ES2828510T3 - Agente terapéutico para tratar un cáncer en el que NRF2 está estabilizado - Google Patents

Abstract

Un agente terapeutico que contiene un acido nucleico que consiste en una secuencia de nucleotidos de hsa-miR- 634 (SEQ ID NO: 2) para su uso en el tratamiento de cancer en el que NRF2 esta estabilizado.

Description

DESCRIPCIÓN

Agente terapéutico para tratar un cáncer en el que NRF2 está estabilizado

Campo técnico

La presente invención se refiere a un agente anticanceroso para su uso como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

Antecedentes de la técnica

El cáncer se ha convertido en la principal causa de muerte de los japoneses durante muchos años, representando alrededor de un tercio del total de muertes estimadas en 2007. En el mundo, alrededor del 13 % de las muertes en 2005 se atribuyeron al cáncer, indicado previamente por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Las muertes por cáncer están aumentando continuamente y se estima que en 2030, 11.400.000 de personas en todo el mundo morirán por cáncer en un año.

Por otra parte, el progreso en el diagnóstico y tratamiento del cáncer es notable. En particular, cuando el tratamiento correspondiente puede iniciarse en una etapa muy temprana del cáncer, la tasa de supervivencia a cinco años con frecuencia supera el 90 %. Además, es de sentido común actual que particularmente en el caso de los ancianos, incluso si su cáncer no se cura por completo, puedan vivir sus vidas si se puede suprimir el progreso o la metástasis del cáncer.

El proyecto genómico humano, completado en 2003, y proyectos similares han acelerado la investigación del cáncer a nivel de genes o a nivel de moléculas de proteínas y la aplicación de los resultados para el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Como resultado, además se han desarrollado diversas técnicas de apoyo a la ciencia médica y la biología, y han progresado rápidamente los métodos relacionados con el diagnóstico y el tratamiento del cáncer en etapas tempranas.

Hace mucho tiempo, la notificación de cáncer era casi equivalente a "una sentencia de muerte", y, por lo tanto, la notificación del cáncer al paciente se consideraba tabú. Sin embargo, la "Ley de Control del Cáncer" de Japón, en vigor en 2007, exige que los pacientes con cáncer y otras partes interesadas participen activamente en el control del cáncer.

En estas circunstancias, actualmente se realizan esfuerzos continuos hacia el desarrollo de métodos terapéuticos y de diagnóstico del cáncer desde una variedad más amplia de aspectos.

Documentos de la técnica anterior

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Itoh, K. et al., Biochem. Bioph. Res Co. 236, 313-322 (1997)

Documento no de patente 2: Uruno, A. y Motohashi, H., Nitric Oxide-Biol. Ch.25, 153-160 (2011)

Documento no de patente 3: Singh, A. et al., Plos. Med. 3, 1865-1876 (2006)

Documento no de patente 4: Thimmulappa, R,K. et al., Cancer Research, 62, 5196-5203 (2002)

Documento no de patente 5: Mituishi, Y. et al., Cancer Cell 22, 66-79 (2012)

Documento no de patente 6: Kim, Y.R. et al., J. Pathol. 220, 446-451 (2010)

Documento no de patente 7: Taguchi, K., Motohashi, H. & Yamamoto, Genes Cells 16, 123-140 (2011)

Documento no de patente 8: Hammerman, P.S. et al., Neoplasia 13, 864-873 (2011)

Documento no de patente 9: Shibata, T. et al., Neoplasia 13, 864-873 (2011)

Documento no de patente 10: Inami, Y. et al., J. Cell Biol. 193, 275-284 (2011)

Documento no de patente 11: Komatsu, M. et al., Nat. Cell Biol. 12, 213-U217 (2010)

Documento no de patente 12: Taguchi, K. et al., P. Natl. Acad. Sci. USA 109, 13561-13566 (2012)

Documento no de patente 13: Lau, A. et al., Mol. Cell Biol. 30, 3275-3285 (2010)

Documento no de patente 14: Jiang, T. et al., Cancer Research 70, 5486-5496 (2010)

Documento no de patente 15: Shibata, T. et al., P. Natl. Acad. Sci. USA 105, 13568-13573 (2008)

Documento no de patente 16: Soils, L.M. et al., Clin. Cancer Res. 16, 3743-3753 (2010)

Documento no de patente 17: Ambros, V., Nature 431,350-355 (2004)

Documento no de patente 18: Zhao, Y. & Srivastava, D., Trends Biochem. Sci. 32, 189-197 (2007)

Documento no de patente 19: Kong, Y.W., Ferland-McCollough, D., Jackson. T. J. & Bushell, M. Lancet, Oncol. 13, E249-E258 (2012)

Documento no de patente 20: Lu, J. et al., Nature 435, 834-838 (2005)

Documento no de patente 21: Miska, E.A., Curr Opin. Genet. Dev. 15, 563-568 (2005)

Documento no de patente 22: Shivdasani, R.S., Blood 108, 3646-3653 (2006)

Documento no de patente 23: Zhang, B.H., Pan, X.P., Cobb, G.P.& Anderson, T.A., Dev. Biol. 302, 1-12 (2007)

Documento no de patente 24: Lewis, B.P., Burge, C.B. & Bartel, D.P., Cell 120, 15-20 (2005)

Documento no de patente 25: Tsuruta, T. et al., Cáncer Research 71,6575-5778 (2011)

Documento no de patente 26: Takeshita, F. et al., Mol. Ther. 18, 181-187 (2010)

Documento no de patente 27: Liu, C. et al., Nat. Med. 17, 211-215 (2011)

El documento EP 2208499 A1 divulga un agente para suprimir o promover la proliferación celular, un reactivo de diagnóstico o fármaco terapéutico para una enfermedad que es el resultado de una anomalía en la proliferación celular, un agente para inducir la apoptosis, un agente para suprimir o promover la expresión de un gen diana para un ácido nucleico tal como un microARN, y un método para suprimir o promover la proliferación celular.

P. Óstling et al., "Systematic Analysis of MicroRNAs Targeting the androgen Receptor in Prostate Cancer Cells", CANCER RESEARCH, vol. 71, n.° 5, 1 de marzo 2011, páginas 1956-1967 divulga que quince AR que regulan negativamente los miARN disminuyeron la proliferación inducida por andrógenos de las células de cáncer de próstata.

T. Boulikas et al., "Recent Clinical Trials Using Cisplatin, Carboplatin and Their Combination chemotherapy drugs (Review), ONCOLOGY REPORTS, SPANDIDOS PUBLICATIONS; GR, vol. 11, n.° 3, 1 de marzo 2004, páginas 559­ 595 resume el estado de la técnica de los ensayos clínicos publicados principalmente en 2002 utilizando cisplatino y carboplatino y sus combinaciones con otros fármacos contra el cáncer.

Sumario de la invención

Problemas para resolver mediante la invención

En las circunstancias mencionadas anteriormente que implican cáncer, los presentes inventores se han centrado en un factor 2 relacionado con NF-E2 (NRF2) en relación con el cáncer. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar medios para el tratamiento del cáncer basados en un nuevo concepto.

NRF2 es un regulador transcripcional para la citoprotección contra el daño celular de la quimioterapia y el estrés oxidativo (Documentos no de patente 1 y 2). En condiciones fisiológicas, NRF2 se ubiquitina por el complejo KEAP1 (culina 3 (CUL3)- proteína asociada a ECH de tipo Kelch) E3 ubiquitina ligasa y se degrada constantemente en el proteasoma, por lo que la concentración celular de proteína NRF2 se puede mantener a un nivel bajo. Bajo estrés celular, KEAP1 se inactiva y NRF2 se estabiliza en el núcleo, conduciendo a la supervivencia celular a través de la activación transcripcional de genes diana [en los que NRF2 se une directamente al elemento de respuesta antioxidante (ARE, por sus siglas en inglés) dentro del promotor en cada gen diana] (Documentos no de patente 3 y 4). Además de la respuesta general al estrés celular, se ha informado de que NRF2 también puede contribuir al crecimiento de células tumorales mediante la modulación del metabolismo (Documento no de patente 5). Las mutaciones génicas conducen a una ganancia de función para NRF2 o pérdida de función para KEAP1 en diversos tipos de cánceres humanos, por lo que se activa NRF2, dando como resultado la supervivencia y el crecimiento de las células cancerosas mediante la mediación de NRF2 (Documentos no de patente 6 a 9). Por otra parte, la acumulación excesiva de proteína p62 (es decir, un sustrato para la degradación de proteínas a través de la autofagia) forma un agregado, que estabiliza NRF2 a través de la interacción competitiva con KEAP1 en el carcinoma hepatocelular (HCC, por su siglas en inglés) (Documentos no de patente 10 a 13). Por lo tanto, se cree que NRF2 muestra una función oncogénica en las células cancerosas, y un alto nivel de proteína NRF2 está asociado con un mal pronóstico (Documentos no de patente 14 a 16). En consecuencia, la inhibición terapéutica de las rutas oncogénicas mediadas por NRF2 puede ser particularmente eficaz para cánceres que tienen resistencia a diversas terapias debido al NRF2 estabilizado. Los inventores también han concebido que la malignidad del cáncer, que puede estimar directamente el pronóstico de un paciente, se puede diferenciar encontrando un índice que refleje el grado de estabilización de NRF2.

Los presentes inventores se han centrado en el papel del microARN (miARN) con respecto a NRF2. El miARN es una pequeña molécula de ARN endógena no codificante que regula la expresión génica interfiriendo con la traducción o estabilización de los transcritos diana mediante la unión a la región 3' no traducida (UTR, por sus siglas en inglés) (Documentos no de patente 17 y 18). Algunos miARN pueden regular negativamente un oncogén, y la regulación negativa de miARN supresores de tumores conduce a la activación de vías oncogénicas (Documentos no de patente 19 a 22). De manera importante, un transcrito puede estar dirigido por una pluralidad de miARN, mientras que un miARN puede dirigirse a una pluralidad de transcritos (Documentos no de patente 23 y 24). Esto sugiere que la regulación negativa de múltiples miARN, que se dirigen a un oncogén, activa vías oncogénicas, y que la administración de miARN que puede dirigirse a múltiples genes en relación con una vía oncogénica puede ser eficaz en la terapia contra el cáncer.

Por lo tanto, un objetivo específico de la presente invención es encontrar miARN que estén fuertemente asociados con la estabilización de NRF2 en tumores y proporcionar medios para utilizar tales miARN para el tratamiento del cáncer.

Medios para resolver los problemas

Para lograr el objetivo anterior, los presentes inventores realizaron la exploración de 470 miARN en una biblioteca de microARN mediante el uso de un sistema indicador con ARE. Más específicamente, las células HeLa se transfectaron con cada uno de los 470 miARN y se determinó la actividad luciferasa de cada caso, para así calcular la actividad de ARE. Como resultado, se identificaron 8 miARN (hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a, hsa-miR-129-5p, hsamiR-639, hsa-miR-337, hsa-miR-153 y hsa-miR-556), que mostraba cada uno una gran disminución en la actividad de ARE en comparación con un miARN de control y 8 miARN (hsa-miR-26a, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-190, hsa-miR-567, hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-432* y hsa-miR-29), que mostraba cada uno un gran aumento en la actividad de ARE en comparación con un miARN de control. Los inventores han descubierto que la activación de NRF2 en el cuerpo vivo, en particular células tumorales, puede detectarse mediante el uso de los microARN así identificados, por lo que se puede diferenciar la malignidad de un tumor o el pronóstico de un paciente con cáncer. Los inventores también han descubierto que un ácido o unos ácidos nucleicos que incluyen una secuencia o secuencias de los microARN asociados con la disminución de la actividad de ARE como se menciona anteriormente pueden usarse como agente terapéutico contra el cáncer.

Por consiguiente, la presente invención proporciona lo siguiente.

A continuación se proporciona un método para ensayar microARN, caracterizado por comprender la cuantificación de uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-639, hsa-miR-337, hsa-miR-153 y hsa-miR-556 en una muestra humana y la diferenciación de la malignidad de un tumor, la activación de NRF2, o el pronóstico de un paciente con cáncer basándose en una disminución en el valor o valores cuantificados como índice (en lo sucesivo en el presente documento, el método también puede denominarse método de determinación de valor bajo de la presente invención). Entre los 8 microARN a ensayar en el método de determinación de valor bajo de la presente invención, 4 microARN; es decir, hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a y hsa-miR-129-5p, en particular, muestran un valor de cuantificación bajo en el caso de un tumor maligno.

A continuación se proporciona un método para ensayar microARN, caracterizado por comprender la cuantificación de uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en hsa-miR-26a, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-190, hsa-miR-567, hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-432* y hsa-miR-29 en una muestra humana y la diferenciación de la malignidad de un tumor, la activación de NRF2, o el pronóstico de un paciente basándose en un aumento en el valor o valores cuantificados como índice (en lo sucesivo en el presente documento, el método también puede denominarse método de determinación de valor alto de la presente invención).

