CN1705749A - 氨基葡萄糖苷抗性基因的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氨基葡萄糖苷抗性基因用于实现动物细胞的高密度生长的应用。

Description

氨基葡萄糖苷抗性基因的应用
本发明涉及生物技术的蛋白质表达领域。特别涉及氨基葡萄糖苷抗性基因，尤指新霉素抗性基因，在实现动物细胞的高密度生长中的应用，以及蛋白质生产方法及高密度细胞培养物。
生物技术上以动物细胞培养方式生产治疗用蛋白质是一项非常费力且昂贵的工作。包括下游加工之生产效率主要系受到最初细胞培养步骤之空间-时间产率支配。自当希望同时使培养物肉汤中之产物蛋白达到高产率及高浓度。结果，在进入工业规模细胞培养之生产稳定期前使最大细胞密度达到较少量增加，将可希望使总产量增加，此仅因为于此方式中加入大量细胞总数。
强硬地视细胞种类及培养方法而定，习知适用于高密度生长之补料-分批培养系统例如气升式反应器并无法使生长中不含血清的细胞培养物达到或甚至高于107细胞/毫升的密度。有可能于补充血清之补料-分批培养系统或于最近之灌输反应器系统中达到较高密度。但是，该二种选择皆留下严重的缺点。经补充以胎牛血清的培养基包含所有天然生长促进物质，其强烈依赖血清来源品质且(最重要的)具有无心地将动物病毒导入生产供医疗应用之治疗性蛋白质的培养物中的永久性危机。因此基于调节性理由，须避免血清补充。
然而，灌输反应器系统较习知补料分批培养系统更为复杂，并需要在操作期间加以控制且在操作上更昂贵。此系由于必须永久灌输新鲜培养基，其需要最新式微过滤系统以供自该反应器平行释出培养基。若过滤单元受细胞碎片或蛋白质阻塞，则易使操作过程发生提早停滞的危险。比较上，补料分批培养在制程经济学及耐用性方面具有显著优势。
而且，产生可制造所兴趣蛋白质之稳定重组细胞株，需要导入至少一种通常被固有表达的抗性标记基因。此类标记基因之表达可能对细胞造成最好不会冲击其生长行为的额外负担，其或甚至在富含血清补充的细胞培养基中亦可能有害地影响生长速率及最大存活细胞密度(Gaigle等，1999，氨基葡萄糖苷抗生素磷酸转移酶亦为丝氨酸蛋白质激酶【Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are alsoserine protein kinases】，Chemistry and Biology 6，11-18；Maio等，1991，人类巨噬细胞及表达氨基葡萄糖苷抗生素磷酸转移酶活性之畸胎癌细胞系中由蛋白质激酶C所介导的基因活化【Gene activation mediated by protein kinase Cin human macrophage and teratocarcinoma cells expressing aminoglycosidephosphotransferase activity】，J.Cell.Physiology 149，548-559；Southern等，1982，哺乳细胞于SV40早期区域启动子调控下经细菌基因转化成具抗生素抗性【Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with abacterial gene under control of the SV40 early region promoter】，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)。
本发明的目的在于避免先前技术所产生之缺点，并提供一种使细胞于不含血清的培养系统中生长达高细胞密度的方法。此目的系通过于动物细胞中表达氨基葡萄糖苷抗性基因，其后将该等细胞培养于适当培养基及如权利要求1、2、8等独立所述的适宜培养系统中而实现。意外地，视习用于该项技术的培养方法及培养基而定，经根据本发明处理的细胞可于不含血清的细胞培养基中生长达到较其未经处理的亲本细胞系高出甚多之密度。此外，亦观察到稳定期生长有些许延长。以此方法，可于不含血清的培养基中达到最大存活细胞密度，其在本发明的前所无法理解的。
本发明的可能实施方案显示于图示中。其中
图1：Neo-转化的NSO细胞在101补料分批气升式反应器系统中生长期间之存活细胞密度，与亲本及bcl-2转化细胞系的比较。
图2：Neo-转化的NSO细胞在101补料分批气升式反应器系统中生长期间所表达呈累加细胞时间之分泌抗体的产量，与bcl-2转化细胞系的比较。
图3：质粒图谱pEF-bcl-2
图4：质粒图谱pEF-Neo
图5：以NSO细胞系适应非致死剂量G418之比较性生长实验。
图6：Neo-转化的NSO细胞系之摇瓶分批培养及产量，与亲本及bcl-2转化细胞系的比较。
根据本发明，氨基葡萄糖苷抗性基因产物系用于增进动物细胞的高密度生长。该项根据本发明的应用包含于细胞中表达该抗性基因产物，以其氨基葡萄糖苷会被该相对应抗性基因产物分解之氨基葡萄糖苷抗生素(优选以抗生素新霉素)检选出表达此类抗性基因产物的细胞，及最后于生物反应器例如气升式或搅拌型生物反应器中，于适宜不含血清的细胞培养基中将此类细胞活化以达高密度生长。
