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Die
vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der Proteinexpression
in der Biotechnologie. Sie betrifft spezifisch die Verwendung von
Aminoglycosidresistenzgenen, insbesondere des Neomycinresistenzgens, zum
Erzielen von Hochdichte-Wachstum von tierischen Zellen, ein entsprechendes
Verfahren zur Proteinherstellung und eine Hochdichte-Zellkultur.
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Die
biotechnologische Herstellung therapeutischer Proteine mittels tierischer
Zellkultur ist ein sehr mühsames
und teures Unterfangen. Die Effizienz der Produktion einschließlich Produktabtrennung
und -aufarbeitung wird hauptsächlich
durch die Raum-Zeit-Ausbeute des Initialzellkulturschritts geregelt.
Erwünscht sind
sowohl hohe Ausbeuten als auch eine hohe Konzentration an Produktprotein
in der Kulturbrühe.
Folglich übersetzen
sich vergleichsweise geringe Zunahmen der erreichten maximalen Zelldichte
vor dem Eintreten in die noch produktive stationäre Phase von Zellkulturen im
Industriemaßstab
in eine beträchtliche
Verbesserung der Gesamtproduktivität, wobei dies einfach auf die
hohe Gesamtanzahl der auf diese Weise zugefügten Zellen zurückzuführen ist.
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Stark
abhängig
vom Zelltyp und von dem Kultivierungsverfahren konnten herkömmliche Fed-Batch-Kultursysteme,
die für
das Hochdichte-Wachstum optimiert sind, wie etwa Airlift-Reaktoren,
kein Wachstum serumfreier Zellkulturen auf eine Dichte von bis zu
oder sogar mehr als 107 Zellen/ml erreichen.
Höhere
Dichten sind potentiell in einer mit Serum angereicherten Fed-Batch-Kultur oder
in moderneren Perfusionsreaktorsystemen erreichbar. Beide Möglichkeiten
bringen jedoch gravierende Nachteile mit sich. Mit fötalem Rinderserum
angereicherte Kulturmedien, die einen ganzen Bereich natürlicher
wachstumfördernder
Substanzen umfassen, sind hinsichtlich der Qualität stark
von der Serumquelle abhängig,
und tragen, und das ist am entscheidendsten, permanent das Risiko,
ungewollt tierische Viren in Kulturen einzuführen, die therapeutische Proteine
für medizinische
Anwendungen produzieren. Deshalb ist die Serumanreicherung aus regulatorischen
Gründen
zu vermeiden.
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Perfusionsreaktorsysteme
sind indes sehr viel komplexer und erfordern während des Betriebs mehr Kontrolle
und sind im Betrieb sehr viel teurer als herkömmliche Fed-Batch-Kultursysteme.
Und zwar aufgrund des permanenten Einfließenlassens frischen Kulturmediums,
das Mikrofiltersysteme auf dem Stand der Technik zur parallelen
Abgabe von Medium aus dem Reaktor erfordert. Insbesondere das Verstopfen
der Filtereinheit durch Zellbruchstücke oder Protein bringt das
Risiko des vorzeitigen Abbruchs des Vorgangs mit sich. Im Vergleich
dazu hat eine Fed-Batch-Kultur erhebliche Vorteile hinsichtlich
der Wirtschaftlichkeit und Robustheit des Prozesses.
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Ferner
erfordert die Erzeugung stabiler Zelllinien, die ein interessierendes
Protein produzieren, die Einführung
mindestens eines üblicherweise
konstitutiv exprimierten Resistenzmarkergens. Die Expression eines
solchen Markergens stellt eine zusätzliche metabolische Belastung
für die
Zelle dar, die bestenfalls das Wachstumsverhalten nicht beeinträchtigt oder
aber die Wachstumsrate und die maximale Dichte von lebensfähigen Zellen
sogar in reichlich mit Serum angereichertem Zellkulturmedium ziemlich
negativ beeinflusst (Gaigle et al., 1999, Aminoglycoside antibiotic
phosphotransferases are also serine protein kinases, Chemistry and
Biology 6, 11-18; Maio et al., 1991, Gene activation mediated by
protein kinase C in human macrophage and teratocarcinoma cells expressing
aminoglycoside phosphotransferase activity, J. Cell. Physiology
149, 548-559; Southern et al., 1982, Transformation of mammalian
cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control
of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341).
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Nachteile des Stands
der Technik zu vermeiden und ein Verfahren zum Züchten von tierischen Zellen
auf eine hohe Zelldichte in einem serumfreien Kultursystem bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch das Exprimieren von Aminoglycosidresistenzgenen
in tierischen Zellen gelöst,
wonach die Zellen in geeigneten Medien und in einem geeigneten Kultursystem
gemäß der unabhängigen Ansprüche 1, 2,
6 kultiviert werden. Überraschenderweise
können,
wie bei dieser Technik üblich,
abhängig
vom Kultivierungsverfahren und dem Kulturmedium, Zelllinien, die
gemäß der vorliegenden
Erfindung behandelt wurden, in einem serumfreien Zellkulturmedium
auf sehr viel höhere
Zelldichten als ihre nicht behandelten Stammzellline wachsen. Außerdem wurde
eine gewisse Verlängerung
der stationären
Wachstumsphase beobachtet. Auf diese Weise sind maximale Dichten
lebensfähiger
Zellen in serumfreier Kultur erreichbar, die vor der Erfindung nicht
realisiert werden konnten.
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Eine
mögliche
Ausführungsform
der Erfindung wird in der Figur gezeigt. Es wird Folgendes gezeigt:
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1:
Dichten lebensfähiger
Zellen während
des Wachstums von Neo-transformierten NS0-Zelllinien in einem 10-Fed-Batch-Airlift-Reaktorsystem
im Vergleich mit einer Stammzell- und einer bcl-2-transformierten Zelllinie.
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2:
Produktivität
für sezernierte
Antikörper
ausgedrückt
als kumulative Zellzeit während
des Wachstums der Neo-transformierten NS0-Zelllinie in einem 10-Fed-Batch-Airliftreaktorsystem
im Vergleich mit einer bcl-2-transfizierten
Zelllinie.
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3:
Plasmidkarte pEF-bcl-2
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4:
Plasmidkarte pEF-Neo
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5: Vergleichswachstumsexperiment mit einer
NS0-Zelllinie, angepasst
auf nichtletale Dosen von G418.
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6: Schüttelkolben-Batchkultur
und Produktivität
einer Neo-transformierten NS0-Zelllinie im Vergleich mit einer Stammzell-
und einer bcl-2-transformierten Zelllinie.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Aminoglycosidresistenzgenprodukt verwendet, um
das Hochdichte-Wachstum von tierischen Zellen zu erreichen. Die
Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst das Exprimieren des Resistenzgenprodukt in den
Zellen, das Selektieren von Zellen, die ein solches Resistenzgenprodukt
exprimieren mit einem Aminoglycosidantibiotikum, bevorzugt mit dem
Antibiotikum Neomycin, dessen Aminoglycosid durch das entsprechende
Resistenzgenprodukt abgebaut wird, und schließlich das Kultivieren solcher
Zellen in einem Bioreaktor, z. B. einem Airliftreaktor oder einem
gerührten
Bioreaktor, in einem geeigneten, serumfreien Zellkulturmedium, das
ein solches Hochdichte-Wachstum ermöglicht.
