering udførtes med 50% n-propanol. Eluatet blev fortyndet to gange med vand og underkastet revers-fase HPLC på YMC-C8-kolonne (Yamamura Kagaku K.K.) efterfulgt af elu-25 ering med n-propanol (30-60% lineær densitetsgradient) indeholdende 0,1% TFA. Fraktionerne, der blev elueret ved n-propanoIkoncentrationer på ca. 40%, blev opsamlet, frysetørret og opløst i 0,1 M glycidinpuffer (pH 9).

Som et resultat af disse procedurer blev det humane 30 G-CSF i supernatanten af kulturen af COS-l-celler koncentreret ca. 20 gange.

Som kontrol blev COS-l-celler transformeret med pML-E+, der var frit for kromosomalt gen for G-CSF, ved de ovenfor beskrevne procedurer, og supernatanten af den 35 resulterende kultur blev koncentreret.

De humane G-CSF-aktiviteter af de opnåede prøver blev testet ved fremgangsmåden (a) til testning af human I DK 175336 B1

I 100 I

G-CSF-aktivitet beskrevet tidligere. Resultaterne er I

sammenfattet i tabel 9. I

I Tabel 9 I

i I

I Human neutrofile kolonier I

_(kolonier/skål)_ I

Renset humant G-CSF (20 nol_18_ I

Kultur af COS-celler trans- I

10 formeret med pML-E+ I

I (koncentreret 20-qanqe)_ 0_ I

Kultur af COS-celler trans- I

formeret med pMLCE3a I

(koncentreret 20-qanqe)_23_ I

H 15 Kultur af COS-celler trans- I

formeret med pMLCE3a I

(koncentreret 10 gange)_19_ I

Eksempel 36 I

I 20 I

RNA-Analyse af G-CSF (kromosomalt gen). I

COS-Celler, dyrket til en cellekoncentration på 8 I

I x 106 celler/plade (9 cm diameter),blev tranformeret med I

I 25 80 μg af plasmidet pMLCE3a. Efter 48 timer fremstilledes I

I det totale RNA ved fremgangsmåden ifølge Chirgwin [Bio- I

I chemistry, 18, 5294-5299 (1979)]. I

I Plasmidet pBRG4 opnået i eksempel 9 blev skåret I

I over ved hjælp af restriktionsenzymet Ahalll og det re- I

30 suiterende DNA-fragment, opnået ud fra pBRG4,blev radio- I

I mærket med [y-32P]ATP under anvendelse af T4-polynucleo- I

I tidkinase til opnåelse af et DNA-fragment med ca. 2,8 kb I

I indeholdende G-CSF-cDNA. Fragmentet blev opsamlet og an- I

vendt som en DNA-probe. Efter denaturering af DNA-pro- I

I 35 ben (1,5 x 105 c.p.m., 2,8 x 106 c.p.m./pg DNA) blev den I

I blandet med 20 μg af det totale RNA fremstillet ud fra I

101 DK 175336 B1 COS-celler. Hybridisering udførtes ved 45°C i 15 timer. Blandingen blev udsat for digestion med 200 enheder/ml eller 400 enheder/ml af Sl-nuclease (P.L. Biochemlcals) ved fremgangsmåden ifølge Weaver og Welssmann [Nucleic 5 Acid Res., 7, 1175-1193 (1979)], hvorefter den blev underkastet elektroforese i 4% polyacrylamidgel i tilstedeværelse af 8,3 M urinstof. Dernæst udførtes detektion ved autoradiografi.

Som et resultat heraf observeredes et bånd sva-10 rende til 722 bp som et stærkt radiomærket bånd i COS-celler, i hvilke et bånd svarende til 487 bp også blev påvist.

Derfor fandtes RNA'et af COS-celler at indeholde G-CSF-mRNA-molekyler af både +VSE- og -VSE-linien.

15

Eksempel 37

Aminosyre- og sukkeranalyse (chromosomalt gen).

20 1) Analyse af aminosyresammensætning.

