HU213226B - Method for production of cdna clones coding for polypeptides exhibiting human granulocyte macrophage and eosinophil cellular growth factor activity - Google Patents

Description

A találmány általában a rekombináns-DNS-technológiák egy olyan területen való alkalmazására vonatkozik, amelynek célja az emlősök immunválaszát szabályozó mechanizmusok tisztázása, részletesebben pedig olyan nukleinsav-klónok izolálására vonatkozik, amelyek humán granulocita/makrofág növekedési faktor aktivitást - beleértve az eozinofil sejt növekedési faktor aktivitást - kifejtő polipeptideket kódolnak.

Általánosságban a rekombináns DNS technológia egy olyan módszer, amikor egy donortól származó genetikai információt vektorokba integrálunk az információ további felhasználása céljából, például egy gazdasejtbe való beépítése révén, s így az átvitt genetikai információ az új környezetben lemásolódik és/vagy kifejeződik. A genetikai információ általában olyan komplementer DNS (cDNS) formájában létezik, amely egy kívánt protein terméket meghatározó messzendzser RNS-től (mRNS) származik. A hordozó gyakran olyan plazmid, amely képes a cDNS befogadására és amely a későbbiekben a gazdasejtben replikálódik. A plazmid bizonyos esetekben a cDNS kifejeződését szabályozza, s ezáltal a kódolt terméknek a gazdasejtben való közvetlen szintézisét.

Az utóbbi években ez a technológia rendkívül gyorsan fejlődött és számtalan exogén protein expressziója valósult meg a különféle gazdasejtekben, de akármilyen kívánt új cDNS kiónhoz eljutni bizonytalan dolog maradt. Példaként néhány ilyen módon termelt eukarióta proteint sorolunk fel: proinzulin [S. Naber és munkatársai, Gene, 21, 95-104 (1983)]; interferonok [L. Simon és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 20592062 (1983) és R. Derynck és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 1, 1819-1837 (1983)]; növekedési hormon [D. Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544-548 (1979)]; és hízó sejt növekedési faktor [T. Yokota és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 5/, 1070-1074 (1984)]. (Ezek a közlemények és a csatolt további idevonatkozó anyag kiegészítő részleteket szolgáltat a szóbanforgó szakterület előzményeiről, jelen esetben a találmány alkalmazásáról, s mindezt hivatkozásként tartalmazza ez a leírás.)

Bizonyos ideig dogma volt, hogy az emlősöknél az immunválasz elsősorban egy sorozat sejtek közti komplex kölcsönhatás, az úgynevezett „immun térháló” (immuné network) eredménye. Bár teljesen világos, hogy a válaszok nagy része valóban a limfociták, makrofágok, granulociták és más sejtek hálószerű kölcsönhatásán alapszik, azonban az immunológusoknak most általában az a véleményük, hogy a szolubilis proteinek (például az ún. limfokinek) meghatározó szerepet játszanak a sejtek közti kölcsönhatások szabályozásában.

A limfokinek kétségtelenül különböző módon közvetítik a sejtaktivitásokat. Kimutatták róluk, hogy képesek a különböző limfociták szaporodását és növekedését fenntartani és azt gondoljuk, hogy döntő szerepük van a pluripotens hematopoetikus őssejtek alapdifferenciálódásának megindításában, s ezzel az immunválaszért felelős különböző sejtvonal-progenitorok roppant nagy számának keletkezésében. Az ebből a szempontból fontos sejtvonalakhoz két limfocita osztály tartozik: B-sejtek, amelyek immunglobulinokat (ezek olyan proteinek, amelyek képesek felismerni és megkötni idegen anyagokat, hogy ezeket eltávolíthassák) termelnek és szekretálnak, és T-sejtek (különböző alcsoportjaival együtt), amelyek különböző mechanizmusokon keresztül indukálják vagy gátolják a B-sejteket és bizonyos más sejteket is (beleértve más T-sejteket). E két csoport alkotja meg az immun térhálót.

Egy másik fontos fehérvérsejt típust képviselnek a fagociták, különösen a polimorfonukleáris és mononukleáris leukociták. Ezekről a sejtekről azt gondoljuk, hogy a takarításra specializálódtak, lényeges tulajdonságuk, hogy segítenek a behatoló organizmusok eltávolításában, továbbá az elpusztult sejtek és sejten kívüli törmelékek megsemmisítésében.

Ezek közé a leukocita sejttípusok közé tartoznak a granulociták, beleértve a neutrofil és eozinofil granulocitákat. A neutrofílek megtalálhatók a perifériás vérben, sokféle szövetben és a testnek leginkább azon a területein, amelyek a környezettel érintkeznek (például szájüreg, légcső- és hörgőrendszer, méhnyak csatorna). A mikroorganizmusok behatárolására adott fagocitáló válaszukat behatóan tanulmányozták [S. Klebanoff és R. Clark: The Neutrophil: Function and Clinical Disorders, Elsevier/North Holland Biomedical Prep., Amsterdam (1978)]. A bekebelezett mikroorganizmus elbontását úgy viszik végbe, hogy először különböző antimikrobiális szereket (például oxigén gyököket, hidrogén-peroxidot és halid ionokat) választanak ki - szabályozottan - a vakuolákba. Sokkal kevesebbet tudunk az eozinofilekről, bár igen könnyen azonosíthatók, mivel nagyon jellemző a granuláció képe és bizonyítottan kapcsolatban vannak allergiás elváltozásokkal és bizonyos parazitás megbetegedésekkel, mint amilyen a trichinózis.

A makrofágok abban különböznek a granulocitáktól, hogy ezek megkülönböztető jellemvonásokat fejlesztettek ki, az őket körülvevő szövetektől függően. Tehát a szöveti makrofágok közé tartoznak a kötőszövetben lévő hisztiociták, a májban lévő Kupffer-sejtek, a tüdőben lévő alveoláris makrofágok, a csontszövetben lévő oszteoklasztok, az idegrendszer mikroglia sejtjei, a bőr Langerhans sejtjei, valamint a többi szervben lévő szabad vagy fix sejtek. Fagocitáló tulajdonságuk mellett a makrofágok sok nagyon fontos biológiailag aktív anyagot szekretálnak, például a következőket: lizozim, plazminogén aktivátor, kollagenáz, elasztáz, savanyú hidrolázok, komplement komponensek, prosztaglandinok, endogén pirogén anyagok, bizonyos limfokinek és oxigén metabolitok. Ezenkívül azt gondoljuk, hogy a makrofágok szabályozzák az antigének eljuttatását és prezentálását a B- és T-limfociták számára [M. Cline: The White Cell, Harvard University Press, Cambridge, MA., USA (1975)].

A kutatómunkát, amely a makrofágok, granulociták, T-sejtek és más, az immunválaszban résztvevő sejtek tanulmányozásán keresztül a neutropenia, lymphopenia, leukémia vagy a leukémiás reakciók, valamint más immun rendellenességek jobb megértését

HU 213 226 B (s ezáltal ezek potenciális gyógykezelését) szolgálják, az akadályozta eddig, hogy általában ezeket a sejteket nem lehetett in vitro fenntartani. Legutóbb azonban számos immunológus felfedezte, hogy ezek a sejtek izolálhatok és bizonyos esetekben tenyészthetők, ha más sejtekből származó szekrétumokon növekednek, például olyan közegben, amelyeket ConcanavalinA-val (ConA-val) stimulált lép-limfociták kondicionálnak. E munkák alapján ma már világossá vált, hogy a sejtklónok keletkezése specifikus faktoroktól függ, például a limfokinektől.

Nem kétséges, hogy majdnem minden vérsejt típus folyamatosan termelődik a felnőtt gerincesek csontvelőjében a hematopoetikus progenitor sejtek rangsorának növekedése és differenciálódása révén. E hierarchia csúcsán helyezkedik el a pluripotens őssejt, amely újra benépesíthet egy halálos mértékben besugárzott állatot majdnem minden - de lehet, hogy minden hematológiai sejttípussal (ilyenek a vörösvérsejtek, vérlemezkék, limfociták, a különböző granulociták és monociták-makrofágok). A pluripotens sejt nemcsak arra képes, hogy újra termelje a pluripotens őssejt-osztályokat (ön-megújulás), de indítást is ad a progenitor sejteknek, elkötelezvén őket egy meghatározott sejtvonalon való fejlődési folyamatra. Úgy látszik, hogy egy meghatározott irányban elkötelezett őssejt utódai ugyanazon sejtvonalra vannak elkötelezve, mint a szülő sejt [D. Metcalf: Hemopoietic Colonies, Springer Publishing Co., New York, NY., USA (1977)].

A hematopoézis in vitro tanulmányozása során megállapították, hogy számos szolubdis faktor szabályozhatja a különböző progenitor és elkötelezett sejt növekedését és differenciálódását. E faktorok egynémelyikét részlegesen tisztították és kimutatták, hogy ezek specifikusan hatnak meghatározott sejtvonalakhoz tartozó őssejtekre. Az eritropoetin például, amely elsősorban a vesében termelődik, a vörösvérsejt hierarchia leginkább differenciálódott tagjait stimulálja [T. Miyake és munkatársai, J. Bioi. Chem., 252, 5558 (1977)], azután a telepserkentő aktivitás, amely a T-sejtekben és a mikrofágokban képződik, főként a granulocitákat stimulálja és a csontvelő sejtek szemiszolid tenyészeteiben a makrofágok növekedését [E. Stanley és P. Heard, J. Bioi. Chem., 252, 4305 (1977)]. Úgy látszik, hogy más típusú növekedési faktor képes stimulálni az egyetlen sejttípusból álló hematopoetikus telepeket és megint más a sejtek keverékeit. A sejtek egész sora, például az eritrociták, megakariociták, granulociták, hízó sejtek és a monocita/makrofágok minden bizonnyal ezen második típushoz tartozó egy faktorra reagálnak, amelyet ezért több sejtvonalra ható sejtnövekedési faktornak neveznek [N. Iscove és munkatársai, J. Cell. Physiol. Suppl. 1, 65-78 (1982)], jelezvén ezzel azt a képességét, hogy számos elkötelezett progenitor sejtre és pluripotens őssejtre is hat.

