ES2269807T3 - Uso de genes de resistencia a aminoglucosidos. - Google Patents

Abstract

Método de expresión de proteínas, que comprende la etapa de a. cultivar una línea celular animal a una densidad de células viables de al menos 107 células/ml o superior en un medio de cultivo de crecimiento de alta densidad sin suero en un biorreactor semicontinuo, transfectándose dicha línea celular con un gen de resistencia a aminoglucósidos expresable y transfectándose con una glutamina sintetasa expresable, y siendo capaz adicionalmente dicha línea celular de expresar un producto proteico, y que comprende adicionalmente la etapa de b. aislar el producto proteico del caldo de cultivo.

Description

Uso de genes de resistencia a aminoglucósidos.

La presente invención se refiere al campo de expresión de proteínas en biotecnología. Específicamente se refiere al uso de genes de resistencia a aminoglucósidos, en particular del gen de resistencia a neomicina, para conseguir un crecimiento de alta densidad de células animales, a un método respectivo de producción de proteínas y a un cultivo celular de alta densidad.

La producción biotecnológica de proteínas terapéuticas mediante cultivo de células animales es una tarea muy laboriosa y costosa. La eficacia de producción incluyendo el procesamiento posterior está gobernada principalmente por el rendimiento espacio-tiempo de la etapa de cultivo celular inicial. Se desean tanto altos rendimientos como altas concentraciones del producto proteico en el caldo de cultivo. Como consecuencia, aumentos comparativamente pequeños en la densidad celular máxima conseguida antes de entrar en la fase estacionaria aún productiva de cultivos celulares a escala industrial se traducirán en un aumento considerable de la productividad global, debiéndose esto simplemente a la gran cantidad total de células añadidas de este modo.

Al depender enormemente del tipo celular y del método de cultivo, los sistemas de cultivo semicontinuos convencionales optimizados para un crecimiento de alta densidad tales como reactores de ascenso por aire (airlift) no podrían conseguir el crecimiento de cultivos celulares sin suero a una densidad de hasta o incluso superior a 10^{7} células por ml. Se pueden conseguir densidades mayores en cultivo semicontinuo suplementado con suero o en los sistemas de reactor de perfusión más modernos. Sin embargo, las dos opciones implican graves inconvenientes. La calidad del medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal que incluye una serie completa de sustancias promotoras del crecimiento naturales depende enormemente de la fuente de suero y, lo que es más importante, lleva el riesgo permanente de introducir de forma involuntaria virus animales en cultivos que producen proteínas terapéuticas para aplicaciones médicas. Por tanto, por razones de regulación, debe evitarse el suplemento con suero.

Sin embargo, los sistemas de reactores de perfusión son mucho más complejos, requieren un control durante el funcionamiento y este funcionamiento es mucho más costoso que los sistemas de cultivo semicontinuos convencionales. Esto se debe a la infusión permanente de medio de cultivo nuevo, que requiere sistemas de microfiltración del estado de la técnica para la liberación paralela de medio desde el reactor. En particular, la obstrucción de la unidad de filtración con desechos celulares o proteínas implica el riesgo de una finalización prematura de la operación. Por el contrario, el cultivo semicontinuo tiene ventajas significativas en la economía y solidez del
proceso.

Además, la creación de líneas celulares recombinantes estables que producen una proteína de interés requiere la introducción de al menos un gen marcador de resistencia expresado habitualmente de forma constitutiva. La expresión de dicho gen marcador constituye una carga metabólica añadida a la célula que, en el mejor de los casos, puede no afectar al comportamiento de crecimiento o puede afectar de forma bastante adversa a la velocidad de crecimiento y densidad máxima de células viables incluso en un medio de cultivo celular suplementado generosamente con suero (Gaigle et al., 1999, Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are also serine protein kinases, Chemistry and Biology, 6, 11-18; Maio et al., 1991, Gene activation mediated by protein kinase C in human macrophage and teratocarcinoma cells expressing aminoglycoside phosphotransferase activity, J. Cell. Physiology 149, 548-559; Southern et al., 1992, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341).

El objeto de la presente invención es evitar los inconvenientes de la técnica anterior y proporcionar un método para cultivar células animales a una alta densidad celular en un sistema de cultivo sin suero. Este objeto se resuelve expresando genes de resistencia a aminoglucósidos en células animales, por lo que las células se cultivan en medios adecuados y en un sistema de cultivo adecuado de acuerdo con las reivindicaciones independientes 1, 2, 6. Sorprendentemente, dependiendo del método de cultivo y del medio de cultivo como es habitual en la técnica, las líneas celulares tratadas de acuerdo con la presente invención pueden crecer en medio de cultivo celular sin suero a densidades celulares mucho mayores que su línea celular parental no tratada. Además, se observó alguna prolongación del crecimiento en fase estacionaria. De este modo, se pueden conseguir densidades máximas de células viables en cultivo sin suero que no podrían haberse conseguido antes de la invención.

En la figura se muestra una realización posible de la invención. Lo que se muestra es

Fig. 1: densidades de células viables durante el crecimiento de la línea celular NSO transformada con Neo en un sistema de reactor de ascenso por aire semicontinuo 101 en comparación con una línea celular parental y una línea celular transformada con bcl-2.

Fig. 2: productividad para un anticuerpo secretado expresado como tiempo celular acumulativo durante el crecimiento de la línea celular NSO transformada con Neo en un sistema de reactor de ascenso por aire semicontinuo 101 en comparación con una línea celular transfectada con bcl-2.

Fig. 3: mapa del plásmido pEF-bcl-2

Fig. 4: mapa del plásmido pEF-Neo

Fig. 5: experimento de crecimiento comparativo con la línea celular NSO adaptada a dosis no letales de G418.

Fig. 6: cultivo discontinuo en matraces de agitación y productividad de la línea celular en NSO transformada con Neo en comparación con una línea celular parental y una línea celular transformada con bcl-2.

De acuerdo con la presente invención se usa un producto génico de resistencia a aminoglucósidos para conseguir un crecimiento de alta densidad de células animales. El uso de acuerdo con la presente invención comprende expresar el producto del gen de resistencia en las células, seleccionar las células que expresan dicho producto del gen de resistencia con un antibiótico aminoglucósido, preferiblemente con el antibiótico neomicina, degradándose dicho aminoglucósido por dicho producto de gen de resistencia correspondiente, y finalmente cultivar dichas células en un biorreactor, por ejemplo, un biorreactor de ascenso por aire o agitado, en un medio de cultivo celular sin suero adecuado que permite dicho crecimiento de alta densidad.

