CN106103698B - 化学成分确定的细胞培养基的添加剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于培养四氢叶酸(THF)营养缺陷型细胞系以及在细胞中高效地制备期望物质的最适培养基。具体地，本发明提供通过向化学组成细胞培养基中添加四氢叶酸(THF)、或其前体或衍生物而促进细胞生长的方法。

Description

化学成分确定的细胞培养基的添加剂
技术领域
本发明涉及用于四氢叶酸营养缺陷型细胞系生长以及在细胞中高效地制备期望产物的最适培养基。更具体地，本发明提出通过向化学成分确定的培养基添加四氢叶酸(THF)或其前体或衍生物而促进细胞生长的方法。
背景技术
自从Harrison在1907年第一次成功进行动物细胞培养，通过不断研究已开发具有特定功能的细胞系和无血清培养基，并且其已广泛用于细胞培养。动物细胞分为悬浮细胞和贴壁细胞。多数细胞属于贴壁细胞。可商购的基于基础Eagle(BME)培养基的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和最低必需培养基(MEM)是最广泛使用的类型。
由于化学成分确定的培养基(CDM)在细胞的大量生产过程中表现出改善的性能，同时保持性能的一致性，并且它们改善原料的可追溯性和批次间一致性，所以化学成分确定的培养基(CDM)主要用于哺乳动物细胞培养。另一方面，不确定的复合培养基成分(例如，酵母和大豆蛋白水解产物)的使用引起过程性能的变化性，包括在细胞生长、产物效价和产物质量属性方面的差异。因此，认为化学成分确定的培养基(CDM)的开发和改进对于哺乳动物细胞培养是尤其重要的。化学成分确定的培养基可包括这样一些化学物质，即使它们的成分是完全确定的，其对细胞生长的影响也并不完全清楚。因此，对于添加物的任意给定添加或去除会观察到何种效果是难以预测的。另外，在多数可商购的化学成分确定的培养基中，哺乳动物宿主细胞例如 CHO DG44细胞的悬浮培养需要经过长期传代培养的适应。即使是经适应的细胞也具有细胞生长慢的问题。
发明详述
发明要解决的问题
因此，本发明旨在提供用于改善化学成分确定的培养基的性能以实现改善的细胞生长的培养基添加物，所述改善的细胞生长例如在培养基中增加的最大细胞密度和降低的倍增时间、缩短悬浮适应周期或避免对悬浮适应的需求。
本发明还旨在提供使用培养基添加物通过细胞培养基制备重组蛋白质的方法。
解决问题的手段
本发明简单地通过添加四氢叶酸(THF)或其前体或衍生物提供对传统化学成分确定的培养基的问题的解决方案。
本发明的一个方面提供包含化学成分确定的培养基和四氢叶酸(THF) 或其前体或衍生物的细胞培养基。
细胞为四氢叶酸营养缺陷型的。
四氢叶酸营养缺陷型细胞具有功能性缺失的或受损的DHFR基因。
四氢叶酸营养缺陷型细胞可选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。
哺乳动物细胞为CHO细胞。
CHO细胞系可衍生自K1或PRO-3。
K1衍生的CHO细胞系可选自UKB25、DUK22、DUK51、DUK-D1、 DUK-S1、DUK51-R1、DUK51-R2、DUK22-R1、DUK22-R2、DXBA、DXE11、 DXC11、DXB11、和DUKX。
PRO-3衍生的CHO细胞系可选自UA2、UA4、UA21、UA41、DU5、 DU11、DG21、DG22、DG23、DG24、DG41、DG42、DG43、DG44、DG45、和DG46。
DHFR基因缺陷的CHO细胞系可衍生自K1或PRO-3。
K1衍生的CHO细胞系可选自UKB25、DUK22、DUK51、DUK-D1、 DUK-S1、DUK51-R1、DUK51-R2、DUK22-R1、DUK22-R2、DXBA、DXE11、 DXC11、DXB11、和DUKX。
PRO-3衍生的CHO细胞系可选自UA2、UA4、UA21、UA41、DU5、 DU11、DG21、DG22、DG23、DG24、DG41、DG42、DG43、DG44、DG45、和DG46。
THF前体为可以衍生自叶酸且之后在细胞中可以转化为四氢叶酸的物质，其可选自二氢叶酸，具有一价阳离子或二价阳离子的二氢叶酸盐如二氢叶酸二钠、二氢叶酸二锂、二氢叶酸二钾、二氢叶酸钙和二氢叶酸镁，和二氢叶酸衍生物。
