BG60840B2

BG60840B2 - Сднк клонове кодиращи полипептиди,проявяващи активността на клетъчни растежни фактори за човешки гранулоцити,макрофаги и еозинофили

Info

Publication number: BG60840B2
Application number: BG98563A
Authority: BG
Inventors: Takashi Yokota; Frank Lee; Donna Rennick; Ken-Ichi Arai
Original assignee: Schering Biotech Corporation
Priority date: 1984-11-20
Filing date: 1994-02-24
Publication date: 1996-04-30
Also published as: PT81513A; ATE82321T1; ES8705470A1; AU5196386A; LU88360I2; AU608741B2; KR860700359A; IE59581B1; CN85109132A; GR852786B; ZA858833B; NL930120I1; ES548998A0; NL930120I2; DK345286A; FI862674A; FI103986B1; JP3038348B2; DK174598B1; IL77080A0

Abstract

Полипептидите имат ценни фармакологични свойства и намират приложение като лекарствено средство. Тепроявяват колоний стимулираща активност за човешки неутрофилни гранулоцити, макрофаги и еозинофили.Полипептидите са със структура, посочена в описанието. Изобретението се отнася също до метод за получаването им, до секвенция от нуклеинови киселини, кодираща полипептида, до вектор, съдържащ тази секвенция, и до микроорганизъм или клетка, трансформирана или трансфектирана с реплициращия се вектор.

Description

Изобретението се отнася до приложението на рекомбинантни ДНК-технологии за изясняване контролните механизми на имунния отговор при бозайници и по-конкретно за изолиране на клонове нуклеинови киселини, които кодират полипептиди, проявяващи активността на растежния фактор за човешки гранулоцити/макрофаги, включително еозинофилният растежен фактор.

Рекомбинантните ДНК-технологии се отнасят главно до техниките на интегриране на генетична информация от даден донор във вектори за провеждане на съответни процедури, като например въвеждане в определен гостоприемник, където пренесената генетична информация се копира и/или експресира в новата среда. Най-общо, генетичната информация съществува под формата на комплементарна ДНК /сДНК/, получена от информационна РНК /шРНК/. Носителят обикновено е плазмид, имащ способността да инкорпорира сДНК за по-късна репликация в гостоприемник и в някои случаи да контролира експресията на сДНК и следователно да насочва синтеза на кодирания продукт.

Тази технология се развива мйого бързо през последните години и редица екзогенни белтъци се експресират в различни гостоприемници. Например някои еукариотни белтъци, продуцирани от рекомбинантни ДНК-технологии включват: проинсулин /Naber,S. et al., Gene 21; 95-104, 1983; иптерферони (Simon, L. et al., Proc.Nat.Acad. Sci. US 80, 2059-2062, 1983 and Derynck R. et al., Nature 281; 544-548, 1979) и растежен фактор за мастни клетки (Yokota, Т. etal., Proc. Nat.Acad. Sci US 81, 1070-1074, 1984).

За известно време се е считало, че имунният отговор при бозайници се дължи главно на серия от сложни клетъчни взаимодействия, наречени имунна мрежа. Доколкото е ясно, че голяма част от имунния отговор се дължи на “мрежоподобни” взаимодействия между лимфоцити, макрофаги, гранулоцити и други клетки, имунолозите поддържат мнението, че разтворими белтъци от типа на лимфокините играят важна роля при тези клетъчни взаимодействия.

Лимфокините играят ролята на медиатори в редица клетъчни процеси. Те могат да поддържат пролиферацията и растежа на различни хематопоетични първични клетки и се смята, че играят съществена роля при основната диференциация на плурипотентните, хематопоетичните първични клетки в множеството прогенитори от различните клетъчни линии, отговорни за имунния отговор. Клетъчните линии, които са важни за този отговор, включват два класа лимфоцити: В-клетки, които могат да продуцират и секретират имуноглобулини (белтъци, които могат да разпознават и да свързват чужди тела с цел премахването им) и Т-клетки, които по различни механизми индуцират или подтискат В-клетките и някои други клетки включващи Т-клетки изграждащи имунната мрежа.

Друг важен тип бели кръвни телца са фагоцитите, главно полиморфонуклеарни и мононуклеарни лимфоцити. Тези клетки са специализирани в елиминирането, по-специално да подпомагат отстраняването на чуждите организми, както и премахването на нефункциониращите клетки и клетъчни отпадъци.

Към левкоцитния тип клетки се пречисляват гранулоцитите, които включват неутрофилите и еозинофилите. Неутрофилите могат да бъдат открити в периферната кръв, главно в тези части на тялото, които са в контакт с околната среда. Техните фагоцитни функции в отговор на микробни инвазии са добре изучени (Klebanoff.S. and Clark R. The neutrofil Functions and clinical Disorbers, Elsevier/North Holland Biomedical Prep., Amsterdam 1978), като разрушаването на погълнатите чужди организми става чрез освобождаването на вакуоли с различни антимикробни агенти (напр. кислородни радикали, прекиси и халогенни йони). Много по-малко се знае за еозинофилите, които имат връзка с алергиите и някои паразитни болести.

Макрофагите се различават от гранулоцитите по това, че те развиват различни качества в зависимост от заобикалящата ги тъкан. Така например тъканните макрофаги включват хистиоцити в съединителната тъкан, Купферови клетки в черния дроб, алвеоларни макрофаги в сливиците, остеоцити в костите, микробни клетки в нервната система, Лангерхаусови клетки в кожата, а така също и свободни или фиксирани клетки в други органи. Освен фагоцитиращите способности, макрофагите могат да секретират важни биологично-активни вещес тва като лизозим, плазминоген активатор, колагеназа, еластаза, кисели хидролази, комплементи, простагландини, ендогенен пироген, някои лимфокини и кислородни метаболити. Освен това, смята се, че макрофагите регулират достъпа на антигени до В и Т лимфоцити (Cline,М., The White Cell, Harvard University Press, Cambridge, Mass, 1975).

Изучаването на неутропенията, лимфопенията, моноцитопенията и левкемията, както и други имунни нарушения, чрез изследването на макрофагите, гранулоцитите и други клетки, участващи в имунния отговор, е затруднено поради необходимостта клетките да се отглеждат in vitro. Някои автори установиха, обаче, че много такива клетки могат да се изолират и в някои случаи да се култивират върху секрети от други клетки, например кондиционирана среда от спленоцити, стимулирани с конканавалин A (Con А). От това изследване става ясно, че създаването на клетъчни клонове зависи от специфични фактори, например лимфокини.

Очевидно, почти всички типове кръвни клетки се генерират в костния мозък на възрастни гръбначни, чрез растеж и диференциация на йерархията от хематопоетични прогениторни клетки. На върха на тази йерархия са плурипотентните първични клетки, които могат отново да населят едно облъчено с летална доза животно с повечето, ако не с всички клетъчни хематологични типове (например еритроцити, тромбоцити, лимфоцити, разлйчни гранулоцити и моноцити/макрофаги). Плурипотентната клетка може не само да генерира плурипотентни първичноклетъчни подразделения, но също така дава начало на прогениторни клетки, свързани със специален начин на метаболизъм. Прогениторните клетки, специално свързани с първични клетки, показват същото предназначение като родителските клетки. (Metcalf, D., Hemopoetic Colonies, Springer Publishing Co., New York, 1977).

In vitro изследванията върху хематопоезата показват, че редица разтворими фактори могат да регулират растежа и диференциацията на тези клетки. Някои от тези фактори са частично пречистени и показват, че специфично повлияват първични клетки, принадлежащи към определен клетъчен вид. Например, еритропоетинът от бъбрек стимулира по-диференцираните клетки от еритроидната йерархия (Miyake, Т. et al., J, Biol.Chem., 252, 5558,1977), а актив ността, стимулираща колониите, продуцирани в Т-клетки и макрофаги, стимулира предимно нарастването на гранулоцити и макрофаги в култури от клетки на костен мозък (Stanley, Е. & Heard, Р. J. Biol.Chem., 252, 4304, 1977). Друг тип растежен фактор стимулира хематопоетичните колонии, състоящи се от един или няколко типа клетки. Такива клетки като прееритроцити, мегакариоцити, гранулоцити и моноцити/макрофаги показват, че реагират на този втори вид фактори (Iscove, N. et al., J.Cell Physiol.Suppl., 1, 65-78, 1982).

