CN111544591A - 调节铁离子体内平衡的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明发现FGF6功能缺失是造成血沉病的重要致病基因，而且FGF6不仅能促进抑制小肠铁吸收基因HAMP的表达，同时还能抑制肝脏的异常铁沉积。因此，本发明涉及调节铁离子体内平衡的组合物及方法。跟具体而言，本发明涉及FGF6调节剂在制备调节对象铁离子体内平衡的药物中的应用。本发明也包括相应的检测试剂盒和药盒。

Description

调节铁离子体内平衡的组合物及方法
技术领域
本发明涉及调节铁离子体内平衡的组合物及方法。
背景技术
铁作为组成机体最重要的元素之一，广泛分布于各种组织中。铁的吸收部位主要在十二指肠和空肠上端。当铁的储存量较多时，血浆铁的转运率降低，铁的吸收减少；当铁缺乏时则相反。储存铁与血浆铁维持着一定的动态平衡。当机体需铁量增加或丢失量较多时，可由储存铁给予补充，同时小肠对铁的吸收也增加。肝脏分泌的铁调素(hepcidin)是铁离子体内平衡的关键调节蛋白，其通过降解细胞的输出蛋白铁转运蛋白(SLC40A1)来控制铁离子由肠黏膜细胞和巨噬细胞向血浆流动而起到调节铁离子体内平衡的作用。
铁代谢异常可导致铁缺乏或铁过载。铁过载的原因分为遗传性和获得性。最常见的疾病是血沉病(也称为血色病)。血沉病是指机体铁过载(铁负荷过多)，在多个脏器组织中沉积并导致组织器官广泛纤维化，引起受累脏器功能损害的一组疾病。根据其病因，可分为先天性和继发性血沉病。先天性血沉病是常染色体隐性遗传病，因肠道吸收铁过多导致机体铁过载；继发性血沉病则指多次熟悉或获得性铁利用障碍导致机体铁过载。铁缺乏是指机体对铁的需求与供给失衡，导致体内储存的铁耗竭，继之缺铁性红细胞生成，最终引起缺铁性贫血。
为了研究血沉病的遗传致病因素，最初进行了几项分离分析，得出隐性遗传模式是高度可信的结论。研究了人铁过载的遗传学，揭示了几个至关重要的基因。值得注意的是，编码膜结合遗传性血沉病蛋白的HFE在20年前就已通过家系连锁分析和关联方法进行定位。其他研究明确将HFE中的错义多态性C282Y(rs1800562)作为成人1型遗传性血沉病的主要易感因子。已通过基于通路的遗传相关性研究和GWAS鉴定了其他基因，包括BMP2、BMP4、HJV、TF、TMPRSS6、NAT2、FADS2和TFR2。
全基因组关联分析(GWAS)是检测中等效应量的额外效应的良好方法。双倍体隐性突变(基因突变)可能会引起疾病的发生，但是这种效应在GWAS中更容易被忽略。简单的显著性计算不足以发现隐性二倍体。隐性二倍体遗传模型在孟德尔遗传疾病包括囊肿性纤维化、β-地中海贫血和尼曼匹克症等中具有良好的普适性。尽管没有在人群队列研究中进行系统的研究，但是已经有很多基因的隐形突变导致疾病中基因功能丧失等效应。
发明内容
本发明第一方面提供FGF6调节剂在制备调节对象铁离子体内平衡的药物中的应用。
在某些实施方案中，所述FGF6调节剂选自：(1)提高FGF6蛋白活性的试剂；和(2)提高FGF6蛋白表达水平的试剂；所述药物用于降低对象机体铁过载。
在一个或多个实施方案中，所述提高FGF6蛋白活性的试剂为FGF6蛋白的激动剂。
在一个或多个实施方案中，所述FGF6调节剂选自：FGF6蛋白本身或其表达载体和重组bFGF蛋白或其表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述提高FGF6蛋白表达水平的试剂选自：(a)FGF6蛋白的表达载体和(b)促进FGF6基因表达的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述药物用于治疗或预防与铁过载相关的疾病。
在一个或多个实施方案中，所述与铁过载相关的疾病选自：皮肤色素沉着、肝纤维化、肝硬化、心肌病、心律失常、心力衰竭、生长发育及性成熟迟缓、糖尿病、不育、甲减、造血功能抑制、AML转化加速、血沉病、自身免疫疾病和癌症。
在某些实施方案中，所述FGF6调节剂选自：(1)抑制FGF6蛋白活性的试剂；和(2)降低FGF6蛋白表达水平的试剂；所述药物用于治疗铁缺乏症。
在一个或多个实施方案中，所述抑制FGF6蛋白活性的试剂为FGF6蛋白活性的拮抗剂。
在一个或多个实施方案中，所述降低FGF6蛋白表达水平的试剂选自：(a)靶向FGF6的siRNA、反义RNA、核酶；(b)基因编辑载体，所述基因编辑载体在对象细胞基因组的FGF6基因中引入导致所表达的FGF6蛋白活性缺少或减弱的突变；和(c)同源重组载体，所述同源重组载体用于敲除基因组中的FGF6基因，或将编码无活性或活性降低的FGF6突变体的核酸序列同源重组到基因组中以替换野生型FGF6。
在一个或多个实施方案中，所述基因编辑载体选自：CRISPR-CAS9基因编辑载体和TALEN基因编辑载体。
在一个或多个实施方案中，所述药物用于治疗缺铁性贫血。