En el método de determinación de valor bajo y el método de determinación de valor alto, se detectan de uno a tres elementos seleccionados del grupo que consiste en la mutación del gen NRF2, a mutación del gen KEAP1 y la acumulación de proteína p62 en el tumor, y los elementos se añaden al índice, por lo que se puede potenciar la precisión en la diferenciación.

En el método de determinación de valor bajo y el método de determinación de valor alto, preferentemente, la suma de los índices, que indica cada uno la tendencia al aumento de la malignidad de un tumor, la activación de NRF2 o el empeoramiento del pronóstico de un paciente con cáncer se emplea como índice de puntuación, para así diferenciar la malignidad del tumor, la activación de NRF2 o el pronóstico del paciente.

En el método de determinación de valor bajo y el método de determinación de valor alto, no se impone ninguna limitación particular sobre el tumor (cáncer) cuya malignidad o similares se va a diferenciar, siempre que la activación de NRF2 sea problemática en la malignidad o similares del tumor (cáncer). El método puede aplicarse a cualquier tumor maligno, incluido el cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de útero, osteosarcoma y cáncer de piel.

En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un agente terapéutico contra el cáncer para su uso como se define en la reivindicación 1.

Por otra parte, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención se usa adecuadamente en combinación con medios para impartir estrés a las células cancerosas.

Asimismo, a continuación se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, comprendiendo la composición el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención (en lo sucesivo en el presente documento también puede denominarse composición farmacéutica).

No se impone ninguna limitación particular sobre el tumor (cáncer) al que se administra el agente terapéutico contra el cáncer de la presente divulgación, siempre que la activación de NRF2 sea problemática en la malignidad o similares del tumor (cáncer). El agente de la presente divulgación puede aplicarse a cualquier tumor maligno, incluido el cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de útero, osteosarcoma y cáncer de piel. En particular, se prefiere un cáncer al que se pueda administrar por vía tópica el agente de la presente divulgación.

Las secuencias de los miARN descritos se enumeran en las siguientes tablas. La Tabla 1-1 muestra 8 miARN que se van a ensayar en el método de determinación de valor bajo (en lo sucesivo en el presente documento se pueden denominar miARN de valor bajo), y se les asignan las SEQ ID NO de 1 a 8 desde la parte superior de la Tabla 1-1. La Tabla 1-2 muestra 8 miARN que se van a ensayar en el método de determinación de valor alto (en lo sucesivo en el presente documento se pueden denominar miARN de valor alto), y se les asignan las SEQ ID NO de 9 a 16 desde la parte superior de la Tabla 1-2.

[Tabla 1-1]

miARN secuencia madura

hsa-miR-507 UUUUGCACCUUUUGGAGUGAA

hsa-miR-634 AACCAGCACCCCAACUUUGGAC

hsa-miR-450a UUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAU

hsa-miR-129-5p CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC

hsa-miR-639 AUCGCUGCGGUUGCGAGCGCUGU

hsa-miR-337 GAACGG CUU CAUACAG GAG U U

hsa-miR-153 UUG CAUAG U CACAAAAG UGAUC

hsa-miR-556 GAUGAGCUCAUUGUAAUAUGAG

[Tabla 1-2]

miARN secuencia madura

hsa-miR-26a U U CAAG UAAUC CAG GAUAG G C

hsa-miR-17-3p ACUGCAGUGAAGGCACUUGU

hsa-miR-1190 UGAUAUGUUUGAUAUAUUAGGU

hsa-miR-567 AG UAUGUUCU UCCAG GACAGAAC

hsa-miR-125b UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA

hsa-miR-125a UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUG

hsa-miR-432* CUGGAUGGCUCCUCCAUGUCU

hsa-miR-297 AUGUAUGUGUGCAUGUGCAUG

Efectos de la invención

Se describe un método de ensayo que permite la diferenciación de la activación de NRF2 mediante la determinación de un miARN específico, así como la malignidad de un tumor y el pronóstico de un paciente con cáncer. La invención proporciona un agente terapéutico contra el cáncer para su uso como se define en la reivindicación 1 que muestra un efecto antitumoral tal que la activación y estabilización de NRF2 en un tumor diana se inhiben mediante el uso de un ácido nucleico que incluye un miARN específico. De manera eficaz, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención se puede emplear con "estrés en las células cancerosas". El estrés lo proporcionan varios procedimientos de examen y tratamiento del cáncer, tal como la quimioterapia contra el cáncer, radioterapia contra el cáncer, cirugía y biopsia.

Breve descripción de los dibujos

[Fig. 1] Resultados de las pruebas de un sistema indicador con ARE que emplea ARNip.

[Fig.2-1] Resultados de la exploración de miARN que permiten la regulación negativa de la actividad transcripcional de NRF2.

[Fig. 2-2] Resultados del análisis de expresión del gen dirigido a NRF2.

[Fig. 3] Resultados de la confirmación de NRF2 como diana directa de 4 miARN candidatos.

[Fig. 4] Resultados de la transferencia Western con respecto a la expresión de NRF2 en células transfectadas con miARN.

[Fig. 5-1] Relación entre la significación clínica y la regulación negativa de miARN en una muestra de tumor primario derivado de cáncer de esófago (carcinoma de células escamosas de esófago: ESCC, por sus siglas en inglés).

[Fig. 5-2] Resultados del análisis de mutación del gen NRF2 y KEAP1 en una muestra de tumor primario derivado de cáncer de esófago (carcinoma de células escamosas de esófago: ESCC).

[Fig. 6] Resultados de la identificación de un gen diana de la transcripción de NRF2 como diana de hsa-miR-507.

[Fig. 7] Gráficos que muestran el análisis de expresión de 4 miARN y el efecto de la transfección con hsa-miR-507 sobre la supervivencia de las células A549 dificultan el estrés inducido por el tratamiento con cisplatino.

[Fig. 8] Efectos inhibidores tumorales in vivo de hsa-miR-507.

[Fig. 9] Estudios in vitro del efecto inductor de apoptosis de hsa-miR-634 sobre células tumorales.

[Fig. 10] Efecto inhibidor tumoral in vitro de hsa-miR-634 sobre las células de cáncer de esófago KYSE170. [Fig. 11 ] Efecto inhibidor tumoral in vivo de hsa-miR-634 sobre las células de cáncer de esófago KYSE170.

[Fig. 12-1] Efectos de la inhibición de la expresión del gen diana XIAP (inhibidor de la proteína de apoptosis ligado al cromosoma X), mediante la introducción de hsa-miR-634 en las células de osteosarcoma U2OS, con referencia al ensayo de luciferasa y transferencia Western.

[Fig. 12-2] Efectos de la inhibición de la expresión del gen diana APIP (proteína de interacción APAF1), mediante la introducción de hsa-miR-634 en las células de osteosarcoma U2OS, con referencia al ensayo de luciferasa y transferencia Western.

[Fig. 12-3] Efectos de la inhibición de la expresión de OPA1 diana (atrofia óptica 1), mediante la introducción de hsa-miR-634 en células de osteosarcoma U2OS, con referencia al ensayo de luciferasa y transferencia Western.

[Fig. 12-4] Efectos de la inhibición de la expresión de TFAM (factor de transcripción A, mitocondrial) diana, mediante la introducción de hsa-miR-634 en las células de osteosarcoma U2OS, con referencia al ensayo de luciferasa y transferencia Western.

Modos para llevar a cabo la invención

< Método de ensayo >

(1) Método de determinación de valor bajo

Tal como se describe anteriormente, el método de determinación de valor bajo se dirige a un "método de ensayo de microARN, caracterizado por comprender la cuantificación de "un o unos miARN de valor bajo" en una muestra humana y la diferenciación de la malignidad de un tumor, la activación de NRF2, o el pronóstico de un paciente con cáncer basándose en una disminución en los valores cuantificados como índice".

Tal como se describe anteriormente, el miARN de valor bajo que se va a ensayar es uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-639, hsa-miR-337, hsa-miR-153 y hsa-miR 556. Entre ellos, uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a y hsa-miR-129-5p, en particular, muestran un valor de cuantificación bajo en el caso de un tumor maligno. Por lo tanto, preferentemente, los 4 microARN se seleccionan preferentemente como dianas de ensayo.

La muestra humana es literalmente una muestra derivada de un ser humano. En muchos casos, los donantes de muestras son pacientes con cáncer. En la presente invención, los donantes de muestras pueden incluir pacientes cuyos cánceres no han sido diagnosticados. No se impone ninguna limitación particular sobre el tipo de muestras, siempre que se pueda detectar el cambio en los miARN de valor bajo en las células tumorales. En el caso más sencillo, la muestra es una muestra de tumor (es decir, el tumor en sí), y los ejemplos específicos de la misma incluyen muestras de tumor y muestras de biopsia que se han extraído mediante cirugía o con un endoscopio. Siempre que se cumpla el requisito anterior, se puede utilizar cualquier tejido humano como muestra de tejido. Generalmente, se pueden usar muestras de sangre (p. ej., suero, plasma y sangre completa), muestras de orina, muestras de líquido de lavado pulmonar, muestras de esputo, muestras de líquido linfático, muestras de líquido cefalorraquídeo, etc., de acuerdo con las necesidades.

No se impone ninguna limitación particular sobre los medios de cuantificación de miARN de valor bajo, y se puede emplear cualquier medio conocido y otros medios a desarrollar en el futuro. Ejemplos típicos de tales medios incluyen métodos de cuantificación de ARN basados en métodos de amplificación génica tal como RT-PCR. Desde el punto de vista de procesar numerosas muestras a alta velocidad, una técnica de RT-PCR en tiempo real que emplea un dispositivo de detección automatizado es un método más preferido. Otros ejemplos de tales medios incluyen el trazado Northern.

Cuando el valor cuantificado de un miARN de valor bajo es relativamente más bajo que el de un control interno en un valor umbral, se considera que el valor cuantificado del miARN ha disminuido. El valor umbral puede predeterminarse de manera específica para cada miARN. El valor umbral se establece preferentemente en un valor que corresponde a una disminución de al menos un 30 %. Más preferentemente, como se divulga en los Ejemplos descritos a continuación, el valor de umbral se establece en un valor que corresponde a una disminución de >50 %.

Entre 8 miARN de valor bajo, se puede emplear como índice una disminución en cada valor cuantificado. Cuanto mayor sea el aumento en el número de miARN que muestran una "disminución en el valor cuantificado", más fuerte es la malignidad de un tumor. En tal caso, NRF2, en particular, está activado en el tumor y el pronóstico del paciente se agrava.

Es decir, puede emplearse una disminución en un valor o valores cuantificados de uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-639, hsa-miR-337, hsa-miR-153 y hsa-miR-556 como índice para determinar la elevación de la malignidad tumoral, la activación de NRF2 o el empeoramiento del pronóstico de un paciente.

En un modo más preferido del método de determinación de valor bajo, entre los 8 miARN de valor bajo anteriores, se seleccionan uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en 4 microARN "hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a y hsa-miR-129-5p". Los resultados del caso en el que la malignidad del tumor y similares se diferenciaron mediante el uso de los 4 microARN se describen en los Ejemplos descritos a continuación.

En el método de determinación de valor bajo, se puede detectar de una a tres mutaciones génicas seleccionadas del grupo que consiste en la mutación del gen NRF2, la mutación del gen KEAP1 y la acumulación de proteína p62 en el tumor, y se pueden añadir las mutaciones génicas al índice de malignidad del tumor, la activación de NRF2, en particular, en el tumor y el pronóstico de un paciente. Mediante la adición de estos elementos al índice, la precisión de diferenciación del método de determinación de valor bajo se puede mejorar aún más. La mutación del gen NRF2 y/o la mutación del gen KEAP1 son cualquier mutación sin sentido, incluida la mutación puntual, mutación sin sentido y mutación del marco de lectura. La mutación en modo de sustitución de aminoácidos en los Ejemplos es un ejemplo de mutación sin sentido. No se impone ninguna limitación particular al método de detección de mutaciones génicas. Ejemplos del método de detección incluyen métodos de tipificación dependientes de PCR tal como pirosecuenciación, MALDl-TOF MS, RFLP, SSCP, SSOP, protección de RNasa, RDA, RAPD y AFLP; y métodos de tipificación no dependientes de PCR tal como TaqMan PCR e Invader.

