NO332092B1 - Fremgangsmate for proteinekspresjon, anvendelse av neomycinresistensgenprodukt, samt cellekultur med hoy tetthet - Google Patents

Abstract

Anvendelse av aminoglykosidre sistensgenprodukt for oppnåelse av vekst av dyreceller med høy tetthet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår området proteinekspresjon innenfor bio-teknologien. Den angår spesifikt anvendelse av neomycinresistensgen for oppnåelse av vekst av dyreceller med høy tetthet, en respektiv fremgangsmåte for proteinproduksjon og en cellekultur med høy tetthet.

Bioteknologisk produksjon av terapeutiske proteiner ved hjelp av en dyre-cellekultur er en meget arbeidskrevende og kostbar oppgave. Effektiviteten av produksjonen innbefattende nedstrøms bearbeidelse styres hovedsakelig av rom-tid-utbyttet i det innledende celledyrkningstrinn. Både høye utbytter og konsentrasjon av produktprotein i dyrkningsbuljongen er ønskelig. Følgelig vil forholdsvis små økninger i den maksimale celletetthet som oppnås før inntreden i den fremdeles produktive stasjonære fase av cellekulturer i industriell målestokk, omformes til en betydelig forøkning i total produktivitet, og dette skyldes ganske enkelt det store totale antall celler som tilsettes på denne måte.

Sterkt avhengig av celletype og av dyrkningsmetoden kan konvensjonelle tilførselssats-("fed-batch")-dyrkningssystemer optimalisert for vekst med høy tetthet, så som boble-("airlift")-reaktorer, ikke oppnå vekst av serumfrie cellekulturer til en tetthet på opp til eller til og med over 10<7>celler pr. ml. Høyere tettheter er potensielt oppnåelige i serumsupplert tilførselssatskultur eller i de mer moderne perfusjonsreaktorsystemer. Imidlertid medfører begge muligheter alvorlige ulemp-er. Dyrkningsmedier supplert med føtalt bovint serum, som omfatter et helt område av naturlige vekstbefordrende substanser, er sterkt avhengige av kilden til serum når det gjelder kvalitet, og har, høyst avgjørende, en permanent risiko for utilsiktet å innføre dyrevirus i kulturer som produserer terapeutiske proteiner for medisinske anvendelser. Følgelig må serumsupplering unngås av lovgivningsmessige hensyn.

Perfusjonsreaktorsystemer er imidlertid mye mer komplekse og krevende å kontrollere under driften og er mye mer kostbare i drift enn vanlige tilførselssats-dyrkningssystemer. Dette skyldes den permanente infusjon av friskt dyrkings-medium, som fordrer mikrofiltreringssystemer ifølge teknikkens stand for parallell frigjøring av medium fra reaktoren. Spesielt medfører tilstopping av filtreringsen-heten med cellerester eller protein risiko for driftsstopp før tiden. Til sammenlikning har tilførselssatskultur betydelig fordeler når det gjelder prosessøkonomi og ro-busthet.

Videre fordrer frembringelse av stabile rekombinante cellelinjer som produserer et aktuelt protein innføring av minst ett vanligvis konstitutivt uttrykt resistensmarkørgen. Ekspresjon av et slikt markørgen utgjør en ytterligere metabolsk belastning på cellen som i beste fall ikke påvirker vekstoppførselen, eller ganske negativt kan påvirke veksthastigheten og den maksimale tetthet av levedyktige celler selv i rikt serumsupplert celledyrkningsmedium (Gaigle et al., 1999, Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are also serine protein kinases, Chemistry and Biology 6, 11-18; Maio et al., 1991, Gene activation mediated by protein kinase C in human macrophage and teratocarcinoma cells expressing aminoglycoside phosphotransferase activity, J. Cell Physiology 149, 548-559; Southern et al., 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341).

Det skal også nevnes Hayden MS. et al. Antibody engineering. Current opinion in immunology, 1997, Vol. 9, no. 2 and Sinacore MS. et al. Adaptation of mammalian cells to growth in serum-free media. Molecular biotechnology, 2000, Vol. 15, no.3.

Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å unngå ulempene ved teknikkens stand og å tilveiebringe en fremgangsmåte for dyrking av dyreceller til høy celletetthet i et serumfritt dyrkningssystem. Dette formål oppnås ved ekspresjon av neomycinresistensgen i dyreceller, hvoretter cellene dyrkes i egnet medium og i et egnet dyrkningssystem i henhold til de selvstendige krav 1, 2,6. Avhengig av dyrkningsmetoden og dyrkningsmediet som er vanlig på området, kan, overraskende nok, cellelinjer behandlet i henhold til foreliggende oppfinnelse vokse i serumfritt celledyrkningsmedium til mye høyere celletettheter enn deres ubehandlede opphavscellelinje. Dessuten ble det observert en viss forlengelse av stasjonærfasevekst. På denne måte er maksimale tettheter av levedyktige celler oppnåelige i serumfri kultur som ikke kunne bli realisert før oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for proteinekspresjon, som omfatter trinnet

a. dyrking av en dyrecellelinje til en tetthet av levedyktige celler på minst eller over 10<7>celler pr. ml i et serumfritt dyrkningsmedium for vekst med høy tetthet, i en tilførselssats-bioreaktor, hvilken cellelinje er transfektert med et uttrykkbart neomycinrestistensgen og er transfektert med en uttrykkbar glutaminsyntetase, og hvilken cellelinje videre er i stand til å uttrykke et produktprotein; og videre omfatter trinnet

b. isolering av produktproteinet fra dyrkningsbuljongen.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av neomycinresistensgenprodukt for oppnåelse av vekst av dyreceller med høy tetthet, hvilke celler videre er i stand til å uttrykke rekombinant glutaminsyntetase og hvor veksten med høy tetthet er over10<7>celler pr. ml.

Oppfinnelsen vedrører også en cellekultur med høy tetthet, som omfatter dyreceller som finnes i et flytende medium i en tilførselssats-bioreaktor i et serumfritt celledyrkningsmedium med vekst med høy tetthet, hvor cellekulturen har en tetthet av levedyktige celler på over 10<7>celler pr. ml, og hvor cellelinjen er transfektert med et uttrykkbart neomycinresistensgen og er transfektert med en uttrykkbar glutaminsyntetase.

En mulig utførelsesform av oppfinnelsen er vist på figurene. Det som er vist, er: Fig. 1: Tettheter av levedyktige celler under dyrkning av Neo-transformert NSO-cellelinje i et 10 I tilførselssats-airliftsystem sammenliknet med en opphavs-og en bcl-2-transformert -cellelinje. Fig. 2: Produktivitet for utskilt antistoff uttrykt som kumulativ celletid under dyrking av Neo-transformert NSO-cellelinje i et 10 I tilførselssats-airliftreaktorsystem sammenliknet med en bcl-2-transfektert cellelinje.