Факторите, стимулиращи колониите, се намират в няколко молекулни форми, които се обединяват в групата на т. нар. колонии-стимулиращи фактори (CSF). CSF представлява група от гликопротеини с молекулно тегло между 20 000 и 70 000 далтона, които могат да се намерят циркулиращи в кръвта или в урината. Факторите, които могат да стимулират формирането на колонии от гранулоцити и макрофаги са известни като GM-CSF (за справка - Metcalf,

D., Hematopoetic Colonies; In vitro Cloning of Normal and Leukemic Cells; Springer Publishing Co., New York, 1977).

Докато мишите и човешки GM-CSF са частично преочистени и описани в биохимично отношение, в литературата има големи несъответствия при данните за молекулните им тегла, както и за спектъра на активностите им (Metcalf, D., Hematopoetic Colony Stimulating Factors in Handbook of Experimental Pharmacology, 57, 343384, Springer Verlag, New York, 1978). Успешното клониране на сДНК, кодираща определена активност от типа GM-CSF, може да даде отговор на някои от тези въпроси (Gough, N. et al., Nature 309, 763-767, 1984). Съществуват данни и за подобни изследвания при хора (Das, S. et al., Blood 58, 630-641, 1981, и Nicola, N. et al., Blood, 54, 614-627, 1979). Всъщност дори при in vitro транслация на и РНК (mRNA), изолирана от Т-лимфоцити (US 4438032), кодираща човешки GM-CSF (Lisis, A. et al., Nature 298, 75-77, 1982), неяснотата около човешкия CSF продължава да съществува (Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, pgs. 93-124, Academic Press, New York, 1984).

Въпреки че различията в молекулните тег-. ла могат отчасти да се обяснят с вариации в нивото на гликозилиране, изясняването на този въпрос, както и на целия спектър от активности на една определена молекула изисква допълни телни структурни данни, например пълен секвенционен анализ на въпросната молекула. Белтъчното секвениране предлага добри възможности за решаване на тези проблеми, но това е трудна работа в експериментално отношение, а и понякога получените данни не дават пълна и точна информация за аминокиселинната последователност. Освен това, ако е възможно да се получат по-значителни количества от полипептида, показващ човешка GM-CSF - активност, това в голяма степен ще улесни изучаването на биологическите механизми, включващи гранулоцити, макрофаги и други клетки, участващи в имунния отговор. Пълна информация за точната секвенция на който и да е човешки CSF би допринесло за опростяване на търсенето на нови и различни имунологични фактори. Освен това, допълнителна информация за които и да са лимфокини би помогнала да се изясни ролята на различни растежни фактори и клетки от имунната мрежа.

Следователно, очевидна е необходимостта от по-пълни данни за кодиращата нуклеотидна секвенция на ДНК и аминокиселинната секвенция на белтъците, проявяващи човешка GMCSF - активност, както и от един несложен и икономичен метод, чрез който се получават тези вещества в значително количество и в чист вид. Настоящото изобретение отговаря на тези условия.

Съгласно изобретението се ^юлучават ДНК-клонове, кодиращи полипептиди, които имат човешка GM-CSF - активност. Нуклеотидната секвенция на сДНК и съответната аминокиселинна секвенция на съответния полипептид са показани на фигура 1. Тази сДНК може да бъде интегрирана в различни вектори, които на свой ред могат да насочват синтезата на съответните полипептиди в различни гостоприемници.

Изобретението предлага метод за получаване на полипептиди, имащи човешка GMCSF - активност, като процесът се състои от следните етапи:

а/ получаване на вектор, съдържащ нуклеотидни секвенции, кодиращи въпросния полипептид, като нуклеотидната секвенция може да се експресира в гостоприемник, съдържащ вектора;

б/ включване на вектора в гостоприемника;

в/ съхраняване на гостоприемника в условия, подходящи за експресиране на нуклеотидна та последователност в съответния полипептид.

За предпочитане е сДНК-секвенциите да се получат от тРНК, кодираща белтъци от нетрансформирани човешки Т-клетки и гостоприемникът да е еукариотен организъм, например клетки от бозайници, трансфектирани или трансформирани с вектор. Добре е освен това векторът да съдържа и втора нуклеотидна секвенция, която може да контролира експресията на полинуклеотида, кодиращ полипептида. Тази втора нуклеотидна секвенция може да включва промоторна секвенция, една или няколко интронни секвенции и полиаденилираща секвенция, за да позволи съответно транскрипция, сплайсинг и полиаденилиране на нуклеотидната секвенция, кодираща полипептида. Особено когато гостоприемникът е клетка от бозайник, например COS-7 клетки от бъбрек на маймуна, векторът съдържа промоторна секвенция от вируса SV 40, както и полиаденилираща секвенция от същия вирус.

Човешката сДНК-секвенция от фигура 1 може да хибридизира с друга ДНК-секвенция, като например ДНК кодираща други растежни фактори при бозайници от сДНК или геномни библиотеки. Установено е, че описаните сДНКсеквенции съдържат информация за водеща секвенция.

Полипептидите, използвани в това изобретение, могат да стимулират растежа на човешки неутрофилни гранулоцити, макрофаги и други клетки (например еозинофили) главно в култури in vitro. Подходящи фармацевтични смеси могат да бъдат получени чрез прибавяне на тези полипептиди, препаратите от които практически не съдържат други човешки растежни фактори, към терапевтично съпоставими носители.

Някои допълнителни качества и предимства на това изобретение ще бъдат изяснени от детайлното описание, което следва по-долу, и дава допълнителни данни за изобретението в комбинация със съответни илюстрации.

Описание на фигурите

Фигура 1 показва нуклеотидната секвенция и съответната аминокиселинна секвенция на сДНК клон, имаща човешка GM-CSF активност;

фигура 2А - pcD човешки GM-CSF, плазмид носещ сДНК клон проявяващ човешка GMCSF - активност;

фигура 2В - рестрикционна карта на сДНК фрагмента от фиг.2А;

фигура 3 - сравнение между миша и човешка GM-CSF - аминокиселинна секвенция.

Съгласно изобретението, получават се клонове ДНК, които кодират полипептиди, проявяващи човешка GM-CSF - активност. След като сДНК-секвенциите са инкорпорирани в реплицируеми експресионни вектори, трансфектирани в подходящ гостоприемник (клетъчни култура от бозайници), като експресираните полипептиди имат способността да индуцират експанзия при неутрофилни гранулоцити, макрофаги и други хематопоетични линии (напр. еозинифили).

Една предполагаема аминокиселинна секвенция, базирана на изолирана нуклеотидна секвенция, е показана на фигура 1. Човешката GM-CSF сДНК съдържа една отворена четяща рамка, състояща се от 144 кодона. Надолу от иницииращия кодон следва една област, богата на хидрофобни аминокиселини. Следователно твърде е вероятно зрялата форма на секретираната човешка GM-CSF да започва със серин, а предходните 23 аминокиселини да изграждат една лидерна област, която може да бъде премахната чрез протеолиза. По този начин в един свой вариант човешкия GM-CSF може да се състои от около 121 аминокиселини с молекулно тегло от около 13500 далтона (негликозилирана).

Когато бъде трансфектирана в COS-7 клетки от маймуна или друга подходяща експресионна система, сДНК клоновете от това изобретение могат да насочват синтезата на биологично активен човешки GM-CSF. Добавянето на този клониран генен продукт към култури от хематопоетични клетки води до експанзия на рецептивни клетки и/или тяхното поддържане в култура.

Различни методи могат да бъдат използвани за да се приготви сДНК за настоящото изобретение. Например тотална тРНК се екстрахира (съгласно Berger et al., Biochemistry 18, 5143-5149, 1970) от клетки (например нетрансформирани човешки Т-клетки) продуциращи полипептиди, проявяващи човешка GM-CSF активност. От тези тРНК може да бъде създадена двойноверижна сДНК, като първо чрез праймер-инициирана обратна транскрипция (Verma, I., Biochim. Biophys. Acta, 473, 1-38, 1977) се получават комплементарни на всяка тРНК секвенции и след това чрез праймиране се синтезира втората верига (Land, Н. et al., Nucleic Acid Res., 9, 2251-2266p 1981). След това сДНК могат да бъдат клонирани чрез интегрирането им в подходящи плазмиди или бактериофагни вектори (Rougeon, F. et al., Nucleic Acid Res., 2, 235-2378, 1975; Scherder, G. et al., Dev. Biol., 86, 438-447, 1981), чрез коплементарни хомополимерни опашки (Efstratiadis, A. et al., Cell, 10, 571-585, 1977) или чрез лепливи краища, създадени чрез линкерни сегменти, съдържащи подходящи рестрикционни места (Seeburg, Р. etal., Nature, 270, 486-499, 1977), след което да се осъществи трансформиране на подходящи гостоприемници (Efstratiadis, А., & Villa-Kormaroff, L., “Cloning of double stranded cDNA”j in Setlow, J. & Hollaender, A. (eds.) Genetic Engineering, vol 1, Plenum Publishing Corp., NY, US, 1982).