Den rå CSF-prøve fremstillet i eksempel 35 blev renset ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 2(iii).

Den rensede CSF-prøve blev underkastet analyse af amino-25 syresammensætning ved fremgangsmåden beskrevet i 1)1 eksempel 27. Resultaterne er vist i tabel 10.

I DK 175336 B1 I

I 102 I

I Tabel 10 I

I Aminosyreanalysedata I

I Aminosyrer Mol· % I

5 ------- I

I Asp (Asp + Asn) 2,3 I

I The 4,9 I

I Ser 8,3 I

I 10 Glu {Glu + Gin) 15,3 I

I Pro 7,4 I

I Gly 7,9 I

I Ala 10,.8 I

15 I

I 1/2 Cys 2,8 I

I val 4,3 I

I Met 1,7 I

I 20 2,3 I

I Leu 18,7 I

I Tyr 1,7 I

I Phe 3,4 I

I 25 LyS 2,3 I

I Bis 2,9 I

I Trp 1,1 I

I Arg__2,9 I

I 30 2} Analyse af sukkersammensætning. I

I Den rensede CSF-prøve anvendt ved analysen af I

aminosyresammensætningen i 1) blev også underkastet ana- I

I lyse af dens sukkersammensætning ved samme fremgangsmå- I

I 35 de og under samme betingelser som beskrevet i 2) i ek- I

103 DK 175336 B1 sempel 27. Som et resultat af denne analyse verificere-des forekomsten af galactose, N-acetylgalactosamin og sialsyre i CSF-prøven ifølge den foreliggende opfindelse .

I DK 175336 B1 I

I 104 I

I Eksempel 38 I

I Ekspression af det kromosomale gen for humant G-CSF i I

I C127-celler. I

I 5 I

I Plasmidet pMLCEda opnået i eksempel 34 blev be- I

I handlet med EcoRI, og et fragment med ca. 4 kb blev op- I

I samlet ved fremgangsmåden beskrevet i Molecular Cloning, I

I ibid. Det opsamlede fragment blev anvendt som en kilde I

I 10 for det kromosomale G-CSF-gen. I

I Fragmentet blev behandlet med Klenow-fragmentet I

I af DNA-polymerase I til dannelse af ender uden sammen- I

I bindende evne (A). I

I Promotoren for SV40 (EcoRI-EcoRI-fragment med ca. I

I 15 0,4 kb) blev skåret ud fra plasmidet pHGA410 (fremstil- I

I let i eksempel 22) ved fremgangsmåden beskrevet i Mole- I

I cular Cloning, ibid., og dernæst behandlet med Klenow- I

I y fragmentet af DNA-polymerase (B). I

I Ved et separat trin blev et plasmid, pdBPV-1, I

I 20 med en bovin papillomavirus (BPV) [dette plasmid blev I

I opnået ved imødekommenhed fra Dr. Howley og er beskrevet I

I i Sarver, N., Sbyrne, J.C. & Howley, P.M., Proc. Natl. I

I Acad. Sci., USA, 79, 7147-7151 (1982)] behandlet med I

I HindiII og PvuII til opnåelse af et DNA-fragment med ca. I

I 25 8,4 kb. Dette fragment blev behandlet med Klenow-frag- I

I mentet af DNA-polymerase I og dephosphoryleret med en I

I bakteriel alkalisk phosphatase (C). I

I DNA-Fragmenterne (A), (B) og (C), der hver vejede I

I 0,1 ug, blev opløst i 20 μΐ af en reaktionsopløsning I

I 30 (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM I

I ATP), og omsætningen blev udført natten over ved 4°C I

I i tilstedeværelse af 180 enheder af en T4-DNA-ligase. I

I Reaktionsopløsningen blev dernæst behandlet ved I

I rubidiumchloridmetoden beskrevet i Molecular Cloning, I

I 35 ibid., til opnåelse af plasmidet pTNCE3a (fig. 21). I

105 DK 175336 B1

DNA-Fragmentet (A) anvendt som kilde for det kromosomale G-CSF-gen kan udskiftes med et DNA-fragment på ca. 1,78 kb, som opnås ved den følgende fremgangsmåde: 20 ug pMLCE3a opløses i 100 μΐ af en blanding af 10 5 mM Tris-HCl (pH 8,0), 7 mM MgCl2* 100 mM NaCl, 7 mM