根据本发明的抗性基因产物为任意氨基葡萄糖苷抗性标记，例如已知对庆大霉素、新霉素、潮霉素(且尤其是新霉素)的抗性基因，其可用做真核细胞之基因标记。氨基葡萄糖苷抗性基因一般用于真核细胞分子生物学中且经描述在许多标准教科书及实验手册中(例如，Shaw等，1993，氨基葡萄糖苷抗性基因之分子遗传学及氨基葡萄糖苷-修饰酵素之家族关系【Molecular genetics of aminoglycosideresistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes】，Microbiol.Rev.57：138-163；WO 82/03087；Southern等，1982，哺乳细胞于SV40早期区域启动子调控下经细菌基因转化成具抗生素抗性【Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with abacterial gene under control of the SV40 early region promoter】，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)。如上所推论得，氨基葡萄糖苷抗性基因产物以其根据本发明的氨基葡萄糖苷分解活性的观点而言，系一种功能性之基因产物。因此依上述概念，亦可将已知氨基葡萄糖苷抗性基因产物之经遗传工程改造所得的有义功能性变体用于本发明。此类变体可例如通过分别对胺基酸及其编码DNA序列进行取代、缺失、插入或截断而产生。此等方法为该项技术所熟知且通常包含定点突变或经由其随机突变产生多样性，然后再以功能分析之方式筛选得所希望的变体。用于产生突变之例行方法可为例如暴露至烷化剂或UV照射、进行易错PCR或相关之基因改组PCR技术，且通常在微生物中完成(Miller，J.，分子遗传学实验【Experiments in Molecular Genetics】，冷泉港实验室1972；Ling等，1997，DNA致变方法【Approaches to DNA Mutagenesis】，分析生物化学254，157-178；Cadwell等，1992，通过PCR致变作用之基因随机化：于PCR方法【Randomizationof genes by PCR mutagenesis in：PCR Methods】，冷泉港实验室出版1992；Moore等，1997，蛋白质功能活体外演化之策略【Strategies for the in vitro evolutionof protein function】，J.Mol.Biol.272，336-347)。
方便上，系从适用于真核细胞表达且经已知技术转染入细胞中的DNA表达构体表达该抗性基因产物；可固有表达该抗性基因产物或可诱发其表达或压制，亦即可以其中任一种方式调控表达。至少于以氨基葡萄糖苷抗生素进行筛选期间，及于高密度细胞培养系统中达到最大细胞密度之对数增长期间，应根据本发明表达该抗性基因。优选在例如胸苷激酶(TK)或猴病毒(SV40)晚期启动子调控下固有表达，最优选在在真核细胞中恒定具活性之强病毒增强子-启动子，例如Rous肉瘤病毒(RSV)-长末端重复序列(LTR)-启动子或巨细胞病毒(CMV)-启动子调控下表达。亦可利用由强病毒启动子之增强子部份与另一启动子，例如提供必要如转录起始区、TATA区框及CAAT区框之α-肌动蛋白启动子之核心启动子部份所构成的嵌合型启动子。
根据本发明的氨基葡萄糖苷为一般已知的氨基葡萄糖苷类抗生素(Mingeot-Leclercq，M.等，氨基葡萄糖苷：活性与抗性【Aminoglycosides：acitvity andresistance】，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43(4)：727-737)，它包含至少一个通过葡萄糖苷键与该分子之另半部结合的胺基-吡喃糖或胺基-呋喃糖。它们的抗生素作用系基于抑制蛋白质合成。例子有卡那霉素、链霉素、庆大霉素、妥布拉霉素、G418(遗传霉素)、新霉素B(法拉霉素)、紫苏霉素、阿米卡星、异帕米星等。
在本发明文中，其他由于抑制细菌蛋白质合成而具有抗生素活性之化合物例如奇放线菌素、茴香霉素与尤其普罗霉素，及具有与非还原性胺基-糖部份相关之化学结构的化合物，亦被认为系根据本发明的“氨基葡萄糖苷抗生素”，诚如该项技术所常为之。须注意，氨基葡萄糖苷类化合物对真核细胞培养物亦具有毒性，部份是因为粒线体的蛋白质转译元件系由原核生物演化而来(粒线体演化之内共生学说)，而亦可能具有其他毒性作用且先前已有描述。