Един предпочитан метод за получаване клонирани сДНК в пълната им дължина за целите на това изобретение е процедурата, предложена от Н. Okayama and Р. Berg (Mol. Cell Biol., 2, 161-170, 1982). Предимството на този метод е, че при него сДНК инсерти се поставят в бактериален клониращ вектор в позиция, при която сДНК може също така да бъде директно транслирана в клетки от бозайници. Първата верига сДНК е праймирана с полидеокси тимидилова киселина, която се свързва ковалентно с единия край на линеарния плазмиден вектор ДНК. След това плазмидният вектор се циклизира с ДНК линкерен сегмент, който свързва единия край на плазмида с 5' края на сДНК кодираща секвенция. Използвайки ДНК фрагмент, съдържащ Simian Virus (SV 40), промотор и линкер съдържащ модифициран SV 40 интрон, сДНК може да бъде експресирана in vitro в COS7 бъбречни клетки от мишка без по-нататъшна модификация (Okayama Н., Berg Р., Mol. and Cell. Biol., 3, 280-289, 1983 and Jolly D. et al„ Proc. Nat. Acad. Sci., US, 80, 477-481, 1983).

След създаването на сДНК библиотека в Okayama/Berg плазмиден вектор с ДНК клоновете се събират и произволно количество от сДНК клонове могат да бъдат проверени за присъствие на желаните сДНК и чрез хибридна селекция, транслация или друго тестуване (например измерване на човешката GM-CSF - активност върху клетъчни култури, наличие на антигенни детерминанти и други биологични активности. Позитивните по тези критерии количества сДНК могат да бъдат сондирани след това с подходящи сонди, например сДНК от Вклетъчни линии и/или неиндуцирани Т-клетъчни линии. След това позитивните сондирани количества сДНК се разделят на индивидуални клонове, които се тестуват в подходящи гостоприемници (като клетъчни култури на бозайници) и супернатантата от гостоприемника се изпитва за желаната активност. Накрая, позитивните клонове се съгласуват.

Необходимите сДНК клонове могат също така да бъдат установени и изолирани чрез хибридизационен скрининг с подходящи тРНК проби (Heindell Н. etal., Cell, 15, 43-54, 1978). По принцип, сДНК могат да бъдат скринирани чрез хибридизационна селекция (Harpold, М. et al., Nucleic Acid Res., 5, 2939-2053, 1978 или Pames, J. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., US, 78, 22532257, 1981) или в овоцити на Xenopus (Aurdon, Nature, 233, 177-182, 1971).

При по-нататъшното описание на процедурите относно получаване на сДНК-клонове от настоящото изобретение, първо се разглежда клетъчният източник и другите използвани клетъчни линии, следвани от общо описание на процедурите за изолиране на тРНК, кодираща белтък с човешка GM-CSF - активност, изграждането на сДНК-библиотека, съдържаща сДНК секвенции, изолиране на сДНК-клонове в плазмиден вектор и съответната им експресия в клетки на бозайници, субклониране и експресия в бактерии и дрожди, и пречистване и формиране. По-детайлно описание на цялостна^ експериментална процедура следва по-долу.

Т-клетки и други клетъчни линии

Всяка една от голям брой различни клетъчни линии може да бъде използвана като източник за човешка GM-CSF - активност, (виж Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, Academic Press, 43-124, New York, 1984). Един предпочитан източник е т.нар. Т-хелперна клетъчна линия, но също така могат да се използват човешка периферна кръв (Verma, D. et al., Brit. J. of Haematology, 57, 505-520, 1984), макрофаги или други клетки, продуциращи човешка GMCSF - активност (Bodeker, В. et al., Immunobiology, 166, 12-23, 1984), както и хибридомни и трасформирани клетъчни линии (Gasson, J. et al., “Lymphokines and Hematopoesis”, Normal and Neoplastic Hematopoesis, Alan R. Lisis, Inc., NY, 1983).

Предпочитан източник също така е човешки костен мозък, взет от донори нестрада щи от хематологични болести. Човешкият далак и кръв от сърцето също са подходящи, при условие, че се използват от 12 до 48 h след изваждането му.

За да се определи CSF - активността, източникът на хемопоетични клетки се довежда до формата на суспензия от единични клетки. Индивидуалните клетки се имобилизират в полутвърда (агар) или вискозна (метилцелулоза) среда, съдържаща хранителни вещества и обикновено телешки фетален серум. В присъствието на подходящ стимулиращ фактор, отделните клетки пролиферират и се диференцират. Тъй като инициалните клетки са имобилизирани, колониите се развиват в процеса нд пролиферация и узряване на клетките. Тези колонии могат да се използват след 7-14 дни. (Burgess, A., Growth Factors and Stem Cells, 52-55, Academic Press, New York, 1984). Ako e необходимо, индивидуални колонии могат да се изолират на микроскопски стъкла, да се фиксират и оцветят с Wright/Geimsa (Todd-Sanford, Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, Eds. Davidson and Henry, 1974). След това може да се проведе морфологичен анализ на клетъчни типове, налични във всяка отделна колония.

Изолиране на тРНК и създаване на сДНК библиотека

Тотална клетъчна тРНК може да бъде изолирана по редица добре известни методики (напр. Przybla, A. et al., J. Biol. Chem., 254, 2154-2158, 1979), но предпочитаният метод е екстракция с гуанидин-тиоцианат (Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979).

сДНК библиотека, получена от poly А* тРНК, може най-добре да бъде формирана, използвайки pcDVI вектор-праймер и pLl линкерен фрагмент съгласно процедурите, които имат като резултат силно обогатяване на копия от тРНК транскрипти в пълна дължина (напр. Okayama, Н., Berg, Р., Mol. Cell Biol., 2, 161170, 1982).

Използвайки метода на Okayama & Berg, кръговият сДНК вектор се трансформира в конкурентна бактериална клетка като E.coli МС 1061 (Casadaban, М. & Cohen S. J. Mol. Biol., 138, 179-207, 1980) с помощта на калциев хлорид (Cohen, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., US, 69: 2110-2114 [1972]). Започвайки c 5 pg поли А* РНК от ConA - стимулирани клетки, около 1,5 χ 10⁶ независими трансформанти могат да бъдат получени. Обикновено 10⁴ клоно ве се взимат поотделно и се инокулират в кладенчетата на микротиторни пластини (Flow Lab. Inc., McLean, Virginia), съдържащи 200 μΐ Lхранителен бульон, 50 μ/ml ампицилин и 7 % DMSO. При желание, производни сДНК библиотеки, базирани на размера на сДНК инсерта могат да бъдат получени от общата сДНК библиотека по начина, описан от Okayama, Н. & Berg, Р. (Mol. Cell Biol., 3, 280-298, 1983). Накратко процедурата е следната: Плазмидната ДНК се разгражда със Sall, Clal, и Hindlll поотделно и се подлага на електрофореза в 1 % агарозен гел. След оцветяване с етидиев бромид, гелът се нарязва на 7 части, отговарящи на различните размери сДНК по следния начин: от 0 до 1, от 1 до 2, от 2 до 3, от 3 до 4, от 4 до 5, от 5 до 6 и повече от 6 килобази. ДНК се екстрахира, рециклизира с Т4 ДНК лигаза и се използва за трансформиране на МС 1061. Цялото нуклеотидно съгласуване може да бъде извършено съгласно метода на Махат, А. & Gilbert, W. (Methods Enzymol., 65, 499-560, 1980).

ДНК-трансфекции в клетки от маймуна Около 1 χ 10⁶ COS-7-клетки от бъбрек на маймуна се посяват в 60 mm пластинки в деня преди трансфекцията. Трансфекциите се провеждат най-добре с 15 pg плазмидна ДНК в 1,5 ml DME, съдържаща 50 тМ Трие. НС1, рН 7,4 и 400 pg/ml DEAE-Dextran (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden). Този разтвор се отделя след 4 h и се заменя с 2,0 ml DME + 4 % фетален телешки серум. Средата се събира след 72 h и се изследва за GM-SCF активност, както е описано по-горе. ДНК-трансфекциите могат да бъдат проведени с L-клетки, както и с редица други клетки (виж по-долу).