Cuando uno a tres elementos seleccionados del grupo que consiste en la mutación del gen NRF2, la mutación del gen KEAP1 y la acumulación de proteína p62 en el tumor se añaden al índice empleado en el método de determinación de valor bajo, la "presencia" entre la presencia y ausencia de estas mutaciones génicas y la acumulación de proteínas se puede añadir al índice para determinar un aumento en la malignidad del tumor, activación de NRF2 y empeoramiento del pronóstico de un paciente. En los ejemplos descritos a continuación, el número de mutaciones génicas "presentes" (puntuación) se suma al número de "disminución" en los valores de cuantificación de los 4 miARN de valor bajo (puntuación) anteriormente mencionados, y la suma se emplea como índice final de malignidad tumoral, activación de NRF2 y pronóstico de un paciente. Cuando el número (puntuación) es 0 o 1, el grupo se denomina "grupo de puntuación baja", mientras que cuando el número (puntuación) es 2 o mayor, el grupo se denomina "grupo de puntuación alta". Se ha encontrado una diferencia significativa en el pronóstico de los pacientes entre los dos grupos. Por lo tanto, en el método de determinación de valor bajo, es posible y se prefiere evaluar si el empeoramiento de la malignidad del tumor, etc., está representado en cada nivel de elementos que son índices, y para emplear el número (puntuación) de elementos que representan el empeoramiento de la malignidad del tumor, etc. como índice para determinar la malignidad tumoral, etc. La forma de establecer el valor umbral de la puntuación varía según el tipo de cáncer diana, el índice seleccionado, etc., y no se limita al contenido de los Ejemplos descritos a continuación. El concepto esencial del método de determinación de valor bajo de la presente invención se basa en el hallazgo de que, entre otros, una "disminución" en el valor cuantificado de miARN que sirve como índice de diferenciación se relaciona estrechamente con la activación de NRF2 que conduce a un empeoramiento de la malignidad del cáncer, por lo que el pronóstico del cáncer se puede diferenciar adecuadamente. Por lo tanto, no hay un significado esencial en otros elementos del diseño, tal como establecer un valor umbral. Cuando se diagnostica que un paciente tiene un alto riesgo de cáncer mediante el método de determinación de valor bajo, se puede ejecutar un tratamiento médico tal como la administración del agente terapéutico contra el cáncer de la presente divulgación descrito a continuación.

(2) Método de determinación de valor alto

Tal como se describe anteriormente, el método de determinación de valor alto se dirige a un "método de ensayo de microARN, caracterizado por comprender la cuantificación de "miARN de valor alto" en una muestra humana y la diferenciación de la malignidad de un tumor, la activación de NRF2, o el pronóstico de un paciente con cáncer basándose en un aumento en los valores cuantificados como índice.

Tal como se describe anteriormente, el miARN de valor alto que se va a ensayar es uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en hsa-miR-26a, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-190, hsa-miR-567, hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-432* y hsa-miR-29.

La "muestra humana" y los "medios para cuantificar miARN de valor alto" son los mismos que aquellos en relación con el "método de determinación de valor bajo" mencionado anteriormente.

Cuando el valor cuantificado de un miARN de valor alto es mayor que el de un control interno en un valor umbral, se considera que el valor cuantificado del miARN aumenta. El valor umbral puede predeterminarse de manera específica para cada miARN. El valor umbral se fija preferentemente a un valor correspondiente a un aumento de al menos un 30 %. Más preferentemente, como se divulga en los Ejemplos descritos a continuación, el valor umbral se establece en un valor correspondiente a un aumento de >50 %.

Entre 8 miARN de valor alto, se puede emplear como índice un aumento en cada valor cuantificado. Cuanto mayor sea el aumento en el número de miARN que muestran un "aumento en el valor cuantificado", más fuerte es la malignidad de un tumor. En tal caso, NRF2, en particular, está activado en el tumor y el pronóstico del paciente se agrava.

Es decir, puede emplearse un aumento en un valor o valores cuantificados de uno o más microARN seleccionados del grupo que consiste en hsa-miR-26a, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-190, hsa-miR-567, hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsamiR-432* y hsa-miR-29 como índice para determinar la elevación de la malignidad tumoral, la activación de NRF2 o el empeoramiento del pronóstico de un paciente.

En el método de determinación de valor alto, se puede detectar de uno a tres elementos seleccionados del grupo que consiste en la mutación del gen NRF2, la mutación del gen KEAP1 y la acumulación de proteína p62 en el tumor, y se pueden añadir las mutaciones génicas al índice de malignidad del tumor, la activación de NRF2, en particular, en el tumor y el pronóstico de un paciente. La característica es la misma que se describe en relación con el "método de determinación de valor bajo".

Cuando estas mutaciones génicas y la acumulación de proteínas se añaden al índice empleado en el método de determinación de valor alto, la "presencia" entre la presencia y ausencia de estas mutaciones génicas se puede añadir al índice para determinar un aumento en la malignidad del tumor, activación de NRF2 y empeoramiento del pronóstico de un paciente.

Por lo tanto, en el método de determinación de valor alto, es posible y se prefiere evaluar si el empeoramiento de la malignidad del tumor, etc., está representado en cada nivel de elementos que son índices, y para emplear el número (puntuación) de elementos que representan el empeoramiento de la malignidad del tumor, etc. como índice para determinar la malignidad tumoral, etc. La forma de establecer el valor umbral de la puntuación varía según el tipo de cáncer diana, el índice seleccionado, etc. El concepto esencial del método de determinación de valor alto se basa en el hallazgo de que, entre otros, un "aumento" en el valor cuantificado de miARN que sirve como índice de diferenciación se relaciona estrechamente con la activación de NRF2 que conduce a un empeoramiento de la malignidad del cáncer, por lo que el pronóstico del cáncer se puede diferenciar adecuadamente. Por lo tanto, no hay un significado esencial en otros elementos del diseño, tal como establecer un valor umbral. Cuando se diagnostica que un paciente tiene un alto riesgo de cáncer mediante el método de determinación de valor alto, se puede ejecutar un tratamiento médico tal como la administración de un agente terapéutico contra el cáncer antagonista. El agente terapéutico contra el cáncer antagonista se refiere a, por ejemplo, un agente terapéutico contra el cáncer que contiene esencialmente un oligo sintético que puede inhibir de manera antagonista la función de un miARN que muestra expresión promovida confirmada en el método de determinación de valor alto.

< Agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención >

(1) El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención

Tal como se describe anteriormente, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención es un "agente terapéutico contra el cáncer para su uso como se define en la reivindicación 1".

Tal como se describe anteriormente, con respecto a todos los microARN que tienen las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionados (SEQ ID NO: 1 a 8), su expresión se suprime en las células cancerosas que tienen actividad NRF2 promovida o estabilizada, alta resistencia a la terapia y alta malignidad. El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención proporciona tratamiento médico para un cáncer de este tipo que tiene resistencia a la terapia y una alta malignidad a través del siguiente mecanismo. Específicamente, un ácido nucleico que sirve como microARN cuya expresión está suprimida en las células cancerosas se administra a un paciente con cáncer, para así inactivar el n RF2 para debilitar el cáncer diana.

La actividad de NRF2 es intrínsecamente alta en algunas células cancerosas. Sin embargo, en muchos casos, NRF2 se activa al generar estrés a las células cancerosas. Un factor de estrés es una acción terapéutica contra el cáncer, y los ejemplos específicos incluyen quimioterapia contra el cáncer, radioterapia contra el cáncer y cirugía. Estas acciones pueden ser acciones terapéuticas para el cáncer, pero destruye las células cancerosas diana. Por lo tanto, el estrés por tales acciones está concebido para promover la actividad de NRF2 en las células cancerosas. Por lo tanto, en una realización preferida del uso del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención, el agente terapéutico contra el cáncer se usa en combinación con el estrés para el cáncer, a través de la quimioterapia contra el cáncer, etc., como se describe anteriormente. De manera destacable, similar a la cirugía, se cree que la estimulación de las células cancerosas a través de la biopsia provoca estrés físico en las células cancerosas. Por lo tanto, el agente terapéutico contra el cáncer se puede usar en combinación con biopsia. El concepto "combinación" engloba conceptos temporales, "antes de", "durante (simultáneo)", y después". En otras palabras, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede administrarse "antes" de una acción que genere estrés, tal como la administración de otro agente anticanceroso, cirugía o biopsia. Como alternativa, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede tomarse "simultáneamente" con otro agente anticanceroso, o puede tomarse como una mezcla (composición farmacéutica) con otro agente anticanceroso. Sin embargo, alternativamente, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede administrarse "después" de una acción que genere estrés, tal como la administración de otro agente anticanceroso, cirugía o biopsia.

No se impone ninguna limitación particular sobre el "ácido nucleico que incluye las 8 secuencias de nucleótidos de miARN mencionadas anteriormente", sirviendo como los componentes esenciales del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención, siempre que el ácido nucleico incluya la o las secuencias y pueda mostrar funciones de miARN en células cancerosas. Aunque el ácido nucleico puede ser un "miARN" presente en el organismo vivo tal como un ARN monocatenario, preferentemente es un ácido nucleico bicatenario, desde el punto de vista de la estabilidad en el cuerpo vivo. Ejemplos específicos del ácido nucleico bicatenario incluyen un "ARN bicatenario" compuesto por un par de una secuencia de miARN y un ARN complementario de la misma, un "complejo de ARN-ADN de doble cadena", un "complejo de ARN-APN de doble cadena", y un "cadena de ARN-LNA de doble cadena". APN (ácido peptidonucleico) se refiere a un homólogo de ácido nucleico que tiene un esqueleto en el que un esqueleto de desoxirribosa-fosfato (esqueleto de ácido nucleico) está sustituido por (2-aminoetil)glicina. LNA (ácido nucleico bloqueado) (también llamado BNA: ácido nucleico con puente) se refiere a un ácido nucleico artificial que tiene una estabilidad potenciada en virtud de que la posición 2' y la posición 4' del resto de azúcar están unidas entre sí a través de una cadena de carbono (D.A. Braasch, D.R. Corey, Chem. Biol., 8, 1 (2001)). En los ejemplos descritos a continuación, se utiliza un "ARN bicatenario".

Un ácido nucleico de interés se puede sintetizar mediante un método de síntesis de ARN conocido o una técnica similar. Ejemplos del método de síntesis de ARN incluyen un método de fosforamidita y un método mejorado del mismo (M. Kataoka, Y. Hayakawa, J. Org. Chem., 64, 6087 (1999)), un método de H-fosfonato y un método mejorado del mismo (T. Wada, F. Handa, Y. Sato, S. Kawahara, M. Sekine, Nucleic Acids Symp. Ser., 37, 19 (1997)) y un método de síntesis enzimática (método de transcripción in vitro). De acuerdo con las necesidades, se puede realizar una mono modificación de a-oxígeno del resto fosfato del ácido nucleico (por ejemplo, modificación S-oligo), modificación del resto de éster de fosfato, modificación del esqueleto de fosfato con APN o similares, modificación del resto de azúcar con LNA anteriormente mencionado o similares, y otras modificaciones. Como alternativa, también se puede utilizar en la presente invención cualquiera de los productos de ácido nucleico comerciales y productos de ácido nucleico fabricados por contrato.

El ácido nucleico así obtenido que incluye una secuencia o secuencias de nucleótidos de miARN específicas puede usarse como componente o componentes esenciales del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención. Cuando el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención se administra a un cuerpo humano, el agente se administra generalmente como una composición farmacéutica de la presente invención, como se describe a continuación. La dosis diaria del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención en el caso de la administración a un cuerpo humano es de aproximadamente 0,01 |jg a aproximadamente 10 mg para un adulto. Puede ser aplicable una administración única o dividida (2 a 5 veces) por día, o la repetición de dicha administración con intervalos de varios días.

Tal como se describe anteriormente, el cáncer al que se puede aplicar el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención no está determinado por el tipo del mismo, sino que satisface preferentemente la condición de que se suprima la expresión de miARN específicos (8 miARN: hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-639, hsa-miR-337, hsa-miR-153 y hsa-miR-556, y normalmente 4 miARN: hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a y hsa-miR-129-5p), por lo que la actividad de NRF2 en las células cancerosas diana se potencia o se estabiliza. En otras palabras, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención está planificado activamente para administrarse a un paciente con cáncer que se diferencia, por la determinación de valor bajo de la presente invención, por haber suprimido NRF2 debido a la expresión suprimida de los microARN específicos antes mencionados. A este respecto, la combinación de los ácidos nucleicos que incluyen secuencias de nucleótidos de miARN que sirven como componentes esenciales del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención puede estar preparada (generalmente, ácidos nucleicos que incluyen las secuencias de nucleótidos de 4 miARN mencionados anteriormente). Como alternativa, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención también se puede adaptar de modo que el componente esencial del mismo sea un ácido nucleico que incluya una secuencia o secuencias de nucleótidos de miARN cuya expresión se haya comprobado. Por lo tanto, los miARN específicos, que sirven como componentes esenciales del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención, se pueden usar solos o en combinación de dos o más especies. No se impone ninguna limitación particular sobre el cáncer al que se aplica el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención, y los ejemplos del cáncer diana incluyen cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de útero, cáncer de piel y osteosarcoma, como se describe anteriormente.

