KR100982153B1

KR100982153B1 - 아미노글리코시드 내성 유전자의 용도

Info

Publication number: KR100982153B1
Application number: KR1020047004526A
Authority: KR
Inventors: 모하메드 알-루비; 페라니안젤로; 레이처앤디; 버치존
Original assignee: 모하메드 알-루비; 론자 바이올로직스 피엘씨
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2010-09-14
Also published as: ES2269807T3; US20050112722A1; GB0123098D0; CN100402653C; US7439037B2; EP1438411A2; CN1705749A; WO2003027300A3; KR20040054698A; JP2005518189A; DE60213441T2; NO332092B1; NO20041856D0; JP4267450B2; ATE334215T1; NO20041856L; AU2002334102A1; DK1438411T3; EP1438411B1; WO2003027300A2

Abstract

동물 세포의 고밀도 성장을 성취하기 위한, 아미노글리코시드 내성 유전자의 용도.

Description

아미노글리코시드 내성 유전자의 용도{USE OF AMINOGLYCOSIDE RESISTANCE GENE}

본 발명은 생물공학에서의 단백질 발현 분야에 관한 것이다. 본 발명은, 구체적으로, 동물 세포의 고밀도 성장을 성취하기 위한 아미노글리코시드 내성 유전자, 특히 네오마이신 내성 유전자의 용도, 단백질의 제조 방법 및 고밀도 세포 배양 방법 각각에 관한 것이다.

동물 세포 배양에 의한 치료제 단백질의 생물공학적 제조는 매우 어려우며 고비용적이다. 하류 공정 (downstream processing)을 포함하는 제조 효율성은 주로 초기 세포배양 단계의 공간-시간적 수율에 의해 결정된다. 배양액에서의 제조 단백질의 고수율 및 고농도 모두가 요구된다. 결과적으로, 산업적 규모 세포 배양의 정지된 생산적 고정상(stationary phase)에 들어가기 전에 성취되는 최대 세포 밀도에 있어서의 상대적으로 적은 증가는, 전체 생산성의 상당한 강화로 해석될 것이고, 이는 단순히 이러한 방식으로 첨가된 세포의 커다란 총수에 기인한 것이다.

세포 형태 및 배양 방법에 강력하게 의존하여, 공기양수(airlift) 반응기와 같은 고밀도 배양을 위해 최적화된 통상적인 공급-회분식 (fed-batch) 배양계는, 10⁷ 세포수/㎖ 까지의 또는 그를 초과하는 밀도로 무혈청 세포 배양물을 성장시킬 수 없었다. 혈청-보충 공급-회분식 배양 또는 더욱 현대적인 관류(perfusion) 반응계에서 고밀도가 잠재적으로 성취가능하다. 그러나, 이런 모든 선택사항은 심각한 단점을 수반한다. 천연 성장-촉진 물질의 전 범위을 포함하는 우태아 혈청-보충 배양 배지는 양질의 혈청 공급에 강력하게 의존하고, 가장 결정적으로는, 의학 적용을 위한 치료제 단백질을 생성하는 배양물로의 동물 바이러스의 비의도적인 도입에 대한 영구적인 위험을 갖는다.

그러나, 관류 반응계는 훨씬더 복잡하고, 조작 동안 제어를 요구하며, 조작에 있어서 통상적인 공급-회분식 배양계 보다 고비용이다. 이는 갓만든 배양배지의 끊임없는 주입에 기인하며, 따라서 반응기로부터의 배지의 평행적 방출을 위해 당업계에 존재하는 미세여과계를 요구한다. 특히, 세포 잔해물 또는 단백질에 의한 여과 설비의 방해(jamming)는 조작의 너무 이른 중단의 위험을 수반한다. 견주어 보면, 공급-회분식 배양은 제조 비용 및 견고함에 있어서 상당한 장점을 갖는다.

또한, 목적 단백질을 생성하는 안정한 재조합 세포주의 창출은, 통상 항시적으로 발현되는 내성 마커 유전자의 하나 이상의 도입을 요구한다. 이러한 마커 유전자의 발현은 세포에 가해지는 대사적 부하를 구성하며, 이는 잘해야 성장 양상에 영향을 주지 않을 수 있고, 또는 성장률 및 풍부한 혈청-보충 세포 배양 배지에서 조차도 최대 생존세포 밀도에 상당한 악영향을 미칠 수 있다 (Gaigle 등, 1999, Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are also serine protein kinases, Chemistry and Biology 6,11-18 ; Maio 등, 1991, Gene activation mediated by protein kinase C in human macrophage and teratocarcinoma cells expressing aminoglycoside phosphotransferase activity, J. Cell. Physiology 149, 548-559; Southern 등, 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1,327-341).

본 발명의 목적은 선행기술의 단점을 피하는 것이고, 그리고 무혈청 배지계에서 고밀도로 동물 세포를 성장시키는 방법을 제공하는 것이다. 상기 목적은 동물 세포내 아미노글리코시드 내성 유전자를 발현시킨 후, 독립항 제 1 항, 제 2 항 및 제 10 항에 따라 세포를 적당한 배지 및 적당한 배양계에서 배양하는 것에 의해 해결된다. 놀랍게도, 당업계에 통상적인 배양 방법 및 배양 배지에 의존하여, 본 발명에 따라 처리된 세포주는, 비처리 모체 세포주 보다, 무혈청 세포배양 배지 중에서 훨씬 고밀도로 성장될 수 있다. 또한, 정지상 성장의 일부 지연이 관찰되었다. 이런 방식으로, 최대 생존세포 밀도가 무혈청 배양으로 성취가능하고, 이는 본 발명 이전에는 인식될 수 없었다.

본 발명의 가능한 구현예를 도면에 나타낸다. 그것이 나타내는 것은 다음과 같다:

도 1: 모체 및 bcl-2 형질전환된 세포주와 비교한, 10 ℓ공급-회분식 공기양 수 반응기 계에서 Neo-형질전환된 NS0 세포주의 성장 동안의 생존 세포;

도 2: bcl-2 형질감염 세포주와 비교한, 10 ℓ공급-회분식 공기양수 반응기 계에서 Neo-형질전환된 NS0 세포주의 성장 동안의 누적 세포 기간으로 표현된 분비 항체에 대한 생산성;

도 3: 플라스미드 지도 pEF-bcl-2;

도 4: 플라스미드 지도 pEF-Neo;

도 5: G418 의 비치명적 투여량으로 적응시킨, NS0 세포주에 의한 상대적 성장실험;

도 6: 모체 및 bcl-2 형질전환된 세포주와 비교한, Neo-형질전환된 NS0 세포주의 진탕 플라스크 회분식 배양 및 생산성.