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Ein
Resistenzgenprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung ist jeder Aminoglycosidresistenzmarker, wie etwa bekannte
Resistenzgene für
Gentamycin, Neomycin, Hygromycin und insbesondere für Neomycin, der
als genetischer Marker für
eukaryotische Zellen verwendet werden kann. Aminoglycosidresistenzgene werden
allgemein in der Molekularbiologie eukaryotischer Zellen benutzt
und werden in vielen Standardlehrbüchern und Laborhandbüchern beschrieben
(für eine
Beschreibung vgl. z. B. Shaw et al., 1993, Molecular genetics of
aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the
aminoglycoside-modifying enzymes, Microbiol. Rev. 57:138-163; WO
82/03087; Southern et al., 1982, Transformation of mammalian cells
to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of
the SV40 early region promoter, J. Mol.
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Appl.
Genet. 1, 327-341). Wie aus dem zuvor gesagten abgeleitet werden
kann, wird davon ausgegangen, dass das Aminoglycosidresistenzgenprodukt
ein im Hinblick auf seine Aminoglycosid-abbauende Aktivität gemäß der Erfindung
funktionelles Genprodukt ist. Es ist daher denkbar, gentechnisch
veränderte,
im oben genannten Sinn funktionelle Varianten bekannter Aminoglycosidresistenzgenprodukte
in der vorliegenden Erfindung zu benutzen. Solche Varianten können z.
B. durch Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Trunkationen
der Aminosäure
bzw. deren kodierender DNA-Sequenz generiert werden. Verfahren hierfür sind dem
Fachmann bekannt und umfassen üblicherweise
ortsspezifische Mutagenese oder die Generierung von Diversität durch
Zufallsmutagense, der dann die Selektion der gewünschten Varianten mittels funktioneller
Assays folgt. Routineverfahren, die für die Mutagenese verwendet
werden, können
z. B. die Exposition an alkylierende Mittel oder UV-Strahlung, zu
Fehlern neigende PCR oder verwandte Genzusammenbau-PCR-Techniken sein, und
werden üblicherweise
in Mikroorganismen durchgeführt
(Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory 1972; Ling et al., 1997, Approaches to DNA Mutagenesis,
Analytical biochemistry 254, 157-178; Cadwell et al., 1992, Randomization
of genes by PCR mutagenesis in: PCR Methods, Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1992; Moore et al., 1997, Strategies for the in
vitro evolution of protein function, J. Mol. Biol. 272, 336-347).
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Zweckmäßigerweise
wird das Resistenzgenprodukt aus einem DNA-Expressionskonstrukt
exprimiert, das sich für
die eukaryotische Expression eignet, das in die Zellen durch bekannte
Techniken transfiziert wurde; das Resistenzgenprodukt kann konstitutiv
exprimiert werden oder kann induzierbar exprimiert oder reprimiert
werden, d. h. auf die eine oder die andere Art exprimierbar sein.
Das Resistenzgenprodukt sollte mindestens während der Selektionsperioden
mit einem Aminoglycosidantibiotikum und während der logarithmi schen Entwicklung
in einem Hochdichte-Zellkultursystem zum Erreichen der maximalen
Zelldichte, gemäß der vorliegenden
Erfindung exprimiert werden. Bevorzugt wird es konstitutiv exprimiert,
z. B. aus Thymidinkinase (TK) oder dem späten Siamian-Virus-Promoter
(SV40), am stärksten
bevorzugt wird es aus einem starken viralen Enhancer-Promoter exprimiert,
der konstitutiv in eukaryotischen Zellen aktiv ist, wie z. B. etwa
dem langen terminalen Wiederholungs(LTR)-Promoter des Rous Sarkom-Virus
(RSV) oder dem Cytomegalovirus-Promoter (CMV). Es kann auch möglich sein,
chimäre
Promoter zu nutzen, die aus dem Enhancerabschnitt eines starken viralen
Promoters und dem Core-Promoterabschnitt eines anderen Promoters
bestehen, z. B. dem alpha-Actinpromoter, die notwenige, z. B. Transkriptionsstart-,
TATA-Boxen und CAAT-Boxen
bereitstellen.
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Ein
Aminoglycosid gemäß der vorliegenden
Erfindung sind die allgemein bekannten Aminoglycosidantibiotika
(Mingeot-Leclercq, M. et al., Aminoglycosides: acitivity and resistance,
1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43(4): 727-737), die mindestens
eine Amino-Pyranose-
oder Amino-Furanose-Komponente umfassen, die über eine Glycosidbindung an
die andere Hälfte
des Moleküls
gebunden ist. Deren antibiotische Wirkung basiert auf der Inhibition
der Proteinsynthese. Beispiele sind Kanamycin, Streptomycin, Gentamicin,
Tobramycin, G418 (Geneticin), Neomycin B (Framycetin), Sisomicin,
Amikacin, Isepamicin und ähnliche.
Es ist anzumerken, dass Aminoglycosidverbindungen in einer eukaryotischen
Zellkultur auch toxische Wirkungen haben, teilweise weil der mitochondriale
Proteintranslationsapparat evolutionär prokaryotischen Ursprungs
ist (Endosymbionten-Hypothese der Mitochondrienentwicklung), obwohl
andere Toxizitätswirkungen
ebenfalls möglich sind
und bereits beschrieben wurden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird zum Selektieren der Zellen, die das Resistenzgenprodukt
expri mieren, die Resistenzselektion mit einem Aminoglycosidantibiotikum
mindestens für
initial selektierende Transfektanten nach der Transfektion des Resistenzgens
angewendet, die allgemein in der Größenordnung von 48 Stunden bis
zu mehreren Wochen liegt. Folglich wird das Aminoglycosidresistenzgen
stabil in die Zelllinie transfiziert. Stabile Transfektanten sind
allgemein genomische Integranten mindestens einer exprimierten oder
exprimierbaren Kopie des Aminoglycosidresistenzgens, die das funktionelle
Genprodukt hervorrufen. Neuere Ansätze der Gentechnik, die z.
B. die Erzeugung künstlicher,
stabiler Minichromosomen in einer Zelle entwickeln können, sind
ebenso im vorliegenden Begriff des 'stabilen Transfektanten' enthalten. Es versteht sich,
dass gemäß der bekannten
Transfektionsprotokolle, wie z. B. etwa Lipofektion, DEAE-Dextran,
Ca-Phosphat- oder Elektroporation, die alle mögliche Transfektionsverfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung sind, frisch transfizierte Zellen zuerst in einem nicht
mit Aminoglycosid angereicherten Medium kultiviert werden, bevor
für die
Selektion ein solcher Zusatz zugefügt wird. Diese Zwischenzeit
der Nicht-Selektion ist für
die effiziente Expression des Resistenzmarkergenprodukts erforderlich
und liegt, abhängig
vom Zelltyp, innerhalb eines Bereichs von ungefähr 12 Stunden bis zu 1 bis
2 Tagen. Bevorzugt wird die Resistenzselektion mindestens 2 Wochen
nach der Transfektion angewendet, stärker bevorzugt mindestens 5
Wochen nach der Transfektion, am stärksten bevorzugt mindestens
8 Wochen nach der Transfektion. Es ist auch möglich, die Wachstumsperiode
unter Selektionsdruck auszudehnen, der durch das Aminoglycosidantibiotikum
ausgeübt
wird, das dem Medium zur weiteren Kultivierung der Zellen, z. B.
während
der Fermentation im Bioreaktor, zugefügt wurde. Es ist auch möglich, nach
der anfänglichen
Selektion der Transfektanten, Selektionsdruck in kurzen eingestreuten
Intervallen während
der weiteren Kultivierung anzuwenden, indem wiederholt Zugaben von
Aminoglycosid- Einzeldosen
mit dem Kulturmedium zugefügt
werden, das dann aufgefüllt
wird mit nicht mit Aminoglycosid angereichertem Medium. Bevorzugt
wird das exprimierbare oder exprimierte Resistenzgen gemäß der vorliegenden
Erfindung während
der Kultivierung in einem Bioreaktor stabil in das Genom integriert
und die Kultivierung ohne Selektionsdruck durchgeführt. Das
heißt,
die Zellkultur wird, – z.
