HU204088B - Process for producing polypeptides having growth factor activity concerning cells acting on several cell lines of mouse and/or fattening cell growth factor actvity - Google Patents

Description

A találmány általában a rekombináns DNS technológiának egy olyan területen történő alkalmazására vonatkozik, mélynek célja az emlősök immunválaszát szabályozó mechanizmus tisztázására, részletesebben pedig olyan dezoxiribonuldeinsav (DNS) Hónok izolálására vonatkozik, amelyek több-sejtvonalra ható sejt növekedési faktor aktivitást és/vagy fázó sejt növekedésifaktor aktivitástkifejtőpolipeptideketkódolnak.

Általánosságban a rekombináns DNS technológia egy olyan módszer, amikor a donortól származó genetikai ihförmációt vektorba integrálunk az információ további felhasználása céljából, például egy gazdasejthevaló beépítése révén, miáltal az átvitt genetikai információ az új környezetben lemásolódik ésNagy kifejeződik. A genetikai információ általában olyan komplementer DNS (cDNS) formájában létezik, amely egy kívánt protein terméket meghatározó messzendzserRNS-től (mRNS) származik. Ahordozó gyakran olyan plazmid, amely képes a cDNS befogadására és amely a későbbiekben a gazdasejtben replikálódik. A plazmid bizonyos esetekben valójában a cDNS kifejeződését szabályozza, s ezáltal a kódolt terméknek a gazdában történő közvetlen szintézisét.

Az utóbbi években ez a technológia rendkívül gyorsan fejlődött és számtalan exogénprotein expressziója valósult meg a különféle gazdasejtekben. Példaként néhány ilyen módon termelt eukarióía proteint sorolunk fel: proinzulin [S. Naher és munkatársai, Gene,

21,95-104 (1983)]; interferonok JL.Simon és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 2059-2062 (1983) és R. Dérynék és munkatársai, Nucl. Acids Rés., 1,1819-1837 (1983)]; növekedési hormon [D. Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544-548 (1979)].

(Ezek a közlemények és a csatolt további idevonat- kozó anyag kiegészítő részleteket szolgáltat a szóbanforgó szakterület előzményeiről, jelen esetben a találmány alkalmazásáról, s mindezt hivatkozásként tartalmazza ezaleirás).

Bizonyos időn át dogma volt, hogy az emlősöknél az 40 immunválasz elsősorban egy sorozat sejtek közti komplex kölcsönhatás, az úgynevezett „immun térháló” (immuné network) eredménye. Bár teljesen világos, hogy a válaszok nagyrésze valóban a limfociták, makrofágok,granulocitakésmássejtekhálószerűköl- 45 csönhatásán alapszik, azonban az immunológusoknak most általában azavéleményük, hogy a szolubilis proteinek például azúgynevezettlimfoldnek) meghatározó szerepet játszanak ezen sejtek közti kölcsönhatásokszahályozásáhan. 50

A limfokinek kétségtelenül különböző módon közvetítik a sejt-aktivitásokat. Kimutatták, hogy képesek a különböző limfociták szaporodását és növekedését fenntartani és azt gondoljuk, hogy döntő szerepükvan a pluripotens hematopoetikus ős sejtek differenciáló- 55 dásának megindításában, s ezzel az immunválaszért felelős különböző sejtvonal-progenitorok roppant nagy számának keletkezésében. Az immunválasz szempontjából fontos sejt vonalakhoz két limfocita osztálytartozik: 50

B sejtek, amelyekimmunglobulinokat (proteineket, amelyek képesek felismerni és megkötni idegen anyagokat, hogy ezeket eltávolíthassák) termelnek és székretálnak, és T sejtek (különböző alcsoportjaival 5 együtt), amelyekindukáljákvagygátolják aB sejteket és bizonyos más sejteket is (beleértve más T sejteket). E két csoport alkotja meg az immun térhálót.

Egy másikfontos sejt vonal a hízósejteké. Ezekgranulum tartalmú kötőszöveti sejtek, amelyek a testet 10 behálózó kapillárisok közelében helyezkednek él és különösen nagy sűrűségben a tüdőben, bőrben, a gyomor-bél csatornában és a húgy-és ivarszervi traktusban. Ahízó'sejteknekközponti szerepükvan az alleigiával összefüggő zavarokban, különösen az anafilaxiá15 bán. Ezt a szerepűket röviden a következőképpen magyarázhatjuk: ahogy a hízósejt felületén lévő receptorokhozkötött speciális immunglobulinokkeresztreakcióha lépnek bizonyos antigénekkel, a hízósejt degranulálódik és mediátorokat bocsát ki (például hiszta20 mint, szerotonint, heparint, kinineket, stb.), amelyek allergiás reakciókat okoznak, például anafilaxiát.

Az allergia, anafilaxia és más immunrendellenességek jobb megértésére (és ezáltal ezek potenciális gyógykezelésére) irányuló kutatást, amely a hízósej25 tek, T sejtek és az immunválaszban szerepet játszó más sejtek tanulmányozásán keresztül történik, az gátolja, hogy általában ezeket a sejteket nem lehet in vitro fenntartani. Legutóbb azonban számos immunológus felfedezte, hogy ezek a sejtek izolálhatok és te30 nyészthetők, ha más sejtekből származó szekrétumokon tenyésztik őket, például olyan táptalajokon, amelyeket concanavalinA-val (ConA) stimulált lép-limfociták kondicionálnak. E munkák alapján ma már világossá vált, hogy a sejt kiónok keletkezése specifikus faktoroktól függ, például a limf okinektől.

Úgy tűnik, hogy majdnem minden vérsejt típus folyamatosan termelődik a felnőtt gerincesek csontvelőjében a hematopoetikus progenitor sejtek rangsorának növekedése és differenciálódása révén. E hierarchia csúcsán helyezkedik el a pluripotens ős sejt, amely újra benépesíthet egy halálos mértékben besugárzott állatot majdnem minden — de lehet, hogy minden—immunológiai sejt típussal (ilyenek például a vörösvérsejtek, vérlemezkék, limfociták, különböző granulociták és monociták/makrof ágok. A pluripotens sejt nemcsak arra képes, hogyújra termelje a pluripotens ős sejt osztályokat (önmegújulás), de indítást is ad a progenitor sejteknek, elkötelezvén őket egy meghatározott sejtvonalon történő fejlődési folyamatra, úgy látszik, hogy egy meghatározott irányban elkötelezett ős sejt utódai ugyanazon sejtvonalra vannak elkötelezve, mint a szülő sejt [D. Metcalf:„Hemopoietic Colonies”, Springer Publishing Co., New York, N.Y. (1977)].

A hematopoézis in vitro tanulmányozása során megállapították, hogy számos szolubilis kolónia serkentő faktor (colony stimulating factor - CSF) szabályozza a különböző progenitor sejtek növekedését. E faktorok egynémelyikét részegesen tisztították és kimutatták, hogy specifikusan hatnak meghatározott

HU 204088 Β sejtvonalakhoz tartozó ős sejtekre. Az eritropoetin például a vörösvérsejt hierarchia erősebben differenciálódott tagjait stimulálja [T. Miyake és munkatársai, J. Bioi. Chem. 252,5558 (1977)], egy másikfaktor (colony stimulating factor-macrophage, vagy CSF-1) főleg a makrofág növekedését stimulálja csontvelő sejtek szemiszolid tenyészetében [E. Stanley, P. Heard, J. Bioi. Chem., 252, 4305 (1977)]. Úgy látszik, hogy más típusú növekedési faktor képes stimulálni az egyetlen sejt típusból álló hematopoetikus telepeket és megint más a sejtek keverékeit. A sejtek egy része, például az eritrociták, megakariociták, granrdociták, hízósejtek és amonocita/makrofágok ezenmásodik típusba tartozó egy faktorra érzékenyek, amelyet ezért több-sejtvonalra ható sejt növekedési faktornak (multi-CSF) neveztek |N. Iscove és munkatársai, J.Cell Physiol. Suppl., 1., 65-78 (1982)], jelezve ezzel azt a képességét, hogy számos elkötelezett progenitor sejtre hat és talán pluripotens ős sejtekre is.

Az egyik legjobban jellemzett faktor az interieukin-1 (IL-1). Az IL-1, melyet a makrofágok termelnek, a timociták és a perifériás T sejtek replikációját indukálja [S. Mizel és munkatársai, J. Immunoi., 120, 1497-1503 (1978)]. Az interleukin-2 (IL-2) és az interleukin-3 (IL-3), melyeket bizonyos stimuláltlimfociták bocsátanak ki, két hasonlóan jól tanulmányozott limf okin. Igen szignifikánsan jellemzi az IL-2-t, hogy képes bizonyos T sejtek folyamatos növekedését in vitro fenntartani [Farrar és munkatársai, Ann. N. Y. Acad. Sci., 332,303-315 (1979)]. AzIL-3-nakhasonlóan fontos jellemzője, hogy olyan sejtvonalak növekedését képes fenntartani, amelyek hízósejt fenotípusú jellemzőkkel rendelkeznek [J. Ihle és munkatársai, Immunological Rév., 63,5-32 (1982)]. Számos más sejtnövekedésre ható tulajdonságot is tulajdonítanak az IL-3-nak [J. Ihle és munkatársai, J. Immunoi., 131, 282-287 és 129,2431 (1981)], de a multi-CSF-elvaló pontos kapcsolata még nem volt tisztázva.

Bár mind az egér IL-2, mind az egér IL-3 biokémiai jellemzése legalábbis részben megtörtént [S. Gillis és mukatársai, J. Immunoi., 124,1954-1962 (1980), illetve J. Ihle és munkatársai, J. Immunoi., 129,24312436 (1982)] és jelenleg az IL-2-t fogadják el, mint a T sejtek növekedéséért elsődlegesen felelős faktort, azonban azon proteinek) tekintetében, amely(ek) hízó sejt növekedési faktor aktivitással (MCGF) és CSF aktivitással rendelkezik (rendelkeznek), hasonló mértékű megállapodás nem jött létre. Jelenlegúgy gondolják, hogy az egér IL-2 molekulatömege (valószínűleg, mint dimer) körülbelül 30-35.000 [R. Robb és K. Smith, Molec. Immun., 18,1087-1094 (1981)]; Ahumán IL-2-nek nyilvánvalóan 15,000 körüli a molekulatömege [S. Gillis és munkatársai, Immun. Rév., 63, 167-209 (1982)]. Legutóbb egy humán IL-2-t meghatározó cDNS klónról is jelentmegközlemény [T. Taniguchi és munkatársai, Natúré, 302,305-310 (1983)]. Ezzel szemben az egér hízósejt növekedési faktor molekulatömegére vonatkozóan különböző közlések jelentek meg: 45.000 [Y. Yung és munkatársai, J. Immunoi., 127,794-799 (1981)] és 28.000 [J.Ihle ésmunkatársai, J. Immunoi., 129,1377-1383 (1982)]. Hasonló eltérésekvannak a CSF-ekkörül.

Jóllehet az ilyen molekulatömegbeli különbségek talán részben a változó mértékű glükoziláltsággal magyarázhatók, az ügy tisztázásához azonban a szerkezetre vonatkozó kiegészítő adatokra lenne szükség, például a szóbanforgómolekulákteljés hosszában végzett szekvencia analízisre. A protein szekvencia analízise természetesen a probléma megoldásának egyik lehetséges módja, de ez igen nehéz kísérleti munkát igényel és gyakran nem is eredményezi sem a teljes pontos, sem a teljes hossznak megfelelő aminosav szekvenciát. Minthogy azonban az emlős MCGF vagy CSF aktivitással rendelkező polípeptidekből nagyobb mennyiségek előállítására van lehetőség, ez nagyban meg fogja könnyíteni a hízósejtek biológiájának a tanulmányozását; például azzal, hogy a sejtnövekedés stimulálása érdekében a ConA-val kondicionált táptalajokra való támaszkodás szükségességét csökkenti. Egy MCGF vagy CSF molekula pontos és teljes szekvencia adatait szintén egyszerűsítik majd a keresést más immunológiai faktorok irányában. Végül, bármely limfokinre vonatkozó kiegészítő információ segítséget ad ahhoz, hogy meghatározzuk a különböző növekedési faktoroknak és az immuntérháló sejtjeinek szerepét, ezáltal betekintést nyerünk az egész immunrendszerbe s ezzel együtt járnak a gyógyászati felhasználás előnyei.

Nagyon komoly szükség van tehát pontos adatokra az MCGF és CSF aktivitással rendelkező proteineket kódoló DNS-ek nukleotid szekvenciájára és e proteinek aminosav szekvenciáira vonatkozóan, továbbá egy egyszerű és gazdaságos módszerre, melynek segítségével ezeket az anyagokat tekintélyes mennyiségben és főként tisztán tudjuk előállítani. A jelen találmány teljesíti ezeket a kívánalmakat.

Jelen találmány olyan cDNS kiónok előállítására vonatkozik, amelyek egér hízósejt növekedési faktor (MCGF) aktivitást vagy egér több-sejtvonalra ható sejt növekedési falitor aktivitást kifejtő polipeptideket kódolnak. Egy ebbe a csoportba tartozó polipeptidet meghatározó cDNS nukleotid szekvenciáját és a polipeptid feltételezett aminosav szekvenciáját mutatjuk be az 1. ábrán. A cDNS szekvenciát beépíthetjük különböző vektorokba, s ezután e szekvencia a gazdasejtek változatos fajtáiban—beleértve az eukarióta sejteket, például a tenyésztett emlős sejteket — irányíthatja a megfelelő polipeptidek szintézisét.

Részletesebben, a találmány eljárást ad közre, melynek segítségével egér MCGF aktivitással és/vagy egér több-sejtvonalra ható sejtnövekedési faktor aktivitással rendelkező polipeptid termelése válik lehetővé.

Az eljárás a következő lépésekből áll:

a) a szóbanforgó polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát magába foglaló vektor megszerkesztése úgy, hogy a nukleotid szekvencia képes legyen a vektort tartalmazó gazdasejtben kifejeződni;

b) a vektor beépítése a gazdasejtbe; és

c) a vektort tartalmazó gazdasejt fenntartása olyan

HU 204088 Β körülmények között, hogy ezek anukleotid szekvenciának a szóbanforgó polipeptiddé történő' átírásához megfelelőek legyenek. Előnyős, ha a cDNS szekvenciák a polipeptideket meghatározó egy mRNS-ből származnak és ha a gazdasejt egy olyan szervezet, — például egy eukarióta sejt, ilyen egy emlős sejt — amelyet a vektorral transzficiáltunk vagy transzformáltunk. Ezenfelül előnyös, ha a vektor egymásodiknukIeotid szekvenciát is tartalmaz, amely a polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia kifejeződését szabályozza. Ez a második szekvencia tartalmazhat egypromoter szekvenciát, egy vagy több intron szekvenciát és egypoliadenilációs szekvenciát, amelyek lehetővé teszik a polipeptidet meghatározó nukleotid szekvencia transzkripcióját, a splicing megvalósulását, illetve a poliadenilációt.

Abban az esetben, ha a gazda egy emlős sejt, mint a

COS-7 majom-vese sejt, a vektor a Simian vírus 40 (SV40) korai promoter régiójából való promoter szekvenciát és azSV40 későirégiójából való poliadenilációs szekvenciát tartalmaz.

Az 1. ábrán (lásd alább) bemutatott egér cDNS szekvencia képes más DNS szekvenciákkal hibridizálni, például olyan cDNS vagygenomgyűjteményből való DNS-sel, amely más emlős növekedési faktorokat határoz meg. Megjegyezzük, hogy a leírt cDNS szekvenciák—úgy tűnik—egy vezér szekvencia informá Jeloi találmány polipeptidjei képesek arra, hogy egér hízósejtek és más sejtek növekedését in vitro tenyészetekben serkentsék Megfelelő gyógyszerek készíthetők belőlük, ha a polipeptideket (ezek a készítmények más emlős növekedési faktoroktól mentesek) gyógyászatüagkompatibilis hordozókhoz adjuk.

A találmány más vonatkozásait és előnyeit az alant következő részletes leírásokvilágítjákmeg. Abemutatott példákon keresztül — a csatolt rajzokkal együtt — ismertetjük a találmány megvalósítási módját anélkül azonban, hogy a találmány oltalmi körét a példákra korlátoznánk.

Az alábbiakban ismertetjükazábrákat.

Az 1. ábrán egy több-sejtvonalra ható sejt növekedési faktor aktivitású cDNS klón nukleotid szekvenciáját és vélt megfelelő aminosav szekvenciáját mutatjukbe.

A2. ábra a ConA-valstimulált ClLy-l⁺279 sejtekből izolált mRNS szacharóz gradiensben való szedimentáclós frakcióinakMCGF aktivitását ábrázolja. A 18S és 28S riboszóma csúcsokhelyzetét megjelöltük.