본 발명에 따르면, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물은 동물 세포의 고밀도 성장을 성취하기 위해 사용된다. 본 발명에 따른 용도는 세포내의 내성 유전자 산물을 발현시키고, 아미노글리코시드 항생제, 바람직하게는 항생제 네오마이신의 존재하에 상기 내성 유전자 산물을 발현하는 세포를 선별하고 (여기서, 아미노글리코시드는 상기 대응하는 내성 유전자 산물에 의해 분해된다), 마지막으로 상기 세포를 생물반응기, 예를 들어 공기양수 또는 교반 생물반응기 중 상기 고밀도 성장을 가능하도록 하는 적당한 무혈청 세포 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 내성 유전자 산물은 임의의 글리코시드 내성 마커, 예컨대 젠타미이신, 네오마이신, 히그로마이신으로 공지된 내성 유전자, 특히 네오마이신이고, 이는 진핵 세포에 대한 유전자 마커로서 사용될 수 있다. 아미노글리코시드 내성 유전자는 통상적으로 진핵 세포의 분자 생물학에서 통상적으로 사용되며, 수많은 표준 교과서 및 실험 매뉴얼에 기재되어 있다 (이러한 기술에 있어서는, 예를 들어 하기 참조: Shaw 등 , 1993, Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of theaminoglycoside-modifying enzymes, Microbiol. Rev. 57: 138-163; WO 82/03087; Southern 등, 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1,327-341). 상기로부터 유추할 수 있는 바와 같이, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물은 본 발명에 따른 아미노글리코시드 분해 활성의 관점에서 기능성 유전자 산물인 것으로 불려진다. 따라서, 상기한 관점으로, 본 발명에서의 공지된 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 유전적으로 가공된 기능성 변이체의 사용이 고려될 수 있다. 이러한 변이체는, 예를 들어 아미노산 및 이를 코딩하는 DNA 서열 각각에서의 치환, 결실, 삽입 또는 절단에 의해서 생성될 수 있다. 이를 위한 방법은 당업계에 자명하게 공지되어 있고, 통상적으로 특정 부위 표적 돌연변이형성 또는 랜덤 돌연변이형성에 의한 다양성의 생성 후 기능성 검사에 의한 목적 변이체의 선별을 포함한다. 돌연변이형성을 위해 사용되는 통상의 방법은, 예를 들어 알킬화제 또는 UV 조사에의 노출, 에러-성향(error-prone) PCR 또는 관련 유전자 셔플링 (shuffling) PCR 기술일 수 있고, 통상적으로 미생물 중에서 수행된다 (Miller, J., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972; Ling 등, 1997, Approaches to DNA Mutagenesis, Analytical biochemistry 254,157-178; Cadwell 등 , 1992, Randomization of genes by PCR mutagenesis in: PCR Methods, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1992; Moore 등, 1997, Strategies for the in vitro evolution of protein function, J. Mol. Biol. 272, 336-347).

적합하게는, 내성 유전자 산물은 공지된 기술에 의해서 세포로 형질감염된 진핵세포 발현을 위해 적합한 DNA 발현 구축물로부터 발현되고; 상기 내성 유전자 산물은 항시적으로 발현될 수 있거나, 유도 발현되거나 억제될 수 있고, 즉 둘 중 하나의 방식으로 발현가능하다. 적어도 아미노글리코시드 항생제에 의한 선별 기간 동안, 그리고 최대 세포 밀도를 성취하기 위한 고밀도 세포 배양계에서의 로가리듬 상향성장(logarithmic upgrowth) 동안에, 상기 내성 유전자 산물이 본 발명에 따라 발현되어야만 한다. 바람직하게는, 예를 들어 티미딘 키나아제 (TK) 또는 유인원 바이러스 (SV40) 후기 포로모터로부터 항시적으로 발현되고, 가장 바람직하게는 진핵 세포에서 항시적으로 활성인 강력한 바이러스-프로모터, 예컨대 라우스 사코마 바이러스 (Rous Scarcoma Virus; RSV)-긴 말단 반복부(LTR)-프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV)-프로모터로부터 발현된다. 또한, 강력한 바이러스 프로모터의 인핸서(enhancer) 부분과 또다른 프로모터의 코어 부분 (예를 들어, 필수적인, 예를 들어 전사 시작부분인 TATA 박스 및 CAAT 박스를 제공하는 알파-액틴 프로모터)으로 구성된 키메라 프로모터도 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 아미노글리코시드는 통상적으로 공지된 아미노글리코시드 항생제로서 (Mingeot-Leclercq, M. 등, Aminoglycosides: acitivity and resistance, 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43 (4): 727-737), 분자의 다른 절반에 글리코시드 결합을 통해 연결된 하나 이상의 아미노-피라노오스 또는 아미노-푸라노오스 부분 구조를 포함한다. 이들의 항생 효과는 단백질 합성의 억제에 기초한다. 예를 들면, 카나마이신, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 토브라마이신, G418 (제네티신), 네오마이신 B (프라마이세틴), 시소마이신, 아미카신, 이세파마이신 등이 있다.

본 발명과 관련하여, 박테리아에서 단백질 합성의 억제로 인해 항생제 활성을 갖고, 비환원 아미노당 부분구조에 관련된 화학적 구조를 갖는 다른 화합물, 예컨대 스펙티노마이신, 아니소마이신, 특히 푸로마이신이 본 발명에 따른 '아미노글리코시드 항생제'인 것으로 간주되고, 이러한 간주는 당업계에서도 또한 종종 행해진다. 아미노글리코시드 화합물은 또한 진핵 세포 배양에서 독성 효과를 갖는다는 것이 주지되어야 하며, 이는 기타 다른 독성 효과가 또한 가능할지라도 부분적으로는 미토콘드리아 단백질 번역 장치가 원핵세포 기원에서 진화한 것이기 때문인 것으로 (미토콘드리아 진화의 세포내 공생설), 이는 이전에 언급되어 왔다.

본 발명에 따르면, 내성 유전자 산물을 발현하는 세포를 선별하기 위해서, 아미노글리코시드 항생제에 의한 내성 선별이, 통상적으로 48 시간 내지 수주 정도인 내성 유전자의 형질감염 후 초기 형질감염체 선별 동안에 적어도 적용된다. 결과적으로, 아미노글리코시드 내성 유전자는 세포주에 안정하게 형질감염된다. 안정한 형질감염체는 통상적으로 아미노글리코이스 내성 유전자의 발현 또는 발현가능한 카피(copy) 하나 이상의 게놈 통합체(genomic integrant)로서, 기능성 유전자 산물을 발생시킨다. 예를 들어 세포내 인공적인 안정한 미니크로모좀의 창출을 고안하는 유전 공학에서의 더욱 최근의 접근은 또한 '안정한 형질감염체' 에 대한 본 발명의 개념에 포함된다. 예를 들어 리포펙션, DEAE-덱스트란, Ca-포스페이트 또는 전기천공과 같은 자명하게 공지된 형질감염 프로토콜에 따른 모든 것들이 본 발명의 따른 형질 감염 방법으로 가능하다는 것은 말할 필요가 없으며, 갓 제조된 형질감염 세포는 우선 아미노글리코시드가 보충되지 않은 배지 중에서, 이러한 보충물이 선별을 위해 첨가되기 전에, 배양된다. 비선별의 상기 조정 기간은 내성 마커 유전자 산물의 효율적인 발현을 위하여 요구되고, 세포 형태에 의존하여 대략적으로 12 시간 내지 1-2일 범위 내이다. 바람직하게는, 내성 선별은 형질감염 후 2 주 이상 동안, 더욱 바람직하게는 형질감염 후 5 주 이상 동안, 가장 바람직하게는 형질감염 후 8 주 이상 동안 적용된다. 또한, 추가의 세포 배양을 위해서, 예를 들어 생물반응기 중의 발효 동안에, 배지로 첨가되는 아미노글리코시드 항생제에 의해 발휘되는 선별 압력 하에서 성장 기간을 연장시키는 것도 또한 가능하다. 형질감염의 초기 선별 후에, 짧은 점재된 간격으로 추가 배양 동안, 아미노글리코시드의 단일 투여량을 배양배지와 함께 반복적으로 첨가한 후 아미노글리코시드가 보충되지 않은 배지를 재보급하는 것에 의해 선별 압력을 적용하는 것도 또한 가능하다. 바람직하게는, 생물반응기에서의 배양 동안에, 본 발명에 따른 발현가능한 또는 발현 내성 유전자를 게놈으로 안정하게 통합(integrating)시키고, 배양을 선별 압력의 부재하에 수행한다. 즉, 세포 배양 - 예를 들어 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에 따른 공급-회분식 생물반응기에서의 세포배양 - 은 발효의 개시 또는 과정에서 세포배양 배지에 보충되는 아미노글리코시드 항생제의 부재하에 수행된다.