B. in einem Fed-Batch-Bioreaktor gemäß einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung – ohne
ein mit einem Aminoglycosidantibiotikum angereichertes Zellkulturmedium,
entweder zu Beginn oder im Laufe der Fermentation, ausgeführt.
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Das
Aminoglycosid wird bevorzugt in einer Konzentration von mindestens
0,1 mg/ml, bevorzugt in a Konzentration von mindestens 1 mg/ml,
am stärksten
bevorzugt in einer Konzentration von mindestens 4 mg/ml benutzt. Üblicherweise
wird das Aminoglycosid gemäß der Erfindung
dem Zellkulturmedium nach der Transfektion mit dem Expressionskonstrukt
für das
entsprechende Resistenzgenprodukt in einer solchen Menge zugefügt, die
dem Fachmann bekannt ist und in den Standard-Laborhandbüchern beschrieben
wird. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform
wird das Aminoglycosid in einer Konzentration von 1 bis 4 mg/ml
für mindestens
2 Wochen benutzt, stärker
bevorzugt für
mindestens 5 Wochen, am stärksten
bevorzugt für
mindestens 8 Wochen nach der Transfektion während der kontinuierlichen
Zellkultivierung.
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Das
Resistenzgenprodukt gemäß der vorliegenden
Erfindung ist bevorzugt eine Neomycin-Phosphotransferase (wobei
das Resistenzgen üblicherweise
mit Neor bezeichnet wird), wie in WO82/03087
beschrieben. Es sind verschiedene natürliche Isoformen eines solchen
Phosphotransferaseenzyms bekannt und ebenfalls im Umfang der vorliegenden
Erfindung enthalten. G418-Selektion
(Geneticin, wie in den Chemical Abstracts, Registrierungsnummer
49863-47-0 definiert) oder Neomycin kann verwendet werden, um Zellen
zu selektieren, die das Neomycingenprodukt exprimieren. In einer
stärker
bevorzugten Ausführungsform
wird G418 für
die Selektion resistenter Zellen verwendet.
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Die
tierischen Zellen oder Zelllinien gemäß der vorliegenden Erfindung
können
alle herkömmlichen Zelllinien
sein, die bei der Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden,
wie z. B. Sf9-Insektenzellen, CHO-Zellen,
Hela-Zellen, COS-7-Zellen, VERO-96-Zellen, HepG2-Zellen, BHK-Zellen,
Fibroblasten, Hybridomzellen, immortalisierte EBV-Lymphoblasten
oder 'Myelomzellen', wie etwa z. B.
die NS0-Zellinie. Myelomzellen, wie etwa NS0-Zellen, sind echte
B-Lymphoid-Zelltypen,
obwohl sie von den Fachleuten routinemäßig als 'Myelome' bezeichnet werden (Barnes et al., Cytotechnology
32:109-123, 2000).
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Die
tierischen Zellen oder Zelllinien gemäß der vorliegenden Erfindung
sind bevorzugt adhäsionsunabhängige Zellen.
Solche Zellen sind für
ein ordentliches Wachstum nicht auf Substratkontakt angewiesen und können wachsen,
wenn sie frei im Kulturmedium schweben. In einer stärker bevorzugten
Ausführungsform sind
die produzierenden Zelllinien Lymphoidzelllinien, z. B. Hybridomzellen,
immortalisierte EBV-Lymphoblasten oder Myelomzellen, die am stärksten bevorzugte
Zelllinie sind Myelomzellen und insbesondere Myelom-NS0-Zellen,
wie z. B. etwa die Zelllinie mit der ECACC Nr. 85110503 und Derivate
davon, die von der European Collection of Cell Cultures (ECACC),
Centre for Applied Microbiology & Research,
Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Vereinigtes Königreich, frei erhältlich sind.
Es wurde festgestellt, dass NS0 potentiell zu extrem hohen Produktausbeuten
führt,
insbesondere, wenn sie für
die Herstellung rekombinanter Antikörper verwendet werden. Die
meisten Standard-NS0-Zelllinien sind cholesterolabhän gig, wodurch
Cholesterol zum obligatorischen Bestandteil des Kulturmediums wird.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Zelllinie gemäß der vorliegenden
Erfindung, die ein Aminoglycosidresistenzgen trägt, eine Zellinie, die ferner
in der Lage ist, rekombinante Glutaminsynthetase (GS) zu exprimieren,
stärker
bevorzugt ist es eine NS0-Myelom-rekombinante
GS-Zelllinie. NS0-Zellen sind spezifisch von Vorteil, wenn sie mit
dem Glutaminsynthetase(GS)-Expressionssystem verwendet werden (Bebbington
et al., 1992, High-level expression of a recombinant antibody from
myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable
selctable marker, Bio/Technology 10:169-175; Cockett et al., 1990,
High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases
in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase
gene amplification, Bio/Technology 8:662-667). Die Produktproteingensequenz
und die GS-Gensequenz werden bevorzugt von einem einzigen GS-Plasmidvektor
getragen, um die transfizierte NS0-Zellinie zu generieren, wobei
die Gene entweder von verschiedenen oder gleichen Promotern, unter
Nutzung von z. B. IRES-Elementen, exprimiert werden. – Das GS-System
ist eines von nur zwei Systemen, die für die Herstellung therapeutischer
Proteine von besonderer Bedeutung sind. Im Vergleich zum Dihydrofolatreduktasesystem
(DHFR), bietet das GS-System,
und insbesondere das GS-System, das in Kombination mit den NS0-Myelomzellen
verwendet wird, während
der Entwicklung einen großen
Zeitvorteil, weil hoch produktive Zelllinien häufig aus dem Initialpool von
Transfektanten erzeugt werden können,
und somit der Notwendigkeit, mehrere Selektionsrunden in Gegenwart
steigender Konzentrationen des Selektionsmittels durchzuführen, vermieden
wird, um die Genamplifikation zu erreichen (Brown et al., 1992,
Process development for the production of recombinant antibodies
using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9:231- 236). NS0-Myelomzellen
sind phenotypisch Glutaminsynthetase-defizient. Daher ist die NS0-Zelllinie, die aus
einer Maustumorzelllinie abgeleitet wurde (Galfre, G. and Milstein,
C., Methods in Enzymol. 73, 3-75, 1981) häufig die Zellinie der Wahl
bei der Verwendung des GS-Systems im Industriemaßtab. Ein Beispiel einer solchen
Zellinie ist die 6A1-Neo-Zellinie,
die am 30. Aug. 2002 gemäß dem Vertrag
von Budapest unter der Accession Number 02083031 bei der European
Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for Applied Microbiology
and Research, Porton Down, Salisbury/Wiltshire SP4 0JG, Vereinigtes
Königreich,
hinterlegt wurde. Der hinterlegten Zellinie fehlen bcl-2-Rekombinanten und
sie wird im Abschnitt zu den Experimenten weiter beschrieben. Diese
Zellinie und jede mögliche
Nachzucht, die gentechnisch hergestellt wurde, um andere Antikörper als
cB72-Rekombinanten zu produzieren, ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Ein solches gentechnisches Verfahren
kann die Zellfusion sowie das Silencing oder Knocking-out bestimmter
Gene sowie traditionelle Techniken zur Erzeugung von Rekombinanten
sowie die Generierung von Varianten mittels Mutageneseverfahren
(wie oben detaillierter erläutert)
oder traditionelle Verfahren zur Anpassung des Mediums umfassen,
die für
ein gegebenes Zellkulturmedium die Wachstumseigenschaften der Stammzelllinie,
wie hinterlegt, erhalten oder verbessern.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
fehlt den Zellen gemäß der vorliegenden
Erfindung, die für
die Hochdichte-Zellkultur benutzt werden, rekombinant exprimiertes
bcl-2-Protein, bcl-xl-Protein oder eine andere funktionelle, wobei
unter funktionell Apoptose-vorbeugend zu verstehen ist, natürliche oder
gentechnisch hergestellte Variante der die Apoptosehemmenden bcl-2-Familie
(Petros et al., 2001, Solution structure of the antiapoptotic protein
bcl-2, Proc. Natl. Acad. Science U.S.A., 98, 3012-3017) oder Spe ziesanaloga von
bcl-2, wie zum Beispiel etwa BHFR-1 des Eppstein-Barr-Virus oder
andere funktionelle Analoga von bcl-2, wie in Petros et al. (ibd.)