根据本发明，为筛选可表达该抗性基因产物的细胞，遂在转染该抗性基因后至少实施以氨基葡萄糖苷抗生素进行之抗性筛选，其一般须达48小时至数星期。结果，该氨基葡萄糖苷抗性基因被稳定转染至所述细胞系中。稳定的转染株一般在其基因组插入至少一个该氨基葡萄糖苷抗性基因的经表达或可表达拷贝，而产生具功能之基因产物。最近在遗传工程方面可想出的策略，例如于细胞中产生人造、稳定之微型染色体亦包括于目前所提“稳定转染株”的概念中。当然，已知的转染方法例如脂质转染法、DEAE-葡聚糖、Ca-磷酸盐或电穿透都是根据本发明的可用转染方法，应首先将刚经转染的细胞培养于未补充氨基葡萄糖苷的培养基中，然后再于进行筛选时添加此类补料。此未筛选之间隔期系为有效表达该抗性标记基因产物所需，且视细胞种类而定期范围大约从12小时至1-2天。优选地，抗性筛选在转染后进行至少2周，更优选在转染后进行至少5周，最优选在转染后进行至少8周。亦可能于生物反应器中进行发酵期间，在由已添加至该培养基的氨基葡萄糖苷抗生素所产生之压力下延长生长期以进一步培养细胞。亦可在转染株之最初筛选后，在进一步培养期间通过重复添加单一剂量氨基葡萄糖苷，然后将该培养基再以未补充氨基葡萄糖苷的培养基冲净，而间隔地施予短暂筛选压力。优选地，在生物反应器培养期间，该根据本发明的可表达或经表达抗性基因系稳定地整合入基因组中，且该培养在无筛选压力存在下进行。亦即，例如于根据本发明另一优选实施方案之补料-分批生物反应器中进行的细胞培养，在无补充至所述细胞培养基(发酵开始或发酵期间)的氨基葡萄糖苷存在下完成。
优选地，氨基葡萄糖苷的使用浓度为至少0.1毫克/毫升，优选浓度为至少1毫克/毫升，最优选浓度为至少4毫克/毫升。通常，在经用以表达相对应抗性基因产物之表达构体转染后，将此量根据本发明的氨基葡萄糖苷如该项技术所熟知且如标准实验操作手册所述加至细胞培养基中。在另一尤其优选实施方案中，在转染后连续细胞培养期间，使用氨基葡萄糖苷浓度为1至4毫克/毫升达至少2周，更优选达至少5周，最优选达至少8周。
优选地，根据本发明的抗性基因产物为如WO82/03087中所述的新霉素-磷酸转移酶(该抗性基因通常命名为Neor)。此类磷酸转移酶之各种天然同工型为已知，且亦包含在本发明范围中。可使用以G418(遗传霉素，定义于化学摘要注册编号49863-47-0)或新霉素进行之筛选，以挑选出表达该新霉素基因产物的细胞。于一项更优选的实施方案中，系使用G418筛选具抗性的细胞。
根据本发明的动物细胞或细胞系可为任何用于生产重组蛋白质之习知细胞系，例如Sf9昆虫细胞、CHO细胞、Hela细胞、COS-7细胞、VERO-96细胞、HepG2细胞、BHK细胞、成纤维细胞、融合瘤、EBV无限增殖化淋巴母细胞、或“骨髓瘤”细胞例如NSO细胞系。骨髓瘤细胞例如NSO细胞实际上为B-淋巴样细胞，而其于该项技术中惯常被归于“骨髓瘤”(Barnes等，Cytotechnology 32：109-123，2000)。
优选地，根据本发明的动物细胞或细胞系为不依赖贴壁的细胞。此类细胞毋需仰赖基质接触而得以适当生长，且可自由悬浮于培养基中。在更优选的实施方案中，该生产细胞系为淋巴样细胞系例如融合瘤、EBV无限增殖化淋巴母细胞或骨髓瘤细胞，最优选所述细胞系为骨髓瘤细胞且尤其是骨髓瘤NSO细胞，例如细胞系ECACCNo.85110503及其衍生物，可免费索取自欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)，应用微生物学与研究中心，萨里布利，威斯海尔SP4 0JG，英国。已发现NSO可提升相当高的产量，尤其在用于制造重组抗体方面。最标准的NSO细胞系为胆固醇依赖性，使胆固醇成为培养基的必须组成份。
在另一优选实施方案中，根据本发明携带氨基葡萄糖苷抗性基因的细胞为能够进一步表达重组谷胺酰胺合成酶(GS)的细胞系，更优选为NSO骨髓瘤重组型GS细胞系。NSO细胞若与谷胺酰胺合成酶(GS)表达系统使用时则特别有利(Bebbington等，1992，自使用谷胺酰胺合成酶基因做为可扩增可选择标记之骨髓瘤细胞高度表达重组型抗体【High-level expression of a recombinant antibody from myelomacells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selctable marker】，Bio/Technology 10：169-175；Cockett等，1990，于使用谷胺酰胺合成酶基因扩增作用之中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高度表达金属蛋白酶之组织抑制剂【Highlevel expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in ChineseHamster Ovary(CHO)cells using Glutamine synthetase gene amplification】，Bio/Technology 8：662-667)。优选地，所述产物蛋白基因序列及GS基因序列系携带于供产生该经转染NSO细胞系之单一GS质粒载体上，且该等基因系从不同或相同使用(例如)内部核糖体进入位置之启动子表达。GS系统为现今仅两种供制造治疗性蛋白质之特别重要系统其中之一。