THF衍生物可选自5-甲酰基-THF、5-甲基-THF、10-甲酰基-THF、5,10- 亚甲基-THF、5,10-次甲基-THF、5-亚胺甲基-THF、THF-L-谷氨酸、THF-聚谷氨酸、4-氨基-4-脱氧-THF、10-甲酰基四氢叶酸-4a-甲醇胺、10-甲基-5,6,7,8- 四氢蝶酰谷氨酸、二氢叶酸、及它们的盐。
THF可以0.1至160mg/L的浓度存在。
本发明的另一方面提供用于在细胞中制备期望产物的方法，其包括(a) 向化学成分确定的培养基添加四氢叶酸(THF)或其前体或衍生物，(b)在培养基中培养用基因重组载体转染的细胞，(c)使细胞表达期望产物，和(d) 从细胞分离期望产物。
细胞为四氢叶酸营养缺陷型的。
四氢叶酸营养缺陷型细胞具有功能性缺失的或受损的DHFR基因。
四氢叶酸营养缺陷型细胞可选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。
哺乳动物细胞为CHO细胞。
CHO细胞系可衍生自K1或PRO-3。
K1衍生的CHO细胞系可选自UKB25、DUK22、DUK51、DUK-D1、 DUK-S1、DUK51-R1、DUK51-R2、DUK22-R1、DUK22-R2、DXBA、DXE11、DXC11、DXB11、和DUKX。
PRO-3衍生的CHO细胞系可选自UA2、UA4、UA21、UA41、DU5、DU11、DG21、DG22、DG23、DG24、DG41、DG42、DG43、DG44、DG45、和DG46。
THF前体为可衍生自叶酸且之后在细胞中可以转化为四氢叶酸的物质，其可选自二氢叶酸，具有一价阳离子或二价阳离子的二氢叶酸盐如二氢叶酸二钠、二氢叶酸二锂、二氢叶酸二钾、二氢叶酸钙和二氢叶酸镁，和二氢叶酸衍生物。
THF衍生物可选自5-甲酰基-THF、5-甲基-THF、10-甲酰基-THF、5,10- 亚甲基-THF、5,10-次甲基-THF、5-亚胺甲基-THF、THF-L-谷氨酸、THF-聚谷氨酸、4-氨基-4-脱氧-THF、10-甲酰基四氢叶酸-4a-甲醇胺、10-甲基-5,6,7,8- 四氢蝶酰谷氨酸、二氢叶酸、及它们的盐。
THF可以0.1至160mg/L的浓度添加。
发明效果
根据本发明，向化学成分确定的培养基添加THF导致最大细胞密度的增加和倍增时间的减少，缩短悬浮适应周期或避免对悬浮适应的需求。另外，具有改善性能的细胞培养基可以应用于通过细胞培养制备期望产物，例如，期望的蛋白质、细胞、病毒或基因组。
附图说明
图1示出在包含THF作为培养基添加物的化学成分确定的培养基中，在悬浮培养期间CHO DG44细胞的生长。
图2示出随着传代培养数的增加，在补充有THF的HY-CDM培养基中细胞生长特征的变化：(a)细胞密度的变化，(b)倍增时间。
图3示出在含THF和不含THF的可商购的化学成分确定的培养基中，细胞生长特征的变化：(a)细胞密度的变化，(b)倍增时间。
图4示出在补充有DHF的HY-CDM培养基中细胞的生长。
本发明的最佳实施方式
本文中使用的术语定义如下。
术语“培养基”是指协助供养、繁殖和/或分化细胞的营养成分。本文使用的术语“化学成分确定的培养基”是指其中所有成分都可以用其化学式表示并且以已知浓度存在的培养基。本文使用的术语“化学成分确定的培养基”是指还没有使用本发明的方法进行开发的预选CDM。本发明中使用的化学成分确定的培养基可以还包含少量的生长因子或脂质混合物。
术语“细胞”是指细胞群体。细胞可为野生型或重组型。术语“细胞培养”或“细胞培养技术”是指适合细胞存活和/或生长和/或分化的方法和条件。
术语“期望产物”是指可对研究、诊断或治疗目的有用的任意重组蛋白质、细胞、病毒或基因组。期望蛋白质可包括哺乳动物蛋白质或非哺乳动物蛋白质，可任选地包括受体或配体。示例性的期望蛋白质包括，但不限于：分子，例如肾素；生长激素，包括人类生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素 A链：胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；胰高血糖素；凝血因子，例如VIIIC因子、IX因子、组织因子和血管性血友病因子；抗凝血因子，例如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；TNF和TNF受体(TNFR)家族的成员，例如肿瘤坏死因子 -α和肿瘤坏死因子-β；CD40配体、APO-2配体/TRAIL、DR4、DR5、DcR1、 