Fig. 3: Plasmidkart pEF-bcl-2.

Fig. 4: Plasmidkart pEF-Neo

Fig. 5: Komparativt vekst-forsøk med NSO-cellelinje tilpasset til ikke-dødelige doser

av G418.

Fig. 6: Ristekolbe-satskultur og produktivitet av Neo-transformert NSO-cellelinje sammenliknet med en opphavs- og en bcl-2-transformert cellelinje.

I henhold til foreliggende oppfinnelse anvendes et

neomycinresistensgenprodukt for oppnåelse av vekst av dyreceller med høy tetthet. Anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ekspresjon av resistensgenproduktet i cellene, utvelging av celler som uttrykker slikt resistensgenprodukt med antibiotikumet neomycin, som nedbrytes ved det tilsvarende resistensgenprodukt, og endelig dyrking av slike celler i en bioreaktor, f.eks. en airlift- eller omrørt bioreaktor, i et egnet serumfritt celledyrkningsmedium som muliggjør slik høytetthets-vekst.

Et resistensgenprodukt i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse er neomycin, som kan anvendes som en genetisk markør for eukaryote celler. Neomycinresistensgen anvendes vanligvis innenfor molekylærbiologien for eukaryote celler og er beskrevet i mange standardlærebøker og laboratoriemanualer (for beskrivelse sml. f.eks. Shaw et al., 1993, Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes, Microbiol. Rev. 57:138-163; WO 82/03087; Southern et al., 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341). Som man kan slutte ut fra det forannevnte, sies neomycinresistensgenproduktet å være et funksjonelt genprodukt på bakgrunn av sin neomycinnedbrytende aktivitet i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse. Det er derfor mulig å anvende genteknologisk konstruerte, i ovennevnte betydning funksjonelle varianter av kjente aminoglykosidresistensgenprodukter. Slike varianter kan frembringes f.eks. ved substitusjoner, delesjoner, innsettinger eller avkortinger av henholdsvis aminosyren og dens kodende DNA-sekvens. Metoder for dette er velkjente på området og omfatter vanligvis spesifikk setedirigert mutagenese eller frembringelse av forskjellighet ved tilfeldig mutagenese, som så følges av utvelging av ønskede varianter ved hjelp av funksjonelle analyser. Rutinemetoder som anvendes for mutagenese, kan f.eks. være eksponering for alkyleringsmidler eller UV-bestråling, feil-utsatt PCR eller beslektede genmanipulerings-PCR-teknikker, og de utføres vanligvis på mikro-organismer (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972; Ling et al., 1997, Approaches to DNA Mutagenesis, Analytical biochemistry 254,157-178; Cadwell et al., 1992, Randomization of genes by PCR mutagenesis in: PCR Methods, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1992; Moore et al., 1997, Strategies for the in vitro evolution of protein function, J. Mol. Biol. 272, 336-347).

Resistensgenproduktet uttrykkes hensiktsmessig fra en DNA-ekspresjonskonstruksjon egnet for eukaryot ekspresjon som er blitt transfektert inn i celler ved hjelp av kjente teknikker; resistensgenproduktet kan uttrykkes konstitutivt eller induserbart uttrykkes eller undertrykkes, dvs. at det kan uttrykkes på begge måter. I det minste i løpet av tidsrommene for seleksjon med et neomycin-antibiotikum og under logaritmisk oppvekst i et celledyrkningssystem med høy tetthet for oppnåelse av maksimal celletetthet bør resistensgenproduktet uttrykkes i henhold til foreliggen de oppfinnelse. Det uttrykkes fortrinnsvis konstitutivt f.eks. fra thymidinkinase (TK) eller Simian-virus (SV40) senpromoter, og mest foretrukket uttrykkes det fra en sterk virusforsterker-promoter som er konstitutivt aktiv i eukaryote celler så som f.eks. Rous sarkom-virus (RSV)-langterminalrepetisjons-(LTR)-promoter eller cytomegalo-virus (CMV)-promoter. Det kan også være mulig å anvende kimæriske promotere som består av forsterkerdelen av en sterk viral promoter og kjernepromoterdel av en annen promoter, f.eks. alfa-actin-promoter som gir essensiell, f.eks. transkripsjons-start-, TATA-bokser og CAAT-bokser.

Et aminoglykosid er de vanlig kjente aminoglykosid-antibiotika (M. Mingeot-Leclercq et al., Aminoglycosides: activity and resistance, 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43(4): 727-737) omfattende minst én aminopyranose- eller amino-furanosedel knyttet via en glykosidbinding til den andre halvdel av molekylet. Deres antibiotiske effekt er basert på inhibering av proteinsyntese. Eksempler er kana-mycin, streptomycin, gentamicin, tobramycin, G418 (geneticin), neomycin B (framycetin), sisomicin, amikacin, isepamicin og liknende.

Andre forbindelser med antibiotisk aktivitet på grunn av inhibering av proteinsyntese i bakterier så som f.eks. spectinomycin, anisomycin og spesielt puromycin, og som har kjemiske strukturer beslektet med ikke-reduserende aminosukkerdeler, anses for å være "aminoglykosid-antibiotika", som også ofte gjøres på området. Det skal bemerkes at aminoglykosidforbindelser også har toksiske virkninger i eukaryot cellekultur, delvis på grunn av at mitokondrie-proteintranslasjonsapparatet er evolu-sjonært av prokaryot opprinnelse (endosymbiont-hypotese for mitokondrie-evolu-sjon) skjønt andre toksisitetseffekter også er mulig og er beskrevet tidligere.