Изолиране на сродни гени

Клоновете сДНК съгласно изобретението могат да се използват и за да се идентифицират и изолират секвенции от нуклеинови киселини, кодиращи сродни гени. Поради ниската степен на хомология между хомоложните гени, условията на хибридизация трябва да бъдат нагодени така, че да е възможна кръстосано хибридизиране между секвенции, които са хомоложни само 70 - 80 %.

Няколко различни експериментални подхода могат да бъдат използвани за локализиране на сродни гени. Например човешкия ген, кодиращ леката верига на Ск-имуноглобулин, е бил изолиран с помощта на съответния миши Ск-ген като сонда (Heiter, Р. et al., Cell, 22,

197-207, 1981), а генът, кодиращ миши трансплантационен антиген, е бил изолиран чрез хибридизация с ДНК-клонове, кодиращи техните копия при хора (Steinnetz, Т. et al., Cell, 24, 125-134, 1981).

За геномната ДНК се получават добри резултати при посяване на фагови клонове от ДНК-библиотеката, съдържащи хомоложните гени (Maniatis, Т. et al., Molecular cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, US, 1982), при плътност 2 x 10⁴ до 2 χ 10⁵плаки за 150 mm пластинка и при подходящ щам гостоприемник, като например E.coli LE 392. Обикновено са достатъчни десет до двадесет пластинки.

След инкубация от 10 - 12 h при 37°С, пластинките се поставят в хладилник за 2 h, след което се поставя 132 mm нитроцелулозен филтър върху агара във всяка една паничка, за минимум 5 min. След изваждането им, филтрите се инкубират последователно за поне 2 min първо в 250 ml от 0,1 N NaOH, 0,5 М NaCl; след това в 250 ml 0,5 М Tris HCI pH 7,5, 1,5 М NaCl. След това филтрите се изсушават върху хартия и се пекат при 80°С за 4 - 8 h.

За хибридизация филтрите се намокрят 1 х SET (0,15 М NaCl, 30 mM Tris HCI pH 8,0, 1 mM Na₂ EDTA), а след това се инкубират в разтвор от 3 х SET, 5 х Denhardt’s (Denhardt’s, D.T., B.B.R.C., 23, 641-646, 1966), 10 % декстран сулфат, 0,1 % SDS и 50 μg/ml от всяко едно от poly (гА), poly (гС) и poly (rG), при 65°С за 2 h при постоянно разклащане. Този разтвор се отстранява и филтрите се хибридизират с 0,5 mg (над 10 ерт) от никтранслираната сонда съдържаща GM-CSF сДНК в същия разтвор (пресен), 1,5-2 ml/филтьр при 65°С за 1 h и за 12 - 29 h при 55°С. Филтрите се промиват трикратно със SET в 1 х Denhardt’s; 0,1 % SDS и 1 χ SET; 0,1 % SDS (10 - 15 ml/филтьр) при 55°C за 1 h при внимателно разбъркване, изсушават се и се авторадиографират за 12 - 24 h с подходящ филм. Хибридизиралите плаки се изваждат от агарните пластинки със стерилни пинсети на Пастьор и всяка се поставя в 1 ml 0,1 М NaCl, 0,01 М Tris. HCI pH 7,5, 10 mm MgC^, 100 pg/ ml желатин и 50 μΐ СНС1₃. След поне 4 - 8 h престой на студено фагите от всяка плака се скринират отново при ниска плътност (2000 4000 плаки/150 mm пластинка) по процедура идентична на цитираната по-горе.

Експресия в E.coli, дрожди и клетъчни култури

Прокариоти като E.coli са много подходящи за експресия на полипептидите съгласно изобретението (например US 4 338 397 и US 4 411 994), осигурили гликозилиране са нежелани.

За да се получат високи нива на експресия, трябва да се използват промотори от типа на β-лактамаза (пеницилаза) и лактозопромоторни системи (Chang et al., Nature, 275, 615, 1978; Ytakura et al., Science, 198, 1956 [1977]; Goeddel et al., Nature 281, 544, 1979, или триптофан (trp) - промоторни системи (Goeddel et al., Neucleic Acids Res., 8,4057, 1980, свързани c Shine-Delgarno секвенции.

He само прокариоти, но също така и еукариотни микроби от типа на дрождите могат да се използват за получаване на белтъци. Saccharomycas cerevisiae е един предпочитан еукариотен микроорганизъм. Към подходящите промоторни секвенции при дрождите спадат промоторите на 3-фосфоглицерат киназа (Hitzeman et al., J. Biol., Chem., 255, 12073-12080, 1980) или други гликолитични ензими (Hess et al., Adv. Enzyme Reg., 7, 149-167, 1969; Holland et al., Biochemistry, 17:4900-4907, [1978]). Подходящ е всеки плазмиден вектор, съдържащ промотор, съвместим с този при дрождите, инициатор на репликацията и терминационни секвенции.

Предпочитан метод за получаване на човешки GM-CSF с помощта на сДНК-ите от настоящото изобретение е използването на феромон α-фактор - секреторният метаболизъм при дрожди. (Julius, D. et al., Cell 32, 839-852, 1983). S. cerevisiae секретира специфичен тип свързващи олигопептидни феромони.

МАТ-ос клетки синтезират фактор, който индуцира растежа на МАТ-а клетки при G1 фаза от клетъчния цикъл (Thomer, J., The Molecular Biology of the Jeast Saccharomices, Cold Spring Harbor Laboratory, New York [1981]); P. 143-180. ос-факторът първоначално се синтезира като една голяма прекурсорна молекула, съдържаща на аминокрая си една сигнална секвенция от около 20 аминокиселини, следвани от една водеща секвенция от 60 аминокиселини и завършващи с 4 идентични тандемни повторения. Тези повторения са отделени една от друга чрез 6 или 8 аминокиселинни спейсери (LysArg-Glu-Ala-Glu-Ala и Lys-Arg-GIu-Ala-Glu-AlaGlu-Ala). Този препро-ос-фактор се разрязва на няколко специфични места. Първо се отцепва от СООН-края двойката Lys-Arg от спейсерна та секвенция (Julius et al., Cell, 37, 1075-1089, 1984). Ензим, подобен на карбоксипептидаза В реже една Lys-Arg двойка в аминокрая. Крайната стъпка е премахването на Glu-Ala или Asp-Ala чрез диаминопептидаза, която се кодира от STE 13, Brake, J. et al., (Proc. Nat. Acad. Sci. US, 81, 4642-4646, 1984) показа, че сливането на секвенциите кодиращи зрели човешки белтъци прави възможно секретирането на тези белтъци.

Един основен експресионен вектор за дрожди, наречен pMF-a-8, съдържащ ос-факторен промотор и лидерни секвенции в комбинация с други елементи е депозиран в АТСС (№ 40140). Той може да бъде конструиран по следния начин:

Един 1,7 kb EcoRI фрагмент носещ гена MFal (Kurjan, J. & Hershowitz, I., Cell, 30: 933943, 1982) се клонира в EcoRI рестрикционен сайт на M13mp8 (Viera, J. & Messing, J., Gene, 19, 259-268, 1982). За да се създаде Hindlll рестрикционен сайт след лизиновия кодон на първия спейсерен район, синтетичният олигонуклеотид TCTTTTATCCAAAGATACCC се хибридизира с едноверижна M13-MF α 1 ДНК и олигонуклеотидният праймер се удължава с ДНК-полимераза I Klenow фрагмент. След S1 нуклеазно третиране, ДНК се срязва с EcoRI и фрагментът, носещ MFal промотор и лидерна секвенция, се клонира в EcoRI и запълва Hindlll рестрикционно място на pUC 8 (Viera, J. and Messing J., виж горе). По този начин може да бъде изолиран плазмид с желаната структура, наречен pMFa4Al. Този плазмид е срязан с Hindlll и частично запълнен с ДНК-полимераза I Klenow фрагмент в присъствие на dATP и dGTP. ДНК е третирана с нуклеаза, получена от Phaseolus aureus и прикачен GCCTCGAGGC олигонуклеотиден линкер. Плазмидьт, който се получава (означен pMFa5) има Stul рестрикционен сайт, непосредствено след аргининовия кодон, следван от Xhol рестрикционен сайт. Един S. cerevissae-E.coli совалков вектор (pTRP 584) може да бъде конструиран по следния начин: Pstl-Xbal фрагмент, носещ плазмидното начало на репликация, е клониран в Clal мястото на pTRP56 Miyajima et al., Mol. Cell Biol., 4, 407-414 (1984) и Stul рестрикционниях сайт в TRPI-ARSI фрагмент превърнат в PvuII място чрез PvuII линкерно инсертиране, Kpul мястото, в началния pTRP56 е превърнато в Xhol чрез Xhol линкерно инсертиране. Общият век тор pMFa8 се получава чрез вкарване на Bgl IIXhol фрагмента от pMFa5 в BamHI-XhoI рестрикционните сайтове на pTRP584.