DcR2、DcR3、OPG和Fas配体；脑啡肽酶；RANTES(受活化调节的、通常T细胞表达和分泌的)；人类巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；缪勒氏管抑制物；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原(prorelaxin)；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如 CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素受体或生长因子受体；蛋白A或蛋白D；类风湿因子；神经营养因子，例如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5或神经营养因子-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和 TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-P3、TGF-P4或TGF-P5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑 IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白质，如CD3、CD4、CD8、 CD19和CD20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态生成蛋白 (BMP)；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；血小板生成素(TPO)；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，如AIDS包膜的部分和gp120；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、 VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如HER2受体、HER3受体或HER4受体；任何以上列出多肽的变体和/或片段；针对各种蛋白质抗原如CD蛋白例如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34的抗体；ErbB受体家族的成员，例如EGF受体、HER2受体、HER3受体或HER4受体；细胞黏附分子，例如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和包括其α亚单元或β亚单元的α元AM-整合素(例如，抗CD11a抗体、抗CD18抗体或抗CD11b 抗体)；生长因子，例如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB) 受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C；Apo-2L受体，例如Apo-2(DR5)、DR4、 DcR1、DcR2和DcR3；和上述抗体的变体和/或片段。
术语“前体”意思是在反应中特定产物的在先步骤中产生的物质，所述反应例如新陈代谢或化学反应。特定产物也许未必是反应的终产物，而是指在任意步骤中可获得的物质。
术语“衍生物”意思是通过化学改变化合物的部分而获得的类似化合物。通常，衍生物是指其中化合物的一个或更多个氢原子或特定原子基团被其他原子或原子基团取代的化合物。
应理解的是，在本说明书和权利要求中使用的术语和词语不应解释为具有通常含义和字典含义，而是根据本发明人能够合适地定义术语和词语的概念来以最好的方法描述他/她的发明的原则将其理解为具有与本发明技术精神相对应的含义和概念。因此，说明书中描述的实施方式和附图中所示的结构仅以说明性目的提供，而并不旨在代表本发明的所有技术精神。因此，应理解的是，在提交本申请时可对这些实施方案和结构进行各种等同替换和修改。
现在会详细地描述本发明。
在本发明中，向细胞培养基以适当浓度简单地添加在细胞培养领域中未被报道为添加物的四氢叶酸(THF)。THF的添加在改善细胞生长和缩短悬浮适应周期方面是有效的。多数传统可商购化学成分确定的培养基对于CHO DG44宿主细胞悬浮培养需要通过长期传代培养的适应，并且即使在适应之后也表现出低的细胞生长性能，而本发明提供对多数传统可商购化学成分确定的培养基的问题的解决方案。