A 3. ábrán a pcD-McGFplazmid látható; ez a plazmidhízósejtnövekedésifaktoraktivitássalrendelkező cDNS ldónt hordoz. A 4. ábra a 3. ábrán bemutatott cDNS inszertum restrikciós endonukleázokkal történő hasítási térképét tartalmazza.

A3. ábránapcD expressziósvektorbanlévő 950 bp hosszú cDNS inszertumnak az SV40 korai promotere általi transzkripcióját nyíllal jelöljük; A splice donor és akceptorhelyekhelyzetétmegjeiöltük. apoliadeniIációs szignál, mely szintén az SV40-ból származik, a beépített cDNS 3’ végén helyezkedik el. A cDNS inszertum erősen sraffozott. A fennmaradó vektor szekvenciák a pBR322-ból származnak, tartalmazzák a βIaktamázgént(amp^R) és a replikádé kezdőpontját Jelen találmány alapján komplementer DNS 5 (cDNS) ldónokat állítunk elő egér hízósejt növekedési faktor (MCGF) aktivitást és/vagy több-sejtvonalraható sejt növekedési faktor (multi-CSF) aktivitást kifejtő polipeptidek termelése érdekében. A cDNS szekvenciákat replikációra képes expressziős vektorokba 10 építjükbeés ezután a vektorokkalmegfelelő gazdasejteket transzficiálunk (például emlős sejt tenyészetet), s a kifejeződött polipeptid vagy polipeptidek képesek lesznek arra, hogy a hízósejtek és a hematopoetikus sejtektöbb sejtvonalon történő terjedését elősegítsék.

Egy izolált nukleotid szekvencia alapján feltételezett aminosav szekvenciátmutatunkbe az 1. ábrán. Az elképzelt szekvencia egy része (a 33-tól 41-ig terjedő aminosavak) azonos — a közlemények szerint — az egérinterleukin-3 (IL-3) amino-terminális szekvenci20 ájávaI.AzegérIL-3-rólkimutatták, hogy egér MCGF aktivitással és multi-CSF aktivitással rendelkezik [J. Ihle és munkatársai, J. Immunoi. 129, 2431-2436 (1982); J. Ihle és munkatársai, J. Immunoi, 131,282287 (1983); J. Garland és munkatársai „Ihterleukins, 25 Lymphokines, and Cytosines (Proceedings of Third Int. Lymphokines Wordshop), Academic Press, New York, 123-129. oldal; szerkesztők J. Oppenheim és S. Cohen (1983)]. A kódoló régió, amely a transzlációs startkodon (ATG) és azIL-3-banmeglévő szekvencia 30 kezdete közt helyezkedik el, hidrofób aminosavakban gazdag, mint ahogy ez egy szekretált protein vezérszekvenciájától elvárható. Tehát a polipeptidek érett formája· in vivő, ahogy szekretálódott, valószínűleg egy Asp maradékkal kezdődik, ahogy azIL-3-ban is és 35 a megelőző mintegy 20 aminosav — ezek alkotják a feltételezettvezérszekvenciát—eltávolítása proteolízissel történik. Feltéve, hogy ez így igaz, a MCGF és multi-CSF aktivitást kifejtő polipeptid 134 aminosavból áll és számított molelöilatömege 15.000 körül van. 40 Ezenkívül,négy potenciális N-glükozilációs hely, azaz az Asn-x-Ser csoport (ahol X egy aminosav maradék) jelenléte a polipeptidben a kikövetkeztetett 42-44, 70-72,77-79 és 112-114 aminosav pozícióban pásd Neuberger és munkatársai, Giycoproteins, 5, 45045 490 oldal, Elsevier Publishing Co., USA (1972)], ahhoz a feltételezéshez vezet, hogy itt in vivő glükoziláció megy végbe.

Ha a találmány szerinti cDNS klőnok egyikét transzfekció révén COS-7 majom sejtekbe visszük be, 50 a klón irányítani fogja a biológiailag aktív MCGF és multi-CSF szintézisét. Ezenkívül akifejeződött kiónozott géntermék egér csontvelő sejt tenyészetekben elősegíti a több-sejtvonalra elkötelezett hematopoetikus sejtek terjedését; serkenti az eritroid telepek 55 (burst-forming erythroid colonies; BFU-E), a granulocita/makrofág telepek (granulocyte/macrophage colonies; GFU-G(M), hízósejt telepek (mást cell olonies; CFU-mast),valamintatöbb-sejtvonálastelepek(colonies of multiple-lineagtes; CFU-Mixed) kialakulását 60 és fenntartja a multipotens ős sejteket (multipotential

HU 204088 Β stem cells; CFU-S) folyékony tenyészetben. Különböző módszerek használhatók fel a találmány szerinti cDNS-ek előállítására. Például: emlős hízósejt növekedési faktor aktivitását felmutató sejtvonalból (például egy hibrid sejtvonalból) az ossz mRNS-t kivonjuk [például S. Berger és munkatársai szerint, Biochemistry, 18,5143-5149 (1979)].AzösszmRNS-ből úgy építjük fel a kétszálú cDNS-t, hogy először előállítjuk reverz transzkriptázzal az összes mRNS szekvencia komplementerét [Γ. Verma, Biochim. Biophys. Acta, 473,1-38 (1977], majd priming révén a második szám szintézise következik [H. Land és munkatársai, Nucleic Acid Rés., 2,2365-2378 (1975)]. Ezután a cDNS-t alkalmas plazmid vagy bakteriofág vektorba klónozhatjuk [F. Rougeon és munkatársai, Nucleic Acid Rés., 2, 2365-2378 (978) vagy G. Scherer és munkatársai, Dev. Bioi., 86, 437-447 (1981)] vagy komplementer homopolimer farkak [A. Efstratiadis, Cell, 10,571-585 (1977)], vagy kohéziós végek segítségével, amelyeket megfelelő restrikciós helyeket tartalmazó linker darabokkal állítunk elő [P. Seeburg és munkatársai, Natúré, 270,486-494 (1977); J. Shne és munkatársai, Natúré 270,494-499 (1977)], s ezt követően egy megfelelő gazdasejtet transzformálunk a vektorral pásd főként: A. Efstratiadis és L. Villa-Komaroff: „Cloning of double stranded cDNA” című munkáját a Genetic Engineering 1. kötetében, szerkesztők: J. Setlow és A. Hollaender, kiadó: Plenum Publishing Corp.,N.Y. USA, (1982)].

Egy, a találmány szerinti klónozott, teljes hosszúságú cDNS előállítása szempontjából előnyös eljárást dolgozott kiH. OkayamaésP.Berg [Mól. andCeUBiol. 2,161-170 (1982)]. Ennek a módszernek az az előnye, hogy a cDNS inszertumot egy bakteriális ldónozó vektorban olyan helyzetbe építjük he, hogy a cDNS közvetlenül transzlatálható és kifejezhető legyen emlős sejtekben is. Röviden, az első cDNS szálat úgy kapjuk, hogy a plazmid vektor lineáris DNS-ének egyik végéhez polidezoxitimidü savat kapcsolunk. A plazmid vektort ezután gyűrűbe zárjuk egy linker DNS darabbal, amely a plazmid egyik végét a cDNS kódoló szekvencia 5’ végével köti össze. Egy Simian vírus 40 (SV40) korai promoter régiót és egy módosított SV40 késői intron régióval rendelkező linkért tartalmazó DNS fragmentum felhasználásával, a cDNS COS-7 majom vese sejtekben, in vitro, további módosítás nélkül kifejezhető pásd főként: H. Okayama és P. Berg, Mól. and Cell Bioi., 3,280-289 (1983) és D. JoUy és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 80,477-481 (1983)].

A kívánt cDNS kiónok kimutatására és izolálására szolgál a hibridizációval való szűrés, alkalma mRNS minták segítségével [H. Hiendell és munkatársai, Cell, 15,43-54 (1978)]. Vagy pedig a cDNS gyűjteményt hibrid szelekciós eljárással [M. Harpold és munkatársai, Nucleic Acid Rés. 5,2039-2053 (1978); J. Pames és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78,22532257 (1981)], vagy Xenopus ociták segítségével is [J. Aurdon, Natúré, 233, 177-182 (1971)] szűrhetjük. [Lásd főként: L. Villa-Komaroff és munkatársai, Proc.

Nat. Acad. Sci. USA, 75,3727-3731 (1978)].

Mihelyt az Okayama/Berg Plazmid vektorban a cDNS gyűjtemény teljessé válik, a cDNS ldónokat összegyűjtjük, majd randomizált keverékeit a kívánt cDNS-ek jelenlétére vizsgáljuk hibrid szelekcióval, transzlációval és egyéb módszerekkel (például: megmérjük az MCGF vagy multi-CSF növekedési faktor aktivitást; antigén determinánsok jelenlétére vagy más biológiai hatások kimutatására végzünk vizsgálatokat). Azokat a poolokat, amelyek ezeknek a kritériumoknakmegfeleinek, meglehetvizsgálni egymegfelelő próba-anyaggal, például B sejtvonalból, vagy indukálatlan T sejtvonalból kivont cDNS-el. Ezután, a pozitív, kivizsgáltpoolokat egyedi klónokra osztjukfel, s ezeket alkalmas gazdasejt (üyen egy emlős sejt tenyészet) transzfekciója révén teszteljük úgy, hogy a gazdasejtek felülúszóját a kívánt aktivitásra (például multi-CSF, vagy MCGF aktivitásra) megvizsgáljuk. A pozitív kiónoknál ezután szekvencia analízist végzünk.

A találmány szerinti cDNS kiónok előállítására vonatkozó eljárások most következő leírásában először a hízósejtet, majd más sejtvonalakat érintünk, végül ezt általános leírások követik: az MCGF aktivitással rendelkező proteint meghatározó mRNS in vitro transzlációjával foglalkozó leírások; a cDNS szekvenciákat tartalmazó cDNS gyűjtemény előállításának leírása; a gyűjtemény szelekciója hibridizációval; teljes hosszúságú cDNS kiónok izolálása egy plazmid vektorban és ezt követő expressziója emlős sejtekben; multi-CSF kimutatása; humán multi-CSF és MCGF izolálása, klónozása és kifejezése baktériumokban és élesztőben; végül a tisztítás és a készítmény leírása ezután következik.

Hízósejt és T-sejt vonalakk jelen találmány kapcsán előnyösen azokat a sejteket használjuk, amelyeket . Galli és munkatársai fejlesztettek ki [J. Cell Bioi., 95,435-444 (1982)]. AzMC/9 jelzéssel ellátott klónozott hízósejt vonalat — letétbe helyezve az American Type Culture Collection gyűjteményébe nATCC CRL 8306 letéti számmal — Dulbecco által módosított Eagle tápoldatba n(DME) tenyésztjük. A tápoldatot 5% ConA-val aktivált Cl.Ly-l⁺2“/9 jelű T sejtvonal szuszpernatánsával egészítjük ki. A sejtvonalat letétbe helyeztük az American Type Culture Collection gyűjteményében, ATCC CRL 8179 letéti számmal. [G. Nabel és munkatársai, Natúré, 291, 332-334 (1981)]. A T sejtvonal a C57B1/6 egérből származott [G. Nabel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78, 1157-1161 (1981)] és módosított, kiegészített DME tápoldatban volt fenntartva [G. Nabel és munkatársai, Cell, 23, 19-28 (1981)].E sejtvonal alkalmas forrása a találmány szerinti mRNS-nek, de más megfelelő aktivitást (például MCGF vagy multi-CSF aktivitást) mutató emlős sejt-források is (beleértve a humán perifériás vért, mint forrást) felhasználhatók.

Az MC/9 sejteket az MCGF aktivitás vizsgálatára használjuk, előnyösen ³H-timidmfelvételénekvizsgálata révén, az erre kialakított módszerek szerint [G. Nabel és munkatársai, Natúré, 291,332-334 (1981)]. Röviden: MC/9 sejteket (10⁴sejt/tartály) tenyésztünk

HU 204088 Β lapos fenekű Falcon mikrotitráló tálcákon. A tenyésztést DME tápoldatban végezzük, melyet 4% fetális borjú szérummal, 50 pM 2-merkapto-etanoIIal (2ME), 2 mM glutammnal, nem-esszenciális aminosavakkal, esszenciális vitaminokkal és különböző koncentrációjú felülűszókkal egészítünk ki. A tápoldat végső térfogata 0,1 rnLEgy 24 órás inkubációs időtartam utolsó 4 órájára minden tenyészethez 0,5 Ci aktivitású ³H-timidint adunk. A sejteket üvegszűrőkön gyűjtjük össze és radioaktivitásukatfolyadékszcintillációs spektrométerrelmérjük.

A mRNS izolálása és molekula-nagyság szerinti frákcionálása

Több jól ismert módszerrel izolálható a sejtek ossz mRNS tartalma, például a Chirwing és munkatársai által lent [Biochemistry, 18,5294-5299 (1979)] guanidinium-tiocianátos extrakciós eljárással. Ha ezt a módszert használjuk, úgy l-2xl0⁸ aktivált helper Tsejtből — ilyen a CLLy-l⁺279 sejt — körülbelül 100 pg poliA⁺ mRNS-t kaphatunk oligo(dT)-cellulóz oszlopon történő elválasztással A mRNS molekulanagyság szerintifrakcionálásra 100 pgpoliA⁺ mRNSt rétegezőnk 10 ml-nyi 5-25% szacharóz gradiensre [10 mM trisz-sósav. (pH- 7,4), 100 mM nátrium-klorid, 1 mM EDTA] és 19 óra hosszat centrifugáljuk. 26.000 fordulattal Beckman SW41 rotorban. 450 μΐesfrakciókatgyűjtünkésazRNS-t2térfogatetanolIal csapjukkí.

Hibrid szelekció és Xenopus lasvis oociták mikroinjekciója

A szurőmembrános hibridizációkat lényegében főként Fames és munkatársai által leírt módszerrel végezzük [Proc. Nat Acad. Sci USA, 78, 2253-2257 (1981)]. Az eluált mRNS alikvot mennyiségeit — a szakterületen jól ismert módon — egy-egy Xenopus laevis oocitába ínjicíáljuk. Az élő oociták felülúszóit 48 óra múlva összegyűjtjük, poolozzuk és aktivitásra vizsgáljuk.

cDNS gyűjtemény létrehozása

A cDNS gyűjteményt legcélszerűbben a pcDVl vektor-primer és a pLl linker fragmentum (beszerezhető a P-L Biochemicals Inc., Milwaukee, W0 felhasználásával hozhatjuklétre, mégpedig olyan eljárásokkal, amelyek a mRNS teljes hosszúságában átírt másolatainak nagymértékű feldúsítását eredménye- ^í zik [például: Hl· Okayama, P. Berg, Mól. Cell Bioi. 2, 161-170 (1982) és MoL Cél Bioi. 3,280-289 (1983)]. Aplazmid-vektor, amely az SV40 korai promoterét és az SV40 RNS processzor szignáljait tartalmazza, arra szolgál, hogy elősegítse aklónozott cDNS szegmentum í kifejeződését emlős sejtekben.