For seleksjon av celler som uttrykker resistensgenproduktet, anvendes resistens-seleksjon med et neomycin-antibiotikum i det minste for innledende seleksjon av transfektanter etter transfektering av resistensgenet, som vanligvis er i stør-relsesordenen fra 48 timer opp til flere uker. Som en følge av dette blir neomycinresistensgenet stabilt transfektert i cellelinjen. Stabile transfektanter er vanligvis genomiske integranter i minst en uttrykt eller uttrykkbar kopi av neomycinresistensgenet, som gir opphav til funksjonelt genprodukt. Senere fremgangsmåter innenfor genmanipulering som kan sette i gang f.eks. frembringelse av kunstige, stabile minikromosomer i en celle, inngår likeledes i foreliggende begrep om "stabil trans-fektant". Det sier seg selv at, i henhold til de velkjente trarnsfeksjonsprotokoller så som f.eks. lipofeksjon, DEAE-dekstran, Ca-fosfat eller elektroporasjon, som alle er mulige transfekteringsfremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse, blir nylig transfekterte celler først dyrket i ikke-aminoglykosid-supplert medium før slikt supplement tilsettes for seleksjon. Dette mellomliggende ikke-seleksjons-tidsrom er nødvendig for effektiv ekspresjon av resistensmarkørgenproduktet og er i området fra ca. 12 timer opp til 1-2 dager, avhengig av celletype. Fortrinnsvis anvendes resi-stensseleksjon i minst 2 uker etter transfektering, mer foretrukket i minst 5 uker etter transfektering, mest foretrukket i minst 8 uker etter transfektering. Det er også mulig å utvide veksttidsrommet under seleksjonspress som utøves av neomycin-antibiotikum som er blitt tilsatt til mediet for ytterligere dyrking av cellene, f.eks. under fermentering i bioreaktoren. Det er også mulig, etter den innledende seleksjon av transfektanter, å påføre seleksjonspress i korte, mellomliggende tidsrom under ytterligere dyrking, ved gjentatt tilsetting av enkeltdoser av neomycin med dyrk-ingsmediet som så suppleres med ikke-anibiotikum supplert medium. Under dyrking i en bioreaktor blir det uttrykkbare eller uttrykte resistensgen fortrinnsvis stabilt integrert i genomet, og dyrking utføres i fravær av seleksjonspress. Det vil si at celledyrking, i f.eks. i en tilførselssats-bioreaktor, utføres i fravær av antibiotikumet supplert til celledyrkningsmediet enten i begynnelsen av eller i løpet av fermente-ringen.

Neomycin anvendes fortrinnsvis i en konsentrasjon på minst 0,1 mg/ml, fortrinnsvis i en konsentrasjon på minst 1 mg/ml, mest foretrukket i en konsentrasjon på minst 4 mg/ml. Vanligvis tilsettes en slik mengde neomycin til celledyrkningsmediet etter transfektering med ekspresjons-konstruksjonen for det tilsvarende resistensgenprodukt, som velkjent på området og grundig beskrevet i standard-laboratoriemanualene. Ytterligere foretrukket anvendes neomycin i en konsentrasjon på 1-4 mg/ml i minst 2 uker, mer foretrukket i minst 5 uker, mest foretrukket i minst 8 uker etter transfektering under kontinuerlig celledyrkning.

Resistensgenproduktet er fortrinnsvis en neomycin-fosfotransferase (resistensgenet kalles vanligvis Neo<r>) som beskrevet i WO 82/03087. Forskjellige naturlige isoformer av slike fosfotransferase-enzymer er kjent og omfattes også innenfor rammen for foreliggende oppfinnelse. Seleksjon med G418 (geneticin, som definert under Chemical abstracts registreringsnummer 49863-47-0) eller neomycin kan anvendes til seleksjon med henblikk på celler som uttrykker neomycingen-produktet. Ved en mer foretrukket utførelsesform anvendes G418 for seleksjon av resistente celler.

Dyrecellene eller -cellelinjen i cellekulturen ifølge foreliggende oppfinnelse

kan være hvilken som helst konvensjonell cellelinje som anvendes til fremstilling av rekombinant protein, så som f.eks. Sf9-insektceller, CHO-celler, HeLa-celler, COS-7-celler, VERO-96-celler, HepG2-celler, BHK-celler, fibroblaster, hybridomer, EBV-immortaliserte lymfoblaster eller "myelom"-celler så som f.eks. NSO-cellelinjen. Myelomceller så som NSO-celler er i virkeligheten B-lymfoidcelletyper skjønt de rutinemessig omtales innenfor teknikken som "myelomer" (Barnes et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000).

Dyrecellene eller -cellelinjen i cellekulturen i henhold til foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis forankrings-uavhengige celler. Slike celler er ikke avhengig av substratkontakt for behørig vekst og kan vokse fritt oppslemmet i dyrkningsmediet. Ved en mer foretrukket utførelsesform er produksjonscellelinjen lymfoide cellelinjer, f.eks. hybridomceller, EBV immortaliserte lymfoblaster eller myelomceller, og mest foretrukket er cellelinjen myelomceller og spesielt myelom-NSO-celler så som f.eks. cellelinje ECACC nr. 85110503 og derivater derav, fritt tilgjengelige fra European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Storbritannia. NS0 er funnet å gi potensielt opphav til ytterst høye produktutbytter, spesielt hvis de anvendes for produksjon av rekombinante antistoffer. De fleste standard-NSO-cellelinjer er kolesterolavhengige, noe som gjør kolesterol til en nødvendig komponent i dyrkningsmediet.

Ytterligere foretrukket er cellelinjen i cellekulturen ifølge foreliggende oppfinnelse som bærer et neomycinresistensgen, en cellelinje som videre er i stand til å uttrykke rekombinant glutaminsyntetase (GS), og mer foretrukket er den en rekombinant NSO-myelom-GS-cellelinje. NSO-celler er spesifikt fordelaktige hvis de anvendes med glutaminsyntetase-(GS)-ekspresjonssystemet (Bebbington et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker, Bio/Technology 10:169-175; Cockett et al., 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8: 662-667). Produktprotein-gensekvensen og GS-gensekvensen ble fortrinnsvis båret på en enkelt GS-plasmid-vektor for frembringelse av den transfekterte NSO-cellelinje, idet disse gener enten ble uttrykt fra forskjellige eller de samme promotere under anvendelse av f.eks. indre ribosominngangsseter. GS-systemet er ett av bare to systemer som er av spesiell betydning for produksjon av terapeutiske proteiner. Sammenliknet med dihydrofolatreduktase-(DHFR)-systemet, gir GS-systemet og spesielt GS-systemet anvendt i kombinasjon med NSO-myelomceller en stor tidsfordel under utviklingen på grunn av at sterkt produktive cellelinjer ofte kan frembringes fra den innledende blanding av transfektanter, hvorved man unngår behovet for multiple runder med seleksjon i nærvær av økende konsentrasjoner av selektivt middel for oppnåelse av genamplifikasjon (Brown et al., 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9:231-236). NSO-myelomceller har fenotypisk mangel på glutaminsyntetase. Derfor er NSO-cellelinjen som ble avledet fra en musetumor-cellelinje (G. Galfre og C. Milstein, Methods in Enzymol. 73, 3-75,1981), ofte den ønskede cellelinje for anvendelse av GS-systemet i industriell målestokk. Et eksempel på en slik cellelinje er 6A1-Neo-cellelinjen som ble deponert 30. august 2002 under Budapest-Traktaten under adkomstnummer 02083031 i European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury/ Wiltshire SP4 0JG, Storbritannia. Den deponerte cellelinje mangler rekombinant bcl-2 og er ytterligere beskrevet i forsøksavsnittet. Denne cellelinje og et potensielt av-kom som ble konstruert for å produsere annet antistoff enn rekombinant cB72, er ytterligere foretrukket. Slik konstruksjon kan omfatte cellefusjon samt stumgjøring eller utslåing av visse gener, samt mer tradisjonelle teknikker for frembringelse av rekombinanter samt frembringelse av varianter ved hjelp av mutagenesemetoder (som vist mer detaljert ovenfor) eller tradisjonelle mediumtilpasningsteknikker som konserverer eller forbedrer for et gitt celledyrkningsmedium vekstegenskapene hos opphavscellelinjen som deponert.