在一个方面，本发明提供包含化学成分确定的培养基和四氢叶酸(THF) 或其前体或衍生物的细胞培养基。
细胞
在本发明培养基中培养的细胞可为四氢叶酸营养缺陷型的。
四氢叶酸营养缺陷型细胞意思是缺少四氢叶酸生物合成基因且必须从外源性来源获得四氢叶酸的细胞，所述外源性来源通常为细胞培养基。也就是说，四氢叶酸营养缺陷型细胞在关于叶酸向THF转化的酶的活性方面是有缺陷的。
酶优选为DHFR。DHFR活性缺陷意思是细胞与其中DHFR基因被从染色体去除或内源性表达的DHFR酶相比对叶酸具有较低敏感性。该特点可以通过在DHFR酶的氨基酸序列方面的一个或更多个氨基酸更换(例如，缺失、替换或增加)而表现出来。
四氢叶酸营养缺陷型细胞与野生型细胞相比具有较低的叶酸摄取。该细胞可通过叶酸转运体系即介导叶酸摄取的叶酸受体(FR)、质子偶联叶酸转运体(PCFT)和还原叶酸载体(RFC)的功能丧失/突变/或基因缺失来获得。
细胞优选选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。
真菌细胞和植物细胞是四氢叶酸原养型的。也就是说，这种细胞可以自主合成其细胞生存力即细胞生长和增值所必需的叶酸。本发明特别地包括是四氢叶酸营养缺陷型或可变为四氢叶酸营养缺陷型的这种真菌细胞和植物细胞。这可以例如归因于基因操纵，即细胞当前不能合成其细胞生存力所必需的足量四氢叶酸。例如，可以通过例如合适的目标基因的基因破坏或基因沉默、或者关键酶的抑制等来使这种真菌细胞或植物细胞例如经由合适的代谢途径来内源性生物合成四氢叶酸的能力失去活性。优选地，宿主细胞为哺乳动物细胞。
哺乳细胞可选自啮齿动物细胞、人类细胞和猴细胞。特别优选啮齿动物细胞，其优选选自CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、小鼠3T3成纤维细胞和 SP2/0细胞。最优选的啮齿动物细胞为CHO细胞。还优选人类细胞，其优选选自细胞毒性T淋巴细胞、软骨细胞、纤维细胞、造血干细胞、HEK293细胞、 MCF-7细胞、PerC6细胞和HeLa细胞。还优选猴细胞，其优选是COS-1细胞、 COS-7细胞和Vero细胞。
哺乳动物细胞可包括MDCK细胞，其可主要用于病毒制备。
哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括与DHFR选择性标志使用的dhfr-CHO DG44细胞。
CHO细胞通常用于生物学和医学研究，并在商业上用于治疗性蛋白质的生产。它们是在1960年代被引进并最初生长成培养的单层。如今，CHO细胞是重组蛋白质治疗剂的工业生产中最常用的哺乳动物宿主。其在悬浮培养中生长良好。
本发明使用的DHFR基因缺陷型CHO细胞系是甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷营养缺陷型。多数基因重组蛋白质通常在哺乳动物细胞、大多在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中制备。期望的蛋白质目前在细菌宿主中制备。在原核细胞中制备的多数蛋白经历翻译后修饰例如糖基化。细菌中该修饰功能的缺失使得难以实际制备功能性蛋白。这是在基因重组蛋白质制备中使用CHO细胞的原因。
使用含动物血清的DMEM培养基进行了关于CHO细胞的许多研究。含动物血清的培养基主要用于研究目的而不用于在实际生产线中的商业目的。
DHFR用作CHO细胞中的选择性标志。DHFR为二氢叶酸还原酶，其用 NADPH作为电子供体将叶酸还原为四氢叶酸(THF)。叶酸是种常用于培养基中的一种维生素。叶酸用于生物合成嘌呤、嘧啶和甘氨酸并提供甲基。由于在DHFR基因缺陷型细胞系中不能产生THF，所以THF在培养基中是必需的。多数化学成分确定的培养基不含THF且不含动物血清、血清组分、组织提取水解物和蛋白胨，在生产期间THF以高概率存在于其中。
本发明使用的DHFR基因缺陷型CHO细胞系可衍生自K1或PRO-3。K1衍生的CHO细胞系可选自UKB25、DUK22、DUK51、DUK-D1、DUK-S1、 DUK51-R1、DUK51-R2、DUK22-R1、DUK22-R2、DXBA、DXE11、DXC11、 DXB11和DUKX。PRO-3衍生的CHO细胞系可选自UA2、UA4、UA21、UA41、DU5、DU11、DG21、DG22、DG23、DG24、DG41、DG42、DG43、DG44、 DG45和DG46。