untersucht. Eine solche bevorzugte Ausführungsform kann zweckmäßigerweise
mit einer anderen zuvor genannten bevorzugten Ausführungsform
kombiniert werden, und zwar in Abwesenheit von Selektionsdruck,
zu verstehen als Gegenwart eines Aminoglycosidantibiotikums während der
Fermentation. Überraschenderweise
stellte sich heraus, dass die Coexpression eines Aminoglycosidresistenzmarkers und
eines bcl-2-Proteins refraktär
gegenüber
der die Zelldichte fördernden
Wirkung der Aminoglycosidresistenz gemäß der vorliegenden Erfindung
ist. Ohne an die eine Theorie gebunden zu sein, scheint die wachstumsfördernde
Wirkung der vorliegenden Erfindung daher nicht einer anti-apoptotischen
Wirkung oder einer bcl-2-basierten
Wirkung zuzuschreiben zu sein, da die Coexpression, z. B. bcl-2
und Neor, in diesem Fall eher epistatisch
als refraktär
gegenüber
dem Hochdichte-Wachstum
sein sollte, wie in den Vergleichsexperimenten tatsächlich beobachtet
wurde.
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Geeignete
Medien und Kulturverfahren für
Säugetierzelllinien
sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel in der US-Patentschrift
Nr. 5,633,162 beschrieben. Beispiele für Standardzellkulturmedien
für Laborkolben
oder Low-Density-Zellkultur, die auch an die Bedürfnisse bestimmter Zelltypen
angepasst sind, sind zum Beispiel: Roswell Park Memorial Institute
(RPMI) 1640-Medium (Morre, G., The Journal of the American Medical
Association, 199, p.519 f. 1967), L-15-Medium (Leibovitz, A. et
al., Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), Dulbeccos modifiziertes
Eagle's Medium (DMEM),
Eagle's Minimal
Essential Medium (MEM), Hams F12-Medium (Ham, R. et al., Proc. Natl.
Acad. Sc.53, p288 ff. 1965) oder Iscoves modifiziertes DMEM ohne Albumin,
Transferrin und Lecithin (Iscoves et al., J. Exp. med. 1, p. 923
ff., 1978). Es ist bekannt, dass solche Kulturmedien mit fötalem Rinderserum
(FBS, auch FCS genannt) angereichert werden können, wobei letzteres eine
natürliche
Quelle einer großen
Menge an Hormonen und Wachstumsfaktoren bereitstellt.
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Während der
Transfektion und Selektion mit Aminoglycosiden kann jedes Medium
benutzt werden, das sich zum in Gang halten des Wachstums der kultivierten
tierischen Zellen eignet. Für
das Hochdichte-Wachstum der tierischen Zellen in einem Fed-Batch-Bioreaktor
gemäß der vorliegenden
Erfindung muss ein Hochdichte-Wachstumskulturmedium
benutzt werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Zellkulturmedium per Definition ein Hochdichte-Zellkulturmedium,
wenn das Kulturmedium das Wachstum von tierischen Zellen bis zu
einer Dichte von lebensfähigen Zellen
von 10
6 Zellen/ml oder mehr in einem herkömmlichen
Fed-Batch-Bioreaktorsystem ermöglicht.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung führt ein solches Kulturmedium
in Kombination mit der zuvor beschriebenen Aminoglycosidselektion
sogar zu höhere
Zelldichten. Üblicherweise
wird ein solches Medium gemäß der vorliegenden
Erfindung 1-10 g/l Glucose oder eine andere Energiequelle umfassen,
wobei die Glucosekonzentration während
der Fed-Batch-Kultivierung auf diesem Level kontrolliert wird. Das
Medium wird bevorzugt mindestens 2 g/l Glucose umfassen, wobei diese
Konzentration im Wesentlichen während
der Fed-Batch-Fermentation kontrolliert wird. Das Medium ist isotonisch,
und zwar in einem Bereich von 270 bis 320 mOsm/kg, bevorzugt von
280 bis 300 mOsm/kg, Individuelle Präferenzen bestimmter Zelltypen,
z. B. von Lymphoidzellen für
bestimmte Medien sind dem Fachmann bekannt, und sind mit dem Bereich,
dem Anteil und der individuellen Dosierung der Nährsubstanzen komplex korreliert.
