JP4267450B2

JP4267450B2 - アミノグリコシド系耐性遺伝子の使用

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Publication number: JP4267450B2
Application number: JP2003530865A
Authority: JP
Inventors: アル−ルベアイ、モハメド; ペラニ、アンジェロ; レイチャー、アンディ; バーチ、ジョン
Original assignee: ロンザ・バイオロジクス・ピーエルシー; アル−ルベアイ、モハメド
Priority date: 2001-09-26
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2009-05-27
Anticipated expiration: 2022-09-26
Also published as: ES2269807T3; US20050112722A1; GB0123098D0; CN100402653C; US7439037B2; EP1438411A2; CN1705749A; WO2003027300A3; KR20040054698A; JP2005518189A; DE60213441T2; NO332092B1; NO20041856D0; ATE334215T1; NO20041856L; AU2002334102A1; KR100982153B1; DK1438411T3; EP1438411B1; WO2003027300A2

Description

本発明は、バイオテクノロジーにおけるタンパク質発現分野に関する。具体的には、動物細胞の高密度増殖を達成するための、アミノグリコシド系耐性遺伝子、特にネオマイシン耐性遺伝子の使用に関し、タンパク質産生及び高密度細胞培養のそれぞれの方法に関する。

動物細胞培養による治療タンパク質のバイオテクノロジー的な生産は、非常に困難であり、また費用的に多大な努力を要する。ダウンストリーム処理を含めた生産の効率は、主に初期の細胞培養段階の時間と空間の収率によって左右される。培養ブロスにおける産生タンパク質の高収率と高濃度の両方が望まれている。結果として、工業的なスケールの細胞培養において、静的な生産定常期に入る前に達する最大細胞密度の比較的小さい上昇によって、全体的な生産性のかなりの増強が説明されるだろう。これは単に、この方法に加えられる細胞の総数が大きいためである。

細胞のタイプ及び培養方法に強く依存するが、エアリフトリアクターのような高密度増殖のために最適化された従来のバッチ供給式培養法（fed-batch culture）システムは、無血清の細胞培養物を１０⁷細胞／ｍｌ以上の密度まで増殖させることはできなかった。高密度は、可能性としては、血清を補充したバッチ供給式培養法において、またはより近代的な灌流リアクターシステムによって達成できる。しかしながら、どちらの選択肢も重大な不利益を必然的に伴う。全範囲にわたる天然増殖促進物質を包含するウシ胎児血清を補充した培養培地は、その品質が血清の原料に強く依存し、極めて重大なことに、医療用の治療タンパク質を生産する培地に、偶発的に動物ウイルスを導入する永続的なリスクをもたらす。よって規制上の理由のために、血清の補充は避けられるべきである。

しかしながら、灌流リアクターシステムはより複雑で、運転中にコントロールが必要であり、また、従来のバッチ供給式培養法システムよりも運転に費用がかかる。これは、新しい培養培地を持続的に注入するために、平行して培地をリアクターから放出するための最新式の精密濾過システムを必要とする。特に、細胞細片またはタンパク質による濾過ユニットの目詰まりは、早期の運転停止のリスクを伴う。比較すると、バッチ供給式培養法は、経済的な処理及び頑強性において重要な利点を有する。

さらに、所望のタンパク質を生産する安定した組換え細胞株を創造するためには、少なくとも一つの、通常は恒常的に発現される耐性マーカー遺伝子を導入することが必要である。そのようなマーカー遺伝子の発現は、細胞に対するさらなる代謝負荷を構成し、これは最善の状態では増殖挙動に影響を与えないが、極めて不利なことには、血清が十分に補充された細胞培養培地においてさえ増殖率と最大生細胞密度に影響を与え得る（Gaigle et al., 1999, Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are also serine protein kinases, Chemistry and Biology 6,11-18 ; Maio et al., 1991, Gene activation mediated by protein kinase C in human macrophage and teratocarcinoma cells expressing aminoglycoside phosphotransferase activity, J. Cell. Physiology 149,548-559 ; Southern et al. , 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1,327-341）。

本発明の目的は、従来技術の不都合を回避し、動物細胞を無血清培養システムにおいて高細胞密度に増殖させる方法を提供することである。この目的は、動物細胞中でアミノグリコシド耐性遺伝子を発現させることによって解決し、その後該細胞は、独立請求項１，２，８に従った適切な培養システムにおいて適切な培地で培養される。驚くべきことに、当該分野では慣例である培養方法及び培養培地によって、本発明に従って処置された細胞株は、それらの非処理親細胞株と比較してより高い細胞密度にまで、無血清細胞培養培地で増殖可能である。加えて、増殖定常期の延長もいくらか観察された。このように、本発明以前には実現されていなかった、無血清培地において最大生細胞密度を達成することが可能である。

本発明の可能な実施形態を図に示した。

本発明に拠れば、アミノグリコシド系耐性遺伝子産物は、動物細胞の高密度増殖を達成するために使用される。本発明による使用は、細胞内で該耐性遺伝子産物を発現させることと、アミノグリコシド系抗生物質、好ましくは抗生物質ネオマイシンを用いてそのような耐性遺伝子産物を発現している細胞を選択することと（アミノグリコシドは前記対応する耐性遺伝子産物によって分解される）、及び最後に、バイオリアクター、例えばエアリフトまたは攪拌バイオリアクターにおいて、高密度増殖を可能にする適切な無血清細胞培養培地でそのような細胞を培養することとを含む。