Az Okayama-Berg eljárás alkalmazásával a gyűrűbe zárt cDNS-vektor készítménnyel kompetens baktérium sejtet transzformálunk, például E. coli MC10/1 sejteket [M. Casadaban és S. Cohen, J. Mól. Bil., 138, δ 179-207 (181)] kalcium-ldorid használatával [S. cohen és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114 (1972)]. ConA-val stimulált ClLy-l⁺279 sejtekből származó 5 pg poliA⁺ RNS-ből kiindulva, körülbelül l,5xl0⁶ egymástól független transzformált θ sejtet kapunk. Körülbelül 10⁴ egyedi klónt emelünk ld és ezeket mikrotitráló lemezeken (Flow Laboratories, Inc., McLean, Virginia) 200 pl L-táplevest — 50 pg/ml ampicillinnel és 7% DMSO-val kiegészítve — tartalmazó tartályokba oltjuk át. Ha kívánatos, fiók-gyűjteményeket is képezhetünk a teljes cDNS gyűjteményből a cDNS inszertumoknagysága alapján úgy, ahogyan ezt H. Okayama és P. Berg leírta [Mól. Cell Bioi., 3,280-289 (1983)]. (Röviden: a plazmid

DNS-t Sáli, Clal és Hindin enzimmel emésztjük külön-külön, majd 1%-os agaróz gélben elektroforetizálunk. Etidium-bromiddal való festés után a gélt 7 részre szeleteljük a cDNS inszertum nagyságának megfelelően, azaz 1-1-2, 2-3, 3-4, 4-5, 5-6 és nagyobb ί 5 mint 6kilobázis-pár (kb) lánchosszúságnakmegfelelően. A szeletekből extrahált DNS-t T4 DNS ligázzal reciklizáljuk és ezt használjuk az MC1061 törzs transzformálására. A nukleotid szekvencia analíziseket A Maxam és W. Gilbert szerint [Methods Enzymol., 65, :0 499-560 (1980)] végezhetjük.

cDNS próba-anyag készítése kimerítéssel Ha kívánt, ConA-val indukált szekvenciában gazdag ³²P-cDNS próba-anyagot készítünk kétszeri cDNS abszorpcióval abból a célból, hogy eltávolítsuk azokat a cDNS szekvenciákat, amelyeket mind a CLLy-l⁺279 sejtek, mind az immunrendsze rszoros rokonságban lévő, de differenciálódott sejtjei—ilyenekaB sejtmyelomák—egyaránt tartalmaznak [lásd M. Davis és munkatársai:, Jsolation of B4 T-Cell Spe0 cific Genes”, Szerkesztők: E. Vitteta és C. Fox; UCLA szimpózium anyagának48. oldalán (1982)]. Szacharóz gradiens frakcióból származó körülbelül 2 pg-nyi, MCGF vagy multi-CSF aktivitású mRNS-t előnyösen használunk templátként a reverz transzkriptáz reakci5 óban, valamint oligo(dl)₁₂_i8 primereket (beszerezhető: Collaborative Research, Waltham, Mass.). Az RNS lúgos hidrolízise után a ³²P-cDNS-t 20-20 pg WEHI-231 B-sejt lymphoma [lásd például: Taussing és munkatársai, hnmunology, 39, 57-60 (1981)] és ) NS-1 hybridoma (ATCC letéti száma HB-8113) eredetű mRNS-el hibridizálunk 68 ’C-on 14 órán át (cotérték -5.000). Ahibridizálatlan cDNS-t a cDNS/RNS hibridektől oszlopkromatográfiásan, hidroxilapatíton választjuk el. A második elválasztást ezután a nem í hibridizált ³²P-cDNS-el végezhetjük, inkubálatlan ClLy-l⁺279 sejtekből — mint fent — való mRNS (10 pg) feleslegét használva (cot-érték- 1.100). Az egyszálú conA-val indukált szekvenciákban gazdag ³²P-cDNS-t, amely a kiindulási anyag körülbdül 1¹ 2%-ából áll, használjuk ezután a telep hibridizációs eljárásában [T. Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning, A laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory,USA (1982)].

Majom sejtek transzfekciója DNS-el Atranszfekció előtti napon körülbelül lxlO⁶ COS7 majom vese sejtet oltunk 60 mm-es lemezekre. A transzfekciókat legalkalmasabban 15 pg plazmid DNS-el végezzük, 1,5 ml DME tápoldatban, mdy 50 mM trisz-sósavat (pH- 7,4) és 400 pg/ml DEAE dextránt (PharmacíaFine Chemical, Uppsala, Svédor6

HU 204 088 Β száj) tartalmaz. Ezt az oldatot ezután 4 óra elteltével eltávolítjuk és 4% fetális borjú szérumot tartalmazó 2,0 ml DME oldattal helyettesítjük. A tápoldatot 72 óramúlva összegyűjtjük és MCGF vagy multi CSF aktivitásra vizsgáljuk, ahogy ezt fent leírtuk. A DNS 5 transzfekciókat számtalan más sejttel is elvégezhetjük (lásd alább).

Multi-CSF meghatározási módszerek

A multi-CSF aktivitás meghatározása abból áll, hogy megvizsgáljuk vajon képes-e hatást kifejteni a 10 multipotens progenitor sejtekre, vagy számos más sejtvonalra korlátozott sejtre, vagy mindkettőre. [Lásd főként: N. Iscove és munkatársai, J. cell Physiol. Suppl. 1,65-78 (1982), és S. Ruppert, Exp. Hematol.,

11,154-161 (1983)]. Alapjában véve a vizsgálati kö- 15 riilmények elősegítik a vörösvérsejtprekurzor telepek (burst-forming erythroid colonies; BFU-E), a granulocita/makrofág telepek (granulocyte/macrophage colonies; CU-G/M) és kevert sejtvonalakhoz tartozó telepek (colonies of mixed lineages; CFU-Mixed) kifej- 20 lődését. A vizsgálatot rendszerint D. Metcalf és munkatársai [J. Cell Physiol., 98, 401-420 (1979)], valamint G. Johnson [J. Cell Physiol., 103, 371-383 (1980)] szerint végezzük.

-CSF-c meghatározás (Colony Formáig Unit- 25 culture)

A csontvelő sejteket C57B1/6 egerek combcsontjából nyerjük. A sejteket egyszer mossuk és egy-egy sejt szuszpenziót készítünk az Iscove által módosítottDulbecco tápoldatban (IMDM; Gibco, Grandlsland, New York), mely 3% fetális borjú szérumot (FCS, Gibco) tartalmaz. Az egy-sejt szuszpenziót műanyag szövettenyésztő csészékbe öntjük és 37 ’C-os inkubátorba,

6% széndioxid mellett 1-2 órán át inkubáljuk és hagyjuk, hogy a sejtek a csészéhez tapadjanak. Anem tapadó sejteket ezután eltávolítjuk és bizonyos esetekben áttesszük szakaszos Percoll (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gradiensbe, mely 40%-os, 50%-os, 60%-os és 70%-os Percoll oldat 2 ml-es rétegeiből áll [Kakiuchi és munkatársai közlése szerint, J. Immunoi., 131,

109 (1983)]. A különböző határfelületekről elkülönítve gyűjtjük be a sejteket, majd kétszer mossuk IMDM + 3% FCS oldattal. (Másképpen: a Percollra nem vitt sejteket egyszer moshatjuk IMDM+3% FCS oldattal).

Az elkülönített sejt üledékeket ezután IMDM + 15%

FCS oldatban reszuszpendáljuk úgy, hogy koncentrációjuk 4,5xl0⁶ sejt/ml legyen.

A CFU-c meghatározása az Iscove és munkatársai által módosított [J. Cell Physiol., 83,309 (1974)] metil-cellulóz módszer használatával történik. Keveréket készítünk FCS-ből (végső koncentrációja 25%), 2merkapto-etanolból (5xl0^s mól), penicülin-streptomicinből (Gibco törzsoldatból 1:100), metilcellulózból (1,1%, 4.000 centipoise), a sejtekből (l,5-2xl0⁵ /ml) és a különbőz CFU-c képességre vizsgálandó faktorból (30%), s a keveréket 1 ml-enként kis Petri-csészékben osztjuk. A lemezeket 7 napon át 37 ’C-on, 6% CO₂ tartalmú inkubátorban inkubáljuk. A lemezeken ezután bejelöljük a telepeket telep-mikroszkóp (4x) használatával. Kolóniának tekintjük azt a telepet, amely 50 vagy több sejtből áll. Az egyedi telepeket kiemeljük, tárgylemezre tesszük, fixáljuk és Wright/Giemsa szerint festjük [Lásd: Todd-Sanford, Glinical Diagnosis By Laboratory Methods, 15. kiadás, 137. oldal; Szerkesztők: Davidsohn és Henry (1974)]. Ezután az egyedi kolóniákban jelenlévő sejt típusokmorfológiájátmeghatározzuk.

-BFU-E meghatározás (Burst Formáig UnitErythroid vagy CFU-E)

Használhatjuk a fenti módszert a következő módosításokkal. Vagy a metil-cellulóz lemezre történő rávitelkor, vagy 3 napoal később lemezenként 0,5-1 egység birka eritroprotein (Step ΠΓ, Connaught Medical Research Laboratories, Philadelphia, PA) adagolunk. Alemezrevitelutáni 10-14. napon az eritroid sejt tartalmú telepeket (BFU-e vagy CFU-E)—ezek vizuálisan leolvasható elemeket tartalmaznak — megjelöljük. Egyedi telepeket emelünk ki és a morfológiai vizsgálathoz megfestjük, mint fent.

-CFU-s (Colony Formáit Unit-spleen (lép)

C57B1/6 egerek combcsontjából csontvelőt veszünk ki. A sejteket kétszer mossuk Dulbecco által módosított Eagel oldattal (DME, Gibco) és/vagy azonnal beoltjuk halálos adaggal besugárzott (1.000 rád) C57B1/6 recipiens egerek farok vénájába, vagy tovább kezeljük a sejteket. A kezelés az alábbi változatokból áll: (1) a sejteket anti-0 szérummal és komplementtel lizáljuk, majd vagy rögtön beoltjuk a recipiensekbe, vagy a beoltás előtt még különböző ideig, különböző 30 körülmények között tenyésztjük őket; (2) antiszérumos lizálást nem végzünk és a sejteket rögtön különböző körülmények mellett tenyésztjük. A tenyésztés körülményei a következők lehetnek: a sejteket lxlO⁶ sejt/ml sűrűségben olyan tápoldatban reszuszpendál35 juk, melynek összetétele a következő: DME (Gibco), 5xl0^-5 mól 2-ME, 1:100 MÉM vitaminok (Gibro), 1:100 nem esszenciális aminosavak (Gibco), 1:100 Lglutamin (Gibco), 1:100 penicillin/streptomicin (Gibco), arginin, aszpargin és folsav keveréke, 15% FCS 40 (Gibco), 2 mM nátrium-piruvát és a különböző faktorok (végső koncentrációjuk 25%), amelyek a CFU-s fenntartása szempontjából vizsgálandók. E sejt-készítményt ezután Falcon féle 24 tartályos szövettenyésztő lemezekre visszük — tartályonként 1 ml-t — 45 és 37 ’C-on, 10% széndioxidot tartalmazó inkubátorban inkubáljuk különböző időtartamokig (minimum 7 napig). Minden 3-4. napon a nem tapadó sejteket leválasztjuk, lecentrifugáljuk, megfelelő faktorokat tartalmazó friss tápoldatban reszuszpendáljuk és újra le50 mezre visszüli. Azokban a vizsgálatokban, amelyekben a tenyésztés 7 napnál tovább tart, a sejteket nagyobb műanyag szövettenyésztő edényekbe tesszük át, hogy a nem adherens sejtek töménysége ne haladja meg az 5xl0⁵/ml értéket. Az inkubáció végén a sejteket két55 szer mossuk, DME oldatban (kiegészítés nélkül) reszuszpendáljuk és halálos adaggal besugárzott C57B1/6 egerekfarokvénájába oltjuk. Asejteketvagy meghatározott élő sejt-szám szerint, vagy a tenyészet egy specifikus térfogatrésze szerint oltjuk be. Az oltás 60 utáni 9-12. napon a lépeket kimetsszük és Borin féle

HU 204088 Β fixáló oldatba tesszük (Mallinkrodt, St. Louis, MO).

Telep-mikroszkóp (4x) segítségével a lép felületén, lépkolóniák észlelhetők, mint látható modulusok.

Humán multi-CSF és MCGF cDNS izolálása Rágcsálók génjénekDNS Honjait használjuk a homológ humán géneket kódoló DNS azonosítására és izolálására.Mívd viszonylagkismértékű a hasonlóság ahumán és arágcsáló génekközötf,szigorúhibrfdizációs körülményeket kell teremteni ahhoz, hogy kereszt-hibridizáció jöjjön létre olyan szekvenciák között, amelyek csak 75-80%-han homológok. Számos különböző kísérlet eredményeit használtuk fel e cél elérése érdekében. Például humán immunglobulin könnyű lánc C^K gént izoláltunk a megfelelő egér C^K génnek, mint próba-anyagnak a felhasználásával JP. Heiter és munkatársai, Cell, 22,197-207 (1981)] és egér transzplantációs antigén géneket izoláltunk a humán megfelelőjét kódoló DNS Hónokkal való hibridizálás révén [T. Stemnetz és munkatársai, Cell, 24, 125-134(1981)]. 2

Egy előnyös módszer szerint humán genom DNS gyűjteményből való yfágHónokatviszünklemezre [Γ. Maniatis és munkatársai: „Molecular CIoning, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, USA (1982)] olyan sűrűségben, hogy egy megfelelő 2 gazda törzs esetében, ilyen azE. coliLE392,15mm-es lemezenként 2xlO⁴-5xlO⁴ plakk képződjék, Tíz-tizenkétlemezrendszerint elégséges.

’C-on 10-12 órán át tartó inkubálás után a lemezeket két óra hosszat fagyasztjuk, majd ezután egy 3 132 mm-es nitrocellulóz szűrőmembránt helyezünk a lemezeken lévő agar felszínére. A szűrőket legalább 5 percig hagyjuk érintkezni a lemezekkel, s ezen idő alatt a szűrőket úgy hozzuk kapcsolatba a lemezekkel, hogy tintával töltött22-es tűvel átszurkáljuk. A szűrő- 3: két ezután lehámozzuk a lemezekről, majd egymás után legalább két percig inkubáljuk először 250 ml 0,1 n nátrium-hidroxid és 0,5 mól nátrium-Horid tartalmú oldatban, majd 250 ml 0,5 mól trisz-sósavat (pH- 7,5) és 1,5 mól nátrium-Horidot tartalmazó ol- 4( datban. A szűrőket papírtörülközőkön szárítjuk és ezután 80 ’C-on 4-8 óránáthevítjük.

Hibridizáláshoz a szűrőket lxSET oldattal [0,15M NaCJ, 30 mM trisz-sósav (pH= 8,0), 1 mMNa₂EDTA] nedvesítjük, majd a következő összetételű oldatban 4í inkubáljuk állandó rázás mellett 65 ’C-on, két órán át: 3xSET, 5xDenhardt oldat [D.TUenhardt, B/BJLC. 23, 641-646 (1966)], 10% dextrán-szulfát, 0,1% SDS, 5050 μgΛnIpoK (rA), poli (rC) éspoli (rG). Lemezenként

1,5-2 ml oldatot használunk. Ezt az oldatot elöntjük 5C és a szűrőket 0,5 pg (10⁸ cpm) nick-transzlatált egér DNS próba-anyaggal hibridizáljukugyanezenfriss oldatban —szűrőnként 1,5-2 ml—65 ’C-on 1 órán át, majd 55 ’C-on 12-20 óra hosszat. A szűrőket ezután egymás után mossuk a következő oldatokban: SxSET, 55 IxDenhardt; 0,1% SDS és lxSET, 0,1% SDS. Amosást (10-15 ml/szűrőmembrán) 1 órán át 55 ’C-on végezzük enyherázogatás mellett. Aszűrőket papír törülközőn szárítjuk, majd a megfelelő filmmel és egy erősítő szűrővel 12-24 órás autoradiográfiás vizsgálatot vég- θθ zünk.

Az agar lemezekről steril Pasteur pipettával levesszük a hibridizált plakkokat és ezeket egyenként 1-1 ml alábbi összetételű oldatba tesszük át: 0,1 M 5 NaQ, 0,1 M trisz-sósav (pH- 7,5), 10 mM MgCl₂ és 100 pg/ml zselatin 50 pl Horoformban. Miután legalább 4-8 órán át tartottuk hideg helyen a plakkokat, ezek mindegyikét — kis sűrűség mellett: 150 mm-es lemezenként 2.000-4.000 plakk—újra szűrjük a fent (0 leírt módszer szerint.

Ugyanúgy, ahogyan az előbbiekben az egér-rendszernél leírtuk, az újbóli szűrővizsgálattal azonosított pozitiven hibridizáló fág Hónokat használhatjuk ezután próba-anyagként, hogy a humán cDNS gyüjte5 menyből származó random kolóniákkal elvégezzük a szűrővizsgálatot. A humán cDNS gyűjteményt egy megfelelő sejt populációból — ilyenek a humán perifériás vér T limfocitái [lásd: P. Gray és munkatársai, Natúré, 295,503-508 (1972)] —való RNS segítségé0 vei kell előállítani. Teljes hosszúságú cDNS Hónok azonosítása COS-7 sejtekben történő kifejeződésük révén lehetséges, ugyancsak oly módon, ahogy ezt az egér cDNS Hónoknál tettük. Az izolált humán multiCSF cDNS Hónok egy olyan faktort fognak kifejezni, amely humán csontvelő sejteketképes stimulálni.

Kifejeződés E. coliban, élesztőben és sejt tenyészetben

A prokarióták, ilyen az E. coli, igen alkalmasak a jelen találmány szerinti polipeptidek expressziójára 0 (Iásdpéldáula4388 397,és4411994számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat), feltéve, hanemkívánjukmegaglükoziIáltformát.Magas szintű kifejeződés elérésérepromotereketkell alkalmazni, ilyen a β-laktamáz (penicillináz) és laktóz promoter 5 rendszer [Chang és munkatársai, Natúré, 275, 615 (1978)]; Italaira és munkatársai, Science, 198,1056 (1977); Goeddel és munkatársai, Natúré, 281, 544 (1979), vagy a triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acid Rés., 8, 4057 ) (1980)]. Ezek a legáltalánosabban használt promoterek, de más mikrobiális promoterek is hozzáférhetők.