Ejemplos del agente contra el cáncer que sirve como medio de estrés para las células cancerosas empleado en combinación con el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención incluyen agentes alquilantes tales como ifosfamida, ciclofosfamida, dacarbazina, temozolomida, nimustina, busulfano, procarbazina y melfalán; fármacos de diana molecular tal como ibritumomab tiuxetán, imatinib, everolimus, erlotinib, gefitinib, gemtuzumab ozogamicina, sunitinib, cetuximab, sorafenib, dasatinib, tamibaroteno, trastuzumab, tretinoína, panitumumab, bevacizumab, bortezomib, lapatinib y rituximab; antimetabolitos tales como enocitabina, capecitabina, carnofur, cladribina, gemcitabina, citarabina, ocfosfato de citarabina, tegaful, tegaful/uracilo, tegaful/gimeracil/oteracil potasio, doxifluridina, nelarabina, hidroxicarbamida, fluorouracilo, fuludarabina, pemetrexed, pentostatina, mercaptopurina y metotrexato; alcaloides vegetales tales como irinotecán, etopósido, eribulina, sobuzoxano, docetaxel, nogitecano, paclitaxel, vinorelbina, vincristina, vindesina y vinblastina; antibióticos contra el cáncer tales como actinomicina D, aclarrubicina, amurrubicina, idarrubicina, epirrubicina, estimalámero de zinostatina, daunorrubicina, doxorrubicina, pirarrubicina, bleomicina, pepleomicina, mitomicina C, mitoxantrona, doxorrubicina liposómica; agentes de platino tal como oxaliplatino, carboplatino, cisplatino (CDDP) y nedaplatino; fármacos hormonales tales como anastrozol, exemestano, estramustina, etinil estradiol, clormadiona, tamoxifeno, dexametasona, toremifeno, bicalutamida, flutamida, prednisolona, fosfestrol, mitotano, metiltestosterona, medroxiprogesterona, mepitiostano, leuprorelina y letrozol; y modificadores de la respuesta biológica, tales como interferón-a, interferón-p, interferón-Y, interleucina, ubenimex, vacuna BCG seca y lentinano. Cuando se observa activación de NRF2 mediante el tratamiento con cualquiera de estos agentes anticancerosos, se puede encontrar que el cáncer es una diana adecuada del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención. En cuanto a la radioterapia contra el cáncer, se puede emplear radioterapia iónica y similares, además de las técnicas de radioterapia convencionales. Además, la cirugía y la biopsia pueden emplearse como se describe anteriormente.

Independientemente de la consideración de las afecciones de cáncer relacionadas con el estrés, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención también puede aplicarse al caso en el que se abandona el tratamiento completo del cáncer y se permite la "coexistencia con el cáncer". En otras palabras, se cree que el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención es adecuado para el caso en el que se previene el empeoramiento del cáncer mediante la supresión de la activación de NRF2 en las células cancerosas, que lleva a los pacientes con cáncer a vivir su vida.

< Composición farmacéutica >

Tal como se describe anteriormente, la composición farmacéutica es una "composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, comprendiendo la composición el agente terapéutico contra el cáncer mencionado anteriormente de la presente divulgación".

Tal como se describe anteriormente, el propio agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención y la "composición farmacéutica" que contiene el agente terapéutico que sirve como principio activo se administran a un cuerpo humano. En caso de que el propio agente terapéutico contra el cáncer se administre directamente, una inyección o similares se mezcla con el agente cuando se usa. Por lo tanto, también se abarca tal caso en la composición farmacéutica.

La composición farmacéutica se prepara mezclando el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención con un transportador de preparación farmacéutica apropiado, en forma de composición de preparación farmacéutica. El transportador de la preparación farmacéutica se puede seleccionar de acuerdo con el modo de uso, y los ejemplos del transportador que se puede usar en la invención incluyen un vehículo o diluyente tal como un relleno, un extensor, un aglutinante, un humidificador, un disgregante, un tensioactivo, etc. No se impone ninguna limitación particular sobre la forma de la composición, siempre que la composición pueda contener eficazmente el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención. Ejemplos de la forma de composición que se puede emplear en la invención incluyen sólidos tales como comprimido, polvo, gránulo, píldora y ungüento. Generalmente, la forma es inyecciones adecuadas tal como líquido, suspensión y emulsión. El agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención se puede transformar en un producto seco a partir del cual se puede preparar una preparación líquida añadiendo un transportador apropiado cuando se usa. El efecto del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención se puede potenciar mediante el empleo de sistemas de suministro de fármacos tales como nanopartículas formadas de polímero que contiene ciclodextrina, micela polimérica, partículas lipídicas de ácido nucleico estabilizado (SNALP, por sus siglas en inglés) y nanodispositivo polifuncional de tipo envolvente (MEND, por sus siglas en inglés), en la composición farmacéutica.

La composición farmacéutica así obtenida se administra a un paciente a través de una vía de administración apropiada adecuada para la forma de la misma. La composición farmacéutica en forma de inyección se puede administrar por vía intravenosa, vía intramuscular, vía hipodérmica, vía intradérmica o vía intraperitoneal. La composición farmacéutica en forma sólida puede administrarse por vía oral o entérica. La cantidad del agente terapéutico de la presente invención en la composición farmacéutica se selecciona apropiadamente según la vía de administración de la composición, modo de administración, propósito de uso, condiciones del paciente diana, etc., y no es constante. Generalmente, el agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención se prepara en una composición farmacéutica correspondiente que tiene un contenido de agente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 95 % en masa. Preferentemente, la dosis diaria anterior (de aproximadamente 0,01 |jg a aproximadamente 10 mg para un adulto) se administra individualmente o dividida (de 2 a 5 veces), o puede ser aplicable la repetición de dicha administración con intervalos de varios días.

Ejemplos

La presente invención se describirá a continuación a modo de ejemplos.

1. Materiales y Métodos

Antes de proporcionar los resultados de los Ejemplos, se describirán los materiales y métodos de prueba empleados en los mismos.

(1) Medios de cultivo celular y muestras de tumores primarios

Se adquirieron células HeLa, Lk-2, A549 y JHH-5 en American Culture Collection (EE. UU.). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (para células HeLa y Lk-2), en medio RpMI 1640 (para células A549) o en medio E de Williams (para células JHH-5), complementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina y estreptomicina, a 37 °C con CO2 al 5 %.

Se obtuvieron muestras de carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC) primario (30 muestras en total) y de mucosa esofágica no cancerosa correspondiente de pacientes tratados en el Hospital Universitario Médico y Dental de Tokio entre abril de 2005 y junio de 2007. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta que se extrajeron el ADN y el ARN genómico. El consentimiento por escrito siempre se obtuvo en el estilo formal. La recogida y el análisis de muestras de pacientes se aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Médica y Dental de Tokio (aprobación n.° 2010 52). Las muestras tumorales fijadas con formalina y embebidas en parafina se sometieron a análisis inmunohistoquímico. Se obtuvieron datos relevantes clínicos y de supervivencia de todos los pacientes. Ninguno de los pacientes había recibido quimioterapia o radiación antes de la cirugía. El estadio de la enfermedad se definió de acuerdo con la clasificación de tumor-ganglio linfáticometástasis del cáncer de esófago. Los pacientes que se trataron mediante resección no curativa o que murieron por otras enfermedades no se incluyeron en este estudio. La mediana del período de seguimiento de los pacientes que sobrevivieron fue de 35 meses (4 a 69 meses).

(2) Anticuerpos y reactivos

Se utilizaron anticuerpo policlonal anti-NRF2 de conejo (Santa Cruz Biotechnology) (para transferencia Western), anticuerpo policlonal anti-NRF2 de conejo (Santa Cruz Biotechnology) (para inmunohistoquímica), anticuerpo policlonal anti-KEAP1 de conejo (Proteintech), anticuerpo monoclonal anti-ME-1 de ratón (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo anti-XIAP de conejo (señalización celular), anticuerpo anti-APIP de conejo (Abcam), anticuerpo anti-OPAl de conejo (Abcam), anticuerpo anti-TFAM de conejo (Sigma) y anticuerpo monoclonal anti-p-actina de ratón (Sigma). Para el tratamiento de células cultivadas, se utilizó peróxido de hidrógeno (Wako) o cisplatino (Wako).

(3) Ensayo de supervivencia celular

La supervivencia celular se evaluó mediante el ensayo de tinción con cristal violeta (CV). Específicamente, las células se lavaron en PBS y se fijaron con CV al 0,2 % en formaldehído al 10 % en PBS durante 3 minutos. Después de eliminar el exceso de solución CV y secar completamente al aire, las células teñidas se lisaron con una solución de SDS al 2 %, agitando la placa durante una hora. La absorbancia de la densidad óptica (DO) se midió a 560 nm por medio de un lector de microplacas (ARVOmx; Perkinelmer) y se determinó el porcentaje de absorbancia de cada pocillo. Los valores de absorbancia de DO de las células en los pocillos de control se fijaron arbitrariamente al 100 % para determinar el porcentaje de células viables.

(4) Sistema de detección usando indicador ARE-luciferasa

El plásmido indicador de luciferasa se preparó insertando una región promotora de NQO-1 humana 5'-CTCAGCCTTCCAAATCGCAGTCACAGTGACTCAGCAGAATC-3' (SEQ ID NO: 19) que incluye un elemento de respuesta antioxidante (ARE) en un sitio Mlu1/Xho1 en el vector pGL3 (Promega). Específicamente, un par de oligonucleótidos sintéticos complementarios entre sí que se muestran en la Tabla 2 (superior; SEQ ID NO: 20, inferior; SEQ ID NO: 21) se hibridaron, para formar de ese modo un ADN bicatenario y se preparó un ADN bicatenario que tenía extremos cohesivos complementarios al sitio Mlu1/Xho1 mediante el uso de Mlu1 y Xho1. El fragmento de ADN bicatenario así producido se insertó en el sitio Mlu1/Xho1, para producir así un pGL3 recombinante (plásmido indicador) de interés.

_____________________________________________ ITabla 21_____________________________________________ Nombre____________ Secuencia (5’-3’)________________________________________________________________ NQO1-ARE- CGACGCGTCTCAGCCTTCCAAATCGCAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCCTCGAGCGG Mlul/Xhol

NQO1-ARE- CCGCTCGAGGATTCTGCTGAGTCACTGTGACTGCGATTTGGAAGGCTGAGACGCGTCG Xhol/Mlul

En primer lugar, el plásmido indicador se transfectó transitoriamente en células HeLa (1 x 107 células/placa) en una placa de 10 cm. 24 horas después de la transfección, las células (1 x 104 células/pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos, y al día siguiente, se transfectaron 20 nmol/L de cada uno de los 470 fragmentos de ARN bicatenario, derivados de la biblioteca de precursores de pre-miARN Humana V3 (Ambion) o de miARN de control. Después de dos días, la actividad de luciferasa de luciérnaga se midió mediante un lector de microplacas (ARVOmx; Perkinelmer) usando el Sistema de Ensayo Bright-Glo Luciferase (Promega). Al mismo tiempo, las células vivas se detectaron mediante un ensayo de tinción con CV. La actividad de ARE se calculó a partir de la actividad luciferasa por célula viva.

(5) Los MicroARN (miARN) y ARN de interferencia pequeños (ARNip)

miARN o ARNip (20 nmol/L) se transfectaron individualmente en células usando Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. Los ARN bicatenarios que imitan el miARN maduro humano (hsamiR-507 (PM 10509), hsa-miR-129-5p (PM10195), hsa-miR-450a (PM11192) y hsa-miR-634 (PM11538)) y el miARN de control (control negativo n.° 1) se obtuvieron de Ambion. El ARNip para NRF2 (siGENOME SMARTpool; M-003755-02-0005) y el ARNip para KEAP1 (siGENOME SMARTpool; M-012453-00-0005) se obtuvieron de Thermo Scientific Dharmacon.

(6) Ensayo de luciferasa convencional

Los plásmidos indicadores de luciferasa se prepararon insertando la región 3' sin traducir de NRF2, ME1, or NQO1 (UTR: SEQ ID NO: 49 a 51) en un sitio cadena abajo del gen de la luciferasa dentro del Vector de Expresión Diana de miARN pmirGlO Dual-Luciferase (Promega). Todas las mutaciones específicas de sitio se generaron utilizando el sistema de mutagénesis dirigida al sitio GeneTailor (Invitrogen) o el kit de mutagénesis KOD (TOYOBO). Los plásmidos indicadores de luciferasa y los plásmidos pTK que sirven como control interno se transfectaron conjuntamente en células HeLa y, al día siguiente, se transfectó el ARN bicatenario que imita el miARN maduro humano o el miARN de control. Después de 2 días, se midieron las actividades de luciferasa de luciérnaga y renilla usando el Sistema de Ensayo Indicador Dual-Luciferase (Promega), y se calculó la actividad luciferasa relativa normalizando la lectura de luciferasa de luciérnaga con su correspondiente control interno de luciferasa de renilla.