本发明第二方面提供FGF6的检测试剂在制备诊断对象体内铁离子平衡的试剂中的应用。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂包括为核酸序列或蛋白序列。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为引物序列。
在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为特异性结合FGF6的抗体。
本发明第三方面提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有FGF6的检测试剂。
本发明第四方面还提供一种药盒，所述药盒含有FGF6的调节剂和任选的铁剂、去铁剂、化疗剂和自身免疫疾病的治疗药物。
附图说明
图1：基于基因的隐性二倍体模型的曼哈顿图。
图2：比较基因组分析显示FGF6与铁代谢基因同步进化(A)；FGF6与FGFR1、MAPK1/3、INS、FN1相互作用，并参与到涉及TF、HFE、HAMP和SLC40A1的铁代谢子网(B)。
图3：FGF6序列及结构域示意图。
图4：FGF6对HepG2、HCT8、HCT116、786-O和HFF1细胞中铁摄取和铁代谢基因表达的影响。
图5：FGF6对参与铁代谢的一组基因表达的影响(A、B)；野生型FGF6和FGF6突变体的表达质粒在不同细胞中对不同基因表达的影响(C、D、E)；M1和M3产生升高的铁沉积(F-H)和铁蛋白表达(I-J)。
图6：使用Perls染色通过IHC证实细胞内铁积累。
图7：FGF6表达在SSc患者皮肤组织中显著下降(A)；SSc患者皮肤组织中铁沉积上升(B)；FGF6在非转移性癌症病变组织中显著降低(C)，铁沉积增加(D)。
图8：在转移性肝癌组织中观察到FGF6表达增加。A、正常的肝细胞和转移细胞；B、非转移性肝脏癌细胞。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明通过对7000个人群外显子芯片数据，运用二倍体隐形功能缺失扫描策略，挖掘到一个与血沉病显著相关的基因FGF6。比较基因组、细胞实验和人类组织实验共同确认了FGF6功能缺失是造成血沉病的重要致病基因。此外本发明发现FGF6不仅能促进抑制小肠铁吸收基因HAMP的表达，同时还能抑制肝脏的异常铁沉积。
本文中，FGF6蛋白也称为肝素分泌转化蛋白2或肝素结合生长因子6。其氨基酸序列可如NP_066276.2所示，编码序列可如SEQ ID NO:15所示或NM_020996.2所示。本文包括FGF6的突变体，包括导致FGF6的生物学功能得以提高的突变体以及导致其生物学功能降低或丧失的突变体。例如，本领域已知，位于肝素结合位点(R188)或侧翼位点(D174和E172)的三种已知的非同种异体变体被认为对FGF6功能是重要的。因此，本发明所述的突变体包括在上述三个位置上的至少一个位置上发生了突变的突变体，包括但不限于R188Q、D174V和E172X。本文也包括来自其它动物的FGF6蛋白或其编码序列。
本发明通过调节FGF6蛋白的活性或其表达来调节对象铁离子体内平衡。本文中，对象包括哺乳动物，优选为人。调节包括上调和下调。上调可以是例如提高FGF6蛋白的活性或其表达水平；下调可以是降低或减少FGF6蛋白的活性或其表达水平。
上调FGF6的活性或其表达水平可用于治疗或预防与铁过载相关的疾病及其相关症状。血清铁蛋白是铁的贮存形式，其含量变化也可作为判断是否缺铁或铁过载的治疗。通常，男性血清铁蛋白的正常值在10-220微克/L的范围内，女性血清铁蛋白的正常值在10-85微克/L的范围内。当接受20个国际单位红细胞输注或血清铁蛋白时，SF>1000微克/L即可判断为铁过载。本文中，与铁过载相关的疾病或症状包括皮肤色素沉着、肝纤维化、肝硬化、心肌病、心律失常、心力衰竭、生长发育及性成熟迟缓、糖尿病、不育、甲减、造血功能抑制、AML转化加速、血沉病等疾病。血沉病包括原发性和继发性血沉病。本文中，与铁过载相关的疾病还包括自身免疫疾病和癌症。与铁过载相关的自身免疫疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、硬皮病(也称为系统性硬化症，SSc)、天疱疮、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病和溃疡性结肠等。与铁过载相关的癌症包括本领域熟知的各种实体瘤，如肝癌等。应理解的是，这些与铁过载相关的疾病中，铁过载未必是导致这些疾病的主要致病因素，但通过抑制、降低或消除铁过载，可减缓疾病的进程、消除疾病的某些与铁过载相关的症状，起到改善患者的健康状况的作用。
可通过给予FGF6蛋白的激动剂、或可构建并给与FGF6蛋白的表达载体以使FGF6蛋白在对象的细胞内过表达、或可给予FGF6蛋白本身或重组bFGF蛋白或其表达载体，从而提高细胞内FGF6蛋白的水平，以降低铁过载。激动剂可以是小分子化合物，可采用本领域已知的FGF6蛋白的激动剂。FGF6蛋白及重组bFGF蛋白可以是本领域周知的蛋白，可从市售途径获得，也可按照已知的蛋白序列采用已知的重组技术制备。