本発明に従った耐性遺伝子産物は、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、特にネオマイシンに耐性である周知の遺伝子のような、任意のアミノグリコシド系耐性マーカーであり、真核細胞のための遺伝子マーカーとして使用できる。アミノグリコシド系耐性遺伝子は、真核細胞の分子生物学において一般に使用され、多くの標準的な教本及び研究室マニュアルに記載されている（例えば、Shaw et al., 1993, Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes, Microbiol. Rev. 57: 138-163 ; WO 82/03087; Southern et al., 1982, Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with a bacterial gene under control of the SV40 early region promoter, J. Mol. Appl. Genet. 1,327-341）。前述の事柄から推論されるように、アミノグリコシド系耐性遺伝子は、本発明によるアミノグリコシド分解活性の点から見て、機能的な遺伝子産物であると言われる。これはそれ故、本発明の既知のアミノグリコシド系耐性遺伝子産物の上記の意味での機能的変異体における、遺伝子改変の利用であると考えうる。そのような変異体はそれぞれ、例えば置換、欠損、挿入又はアミノ酸及びそのコードするＤＮＡ配列の切断によって生成され得る。そのような方法は当該分野において周知であり、通常、突然変異を指向する特異的なサイト、またはランダム突然変異による多様性の発生とそれに続く機能的分析方法による所望の変異体の選択を含む。突然変異を誘発する慣例的な方法は、例えばアルキル化剤またはＵＶ照射への曝露、エラー易発性ＰＣＲまたは関連遺伝子混合ＰＣＲなどの技術であり、通常は微生物で行われる（Miller, J. , Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory 1972; Ling et al. , 1997, Approaches to DNA Mutagenesis, Analytical biochemistry 254, 157-178 ; Cadwell et al. , 1992, Randomization of genes by PCR mutagenesis in: PCR Methods, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1992; Moore et al. , 1997, Strategies for the in vitro evolution of protein function, J. Mol. Biol. 272,336347）。

便宜的に、耐性遺伝子産物は、既知の技術によって細胞に形質移入され、真核生物の発現に適したＤＮＡ発現構築物から発現される。この耐性遺伝子産物は、恒常的に発現されてもよく、または誘導されて発現するか抑制されることもできる、即ち、何れの方法でも発現可能である。少なくともアミノグリコシド系抗生物質で選択している期間、及び最大細胞密度を達成するための高密度細胞培養システムにおいて対数的に成長している期間は、本発明の耐性遺伝子産物は発現されなければならない。例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）またはシアミアンウイルス（ＳＶ４０）レートプロモーターによって恒常的に発現されることが好ましく、真核細胞において恒常的に活性である強力なウイルス転写促進プロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターによって発現されることが最も好ましい。強力なウイルスプロモーターの転写促進因子と他のプロモーター、例えばアルファ-アクチンプロモーターの、必須な例えば転写開始ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＡＴボックスを提供する核プロモーター部分とから成るキメラプロモーターを使用しても良い。

本発明のアミノグリコシドは、他の半分子とグリコシド結合を介して結合したアミノ−ピラノース分子またはアミノ−フラノース分子を少なくとも一つ含む、一般に知られているアミノグリコシド系抗生物質である（Mingeot-Leclercq,M. et al., Aminoglycosides: acitivity and resistance, 1999, Antimicrob. Agents Chemother. 43 (4): 727-737）。それらの抗生剤効果は、タンパク質の合成阻害に基づいている。例としては、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、Ｇ４１８（ジェネティシン）、ネオマイシンＢ（フラマイセチン（Framycetin））、シソマイシン、アミカシン、イセパマイシン等である。

本発明の状況において、スペクチノマイシン、アニソマイシン、及び特にプロマイシンのような、細菌中においてタンパク質の合成を阻害するための抗生物質活性を有し、また、非還元アミノ−糖分子に関する化学構造を有する他の化合物は、当該分野でしばしばそうされるように、本発明の「アミノグリコシド系抗生物質」と見なされる。アミノグリコシド系化合物が真核細胞培養において毒性効果をも有するということは留意されるべきである。これは、上述したように、ミトコンドリアのタンパク質翻訳装置が進化上の他の毒性効果があり得ると考えられる、原核生物の起源である（ミトコンドリアの進化の内部共生体仮説）ことにも部分的に原因しているためである。

本発明に従って、耐性遺伝子産物を発現している細胞を選択するために、アミノグリコシド系抗生物質を用いた耐性選択が、少なくとも耐性遺伝子を形質移入した後の形質移入体の初期の選択に適用され、これは通常４８時間から数週間にのぼる。その結果、アミノグリコシド系耐性遺伝子は細胞株に安定して形質移入される。安定的な形質移入は通常、少なくとも発現されたかまたは発現可能であるアミノグリコシド系耐性遺伝子のコピーがゲノムへ組み込まれることであり、機能的遺伝子産物を生じる。例えば細胞における人工的かつ安定な微小染色体の創造を発明し得る遺伝子工学の近年のさらなるアプローチは、同様に本発明の「安定な形質移入」という概念を含んでいる。言うまでもなく、周知の形質移入プロトコール、例えばリポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、Ｃａ−リン酸または電気穿孔法など、これら全ては本発明の形質移入に適用できるが、これらに従って、新しい形質移入細胞を、選択用のアミノグリコシドのような補充物を加える前のアミノグリコシド非補充培地でまず培養する。この非選択処置期間は、耐性マーカー遺伝子産物を効率的に発現させるために必要であり、細胞の種類によって約１２時間から１〜２日間の範囲である。耐性選択は、好ましくは形質移入後少なくとも２週間、さらに好ましくは形質移入後少なくとも５週間、最も好ましくは形質移入後少なくとも８週間の間適用される。さらなる細胞培養、例えばバイオリアクター内で発酵する期間、培地に添加されたアミノグリコシド系抗生物質によって及ぼされる選択圧下での増殖期間を延長することも可能である。形質移入体の初期の選択の後、培養培地にアミノグリコシドの単投与量を繰り返し添加して培養期間中にさらに散在的な短い間隔での選択圧を与え、その後、アミノグリコシド非補充培地を補充してもよい。好ましくは、バイオリアクターでの培養中、本発明の発現可能であるかまたは発現された耐性遺伝子は、ゲノム中に安定に組み込まれ、培養は選択圧の非存在下で行われる。これは、細胞培養―例えば、本発明の他の好ましい実施形態によるバッチ供給式バイオリアクターにおける―が、発酵の開始または過程のどちらかにおいて、細胞培養培地に補充されたアミノグリコシド系抗生物質の非存在下で行われるということである。

好ましくは、アミノグリコシドは少なくとも０，１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用され、より好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度、最も好ましくは少なくとも４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。通常、本発明に従ったそのような量のアミノグリコシドは、当該分野で周知であり、また、標準的な研究室マニュアルによく記載されているように、対応する耐性遺伝子産物の発現構築物を形質移入した後の細胞培養培地に添加される。さらに、特に好ましい実施形態において、アミノグリコシドは形質移入後に１〜４ｍｇ／ｍｌの濃度で少なくとも２週間、さらに好ましくは少なくとも５週間、最も好ましくは少なくとも８週間、細胞培養を継続する間使用される。