Tudjuk, hogy a telepserkentő aktivitás különböző molekuláris formában létezik, és ezeket együttesen telepserkentő faktoroknak (CSF = Colony Stimulating Factor) nevezik. A CSF-ek egy glükoprotein családot alkotnak, molekulatömegük 20 000-70 000 dalton, s megtalálhatók a vérben és a vizeletben. A faktoroknak azt a csoportját, amelynek tagjai mind a granulocita, mind a makrofág telepek kifejlődését serkentik szemiszolid tenyészetekben [lásd D. Metcalf: Hematopoietic Colonies; In Vitro Cloning of Normál and Leukemic Cells; Springer Publishing Co., New York (1977)] „GM-CSF faktorok”-nak nevezik.

Míg mind az egér, mind a humán GM-CSF faktorok legalábbis részlegesen tisztították és biokémiai vizsgálatuk is megtörtént, mindkét anyag molekulatömegére és aktivitás spektrumára - még fajtán belül is nagymértékben eltérő közlések jelentek meg [D. Metcalf: „Hematopoietic Colony Stimulating Factors” a Handbook of Experimental Pharmacology 57. kötetének 343-384. oldala; Springer Verlag, New York (1978)]. Amíg az egérfélék GM-CSF aktivitását meghatározó cDNS-ek eredményes klónozása [N. Gough és munkatársai, Natúré, 309, 763-767 (1984)] számos, az egérfélék GM-CSF faktoraival kapcsolatos kérdésekre adandó válasznál segítséget jelent, addig a humán rendszerrel kapcsolatos problémák még fennállnak. Ugyanis két kutató csoport két humán GM-CSFről jelentetett meg közleményeket [S. Das és munkatársai, Blood, 58, 630-641 (1981) és N. Nicola és munkatársai, Blood, 54, 614-627 (1979)]. Valóban, bár a humán GM-CSF-et kódoló mRNS (egy T-limfocita sejtvonalból izolálták; ATCC letéti száma CRL 8066; lásd a 4 438 032 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást) in vitro transzlációja a leközölt biológiailag aktív protein előállítása céljára megtörtént, a humán CSF-eket körülvevő bizonytalanság óriási mértékű maradt [lásd. A. Burgess: Growth Factors and Stem Cells, 4. fejezet, 93-124. oldal; Academic Press, New York (1984)].

Jóllehet a molekulatömegbeli különbségeket talán a változó mértékű glükozilációval részben meg lehetne magyarázni, azonban az ügy tisztázására és a molekula által kifejtett aktivitás spektrumot illetően, a molekula szerkezetre vonatkozó kiegészítő adatokra van szükség, például elsősorban a szóbanforgó molekula teljes szekvencia analízisére. A protein szekvenálása természetesen a probléma megoldásának egyik lehetséges módja, amely igen nehéz kísérleti munkát igényel és gyakran nem is kapjuk meg sem a teljesen pontos, sem a molekula teljes hosszának megfelelő aminosav szekvenciát. Minthogy azonban humán GM-CSF aktivitást kifejtő polipeptidekből nagyobb mennyiségek előállítására van már kapacitás, ez nagyban meg fogja könynyíteni a granulociták, makrofágok és más, az immunválaszban résztvevő sejtek biológiájának tanulmányozását, például azáltal, hogy csökken a ConA-val kondicionált közegekre való támaszkodás szükségessége a sejtnövekedés stimulálása érdekében. Ha bármelyik humán CSF-re pontos és teljes szekvenciaadatok állnak rendelkezésre, ez egyszerűsíteni fogja majd a keresést más immunológiai faktorok irányában is. Végül, bármely limfokinre vonatkozó kiegészítő információ segítséget nyújt ahhoz, hogy meghatározzuk a különböző növekedési faktoroknak és az immun térháló sejtjeinek szerepét, miáltal betekintést nyerünk az

HU 213 226 B egész immunrendszerbe, s ez egyben a gyógyászati felhasználás lehetőségeit is megteremti.

Tehát kifejezetten szükségünk van a humán GMCSF aktivitással rendelkező proteineket kódoló DNSek nukleotid szekvenciájának és a proteinek aminosav szekvenciájának pontos adataira, továbbá olyan egyszerű és gazdaságos módszerre, amelynek segítségével ezeket az anyagokat tekintélyes mennyiségben és lényegében tisztán elő tudjuk állítani. Ez a találmány teljesíti ezeket a kívánalmakat.

Jelen találmány olyan cDNS kiónok előállítására vonatkozik, amelyek humán GM-CSF aktivitást kifejtő polipeptideket kódolnak. Az 1. ábrán egy cDNS nukleotidszekvenciáját és az ennek megfelelő polipeptid feltételezett aminosavszekvenciáját mutatjuk be. A cDNS szekvenciát különböző vektorokba építhetjük be, s ezután e szekvencia gazdasejtek változatos fajtáiban - beleértve az eukarióta sejteket, például a tenyésztett emlős sejteket - irányíthatja a megfelelő polipeptidek szintézisét.

Részletesebben: a találmány tárgya eljárás humán GM-CSF aktivitást kifejtő polipeptid előállítására. Az eljárás a következő lépésekből áll:

(a) a szóbanforgó polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciát magába foglaló vektor megszerkesztése úgy, hogy a nukleotidszekvencia képes legyen a vektort tartalmazó gazdasejtben kifejeződni;

(b) a vektor beépítése a gazdasejtbe; és (c) a vektort tartalmazó gazdasejt fenntartása olyan körülmények között, amelyek a nukleotid szekvenciának a szóbanforgó polipeptiddé történő kifejeződéséhez megfelelnek.

Előnyös, ha a cDNS szekvenciák egy, a polipeptideket kódoló, nem transzformált T-sejt mRNS szekvenciából származnak és a gazdasejt egy olyan szervezet - ilyen egy eukarióta sejt, például egy emlős sejt amelyet vektorral transzficiáltunk vagy transzformáltunk. Ezenfelül előnyös, ha a vektor egy második nukleotidszekvenciát is tartalmaz, amely a polipeptidet kódoló nukleotidszekvencia kifejeződését szabályozza. Ez a második kódoló szekvencia egy promoter szekvenciát, egy vagy több intron szekvenciát és egy poliadenilációs szekvenciát tartalmazhat, amelyek lehetővé teszik a polipeptidet meghatározó nukleotidszekvencia transzkripcióját és a splicing, illetve poliadeniláció megvalósulását. Abban az esetben, ha a gazda egy emlős sejt, mint a COS-7 majom vesesejt, a vektor a Simian vírus 40 (SV40) korai promoter régiójának promoter szekvenciáját és az SV40 késői poliadenilációs régiójának poliadenilációs szekvenciáját tartalmazza.

Az 1. ábrán (lásd alább) bemutatott cDNS szekvencia képes más DNS szekvenciákkal hibridizálni, például olyan cDNS-sel vagy genom gyűjteményből való DNS-sel, amelyek más emlős növekedési faktorokat határoznak meg. Megjegyezzük, hogy a leírt cDNS szekvenciák - úgy tűnik - egy vezérszekvencia információját is tartalmazzák.

Jelen találmány polipeptidjei képesek arra, hogy humán neutrofil granulociták, makrofágok és más sejtek (például eozinofil sejtek) növekedését, különösen in vitro tenyészetekben serkentsék. Megfelelő gyógyszerek készíthetők belőlük, ha a polipeptideket (ezek a készítmények lényegében más humán növekedési faktorokat nem tartalmaznak) gyógyászatilag kompatíbilis hordozókhoz adjuk.

A találmány más vonatkozásait és előnyeit a csatolt ábrákkal és példákkal együtt az alant következő részletes leírások világosítják meg.

Most ismertetjük az ábrákat: Az 1. ábrán egy humán GM-CSF aktivitású cDNS-klón nukleotidszekvenciáját és az ennek megfelelő feltételezett aminosavszekvenciát mutatjuk be. A

2A ábra a pcD-human-GM-CSF elnevezésű plazmidot ábrázolja, amely humán GM-CSF aktivitással rendelkező cDNS kiónt hordoz. A

2B ábra a 2A ábrán látható cDNS inszertum restrikciós térképét (restrikciós endonukleázokkal való hasítások segítségével meghatározva) ábrázolja. A

3. ábra az egér és a humán GM-CSF feltételezett aminosavszekvenciái közti összehasonlítást mutatja be.

E találmány alapján olyan cDNS kiónokat állítunk elő, amelyek humán GM-CSF aktivitású polipeptideket kódolnak. A cDNS szekvenciákat replikációra képes kifejező vektorokba építjük be, majd a vektorokkal megfelelő gazdasejtet transzficiálunk (például emlős sejt tenyészetet), s a kifejeződött polipeptid vagy polipeptidek képesek lesznek arra, hogy a neutrofil granulociták, makrofágok és más hematopoetikus sejtvonalak (például eozinofilek) kifejlődését elősegítsék.

Példaként az izolált nukleotidszekvencián alapuló feltételezett aminosavszekvenciát mutatjuk be az 1. ábrán. A humán GM-CSF cDNS egyetlen nyitott leolvasási rendszere 144 kodonból áll. A feltételezett iniciációs kodontól lefelé (downstream) egy hidrofób aminosavakban gazdag szakasz helyezkedik el. Lehetséges tehát, hogy a szekretált humán GM-CSF érett formája szerin csoporttal kezdődik és az ezt megelőző 23 aminosav egy vezér régiót képez, amelyet proteolitikus folyamatban eltávolíthatunk. Ennélfogva az egyik megvalósítási eljárásban a humán GM-CSF mintegy 121 aminosavból állna, amelynek számított molekulatömege körülbelül 13 500 dalton (nem glükozilált). Úgy tűnik, hogy itt két potenciális N-glükozilációs hely van [Asn-X-Ser/Thr; A. Neuberger és munkatársai, Glycoproteins, 5, 450-490, Elsevier Publishing Co., USA (1972)] a 44-46. és az 54-56. pozícióban, s ez szintén hozzájárulhat ahhoz, hogy a szakirodalomban a molekulatömeggel kapcsolatban eltérések fordulnak elő.

Ha a találmány szerinti cDNS kiónokat transzfekció révén COS-7 majom sejtekbe vagy más alkalmas expressziós rendszerekbe visszük be, akkor e kiónok a biológiailag aktív humán GM-CSF szintézisét fogják irányítani. Ha a kifejeződött klónozott génterméket hematopoetikus progenitor sejt tenyészetekhez adjuk hozzá, úgy a termék elősegíti a fogékony sejtek fejlő4

HU 213 226 B dését és/vagy ezek tenyészetben való fenntartását. A kifejeződött polipeptidek a humán GM-CSF-hez kapcsolódó, megfelelő aktivitást fogják kifejteni.

