WO2015137640A1 - 화학 조성 세포 배양 배지 첨가물 - Google Patents

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WO2015137640A1
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thf
cells
cell
medium
dihydrofolate
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PCT/KR2015/001697
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French (fr)
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박홍우
김봉균
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한양대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to the growth of cell lines that are nutritionally required for tetrahydrofolate and to the optimum medium for high efficiency production of the desired material in said cells. Specifically, the present invention proposes a method of enhancing the growth of cells by adding tetrahydrofolate (THF) or a precursor or derivative thereof to the chemical composition cell medium.
  • THF tetrahydrofolate
  • Chemically defined cell media not only improve its performance in the process for mass production of cells, but also ensure consistency of performance, traceability and raw-to-lot consistency of raw materials. It is mainly used for mammalian cell culture by improving the lot-to lot consistency.
  • unidentified complex media components eg yeast and soy hydrolysates, etc.
  • process performance variability including differences in cell growth, product titers and product quality characteristics. Therefore, the development and improvement of chemical composition cell media are importantly recognized in mammalian cell culture techniques.
  • the chemical composition cell medium may contain some chemicals whose effects on cell growth have not been fully characterized, even if the components are fully identified.
  • suspension cultures of mammalian host cells such as CHO DG44, in most commercial chemical composition media require adaptation through long-term passages and show low cell growth performance even after the adaptation process. .
  • the present invention is to provide a medium additive for improving the medium performance of short or no need for suspension adaptation period through the improvement of the cell growth of the maximum cell concentration and the doubling time in the chemical composition medium.
  • the present invention is to provide a method for producing a recombinant protein through cell culture using such a medium additive.
  • the present invention improved the problem of the chemical composition medium by simply adding tetrahydrofolate (THF) or a precursor or derivative thereof to the chemical composition medium.
  • THF tetrahydrofolate
  • a medium for cell culture in which tetrahydrofolate (THF) or a precursor or derivative thereof is added to a chemical composition medium can be provided.
  • the cell is characterized in that the tetrahydrofolate trophoblast cell.
  • the tetrahydrofolate trophoblast cell is characterized in that the function of the DHFR gene is missing or weakened.
  • the tetrahydrofolate trophoblast cell may be selected from the group consisting of mammalian cells, insect cells, plant cells and fungal cells.
  • the mammalian cell is characterized in that the CHO cell.
  • the CHO cell line may be selected from K1 derived or PRO-3 derived.
  • the PRO-3 derived CHO cell line may be selected from the group consisting of UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 and DG46.
  • the CHO cell line lacking the DHFR gene may be selected from K1 derived or PRO-3 derived.
  • the PRO-3 derived CHO cell line may be selected from the group consisting of UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 and DG46.
  • the precursor of THF is a substance that can be converted into tetrahydrofolate after folate in the cell, and has a dihydrofolate salt in combination with monovalent and divalent cations such as dihydrofolate, disodium dihydrofolate, dilithium dihydrofolate, dipotassium dihydrofolate, calcium dihydrofolate, magnesium dihydrofolate, etc. Substances and derivatives of dihydrofolate and the like.
  • the derivatives of THF are 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, 5,10-methenyl-THF, 5-formimino-THF, THF-L-glutamate , THF-polyglutamate, 4-amino-4-deoxy-THF, 10-formyl tetrahydrofolate-4a-carbinolamine, 10-methyl-5,6,7,8-tetrahydropteroyl glutamate, dihydrofolate and salts of these substances It may be selected from the group consisting of the material having.
  • the concentration range of THF is characterized in that 0.1 to 160 mg / L.
  • a production method comprising the following steps:
  • the cell is characterized in that the tetrahydrofolate trophoblast cell.
  • the tetrahydrofolate trophoblast cell is characterized in that the function of the DHFR gene is missing or weakened.
  • the tetrahydrofolate trophoblast cell may be selected from the group consisting of mammalian cells, insect cells, plant cells and fungal cells.
  • the mammalian cell is characterized in that the CHO cell.
  • the CHO cell may be selected from K1 derived or PRO-3 derived.
  • the K1 derived CHO cells are in the group consisting of UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 and DUKX, etc. Can be selected.
  • the PRO-3 derived CHO cells may be selected from the group consisting of UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 and DG46.
  • the precursor of THF is a substance that can be converted into tetrahydrofolate after folate in the cell, and has a dihydrofolate salt in combination with monovalent and divalent cations such as dihydrofolate, disodium dihydrofolate, dilithium dihydrofolate, dipotassium dihydrofolate, calcium dihydrofolate, magnesium dihydrofolate, etc. Substances and derivatives of dihydrofolate and the like.
  • the derivatives of THF are 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, 5,10-methenyl-THF, 5-formimino-THF, THF-L-glutamate , THF-polyglutamate, 4-amino-4-deoxy-THF, 10-formyl tetrahydrofolate-4a-carbinolamine, 10-methyl-5,6,7,8-tetrahydropteroyl glutamate, dihydrofolate and salts of these substances It may be selected from the group consisting of the material having.
  • the concentration range of THF is characterized in that 0.1 to 160 mg / L.
  • the present invention can provide a cell culture medium having improved performance or shorter suspension adaptation period through the addition of THF to the chemical composition medium to increase the maximum cell concentration and decrease the doubling time.
  • the present invention can be utilized in the production process of the desired material, such as proteins, cells, viruses or genomes through cell culture using this improved cell culture medium.
  • 1 is a graph showing suspension growth of CHO DG44 cells in chemical composition medium containing THF as a medium additive.
  • Figure 2 is a result of measuring the change in cell growth characteristics according to passage in HY-CDM medium added THF, (a) is a graph showing the cell concentration, (b) is a graph showing the doubling time.
  • Figure 3 is a result of measuring the change in cell growth according to the addition of THF in a commercial chemical composition medium, (a) is a graph showing the maximum cell concentration, (b) is a graph showing the doubling time.
  • FIG. 4 is a graph showing cell growth in HY-CDM medium with DHF added.
  • media refers to a nutritional composition that assists in the maintenance, development and / or micronization of cells.
  • chemically defined media means a medium in which all components can be described by their formulas and are present in known concentrations.
  • chemical composition medium means a preselected CDM that has not been developed using the method of the present invention. A small amount of growth factor or lipid mixture may be added to the chemical composition medium according to the present invention.
  • cell refers to a cell population.
  • the cells can be wild type or recombinant.
  • cell culture or “cell culture technology” or “cell culture process” means methods and conditions suitable for survival and / or growth and / or micronization of cells.
  • target material refers to any recombinant protein, cell, virus or genome that may be useful for research, diagnostic or therapeutic purposes.
  • Proteins can include mammalian proteins or non-mammalian proteins, and can optionally include receptors or ligands.
  • target proteins include, but are not limited to, molecules such as lenin; Growth hormones including human growth hormone and bovine growth hormone; Growth hormone releasing factor; Parathyroid hormone; Thymic stimulating hormone; Lipoprotein; Alpha-1-antitrypsin; Insulin A-chain; Insulin B-chain; Proinsulin; Hair follicle stimulating hormone; Calcitonin; Progesterone; Glucagon; Blood clotting factors such as Factor VIIIC, Factor IX, Tissue Factors, and von Willebrands Factors; Anti-thrombotic factors such as protein C; Atrial sodium excretion factor; Waste surfactants; Plasminogen activators such as urokinase or human urine or tissue-type plasminogen activator (t-PA); Bombesin; Thrombin; Hemopoietin growth factor; Members of the TNF and TNF receptor (TNFR) families, such as tumor necrosis factor-alpha and -beta, CD40 ligand, Apo-2
  • precursor refers to a substance before it becomes a specific substance that can be finally obtained in any metabolism or chemical reaction.
  • the specific substance here does not need to be the last substance of any reaction, but refers to a substance that can be obtained at any stage.
  • the term derivative refers to a similar compound obtained by chemically changing a portion of a compound.