сДНК-клоновете, кодиращи GM-CSF се включват лесно във вектора pMFa8, след което се трансформират в дрожди (за пример виж Viera, J. & Messing J., Gene, 19, 259-268, 1982). За да се получи двойноверижен фрагмент, носещ кодиращите секвенции на зрелия белтък, се конструира олигонуклеотиден праймер AGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCAT. Този праймер се хибридизира с едноверижния М13тр8, носещ човешка GM-CSF сДНК и се удължава с ДНК полимераза I Klenow фрагмент. Двойноверижната ДНК се срязва с Bam HI и едноверижната област се отстранява с нуклеаза. Двойноверижният фрагмент, носещ секвенция за човешки GM-CSF зрял протеин, се изолира и се клонира в Stul рестрикционен сайт на общия секретиращ векторен плазмид pMFa8. Тази плазмидна ДНК може да бъде включена в дрожди (Ito, Н. et al., J. Bacteriology, 153, 163-168, 1983) и трансформантите да бъдат селекционирани в синтетична хранителна среда в отсъствие на триптофан. За да се получат дрождевите клетки, те се ресуспендират в PBS, съдържащ 1 mM PMSF и се разклащат силно в съд с промити с киселина стъклени перли, за да може клетките да се дезинтегрират. Бистра супернатанта се получава след центрофугиране при 10 000 rpm за 15 min.

Освен микроорганизми, могат да се използват и клетъчни култури, получени от многоклетъчни организми - например HeLa-клетки, клетъчни линии от яйчник на Китайски хамстер и бъбречни клетки от хамстери - сукалчета. Експресионните вектори за такива клетки обикновено включват, ако е необходимо, начало на репликация, промотор разположен преди гена, който трябва да се експресира, необходимите сайтове за свързване с рибозомите, сайтове на скачване на РНК, полиаденилационни сайтове и транскрипционни терминиращи секвенции. Когато се използват в клетки на бозайници, експресионните вектори често имат контролни функции, осигурявани от вирусен материал. Най-използваните промотори се получават от полиома, Аденовирус 2 и най-често от SV-40 (виж патент № 4 399 216 и Geysen, D. & Fiers, W. J. Mol. and Appl. Genetics 1, 385-394, 1982).

Очистване и формулиране

Човешките GM-CSF полипептиди, експ ресирани в дрожди, E.coli и други клетки, могат да бъдат очистени по стандартните процедури, включващи преципитация с амониев сулфат, колонна хроматография (йонообменна, гел филтрация, афинитетна хроматография и т.н.), кристализация и други (Enzyme purification and Related Techniques, Methods in Enzymology, 22, 233-577, 1977 и Scopes, R., Protein Purification : Principles and Practice, Springer Verlag, New York, 1982). След като веднъж се получат и очистят, полипептидите съгласно изобретението могат да се използват за изследователски цели, например като добавка към средата на клетъчни култури, напр. минимална хранителна среда на Eagle, модифицирана от Jscove хранителна среда на Dulbecco или RPMI 1640, достъпна от Sigma Chemical Company, St. Lonis, МО и GIBCO Division, Chagrin Falls, OH, (напр. към DMEM) или като антигенна субстанция за отстраняване на специфични имуноглобулини, приложими за имуноизследвания, имунофлуоресцентни оцветявания (Immunological Methods, I & II, Academic Press, New York, 1979 & 1981; и Handbook of Experimental Immunology, ed. Weir, D., Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO, 1978).

Полипептидите от настоящото изобретение могат да се използват също и за получаване на фармацевтични препарати, например за повишаване на съпротивителните сили срещу различни неопластични и инфекциозни болести или в химиотерапията (Gasson, J. et al., Lymphokines and Hematopoiesis, в Normal and Neoplastic Hematopoiesis, 129-139, Alan R. Liss, Inc. New York, 1983).

За получаване на фармацевтични препарати полипептидите от изобретението се съчетават с вещества, които са инертни и лесно усвоими от организма (Remington Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980). Предпочитаният начин на приложение е парентерален и може да включва механични системи за вкарване в организма.

За предпочитане е фармацевтичният препарат да бъде в единични дозирани форми, съдържащи необходимото количество активен компонент, което може да варира от I gg до 100 gg например. В препарата могат да бъдат включени и други терапевтични агенти.

Дозите могат да варират в зависимост от изискванията на пациента, неговото състояние и от веществото, което се използва. По принцип лечението започва с дози по-ниски от оптималната, след което дозите се повишават до постигане на желания ефект. За удобство, дневната терапевтична доза може да се раздели на няколко порции.

Следващите примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.

Експериментални процедури

А. Клонирани човешки хелперни Т-клетки

1. Един клон от човешки Т-клетки, означен като Т-7, се изолира съгласно метода, описан в глави 36 и 37 на Isolation, Characterization and Utilization of T Lymphocyte Clones, Eds. Fathman, C. & Fitch F., Academic Press, New York, 1982. Тази клетъчна линия се поддържа при гъстота 0,5 х 10⁵ кл/ml в DME с 10 % топлинно инактивиран фетален телешки серум (FCS), 5 х 10⁵М 2-МЕ, 2 тМ глутамин, неесенциални аминокиселини, витамини и 30 % супернатанта от фитохемаглутинин (Р НА)-стимулирани човешки периферни левкоцити.

2. РНК-активиране на Т-7 клетки

Клетките (5 х lOVml) се култивират в DME с 4 % топлинно инактивиран фетален телешки серум, 5 х 10'⁵М 2-МЕ, 2 тМ глутамин, неесенциални аминокиселини, витамини и 4 μ/ ml ConA. След инкубация от 4 - 6 h на 37°С, в 10 % въглероден двуокис, клетъчната суспензия се центрофугира при 1500 rpm за 10 min. Утайките се събират и замразяват при -70°С. Супернатантите се филтруват (Nalgene - 0,22 мкм) и се съхраняват като източник на растежни фактори. Проби от супернатантата се тестуват за CSF - активност, за да се докаже индуцирането на линия чрез РНА третирането.

Б. Изследване на костен мозък и на кръв от пъпна връв

Клетки от костен мозък се взимат от пациенти без хематологични заболявания, поставят се върху Ficoll тип 400 (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) и се центрофугират на 2000 rpm за 20 min. Клетките в интерфазата се промиват два пъти с Iscove.s Modified Dulbecco Medium, съдържаща 10 % фетален телешки серум, ресуспендират се в същата среда, а адхезиралите на дъното на пластмасовите петриеви панички клетки се отстраняват. Неадхезиралите клетки се добавят към средата, съдържаща 20 % FCS, 50 μΜ 2-МЕ, 0,9 % метилцелулоза и различни концентрации от супернатантата, където се съдържат стимулиращите активности. Един ml от пробите се посява в 35 mm петриева паничка за култивиране. След 3 дена на 37°С и 6 % СО₂ се прибавя по 1 единица еритропоетин (Eaves, A., British Columbia Cancer Research Center, Vancouver, В. C.). Гранулоцитно-макрофагните колонии и еритроидните образувания се преброяват на 10 - 14 ден чрез инвертен микроскоп.

Кръвни клетки от пъпна връв, получени в хепарин, се утаяват при 2000 rpm за 6 min. Белите кръвни клетки в интерфаза между плазма и червени кръвни клетки, се прехвърлят в епруветка, съдържаща 0,17 N амониев хлорид и 6 % FSC. След престой от 5 min в лед, суспензията се центрофугира за 6 min при 2000 rpm. Получената утайка се промива с Dulbecco’s PBS, след което се използва същия подход за пречистване с Ficoll и адхезия върху пластмасова повърхност, както е описано за клетки от костен мозък. Неадхезиралите клетки се поставят при гъстота 10⁵ кл/култура в полутвърд агар, както е описано.