可采用本领域周知的方法构建表达载体，并将其给予需要的对象。在某些实施方案中，上调FGF6蛋白的表达水平的试剂还可以调节FGF6信号通路的上游中基因的表达、从而能促进FGF6表达的试剂。在某些实施方案中，可直接给予FGF6蛋白(包括重组FGF6蛋白)或其活性提高的突变体，或者给予重组的bFGF蛋白等，用于治疗或预防铁过载或与铁过载相关的疾病。本文中，FGF6蛋白的生物学活性或功能通常指其调节hepcidin表达和铁摄取的生物学活性或功能。通常，上调FGF6的活性或其表达水平，可促进hepcidin的表达，减少铁摄取，从而降低铁过载。
因此，本发明也提供上调FGF6的活性或其表达水平的试剂在制备治疗或预防与铁过载相关的疾病及其相关症状的药物中的应用。还提供的是一种药盒，该药盒里可含有上调FGF6活性或其表达水平的试剂，和任选的去铁剂。去铁剂的例子包括铁螯合剂，其能选择性结合多余的铁并促进铁排泄，从而降低患者的铁负荷。示例性的铁螯合剂包括但不限于去铁胺(OFO)、去铁酮(DFP)和地拉罗司(DFX)。可以常规的量使用去铁剂。例如，可将去铁胺配制成10％的浓度(5ml注射用水溶解500mg去铁胺)，静脉或输液泵皮下输注，剂量范围在每天20-60mg/kg。在同时使用本发明的方法降低铁过载时，去铁剂的用量可适当降低。在某些实施方案中，本发明的药盒里含有FGF6蛋白和/或重组的bFGF蛋白和铁螯合剂。在某些实施方案中，本发明的药盒中含有FGF6蛋白和/或重组的bFGF蛋白与治疗自身免疫疾病或癌症的药物，如相应癌症如肝癌的化疗剂。例如，在某些实施方案中，本发明的药盒中含有FGF6蛋白和/或重组的bFGF蛋白与硬皮病的治疗药物，包括但不限于糖皮质激素、免疫抑制剂(如环孢霉素A、环磷酰胺、硫唑嘌呤)、青霉胺、甲氨蝶呤、松弛素、伊马替尼、CD20单抗、TGF-β抗体等中的任意一种或多种。肝癌的治疗药物包括索拉菲尼、舒尼替尼、贝伐单抗和厄洛替尼等。
上调FGF6活性或其表达水平的试剂的给药剂量可根据患者的年龄、性别、病情、并发症等相关状况由本领域技术人员加以确定。给药方式可以是本领域常规的给药方式，包括但不限于输注、注射等。
另一方面，下调FGF6活性或其表达水平的试剂可用于治疗或预防与铁缺乏相关的疾病及相关症状。本文中，与铁缺乏相关的疾病包括但不限于贫血，常见的症状包括乏力、易倦、头晕、头痛、眼花、耳鸣、心悸、气短、纳差、苍白、心率增快。贫血通常是转铁蛋白缺乏性贫血。通过下调FGF6的活性或其表达水平，抑制hepcidin的表达，减少降解细胞的输出蛋白铁转运蛋白(SLC40A1)的降解，从而增加铁离子由肠黏膜细胞和巨噬细胞向血浆流动，起到增加血液中铁含量的作用。
可通过给予FGF6蛋白活性的拮抗剂来下调细胞内FGF6的活性。所述拮抗剂可以是小分子化合物，或者是FGF6蛋白的特异性抗体或其抗原片段。或者，可采用RNAi技术干扰FGF6基因的表达，或者采用同源重组技术敲除FGF6基因，或用突变的FGF6基因替换野生型FGF6基因、使细胞表达的活性降低或无活性的FGF6蛋白，或者采用基因编辑技术在FGF6基因中引入导致表达FGF6蛋白活性降低或丧失的突变。可通过给予相应的试剂来实现所述下调。例如，可采用FGF6基因的siRNA下调FGF6基因的表达。或者，可利用打靶载体将FGF6基因全基因敲除。因此，这类试剂包括但不限于siRNA和打靶载体。
本申请中，降低FGF6蛋白的活性包括使FGF6蛋白的活性与野生型FGF6蛋白相比降低至少30％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，甚至完全无活性。上调FGF6蛋白的活性包括使FGF6蛋白的活性与野生型FGF6蛋白相比升高至少10％，例如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少100％等。
通常，可通过在FGF6蛋白中引入突变而使其活性降低。例如，本领域已知，位于肝素结合位点(R188)或侧翼位点(D174和E172)的三种已知的非同种异体变体被认为对FGF6功能是重要的。因此，本发明所述的突变体包括在上述三个位置上的至少一个位置上发生了突变的突变体，包括但不限于R188Q、D174V和E172X。
因此，本发明也提供下调FGF6的活性或其表达水平的试剂在制备治疗或预防与铁缺乏相关的疾病及其相关症状的药物中的应用。还提供的是一种药盒，该药盒里可含有下调FGF6活性或其表达水平的试剂，和任选的铁剂。铁剂的例子包括硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、富马酸亚铁等。铁剂的剂量为常规的剂量。但在同时使用本发明下调FGF6的方法时，铁剂的用量可适当降低。
下调FGF6活性或其表达水平的试剂的给药剂量可根据患者的年龄、性别、病情、并发症等相关状况由本领域技术人员加以确定。给药方式可以是本领域常规的给药方式，包括但不限于输注、注射等。