Un producto del gen de resistencia de acuerdo con la presente invención es cualquier marcador de resistencia a aminoglucósidos tal como genes de resistencia conocidos a gentamicina, neomicina, higromicina y, en particular, a neomicina, que pueden usarse como marcador genético para células eucariotas. Los genes de resistencia a aminoglucósidos se emplean comúnmente en la biología molecular de células eucariotas y se describen en muchos libros de texto convencionales y manuales de laboratorio (si se desea una descripción, compárese, por ejemplo, Shaw et al., 1993, Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes, Microbiol. Rev. 57:138-163; documento WO 82/03087; Southern et al., 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341). Como puede deducirse de lo mencionado anteriormente, se dice que el producto del gen de resistencia a aminoglucósidos es un producto génico funcional en vista de su actividad de degradación de aminoglucósidos de acuerdo con la invención. Por lo tanto, en la presente invención es concebible emplear variantes modificadas genéticamente, funcionales en el sentido anterior, de productos de genes de resistencia a aminoglucósidos conocidos. Dichas variantes pueden generarse, por ejemplo, por sustituciones, deleciones, inserciones o truncamientos de la secuencia de aminoácidos y su secuencia de ADN codificante, respectivamente. Se conocen bien en la técnica métodos para conseguir esto y habitualmente comprenden mutagénesis de localización dirigida o generación de diversidad por mutagénesis aleatoria que después se continúa por la selección de variantes deseadas mediante ensayos funcionales. Los métodos de rutina empleados para mutagénesis pueden ser, por ejemplo, exposición a agentes alquilantes o irradiación UV, técnicas de PCR propensa a error o técnicas de PCR de transposición de genes relacionadas y habitualmente se realizan en microorganismos (Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Laboratory, 1972; Ling et al., 1997, Approaches to DNA Mutagenesis, Analytical biochemistry 254, 157-178; Cadwell et al., 1992; Randomization of genes by PCR mutagenesis in: PCR Methods, Cold Spring Habor Laboratory Press 1992; Moore et al., 1997, Strategies for the in vitro evolution of protein function, J. Mol. Biol. 272,
336-347).

Convenientemente, el producto del gen de resistencia se expresa a partir de una construcción de expresión de ADN adecuada para la expresión en eucariotas que se ha introducido por transfección en las células por técnicas conocidas; el producto del gen de resistencia puede expresarse de forma constitutiva o puede expresarse o reprimirse de forma inducible, es decir, puede expresarse de cualquier modo. Al menos durante los periodos de selección con un antibiótico aminoglucósido y durante el crecimiento logarítmico en un sistema de cultivo celular de alta densidad para conseguir una densidad celular máxima, el producto del gen de resistencia debe expresarse de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, se expresa de forma constitutiva, por ejemplo, a partir del promotor de timidina quinasa (TK) el promotor tardío del virus de simio (SV40), más preferiblemente se expresa a partir de un potenciador-promotor viral fuerte constitutivamente activo en células eucariotas tal como, por ejemplo, la repetición terminal larga (LTR)-promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) o el promotor de citomegalovirus (CMV). También es posible emplear promotores quiméricos constituidos por la parte potenciadora de un promotor viral fuerte y la parte promotora central de otro promotor, por ejemplo, el promotor de la alfa-actina que proporciona, por ejemplo, el inicio de la transcripción, cajas TATA y cajas CAAT esenciales.

Los aminoglucósidos de acuerdo con la presente invención son los antibióticos aminoglucósidos conocidos comúnmente (Mingeot-Leclercq, M. et al., Aminoglicosides: activity and resistance, 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43(4): 727-737) que comprenden al menos un resto de aminopiranosa o aminofuranosa unido por un enlace glucosídico a la otra mitad de la molécula. Su efecto antibiótico se basa en la inhibición de la síntesis de proteínas. Son ejemplos kanamicina, estreptomicina, gentamicina, tobramicina, G418 (geneticina), neomicina B (framicetina), sisomicina, amikacina, isepamicina y similares. Debe observarse que los compuestos aminoglucósidos también tienen efectos tóxicos en cultivo de células eucariotas, en parte porque el aparato de traducción de proteínas mitocondriales es evolutivamente de origen procariota (hipótesis en endosimbiótica de la evolución mitocondrial) aunque también son posibles otros efectos de toxicidad y se han descrito anteriormente.

De acuerdo con la presente invención, para seleccionar células que expresan el producto del gen de resistencia, se aplica selección de resistencia con un antibiótico aminoglucósido al menos para seleccionar inicialmente los transfectantes después de la transfección con el gen de resistencia que comúnmente dura del orden de 48 horas hasta varias semanas. En consecuencia, el gen de resistencia a aminoglucósidos se introduce por transfección de forma estable en la línea celular. Los transfectantes estables son comúnmente integrantes genómicos de al menos una copia expresada o expresable del gen de resistencia a aminoglucósidos, dando lugar a un producto génico funcional. Del mismo modo, en la idea actual de "transfectante estable" se incluyen enfoques más recientes en la ingeniería genética que podrían concebir, por ejemplo, la creación de microsomas artificiales y estables en células. No hace falta decir que, de acuerdo con los protocolos de transfección bien conocidos tales como, por ejemplo, lipofección, DEAE-Dextrano, fosfato Ca o electroporación, que son todos posibles métodos de transfección de acuerdo con la presente invención, las células recién transfectadas se cultivan primero en medio suplementado sin aminoglucósidos antes de que se añada dicho suplemento para la selección. Este periodo intermedio sin selección es necesario para la expresión eficaz del producto del gen marcador de resistencia y está en el intervalo de aproximadamente 12 horas hasta 1-2 días, dependiendo del tipo celular. Preferiblemente, la selección de resistencia se aplica durante al menos dos semanas después de la transfección, más preferiblemente durante al menos cinco semanas después de la transfección, aún más preferiblemente durante al menos 8 semanas después de la transfección. También es posible prolongar el periodo de crecimiento bajo la presión de selección ejercida por el antibiótico aminoglucósido que se ha añadido al medio para el cultivo adicional de las células, por ejemplo, durante la fermentación en el biorreactor. También es posible aplicar, después de la selección inicial de los transfectantes, presión de selección a cortos intervalos intercalados durante el cultivo adicional, añadiendo de forma repetida dosis únicas de aminoglucósido con el medio de cultivo que después se repone por medio suplementado sin aminoglucósido. Preferiblemente, durante el cultivo en un biorreactor, el gen de resistencia expresable o expresado de acuerdo con la presente invención se integra de forma estable en el genoma y el cultivo se realiza en ausencia de presión de selección. Es decir, el cultivo celular -por ejemplo, en un biorreactor semicontinuo de acuerdo con otra realización preferida de la presente invención- se realiza en ausencia de un antibiótico aminoglucósido suplementado al medio de cultivo celular al inicio o en el transcurso de la
fermentación.