相较于二氢叶酸还原酶(DHFR)系统，GS系统(且尤指用于与NSO组合之GS系统)于研发期间提供极大时间优势，因为常可自原始转染株群体中产生具高产量的细胞系，而免除需要重复多次渐增筛选剂浓度以达基因扩增之筛选循环(Brown等，1992，供使用谷胺酰胺合成酶(GS)系统制造重组抗体之制程研发【Process development for the production of recombinantantibodies using the glutamine synthetase(GS)system】，Cytotechnology9：231-236)。NSO骨髓瘤细胞在表型上缺乏谷胺酰胺合成酶。因此衍生自小鼠肿瘤细胞系的NSO细胞系(Galfre，G.与Milstein，C.Methods in Enzymol.73，3-75，1981)常在工业规模上被选为利用GS系统的细胞系。此类细胞系的例子是6A1-Neo细胞系，其于2002年8月30依据布达佩斯条约以保藏标号为02083031保藏于欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)，应用微生物学与研究中心，波特丹，萨里布利/威斯海尔SP4 0JG，英国。该已保藏的细胞系缺乏重组型bcl-2，且经进一步描述在实验段落中。此细胞系与任何经工程改造以生产除cB72以外之抗体的亲本子代亦为本发明的优选实施方案。此类工程可包含细胞融合及缄默化或剔除特定基因，以及通过致变方法产生重组体及产生变异株之较传统技术(如前文详述)或使所给细胞培养基保留或改善亲本细胞系生长特性之传统培养基适应技术。
在另一优选实施方案中，根据本发明用以高密度细胞培养的细胞系缺乏经重组表达的bcl-2蛋白质、bcl-x1蛋白质或其他功能性(据了解为防止细胞凋亡)的抑制细胞凋亡-bcl-2家族的天然或经遗传工程改造的变体(Petros等，2001，抗细胞凋亡蛋白质bcl-2之溶液结构【Solution structure of the antiapoptotic proteinbcl-2】，Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.，98，3012-3017)，或bcl-2之种系类似物例如依斯坦巴尔病毒之BHFR-1，或如Petros等(前述)所回顾描述之bcl-2功能类似物。此类优选实施方案可权宜地与另一前述优选实施方案组合，亦即如所了解在发酵期间无筛选压力实则有氨基葡萄糖苷抗生素存在。意外地，已发现氨基葡萄糖苷抗性标记与bcl-2之共表达对根据本发明氨基葡萄糖苷抗性增进性细胞密度之功效而言是一项难题。无意限定于理论，本发明的生长促进作用似乎并非由于抗-细胞凋亡或以bcl-2为主之影响所致，因为在比较性实验中确实观察到，例如bcl-2与Neo之共表达应较欲实现高密度生长之难题更占优势。
适用于哺乳动物细胞系之适宜培养基与培养方法为该项技术所熟知，例如描述在美国专利5633162号。用于实验室培养瓶或低密度细胞培养且适于特定细胞种类所需之标准细胞培养基实例如：罗斯威尔派克纪念协会(RPMI)1640培养基(摩尔，G.，The Journal of the American Medical Association，199，p.519f.1967)、L-15培养基(Leibovitz，A.等，Amer.J.of Hygiene，78，1p.173ff，1963)、Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、Eagle极限必须培养基(MEM)、汉姆氏F12培养基(Ham，R.等，Proc.Natl.Acad.Sc.53，p288ff.1965)、或缺乏白蛋白、转铁蛋白及卵磷脂的Iscoves改进的Eagle培养基(Iscoves等，J.Exp.med.，1，p.923ff.，1978)。已知此等培养基可补充以胎牛血清(FBS，亦称为FCS)，该后者提供许多激素与生长因子来源。
在转染及以氨基葡萄糖苷进行筛选期间，可使用任何适于使所培养的动物细胞持续生长的培养基。为使动物细胞于根据本发明的补料分批生物反应器中达高密度生长，则必须使用高密度生长培养基。
根据本发明，若一种培养基可使动物细胞于习知补料分批生物反应器系统中生长高达或超过存活细胞密度为106细胞/毫升，则该培养基即被定义为高密度生长培养基。在本发明文中，此类培养基再与前述氨基葡萄糖苷筛选组合时甚至可提升较高细胞密度。通常，此类根据本发明的培养基将包含1-10克/升葡萄糖或其他能量来源，于补料-分批培养期间将葡萄糖浓度控制于此浓度。优选地，该培养基将包含至少2克/升葡萄糖，基本上于补料-分批发酵期间被控制于此浓度。该培养基为等张性，亦即范围介于270-320mOsm/公斤，优选为280-300mOsm/公斤。特定细胞种类(例如淋巴样细胞)对某种培养基的个别优选性为该项技术所熟知，且复杂地与各营养物之浓度范围、比例及个别剂量有关。相较于上述标准培养基，一些适用于例如融合瘤的高密度生长培养基的例子描述在GB2251 249 A中；此类高密度生长培养基一般可补充以诸如所有氨基酸、能量来源如葡萄糖(浓度范围如上述)、无机盐类、维生素、微量元素(定义为通常以其最终浓度落于微摩尔体积浓度范围内存在之无机化合物)、缓冲剂、四种核苷类或其相对应之核苷酸、抗氧化剂如谷胱甘肽(还原型)、维生素C及其他组成如重要的膜脂质例如胆固醇或磷脂酰胆碱或脂质前驱物例如胆碱或肌醇等营养物。