好ましくは、本発明の耐性遺伝子産物は、ＷＯ８２／０３０８７に開示されているようなネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ（この耐性遺伝子は通常Ｎｅｏ^rと呼ばれる）である。そのようなホスホトランスフェラーゼ酵素の種々の天然イソ型は、既知であり、本発明の範囲にも含まれる。Ｇ４１８（ジェネティシン、Chemical abstracts Registry Number 49863-47-0で定義される）またはネオマイシンによる選択は、ネオマイシン遺伝子産物を発現している細胞の選択に使用され得る。より好ましい実施形態では、Ｇ４１８が耐性細胞の選択に使用される。

本発明の動物細胞または細胞株は、組換えタンパク質の生産に使用される通常の細胞株であれば何れのものでもよく、例えばＳｆ９昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＶＥＲＯ−９６細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＢＨＫ細胞、フィブロブラスト、ハイブリドーマ、ＥＢＶ不死化リンパ芽球または「骨髄腫」細胞、例えばＮＳ０細胞株であってよい。ＮＳ０細胞のような骨髄腫細胞は、当該分野で「骨髄腫」と日常的に呼ばれるが、実際はＢ−リンパ系細胞タイプである（Bames et al. , Cytotechnology 32: 109-123, 2000）。

本発明の動物細胞または細胞株は、足場非依存性の細胞であることが好ましい。そのような細胞は、本来の増殖を基質接触に依存せず、培養培地中で遊離懸濁液として増殖することができる。さらに好ましい実施形態において、産生細胞株は、リンパ系細胞株、例えばハイブリドーマ細胞、ＥＢＶ不死化リンパ芽球または骨髄腫細胞であり、最も好ましくは、細胞は骨髄腫細胞であり、特に骨髄腫ＮＳ０細胞、例えば細胞株ＥＣＡＣＣ番号85110503及びその誘導体であり、欧州細胞株コレクション（ＥＣＡＣＣ）（Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom）から自由に入手可能である。ＮＳ０は、特に組換え抗体の産生に使用される場合に、極めて高い生産収率を潜在的に生じさせることが発見された。最も標準的なＮＳ０細胞株は、コレステロールを培養培地の絶対組成物とするコレステロール依存性である。

さらに好ましい実施形態において、アミノグリコシド耐性遺伝子を保持する本発明に従った細胞株は、さらに、組換えグルタミン合成酵素（ＧＳ）を発現可能な細胞株であり、特に好ましくはＮＳ０骨髄腫組換えＧＳ細胞株である。ＮＳ０細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現システムと共に使用される場合に、特に有利である（Bebbington et al. , 1992, High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selctable marker, Bio/Technology 10: 169-175 ; Cockett et al. , 1990, High level expression of tissue inhibitor of metalloproteinases in Chinese Hamster Ovary (CHO) cells using Glutamine synthetase gene amplification, Bio/Technology 8 : 662-667）。好ましくは、産生タンパク質遺伝子配列及びＧＳ遺伝子配列は、前記形質移入されたＮＳ０細胞株を生成するために、単一のＧＳプラスミドベクター上に保持され、前記遺伝子は例えば内部リボソームエントリーサイトを使用する、異なるプロモーターまたは同一のプロモーターによって発現される。このＧＳシステムは、治療的タンパク質を産生するために特に重量なただ二つのシステムのうちのひとつである。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）システムと比較して、ＧＳシステム、特にＮＳ０骨髄腫細胞と組み合わせて使用されるＧＳシステムは、高増殖性細胞株がしばしば形質移入体の初期のプールから生成し、従って遺伝子増幅を達成するための、濃度が上昇された選択剤の存在下における複数回の選択の必要性が回避されるために、発展させる間に多大な利点を提供する（Brown et al. , 1992, Process development for the production of recombinant antibodies using the glutamine synthetase (GS) system, Cytotechnology 9: 231-236）。ＮＳ０骨髄腫細胞は、表現型的にグルタミン合成酵素が欠損している。それ故、マウス腫瘍細胞株（Galfre, G. and Milstein"C., Methods in Enzymol. 73,3-75, 1981）に由来するＮＳ０細胞株は、工業的スケールでのＧＳシステムの使用のためにしばしば選択される細胞株である。そのような細胞株の例は、６Ａ１−Ｎｅｏ細胞株でありこれは２００２年８月３０日にブタペスト条約に基づいて、受付番号０２０８３０３１として、欧州細胞培養物コレクション（ＥＣＡＣＣ）（Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury/Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom）に寄託された。寄託された細胞株は、組換えｂｃｌ−２に欠けており、実施例でさらに記載される。この細胞株及び他の組換えｃＢ７２より抗体を産生するよう改変された任意の可能な子孫は、本発明のさらに好ましい実施形態である。そのような改変は、細胞融合のみならず、ある遺伝子のサイレンシングまたはノックアウト、より慣習的な組換え体の生成技術、突然変異誘発方法による変異体の発生（詳細は上述した）、または、与えられた細胞培養培地のために、貯蔵（deposited）として親細胞株の増殖性質を保存するかまたは改良する慣例的な培地適用技術を同様に含む。

さらなる実施形態において、高密度細胞培養に用いられる本発明に従った細胞は、組換え的に発現されるｂｃｌ−２タンパク質、ｂｃｌ−ｘｌタンパク質または他の機能的な（機能的とはアポトーシスを予防することと理解されるべきである）天然または遺伝子改変された変異体のアポトーシス阻害―ｂｃｌ−２ファミリー（Petros et al., 2001, Solution structure of the antiapoptotic protein bcl-2, Proc. Natl. Acad. Science U. S. A., 98, 3012-3017）またはｂｃｌ−２の類縁体種、例えばエプスタインバールウイルス（ＥｐｐｓｔｅｉｎＢａｒｒＶｉｒｕｓ）のＢＨＦＲ−１、またはＰｅｔｒｏｓｌら（ibd.）によって概説された他の機能的な類縁体ｂｃｌ−２に欠いている。そのような好ましい実施形態は、上述した他の好ましい実施形態、即ち、発酵期間中のアミノグリコシド系抗生物質の存在として理解される選択圧の非存在と都合よく組み合わせることができる。驚くべきことに、アミノグリコシド系耐性マーカーとｂｃｌ−２タンパク質の共発現は、本発明のアミノグリコシド耐性の細胞密度促進効果に対して反応しないことが発見された。理論的に結びつかないため、本発明の増殖促進効果は抗アポトーシス効果またはｂｃｌ−２に基づく効果に起因するとは思われない。というのも、例えばｂｃｌ−２とＮｅｏ^rの共発現は、この場合、比較実験で実際に観察された高密度増殖に対する不反応性よりも上位性であるためである。