Preferiblemente, el aminoglucósido se emplea en una concentración de al menos 0,1 mg/ml, preferiblemente en una concentración de al menos 1 mg/ml, más preferiblemente una concentración de al menos 4 mg/ml. Habitualmente, dicha cantidad de aminoglucósido de acuerdo con la invención se añade al medio de cultivo celular después de la transfección con la construcción de expresión para el producto del gen de resistencia correspondiente, como se conoce bien en la técnica y se describe bien en los manuales de laboratorios convencionales. En una realización adicional particularmente preferida, el aminoglucósido se emplea en una concentración 1 a 4 mg/ml durante al menos 2 semanas, más preferiblemente durante al menos 5 semanas, y aún más preferiblemente durante al menos 8 semanas después de la transfección durante el cultivo celular continuo.

Preferiblemente, el producto del gen de resistencia de acuerdo con la presente invención es una Neomicina Fosfotransferasa (denominándose habitualmente el gen de resistencia Neo^{r}) como se describe en el documento WO82/03087. Se conocen diversas isoformas naturales de dichas enzimas fosfotransferasas y también están incluidas en el alcance de la presente invención. Puede usarse selección con G418 (geneticina, como se define según Chemical abstracts Número de Registro 49863-47-0) o neomicina para seleccionar las células que expresan el producto génico neomicina. En una realización más preferida, se usa G418 para la selección de células resistentes.

Las células animales o la línea celular de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier línea celular convencional usada en la producción de proteínas recombinantes tal como, por ejemplo, células de insecto Sf9, células CHO, células Hela, células COS-7, células VERO-96, células HepG2, células BHK, fibroblastos, hibridoma, linfoblastos inmortalizados con EBV o células de "mieloma" tales como, por ejemplo, la línea celular NSO. Las células de mieloma tales como células NSO son realmente tipos de células linfoides B, aunque se conocen habitualmente en la técnico como "mielomas" (Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000).

Preferiblemente, las células animales o la línea celular de acuerdo con la presente invención son células independientes de anclaje. Estas células no dependen del contacto con el sustrato para tener un crecimiento apropiado y pueden crecer estando suspendidas libremente en el medio de cultivo. En una realización más preferida, la línea celular productora son líneas celulares linfoides, por ejemplo, células de hibridoma, linfoblastos inmortalizados con EBV o células de mieloma, siendo la línea celular más preferida células de mieloma y en particular células NSO de mieloma tales como, por ejemplo, la línea celular ECACC Nº 85110503 y derivados de la misma, disponibles libremente en la European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom. Se ha descubierto que NSO potencialmente da lugar a rendimientos de producto extremadamente altos, en particular si se usa para la producción de anticuerpos recombinantes. La mayoría de las líneas celulares NSO convencionales dependen del colesterol, haciendo que el colesterol sea un componente obligado del medio de cultivo.

En una realización preferida adicional, la línea celular de acuerdo con la presente invención que lleva un gen de resistencia a aminoglucósidos es una línea celular que adicionalmente es capaz de expresar una glutamina sintetasa (GS) recombinante, más preferiblemente es una línea celular GS recombinante de mieloma NSO. Las células NSO son específicamente ventajosas si se usan con el sistema de expresión de glutamina sintetasa (GS) (Bebbington et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10: 169-175; Cockett et al., 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8: 662-667). Preferiblemente, la secuencia génica del producto proteico y la secuencia del gen GS se llevaban en un solo vector plasmídico GS para generar dicha línea celular NSO transfectada, expresándose dichos genes a partir de promotores diferentes o iguales que empleaban, por ejemplo, sitios de entrada a ribosomas internos. El sistema GS es uno de los dos únicos sistemas que son de particular importancia para la producción de proteínas terapéuticas. En comparación con el sistema de dihidrofolato reductasa (DHFR), el sistema GS, y en particular el sistema GS usado en combinación con células de mieloma NSO, ofrece una gran ventaja en relación con el tiempo durante el desarrollo, porque a menudo pueden crearse líneas celulares altamente productivas a partir de un conjunto inicial de transfectantes, evitando de esta manera la necesidad de múltiples vueltas de selección en presencia de concentraciones crecientes de agente selectivo para conseguir la amplificación del gen (Brown et al., 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9:231-236). Las células de mieloma NSO son fenotípicamente deficientes en glutamina sintetasa. Por lo tanto, la línea celular NSO procedente de una línea celular de tumor de ratón (Galfre, G. y Milstein "C. Methods in Enzymol". 73, 3-75, 1981) es frecuentemente la línea celular elegida para el uso del sistema GS a escala industrial. Un ejemplo de dicha línea celular es la línea celular 6A1-Neo que se depositó el 30 de agosto de 2002 según el tratado de Budapest con el número de acceso 02083031 en la European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre of Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury/Wiltshire SPA 0JG, United Kingdom. La línea celular depositada carece de bcl-2 recombinante y se describe adicionalmente en la sección experimental. Otra realización preferida de la presente invención es esta línea celular y cualquier descendiente potencial modificado por ingeniería genética para producir un anticuerpo diferente a cB72. Dicha modificación por ingeniería genética puede comprender fusión celular así como silenciamiento o supresión de ciertos genes, además de técnicas más tradicionales para crear recombinantes, así como la generación de variantes mediante métodos de mutagénesis (como se ha expuesto con más detalle anteriormente) o técnicas de adaptación al medio tradicionales que conservan o mejoran las propiedades de crecimiento para un medio de cultivo celular dado de la línea celular parental
depositada.