2-mercaptoethanol og 0,01¾ BSA. Opløsningen inkuberes ved 37°C i 5 timer i tilstedeværelse af 20 enheder af Stul og underkastet elektroforese gennem 1,2¾ agarose-gel.

10 Det således opnåede plasmid, pTNCE3a blev anvendt til transformation af muse-C127 I-celler som i eksempel 24, og kloner, der eksprimerede det kromosomale gen for humant G-CSF, og som havde evne til at danne en stor mængde G-CSF, blev udvalgt.

15

Eksempel 39

Ekspression af kromosomalt gen for humant G-CSF i CHO-celler.

20

Som ved ekspression i C127-celler blev plasmidet pMLCE3a behandlet med Stul, og et DNA-fragment med ca.

1,78 kb blev udvundet. Alternativt blev det samme plasmid behandlet med EcoRI, og et EcoRI-fragment med ca. 4 25 kb blev udvundet. Begge fragmenterne var egnede til anvendelse som kilde for det kromosomale G-CSF-gen.

Kildefragmentet blev behandlet med Klenow-frag-mentet af DNA-polymerase I (a).

Som i eksempel 38 blev promotoren for SV40 30 (EcoRI-EcoRI-fragment) skåret ud fra pHGA4l0 til opnåelse af et fragment med ca. 0,4 kb, som blev behandlet på samme måde med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase (b).

I et separat trin blev plasmidet pAdD26$VpA [Kaufman, R.G. & Sharp, P.A., Mol. Cell. Biol., 2, 35 1304-1319 (1982)] behandlet med EcoRI og derefter med Klenow-fragmentet af DNA-polymerase og endelig dephos-

I DK 175336 B1 I

I 106 I

I phoryleret ved behandling med en bakteriel alkalisk I

I phosphatase (c). I

I Fragmenterne (a), (b) og (c), der hver vejede I

0,1 μς, blev opløst i 20 μΐ af en reaktionsopløsning (50 I

5 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP), I

I og omsætningen udførtes natten over ved 4°C i tilstede- I

I værelse af 180 enheder af en T4-DNA-ligase. I

I Reaktionsopløsningen blev dernæst behandlet ved I

I rubidiumchloridmetoden beskrevet i Molecular Cloning, I

I 10 ibid., til transformation af coli-stamme DH1. De re- I

I suiterende Tetr-kolonier blev screenet for dem, der in- I

I deholdt plasmidet pD26SVCE3a. I

I Som vist i fig. 22 havde plasmidet pD26SVCE3a I

I CSF-genet bundet til det tidlige gen af SV40 og dhfr-ge- I

15 net bundet efter adenovirusset1 s vigtigste sene I

I promotor. I

I Plasmidet pAdD26SVpA blev behandlet med EcoRI og I

I BamHI som 12) i eksempel 25 til opnåelse af et DNA- I

fragment (ca. 2 kb) indeholdende dhfr-genet. Dette frag- I

20 ment blev bundet til fragment (a) og EcoRI-Sall-fragmen- I

tet af pHGA410 (H) til konstruktion af en Ampr-ekspres- I

I sionsvektor, pDRCE3a (fig. 22). I

CHO-Celler blev transformeret med de således I

I opnåede plasmider pD26SVCE3a og pDRCE3a, som i eksempel I

I 25 25. Ved gentagen selektion ved vækst i tilstedeværelse I

af MTX opnåedes kloner af en G-CSF-producerende stamme. I

I Eksempel 40 I

I 30 Testning af G-CSF-aktiviteten af transformanter (der I

I eksprimerer humant kromosomalt gen). I

Supernatanterne af kulturer af C127-celler og I CHO-celler, der blev opnået i henholdsvis eksempel 38

I 35 og 39, blev oparbejdet som i eksempel 26 til opnåelse af I

I humant G-CSF, og dets aktivitet blev testet. Resultater- I

ne er vist i tabel 11.