Azok, akik a szakterületen jártasak, tudják, hogy nemcsak prokarióták, hanem eukarióta mikrobák, például az élesztő, szintén használhatókproteinek dői állítására. A Saccharomyces cerevisiae igen előnyös eukarióta mikroorganizmus. Az élesztő vektorban alkalmas promoter szekvenciák közé tartozn aka3-foszfoglicerát-kináznak [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (198Q)], vagy a glükolízis más ¹ enzimeinek [Hess és munkatársai, J. Adv. Enzyme Reg., 7,149 (1968)] a promoterei. Más promotereket is használhatunk, melyeknek még ezenkívül az az előnyük, hogy transzkripciójukat a növekedési körülmények szabályozzák. Alapvetően bármelyik olyan plazmid-vektor alkalmas, amelyik az élesztővel kompatibilis promoter, egyreplikációskezdőpontot és terminációs szekvenciáiét tartalmaz.

A mikroorganizmusokon Hvül többsejtű organizmusokbólszármazó sejt tenyészetek (különösen emlős sejtek) is használhatók gazdasejtekként. Hyen alkal1

HU 204088 Β más sejtvonalak például a következők: HeLa sejtek, kínai hörcsögméh sejtvonalak és újszülött hörcsög-vese sejtvonalak. Az ezen sejtvonalaldiozvaló expressziős vektorok rendesen és szükségszerűen tartalmaznak egy replikációs kezdőpontot, a kifejezendő génnel 5 szemben elhelyezkedő promotert, bármely kívánt riboszóma kötő hely mellett RNS illeszkedési helyeket, poliadenilációs helyeket és transzkripciós terminátor szekvenciákat. Az expressziós vektor, ha emlős sejtekben történik a felhasználása, gyakran szabályozó 10 funkciókatlát el, s ezt vírus eredetű anyagszolgáltatja. Például az általánosan használt promoterek polyoma vírusból, adenovírus 2-ből és leggyakrabban az SV40ből származnak. (Lásd a 4 399 216. számú amerikai egyesült államokbeli és a WO 81/02425 és WO 15 83/03259 számú szabadalmi leírásokat).

A jelen találmány szerinti cDNS klónok E. coliban történő kifejezése érdekében megfelelő promotereket (például trp, lac, tac, XpL, stb.) és Shine-Dalgamo szekvenciákat fuzionálunk azon plazmidok teljes kó- 20 doló szekvenciájával, amelyek ATG kodont hordoznak, kedvezően a szignál peptid hasítási helyével· szemben. Részletesebben, a MCGF vagy mulü-GSF cDNS kiónját — például a pcD-MCGF-et — először Psű és Xhol endonuldeázzal emésztjük és a teljes pro- 25 tein kódoló szekvenciát tartalmazó 1 kb nagyságú szegmentumot a megfelelő E. coli expressziós vektorba klónozzuk, hogy a protein és a szignál szekvencia kifejeződjék. Másmódon — annak érdekében, hogy csak az érett protein fejeződjék ki — úgy járunk el, 30 hogy a szegmentumot az M13mp8 vektor Psű és Sáli endonukleáz hasítási helyeire klónozzuk, az egyszálú M13mp8 DNS-t, amely a protein kódoló szekvencia komplementer szálát tartalmazza, összekapcsoljuk egy szintetikus oligonukleotiddal 35 (5’ GATACCCACCGTTTA3’) majd kétszálú protein kódoló szekvenciát Klenow fragment segítségével állítjuk elő. A szekvenciát ezután Neol endonukleázzal emésztjük, majd SÍ nukleázzal kezeljük. A keletkezett tompa végű (blunt-en- 40 ded) DNS szegmentumot, amely a kétszálú MCGF kódoló szekvenciát, vagy a multi-CSF kódoló szekvenciát tartalmazza, beépítjük egy alkalmas expressziós vektorba, amilyen a tac promoterrel rendelkező pDR540 JD. R. Russel és G. N. Bennett, Gene, 20, 45 231-243 (1982); H.DeBoer és munkatársai, Proc.Nat. Acad. Sci. USA, 80,21-25 (1983); J. Messing és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74, 3642-3646 (1977); B. Gronenborn, J. Messing, Natúré, 272,375 (1978); J. Messing és munkatársai, Nucl. Acid. Rés., 9, 50 309 (1981); J. Messing és J. Vieira, Gene, 19,269-276 (1982)].

Egy MCGF vagy multi-CSF cDNS klón élesztőben való expressziója érdekében, a pcD-MCGF plazmidból izoláljuk a cDNS inszertumot hordozó Psű-Xhol 55 fragmentumot, majd a pUC8 plazmid Pstl-Sall helyére klónozzuk. A keletkező B8/pUC8 plazmidot Pstl-el hasítjuk és Bal31-el emésztjük, hogy a cDNS fölött elhelyezkedő oligo(dG:dC) blokkot eltávolítsuk. Egy Xhol linkért kötünk a Bal31-el emésztett DNS-hez, s 60 ezzel a plazmidokat az E. coliban helyreállítjuk. A transzformált sejteket megvizsgáljuk, hogy megállapítsuk a deléció nagyságát. Az XhoI-EcoRI fragfmentumot (amely a MCGF vagy multi-CSF cDNS-t hordozza) ezután egy olyan deletált származékból izoláljuk, amely 20 bázis pár nagyságú deléciót kell tartalmazzon és ezt a pAAH5 Hindin helyére és a pAAR6 EcoRl helyére klónozzuk blunt-end ligáz realicióval, Klenow fragment segítéségveí. [ApUC8 plazmid egy m!3mp7-ből származó rendszer, amely klónozásra, és szintetikus univerzális primerekkel történő szekvencia analízisnél jól alkalmazható: lásd J. Vieira és J. Messing, Gene, 19,259-268 (1983); a pcD-X-re vonatkozóan lásd H. Okayama és P. Berg, Mól. Cell. Bioi. 3,280-289 (1983); a pAAH5 és a pAAR6 olyan élesztő expressziós vektorok, amelyek az ADCI promotert és terminátort hordozzák: G. Ammer, „Expression of Genes in Yeast Using the ADCI Promoter” Methods inEnzymology 101,192-201 (1982)].

Tisztítás és gyógyszerkészítés

Az E. coliban, élesztőben vagy más sejtekben kifejeződött multi-CSF és MCGF polipeptideket a szakterület standard módszerei szerint tisztíthatjuk, beleértve az ammónium-szulfáttal való kicsapásí, az oszlopkromatográfiás frakcionálási (például: ioncserélő kromatográfia, géíszűrés, elektroforézis, affinitás kromatográfia, stb.) és a végső kristályosítást [lásd általánosságban: „Enzyme Purification and Related Techniques”, Methods in Enzymology, 22, 233-577 (1977)]. A találmány szerinti részlegesen vagy homogenitásig tisztított polipeptideket fel lehet használni gyógyszerkészítményekben (lásd alább), például a gyomor-bél csatorna parazita fertőzéseinek kezelésére, vagy kísérleti célra, például hematopoetikus és hízósejtek tápoldatainak kiegészítésére, vagy antigénként, specifikus immunglobulinok előállítására, amelyeket immunassayknél, immunfluoreszcenciás jelzéseknél, stb. lehet használni [lásd általában: „hnmunological Methods I-H. kötet, szerkesztők: I. Lefkovits és B. Pernis; Academic Press, New York, N.Y. (1979 és 1981) és „Handbook of Experimental Immonology”, szerkesztő: D. Weir; Balckwell Scientific Publications, St. Louis, MO (1978)].

A találmányban leírt polipeptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállításához ezeket a polipeptideket segédanyaggal—előnyösen inért, a gyógyszergyártásban elfogadott hordozókkal — keverjük. A megfelelő hordozók és előállításuk módszerei jól ismertek a szakterületen [lásd például: Remington’s Pharmaceutical Sciences és U.S. Pharmacopoeia: National Formulary, Marék Publishing ompany, Easton, PA (1980)]. Előnyös a parenterális alkalmazás, mely magába?oglalhat mechanikus adagolási rendszereket.

A gyógyszerkészítmény előnyösen egyadagos kiszerelésű. Ilyen fonna esetén a készítmény adagonként van szétosztva, s ezek az aktív komponens megfelelő mennyiségeit tartalmazzák. A készítmény egy adagjában lévő aktív anyag mennyisége 1 pg-tól 100 fig-ig változhat, illetve így állíthatjuk be, az egyedi alkalmazásnak és az aktív anyag hatékonyságának

HU 204088 Β megfelelően. A készítmény, ha kívánt, más terápiás szert is tartalmazhat.

Az adagolás a beteg szükséglete szerint változhat, a kezelendő állapot súlyossága és egy adott anyag használata alapján, egy adott esetnek megfelelő adagolás 5 meghatározása hozzátartozik e szakterülethez. Általánosságban a kezelést a hatóanyag optimális adagjánál kisebb adagokkal kezdjük. Ezután az adagolást kicsinyenkéntnőveljük, amígakörübnényeknekmegfelelő optimális hatást el nem érjük. Ha kívánt, akkor 10 kényelmes, ha a teljs napi adagot elosztjuk s a nap foIyamánrészletekben adagoljuk

Kísérleti eredményeink és adatainkmegvilágítására akóvetkező példákat adjuk közre anélkül azonban, hogy találmányunk oltalmi körét ezen példákra korlá- 15 toznánk.

1. példa

Kiónozott induktorT-sejtek

1. A Tby l⁺Lyl⁺2² fenotípusú (31^-1^279 sejtek 20 (ATCCIetétí szám: CRL 8179) egy klónjátfolyamatosan 0,5xl0⁵ sejt/ml sűrűségben a Dulbecco által módosított Eagle tápoldatban (DME) tartjuk fenn. A tápoldat a kövektező anyagokkal van kiegészítve: 10% bővel inaktivált fetális borjú szérum, 5xl0'⁵ mól 2- 25 ME, 2 mmól glutamin, nem esszenciális aminosavak, esszenciális vitaminok és 25% a ConA-val aktivált egér Balb/c lépsejtek felülőszójából kondicinálás végett

2) ACIiy-l⁺279 sejtek aktiválása ConA-val: a sej- 30 teket 5xl0⁵/ml sűrűségben tenyésztjük DME tápoldatban, melyhez 4% bővel inaktivált fetális borjúszérumot, 5xl0⁵ mól 2-ME-t, 2 mmól glutamint, nem esszenciális aminosavakat, esszenciális vitaminokat és 2 [ig/ml ConA-t adtunk. A sejt szuszpenziót 12-14 35 órás mkubálás után (37 °C, 10% CO^, 10 percig centrifugáljuk 1.500 ford/perc mellett. A sejtüledéket összegyűjtjük és azonnal -70 °C-ra fagyasztjuk. Afelulúszőkat—ezek tartalmazzák a növekedési faktorokat —leszűrjük (Nalgene—0,22 mikron) és -20 *C- 40 on tartjuk. Meghatározzuk a felülúszók alikvot mennyiségeinekMCGF aktivitását (lásd alább), hogy meggyőződjünk, vajon a sejtvonal indukálődott-e a ConAkezelésre.

2. példa

Klónozott hízó sejtek

1) Hízósejt vonalat (MC 9,' ATCCIetétí száma: CRL 8306), mely 13 napos egér-fetus májából származik, kiónozunk határhígításos módszerrel (Limiting Dilutíon Analysis) DME tápoldatban. A tápoldatot 4% bővel inaktívált fetális borjú szérummal (FCS), 5xl0’⁵ mól 2-ME-vel és 2 mM glutaminnal egészítjük ki, továbbá ConA-val aktíváit Balb/c Iép-sejtekkel kondicionáljuk JNábélés munkatársai, Natúré, 291,332-334 (1981)].AsejtkIónfelűleti membrán glükoproteínjeire nézve Tby 1, Ly 1, 2, Ly 5⁺fenotípusú.

2) A hízósejt ldónt 16-18 óránkénti megkétszereződés mellett, folyamatosan tartjuk fenn DME tápoldatban, melyhez 10% hővel inaktívált FCS-t, 5xl0~⁵

M 2-ME-t, 2 mM glutamint, nem esszenciális aminosavakat és esszenciális vitaminokat adunk s kiegészítjük ConA-val aktivált induktor T sejt klón (lásd fent) felülúszójának 5%-ávaL A hízósejt klón növekedése a stimulált ClJLy-l⁺279 sejtek felülúszó jában lévő aktívnövekedésifaktor(ok)tőlfügg.

3. példa

AzMCGFbiológiaimeghatározása

A Triciummal jelzett timidin beépülés meghatározása

a) 1 x 10 MC/9sejtet tenyésztünklaposfenekűmikrotítráló lemezeken 0,1 ml DME tápoldatban, melyhez 4% bővel inaktivált FCS-t, 5xl0’⁵ M 2-ME-t, 2 mM glutamint, nem esszenciális aminosavakat, eszszenciális vitaminokat és a vizsgálandó felülúszó felező hígításait adjuk.

b) A tálcákat 37 ’C-on, 10% CO₂-vel inkubáljuk. Húsz óra múlva 0,5 μΟ. ³H-timidint (New England Nuclear, Boston, Mass) adunk minden tenyészethez. Négy órával később a sejteket szűrőpapír csíkokra gyűjtjük automata sejt-harvester segítségévet A szárított mintákat szcintillációs folyadékba helyezzük és a percenkénti beütés számát standard β-számlálóval mérjük.

B. Kolorimetriás meghatározás tetrazollum sóval (MIT)

a) 1x10⁴MC/9 sejtet tenyésztünklaposfenekűmikrotitráló tálcákon, 0,1 ml, az Aa) pont szerint kofaktorokkal és az Aa) pontban leírt vizsgálandó felülúszóvalkiegészítettDME tápoldatban.

b) a tálcákat 37 °C-on, 10% CO₂-vel inkubáljuk. Húsz óra múlva minden tenyészethez 0,01 ml 5mg/mles MTT-t [3-(4,5-dimetiI-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromid; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO] adunkfoszfátpufferesnátrium-klorid (PBS) oldatban. Négy órával később 0,1 ml 0,04 n sósav tartalmú izopropanolt adunk minden tenyészethez és jól elkeverjük. Néhány perc múlva a tálcákat leolvassuk. Dynatecb MR580 Microelisa Autó Readert (Dynatecb Instruments,Inc., Torrance, CA) használunk 570 nM hullámhossznál (ferefencia hullámhossz 630 nm), a kalibráció 1,99.

4. példa mRNS izolálása ClXy-l⁺279 sejtekből a) A sejtekből az össz sejt-RNS-t izoláljuk Chirgwin és munkatársai [Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)] szerint, guanidin-izotiocianátos módszerrel.

Az indukálatlan vagy a ConA-val indukált fagyasztott CLLy-l⁺279 sejt üledéket guanidin-izotíocianát lizáló oldatban szuszpendáljuk. 20 ml lizáló oldatot használunk 1-2x10® sejthez. Az üledéket pipettázással reszuszpendáljuk, majd a DNS-t fecskendővel — 16-os tűvel—távolítjuk el, négy felszívással. Alizátumot 40 ml-es polÍalIomer centrifuga csőbe lévő 20 ml 5,7 mól cézium-klorid és 10 millimól EDTA tartalmú oldat tetejére rétegezzük. Az oldatot 25.000 ford/perc mellett Beckman SW28 rotorban (Beckman Instruments, Inc., Faló Alto, CA) 40 órán át 15 ’C-on centri10

HU 204088 Β fugáljuk ADNS tartalmú guanidin-izotiocianát fázist a folyadék tetejéről, egészen le a határfelületig, kipipettázzuk A centrifuga cső falát és a határfelületet 2-3 ml guanidin-izotiocianát lizáló oldattal mossuk. A csövet a határfelület alatt ollóval elvágjuk a céziumklorid oldatot dekantáljuk Az RNS üledékeket kétszer mossuk hideg 70%-os etanollal. Az üledékeket ezután500 μΐ 10mMtrisz-sósav(pH=7,4), 1 mMEDTA és 0,05% SDS tartalmú oldatban reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 50 pl 3 mólos nátrium-acetátot adunk és az RNS-t 1 ml etanollal kicsapjuk. Az RNS-t centrifugálással gyűjtjük Össze és az üledékeket egyszer mossuk hideg etanolla.

b) Poli A⁺mRNS izolálása: a mosott és szárított ossz RNS üledéket 900 pl oligo(dT) eluáló pufferben [10 mM trisz-sósav (pH= 7,4), 1 mM EDTA, 0,5% SDS] reszuszpendáljukAz RNS-t 3 percig 68 °C-on melegítjük, majd jégen lehűtjük, s ezután 100 pl 5 mólos nátrium-kloridot adunk hozzá. Az RNS-t ezután 1,0 ml oligo(dT) cellulózzal töltött oszlopra (Type 3, Collaborative Research, Waltham, MA) visszük, melyet a következő kötő-puff errel egyensúlyozunk ki: 10 mM trisz-sósav (pH= 7,4), 1 mM EDTA, 1,5 mM NaCl, 0,5% SDS. Az oszlopon átfolyt anyagot még kétszer rávisszük az oszlopra. Az oszlopot ezután 20 ml kötő-puff errel mossuk át. A poli A⁺ mRNS-t úgy kapjuk meg, hogy az eluáló pufferrel mossuk az oszlopot. Az RNS rendszerint az első 2 ml eluáló pufferben van. Az RNS-t 0,1 térfogat 3 mólos nátrium-acetáttal (pH= 6) és 2 térfogat etanollal csapjuk ki. Az RNS csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze, kétszer mossuk hideg etanollal és szárítjuk. Az üledéket ezután vízben reszuszpendáljuk. Alikvot mennyiségeit meghígítjuk és abszorpcióját 260 nm-en mérjük,

5. példa

A poli A⁺ mRNS frakcionálása szacharóz gradiens centrifugálással

A 4.b) példa szerint előállított poli A⁺ mRNS 100 pg-ját tartalmazó 100 pl oldatot 65 ’C-on hevítjük 1 percig, majd 5-25% szacharóz grádiensre [10 mM trisz-sósav (pH= 7,4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA] rétegezzük A gradienst 19 órán át 5 °C-on 26.000 ford/perc mellett centrifugáljuk, Beckman SW41 rotorban. 450 pl-es frakciókat gyűjtünk, amelyeket 2 térfogat etanollal kicsapunk, s a csapadékot reszuszpendáljuk. Az oociták oltásához (lásd alább). Paralell grádiensre radioizotóppal jelzett (³H-uridin) riboszóma RNS (BRL, Bethesda, MA) keveréket rétegezünk, centrifugáljuk, mint fent és a 450 pl-es frakciókat szcintillációs számlálóval mérjük.