바람직하게는, 아미노글리코시드는 0.1 ㎎/㎖ 이상의 농도, 바람직하게는 1 ㎎/㎖ 이상의 농도, 가장 바람직하게는 4 ㎎/㎖ 이상의 농도로 사용된다. 통상적으로, 본 발명의 따른 아미노글리코시드의 이러한 양은, 당업계에 자명하게 공지되어 있고 표준 실험 매뉴얼에서 자명하게 기재되어 있는 바와 같이, 상응하는 내성 유전자 산물에 대한 발현 구축물로 형질감염된 후에, 세포배양 배지에 첨가된다. 더욱 특히 바람직한 구현예에 의하면, 아미노글리코시드는 형질감염 후 2 주 이상 동안, 더욱 바람직하게는 5 주 이상 동안, 가장 바람직하게는 8 주 이상 동안, 연속적인 세포 배양에서 1 내지 4 ㎎/㎖ 의 농도로 사용된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 내성 유전자 산물은 WO 82/03087 에 기재된 네오마이신-포스포트랜스퍼라아제 (통상적으로 Neo^r 로 명명되는 내성 유전자)이다. 상기 포스포트랜스퍼라아제 효소의 각종 천연 동종효소가 공지되어 있고, 이는 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. G418 (제네티신, Chemical abstracts 등록 번호 49863-47-0 하에 정의되어 있음) 또는 네오마이신에 의한 선별이 네오마이신 유전자 산물을 발현하는 세포를 선별하기 위해 사용될 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에 의하면, G418 은 내성 세포의 선별을 위해 사용된다.

본 발명에 따른 동물 세포 또는 세포주는 재조합 단백질의 제조에 사용되는 임의의 통상적인 세포주, 예컨대 Sf9 곤충세포, CHO 세포, Hela 세포, COS-7 세포, VERO-96 세포, HepG2 세포, BHK 세포, 섬유아세포, 하이브리도마, EBV 불사화 림프아세포 또는 '미엘로마' 세포, 예컨대 NS0 세포주일 수 있다. 미엘로마 세포, 예컨대 NS0 세포는, 당업계에서 통상적으로 '미엘로마' 로 불려질지라도, 실제로는 B-림프구 세포 형태이다 (Bames 등, Cytotechnology 32: 109-123, 2000).

바람직하게는, 본 발명에 따른 동물 세포 또는 세포주는 고정자(anchorage)-독립적 세포이다. 이러한 세포는 적당한 성장을 위해 기질 접촉에 의존하지 않고, 배양배지 중에 자유롭게 현탁되어 성장할 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 생산자 세포주는 림프구 세포주, 예를 들어 하이브리도마 세포, EBV 불사화 림프아세포 또는 미엘로마 세포이고, 가장 바람직하게는 상기 세포주는 미엘로마 세포, 특히 미엘로마 NS0 세포, 예컨대 세포주 ECACC No. 85110503 및 이의 유도체이며, 이는 Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom 소재의 European Collection of Cell Cultures (ECACC) 로부터 자유롭게 이용가능하다. NS0 는, 특히 재조합 항체의 제조 동안에 사용될 경우, 극도로 높은 제조 수율을 잠재적으로 제공하는 것이 발견되었다. 대부분의 표준 NS0 세포주는, 배양배지의 필수 성분으로서 콜레스테롤을 제공해야되므로, 콜레스테롤 의존성이다.

추가의 바람직한 구현예에 의하면, 아미노글리코시드 내성 유전자를 담지하는 본 발명에 따른 세포주는 재조합 글루타민 신데타아제 (GS)를 또한 발현할 수 있는 세포주이고, 더욱 바람직하게는 이는 NS0 미엘로마 재조합 GS 세포주이다. NS0 세포는 글루타민 신데타아제 (GS) 발현계와 함께 사용될 경우 특별한 잇점을 갖는다 (Bebbington 등, 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as anamplifiable selctable marker,Bio/Technology 10:169-175; Cockett 등, 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8: 662-667). 바람직하게는, 생성물 단백질 유전자 서열 및 GS 유전자 서열은 상기 형질감염된 NS0 세포주를 생성하기 위한 단일 GS 플라스미드 벡터 상에 담지되어 있으며, 상기 유전자들은 예를 들어 내부 리보좀 내입 부위(internal ribosome entry site)를 사용하여 상이하거나 동일한 프로모터로부터 발현된다. GS 계는 치료제 단백질의 제조를 위해 특히 중요한 단지 두 가지의 계 중 하나이다. 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 계와 비교하여, GS 계, 특히 NS0 미엘로마 세포와 조합되어 사용되는 GS 계는, 고도의 생산성 세포주가 종종 형질감염체의 초기 집단으로부터 생성되므로 유전자 증폭을 성취하기 위해 증가된 농도의 선별제의 존재하에서 복수회의 선별에 대한 필요성을 피할 수 있기 때문에, 개발 동안에 커다란 기간적 잇점을 제공한다 (Brown 등, 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9: 231-236). NS0 미엘로마 세포는 표현형적으로 글루타민-신데타아제 결핍이다. 따라서, 마우스 종양 세포주 유래의 NS0 세포주 (Galfre, G. and Milstein, C., Methods in Enzymol. 73, 3-75, 1981)는 종종 산업적 규모에서의 GS 계의 사용을 위해 선택되는 세포주이다. 이러한 세포주의 예에는, 부다페스트 조약하에 Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom 소재의 European Collection of Cell Cultures (ECACC)에 접근번호 02083031 로 2002년 8월 30일자로 기탁된 6A1-Neo 세포주가 있다. 기탁된 세포주는 재조합 bcl-2 가 없으며, 또한 실험 섹션에 기재되어 있다. 상기 세포주, 및 재조합 cB72 와 다른 항체를 생산하도록 가공된 임의의 잠재적 자손은 본 발명의 다른 바람직한 구현예이다. 이러한 가공은, 세포 융합과 특정 유전자의 사일런싱(sillencing) 또는 녹아웃뿐만 아니라, 돌연변이형성 방법 (상기에 더욱 상세히 기재되어 있음)에 의한 재조합체의 창출 및 변이체의 생성에 대한 더욱 전통적인 기술, 또는 기탁된 모체 세포주의 성장 특성을 보존하거나 개선하는 소정의 세포 배양 배지에 관련한 통상적인 배지 적응(adaption) 기술을 포함한다.