Különböző módszereket alkalmazhatunk a találmány szerinti cDNS-ek előállítására. Például az összmRNS-t kivonjuk [például Berger és munkatársai szerint, Biochemistry, 18, 5143-5149 (1979)] a humán GM-CSF-aktivitású polipeptideket termelő sejtekből (például nem transzformált T-sejtekből). Az összmRNS-ből úgy szerkeszthetjük meg a kétszálú cDNS-t, hogy primerrel megindított reverz transzkripcióval [I. Verma, Biochim. Biophys. Acta, 473, 1-38 (1977)] először előállítjuk minden egyes mRNS szekvencia komplementerét, ezután priming segítségével a második szál szintézise következik [H. Land és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 9, 2251-2266 (1981)]. Ezt követően a cDNS-t megfelelő plazmid vagy bakteriofág vektorokba klónozhatjuk be [F. Rougeon és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 2, 2365-2378 (1975) vagy G. Scherer és munkatársai, Dev. Biok, 86, 438-447 (1981)] komplementer homopolimer farkak révén [A. Efstratiadis és munkatársai, Cell, 10, 571-585 (1977)] vagy ragadós végek segítségével, amelyeket alkalmas restrikciós helyeket tartalmazó linker szegmentumokkal alakíthatunk ki [P. Seeburg és munkatársai, Natúré, 270, 486-494 (1977) vagy J. Shine és munkatársai, Natúré, 270, 494-499 (1977)], ezután e vektorokkal megfelelő gazdasejteket transzformálunk [lásd általánosságban: A. Efstratiadis és L. Villa-Komaroff: „Cloning of double stranded cDNS” című munkáját a következő kiadványban: J. Setlow és A. Hollaender (szerkesztők), Genetic Engineering, 1. kötet, Plenum Publishing Corp., NY., USA (1982)].

Egy előnyös eljárást dolgozott ki H. Okayama és P. Berg [Mól. and Cell. Bioi., 2, 161-170 (1982)] a találmány szerinti teljes hosszban klónozott cDNS-ek előállítására. Ennek a módszernek az az előnye, hogy a cDNS inszertumot egy bakteriális klónozó vektorban olyan helyre építjük be, hogy a cDNS közvetlenül transzlatálható és kifejezhető legyen emlős sejtekben is. Röviden: az első cDNS szálat úgy kapjuk, hogy egy lineáris plazmid vektor DNS-ének egyik végéhez kovalens kötéssel polidezoxitimidil-savat kapcsolunk. A plazmid vektort ezután gyűrűbe zárjuk egy DNS-linker darabbal, amely a plazmid egyik végét a cDNS kódoló szekvencia 5'-végével köti össze. Egy Simian vírus 40 (SV40) korai promoter régiót és egy módosított SV40 késői intron régióval rendelkező linkért tartalmazó DNS fragmentum felhasználásával, a cDNS COS-7 majom vesesejtekben in vitro kifejezhető, további módosítás nélkül [lásd általánosságban: H. Okayama és P. Berg, Mól. and Cell. Bioi., 3, 280-289 (1983) és D. Jolly és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 477481 (1983)].

Mihelyt az Okayama/Berg plazmid vektorban a cDNS gyűjtemény teljessé válik, a cDNS kiónokat összegyűjtjük, majd randomizált pooljait a kívánt cDNS-ek jelenlétére vizsgáljuk hibrid szelekcióval, transzlációval és egyéb módszerekkel (például megmérjük a sejttenyészetekben a GM-CSF aktivitást, vagy antigén determinánsok jelenlétére vagy más biológiai hatások kimutatására végzünk vizsgálatokat). Ezután a pozitívnak bizonyult poolokat egyedi kiónokra osztjuk fel, amelyeket alkalmas gazdasejt (ilyen egy emlős sejt tenyészet) transzfekciója révén tesztelünk úgy, hogy a gazdasejtek felülúszóját a kívánt aktivitásra vizsgáljuk. A pozitív kiónoknál ezután szekvenciaanalízist végzünk.

A kívánt cDNS-klónok kimutatására és izolálására szolgál a hibridizációs vizsgálattal való szűrés, megfelelő mRNS minták segítségével [H. Heindell és munkatársai, Cell, 75, 43-54 (1978)]. A cDNS gyűjteményt hibridszelekciós eljárással [M. Harpold és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 5, 2039-2053 (1978) vagy J. Parnes és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 22532257 (1981)] vagy Xenopus oociták segítségével [J. Aurdon, Natúré, 233, 177-182 (1971)] is szűrhetjük [lásd: általában L. Villa-Komaroff, Proc. Natl. Acad. Sci., 75, 3727-3731 (1978)].

A találmány szerinti cDNS-klónok előállítására vonatkozó eljárások most következő leírásában először a sejtek eredetét taglaljuk, majd más sejtvonalakról lesz szó. Ezt követi a humán GM-CSF-aktivitású proteint kódoló mRNS izolálására szolgáló eljárások általános leírása. A továbbiakban a cDNS-szekvenciákat tartalmazó cDNS gyűjtemény létesítése, a teljes hosszúságú cDNS kiónok izolálása plazmid vektorból és emlős sejtekben való kifejeződésük, szubklónozás és baktériumokban és élesztőben való kifejeződés, tisztítás és a készítmény leírása a sorrend. A teljes kísérleti munka részletesebb leírása ezután következik.

T-sejt és más sejtvonalak

A különböző sejtek széles változatát használhatjuk fel humán GM-CSF aktivitás forrásául [lásd például: A. Burgess: Growth Factors and Stem Cells, Academic Press, New York, 43-124 oldal (1984)]. Előnyös forrás a helper T-sejtvonal, de a humán perifériás vér [D. Verma és munkatársai, Brit. J. of Haemat., 57, 505-520 (1984) és P. Hasketh és munkatársai, Blood, 63, 1141— 1146 (1984)], a makrofágok és humán GM-CSF aktivitást kifejtő más sejtek is [B. Bodeker és munkatársai, Immunbioi., 766, 12-23 (1984)] megfelelnek. Ide tartoznak a hybridomák és a transzformált sejtvonalak [J. Gasson és munkatársai: „Lymphokines and Hematopoiesis”, Normál and Neoplastic Hematopoiesis, Alán R. Liss, Inc., New York (1983)].

A humán GM-CSF aktivitás vizsgálata szempontjából igen kedvező forrás a humán csontvelő, amelyet olyan donoroktól veszünk le, akik nem szenvednek hematológiai betegségben. Azonban a humán köldökzsinór-vér és a lép is megfelelő forrás, feltéve, ha a kivétel után 12-48 órán belül használjuk fel.

A CSF aktivitás meghatározásához a kiindulási hematopoetikus sejtből egysejt szuszpenziót készítünk. Az egyedi sejteket, tápanyagokat és rendszerint fetális borjúszérumot tartalmazó szemiszolid (agar) vagy viszkózus (metilcellulóz) táptalajban immobilizáljuk. Megfelelő stimuláló faktor jelenlétében az egyedi sejtek szaporodni és differenciálódni fognak. Minthogy a

HU 213 226 B kezdő sejteket immobilizáltuk, telepek keletkeznek, ahogy a sejtek szaporodnak és érnek. Ezeket a telepeket 7-14 nap múlva vizsgálhatjuk [A. Burgess: Growth Factors and Stem Cells, 52-55. oldal, Academic Press, New York (1984)].

[A granulociták és makrofágok növekedésére vonatkozó specifikus felhasználást illetően lásd: T. Bradley és D. Metcalf, Aust. J. Exp. Bioi. Med. Sci., 44, 287-30 (1966) és általánosságban D. Metcalf: Hemopoietic Colonies, Springer Verlag, Berlin (1977)]. Ha szükséges, akkor az egyedi telepeket kivesszük, tárgylemezre visszük, ahol fixáljuk és Wright/Giemsa szerint festjük [Todd-Sanford, Clinical Diagnosis by Laboratory Methods, 15. kiadás, szerkesztők: Davidson és Henry (1974)]. Az egyes telepekben lévő sejttípusokat morfológiájuk alapján határozzuk meg.

Az mRNS izolálása és cDNS gyűjtemény létrehozása

Különböző jól ismert módszerekkel izolálhatjuk a sejtek össz-mRNS tartalmát [például: A. Przybla és munkatársai, J. Bioi. Chem., 254, 2154—2158 (1979)], de a legelőnyösebb eljárás a Chirgwin és munkatársai által kidolgozott guanidínium-tiocianátos extrakciós módszer [Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)]. Ha ezt a módszert használjuk, akkor körülbelül 10 pg - oligo (dT) cellulóz oszlopokon elválasztott - poliA⁺ mRNS-t kapunk 1-2T0⁸ aktivált humán helper T-sejtből.

A poliA⁺ mRNS-ből a cDNS gyűjteményt legcélszerűbben a pcDVl vektor-primer és a pLl linker fragmentum (beszerezhetők a P-L Biochemicals Inc., Milwaukee, WO, USA cégtől) felhasználásával hozhatjuk létre, mégpedig olyan eljárásokkal, amelyek az mRNS teljes hosszában átírt másolatainak nagymértékű feldúsulását eredményezik [például: H. Okayama és P. Berg, Mól. Cell. Bioi., 2, 161-170 (1982) és Mól. Cell. Bioi., 3, 280-289 (1983)]. A plazmid vektor, amely az SV40 korai promoterét és az SV40 RNS processzor szignáljait tartalmazza, arra szolgál, hogy elősegítse a klónozott cDNS szegmentum kifejeződését emlős sejtekben.

Az Okayama-Berg eljárás alkalmazásával a gyűrűs vektor-cDNS preparátummal kompetens baktériumsejteket transzformálunk, például E. coli MC1061 sejteket [M. Casadaban és S. Cohen, J. Mól. Bioi., 138, 179-207 (1980)], kalcium-klorid használatával [S. Cohen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 2110— 2114 (1972)]. ConA-val stimulált sejtekből származó poliA⁺ mRNS 5 pg-jából kiindulva, körülbelül 1,510⁶ független transzformált sejtet kaphatunk. Rendszerint körülbelül 10⁴ egyedi kiónt emelünk ki és ezeket mikrotitráló lemezek [Flow Laboratories Inc., McLean, Virginia, USA] tartályaiba oltjuk át, amelyek 200 μΐ L-levest, 50 pg/ml ampicillint és 7% DMSO-t (dimetilszulfoxid) tartalmaznak. Ha kívánatos, fiók-gyűjteményeket is képezhetünk a teljes cDNS gyűjteményből a cDNS inszertumok nagysága alapján, ahogyan ezt H. Okayama és P. Berg leírták [Mól. Cell. Bioi., 3, 280289 (1983)]. Röviden: a plazmid DNS-t Sall-vel, Clalvel és HindlII-mal emésztjük külön-külön, ezután 1%os agaróz gélben elektroforetizálunk. Etidium-bromiddal való festés után a gélt 7 részre szeleteljük a cDNS inszertumok nagyságának megfelelően, azaz 0-1, 1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6 és nagyobb mint 6 kb (kilobázis pár) hosszúságnak megfelelően. A szeletekből kivont DNS-t T4-DNS ligázzal reciklizáljuk és ezt használjuk az MCI061 törzs transzformálására. A nukleotid szekvencia analíziseket A. Maxam és W. Gilbert szerint [Methods Enzymol., 65, 499-560 (1980)] végezhetjük.