A molekula-nagyság szerint frakcionált poli A⁺ mRNS-ből — a Xenopus oociták oltása révén kapott eredmények szerint — a 18S-nél lassabban ülepedő frakciók adnak MCGF aktivitásra csúcsot — kolorimetriás módszerrel mérve. Ez látható a 2. ábrán. Ezekben a frakciókban megközelítőleg tízszeresére dúsult a MCGF mRNS és ezeket használjuk a következőkben a ³²P-vel jelzett cDNS próbaanyag előállításához.

6. példa

Oociták oltása

Nőnemű Xenopus laevis-ből oocitákat veszünk le és Barth oldatban [88 mM NaCÍ, ImM KC1, 0,33 mM Ca(NO₃)₂,0,41 mM CaCl₂,0,82 mMMgSO₄,2,4 mM NaHCO₃,10 mMHEPES (pH== 7,9) Sigma Chemical Co., St. Louis, MO] inkubáljuk Injekcióhoz 2-3 oocitából álló csoportokat készítünk elő. Az injiciálandó RNS mintákat injekciós pufferben [40 mM trisz-sósav (pH= 7,4), 1,35 M NaCl] oldjuk. Az ossz poli A⁺ mRNS-t injekciós pufferben reszuszpendáljuk 500 pg/ml koncentrációban , míg az RNS mintákat, amelyeket a hibrid szelekciós eljáráskor a DNS szűrőmembránokról oldottunk le és hordozóként mindig injekciós pufférben reszuszpendáljuk Minden oocitát 40 ml alikvot mennyiséggel oltunk be, kézzel kihúzott mikropipetták és olyan pipetta-hegyek használatával, melyeket mikro-berendezéssel készítettünk A pipettákat ismert térfogatú steril desztillált vízzel kalibráltuk Körülbelül 30-40 oocitát oltunk minden mRNS mintából. A beoltott oocitákat 2-3 egyedből álló csoportonként 96 tartályos mikrotitráló csészében külön tartályokban — ezek 10 pl Barth oldatot és oocitánkubáljuk Az oocitákat 19 °C-on tartjuk 48 órán át, majd az élő oocitákat tartalmazó tartályok felülúszóit összegyűjtjük és egyesítjük. E felülúszókat mikrocentrífugában 10 percig centrifugáljuk és MCGF aktivitásukat a fent leírt ódon meghatározzuk A nem oltott oociták felülúszóit kontroll céljára mindig összegyűjtjük

A kezeletlen és a ConA-val stimulált CLLy-l⁺279 sejtek összegyűjtött felülúszóinak vizsgálati eredményeit azt táblázat tartalmazza. Minden minta titrálását, beleértve a referencia standardét is, triplikátumban végzünk. Egy MCGF egység az a faktor-mennyiség, amely a Cl.Ly-l⁺279 szupematáns alkalmazásánál kapott ³H-timidin beépülés maximális szintjének 15%-át eredményezi.

I. táblázat

Cl.Ly-l+279 sejtektől származó MCGF aktivitás (egység/ml)
	Sejt	Beoltott
	felülűsző	mRNS
ConAnélkül	50	40
ConA-val	26,383	1,404

7. példa cDNS gyűjtemény létrehozása A Vektor-primer és oligo dG-farofckal ellátott linker DNS-ek előállítása

Az Okayama és Berg (Mól. And. Cell. bioi. 2,161— 170 (1982)3 által leírt eljárást alkalmazzuk csekély módosításokkal és ezt adaptáljuk az Okayama és Berg (Mot and Cell. Bioi. 3, 380-389 (1983)] által leírt pcDVl éspLl plazmidokhoz.

A pcDVl DNS-ének 80 pg-os mintáját 20 egység KpnI endonukleázzal emésztjük 30 °C-on 450 pl-nyi

HU 204088 Β reakció keverékben, mely 6mM trisz-sósav (pH- 7,5), mM MgCl₂, 6 mM NaCl, 6 mM 2-ME és 0,1 mg marha szérum albumin (BSA) tartalmú. Az emésztést 16 óramúlva 40 pl0,25MEDTA-t(pH-8,0)és20 pl 10%-os SDS-t tartalmazó oldattal állítjuk le; a DNS-t vízzel telített fenol-kloroform 1:1 elegyével (a következőkben: fenol-CHCl₃) és etanollal való kicsapással nyerjükkt Hatvan, de nem több mint80dezoxitimidilát (dl) csoporttal végződő homopolimer farkakat adunk a Kpnl endonukleáz reakcióban keletkezett végekhez borjú timusz terminális transzferázzal úgy, hogy a reakciókeverék (38 pl) tartalma a következő: 140 mMnátrium-kakodilát, 30 mM trisz-sósav (pH6,8) puffer, 1 mM CoCl₂> 04 mM Dtt (ditiotreitol), 0,25 mM dTIP, a Kpnl endonukleázzal emésztett DNS és 68 egységterminálís dezoxinukleotidll transzferáz (P-L Biochemicals, Inc., Milwaukee, WI). A keveréket 37 ’C-on tartjuk és 30 perc múlva 20 pl 0,25 mólosEDTA(pH-8,0)és 10 pl 10%-os SDS keverékével állítjuk le a reakciót. A DNS-t többszöri fenolCHGl₃-al való extrahálással és etanolos kicsapással kapjuk meg. A DNS-t ezután 15 egység EcoRI endonukleázzal emésztjük 50 pl 10 mM trisz-sósav (pH=

7,4), 10 mM Mga₂,1 mM DTT és 0,1 mg/ml BSA tartalmú oldatban 5 órán át 37 ’C-on. Azt a nagy fragmentumot, amely az SV40 poliadenilációs helyét és a pBR322replikációs kezdőpontját és ampicillin rezisztencia génjéttartalmazza, agarózgél (1%) elektroforézissel tisztítjuk és a gélből módosított üvegpor módszerrel [B. Vogelstein és D. Gillespie, Proc. Nat Acad. Sci 76,615-619 (1979)], nyerjük vissza. A dT faktorokkal rendelkező DNS-t egy oh'go(dA)-cellulóz oszlopra történő adszorpció és az oszlopról való leoldás segítségével tovább tisztítjuk a következőképpen: a DNS-t 1 ml 10 mólos trisz-sósav (pH- 7,3) puff erben oldjuk, mely 1 mMEDTA-t és 1 MNaö-t tartalmaz. Az oldatot 0 ’C-ra hűtjük és rávisszük egy azonos pufferrel 0 ’C-on kiegyensúlyozott oIigo(dA)-cellulóz oszlopra (0,6 x 2,5 cm). Az oszlopot azonos pufferral mossuk 0 ’C-on és vízzel oldjuk ki szobahőmérsékleten. A leoldott DNS-t etanollal csapjuk ki és a csapadékot 10 mM trisz-sósav (pH- 7,3) és 1 mM EDTA tartalmú oldatban oldjuk vissza.

Azoligo(dG) farokkal bíró linker DNS-t úgy állítjuk elő, hogy a pLl DNS-ének 75 pg-ját 20 egység Psű endonukleázzal emésztjük450 pl reakciókeverékben, melynek tartalma a következő: 6 mM trisz-sósav (pH7,4), 6mMMgCl₂, 6mM2-ME, 50 mMNaClésO.Ol mg/ml BSA. A reakció keveréket 30 ’C-on tartjuk 16 órán át és ekkor fenoI-CHCl₃-al extraháljuk. Akapott DNS-t etanollal csapjuk ki. Ezután 10-15 dezoxiguanilát (dG) végcsoportot tartalmazó farkakat adunk a keverékhez 46 egység terminális dezoxinukleotidil transzferázzal, ugyanazon reakciókeverékben (38 pl), mint azt fentleírtuk, kivéve, hgoy a 0,1 mM dTIP helyett (JGTP-t használunk. A keveréket 37 ’C-on tartjuk és 20 perc múlva fenol-CHCl₃-al extraháljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 35 egység HindDI endonukleázzal emésztjük 37 ’C-on 4 órán át 50 pl 20 mM trisz-sósav (pH- 7,4), 7 mM MgCI₂,60 mM NaCl és

0,1 mg BSA tartalmú oldatban. Akis oligo(dG) farkas linker DNS-eket agarózgél (1%) elektroforézissel tisztítjuk és úgy izoláljuk, miatfentleírtuk.

B. cDNS gyűjtemény előállítása

1. lépés. cDNS szintetizálás

Reakciókeveréket készítünk, melynek 10 pl-e a következőket tartalmazza: 50 mM trisz-sósav (pH- 8,3), 8 mM MgCI₂, 30 mM KCI, 0,3 mM DTT, 2-2 mM dATP, dTIP, dGTP és dCTP, 20 pd aktivitású ³²P10 dCTP (3000 cüZmmól), 2 pg poliA+RNS a ConA-val indukált CLLy-lt279 sejtekből, 2 pg vektor-primer DNS (a primer vég 15 pmólja) és 45 egység reverz transzkriptáz. A reakciókever éket 60 percig 42 ’C-on inkubáljuk, hozzáadunk 60 egység RNáz-t (Biotec„ 15 Inc., Madison, WI), 15 percet 25 ’C-on inkubáljuk, majd a reakciót 1 pl 0,25 mólos EDTA (pH- 8,0) és 0,5 pl 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk le. A keverékhez 40 pl fenol-CHCl₃-ot adunk, majd az oldatot Vortex keverőben erősen keverjük, ezután centrifu20 gáljuk.Avizesfázishozezután40pl4mólosammónium-acetátotés 160 pl etanolt adunk, majd száraz jéggel 15 percig hűtjük, s ezt követően enyhe rázogatás mellett —hogy a reagálatlan dezoxinukleotid trifoszfátok, meíyekahűtés alatt kicsapódtak, feloldódjanak 25 — szobahőmérsékletre melegítjük és 10 percig Eppendorf mikrocentrifugában centrifugáljuk. Az üledéket 10 pl 10 mM trisz-sósavat (pH- 7,3) és 1 mM EDTA-t tartalmazó oldatban feloldjuk, hozzákeverünk 10 pl 4 mólos ammónium-acetátot és újra ki30 csapjuk 40 pl etanollal. Ez az eljárás a lereagálatian dezoxinukleozid-trifoszfátok több mint 99%-át eltávolítja. A csapadékot etanollal mossuk.

2. lépés: Oligodezoxicitidilát (oligo/dQ addíció Az üledéket, amely a plazmid-cDNSmRNS-t tar35 talmazza, 20 pl 140 mMnátrium-kakodilát—30 mM trisz-sósav (pH-6,8) pufferben oldjuk. Apuffer 1 mM CoCl₂-t, 0,1 mM DDT-t 0,2 pg poli(A)-t, 70 pM dCTP-t, 5 pCi ³²P-dCIP-t (3.000 Ci/mM) és 60 egységterminális dezoxinukleotid transzferázt tartalmaz.

Areakciót 37 ’C-on 5 percig végezzük, hogy létrejöjjön végződésenként 10-15 dCMP csoport addídója, majd 2 pl 0,25 mólos EDTA (pH- 8,0) és 1 pl 10%-os SDS hozzáadásával állítjuk le areakciót Areakciókeveréket 20 pl fenol-CHCl₃-al extraháljuk, a vizes fá45 zishoz 20 pl 4 mólos ammónium-acetátot keverünk, a DNS-tkicsapjukésújra kicsapjuk 80 pl etanollal, s az utolsó üledéket etanollal őblítjükle.

3. lépéstEmésztés Hindinendonukleázzal

Az üledéket 30 pl olyan pufferben oldjuk, mely

20mMtrisz-sósavat(pH-7,4),7mMMgQ₂-t,60mM NaCl-t és 0,1 mg/mlBSA-t tartalmaz, majd az oldatot 10 egységHindlH endonukleázzalemésztjük2 órán át 37 ’C-on. Areakciót3 pl 0,25 mólos EDTA (pH-8,0) és 1,5 pl 10%-os SDS hozzáadásával állítjukle. Ezután extrahálás következik fenol-CHCl₃-al, majd 30 pl 4 mólos ammónium-acetátot adunk a keverékhez, végűi a DNS-t 120 pl etanollal csapjuk ki. Az üledéket etanollal öblítjük, majd feloldjuk 10 pl 10 mM triszsósav (pH-7,3) és ImMEDTA tartalmú oldatban. Az oldathoz 3 pl etanolt adunk, hogy a -20 ’C-on való

HU 204088 Β tárolás alatt ne fagyjon le.

4. lépés: Gyűrűbe zárás (ciklizálás) oligo(dG) farokkal bíró linker DNS bekapcsolásával

A Hindin endonukleázzal emésztett, oligo(dC) farokkal rendelkező cDNS:mRNS plazmid (a minta 90%-a) 9 pl-es mintáját 90 μϊ következő összetételű keverékben ínkubáljuk: 10 mM trisz-sósav (pH= 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 1,8 pM oligo(dG)-farkos linker DNS. Az inkubálást 65 °C-on 5 percig, majd 42 ’C-on 60 percig végezzük, utána a keveréket 0 ’C-ra hűtjük. A keveréket (90 μϊ) ezután 900 μϊ térfogatra állítjuk be ügy, hogy az 20 mM trisz-sósavat (pH- 7,5), mMMgC^-t, 10 mM (NH^SC^-ot, 0,1 MKCl-ot, 50 pg/ml BSA-t és 0,1 mM p-NAD-ot tartalmazzon. Az oldathoz ezután 6 pgE. coli DNS-ligázt adunk és egy éjszakán át 12 ’C-on ínkubáljuk.

5. lépés: Az RNS szál cseréje DNS szálra

Hogy az inszertum RNS szálát kicseréljük, a ligáz reakció-keveréket úgy állítjuk be, hogy a négy dezoxi• nukleotid trifoszfátból 40-40 pM-t, 0,15 mM βNAD-ot,még4 pgE.coliDNS-ligázt, 16 egység E. coli DNS pölimeráz I-e (Poll) és 9 egység E. coli RNázH-t tartalmazzon. Ezt a keveréket (960 pl) ezután 1 órán át 12 ’C-on szobahőmérsékleten ínkubáljuk, hogy elősegítse az optimális repair szintézist és a Poll segítségével történő nick-transzlációt.