DK 175336 B1 107

Tabel 11

Testning af human G-CSF-aktivitet

Humane neutrofile 5 kolonier _(kolonier/skål)_

Renset huroanet G-CSF_(20 na)_85_

Kultur af C127 celler tranformeret med pdBPV-1 0 10 BPV (koncentreret 20 gange)_

Kultur af C127 celler tranformeret med pTNCE3a 83 _(koncentreret 20 gange)_

Kultur af CHO-celler 15 tranformeret med pAdD26SVpA 0 koncentreret 20 gange)_

Kultur af CHO-celler dhfr transformeret med pD26SVCE3a 85 (koncentreret 20 gange)_ 20 Kultur af CHO-celler transformeret med pDRCE3a 86 _(koncentreret 20 gange) _

Eksempel 41 25

Transformanternes molekylvægt og isoelektroiske punkt.

De rensede CSF-prøver anvendt ved analyse af ami-nosyresammensætningerne i eksempel 16, 20, 27, 33 og 37 30 blev underkastet målinger af deres molekylvægte og iso-elektriske punkter ved følgende fremgangsmåder.

- - - I _^

I DK 175336 B1 I

I 108 I

I 1) Molekylvægt. I

Molekylvægten af CSF'et blev bestemt ved natrium- I

I dodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). I

I 5 Det anvendte elektroforeseudstyr var PROTEANTH (16 cm, I

produkt fra Bio-Rad Corporation), ved hvilket der anven- I

I des en gel fremstillet af en skive polyacrylamidgel I

I (T = 15%, C = 2,6%), der måler 140 mm x 160 mm x 1,5 mm, I

I og en koncentrerende gel (T = 3%, C = 20%). En denatu- I

I 10 reret CSF-prøve blev præpareret ved følgende fremgangs- I

måde: CSF blev kogt i 3 minutter i en opløsning indehol- I

I dende 2% natriumdodecylsulfat i 0,46 M 2-mercaptoetha- I

I nol. Efter udførelse af elektroforese med 4 Mg af prø- I

I ven med en konstant strømstyrke på 30 mA i 4 timer, I

I 15 blev gelen fjernet og farvet med 0,25% Coomassie Brilli- I

I ant blå R 250 (produkt fra Sigma Chemical Co.) til bånd- I

I detektion. De følgende stoffer blev anvendt som molekyl- I

H vægtmarkører efter samme behandlinger: Phosphorylase B I

I (molvægt 92.500), bovint serumalbumin (BSA, molvægt I

I 20 67.000), ovalbumin (OVA, molvægt 45.000), carboanhydra- I

I se (molvægt 31.000), soyabønnetrypsininhibitor (mol- I

vægt 21.500) og lysozym (molvægt 14.400). I

I Som et resultat heraf påvistes et enkelt bånd I

I svarende til molekylvægt på 185.000 ± 1.000 for hver af I

I 25 CSF-prøverne opnået i eksempel 16 [E^ coli/cDNA (+VSE)] I

I og eksempel 20 iE. coli/cDNA (-VSE)], og et enkelt bånd I

I svarende til en molekylvægt på 19.000 ± 1.000 blev på- I

I vist ved hver af CSF-prøverne opnået i eksempel 27 I

I [C127,CHO/cDNA (+VSE)], eksempel 33 [C127,CHO/CDNA I

I 30 (-VSE)] og eksempel 37 (COS/gDNA). I

·π-w· ,· - .. - -- ·*·.ι-«»·ηΓΛ· '»ί·. jHWW^MB— DK 175336 B1 109 2) Isoelektrisk punkt.