더욱 바람직한 구현예에 의하면, 고밀도 세포배양을 위해 사용되는 본 발명에 따른 세포는, 재조합적으로 발현되는 bcl-2 단백질, bcl-x1 단백질, 또는 아폽토시스 억제 bcl-2 계열의 또다른 기능성 천연 변이체 또는 유전적으로 가공된 변이체 (여기에서, '기능성'은 아폽토시스 방지로서 이해되어야 한다) (Petros 등, 2001, Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2, Proc. Natl. Acad. Science U.S.A., 98, 3012-3017), 또는 예를 들어 Eppstein Barr 바이러스의 BHFR-1 과 같은 bcl-2 의 종 유사체, 또는 Petrosl 등 (ibd.) 에서 검토된 bcl-2 의 다른 기능성 유사체가 없다. 이러한 바람직한 구현예는 또다른 상술한 바람직한 구현예 (즉, 발효 동안에 아미노글리코시드 항생제의 존재로서 이해되는 선별 압력의 부재)와 적절하게 조합될 수 있다. 놀랍게도, 아미노글리코시드 내성 마커 및 bcl-2 단백질의 동시발현은, 본 발명에 따른 아미노글리코시드 내성의 세포밀도 촉진 효과에 대해 불응성(refractory)인 것으로 발견되었다. 따라서, 이론에 한정되지는 않지만, 예를 들어 bcl-2 및 Neo^r 의 동시발현은 그럴 경우에 비교 실험에서 실제로 관찰된 고밀도 성장에 대해 불응성인 것보다는 상위성(epistatic)이어야만 하므로, 본 발명의 성장 촉진 효과는 항-아폽토시스 효과 또는 bcl-2 효과에 기인한 것은 아닌 것 같다.

포유동물 세포주를 위한 적당한 배지 및 배양 방법은 당업계에 자명하게 공지되어 있고, 예를 들어 US 5633162 에 기재되어 있다. 실험용 플라스크 배양 또는 저밀도 세포 배양용 표준 세포배양 배지, 및 특정 세포 형태의 요구성을 수용한 것의 예로는 다음이 있다: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지 (Morre, G., The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967), L-15 배지 (Leibovitz, A. 등, Amer. J. of Hygiene, 78, 1p. 173 ff, 1963), Dulbecco's 변형 Eagle's 배지 (DMEM), Eagle's 최소 필수 배지 (MEM), Ham's F12 배지 (Ham, R. 등, Proc. Natl. Acad. Sc. 53, p288 ff. 1965) 또는 알부민, 트랜스페린 및 레시틴이 결핍된 Iscoves' 변형 DMEM (Iscoves 등, J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978). 이러한 배양배지는 우태아혈청 (FBS, 또한 FCS 로도 불림)가 보충될 수 있음이 공지되어 있고, 후자는 과다한 호르몬 및 성장 인자의 천연 공급원이 제공된다.

아미노글리코시드에 의한 형질감염 및 선별 동안에, 배양된 동물 세포의 성 장을 지지하는데 적합한 임의의 배지가 사용될 수 있다. 공급-회분식 생물반응기에서의 동물 세포의 고밀도 성장을 위해서, 고밀도 성장 배양 배지가 사용되어야만 한다.

본 발명에 따르면, 세포배양 배지는 배양 배지가 통상적인 공급-회분식 생물반응기 계에서의 10⁶ 세포수/㎖ 의 생존 세포 밀도까지 또는 그를 초과하는 동물 세포의 성장을 가능하게 하는지의 여부에 관한 정의에 의한 고밀도 성장 배양 배지일 것이다. 본 발명과 관련하여, 이러한 배양 배지는 상술한 아미노글리코시드 선별과 조합하면 세포를 훨씬 고밀도로 상승시킨다. 통상적으로, 본 발명에 따른 이러한 배양 배지는 1 내지 10 g/ℓ의 글루코오스 또는 또다른 에너지원을 포함할 것이고, 이런 글루코오스 농도는 공급-회분식 배양 동안에 상기 수준으로 조절된다. 바람직하게는 배지는 2 g/ℓ이상의 글루코오스를 포함할 것이고, 이런 농도는 공급-회분식 발효 동안에 본질적으로는 조절된다. 배지는 등장액이고, 즉 270 내지 320 mOsm/kg, 바람직하게는 280 내지 300 mOsm/kg 범위이다. 특정 배지에 대한 특정 세포 형태 (예를 들어, 림프구 세포)의 개별적인 편재성은 당업계에 자명하게 공지되어 있고, 영양성분의 범위, 비율 및 개별적 투여량과 복잡하게 상호관련되어 있다. 상술된 표준 배지와 비교하여, 예를 들어 하이브리도마 세포주에 적합한 고밀도 성장배지의 예에는 GB2251 249 A 에 기재되어 있고; 이러한 고밀도 성장 배지는, 통상적으로, 모든 아미노산과 같은 영양성분, 상술된 범위의 글루코오스와 같은 에너지원, 무기염, 비타민, 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상적으로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 완충액, 4 가지의 뉴클레오사이드 또는 그에 해당하는 뉴클레오타이드, 글루타티온 (환원 형태)와 같은 항산화제, 비타민 C, 및 중요한 막지질과 같은 기타 성분, 예를 들어 콜레스테롤 또는 포스파티딜콜린 또는 지질 전구체 (예를 들어, 콜린 또는 이노시톨)가 보충될 수 있다. 고밀도 배지는 대부분의 또는 모든 상기 화합물이 풍부하며, 무기염을 제외하고는, 본질적으로 등장액인 배지의 몰삼투압농도(osmolarity)가 조절되는지의 여부에 기초하여, GB2251 249 로부터 유추할 수 있는 바와 같이, RPMI 1640 과 비교하여 상술한 표준 배지 보다 높은 고함량 (보강됨)으로 이들을 포함할 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 고밀도 배양 배지는 트립토판을 제외한 모든 아미노산이 75 ㎎/ℓ배양 배지를 초과하도록 균형맞춰 강화된다. 바람직하게는, 일반적인 아미노산 요구사항과 관련하여, 글루타민 및/또는 아스파라긴은 공통적으로 1 g/ℓ 초과, 더욱 바람직하게는 2 g/ℓ초과로 고밀도 배양 배지 중에 존재한다. 후자의 바람직한 구현예는 글루타민 신데타아제 (GS) 벡터로 형질감염된 재조합 세포주의 경우에는 덜 적합하다는 것은 말할 필요가 없다. 이러한 세포주에 있어서, 예를 들어 외래성 및 내인성 공급원 모두로부터 유래된 과량의 글루타민은 피해야할 암모니아의 생성을 유도한다. GS 형질감염된 세포주에 대한 배양 조건은 실시예에 기재되어 있다.