Ytterligere foretrukket mangler cellene som anvendes for høytetthets-celledyrkning, rekombinant uttrykt bcl-2-protein, bcl-xl-protein eller en annen funksjonell, funksjonell i betydningen apoptose-forebyggende, naturlig eller genetisk konstruert variant av den apoptoseinhiberende bcl-2-familie (Petros et al., 2001, Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2, Proe. Nati. Acad. Science U.S.A., 98, 3012-3017) eller artsanaloger til bcl-2 så som BHFR-1 av for eksempel Epstein Barr-virus, eller andre funksjonelle analoger til bcl-2, gjennomgått i Petrosl et al.

(ibd.). En slik foretrukket utførelsesform kan hensiktsmessig kombineres med en annen forannevnt foretrukket utførelsesform, nemlig fravær av seleksjonspress, underforstått som tilstedeværelse av aminoglykosid-antibiotikum under fermente-

ring. Overraskende nok er ko-ekspresjon av en neomycinresistensmarkør og bcl-2-protein funnet å være resistent overfor den celletetthets-befordrende effekt av neomycin-resistens. Uten at man er bundet av noen teori, synes derfor ikke den vekstbefordrende effekt å skyldes en anti-apoptotisk effekt eller bcl-2-basert effekt, siden koekspresjon av f.eks. bcl-2 og Neo<r>i dette tilfelle skulle være epistatisk heller enn standhaftig mot vekst med høy tetthet, slik det faktisk er observert i forsøk som tjener til sammenlikning.

Egnede medier og dyrkningsmetoder for pattedyrcellelinjer er velkjente på området, som beskrevet i for eksempel US-patent 5 633 162. Eksempler på standard-celledyrkningsmedier for laboratoriekolbe-celledyrkning eller celledyrkning med lav tetthet, og som er tilpasset til behovene hos spesielle celletyper, er for eksempel: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (G. Morre, The Journal of the American Medical Association, 199, s. 519, f. 1967), L-15-medium (A. Leibovitz et al., Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), Eagles minimalt essensielt medium (MEM), Hams F12-medium (R. Ham et al., Proe. Nati. Acad. Sc., 53, s. 288 ff, 1965) eller Iscoves' modifiserte DMEM som mangler albumin, transferrin og leeitin (Iscoves et al., J. Exp. Med. 1, s. 923 ff., 1978). Det er kjent at slike dyrkningsmedier kan suppleres med føtalt bovint serum (FBS, også kalt FCS), hvor sistnevnte tilveiebringer en naturlig kilde til en overflod av hormoner og vekstfaktorer.

Under transfektering og selektering med et aminoglykosid kan det anvendes hvilket som helst medium egnet for opprettholdelse av veksten av de dyrkede dyreceller. Når det gjelder vekst av dyrecellene med høy tetthet i en tilførselssats-bioreaktor må det anvendes et vekstdyrknings-medium med høy tetthet.

Et celledyrkningsmedium vil være et dyrkningsmedium for vekst med høy tetthet, ved definisjon, hvis dyrkningsmediet muliggjør vekst av dyreceller opp til eller over en tetthet av levedyktige celler på 10<6>celler pr. ml i et konvensjonelt tilførselssats-bioreaktorsystem. I forbindelse med foreliggende oppfinnelse gir et slikt dyrkningsmedium opphav til enda høyere celletettheter i kombinasjon med den foran beskrevne aminoglykosidseleksjon. Vanligvis vil et slikt medium omfatte 1-10 g/l glukose eller en annen energikilde, idet konsentrasjonen av glukose reguleres på dette nivå under tilførselssatsdyrkning. Mediet vil fortrinnsvis omfatte minst 2 g/l glukose, idet denne konsentrasjon hovedsakelig reguleres under tilførselssatsfer-mentering. Mediet er isotont, idet det nemlig er i området 270-320 mOsm/kg, for trinnsvis 280-300 mOsm/kg. Individuelle preferanser av visse celletyper, f.eks. lymfoide celler, for visse medier er velkjente på området og er komplekst korrelert til området, forholdet og den individuelle dosering av næringsstoffer. Eksempler på et høytetthets-vekstmedium egnet f.eks. for hybridomcellelinjer sammenliknet med standardmediene nevnt ovenfor er gitt i GB2251 249 A; slike høytetthets-vekst-medier kan vanligvis suppleres med næringsstoffer så som alle aminosyrer, energikilder så som glukose i området angitt ovenfor, uorganiske salter, vitaminer, spor-elementer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis er til stede i slutt-konsentrasjoner i mikromolarområdet), buffere, de fire nukleosider eller deres tilsvarende nukleotider, antioksidanter så som glutation (redusert), vitamin C og andre komponenter så som viktige membranlipider, f.eks. kolesterol eller fosfatidylcholin, eller lipidforløpere, f.eks. cholin eller inositol. Et høytetthetsmedium vil være anriket med de fleste eller alle disse forbindelser, og vil, bortsett fra når det gjelder de uorganiske salter basert på hvilke osmolariteten av det essensielt isotoniske medium reguleres, omfatte dem i høyere mengder (forsterket) enn de forannevnte standardmedier som kan utledes fra GB2251 249 sammenliknet med RPMI 1640. Et høytetthets-dyrkningsmedium blir fortrinnsvis forsterket på en balansert måte ved at alle aminosyrer, bortsett fra tryptofan, finnes i en mengde på mer enn 75 mg pr. I dyrkningsmedium. I forbindelse med det generelle aminosyrebehov, utgjør glutamin og/eller asparagin samlet fortrinnsvis mer enn 1 g pr. I, mer foretrukket mer enn 2 g pr. I av høytetthets-dyrkningsmediet. Det sier seg selv at den sistnevnte foretrukne utførelsesform er mindre egnet når det gjelder en rekombinant cellelinje transfektert med en glutaminsyntetase-(GS)-vektor. I en slik cellelinje vil et overskudd av f.eks. glutamintilførsel ("glutamine stemming") både fra eksogen og endogen kilde føre til dannelse av ammoniakk, som må unngås. Dyrkningsbetingelser for GS-transfekterte cellelinjer er beskrevet i eksemplene.