Det isoelektriske punkt for CSF'et ifølge den foreliggende opfindelse blev bestemt ved hjælp af et iso-5 elektrisk elektroforeseapparatur med fladt leje, FBE-3000 (produkt fra Pharmacia Fine Chemicals). Efter 2 timers elektroforese med en konstant effekt på 30 watt (Vmax = 2.000 volt) på en polyacrylamidgel (T = 5515, C = 3%, 115 mm x 230 mm) indeholdende Pharmalyte (pH * 10 4-6,5, Pharmacia Fine Chemicals) og 4M urinstof, blev CSF'et fikseret med 30¾ methanol/10¾ trifluoreddikesy-^/35¾ sulfosalicylsyre og farvet med Coomassie Brilliant blå R-250. Et Low pi-sæt (pH: 2,5-6,5, produkt fra Pharmacia Fine Chemicals) anvendtes som markør af iso-15 elektrisk punkt.

Analyse af båndseparation ved en pH-værdi fra 4 til 6,5 gav et enkelt bånd svarende til pi = 6,1 for hver af CSF-prøverne opnået i eksempel 16 og 20 og tre adskilte bånd svarende til pi = 5,5, 5,8 og 6,1 for hver 20 af CSF-prøverne opnået i eksemplerne 27, 33 og 37.

Eksempel 42

Beskyttende virkning af humant G-CSF mod mikrobiel in-25 fektion.

Testmetode 1. Beskyttelse mod infektion med Pseudomonas aeruginosa.

30

Endoxan (varemærke fra Shionogi & Co., Ltd.) blev administreret intraperitonealt til 8-9 uger gamle ICR-mus (hanlige, 35,3 ± 1,38 g kropsvægt) i en dosis på 200 mg/kg. Musene blev dernæst inddelt i tre grupper, og to 35 grupper fik fire subkutane injektioner (hver med 0,1 I DK 175336 B1 I 110 ml's dosis) med 24 timers intervaller af et opløsnings- middel [l% propanol og 0,5% (vægt/vol) museserumalbumin

i fysiologisk saltvand] indeholdende humant G-CSF

(25.000 eller 50.000 enheder/mus), mens den tredie grup- 5 pe kun fik indgivet opløsningsmidlet ved samme program.

Tre timer efter den sidste injektion blev musene i hver gruppe inficeret med Pseudomonas aeruginosa GNB-139 ved subkutan injektion (3,9 x 105 CFU/mus). 21 Timer efter inficeringen fik de to første grupper en anden subkutan

10 injektion af opløsningsmidlet indeholdende humant G-CSF

(25.000 eller 50,000 enheder/mus) og den sidste gruppe fik kun indgivet opløsningsmidlet.

Den beskyttende effekt af humant G-CSF blev un- dersøgt ved at tælle antallet af levende mus 10 dage 15 efter inficeringen.

Fremstilling af cellesuspension

Pseudomonas aeruginosa GNB-139 blev dyrket natten 20 over tinder omrystning ved 37°C i. et Heart Infusion liqu- id medium (varemærke fra Difco). Kulturen blev suspen- deret i en fysiologisk saltopløsning.

2) Beskyttelse mod infektioner med Candida 25 I Endoxan (varemærke fra Shionogi & Co., Ltd.) blev administreret intraperitonealt til 8 uger gamle ICR-mus (hanlige, kropsvægt på 40,5 ± 1,60 g) i en dosis på 200 I mg/kg. Musene blev dernæst inddelt i to grupper. Den ene I 30 gruppe fik fire subkutane injektioner (hver med en 0,1 I ml's dosis) med 24 timers intervaller af et opløsnings- middel [l% propanol og 10% (vægt/vol) ICR-museserum i

fysiologisk saltopløsning] indeholdende humant G-CSF

(50.000 enheder/mus), mens den anden gruppe kun fik ind- I 35 givet opløsningsmidlet efter det samme program. 4 Timer efter den sidste injektion, blev musene i begge grupper 111 DK 175336 B1 inficeret med Candida albicans 0-50-1 (stamme isoleret fra urin fra leukæmipatienter, tilvejebragt ved imødekommenhed fra Bacteriological Laboratory, Tohoku University, School of Medicine) ved intravenøs injektion (5,6 5 x 101 2 3 4 CFU/mus). Den beskyttende virkning af humant G-CSF blev undersøgt ved tælling af antallet af levende mus 10 dage efter inficeringen.