  • a hydrogen atom or a specific atomic group in the compound refers to a compound substituted with another atom or atomic group.
  • the present invention provides the effect of improving cell growth and shortening the period of suspension adaptation by simply adding tetrahydrofolate (THF), which is not reported as an additive in the field of cell culture, to concentrations useful in the cell culture medium.
  • THF tetrahydrofolate
  • the present invention solves the problem of low cell growth performance even after the adaptation process requires an adaptation process through a long passage for the CHO DG44 host cell suspension culture in most conventional chemical composition medium.
  • the present invention can provide a cell culture medium in which tetrahydrofolate (THF) or a precursor or derivative thereof is added to a chemical composition medium.
  • THF tetrahydrofolate
  • the cells to be cultured may be tetrahydrofolate trophoblastic cells.
  • the tetrahydrofolate trophoblast cells refer to cells that lack the biosynthesis of tetrahydrofolate and are required to obtain them from exogenous sources, usually culture media, and the function of enzymes involved in THF conversion from folate is It is a cell deficient.
  • the enzyme is preferably DHFR.
  • DHFR deficiency is a cell that has a lower sensitivity to folate than the DHFR enzyme, in which the DHFR gene is removed from the chromosome or is tolerantly expressed, wherein the feature is one or more amino acid sequence replacements (e.g., deletions) with respect to the amino acid sequence of the DHFR enzyme. , Substitution or addition).
  • the tetrahydrofolate trophoblast cells are cells with a lower folate uptake than wild-type cells, and the cells are folate transport systems, i.e., folate receptors (FR), proton-coupled poles that mediate folate uptake It may be manifested through loss of function / mutation and / or gene loss of the rate transporter (PCFT) and reduced folate carrier (RFC).
  • folate transport systems i.e., folate receptors (FR), proton-coupled poles that mediate folate uptake It may be manifested through loss of function / mutation and / or gene loss of the rate transporter (PCFT) and reduced folate carrier (RFC).
  • FR folate receptors
  • PCFT rate transporter
  • RRC reduced folate carrier
  • the cell is preferably selected from the group consisting of mammalian cells, insect cells, plant cells and fungal cells.
  • Fungal cells and plant cells are autotrophic to tetrahydrofolate. That is, such a cell can autonomously synthesize its cell viability, ie its own folate necessary for cell growth and proliferation.
  • the present invention includes such fungal and plant cells that may or may be nutrients, particularly for tetrahydrofolate. This may be due to, for example, genetic engineering. That is, when a cell is no longer able to synthesize a sufficient amount of tetrahydrofolate for its cell viability.
  • this fungal or plant cell ability to endogenously biosynthesize tetrahydrofolate via the appropriate target pathway may be inactivated, for example, by gene disruption or gene silencing of the appropriate target gene, or by inhibition of key enzymes.
  • the host cell is a mammalian cell.
  • the mammalian cell may be selected from the group consisting of rodent cells, human cells and monkey cells.
  • Rodent cells are particularly preferred, which is preferably selected from the group consisting of CHO cells, BHK cells, NS0 cells, mouse 3T3 fibroblasts and SP2 / 0 cells. Most preferred rodent cells are CHO cells.
  • human cells which are preferably selected from the group consisting of cytotoxic T lymphocytes, chondrocytes, fibroblasts, hematopoietic stem cells, HEK293 cells, MCF-7 cells, PerC6 cells and HeLa cells.
  • Further monkey cells are preferred, which is preferably selected from the group consisting of COS-1, COS-7 cells and Vero cells.
  • mammalian cells may include MDCK cells, which may be mainly used for virus production.
  • the mammalian cells include Chinese Hamster Ovary (CHO cells) and include dhfr - CHO cells used with DHFR selective markers.
  • CHO cells are often used in biological and medical research and in the commercial production of therapeutic proteins. It was introduced in the 1960s and originally grew into a monolayer culture group, and today it is the most widely used mammalian host for the industrial production of recombinant protein therapeutics and usually grows in suspension culture.
  • the DHFR gene-deficient CHO cell line is characterized in that the auxotrophic cell line (auxotroph) for glycine, hypoxanthine, thymidine.
  • auxotroph for glycine, hypoxanthine, thymidine.
  • CHO Chinese Hamster Ovary
  • CHO cells are being studied using DMEM medium containing animal serum, which is mainly used for research, and is not used for commercial purposes in actual production lines.
  • DHFR is used as a selection marker in CHO cells.
  • the DHFR is a dihydrofolate reductase, an enzyme that reduces folic acid to tetrahydrofolate (THF) using NADPH as an electron donor.
  • Folic acid is a type of vitamin commonly used in the medium, and serves to supply the biosynthesis and methyl groups of purine, pyrimidine and glycine.
  • THF is required in the medium because the cell line lacking the DHFR gene cannot produce THF.
  • a chemical composition medium it is a THF-free medium in most cases, and it is a medium which does not contain the animal serum, serum fraction, tissue extract hydrolyzate, peptone, etc. which are likely to contain THF in a manufacturing process.
  • the CHO cell line deficient in the DHFR gene may be selected from K1 derived or PRO-3 derived.
  • the K1 derived CHO cell line in the group consisting of UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 and DUKX, etc. Can be selected.
  • the PRO-3 derived CHO cell line may be selected from the group consisting of UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 and DG46.
  • the components in the medium be large or high in concentration to allow the cells to grow at high concentrations. Rather, the higher the media component, the higher the osmotic pressure of the media, which may act as toxic to the cells.
  • conventional media are equipped with animal serum-rich proteins and hormones, when animal proteins are present in the media, problems may arise in the actual clinical use of substances produced in cells, such as proteins. Therefore, there is no serum in the medium, but all ingredients must be present that can sufficiently replace the serum. In other words, carbohydrates, amino acids, ions, vitamins, etc. should be included in the optimal concentration to grow the cells.
  • the cell culture medium is characterized in that the chemical composition medium.
  • the chemical composition medium is a medium containing no protein hydrolyzate, hypoxanthine and thymidine, and any one selected from the group consisting of amino acids, vitamins, carbohydrates, inorganic salts, organic acids, trace elements, growth factors, hormones, etc. It is characterized by including the above.
  • lipid mixtures may be included and may be synthetic lipid mixtures or animal derived lipid mixtures such as cod liver oil.
  • the medium may include any THF as an impurity in the added chemical when reinforcing a chemical for inducing cell growth in a chemical composition base medium consisting of amino acids, vitamins, carbohydrates, buffers, and trace elements, in which case the concentration of THF Means a condition below the concentration range that affects improvement in cell growth, and is a concentration of 0.1 mg / L or less.
  • the chemical composition medium includes commercially available commercial medium, for example, PowerCHO-2 CD medium, HyCell CHO medium, CDM4CHO medium, CD OptiCHO medium, EX-CELL CD CHO medium, ProCHO5 medium.
  • the chemical composition medium may or may not contain animal-derived components, and may or may not include serum.
  • THF tetrahydrofolate
  • tetrahydrofolate is produced from folic acid by dihydrofolate reductase and NADPH in cells.
  • tetrahydrofolate derivatives include 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, and 5,10-methenyl-THF. It is an intermediate that exchanges formyl group, hydroxy methyl group, methyl group and the like by the reaction, and functions as a coenzyme in various enzyme reactions. In particular, it is involved in the biosynthesis of purine, pyrimidine, glycine to supply methyl groups.
  • additives also include precursors or derivatives of tetrahydrofolate (THF).
  • THF tetrahydrofolate
  • the precursor of THF is a substance that can be converted into tetrahydrofolate after folate in the cell, and has a dihydrofolate salt in combination with monovalent and divalent cations such as dihydrofolate, disodium dihydrofolate, dilithium dihydrofolate, dipotassium dihydrofolate, calcium dihydrofolate, magnesium dihydrofolate, etc. Substances and derivatives of dihydrofolate and the like.
  • the derivatives of THF are 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, 5,10-methenyl, which have a physiological function that can be converted into tetrahydrofolate in cells.