本发明的药物或药盒中的药物组合物中还可含有药学上可接受的载体或赋形剂。例如，在制备药物组合物时，通常将所述试剂与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊、纳米颗粒形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，药物组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、纳米颗粒等。药物组合物还可含有其它成分，例如湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯和甜味剂等。
本发明也包括使用FGF6的检测试剂制备诊断对象体内铁离子平衡的试剂。所述检测试剂包括FGF6基因的特异性引物，也可以是FGF6蛋白的特异性抗体。本发明还提供一种检测试剂盒，该试剂盒中含有FGF6基因或蛋白的检测试剂，如引物或特异性结合FGF6蛋白的抗体。示例性的引物可如SEQ ID NO:1和2所示。检测试剂盒中还可包括实施所述检测方法所需的其它试剂，包括实施PCR所需的试剂或实施免疫组化所需的试剂。
本发明还包括降低对象铁过载或治疗或预防与铁过载相关的疾病的方法，该方法包括上调该对象体内的FGF6的活性或其表达水平的步骤。例如，可给予有效量的本文所述的能上调该对象体内FGF6的活性或其表达水平的试剂。本领域技术人员可根据不同个体的铁过载量、使用的试剂种类、性别、年龄、健康状况等确定所述有效量。
本发明还包括治疗或预防对象铁缺乏的方法，所述方法包括下调该对象体内的FGF6的活性或其表达水平的步骤。例如，可给予有效量的本文所述的能下调该对象体内FGF6的活性或其表达水平的试剂。本领域技术人员可根据不同个体的铁过载量、使用的试剂种类、性别、年龄、健康状况等确定所述有效量。
本发明还包括用于降低对象铁过载或治疗或预防与铁过载相关的疾病的能上调该对象体内的FGF6的活性或其表达水平的试剂，包括FGF6蛋白本身、重组bFGF蛋白、前述蛋白的表达载体等。还包括用于治疗或预防对象铁缺乏的能下调该对象体内的FGF6的活性或其表达水平的试剂，包括siRNA、基因编辑载体、打靶载体、FGF6蛋白的特异性抗体等。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。
一、实验方法和过程
1、威斯康星州中部血沉病样本集
威斯康星州中部农村地区的同质人口是个性化医学研究项目(PMRP)的来源人群，该PMRP是与马歇尔菲尔德临床研究所收集的电子健康记录(EHR)相关的生物库，包括来自20,000多个个体的样本。所有样品均经过书面知情同意后收集。威斯康星州中部的人口基本上是静止的，主要来自19世纪后期的巴伐利亚移民。由于减少了群体分层的混杂因素和较低的等位基因和基因座异质性预期水平，该群体对疾病基因定位具有很高的效用。此外，环境暴露在这一人群中相对一致。由于这些原因，该PMRP已被有效用于许多人类遗传学研究。PMRP DNA样本在大约14年前被收集和储存，并且所有个体都有马歇尔菲尔德临床研究所的纵向EHR信息，平均超过30年。EHR由ICD-9诊断代码、实验室测试结果、临床程序数据、处方信息和医生注释组成。从PMRP群体中选择血沉病病例和对照。转铁蛋白饱和度实验室值(血清铁与转铁蛋白铁结合能力的比值)超过48％并且有两个或两个以上ICD-9代码诊断为血沉病：275.0(铁代谢紊乱，排除贫血)，275.01(遗传性血沉病)，275.03(未明确的血沉病)，和/或275.09(其他铁代谢紊乱)。为了通过种群分层减少混淆，使用对疾病状态不知情的所有样品实施外显子组基因分型数据的主成分分析(PCA)。遗传背景异常(前两个主要成分的质心超过三个标准偏差)的个体被排除在研究之外。在去除异常值之后，基于前三个主要成分，所得到的一组个体高度同质。计算穷举的两两的血缘系数，去除三代以内或更亲血缘关系的一对个体的一个个体。在先前经历外显子组基因分型阵列和质量控制程序的大约10,000个个体中，表型算法鉴定了18个个体，被选为血沉病病例。对照(n＝6896)是没有异常饱和值且没有任何血沉病ICD-9代码的个体。
2、基因分型分析
在完整的PMRP群组中，通过Illumina HumanCoreExome beadchip上的高密度基因分型来查询大约10,000个DNA。该外显子测序组涵盖了所有GWAS研究显著的基因位点的组合。该芯片涵盖了500000个位点，芯片里47.8％的突变为稀有突变(频率<1％)，8.1％的突变为中度的常见突变(频率为1-10％)，44.1％的突变为常见突变(频率>10％)。基因分型的质控条件是：1)覆盖率>0.985，2)违背变异体Hardy-Weinberg equilibrium(p<1×10-6)，违背的样本均被排除在外。
3、单倍型分配