培养基
优化培养基成分对于通过细胞培养制备期望产物是非常重要的。培养基中过多或过浓的成分的存在对于高密度的细胞生长不是优选的。更确切地说，较大量或较高浓度的培养基成分的存在导致培养基渗透压的增加，这对细胞可能是有毒的。一般培养基含有动物血清富含的蛋白质和激素，但当细胞中产生的物质(例如蛋白质)用于实际临床应用时，培养基中动物性蛋白质的存在可能会引发问题。因此，理想培养基应是无血清的并含有能够足以替代血清的所有成分。也就是说，细胞生长所必需的成分，例如碳水化合物、氨基酸、离子和维生素，应当在培养基中以最适浓度存在。
本发明的细胞培养基是基于化学成分确定的培养基的。
化学成分确定的培养基不含蛋白水解物，含有次黄嘌呤、胸苷和选自氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、有机酸、微量元素、生长因子和激素中的一种或更多种成分。化学成分确定的培养基还可以包含脂质混合物。脂质混合物可以是合成制备的或来源于动物。例如，脂质混合物可为鱼肝油。
本发明的细胞培养基包含由各种成分例如氨基酸、维生素、碳水化合物、缓冲液和微量元素组成的化学成分确定的培养基和THF。添加至化学成分的 THF作为杂质诱导细胞生长。THF浓度低于影响改善细胞生长的浓度范围且不高于0.1mg/L。
化学成分确定的培养基旨在包括市场上可商购的培养基，例如PowerCHO-2CD培养基、HyCell CHO培养基、CDM4CHO培养基、CD OptiCHO培养基、EX-CELL CD CHO培养基和ProCHO5培养基。化学成分确定的培养基可任选地包含至少一种动物源性成分和血清。
添加物
本发明的改良的培养基可以通过向化学成分确定的培养基添加四氢叶酸 (THF)来高效地制备。在本发明的培养基中，哺乳动物细胞可以在短期内适应悬浮。THF可以0.1至160mg/L的浓度来添加。
在细胞中、在NADPH存在下，通过二氢叶酸还原酶的作用由叶酸制备四氢叶酸。四氢叶酸衍生物例如5-甲酰基-THF、5-甲基-THF、10-甲酰基-THF、 5,10-亚甲基-THF和5,10-次甲基-THF存在于细胞中。它们是在交换甲酰基、羟甲基、甲基等的时候通过转移反应或还原反应相互转化的中间体，并在各种酶促反应中起到辅酶的作用。具体地，它们涉及嘌呤、嘧啶和甘氨酸的生物合成以供给甲基。
根据本发明，添加物可为四氢叶酸(THF)前体或衍生物。
THF前体是可以衍生自叶酸并且之后可以在细胞中转化为四氢叶酸的物质。这种THF前体的实例包括二氢叶酸，具有一价阳离子或二价阳离子的二氢叶酸盐例如二氢叶酸二钠、二氢叶酸二锂、二氢叶酸二钾、二氢叶酸钙和二氢叶酸镁，和二氢叶酸衍生物。
THF衍生物可选自5-甲酰基-THF、5-甲基-THF、10-甲酰基-THF、5,10- 亚甲基-THF、5,10-次甲基-THF、5-亚胺甲基-THF、具有一价阳离子或二价阳离子的四氢叶酸盐例如5-甲基-四氢叶酸二钠和5-甲酰基-四氢叶酸钙、和四氢叶酸的功能性替代物，其可以转化成四氢叶酸并在细胞中发挥生理功能。
制备期望产物的方法
在另一方面，本发明提供用于在细胞中制备期望产物的方法。
具体地，方法包括(a)向化学成分确定的培养基添加四氢叶酸(THF) 或其前体或衍生物，(b)在培养基中培养用基因重组载体转染的细胞，(c) 使细胞表达期望产物，和(d)从细胞分离期望产物。
期望产物可为蛋白质、细胞、病毒或基因组。
在步骤(b)中，使用电穿孔和脂质体转染剂(lipofectamine)来进行利用基因重组载体的转染。细胞膜在转染期间容易损坏。因此，用于细胞恢复的过程是必要的。该过程通常通过在含血清培养基中的黏附培养来进行。在一些情况下，该过程也可以在化学成分确定的培养基中进行。然而，需要具有高细胞生长性能的培养基来确保稳定的细胞生长。根据本发明，添加THF 作为添加物有助于各种化学成分确定的培养基的细胞培养性能的改善，这解释了在步骤(b)中化学成分确定的培养基的用途。