  • Substances in the form of tetrahydrofolate derivative salts combined with monovalent and divalent cations such as -THF, 5-formimino-THF, disodium 5-methyl tetrahydrofolate, calcium 5-formyl-tetrahydrofolate, or substitutes for the function of tetrahydrofolate Can be heard.
  • the method for producing a target substance in a cell according to the present invention includes the following steps.
  • the target material may be a protein, cell, virus or genome.
  • step (b) electroporation, lipofectamine, etc. are used for transfection of the recombinant vector, and a process for cell recovery is necessary due to problems such as cell membrane damage during transfection.
  • This process is generally carried out in adherent culture in a medium containing serum and in some cases is also carried out in the chemical composition medium, but it is necessary to secure a medium having excellent cell growth performance for stable growth of cells.
  • the cell culture performance is improved in various chemical composition media, thereby increasing the possibility of using the chemical composition media in the process of (b).
  • Method of producing the target protein using CHO cells 1) Recombinant cell line production: Recombinant gene transfection into host cell, Selection of high productivity cell line, 2) Establishment of culture process suitable for the selected cell line-> Selection of suitable medium for selection recombinant cell line, Culture conditions Establishment: cultivation temperature, enrichment composition establishment, addition time and amount establishment 3) It is divided into purification step of separating recombinant protein from the cell.
  • high productivity culture conditions per unit medium are preferred, and a fed-batch culture process is mainly used.
  • the cell line having stable productivity of recombinant protein is used to increase the concentration of cells and to improve the incubation period. For this, selection of cell culture medium and concentrated additives is the most important factor.
  • CHO cells lacking DHFR can be grown only by adding glycine, hypoxanthin, and thymidine to the medium.
  • target gene and the DHFR gene are put together in CHO cells and grown in a medium without glycine, hypoxanthin, and thymidine, only cells containing the DHFR gene are selectively grown.
  • a DHFR inhibitor it is possible to select only cells in which the DHFR gene is amplified by attaching while increasing the concentration of methotrexate little by little.
  • the selected cell line can be a highly efficient cell line capable of producing the desired protein.
  • the target protein can be obtained by cloning the gene for the target protein in a vector containing DHFR (+), transfecting the DHFR deficient CHO cells, and then amplifying the gene using MTX.
  • the method for producing a target substance according to the present invention can be produced in high efficiency in DHFR-deficient CHO cells by using a medium containing THF as an additive in a chemical composition medium as a culture medium of cells. That is, the recombinant cell line is transfected into the host cell, and then selects a cell line having high growth and high productivity. Recombinant cell lines are screened in media that exclude hypoxanthine and thymidine, and therefore require the action of DHFR for cell growth. MTX is used as an enzyme substrate inhibitor of folate to DHFR for recombinant gene amplification and recombinant cell line selection.
  • Recombinant cell line screening involves colony screening, mainly by culturing with adherence in serum medium. Since serum is likely to contain THF as a complex material, it is expected to improve the low growth potential due to serum exclusion when introducing chemical composition medium during selection of recombinant cell lines, thus counteracting the problem of decreasing MTX effect. There will be. Therefore, by using a medium containing THF as an additive, it is possible to select a high-productivity cell line, thereby producing high efficiency in DHFR-deficient CHO cells.
  • HY-CDM in-house
  • the growth characteristics were evaluated in a commercial chemical composition medium.
  • HY-CDM medium consists only of chemical composition, and contains one growth factor.
  • the medium used in Examples 1 and 3 and 4 is HY-CDM without an animal-derived lipid complex, and the medium used in Example 2 is HY-CDM with cod liver oil added.
  • Cell suspension culture Cell line 30 ml / 125 ml Erl. At inoculation concentration of 410 5 cells / ml. The flask was incubated under working volume of flask, orbital shaker with agitation speed of 120 rpm, incubation temperature of 37, 5% CO 2 , and wet conditions. Cell inoculation and passage were centrifuged at 1,000 rpm (162 g ) for 5 min. The supernatant was removed and dispersed in warmed medium as single cells and used as inoculated cells. In order to minimize the influence of the remaining medium in each commercial medium and experimental conditions were evaluated by three passages in each condition.
  • Live Cell Concentration Analysis Live cell concentration was analyzed using hemocytometer (Neubauer improved bright-line, Marienfeld, Germany), reversed-phase microscope (CK30, Olympus, Japan) and trypan blue dye exclusion method.
  • Example 1 was intended to evaluate the effective concentration range of THF that induces CHO DG44 cell line suspension growth with THF addition in HY-CDM medium.
  • THF concentration range effective for inducing cell growth in HY-CDM medium three passages were cultured at a concentration range of 0480 mg / L and the maximum cell concentration and doubling time were measured.
  • Table 1 below describes the concentration of THF and the maximum cell concentration according to passage culture.
  • Table 2 describes the change in doubling time according to the concentration of THF.
  • the HY-CDM medium used in Example 2 is the addition of a commercial lipid mixture containing an animal-derived component (Cod liver oil).
  • Table 3 describes the change of cell growth characteristics according to passage in HY-CDM medium to which THF was added.
  • Induction of cell growth with or without THF shows increased cell concentration and growth rate in all 6 commercial chemical composition media, and thus is a useful substance that can be used universally to improve growth in the chemical composition of CHO cell lines knocked out by the DHFR gene. (Table 5).
  • Example 3 the medium used in Example 3 is divided and displayed, the maximum cell concentration in the medium condition according to Table 5 is described in Table 6, and the doubling time is described in Table 7.
  • the maximum cell concentration was 21.04.910 5 cells / ml, and the doubling time was 23.85.6 h in THC 1.6 mg / L addition PowerCHO-2 CD medium (M1T). It was about 46% higher cell concentration and 24% faster cell growth than THF.
  • HyCell CHO medium (M2T) with 1.6 mg / L THF has a maximum cell concentration of 30.71.210 5 cells / ml and a doubling time of 21.71.4 h, approximately 200% higher cell concentration and 46% faster cell growth than THF. Indicates.
  • CD OptiCHO medium with 1.6 mg / L THF had a maximum cell concentration of 13.91.510 5 cells / ml, a doubling time of 34.43.0 h, and no THF addition conditions in cell growth in three passages.
  • CDM4CHO medium with 1.6 mg / L THF had a maximum cell concentration of 42.62.810 5 cells / ml, a doubling time of 21.12.0 h, and about 200% higher cell concentration and 21% faster cell growth than THF-free. .
  • EX-CELL CD CHO medium with 1.6 mg / L THF has a maximum cell concentration of 16.93.010 5 cells / ml and a doubling time of 28.13.8 h, which is approximately 40% higher and 34% faster than THF.
  • ProCHO5 medium with 1.6 mg / L THF had a maximum cell concentration of 12.91.710 5 cells / ml, doubling time of 37.25.9 h, and about 20% higher cell concentration and 4% faster cell growth than THF-free. .
  • the present invention provides a medium additive for improving medium performance with short or no need for suspension adaptation period through improving cell growth of increasing maximum cell concentration and decreasing doubling time in a chemical composition medium, and thereby It is possible to provide a method for producing a recombinant protein by culturing.

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Abstract

본 발명은 테트라하이드로폴레이트에 대해 영양 요구성인 세포주의 성장 및 상기 세포에서 목적하는 물질을 고효율로 생산하기 위한 최적 배지에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 화학 조성 세포 배지에 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate; THF) 또는 그 전구체 또는 유도체를 첨가함으로써 세포의 성장을 향상시키는 방법을 제공한다.

Description

화학 조성 세포 배양 배지 첨가물
본 발명은 테트라하이드로폴레이트에 대해 영양 요구성인 세포주의 성장 및 상기 세포에서 목적하는 물질을 고효율로 생산하기 위한 최적 배지에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 화학 조성 세포 배지에 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate; THF) 또는 그 전구체 또는 유도체를 첨가함으로써 세포의 성장을 향상시키는 방법을 제안한다.