通常，配子分配对于直接确定特定基因的复合杂合个体是必需的。使用来自PMRP的所有10,000个外显子组基因分型样本，应用软件包Beagle，使用局部化的单倍型-聚类模型算法从未定位基因分型数据推断定位单倍型。计算在马歇尔菲尔德临床研究所的高性能计算中心进行。由于随后的分析是基于基因的分析，并且基因分型数据集中在外显子变体上，因此使用该方法分别定位外显子组中的每个基因。尽管稀有变体可能难以定位，但是从高度同质的群体中使用大样本量有助于减少错误率。
4、推定的功能变体的确定
在基因分型数据定位之后，鉴定了推定的功能变体。分析中包含的假定功能变体满足已披露的质量控制标准。分析中使用的标记为GWAS显著(2015年6月)，和/或被注释为错义、无义、3'UTR、5'UTR或发生在剪接位点区域内。使用ANNOVAR软件进行注释。在对假定的功能变体进行过滤后，仍有129,556个SNP用于本文基于基因的隐性双倍型扫描。
5、隐性双倍型的统计检验
对于每个基因，如果个体在每个同源物上携带至少一个推定的功能性等位基因，则该个体被归类为具有隐性双倍型构型的个体(PF)。携带至少一种不含推定的功能性等位基因的同源物的个体被归类为具有野生型双倍型的个体(W)。携带隐性双倍型的病例和对照个体的总数分别由PFcs和PFct表示。类似地，携带野生型双倍型的病例和对照个体的总数分别由Wcs和Wct表示。在确定这些数量后，将Fisher精确检验应用于列联表。由于超几何零密度适用于所有样本大小，Fisher精确检验对于病例和对照样本大小之间的不平衡是稳健的。为了研究性别特异性影响，Haldane的OR为在推定的功能性等位基因的单个位点上携带一个或多个纯合基因型的个体，将其包括在PF类别中。从分析中剔除所有样品中没有任何高质量假定功能等位基因的基因。在具有可分析数据的所有基因中，采用保守的实验校正15900个基因测试中的多重性。为了将隐性双倍型分析程序与基于标准稀有变异基因的测试进行比较，也将实施序列核心关联测试的RVTESTS软件应用于该基因型数据。此外，为了研究性别特异性效应，分别计算女性和男性的Haldane OR。然后计算Mantel-Haenszel联合OR，以获得基于性别变量的效应大小的估值。最后，计算Mantel-Haenszel同质性检验以确定性别特异性效应差异的统计证据水平。
6、检定力计算
为了探索本文提出的方法的功效，我们在两个位点的复合杂合性/隐性遗传性的可替换疾病模型下进行分析能力计算，每个位点分离两个等位基因。由此我们将比较了标准GWAS分析(Armitage趋势检验)的检定力与对数似然比G检验的检定力。为了巩固不同组的单倍型频率，将结果绘制为两个位点间的连锁不平衡的函数。结果显示，在几乎所有参数空间内，隐性双倍型的G检验的检定力超过了Armitage趋势检验的检定力。
7、比较基因组分析和蛋白质-蛋白质相互作用推断
收集核心铁代谢基因的氨基酸测序，包括TFRC、FTH1、IREB1、SKP1、SKP1、ACO1、TFR2、TF、HMOX1、ACO2、HAMP、FGF6和FGFR1。序列比对来自NCBI BLASTn数据库。比较了不同基因的系统发育，显示了最早的进化时间点，然后将每个基因的发生定位到系统发育树上。对FGF6和主要铁代谢蛋白进行了蛋白质-蛋白质相互作用网络推断。在去除FGF6和包括HFE和SLC40A1在内的关键铁分子之间的非必需节点之后，调整了最终网络。
8、细胞培养，试剂和蛋白质处理
在37℃、5％CO2加湿培养箱中，在补充有10％的FBS的DMEM培养基中培养结肠癌细胞系(HCT-8和HCT116)、肾癌细胞系(786-O)、肝癌细胞系(HepG2)和成纤维细胞系(HFF-1)。采用柠檬酸铁铵(FAC)细胞培养方法研究不同蛋白质处理或质粒转染下的铁摄取变化。具体而言，细胞在含1uM柠檬酸铁铵(FAC)和50uM抗坏血酸盐的正常DMEM和FBS培养基中培养48h后检测细胞铁浓度。用FAC培养48小时的细胞中的总细胞铁含量远高于正常培养细胞的总细胞铁含量，实际上，后者含量非常低，几乎没有检测到任何铁。
重组人FGF6蛋白(活性)(ab219122)、抗铁蛋白抗体(ab75973)购自Abcam；Flag标签抗体(20543-1-AP)购自Proteintech Group；抗GAPDH抗体购自上海翊圣生物科技有限公司(Shanghai Yeasen Biotechnology)。
将1mM柠檬酸铁铵和50mM抗坏血酸盐溶解在蒸馏水中。NaOH、HCl、KMnO4、菲洛嗪、新亚铜试剂、乙酸铵、抗坏血酸和FeCl3购自北京沃凯生物科技有限公司(Beijing OkaBiological Technology)。
构建了FGF6(NM_020996.2，野生型，编码序列如SEQ ID NO:15所示；氨基酸序列见NP_066276.2)的过表达载体，载体为p3XFLAG-CMVTM-7.1(E7533，Sigma)，然后通过巢式PCR构建了M1(E172X，编码序列如SEQ ID NO:16所示)，M2(D174V，编码序列如SEQ ID NO:17所示)和M3(R188Q，编码序列如SEQ ID NO:18所示)点突变的质粒。用lipo2000(Thermo)作为脂质体转染，24h后收取细胞，进行Q-PCR检验其对铁离子代谢相关基因的水平。