En otra realización preferida, las células de acuerdo con la presente invención empleadas para el cultivo celular de alta densidad están desprovistas de la proteína bcl-2 expresada de forma recombinante, la proteína bcl-xl u otra proteína funcional, entendiéndose funcional como una variante natural o modificada por ingeniería genética que evita la apoptosis, de la familia bcl-2 inhibidora de la apoptosis (Petros et al., 2001, Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2, Proc. Natl. Acad. Science U.S.A., 98, 3012-3017) o especies análogas de bcl-2 tales como BHFR-1 del virus de Epstein Barr, por ejemplo, u otros análogos funcionales de bcl-2 como se revisa en Petrosl et al. (ibd). Esta realización preferida puede combinarse convenientemente con otra realización preferida mencionada anteriormente, concretamente la ausencia de presión de selección entendida como la presencia de antibiótico aminoglucósido durante la fermentación. Sorprendentemente, se ha descubierto que la coexpresión de un marcador de resistencia a aminoglucósido y la proteína bcl-2 es refractaria al efecto promotor de la densidad celular de resistencia a aminoglucósido de acuerdo con la presente invención. Por lo tanto, sin limitarse por la teoría, el efecto promotor del crecimiento de la presente invención no parece ser atribuible a un efecto anti-apoptótico o efecto basado en bcl-2, ya que la co-expresión, por ejemplo, de bcl-2 y Neo^{r}, en ese caso, debería ser epistática en lugar de refractaria al crecimiento de alta densidad como realmente se ha observado en experimentos comparativos.

Los medios y métodos de cultivo adecuados para líneas celulares de mamífero son bien conocidos en la técnica, como se describe, por ejemplo, en el documento US 5633162. Son ejemplos de medios de cultivo celular convencionales para cultivo celular en matraz de laboratorio o de baja densidad, estando adaptados a las necesidades de los tipos celulares particulares, por ejemplo: medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p.519 f. 1967), medio L-15 (Leibovitz, A. et al., Arner, J. of Hygiene, 78, 1p.173 ff, 1963), medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo de Eagle (MEM), medio F12 de Ham (Ham, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 53, p288 ff. 1965) o DMEM modificado por Iscoves que carece de albúmina, transferrina y lecitina (Iscoves et al., J. Exp. Med. 1, p. 923 ff., 1978). Se sabe que dichos medios de cultivo pueden suplementarse con suero bovino fetal (FBS, también denominado FCS), proporcionando este último una fuente natural de una plétora de hormonas y factores de crecimiento.

Durante la transfección y la selección con aminoglucósidos, puede emplearse cualquier medio adecuado para sostener el crecimiento de las células animales cultivadas. Para el crecimiento de alta densidad de las células animales en un biorreactor semicontinuo de acuerdo con la presente invención, tiene que emplearse un medio de cultivo de crecimiento de alta densidad.

De acuerdo con la presente invención, un medio de cultivo celular será un medio de cultivo de crecimiento de alta densidad por definición si el medio de cultivo permite el crecimiento de células animales hasta o en exceso de una densidad de células viables de 10^{6} células/ml en un sistema biorreactor semicontinuo convencional. En el contexto de la presente invención, dicho medio de cultivo da lugar a densidades celulares incluso superiores en combinación con la selección con aminoglucósido descrita anteriormente. Habitualmente, dicho medio de acuerdo con la presente invención comprenderá 1-10 g/l de glucosa u otra fuente de energía, estando controlada la concentración de glucosa a este nivel durante el cultivo semicontinuo. Preferiblemente, el medio comprenderá al menos 2 g/l de glucosa, estando controlada esencialmente está concentración durante la fermentación semicontinua. El medio es isotónico, estando concretamente en el intervalo de 270-320 mOsm/Kg, preferiblemente de 280-300 mOsm/Kg. Las preferencias individuales de ciertos tipos celulares, por ejemplo, células linfoides, para ciertos medios son bien conocidas en la técnica, y se correlacionan de forma compleja con la gama, proporción y dosificación individual de nutrientes. En el documento GB2251 249 A se proporcionan ejemplos de medios de crecimiento de alta densidad adecuados, por ejemplo, para líneas celulares de hibridoma en comparación con los medios convencionales mencionados anteriormente; dichos medios de crecimiento de alta densidad pueden suplementarse habitualmente con nutrientes tales como todos los aminoácidos, fuentes de energía tales como glucosa en el intervalo proporcionado anteriormente, sales inorgánicas, vitaminas, oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), tampones, los cuatro nucleósidos o sus correspondientes nucleótidos, antioxidantes tales como glutatión (reducido), vitamina C y otros componentes tales como lípidos de membrana importantes, por ejemplo colesterol o fosfatidilcolina o precursores lipídicos, por ejemplo, colina o inositol. Un medio de alta densidad estará enriquecido en la mayoría o todos estos compuestos y los contendrá, con la excepción de las bases inorgánicas en las que se basa la regulación de la osmolaridad del medio esencialmente isotónico, en cantidades superiores (fortalecidas) que los medios convencionales mencionados anteriormente que pueden deducirse del documento GB2251 249 en comparación con RPMI 1640. Preferiblemente, un medio de cultivo de alta densidad de acuerdo con la presente invención se fortalece de forma equilibrada ya que todos los aminoácidos, excepto el Triptófano, están en una cantidad superior a 75 mg/l de medio de cultivo. Preferiblemente, junto con las necesidades de aminoácidos generales, la glutamina y/o la asparagina están conjuntamente en una cantidad superior a 1 g/l, más preferiblemente de 2 g/l de medio de cultivo de alta densidad. No hace falta decir que la última realización preferida es menos adecuada en el caso de una línea celular recombinante transfectada con un vector de glutamina sintetasa (GS). En dicha línea celular, un exceso de, por ejemplo, glutamina procedente tanto de fuentes exógenas como de fuentes endógenas conduciría a la producción de amoniaco, lo cual debe evitarse. Las condiciones de cultivo para líneas celulares transfectadas con GS se describen en los ejemplos.