Majom sejtek transzfekciója DNS-sel

Atranszfekció előtti napon körülbelül 110⁶ COS-7 majom vesesejtet oltunk 60 mm-es lemezekre. A transzfekciókat legalkalmasabban 15 pg plazmid DNS-sel végezzük, 1,5 ml DME tápoldatban, amely 50 mmól trisz-HCl-t (pH = 7,4) és 400 pg/ml DEAEdextránt (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Svédország) tartalmaz. Ezt az oldatot azután 4 óra elteltével eltávolítjuk és 4% fetális borjúszérumot tartalmazó 20,0 ml DME tápoldattal helyettesítjük. A tápoldatot 72 óra múlva összegyűjtjük és humán GM-CSF-aktivitásra vizsgáljuk, ahogy ezt fent leírtuk. A DNS-sel L-sejteket és még számos más sejtet (lásd alább) transzficiálhatunk.

Rokon gének izolálása

A találmány cDNS kiónjait felhasználhatjuk rokon géneket kódoló nukleotidszekvenciák azonosítására és izolálására. Minthogy a homológ gének közt gyakran nagyon alacsony fokú a homológia, szigorú hibridizációs körülményeket kell teremteni ahhoz, hogy a csak 70-80%-ban homológ szekvenciák közt is végbemenjen a kereszthibridizáció.

Számos különböző kísérleti eredményt használtunk fel a rokon gének felkutatásánál. Például: humán immunglobulin könnyű lánc C^K gént izoláltunk a megfelelő egér C^K génnek próbaanyagként való felhasználásával [P. Heiter és munkatársai, Cell, 22, 197-207 (1981)] és egér transzplantációs antigén géneket izoláltunk humán megfelelőjét kódoló DNS kiónok segítségével, hibridizálással [T. Steinnetz és munkatársai, Cell, 24, 125-134(1981)].

Ami a genom DNS-t illeti, egy előnyös módszer szerint, homológ géneket tartalmazó DNS gyűjteményből fág kiónokat viszünk lemezre [T. Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning, A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, USA (1982)] olyan sűrűségben, hogy egy megfelelő gazdatörzs esetében ilyen az E. coli LE392 - 150 mm-es lemezenként 210^5 10⁴ plakk képződjék. Tíz-húsz lemez rendszerint elégséges.

A lemezeket 10-12 órán át 37 °C-on inkubáljuk, majd 2 óra hosszat fagyasztjuk, ezután 132 mm-es nitrocellulóz szűrőmembránokat helyezünk a lemezeken lévő agar felszínére. A szűrőket legalább 5 percig hagyjuk érintkezni a lemezekkel, mialatt a szűrőmembránokat úgy érintkeztetjük a lemezekkel, hogy tintával töltött 22-es tűvel megszurkáljuk. A szűrőket ezután lehámozzuk a lemezekről, majd egymás után legalább 2 percig inkubáljuk először 250 ml 0,1 n nátrium-hidroxid és 0,5 mól nátrium-klorid tartalmú oldatban, ezután

HU 213 226 B

250 ml 0,5 mól trisz'HCl (pH = 7,5) és 1,5 mól nátrium-klorid tartalmú oldatban. A szűrőket papírtörülközőkön szántjuk és ezután 4-8 órán át 80 °C-on hevítjük.

Hibridizáláshoz a szűrőket SET oldatban [0,15 mól NaCl, 30 mmól trisz-HCl (pH = 8,0), 1 mmól Na₂EDTA] nedvesítjük, majd a következő összetételű oldatban inkubáljuk - állandó rázás mellett - 2 órán át 65 °C-on: 3xSET, 5xDenhardt [D. T. Denhardt, B. B. R. C., 23, 641-646 (1986)], 10% dextrán-szulfát, 0,1% SDS és 50-50 pg/ml poli(rA), poli(rC) és poli(rG). Szűrőlemezenként 1,5-2 ml oldatot használunk. Ezt az oldatot elöntjük és a szűrőket 0,5 pg (>10⁸ cpm) GMCSF cDNS-ből készült nick-transzlatált próbaanyaggal hibridizáljuk frissen készített ugyanilyen oldatban szűrőnként 1,5-2 ml oldatban -65 °C-on egy órán át és ezután 55 °C-on 12-20 órán át. A szűrőket ezután egymás után mossuk a következő oldatokban: 3xSET, lxDenhardt; 0,1%-os SDS; lxSET, 0,1% SDS. A mosást szűrőnként 10-15 ml oldattal végezzük 1 órán át 55 ”C-on, enyhe rázogatás mellett. A szűrőket papírtörülközőkön szárítjuk, majd autoradiográfiás vizsgálatot végzünk - megfelelő filmmel és erősítő szűrővel 12-24 órán keresztül. Az agar lemezekről steril Pasteur pipettával levesszük a hibridizált plakkokat és ezeket egyenként 1-1 ml 0,1 mól NaCl, 0,01 mól trisz-HCl (pH = 7,5), 10 mmól MgCl₂, 100 pg/ml zselatin összetételű oldatba - 50 pl kloroform hozzáadása mellett tesszük át. Az oldatokat legalább 4-8 órán át hideg helyen tartjuk, majd a plakkok fágjait újra szűrővizsgálatnak vetjük alá alacsony sűrűség mellett (20004000 plakk/150 mm-es lemez) a fent már leírt módszer szerint.

Kifejeződés E. coliban, élesztőben és sejt tenyészetben

A prokarióták, ilyen az E. coli, igen alkalmasak a jelen találmány szerinti polipeptidek expressziójához (lásd például 4 338 397 és 4 411 994 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat), feltéve, ha nem kívánjuk meg a glükozilált formát.

Magas szintű kifejeződés eléréséhez promotereket kell alkalmazni, ilyen a β-laktamáz (penicillináz) és laktóz promoter rendszer [Chang és munkatársai: Natúré, 275, 615 (1978); Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977); Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 (1979)] vagy a triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 8, 4057 (1980)] a Shine-Dalgamo szekvenciákkal összekapcsolva.

Azok, akik ezen a szakterületen jártasak, tudják, hogy nemcsak prokarióták, hanem eukarióta mikroorganizmusok, például ilyen az élesztő, szintén használhatók proteinek előállításához. A Saccharomyces cerevisiae igen előnyös eukarióta mikroorganizmus. Az élesztő vektorokhoz alkalmas promoter szekvenciák közé tartoznak a 3-foszfoglicerát-kináznak [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 12 073-12 080 (1980)] vagy a glükolizis más enzimeinek [Hess és munkatársai, Adv. Enzyme Reg., 7, 149-167 (1969);

Holland és munkatársai, Biochemistry, 17, 4900-4907 (1978)] a promoterei. Más promotereket is használhatunk, amelyeknek még ezenkívül az az előnyük, hogy növekedési körülmények által szabályozott transzkripciójuk van. Alapjában véve bármelyik olyan plazmid vektor alkalmas, amelyik egy élesztővel kompatíbilis promotert, egy replikációs kezdőpontot és terminációs szekvenciákat tartalmaz.

A humán GM-CSF előállításának egy előnyös módszere - a találmány szerinti cDNS-ek felhasználásával - az élesztő mating feromon α-faktor szekretoros folyamatot alkalmazza [D. Julius és munkatársai, Cell, 32, 839-852 (1983)]. A S. cerevisiae mating-type specifikus oligopeptid feromonokat szekretál. A ΜΑΤ a sejtek a-faktort választanak el, amelyek a MÁT sejtek növekedésének leállását indukálják a sejtciklus G1 fázisában [J. Thorner: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1981); lásd főként a 143-180. oldalakat]. Az α-faktor először mintegy nagy prekurzor molekula szintetizálódik, amely egy körülbelül 20 aminosavból álló NH₂ - terminális szignál szekvenciából áll, ezt követi kiegészítésül egy 60 aminosavból álló vezér szekvencia, majd négy azonos, ismétlődő érett a-faktor szekvenciával fejeződik be. Az ismétlődő részeket 6 vagy 8 aminosavból álló spacerek (Lys-Arg-Glu-AlaGlu-Ala és Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-) vagy Asp-(AlaGlu-Ala) választják el egymástól. Ez a pre-pro-a-faktor számos specifikus helyen hasad. Az első folyamatban a spacer szekvencia Lys-Arg párjának COOH-terminális része hasad, amelyet a KEX2 terméke katalizál [Julius és munkatársai, Cell, 37, 1075-1089 (1984)]. Egy karboxipeptidáz-B-szerű enzim a Lys-Arg pár NH₂-terminális oldalán hasít. A végső lépés a Glu-Ala vagy Asp-Ala párok eltávolítása diamino-peptidázzal, amelyet a STE13 kódol. J. Brake és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 4642-4646 (1984)] kimutatták, hogy ha az érett humán proteineket kódoló szekvencia az első folyamat helyén fuzionál, akkor bekövetkezik az ilyen proteinek szekretálása.

Azt a pMF-alpha-8 elnevezésű általános élesztő kifejező vektort, amely az alfa-faktor promotert és a downstream vezérszekvenciát más elemekkel együtt tartalmazza, letétbe helyeztük az ATCC intézményénél (letéti szám: ATCC 40140). Szerkesztése a következőképpen történik.