1907년 Harrison에 의해 최초의 동물세포 배양이 이루어진 이래 지속적인 연구를 통해 특이적인 기능을 발현하는 세포주와 무혈청 배지 등이 개발되어 세포배양법으로 널리 이용되고 있다. 동물세포는 부유성 세포와 부착성 세포로 구분되며 대부분의 세포는 부착성 동물세포로 Basal Medium Eagle (BME) 배지를 기초로 만들어진 Dubeccos Modified Eagles medium (DMEM)과 Minimum Essential Medium (MEM) 배지가 상업적으로 판매되며 가장 널리 사용되고 있다.
화학 조성 세포 배지(chemically defined cell media: CDM)는 세포를 대량생산하기 위한 공정에서 그 성능을 향상시킬 뿐 아니라, 그 성능의 일관성을 유지하게 하고, 원료의 트레이서빌러티(traceability) 및 랏트간 일관성(lot-to lot consistency)을 향상 시킴으로써 포유동물 세포배양에 주로 사용된다. 한편, 규명되지 않은 복잡한 배지 성분(예: 효모 및 대두 가수분해물 등)의 사용은 세포 성장, 생성물 역가 및 생성물 품질 특성의 차이를 포함한 공정 성능 가변성을 유도한다. 따라서, 화학 조성 세포 배지의 개발 및 개선이 포유동물 세포 배양 기술에서 중요하게 인식되고 있다. 또한, 화학 조성 세포 배지는 완전히 그 성분이 규명된 경우라고 하더라도, 세포 성장에 미치는 영향이 완전히 규명되지 못한 일부 화학물질들이 포함될 수 있다. 따라서, 배지에 임의의 첨가물을 부가 또는 제거한 경우에 미치는 효과에 대하여 예측하기는 어렵다. 또한, 대부분의 상용 화학 조성 배지에서 포유동물 숙주 세포, 예를 들면, CHO DG44의 현탁 배양을 위해서는 장기간의 계대 배양을 통한 적응과정을 필요로 하며, 적응 과정 이후에도 낮은 세포 성장 성능을 나타내는 문제점을 나타낸다.
이에, 본 발명은 화학 조성 배지에서 최대 세포 농도 증가 및 배가 시간 (doubling time) 감소의 세포 성장 개선을 통하여 현탁 적응기간이 짧거나 필요 없는 배지 성능 개선을 위한 배지 첨가물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 이러한 배지 첨가물을 이용하여 세포 배양을 통한 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate; THF) 또는 그 전구체 또는 유도체를 단순 첨가함으로써 화학 조성 배지의 문제점을 개선하였다.
본 발명의 일 양태로서, 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(THF) 또는 이것의 전구체 또는 유도체를 첨가한 세포 배양용 배지를 제공할 수 있다.
상기 세포는 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포인 것을 특징으로 한다.
상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 DHFR 유전자의 기능이 결손 또는 약화된 것을 특징으로 한다.
상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 포유동물 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 한다.
상기 CHO 세포주는 K1 유래 또는 PRO-3 유래인 것에서 선택될 수 있다.
상기 K1유래 CHO 세포주는 UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 및 DUKX 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 PRO-3 유래 CHO 세포주는 UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 및 DG46 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 DHFR 유전자가 결핍된 CHO 세포주는 K1 유래 또는 PRO-3 유래인 것에서 선택될 수 있다.
상기 K1유래 CHO 세포주는 UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 및 DUKX 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 PRO-3 유래 CHO 세포주는 UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 및 DG46 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 THF의 전구체는 세포에서 folate 이 후 tetrahydrofolate으로 전환될 수 있는 물질로 dihydrofolate, disodium dihydrofolate, dilithium dihydrofolate, dipotassium dihydrofolate, calcium dihydrofolate, magnesium dihydrofolate 등 1가 및 2가 양이온들과 결합된 dihydrofolate 염의 형태를 갖는 물질 및 dihydrofolate의 유도체 등일 수 있다.
상기 THF의 유도체는 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, 5,10-methenyl-THF, 5-formimino-THF, THF-L-glutamate, THF-polyglutamate, 4-amino-4-deoxy-THF, 10-formyl tetrahydrofolate-4a-carbinolamine, 10-methyl-5,6,7,8-tetrahydropteroyl glutamate, dihydrofolate 등의 물질 및 이러한 물질의 염의 형태를 갖는 물질로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 THF의 농도 범위는 0.1 내지 160 mg/L인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 세포에서 목적 물질을 생산하는 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는 생산 방법을 제공할 수 있다:
(a) 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(THF) 또는 이것의 전구체 또는 유도체를 첨가하는 단계;
(b) 상기 배지에 유전자 재조합 벡터로 형질주입된 세포를 배양하는 단계;
(c) 상기 세포가 목적 물질을 발현하는 단계; 및
(d) 상기 세포로부터 목적 물질을 분리하는 단계.
상기 세포는 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포인 것을 특징으로 한다.
상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 DHFR 유전자의 기능이 결손 또는 약화된 것을 특징으로 한다.
상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 포유동물 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 한다.
상기 CHO 세포는 K1 유래 또는 PRO-3 유래인 것에서 선택될 수 있다.
상기 K1유래 CHO 세포는 UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 및 DUKX 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 PRO-3 유래 CHO 세포는 UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 및 DG46 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 THF의 전구체는 세포에서 folate 이 후 tetrahydrofolate으로 전환될 수 있는 물질로 dihydrofolate, disodium dihydrofolate, dilithium dihydrofolate, dipotassium dihydrofolate, calcium dihydrofolate, magnesium dihydrofolate 등 1가 및 2가 양이온들과 결합된 dihydrofolate 염의 형태를 갖는 물질 및 dihydrofolate의 유도체 등일 수 있다.
상기 THF의 유도체는 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, 5,10-methenyl-THF, 5-formimino-THF, THF-L-glutamate, THF-polyglutamate, 4-amino-4-deoxy-THF, 10-formyl tetrahydrofolate-4a-carbinolamine, 10-methyl-5,6,7,8-tetrahydropteroyl glutamate, dihydrofolate 등의 물질 및 이러한 물질의 염의 형태를 갖는 물질로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 THF의 농도 범위는 0.1 내지 160 mg/L인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 화학 조성 배지에 THF를 첨가함으로써 최대 세포 농도 향상 및 배가 시간 감소를 통하여 현탁 적응기간이 짧거나 필요 없는 성능이 개선된 세포 배양 배지를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 개선된 세포 배양 배지를 이용하여 세포 배양을 통한 목적하는 물질, 예를 들면 단백질, 세포, 바이러스 또는 유전체의 생산 공정에 활용할 수 있다.
도 1은 배지 첨가물로 THF가 포함된 화학 조성 배지에서 CHO DG44 세포의 현탁 성장을 보여주는 그래프이다.
도 2는 THF가 첨가된 HY-CDM 배지에서 계대 배양에 따른 세포 성장 특성 변화를 측정한 결과로서, (a)는 세포농도를 나타낸 그래프이고, (b) 는 doubling time을 나타낸 그래프이다.
도 3은 상용 화학 조성 배지에서 THF 첨가에 따른 세포 성장 변화를 측정한 결과로서, (a)는 최대 세포 농도를 나타낸 그래프이고, (b)는 doubling time을 나타낸 그래프이다.
도 4는 DHF가 첨가된 HY-CDM 배지에서 세포 성장을 보여주는 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 아래와 같다.
용어 "배지(media)"는 세포의 유지, 전개 및/또는 미분화를 돕는 영양 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "화학 조성 배지(chemically defined media)"는 모든 성분이 그들의 화학식으로 기재될 수 있고, 공지된 농도로 존재하는 배지를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "화학 조성 배지"는 본 발명의 방법을 사용하여 개발되지 않은 미리 선택된 CDM을 의미한다. 본 발명에 따른 화학 조성 배지에는 성장 인자 또는 lipid mixture가 소량 추가될 수 있다.