Convenientemente, el medio de cultivo celular de alta densidad de acuerdo con la presente invención carece de suero bovino fetal (FCS o FBS), recibiendo el nombre de medio "sin suero". No sólo se ha considerado posible, de acuerdo con la presente invención, conseguir crecimiento de alta densidad a una densidad de células viables de o superior a 10^{7} células/ml con medio sin suero, sino que se ha descubierto que, sorprendentemente, la suplementación con suero fetal es refractaria al crecimiento de alta densidad de al menos algunas líneas celulares ensayadas en el contexto de la presente invención, lo cual es contrario a las expectativas habituales del especialista en la técnica. Las células en un medio sin suero generalmente requieren insulina y transferrina para el crecimiento óptimo. La transferrina puede sustituirse al menos parcialmente por sideróforos no peptídicos tales como tropolona como se describe en el documento WO 94/02592. La mayoría de las líneas celulares requieren uno o más factores de crecimiento sintéticos (que comprenden polipéptidos recombinantes) incluyendo, por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento semejantes a insulina I y II (IGFI, IGFII), etc. Otras clases de factores que pueden ser necesarios incluyen: prostaglandinas, proteínas de transporte y unión (por ejemplo, ceruloplasmina, lipoproteínas de alta y baja densidad, albúmina de suero bovino (BSA)), hormonas, incluyendo hormonas esteroideas, y ácidos grasos. El ensayo de factores polipeptídicos se hace mejor de un modo por etapas ensayando nuevos factores polipeptídicos en presencia de los considerados estimuladores del crecimiento. Hay varios enfoques metodológicos bien conocidos en el cultivo de células animales, describiéndose a continuación uno ejemplar. La etapa inicial es obtener condiciones en las que las células sobrevivan y/o crezcan lentamente durante 3-6 días después de transferirse desde el medio de cultivo suplementado con suero. En la mayoría de los tipos celulares, esto es al menos en parte una función de la densidad del inoculo. Una vez que se ha encontrado el suplemento óptimo de hormona/factor de crecimiento/polipéptido, se reducirá la densidad del inóculo necesaria para la
supervivencia.

En una realización más preferida, el medio de cultivo celular no tiene factores de crecimiento, lo que significa que carece de suero fetal o de adición de factores de crecimiento proteicos esencialmente puros que desencadenan la transducción de señales y la progresión del ciclo celular, respectivamente. Dicho medio también puede comprender otras proteínas tales como insulina o transferrina, útiles para el reclutamiento de hierro desde el medio, o BSA necesaria para el suministro de lípidos tales como colesterol. Más preferiblemente, dicho medio se emplea de acuerdo con la presente junto con líneas celulares linfoides, más preferiblemente junto con líneas celulares de mieloma, en particular líneas celulares NSO.

Son biorreactores adecuados de acuerdo con la presente invención biorreactores discontinuos tales como, por ejemplo, biorreactores de ascenso por aire o biorreactores agitados como los empleados de forma rutinaria para el cultivo de células animales de alta densidad. Convenientemente, para el cultivo celular de alta densidad, dicho biorreactor se accionará en un modo semicontinuo. Esta definición incluye también el funcionamiento de suministro continuo. Preferiblemente, los biorreactores semicontinuos de acuerdo con la presente invención tienen un coeficiente volumétrico de transferencia de masa de oxígeno K_{L}a (definido en Bailey, J. et al., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, N.Y. 1986) de al menos 6 h^{-1}, más preferiblemente de al menos 10 h^{-1}. Más preferiblemente, un biorreactor semicontinuo que tiene dichas propiedades de transferencia de masa de oxígeno preferidas de acuerdo con la presente invención es un biorreactor de ascenso por aire. Los biorreactores de ascenso por aire son bien conocidos por los especialistas en la técnica y se han descrito bien los parámetros cruciales para el diseño del reactor (como revisión, véase por ejemplo Chisti, M. et al., 1987, Airlift reactors, Chem. Eng. Commun. 60, 195-242; Koch, A. et al., 1987; Measurement and modeling of mass transport in airlift-loop reactors in relation to the reactor design, Chem. Ing. Tech. 59, 964-965). Aunque es evidente, se hace hincapié en que el cultivo semicontinuo de acuerdo con la presente invención no comprende sistemas de cultivo de perfusión.

En el contexto de la presente invención, un cultivo celular de alta densidad se define como una población de células animales que tienen una densidad de células viables de al menos 10^{6} células/ml o una densidad superior, preferiblemente de al menos 10^{7} células/ml o una densidad superior, más preferiblemente superior a 1,23 x 10^{7} células/ml, y aún más preferiblemente superior a 1,3 x 10^{7} células/ml, habiendo crecido dicha población de forma continua desde una sola célula o inóculo de densidad de células viables inferior en un medio de cultivo celular en un volumen de cultivo constante o en aumento.

En una realización preferida adicional, el cultivo semicontinuo es un sistema de cultivo en el que se suministra al menos glutamina, opcionalmente con uno o varios aminoácidos diferentes, preferiblemente glicina, al cultivo celular como se describe en el documento GB2251 249 para mantener su concentración en el medio, aparte de controlar la concentración de glucosa por un suministro diferente. Más preferiblemente, el suministro de glutamina y opcionalmente uno o varios aminoácidos diferentes se combina con el suministro de una o más fuentes de energía tales como glucosa al cultivo celular como se describe en el documento EP-229 809-A. El suministro habitualmente se inicia a las 25-60 horas después del comienzo del cultivo; por ejemplo, es útil comenzar el suministro cuando las células han alcanzado una densidad de aproximadamente 10^{6} células/ml. El suministro de glutamina y/o asparagina total (para la sustitución de glutamina por asparagina, véase Kurano, N. et al., 1990, J. Biotechnology 15, 113-128) está habitualmente en el intervalo de 0,5 a 3 g por 1, preferiblemente de 1 a 2 g por 1 volumen de cultivo; otros aminoácidos que pueden estar presentes en el suministro son de 10 a 300 mg de suministro total por litro de cultivo. En particular, la glicina, lisina, arginina, valina, isoleucina y leucina habitualmente se suministran en cantidades superiores de al menos 150 a 200 mg en comparación con los otros aminoácidos. El suministro puede añadirse como una adición de golpe o como un suministro bombeado de forma continua, siendo preferible un suministro bombeado de forma casi continua al biorreactor. No es necesario decir que el pH se controla cuidadosamente durante el cultivo semicontinuo en un biorreactor a un pH aproximadamente fisiológico óptimo para una línea celular dada por adición de base o tampón. Cuando se usa glucosa como fuente de energía, el suministro de glucosa total es habitualmente de 1 a 10, preferiblemente de 3 a 6 g/l de cultivo. Aparte de incluir aminoácidos, el suministro preferiblemente comprende una pequeña cantidad de colina en el intervalo de 5 a 20 mg por litro de
cultivo.