Beispiele für
Hochdichte-Wachstumsmedien, die z. B. für Hybridomzelllinien geeignet
sind, im Vergleich zu den oben genannten Standardmedien werden in
GB 2251 249 A angegeben;
solche Hochdichte-Wachstumsmedien können üblicherweise mit Nährsubstanzen
angereichert werden, wie etwa allen Aminosäuren, Energiequellen, wie etwa
Glucose im oben angegebenen Bereich, anorganischen Salzen, Vitaminen,
Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise
in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind), Puffer,
den vier Nucleosiden oder ihren entsprechenden Nucleotiden, Antioxidanzien,
wie etwa (reduziertes) Glutathion, Vitamin C und andere Bestandteile,
wie etwa wichtige Membranlipide, z. B. Cholesterol oder Phosphatidylcholin
oder Lipidvorläufer,
z. B. Cholin oder Inositol. Ein Hochdichtemedium wird in den meisten
oder allen diesen Verbindungen angereichert, und wird, abgesehen
von den anorganischen Salzen, auf deren Basis die Osmolarität des im
Wesentlichen isotonischen Medium reguliert wird, sie in höheren Mengen
(verstärkt)
umfassen als die zuvor genannten Standardmedien, wie aus
GB 2251 249 hervorgeht,
im Vergleich mit RPMI-1640. Ein Hochdichtekulturmedium gemäß der vorliegenden
Erfindung ist bevorzugt gleichmäßig dadurch
verstärkt,
dass alle Aminosäuren,
abgesehen von Tryptophan, mit mehr als 75 mg/l Kulturmedium vorhanden
sind. In Verbindung mit dem allgemeinen Aminosäurenbedarf sind Glutamin und/oder
Asparagin gemeinsam mit mehr als 1 g/l, stärker bevorzugt mit mehr als
2 g/l des Hochdichtekulturmediums vorhanden. Es versteht sich, dass
letztere bevorzugte Ausführungsform
im Falle einer rekombinanten Zellinie, die mit einem Glutaminsynthetase(GS)-Vektor
transfiziert ist, weniger geeignet ist. In einer solchen Zellinie
würde ein Überschuss
von z. B. Glutamin, das sowohl aus einer exogenen als auch aus einer
endogenen Quelle stammt, zur Produktion von Ammoniak führen, was vermieden
werden sollte. Die Kulturbedingungen für GS-transfizierte Zelllinien
werden in den Beispielen beschrieben.
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Zweckmäßigerweise
fehlt dem Hochdichtekulturmedium gemäß der vorliegenden Erfindung,
das 'serumfrei' genannt wird, fötales Kälberserum
(FCS oder FBS). Es wurde gemäß der vorliegenden
Erfindung nicht nur die Möglichkeit
erdacht, das Hochdichte-Wachstum mit einer Dichte von lebensfähigen Zellen
von 107 Zellen/ml oder mehr mit einem serumfreien
Medium zu erreichen, sondern es hat sich überraschenderweise herausgestellt,
dass die Zugabe von fötalem
Serum gegenüber
dem Hochdichte-Wachstum
mindestens einiger der in Kontext der vorliegenden Erfindung getesteten
Zelllinien refraktär
ist, im Gegensatz zu den üblichen
Erwartungen des Fachmanns. Zellen in einem serumfreien Medium erfordern
für optimales
Wachstum im Allgemeinen Insulin und Transferrin in einem serumfreien
Medium. Transferrin kann mindestens teilweise durch Nichtpeptid-Siderophore,
wie etwa Tropolon, substituiert werden, wie in WO 94/02592 beschrieben.
Die meisten Zelllinien erfordern einen oder mehrere synthetische
Wachstumsfaktoren (umfassend rekombinante Polypeptide), einschließlich z.
B. den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF),
die Insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktoren I und II (IGFI, IGFII) usw. Andere Klassen von
Faktoren, die notwenig sein können,
enthalten: Prostaglandine, Transport- und Bindeproteine (z. B. Ceruloplasmin,
High- und Low-Density-Lipoproteine, Rinderserumalbumin (BSA)), Hormone,
einschließlich
Steroidhormone und Fettsäuren.
Das Testen der Polypeptidfaktoren erfolgt am Besten durch das schrittweise
Testen neuer Polypeptidfaktoren in Gegenwart jener, von denen festgestellt
wurde, dass sie das Wachstum stimulieren. Es gibt mehrere methodologische
Ansätze,
die für
die Kultur tierischer Zellen bekannt sind, wobei einer im Folgenden exemplarisch
beschrieben wird. Der erste Schritt ist, Bedingungen zu erhalten,
in denen die Zellen überleben und/oder
3 bis 6 Tage nach der Übertragung
aus dem mit Serum angereicherten Kulturmedium langsam wachsen. Bei
den meisten Zelltypen ist das mindestens zum Teil eine Funktion
der Inokulumdichte. Sobald die optimale Hormon/Wachstumsfaktor/Polypeptid- Zugabe gefunden ist,
wird die Inokulumdichte, die für
das Überleben
erforderlich ist, abnehmen.
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In
einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
ist das Zellkulturmedium frei von Wachstumsfaktoren, was bedeutet,
dass es frei von fötalem
Serum ist oder von der Zugabe von im wesentlichen reinen Proteinwachstumsfaktoren,
die die Signaltransduktion bzw. die Zellzyklusprogression triggern.
Ein solches Medium kann immer noch andere Proteine, wie etwa Insulin
oder Transferrin umfassen, die nützlich
sind, um Eisen aus dem Medium zu rekrutieren, oder BSA, das für die Abgabe
von Lipiden, wie etwa Cholesterol, erforderlich ist. Stärker bevorzugt
wird ein solches Medium gemäß der vorliegenden
Erfindung in Verbindung mit Lymphoidzelllinien benutzt, am stärksten bevorzugt
in Verbindung mit Myelomzelllinien, insbesondere NS0-Zelllinien.
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Geeignete
Bioreaktoren gemäß der vorliegenden
Erfindung sind Batch-Bioreaktoren, z. B. Airlift-Bioreaktoren oder
gerührte
Bioreaktoren, wie sie routinemäßig für die Hochdichtekultur
tierischer Zellen benutzt werden. Zweckmäßigerweise wird ein solcher
Bioreaktor für
die Hochdichte-Zellkultur im Fed-Batch-Modus betrieben. Diese Definition
enthält
ebenfalls den Betrieb mit kontinuierlicher Zufuhr. Fed-Batch-Bioreaktoren gemäß der vorliegenden
Erfindung haben bevorzugt einen volumentrischen Stoffübergangskoeffizienten
KLa (wie in Bailey, J. et al., Biochemical
Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, N.Y. 1986 definiert) von
mindestens 6 h–1, stärker bevorzugt
von mindestens 10 h–1. Am stärksten bevorzugt
ist ein Fed-Batch-Bioreaktor, der diese bevorzugten Stoffübergangseigenschaften
gemäß der vorliegenden
Erfindung aufweist, ein Airlift-Bioreaktor. Airlift-Bioreaktoren
sind dem Fachmann bekannt und die entscheidenden Parameter für das Reaktordesign
wurden gut beschrieben (für
einen Überblick,
vergleiche z. B. Chisti, M. et al., 1987, Airlift reactors, Chem. Eng.
Commun. 60, 195-242; Koch, A. et al., 1987, Measu rement and modeling
of mass transport in airlift-loop reactors in relation to the reactor
design, Chem. Ing. Tech. 59, 964-965). Auch wenn es offensichtlich
ist, wird betont, dass eine Fed-Batch-Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung
keine Perfusionskultursysteme umfasst.