Det er formålstjenlig at høytetthets-celledyrkningsmediet mangler føtalt kalve-serum (FCS eller FBS), som betegnes "serumfritt". Det er ikke bare ansett for mulig i henhold til foreliggende oppfinnelse å oppnå høytetthets-vekst ved en tetthet av levedyktige celler på eller over 10<7>celler pr. ml med serumfritt medium, men det er overraskende funnet at supplering med føtalt serum er standhaftig mot vekst i høy tetthet for i det minste en del cellelinjer testet i forbindelse med foreliggende oppfinnelse, i motsetning til de vanlige forventninger hos en fagperson på området. Celler i serumfritt medium fordrer vanligvis insulin og transferrin i et serumfritt medium for optimal vekst. Transferrin kan i det minste delvis substitueres av ikke-peptid-sideroforer så som tropolon, som beskrevet i WO 94/02592. De fleste cellelinjer fordrer én eller flere syntetiske vekstfaktorer (omfattende rekombinante poly-peptider), innbefattende f.eks. epidermal vekstfaktor (EGF), fibroblast-vekstfaktor (FGF), insulinliknende vekstfaktorer I og II (IGFI, IGFII) osv. Andre klasser av faktorer som kan være nødvendige, innbefatter: prostaglandiner, transport- og bindingsproteiner (f.eks. ceruloplasmin, høy- og lavdensitets-lipoproteiner, bovint serumalbumin (BSA)), hormoner, innbefattende steroidhormoner, og fettsyrer. Polypeptidfaktortesting utføres best på trinnvis måte med testing av nye polypeptid-faktorer i nærvær av dem som finnes å være vekststimulerende. Det er flere meto-dologiske fremgangsmåter som er velkjente innenfor dyrecelledyrkning, og et eksempel på disse er beskrevet i det følgende. Det innledende trinn er å oppnå betingelser hvor cellene vil overleve og/eller vokse langsomt i 3-6 dager etter over-føring fra serumsupplert dyrkningsmedium. I de fleste celletyper er dette i det minste delvis en funksjon av inokulumtetthet. Når det optimale hormon/vekstfaktor/ poly-peptid-supplement er funnet, vil inokulumtettheten som trenges for overlevelse, reduseres.

Mer foretrukket er celledyrkningsmediet fritt for vekstfaktorer, noe som betyr at det er fritt for føtalt serum eller for tilsetting av hovedsakelig rene proteinvekst-faktorer som trigger henholdsvis signaloverføring og cellesyklusprogresjon. Slikt medium kan fremdeles omfatte andre proteiner så som insulin eller transferrin, som er egnet for å skaffe jern fra mediet, eller BSA som fordres for avgivelse av lipider så som kolesterol. Mer foretrukket anvendes slikt medium i forbindelse med lymfoide cellelinjer, mest foretrukket i forbindelse med myelomcellelinjer, spesielt NSO-cellelinjer.

Egnede bioreaktorer er sats-bioreaktorer så som f.eks. airlift-bioreaktorer eller omrørte bioreaktorer som rutinemessig anvendes for dyrking av dyreceller med høy tetthet. Når det gjelder celledyrkning med høy tetthet, vil en slik bioreaktor hensiktsmessig bli drevet på tilførselssatsmåte. Denne definisjon innbefatter også kontinuerlig tilførsels-drift. Tilførselssats-bioreaktorer som anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse har fortrinnsvis en volumetrisk oksygenmasse-overføringskoeffisient Ki_a (som definert i J. Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, N.Y. 1986) på minst 6 time"<1>, mer foretrukket minst 10 time"<1>. Mest foretrukket er en tilførselssats-bioreaktor med de nevnte foretrukne oksygenmasseoverføringsegenskaper en boble-bioreaktor. Boble-bioreaktorer er velkjente for en fagperson, og de avgjørende parametere for reaktorutforming er grundig beskrevet (for oversikt, se f.eks. M. Chisti et al., 1987, Airlift reactors, Chem. Eng. Commun. 60,195-242; A. Koch et al., 1987, Measurement and modeling of mass transport i airlift-loop reactors in relation to the reactor design, Chem. Ing. Tech. 59, 964-965). Skjønt det er selvinnlysende, understrekes det at tilførselssats-dyrkingen ikke omfatter perfusjonsdyrkningssystemer.

Høytetthets-cellekultur ifølge oppfinnelsen er definert som en populasjon av dyreceller med en tetthet av levedyktige celler på over 10<7>celler pr. ml, mer foretrukket over 1,23 x 10<7>celler pr. ml, mest foretrukket over 1,3 x 107 celler pr. ml. Populasjoner er kontinuerlig dyrket fra en enkelt celle eller inokulum med lavere tetthet av levedyktige celler i et celledyrkningsmedium i et konstant eller økende dyrkningsvolum.

Ytterligere foretrukket er tilførselssatskulturen et dyrkningssystem hvor i det minste glutamin, eventuelt med én eller flere andre aminosyrer, fortrinnsvis glycin, tilføres til cellekulturen som beskrevet i GB2251 249 for opprettholdelse av konsentrasjonen av dem i mediet, bortsett fra regulering av glukose-konsentrasjonen ved separat tilførsel. Mer foretrukket kombineres tilførselen av glutamin og eventuelt én eller flere andre aminosyrer med tilførsel av én eller flere energikilder så som glukose til cellekulturen som beskrevet i EP-229 809-A. Tilførselen innledes vanligvis 25-60 timer etter start av dyrkningen; for eksempel er det nyttig å starte tilførsel-en når cellene har nådd en tetthet på ca. 10<6>celler pr. ml. Den totale glutamin- og/ eller asparagintilførsel (for substituering av glutamin med asparagin, se N. Kurano et al., 1990, J. Biotechnology 15,113-128) er vanligvis i området fra 0,5 til 3 g pr. I, fortrinnsvis fra 1 til 2 g pr. I dyrkningsvolum; andre aminosyrer som kan være til stede i tilførselsmaterialet, er fra 10 til 300 mg total tilførsel pr. liter kultur; spesielt tilføres glycin, lysin, arginin, valin, isoleucin og leucin vanligvis i høyere mengder på minst 150-200 mg sammenliknet med de andre aminosyrer. Tilførselsmaterialet kan tilsettes som støtvis ("shot") tilsetning eller som kontinuerlig pumpet tilførselsmateri-ale; fortrinnsvis blir tilførselsmaterialet nesten kontinuerlig pumpet inn i bioreaktoren. Det sier seg selv at pH omhyggelig reguleres under tilførselssatsdyrkning i en bioreaktor ved omtrent fysiologisk pH optimalt for en gitt cellelinje ved tilsetting av base eller buffer. Når glukose anvendes som energikilde, er den totale glukosetilførsel vanligvis fra 1 til 10, fortrinnsvis fra 3 til 6 gram pr. liter av kulturen. I tillegg til inn- lemming av aminosyrer, omfatter tilførselsmaterialet fortrinnsvis en liten mengde cholin i området 5-20 mg pr. liter kultur.