Накрая клетъчният състав се изследва за всяка колония, като се извършва оцветяване с Wright-Giemsa. Еозинофилите се оцветяват с Luxol Fast Blue (Johnson, G. & Metcalf, D. Exp. Hematol. 8, 549-561, 1980).

C. Изолиране на mPHK от човешки клетки

1. Тотална клетъчна РНК се изолира от клетки с гуанидин изотиоцианат (Chirgwin, J. et al., Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979). Замразени утайки от неиндуцирани или Con Аиндуцирани (4 h след стимулирането) човешки хелперни клетки се суспендират в разтвор на гуанидин тиоцианат, 20 ml от лизата се използват за 1,5 х 10’ клетки. Утайката се ресуспендира чрез пипетиране, след което ДНК се разпределя на 4 фази и лизата се поставя върху 20 ml от следната смес: 5,7 М CsCl, 10 mM EDTA в полиаломерна центрофужна епруветка от 40 ml. Този разтвор се центрофугира при 25000 rpm на Beckman SW 28 ротор (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, СА) за 40 h при 15°C. Гуанидин изотиоцианатната фаза, съдържаща ДНК, се отпипептира от върха надолу към интерфазата. Кладенчето на епруветката и интерфазата се промиват с 2 - 3 ml гуанидин изотиоцианатен лизисен разтвор. Епруветката се отрязва под интерфазата с ножици и CsClразтворът се отдекантира. Утайката от РНК се промива два пъти със студен 70 % етанол. След това утайката се ресуспендира в 500 ml от 10 mM Tris. НС1, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,05 % SDS, 3 М натриев ацетат и РНК се преципитира в 1 ml етанол. Около 0,3 mg тотална РНК се събира чрез центрофугиране и утайките се промиват със студен етанол.

2. Изолиране на poly А* тРНК

Промита и изсушена утайка от тотална РНК се ресуспендира в 900 ml от олиго (dT) елуационен буфер (10 mM Tris. НС1, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS). РНК се нагрява за 3 min при 68°С и след това се охлажда на лед. След добавяне на 100 pg 5М NaCl, РНК пробата се натоварва на олиго (dT) целулозна колона (type 3, Collaborative Research, Waltham, МА) уравновесена със свързващ буфер (10 mM Tris. НС1 pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,5 М NaCl, 0,5 % SDS). Колоната се промива с 20 ml от свързващия буфер. Poly А* тРНК се получава чрез промиване с елуационен буфер. РНК обикновено се елюира с първите 2 ml от този буфер. РНК се преципитира с 3 М натриев ацетат и етанол. Утайката от РНК се получава чрез центрофугиране, след което се промива с етанол и се изсушава. Утайката се разтваря във вода и се мери абсорбцията при 260 nm.

D. Конструиране на сДНК библиотека

1. Получаване на векторен праймер и олиго dG-линкерни ДНК

Процедурата на Okayama & Berg (Mol. & Cell Biol., 2, 161-170, 1982) се използва c малки модификации и е адаптирана з$ pcDVl и pLl плазмиди (Okayama & Berg, Mol. Cell. Biol., 3, 380-389, 1983).

Проба от 80 pg от pcDVl се разгражда при 30°С с 20 U ΚρηΙ ендонуклеаза в реакционна смес от 450 μΐ, съдържаща 6 mM Tris. НС1 (pH 7,5), 6 mM MgCl₂, 6 mM NaCl, 6 тМ 2-МЕ и 0,1 mg BSA на ml. След 16 h разграждането се прекратява с 40 μΐ от 0,25 М EDTA (pH 8,0) и 20 pg SDS. ДНК се възстановява след екстракция с воден разтвор 1 : 1 на фенол-СНС1₂ и преципитация с етанол. Хомополимерните опашки, състоящи се средно от 60, но не повече от 80 деокситимидилат (dT) - остатъци се добавят към ΚρηΙ ендонуклеаза-генерираните краища с телешка тимусна терминална трансфераза по следния начин: Реакционната смес (38 μΐ) съдържаща натриев какодилат-30 mM Tris. НС1 pH 6,8, 1 mM СоС1₂, 0,1 тМ дитиотреитол, ΚρηΙ ендонуклеазно разградена ДНК и 68 U от терминалната деоксинуклеоти дил трансфераза (Р - L Biochemicals, Juc., Milwaukee, wl). След 30 min при 37°C реакцията се спира с 20 μΐ 0,25 М EDTA (pH 8,0) и 10 μΐ 10 % SDS. ДНК се получава след няколко екстракции с фенол-СНС1₃ и с преципитация с етанол. След това ДНК се разгражда с 15 U EcoRI ендонуклеаза в 50 μΐ, съдържаща 10 mM Tris. НС1 pH 7,4, 10 тМ MgCl₂, 1 тМ дитиотреитол и 0,1 mg BSA за 5 h при 37°С. Големият фрагмент, съдържащ SV 40 полиаденилиращо ационният сайт и pBR 322 началото на репликацията, се очиства чрез електрофореза в агарозен гел и се възстановява от гела чрез модификация на метод на стъклената пудра (Vogelstein, В. & Gillespie, D., Proc. Nat. Acad. Sci., 76, 615-619, 1979). dT-опашатата ДНК се очиства по-нататък чрез адсорбция и елюиране от олиго (dA)-целулозна колона по следния начин: ДНК се разтваря в 1 ml от 10 mM Tris. НС1, pH 7,3- буфер, съдържащ 1 тМ EDTA и 1 М NaCl. Колоната се промива със същия буфер на 0°С и елюирането се извършва с вода при стайна температура. Елюираната ДНК се преципитира с етанол и се разтваря в 10 mM Tris. НС1 pH 7,3 с 1 тМ EDTA.

Линкерната ДНК с олиго (dG) опашка се получава чрез разграждане на 75 μg от pLl ДНК с 20 U PstI ендонуклеаза в 450 μΐ, съдържащи 6 mM Tris. НС1, pH 7,4, 6 тМ MgCl₂, 6 тМ 2-МЕ, 50 тМ NaCl, и 0,01 mg BSA. След 16 h при 30°С се прави екстракция с фенолСНС1₃ и ДНК се утаява с алкохол. Опашки от 10-15 дезоксигуанолатни (dG) остатъци след това се добавят с 46 U терминална дезоксинуклеотидил трансфераза в същата реакционна смес, описана по-горе (38 μΐ) с изключение на това, че 0,1 mM dGTP замества dTTP. След 20 min на 37°С сместа се екстрахира с фенол-СНС1₃и след утаяване с етанол ДНК е смляна с 35 U Hind III в 50 μΐ съдържащи 20 mM Tris. НС1, pH 7,4, 7 mM MgCl₂, 60 тМ NaCl и 0,1 mg BSA на 37°С за 4 h. Малката линкерна ДНК с олиго (dG)-опашка се очиства чрез електрофореза на агарозен гел (1,8 %), и се получава по метода, описан по-горе.

2. Получаване на сДНК-библиотека Етап 1: Синтез на сДНК

Реакционната смес (10 μΐ) съдържа 5Q mM Tris. НС1, pH 8,3, 8 тМ MgCl₂, 30 тМ КС1, 0,3 тМ дитиотреитол, по 2 ml от dATP, dTTP, dGTP, dCTP, 20 микрокюри ³²P-dCTP, 3 pg poly А* РНК от ConA - индуцирани Т-клетки

U Rnasin и 2 gg векторно-праймерна ДНК и 45 U обратна транскриптаза. Реакцията се инкубира за 60 min при 42°С и се спира с добавянето на 0,25 М EDTA и 10 % SDS. След екстракция с 40 μΐ фенол-СНС1₃ се добавят 40 μΐ 4 М амониев ацетат и 160μ1 етанол към водната фаза, разтвора се охлажда за 15 min на сух лед, затопля се на стайна температура и се центрофугира 10 min в центрофуга Епендорф. Утайката се разтваря в 10 μΐ 10 mM Tris. НС1, pH 7,3 и 1 тМ EDTA и 4 М амониев ацетат и се репреципитира с 40 μΐ етанол. Утайката се измива с етанол.