高密度培养基将富含大多数或所有此等化合物，且它们(除需以其调节实质等张性培养基的重量摩尔渗透浓度的无机盐类以外)的含量将较前述标准培养基更高(增养化)，例如GB2251249与RPMI 1640间之比较。优选地，根据本发明的高密度培养基系以所有氨基酸(除色氨酸外)量高于75毫克/升而均衡地增养化。优选地，结合对一般胺基酸之需求，谷胺酰胺及/或天冬酰胺共同量高于1克/升，更优选为2克/升高密度培养基。无异议地，后述之优选实施方案较不适用于经谷胺酰胺合成酶(GS)载体转染之重组细胞系个案中。于此类细胞系中，过量例如自外加及内在来源产生之谷胺酰胺将导致氨产生(其应避免)。GS转染细胞系的培养条件叙述于下列实施例中。
权宜地，根据本发明的高密度细胞培养基缺乏胎牛血清(FCS或FBS)，称之为“不含血清”。根据本发明不仅希望以不含血清的培养基使存活细胞密度高达或高于107细胞/毫升，亦意外地发现补充胎牛血清在至少某些在本发明文中所测试的细胞系难以实现高密度生长，此与习于该项技术人士所接受之一般概念相左。生长于无血清培养基中的细胞需要胰岛素与转铁蛋白以达最适生长。转铁蛋白可至少部份以非肽类铁载体如WO 94/02592中所述之环庚三烯酚酮取代。大多数细胞系需要一或多种合成型生长因子(包含重组型多肽类)，其包括例如上皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子I及II(IGFI、IGFII)等。可能需要其他类因子其可包括：前列腺素、转运和结合蛋白(例如血浆铜蓝蛋白、高及低密度脂蛋白、牛血清白蛋白(BSA))、激素(包括类固醇激素)及脂肪酸。最好以逐步方式进行多肽因子试验，以测试出该等于其存在下可刺激生长的新颖多肽因子。在动物细胞培养领域中已知有数种可行方法，其中一例即列述于下文中。最初步骤系获得可使细胞从血清-补充培养基传代后存活且/或缓慢生长达3-6天之条件。于大多数细胞种类中，此条件至少部份为接种密度之函数。一旦发现最适激素/生长因子/多肽补充物后，即减少存活所需之接种密度。
在更优选的实施方案中，所述细胞培养基不含生长因子，亦即其中不含胎牛血清或未添加可分别触发讯号传导及细胞周期进行之实质上纯的蛋白质生长因子。此类培养基尚可包含其他蛋白质例如胰岛素或转铁蛋白(可用于自培养基征集铁)、或供递送诸如胆固醇等脂质所需之BSA。更优选地，根据本发明是将此类培养基与淋巴样细胞系结合使用，最优选系与骨髓瘤细胞系(尤其是NSO细胞系)组合。
根据本发明的生物反应器为分批生物反应器，例如惯常用于高密度动物细胞培养之气升式生物反应器或搅拌式生物反应器。方便上，为达高密度细胞培养此类生物反应器将以补料-分批形式操作。此定义亦包括连续型补料操作。优选地，根据本发明的补料-分批生物反应器具有容量氧转质系数KLa(如Bailey，J.等，生化工程原理【Biochemical Engineering Fundamentals】，McGraw-Hill，N.Y.1986中所定义)为至少6h-1，更优选为至少10h-1。最优选地，一种具有该根据本发明优选氧转质特性之补料-分批生物反应器为气升式生物反应器。气升式生物反应器为习于该项技术人士所熟知，且为已知反应器设计之必要参数(其回顾参见，例如Chisti，M.等，1987，气升式反应器【Airlift reactors】，Chem.Eng.Commun.60，195-242；Koch，A.等，1987，气升-循环式反应器之转质测量及模型制作【Measurement and modeling of mass transport in airlift-loop reactors inrelation to the reactor design】，Chem.Ing.Tech.，59，964-965)。虽已自明但仍需在此强调，根据本发明的补料-分批培养并不包含灌输培养系统。
在本发明文中，高密度细胞培养系定义为具有存活细胞密度为至少或高于106细胞/毫升，优选为至少或高于107细胞/毫升，更优选高于1.23×107细胞/毫升，最优选高于1.3×107细胞/毫升的动物细胞群体，且该群体已于细胞培养基中于恒定或渐增培养体积中连续地自单一细胞或接种较低存活细胞密度下生长而得。