哺乳類細胞株に適した培地と培養方法は、当該分野において周知であり、例えばＵＳ5633162に開示されている。研究室のフラスコ用または低密度細胞培養用、及び特定の細胞タイプの要求に適応している標準的な細胞培養培地の例は、例えば、ロスウェルパーク記念研究所（Roswell Park Memorial Institute）(RPMI)１６４０培地(Morre, G.,The Journal of the American Medical Association, 199, p. 519 f. 1967)、Ｌ−１５培地(Leibovitz, A. et al. , Amer. J. of Hygiene, 78, lp. 173 ff, 1963)、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)、イーグル最小必須培地(ＭＥＭ)、ハムＦ１２培地(Ham, R. et al. , Proc. Natl. Acad. Sc. 53, p288 ff. 1965)、またはアルブミン、トランスフェリン、及びレシチンを欠損したイスコブ（Iscoves）改変ＤＭＥＭ(Iscoves et al. , J. Exp. med. 1, p. 923 ff., 1978)である。そのような培養培地はウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＦＣＳとも称される）を補充し得ることが知られており、ウシ胎児血清は過剰のホルモン及び増殖因子の天然源を提供する。

形質移入とアミノグリコシドによる選択の間は、培養された動物細胞の持続する増殖に適した任意の培地を使用することができる。本発明に従ったバッチ供給式バイオリアクターにおける動物細胞の高密度増殖のために、高密度増殖培養培地が使用されるべきである。

本発明に従って、細胞培養培地は、その細胞培養培地が、従来のバッチ供給式バイオリアクターシステムにおいて動物細胞を生細胞の密度が１０⁶細胞／ｍｌを超えるまで増殖させることができるかどうかで定義されることによる高密度増殖培養培地である。本発明の状況において、そのような培養培地は、上述したアミノグリコシド選択と組み合わされて、いっそう高い細胞密度を生じさせる。通常、本発明に従ったそのような培地は、１〜１０ｇ／ｌのグルコースまたは他のエネルギー源を含み、グルコースの濃度はバッチ供給式培養の間このレベルに制御されている。好ましくは、その培地は少なくとも２ｇ／ｌのグルコースを含み、この濃度は、バッチ供給式発酵の間、ほとんど完全に制御される。この培地は等張性であり、即ち、２７０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２８０〜３００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲にある。特定の細胞タイプ、例えばリンパ系細胞のそれぞれの培地の選択は、当該分野において周知であり、範囲、割合、及び個々の栄養の投与量によって複合的に相関する。例えばハイブリドーマ細胞株に適した高密度増殖培地の例は、上記の標準的な培地と比較するとＧＢ２２５１２４９Ａで与えられる。そのような高密度増殖培地は、通常、全アミノ酸、上述した範囲で与えられるグルコースのようなエネルギー源、無機塩、ビタミン、微量元素（無機化合物として定義され、通常マイクロモーラーの範囲の最終濃度で存在する）、バッファー、４つのヌクレオチドまたはそれらに対応するヌクレオチド、グルタチオン（レダクターゼ）のような抗酸化物、ビタミンＣ、及び、重要な膜脂質のような他の成分、例えばコレステロール、またはホスファチジルコリンまたは脂質前駆体、例えばコリンまたはイノシトールなどの成分のような栄養が補充される。高密度培地はこれらのほとんどの成分または全ての成分を豊富に含み、そして、基本等張培地のモル浸透圧濃度に基づいて無機塩が調節されていることを除き、ＲＰＭＩ１６４０と比較して、ＧＢ２２５１２４９から得られる上述の標準的な培地よりもそれらを多量に含む。好ましくは、本発明に従った高密度培養培地は、トリプトファンが培養培地当たり７５ｍｇ／ｌを超過することを除き、全てのアミノ酸が平均的に補強される。好ましくは、一般のアミノ酸の必要性と組み合わせて、グルタミン及び／またはアスパラギンは高密度培地に１ｇ／ｌより多く、より好ましくは２ｇ／ｌより多く加えられる。言うまでもなく、後者の好ましい実施形態は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）ベクターを形質移入された組換え細胞株の場合にはあまり適さない。そのような細胞株においては、例えば外来性及び内因性の源の両方に由来するグルタミンの超過は、回避すべきアンモニアの生成を引き起こす。ＧＳ形質移入細胞株のための培養条件は、実施例に記載される。

便宜上、本発明の高密度細胞培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＣＳまたはＦＢＳ）を欠いており、これは「無血清」と名付けられる。本発明の、無血清培地で１０⁷細胞／ｍｌを超える生細胞密度での高密度増殖を達成する可能性はこれまで案出されていないが、驚くべきことに、胎児血清の補充は、本発明の状況において試験された少なくとも幾つかの細胞株の高密度増殖に対して反応しないことが発見され、これは当該分野の技術者の通常の予想に反するものである。無血清培地中の細胞は通常、最適な増殖のために無血清培地中のインスリン及びトランスフェリンを必要とする。トランスフェリンは、ＷＯ９４／０２５９２に開示されているトロポロン（tropolone）のような非ペプチドシデロフォアによって少なくとも部分的には代用される。殆どの細胞株は、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ及びII（ＩＧＦＩ、ＩＧＦII）などを含めた一以上の合成増殖因子（組換えポリペプチドを含む）を必要とする。必要とされる他のクラスの因子は、プロスタグランジン、輸送及び結合タンパク質（例えばセルロプラスミン、高密度及び低密度リポタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、ステロイドホルモンを含むホルモン、及び脂肪酸を含む。ポリペプチド因子試験は、増殖刺激性であることが分かっているそれらの存在下で、新しいポリペプチド因子を試験する段階的な様式で行われることが最良である。動物細胞培養における幾つかの方法論的なアプローチが周知であり、代表的なものを次に記載する。最初の段階では、血清補充培養培地から移して３〜６日後の細胞が生存する条件、及び／またはゆっくり増殖する条件を得る。ほとんどの細胞型において、これは少なくとも一部は接種した密度の関数である。一旦、最適なホルモン／増殖因子／ポリペプチドの補充が分かれば、生存に必要な接種密度は減少する。