Етап 2: Добавяне на олигодеоксицитидилат (олиго (dC>)

Утайката, съдържаща плазмид-сДНК: тРНК, се разтваря в 20 μΙ от 140 шМ натриев какодилат - 30 mM Tris. НС1, pH 6,8,1 mM СоС1₂, 0,1 тМ дитиотреитол, 0,2 gg poly A, 70 mMdCTP, 5 MCi ³²P-dCTP, 60 U терминална деоксинуклеотидилтрансфераза. Реакцията се провежда при 37°С за 5 min, което дава възможност да се добавят 10-15 остатъка от dCMP и се прекъсва с 2 μΐ 0,25 М EDTA (pH 8,0) и 1 μΐ 10 % SDS. След екстракция с фенол-СНС^ водната фаза се смесва с 4 М амониев ацетат и ДНК се преципитира с етанол, като крайната утайка се промива също с етанол.

Етап 3: Разграждане с Hind III ендонуклеаза

Утайката се разтваря в 30 μΐ буфер, съдържащ 29 mM Tris. НС1, pH 7,4, 7 mM MgCl₂, 60 тМ NaCl, 0,1 mg BSA и след това^се смила с 10 U Hind III ендонуклеаза за 2 h при 37°С. Реакцията се спира с 0,25 М EDTA (pH 8,0) и 10 % SDS и след екстракция с фенол-СНС1₃ и добавяне на 4 М амониев ацетат, ДНК се преципитира с етанол. Получената утайка се промива с етанол и се разтваря в 10 mM Tris. НС1 (pH 7,3), 1 тМ EDTA и 3 μΐ етанол се добавят, за да се предотврати замръзването при съхранението й при -20°С.

Етап 4: Кристализация, опосредствана от линкерна ДНК с олиго (dG) -опашка

Една 9-μ1 проба от разградена с Hind III ендонуклеаза плазмидна сДНК:тРНК с олиго (dC) -опашка се инкубира в смес (90 μΐ), съдържаща 10 тМ Tris. НС1, pH 7,5, 1 тМ EDTA, 0,1 М NaCl и 1,8 пикомола от линкерната ДНК с олиго (dG)-опашка при 65“С за 5 min, след което се оставя на 42°С за 65 min и накрая се охлажда до 0°С. Тази смес се долива до 900 μΐ с 20 mM Tris. НС1, pH 7,5, 4 тМ MgCl₂, 10 тМ амониев сулфат, 0,1 М КС1, 50 gl BSA/ml 0,1 тМ β-NAD и 6 gg ДНК-лигаза от E.coli. Инкубацията се провежда цяла нощ при 12°С.

Етап 5: Заместване на РНК-верига с ДНК

За да се замести РНК-веригата с ДНК, лигиращата смес трябва да съдържа по 40 gmol от всеки един от четирите деоксинуклеотид трифосфати, 0,15 mM b-NAD, 4 gg допълнителна ДНК-лигаза от E.coli, 16 U от ДНК полимераза I от E.coli (Poll) и 9 U РН-аза Н от E.coli. Получената смес се инкубира последователно при 12°С и при стайна температура за 1 h.

Етап 6: Трансформация на E.coli

Трансформацията се провежда по метода на Cohen et al., (Proc. Nat. Acad. Sci., US, 69, 2110-2114, 1972). E.coli щам K-12MC 1061 (Casadaban, M. & Cohen, S., J. Mol., Biol., 138, 179-207, 1980) се култивира до 0,5 абсорбционни единици при 600 nm в 20 ml L-бульон. Клетките се събират чрез центрофугиране, суспендират се в 10 ml 10 mM Tris. НС1, pH 7,3, съдържащ 50 тМ СаС1₂ и се центрофугират. След това 0,2 ml от клетъчната суспензия се смесват с 0,1 ml ДНК (етап 5) и се инкубират при 0°С за 15 min. Добавя се 0,5 ml от бульона и културата се инкубира при 37°С за 30 min, смесва се с 2,5 ml L-бульон при 42°С и се поставя върху агар, съдържащ 50 gg/ml ампицилин. След инкубация при 37°С от 12 до 24 h, колониите се отделят със стерилен прибор. В резултат на това се генерират около 5 χ 10⁴независими сДНК колонии.

Е. Скриниране на човешка Т-клетъчна сДНК-библиотека чрез ДНК-трансфекции

Един набор от 104 независими клонове се вземат случайно от сДНК-библиотеката и се слагат поотделно в кладенчетата на микротитърни панички, 20 gl L-бульон, 50 gg/ml ампицилин и 7 % диметилсулфоксид. Така се получават пулове, съдържащи 48 сДНК клонове. 40 такива пула се поставени в еднолитрови бутилки за култивиране с L-бульон, съдържащ 100 gg/ml ампицилин. Плазмидната ДНК се изолира от всяка една култура и се очиства през градиенти от CsCl. Представителна ДНК за всеки пул се трансфектира в COS-7 клетки от маймуна по следния начин: Един ден преди трансфекция COS-7 клетки от маймуна се поставят в индивидуални съдове с DME, съдържаща 10 % FCS и 2М глутамин. За осъществяване на трансфекцията, средата се изсмуква от всяко съдче и се замества с 1,5 ml DME, съдържаща 50 mM Tris. ННС1, pH 7,4, 400 gg/ml DEAE-Dextran и 15 gg от изследваната плазмидна ДНК. Съдчетата се инкубират за 4 h при 37°С, след което средата, съдържаща ДНК, се изхвърля и съдовете се промиват с DME без серум. DME съдържаща 150 тМ хлорокин се добавя и съдчетата се инкубират отново за 3 h при същата температура. Съдчетата се промиват с DME съдържаща 4 % FCS, 2 тМ глутамин, пеницилин и стрептомицин. Клетките се инкубират за 72 h при 37°С. Средата се събира и се изследва за човешка GM-CSF - активност както е описано по-горе. Четири пула (групи 1А, ЗВ, 7А и 14А) имат такава активност (виж Таблица 1). Всяка група се подразделя на 6 пула, всеки един от които съдържа 8 от оригиналните клонове. По един субпул от всеки един първоначален пул показва положителен резултат при трансфекцията, с изключение на 7А, който даде два положителни субпула. Всеки от плазмидите в 4 от петте субпула се трансфектира индивидуално в COS-7 клетките. Четири единични клона, означени като 3 - 8а, 7 - la, 7 - 4d и 14 - 1с са активни в продуцирането на GM-CSF. Анализ с рестрикционна ендонуклеаза показва, че всички тези клонове имат еднаква структура. Таблица 1 показва броя на хемопоетичните колонии, стимулирани от всяка една трансфекционна проба в двойно повторение. Едно струпване представлява 20 50 клетки, малка колония се състои от 51 до 150 клетки, а истинска колония се образува от повече от 150 клетки.

Таблица I

Тест за активност стимулираща колониите от трансфекция с пулове от плазмидна ДНК

Първи скринирани Моск-инфектирани	40 пула от 48 клона (1 - 20, А + В) COS-7: 7 + 12 струпвания
Пул 1А:	29 + 25 струпвания
Пул ЗВ:	38 + 20 струпвания
Пул 7А:	22+19 струпвания
Пул 14А:	26 + 32 струпвания

Всички останали пулове: по-малко от 20 струпвания

Второ скриниране Моск-инфектирани	Субпулове от 8 клона C0S-7: 9 + 15 струпва ния
Суб-пул 1-5: Суб-пул 3-8: Суб-пул 7-1: Суб-пул 7-4: Суб-пул 14-1:	56 + 54 струпвания 98 + 52 малки колонии 29 + 41 малки колонии 100 + 93 малки колонии 40 + 73 малки колонии

Всички останали суб-пулове: по-малко от струпвания

Трето скриниране	Индивидуални клонове
Клон 3 - 8а: Клон 7 - 1а: Клон 7 - 4а: Клон 14 - 1е:	120 + 127 колонии 198 + 164 колонии 176 + 160 колонии 62 + 67 колонии

Всички останали клонове: по-малко от 20 струпвания

Плазмид (pcD-човешки GM-CSF), носещ сДНК в цялата му дължина е показан на фигура 2. Бактериите E.coli (МС 1061), носещи плазмида са депозирани в АТСС (№ 39923). На фиг. 2 със стрелка е показана транскрипцията на сДНК фрагмент състоящ се от 766 вр (двойки бази) от SV 40 ранния промотор в pcD експресионния вектор. Показани са донорните и акцепторните места на свързване. Сигналът за полиаденилиране, произхождащ от SV 40 е локализиран в 3'-края на сДНК-фрагмента. GMCSF кодиращата част на сДНК фрагмента е по-тъмна, а некодиращата част е по-светла. Остатъкът от векторните секвенции произхождат от pBR 322 и включват β-лактамазния ген (Amp-R) и началото на репликацията.