在另一优选实施方案中，该补料-分批培养为一种其中除通过分别补料以控制葡萄糖浓度外，亦至少将谷胺酰胺(视需要地与一或数种其他氨基酸，优选为甘氨酸)补料至细胞培养物中(如GB2251 249所述)以维持它们在培养基中所存之浓度的培养系统。更优选地，是将谷胺酰胺视需要地一或数种其他氨基酸之补料与将一或多种能量来源如葡萄糖添补入所述细胞培养物结合，如欧洲专利EP-229 809-A中所述。通常于开始培养后25-60小时进行补料；例如，通常在细胞已达为约106细胞/毫升之密度时开始进行补料。谷胺酰胺及/或天冬酰胺补料(以天冬酰胺替代谷胺酰胺，参见Kurano，N.等，1990，J.Biotechnology 15，113-128)通常系介于0.5至3克(优选为1至2克)每1培养体积之范围内；其他可存在补料中之氨基酸优选为10至300毫克总补料每升培养物，尤其甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸及亮氨酸通常较其他胺基以为至少150至200毫克之较高量进行补料。补料可以喷丸-添加或以连续泵送补料之形式添加，优选为将补料以几近连续地泵送至该生物反应器中。当然在生物反应器中进行补料分批培养期间，须通过添加碱或缓冲剂将pH值控制于所指定最适细胞系生长之近似生理pH值下。当使用葡萄糖作为能量来源时，总葡萄糖补料通常为1至10(优选为3至6)克每升培养物。除包含氨基酸外，该补料优选尚包含范围为5至20克每升培养物之低量胆固醇。
优选地，根据本发明的动物细胞或细胞系为一种(例如)于诱导时制造第二产物蛋白，或能够表达第二产物蛋白之生产细胞系。根据本发明，该第二产物蛋白系为能以高产量制造并获得的蛋白质。其可为任何有兴趣的蛋白质，例如治疗性蛋白质如介白质或酵素，例如酵素抑制剂或抗体或其片段(如fab片段)。其可为重组蛋白质(携带于质粒或另一类包括经遗传工程改造之病毒的载体上)或其可经由任何技术稳定地整合入所述细胞之基因组中。其亦可为天然表达构体例如由血浆或融合瘤细胞所分泌之抗体。所述产物蛋白可包括令多肽自宿主生产者细胞分泌出之讯号序列。其可经固有表达或可经诱导表达。
优选地，所述产物蛋白为重组型蛋白质，最优选为一种自组成启动子表达之重组蛋白质。根据本发明“重组型”意指于细胞系中从原先已通过任意遗传工程技术导入所述细胞系之该相对应基因的至少一个外源拷贝所表达得的蛋白质，而不考虑该蛋白质是否以其至少一个天然存在之拷贝生成于该生产细胞系中。此等重组基因之额外拷贝可例如整合入基因组内或可携带于游离型元件上。可使用稳定或暂时性表达。根据本发明可使用任意表达载体技术，包括经遗传工程改造之病毒。更优选地，该重组型蛋白质为经稳定地整合至染色体的蛋白质。
在本发明另一优选实施方案中，所述产物蛋白为分泌蛋白。更优选地，所述产物蛋白为抗体或经工程改造之抗体或其片段，最优选其为免疫球蛋白G(IgG)抗体。
蛋白质表达之个别方法及进一步基于使用氨基葡萄糖苷抗性基因与前述对应的高密度细胞培养亦为本发明的标的。前文中对于可能及优选实施方案之叙述同样应用于此目的的。
实施例
1.细胞系及质粒的产生
NSO 6A1(100)3细胞系(6A1简称；Lonza Biologics有限责任公司，史罗夫/UK)由经稳定整合之重组谷胺酰胺合成酶(GS)表达构体分泌人-鼠嵌合型IgG抗体(cB72.3)。携带新霉素抗性之重组细胞系系通过将该6A1细胞系以双顺反子表达bcl-2及Neor或仅自单一质粒构体表达Neor的质粒载体转染而得。为产生pEF-Neor，是将得自pMC1neopa(Stratagene)的MC1 Neo多聚A弹夹插入具有填充片段的pEF BOS(Mizushima等，1990，pEF BOS，一种有力的哺乳动物表达载体【A powerfulmammalian expression vector】，Nucleic Acids Research 18，5322)而制得pEFMC1 neo多聚A(Visvader等，Mol.Cell Biol.1995Feb；15(2)：643-41)。图4显示该质粒的图谱。为产生pEFbcl-2-Neor，是将人类bcl-2cDNA(长抗-细胞凋亡转录物，Cleary等，Cell 47：19-28(1986))的EcoRI/Taq I片段亚克隆入经EcoRI/ClaI开环之pIC194(Gene 32：482，1984)中，再切出呈SalI(钝端)/EcoRV片段进一步克隆入pEF-MC1neopA多克隆位点(MCS)的钝端XbaI位置中。因此bcl-2由延伸因子(EF)l-a启动子表达(质粒图谱，图3)。该Neor-表达弹夹(MC1neopA)为pEF-载体之整合部份，虽然在最终所使用之Neo载体构体中EF1-a启动子下的MCS在XhoI位置开环，钝端化且为达适当调控而插入一段得自非-编码序列之300bp随机填充片段(质粒图谱，图4)。根据制造商之操作程序进行由脂质转染试剂(Gibco，派斯利，苏格兰)介导的转染作用。质粒转染株系以1毫克/毫升G418存于补充以5％胎牛血清及其他如泰等(Tey，B.等，于骨髓瘤NSO培养物中由Bcl-2所介导的细胞凋亡抑制作用【Bcl-2mediated suppression of apoptosis in myelomaNSO cultures】，J.Biotechnology，79(2000)，147-159)所述之补料的GMEM培养基(Gibco)中进行筛选。然后将稳定的转染株适应于不含血清的高密度生长培养基EX-CELL 302。
2.高密度补料分批细胞培养
对于高密度细胞培养，是将NSO 6A1亲本细胞系、6A1 Neo-细胞系及6A1bcl-2/Neo对照组细胞系适应于补充以1毫升/50毫升GSEM(GS表达培养基补料，产品编号G9785，Sigma，Poole，UK)的无血清培养基EX-CELL 302(JRH Biosciences股份有限公司，KS/U.S.A.)。在进行传代同时，将25μM MSX及0.7克/升G418补充至该培养基中，但于接种及生物反应器培养基则省略。针对各细胞在生物反应器细胞培养期间之存活细胞密度系显示于图1中。各细胞系之补料分批培养设定如下：