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Im
Kontext der vorliegenden Erfindung wird eine Hochdichte-Zellkultur
als eine Population von tierischen Zellen definiert, die eine Dichte
von lebensfähigen
Zellen von mindestens 106 Zellen/ml oder
mehr aufweist, bevorzugt von mindestens 107 Zellen/ml
oder mehr, stärker
bevorzugt von mehr als 1,2 3·107 Zellen/ml, am stärksten bevorzugt von mehr als
1,3·107 Zellen/ml, und deren Population kontinuierlich
aus einer einzelnen Zelle oder einem Inokulum mit einer geringeren
Dichte von lebensfähigen
Zellen in einem Zellkulturmedium in einem konstanten oder steigenden
Kulturvolumen gezüchtet
wurden.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Fed-Batch-Kultur ein Kultursystem, in dem der Zellkultur
mindestens Glutamin, optional mit einer oder mehreren anderen Aminosäuren, bevorzugt
Glycin, zugeführt
wird, wie in
GB 2251 249 beschrieben,
um dessen Konzentration im Medium aufrecht zu erhalten, abgesehen
davon dass, die Glucosekonzentration durch eine separate Zufuhr
kontrolliert wird. Stärker
bevorzugt wird die Zufuhr von Glutamin und optional einer oder mehrerer
anderer Aminosäuren
mit dem Zuführen
einer oder mehrerer Energiequellen, wie etwa Glucose zur Zellkultur
kombiniert, wie in EP-229 809-A beschrieben. Die Zufuhr wird üblicherweise
25 bis 60 Stunden nach dem Start der Kultur begonnen; es ist zum
Beispiel nützlich,
die Zufuhr zu starten, wenn die Zellen eine Dichte von etwa 10
6 Zellen/ml erreicht haben. Die gesamte Glutamin-
und/oder Asparaginzufuhr (für
die Substitution von Glutamin durch Asparagin vergleiche Kurano,
N. et al., 1990, J. Biotechnology 15, 113-128) liegt üblicherweise
im Bereich von 0,5 bis 3 g je 1, bevorzugt von 1 bis 2 g je 1 Kulturvolumen;
andere Aminosäuren,
die in der Zufuhr vorhanden sein können, liegen zwischen 10 bis
300 mg Gesamtzufuhr je Liter Kultur, insbesondere Glycin, Lysin,
Arginin, Valin, Isoleucin und Leucin werden, verglichen mit den
anderen Aminosäuren, üblicherweise
in größeren Mengen
von mindestens 150 bis 200 mg zugeführt. Die Zufuhr kann als stoßweise erfolgen
oder kontinuierlich eingepumpt werden, bevorzugt wird das annähernd kontinuierliche
Einpumpen in den Bioreaktor. Es versteht sich, dass der pH-Wert
während
der Fed-Batch-Kultivierung in einem Bioreaktor auf einen ungefähr physiologischen
pH-Wert, der für
eine gegebene Zellinie optimal ist, durch die Zugabe einer Base
oder eines Puffers sorgfältig
kontrolliert wird. Wenn Glucose als Energiequelle verwendet wird,
reicht die gesamte Glucosezufuhr üblicherweise von 1 bis 10,
bevorzugt von 3 bis 6 Gramm je Liter Kultur. Abgesehen vom Einschluss
von Aminosäuren
umfasst die Zufuhr bevorzugt eine geringe Menge an Cholin im Bereich
von 5 bis 20 mg je Liter Kultur.
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Bevorzugt
ist die tierische Zelle oder Zellinie gemäß der vorliegenden Erfindung
eine produzierende Zellinie, die ein zweites Produktprotein produziert,
oder in der Lage ist, ein zweites Produktprotein, z. B. durch Induktion
zu exprimieren. Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist das zweite Produktprotein das Protein, das in großer Menge
produziert und geerntet werden soll. Es kann jedes interessierende
Protein sein, z. B. therapeutische Proteine, wie etwa Interleukine
oder Enzyme, z. B. Enzyminhibitoren oder Antikörper oder Fragmente davon (zum
Beispiel ein Fab-Fragment). Es kann ein rekombinantes Protein sein,
das von einem Plasmid oder einer anderen Art von Vektor getragen
wird, einschließlich
gentechnisch hergestellter Viren, oder es kann durch irgendeine
Technik stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Es kann
auch ein natürlich
auftretendes Expressionskonstrukt sein, wie etwa ein Antikörper, der
von Plasma- oder Hybridomzellen sezerniert wird. Das Produktprotein
kann eine Signalsequenz enthalten, die die Sekretion des Polypeptids
aus der produzierenden Wirtszelle ermöglicht. Es kann konstitutiv
exprimiert sein oder induzierbar exprimiert sein.
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Das
Produktprotein ist bevorzugt ein rekombinantes Protein, am stärksten bevorzugt
ein rekombinantes Protein, das von einem konstitutiven Promoter
exprimiert wird. 'Rekombinant' gemäß der vorliegenden
Erfindung bedeutet ein Protein, das exprimiert ist aus mindestens
einer exogenen Kopie des entsprechenden Gens in einer Zellinie,
die ursprünglich
in diese Zellinie eingeführt
wurde durch jede Technik der genetischen Manipulation, unabhängig davon,
ob genau dieses Protein in der produzierenden Zellinie in mindestens
einer natürlich
vorhandenen Kopie auftritt. Solche zusätzlichen Kopien eines rekombinanten
Gens können
z. B. in das Genom integriert werden oder können auf einem episomalen Element
getragen werden. Es kann sowohl eine stabile als auch eine vorübergehende
Expression benutzt werden. Jede bekannte Expressionsvektortechnologie,
einschließlich
gentechnisch veränderter
Viren können
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Stärker
bevorzugt ist das rekombinante Protein ein chromosomal stabil integriertes
Protein.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist das Produktprotein ein sezerniertes
Protein. Stärker
bevorzugt ist das Produktprotein ein Antikörper oder ein gentechnisch
hergestellter Antikörper
oder ein Fragment davon, am stärksten
bevorzugt ist es ein Immunoglobulin-G-Antikörper (IgG-Antikörper).
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Ein
entsprechendes Verfahren zur Proteinexpression und ferner eine Hochdichte-Zellkultur,
die dem entspricht, was in den vorhergehenden Abschnitten zur Verwendung
des Aminoglycosidresistenzgenprodukts gesagt wurde, sind weitere
Aufgaben der vorliegenden Erfindung. Die Beschreibung möglicher
und bevorzugter Ausführungsformen
in dem Vorhergehenden ist ebenso auf diese Aufgaben anwendbar.
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Beispiele
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1. Generierung von Zelllinien und Plasmiden
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Die
Zellinie NS0 6A1 (100) 3 (6A1 für
kurz; Lonza Biologics plc., Slough/UK) sezerniert einen chimären Mensch-Maus-IgG-Antikörper (cB72.3)
aus einem stabil integrierten rekombinanten Glutaminsynthetase(GS)-Expressionskonstrukt.