Секвенцията 3 - 8а се определя чрез метода на М 13 дидеокси верижно прекъсване Sanger, F. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., US, 74, 5463-5467, 1977) и модифицираната техника на Maxam/Gilbert (Rubin, C. & Scmidt, Nucleic Acid Res., 8, 4613-4619, 1981). сДНК инсертът съдържа единична отворена четяща рамка. Първият ATG съдържа 33 - 35 нуклеотида от 5'-края, следван от 144 кодона преди термини-, ращия триплет (TGA) в нуклеотидна позиция 465-467.

Таблица II показва процентното разпределение на клетъчния състав на около 60 чо13 вешки колонии от костен мозък и пъпна връв, отглеждани под влияние на клонове 3 - 8а, 7 la, 7 - 4d и 14 - 1е. Наличието на еозинофили и други клетъчни типове може да се дължи на колонии растящи заедно. 5

Таблица II

Клетъчен състав на колонии от човешки костен мозък

Neu	15%	Neu/ΜΘ	37%
ΜΘ	30%	ΜΘ/Eos	2%
Eos	7%	Neu/M6/Eos	9%

Изолирана е сДНК в пълна дължина (вклю- 15 чително - сигнална секвенция) кодираща муринова GM-CSF - активност. E.coli бактерии (МС 1061), носещи pcD плазмид с муриновата сДНК, са депозирани в АТСС (№ 39924). В представения патент ³²Р белязана проба от PST 1/А1а 20 III фрагмент от мишата сДНК се хибридизира при строги условия (42°С) с една от човешките GM-CSF сДНК.

Фигура 3 прдставлява съпоставка между вероятните миши и човешки GM-CSF протеино- 25 ви секвенции. Идентичните остатъци (след съпоставяне) са подчертани, а остатъците, налични само в мишката (напр. Ser + Asn позиции 57 - 58 или Lys-Lys позиция 65), са представени с къса вертикална черта. Хомоложността между 30 мишата и човешката GM-CSF сДНК е изненадваща. Има около 70 % хомолозрюст между двете GM-CSF секвенции. (Brutlag D. et al., Nucleic Acids Res., 10, 279-294, 1981). Въпреки това човешкият GM-CSF в настоящото изобре- 35 тение не стимулира значително растежа на хе матопоетични първични клетки in vitro.

Библиотеката от клонове в pcD експресионният вектор дава възможност за идентифициране на пълните сДНК клонове чрез директна експресия в клетки от бозайници. Поконкретно, всички човешки GM-CSF сДНК клонове се идентифицират директно чрез трансфектиране на COS-7 клетки със случайно избрани сДНК клонове и чрез измерване на GMCSF - активност в супернатантата. Тези резултати потвърждават, че идентификацията на сДНК клонове от лимфокини или хормони може да се осъществи само на базата на установяването на функционалния полипептид в еукариотни клетки.

Следователно сДНК клоновете от настоящото изобретение обезпечават точна и пълна информация за секвенцията на човешкия GMCSF. Изобретението също улеснява опитните експериментатори да продуцират значителни количества от този фактор (част от други хематопоетични фактори) за по-добро поддържане in vitro на неутрофилни гранулоцити и макрофаги, както и на други хематопоетични клетки (напр. еозинофили). Освен това информацията, получена от сДНК клоновете, задълбочава знанията за имунните реакции при бозайници и повишава възможностите за експериментални изследвания.

Claims

Патентни претенции

1. Рекомбинантен полипептид, проявяващ активността на колонии стимулиращ фактор, за човешки неутрофилни гранулоцити, макрофаги и еозинофили със следната структура:

Mel Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu

Gly Ibr Val Ala Cys Ser Пе Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp Glu His Val Asn Ala He Gin Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val lie Ser Glu Met Phe Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Mel Mel Ala Ser His Tyr Lys Gin His Cys Pro Pro Thr Pro Glu lhr Ser Cys Ala Thr Gin He lie Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val He Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gin Glu
2. Полипептид съгласно претенция 1 без сигнална секвенция.
3. Полипептид, съгласно претенции 1 и 2, който е гликозилиран.
4. Полипептид съгласно претенции 1 и 2, който не е гликозилиран.
5. Полипептид съгласно претенции от 1 до 4 в чист вид и по същество свободен от други хематопоетични клетъчни протеини на бозайници.
6. Метод за получаване на полипептид съгласно която и да е претенция от 1 до 5, характе- ризиращ се с това, че включва следните етапи:

а. формиране на вектор, съдържащ нуклеотидна секвенция, кодираща полипептида, която може да се експресира в гостоприемник,

5 съдържащ вектора;

б. включване на вектора в гостоприемник;

в. поддържане на гостоприемника, съдържащ вектора, в условия подходящи за експресия на нуклеотидната секвенция в посочения

10 полипептид.
7. Метод съгласно претенция 6, при който нуклеотидната секвенция съдържа секвенцията:

ATG TGG CTG CAG AGC CTG СТС СТС TTG GGC ACT GTC GCC TGC AGC ATC ТСТ GCA ССС GCC.CGC TCG ССС AGC ССС AGC ACG CAG ССС TGG GAG CAT GTG ААТ GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CTG ACT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG TTT GAC CTC CAG GAG CCG ACC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG GGC CTG CGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG АТГ ATC ACC TTT GAA AGT TTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT GTC ATC CCC TTT GAC TGC TGG GAG CCA GTC CAG GAG
8. Секвенция от нуклеинови киселини, βθ
9. Секвенция от нуклеинови киселини съг- която кодира полинуклеотид, както е посочено ласно претенция 8, съдържаща нуклеотидната в претенции 1 или 2. у секвенция:

ATG TCG СТС CAG AGC CTG CTG СТС TTG

GGC АСГ GTG GCC TGC AGC АТС ТСТ GCA ССС GCC CGC TCG ССС AGC ССС AGC ACG

CAG ССС TCG GAG CAT GTG ААТ GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CIO

AGT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG

ТТГ GAC CTC CAG GAG CCG ACC TGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG

GGC CTG CGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC

CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ATT

ATC ACC TTT GAA AGT TTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TIT CTG CTT GTC ATC CCC

TTT GAC TGC TGG GAG CCA GTC CAG GAG
10. Вектор, съдържащ по същество секвенцията ДНК от претенции 8 или 9, по-специално когато векторът е инкорпориран в микроорганизъм или клетка.
11. Микроорганизъм или клетка, трансформирана или трансфектирана с реплициращ се експресионен вектор, съгласно претенция 10.
12. Метод за повишаване на клетъчния растеж или диференциация, включващ контакт на клетката с полипептида, съгласно претенции от 1 до 5.
13. Метод за получаване на полипептид, проявяващ активността на колонии стимулира- 5 ща активност върху човешки неутрофилни гранулоцити, макрофаги и еозинофили, който включва култивиране във водна хранителна среда на прокариотен микроорганизъм или еукариотна клетка, която е била трансфектирана или транс- 10 формирана с вектор съгласно претенция 10.
14. Рекомбинантна ДНК молекула, съдържаща сегменти ДНК от различни геноми, които са били свързани със своите краища извън живите клетки и притежават способността да инфектира даден гостоприемник, където се съхранява и дава поколение от тези ДНК секвенции, кодиращи полипептида съгласно претенции 1 и 2.
15. Рекомбинантна ДНК молекула съгласно претенция 14, съдържаща следната ДНКсеквенция:

ATGTGG CTG CAG AGCCTG CTG CTC TTG

GGC ACT GTG GCC TGC AGC ATC TCI' GCA CCC GCC CGC TCG CCC AGC CCC AGC ACG

CAG CCC TGG GAG CAT GTG AAT GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AAC CTG

AGT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTA GAA GTC ATC TCA GAA ATG

TTT GAC CTC CAG GAG CCG ACC TGC CT A CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG

GGC CTG CGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATG ATG GCC AGC

CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCG GAA ACT TCCTGT GCA ACC CAG ATT

ATC ACC TTT GAA AGT TTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT GTC ATC CCC

TTT GAC TGC TGG GAG CCA GTC CAG GAG
16. Фармацевтичен състав, характеризи- претенции от 1 до 5, свързан с подходящ фарращ се с това, че съдържа полипептид съгласно 30 мацевтичен носител.