骨髓瘤细胞系生长于含无血清EX-CELL 302培养基的10升气升式发酵槽中。起始细胞群体密度为大约105细胞/毫升取自新鲜之中-指数生长其培养物。待连续生长至密度达约106细胞/毫升后，进行补料之喷丸添加并开始泵送补料(表1)。补料连续进行历时100小时。pH值控制于约pH7。大约每25小时通过计数经锥虫蓝排除法决定的细胞存活度测定培养物密度。为计算总体及存活细胞浓度，遂将经适度稀释之样本以锥虫蓝(Sigma，Poole，UK)稀释，随后使用改进之Fuchs-Rosental血球计数器以显微镜进行检视。使用CASY计数器(基于细胞大小)测量总体及存活细胞浓度以进行复核。
表1
  组成   添加量[毫克/升培养物]   添加模式
 添加物A   L-谷胺酰胺   250-350   当培养物达106细胞/毫升时，以200mM溶液进行喷丸-补料
 添加物B   L-胱氨酸L-酪氨酸L-色氨酸   10-4040-7010-20   当培养物达106细胞/毫升时，以200mM溶液进行喷丸-补料
 添加物C   L-赖氨酸HClL-组氨酸L-精氨酸HClL-甘氨酸L-缬氨酸L-甲硫氨酸L-苏氨酸L-丝氨酸L-异亮氨酸L-亮氨酸L-苯丙氨酸L-谷胺酰胺D-葡萄糖氯化胆碱胆固醇(+BSA)L-肉碱   100-14030-4060-9010-3060-8020-3040-6020-4080-10070-9040-601000-12504000-50005-155-205-20   以溶于PBS之浓缩液进行泵送-补料。当培养物达106细胞/毫升时开始补料
而bcl-2/Neo重组细胞系仅生长至最大存活细胞密度为约107细胞/毫升，相对于泰等所述于血清-补充之补料分批培养中所获得最大细胞密度为＜106细胞/毫升，该Neo重组细胞系可生长至最大密度为1.4×107细胞/毫升(图1)。所计算得的细胞存活度系依上述之锥虫蓝排除法进行测定。
重组抗体之空间时间产率支持该重组型Neo细胞系(图2)。此显示于以生物反应器中之产物力价对培养细胞时间(CCT；单位：109细胞小时/升)所绘制之图中。CCT系经由细胞生长曲线之积分计算得，基本上如Renard等(1988，生物技术简报10：91-96)所述。如图2所示，bcl-2/Neo重组细胞系之平均单一细胞产量为0.260微微克蛋白质/细胞·小时，而Neo细胞系计量为0.210微微克蛋白质/细胞。单一细胞产量(qp)的些微差距显然在总产量层面上高过于存活细胞密度上的差异。
3.基因拷贝数之测定
通过定量PCR分析方法对所保藏的6A1-Neo细胞系测定该新霉素抗性基因之基因拷贝数，其使用6A1亲本做为比较性标准物。测定得基因拷贝数为3.0拷贝(±0.4)。已给予经稳定转染基因之多联体整合，亦即该重组新霉素抗性标记之单一整合作用发生于该6A1细胞系中而未进一步扩增。此与约为25μM MSX之低MSX浓度有关；为可使GS标记基因发生扩增必须施予高出10-20倍高浓度之筛选剂。该分析系由特定合约实验室(Lark Technologies股份有限公司，修斯顿，得克萨斯州)完成。除了测试来自转座子Tn5的新霉素抗性基因外，亦建立以同样方法测定小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶[GAPDH]基因之阴性对照组。使用经克隆的质粒标准物校正该等分析平板。拷贝数计算成每细胞中标靶物(NEO)的数量(MUSGAPDH)，假设标准双套哺乳动物细胞的DNA质量为约6.6微微克，且GAPDH系以两拷贝存在每细胞。如该项技术之例行公事，通过测量260及280nm下之吸光密度以分光光度计定量从细胞萃取出之基因组DNA。为分析新霉素抗性基因拷贝数，遂使用八组由隆萨生物公司所提供之pMC1 neopA质粒的稀释物制作QPCR标准曲线。该系列稀释代表范围从5×106拷贝至49拷贝的质粒DNA。将各标准物稀释于GS-NSO对照组基因组DNA(相当于1000个细胞)中以模拟经粹取细胞系DNA之基质效应。阴性对照组反应不包含模板或其仅含有对照组质粒(5000至50000拷贝)或相当1000GS-NSO细胞(亲本细胞系，约6.6毫微克)的DNA同等物。
通过测定阀值周期(Ct)以95％置信区间决定拷贝数。该Ct为通过探针裂解所产生之报告物萤光乘以设定于基准线以上之固定阀值的分数。各Ct数值之增加代表标的物呈2×增加，假设PCR效率达100％。制备各测试物件DNA之六组独立稀释并重复进行分析。各QPCR反应含有约6.6毫微克之测试样本DNA。该等QPCR系根据TaqManTM Universal PCR Master Mix操作程序(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行组装。将反应进行热循环并通过ABI Prism 7700序列测定系统1.6.3版(Applied Biosystems)收集数据。