용어 "세포"는 세포 집단을 의미한다. 세포는 야생형이거나 재조합될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "세포배양" 또는 "세포배양 기술" 또는 "세포배양 공정"은 세포의 생존 및 /또는 성장 및/또는 미분화에 적합한 방법 및 조건을 의미한다.
용어 "목적 물질" 은 연구, 진단 또는 치료 목적에 유용할 수 있는 임의의 재조합 단백질, 세포, 바이러스 또는 유전체를 지칭한다. 단백질로는 포유류 단백질 또는 비-포유류 단백질을 포함할 수 있고, 선택적으로는 수용체 또는 리간드를 포함할 수 있다. 목적 단백질의 예시는, 이에 제한되지 않으나, 레닌과 같은 분자; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 파라티로이드 호르몬; 흉선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 모낭 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 혈병형성 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 von Willebrands 인자; 혈병형성방지 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨배설 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 유로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 헤모포이에틴 성장 인자; TNF 및 TNF 수용체 (TNFR) 패밀리의 구성원들, 예컨대 종양 괴사 인자-알파 및 -베타, CD40 리간드, Apo-2 리간드/TRAIL, DR4, DR5, DcRl, DcR2, DcR3, OPG, Fas 리간드; 엔케팔리나아제; RANTES (발현 및 분비된 정상적 T-세포의 활성화시 조절됨); 인간 마크로파지 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러관 억제 물질 (Muellerian-inhibiting substance); 릴렉신 A-사슬; 릴렉신 B-사슬; 프로릴렉신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 뼈-유도성 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-; 혈소판-유도성 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), TGF-알파 및 예컨대 TGF-1, TGF-2, TG-P3, TGF-P4 또는 TGF-P5 를 포함하는 TGF-베타; 인슐린형 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌n IGF-I), 인슐린형 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성장 인자; 면역독소; 뼈형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 트롬보포이에틴 (TPO); 인터류킨 (ILs), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥시드 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 멤브레인 단백질; 부패 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 AIDS 껍질의 일부분, gpl20; 수송 단백질; 귀환 수용체; 아드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거된 임의의 폴리펩티드의 변이체 및/또는 절편; 및 CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34 와 같은 다양한 단백질 항원에 대한 항체; ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Macl, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 그의 또는 서브유닛을 포함하는 /3__인테그린 (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 예컨대 VEGF; IgE; 혈액 군 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C; Apo-2L 수용체, 예컨대 Apo-2 (DR5), DR4, DcR1, DcR2, DcR3; 및 상기 밝혀낸 항체의 변이체 및/또는 절편 등을 포함할 수 있다.
용어 전구체는 어떤 물질대사나 화학반응 등에서 최종적으로 얻을 수 있는 특정 물질이 되기 전 단계의 물질을 의미한다. 여기서 특정 물질이란 어떤 반응의 마지막 물질일 필요는 없으며, 임의의 어느 단계에서 얻을 수 있는 물질을 말한다.
용어 유도체는 어떤 화합물의 일부가 화학적으로 변화되어 얻어지는 유사한 화합물을 의미한다. 통상은 화합물 중의 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 말한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 기재된 구성은 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포 배양 분야에서 첨가물로써 보고되지 않은 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate; THF)를 세포 배양 배지에 유용한 농도로 단순 첨가함으로써 세포 성장 향상 및 현탁 적응 기간을 단축시키는 효과를 제공한다. 본 발명은 기존 대부분의 상용 화학 조성 배지에서 CHO DG44 host 세포 현탁 배양을 위해서는 장기간의 계대 배양을 통한 적응과정을 필요로 하며 적응 과정 이후에도 낮은 세포 성장 성능을 나타내는 문제점을 해결하였다.
본 발명은 일 양태로서, 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(THF) 또는 이것의 전구체 또는 유도체를 첨가한 세포 배양 배지를 제공할 수 있다.
세포
본 발명에 사용된 바와 같이, 배양되는 세포는 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포일 수 있다.
상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는, 테트라하이드로폴레이트의 생합성이 결여되어 있어서 외생 공급원, 통상적으로 배양 배지로부터 이들을 수득해야 되는 세포를 의미하며, 폴레이트로부터 THF전환에 관여하는 효소의 기능이 결핍된 세포이다.
상기 효소는 DHFR이 바람직하다. DHFR 기능 결핍은 DHFR 유전자가 염색체에서 제거되거나 내성적으로 발현되는 DHFR 효소보다 폴레이트에 대해 더 낮은 민감성을 갖는 세포이며, 상기 특징은 DHFR 효소의 아미노산 서열에 관하여 하나 이상의 아미노산 서열 교체 (예를 들어 결실, 치환 또는 부가)를 통해 나타날 수 있다.
또는, 상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 폴레이트 흡수율이 야생형 세포보다 낮은 세포로서 상기 세포는 폴레이트 수송 시스템, 즉 폴레이트 흡수를 매개하는 폴레이트 수용체 (FR), 양성자-커플링된 폴레이트 수송체 (PCFT) 및 환원된 폴레이트 캐리어 (RFC)의 기능손실/돌연변이/또는 유전자 상실을 통해 나타날 수 있다.
상기 세포는 바람직하게는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
진균 세포 및 식물 세포는 테트라하이드로폴레이트에 대해 독립영양적이다. 즉, 이러한 세포는 그의 세포 생존능, 즉 세포 성장 및 증식에 필요한 그 자신의 폴레이트를 자율적으로 합성할 수 있다. 본 발명은 특히 테트라하이드로폴레이트에 대해 영양요구성이거나 영양요구성이 될 수 있는 이러한 진균 및 식물 세포를 포함한다. 이는 예를 들어, 유전자 조작에 기인하는 것일 수 있다. 즉, 세포가 이제 그의 세포 생존능에 필요한 충분한 양의 테트라하이드로폴레이트를 합성할 수 없는 경우를 의미한다. 예를 들어, 적절한 대상 경로를 통해 테트라하이드로폴레이트를 내생적으로 생합성하는 이러한 진균 또는 식물 세포 능력은, 예를 들어 적절한 표적 유전자의 유전자 파괴 또는 유전자 침묵, 또는 핵심 효소의 억제 등에 의해 불활성화 될 수 있다. 바람직하게는, 숙주세포는 포유동물 세포이다.
상기 포유동물 세포는 설치류 세포, 인간 세포 및 원숭이 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 설치류 세포가 특히 바람직하며, 이는 바람직하게는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, 마우스 3T3 섬유모세포 및 SP2/0 세포로 이루어진 군으로부터 선택한다. 가장 바람직한 설치류 세포는 CHO 세포이다. 또한, 인간 세포가 바람직하며, 이는 바람직하게는 세포독성T임파구, 연골세포, 섬유세포, 조혈모세포, HEK293 세포, MCF-7 세포, PerC6 세포 및 HeLa 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 원숭이 세포가 바람직하며, 이는 바람직하게는 COS-1, COS-7 세포 및 Vero 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한편, 포유동물 세포에는 MDCK 세포가 포함될 수 있으며, 이는 바이러스 생산 등에 주로 사용될 수 있다.
상기 포유동물 세포는 차이니스 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)(CHO 세포)를 포함하며, DHFR 선택성 마커와 함께 사용되는 dhfr -- CHO 세포를 포함한다.
CHO 세포는 생물학 및 의학 연구에서 종종 쓰이고 치료용 단백질의 상업적 생산에 쓰인다. 이는 1960년대에 도입되었고, 원래 단일층 배양군으로 자라며, 오늘날, 재조합 단백질 치료제의 산업적 생산을 위한 포유세포 숙주 중 가장 널리 쓰이며, 보통 부유 배지(suspension culture)에서 자란다.