(7) Transferencia Western

Los lisados de células enteras se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare). Después de bloquear con TBS que contiene Tween 20 al 0,05 % y leche desnatada en polvo al 5 % durante 1 hora, cada membrana se hizo reaccionar con un anticuerpo durante la noche. Los factores de dilución de los anticuerpos primarios fueron los siguientes: anti-NRF2 de conejo (1/1.000), anti-KEAP1 de conejo (1/1.000), anti-ME1 de ratón (1/1.000) y anti-p-actina de ratón (1/5.000). La membrana se lavó y se expuso a anticuerpos anti-IgG de ratón o de conejo conjugados con HRP (ambos a 1/2.000) durante 2 horas. Los anticuerpos unidos se visualizaron con solución de tinción HRP o con un kit de transferencia Western ECL (Cell Signaling Technology) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

(8) RT-PCR cuantitativa

El ARN total se aisló usando un reactivo TRIzol (marca registrada) (Invitrogen) de acuerdo con procedimientos convencionales. El ADNc monocatenario obtenido a partir del ARN total se amplificó con un conjunto de cebadores específico para cada gen. Se realizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) utilizando el sistema KAPA SYBR (Kapa Biosystems) y un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de expresión génica se dan como relaciones (diferencias entre los valores Ct) entre los genes de interés y un control interno (GAPDH) o U6, y posteriormente se normalizan con el valor en las células de control (nivel de expresión relativo). Las tablas 3 y 4 proporcionan información sobre los cebadores y las sondas TaqMan empleados. En la Tabla 3, las SEQ ID NO 22 a 32 se asignaron a las secuencias de nucleótidos de la columna izquierda que muestran cebadores directos, secuencialmente hacia abajo desde la parte superior, y de la misma manera, las SEQ ID NO 33 a 43 se asignaron a las secuencias de nucleótidos de la columna derecha que muestran cebadores inversos. De manera similar en la Tabla 4, secuencialmente hacia abajo desde la parte superior, las SEQ ID NO 44 a 48 se asignaron a las secuencias de nucleótidos de las sondas TaqMan.

[Tabla 31

Gen Cebador directo de PCR Cebador inverso de PCR

NRF2

Exón2 ACCAT CAACAGT G G CAT AAT GTG G G CAAAG CTGGAACT CAAAT CCAG

KEAP1

Exón2 G CAAAT G GATT CT G CTT CACCT ACTT T CAAACT GTGGAGACT ACACCACCAT Exón3 CAT CACAAT GT ACGCGGTTCCT ATT A G G CACAGAAT CAAAG GT CACT GACT A Exón4 GAT GAACCT GTCT CTTT AAG GGGGAA G GAGAGAGAGAAG CTT GGACTCTAT CAGAA Exón5 GTGAGAAGGGAGAGGAGAGAGGAAAGGTCT TCCAG CTGGG CAACAGAGCGAGACCTT GTTT Exón6 AAGAGACT AAG GTTTT GCTATGTTGC AG CT GAAACT GAAG GAGAACT GTGTG NQO1 CATT CT GAAAG GCTG GTTT G GGCTGCTTGGAGCAAAATAC

HO1 GCTACCTGGGTGACCTGTCT GGG CAGAAT CTT G CACTTT G

GPX2 GGCTTTCATTGCCAAGTCCTTC CTATATGGCAACTTTAAGGAGGCGC TXNRD1 CTTTTT CATT CCTGCTACTCTACC CT CT CTCCTTTTCCCTTTTCC

GAPDH CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT AGCCTT CTCCAT GGTGGT GAAGAC

___________________________________ [Tabla 41_____

miARN___________ Secuencia Diana________________

hsa-miR-507 UUUUGCACCUUUUGGAGUGAA

hsa-miR-634 AACCAGCACCCCAACUUUGGAC

hsa-miR-450a UUUUGCGAUGUGUUCCUAAUAU

hsa-miR-129-5p CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC

(continuación)

miARN Secuencia Diana

RNU6B CGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAAGCGUUCCAUAUUUUU

Para los miARN, la PCR de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real rápido ABI Prism 7500 (Applied Biosystems), la mezcla Maestra para PCR Taqman Universal (Applied Biosystems), el kit de transcripción inversa Taqman (Applied Biosystems) y ensayos de microARN Taqman (Applied Biosystems), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de los genes de miARN se basaron en la cantidad del mensaje diana que se relaciona con el del transcrito de RNU6B que sirve como control para normalizar la entrada inicial de a Rn total.

(9) Inmunohistoquímica

Las muestras de tumor se fijaron con formaldehído al 10 % en PBS, se embebieron en parafina, se seccionaron en rodajas de 4 |jm de grosor y sometido a tinción inmunohistoquímica de NRF2 o ME1 con el método avidina-biotinaperoxidasa. Las secciones de las muestras de tumor embebidas en parafina se desparafinaron con xileno y se rehidrataron en etanol. Después de la recuperación de los antígenos hirviéndolos en tampón citrato 10 mM (pH 6,0), las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 0,3 % en metanol para inactivar la peroxidasa endógena. Posteriormente, las secciones se incubaron con un anticuerpo anti-NRF2 (dilución: 1/1.000) o anticuerpo anti-ME1 (dilución: 1/500) a 4 °C durante la noche. El anticuerpo unido se visualizó usando diaminobencidina (kit VECTASTAIN_Elute ABC, Vector Laboratories) que sirvió como cromógeno, y las secciones se contratiñeron ligeramente con hematoxilina.

(10) Análisis de mutaciones de NRF2 y KEAP1

Las regiones genómicas que contienen el exón 2 de NRF2 o todas las regiones codificantes de KEAP1 se amplificaron mediante PCR usando KOD-plus (TOYOBO). Los productos de PCR se purificaron usando ExoSAp-IT (GE Healthcare) y se sometieron a análisis de secuencia. La información sobre los cebadores se proporciona en la Tabla 3.

(11) Análisis de matriz de expresión y análisis de vía utilizando IPA

Para el análisis de matriz de expresión génica, se utilizó la matriz de expresión génica Agilent 4x44K (Agilent Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada experimento de matriz de genes se realizó por duplicado y los datos se analizaron utilizando GeneSpring (Agilent Technologies).

Los datos de expresión y los datos del programa TargetScan se sometieron a un análisis de vías de ingenio (IPA) (Ingenuity Systems).

(12) Ensayo de crecimiento tumoral in vivo y administración de miARN

Se adquirieron ratones atímicos hembra BALB/c de siete semanas de edad de Oriental Yeast Co., Ltd. y se mantuvieron en condiciones sin patógenos. 200 j l de PBS que contenían 1,0 x 107 células se inyectaron por vía subcutánea en el costado de los ratones. Se administró una mezcla de 1 nmol de ARN bicatenario (Ambion) y 200 j l de AteroGene (Koken) en el espacio entre el tumor y la piel. Los ratones se trataron con cisplatino a una dosis de 5 mg/kg de peso corporal mediante administración intraperitoneal. El día 35 después de la inyección de células, los ratones se sacrificaron y los tumores se resecaron. Todos los protocolos experimentales realizados sobre los ratones se aprobaron por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica y Dental de Tokio.

(13) Análisis estadístico

Las diferencias entre subgrupos se estudiaron mediante la prueba t de Student. Las variables clínico-patológicas de los correspondientes pacientes se analizaron por la prueba x2o prueba exacta de Fisher. Para el análisis de supervivencia, se construyeron curvas de Kaplan-Meier para grupos basándose en predictores univariados y se estudiaron las diferencias entre grupos mediante la prueba del orden logarítmico. Se analizaron los resultados de los experimentos in vivo y el ensayo de supervivencia celular en células A549 para determinar la significación estadística utilizando un ANOVA de dos vías (un análisis de varianza de dos vías). Un valor calculado de p< 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

2. Ejemplos

[Ejemplo 1] Exploración de miARN que regulan negativamente la actividad transcripcional de NRF2

Para identificar miARN que regula negativamente la actividad transcripcional de NRF2, se exploró una biblioteca de miARN utilizando el sistema indicador de luciferasa. El sistema permite medir la expresión del gen de luciferasa activando el ARE (elemento de respuesta antioxidante). Con este sistema de indicadores, se confirmó que la actividad de ARE cambiaba de acuerdo con el nivel de proteína NRF2 en las células HeLa (Fig. 1). La Fig. 1 muestra los resultados de validación del sistema indicador con ARE usando ARNip. Específicamente, las células Hela se transfectaron conjuntamente con un plásmido indicador ARE-luciferasa y un vector de control interno, y 24 horas después, se transfectaron con ARNip de control, o NRF2-ARNip (a) o KEAP1ARNip (b). Después de 48 horas de transfección con ARNip, el lisado celular se sometió a SDS-PAGE y se hizo inmunorreacionar con los anticuerpos indicados (panel superior). Por separado, se midió la actividad luciferasa de luciérnaga o renilla, y la actividad de ARE en relación con la de Simulado se muestra en el eje vertical (panel inferior). Las barras indican la desviación estándar (DE).

La Fig. 2-1 muestra los resultados de la exploración de miARN que regulan negativamente la actividad transcripcional de NRF2. La Fig.2-1 (a) muestra un método de exploración de una biblioteca de miARN utilizando un sistema indicador con ARE. Para la exploración de 470 ARN bicatenarios, las células HeLa se transfectaron secuencialmente con cada miARN junto con el plásmido indicador, y después se calculó la actividad de ARE en cada célula transfectada como la actividad luciferasa por célula viva, medida por el ensayo de tinción con cristal violeta (CV). Brevemente, el plásmido indicador ARE-luciferasa y cada miARN de la biblioteca se transfectaron secuencialmente en células HeLa, y después de 48 horas, se midió la actividad luciferasa o el número de células vivas utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Bright-GIo o el ensayo de tinción con cristal violeta (CV), respectivamente. Se calculó la actividad de ARE para cada célula transfectada con miARN como la actividad luciferasa por célula viva.

La Fig. 2-1 (b) muestra un sumario de los resultados de la actividad de ARE en células transfectadas con miARN. La actividad de ARE en relación con la de las células transfectadas con miARN de control se indica en el eje vertical. Este sistema de exploración identificó como candidatos ocho miARN con una relación relativa de 0,5 o menos. Además, este sistema de exploración identificó como candidatos ocho miARN con una relación relativa de 1,5 o menos.

La Fig. 2-1 (c) muestra los resultados de la validación de cuatro miARN candidatos mediante el ensayo de luciferasa. Las células HeLa se transfectaron conjuntamente con un plásmido indicador ARE-luciferasa y un vector de control interno, y después de 24 horas, se transfectó hsa-miR-507, -634, -450a, o -129-5p, o miARN de control. Después de 48 horas de transfección con miARN, se midió la actividad luciferasa de luciérnaga o renilla. La actividad de ARE en relación con la de las células transfectadas con miARN de control se indica en el eje vertical. Las barras indican la desviación estándar (DE).

La Fig. 2-1 (d) muestra los resultados del análisis de expresión del ARNm de NQO1 en células transfectadas con miARN. Las células HeLa se transfectaron con hsa-miR-507, -634, -450a, o -129-5p, o miARN de control. Después de 48 horas de transfección, el nivel de ARNm del gen NQO1 se midió mediante qRT-PCR. La expresión del gen GAPDH se utilizó como control interno. El nivel de expresión en relación con de las células transfectadas con miARN de control se indica en el eje vertical. Las barras indican la desviación estándar (DE).

La Fig. 2-2 muestra los resultados del análisis de expresión de genes diana de NRF2. Las células HeLa se transfectaron con ARNip (control, NRF2 o KEAP1) (a), o miARN (miARN de control, hsa-miR-507, -634, -450a o -129-5p) (b). Después de 48 horas de transfección, el nivel de expresión de ARNm de cuatro genes diana de NRF2, NQO1, GPX2 y TXNRD1, se midieron mediante qRT-PCR. La expresión del gen GAPDH se utilizó como control interno. El nivel de expresión en relación con el de las células transfectadas con ARNip de control o miARN de control se indica en el eje vertical. Las barras indican la desviación estándar (DE). Los resultados de la transferencia Western y los resultados de la expresión de NQO1 mostrados en (b) también se muestran en la Fig. 3. a y en la Fig. 2-1 (d).

Los presentes inventores se centraron en los cuatro miRNA principales (hsa-miR-507, -634, -450a y -129-5p) y de las Figs. 2-1 (c), 2-1 (d) d, y 2-2, se confirmó que su transfección en realidad reducía la actividad de ARE y también regulaba negativamente la actividad transcripcional de genes diana conocidos de NRF2 (NQO1, HO1, GPX2 y TXNRD1).