4.对比例：6A1亲本细胞在无Neo-抗性基因但有次致死量G418存在下的培养
为排除任何因暴露至G418而非由于经表达的新霉素抗性基因所造成对生长的影响，遂使亲本细胞系6A1适应于含有G418的细胞培养基中。可在未使细胞停止生长之条件下，将G418的含量逐渐增加至浓度为360毫克/毫升G418(Sigma，Poole，UK；注意G418之批次品质会视其来源而有所改变)。生长培养基为补充以6mM谷胺酰胺而不含胎牛血清之最适化NSO细胞专用培养基。相较于bcl-2转染株或未经转染之亲本细胞系6A1，对于6A1-Neo细胞系而言，此无血清培养基可重复性地达到根据本发明的高细胞密度(＞2×107细胞/毫升)。因此，该培养基适用于选择在无新霉素标记基因存在下G418适应之可能影响。
相较于生长于PM1+6mM谷胺酰胺之未经适应之亲本细胞系，生长于G418(-)培养基的已适应细胞对细胞凋亡及坏死性细胞死亡稍较具抗性(数据未示)，但其与亲本细胞系相较时具有较低生长速率及较低最大细胞密度(图5A：NSO 6A1细胞系分批培养物中的存活细胞密度/未经适应之6A1：实心圆形，经适应于360毫克/毫升G418之6A1于有G418存在下(空心圆形)及无G418存在下(实心三角形))。通过将存活细胞数从总体细胞数扣除，而测定得死亡或坏死细胞之数量并以其对总体细胞数之百分比显示图5B中。该项实验结论为，于无新霉素抗性标记存在下暴露至G418可仅视为对细胞凋亡抗性之潜在作用而不能视为增进高密度生长行为的功效。有趣地，经适应细胞系之生物反应器培养物于有360毫克/升G418存在下，甚至使该经适应细胞在无血清PM1培养基中的生长速率及最大细胞密度减至最小。
5.6A1、6A1-Neo及6A1-bcl-2分批培养物中的 qp值
各细胞系已详述于实施例1及2中；如实施例2所述进行细胞培养，惟系以于摇晃烧瓶中进行单次分批培养取代前述于气升式发酵槽中进行的补料-分批培养。通过于Elisa测试中分析等量取样自培养物之cB72.3分泌量而测定单一细胞产量。对各等量计数存活细胞数并悬浮于新鲜培养基中置入96槽平盘达一段预定时间。于约80小时采样培养物样本并收取细胞(约240小时)。结果显示于图6B中。基于经由锥虫蓝排除法校正所得存活细胞密度绘制的生长曲线显示于图6A中(空心圆形：6A1-Neo，实心三角形：6A1-bcl-2，实心圆形：6A1-(100)3)。该6A1-Neo细胞系恒定地显示具有较该6A1-bcl-2细胞系高的单一细胞产量qp。该亲本6A1细胞系具有曾经较高之qp值，而此系由于被其低甚多的生长位势负平衡所致。

Claims (12)

1.一种蛋白质表达法，其特征在于，所述方法包括将经氨基葡萄糖苷抗性基因转染且能够表达第二产物蛋白，优选为重组型产物蛋白，的动物细胞在不含血清的高密度生长培养基中生长至存活细胞密度达至少或高于106个细胞/毫升，优选为至少或高于107个细胞/毫升的步骤，并进一步包括将所述产物蛋白自该培养物肉汤单离的步骤。
2.氨基葡萄糖苷抗性基因产物在实现动物细胞高密度生长中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述动物细胞为淋巴样细胞，更优选为骨髓瘤细胞，最优选为NSO细胞。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高密度生长为存活细胞密度高于106个细胞/毫升，优选为高于107个细胞/毫升。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗性基因产物为新霉素抗性基因产物，所述细胞经携带可表达新霉素抗性弹夹的DNA转染，然后通过将其与浓度为至少1毫克/毫升的新霉素或，优选地，G418培育于细胞培养基中而筛选出具有新霉素抗性表型的细胞。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，进行新霉素抗性筛选后，所述细胞进一步于补料-分批生物反应器系统中培养至高密度。
7.抗生素氨基葡萄糖苷在实现动物细胞高密度生长中的应用。
8.一种高密度细胞培养物，它包含存在于液体培养基、补料-分批生物反应器、高密度生长无血清细胞培养基中的动物细胞，其中，所述细胞培养物的存活细胞密度高于106个细胞每毫升，优选为高于107个细胞每毫升。
9.如权利要求8或9所述的细胞培养物，其特征在于，所述培养物已通过将存活骨髓瘤细胞密度低于107个细胞每毫升的细胞接种物进行生长获得。
10.如权利要求8或9所述的细胞培养物，其特征在于，所述细胞携带一种氨基葡萄糖苷抗性标记基因。
11.如权利要求10所述的细胞培养物，其特征在于，所述细胞已在经可表达氨基葡萄糖苷抗性标记基因转染后用补充至该培养基的氨基葡萄糖苷抗生素处理。
12.如权利要求8所述的细胞培养物，其特征在于，所述细胞缺乏重组型bcl-2或其功能性变体。
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