본 발명에서 사용된 바와 같이, DHFR 유전자가 결핍된 CHO 세포주는 glycine, hypoxanthine, thymidine에 대한 영양요구세포주(auxotroph)인 것을 특징으로 한다. 일반적으로 유전자 재조합 단백질의 대부분이 포유류 세포에서 제조되는데, 그 중 대부분은 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 생산된다. 기존에는 박테리아를 숙주로 하여 목적 단백질을 생산하였는데, 대부분의 진핵세포에서 생산되는 단백질은 glycolation과 같은 post-translational modification을 거치게 되는데, 박테리아에서는 이러한 modification 기능이 존재하지 않기 때문에 실제로 기능을 나타내는 단백질 생산이 어렵다. 따라서, 유전자 재조합 단백질 생산에는 CHO 세포를 이용하게 되었다.
CHO 세포는 동물 혈청이 들어간 DMEM 배지를 이용하여 연구가 많이 되고 있는데, 동물 혈청이 들어간 배지는 연구용으로 주로 사용하며, 실제 생산 라인에서 상업적 목적을 위해서는 사용되지 않는다.
CHO 세포에서 선택 마커로 사용되는 것이 DHFR이다. 상기 DHFR은 dihydrofolate reductase로서, NADPH를 전자공여체로 이용하여 folic acid를 tetrahydrofolate(THF)로 환원시키는 효소이다. Folic acid는 배지에 일반적으로 사용되는 비타민의 일종으로, purine, pyrimidine 및 glycine의 생합성 및 메틸기를 공급하는 역할을 한다. 그런데, DHFR 유전자가 결핍된 세포주에서는 THF를 생성할 수 없게 되므로, 배지에는 THF가 필요하다. 그런데, 화학 조성 배지의 경우, THF-free 배지인 경우가 대부분이며, THF가 제조 공정 중 함유되어 있을 가능성이 높은 동물 혈청, 혈청 분획물, 조직 추출물 가수분해물과 펩톤 등을 포함하지 않는 배지이다.
본 발명에 있어서, 상기 DHFR 유전자가 결핍된 CHO 세포주는 K1 유래 또는 PRO-3 유래인 것에서 선택될 수 있다. 상기 K1유래 CHO 세포주는 UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 및 DUKX 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 상기 PRO-3 유래 CHO 세포주는 UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 및 DG46 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
배지
목적하는 물질을 세포배양을 통하여 생산하기 위해서는, 배지 성분을 최적화하는 것이 매우 중요하다. 세포가 높은 농도로 자랄 수 있도록 하기 위하여 배지 안의 성분이 무조건 많거나 농도가 높다고 바람직한 것은 아니다. 오히려, 배지 성분이 높은 만큼, 배지의 삼투압이 높아져서 세포에게 독성으로 작용할 수 있기 때문이다. 통상의 배지는 동물의 혈청이 풍부한 단백질과 호르몬을 갖추고 있긴 하지만, 동물성 단백질이 배지에 존재하면, 세포에서 생산된 물질, 예컨대 단백질을 실제 임상적으로 이용시 문제점을 발생할 수 있다. 따라서, 배지에는 혈청이 존재하지 않지만, 혈청을 충분히 대체할 수 있는 모든 성분이 존재해야 한다. 즉, 탄수화물, 아미노산, 이온, 비타민 등 세포가 성장할 수 있을 정도의 최적 농도로 포함되어 있어야 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 화학 조성 배지인 것을 특징으로 한다.
상기 화학 조성 배지는 단백질 가수분해물이 포함되어 있지 않은 배지로서, hypoxanthine 및 thymidine이 포함되고, 아미노산, 비타민, 탄수화물, 무기염류, 유기산, 미량원소, 성장인자, 호르몬 등으로 구성된 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 지질 혼합물이 포함될 수 있으며, 합성 지질 혼합물 또는 동물 유래 지질 혼합물, 예컨대 cod liver oil 일 수 있다.
상기 배지는 아미노산, 비타민, 탄수화물, 완충용액, 미량원소 등으로 이루어진 화학 조성 기본 배지에서 세포 성장 유도를 위한 화학 물질 보강 시 첨가 화학 물질에 불순물로 임의의 THF가 포함될 수도 있는데, 이 경우 THF의 농도는 세포 성장에 향상에 영향을 주는 농도 범위 이하의 조건을 의미하며, 0.1 mg/L 이하의 농도이다.
상기 화학 조성 배지에는 시중에서 시판되는 상업용 배지를 포함하며, 예를 들면 PowerCHO-2 CD 배지, HyCell CHO 배지, CDM4CHO 배지, CD OptiCHO 배지, EX-CELL CD CHO 배지, ProCHO5 배지가 있다. 상기 화학 조성 배지는 동물유래 성분이 포함되거나 또는 포함되지 않을 수 있으며, 혈청이 포함되거나 또는 포함되지 않을 수 있다.
첨가물
본 발명에 따르면, 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(THF)를 첨가함으로써 포유동물 세포가 고효율로 현탁 적응기간이 단축된 개선된 배지를 제조할 수 있다. 여기서 첨가되는THF의 농도 범위는 0.1 내지 160 mg/L인 것을 특징으로 한다.
상기 테트라하이드로폴레이트는 세포 내에서 dihydrofolate reductase와 NADPH에 의해 엽산으로부터 생성된다. 세포 내에서는 tetrahydrofolate 유도체로 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, 5,10-methenyl-THF 등이 존재하며 이러한 성분들이 서로 전이나 환원반응에 의해서 변함과 동시에 포르밀기, 히드록시 메틸기, 메틸기 등을 주고받는 중간체로서 각종 효소반응에서 조효소로 기능한다. 특히, purine, pyrimidine, glycine의 생합성에 관여하여 메틸기를 공급하는 역할을 한다.
본 발명에 따르면, 첨가물로서, 테트라하이드로폴레이트(tetrahydrofolate: THF)의 그 전구체 또는 유도체도 포함한다.
상기 THF의 전구체는 세포에서 folate 이 후 tetrahydrofolate으로 전환될 수 있는 물질로 dihydrofolate, disodium dihydrofolate, dilithium dihydrofolate, dipotassium dihydrofolate, calcium dihydrofolate, magnesium dihydrofolate 등 1가 및 2가 양이온들과 결합된 dihydrofolate 염의 형태를 갖는 물질 및 dihydrofolate의 유도체 등일 수 있다.
상기 THF의 유도체는 세포 내에서 tetrahydrofolate로 전환될 수 있는 생리적인 기능을 하는 5-formyl-THF, 5-methyl-THF, 10-formyl-THF, 5,10-methylene-THF, 5,10-methenyl-THF, 5-formimino-THF 등의 물질, disodium 5-methyl tetrahydrofolate, calcium 5-formyl-tetrahydrofolate 등 1가 및 2가 양이온들과 결합된 tetrahydrofolate 유도체 염의 형태를 갖는 물질 또는 tetrahydrofolate의 기능을 대신하는 물질들일 수 있다.
목적 물질의 생산 방법
본 발명에 따른 세포에서 목적 물질을 생산하는 방법은 다음 단계를 포함한다.
(a) 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(THF) 또는 이것의 전구체 또는 유도체를 첨가하는 단계;
(b) 상기 배지에 유전자 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 배양하는 단계;
(c) 상기 세포가 목적 물질을 발현하는 단계; 및
(d) 상기 세포로부터 목적 물질을 분리하는 단계
상기 목적 물질은 단백질, 세포, 바이러스 또는 유전체일 수 있다.
상기 (b) 단계에 있어서 유전자 재조합 벡터 형질주입시 electroporation, lipofectamine 등이 사용되며 형질주입시 세포막손상과 같은 문제로 인하여 세포가 회복하는 과정이 필요하다. 이러한 과정은 일반적으로 혈청이 포함된 배지에서 부착 배양으로 이루어지며 일부의 경우 화학 조성 배지에서도 시행되고 있으나 세포의 안정적인 성장을 위하여 우수한 세포 성장 성능을 갖는 배지의 확보가 필요하다. 본 발명의 THF 첨가 배지의 경우 다양한 화학 조성 배지에서 세포 배양 성능이 향상되므로 (b)의 과정에서 화학 조성 배지 사용 가능성을 높여 줄 것이다.