9、通过菲洛嗪实验定量铁含量
通过菲洛嗪实验测量总胞内铁含量。具体而言，细胞在12孔板中培养48小时后，用冷PBS洗涤三次。用50mM NaOH裂解2小时后，将100μL细胞裂解物与10mM HCl和100μL铁释放试剂(等体积的1.4M HCl和4.5％(w/v)KMnO4在H2O中的新混合溶液)混合。将混合物温育2小时，然后加入30μL铁检测试剂(6.5mM菲洛嗪，6.5mM新亚铜试剂，2.5M乙酸铵和1M抗坏血酸)，孵育30分钟后，将280μL溶液加入96孔板中并在酶标仪上550nm数据。此外，FeCl3(0-100μM)用作铁标准品，蛋白质定量通过Lowry蛋白质测定法测定。
10、蛋白质印迹
培养48小时后收获细胞裂解物，然后将来自每个样品的等量蛋白质进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，之后转移到PVDF膜上。用5％BSA封闭后，将膜与GAPDH(1：10000)，铁蛋白(1：1000)和Flag(1：2000)在4℃温育过夜。然后用TBST洗涤膜三次，与抗兔或抗小鼠二抗一起孵育。使用Image QuantTL软件可视化条带。
11、Perls染色
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞三次，用4％戊二醛固定10分钟，并用含有等体积2％盐酸水溶液和2％亚铁氰化钾(II)三水合物的2ml普鲁士蓝溶液在37℃温育60分钟。细胞用0.5％中性红染色3分钟后，用尼康显微镜观察铁染色。用铁阳性高阳性染色细胞除以总细胞数，用于评估铁沉积水平。
12、RT-PCR和定量RT-PCR分析
使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从细胞中提取总RNA。根据制造商的说明，使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)由1微克总RNA合成cDNA。使用Primer 5设计每个基因的特异性引物，并由Generay BiotechCo.，Ltd(中国上海)合成。使用SYBR Green I PCR试剂盒(TaKaRa，Shanghai，Japan)，根据制造商的说明书进行RT-PCR扩增。反应在ABI Prism 7900检测器系统(AppliedBiosystems)上进行。RT-PCR条件为95℃3分钟，然后进行40个循环的95℃15秒+60℃40秒，获得解离曲线的条件为95℃15秒、60℃15秒和95℃15秒。用SDS 2.3软件(AppliedBiosystems)分析测定获得的数据。对于每个样品，使用与GAPDH的相对比值计算相对基因表达。相关的RT-PCR引物如下表所示：
Figure BDA0001968271850000141
Figure BDA0001968271850000151
13、FGF6的免疫组织化学染色
使用的一抗是抗FGF6(1：200，D162668BBI，上海)。分别来自四名肝癌患者和六名SSc患者及正常对照的肝脏和皮肤组织以福尔马林固定和石蜡包埋。将切片脱石蜡并与5％牛血清白蛋白一起温育60分钟。通过与一抗在室温下孵育2小时，然后与3％过氧化氢孵育10分钟来检测FGF6阳性细胞。用辣根过氧化物酶标记的兔抗兔IgG作为二抗。用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB-4HCl)显现FGF6的表达。使用软件imageJ(Windows和Java-1.8.0，NIH)，由每个样品中阳性信号的平均光密度(AOD)定量FGF6在SSc和肿瘤组织中的表达。
二、实验结果
1、基于基因的复合杂合性鉴定了新的血沉病易感基因
为了发现新的铁过载易感基因，我们使用了与从威斯康星州中部农村的遗传同质群体获得的电子病历相关联的生物标记样本，对由外显子组中推定的功能性等位基因组成的隐性双倍型进行了基于基因的扫描。在评估的10,000个样本中，我们的转铁蛋白饱和度和基于诊断代码的表型算法鉴定到18个病例个体和6896个对照。我们估计了所有个体的配子阶段，并将我们对双倍型的分析限制为推定的功能变体。我们的隐性双倍型扫描确定了两个外显子组显著基因(图1)：HFE(P＝1.29×10-8；OR＝28.7)和FGF6(P＝1.99×10-6；OR＝22.8)。为了比较，对FGF6基因型数据的SKAT/rvtest程序产生渐近P＝3.86×10-5，置换成P＝1.0×10-4。我们没有发现女性和男性对FGF6数据的影响差异的统计学证据(Mantel-Haenszel均一性检验P＝0.728)。这些结果促使我们研究FGF6功能和特定FGF6变体对铁代谢的影响。
2、比较基因组分析显示FGF6与铁代谢基因同步进化
为了探讨FGF6在铁代谢中的作用，我们通过研究FGF6蛋白-蛋白相互作用，发现FGF6与FGFR1、MAPK1/3、INS、FN1相互作用，并参与到涉及TF、HFE、HAMP和SLC40A1的铁代谢子网的证据(图2)。