Estos resultados sugieren que el sistema de exploración de genes diana conocidos podría identificar con éxito al menos cuatro miARN candidatos que regulan negativamente la actividad transcripcional de NRF2. Además, tal como se muestra en la Fig. 2-1 (b), se confirmó que ocho miARN (hsa-miR-26a, has-miR-17-3p, hsa-miR-190, hsa-miR-567, hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-432 * y hsa-miR-29) tenían una relación relativa de actividad de ARE de 1,5 o más, en comparación con las células transfectadas con miARN de control.

[Ejemplo 2] Identificación de NRF2 como una diana funcional de los miARN candidatos

Para identificar la diana funcional de los cuatro miARN candidatos (hsa-miR-507, hsa-miR-634, hsa-miR-450a y hsamiR-129-5p), primero se investigó si los genes que se sabe están asociados con la vía de NRF2 existen entre las dianas predichas por el programa TargetScan (http://www.targetscan.org) utilizando el IPA (Ingenuity Systems Pathway Analysis, Redwood City, CA) (http://www.ingenity.com). Mediante este análisis in silico, los presentes inventores descubrieron inesperadamente, que los cuatro miARN candidatos podrían dirigirse funcionalmente al propio NRF2, porque las secuencias de base de tres miARN, excepto hsa-miR-450a, se mapearon dentro de la 3'UTR de NRF2 (2 sitios para hsa-miR-507, 1 sitio para hsa-miR-634 y 2 sitios para hsa-miR-129-5p) (Fig. 3 (b)). La Fig. 3 (b) muestra secuencias homólogas de las secuencias de base para cuatro miARN candidatos dentro de la 3'UTR de NRF2 y el diseño para plásmidos indicadores. Las secuencias de base para hsa-miR-507 (2 sitios), hsa-miR-634 (1 sitio) y hsa-miR-129-5p (2 sitios) se mapearon dentro de la 3'UTR de n RF2. Debido a que la secuencia de base para hsamiR-450a es altamente homóloga a la de hsa-miR-507 (6 de 7 secuencias de base), los sitios para la secuencia de base para hsa-miR-450a se indican en los mismos sitios que hsa-miR-507. En el ensayo de luciferasa se usaron la región 1 (R1), la región 2 (R2) o la R2 mutada. El símbolo en negro "x" muestra un sitio de mutación insertado para cada secuencia de base.

La secuencia de base para hsa-miR-450a era altamente homóloga a la de hsa-miR-507 (6 de 7 secuencias de base). De hecho, se demostró que el nivel de proteína NRF2 disminuyó notablemente en las células transfectadas con cada miARN, en comparación con las células transfectadas con miARN de control (Fig.3 (a)). La Fig. 3 (a) muestra los resultados del análisis de transferencia Western de la expresión de NRF2 en células transfectadas con miARN. Las células Hela se transfectaron con hsa-miR-507, -634, -450a, o -129-5p, o miARN de control. Después de 48 horas de transfección, La transferencia Western se realizó utilizando lisados celulares, seguida de inmunorreacción con los anticuerpos indicados.

Como se muestra en la Fig.4, la regulación negativa de NRF2 por sobreexpresión de los miARN mostrados en la Fig.3 (a) también se observó en líneas celulares de cáncer estabilizadas con NRF2, LK2 (NSCLC) que tenían una mutación de NRF2, A549 (NSCLC) que tenían una mutación de KEAP1 y JHH-5 (HCC) que tenían agregación de proteína p62. La Fig. 4 muestra los resultados del análisis de transferencia Western con respecto a la expresión de NRF2 en células transfectadas con miARN. Específicamente, se transfectó hsa-miR-507, -634, -450a, o -129-5p, o miARN de control en células LK2 (células de carcinoma de células escamosas de pulmón), células A549 (células de adenocarcinoma pulmonar) y células JHH-5 (células de carcinoma hepatocelular). Después de 48 horas de transfección, los lisados celulares se sometieron a SDS-PAGE, seguida de inmunorreacción con los anticuerpos indicados.

Por lo tanto, para examinar si cada miARN podría unirse directamente a la 3'-UTR de NRF2, se realizaron ensayos de luciferasa utilizando vectores de plásmido indicador que tenían cada uno de dos fragmentos de la 3'-UTR, Región-1 (R1) y Región-2 (R2), o cinco mutantes diferentes de R2 (Fig. 3 (b)).

La Fig. 3 (c) muestra los resultados de los ensayos de luciferasa usando plásmidos indicadores que tienen regiones mostradas en la Fig. 3 (b). Las células HeLa se transfectaron conjuntamente con un plásmido indicador y un vector de control interno, y después de 24 horas, se transfectó hsa-miR-507, -634, -450a, o -129-5p, o miARN de control. Después de 48 horas de transfección con miARN, se midió la actividad luciferasa de luciérnaga o renilla. La actividad luciferasa en relación con la de las células transfectadas con miARN de control se indica en el eje vertical. Los segmentos de la línea horizontal debajo de los gráficos indican plásmidos mutantes relevantes en las células transfectadas con miARN. Las barras indican la desviación estándar (De). Como se muestra en la Fig. 3 (c), la actividad luciferasa para el vector R2 se redujo significativamente en comparación con la de los vectores vacío y R1 en las células transfectadas con cada miARN, y se restauró completamente con vectores que tenían mutaciones dentro de las secuencias de base de R2.

La Fig. 3 (d) muestra los resultados de la investigación sobre el efecto de la transfección de miARN sobre la supervivencia celular bajo estrés celular causado por cisplatino (CDDP) (izquierda) o estrés oxidativo (peróxido de hidrógeno) (derecha). Las células Hela se transfectaron con hsa-miR-507, -634, -450a, o -129-5p, o miARN de control, y al día siguiente, se trataron con cisplatino (15 |jM) durante 24 horas, o con peróxido de hidrógeno (100 |jM) durante 12 horas. El lisado celular se sometió a SDS-PAGE y se hizo inmunorreaccionar con los anticuerpos indicados. La expresión de NRF2 se examinó mediante transferencia Western (panel superior). Las células no tratadas para las células con miARN de control y transfectadas con miARN se evaluaron mediante el ensayo de tinción con cristal violeta (panel inferior). Las barras indican la desviación estándar (DE). De la Fig. 3 (d), se entiende que la transfección de cada miARN no solo inhibió la expresión de la proteína n RF2 sino que también aumentó significativamente la sensibilidad al tratamiento con cisplatino o la exposición al peróxido de hidrógeno.

Los resultados descritos anteriormente del Ejemplo 2 sugieren que los cuatro miARN candidatos pueden dirigirse funcionalmente a NRF2 uniéndose directamente a su 3'-UTR, conduciendo a la inhibición de la supervivencia de las células cancerosas mediada por NRF2 a pesar de un estrés celular elevado.

[Ejemplo 3] Importancia clínica de la regulación negativa de los cuatro miARN para el carcinoma primario de células escamosas de esófago (ESCC)

Se examinó el nivel de cada miARN mediante análisis de qRT-PCR en 30 muestras de pacientes con carcinoma primario de células escamosas de esófago. La Fig. 5 muestra la asociación entre la importancia clínica y la regulación negativa de miARN en muestras de tumores primarios de carcinoma de esófago (carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC)).

La Fig. 5-1 (a) resume los resultados del análisis de expresión de cuatro miARN (hsa-miR-507, -634, -450a y -129-5p) y el análisis de mutaciones del gen NRF2 o KEAP1 en 30 muestras de tumores primarios. Los cuadrados rellenos indican la presencia de una mutación en el gen NRF2 o KEAP1, o la regulación negativa del miARN en cada caso. El número de aberraciones en cada caso se mostró como la puntuación aberrante (0 a 4), y se asignaron 30 casos en dos grupos según la "puntuación de aberración"; un grupo de puntuación alta (n = 14; la puntuación de aberración varía de 2 a 4) y un grupo de puntuación baja (n = 16; la puntuación de aberración es 0 o 1). La Fig. 5 (b) muestra las curvas de Kaplan-Meier para las tasas de supervivencia global de los 30 pacientes con ESCC de acuerdo con la puntuación aberrante. Se encontró que el grupo de puntuación alta se asoció significativamente con una peor tasa de supervivencia (p = 0,004, prueba del orden logarítmico). La Fig. 5 (c) muestra imágenes representativas de la inmunotinción de la proteína NRF2 en ESCC primaria del grupo de puntuación alta (Caso-1, Caso-4 y Caso-7) (panel superior) y el grupo de puntuación baja (Caso-21, Caso-25 y Caso-26) (panel inferior). Las barras negras sólidas son barras de escala, indicando cada una 100 |jm.

La Fig. 5-2 muestra los resultados del análisis de mutaciones de los genes NRF2 y KEAP1 en muestras de tumores primarios originados en el carcinoma de esófago (carcinoma de células escamosas de esófago: ESCC). Entre las muestras de tumores, 5 muestras mostraron mutaciones por sustitución de aminoácidos en NRF2 o KEAP1, y esas mutaciones se muestran en perfiles de cromatografía de secuencia. Las tres primeras muestras mostraron mutaciones en el gen NRF2 ("a"), mientras que las dos muestras inferiores mostraron mutaciones en el gen KEAP1 ("b"). Las flechas en la parte superior muestran secuencias de tipo silvestre en el tejido normal correspondiente, y las de la parte inferior muestran la secuencia de mutación y cambios en la secuencia de aminoácidos en muestras de tejido tumoral primario. Además, el término que se muestra en la parte inferior, por ejemplo, "D77G" significa una mutación en la que el 77° D (ácido aspártico) codificado por el gen NRF2 en la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre está sustituido por G (glicina) (se aplican reglas similares a otros términos). Ejemplos de códigos de una letra para otros aminoácidos son "R: arginina", "Q: glutamina", "L: leucina" y "M: metionina". Aunque se conocen las secuencias de nucleótidos de ADN de los genes NRF2 y KEAP1, estos se muestran como SEQ ID NO: 17 (NRF2: Secuencia de Referencia del NCBI: NM_006164.4) y SEQ ID NO: 18 (KEAP1: Secuencia de Referencia del NCBI: NM_012289.3).

En los análisis anteriores, se observó una reducción del 50% o más en el nivel de miARN en el tejido tumoral primario, en comparación con el tejido no canceroso correspondiente, en nueve casos (30,0 %) para hsa-miR-507, 12 casos (40,0 %) para hsa-miR-634, 2 casos (6,7 %) para hsa-miR-450a y 18 casos (60,0 %) para hsa-miR-129-5p (Fig. 5-1 (a)). Además, a través del análisis de mutaciones, se encontró una mutación sin sentido de NRF2 en 3 casos (10 %) y la de KEAP1 en 2 casos (6,7 %) (Figs. 5-1 (a) y 5-2). Basándose en una "puntuación de aberración", que es un índice que indica el número correspondiente a los casos de disminución de los cuatro niveles de miR anteriores y mutación sin sentido en los dos genes, se estudió NRF2 o KEAP1 y/o la regulación negativa de cada miARN, y se asignaron 30 casos en dos grupos; 14 casos de ESCC primarios con una puntuación de aberración de 2 a 4 a un "grupo de puntuación alta", y 16 casos de ESCC primarios con una puntuación de aberración de 0 o 1 a un "grupo de puntuación baja" (Fig. 5-1 (a)). De manera importante, el "grupo de puntuación alta" se correlacionó significativamente con la metástasis a distancia (categorías pM, p = 0,0394, Tabla 5), y se asoció con una peor tasa de supervivencia como lo muestran las estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier (prueba del orden logarítmico: p = 0,004) (Fig. 5-1 (b)).

ITabla 51

Puntuación de aberración

n Grupo de puntuación baja Grupo de puntuación alta 2, Valor pa 0 o 1 3 o 4

Total 30 16 14

Sexo P=0,4850 Masculino 28 14 14

Femenino 2 2 0

Edad (años)

mediana 64,5 P=0,9804 65 < 16 9 7

65> 14 7 7

Grado histopatológico P=0,5229 Bueno/Moderadamente 21 12 9

Malo 9 4 5

pT P=0,9197 pT 1 1 1 0

pT2/3 23 11 12

pT4 6 4 2

pN P=0,8175 pN0 7 4 3

pN1 23 12 11

categoría pM P = 0,0394 pM0 22 14 8

pM1a/1b 8 2 6

etapa p P=0,3940 I/II A/II B 8 4 2

III 18 10 6

IVA/IVB 8 2 6

___________________________________________(continuación)___________________________________________

______________ Puntuación de aberración______________

n Grupo de puntuación baja Grupo de puntuación alta 2, Valor pa ___________________________________________ 0_oJ____________________ 3 o 4_________________________ * en la Tabla 5, las letras en negrita indican "significación estadística". Se utilizó la prueba de chi cuadrado o la prueba exacta de Fisher para analizar los datos, y un valor de p <0,05 en la prueba de dos colas se consideró estadísticamente significativo.________________________________________________________________________

El análisis inmunohistoquímico de muestras primarias de ESCC, que se seleccionaron al azar, mostró que los niveles de proteína NRF2 eran marcadamente más altos en el "grupo de puntuación alta" que en el "grupo de puntuación baja" (Fig. 5-1 (c)). Estos hallazgos sugieren que la regulación negativa de la expresión de estos miARN, además de la mutación de NRF2 o KEAP1, contribuye a la estabilización de NRF2 en tumores primarios de ESCC. Asimismo, mediante el uso del aumento en la "puntuación de aberración" como índice, los tumores estabilizados con NRF2 pueden aclararse y diferenciarse la malignidad de los tumores o el pronóstico de los pacientes con cáncer.