Egy 1,7 kb hosszú EcoRI fragmentumot, amely az MFal gént hordozza [J. Kurjan és I. Herskowitz, Cell, 30, 933-943 (1982)] beklónozzuk és M13mp8 EcoRI restrikciós helyére [J. Viera és J. Messing, Gene, 19, 259-268 (1982)]. Annak érdekében, hogy az első spacer szakasz lizin kodonja után egy HindlII helyet vezessünk be, a TCTTTTATCCAAAGATACCC szintetikus oligonukleotidet az M13-MFal egyszálú DNSével hibridizáljuk és az oligonukleotid prímért meghosszabbítjuk a DNS polimeráz I Klenow fragmentje segítségével. SÍ nukleázzal való kezelés után a DNS-t EcoRI-vei hasítjuk és az MFal promotert hordozó fragmentumot és a vezér szekvenciát az EcoRI helyre klónozzuk, majd beépítjük a pUC8 HindlII restrikciós

HU 213 226 B helyére (lásd J. Viera és J. Messing fent idézett közleményét). Ezután izolálhattuk a kívánt szerkezetű plazmidot, jele: ρΜΡα4Δ1. ApMFcz4Al plazmidot HindlIImal hasítjuk és részlegesen betöltjük a DNS polimeráz I Klenow fragmentje segítségével, dATP és dGTP jelenlétében. A DNS-t mung bean nukleázzal (mung bean = arany paszuly = Phaseolus aureus) kezeljük és hozzákapcsoljuk a GCCTCGAGGC oligonukleotid linkért. A keletkező plazmid (jele: pMFa5) egy Stul hasítási helyet fog tartalmazni közvetlenül az arginin kodon után, s ezt egy Xhol restrikciós hely követi. Egy

S. cerevisiae - E. coli ingázó vektort (pTRP584) a következőképpen szerkeszthetünk meg: a Pstl-Xbal fragmentumot, amely a 2 pm plazmid replikációs kezdőpontját tartalmazza [lásd J. Broach fent idézett közleményét], beklónozzuk a pTRP56 [Miyajima és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 4, 407-414 (1984)] Clal restrikciós helyére és a TRP1-ARS1 frgmentumon belüli Stul restrikciós helyet PvuII restrikciós hellyé konvertáljuk PvuII linker beépítése révén. Az eredeti pTRP56 Knpl restrikciós helyét Xhol-re konvertáljuk Xhol linker beépítésével. A pMEoc8 általános szekréciós vektort ezután úgy kapjuk meg, hogy a pMFoc5 BglII-XhoI fragmentumot beépítjük a pTRP584 BamHI-XhoI restrikciós helyeire.

Akik e szakterületen jártasak, belátják, hogy a humán GM-CSF-et meghatározó cDNS kiónok ezután könnyen beépíthetők a pMFa8 vektorba, amellyel ezt követően élesztősejtet transzformálhatunk humán GM-CSF termelése érdekében. Például: egy 1,0 kb hosszú, az egész humán GM-CSF cDNS-t hordozó BamHI fragmentumot beklónozunk az M13mp8 BamHI restrikciós helyére [J. Viera és J. Messing, Gene, 19, 259-268 (1982)]. Abból a célból, hogy egy érett proteint kódoló szekvenciát hordozó kétszálú fragmentumot állítsunk elő, egy

AGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCAT szekvenciájú oligonukleotid prímért szerkesztünk. Ezt a prímért azután a humán GM-CSF cDNS-t hordozó, egyszálú M13mp8-cal hibridizáljuk és meghosszabbítjuk a DNS polimeráz I Klenow fragmentje segítségével. A kétszálú DNS-t BamHI-vel hasítjuk, majd az egyszálú szakaszt mung bean nukleázzal távolítjuk el. Ezután az érett humán GM-CSF proteint kódoló szekvenciát tartalmazó kétszálú fragmentumot izoláljuk és beklónozzuk a pMF 8 általános szekretáló vektor Stul restrikciós helyére. A pMF 8 plazmid DNS-ét (ez hordozza a TRP1 gént) bejuttathatjuk élesztő sejtekbe lítium-acetát módszerrel [H. Ito és munkatársai, J. Bacteriol., 153, 163-168 (1983)] és a transzformált sejteket triptofán mentes szintetikus táptalajban szelektálhatjuk. A transzformált sejteket ezután 0,5% Casamino acid készítménnyel kiegészített közönséges táptalajon tenyésztjük. Az élesztő sejteket összegyűjtjük úgy, hogy először 1 mmól PMSF (fenil-metil-szulfonil-fluorid) tartalmú PBS-ben (foszfáttal pufferolt konyhasó oldat) reszuszpendáljuk, majd a sejteket savval mosott üveggyöngyökkel való erőteljes rázással roncsoljuk. Tiszta felülúszót kapunk 10 000 ford./perc mellett 15 percig tartó centrifugálással.

A mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetekből származó sejttenyészeteket (különösen emlős sejteket) is fel lehet használni gazdaszervezet gyanánt. Alkalmas gazda-sejtvonalak például a következők: HeLa sejtek, kínai hörcsög petefészek sejtvonal és újszülött hörcsög-vese sejtvonal. Az ezekhez a sejtekhez való kifejező vektorok általában szükségszerűen tartalmaznak egy replikációs kezdőpontot, egy promotert, ami a kifejezendő génnel szemben helyezkedik el, valamennyi szükséges riboszóma kötőhely mentén RNS illeszkedési helyeket, poliadenilációs helyeket és transzkripciós terminátor szekvenciákat. Az expressziós vektor, ha emlős sejtekben alkalmazzuk, gyakran szabályozó funkciókat lát el, s ezt vírus eredetű anyag szolgáltatja. Az általánosan használt promoterek például polyoma vírusból, adenovírus-2-ből és leggyakrabban az SV40-ből származnak [lásd például a 4 399 216 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást, továbbá: D. Gheysen és W. Fiers, J. of Mól. and Appl. Genetics, 1, 385-394 (1982)].

Tisztítás és gyógyszerkészítés

Az E. coliban, élesztőben vagy más sejtben kifejeződött humán GM-CSF polipeptideket a szakterület standard módszerei szerint tisztíthatjuk, ideértve az ammónium-szulfáttal való kicsapást, az oszlopkromatográfiás frakcionálási (például: ioncserélő kromatográfia, gélszűrés, elektroforézis, affinitás kromatográfia stb.) és a végső kristályosítást [lásd általánosságban: „Enzyme Purification and Related Techniques”, Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1977) és R. Scopes: Protein Purification: Principles and Practice, Springer Verlag, New York (1982)]. A találmány szerinti részlegesen vagy homogenitásig tisztított polipeptideket fel lehet használni kísérleti célra, például sejttenyésztéshez szolgáló tápoldatok (ilyenek az Eagle-féle minium essential médium, az Iscove által módosított Dulbecco táptalaj vagy az RPMI 1640 táptalaj, melyek az alábbi cégektől szerezhetők be: SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO„ USA; GIBCO Division, Chagrin Falls, OH., USA) kiegészítésére és mint antigént, specifikus immunglobulinok előállítására, amelyek immunassay-kben, immunfluoreszcens festéseknél stb. kerülnek felhasználásra [lásd általánosságban: Immunological Methods, I—II kötet, I. Lefkovits és B. Pemis (szerkesztők), Academic Press, New York, NY. (1979-1981); Handbook of Experimental Immunology, D. Weir (szerkesztő) Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO. (1978)].

A találmány szerinti polipeptideket gyógyszerkészítményekben is fel lehet használni, például a különböző daganatos és fertőző betegségek elleni természetes védekezőkészség fokozására vagy a mieloszupresszió leküzdésénél a kemoterápia kiegészítő anyagaként [lásd: J. Gasson és munkatársai: „Lymphokines and Hematopoiesis” c. fejezet a „Normál and Neoplastic Hematopoiesis” c. kiadvány 129-139. oldalain, Alán R. Liss, Inc., New York (1983)].

A találmányban leírt polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállításához ezeket a poli8

HU 213 226 B peptideket segédanyagokkal - előnyösen a gyógyszergyártásban elfogadott közömbös hordozókkal - keverjük. A megfelelő hordozók és előállításuk módszerei jól ismertek e szakterületen [lásd például: Remington’s Pharmaceutical Sciences és U. S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1980)]. Előnyös a parenterális alkalmazás, amely magába foglalhat mechanikus adagolási rendszereket.

Az adagolás a beteg szükséglete szerint változhat, amelyet a kezelendő állapot súlyossága és a felhasználásra kerülő adott anyag határoz meg. Egy adott esetben a megfelelő adagolás meghatározása hozzátartozik az ezen szakterületen való jártassághoz. Általában a kezelést a hatóanyag optimális adagjánál kisebb adagokkal kezdjük. Ezután az adagolást kicsinyenként növeljük, amíg a körülményeknek megfelelő optimális hatást el nem érjük. Kényelmi szempontból a teljes napi adagot eloszthatjuk és a nap folyamán részletekben adagolhatjuk. Kísérleti eredményeinket és adatainkat a következő példákban adjuk közre, anélkül hogy találmányunk oltalmi körét ezekre a példákra korlátoznánk.

1. Klónozott humán helper T-sejtek

1. Humán T-sejtek egy T-7 elnevezésű kiónját az alábbi kiadványban közölt módszer szerint izoláljuk: Isolation, Characterization, and Utilization of T Lymphocyte Clones, 36. és 37. fejezet, C. Fathman és F. Fitch (szerkesztők), Academic Press, New York (1982). A sejtvonalat folyamatosan, mintegy 0,5 T0^{2 * * 5} sejt/ml sűrűségben tartjuk fenn a Dulbecco által módosított Eagle-féle táptalajon (DME), amely 10% hővel inaktivált fetális borjúszérumot, 510^-5 Μ 2-MEt (2-merkapto-etanol), 2 mM glutamint, nem esszenciális aminosavakat és esszenciális vitaminokat tartalmaz. A táptalajt fitohemagglutininnel (PHA) stimulált humán perifériás leukociták felülúszóival (30%) kondicionáljuk.

2. A T-7 sejtek PHA-val való aktiválását úgy végezzük, hogy a sejteket 510⁵/ml sűrűségben, DME tápoldatban tenyésztjük, melyhez 4% hővel inaktivált fetális borjúszérumot, 5T0^-5 M 2-ME-t, 2 mM glutamint, nem esszenciális aminosavakat, esszenciális vitaminokat és 4 pg/ml ConA-t adtunk. A sejtszuszpenziót 4-6 órás inkubálás után (37 °C; 10% CO₂) 10 percig centrifugáljuk 1500 ford./perc mellett. A sejtüledéket összegyűjtjük és azonnal lefagyasztjuk -70 °C-ra. A felülúszókat - ezek tartalmazzák a növekedési faktorokat - leszűrjük (0,22 mikronos Nalgens-szűrő) és a szűrletet -80 °C-on tároljuk. A felülúszó alikvot mennyiségeit CSF-aktivitásra vizsgáljuk (lásd előbb), hogy megállapítsuk, vajon a PHA kezelés indukálta-e a sejtvonalat.