FGF6，也称为肝素分泌转化蛋白2或肝素结合生长因子6，具有多个肝素结合位点(HBS)。位于肝素结合位点(R188Q)或侧翼位点(D174V和E172X)的三种已知的非同种异体变体被推测对FGF6功能是重要的。此外，D174V和E172X位于FGFR结合区(FGFR-BR-3)和HBS-1之间的区域(图3)。因此，我们在功能研究中研究了这三种变体，以进一步研究FGF6在铁代谢中的作用。
3、FGF6调节hepcidin表达和铁摄取
为了研究将FGF6与铁代谢联系起来的潜在机制，评估了FGF6对HepG2、HCT8、HCT116、786-O和HFF1细胞中铁摄取和铁代谢基因表达的影响。使用细胞培养细胞和菲洛嗪试验检测铁，当用活性FGF6蛋白以剂量依赖性方式处理时，HepG2、786-O、HCT8、HCT116和HFF-1细胞的总细胞内铁浓度显著降低(图4)。
测试了FGF6对参与铁代谢的一组基因(HAMP、HDAC2、HMOX1、TFRC和HEPH)表达的影响，HepG2细胞接受对照或FGF6蛋白和FGF6mRNA或对照的处理。在五种铁代谢基因中测量了相对于GAPDH的mRNA表达。RT-PCR分析显示，与用PBS作为对照处理相比，在HepG2细胞中引入FGF6活性蛋白后HAMP和HDAC2mRNA水平显著增加(图5，A)。与不含FGF6的载体相比，FGF6质粒转染显著增加了HAMP、HDAC2和HMOX1水平，而HepG2中TFRC水平显著降低(图5，B)。
为了研究FGF6等位基因对FGF6功能的影响，我们用携带野生型FGF6或上述三个点突变体中的任一个突变体的质粒转染进行转染。与野生型(WT)相比，HepG2细胞中，M1(E172X)和M3(R188Q)变体表现出HAMP的下调(图5，C)。此外，与野生型相比，在M3存在下TFRC表达显著上调(图5，C)。对于HCT-116和HFF-1细胞，与引入WT FGF6相比，M1和M3变体均显著降低HAMP的表达(图5，D-E)。
检查特定变体对细胞内铁浓度的影响，发现M1和M3产生升高的铁沉积(图5，F-H)和铁蛋白表达(图5，I-J)，表明缺乏变体FGF6介导的铁摄取抑制。此外，使用Perls染色通过IHC证实细胞内铁积累(图6)。
4、系统性硬化症和癌症中改变的FGF6基因表达
我们假设FGF6可能参与人类自身免疫性疾病和癌症，因为许多研究报道了异常的铁代谢。更具体地说，降低的铁调素与慢性疾病的贫血有关，该贫血经常伴随着这些全身炎症状态。为了探讨自身免疫组织中FGF6表达与铁沉积之间的关系，检查了系统性硬化病患者(SSc)和健康对照的皮肤病灶中的FGF6表达和铁沉积。通过免疫组织化学测定，我们发现FGF6表达在SSc患者皮肤组织(尤其是表皮)中显著下降(图7，A)；通过检测铁蛋白含量，我们发现在SSc患者皮肤组织(尤其是表皮)中铁沉积上升(图7，B)。
我们还研究了肝癌组织中FGF6蛋白表达与铁沉积之间的关系。我们发现FGF6在非转移性癌症病变组织中显著降低(图7，C)，铁沉积增加(图7，D)。然而，在转移性肝癌组织中观察到FGF6表达增加(图8)，表明FGF6在肿瘤发生和转移中起不同作用，类似于TGF-β。
三、讨论
铁稳态由通路和四种主要细胞类型的组合产生：肠细胞，肝细胞，巨噬细胞和早幼粒红血球细胞。EGF/EGFR信号传导途径、血红素产生、STAT信号传导、cAMP信号传导、铁蛋白存储和BMP-SMAD信号传导都参与铁调节。FGF6属于旁分泌FGF基因家族，主要在骨骼肌中表达，骨骼肌在铁代谢中起重要作用，因为它含有10％-15％的铁储备。我们进行了FGF6和已知铁代谢基因的进化分析，包括FGFR1、TFRC、FTH1、IREB1、TF、HMOX1、ACO2和HAMP(编码hepcidin)。功能实验表明，FGF6强烈影响hepcidin表达以调节铁稳态并降低肝细胞中Fe2+的吸收，同时不影响铁调素非依赖性Fe3+摄取。这些结果表明FGF6通过铁调素介导其对铁代谢的影响。通过FGF6诱导铁调素表达，可促进铁蛋白抑制。
我们另外发现，与野生型FGF6相比，三种FGF6非同义变体增加细胞内Fe2+浓度并降低铁调素水平，表明功能丧失。我们观察到FGF6参与SSc和肝癌中的铁沉积。总之，这些结果表明通过FGF6的成纤维细胞生长因子受体(FGFR)信号传导是铁代谢中至关重要的机制。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 调节铁离子体内平衡的组合物及方法
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tccactgtgg agcgaggcgt ggtgagtctc tttggagtga gaagtgccct cttcgttgcc 420
atgaacagta aaggaagatt gtacgcaacg cccagcttcc aagaagaatg caagttcaga 480