使用CHO细胞制备期望蛋白质的方法包括以下步骤：1)重组细胞系构建：用重组基因转染宿主细胞，筛选具有高生产率的细胞系；2)建立适合于所筛选的细胞系的培养方法→选择适合于所筛选的重组细胞系的培养基，和建立培养条件：培养温度、浓缩添加物组成、添加时间和添加量的确定；和3) 从细胞分离并纯化重组蛋白质。在步骤2)中，每单位培养基高生产率的培养条件是优选的，并通常使用补料分批培养方法。该方法中使用的细胞系应具有以稳定生产率制备重组蛋白质的能力以确保高的细胞密度和短的细胞培养周期。为此，细胞培养基和浓缩添加物的选择是最重要的因素。每单位培养基的高生产率可以通过向培养基添加非必需氨基酸和DNA前体(核苷酸和核苷)作为浓缩添加物来实现，所述非必需氨基酸和DNA前体可以通过细胞代谢自然产生和使用。还可添加复杂物质例如蛋白质和酵母水解物。因此，在使用化学成分确定的培养基和浓缩培养物的补料分批过程中，很有可能还需要THF的功能。
DHFR缺陷型CHO细胞仅在含甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷的培养基中可以生长。当使含目的基因和DHFR基因的CHO细胞在不含甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长时，只有含DHFR基因的细胞选择性地生长。只有其中 DHFR基因被扩增的细胞可以通过逐步增加作为DHFR抑制剂的甲氨蝶呤浓度来筛选。所筛选的细胞系具有高效制备期望蛋白质的能力。
DHFR基因缺陷型CHO细胞系广泛用于工业应用中以制备期望蛋白质。例如，可以将期望蛋白质的基因克隆到含DHFR的载体(+)中，转染到DHFR 缺陷型CHO细胞，并使用MTX扩增以获得期望蛋白质。
在本发明的方法中，补充有THF的化学成分确定的培养基作为细胞培养基的使用使得能够在DHFR缺陷型CHO细胞中高效地制备期望蛋白质。也就是说，在转染到宿主细胞中后，筛选了具有高生长性能和生产率的细胞系。由于在不含次黄嘌呤和胸苷的培养基中筛选重组细胞系，所以DHFR的活性对细胞生长是必要的。对于重组基因扩增和重组细胞系筛选，MTX用作DHFR 酶的抑制剂。在通过MTX筛选和基因扩增期间，预期THF向培养基的添加降低MTX的作用。重组细胞系筛选涉及主要在血清培养基中的黏附培养之后的菌落筛选。由于血清作为复杂物质被认为潜在地包含THF，可以预期在重组细胞系筛选期间引入的化学成分确定的培养基解决由于不含血清而造成的低生长性能的问题。这在克服与MTX作用降低有关的问题上是有效的。因此，补充有THF的培养基的使用允许具有高生产率的细胞系的筛选，这使得能够在DHFR缺陷型CHO细胞中高效地制备期望蛋白质。
将参考以下实施例更详细地阐述本发明。然而，对本领域技术人员明显的是这些实施例仅出于说明目的而提供，而不应理解为限定本发明的范围。
细胞系和实验步骤
1.细胞系和培养基：使用CHO DG44细胞系作为DHFR缺陷型细胞系。将该细胞系传代80次或更多次，在作为化学成分确定的培养基的HY-CDM (in-house)培养基中悬浮适应。将悬浮适应的细胞系用于评价四氢叶酸(THF) 和二氢叶酸(DHF)的影响和在商购化学成分确定的培养基中的生长特征。 HY-CDM培养基仅由化学成分确定的成分组成。每个HY-CDM培养基还包含生长因子。实施例1、3和4中使用的HY-CDM培养基不含动物源性的脂质混合物，实施例2中使用的HY-CDM培养基补充有鱼肝油。
2.细胞悬浮培养：以4×105个细胞/毫升的密度接种细胞系，并将其在37℃和5％的CO2下的湿润条件下在轨道摇床上以120rpm培养于具有30ml/125ml 工作体积的锥形瓶中。接种之前，将细胞在1000rpm(162×g)下离心5分钟，舍弃上清液，将剩余细胞在经加热的培养基中分散成单个细胞。将细胞传代3 次以使在实验条件下残留培养基的影响最小化。评价传代培养的细胞。
3.活细胞密度：用血细胞计数器(Neubauer improved bright-line,马林费尔德,德国)、倒置显微镜(CK30,Olympus,日本)和台盼蓝染料排斥法来分析活细胞密度。
本发明的实施方式
[实施例1]
THF有效浓度范围的确定
在本实施例中，通过改变THF的量来评价诱导CHO DG44细胞系在 HY-CDM培养基中悬浮生长的THF有效浓度范围。
为此，在0至480mg/L的THF浓度下，将CHO DG44细胞系传代3次，测量它们的最大细胞密度和倍增时间。
当以0.1mg/L和0.2mg/L的量添加THF时，细胞生长增加了约35％或更多。当分别以0.4mg/L、0.8mg/L和160mg/L的量添加THF时，细胞密度增加了约 56％、约73％和约90％。特别地，当以1.6mg/L和16mg/L的量添加THF时，细胞密度增加至约155％或更大的最大值。相反，480mg/L THF的添加抑制细胞生长。综上所述，以0.1至160mg/L的量添加THF在改善化学成分确定的培养基中的细胞生长方面是有效的(表1)。