Rekombinante Zelllinien, die Neomycinresistenz tragen, wurden durch
Transfektion der 6A1-Zellinie mit Plasmidvektoren erhalten, die
entweder dicistronisch bcl-2 und Neor exprimieren oder
nur Neor aus einem einzigen Plasmidkonstrukt
exprimieren. Zur Generierung von pEF-Neor wurde
die MCl-Neo-PolyA-Kassette
von pMClneopA (Stratagene) in pEF BOS eingeführt (Mizushima et al., 1990,
pEF BOS, A powerful mammalian expression vector, Nucleic Acids Research
18, 5322), das den Stuffer hat, um pEF MCl-Neo-polyA (Visvader et
el., Mol. Cell Biol. 1995 February; 15 (2):634-41) herzustellen. 4 zeigt
die Plasmidkarte. Zur Generierung von pEFbcl-2-Neor wurde
das EcoRI/TaqI-Fragment der menschlichen bcl-2-cDNA (lange anti-apoptotische
Transkriptversion, Cleary et al., Cell 47: 19-28(1986)) in plC194
subkloniert (Gen 32:482, 1984), mit EcoRI/ClaI geöffnet und
herausgeschnitten als SalI (stumpf „blunt")/EcoRV-Fragment, das weiter kloniert wurde
in die stumpfe („blunted") XbaI-Stelle der
Mehrfachklonierungsstelle (MCS) von pEF-MClneopA, somit ist bcl-2
aus dem Elongationsfaktor (EF) 1-a-Promoter exprimiert (Plasmidkarte, 3). Die
Neor-Expressionskassette (MClneopA) ist
ein wesentlicher Bestandteil des pEF- Vektors, obschon schließlich in
dem pEF-Neo-Vektorkonstrukt
benutzt, die MCS über
dem EF1-a-Promoter an der Xho I-Stelle geöffnet wurde, abgestumpft ("blunted") und ein Randomstuffer
300 bp-Fragment aus einer nicht kodierenden Sequenz für eine fachgerechte
Kontrolle eingeführt
wurde (Plasmidkarte, 4). Die Lipofectin-vermittelte
(Gibco, Paisely, Scotland) Transfektion wurde gemäß dem Protokoll
des Herstellers durchgeführt.
Die Plasmidtransfektanten wurden mit 1 mg/ml G418 in GMEM-Medium
(Gibco), angereichert mit 5 % fötalem
Kälberserum
und weiteren Zusätzen
wie in Tey et al. (Tey, B. et al., Bcl-2 mediated suppression of
apoptosis in myeloma NS0 cultures, J. Biotechnology, 79(2000), 147-159)
beschrieben, selektiert. Stabile Transfektanten wurden dann an das
serumfreie Hochdichte-Wachstumsmedium EX-CELL 302 angepasst.
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2. Hochdichte Fed-Batch-Zellkultur
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Für eine Hochdichte-Zkultur
wurde die NS0-6A1-Stammzellinie,
die 6A1-Neo-Zellinie und die 6A1-bcl-2/Neo-Kontrollzellinie an das serumfreie
Medium EX-CELL 302 (JRH Biosciences Inc., KS/U.S.A.), angereichert
mit 1 ml/50 ml GSEM (GS-Expressionsmediumszusatz, Produktnummer
G9785, Sigma, Poole, UK) angepasst. während der Passage wurden das
Medium mit 25 μM
MSX und 0,7 g/l G418 angereichert, wurden aber aus dem Inokulum
und dem Bioreaktorkulturmedium weggelassen. Die Dichte der lebensfähigen Zellen
während
der Bioreaktorzellkultur wird in
1 für die Kultur
der einzelnen Zelllinien gezeigt. Die Fed-Batch-Kultur für jede Zellinie
wurde wie folgt eingerichtet:
Die Myelomzellinie wurde in einem
101-Airliftfermenter in serumfreiem EX-CELL 302-Medium gezüchtet. Die Dichte
der Startzellpopulation betrug ungefähr 10
5 Zellen/ml
aus frischer mittlerer exponentieller Kultur. Nach kontinuierlichem
Wachstum auf eine Dichte von etwa 10
6 Zellen/ml,
erfolgte die stoßweise
Zugabe der Zusätze und
wurde mit dem Einpumpen der Zusätze
begonnen (Tabelle 1). Die Zufuhr erfolgte kontinuierlich über 100 Stunden.
Der pH-wert wurde auf etwa 7 eingestellt. Die Kulturdichte wurde
ungefähr
alle 25 Stunden durch Zählen
bestimmt und die Lebensfähigkeit
der Zellen wurde durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt. Für die gesamte
und lebensfähige
Zellkonzentration wurde eine passend verdünnte Probe mit Trypanblau (Sigma,
Poole, UK) verdünnt,
gefolgt von einer mikroskopischen Untersuchung unter Verwendung
einer modifizierten Fuchs-Rosental-Blutkörperchenzählkammer.
Zur Gegenprüfung
wurde ein CASY-Zähler
verwendet, um die gesamten und lebensfähigen Konzentrationen auf der
Basis der Zellgröße zu messen. Tabelle
1
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Während die
rekombinante bcl-2/Neo-Zellinie auf eine maximale Dichte von lebensfähigen Zellen
von nur etwa 107 Zellen/ml wuchs, im Gegensatz
zu Tey et al., die maximale Zelldichten von < 106 Zellen/ml
in einer Serum-angereicherten Fed-Batch-Kultur beschrieben, wuchs
die Kultur der rekombinanten Neo-Zellinie auf eine maximale Dichte
von 1,4·107 Zellen/ml (1). Die
Lebensfähigkeit
der gezählten
Zellen wurde mittels Trypanblau-Ausschluss bestimmt, wie zuvor beschrieben.
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Die
Raum-Zeit-Ausbeute der rekombinanten Antikörper fiel zugunsten der rekombinanten
Neo-Zellinie (2) aus. Dies wird gezeigt, indem
der Produkttiter im Bioreaktor im Verhältnis zur kumulativen Zellzeit (CCT;
Einheit: 109 Zelle-Std/L) präsentiert
wird. Die CCT wurde durch Integration der Zellwachstumskurve berechnet,
im Wesentlichen wie in Renard et al. (1988, Biotechnology Letters
10:91-96) beschrieben. Wie aus 2 abgeleitet
werden kann, betrug die mittlere Einzelzellenproduktivität der rekombinanten
bcl-2/Neo-Zellinie
0,260 pg Protein/Zelle.Std., während
sich die Neo-Zellinie auf 0,210 pg Protein/Zelle belief. Der geringe Unterschied
bei der Einzelzellenproduktivität
(qp) wurde auf dem Niveau der gesamten Ausbeute durch den Unterschied
bei der Dichte von lebensfähigen
Zellen deutlich übertroffen.
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3. Bestimmung der Genkopiezahl
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Die
Genkopiezahl des Neomycinresistenzgens wurde für die 6A1-Neo-Zellinie, wie
hinterlegt, mittels eines quantitativen PCR-Assays bestimmt, wobei
der 6A1-Stamm als Vergleichsstandard benutzt wurde. Es wurde eine
Genkopiezahl von 3,0 Kopien (± 0,4)
bestimmt. In Anbetracht der konkatemeren Integration stabil transfizierter
Gene bedeutet dies, dass die einfache Integration des rekombinanten
Neoymcinresistenzmarkers in die 6A1-Neo-Zellinie ohne weitere Amplifikation
stattfand. Dies stimmt mit den niedrigen MSX-Konzentrationen von
etwa 25 μM
MSX überein;
damit die Amplifikation eines GS-Markergens
geschieht, müssen
10 bis 20·Mal
höhere
Konzentrationen des Selektionsmittels angewendet werden. Der Assay
wurde von einem spezialisierten Vertragslabor (Lark Technologies
Inc., Houston, Tex.) ausgeführt.
