JPWO2014126233A1

JPWO2014126233A1 - マイクロｒｎａの測定方法、並びに、がん治療剤及びこれを含有するがん治療のための医薬組成物

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Publication number: JPWO2014126233A1
Application number: JP2015500326A
Authority: JP
Inventors: 稲澤　譲治; 譲治稲澤; 井上　純; 純井上; 信祐山本; 辰幸河野; 健一小崎
Original assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2013-02-15
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2017-02-02
Anticipated expiration: 2034-02-17
Also published as: JP6587142B2; EP2963125B1; WO2014126233A1; EP2963125A4; US20160053257A1; JP6745071B2; DK2963125T3; US10876115B2; ES2828510T3; US9994843B2; US20190367915A1; EP2963125A1; JP2018143248A

Abstract

腫瘍におけるＮＲＦ２の安定化に強く関係するマイクロＲＮＡを見出し、それらをがんの診断と治療に活用する手段を提供することを課題とする発明である。マイクロＲＮＡライブラリーの４７０種類のマイクロＲＮＡについて、ＨｅＬａ細胞を用いたスクリーニングを行い、各々のマイクロＲＮＡの活性値がコントロールに比べて大きく減少した８種類のマイクロＲＮＡと、大きく上昇した８種類のマイクロＲＮＡを特定した。そして、特定されたこれらのマイクロＲＮＡを用いることによって、生体、特に腫瘍細胞、におけるＮＲＦ２の活性化を検出することが可能であり、これにより、腫瘍の悪性度等を鑑別することができることを見出した。さらに、上記ＡＲＥ活性値の減少に係わるマイクロＲＮＡ配列を含む核酸を、がん治療剤として用いることができることを見出した。

Description

本発明は、第一に生体検体の測定に関する発明であり、より具体的には腫瘍組織におけるマイクロＲＮＡを測定することでがんの悪性度等を鑑別するための発明である。そして、第二に抗がん剤に関する発明であり、より具体的には特定のマイクロＲＮＡに係る抗がん剤と抗がん医薬組成物に関する発明である。

がんが日本人の死因のトップとなってから久しく、２００７年の推計値では、全死亡数の約１／３ががんで亡くなっている。世界レベルで見ても、２００５年の世界の死亡のうち約１３％ががんによる死亡であることが世界保健機構（ＷＨＯ）において報告されている。がんによる死亡は増加し続け、２０３０年には世界で年間１１４０万人ががんで死亡することが予測されている。

その反面がんをめぐる診断や治療の進歩は目覚ましく、特に早期の段階で治療を始めることができた場合には、５年生存率は９０％を超えることも珍しくなくなっている。さらに、特に高齢者の場合には無理にがんを根絶しなくても、がんの増殖や転移を抑えれば天寿を全うすることも可能といわれている。

２００３年に終了したヒトゲノム計画等により、がんを遺伝子レベル、タンパク質分子レベルで理解し、それをがん診断や治療に役立てようとする動きが加速され、医学や生物学を支える様々な技術が底上げされ、がんの早期診断法や治療法なども長足の進歩を遂げている。

以前はがんの告知は「死の宣告」に近いものであり、患者本人への告知はタブー視されていたが、２００７年に施行された「がん対策基本法」では、患者等ががんに対して主体的にかかわることを求めている。