6. lépés: E. coli transzformálása

A transzformálást a Colién és munkatársai által leírt [Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69,2110-2114 (1972)] eljárás szerint — azt kissé módosítva — végezzük. MCI 061E. coli K-12 törzset |M. Casadaban és S. Cohen, J. Mól. Bioi. 138,179-207 (1980)] tenyésztünk 20 ml L-táplevesben [Mamiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, NY (1982) 68, old.] 600 nm-en mért 0,5 abszorpció értéket adó sűrűségig. A sejteket lecentrifugáljuk, 10 ml mM CaCl2 tartalmú 10 millimólos trisz-sósav (pH= 7,3) pufferben szuszpendáljuk és 0 ’C-on 5 percig centrifugáljuk. A sejteket újra szuszpendáljuk a fenti pufferben és megint 0 ’C-on 5 percig ínkubáljuk; ezután a sejtszuszpenzió 0,2 ml-ét 0,1 ml DNS oldattal (5. lépés) keverjük össze, s a keveréket 0 ’C-on 15 percig ínkubáljuk. Ezután a sejteket 37 ’C-on tartjuk 2 percig, majd szobahőmérsékleten 10 percig; ekkor 0,5 mlL-táplevest adunk hozzá és a tenyészetet 37 ’Con 30 percig ínkubáljuk; elkeverjük2,5 mlL-táplevessel készült lágy agarral 42 ’C-on, s ezt 50 pg/ml ampicillin tartalmú L-tápleveses agaira rétegezzük. A táptalajt 37 ’C-on 12-24 órán át Ínkubáljuk, majd egyedi telepeket szúrunk ki steril fogpiszkálókkal. Megközelítőleg lxyl0⁶független cDNS klón keletkezik és ezekből 10.000 egyedi kiónt emelünk ki. Akiónokat mikrotitráló lemezek tartályaiba, 200 pl tápoldatba oltjuk. A tápoldat 50 pg/ml ampiciiiin és 7% DMSO (dimetilszulfoxid) tartalmú L-tápleves. Körülbelül 1.000 klónos random poolokat képezünk és plazmid DNS-t készítünk a hibrid szelekciós kísérletekhez.

8. példa

Hibrid szelekciós vizsgálatok

A fentiek szerint előállított random poolokból készített nyolc plazmid cDNS készítménnyel hibrid szelekciókat végzünk.

1. DNS szűrői emezek készítése

Minden plazmid DNS-t, mielőtt a nitrocellulóz szűrőmembránokra kötjük, Clal-el való emésztéssel linearizálunk. Az emésztést 50 pl olyan oldatban végezzük, melynek tartalma a következő: 10 mM trisz-sósav (pH=7,9), 10mMMgCÍ₂,10 pg plazmid DNS, 50 mM NaCl és 10 egység Clal. A reakciókeveréket 2 órán át 37 ’C-on ínkubáljuk, majd a mintákat 200 μϊ-re hígítjuk TE oldattal (10 mM írisz-sósav/pH= 8,1/, 1 mM EDTA) és azonos mennyiségű, (200 pl) TE-vel telített fenollal extraháljuk. A vizes fázishoz 20 pl 3 mólos nátríum-acetátot (pH= 6) adunk és ezt 2 térfogat etanollal csapjuk ki. ADNS csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze és ezután 70%-os etanollal mossuk. A szárított üledék minden 10 pg-ját (DNS) 150 pl steril vízben reszuszpendáljuk. Minden DNS minta részére két szűrőt készítünk, szűrőnként 10 pg DNS-el. A 150 μϊ-ben lévő DNS-t 10 percig forraljuk, hozzáadunk 150 pl 1 n NaOH-t, majd az oldatot 20 percig szobahőmérsékleten ínkubáljuk. Az oldatot jéggel lehűtjük, majd 150 μϊ 1M sósav, 1 M nátrium-klorid, 0,3 M nátrium-citrat és 0,5 M trisz-sósav (pH= 8,0) tartalmú oldatot adunk hozzá.

Schleicher-Schueíi mikroszűrő készülékre desztillált vízzel nedvesített 0,9 cm-es Millipore HAWP szűrőmembránokat helyezünk, a fenti denaturált és neutralizált DNS oldatot átszűrjük 500 ford/perc melletti 5 percig tartó centrifugálással. A szűrőket 1 ml 6xSSC oldattal (0,15 M NaCl, 0,15 M Nátrium-citrát) mossuk, majd szárítjuk és 2 órán át 80 ’C-on hevítjük.

2. Hibridizálás

A hibridizálást 200 pl olyan oldatban végezzük, mely 65% (v/v) redesztillált formamidot, 20 mM PIPES puffért (pH= 6,4), 0,4 MNaCl-t, 200 pg/ml borjúmáj tRNS-t és ConA-val indukált Cl.Ly-1+279 sejtekből származó poli Á⁺-mRNS-ből 100 pg/ml-t tartalmaz. A hibridizációs oldatokat 3 percig 70 ’C-on tartjuk, majd két DNS szűrőt (10 pg DNS szűrőként) negyedekre vágunk és beletesszük az oldatba. A hibrideket 4 órán át 50 ’C-on ínkubáljuk, majd ezt követően 4 órán át 46 ’C-on és 42 ’C-on. Ezen idő elteltével a felüíúszókat eltávolítjuk és a szűrőmembránokat háromszor mossuk 1-1 ml kővetkező összetételű oldattal: 10 mM trisz-sósav (pH- 7,4), 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS. Ezután még háromszor 1-1 ml ugyaneze npufferrel mossuk, de SDS nélkül. Mindkét mosópuff ért 65 ’C-on tartjuk. Ahibridizált mRNS leoldására a szűrőket tartalmazó fiolákhoz 400 pl desztillált vizet adunk, melyben 5 pg borjúmáj tRNS van. A fiolákat 3 percig forraljuk, majd gyorsan lehűtjük etanolos száraz jégen. A mintákat felolvasztjuk és a kioldódott RNS-t 2 térfogat etanollal és 0,1 térfogat 3 mólos nátrium-acetáttal (pH- 6) kicsapjuk. A centrifugálással összegyűjtött RNS üledékeket 2 pl oocita injekciós pufferben reszuszpendáljuk és az egész anyagot oocitákba oltjuk (lásd fent).

Az ilyen módon szűrt 8 pool többsége pozitív volt és

HU 204088 Β azt a poolt, amely a legnagyobb MCGF aktivitást fejtette ki, választottuk további vizsgálatokhoz. Ezt a poolt, mely 672 egyedi kiónból állt, 48 Hónból álló 14 további szub-poolra osztottukfel. E szub-poolokplazmid DNS-ét használtuk fel a hibrid szelekció egy má- 5 sodik sorozatában. Ezekből aszub-poolokből csak egy adottpozitíveredményt. A48 Hónt ezután kétkimerített cDNS próba-anyaggal — leírását lásd később — szűrjük.

9. példa

Kimerített cDNS próba-anyag előállítása 1.³²P-cDNS szintetizálása Fenti szacharóz gradiens MCGF csúcs frakciójából YalópoliA⁺mRNS 2 pg-ját2plvízhenreszuszpendál- 15 juk. A szuszpenziót 5 percig 65 ’C-on hevítjük, majd hozzáadjuk az alábbi összetételű, 100 pl összmennyiségű reakciókeverékhez: 50 mM trisz-sósav (pH= 8,3), mM Mga₂, 30 mM Kd, 0,7 mM DTT, l-l mM dATP, dGTP, dTTP, 34 μΜ dCTP, 10 pg/ml oligo- 20 (12-18)-dT (CollaborativeResearch), 100 pg/ml aktinomicin D, 500 μΰ a³²P-DCTP (Amersham, 3.000 Ci/millimól) és 150 egység reverz transzkriptáz (Life Sciences, Inc., St. Petersburg, EL). Areakciókeveréket 2 óra hosszat 40 ’C-on inkubáljuk, s ekkor kiveszünk 25 belőle 0,5 pl-t triHórecetsavas kicsapáshoz, a beépült ³²P mennyiségének meghatározására. Ezután 100 pl 0,2 n nátrium-hidroxidot adunk a reakciókeverékhez, majd20percig70 ’C-on tartjuk, hogy azRNS-t elhidrolizáljuk. Lehűtés után a reakció keveréket 20 pl 1 n 30 sósavval semlegesítjük és 4 pl 1 mg/mlkoncentrációjú tRNS oldatot adunk hozzá, hordozóként. A mintákat kétszer extraháljuk azonos térfogatú fenol-Horoform (1:1) keverékével, s az extraktumot ezután azonos térfogatú 4 mólos ammónium-acetáttal és kétszeres tér- 35 fogatú etanollal csapjukH. Az üledéket 100 pl vízben reszuszpendáljuk, a Hcsapást megismételjük és az üledéketkétszermossuk80%-os etanollal.

2. Első kimerítő hibridizálás WEHI-3 sejtvonalból (mielo-monocita sejtvonal) 40 származó 20 pgpoli A⁺mRNS-el és egyB-sejt hibridomából származó 20 pg poli A* mRNS-el koprecipitáljuk a fent leírtak szerint szintetizált ^3zP-cDNS-t.

Az üledéket a következő összetételű oldatban reszuszpendáljuk: 7 pl víz, 1 pl 4 mólos nátrium-foszfát (pH= 45 7), 0,1 pl 20%-os SDS és 0,1 pl 0,1 mólos EDTA Ezután az egész mintát kapilláris csőbe forrasztjuk. A mintát 30 percen át 90 ’C-on hevítjük, majd lehűtjük 68 ’C-ra, s ezen a hőfokon tartjuk 14 órahosszat (Cot=

5.000 [Lásd Wood et al., Bicohemistry, 2.ed., Benja- 50 nim/Cummings (1981) 453-457. old., és Methods in Enzymology, Vol29,363-365(1974)]).Ahibridizációs keveréket ezután 1 ml-re hígítjukO,12 mólos nátrium-foszfát (pH- 7,0) és 0,10-os SDS keverékével, majd a reakció keverékhőmérséHetét 60 ’C-ra emel- 55 jük. A keveréket ezután azonos pufferrel 60 ’C-on kiegyensúlyozott 0,4 ghidroxi-apatit tartalmú oszlopra visszük fel. Az átfolyt folyadékot összegyűjtjük, majd az oszlopot 5 ml azonos pufferrel mossuk 60 ’C-on.

1-1 ml-es frakciókat szedünk és minden frakcióból 50 pl alikvot mennyiséget szcintillációs számlálóval megvizsgálunk. Az egyszálú cDNS csúcs, a 2, 3 és 4 frakcióban van s ezeket összeöntjük. Ezt az anyagot, amely a kiindulási ³²P-cDNS 66,5%-át képviseli, 0,4 ml-re koncentráljuk úgy, hogy 2-butanolIal Hcsapjuk, majd 2 ml Sephadex G-25 oszlopon kromatográfiásan sótalanítjuk.

3. Másodikkimerítő hibridizálás

Fenti sótalanított mintát etanolos kicsapással koncentráljuk, majd koprecipitáljuk indukálatlan a JLyl⁺279 sejtekből származó 9,5 pg poli A⁺mRNS-el. A mosott és szárított üledéket a következő összetételű oldatban reszuszpendáljuk: 10 pl víz, 1,5 pl 4 mólos nátrium-foszfát (pH= 7), 0,15 pl 20%-os SDS és 0,15 pl 0,1 mólos EDTA Amintát leforrasztott kapilláris csőben 30 percig 90 ’C-on, majd 68 ’Ck-on 20 órán át inkubáljuk. Megismételjük af ént leírt hidroxiapatitos kromatografálást. Az oszlopról 60 ’C-on duált egyszálú cDNS a kiindulási anyag 17%-át képviselte. Ezt a ³²P-cDNS-t használtuk a hibrid szekvenciós vizsgálatnál azonosított 48 telepből álló alcsoport telep hibridizációjához Három telep hibridizált a próbaanyaggal és ezekkel végeztüka továbbihibridszelekciót. Ezek közül az egyik 5G-vel jelölt Hón — reprodukálhatóanpozitívvolt.

10. példa

Nagyság szerint frakcionált fiók-gyűjtemény

A teljes cDNS gyűjteményt reprezentáló plazmidDNS-ből (pcD-XDNS) 30 pg-ot Sáli, Hindin és Clal restrikciós enzimmel külön-külön emésztünk, hogy a plazmidot linearizáljuk. A hasított DNS darabokat nagyságuk szerint frakcionáljuk 1%-os agaróz gélben abból a célból, hogy a különböző hosszúságú cDNS inszertumokat tartalmazó plazmidokat elválasszuk. A gélből úgy vágunkH szeleteket, hogy azok akövetkező nagyság-tartományba tartozó cDNS-el rendelkező plazmidokatképviseljék:

0-1 kb (kilobázis pár) l-2kb

3- 4 kb

4- 5kb

5- 6kb

6kb és ennélhosszabb.

Minden gél-szeletbőlHoldjukaDNS-taVogelstein és Gülespie által leírt üvegpor módszerrel [Proc. Nat Acad. Sci. USA 76,615-619 (1970)]. Ahárom emésztésből származó, kioldott DNS-eket molekula nagyságuk szerint poolozzuk, majd T4 ligázzal kezeljük a reciHizálás érdekében. A ligáz reakciót 15 pl összmennyiségben végezzük a közeg 50 mM trisz-sósavat φΗ-7,4), 10mMMga₂-t, lOmMDIT-t, ImMspermidint, 1 mM ATP-t és 100 pg/ml BSA-t tartalmaz. A ligáz reakció keverékeket 16 órán át 12 ’C-on inkubáljuk. Minden egyes nagyság szerint összeöntött frakcióból 3 pl-t használunk az MC 1061 E. coli törzs transzformálására, melyet Cohen és munkatársai módszerével végzünk [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114 (1972)]. Az 1-2 kb hosszú cDNS inszertumokat tartalmazó frakcióból Ι,ΙχΙΟ⁵ egymástól füg14

HU 204088 Β getlen, transzformált sejtből álló gyűjteményt kaptunk, s ezeket használtuk fel a teljes hosszúságú MCGF Hónok ezután következő szűrésére.

11. példa

Anagyság szerint frakcionált fiók-gyűjtemény szűrése

Az előzetes, restrikciós endonuHeázzal végzett vizsgálatok, valamint a DNS szekvencia adatok azt mutatták, hogy az 5G Hón cDNS inszertuma (hibrid szelekcióval azonosítva) volt közelítően 650 bázispár hosszú. Az 5G Hónból egy belső BamHI-NcoI restrikciós fragmentumot izolálunk. A fragmentumot borjúbél alkalikus foszfatázzal defoszforiláljuk G. Chacomas és J. Sande [Methods Enzymol. 65,75-79 (1980)] módszerével. A fragmentumot ezután γ³²Ρ-ΑΤΡ és T4 polinuHeotid kináz segítségével jelezzük A. Maxam és W. Gilbert szerint [Methods En2ymol. 65, 499-507 (1980)]. Ezt a jelzett fragmentumot használjuk ezután, hogy a ConA-val indukált Cl.Ly-l+279 sejt mRNS-ének egy RNS részét megvizsgáljuk. Egyetlen, körülbelül 1 kb hosszú sávot észleltünk, mely arra engedett következtetni, hogy az 5G Hón nem volt teljes hosszúságú Hón.

Ezért az 5G Hón cDNS inszertumából való ugyanezen próba-anyagot használjuk fel az 1-2 kb hosszúságú inszertumokban gazdag fiók-gyűjtemény (lásd fent) szűrésére. Hanahan és Moselson [Gene, 10, 63' munkatársai leírták [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Körülbelül 500-1.000 baktériumot szélesztünk 80 mm-es nitrocellulóz szűrőlemezekre, melyeket ezután 50 pg/ml ampicillin tartalmú L-tápleves lemezeken inkubálunk 37 ’C-on, s a képződött baktérium telepeket egy második nitrocellulóz lemezre visszük át. A duplikátum szűrőket ampicillines L-táplevesben inkubáljuk 8 órán át 37 ’C-on,

II.

majd átvisszük 10 μg/ml Horamfenikol tartalmú Ltápleves lemezekre, ezeket egy éjszakán át inkubáljuk, hogy megnöveljük a plazmid másolat számát. A telepek DNS-e nitrocellulózhoz kötődik, miután a telepeket SDS-el lizáljuk. NaOH-val denaturáljuk és neutralizáljuk T. Maniatis és munkatársai által leírtak szerint (lásd a fentiközleményt).

Megközelítően 20.000 telepet szűrtünk és ezek közül 19 telep adott reprodukálhatóan pozitív eredményt a próbaanyaggal történő újraszűrést követően. Ezekből a telepekből izoláljuk a plazmid DNS-t, amelyet ezután a transzekciós kísérleteknél használunk fel.

12. példa

TranszfekciókDNS-el

A transzfekció előtt egy nappal közelítően 10 ⁶ COS-7 majom sejtet oltunk 10%-os fetális borjúszérumot és 2 mól glutamint tartalmazó DME tápoldat20 ba, egyedi 60 mm-es lemezekre. A transzfekció keresztülviteléhez a tápoldatot minden lemezről kiszívjuk és helyette 1,5 ml olyan DME tápoldatot adagolunk, amely 50 mM trisz-sósavat (pH= 7,4), 400 μ^ιηΐ DEAE-dextránt és a vizsgálandó plazmid DNS-ekből

15 ^g-ot tartalmaz. A lezemezeket 4 órán át 37 ’C-on inkubáljuk, majd a DNS tartalmú tápoldatot eltávolítjuk, a lemezeket kétszer mossuk 2 ml szérum mentes DME tápoldattal. A lemezekhez 4% fetális borjú szérumot és 2 mM glutamint tartalmazó 2,0 ml DME tá30 poldatot adunk, majd a lemezeket 72 órán át 37 ’C-on inkubáljuk. A tenyészíeveket összegyűjtjük és MCGF aktivitásra viszgáljuk, a fent leírt módon.