より好ましい実施形態において、細胞培養培地は増殖因子を含まない。これは、シグナル伝達及び細胞サイクルの進行の引き金となる、胎児血清または殆ど完全に純粋なタンパク質成長因子の添加のそれぞれを含まないことを意味する。そのような培地はなお、インスリンまたはトランスフェリンのような、培地から鉄を補充するために有用である他のタンパク質、またはコレステロールのような脂質の輸送のために必要なＢＳＡを含んでいる。さらに好ましくは、そのような培地は本発明に従ってリンパ系細胞株と組み合わせて使用され、最も好ましくは骨髄腫細胞株、特に、ＮＳ０細胞株と組み合わせて使用される。

本発明に従った適切なバイオリアクターは、例えばエアリフトバイオリアクターまたは攪拌バイオリアクターのような高密度動物細胞培養に慣例的に使用されるバッチバイオリアクターである。便宜上、バイオリアクターのような高密度細胞培養は、バッチ供給式方法で操作される。この定義は、連続的に与える操作も同様に含む。好ましくは、本発明に従ったバッチ供給式バイオリアクターは、少なくとも６ｈ^-1、さらに好ましくは少なくとも１０ｈ^-1の容積測定の酸素質量移動係数Ｋ_Lａ（Bailey, J. et al., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill, N. Y. 1986）を有する。最も好ましくは、本発明の前記好ましい酸素質量移動性質を有するバッチ供給式バイオリアクターは、エアリフトバイオリアクターである。エアリフトバイオリアクターは、技術者に周知であり、リアクターの設計のための重要なパラメーターは十分に開示されている（概説として、例えばChisti, M. et al., 1987, Airlift reactors, Chem. Eng. Commun. 60,195-242 ; Koch, A. et al. , 1987, Measurement and modeling of mass transport in airlift-loop reactors in relation to the reactor design, Chem. Ing. Tech. 59,964965を参照）。自明のことであるが、本発明のバッチ供給式培養には灌流培養システムは含まれないことを強調する。

本発明の状況において、高密度細胞培養は、生細胞が１０⁶細胞／ｍｌ以上、好ましくは、１０⁷細胞／ｍｌ以上、さらに好ましくは１.２３×１０⁷細胞／ｍｌより高く、最も好ましくは１.３×１０⁷細胞／ｍｌより高い密度を有する動物細胞の個体群密度として定義され、その個体群は、単一細胞から、または、一定であるかまたは増殖する培養物容積における、細胞培養培地における低い生細胞密度の接種菌から継続的に増殖したものである。

さらに好ましい実施形態において、バッチ供給式培養法は、グルタミン濃度が個別に供与されて制御されていることは別として、少なくともグルタミンと、任意に一つまたは幾つかの他のアミノ酸、好ましくはグリシンが、ＧＢ２２５１２４９に開示されているように、それらの培地中の濃度を維持するために細胞培養物に与えられる培養システムである。さらに好ましくは、グルタミンと、一つまたは幾つかの他のアミノ酸の任意の供与は、ＥＰ２２９８０９−Ａに開示されているように、一以上のエネルギー源、例えばグルコースの細胞培養物への供与と組み合わされる。供与は通常、培養開始から２５〜６０時間後に開始される。例えば、細胞密度が約１０⁶細胞／ｍｌに達した時に供与を開示するのが有用である。グルタミン及び／またはアスパラギン供与の総計（グルタミンをアスパラギンで置き換えて。Kurano, N. et al. , 1990, J. Biotechnology 15,113-128を参照）は、培養物の容積当たり、０.５〜３ｇ／Ｌ、好ましくは１〜２ｇ／Ｌの範囲にあるのが有用である。供与し得る他のアミノ酸は、総供与量が培養物当たり１０〜３００ｍｇ／Ｌであり、特にグリシン、リジン、アルギニン、バリン、イソロイシン、及びロイシンは一般に、少なくとも１５０〜２００ｍｇという他のアミノ酸よりも高い供与量で与えられる。供与は、単回添加として、または連続的なポンプ供与として添加することもでき、好ましくは、供与はほとんど連続的にバイオリアクターに注入される。言うまでもなく、ｐＨは、バイオリアクターでバッチ供給式培養をしている間、塩基またはバッファーを添加することで、与えられた細胞株に最適なおよその生理学的ｐＨに注意深く制御される。グルコースがエネルギー源として用いられる場合、グルコース供与の総計は通常、培養物１リットル当たり１〜１０グラム、好ましくは３〜６グラムである。アミノ酸の算入は除き、供与は好ましくは、培養物１リットル当たり５〜２０ｍｇの範囲の低い量のコリンを含む。

好ましくは、本発明の動物細胞または細胞株は、第二の産生タンパク質を産生するか、または第二の産生タンパク質を、例えば誘導されて発現できる産生細胞株である。本発明に拠る第二の産生タンパク質は、多量に産生されて収集されることが求められるタンパク質である。これは所望する任意のタンパク質、例えばインターロイキンのような治療的タンパク質、または例えば酵素阻害剤のような酵素または抗体またはそれらの断片（例えばｆａｂフラグメント）であってよい。これは、プラスミドまたは遺伝子改変ウイルスを含めた他のタイプのベクターで保有される組換えタンパク質であり得、あるいは任意の技術によってゲノムに安定に組み込まれることもできる。これは、プラスマまたはハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体のような自然発生の発現構築物であることもできる。この産生タンパク質は、宿主産生細胞からポリペプチドの分泌を可能にするシグナル配列を含んでもよい。これは恒常的に発現するか、または誘導によって発現されてもよい。