Preferiblemente, la célula animal o línea celular de acuerdo con la presente invención es una línea celular productora que produce un segundo producto proteico o es capaz de expresar un segundo producto proteico, por ejemplo, después de la inducción. De acuerdo con la presente invención, el segundo producto proteico es la proteína que se pretende producir y recoger en grandes cantidades. Puede ser cualquier proteína de interés, por ejemplo, proteínas terapéuticas tales como interleuquinas o enzimas, por ejemplo, inhibidores enzimáticos o anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ejemplo un fragmento fab). Puede ser una proteína recombinante, transportada en un plásmido o en otro tipo de vector incluyendo virus modificados genéticamente, o puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula por cualquier técnica. También puede ser una construcción de expresión de origen natural tal como un anticuerpo secretado por células plasmáticas o de hibridoma. El producto proteico puede incluir una secuencia señal que permite la secreción del polipéptido a partir de la célula productora hospedadora. Puede expresarse de forma constitutiva o puede expresarse de forma inducible.

Preferiblemente, el producto proteico es una proteína recombinante, aún más preferiblemente una proteína recombinante expresada a partir de un promotor constitutivo. El término "recombinante" de acuerdo con la presente invención significa una proteína expresada a partir de al menos una copia exógena del gen correspondiente en una línea celular que se ha introducido originalmente en dicha línea celular por cualquier técnica de ingeniería genética, independientemente de si la misma proteína se está produciendo en la línea celular productora en al menos una copia presente de manera natural. Estas copias adicionales de un gen recombinante pueden integrarse, por ejemplo, en el genoma o pueden transportarse en un elemento episomal. Puede emplearse tanto expresión estable como expresión transitoria. Puede usarse cualquier tecnología de vectores de expresión conocida, incluyendo virus modificados por ingeniería genética, de acuerdo con la presente invención. Más preferiblemente, la proteína recombinante es una proteína integrada de forma estable en el cromosoma.

En una realización preferida adicional de la presente invención, el producto proteico es una proteína secretada. Más preferiblemente, el producto proteico es un anticuerpo o anticuerpo modificado por ingeniería genética o un fragmento del mismo, más preferiblemente es un anticuerpo inmunoglobulina G (IgG).

Son objetos adicionales de la presente invención un método respectivo de expresión de proteínas y adicionalmente un cultivo celular de alta densidad correspondiente con lo que se ha dicho en las secciones precedentes sobre el uso de productos de genes de resistencia a aminoglucósidos. La descripción de realizaciones posibles y preferidas en lo anterior se aplica del mismo modo a estos objetos.

Ejemplos 1. Generación de líneas celulares y plásmidos

La línea celular NSO 6A1(100)3 (6A1 para abreviar; Lonza Biologics plc., Slough/UK) secreta un anticuerpo IgG quimérico de humano-ratón (cB72.3) a partir de una construcción de expresión de glutamina sintetasa (GS) recombinante integrada de forma estable. Las líneas celulares recombinantes que llevaban resistencia a neomicina se obtuvieron por transfección de la línea celular 6A1 con vectores plasmídicos que expresaban de forma dicistrónica bcl-2 y Neo^{r} o que expresaban solamente Neo^{r} a partir de una sola construcción plasmídica. Para la generación de pEF-Neo^{r}, se insertó el cassette MC1 Neo poli A de pMCIneopA (Stratagene) en pEF BOS (Mizushima et al., 1990, pEF BOS, A powerful mammalian expression vector, Nucleic Acids Research 18, 5322) que tiene el fragmento stuffer, para producir pEF MC1 neo poli A (Visvader et al., Mol. Cell Biol. 1995 Feb; 15(2):634-41). La figura 4 muestra el mapa del plásmido. Para la generación de pEFbc1-2-Neo^{r}, se subclonó el fragmento de EcoRI/Taq I del ADNc de bcl-2 humano (versión larga del transcrito antiapoptótico, Cleary et al., Cell 47: 19-28 (1986)) en pIC194 (Gene32:482, 1984) abierto con EcoRI/Clal y escindido como un fragmento Sall (romo)/EcoRV que se clonó adicionalmente en el sitio XbaI que se había hecho romo del sitio de clonación múltiple (MCS) de pEF-MC1neopA. De esta manera, se expresa bcl-2 a partir del promotor 1-a del factor de elongación (EF) (mapa del plásmido, Figura 3). El cassette de expresión Neo^{r-} (MC1neopA) es una parte integral del vector pEF, aunque en la construcción del vector pEF-Neo finalmente empleada, el MCS más allá del promotor EF1-a se abrió en el sitio Xho I, que se había hecho romo y se insertó un fragmento stuffer aleatorio de 300 pb procedente de una secuencia no codificante para el control apropiado (mapa del plásmido, Fig. 4). Se realizó la transfección mediada por lipofectina (Gibco, Paisely, Escocia) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se seleccionaron transfectantes plasmídicos con 1 mg/ml de G418 en medio GMEM (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 5% y suplementos adicionales como se describe en Tey et al. (Tey, B. et al., Bcl-2 mediated suppression of apoptosis in myeloma NSO cultures, J. Biotechnology, 79(2000), 147-159). Después, los transfectantes estables se adaptaron al medio de crecimiento de alta densidad sin suero
EX-CELL 320.