CHO 세포를 이용한 목적 단백질 생산 방법은 1) 재조합 세포주 제작: host 세포에 재조합 유전자 형질주입, 고생산성 세포주 선별, 2) 선별된 세포주에 적합한 배양 공정확립->선별 재조합 세포주에 적합 배지 선정, 배양 조건 확립: 배양 온도, 농축첨가물 조성확립, 첨가 시기 및 첨가량 확립 3) 상기 세포로부터 재조합 단백질 분리 정제 단계로 나누어 진다. 여기서, 2)의 경우 단위 배지당 고생산성 배양 조건이 선호되며 주로 유가식 배양 공정을 사용한다. 이 공정에서는 재조합 단백질의 안정적인 생산성을 갖는 세포주를 이용하여 세포의 농도 증가 및 배양기간 향상을 통해 이루어지며 이를 위해서는 세포 배양 배지와 농축 첨가물의 선정이 가장 중요한 요소이다. 이들 배지와 농축 첨가물은 단위 배지당 높은 생산성을 위해서 세포의 대사과정을 통해 스스로 만들어 사용할 수 있는 비필수아미노산, DNA 전구체 (뉴클레어타이드, 뉴클레어사이드) 등의 물질들이 첨가될 뿐만 아니라 단백질 및 효모 가수분해물 같은 복합 물질이 첨가한다. 따라서 화학 조성 배지 및 농축 첨가물을 사용하는 유가식 공정에서는 THF의 기능이 추가적으로 요구될 가능성이 높다.
DHFR이 결여된 CHO 세포는 배지에 glycine, hypoxanthin, 그리고 thymidine을 넣어주어야만 자랄 수 있다. 목적 유전자와 DHFR 유전자를 함께 CHO 세포에 넣고, glycine, hypoxanthin, 그리고 thymidine이 들어가지 않은 배지에서 키우게 되면, DHFR 유전자가 들어간 세포만 선택적으로 자라게 된다. 여기에, DHFR 억제제로서, methotrexate의 농도를 조금씩 높여가면서 첨부하여 DHFR 유전자가 증폭되어 있는 세포만을 선별할 수 있다. 선별된 세포주는 목적 단백질을 생산할 수 있는 고효율성 세포주가 될 수 있다.
DHFR 유전자가 결핍된 CHO 세포주는 목적 단백질을 생산하기 위하여 산업적으로 널리 사용되고 있다. 목적 단백질에 대한 유전자를 DHFR(+)가 든 벡터에 클로닝하고 DHFR 결핍된 CHO 세포에 형질주입(transfection) 한 후 MTX를 이용하여 유전자를 증폭 시킴으로써 목적 단백질을 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 목적 물질의 제조 방법은 세포의 배양 배지로서 화학 조성 배지에 THF를 첨가물로 포함하는 배지를 사용함으로써 DHFR 결여 CHO 세포에서 고효율로 생산할 수 있다. 즉, 재조합 세포주는 host 세포에 형질주입 후, 고성장 및 고생산성을 갖는 세포주를 선별한다. 재조합 세포주는 hypoxanthine과 thymidine이 배제된 배지에서 선별과정이 이루어지므로 세포의 성장을 위해서는 DHFR의 작용이 필요하다. 재조합 유전자 증폭 및 재조합 세포주 선별을 위해서 DHFR에 대한 folate의 효소기질 저해제로 MTX를 사용하는 데, THF를 배지에 첨가하게 되면은 MTX에 의한 선별 및 유전자 증폭 과정에서 MTX의 효과가 낮아질 것으로 예상되나, 재조합 세포주 선별 과정은 주로 혈청 배지에서 부착으로 배양하여 colony 선별 과정을 포함한다. 혈청에는 복합 물질로 잠재적으로 THF가 포함되어 있을 것으로 생각되므로, 재조합 세포주 선별 중 화학 조성 배지 도입 시 혈청 배제로 인한 낮은 성장성에 대한 개선 효과를 기대할 수 있으므로 MTX 효과 감소에 대한 문제점을 상쇄시키는 효과가 있을 것이다. 따라서, THF를 첨가물로 포함하는 배지를 사용함으로써 고생산성 세포주 선별이 가능함으로써 DHFR 결여 CHO 세포에서 고효율로 생산할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
세포주 및 실험방법
1. 세포주 및 배지: DHFR 결핍 세포주로 CHO DG44 세포주를 사용하였으며 화학 조성 배지 HY-CDM (in-house) 배지에서 80계대 이상 현탁 적응시킨 세포주를 활용하여 tetrahydrofolate (THF) 및 dihydrofolate (DHF) 영향 및 상용 화학 조성 배지에서 성장특성 평가에 사용하였다. HY-CDM 배지는 화학 조성 성분만으로 이루어졌으며, 성장인자 1종이 포함되어 있다. 실시예 1 및 3 및 4에 사용된 배지는 동물유래 지질 복합물이 첨부되지 않는 HY-CDM이고, 실시예 2에서 사용된 배지는 cod liver oil이 첨가된 HY-CDM 이다.
2. 세포 현탁 배양법: 세포주는 4105 cells/ml의 접종농도로 30 ml/125 ml Erl. flask의 working volume, 교반 속도 120 rpm의 orbital shaker, 배양온도 37, 5% CO2, 습윤하 조건에서 배양하였으며 각각의 실험 조건에서 세포 접종 및 계대는 1,000 rpm (162 g)에서 5 분간 원심분리하여 상등액 제거하고 가온된 배지로 단일 세포로 분산 후 접종 세포로 사용하였다. 각각의 상용 배지 및 실험조건에서 잔존 배지의 영향을 최소화 하고자 각각의 조건에서 3 계대 배양하여 평가하였다.
3. 생세포 농도 분석: 생세포 농도는 hemocytometer (Neubauer improved bright-line, Marienfeld, Germany), 역상 현미경 (CK30, Olympus, Japan) 및 trypan blue dye exclusion법을 이용하여 분석하였다.
[실시예 1]
THF 유효 농도 범위의 결정
실시예 1은 HY-CDM 배지에서 THF 첨가에 따른 CHO DG44 세포주 현탁 성장을 유도하는 THF의 유효 농도 범위를 평가하고자 하였다.
HY-CDM 배지에서 세포 성장 유도에 효과적인 THF의 농도 범위를 평가하고자 0480 mg/L 농도 범위에서 3 계대 세포 배양을 진행하고 최대세포농도와 doubling time을 측정하였다.
THF 0.10.2 mg/L 첨가 조건에서는 약 35% 이상 세포 성장이 증가되며 0.4, 0.8, 160 mg/L에서는 각각 약 56%, 73%, 90% 증가된 세포농도를 나타낸다. 특히 1.616 mg/L 첨가조건에서는 약 155% 이상 증가된 최대세포농도를 보이나 480 mg/L 첨가된 조건에서는 세포 성장이 억제된다. 따라서 화학 조성 배지에서 THF 첨가에 따른 세포 성장 향상 효과는 0.1160 mg/L가 유효하다 (표 1).
아래 표 1에는 THF의 농도 및 계대 배양에 따른 최대세포농도가 기재되어 있다.
THF 0.02516 mg/L 첨가 조건에서는 21.30.7 h의 doubling time으로 control 대비 약 14% 이상 빠른 세포 성장을 나타낸다 (표 2).
아래 표 2에는 THF의 농도에 따른 doubling time 변화가 기재되어 있다.
[표 1]
Figure PCTKR2015001697-appb-I000001
[표 2]
Figure PCTKR2015001697-appb-I000002
[실시예 2]
THF 첨가 배지에서 계대 배양 특성
THF가 1.6 mg/L 첨가된 HY-CDM 배지에서 냉동 보관된 CHO DG44 세포주의 해동 후 배양 2일 마다 계대 배양한 결과 3 계대 이후 배양 2일째 21.92.2105 cells/ml의 세포농도와 20.31.3 h의 doubling time으로 control의 17.13.4105 cells/ml 세포농도와 25.33.7 h의 결과 대비 약 28% 높은 세포 농도와 약 20% 빠른 세포 성장을 나타낸다 (표2). 실시예 2에서 사용된 HY-CDM 배지는 동물 유래 성분 (Cod liver oil)이 포함된 상용 지질 혼합물을 첨가한 것이다.