好ましくは、産生タンパク質は組換えタンパク質であり、最も好ましくは恒常的なプロモーターによって発現される組換えタンパク質である。本発明の「組換え」とは、任意の遺伝子工学技術によって最初に前記細胞に導入された、細胞株において対応する遺伝子の、少なくとも一つの外来性のコピーから発現されるタンパク質を意味し、そのタンパク質が、少なくとも一つの天然に存在するコピーにおける産生細胞において生じるかどうかは無関係である。そのような、組換え遺伝子のさらなるコピーは、例えばゲノム中に組み込まれることができ、あるいはエピソーム要素で保有されることもできる。両方の安定なまたは一過性の発現を使用することもできる。遺伝子改変ウイルスを含む任意の既知の発現ベクター技術を本発明に使用することができる。さらに好ましくは、組換えタンパク質は染色体に安定に組み込まれたタンパク質である。

本発明のさらなる好ましい実施形態において、産生タンパク質は分泌されるタンパク質である。さらに好ましくは、産生タンパク質は抗体または改変された抗体またはそれらの断片であり、最も好ましくは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。

タンパク質発現の方法及び先に述べたことに対応するアミノグリコシド耐性遺伝子産物を使用したさらなる高密度細胞培養は、本発明のさらなる目的である。前述した、可能であり、また好ましい実施形態の記述は、同様にこれらの目的に適用される。

１．細胞株及びプラスミドの生成
ＮＳＯ６Ａ１（１００）３細胞株（６Ａ１と省略；Lonza Biologics plc., Slough/UK）は、安定に組み込まれたグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現構築物からヒト―マウスキメラＩｇＧ抗体（ｃＢ７２.３）を分泌する。ネオマイシン耐性を保有する組換え細胞株は、ｂｃｌ−２及びＮｅｏ^rをジシストロン的に発現するかまたは一つのプラスミド構築物からＮｅｏ^rを単独で発現する何れかのプラスミドベクターを６Ａ１細胞株に形質移入することによって得られる。ｐＥＦ−Ｎｅｏ^rを生成するために、ｐＭＣ１ｎｅｏｐＡ（Stratagene）からのＭＣ１ＮｅｏｐｏｌｙＡカセットが、ｐＥＦＢＯＳ（Mizushima et al. , 1990, pEF BOS, A powerful mammalian expression vector, Nucleic Acids Research 18,5322）へ挿入された。これは、ｐＥＦＭＣ１ｎｅｏｐｏｌｙＡ（Visvader et el. , Mol. Cell Biol. 1995 Feb; 15 (2): 634-41）を作製するためのスタッファー（stuffer）である。図４はプラスミド地図である。ｐＥＦｂｃｌ-２-Ｎｅｏ^rを生成するために、ヒトｂｃｌ-２ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ／ＴａｑＩ断片（抗アポトーシス転写物ロングバージョン、Cleary et al., Cell 47 : 19-28 (1986)）を、ＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩで開環したｐＩＣ１９４（遺伝子３２：４８２、１９８４）にサブクローニングし、ＳａｌＩ（平滑）／ＥｃｏＲＶ断片として切除して、さらに、ｐＥＦ−ＭＣ１ｎｅｏｐＡのマルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）の平滑化されたＸｂａｌＩサイトにクローン化した。ｂｃｌ−２は、それ故、伸長因子（ＥＦ）１−ａプロモーター（プラスミド地図、図３）によって発現される。Ｎｅｏ^r発現カセット（ＭＣ１ｎｅｏｐＡ）はｐＥＦ−ベクターの不可欠な部分である。もっとも、最後に使用されるｐＥＦ−Ｎｅｏベクター構築物において、ＥＦ-１-ａプロモーターの範囲外のＭＣＳは、ＸｈｏＩサイトで開環され、平滑化され、そして非コーディング配列のランダムスタッファー３００ｂｐ断片が、適切な制御のために挿入された（プラスミド地図、図４）。リポフェクチン（Gibco, Paisely, Scotland）が媒介する形質移入は、製造元のプロトコールに従って行った。プラスミドの形質移入体は、５％の胎児ウシ血清を補充し、さらにＴｅｙらによって開示されている（Tey, B. et al., Bcl-2 mediated suppression of apoptosis in myeloma NSO cultures, J. Biotechnology, 79 (2000), 147-159）他の補充物を加えたＧＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）において、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択した。安定な形質移入体は、従って、無血清高密度増殖培地ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２に順応した。

２．高密度バッチ供給式細胞培養
高密度細胞培養のために、ＮＳ０６Ａ１親細胞株、６Ａ１Ｎｅｏ−細胞株及び６Ａ１ｂｃｌ−２／Ｎｅｏ対照細胞株を、１ｍｌ／５０ｍｌのＧＳＥＭ（ＧＳ発現培地補充物、製品番号Ｇ９７８５、Sigma, Poole, UK）を補充した無血清培地ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２（JRH Biosciences Inc., KS/U.S.A）に順応させた。継代の間、２５μＭのＭＳＸ及び０．７ｇ／ｌのＧ４１８が培地に補充されたが、接種物及びバイオリアクター培養培地からは取り除かれた。バイオリアクター細胞培養の間の生細胞の密度は、個々の細胞株の培養で図１に示した。各細胞株のバッチ供給式培養は、次のように設定した。

骨髄腫細胞株は、無血清ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地で、１０Ｌのエアリフト発酵槽で増殖させせた。開始細胞集団密度は、新しい、中点の対数培養物から、約１０⁵細胞／ｍｌであった。約１０⁶細胞／ｍｌ密度まで連続して増殖させた後、補充物を単回添加し、そして補充物のポンプ添加を開始した（表１）。供与は１００時間以上連続した。ｐＨは約ｐＨ７に制御した。培養物密度は、約２５時間毎に、カウンティングによって測定し、生細胞はトリパンブルー排除法によって測定した。総計及び生細胞濃度は、適度に希釈した試料をトリパンブルー（Sigma, Poole, UK）で希釈し、改良されたＦｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔａｌ血球計算器を用いて顕微鏡で試験した。再照合のために、ＣＡＳＹ計測用いて細胞サイズに基づき、総計及び生細胞濃度を測定した。