A hat pozitív kiindulási Hónból ötöt vizsgáltunk transzfekcióval, s a kapott eredményeket a ÜL táblá35 zatban mutatjuk be. Az ál-transzficiált (moekbfected) COS-7 sejteket azonos módonkezeljük, deaDNS elhagyásával.

táblázat

Klón	cDNS kezdőpont-f-	Azoligo(dG) szakasz hossza+++	NCGF aktivitás egység/ml
Ál-transzf,(Mock)	-	-	20
B4	41	13	5,228
B5	ND++	ND	7,371
B6	1	12	2,207
B8	1	13	6,929
B9	1	13	3,362
Cl.Ly-l+279	-	-	19,769

+Az MCGF cDNS 5' végét az 1. ábrán nukleotid csoportként jelöljük.

('('(Nőt determined) Nem ht’.ároztuk meg; a cDNS kezdőpontja a 41 -es pozíció 5’ felé eső részében van. +++Az MCGF cDNS 5’ végén lévő oligo(dG) szakasz.

A teljes hosszúgágú MCGF és multi-CSF (lásd alább) cDNS inszertumot hordozó pcD-MCGF plazmidot a 3. ábrán mutatjuk be. A plazmidot hordozó E. coli baktériumot letétbe helyeztük ATCC 39.467 letéti szám alatt. A 950 bp hosszú inszertumot a pcD expressziós vektor tartalmazza. Az SV40 korai promoíeréből induló transzkripciót nyíllal jelöljük. A splice donor és akceptor helyek helyzetét megjelöltük. Apo15

HU 204088 Β liadenilációs szignál, mely szintén az SV40-ből származik, a cDNS mszertum 3’ végénél helyezkedik el. A cDNS inszertum erősen sraffozott. A vektor további szekvenciái a pBR322 plazmidból származnak, a βIaktamáz génnel (Amp¹¹) és a replikáció kezdőpontjával együtt. A 4. ábra a jelen találmány szerinti cDNS inszertumban a restrikciós endonukleáz hasítási helyek térképét mutatja be, az 1. ábra ennek nukleotid szekvenciáját és feltételezett aminosav szekvenciáját tartalmazza.

Három cDNS inszertum 166 kodonból álló egyetlen nyitott leolvasási rendszert tartalmaz, amely a 28-as pozícióban a metionin kodonnal kezdődik E feltételezett iniciációs kodonon kívül két másik metionin kodon is előfordul; az elsőtől lefelé a 12. és 18. kodon. A negyedik cDNS kiónban az mszertum 40 bázispárral lejjebb kezdődik a másik három inszertum 5’ végéhez képest. Ebben a rövidebb cDNS kiónban az első metionin kodon hiányzik de még mindig termel aktív MCGF-et, ha COS sejtekbe építjük be. Tehát a két lefelé fekvő ATG kodon egyike nyilvánvalóan iniciáciős ködönként szolgál.

A COS-7 sejtekben kifejeződő B9 ldónt (COSMCGF) használtuk arra —más T-sejt termékektávollétéhen — hogy aktivitásának spektrumát meghatározzuk. A kifejeződött anyag a T és B sejtekre nézve nem mitogén, nem indukálja a B sejteket immunglobulin termelésre (EH. táblázat) és nem indukál makrogfág la expressziót. Ez a gén-termék azonban a metilcellulózban szuszpendált csontvelő sejteket hematopoetikus telepek képzésére stimulálja, bizonyítván, hogy egyetlen géntermék úgy MCGF, mint telep serkentő faktor aktivitást (colony stimulating acticíty) fejthetki.

HL táblázat

ACOS-MCGFmetilcellulózos csontvelő-sejt tenyészetekbenstimulálja a BFU-E, CFU-C és CFU-Mexed telepekkialakulását

Atenyészethez adott felülúszó	Kísérlet	Nemeritroid CFU-C*	BFU-E* CFU/ Mixed*	TGF” aktivitás egység/ml	BCGF+ aktivitás egység/ml	PFC++ (106-B -sejt)
MCGFcDNS-el
transzficiálí	1
COS-7 sejtek	2
Ál-transzficiált COS-7	1
sejtek	2
L sejtek	1
aLy-1+279 sejtek	1
Tápoldat

ND- (nőt determined) nincs meghatározva «Telepszám per 1,5x105 csontvelő sejt. Minden érték a triplikátum tenyészetekben meghatározott telepszám átlagát te SEM (SEMStandard Error of Mean) jelenti. 1,5x105 nem tapadó, alacsony sűrűségű ( 1,077 g/ml), C57B1/6 egerekből származó csontvelő sejteket szuszpendálunk 1 ml alikvot mennyiségekben, 35mm-es csészékben, melyek 0,9% metilcellulőzt, 20% FCS-t, Iscove által módosított Dulbeco táptalajt, 50 mM 2-ME-t tartalmaznak, valamint 30%-ot a sejt felülűszőval kondicionált táptalajból, ahogy jeleztük. A CSF a makrofág telepek kifejlődését indukálja. A csészéket 5 napon át inkubáljuk széndioxidban 37 °C-on, majd minden csészéhez 0,5-1,0 egység eritropoetint (Connaught,in. fázis) adunk. További 7 napos inkubáció után a lemezeken kinőtt telepeket telepmikroszkóp segítségével megszámol juk.

**A TCGF aktivitást az előbbiekben leírt módon határozzuk meg. Egy egység TCGF aktivitású az a mennyiség, amely 5x103 HT-2 sejtekben a 3H-timidinmaxÍmális beépülési szintjének 25%-át idézi elő.

+A B-sejtejet C57B1/6 egerek lépéből tisztítjuk és a leírt módon vizsgáljuk a prolif eráciőjukat. Egy egység BCGF aktivitású az a mennyiség, amely 2 mg/ml IPS-el stimulált 2x105 B sejtben a 3H-timidia beépülési szintjének 50%-át idézi eló.

++Az össz immunglobulin szekretálő plakk-képző sejtek számlálását módosított hemoh'zises plakk módszerrel végezzük.

Végeredményben a kifejeződött B9 kiónt olyan körülmények között vizsgáltuk, amelyek elősegítették a BFU-E, CFU-G/M és CFU-Mixed kolóniák képződését AHL táblázat bemutatja, hogy háromleszámolható telep típus azonosítható akifejeződött anyaggal inkuhált csontvelő sejtektenyészetében. Aleggyakoribb típus színtelen telepekből áll, amelyekben hemoglobinra utaló elemek nincsenek. Morfológiájuk a granulocfta/makrofág kolóniákra volt típusos, s jelenlétüket később hisztokémiai festéssel is biztosítottuk. Volt még néhány nagy makroszkópos telep, amelyek egyöntetűen vörös sejt-halmazokat tartalmaztakmulticentrikus elhelyezkedésben, s ezeketBFU-E-nek jelöltük. Ezenkívül több olyan telepet figyeltünk meg, amelyekben hemoglobinos sejtekkel keverve nagy és kis áttetsző sejtek voltak, s ezeket mint kevert telepeketvettük számba.

Ezen különböző telepeknek az összetételétúgy vizsgáltuk, hogy kiválasztott telepeket tárgylemezre vittünkfel és Wright-Giemsa vagy nem specifikus észte55 ráz festékkel festettünk meg. Több mint 300 telepet vizsgáltunk. E kolóniák többsége (89%)-a) granulocitákból, makrofágokból, vagy granulocita/makrofág keverékből állt, míg 4%-át hízósejtek alkották. A többi kevert sejtvonalakból állt, de nem neutrofil/makrofág sejtekből. Több vizsgálat anyagából 10 reprezentatív

HU 204088 Β kevert telepet választottunk ki és az ezekben lévő különböző sejtek számát a IV. táblázatban adjuk közre. Az egyedi telepekben lévő többféle sejttípus jelenlétéből az a következtetés vonható le, hogy ezek a telepek pluripotens progenitor sejtekből származnak.

TE táblázat

COS-MCGF-el kondicionált tápoldatban tenyésztett csontvelő sejtekből kiemelt hematopoetikus kevert telepek sejtösszetétele

Telep száma	E		vérkép	(%)......... M	B1
n	m	Q	mást
1	21				76		3
2		36	35	20	9
3	97		1			2
4			22	20	78
5	17		74		9
6		64	15	21
7	18	81				1
8	27	40		33
9		86		14
10	96					3	1

^Azoknak a telepeknek a vérképe (a sejt-típusok százalékos aránya), amelyek több mint 200 magvas sejtből állnak.

Rövidítések:

E, Eritrocita (vörösvérsejt); N, neutrofil; m, makrofág/monocita; e, eozinofil; mást, hízósejt; M, megakariocita; Β1, blaszt sejt.

E kifejeződött B9 kiónt korai, el nem kötelezett őssejteken próbáltuk kiaJ.Schrader és I.Clark-Lewis[J. Immunoi., 129,30-35 (1982)] által módosított Till és McCuUock [Radiat.Res., 14, 213-222 (1961)] módszere szerinti CFU-S vizsgálattal. Ha nem adherens, T-sejt mentes csontvelő sejteket egy hétig COS-MCG tápoldatban inkubálunk, majd intravénásán beadjuk halálos mértékben besugárzott egereknek, a iépben makroszkópos telepek jelennek meg (V. táblázat). Ezzel szemben, ha a sejteket ál-transzficiált COS-7 sejtekfelülúszóiban inkubáljuk, nem képződnek telepek.

V táblázat

CFU-S kimutatása egy héten át COS-MCGF-el kondicionált tápoldatban tenyésztett csontvelő sejtekben

A tenyészethez adott felülúsző	Kísérlet száma	Lép modulus egerenként+	CFU-S++
Teljes hosszúságú
MCGFcDNS-el	1	8,8 + 1,5	264
transzficiált COS-7 sejtek	2	6,2 + 2,8	186
InkomplettMCGF cDNS-el
transzficiált COS-7 sejtek	2	0,8 ± 0,7	21
Ál-transzficiált
COS-7 sejtek	1	0,8 ± 0,7	24
	2	0,7 +0,6	21
L sejtek	1	0,3 ± 0,5	9
	2		Meghatározás nem történt
Tápoldat	1	0,3 ± 0,5	9
	2	0,5 ± 0,5	15

+Öt individuális egérben kimutatott lép kolóniák átlag száma sz SEM.

++CFU-S számított átlaga, mely a CFU-S gyakoriságát tükrözi 3x106 csontvelő sejt teljes tenyészetében. Az inkomplett

MCGF cDNS klónból hiányzik az 55 aminosav amino-terminálisát kódoló régió.

Anti-Thyl antitesttel és komplementtel kezelt alacsony sűrűségű ( 1,077) C57B1/6 csontvelő sejteket aduhk lxlO⁶ sejt/ml töménységben csészében lévő Iscove által módosított Dulbecco táptalajhoz, mely 20% fetális borjú szérummal, 50 μΜ 2-ME-vel és 30% kondicionált tápoldattal van kiegészítve, ahogy ezt fent leírtuk. A nem tapadó sejteket háromszor távolítjuk el az egyhetes inkubációs idő folyamán és friss táptalajra visszük őket. A sejteket egy hét múlva fejtjük le, foszfáttal pufferolt izotóniás'nátrium-klorid oldattal

HU 204088 Β kétszermossuk, majd az eredeti tápoldat mennyiségének megfelelően hígítjuk. Mindegyik halálos adaggal besugárzott (1.000 R) C57B1/6 recipienst 0,1 ml sejtszuszpenzióval oltunk i.v. Kilenc nap múlva a lépeket eltávolítjuk és a lép-nodulusokat telep-mikroszkóp alatt számoljuk.

Összefoglalva:

A COS-MCGF-nek a kezdetben meghatározott hízósejt növekedési faktor aktivitásán kívül eritroid progenitor stimuláló faktor aktivitása is van, és előse- 10 gíti azús sejteknek és a különböző sejtvonalakhoz tartozó korai elkötelezett progenitor sejteknek — beleértve a monocita/granulocita, eritroid és megakarióta sejteket—a terjedését. Ez az aktivitás tartomány azt jelzi, hogy a jelen találmány szerinti cDNS kiónok ál- 15 talmeghatározottproteineknekolyannővekedésifaktorokra utaló jellemzőik vannak, melyek szerint több sejt-vonalhoz tartozó hematopoetikus sejtekre hatnak.

Az előbbiek alapján tisztán látható, hogy a jelen ta- 20 lálmány szerinti cDNS Hónok az emlős multi-CSF és hízósejt növekedési faktorokról pontos és teljes szekvencia adatokkal szolgálnak. A találmány ezenHvül azoknak, akik e szakterületen jártasak, módot nyújt arra, hogy ezeket afaktorokat (más hematopoetikus 25 faktoroktól mentesen) jelentős mennyiségben előállíthassák, minthogy a találmány tökéletesítette a hízósejtek és más hematopoetikus sejtek in vitro fenntartását. Ezenkívül a cDNS Hónok révénkapott információ javítja az emlős szervezet immunválaszának meg- 30 értését, miáltal a gyógyászatban elérhető lehetőségek fokozódnak.

Claims (26)

1. SZABADALMIIGÉNYPONTOK _3g

   1. Eljárás egér tőbb-sejtvonalraható celluláris növekedésifaktor aktivitást és/vagy egér hízósejt növekedési faktor aktivitást kifejtő polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogymegfelelő promotert, replikációs origót, az előbbi polipeptideket kódoló nuHeotid 40 szekvenciát és késői poliadenilációs régiót tartalmazó vektort szerkesztünk, a vektorral , egy gazdasejtet transzformálunk, a vektort tartalmazó gazdasejtet megfelelő köriilményekközött tenyésztjük és akifejezett polipeptideket kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984. 03. 45

   19.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidetkódoló mRNS szekvenciából leszármaztatható cDNS szekvenciát tartalmazó vektortszerkesztünk. (Elsőbbsége: 1984.03.19.) 50
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozilezett polipeptidet állítunk elő. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort szerkesztünk, 55 amely promoter szekvenciaként egy SV40 vírus korai promoter régiót és poliadenilációs régióként egy SV40 vírus késői poliadenilációs régiót tartalmaz. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 50 azzal jellemezve, hogy a vektorral egy emlős sejtet transzformálunk (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy hematopoietikus sejtnövekedési faktor aktivitású polipeptidet kódoló nuHeotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
7. 7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogya

   Met-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-Thr-ThrSer-Be-His-Thr-Met-Leu-Leu-LeuLeu-Leu-Met-Leu-Phe-His-Leu-GIyLeu-Gln-AIa-Ser-Be-Ser-Gly-ArgAsp-Thr-His-Arg-Leu-lhr-Arg-ThrLeu-Asn-Cys-Ser-Ser-IIe-Val-LysGlu-Be-Be-Gly-Lys-Leu-Pro-GluPro-Glu-Leu-Lys-Thr-Asp-Asp-GIuPhe-Arg-Arg-Val-Asn-Leu-Ser-LysPhe-Val-Glu-Ser-Gln-Gly-Glu-ValAsp-Pro-Glu-Asp-Arg-Tyr-Val-BeLys-Ser-Asn-Leu-Gln-Lys-Leu-AsnCys-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Ala-AsnAsp-Ser-Ala-Leu-Pro-Gly-Val-PheBe-Arg-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-ArgLys-Lys-Leu-Arg-Phe-Tyr-Met-ValHis-Leu-Ans-Asp-Leu-Glu-Thr-ValLeu-Ala-Ser-Arg-Pro-Pro-Gln-ProAla-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Pro-AsnArg-Gly-Thr-Val-Glu-Cys szekvenciájúpolipeptidetkódolónuHeotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
8. 8. az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidet kódoló