아래 표3에는 THF가 첨가된 HY-CDM 배지에서 계대 배양에 따른 세포 성장 특성의 변화를 기재하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2015001697-appb-I000003
[실시예 3]
상용 화학 조성 배지에서 THF 첨가에 따른 CHO DG44 세포주 성장
(1) 상용 화학 조성 배지의 선정
THF 보강에 따른 세포 성장 유도 효과의 범용성을 평가해보고자 상용 화학 조성 배지 6 종을 선정하고 THF 첨가 유무에 따른 효과를 평가하는데 사용하였다. 사용된 화학 조성 배지의 주요 특징은 다음과 표 4와 같다.
[표 4] 상용 화학 조성 배지의 주요 특징
Figure PCTKR2015001697-appb-I000004
(2) 상용 화학 조성 배지에서 THF 첨가에 따른 세포 성장 유도 효과
THF 첨가 유무에 따른 세포 성장 유도는 6 종의 상용 화학 조성 배지에서 모두 세포 농도 및 성장 속도 증가를 나타내므로 DHFR 유전자가 knockout된 CHO 세포주의 화학 조성 환경에서 성장 향상을 위하여 범용적으로 적용 가능한 유용한 물질로 평가된다 (표 5).
아래 표 5에는 실시예 3에서 사용한 사용배지가 구분되어 표시되어 있으며, 표5에 따른 배지 조건에서 최대 세포 농도가 표 6에 기재되어 있고, 그 doubling time이 표 7에 기재되어 있다.
[표 5]
Figure PCTKR2015001697-appb-I000005
[표 6]
Figure PCTKR2015001697-appb-I000006
[표 7]
Figure PCTKR2015001697-appb-I000007
그 결과를 보면, THF 1.6 mg/L 첨가 PowerCHO-2 CD 배지(M1T)에서는 최대세포농도가 21.04.9105 cells/ml이고, doubling time이 23.85.6 h이었다. THF 무첨가 대비 약 46% 높은 세포 농도와 24% 빠른 세포 성장을 나타냈다. THF 1.6 mg/L 첨가 HyCell CHO 배지(M2T)는 최대세포농도가 30.71.2105 cells/ml이고, doubling time이 21.71.4 h으로, THF 무첨가 대비 약 200% 높은 세포 농도와 46% 빠른 세포 성장을 나타낸다. THF 1.6 mg/L 첨가 CD OptiCHO 배지(M3T)는 최대세포농도가 13.91.5105 cells/ml, doubling time이 34.43.0 h이고, THF 무첨가 조건은 세포 성장이 3계대 배양에서는 이루어지지 않았다. THF 1.6 mg/L 첨가 CDM4CHO 배지(M4T)는 최대세포농도가 42.62.8105 cells/ml, doubling time이 21.12.0 h이며, THF 무첨가 대비 약 200% 높은 세포 농도와 21% 빠른 세포 성장을 나타낸다. THF 1.6 mg/L 첨가 EX-CELL CD CHO 배지(M5T)는 최대세포농도가 16.93.0105 cells/ml, doubling time이 28.13.8 h이며, THF 무첨가 대비 약 40% 높은 세포 농도와 34% 빠른 세포 성장을 나타낸다. THF 1.6 mg/L 첨가 ProCHO5 배지(M6T)는 최대세포농도가 12.91.7105 cells/ml, doubling time이 37.25.9 h이고, THF 무첨가 대비 약 20% 높은 세포 농도와 4% 빠른 세포 성장을 나타낸다.
[실시예 4]
DHF 첨가 배지에서 세포주 성장
HY-CDM에서 가장 우수한 세포 성장 유도 효과를 나타내는 0.8, 1.6, 16 mg/L (각각 몰농도로 1.8, 3.6, 35.9 M에 해당함)의 THF와 분자량을 고려한 동량의 DHF 첨가시 3.6과 35.9 M의 DHF 첨가 조건에서 각각 11%, 24% 향상된 세포 성장이 측정되었다 (표 8). DHF의 세포 성장 향상 효과는 THF 대비 약 7배 낮은 효과를 나타낸다.
[표 8]
Figure PCTKR2015001697-appb-I000008
본 발명은 화학 조성 배지에서 최대 세포 농도 증가 및 배가 시간 (doubling time) 감소의 세포 성장 개선을 통하여 현탁 적응기간이 짧거나 필요 없는 배지 성능 개선을 위한 배지 첨가물을 제공함으로써, 이러한 배지 첨가물을 통한 세포 배양에 의하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공할 수 있다.

Claims (21)

  1. 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(THF) 또는 이것의 전구체 또는 유도체를 첨가한 세포 배양용 배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  3. 제2항에 있어서, 상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 DHFR 유전자의 기능이 결손 또는 약화된 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  4. 제2항에 있어서, 상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  5. 제4항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  6. 제5항에 있어서, 상기 CHO 세포는 UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 및 DUKX 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  7. 제5항에 있어서, 상기 CHO 세포는 UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 및 DG46으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  8. 제1항에 있어서, 상기 THF 또는 이것의 전구체 또는 유도체의 농도 범위는 0.1 내지 160 mg/L인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 THF의 전구체는 디하이드로폴레이트, 디소듐 디하이드로폴레이트, 디리튬 디하이드로폴레이트, 디포타슘 디하이드로폴레이트, 칼슘 디하이드로폴레이트 및 마그네슘 디하이드로폴레이트로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 THF의 유도체는 5-포밀-THF, 5-메틸-THF, 10-포밀-THF, 5,10-메틸렌-THF, 5,10-메테닐-THF, 5-포미미노-THF, 디소듐 5-메틸 테트라폴레이트, 칼슘 5-포밀-테트라하이드로폴레이트로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지.
  11. 세포에서 목적 물질의 생산 방법에 있어서,
    (a) 화학 조성 배지에 테트라하이드로폴레이트(THF) 또는 이것의 전구체 또는 유도체를 첨가하는 단계;
    (b) 상기 배지에 유전자 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 세포가 목적 물질을 발현하는 단계; 및
    (d) 상기 세포로부터 목적 물질을 분리하는 단계
    를 포함하는 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 목적 물질은 단백질, 세포, 바이러스 또는 유전체인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 세포는 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 DHFR 유전자의 기능이 결손 또는 약화된 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 테트라하이드로폴레이트 영양요구성 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 CHO 세포는 UKB25, DUK22, DUK51, DUK-D1, DUK-S1, DUK51-R1, DUK51-R2, DUK22-R1, DUK22-R2, DXBA, DXE11, DXC11, DXB11 및 DUKX 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 CHO 세포는 UA2, UA4, UA21, UA41, DU5, DU11, DG21, DG22, DG23, DG24, DG41, DG42, DG43, DG44, DG45 및 DG46 으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 THF 또는 이것의 전구체 또는 유도체의 농도 범위는 0.1 내지 160 mg/L인 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  20. 제 11 항에 있어서, 상기 THF의 전구체는 디하이드로폴레이트, 디소듐 디하이드로폴레이트, 디리튬 디하이드로폴레이트, 디포타슘 디하이드로폴레이트, 칼슘 디하이드로폴레이트 및 마그네슘 디하이드로폴레이트로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
  21. 제 11 항에 있어서, 상기 THF의 유도체는 5-포밀-THF, 5-메틸-THF, 10-포밀-THF, 5,10-메틸렌-THF, 5,10-메테닐-THF, 5-포미미노-THF, 디소듐 5-메틸 테트라폴레이트, 칼슘 5-포밀-테트라하이드로폴레이트로 구성된 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 생산 방법.
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