ｂｃｌ−２／Ｎｅｏ組換え細胞株が、最大生細胞密度約１０⁷細胞／ｍｌに増殖した一方、血清補充バッチ供給式培養において観察された最大細胞密度が１０⁶細胞／ｍｌ未満であると開示しているＴｅｙらとは対照的に、Ｎｅｏ組換え細胞株は最大密度１.４×１０⁷細胞／ｍｌまで増殖した（図１）。生細胞計測は、先に記載したトリパンブルー排除法によって測定した。

組換え抗体の時間と空間の収率は、組換えＮｅｏ細胞株が有利である（図２）。これは、バイオリアクター対累積細胞時間（ＣＣＴ；単位：１０⁹細胞・時間／Ｌ）における産生力価を図表で表示することで示される。ＣＣＴは、細胞増殖曲線を、基本的にＲｅｎａｒｄらによって開示された（1988, Biotechnology Letters 10: 91-96）ように積分して算出した。図２から推論できるように、ｂｃｌ−２／Ｎｅｏ組換え細胞株の単独細胞の平均生産力は、０.２６０ｐｇタンパク質／細胞・時間であり、一方、Ｎｅｏ細胞株は０.２１０ｐｇタンパク質／細胞に達した。総収率のレベルにおいて、単独細胞生産力（ｑ_p）におけるわずかな相違より、生細胞密度における相違が明らかに数で勝る。

３．遺伝子コピー数の測定
６Ａ１−Ｎｅｏ細胞株のネオマイシン耐性遺伝子の遺伝子コピー数を、定量ＰＣＲ分析によって蓄積させ、比較標準として６Ａ１親を用いて測定した。遺伝子コピー数３.０コピー（±０.４）が測定された。安定に形質移入された遺伝子の鎖状体的組み込み（concatemeric integration）が認められたことは、組換えネオマイシン耐性遺伝子マーカーの単独での組み込みが、さらなる増幅なしに６Ａ１-Ｎｅｏ細胞株において起こったことを意味している。これは、約２５μＭのＭＳＸという低いＭＳＸ濃度に関係している。というのは、１０〜２０×倍高濃度の選択剤を生じさせるために、ＧＳマーカー遺伝子の増幅を適用する必要があるからである。この分析は、専門的に請負う研究室（Lark Technologies Inc., Houston, Texas）で行った。トランスポゾンＴｎ５からのネオマイシン耐性遺伝子のための試験を除き、マウスグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ[ＧＡＰＤＨ]遺伝子を同様に試験することによって、ネガティブコントロールが確立されている。クローン化されたプラスミド標準物質は、分析プレートの較正のために使用された。コピー数は、標準二倍体哺乳類細胞のＤＮＡ質量は約６.６ｐｇであり、ＧＡＰＤＨは細胞当たり二コピー存在すると仮定して、細胞（ＭＵＳＧＡＰＤＨ）あたりの標的（ＮＥＯ）の数として算出された。細胞からのゲノムＤＮＡ抽出は、当該分野で慣例となっているように、２６０及び２８０ｎｍで光学的密度を測定することによって分光光度的に定量された。ネオマイシン耐性遺伝子のコピー数を分析するために、ＱＰＣＲ標準曲線を、ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓによって提供されたｐＭＣ１ｎｅｏｐＡプラスミドの８つの希釈を用いて作成した。希釈系列は、プラスミドＤＮＡを５×１０⁶コピーから４９コピーの範囲とした。各標準物質は、抽出された細胞株のＤＮＡのマトリックス効果を擬するために、ＧＳ−ＮＳ０コントロールゲノムＤＮＡ（１０００細胞と等価）に希釈された。テンプレートを含まない、またはコントロールプラスミドのみを含む（５０００〜１００００コピー）、または１０００ＧＳ−ＮＳ０細胞（親細胞株、約６.６ｎｇ）に等価なＤＮＡを含むネガティブコントロール反応が収集された。

コピー数は、閾値サイクル（Ｃｔ）の測定によって、９５％信頼区間で測定された。このＣｔは、プローブの切断によって生成されたレポーター蛍光が、ベースライン上にセットされた固定閾値を交差する断片数である。Ｃｔの数値的な値におけるそれぞれの上昇は、ＰＣＲ効率が１００％であるとの仮定の下で、標的の２×上昇を表す。それぞれの試験物品ＤＮＡの６つの独立した希釈が調製されて二重に分析された。それぞれのＱＰＣＲ反応は、約６.６ｎｇの試験サンプルＤＮＡを含んだ。ＱＰＣＲ反応は、ＴａｑＭａｎ^TM ＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘプロトコール（Applied Biosystems, Foster City, CA）に従って構築された。反応は熱サイクルであり、データは、ＡＢＩＰｒｉｓｍ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｖｅｒｓｉｏｎ１.６.３（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって収集した。

４．比較試験：Ｎｅｏ−耐性遺伝子の非存在下、致死量以下のＧ４１８の存在下における、６Ａ１親細胞株の培養。

発現されたネオマイシン耐性遺伝子の存在によるものよりも、Ｇ４１８に曝露することによってもたらされる何れの増殖効果をも排除するために、親細胞株６Ａ１を、Ｇ４１８を含有する細胞培養培地に順応させた。Ｇ４１８の量は、細胞増殖を無効にすることなく、Ｇ４１８（Sigma, Poole, UK ; Ｇ４１８のロットの品質が原料にかなり依存し得ることに留意されたい）を濃度３６０ｍｇ／ｍｌまで漸進的に上昇させた。増殖培地は、Ｌｏｎｚａ専売の最適化された、６ｍｇのグルタミンが補充され、胎児血清が存在しないＮＳ０細胞培養培地ＰＭ１である。６Ａ１−Ｎｅｏ細胞株にとって、この無血清培地は、ｂｃｌ−２形質移入体または非形質移入親細胞株６Ａ１と比較して、本発明の高細胞密度（＞２×１０⁷細胞／ｍｌ）の達成を再現可能である。それ故、この培地は、ネオマイシンマーカー遺伝子の非存在下でＧ４１８への順応の潜在的効果を観察するのに適している。