Fremstilling af cellesuspension.

10

Candida albicans 0-50-1 blev dyrket natten over under omrystning ved 37°C i et gærekstraktholdigt Sabou-raud-flydende medium (2¾ dextrose fra Junsei Pure Chemicals Co., Ltd.; 10¾ tryptocasepepton, varemærke fra 15 BBL, 5¾ gærekstrakt fra Difco; pH 5,6). Kulturen blev vasket to gange med fysiologisk saltopløsning og suspenderet i fysiologisk saltopløsning.

Beskyttelse mod infektioner med intrace1lulær, para-20 sitisk Listeria.

2

Endotoxan (varemærke fra Shionogi & Co., Ltd.) blev administreret intraperitonealt til 7 uger gamle ICR-mus (hanlige, kropsvægt 34,7 ± 1,24 g) i en dosis på 200 mg/kg. Musene blev dernæst inddelt i to grupper. Den 25 ene gruppe fik fire subkutane injektioner (hver med 0,1 ml's dosis) med 24 timers intervaller af et opløsningsmiddel [1¾ n-propanol og 10¾ (vægt/vol) ICR-museserum i fysiologisk saltopløsning] indeholdende humant G-CSF (50.000 enheder/mus), mens den anden gruppe kun fik ind-30 givet opløsningsmidlet efter samme program. 4 Timer ef 3 ter den sidste injektion blev musene i begge grupper in 4 ficeret med Listeria monocytogenes 46 (tilvejebragt takket være Microbiological Laboratory, Tohoku University, I DK 175336 B1 I 122

I Fremstiling af cellesuspension. I

Listeria monocytogenes 46 blev dyrket natten over I under omrystning ved 370C i et Brain-Heart Infusion 11-

“5 quid medium (varemærke fra Difco). Kulturen blev suspen- I

deret i fysiologisk saltopløsning.

Resultater

10 i) Testerne 1, 2 og 3 udførtes med E^_ coli-G-GSF

(+VSE)-polypeptidet opnået i eksempel 16. Resultaterne er vist i tabel 12, 13 og 14.

Tabel 12 I 15 I Virkning mod Pseudomonas aeruginosa I Gruppe CSF -koncentration Levende mus/ enheder/mus/dag behandlede mus

I Opløsningsmiddel 0 Q/lQ

20------ I CSF-holdigt opløsningsmiddel 25,000 6/10 I CSF-holdigt opløsningsmiddel 50,000 8/10 I Tabel 13 I 25

Virkning mod Candida albicans I Gruppe CSF-koncentration Levende mus/ I enheder/rus/dag behandlede mus I Ooløsningsmiddel 0 0/10 30 —I------ I CSF-holdigt opløsningsmiddel 50,000 10/10 I 35 DK 175336 B1 113

Tabel 14

Virking mod Listeria monocytogenes 5 Gruooe CSF-koncentration Levende nus/ PP _ enheder/mus/dag bilede tos ·

Opløsningsmiddel _ 0 0/10 CSF-holdigt opløsningsmiddel 50,000 10/10 10 li) Test 1 udførtes med coii-G-CSF (-VSE)-poly- peptidet opnået i eksempel 20. Resultaterne er vist i tabel 15.