Dyrecellen eller -cellelinjen er fortrinnsvis en produksjonscellelinje som produserer et andre produktprotein eller er i stand til å uttrykke et andre produktprotein, f.eks. ved induksjon. I henhold til foreliggende oppfinnelse er det andre produktprotein det protein som man søker å fremstille og høste i stor mengde. Det kan være hvilket som helst aktuelt protein, f.eks. terapeutiske proteiner så som interleukiner eller enzymer, f.eks. enzyminhibitorer eller antistoffer eller fragmenter derav (et fab-fragment for eksempel). Det kan være et rekombinant protein, båret på et plasmid eller en annen type vektor innbefattende genteknologisk konstruerte virus, eller det kan integreres stabilt i genomet i cellen ved hjelp av hvilken som helst teknikk. Det kan også være en naturlig forekommende ekspresjonskonstruksjon så som et antistoff som utskilles av plasma- eller hybridomceller. Produktproteinet kan innbefatte en signalsekvens som muliggjør sekresjon av polypeptidet fra verts-produksjonscellen. Det kan uttrykkes konstitutivt eller induserbart.

Produktproteinet er fortrinnsvis et rekombinant protein, mest foretrukket et

rekombinant protein som uttrykkes fra en konstitutiv promoter. "Rekombinant" ifølge foreliggende oppfinnelse betyr et protein som uttrykkes fra minst én eksogen kopi av det tilsvarende gen i en cellelinje som opprinnelig er blitt innført i cellelinjen ved hjelp av hvilken som helst teknikk for genteknologisk konstatering, uansett om hvorvidt det bestemte protein finnes i produksjonscellelinjen i minst én naturlig tilstede-værende kopi. Slike ytterligere kopier av et rekombinant gen kan f.eks. innlemmes i genomet eller bæres på et episomalt element. Det kan anvendes enten stabil eller forbigående ekspresjon. Hvilken som helst kjent ekspresjonsvektor-teknologi, innbefattende genteknologisk konstruerte virus, kan anvendes i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse. Mer foretrukket er det rekombinante protein et kromoso-malt stabilt integrert protein.

Ytterligere foretrukket er produktproteinet et utskilt protein. Mer foretrukket er produktproteinet et antistoff eller konstruert antistoff eller et fragment derav; mest foretrukket er det et immunglobulin G-(lgG)-antistoff.

Eksempler

1. Frembringelse av cellelinjer og plasmider

NSO 6A1 (100)3-cellelinjen (6A1 for lettvinthets skyld; Lonza Biologics pla, Slough/UK) utskiller et kimært humant-muse-lgG-antistoff (cB72.3) fra en stabilt integrert rekombinant glutaminsyntetase-(GS)-ekspresjonskonstruksjon. Rekombinante cellelinjer som bærer neomycinresistens, ble oppnådd ved transfektering av 6A1 -cellelinjen med plasmidvektorer enten dicistronisk ved ekspresjon av bcl-2 og Neor eller alene ved ekspresjon av Neo<r>fra en enkelt plasmidkonstruksjon. For frembringelse av pEF-Neor ble MC1 Neo poly A-kassetten fra pMCIneopA (Stratagene) innsatt i pEF BOS (Mizushima et al., 1990, pEF BOS, en kraftfull pattedyrekspresjonsvektor, Nucleic Acids Research 18, 5322) som har "stufferen", under fremstilling av pEF MC1 neo poly A (Visvader et al., Mol. Cell Biol. 1995 feb; 15(2):634-41). Fig. 4 viser plasmidkartet. For frembringelse av pEFbcl-2-Neo<r>ble EcoRI/Taq l-fragmentet av humant bcl-2-cDNA (lang anti-apoptotisk transkript-versjon, Cleary et al., Cell 47: 19-28 (1986)) subklonet i plC194 (Gene 32:482, 1984) åpnet med EcoRI/Clal og utskåret som Sali (stump)/EcoRV-fragment som ble ytterligere klonet i butt-ende Xbal-setet av multippelkloningssetet (MCS) av pEF-MdneopA. bcl-2- uttrykkes følgelig fra forlengelsesfaktor-(EF)-1-a-promoteren (plasmidkart, fig. 3). Neo<r->ekspresjonskassetten (MCIneopA) er en integral del av pEF-vektoren, skjønt i pEF-Neo-vektorkonstruksjonen som til slutt ble anvendt, ble MCS ut over EF1-a-promoteren åpnet ved Xhol-setet, gjort buttendet og et tilfeldig 300 bp "stuffer"-fragment fra en ikke-kodende sekvens ble innsatt for passende kontroll (plasmidkart, fig. 4). Lipofectin (Gibco, Paisely, Scotland)-mediert trans-feksjon ble utført i henhold til fabrikantens protokoll. Plasmidtransfektanter ble utvalgt med 1 mg/ml G418 i GMEM-medium (Gibco) supplert med 5% føtalt kalve-serum og ytterligere supplementer som beskrevet i Tey et al. (B. Tey et al., Bcl-2-mediated suppression of apoptosis in myeloma NSO cultures, J. Biotechnology, 79(2000), 147-159). Stabile transfektanter ble deretter tilpasset til serumfritt høy-tetthets-vekstmedium EX-CELL 302.