2. Cultivo celular semicontinuo de alta densidad

Para el cultivo celular de alta densidad, la línea celular parental NSO 6A1, la línea celular 6A1 Neo y la línea celular de control 6A1 bcl-2/Neo se adaptaron al medio sin suero EX-CELL 302 (JRH Biosciences Inc., KS/U.S.A.) suplementado con 1 ml/50 ml de GSEM (suplemento de medio de expresión GS, número de producto G9785, sigma, Poole, UK). Mientras se hacían pases, el medio se suplementó con MSX 25 \muM y 0,7 g/l de G418, pero se omitieron el inóculo y el medio de cultivo del biorreactor. La densidad de las células viables durante el cultivo celular en biorreactor se muestra en la Figura 1 para el cultivo de líneas celulares individuales. El cultivo semicontinuo para cada línea celular se preparó del siguiente modo:

La línea celular de mieloma se cultivó en un fermentador de ascenso por aire 101 en medio EX-CELL 302 sin suero. La densidad de la población celular de partida fue de aproximadamente 10^{5} células/ml a partir del cultivo semiexponencial reciente. Después del crecimiento continuo a una densidad de aproximadamente 10^{6} células/ml, se realizaron adiciones de golpe de los suplementos y se inició el suplemento bombeado (Tabla 1). El suministro fue continuo durante 100 h. El pH se controló a un valor de aproximadamente 7. La densidad de cultivo se determinó aproximadamente cada 25 horas por recuento y se determinó la viabilidad celular por exclusión de azul tripán. Para la concentración de células totales y viables, se diluyó una muestra apropiadamente diluida con azul tripán (Sigma, Poole, UK) seguido de un examen microscópico usando un hemocitómetro Fuchs-Rosental modificado. Para la segunda comprobación, se usó un contador CASY para medir las concentraciones de células totales y viables, basándose en el tamaño celular.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

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Mientras que la línea celular recombinante bcl-2/Neo creció a una densidad máxima de células viables de sólo aproximadamente 10^{7} células/ml, en contraste con Tey et al. que describieron que habiendo obtenido densidades celulares máximas de < 10^{6} células/ml en un cultivo semicontinuo suplementado con suero, la línea celular recombinante Neo creció a una densidad máxima de 1,4 x 10^{7} células/ml (Figura 1). La viabilidad de las células contadas se determinó por exclusión de azul tripán como se ha descrito anteriormente.

El rendimiento espacio-tiempo del anticuerpo recombinante estuvo a favor de la línea celular Neo recombinante (Figura 2). Esto se demuestra representando gráficamente la titulación del producto en el biorreactor frente al tiempo celular acumulativo (CCT; unidad 10^{9} células h/l). El CCT se calculó por integración de la curva de crecimiento celular, esencialmente como se describe en Renard et al. (1988, Biotechnology Letters 10: 91-96). Como puede deducirse por la Figura 2, la productividad media de una sola célula de la línea celular recombinante bcl-2/Neo fue de 0,260 pg de proteína/célula.hora, mientras que la línea celular Neo ascendió a 0,210 pg de proteína/célula. La ligera diferencia en la productividad de una sola célula (q_{p}) fue claramente mayor al nivel de rendimiento total por la diferencia en las densidades de células viables.

3. Determinación del número de copias génicas

El número de copias génicas del gen de resistencia a Neomicina se determinó para la línea celular 6A1-Neo depositada por medio del ensayo de PCR cuantitativo, empleando la 6A1 parental como patrón comparativo. Se determinó un número de copias génicas de 3,0 copias (\pm 0,4). Dada la integración concatemérica de los genes transfectados de forma estable, esto significa que tuvo lugar una única integración del marcador de resistencia a neomicina recombinante en la línea celular 6A1-Neo sin amplificación adicional. Esto está de acuerdo con las bajas concentraciones de MSX de aproximadamente MSX 25 \muM; para que suceda la amplificación de un gen marcador GS tienen que aplicarse concentraciones 10-20 veces superiores del agente de selección. El ensayo se realizó por un laboratorio contratado especializado (Lark Technologies Inc., Houston, Texas). Aparte de ensayar el gen de resistencia a neomicina del Transposón Tn5, se estableció un control negativo ensayando del mismo modo el gen de ratón de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa [GAPDH]. Se usó un patrón plasmídico clonado para calibrar las placas de ensayo. Se calcularon los números de copias como número de dianas (NEO) por célula (MUSGAPDH), suponiendo que la masa de ADN de la célula de mamífero diploide convencional es aproximadamente 6,6 pg y que el GAPDH está presente en dos copias por célula. El ADN genómico extraído de las células se cuantificó espectrofotométricamente midiendo las densidades ópticas a 260 y 280 nm de forma rutinaria en la técnica. Para ensayar el número de copias del gen de resistencia a neomicina, se generó una curva patrón QPCR usando 8 diluciones del plásmido pMC1 neopA proporcionado por Lonza Biologics. La serie de dilución representó el intervalo de 5 x 10^{6} copias a 49 copias de ADN plasmídico. Cada patrón se diluyó en ADN genómico de control GS-NSO (equivalente a 1000 células) para imitar el efecto de matriz del ADN extraído de la línea celular. Las reacciones de control negativo que no contenían plantilla o que contenían sólo el plásmido de control (de 5000 a 50000 copias) o el ADN equivalente de 1000 células GS-NSO (línea celular parental, aproximadamente 6,6 ng) se ensamblaron.

Se determinó el número de copias con un intervalo de confianza del 95% por determinación del ciclo umbral (Ct). El Ct es el número fraccionario al que la fluorescencia indicadora producida por la escisión de la sonda cruza un umbral fijado establecido por encima de la línea basal. Cada aumento en el valor numérico de Ct representa un aumento 2x en la diana, suponiendo una eficacia de PCR de 100%.

Se prepararon 6 diluciones independientes para cada artículo de ensayo de ADN y se analizaron por duplicado. Cada reacción de QPCR contenía aproximadamente 6,6 ng de ADN de muestra de ensayo. Las reacciones de QPCR se ensamblaron de acuerdo con el protocolo TaqMan^{TM} Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones se sometieron a ciclos térmicos y los datos se recogieron por el Sistema de Detección de Secuencias ABI Prism 7700 versión 1.6.3 (Applied Biosystems).