2. Csontvelő és köldökzsinór-vér vizsgálatok

Nem hematológiai beteganyagtól csontvelő sejteket veszünk le, s a sejteket Ficoll-ra (Ficoll 400; SIGMA

Chemical Co., St. Louis, MO., USA) rétegezzük, lecentrifugáljuk (2000 ford./perc; 20 perc), majd a sejteket a határfelületről eltávolítjuk. Ezeket a sejteket kétszer mossuk az Iscove által módosított Dulbecco tápoldatban - amely 10% fetális borjúszérumot (FCS) tartalmaz - s ugyanebben a tápoldatban reszuszpendáljuk, majd az adherens sejteket plasztik Petri-csészére való kitapadásuk révén távolítjuk el. A nem adherens sejteket 10⁵ sejt/ml koncentrációig olyan Iscove-féle tápoldathoz adjuk, amely 20% FCS-t, 50 pmól 2-ME-t, 0,9% metil-cellulózt és különböző koncentrációkban vagy biztosan telep serkentő hatást kifejtő felülúszókat vagy vizsgálandó felülúszókat tartalmaz. Egy milliliteres alikvot mennyiségeket viszünk rá 35 mm-es Petricsészékre, s a tenyésztést 37 °C-on végezzük, 6% CO₂ tartalmú egészen nedves levegőben. A tenyészet megindulása után 3 nappal egy egység eritropoetint (Á. Eaves, British Columbia Cancer Research Center, Vancouver, BC., Kanada) adunk minden lemezhez. A 1014. napon - inverz mikroszkóp használatával - kipontozzuk a granulocita-makrofág telepeket és az eritroid burst telepeket.

Heparinba leveszünk köldökzsinór-vérsejteket és 6 percig centrifugáljuk 2000 ford./perc mellett. A plazma és a vörös vérsejtek közti határfelületen lévő fehérvérsejteket átvisszük egy 0,17 M ammónium-kloridot és 6% FCS-t tartalmazó centrifugacsőbe, amelyet 5 percig jégben tartunk, s a szuszpenziót 4 ml FCS alá rétegezzük, majd 6 percig centrifugáljuk 2000 ford./perc mellett. A sejtüledéket a Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt konyhasó oldattal mossuk és ezután úgy végezzük a Ficollal és a plasztikra való kitapadással kapcsolatos lépéseket, ahogy azt fent a csontvelő sejteknél leírtuk. Akis sűrűségű, nem adherens sejteket összegyűjtjük és szemiszolid agar táptalajon tenyésztjük - mint fent leírtuk - 10⁵ sejt/ml sűrűségben.

Az eljárás végén meghatározzuk a sejtek összetételét oly módon, hogy az egyedi telepeket tárgylemezre visszük és Wright-Giemsa festéssel megfestjük. Az eozinofil sejteket Luxol Fást Blue-val festjük meg [G. Johnson és D. Metcalf, Exp. Hematol., 8, 549-561 (1980)].

3. mRNS izolálása humán sejtekből

1. A sejtekből az össz-sejt-RNS-t izoláljuk J. Chirgwin és munkatársai [Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)] szerint, guanidin izotiocianátos módszerrel.

Az indukálatlan vagy a ConA-val indukált fagyasztott humán helper sejt üledékeket (4 órával a stimulálás után) guanidin-izotiocianát lizáló oldatban szuszpendáljuk. Húsz ml lizáló oldatot használunk 1,510⁸ sejthez. Az üledékeket pipettázással elszuszpendáljuk, majd a DNS-t fecskendővel - 16-os tűvel - távolítjuk el, 4 felszívással. A lizátumot 40 ml-es poliallomer centrifugacsőben lévő 20 ml 5,7 mól cézium-klorid és 10 mmól EDTA tartalmú oldat tetejére rétegezzük. Az oldatot 25 000 ford./perc mellett Beckman SW28 rotorban (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA., USA) 40 órán át 15 °C-on centrifugáljuk. A DNS tartalmú guanidin izotiocianát fázist a folyadék tetejéről, egészen le a határfelületig, kipipettázzuk. A centrifugacső falát és a határfelületet 2-3 ml guanidin-izotiocianát lizáló oldattal mossuk. A csövet a határfelület alatt

HU 213 226 B ollóval elvágjuk és a cézium-klorid-oldatot dekantáljuk. Az RNS üledéket kétszer mossuk hideg 70%-os etanollal. Az üledéket ezután 500 μΐ 10 mmól trisz-HCl (pH = 7,4), 1 mmól EDTA és 0,05% SDS tartalmú oldatban reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 50 μΐ 3 mólos nátrium-acetátot adunk és az RNS-t 1 ml etanollal kicsapjuk. Mintegy 0,3 mg össz-RNS-t gyűjtöttünk össze centrifugálással és az üledéket egyszer mostuk hideg etanollal.

2. PoliA⁺ mRNS izolálása: a mosott és szárított össz-RNS-t tartalmazó üledéket 900 μΐ oligo(dT) eluáló pufferben [10 mmól trisz-HCl (pH = 7,4), 1 mmól EDTA, 0,5% SDS] reszuszpendáljuk. Az RNS-t 3 percig 68 °C-on hevítjük, majd jégen lehűtjük, s ezután 100 μΐ 5 mólos nátrium-kloridot adunk hozzá. Az RNS-t ekkor 1,0 ml oligo/dT/ cellulózzal töltött oszlopra (Collaborative Research, Waltham, MA., USA; 3-as típus) visszük, amelyet a következő kötő-pufferrel egyensúlyoztunk ki: 10 mmól trisz-HCl (pH = 7,4), mmól EDTA, 0,5 mól NaCl, 0,5% SDS. Az oszlopon átfolyt anyagot még kétszer rávisszük az oszlopra. Az oszlopot ezután 20 ml kötő-pufferrel mossuk. A poliA⁺ mRNS-t úgy kapjuk meg, hogy az eluáló pufferrel mossuk az oszlopot. Az RNS rendszerint az első 2 ml eluáló pufferben jelenik meg. Az RNS-t 0,1 térfogat etanollal csapjuk ki. Az RNS üledéket centrifugálással gyűjtjük össze, kétszer mossuk hideg etanollal és szárítjuk. Az üledéket ezután vízben reszuszpendáljuk. Alikvot mennyiségeit meghígítjuk és abszorpciójukat 260 nm-en mérjük.

4. cDNS gyűjtemény létesítése

1. Vektor-primer és oligo-dG farokkal ellátott linker DNS előállítása

Az Okayama és Berg [Mól. Cell. BioL, 2, 161-170 (1982) által leírt eljárást alkalmazzuk csekély módosításokkal és ezt adaptáljuk az Okayama és Berg által leírt pcDVl és pLl plazmidokra Mól. Cell. BioL, 3, 280-289(1983)].

A pcDVl DNS-éből 80 tíg-ot 20 egység KpnI-vel emésztünk 30 °C-on 450 μΐ reakcióelegyben, mely 6 mmól trisz-HCl-t (pH = 7,5), 6 mmól MgCl₂-t, 6 mmól NaCl-t, 6 mmól 2-ME-t és 0,1 mg BSA-t (marhaszérum albumin) tartalmaz. Az emésztést 16 óra múlva 40 μΐ 0,25 mól EDTA-t (pH = 8,0) és 20 μΐ 10%-os SDS-t tartalmazó oldattal állítjuk le. A DNS-t úgy kapjuk meg, hogy vízzel telített fenol-kloroform 1:1 elegyével (a következőkben: fenol-CHCl₃) és etanollal extraháljuk. Hatvan, de nem több, mint 80 dezoxitimidilát (dT) csoporttal végződő homopolimer farkat adunk a KpnI endonukleáz reakcióban keletkezett végekhez borjú timusz terminális transzferáz segítségével úgy, hogy a reakcióelegy tartalma 38 μΐ-ben a következő: 140 mM nátrium-kakodilát, 30 mM trisz-HCl puffer (pH = 6,8), 1 mM CoCl₂ 0,1 mM DTT (ditiotreitol), 0,25 mM dTi'P, a KpnI-vel emésztett DNS és 68 egység terminális dezoxinukleotidil transzferáz (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI., USA). Az elegyet 37 °C-on tartjuk és 30 perc múlva 20 μΐ 0,25 M EDTA (pH = 8,0) és 10 μΐ 10%-os SDS elegyével állítjuk le a reakciót. A DNS-t többszöri fenol-CHCl₃-mal való extrahálással és etanolos kicsapással kapjuk meg. ADNS-t ezután 15 egység EcoRI-vel emésztjük 50 μΐ 10 mM trisz-HCl (pH = 7,4), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT és 0,1 mg/ml BSA tartalmú oldatban 5 órán át 37 ’C-on. A 3,2 kb méretű nagy fragmentumot, amely az SV40 poliadenilációs helyét és a pBR322 replikációs kezdőpontját és ampicillin rezisztencia génjét tartalmazza, agaróz gél (1%) elektroforézissel tisztítjuk, és a gélből módosított üvegpor módszerrel [B. Vogelsteín és D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 615-619 (1979)] nyerjük vissza. A dT farokkal rendelkező DNS-t egy oligo/dA/-cellulóz oszlopon való adszorbeálás és leoldás segítségével tovább tisztítjuk a következőképpen: a DNS-t 1 ml 10 mM trisz-HCl (pH = 7,3) pufferben oldjuk, mely 1 mM EDTA-t és 1 M NaCl-t tartalmaz. Az oldatot 0 ’C-ra hűtjük és rávisszük egy azonos pufferrel 0 °C-on kiegyensúlyozott oligo(dA)-cellulózoszlopra (0,6x2,5 cm). Az oszlopot azonos pufferrel mossuk 0 °C-on és vízzel oldjuk le szobahőmérsékleten. A leoldott DNS-t etanollal csapjuk ki és a csapadékot 10 mM trisz-HCl (pH = 7,3) és 1 mM EDTA tartalmú oldatban oldjuk vissza.