表1中描述在增加的传代培养数下THF的浓度和细胞的最大密度。
在THF以0.025至16mg/L的量添加之后，倍增时间经测量为21.3±0.7小时，这证明与对照的细胞生长相比细胞生长快(≥约14％)(表2)。
表2描述细胞倍增时间随THF浓度增加的变化。
[表1]
Figure GDA0002161630520000141
[表2]
Figure GDA0002161630520000142
[实施例2]
补充有THF的培养基中的传代培养特征
将冻存在以1.6mg/L THF补充的HY-CDM培养基中的CHO DG44细胞系解冻，每两天传代培养一次。在第三次传代后的第2天，观察到21.9±2.2×105个细胞/毫升的细胞密度和20.3±1.3小时的倍增时间，这比对照的细胞密度和倍增时间(17.1±3.4×105个细胞/毫升和25.3±3.7小时)分别高约28％和快约20％ (表2)。HY-CDM培养基包含商购脂质混合物，该脂质混合物含有为动物源性成分的鱼肝油。
表3描述在补充有THF的HY-CDM培养基中细胞生长特征随传代培养数增加的变化。
[表3]
Figure GDA0002161630520000151
[实施例3]
在含THF和不含THF的商购化学成分确定的培养基中CHO DG44细胞系的生长
(1)商购化学成分确定的培养基的选择
在本实施例中，评价了添加THF以诱导细胞生长的效果的通用性。为此，选择6种不同的商购化学成分确定的培养基并将其用于根据THF添加来评价细胞生长。表4示出所使用的化学成分确定的培养基的主要特点。
[表4]商购化学成分确定的培养基的主要特点
Figure GDA0002161630520000161
(2)在商购化学成分确定的培养基中添加THF以诱导细胞生长的效果
在添加和不添加THF的情况下诱导细胞生长。由于THF在6种商购化学成分确定的培养基中增加细胞密度和生长速率，其被认为是普遍适用于在化学成分确定的环境中促进DHFR基因敲除的CHO细胞系生长的有用物质(表5)。
表5示出实施例3使用的培养基及其类别。表6和7分别描述在表5所示培养基条件下的最大细胞密度和倍增时间。
[表5]
Figure GDA0002161630520000171
[表6]
Figure GDA0002161630520000172
[表7]
Figure GDA0002161630520000181
如由表中结果可以看出的，在以1.6mg/L THF补充的PowerCHO-2培养基 (M1T)中，最大细胞密度(21.0±4.9×105个细胞/毫升)和倍增时间(23.8±5.6 小时)分别比不含THF的培养基中的那些高约46％和短约24％。在以1.6mg/L THF补充的HyCell CHO培养基(M2T)中，最大细胞密度(30.7±1.2×105个细胞/毫升)和倍增时间(21.7±1.4小时)分别比在不含THF的培养基中的那些高约200％和短约46％。在以1.6mg/L THF补充的CDOptiCHO培养基(M3T) 中，最大细胞密度和倍增时间分别是13.9±1.5×105个细胞/毫升和34.4±3.0小时。对于不含TFH的培养基，在第三次传代中未观察到细胞生长。在以1.6mg/LTHF补充的CDM4CHO培养基(M4T)中，最大细胞密度(42.6±2.8×105个细胞/毫升)和倍增时间(21.1±2.0小时)分别比在不含THF的培养基中的那些高约200％和短约21％。在以1.6mg/L THF补充的EX-CELL CD CHO培养基 (M5T)中，最大细胞密度(16.9±3.0×105个细胞/毫升)和倍增时间(28.1±3.8 小时)分别比在不含THF的培养基中的那些高约40％和短约34％。在以1.6mg/L THF补充的ProCHO5培养基(M6T)中，最大细胞密度(12.9±1.7×105个细胞 /毫升)和倍增时间(37.2±5.9小时)分别比在不含THF的培养基中的那些高约20％和短约4％。
[实施例4]
在补充有DHF的培养基中的细胞系生长。
根据在HY-CDM中最有效地诱导细胞生长的情况下THF的量(0.8mg/L、 1.6mg/L和16mg/L)和THF的分子量，THF浓度经计算分别为1.8M、3.6M 和35.9M。以与THF相同的浓度使用DHF。以3.6M和35.9M的浓度添加 DHF使细胞生长分别提高了11％和24％(表8)，这是添加THF的约1/7。