적합하게는, 본 발명에 따른 고밀도 세포배양 배지는 우태아혈청 (FCS 또는 FBS) 가 없으며, '무혈청'이라고 불려진다. 이는, 무혈청 배지에 의해 10⁷ 세포수/㎖ 의 또는 그를 초과하는 생존 세포 밀도로 고밀도 성장을 성취하도록 본 발명에 따라 고안될 수 있을 뿐만 아니라, 놀랍게도 소혈청의 보충이, 당업자의 통상의 예측과 반대로, 본 발명과 관련하여 시험된 적어도 일부 세포주의 고밀도 성장에 불응성인 것으로 밝혀졌다. 무혈청 배지에서의 세포는 일반적으로 최적 성장을 위해 무혈청 배지 중에 인슐린 및 트랜스페린을 요구한다. 트랜스페린은 적어도 부분적으로는 WO 94/02592 에 기재된 트로폴론(tropolone)과 같은 비(非)펩티드 시더로포어 (siderophore)에 의해 대체될 수 있다. 대부분의 세포주는, 예를 들어 표피성장인자 (EGF), 섬유아세포 성장인자 (FGF), 인슐린 유사 성장인자 I 및 II (IGFI, IGFII) 등을 포함하는 하나 이상의 합성 성장인자 (재조합 폴리펩티드 포함)를 요구한다. 요구될 수 있는 인장들의 다른 부류는 하기를 포함한다: 프로스타글란딘, 전송 및 결합 단백질 (예를 들어, 세룰로플라스민, 고밀도 및 저밀도 지단백질, 소혈청 알부민 (BSA)), 스테로이드 호르몬을 포함하는 호르몬, 및 지방산. 폴리펩티드 인자 시험은 성장 자극성인 것으로 발견된 것들의 존재하에 새로운 폴리펩티드 인자를 시험하는 단계별 방식으로 최적으로 수행된다. 동물 세포 배양에서 자명하게 공지되어 있는 몇가지 방법론적 접근법이 존재하고, 예를 들어 하기에 기재되어 있다. 초기 단계는 세포가 생존하고/거나 혈청 보충 배지 배양으로부터 전송된 후 3-6 일간 느리게 성장하는 조건을 찾는 것이다. 대부분의 세포 형태에서, 이는 적어도 부분적으로는 접종물 밀도의 함수이다. 최적의 호르몬/성장인자/폴리펩티드 보충이 확인된다면, 생존에 요구되는 접종물 밀도가 감소될 것이다.

더욱 바람직한 구현예에 의하면, 세포배양 배지는 성장인자가 없으며, 이는 소혈청이 없거나, 신호전달 및 세포주기 진행을 각각 유인하는 본질적으로 순수한 단백질 성장인자의 첨가가 없다는 것을 의미한다. 이러한 배지는 배지로부터 철을 강화시키는데 유용한 인슐린 또는 트랜스페린과 같은 기타 단백질, 또는 콜레스테롤과 같은 지질 전달에 요구되는 BSA 를 또한 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배지는 림프구 세포주와 함께, 가장 바람직하게는 미엘로마 세포주, 특히 NS0 세포주와 함께 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 적합한 생물반응기는 회분식 생물반응기, 예를 들어 고밀도 동물세포 배양에 통상적으로 사용되는 공기양수 생물반응기 또는 교반 생물반응기이다. 적합하게는, 고밀도 세포배양을 위해서, 이러한 생물반응기는 공급-회분식으로 조작될 것이다. 이런 정의는 또한 연속적인 공급 조작을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 공급-회분식 생물반응기는 부피측정 산소 질량 전송 계수 K_La (Bailey, J. 등, Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, N.Y. 1986) 를 6 h^-1 이상, 더욱 바람직하게는 10 h^-1 이상으로 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기의 바람직한 산소 질량 전송 특성을 갖는 공급-회분식 생물반응기는 공기양수 생물반응기이다. 공기양수 생물반응기는 당업자에게 자명하게 공지되어 있으며, 반응기 고안을 위해 중요한 변수는 자명하게 기술되어 있다 (검토를 위해 하기 참조: Chisti, M. 등, 1987, Airlift reactors, Chem. Eng. Commun. 60, 195-242; Koch, A. 등, 1987, Measurement and modeling of mass transport in airlift-loop reactors in relation to the reactor design, Chem. Ing. Tech. 59, 964-965). 자명할지라도, 본 발명에 따른 공급-회분식 배양은 관 류 배양계를 포함하지 않음이 강조된다.

본 발명과 관련하여, 고밀도 세포배양은 10⁶ 세포수/㎖ 이상 또는 초과, 바람직하게는 10⁷ 세포수/㎖ 이상 또는 초과, 더욱 바람직하게는 1.23 ×10⁷ 세포수/㎖ 초과, 가장 바람직하게는 1.3 ×10⁷ 세포수/㎖ 초과의 생존 세포 밀도를 갖는 동물 세포 집단으로서 정의되고, 상기 집단은 세포배양 배지 중의 단일세포로부터 또는 낮은 생존 세포 밀도의 접종물로부터 일정하거나 증가시키는 배양 부피 중에서 연속적으로 배양된다.

추가의 바람직한 구현예에 의하면, 공급-회분식 배양은, 개별 공급에 의한 글루코오스 농도의 조절과는 별도로, 글루타민을 임의로는 하나 또는 수개의 기타 아미노산, 바람직하게는 글리신과 함께 GB2251 249 에 기재된 바와 같이, 세포 배양물에 공급하여 배지 중의 이들의 농도를 일정하게 유지시키는 배양계이다. 더욱 바람직하게는, 글루타민 및 임의로 하나 또는 수개의 기타 아미노산의 공급은 EP-229 809-A 에 기재된 바와 같이 세포 배양물로의 글루코오스와 같은 하나 이상의 에너지원의 공급과 함께 조합된다. 공급은 통상적으로 배양 개시후 25-60 시간째에 시작하고; 예를 들어, 세포가 약 10⁶ 세포수/㎖ 의 밀도에 도달할 경우 공급을 개시하는 것이 유용하다. 총 글루타민 및/또는 아스파라긴 공급물 (글루타민을 아스파라긴으로 대체, Kurano, N. 등, 1990, J. Biotechnology 15, 113-128 참조)은 통상적으로 배양부피 1 ℓ당 0.5 내지 3 g, 바람직하게는 1 내지 2 g 의 범위이고; 공급물에 존재할 수 있는 다른 아미노산은 배양물 1 ℓ당, 10 내지 300 ㎎ 이며, 특히 글리신, 리신, 아르기닌, 발린, 이소루신 및 루신은 다른 아미노산과 비교하여 통상적으로 적어도 150 내지 200 ㎎ 의 고함량으로 공급된다. 상기 공급물은 한꺼번의 첨가로서 또는 연속적인 펌프 공급으로서 첨가될 수 있지만, 바람직하게는 공급물은 생물반응기로 거의 연속적으로 펌프된다. 생물반응기에서의 공급-회분식 배양 동안에 pH 가 염기 또는 완충액의 첨가에 의해 소정의 세포주에 대해 대략적으로 최적인 생리학적 pH 로 조심스럽게 조절된다는 것은 말할 필요가 없다.

글루코오스가 에너지원으로서 사용되는 경우, 총 글루코오스 공급은 통상적으로 배양물 1 ℓ당 1 내지 10 g, 바람직하게는 3 내지 6 g 이다. 아미노산의 공급과는 별도로, 상기 공급물은 바람직하게는 콜린을 배양물 1 ℓ당 5 내지 20 ㎎ 의 낮은 양으로 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 동물 세포 또는 세포주는, 예를 들어 유도시에 2차 생성물 단백질을 생성하거나 2차 생성물 단백질을 발현할 수 있는 생산자 세포주이다. 본 발명에 따르면, 2차 생성물 단백질은 고함량으로 생성되고 회수되는 것으로 발견되는 단백질이다. 이는 임의의 목적 단백질, 예를 들어 인터류킨 또는 효소와 같은 치료제 단백질, 예를 들어 효소 억제제 또는 항체 또는 이의 절편 (예를 들어, fab 절편)일 수 있다. 이는 유전적으로 가공된 바이러스를 포함하는 벡터의 또다른 형태 또는 플라스미드 상에 담지된 재조합 단백질일 수 있거나, 임의의 기술에 의해 세포의 게놈내에 안정하게 통합될 수 있다. 또한, 이는 플라스미드 또는 하이브리도마 세포에 의해 분비되는 항체와 같은 천연 존재 발현 구축물일 수 있다. 생성물 단백질은 숙주 생산자 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 가능하게 하는 신호 서열을 포함할 수 있다. 이는 항시적으로 발현될 수 있거나 유도적으로 발현될 수 있다.