   ATG-GTT-CTT-GCC-AGC-TCT-AGC-ACCAGC-ATC-CAC-ACC-ATG-CTG-CTC-CTGCTC-CTG-ATG-CTC-TTC-CAC-CTG-GGACTC-CAA-GCT-TCA-ATC-AGT-GGC-CGGGAT-ACC-CAC-CGT-TTA-AAC-AGA-ACGTTG-AAT-TGC-AGC-TCT-ATT-GTC-AAGGAG-ATT-ATA-GGG-AAG-CTC-CCA-GAACCT-GAA-CTC-AAA-ACT-GAT-GAT-GAAGGA-CCC-TCT-CTG-AGG-AAT-AAG-AGCTTT-CGG-AGA-GTA-AAC-CTG-TCC-AAATTC-GTG-GAA-AGC-CAA-GGA-GAA-GTGGAT-CCT-GAG-GAC-AGA-TAC-GTT-ATCAAG-TCC-AAT-CTT-CAG-AAA-CTT-AACTGT-TGC-CTG-CCT-ACA-TCT-GCG-AATGAC-TCT-GCG-CTG-CCA-GGG-GTC-TTCATT-CGA-GAT-CTG-GAT-GAC-TTT-CGGAAG-AAA-CTG-AGA-TTC-TAC-ATG-GTCCAC-CTT-AAC-GAT-CTG-GAG-ACA-GTGCTA-GCC-TCT-AGA-CCA-CCT-CAG-CCCGCA-TCT-GGC-TCC-GTC-TCT-CCT-AACCGT-GGA-ACC-TGT-GAA-TGT képlettel ábrázolható nuHeotid szekvenciát tartalmazó vektortszerkesztünk. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
9. 9. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidet kódoló, a

   HU 204 088 Β

   ATG-GTT-CTT-GCC-AGC-TCT-ACC-ACCAGC-ATC-CAC-ACC-ATG-CTG-CTC-CTGCTC-CTG-ATG-CTC-TTC-CAC-CTG-GGACTC-CAA-GCT-TCA-ATC-AGT-GGC-CGGGAT-ACC-CAC-CGT-TTA-AAC-AGA-ACGTTG-AAT-TGC-AGC-TCT-ATT-GTC-AAGGAG-ATT-ATA-GGG-AAG-CTC-CCA-GAACCT-GAA-CTC-AAA-ACT-GAT-GAT-GAAGGA-CCC-TCT-CTG-AGG-AAT-AAG-AGCTTT-CGG-AGA-GTA-AAC-CTG-TCC-AAATTC-GTG-GAA-AGC-CAA-GGA-GAA-GTGGAT-CCT-GAG-GAC-AGA-TAC-GTT-ATCAAG-TCC-AAT-CTT-CAG-AAA-CTT-AACTGT-TGC-CTG-CCT-ACA-TCT-GCG-AATGAC-TCT-GCG-CTG-CCA-GGG-GTC-TTCATT-CGA-GAT-CTG-GAT-GAC-TTT-CGGAAG-AAA-CTG-AGA-TTC-TAC-ATG-GTCCAC-CTT-AAC-GAT-CTG-GAG-ACA-GTGCTA-GCC-TCT-AGA-CCA-CCT-CAG-CCCGCA-TCT-GGC-TCC-GTC-TCT-CCT-AACCGT-GGA-ACC-TGT-GAA-TGT képlettel ábrázolható nuldeotid szekvenciától eltérő, de azzal legalább 70%-ban hibridizálni képes nuldeotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a

    Met-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-Ihr-ThrSer-He-His-Thr-Met-Leu-Leu-LeuLeu-Leu-Met-Leu-Pbe-His-Leu-GlyLeu-Gln-Ala-Ser-Ile-Ser-Gly-Arg képlettel ábrázolható szekvencia jú polipeptid vezérszekvenciának (leader sequence) legalább egy részét és az 1. ábra 33—167-ig terjedő aminosavszekvenciáját kódoló nuldeotid szekvencia részletet tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
11. 11. az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogya

    Met-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-Thr-IbrSer-Ee-His-Thr-Met-Leu-Leu-LeuLeu-Leu-Met-Leu-Phe-His-Leu-GlyLeu-Gln-Ala-Ser-He-Ser-Gly-ArgAsp-Thr-His-Arg-Leu-Thr-Arg-ThrLeu-Asn-Cys-Ser-Ser-He-Val-LysGlu-Be-He-Gly-Lys-Leu-Pro-GluPro-Glu-Leu-Lys-Thr-Asp-Asp-GluPhe-Arg-Arg-Val-Asn-Leu-Ser-LysPbe-Val-Glu-Ser-Gln-Gly-Glu-ValAsp-Pro-Glu-Asp-Arg-Tyr-Val-HeLys-Ser-Asn-Leu-Gln-Lys-Leu-AsnCys-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Ala-AsnAsp-Ser-Ala-Leu-Pro-Gly-Val-PbeHe-Arg-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-ArgLys-Lys-Leu-Arg-Pbe-Tyr-Met-ValHis-Leu-Ans-Asp-Leu-Glu-Thr-ValLeu-Ala-Ser-Arg-Pro-Pro-Gln-ProAla-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Pro-AsnArg-Gly-Thr-Val-Glu-Cys képlettel ábrázolható polipeptid még aktívrészét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektorral transzformáit prokarióta mikroorganizmust vagy eukarióta sej tét vizes táptalajban tenyésztünk, és a polipeptidet ki nyerjük. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
12. 12. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogya

    ATG-GTT-CTT-GCC-AGC-TCT-ACC-ACCAGC-ATC-CAC-ACC-ATG-CTG-CTC-CTGCTC-CTG-ATG-CTC-TTC-CAC-CTG-GGACTC-CAA-GCT-TCA-ATC-AGT-GGC-CGGGAT-ACC-CAC-CGT-TTA-AAC-AGA-ACGTTG-AAT-TGC-AGC-TCT-ATT-GTC-AAGGAG-ATT-ATA-GGG-AAG-CTC-CGA-GAACCT-GAA-CTC-AAA-ACT-GAT-GAT-GAAGGA-CCC-TCT-CTG-AGG-AAT-AAG-AGCTTT-CGG-AGA-GTA-AAC-CTG-TCC-AAATTC-GTG-GAA-AGC-CAA-GGA-GAA-GTGGAT-CCT-GAG-GAC-AGA-TAC-GTT-ATCAAG-TCC-AAT-CTT-CAG-AAA-CTT-AACTGT-TGC-CTG-CCT-ACA-TCT-GCG-AATGAC-TCT-GCG-CTG-CCA-GGG-GTC-TTCATT-CGA-GAT-CTG-GAT-GAC-TTT-CGGAAG-AAA-CTG-AGA-TTC-TAC-ATG-GTCCAC-CTT-AAC-GAT-CTG-GAG-ACA-GTGCTA-GCC-TCT-AGA-CCA-CCT-CAG-CCCGCA-TCT-GGC-TCC-GTC-TCT-CCT-AACCGT-GGA-ACC-TGT-GAA-TGT képlettel ábrázolható DNS szekvencia még aktív polipeptidet kódoló részét tartalmazó vektorral transzformált prokarióta mikroorganizmust vagy eukarióta sejtet vizes táptalajban tenyésztünk, és a polipeptidet kinyerjük. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egér IL-3 polipeptidet kódoló nuldeotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1984.03.19.)
14. 14. Eljárás egér hízósej t növekedési faktor aktivitást kifejtő polipeptidek előállítására, azzal jellemezve, hogymegfelelő promotert, replikációs origót, az előbbi polipeptideket kódoló nukleotid szekvenciát és késői poliadenilációs régiót tartalmazó vektort szerkesztünk, a vektorral egy gazdasejtet transzformálunk, a vektort tartalmazó gazdasejtet megfelelő körülmények között tenyésztjük és a kifejezett polipeptideket kinyerjük. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
15. 15. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidet kódoló mRNS szekvenciából leszármaztatható eDNS szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
16. 16. A14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozilezett polipeptidet állítunk elő. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
17. 17. A 14-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektort szerkesztünk, amely promoter szekvenciaként egy SV40 vírus korai promoter régiót és poliadenilációs régióként egy SV40 vírus késői poliadenilációs régiót tartalmaz. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
18. 18. A14-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, begy a vektorral egy emlős sejtet transzformálunk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)

    HU 204088 Β
19. 19. A14-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy hematopoietikus sejt növekedési faktor aktivitású polipeptidet kódoló nukIeotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
20. 20. A14-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a

    Met-Val-Leu-AIa-Ser-Ser-Thr-IhrSer-He-His-Thr-Met-Leu-Leu-LeuLeu-Leu-Met-Leu-Phe-His-Leu-GlyLeu-Gln-Ala-Ser-He-Ser-GIy-ArgAsp-Thr-His-Arg-Leu-Ihr-Arg-ThrLeu-Asn-Cys-Ser-Ser-IIe-Val-LysGln-He-De-Gly-Lys-Leu-Pro-GluPro-Glu-Len-Lys-Thr-Asp-Asp-GIuPhe-Arg-Arg-Val-Asn-Len-Ser-LysPhe-Val-Glu-Ser-Gln-Gly-Glu-ValAsp-Pro-Glu-Asp-Arg-Tyr-Val-HeLys-Ser-Asn-Leu-Gln-Lys-Leu-AsnCys-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Ala-AsnAsp-Ser-Ala-Leu-Pro-Gly-Val-PheDe-Arg-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-ArgLys-Lys-Leu-Arg-Phe-Tyr-Met-Valffis-Leu-Ans-Asp-Leu-GIn-Thr-ValLeu-Ala-Ser-Arg-Pro-Pro-GIn-ProAla-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Pro-AsnArg-Gly-Thr-Val-Glu-Cys szekvenciájúpolipeptidetkódolónukleotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.) 30
21. 21. A14-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidet kódoló

    ATG-GTT-CTT-GCC-AGC-TCT-ACC-ACCAGC-ATC-CAC-ACC-ATG-CTG-CTC-CTG- 35

    CTC-CTG-ATG-CTC-TTC-CAC-CTG-GGACTC-CAA-GCT-TCA-ATC-AGT-GGC-CGGGAT-ACC-CAC-CGT-rCA-AAC-AGA-ACGTTG-AAT-TGC-AGC-TCT-AIT-GTC-AAGGAG-ATT-ATA-GGG-AAG-CTC-CCA-GAA- 40

    CCT-GAA-CrC-AAA-ACT-GAT-GAT-GAAGGA-CCC-TCT-CTG-AGG-AAT-AAG-AGCTTT-CGG-AGA-GTA-AAC-CTG-TCC-AAATTC-GTG-GAA-AGC-CAA-GGA-GAA-GTGGAT-CCT-GAG-GAC-AGA-TAC-GTT-ATC- 45

    AAG-TCC-AAT-CTT-CAG-AAA-CIT-AACTGT-TGC-CTG-CCT-ACA-TCT-GCG-AATGAC-TCT-GCG-CTG-CCA-GGG-GTC-TTCATT-CGA-GAT-CTG-GAT-GAC-TTr-CGGAAG-AAA-CTG-AGA-TTC-TAC-ATG-GTC- 50

    CAC-CIT-AAC-GAT-CTG-GAG-ACA-GTGCTA-GCC-TCT-AGA-CCA-CCT-CAG-CCCGCA-TCT-GGC-TCC-GTC-TCT-CCT-AACCGT-GGA-ACC-TGT-GAA-TGT képlettel ábrázolható nuldeotid szekvenciát tártál- 55 mazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
22. 22. A14-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett polipeptidetkódoló.a

    ATG-GTT-CIT-GCC-AGC-TCT-ACC-ACC- 60

    AGC-ATC-CAC-ACC-ATG-CTG-CTC-CTGCTC-CTG-ATG-CTC-TTC-CAC-CTG-GGACTC-CAA-GCT-TCA-ATC-AGT-GGC-CGGGAT-ACC-CAC-CGT-TTA-AAC-AGA-ACGTIG-AAT-TGC-AGC-TCT-ATT-GTC-AAGGAG-ATT-ATA-GGG-AAG-CTC-CCA-GAACCT-GAA-CTC-AAA-ACT-GAT-GAT-GAAGGA-CCC-TCT-CTG-AGG-AAT-AAG-AGCHT-CGG-AGA-GTA-AAC-CTG-TCC-AAATTC-GTG-GAA-AGC-CAA-GGA-GAA-GTGGAT-CCr-GAG-GAC-AGA-TAC-GTT-ATCAAG-TCC-AAT-CTT-CAG-AAA-CTT-AACTGT-TGC-CTG-CCT-ACA-TCT-GCG-AATGAC-TCT-GCG-CTG-CCA-GGG-GTC-TTCATT-CGA-GAT-CTG-GAT-GAC-TTT-CGGAAG-AAA-CTG-AGA-TTC-TAC-ATG-GTCCAC-CTT-AAC-GAT-CTG-GAG-ACA-GTGCTA-GCC-TCT-AGA-CCA-CCT-CAG-CCCGCA-TCT-GGC-TCC-GTC-TCT-CCT-AACCGT-GGA-ACC-TGT-GAA-TGT képlettel ábrázolható nuldeotid szekvenciától eltérő, de azzal legalább 70%-ban hibridizálni képes nuldeotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
23. 23. A14-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve,, hogy a

    Met-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-lhr-IhrSer-He-His-Thr-Met-Leu-Leu-LeuLeu-Leu-Met-Leu-Phe-His-Leu-GlyLeu-Gln-Ala-Ser-He-Ser-Gly-Arg képlettel ábrázolható szekvenciájú polipeptid vezérszekvenciának (leadersequence) legalább egy részét és az 1. ábra 33-167-ig terjedő aminosavszekvenciáját kódoló nuldeotid szekvencia részletet tartalmazó vektortszerkesztünk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
24. 24. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a

    Met-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-Thr-ThrSer-He-His-Thr-Met-Leu-Leu-LeuLeu-Leu-Met-Leu-Phe-His-Leu-GlyLeu-Gln-Ala-Ser-He-Ser-Gly-ArgAsp-Thr-His-Arg-Leu-Thr-Arg-ThrLeu-Asn-Cys-Ser-Ser-He-Val-LysGlu-Be-He-Gly-Lys-Leu-Pro-GIuPro-Glu-Leu-Lys-lhr-Asp-Asp-GluPhe-Arg-Arg-Val-Asn-Leu-Ser-Lys- i

    Phe-Val-Glu-Ser-Gln-Gly-GIu-ValAsp-Pro-Glu-Asp-Arg-Tyr-Val-BeLys-Ser-Asn-Leu-GIn-Lys-Leu-Asn- ·

    Cys-Cys-Leu-Pro-Thr-Ser-Ala-AsnAsp-Ser-Ala-Leu-Pro-Gly-Val-PheBe-Arg-Asp-Leu-Asp-Asp-Phe-ArgLys-Lys-Leu-Arg-Phe-Tyr-Met-ValHis-Leu-Ans-Asp-Leu-Glu-Thr-ValLeu-Ala-Ser-Arg-Pro-Pro-Gln-ProAla-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Pro-AsnArg-Gly-Thr-Val-Glu-Cys képletté! ábrázolható polipeptidmég aktívrészét kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektorral transzformáit prokarióta mikroorganizmust vagy eukariota sej20

    HU 204088 Β tét vizes táptalajban tenyésztünk, és a polipeptidet kinyerjük. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
25. 25. A14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogya

    ATG-GTT-CTT-GCC-AGC-TCT-ACC-ACCAGC-ATC-CAC-ACC-ATG-CTG-CTC-CTGCTC-CTG-ATG-CTC-TTC-CAC-CTG-GGACTC-CAA-GCT-TCA-ATC-AGT-GGC-CGGGAT-ACC-CAC-CGT-TTA-AAC-AGA-ACGTTG-AAT-TGC-AGC-TCT-ATT-GTC-AAGGAG-ATT-ATA-GGG-AAG-CTC-CCA-GAACCT-GAA-CTC-AAA-ACT-GAT-GAT-GAAGGA-CCC-TCT-CTG-AGG-AAT-AAG-AGCTTT-CGG-AGA-GTA-AAC-CTG-TCC-AAATTC-GTG-GAA-AGC-CAA-GGA-GAA-GTGGAT-CCT-GAG-GAC-AGA-TAC-GTT-ATCAAG-TCC-AAT-CTT-CAG-AAA-CTT-AACTGT-TGC-CTG-CCT-ACA-TCT-GCG-AATGAC-TCT-GCG-CTG-CCA-GGG-GTC-TTCATT-CGA-GAT-CTG-GAT-GAC-TTT-CGGAAG-AAA-CTG-AGA-TTC-TAC-ATG-GTC5 CAC-CTT-AAC-GAT-CTG-GAG-ACA-GTGCTA-GCC-TCT-AGA-CCA-CCT-CAG-CCCGCA-TCT-GGC-TCC-GTC-TCT-CCT-AACCGT-GGA-ACC-TGT-GAA-TGT képlettel ábrázolható DNS szekvencia még aktívpo10 lipeptidet kódoló részét tartalmazó vektorral transzformált prokarióta mikroorganizmust vagy eukarióta sejtet vizes táptalajban tenyésztünk, és a polipeptidet kinyerjük. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)
26. 26. A14-25. igénypontok bármelyike szerinti eljá15 rás, azzal jellemezve, hogy egér IL-3 polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó vektort szerkesztünk. (Elsőbbsége: 1983.10.04.)