Neben dem Testen auf das Neomycinresistenzgen aus Transposon Tn5
wurde eine negative Kontrolle ermittelt, indem ebenso auf das Maus-Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-[GAPDH]-Gen
getestet wurde. Ein klonierter Plasmidstandard wurde verwendet,
um die Assayplatten zu kalibrieren. Die Kopiezahlen wurden als Anzahl
der Targets (NEO) je Zelle (MUSGAPDH) unter der Annahme berechnet,
dass die DNA-Masse der diploiden Standardsäugetierzelle etwa 6,6 pg beträgt und dass
GAPDH in zwei Kopien je Zelle vorhanden ist. Die aus den Zellen extrahierte
genomische DNA wurde spektrophotometrisch quantifiziert, indem die
optischen Dichten bei 260 und 280 nm gemessen wurden, wie es fachliche
Routine ist. Zum Nachweis der Neomycinresistenzgenkopiezahl wurde
eine QPCR-Standardkurve unter Verwendung von acht Verdünnungen
des pMCl-neopA-Plasmids, bereitgestellt von Lonza Biologics, berechnet.
Die Verdünnungsreihen
repräsentierten
den Bereich von 5·106 Kopien bis 49 Kopien der Plasmid-DNA. Jeder
Standard wurde in genomische GS-NS0-Kontroll-DNA (äquivalent
zu 1.000 Zellen) verdünnt,
um den Matrixeffekt der extrahierten Zelllinien-DNA zu imitieren.
Negative Kontrollreaktionen die keine Matrize enthielten oder nur
das Kontrollplasmid (5.000 bis 50.000 Kopien) oder das DNA-Äquivalent
von 1.000 GS-NS0-Zellen (Stammzellinie, etwa 6.6 ng) wurden gesammelt.
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Die
Kopiezahl wurde bestimmt mit einem 95 Vertrauensintervall, durch
die Bestimmung des Zyklus des Schwellenwerts (Ct). Der Ct ist eine
Bruchzahl, bei der die Reporterfluoreszenz, die durch Sondenspaltung produziert
wird, eine fixierte Schwelle kreuzt, die oberhalb der Basislinie
festgelegt ist. Jeder Anstieg des Zahlenwerts des Ct stellt einen
2·-Anstieg
des Targets dar, unter der Annahme einer 100%-igen PCR-Effizienz.
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Sechs
unabhängige
Verdünnungen
von jeder Testartikel-DNA wurden hergestellt und in Doppelbestimmung
analysiert. Jede QPCR-Reaktion enthielt etwa 6,6 ng der Testproben-DNA.
Die QPCR-Reaktionen wurden gemäß dem TaqManTM Universal PCR Master Mix Protocol (Applied
Biosystems, Foster City, Calif.) gesammelt. Die Reaktionen wurden
thermal zyklussequenziert und die Daten wurden mit dem ABI Prism
7700 Sequence Detection System, Version 1.6.3 (Applied Biosystems)
zusammengestellt.
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4. Vergleichsbeispiel: Kultur der 6A1-Stammzellinie
in Abwesenheit des Neo-Resistenzgens, aber in Anwesenheit einer
subletalen Menge an G418
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Um
jeden Wachstumseffekt auszuschließen, der eher durch die Exposition
an G418 gefördert
wurde als durch die Gegenwart eines exprimierten Neomycinresistenzgens,
wurde die Stammzellinie 6A1 an das G418-enthaltende Zellkulturmedium angepasst.
Die Menge an G418 konnte allmählich
bis auf eine Konzentration von 360 mg/ml G418 (Sigma, Poole, UK;
bitte beachten, dass die Chargenqualität von G418 abhängig von
der quelle beträchtlich
variieren kann) gesteigert werden, ohne das Zellwachstum zu unterbinden.
Das Wachstumsmedium war Lonzas optimiertes geschütztes NS0-Zellkulturmedium
PM1, angereichert mit 6 mM Glutamin in Abwesenheit von fötalem Serum.
Für die
6A1-Neo-Zellinie ermöglichte
dieses serumfreie Medium reproduzierbar das Erreichen der hohen
Zelldichten der vorliegenden Erfindung (> 2·107 Zellen/ml) verglichen mit dem bcl-2-Transfektanten
oder der nicht transfizierten Stammzellinie 6A1. Daher war das Medium
geeignet um die potentielle Wirkung der G418-Adaption in Abwesenheit
des Neomycinmarkergens zu überwachen.
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Verglichen
mit, der nicht angepassten Stammzellinie, die in PMl+6 mM Glutamin
gezüchtet
wurde, waren die angepassten Zellen, die in G418(–)Medien
gezüchtet
wurden, etwas resistenter gegenüber
apoptotischem und nekrotischem Zelltod (Daten nicht gezeigt), wiesen
aber eine geringere Wachstumsrate und eine geringere maximale Zelldichte
im Vergleich mit der Stammzellinie auf (5A: Die
Dichte der lebensfähigen Zellen
in der Batch-Kultur aus der NS0-6A1-Zellinie/nicht angepasst 6A1:
gefüllte
Kreise, 6A1 angepasst auf 360 mg/ml G418, gezüchtet in Gegenwart (leere Kreise)
und in Abwesenheit (gefüllte
Dreiecke) von G418). Durch das Abziehen der Anzahl an lebensfähigen Zellen
von der gesamten Zellzahl wurde die Zahl der toten oder nekrotischen
Zellen bestimmt und in 5B als Prozentsatz der gesamten
Zellzahl angegeben. Das Experiment ermöglichte die Schlussfolgerung,
dass die Exposition an G418 in Abwesenheit des Neomycinresistenzmarkers
daher nur für
die potentielle Wirkung der Apoptoseresistenz angerechnet werden
kann, nicht aber für
die Wirkung des verbesserten Hochdichte-Wachstumsverhaltens angerechnet
werden kann. Interessanterweise minimierte die Bioreaktorkultur
der angepassten Zellinie in Gegenwart von 360 mg/l G418 sowohl die Wachstumsrate
als auch die maximale Zelldichte der angepassten Zellinie in serumfreiem
Medium PM1 sogar noch weiter.
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5. qp in Batch-Kultur
von 6A, 6A1-Neo und 6A1-bcl-2
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Die
Zelllinien wurden bereits in den Beispielen 1 und 2 beschrieben;
die Zellkultur wurde wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt, abgesehen
davon, dass anstelle der Fed-Batch-Kultur in einem Airliftfermenter
eine einfache Batch-Kultur in einem Schüttelkolben ausgeführt wurde.
Die einfache Zellproduktivität
wurde durch den Assay der Sekretion von cB72.3 in einem Elisa-Testformat
aus Kulturaliquots bestimmt. Die Aliquots wurden auf die Anzahl
der lebensfähigen
Zellen hin gezählt
und in frischem Medium in einer 96-Titer-Platte für einen
vorher festgelegten Zeitraum resuspendiert. Nach 80 Stunden und
bei der Ernte (nach etwa 240 Stunden) wurden die Kulturproben herausgenommen
Die Ergebnisse werden in
6B gezeigt.
Die Wachstumskurve basierend auf der Dichte von lebensfähigen Zellen,
wie durch Trypanblau-Ausschluss
bewertet, wird in
6A (leere Kreise: 6A1-Neo, gefüllte Dreiecke:
6A1-bcl2, gefüllte
Kreise: 6A1-(100)3) gezeigt. Die 6A1-Neo-Zellinie zeigte konsistent
eine höhere
Einzelzellenproduktivität
qp als die 6A1-bcl-2-Zellinie. Die 6A1-Stammzellinie hat sogar noch
einen höheren
q
p, der durch sein sehr viel geringeres
Wachstumspotential negativ ausgeglichen wird. Schlüssel zu
den Figuren