바람직하게는, 생성물 단백질은 재조합 단백질, 가장 바람직하게는 항시적 프로모터로부터 발현된 재조합 단백질이다. 본 발명에 따른 '재조합'은, 그 단백질이 하나 이상의 천연 존재 카피로 생산 세포주에 존재하는지에 상관없이, 세포주에서 상응하는 유전자의 하나 이상의 외래성 카피 (임의의 유전 공학 기술에 의해서 상기 세포주로 본래 도입된 것)로부터 발현되는 단백질을 의미한다. 이러한 첨가된 카피의 재조합 유전자는, 예를 들어 게놈으로 통합되거나 에피좀 요소 상에 담지될 수 있다. 안정한 또는 일과성 발현 모두가 사용될 수 있다. 유전적으로 가공된 바이러스를 포함하는 임의의 공지된 발현 벡터 기술이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 재조합 단백질은 크로모좀으로 안정하게 통합된 단백질이다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 의하면, 생성물 단백질은 분비 단백질이다. 더욱 바람직하게는, 생성물 단백질은 항체 또는 가공 항체 또는 이의 절편이고, 가장 바람직하게는 면역글로불린 G (IgG) 항체이다.

아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 용도에 대해 앞선 섹션에서 언급된 것에 상응하는, 단백질 발현 및 또한 고밀도 세포 배양의 각각의 방법은 본 발명의 다른 목적이다. 상기에서의 가능하고 바람직한 구현예의 기술이 이러한 목적에 또한 적용된다.

1. 세포주 및 플라스미드의 생성

NSO 6A1 (100)3 세포주 (간단히, 6A1; Lonza Biologics plc., Slough/UK) 는 안정하게 통합된 재조합 글루타민 신데타아제 (GS) 발현 구축물로부터 인간-마우스 키메라 IgG 항체 (cB72.3)를 분비한다. 네오마이신 내성을 담지하는 재조합 세포주는, 시스트론분리적으로(discistronically) 단일 플라스미드 구축물로부터 bcl-2 및 Neo^r 을 발현하거나 Neo^r 만을 유일하게 발현하는 플라스미드 벡터에 의한 6A1 세포주의 형질감염에 의해 수득되었다. pEF-Neo^r 의 생성을 위해서, pMC1neopA (Stratagene) 으로부터의 MC1 Neo PolyA 카세트를, 스터퍼(stuffer)를 갖는 pEF BOS (Mizushima 등, 1990, pEF BOS, A powerful mammalian expression vector, Nucleic Acids Research 18, 5322) 로 삽입하여, pEF MC1 neo PolyA 를 제조하였다 (Visvader 등, Mol. Cell Biol. 1995 Feb; 15(2): 634-41). 도 4 는 플라스미드 지도이다. pEFbcl-2-Neo^r 을 생성하기 위해서, 인간 bcl-2 cDNA 의 EcoRI/TaqI 절편 (긴 항-아폽토시스 전사체 버젼, Cleary 등, Cell 47: 19-28 (1986))을, EcoRI/ClaI 으로 개방시킨 pIC194 (Gene 32: 482, 1984) 로 서브클로닝하고, SalI (블런트)/EcoRV 절편으로서 절단한 다음, 이를 추가로 pEF-MC1neopA 의 복수 클로닝 부위(MCS)를 갖는 블런트 XbaI 부위로 클로닝하였다. 따라서, bcl-2 는 연장 인자 (Elongation Factor; EF) 1-a 프로모터 (플라스미드 지도, 도 3)으로부터 발현된다. 최종적으로 사용되는 pEF-Neo 벡터 구축물에서 EF1-a 프로모터를 지나서 MCS 가 XhoI 부위에서 개방되어, 비코딩 서열로부터의 블런트 및 랜덤 스터퍼 300 bp 절편이 적당한 대조군을 위해 삽입되었을지라도 (플라스미드 지도, 도 4), Neo^r-발현 카세트 (MC1neopA)는 pEF-벡터의 통합 부분(integral part)이었다. 리포펙틴 (Gibco, Paisely, Scotland)-매개 형질감염이 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다. 플라스미드 형질감염체는, Tey 등 (Tey, B. 등, Bcl-2 mediated supression of apoptosis in myeloma NS0 cultures, J. Biotechnology, 79 (2000), 147-159)에 기재된 추가의 보충물 및 5% 우태아혈청을 보충한 GMEM 배지 (Gibco) 에서 1 ㎎/㎖ G418 로 선별하였다. 이어서, 안정한 형질감염체를 무혈청 고밀도 성장 배지 EX-CELL 302 에 적응시켰다.

2. 고밀도 공급-회분식 세포배양

고밀도 세포배양을 위해서, NS0 모체 세포주, 6A1 Neo-세포주 및 6A1 bcl-2/Neo 대조군 세포주를, 1 ㎖/50 ㎖ GSEM (GS 발현 배지 보충물, 제품 번호 G9785, Sigma, Poole, UK)를 보충한 무혈청 배지 EX-CELL 302 (JRH Bioscience Inc., KS/U.S.A.) 에 적응시켰다. 계대하면서, 25 μM MSX 및 0.7 g/ℓG418 을 배지에 보충하였지만, 접종물 및 생물반응기 배양 배지로부터는 생략하였다. 생물반응기 세포배양 동안에 생존 세포의 밀도는 개별 세포주의 배양에 대해 도 1 에서 나타내었다. 각각의 세포주에 대한 공급-회분식 배양은 하기에 기재하였다:

미엘로마 세포주를 10 ℓ의 공기양수 발효기에서 무혈청 EX-CELL 302 배지로 성장시켰다. 출발세포 집단의 밀도는 갓 제조한 중기-지수(exponential) 배양으로 부터 대략적으로 10⁵ 세포수/㎖ 이었다. 약 10⁶ 세포수/㎖ 의 밀도로의 연속 성장 후에, 보충물을 한꺼번에 첨가하고, 보충물의 펌프를 시작하였다 (표 1). 공급을 100 시간에 걸쳐 지속하였다. pH 를 약 pH 7 로 조절하였다. 배양 밀도를 계수에 의해 대략적으로 매 25 시간마다 결정하였고, 세포 생존성을 트립판 블루 배제법에 의해 결정하였다. 전체 및 생존 세포 농도의 경우, 적당하게 희석한 샘플을 트립판 블루 (Sigma, Poole, UK) 로 희석한 후, 변형 Fuchs-Rosental 해모사이토미터 (haemocytometer) 를 이용하여 현미경으로 검사하였다. 대조를 위하여, CASY 계수기를 사용하여, 세포 크기를 기준으로 전체 및 생존 세포 농도를 측정하였다.