2. T ilførselssats- celledyrkning med høv tetthet

For høytetthets-celledyrkning ble NSO 6A1-opphavscellelinjen, 6A1 Neo-cellelinjen og 6A1 bcl-2/Neo-kontrollcellelinjen tilpasset til serumfritt medium EX-CELL 302 (JRH Biosciences Inc., KS/U.S.A.) supplert med 1 ml/50 ml GSEM (GS-ekspresjonsmediumsupplement, produktnummer G9785, Sigma, Poole, UK). Under gjennomgang ble 25^M MSX og 0,7 g/l G418 supplert til mediet, men ble utelatt fra inokulum og bioreaktor-dyrkningsmedium. Tetthet av levedyktige celler under bioreaktor-celledyrkning er vist på fig. 1 for dyrkning av individuelle cellelinjer. Tilfør-selssatskultur for hver cellelinje ble satt opp som følger:

Myelomcellelinjen ble dyrket i en 10 I airlift-fermenteringsinnretning i serumfritt EX-CELL 302-medium. Utgangs-cellepopulasjonstettheten var omtrent 10<5>celler pr. ml fra frisk middel-eksponensiell kultur. Etter kontinuerlig dyrkning til en tetthet på ca. 10<6>celler pr. ml, ble det utført støtvise tilsettinger av supplementer og det pumpede supplement igangsatt (tabell 1). Tilførselen var kontinuerlig over 100 timer. pH ble regulert til omtrent pH 7. Dyrkningstettheten ble bestemt omtrent hver 25. time ved telling, og cellenes levedyktighet ble bestemt ved trypanblått-eksklusjon. Med henblikk på konsentrasjon av total cellemengde og mengden av levedyktige celler, ble en omtrentlig fortynnet prøve fortynnet med trypanblått (Sigma, Poole, UK) fulgt av en mikroskopisk undersøkelse med anvendelse av et modifisert Fuchs-Rosental-hemocytometer. For telle-kontrollering ble det anvendt en CASY-teller for måling av den totale cellekonsentrasjon og konsentrasjonen av levedyktige celler, basert på cellestørrelse.

Mens den rekombinante bcl-2/Neo-cellelinje vokste til en maksimumstetthet av levedyktige celler på bare ca. 10<7>celler pr. ml, vokste den rekombinante Neo-cellelinje, i motsetning til Tey et al., som beskrev å ha oppnådd maksimale celletettheter på < 10<6>celler pr. ml i serumsupplert tilførselssatskultur, til en maksimumstetthet på 1,4x10<7>celler pr. ml (fig. 1). Levedyktighet av talte celler ble bestemt ved trypanblått-eksklusjon som beskrevet foran.

Rom-tid-utbytte av rekombinant antistoff var til fordel for den rekombinante Neo-cellelinje (fig. 2). Dette er vist ved grafisk fremstilling av produkttiter i bioreaktoren sammenstilt med kumulativ celletid (CCT; enhet: 10<9>celle time /1). CCT ble beregnet ved integrasjon av cellevekstkurven, hovedsakelig som beskrevet i Renard et al. (1988, Biotechnology Letters 10: 91-96). Det kan utledes fra fig. 2 at middel-enkeltcelleproduktiviteten for den rekombinante bcl-2/Neo-cellelinje var 0,260 pg protein/celle.h, mens Neo-cellelinjen utgjorde 0,210 pg protein pr. celle. Den lille forskjell i enkeltcelleproduktivitet (qp) var tydelig tallmessig underlegen ved nivået for totalt utbytte ved forskjellen i tettheter av levedyktige celler.

3. Bestemmelse av genkopiantall

Genkopiantall for neomycinresistensgenet ble bestemt for 6A1-Neo-cellelinjen deponert ved hjelp av kvantitativ PCR-analyse, under anvendelse av 6A1-opphavet som komparativ standard. Et genkopiantall på 3,0 kopier (± 0,4) ble bestemt. På bakgrunn av konkatamerisk integrasjon av stabilt transfekterte gener betyr dette at enkelt integrasjon av den rekombinante neomycinresistensmarkør fant sted i 6A1-Neo-cellelinjen uten yttterligere amplifikasjon. Dette er i overensstemmel-se med de lave MSX-konsentrasjoner på ca. 25 \ iM MSX; for at amplifikasjon av et GS-markørgen skal finne sted, trenges det anvendelse av 10-20x ganger høyere konsentrasjoner av seleksjonsmidlet. Analysen ble utført av et spesialisert kontrakt-laboratorium (Lark Technologies Inc., Houston, Texas). I tillegg til testing med henblikk på neomycinresistensgenet fra Transposon Tn5, ble det etablert en negativ kontroll ved den samme testing med henblikk på muse-glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-[GAPDH]-genet. En klonet plasmidstandard ble anvendt til kalibre-ring av analyseplatene. Kopiantall ble beregnet som antallet mål (NEO) pr. celle (MUSGADPH), idet man antok at DNA-massen i standard-pattedyrdiploidcellen er ca. 6,6 pg og at GADPH er til stede i to kopier pr. celle. Genomisk DNA ekstrahert fra celler ble kvantifisert spektrofotometrisk ved måling av optiske tettheter ved 260 og 280 nm, som er rutine på området. For analysering av kopiantallet av neomycin-resistensgen ble det frembrakt en QPCR-standardkurve under anvendelse av åtte fortynninger av pMC1 neopA-plasmidet levert av Lonza Biologics. Fortynningsserien representerte området fra 5 x 10<6>kopier til 49 kopier av plasmid-DNA. Hver standard ble fortynnet i GS-NSO-kontroll-genom-DNA (ekvivalent til 1000 celler) for etterlikning av matrikseffekten av den ekstraherte cellelinje-DNA. Negative kontroll-reaksjoner som ikke inneholdt noe templat eller som bare inneholdt kontrollplasmid-et (5000-50 000 kopier) eller DNA ekvivalent til 1000 GS-NS0-celler (opphavs-cellelinje, ca. 6,6 ng), ble oppsatt.

Kopiantallet ble bestemt med 95% konfidensintervall ved bestemmelse av terskelsyklus (Ct). Ct er fraksjonsantallet ved hvilket reporter-fluorescensen produsert ved probespaltning krysser en fastsatt terskel lagt over basislinjen. Hver økning i den numeriske verdi for Ct representerer en 2x økning i mål, idet man antok 100% PCR-effektivitet. Seks uavhengige fortynninger av hver testartikkel-DNA ble tillaget og analysert i to eksemplarer. Hver QPCR-reaksjon inneholdt ca. 6,6 ng testprøve-DNA. QPCR-reaksjonene ble oppsatt i henhold til TaqMan™ Universal PCR Master Mix-protokollen (Applied Biosystems, Foster City, CA). Reaksjonene gjennomgikk termisk syklus, og dataene ble oppsamlet ved hjelp av ABI Prism 7700 Sequence Detection System versjon 1.6.3 (Applied Biosystems).