gaaaccctcc tgcccaacaa ttacaatgcc tacgagtcag acttgtacca agggacctac 540
attgccctga gcaaatacgg acaggtaaag cggggcagca aggtgtcccc gatcatgact 600
gtcactcatt tccttcccag gatctaa 627

Claims (10)

1.FGF6调节剂在制备调节对象铁离子体内平衡的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，
所述FGF6调节剂选自：(1)FGF6蛋白、重组bFGF蛋白或重组bFGF蛋白的表达载体；(2)提高FGF6蛋白活性的试剂；和(3)提高FGF6蛋白表达水平的试剂；所述药物用于治疗或预防与机体铁过载相关的疾病或症状；或
所述FGF6调节剂选自：(1)抑制FGF6蛋白活性的试剂；和(2)降低FGF6蛋白表达水平的试剂；所述药物用于治疗或预防与铁缺乏相关的疾病或症状；优选地，所述疾病为缺铁性贫血。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述提高FGF6蛋白活性的试剂为FGF6蛋白的激动剂；所述提高FGF6蛋白表达水平的试剂选自：(a)FGF6蛋白的表达载体和(b)促进FGF6基因表达的试剂；
所述抑制FGF6蛋白活性的试剂为FGF6蛋白活性的拮抗剂；所述降低FGF6蛋白表达水平的试剂选自：(a)靶向FGF6的siRNA、反义RNA和/或核酶；(b)基因编辑载体，所述基因编辑载体在对象细胞基因组的FGF6基因中引入导致所表达的FGF6蛋白活性丧失或减弱的突变；和(c)同源重组载体，所述同源重组载体用于敲除基因组中的FGF6基因，或将编码无活性或活性降低的FGF6突变体的核酸序列同源重组到基因组中以替换野生型FGF6。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述与机体铁过载相关的疾病或症状选自：血沉病、皮肤色素沉着、肝纤维化、肝硬化、心肌病、心律失常、心力衰竭、生长发育及性成熟迟缓、糖尿病、不育、甲减、造血功能抑制、AML转化加速、自身免疫疾病和癌症。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因编辑载体选自：CRISPR-CAS9基因编辑载体和TALEN基因编辑载体。
6.FGF6蛋白和/或其表达载体和/或重组bFGF蛋白和/或其表达载体在制备治疗或预防与铁过载相关的疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病选自：血沉病、皮肤色素沉着、肝纤维化、肝硬化、心肌病、心律失常、心力衰竭、生长发育及性成熟迟缓、糖尿病、不育、甲减、造血功能抑制、AML转化加速、自身免疫疾病和癌症；优选地，所述自身免疫疾病为硬皮病，所述癌症为肝癌。
7.FGF6的检测试剂在制备诊断对象体内铁离子平衡的试剂中的应用；优选地，所述检测试剂包括为核酸序列或蛋白序列；更优选地，所述检测试剂为引物序列，所述检测试剂为特异性结合FGF6的抗体。
8.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒含有FGF6的检测试剂；优选地，所述检测试剂为特异性结合FGF6编码序列的引物或FGF6蛋白的特异性抗体。
9.一种药盒，所述药盒含有FGF6的调节剂和任选的铁剂、去铁剂、化疗剂或自身免疫疾病的治疗药物。
10.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述药盒含有：
(1)选自以下的FGF6调节剂：(a)FGF6蛋白、重组bFGF蛋白或重组bFGF蛋白的表达载体，(b)提高FGF6蛋白活性的试剂，和(c)提高FGF6蛋白表达水平的试剂；和去铁剂，如去铁胺、去铁酮和地拉罗司中的一种或多种；
(2)选自以下的FGF6调节剂：(a)抑制FGF6蛋白活性的试剂，和(b)降低FGF6蛋白表达水平的试剂；和铁剂，如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁和富马酸亚铁中的一种或多种；
(3)选自以下的FGF6调节剂：(a)FGF6蛋白、重组bFGF蛋白或重组bFGF蛋白的表达载体，(b)提高FGF6蛋白活性的试剂，和(c)提高FGF6蛋白表达水平的试剂；和肝癌的化疗剂，如索拉菲尼、舒尼替尼、贝伐单抗和厄洛替尼中的一种或多种；或
(4)选自以下的FGF6调节剂：(a)FGF6蛋白、重组bFGF蛋白或重组bFGF蛋白的表达载体，(b)提高FGF6蛋白活性的试剂，和(c)提高FGF6蛋白表达水平的试剂；和硬皮病的治疗药物，包括糖皮质激素、免疫抑制剂、青霉胺、甲氨蝶呤、松弛素、伊马替尼、CD20单抗和TGF-β抗体中的任意一种或多种。
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