Las 30 muestras se sometieron a amplificación génica mediante PCR utilizando sus ADN extraídos como plantillas y cebadores mostrados en la Tabla 3. Las secuencias de los productos de PCR se determinaron mediante el método de Sanger. La Fig. 5-2 muestra gráficos de resultados de cromatografía de secuencia. Como se muestra en la Fig. 5­ 2, con respecto al gen NRF2, en un total de tres casos, se detectaron mutaciones génicas del tipo de ganancia de función con sustituciones de aminoácidos (D77G; 1 caso, D29G; 2 casos). Además, con respecto a KEAP1, en un total de dos casos, se detectaron mutaciones génicas con sustituciones conocidas de aminoácidos, en donde una era una mutación génica conocida del tipo de pérdida de función (R320Q), y en el caso 4 con una puntuación de aberración de 3, se detectó una nueva mutación génica (L276M).

[Ejemplo 4] Efectos supresores de tumores in vivo por la administración de hsa-miR-507

Debido a que un miARN puede dirigirse a múltiples genes que contribuyen a una vía oncogénica, el miARN puede ser eficaz contra tumores con esta vía oncogénica. Los presentes inventores se centraron en hsa-miR-507 entre los cuatro miARN identificados y, utilizando matrices de expresión y análisis de vías, se examinó si puede dirigirse funcionalmente a genes regulados transcripcionalmente por NRF2. En estos análisis, se encontraron ocho genes diana transcripcionales de NRF2 reprimidos por la transfección de hsa-miR-507, y entre ellos, se confirmó que ME1 es una diana directa para hsa-miR-507 mediante la unión a la 3'-UTR de NRF2 (Fig. 6). La Fig. 6 muestra los resultados de la identificación de genes diana transcripcionales de NRF2 que sirven como diana de hsa-miR-507. La Fig. 6 (a) muestra los resultados de la validación de genes diana transcripcionales de NRF2 regulados negativamente por hsamiR-507. Esto muestra que entre los genes cuya expresión está regulada negativamente a través de la transfección de hsa-miR 507 o NRF2-ARNip, el programa TargetScan ha predicho 181 genes como dianas de hsa-miR-507. La Fig. 6 (b) muestra que mediante el uso de IPA, entre 181 genes, se han predicho ocho dianas transcripcionales de NRF2 (ME1, PSMB6, SLC7A11, MGLL, DNAJB5, LGALS8, B4GALNT1, EIF4G2) como las dianas de hsa-miR-507. La Fig. 6 (c) muestra el mapeo de las secuencias de base para hsa-miR-507 en la 3'-UTR de ME1 y el diseño para plásmidos indicadores. Muestra los resultados del examen sobre si hsa-miR-507 puede unirse directamente a la 3'-UTR de ME1 mediante el uso de un análisis de luciferasa. La secuencia de base para hsa-miR-507 está mapeada dentro de la 3'UTR de ME1. En el ensayo de luciferasa, se utilizaron plásmidos indicadores que tienen la región genómica de una secuencia de base para hsa-miR-507 (tipo silvestre; WT, por sus siglas en inglés) o su mutante. Las cruces negras indican sitios de mutación. La Fig. 6 (d) muestra los resultados del ensayo de luciferasa usando los plásmidos indicadores. Las células HeLa se transfectaron conjuntamente con un plásmido indicador y un vector de control interno, y después de 24 horas, se transfectó hsa-miR-507 o miARN de control. Después de 48 horas de transfección con miARN, se midió la actividad luciferasa de luciérnaga o renilla. La actividad luciferasa en relación con la de las células transfectadas con miARN de control se indica en el eje vertical. La actividad luciferasa para el vector que tiene la región WT fue más débil que la del vector vacío, pero se restauró por completo insertando una mutación dentro de la secuencia de base. Las barras indican la desviación estándar (DE). La Fig. 6 (e) muestra los resultados del análisis de transferencia Western de la expresión de ME1 en células transfectadas con miARN. Las células Hela se transfectaron con hsa-miR-507 o miARN de control. Después de 48 horas de transfección, el lisado celular se sometió a SDS-PAGE, seguida de inmunorreacción con los anticuerpos indicados, para confirmar, de este modo, que la transfección con hsa-miR-507 reduce realmente el nivel de expresión de la proteína ME1.

Estos resultados en la Fig. 6 sugieren que hsa-miR-507 puede inhibir la vía oncogénica mediada por NRF2 dirigiéndose directamente tanto a NRF2 como a su gen o genes diana.

A continuación, se examinó el efecto supresor de tumores in vivo de la administración de ARN bicatenario que imita hsa-miR-507 o miARN control en espacios subcutáneos que rodean tumores formados por células A549. La Fig. 7 muestra el análisis de expresión de 4 miARN y el efecto de la transfección con hsa-miR-507 sobre la supervivencia de las células A549 bajo estrés celular inducido por el tratamiento con cisplatino (CDDP) en células A549.

Asimismo, se examinó el efecto supresor de tumores in vivo de la administración de ARN bicatenario que imita hsamiR-507 o miARN control en espacios subcutáneos que rodean tumores formados por células A549. Singh et al. informaron de que el tratamiento combinado con carboplatino y ARNip específico de NRF2 era eficaz para inhibir el crecimiento de tumores formados a partir de células A549, y esta línea celular se asignó al "grupo de puntuación alta" con la mutación de KEAP1 y la regulación negativa de tres miRNA; es decir, hsa-miR-507, hsa-miR-634 y hsa-miR-129-5p, excepto por hsa-miR450a (Fig. 7 (a)). La Fig. 7 (a) muestra los resultados del análisis de expresión, por qRT-PCR, de los cuatro miARN; es decir, hsa-miR-507, -634, -450a y -129-5p. El nivel de expresión de RNU6B se utilizó como control interno. El nivel de expresión en las células A549 en relación con la del tejido pulmonar normal se indica en el eje vertical. Las barras indican la desviación estándar (DE).

Asimismo, se demostró que la sobreexpresión exógena de hsa-miR-507 inhibió levemente el crecimiento celular y aumentó la sensibilidad al estrés celular causado por cisplatino in vivo (Figs. 7 (b) y 7 (c)). La Fig. 7 (b) muestra los resultados del análisis de crecimiento celular en células A549 transfectadas con hsa-miR-507. Se transfectaron células A549 con hsa-miR-507 o miARN de control, y en los días indicados, se midió el número de células vivas mediante un ensayo de tinción con CV. El eje vertical muestra la tasa de crecimiento celular relativa. Las barras indican la desviación estándar (DE). Las diferencias significativas se analizaron mediante la prueba t de Student. Los resultados fueron los siguientes: *p = 0,0172 (día 2), p = 0,0293 (día 4) y p = 0,0067 (día 6). La Fig. 7 (c) muestra el efecto de la transfección con hsa-miR-507 sobre la supervivencia de las células A549 bajo estrés celular causado por cisplatino (CDDP) en las células. Específicamente, las células A549 se transfectaron con hsa-miR-507 o miARN de control y, al día siguiente, se trataron con PBS o cisplatino (2 |jM) durante 48 horas. La tasa de supervivencia celular en relación con la de las células no tratadas para las células control-miRNA- o miRNA-transfectadas se evaluó mediante tinción CV. Las barras indican la desviación estándar (DE). Las diferencias significativas se analizaron mediante ANOVA bidireccional (análisis de varianza de dos factores). Los resultados fueron los siguientes: *p = 0,0002 (entre miARN control y hsamiR-507), p = 0,1844 (entre PBS y CDDP). La interacción (hsa-miR-507 * c Dd P) fue p = 0,0049. FmiR-507= 43,2006, Fcddp= 11,2564, Fm¡R-507*CDDP= 14,7665.

La Fig. 8 muestra el efecto supresor de tumores in vivo de hsa-miR-507. La Fig. 8 (a) muestra el programa experimental para el tratamiento combinado con hsa-miR-507 y cisplatino (CDDP). Los tumores se formaron mediante inyección subcutánea de células A549 en ratones atímicos. Se administró miARN de control o hsa-miR-507 alrededor de tumores que se formaron a partir de células A549 debajo de la piel un total de cuatro veces (7, 14, 21 y 28 días después de la inyección de células A549). Además, los ratones se trataron con PBS o cisplatino mediante administración intraperitoneal al día siguiente un total de tres veces (8, 15 y 22 días después de la inyección de células A549). 35 días después de la inyección de células A549, los ratones se sacrificaron y los tumores se resecaron. El peso del tumor se redujo significativamente mediante el uso suplementario de PBS y cisplatino en combinación con hsa-miR-507 (Figs. 8 (b) y 8 (c)). La Fig. 8 (b) muestra imágenes representativas de ratones portadores de tumores (izquierda) y los tumores resecados (derecha) 35 días después de la inyección de células A549. En la imagen del ratón del lado izquierdo, las letras de contorno "miR-507" (dos apariciones) indican "hsa-miR-507". La Fig. 8 (c) muestra el peso de los tumores resecados. Los ratones se sacrificaron 35 días después de la inyección de células A549 y se midió el peso de cada muestra de tumor resecado. El gráfico indica "promedio ± DE" en 4 ratones tratados con PBS o 3 ratones tratados con cisplatino. Las diferencias significativas se analizaron mediante ANOVA bidireccional (análisis de varianza de dos factores). p = 0,0486 entre el grupo de miARN control y el grupo con hsa-miR-507. p = 0,5716 entre el grupo con PBS y el grupo con cisplatino. La interacción (hsa-miR507 x CDDP) fue p = 0,8757. Fm¡R-507= 170,667, Fcddp= 1304444, y Fm¡R-507*cDDP= 0,026601.

Además, la expresión potenciada de hsa-miR-507 junto con la expresión regulada negativamente de la proteína NRF2 y ME1 se confirmó en tumores tratados con hsa-miR-507 (Figs. 8 (d) y 8 (e)). La Fig. 8 (d) muestra el análisis de expresión de hsa-miR-507 en los tumores resecados. El nivel de expresión de ARNm de hsa-miR-507 se midió mediante qRT-PCR. La expresión de RNU6B se utilizó como control interno. El nivel de expresión en relación con el del tumor de ratón al que se administró miARN de control en ratones tratados con PBS se indica en el eje vertical. Las barras indican la desviación estándar (DE). La Fig. 8 (e) muestra imágenes representativas obtenidas de la inmunotinción de NRF2 y ME1 en las muestras de tumores resecados. Cada barra de escala representa 100 jm .

Por lo tanto, estos resultados sugieren que hsa-miR-507 puede inhibir el crecimiento tumoral al dirigirse a la vía oncogénica mediada por NRF2. Los hallazgos descritos anteriormente muestran la utilidad del diagnóstico molecular basado en miARN y su eficacia terapéutica en tumores estabilizados con NRF2.

Además, los hallazgos de los presentes inventores revelan que la administración combinada de hsa-miR-507 y cisplatino proporciona un efecto anticanceroso sinérgico. Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente terapéutico contra el cáncer que es una combinación de un agente terapéutico contra el cáncer que consiste en un ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de hsa-miR-507 (SEQ ID NO: 1) y un agente de platino tal como cisplatino. No se impone ninguna limitación particular sobre el modo de combinación de un agente terapéutico contra el cáncer que consiste en un ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de hsa-miR-507 (SEQ ID NO: 1) y un agente de platino tal como cisplatino. Es decir, ambos pueden estar contenidos en una sola composición, o los dos pueden administrarse de manera individual y por separado. Como se describe anteriormente, uno de los dos puede administrarse antes que el otro y viceversa. Como alternativa, los dos agentes pueden administrarse al mismo tiempo. Los modos de administración del agente terapéutico contra el cáncer que consiste en un ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de hsa-miR-507 (SEQ ID NO: 1) ya se describen en el presente documento anteriormente. Para la administración de cisplatino, por ejemplo, se pueden emplear modos conocidos. Específicamente, se administra cisplatino a un adulto en una dosis de 70 a 80 mg/m2 (área de superficie corporal) por día, por un período de administración de 2 a 5 meses, durante el cual la administración se realiza una vez al día o más bajo un régimen preestablecido de frecuencia de administración (aproximadamente entre una vez a la semana y cada 4 semanas) generalmente a través de infusión por goteo.