4. Sammenlikningseksempel: Dyrking av 6A1- opphavscellelinje i fravær av Neo- resistensgen, men i nærvær av subletale mengder av G418

For ekskludering av eventuell veksteffekt som ble frembrakt ved eksponering for G418 heller enn for tilstedeværelse av et uttrykt neomycin-resistensgen, ble opphavscellelinjen 6A1 tilpasset til G418-holdig celledyrknings-medium. Mengden av G418 kunne gradvis økes opp til en konsentrasjon på 360 mg/ml G418 (Sigma, Poole, UK; bemerk at partikvaliteten av G418 kan variere betydelig avhengig av kilde) uten oppheving av celleveksten. Dyrkningsmediet var Lonzas merkebeskyt-tede optimaliserte NSO-celedyrkningsmedium PM1 supplert med 6 mM glutamin i fravær av føtalt serum. Når det gjaldt 6A1-Neo-cellelinjen, muliggjorde dette serumfrie medium reproduserbart oppnåelse av de høye celletettheter ifølge foreliggende oppfinnelse (>2 x 10<7>celler pr. ml) sammenliknet med bcl-2-transfektant eller ikke-transfekterte opphavscellelinje 6A1. Mediet var derfor egnet til overvåking av potensiell effekt av G418-adaptasjon i fravær av neomycinmarkørgen.

Sammenliknet med ikke-adaptert opphavscellelinje dyrket i PM1 + 6 mM glutamin, varde adapterte celler dyrket i G418(-)-medium litt mer resistente overfor apoptotisk og nekrotisk celledød (data ikke vist), men hadde lavere veksthastighet og lavere maksimal celletetthet sammenliknet med opphavscellelinjen (fig. 5A: Tetthet av levedyktige celler i satskultur av NSO 6A1-cellelinje/ikke-adaptert 6A1 : fylte sirkler, 6A1 adaptert til 360 mg/ml G418 dyrket i nærvær (åpne sirkler) og fravær (fyle trekanter) av G418). Ved subtrahering av telleverdien for levedyktige celler fra totalcelle-telleverdien ble antallet døde eller nekrotiske celler bestemt og er uttrykt på fig. 5B som prosentandel av totalcelle-telleverdien. Forsøket muliggjorde å konkludere med at eksponering for G418 i fravær av neomycin-resistensmarkør derfor ikke bare vil kunne forklare potensiell effekt av forsterket høytetthetsvekst-oppførsel. Interessant nok minimaliserte bioreaktordyrkning av adaptert cellelinje i nærvær av 360 mg/l G418 enda mer både veksthastigheten og maksimum celletetthet for den adapterte cellelinje i serumfritt medium PM1.

5. q p i satskultur av 6A1, 6A1- Neo og 6A1- bcl- 2

Cellelinjene er allerede beskrevet i eksemplene 1 og 2; celledyrking ble utført som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra at i stedet for tilførselssatsdyrkning i en airlift-fermenteringsinnretning, ble enkel satsdyrkning utført i en ristekolbe. Enkelt-celleproduktiviteten ble bestemt ved analysering av sekresjon av cB72.3 i et ELISA-testformat fra dyrkningsporsjoner. Porsjonene ble talt med henblikk på antallet levedyktige celler og gjenoppslemmet i friskt medium i en 96-brønns-plate i et på for-hånd fastsatt tidsrom. Dyrkningsprøver ble tatt etter ca. 80 timer og ved høsting (ca. 240 timer). Resultatene er vist på fig. 6B. Vekstkurve basert på tetthet av levedyktige celler ifølge bestemmelse ved trypanblått-eksklusjon er vist på fig. 6A (åpne sirkler: 6A1-Neo, fylte trekanter: 6A1-bcl2, fylte sirkler: 6A1-(100)3). 6A1-Neo-cellelinjen viste konsekvent høyere enkeltcelleproduktivitet qp enn 6A1-bcl-2-cellelinjen. Opphavs-6A1-cellelinjen har en enda høyere qp som er negativt balansert ved sitt mye lavere vekstpotensial.

Claims (10)

1. Fremgangsmåten for proteinekspresjon, karakterisert vedat den omfatter trinnet a. dyrking av en dyrecellelinje til en tetthet av levedyktige celler på minst eller over 10<7>celler pr. ml i et serumfritt dyrkningsmedium for vekst med høy tetthet, i en tilførselssats-bioreaktor, hvilken cellelinje er transfektert med et uttrykkbart neomycinrestistensgen og er transfektert med en uttrykkbar glutaminsyntetase, og hvilken cellelinje videre er i stand til å uttrykke et produktprotein; og videre omfatter trinnet b. isolering av produktproteinet fra dyrkningsbuljongen.

2. Anvendelse av neomycinresistensgenprodukt for oppnåelse av vekst av dyreceller med høy tetthet, hvilke celler videre er i stand til å uttrykke rekombinant glutaminsyntetase og hvor veksten med høy tetthet er over 10<7>celler pr. ml.

3. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor dyrecellene er lymfoide celler, mer foretrukket myelomceller, mest foretrukket NSO-celler.

4. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge krav 1-3, hvor cellene transfekteres med DNA som bærer en uttrykkbar neomycinresistenskassett og deretter under-kastes seleksjon av celler med en neomycinresistensfenotype ved inkubering med neomycin eller fortrinnsvis G418 i en konsentrasjon på minst 1 mg/ml i celledyrkningsmedium.

5. Fremgangsmåte eller anvendelse ifølge krav 4, hvor cellene blir videre dyrket til høy tetthet i et tilførselssats-bioreaktorsystem etter seleksjon av neomycin-resistente celler.

6. Cellekultur med høy tetthet, karakterisert vedat den omfatter dyreceller som finnes i et flytende medium i en tilførselssats-bioreaktor i et serumfritt celledyrkningsmedium med vekst med høy tetthet, hvor cellekulturen har en tetthet av levedyktige celler på over 10<7>celler pr. ml, og hvor cellelinjen er transfektert med et uttrykkbart neomycin-resistensgen og er transfektert med en uttrykkbar glutaminsyntetase.

7. Cellekultur ifølge krav 6, hvor kulturen er oppnådd ved dyrking av et inokulum av cellene med en tetthet av levedyktige celler som er lavere enn 10<7>celler pr. ml.

8. Cellekultur ifølge krav 6-7, hvor cellene bærer et neomycinresistens-markørgen.

9. Cellekultur ifølge krav 6-8, hvor cellene er behandlet med neomycin antibiotika supplert til mediet etter transfektering av det uttrykkbare neomycin-resistensmarkørgen.

10. Cellekultur ifølge krav 6, hvor cellene mangler rekombinant bcl-2 eller funksjonelle varianter eller artsanaloger derav.