Az oligo(dG) farokkal bíró linker DNS-t úgy állítjuk elő, hogy a pLl DNS-ének 75 tíg-ját 20 egység Pstl-vel emésztjük 450 μΐ reakcióelegyben, amelynek tartalma a következő: 6 mM trisz-HCl (pH = 7,4), 6 mM MgCl₂, 6 mM 2-ME, 50 mM NaCl és 0,01 mg/ml BSA. A reakcióelegyet 30 °C-on tartjuk 16 órán át és ekkor fenol-CHCl₃-mal extraháljuk. A kapott DNS-t etanollal csapjuk ki. Ezután 10-15 dezoxiguanilát (dG) végcsoportot tartalmazó farkakat adunk az elegyhez 46 egység terminális dezoxinukleotidil transzferáz segítségével, ugyanazon reakcióelegyben (38 μΐ) mint azt fent leírtuk, kivéve, hogy a 0,1 mM dTTP helyett dGTP-t használunk. A keveréket 37 ’Con tartjuk és 20 perc múlva fenol-CHCl₃-mal extraháljuk. ADNS-t etanollal kicsapjuk és 35 egység HindlIImal emésztjük 37 ’C-on 4 órán át 50 μΐ 20 mM trisz-HCl (pH = 7,4), 7 mM MgCl₂, 60 mM NaCl és 0,1 mg BSA tartalmú oldatban. Az 1,3 kb méretű, kis oligo(dG) farkas linker-DNS-eket 1,8%-os agaróz gélben, elektroforézissel tisztítjuk és úgy izoláljuk, mint fent leírtuk.

2. cDNS gyűjtemény szintetizálása

1. lépés: cDNS szintetizálás

Reakcióelegyet készítünk, amelynek 10 μΐ-ében 50 mM trisz-HCl (pH = 8,3), 8 mM MgCl₂, 30 mM KC1, 0,3 mM DTT, 2-2 mM dATP, dTTP, dGTP és dCTP, 20 μα aktivitású ³²P-dCTP (3000 Ci/mmol), 3 μg poliA⁺ RNS a ConA-val indukált T-sejtekből, 60 egység RNázin (Biotec Inc., Madison, WI., USA) 2 μg vektor-primer DNS (a primer végből 15 pmól) és 45 egység reverz transzkriptáz. A reakcióelegyet 60 percig 42 °C-on inkubáljuk, majd a reakciót 1 μΐ 0,25 mólos EDTA (pH = 8,0) és 0,5 μΐ 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk le. Az elegyhez 40 μΐ fenol-CHCl₃-ot adunk, majd az oldatot Vortex keverőben erősen keverjük, ezután centrifugáljuk. A vizes fázishoz ekkor 40 μΐ 4

HU 213 226 B mólos ammónium-acetátot és 160 μΐ etanolt adunk, majd szárazjéggel 15 percig hűtjük, s ezt követően enyhe rázogatás mellett - hogy a reagálatlan dezoxinukleotid trifoszfátok, melyek a hűtés alatt kicsapódtak, feloldódjanak - szobahőmérsékletre melegítjük és 10 percig Eppendorf mikrocentrifugában centrifugáljuk. Az üledéket 10 μΐ 10 mM trisz-HCl-t (pH = 7,3) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldatban feloldjuk, hozzákeverünk 10 μΐ 4 M ammónium-acetátot és újra kicsapjuk 40 μΐ etanollal. Ez az eljárás a lereagálatlan dezoxinukleozid-trifoszfátok több mint 90%-át eltávolítja. A csapadékot etanollal mossuk.

2. lépés: Oligodezoxicitidilát [oligo(dC)] addíció

Az 1. pontban kapott plazmidot és a cDNS:mRNS-t tartalmazó üledéket 20 μΐ 140 mM nátrium-kakodilát, 30 mM trisz-HCl pufferben (pH = 6,8) oldjuk. A puffer 1 mM CoCl₂-t 0,1 mM DTT-t, 0,2 pg poli(A)-t, 70 μΜ dCTP-t, 5 μ(2ϊ ³²P-dCTP-t (3000 Ci/mmól) és 60 egység terminális dezoxinukleotidil transzferázt tartalmaz. A reagáltatást 37 ’C-on 5 percig végezzük, hogy létrejöjjön végződésenként 10-15 dCMP csoport addíciója, majd 2 pl 0,25 M EDTA (pH = 8,0) és 1 μΐ 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk le a reakciót. Areakcióelegyet 20 μΐ fenol-CHCl₃-mal extraháljuk, a vizes fázishoz 20 μΐ 4 M ammónium-acetátot keverünk, a DNS-t kicsapjuk, majd újra kicsapjuk 80 μΐ etanollal, s az utolsó üledéket etanollal öblítjük.

3. lépés: Emésztés Hindlll endonukleázzal

Az üledéket 30 μΐ olyan pufferben oldjuk, amely 20 mM trisz-HCl-t (pH = 7,4), 7 mM MgCl₂-t, 60 mM NaCl-t és 0,1 mg/ml BSA-t tartalmaz, majd az oldatot 10 egység HindlII-mal emésztjük 2 órán át 37 °C-on. A reakciót 3 μΐ 0,25 M EDTA (pH = 8,0) és 1,5 μΐ 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk be. Ezután extrahálás következik fenol-CHCl₃-mal, majd 30 μΐ 4 M ammónium-acetátot adunk a keverékhez, végül a DNS-t 120 μΐ etanollal csapjuk ki. Az üledéket etanollal öblítjük, majd feloldjuk 10 μΐ 10 mM trisz-HCl (pH = 7,3) és 1 mM EDTA tartalmú oldatban. Az oldathoz 3 μΐ etanolt adunk, hogy -20 ’C-on való tárolás alatt ne fagyjon le.

4. lépés: Ciklizálás az oligo(dG) farokkal ellátott linker DNS segítségével

A HindlII-mal emésztett, oligo/dC/ farokkal rendelkező cDNS:mRNS plazmid (a minta mintegy 90%-a) 9 μΐ-es mintáját 90 μΐ következő összetételű elegyben inkubáljuk: 10 mM trisz-HCl (pH = 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 1,8 pmol oligo/dG/-farokkal ellátott linker-DNS. Az inkubálást 65 ’C-on 5 percig, majd 42 ’C-on 60 percig végezzük, utána az elegyet 0 °C-ra hűtjük. Az elegyet (90 pl) ezután 900 μΐ térfogatra állítjuk be úgy, hogy az 20 mM trisz-HCl-t (pH = 7,5), 4 mM MgCl₂-t, 10 mM (NH₄)₂SO₄-ot, 0,1 M KCl-ot, 50 pg/ml BSA-t és 0,1 mM β-NAD-ot tartalmazzon. Az oldathoz ezután 6 pg E. coli DNS-ligázt adunk és egy éjszakán át 12 °C-on inkubáljuk.

5. lépés: Az RNS-szál cseréje DNS szálra

Hogy az inszertum RNS-szálát kicseréljük, a ligáz reakcióelegyet úgy állítjuk be, hogy a négy dezoxinukleotid-trifoszfátból 40-40 μΜ-t, 0,15 mM β-NAD-ot, még 4 pg E. coli DNS ligázt, 16 egység E. coli DNS polimeráz I-et (Poll) és 9 egység E. coli RNázH-t tartalmazzon. Ezt az elegyet (960 pl) ezután 1-1 órán át 12 °C-on, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk, hogy létrejöjjön az optimális repair szintézis és Poll segítségével a nick-transzláció.

6. lépés: E. coli transzformálása

A transzformálást a Cohen és munkatársai által leírt [Proc. Natl. Acad. Sci., 69, 2110-2114 (1972)] eljárás szerint - ezt kissé módosítva - végezzük. E. coli KI 2 MC1061 törzset [M. Casadaban és S. Cohen, J. Mól. Bioi., 138, 179-207 (1980)] tenyésztünk 37 °C-on 20 ml L-táplevesben 600 nm-en mért 0,5 abszorpció értéket adó sűrűségig. A sejteket lecentrifugáljuk, 10 ml 5 mM CaCl₂ tartalmú 10 mM trisz-HCl pufferben (pH = 7,3) szuszpendáljuk és 0 ’C-on 5 percig centrifugáljuk. A sejteket újra szuszpendáljuk a fenti puffer 2 ml-ében és megint 0 ’C-on 5 percig inkubáljuk; ezután a sejtszuszpenzió 0,2 ml-ét 0,1 ml DNS-oldattal (5. lépés) keverjük össze, s a keveréket 0 °C-on 15 percig inkubáljuk. Ezután a sejteket 37 °C-on tartjuk 2 percig, majd szobahőmérsékleten 10 percig; ekkor 0,5 ml L-táplevest adunk hozzá és a tenyészetet 37 ’C-on 30 percig inkubáljuk; elkeverjük 2,5 ml Ltáplevessel készült lágy agarral 42 ’C-on, s ezt 50 pg/ml ampicillin tartalmú L-tápleveses agaira rétegezzük. A táptalajt 37 ’C-on 12-24 órán át inkubáljuk, majd egyedi telepeket szúrunk ki steril fogpiszkálókkal. Összesen megközelítőleg 5-10^{4 *} független cDNS klón keletkezett.

5. A humán T-sejt cDNS gyűjtemény szűrése DNS transzfekciókkal

A T-sejt cDNS gyűjteményből találomra 10⁴ független kiónt emelünk ki és egyenként mikrotitráló lemezek tartályaiba oltjuk. A tartályok 50 pg/ml ampicillin és 7% DMSO tartalmú 200 pl L-levest tartalmaznak. A mikrotitráló lemezeken előállított tenyészetekből 48 klónból álló poolokat készítünk. Negyven ilyen poolból, 1-1 liter L-levesben (100 pg/ml ampicillinnel kiegészítve) tenyészetet állítunk elő. Minden tenyészetből izoláljuk a plazmid DNS-t, s tisztításukat cézium-klorid gradiensben végezzük el, kétszer. A poolokat reprezentáló DNS-ekkel COS-7 majom sejteket transzficiálunk a következőképpen:

A transzfekció előtt egy nappal körülbelül 10⁶ COS-7 majom sejtet oltunk 10% fetális borjúszérumot és 2 mól glutamint tartalmazó DME tápoldatba, egyedi 60 mm-es lemezekre. A transzfekció elvégzéséhez minden lemezről kiszívjuk a tápoldatot és helyette 1,5 ml olyan DME tápoldatot adagolunk, amely 50 mM trisz-HCl-t (pH = 7,4), 400 pg/ml DEAE-dextránt és a vizsgálandó plazmid DNS-ekből 15 pg-ot tartalmaz. A lemezeket 4 órán át 37 ’C-on inkubáljuk, majd a DNS tartalmú tápoldatot eltávolítjuk, a lemeze11

HU 213 226 B két kétszer mossuk 2 ml szérummentes DME-oldattal. Ezután 150 μΜ klorokin tartalmú DME tápoldatot adunk vissza a lemezekhez, amelyeket további 3 órán át inkubálunk 37 °C-on. A lemezeket egyszer mossuk DME-vel, azután 4% fetális borjúszérumot és 2 mmól glutamint tartalmazó DME tápoldattal. A mosásoknál penicillint és streptomicint adagolunk. A sejteket ezután 72 órán át 37 °C-on inkubáljuk. Ekkor a tenyészleveket összegyűjtjük és humán GM-CSF aktivitásra vizsgáljuk a fentiek szerint.