ＰＭ１＋６ｍＭのグルタミン中で増殖した非適応親細胞株と比較して、Ｇ４１８（−）培地で増殖して順応した細胞は、アポトーシス及びネクローシス細胞死に対して少々耐性が高かったが（データは示さず）、しかし親細胞株より増殖率が低く、最大細胞密度も低かった（図５Ａ：ＮＳ０６Ａ１細胞株のバッチ培養における生細胞密度／非順応６Ａ１：黒塗りの円、３６０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８へ順応した６Ａ１、Ｇ４１８の存在下（白抜きの円）及び非存在下（黒塗りの三角））。総細胞計数から生細胞計数を減ずることによって、死細胞またはネクローシス細胞の数を測定し、総細胞計数のパーセントとして図５Ｂに表した。実験は、それ故、ネオマイシン耐性マーカーの非存在下でのＧ４１８への曝露は、アポトーシス耐性の潜在的な効果のみを説明し、高密度増殖の挙動を強める効果を説明し得ないと結論づけられる。興味深いことに、３６０ｍｇ／ｌのＧ４１８の存在下における順応細胞株のバイオリアクター培養は、無血清培地ＰＭ１における順応細胞株の増殖率及び最大細胞密度の何れをもさらに最小化させる。

５．６Ａ１、６Ａ１-Ｎｅｏ及び６Ａ１-ｂｃｌ-２のバッチ培養におけるｑ_p
細胞株は、すでに実施例１及び２で記載した；細胞培養は、バッチ供給式培養の変わりにエアリフト発酵槽で行ったことを除いて、実施例２に記載の通りに行い、単純バッチ培養は振盪フラスコで行った。単独細胞生産力は、培養物の一定分量からＥＬＩＳＡ試験形式でｃＢ７２.３の分泌を分析して行った。一定分量は、生細胞数を計数し、予め設定した期間のために９６穴プレート中の新鮮な培地に再懸濁した。培養試料は、約８０時間で採取され、収集した（約２４０時間）。結果は図６Ｂに示す。トリパンブルー排除によって判定した生細胞密度に基づく増殖曲線は図６Ａに示した（白抜きの円：６Ａ１−Ｎｅｏ、黒塗りの三角：６Ａ１-ｂｃｌ２、黒塗りの円：６Ａ１−（１００）３）。６Ａ１−Ｎｅｏ細胞株は一貫して、６Ａ１-ｂｃｌ-２細胞株よりも高い単独細胞生産力ｑ_pを示した。親細胞６Ａ１細胞株は、より低い増殖能力のために、負に平衡化されて高いｑ_pを有する。

１０Ｌバッチ供給式エアリフトリアクターシステムにおけるＮｅｏ−形質移入ＮＳ０細胞株の増殖中の生細胞密度。親細胞株及びｂｃｌ−２形質移入細胞株と比較。１０Ｌバッチ供給式エアリフトリアクターシステムにおけるＮｅｏ−形質移入ＮＳ０細胞株の増殖中の累積細胞時間に従って発現された、分泌抗体の生産性。ｂｃｌ−２形質移入細胞株と比較。ｐＥＦ−ｂｃｌ−２のプラスミド地図。ｐＥＦ−Ｎｅｏのプラスミド地図。非致死量のＧ４１８に順応したＮＳ０細胞株による比較増殖実験。非致死量のＧ４１８に順応したＮＳ０細胞株による比較増殖実験。Ｎｅｏ−形質移入細胞株の振盪フラスコバッチ培養。親細胞株及びｂｃｌ−２形質移入細胞株と比較。Ｎｅｏ−形質移入細胞株の振盪フラスコバッチ培養の生産性。親細胞株及びｂｃｌ−２形質移入細胞株と比較。

Claims

タンパク質発現方法であって、
ａ．発現可能なアミノグリコシド耐性遺伝子および発現可能なグルタミン合成酵素を形質移入され、さらに、産物タンパク質を発現可能であるＮＳＯ細胞株を、バッチ供給式バイオリアクターにおいて、無血清高密度増殖培養培地で１０⁷細胞／ｍｌ以上の生細胞密度まで増殖させる工程と、
ｂ．該培養ブロスから前記産物タンパク質を単離する工程と、
を具備する方法。
ＮＳＯ細胞の高密度増殖を達成するための、アミノグリコシド耐性遺伝子産物の使用であって、該細胞はさらに、組換えグルタミン合成酵素の発現が可能であり、ここにおいて、前記高密度増殖は１０ ⁷ 細胞／ｍｌより高い生細胞密度であることを特徴とする、アミノグリコシド耐性遺伝子産物の使用。
前記耐性遺伝子産物はネオマイシン耐性遺伝子産物であり、前記細胞は、発現可能なネオマイシン耐性カセットを保有するＤＮＡを形質移入され、続いて、ネオマイシンまたは、細胞培養培地に少なくとも１ｍｇ／ｍｌの濃度のＧ４１８と共にインキュベーションされることによるネオマイシン耐性表現型を有する細胞の選択に供されることを特徴とする、請求項1 又は２に記載の方法又は使用。
ネオマイシン耐性の選択の後、前記細胞はさらに、バッチ供給式バイオリアクターシステムにおいて高密度にまで培養されることを特徴とする、請求項３に記載の方法又は使用。
高密度細胞培養物であって、ＮＳＯ細胞株を含み、該細胞は、バッチ供給式バイオリアクター中、高密度増殖無血清細胞培養培地中に含まれ、前記細胞培養物は、１０^７細胞／ｍｌより高い生細胞密度を有し、前記細胞株は、発現可能なアミノグリコシド耐性遺伝子および発現可能なグルタミン合成酵素を形質移入されていることを特徴とする、高密度細胞培養物。
前記培養物は、１０⁷細胞／ｍｌより低い生細胞密度を有する接種細胞を増殖させることによって得られることを特徴とする、請求項５に記載の細胞培養物。
アミノグリコシド耐性遺伝子が、ネオマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項５または６に記載の細胞培養物。
前記細胞は、発現可能なアミノグリコシド耐性マーカー遺伝子を形質移入した後の培地に補充されたアミノグリコシド抗生物質によって処置されたことを特徴とする、請求項５〜７の何れか一項に記載の細胞培養物。
前記細胞は、組換えｂｃｌ−２またはその機能的変異体又は類縁体を欠いていることを特徴とする、請求項５に記載の細胞培養物。