	성분	첨가량 [배양물 중 ㎎/ℓ]	첨가 방식
보충물 A	L-글루타민	250-350	배양물이 10⁶ 세포수/㎖ 일 경우, 200 mM 용액으로 한꺼번에 첨가
보충물 B	L-시스틴 L-티로신 L-트립토판	10-40 40-70 10-20	배양물이 10⁶ 세포수/㎖ 일 경우, 200 mM 용액으로 한꺼번에 첨가
보충물 C	L-리신 HCl L-히스티딘 L-아르기닌 HCl L-글리신 L-발린 L-메티오닌 L-트레오닌 L-세린 L-이소루신 L-루신 L-페닐알라닌 L-글루타민 D-글루코오스 콜린 클로라이드 콜레스테롤(+BSA) L-카르니틴	100-140 30-40 60-90 10-30 60-80 20-30 40-60 20-40 80-100 70-90 40-60 1000-1250 4000-5000 5-15 5-20 5-20	PBS 중 농축 용액으로 펌프에 의해 공급. 배양물이 10⁶ 세포수/㎖ 일 경우 공급을 시작한다.

혈청 보충 공급-회분식 배양에서 < 10⁶ 세포수/㎖ 의 최대 세포 밀도가 수득됨을 기재한 문헌 [Tey 등]과 반대로, 단지 약 10⁷ 세포수/㎖ 의 생존 세포의 최대 밀도로 bcl-2/Neo 재조합 세포주가 성장된 반면, Neo 재조합 세포주는 1.4 ×10⁷ 세포수/㎖ 의 최대 밀도로 성장되었다 (도 1). 계수된 세포의 생존성은 상기 언급한 바와 같이 트립판 블루 배제법에 의해서 결정되었다.

재조합 항체의 공간 시간적 수율은 재조합 Neo 세포주에 편향적이었다 (도 2). 이는 생물반응기 중의 생성물 적가 대 누적 세포 시간 (CCT; 단위: 10⁹ 세포수 h/ℓ)을 그래프적으로 나타내는 것에 의해 보여졌다. CCT 는 본질적으로는 Renard 등(1988, Biotechnology Letters 10: 91-96)에 의해 기재된 바와 같은 세포 성장 곡선의 적분에 의해 계산되었다. 도 2 로부터 유추할 수 있는 바와 같이, bcl-2/Neo 재조합 세포주의 평균 단일 세포 생산성은 0.260 pg 단백질/세포ㆍh 인 반면, Neo 세포주에서의 양은 0.210 pg 단백질/세포이었다. 단일 세포 생산성 (q_p)에 있어서의 약간의 차이는 생존 세포 밀도에 있어서의 차이에 의해 총 수율의 수준에서 분명히 압도되었다.

3. 유전자 카피수 결정

네오마이신 내성 유전자의 유전자 카피수는, 정량적 PCR 분석에 의해서 기탁 6A1-Neo 세포주에 대해서 비교 표준으로써 6A1 모체를 이용하여 결정하였다. 3.0 (±0.4) 카피의 유전자 카피수가 결정되었다. 안정하게 형질감염된 유전자의 환상화 통합(concatemeric integration)에 관하여, 이는 재조합 네오마이신 내성 마커 의 단일 통합이 추가의 증폭 없이 6A1-Neo 세포주에서 발생한다는 것을 의미한다. 이는 약 25 μM MSX 의 MSX 저농도와 일치하고; GS 마커 유전자의 증폭이 발생하기 위해서는, 10 내지 20 ×배 높은 농도의 선별제가 적용될 필요가 있다. 검사는 전문 협력 실험실 (Lark Technologies Inc., Houston, Texas) 에 의해 수행되었다. 트랜스포존 Tn5 유래의 네오마이신 내성 유전자에 대한 검사와 별개로, 네거티브 대조군은 마우스 글루세르알데히드 3-포스페이트 디히드로게나아제 [GAPDH] 유전자에 대해서 또한 시험하는 것에 의해 확립되었다. 클로닝된 플라스미드 표준은 분석 플레이트를 보정하기 위해 사용되었다. 카피수는, 표준 2배체(diploid) 표유동물 세포의 DNA 질량이 약 6.6 pg 인 것과 GAPDH 가 세포당 2 카피로 존재한다는 것을 가정하여, 세포(MUSGAPDH) 당 표적 (NEO) 의 수로서 계산되었다. 당업계에서 통상적인 260 및 280 nm 에서 흡광도를 측정하는 것에 의해, 세포로부터 추출된 게놈 DNA 를 분광학적으로 정량하였다. 네오마이신 내성 유전자 카피수를 검사하기 위해, Lonza Biologics 에 의해 제공된 pMC1 neopA 플라스미드의 8 개의 희석액을 사용하여 QPCR 표준 곡선이 형성되었다. 희석물 시리즈는 5 ×10⁶ 카피 내지 49 카피의 플라스미드 DNA 범위를 나타내었다. 각각의 표준은 GS-NS0 대조군 게놈 DNA (1000 세포수와 동등)로 희석되어, 추출된 세포주 DNA 의 매트릭스 효과를 모사(模寫)하였다. 주형을 전혀 함유하지 않거나 대조군 플라스미드만을 함유하는 네거티브 대조군 반응액 (5000 내지 50000 카피) 또는 1000 GS-NS0 세포의 DNA 동등물 (모체 세포주, 약 6.6 ng) 을 결합시켰다.

카피수는 역치 사이클 (Ct) 의 결정에 의해 95% 신뢰도 구간으로 결정하였다. Ct 는 프로브 절단에 의해서 형성되는 리포터 형광이 기준선 이상에서 설정된 고정 역치를 교차하는 분획 번호이다. 100% PCR 효율성이라고 가정하면, Ct 의 계산치에 있어서의 각각의 증가는 표적에 있어서의 2 ×증가를 나타낸다.

각각의 시험 대상 DNA 의 6 개의 독립적인 희석액이 제조되었고, 2회 분석되었다. 각각의 QPCR 반응액은 약 6.6 ng 의 시험 샘플 DNA 를 함유하였다. QPCR 반응액은 TaqMan Universal PCR Master Mix 프로토콜 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 에 따라 결합하였다. 반응액을 열순환시키고, 데이터를 ABI Prism 7700 Sequence Detection System version 1.6.3 (Applied Biosystems)에 의해 수집하였다..

4. 비교실시예: Neo-내성 유전자의 부재 및 치사량에 가까운 양의 G418 의 존재하에서의 6A1 모체 세포주의 배양

발현 네오마이신 내성 유전자의 존재에 의해서 보다는 G418 에의 노출에 의해 유도되는 임의의 성장 효과를 배제하기 위해서, 모체 세포주 6A1 을 G418 함유 세포배양 배지에 적응시켰다. G418 의 양은, 세포 성장의 멈춤 없이 360 ㎎/㎖ G418 (Sigma, Poole, UK ; G418 의 로트 품질(lot quality)은 공급원에 따라 상당히 가변적일 수 있다)의 농도까지 점진적으로 증가시킬 수 있었다. 성장 배지는, 송아지 혈청의 부재하에 6 mM 의 글루타민을 보충한 Lonza 의 최적화 전매 NS0 세포배양 배지 PM1 이었다. 6A1-Neo 세포주의 경우, 상기 무혈청 배지는, bcl-2 형질감염체 또는 비형질감염 모체 세포주 6A1 와 비교하여, 재현가능하게 본 발명의 고밀도 (> 2 ×10⁷ 세포수/㎖)를 성취가능하게 하였다. 따라서, 상기 배지는 네오마이신 마커 유전자의 부재하에서 G418 적응의 잠재적 효과를 모니터링하는데 적합하였다.