15

Tabel 15

Virkning mod Pseudomonas aeruginosa

Gruppe CSF-koncentration Levende mus/ enheder/nus/dag behandlede mus

Opløsningsmiddel 0 0/10 CSF-holdigt opløsningsmiddel 25,000 6/10 CSF-holdigt opløsningsmiddel 50,000 8/10 25 -- iii) Test 1 blev udført med en renset prøve af human G-CSF (+VSE) opnået ud fra CHO-celler, hvilken prøve var den samme som den, der anvendtes ved analyse af amino-30 syresammensætningen i eksempel 27. Resultaterne er vist i tabel 16.

I DK 175336 B1 I 114

I Tabel 16 I

Virkning mod Pseudomonas aeruginosa I

Gruppe CSF-koncentration Levende mus/ I

5 enheder/nus/dag behandlede mus I

Opløsningsmiddel 0 0/10 I

CSF-holdigt opløsningsmiddel 25« 000 9/10 I

I CSF-holdigt opløsningsmiddel 50,000 10/10 I

10 I

I det væsentlige samme resultater opnåedes, når I

test 1 udførtes med en prøve af renset humant G-CSF op- I

nået ud fra Ci27-celler, hvilken prøve var den samme som I

den, der blev anvendt ved analyse af aminosyresammensæt- I

15 ningen i eksempel 27. I

iv) Test 1 blev udført med en prøve af renset humant I

I G-CSF (-VSE) opnået ud fra CHO-celler, hvilken prøve var I

den samme som den, der blev anvendt ved analyse af ami- I

nosyresammensætningen i eksempel 33. Resultaterne er I

20 vist i tabel 17. I

I Tabel 17

Virkning mod Pseudomonas aeruginosa

Λ C* I

° Gruppe CSF-koncentration Levende mus/ enheder/mus/dag behandlede mus I Opløsningsmiddel q 0/10 CSF-holdiqt opløsningsmiddel 25,000 9/10 30 CSF-holdigt opløsningsmiddel 50,000 10/10 I det væsentlige samme resultater blev opnået,

I når test 1 udførtes med en prøve af renset humant G-CSF

I opnået ud fra C127-celler, hvilken prøve var den samme I 35 som den, der blev anvendt ved analysen af aminosyresam- I mensætningen i eksempel 33.

Claims (24)

115 DK 175336 B1

1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for et polypeptid med virkning som human gra-nulocytkolonistimulerende faktor, og at den koder for hele eller en del af polypeptidsekvensen vist nedenfor: 5 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gin Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gin Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gin Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu

10 Leu Lys Cys Leu Glu Glit Val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu (Val Ser Glu)mCys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly Bis Ser Leu Gly i Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser

15 Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu . Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gin Gin Met

20 Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala, _ Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 25 (hvori m er 0 eller 1).

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den koder for hele eller en del af polypeptidsekvensen vist nedenfor: I DK 175336 B1 I 116 I Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin val Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu I Lys Leu (Val Ser GluJ^Cys Al* Thr Tyr Lys Leu I 5 Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His I Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser ! I Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys I Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr H Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser 10 pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin 1 Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp I Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe I Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val

15 Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin I Pro (hvori m er 0 eller 1).

3. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendeteg- 20. e t ved, at den har hele eller en del af nucleotid- sekvensen vist nedenfor: I 25 30 I 33 — —-—assE3·^-2--· . , Uv.j--·.· •'.'τ: DK 175336 B1 117 ATG GCT GGA CCT, GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG I GGC CCT GCC AGC TCC CTQ- CCC CAG AGC TTC CTG

5 CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG (GTG I AGT GAG)fflTGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC ' GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC .

10. CAG GCC CTG CAG CTG' GCA GGC TGC TTG AGC CAA ' CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC , CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG ! GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG

15 GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC . ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT 'CTG' CAG AGC TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC . CTT GCC CAG CCC 20 (hvori m er 0 eller 1).

4. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har hele eller en del af nucleotidsekvensen vist nedenfor: 25 1 35 I DK 175336 B1 I 118 I ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC C TG CCC C AG I AG C TTC CTG CTC AAG TG C TTA GAG C AA G TG AGG I A AG ATC C AG GGC GAT GGC GCA G CG CTC CAG GAG I AAG CTG (GTG AGT GAGJJTGT GCC ACC TAC AAG CTG S m TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC I TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC C AA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC I CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG G AA GGG ATC TCC 10 CCC GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG A TG G AA G AA CTG GGA A TG GCC CCT GCC H CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG TOG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG I CCC (hvori m er 0 eller 1). I 20 5. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at I den koder for et polypeptid med virkning som human gra- nulocytkolonistimulerende faktor, og at den har hele el- ler en del af nucleotidsekvensen vist i fig. 3(A).

6. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at I 25 den koder for et polypeptid med virkning som human gra- I nulocytkolonistimulerende faktor, og at den har hele el- ler en del af nucleotidsekvensen vist i fig. 4(A).

7. DNA-sevens, kendetegnet ved, at den I koder for et polypeptid med virkning som human granulo- I 30 cytkolonistimulerende faktor, og at den har hele eller I en del af nucleotidsekvensen vist i fig. 5.

8. DNA-sekvens ifølge et vilkårligt af kravene I 1-7, kendetegnet ved, at det er bundet til et I replikon opnået ud fra en mikroorganisme eller en virus. -^ =3—II -J_I_2-· -^gTO'^Wgl:·-- · DK 175336 B1 119

9. Rekombinantvektor, kendetegnet ved, at den indeholder en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med virkning som human granulocytkolonistimu-lerende faktor, og at DNA-sekvensen er en sekvens ifølge 5 et vilkårligt af kravene 1-7.

10. Rekombinant vektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den skal anvendes sammen med EL co-li.

11. Rekombinantvektor ifølge krav 9, kende-10 t egn e t ved, at den skal anvendes sammen med dyreceller. 12. coli-rekombinantvektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen koder for hele eller en del af polypeptidet vist nedenfor: I DK 175336 B1 I 120 I Het Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro I Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val I Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin I Glu Lys Leu (Val Ser Glu^Cys Ala Thr Tyr Lys

5 Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly I Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile H 10 ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile H Trp Gin Gin Het Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro H Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Het Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly 15 val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg Bis Leu Ala Pro H 20 (hvor m er 0 eller 1).

13. Transformant, kendetegnet ved, at den indeholder en rekombinant vektor indeholdende en DNA-sekvens, der koder for et polypeptid med virkning som human granulocytkolonistimulerende faktor, og at I 25 DNA-sekvensen er en DNA sekvens ifølge et vilkårligt af I kravene 1-7. 14. el coli-transformant ifølge krav 13, k e n - detegnet ved, at den opnås ved transformation I med en EL coli-rekombinantvektor. 15. isoleret dyrecelletransformant ifølge krav 13,kendetegnet ved, at den opnås ved trans- I formation med en rekombinantvektor til anvendelse sammen med dyreceller. 121 DK 175336 B1 16. coll-transformant Ifølge krav 13, ken detegnet ved, at den opnås ved transformation med coll-rekomblnantvektoren Ifølge krav 12.

17. Fremgangsmåde til fremstilling af et poly-5 peptid eller glycoprotein med virkning som human granu- locytkolonistimulerende faktor, kendetegnet ved, at den omfatter, at man: a) opnår en DNA-sekvens ifølge et vilkårligt af kravene 1-7, der koder for et polypeptld med human granulo- 10 cytkolonistimulerende aktivitet, b) fremstiller en rekombinantvektor, hvori denne DNA-sekvens er indføjet, c) transformerer værtsceller med denne vektor, d) dyrker transformanterne, og 15 e) udvinder det ønskede polypeptid eller glycopro tein fra kulturerne.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kende tegnet ved, at vektoren er en E^_ coli-rekombi-nantvektor ifølge krav 12.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kende tegnet ved, at polypeptidet er repræsenteret ved hele eller en del af aminosyresekvensen vist i krav 12.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kende tegnet ved, at glycoproteinet omfatter en sukker-25 kædedel og et polypeptid, der er repræsenteret ved hele eller en del af aminosyresekvensen vist i krav 2.