4. Ejemplo comparativo

Cultivo de la línea celular parental 6A1 en ausencia del gen de resistencia a Neo pero en presencia de cantidades subletales de G418

Para excluir el efecto de crecimiento por la exposición a G418 en lugar de la presencia de un gen de resistencia a Neomicina expresado, se adaptó la línea celular parental 6A1 a medio de cultivo celular que contenía G418. La cantidad de G418 pudo aumentarse de forma gradual hasta una concentración de 360 mg/ml de G418 (Sigma, Poole, UK; obsérvese que la calidad del lote de G418 puede variar considerablemente dependiendo de la fuente) sin suprimir el crecimiento celular. El medio de crecimiento era medio de cultivo celular NSO PM1 patentado optimizado por Lonza suplementado con glutamina 6 mM en ausencia de suero fetal. Para la línea celular 6 A1-Neo, esta reproducibilidad del medio sin suero permitió conseguir las densidades celulares altas de la presente invención (>2 x 10^{7} células/ml) en comparación con la línea celular 6A1 transfectada con bcl-2 o parental no transfectada. Por lo tanto, el medio era adecuado para controlar el efecto potencial de la adaptación a G418 en ausencia del gen marcador de neomicina.

En comparación con la línea celular parental no adaptada que había crecido en PM1 + glutamina 6 mM, las células adaptadas que habían crecido en medio G418 (-) fueron ligeramente más resistentes a la muerte celular apoptótica y necrótica (datos no mostrados), pero tuvieron una velocidad de crecimiento inferior y una densidad celular máxima inferior en comparación con la línea celular parental (Figura 5A: densidad celular viable en cultivo discontinuo de la línea celular NSO 6A1/6A1 no adaptadas: círculos negros, 6A1 adaptadas a 360 mg/ml de G418 que habían crecido en presencia (círculos blancos) y ausencia (triángulos negros) de G418). Restando el recuento de células viables del recuento de células totales, se determinó la cantidad de células muertas o necróticas y se expresa en la Figura 5B como porcentaje del recuento de células totales. El experimento permitió concluir que la exposición a G418 en ausencia del marcador de resistencia a neomicina, por lo tanto, puede explicar sólo el efecto potencial de la resistencia a la apoptosis, pero no puede explicar el efecto del comportamiento de crecimiento de alta densidad potenciado. Es interesante observar que, el cultivo en biorreactor de la línea celular adaptada en presencia de 360 mg/ml de G418 minimizó adicionalmente tanto la velocidad de crecimiento como la densidad celular máxima de la línea celular adaptada en medio PM1 sin suero.

5. q_{p} en el cultivo discontinuo de 6A1, 6A1-Neo y 6A1-bcl-2

Las líneas celulares ya se han descrito en los ejemplos 1 y 2; el cultivo celular se realizó como se ha descrito en el ejemplo 2, con la excepción de que en lugar de un cultivo semicontinuo en un fermentador de ascenso por aire, se realizó un cultivo discontinuo sencillo en un matraz de agitación. Se determinó la productividad de una sola célula ensayando la secreción de cB72.3 en un formato de ensayo Elisa a partir de alícuotas de cultivo. Las alícuotas se contaron para determinar la cantidad de células viables y se resuspendieron en medio reciente en una placa de 96 pocillos durante un periodo pre-establecido de tiempo. Se tomaron muestras de cultivo a aproximadamente 80 horas y en el momento de la recolección (aproximadamente 240 horas). Los resultados se muestran en la Figura 6B. En la Figura 6 A se muestra la curva de crecimiento basada en la densidad de células viables juzgada por exclusión con azul tripán (círculos blancos: 6A1-Neo, triángulos negros: 6A1-bc12, círculos negros: 6A1-(100)3). La línea celular 6A1-Neo mostró forma coherente una productividad de células individuales q_{p} superior que la línea celular 6A1 bc1-2. La línea celular 6A1 parental tuvo un valor de q_{p} incluso superior que se equilibra de forma negativa por su potencial de crecimiento mucho menor.

Claims (10)

1. Método de expresión de proteínas, que comprende la etapa de

a. cultivar una línea celular animal a una densidad de células viables de al menos 10^{7} células/ml o superior en un medio de cultivo de crecimiento de alta densidad sin suero en un biorreactor semicontinuo, transfectándose dicha línea celular con un gen de resistencia a aminoglucósidos expresable y transfectándose con una glutamina sintetasa expresable, y siendo capaz adicionalmente dicha línea celular de expresar un producto proteico, y que comprende adicionalmente la etapa de

b. aislar el producto proteico del caldo de cultivo.

2. Uso del producto del gen de resistencia a aminoglucósidos para conseguir un crecimiento de alta densidad de células animales, siendo dichas células adicionalmente capaces de expresar la glutamina sintetasa recombinante y siendo el crecimiento de alta densidad una densidad de células viables superior a 10^{7} células/ml.

3. Método o uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células animales son células linfoides, más preferiblemente células de mieloma, y aún más preferiblemente células NSO.

4. Método o uso de acuerdo con la reivindicación 1-3, caracterizado porque el producto del gen de resistencia es el producto del gen de resistencia a neomicina, y porque las células se transfectan con ADN que lleva un cassette de resistencia a neomicina expresable y se someten posteriormente a selección de las células que tienen un fenotipo de resistencia a neomicina por incubación con neomicina o, preferiblemente, G418 a una concentración de al menos 1 mg/ml en medio de cultivo celular.

5. Método o uso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque después de la selección de los resistentes a neomicina, las células se cultivan adicionalmente a alta densidad en un sistema de biorreactor semicontinuo.

6. Cultivo celular de alta densidad que comprende células animales, estando contenidas dichas células en un biorreactor semicontinuo en un medio de cultivo celular sin suero de crecimiento de alta densidad, donde el cultivo celular tiene una densidad de células viables superior a 10^{7} células/ml, y donde la línea celular se transfecta con un gen de resistencia a aminoglucósidos expresable y se transfecta con una glutamina sintetasa expresable.

7. Cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el cultivo se ha obtenido haciendo crecer un inóculo de las células que tienen una densidad de células viables inferior a 10^{7} células/ml.

8. Cultivo celular de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque las células llevan un gen marcador de resistencia a aminoglucósidos.

9. Cultivo celular de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque las células se han tratado con antibióticos aminoglucósidos suplementados al medio después de la introducción por transfección del gen marcador de resistencia a aminoglucósidos expresable.

10. Cultivo celular de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque las células están desprovistas de bcl-2 recombinante o variantes funcionales o especies análogas del mismo.