PM1 + 6 mM 글루타민에서 성장시킨 비적응 모체 세포주와 비교하여, G418(-) 배지에서 성장시킨 적응 세포는 아폽토시스성 및 괴사성 세포 사멸에 대해서 더욱 온화하게 내성이었지만 (데이터가 보여지지 않음), 모체 세포주와 비교하여 낮은 성장률 및 낮은 최대 세포 밀도를 가졌다 (도 5A: NS0 6A1 세포주/비적응 6A1 (닫힌 원), G418 의 존재 (개방된 원) 및 부재 (닫힌 삼각형)에서 성장시킨 360 ㎎/㎖ G418 에 적응시킨 6A1 의 회분식 배양에 있어서의 생존세포 밀도). 총 세포 계수에서 생존 세포 계수를 뺌으로써, 사멸 또는 괴사성 세포의 수를 결정하고, 총 세포 계수의 백분율로서 이를 도 5B 에 나타내었다. 따라서, 이 실험을 통해, 네오마이신 내성 마커의 부재하에서 G418 에의 노출은 단지 아폽토시스 내성의 잠재적인 효과를 나타낼 수 있지만, 강화된 고밀도 성장 양상의 효과를 나타낼 수 없다는 결론을 내리는 것이 가능하였다. 흥미롭게도, 360 ㎎/ℓ G418 의 존재하에서 적응된 세포주의 생물반응기 배양은 무혈청 배지 PM1 에서 적응시킨 세포주의 성장률 및 최대 세포 밀도를 훨씬 더 최소화시켰다.

5. 6A1, 6Al-Neo 및 6Al-bcl-2 의 회분식 배양에서의 q _P

세포주는 실시예 1 및 2 에 이미 기재되어 있고; 세포 배양은, 공기양수 발효기에서의 공급-회분식 배양 대신에 단순한 회분식 배양을 진탕 플라스크에서 수 행한 것을 제외하고는 실시예 2 에 기재된 바와 같이 수행하였다. 단일 세포 생산성은 배양 분액으로부터 Elisa 검사 포멧에서 cB72.3 의 분비를 검사하는 것에 의해 결정하였다. 분액에 대해 생존 세포수를 계수하였고, 이를 소정의 시간 동안 96웰 플레이트 중의 갓 제조된 배지에 현탁하였다. 배양 샘플을 약 80 시간째 및 회수 (약 240 시간)시에 채취하였다. 결과를 도 6B 에 나타내었다. 트립판 블루 배제법에 의해서 결정된, 생존 세포 밀도에 기초한 성장 곡선은 도 6A 에 나타내었다 (개방된 원: 6A1-Neo, 닫힌 삼각형: 6A1-bcl2, 닫힌 원: 6A1-(100)3). 6A1-Neo 세포주는 6A1-bcl-2 세포주 보다 높은 단일 세포 생성성 q_P 를 일정하게 보여주었다. 모체 6A1 세포주는 그의 낮은 성장 곡선에 의해 네거티브적으로 균형맞추는 훨씬 높은 q_P 를 가졌다.

Claims

하기 단계를 포함하는 단백질 발현 방법:

a. 세포주가 발현가능한 아미노글리코시드 내성 유전자로 형질감염되고 발현가능한 글루타민 신데타아제 유전자(glutamine synthetase gene) 로 형질감염되며, 세포주가 추가로 생성물 단백질을 발현할 수 있는 동물 세포주를, 유가식(fed-batch) 반응기 중 무혈청 고밀도 성장 배양배지에서 10⁷ 세포수/㎖ 이상 또는 초과의 생존 세포 밀도로 성장시키는 단계; 및 하기 단계를 추가로 포함함:

b. 배양액으로부터 생성물 단백질을 단리하는 단계.
동물 세포주(cell line)의 고밀도 성장을 성취하기 위한 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 사용 방법에 있어서, 상기 세포주가 재조합 글루타민 신데타아제를 추가로 발현할 수 있고, 상기 고밀도 성장이 10⁷ 세포수/㎖ 초과의 생존 세포 밀도인, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 사용 방법.
제 2 항에 있어서, 동물 세포주가 림프구 세포주인 것을 특징으로 하는, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 사용 방법.
제 3 항에 있어서, 림프구 세포주가 미엘로마 세포주인 것을 특징으로 하는, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 사용 방법.
제 4 항에 있어서, 미엘로마 세포주가 NS0 세포주인 것을 특징으로 하는, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 사용 방법.
삭제
제 2 항에 있어서, 내성 유전자 산물이 네오마이신 내성 유전자 산물이고, 세포주가 발현가능한 네오마이신 내성 카세트(cassette)를 담지하는 DNA 로 형질감염되며, 이어서 1 ㎎/㎖ 이상의 농도의 네오마이신 또는 제네티신 (G418) 과 함께 세포주 배양 배지에서 배양함으로써 네오마이신 내성 표현형을 갖는 세포주의 선별을 수행하는 것을 특징으로 하는, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 사용 방법.
제 7 항에 있어서, 네오마이신 내성 선별 후에, 세포주를 유가식 생물반응기에서 고밀도로 추가로 배양하는 것을 특징으로 하는, 아미노글리코시드 내성 유전자 산물의 사용 방법.
삭제
세포가 유가식 생물반응기 중의 액체 배지에 함유된 동물 세포주의 세포를 고밀도 성장 무혈청 세포 배양 배지에 포함하는 고밀도 세포 배양물에 있어서, 상기 세포 배양물이 ㎖ 당 10⁷ 세포수 초과의 생존 세포 밀도를 갖고, 상기 세포주가 발현가능한 아미노글리코시드 내성 유전자로 형질감염되고 발현가능한 글루타민 신데타아제 유전자로 형질감염되며, 상기 세포가 발현가능한 아미노글리코시드 내성 마커 유전자의 형질감염 후에 배지에 보충되는 아미노글리코시드 항생제로 처리되는 고밀도 세포 배양물.
제 10 항에 있어서, 상기 배양물이 ㎖ 당 10⁷ 세포수 미만의 생존 세포 밀도를 갖는 세포 접종물을 성장시키는 것에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
삭제
삭제
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 세포는 재조합 bcl-2 가 없는 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 동물 세포주가 림프구 세포주인 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
제 15 항에 있어서, 림프구 세포주가 미엘로마 세포주인 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
제 16 항에 있어서, 미엘로마 세포주가 NS0 세포주인 것을 특징으로 하는 세포 배양물.
제 1 항에 있어서, 내성 유전자가 네오마이신 내성 유전자이고, 세포주가 발현가능한 네오마이신 내성 카세트(cassette)를 담지하는 DNA 로 형질감염되며, 이어서 1 ㎎/㎖ 이상의 농도의 네오마이신 또는 제네티신 (G418) 과 함께 세포주 배양 배지에서 배양함으로써 네오마이신 내성 표현형을 갖는 세포주의 선별을 수행하는 것을 특징으로 하는, 단백질 발현 방법.
제 1 항에 있어서, 동물 세포주가 림프구 세포주인 것을 특징으로 하는, 단백질 발현 방법.
제 19 항에 있어서, 림프구 세포주가 미엘로마 세포주인 것을 특징으로 하는, 단백질 발현 방법.
제 20 항에 있어서, 미엘로마 세포주가 NS0 세포주인 것을 특징으로 하는, 단백질 발현 방법.