[Ejemplo 5] Efecto antitumoral obtenido por la administración de hsa-miR-634

(1) Efecto inductor de apoptosis in vitro en tumores mediante la administración de hsa-miR-634 (1) (Fig. 9)

La Fig. 9 muestra los resultados del estudio de los presentes inventores in vitro sobre el efecto inductor de apoptosis de hsa-miR-634 sobre células tumorales. Para examinar el efecto supresor de tumores in vitro de hsa-miR-634, se transfectó ARN bicatenario que imitaba hsa-miR-634 o miARN de control en células Hela, una línea celular de carcinoma de cuello de útero, a través del método de lipofección, seguido de incubación durante 3 días. Después de 1,2 y 3 días de transfección, las células se sometieron a tinción con solución de PBS que contenía cristal violeta al 1 % durante 1 minuto, se lavaron con agua y después se dejaron reaccionar en un tampón de PBS que contenía SDS al 2 % durante 1 hora. Posteriormente, se midió la intensidad de la tinción con un lector de placas múltiples, para cuantificar las células vivas. Como resultado, en células en las que se expresó hsa-miR-634, se confirmó una inhibición significativa del crecimiento celular y la inducción de apoptosis. La Fig. 9 (A) muestra imágenes microscópicas tomadas 2 días después de la transfección. Brevemente, las células HeLa se transfectaron con hsa-miR-634 y después se incubaron en una atmósfera de CO2 al 5 % a 37 °C durante 48 horas. En las micrografías se observan cambios morfológicos de las células después de la incubación. Las imágenes superiores son de células transfectadas con miR de control, y las inferiores son de células transfectadas con hsa-miR-634. Las imágenes del lado derecho son imágenes ampliadas de las imágenes de la izquierda. La Fig. 9 (B) muestra los resultados del efecto inhibidor del crecimiento celular a lo largo del tiempo. Específicamente, la Fig. 9 (B) muestra el crecimiento celular confirmado, después de 1, 2 y 3 días en incubación descrita en relación con la Fig. 9 (A), mediante el uso de la intensidad de fluorescencia mediante tinción con CV como índice. Los resultados son de células de células transfectadas simuladas, células transfectadas con miR de control y células transfectadas con miR-634.

Después de 2 días de transfección, las células se recuperaron por centrifugación y las células sedimentadas se fijaron con PBS que contenía etanol al 70 % a 4 °C durante 30 minutos, seguido de tratamiento con RNasa. Las células resultantes se tiñeron con solución de PI (1 |jg/ml). El análisis FACS se realizó usando un citómetro de flujo (Fig. 9 (C)). El gráfico de la izquierda muestra la distribución de las células transfectadas con miR de control, y el gráfico de la derecha muestra la de las células transfectadas con hsa-miR-634. Estos gráficos revelan que en las células transfectadas con hsa-miR-634, las células en la fase SubG1 (pico G1), lo que indica un aumento notable de la apoptosis.

Lo anterior demuestra que la transfección de hsa-miR-634 en células tumorales puede inducir muerte celular mediada por apoptosis, demostrando un claro efecto inhibidor de tumores. Este resultado confirma el destacado efecto terapéutico contra el cáncer del agente terapéutico contra el cáncer de la presente invención.

(2) Efecto inductor de apoptosis in vitro en tumores mediante la administración de hsa-miR-634 y cisplatino (2) (Fig. 10)

Las células de la línea celular de carcinoma de esófago KYSE170 se transfectaron con ARN bicatenario que imita a hsa-miR-634 o miARN de control mediante el método de lipofección. En la parte superior de la Fig. 10 se muestra el programa de ensayo in vitro para la administración combinada de hsa-miR-634 y cisplatino (CDDP). Como se muestra en el programa, la cantidad aditiva de ARN bicatenario que imita a hsa-miR-634 o miARN de control fue 0,2 nM. Los grupos de adición de cisplatino 2,5 jM y los grupos de adición de cisplatino 5,0 jM se sometieron a incubación durante 72 horas. El efecto inductor de la apoptosis se evaluó mediante la aparición (%) de apoptosis en relación con el número de todas las células, en donde las células muertas se contaron mediante tinción con azul tripán. El gráfico en la parte inferior de la Fig. 10 muestra los resultados. El eje vertical muestra la aparición de muerte celular mencionada anteriormente. De manera destacable, en células a las que se les administró hsa-miR-634 y cisplatino simultáneamente, la apoptosis se indujo con alta incidencia. Por lo tanto, puede obtenerse un efecto anticanceroso sinérgico mediante la administración conjunta del agente terapéutico de acuerdo con la presente invención y cisplatino.

(3) Efecto inductor de apoptosis in vivo en tumores mediante la administración de hsa-miR-634 y cisplatino (Fig. 11)

Se realizó un estudio in vivo para evaluar la administración conjunta de hsa-miR-634 y cisplatino utilizando ratones atímicos portadores de tumores, en donde los tumores se formaron por inyección subcutánea de células KYSE170. En la parte superior de la Fig. 11 se muestra el programa de prueba in vivo para el tratamiento combinado con ARN bicatenario que imita a hsa-miR-634 o miARN de control, y cisplatino (CDDP). El período de incubación para la formación de tumores fue de 7 días. El día 7 de incubación, se administró miARN de control o hsa-miR-634 mediante inyección alrededor de tumores formados subcutáneamente a partir de células KYSE170 un total de cinco veces. A cada ratón se le administró PBS o cisplatino por vía intraperitoneal en la primera y cuarta administraciones de miARN, simultáneamente con la administración de miARN (es decir, dos veces en total). Después de 21 días de inyección de células KYSE170, los ratones se sacrificaron y los tumores se resecaron. El gráfico de la parte inferior de la Fig. 11 muestra el peso de los tumores resecados (eje vertical). El gráfico muestra el "promedio ± DE" del peso de los tumores en 7 ratones tratados con PBS y 8 ratones tratados con cisplatino. Un análisis de la prueba t revela una diferencia significativa entre los siguientes dos grupos: p = 0,0182 entre el grupo con miARN de control y el grupo de administración de hsa-miR-634 en ratones tratados con cisplatino, y p = 0,00813 entre PBS y cisplatino en ratones a los que se administró hsa-miR-634.

(4) Efecto inhibidor de la expresión de hsa-miR-634 en un gen diana en células de osteosarcoma

La Fig. 12 (Figs. 12-1 a 12-4) muestra el efecto inhibidor de la expresión de la transfección de hsa-miR-634 en un gen diana en células de osteosarcoma U2OS. Los resultados del ensayo de luciferasa mostrados en los gráficos de la izquierda en las Figs. 12-1 a 12-4 se obtuvieron a partir de los procedimientos de "ensayo de luciferasa convencional" anteriormente mencionados. Es decir, se prepararon plásmidos indicadores de luciferasa para usar en varios ensayos insertando la 3'-UTR de cada gen diana cadena abajo del gen de luciferasa dentro del Vector de Expresión Diana de miARN pmirGlO Dual-Luciferase (Promega). Los genes diana son (a) XIAP (inhibidor de la proteína de apoptosis ligado al cromosoma X: Fig. 12-1), (b) APIP (proteína que interactúa con APAF1: Fig. 12-2), (c) OPA1 (atrofia óptica 1: Fig. 12-3) y (d) TFAM (factor de transcripción A, mitocondrial: Fig. 12-4). Las secuencias de base de UTR de genes que codifican estas cuatro proteínas se muestran en la SEQ ID NO: 52 (XIAP), 53 (APIP), 54 (OPA1) y 55 (TFAM) en el listado de secuencias. Todas las mutaciones específicas del sitio se detectaron utilizando un kit de mutagénesis KOD (TOYOBO). En los gráficos, "mt" indica plásmido introducido por mutación (mutante: mt).

Los plásmidos indicadores de luciferasa, o plásmidos introducidos por mutación (mt), y plásmidos pTK como control interno se transfectaron conjuntamente en células U2OS, y al día siguiente, se transfectó el ARN bicatenario que imita hsa-miR-634 o el miARN de control. Después de 2 días, se midieron las actividades de luciferasa de luciérnaga y renilla usando el Sistema de Ensayo Indicador DUal-Luciferase (Promega), y se calculó la actividad luciferasa relativa normalizando la lectura de luciferasa de luciérnaga con su correspondiente control interno de luciferasa de renilla.

Los resultados del ensayo de luciferasa anterior sugieren que, a través de la unión directa de hsa-miR-634 a la secuencia de base 3'UTR de cada uno de los genes diana mencionados anteriormente en las células tumorales, hsamiR-634 puede inhibir la expresión de los genes. Además, se ha aclarado que, debido a que una expresión potenciada de los genes diana agrava la malignidad de las células cancerosas, el uso de la expresión de esos genes como índice para realizar el método de la presente invención puede potenciar aún más la fiabilidad del ensayo de medición.

En el lado derecho de cada una de las Figs. 12-1 a 12-4, se muestran los resultados de la electroforesis. Para la transferencia Western, se transfectaron células de osteosarcoma U2OS con ARN bicatenario que imita a hsa-miR-634 2 nM o 20 nM o miARN de control mediante el método de lipofección. Cada uno de los lisados de las células completas así preparadas se sometió a SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (GE Healthcare). Después de bloquear con TBS que contiene Tween 20 al 0,05 % y leche desnatada en polvo al 5 % durante 1 hora, cada membrana se hizo reaccionar con un anticuerpo durante la noche. Los factores de dilución de los anticuerpos primarios fueron los siguientes: anti-XIAP de conejo (1/1.000), anti-APIP de conejo (1/1.000), anti-OPAl de conejo (1/1.000), anti-TFAM de conejo (1/1.000) y anti-p-actina de ratón (1/5.000). La membrana se lavó y se expuso a anticuerpos anti-IgG de ratón o de conejo conjugados con HRP (ambos a 1/2.000) durante 2 horas. Los anticuerpos unidos se visualizaron con solución de tinción HRP o con un kit de transferencia Western ECL (Cell Signaling Technology) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados de la transferencia Western muestran que cuando las células tumorales se transfectan con hsa-miR-634, el nivel de expresión de proteínas de cada gen diana disminuye.

Por lo tanto, los resultados del ensayo de luciferasa y la transferencia Western descritos en el presente documento muestran un efecto excelente de hsa-miR-634 como agente terapéutico contra el cáncer y, en particular, muestran que hsa-miR-634 es útil no solo contra las células cancerosas en las que la expresión génica de NRF2 está elevada o estabilizada, sino también contra aquellas células en las que la expresión génica de XIAP, APIP, OPA1 o TFAM está elevada o estabilizada.

Por otra parte, los hallazgos de los presentes inventores revelan que la administración combinada de hsa-miR-634 y cisplatino proporciona un efecto anticanceroso sinérgico. Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente terapéutico contra el cáncer que es una combinación de un agente terapéutico contra el cáncer que consiste en un ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de hsa-miR-634 (SEQ ID NO: 2) y un agente de platino tal como cisplatino. No se impone ninguna limitación particular sobre el modo de combinación de un agente terapéutico contra el cáncer que consiste en un ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de hsa-miR-634 (SEQ ID NO: 2) y un agente de platino tal como cisplatino. Es decir, ambos pueden estar contenidos en una sola composición, o los dos pueden administrarse de manera individual y por separado. Como se describe anteriormente, uno de los dos puede administrarse antes que el otro y viceversa. Como alternativa, los dos agentes pueden administrarse al mismo tiempo. Los modos de administración del agente terapéutico contra el cáncer que consiste en un ácido nucleico que incluye la secuencia de nucleótidos de hsa-miR-634 (SEQ ID NO: 2) ya se describen en el presente documento anteriormente. Para la administración de cisplatino, por ejemplo, se pueden emplear modos conocidos. Los modos de administración ya se describen anteriormente en el presente documento. Para la administración de cisplatino, por ejemplo, se pueden emplear modos conocidos. Específicamente, se administra cisplatino a un adulto en una dosis de

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un agente terapéutico que contiene un ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos de hsa-miR-634 (SEQ ID NO: 2) para su uso en el tratamiento de cáncer en el que NRF2 está estabilizado.

2. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que se usa en combinación con medios para impartir estrés a las células cancerosas, donde dichos medios para impartir estrés a las células cancerosas se seleccionan del grupo que consiste en un agente anticanceroso, radioterapia contra el cáncer, cirugía o biopsia.

3. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el cáncer es cáncer de esófago, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer oral, cáncer de estómago, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de útero o cáncer de piel.

4. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el cáncer es cáncer de esófago o cáncer de piel.

5. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en donde el cáncer es cáncer de esófago.

6. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende cisplatino.

7. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ácido nucleico es un ARN bicatenario, un complejo de ARN-ADN de doble cadena, un complejo de ARN-APN de doble cadena o complejo de ARN-LNA de doble cadena.

8. El agente terapéutico para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ácido nucleico es un ARN bicatenario.