[表8]
Figure GDA0002161630520000191
工业实用性
本发明的培养基添加物增加在化学成分确定的培养基中的最大细胞密度并减少倍增时间。由于改善的细胞生长，可以缩短悬浮适应周期或者可以避免对悬浮适应的需求，实现改善的培养基性能。因此，培养基添加物的使用可以提供通过细胞培养制备重组蛋白质的方法。

Claims (13)

1.一种用于悬浮培养的细胞培养基，包含化学成分确定的培养基和四氢叶酸(THF)或其前体或衍生物，其中所述细胞培养基培养四氢叶酸营养缺陷型且具有功能性缺失的或受损的DHFR基因的细胞，其中所述化学成分确定的培养基包含次黄嘌呤和胸苷，
其中THF或其前体或衍生物以0.1至160mg/L的浓度存在，
其中THF前体选自二氢叶酸、二氢叶酸二钠、二氢叶酸二锂、二氢叶酸二钾、二氢叶酸钙、二氢叶酸镁及其混合物，
其中THF衍生物选自5-甲酰基-THF、5-甲基-THF、10-甲酰基-THF、5,10-亚甲基-THF、5,10-次甲基-THF、5-亚胺甲基-THF、5-甲基四氢叶酸二钠、5-甲酰基-四氢叶酸钙及其混合物。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中四氢叶酸营养缺陷型细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。
3.根据权利要求2所述的细胞培养基，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
4.根据权利要求3所述的细胞培养基，其中所述CHO细胞选自UKB25、DUK22、DUK51、DUK-D1、DUK-S1、DUK51-R1、DUK51-R2、DUK22-R1、DUK22-R2、DXBA、DXE11、DXC11、DXB11和DUKX。
5.根据权利要求3所述的细胞培养基，其中所述CHO细胞选自UA2、UA4、UA21、UA41、DU5、DU11、DG21、DG22、DG23、DG24、DG41、DG42、DG43、DG44、DG45和DG46。
6.一种用于在细胞中制备期望产物的方法，其包括(a)向化学成分确定的培养基添加四氢叶酸(THF)或其前体或衍生物，(b)在培养基中培养用基因重组载体转染的细胞，(c)使细胞表达期望产物，(d)从细胞分离期望产物，
其中THF或其前体或衍生物以0.1至160mg/L的浓度添加，
其中THF前体选自二氢叶酸、二氢叶酸二钠、二氢叶酸二锂、二氢叶酸二钾、二氢叶酸钙、二氢叶酸镁及其混合物，
其中THF衍生物选自5-甲酰基-THF、5-甲基-THF、10-甲酰基-THF、5,10-亚甲基-THF、5,10-次甲基-THF、5-亚胺甲基-THF、5-甲基四氢叶酸二钠、5-甲酰基-四氢叶酸钙及其混合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述期望产物为蛋白质、细胞、病毒或基因组。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞为四氢叶酸营养缺陷型。
9.根据权利要求8所述的方法，其中四氢叶酸营养缺陷型细胞具有功能性缺失或受损的DHFR基因。
10.根据权利要求8所述的方法，其中四氢叶酸营养缺陷型细胞选自哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞和真菌细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中哺乳动物细胞为CHO细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述CHO细胞选自UKB25、DUK22、DUK51、DUK-D1、DUK-S1、DUK51-R1、DUK51-R2、DUK22-R1、DUK22-R2、DXBA、DXE11、DXC11、DXB11和DUKX。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述CHO细胞选自UA2、UA4、UA21、UA41、DU5、DU11、DG21、DG22、DG23、DG24、DG41、DG42、DG43、DG44、DG45和DG46。
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