Négy poolnak (1A, 3B, 7A és 14A csoport) volt GM-CSF aktivitása (lásd az I. táblázatot). Ezután minden csoportot elosztottunk 6 poolra, s ezek mindegyike az eredeti poolozott kiónokból nyolcat tartalmazott. Minden kezdeti poolból egy szubpool mutatkozott pozitívnak a transzfekciós vizsgálat szerint, kivéve a 7A csoportot, amelyből két pozitív szubpoolt kaptunk. Az öt szubpoolból négynek a plazmidjával külön transzficiáltunk COS-7 sejteket. A 3-8a, 7-la, 7-4d és 14-le számozású négy egyedi kiónnak volt GM-CSF aktivitása. Restrikciós endonukleáz analízissel kimutattuk, hogy mindegyik klón lényegében azonos szerkezetű volt.

Az I. táblázat azon hematopoetikus sejtek számát mutatja be, amelyeket - köldökzsinór-vérrel végzett párhuzamos kísérletben - az egyes transzfekciós minták stimuláltak. A táblázatban a „halom” 20-50 sejtet, a „kis telep” 51-150 sejtet és a „telep” több, mint 150 sejtet foglal magába.

I. táblázat

Transzficiált poolok plazmid DNS-einek vizsgálata telep serkentő aktivitásra

ELSŐ SZŰRŐVIZSGÁLAT	40 pool 48 klónból /1-20, A+B/
Ál-inficiált COS-7:	7+12 halom
lApool:	29+25 halom
3B pool:	38+20 halom
7A pool:	22+19 halom
14A pool:	26+32 halom
összes többi pool:	kevesebb, mint 20 halom
MÁSODIK SZŰRŐVIZSGÁLAT	8 klónos szubpoolok
Ál-inficiált COS-7:	9+15 halom
1-5 szubpool:	56+54 halom
3-8 szubpool:	98+52 kis telep
7-1 szubpool;	29+41 kis telep
7-4 szubpool:	100+93 kis telep
14-1 szubpool:	40+73 kis telep
összes többi szubpool:	kevesebb, mint 20 halom
HARMADIK SZŰRŐVIZSGÁLAT	Egyedi kiónok
3-8a klón:	120+127 telep

HARMADIK SZŰRŐVIZSGÁLAT	Egyedi kiónok
7-1 a klón:	198+164 telep
7-4a klón:	176+160 telep
14-le klón:	62+67 telep
összes többi klón:	kevesebb, mint 20 halom

A 2. ábrán a pcD-human-GM-CSF plazmidot mutatják be, amely lényegében a teljes hosszúságú cDNS inszertumot tartalmazza. A plazmidot hordozó E. coli MCI061 baktériumot letétbe helyeztük ATCC 39923 letéti szám alatt. A 2. ábrán a pcD kifejező vektorban lévő 776 bp hosszú cDNS inszertumnak az SV40 korai promoterétől induló átírását nyíllal jelöljük. A splicing donor és akceptor helyek helyzetét megjelöltük. A poliadenilációs szignál, amely szintén az SV40-ből származik, a cDNS inszertum 3'-végénél helyezkedik el. A cDNS inszertumban a GM-CSF-et kódoló régió erősen sraffozott, míg a nem-kódoló régiók enyhén sraffozottak. A vektor további szekvenciái a pBR322 plazmidból származnak a β-laktamáz génnel (Amp^R) és a replikációs kezdőponttal együtt.

A 3-8a klón szekvenciáját kétféle módszerrel határoztuk meg: az Ml3 didezoxi láncterminátoros módszerrel [F. Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci„ 74, 5463-5467 (1977)] és módosított MaxamGilbert módszerrel [C. Rubin és C. Schmid, Nucleic Acids Rés., 8, 4613-4619 (1981)]. A cDNS inszertum egyetlen nyitott leolvasási szerkezettel rendelkezik. Az első ATG az 5'-végtől számított 33-35. nukleotidnál található, ezt követi 144 kodon a 465-467. nukleotid pozícióban lévő TGA terminátor triplet előtt.

A Π. táblázat mintegy 60 humán csontvelőből és köldökzsinór-vérből származó sejttelep - a telepeket a 3-8a, 7-la, 7-4d és 14-le egyedi kiónok behatása mellett tenyésztettük - sejt-összetételének százalékos megoszlását mutatja. Az eozinofil és más sejttípusokból álló kevert telepek keletkezése valószínűleg annak tudható be, hogy a telepeket együtt tenyésztettük.

II. táblázat

Humán csontvelő sejt-telepek sejt-összetétele

Neu	Mf	Eoz	Neu/Mf	Mf/Eoz	Neu/Mf/Eoz
15%	30%	7%	37%	2%	9%

Neu = neutrofil sejt Mf = makróiig Eoz = eozinofil sejt

Egy egér GM-CSF aktivitást kifejtő teljes hosszúságú cDNS-t (beleértve egy szignál szekvenciát) is izoláltunk. Az egér cDNS-t tartalmazó pcD plazmidot hordozó E. coli MC1061 baktériumot letétbe helyeztük ATCC 39924 letéti szám alatt. Az egér cDNS-ből származó, ³²P-vei jelzett Pstl/AlalII fragmentum, mint próbaanyag, a jelen találmány szerinti humán GM-CSF cDNS-ek egyikével hibridizált pontosan nem szabályozott körülmények (42 °C) között [lásd: T. Maniatis és

HU 213 226 B munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].

A 3. ábrán az egér GM-CSF (feltételezett) és a humán GM-CSF proteinszekvenciáját hasonlítjuk össze. Az azonos csoportokat (összeigazítás után) aláhúztuk, a humán proteinben meglévő, de az egér proteinből hiányzó csoportokat csillaggal jelöltük és a csak az egér proteinben meglévő csoportokat (például: Ser+Asn az 57-5 8-as pozícióban és Lys-Lys a 65-ös pozícióban) egy rövid függőleges vonallal jelöltük. Az egér és humán GM-CSF cDNS-ei közt lévő homológia meghökkentő, ugyanis mintegy 70%-os a homológia a két GM-CSF között [D. Brutlag és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 10, 279-294 (1981)]. Mindazonáltal a jelen találmány szerinti humán GM-CSF nem stimulálja jelentős mértékben az egér hematopoetikus őssejtek növekedését in vitro.

A pcD kifejező vektorban lévő klóngyűjtemény lehetővé teszi, hogy a teljes cDNS kiónokat azonosíthassuk emlős sejtekben való közvetlen expressziójuk révén. Nevezetesen, a teljes humán GM-CSF cDNS kiónokat úgy azonosítjuk, hogy COS-7 sejteket transzficiálunk találomra kivett cDNS-klónokkal és a felülúszóba kiválasztott GM-CSF aktivitást megmérjük. Ezek az eredmények megerősítik, hogy limfokinek és hormonok teljes hosszúságú cDNS-klónjainak azonosítása elérhető csupán annak alapján, ha eukarióta sejtekben ki tudunk mutatni egy funkcionális polipeptidet.

Az előbbiekből világosan kitűnik, hogy a jelen találmány szerinti cDNS-klónok egy humán GM-CSF pontos és teljes szekvenciaadatait szolgáltatják. A találmány ezenkívül azoknak, akik e szakterületen jártasak, módot nyújt arra, hogy e faktort (alapjában véve más hematopoetikus faktoroktól mentesen) jelentős menynyiségben előállíthassák, a neutrofil granulociták, makrofágok és más hematopoetikus sejtek (például eozinofilek) in vitro fenntartásának javítása céljára. Ezenkívül a cDNS kiónok révén kapott információ javítja az emlős szervezet által adott immunválasz megértését, ami bővítheti a kísérletes kutatómunka lehetőségeit.

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az 1. ábrán megadott szekvenciájú, 144 aminosavmaradékból felépülő humán granulocita makrofág telep stimuláló faktor aktivitású polipeptidet (humán GM-CSF) kódoló rekombináns DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy

   i) humán GM-CSF-et termelő sejtekből össz-RNS-t izolálunk, és ebből poliA⁺mRNS-t készítünk, majd ii) az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk, és cDNS könyvtárat készítünk;

   iii) a cDNS könyvtárat a GM-CSF-t kódoló cDNSre szűrjük, és iv) a pozitív kiónokat elkülönítjük, és a rekombináns DNS-t izoláljuk.
2. 2. Eljárás az 1. ábrán megadott szekvenciájú, 144 aminosavmaradékból felépülő humán granulocita makrofág telep stimuláló faktor aktivitású polipeptidet (humán GM-CSF) kódoló rekombináns DNS szekvenciát tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán megadott szekvenciájú polipeptidet kódoló rekombináns DNS-t működőképesen szabályzó szekvenciákat tartalmazó plazmidba inszertáljuk.
3. 3. Eljárás az 1. ábrán megadott szekvenciájú, 144 aminosavmaradékból felépülő humán granulocita makrofág telep stimuláló faktor aktivitású polipeptidet (humán GM-CSF) termelő transzformált gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet a tárgyi körben meghatározott polipeptidet kódoló DNS szekvenciát működőképesen tartalmazó vektorral transzformáljuk, és a transzformánsok tenyészetéből a humán GM-CSF-et termelő transzformált sejteket szelektáljuk.
4. 4. Eljárás az 1. ábrán megadott szekvenciájú, 144 aminosavmaradékból felépülő humán granulocita makrofág telep stimuláló faktor aktivitású polipeptid (humán GM-CSF) előállítására, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben meghatározott polipeptidet termelő transzformált gazdasejtet táptalajban tenyésztünk, és a termelt polipeptidet a tenyészetből izoláljuk.
5. 5. Eljárás hatóanyagként az 1. ábrán megadott szekvenciájú, 144 aminosavmaradékból felépülő humán granulocita makrofág telep stimuláló faktor aktivitású polipeptidet (humán GM-CSF) tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti eljárással előállított hatóanyagot önmagában vagy a gyógyszerek készítésénél szokásosan használt hordozó, hígító és/vagy más segédanyagokkal keverve önmagában ismert eljárásokkal gyógyszerkészítménnyé formázzuk.