このような背景のもと、今日もがんをより多面的に捉えた診断法や治療法の開発が試み続けられている。

Itoh,K.et al.,Biochem Bioph Res Co 236,313-322(1997) Uruno,A.& Motohashi,H.,Nitric Oxide-Biol Ch25,153-160(2011) Singh,A.et al.,Plos Med3,1865-1876(2006) Thimmulappa,R,K.et al.,Cancer Research,62,5196-5203(2002) Mituishi,Y.et al.,Cancer Cell 22,66-79(2012) Kim,Y.R.et al.,J Pathol220,446-451(2010) Taguch,K.,Motohashi,H.& Yamamoto,Genes Cells 16,123-140(2011) Hammerman,P.S. et al.,Neoplasia 13,864-873(2011) Shibata,T.et al.,Neoplasia 13,864-873(2011) Inami,Y.et al.,J Cell Biol 193,275-284(2011) Komatsu,M.et al.,Nat Cell Biol 12,213-U217(2010) Taguchi,K.et al.,P Natl Acad Sci USA 109,13561-13566(2012) Lau,A.et al.,Mol Cell Biol 30,3275-3285(2010) Jiang,T.et al.,Cancer Reserch 70,5486-5496(2010) Shibata,T.et ak.,P Natl Acad Sci USA 105,13568-13573(2008) Soils,L.M.et al.,Clin Cancer Res 16,3743-3753(2010) Ambros,V.,Nature431,350-355(2004) Zhao,Y.& Srivastava,D.,Trends Biochem Sci 32,189-197(2007) Kong,Y.W.,Ferland-McCollough,D.,Jackson.T.J.& Bushell,M.,Lancet Oncol 13,E249-E258(2012) Lu,J.et al.,Nature 435,834-838(2005) Miska,E.A.,Curr Opin Genet Dev 15,563-568(2005) Shivdasani,R.$.,Blood 108,3646-3653(2006) Zhang,B.H.,Pan,X.P.,Cobb,G.P.& Anderson,T.A.,Dev Biol 302,1-12(2007) Lewis,B.P.,Burge,C.B. & Bartel,D.P.,Cell 120,15-20(2005) Tsuruta,T.et al.,Cancer Research 71,6575-5778(2011) Takeshita,F.et al.,Mol Ther 18,181-187(2010) Liu,C.et al.,Nat Med 17,211-215(2011)

がんをめぐる上記の状況のもと、本発明者らは、がんにおけるＮＦ−Ｅ２関連ファクター２（ＮＲＦ２）に着目して、新たな概念に基づくがん診断とがん治療の手段を見出すことを課題とした。

ＮＲＦ２は、化学療法や酸化ストレスによる細胞傷害に対する細胞保護作用のための転写調節因子である（非特許文献１、２）。生理的条件下で、ＮＲＦ２は、ＫＥＡＰ１（カリン３（ＣＵＬ３）−ケルヒ様ＥＣＨ関連タンパク質）ユビキチンＥ３リガーゼ複合体によりユビキチン化され、プロテアソーム中で常に分解される結果、ＮＲＦ２タンパク質の細胞内濃度は低く保たれている。細胞ストレス下で、ＫＥＡＰ１は不活化され、ＮＲＦ２は、核内で安定化し、標的遺伝子［ＮＲＦ２が直接的に、各々の標的遺伝子中のプロモーター中の抗酸化応答素子（ＡＲＥ）に結合している］の転写活性により細胞生存をもたらす（非特許文献３、４）。通常の細胞ストレス反応に加えて、ＮＲＦ２は新陳代謝を調節することによりがん細胞の増殖にも寄与し得ることも報告されている（非特許文献５）。遺伝子突然変異は、種々のタイプのヒトがんにおいてＮＲＦ２に関する機能獲得又はＫＥＡＰ１に関する機能喪失に導き、その結果ＮＲＦ２が活性化され、ＮＲＲ２の媒介によるがん細胞生存と増殖をもたらす（非特許文献６〜９）。さらにｐ６２蛋白（自食作用によるタンパク質分解のための物質）が過剰蓄積した凝集体により、肝細胞上皮性悪性腫瘍（ＨＣＣ）中のＫＥＡＰ１と競合的に相互作用することでＮＲＦ２を安定化する（非特許文献１０〜１３）。従って、ＮＲＦ２は、がん細胞中で発がん作用を有し、高レベルのＮＲＦ２タンパク質は、不良な予後に関連していると考えられる（非特許文献１４〜１６）。これらのことから、ＮＲＦ２が媒介する発がん経路を治療的に阻害することは、特にＮＲＦ２が安定化して種々の治療に耐性を有するがんに対して有効であると考えた。また、ＮＲＦ２の安定化の程度を反映する指標を見出すことにより、患者の予後の善し悪しに直結するがんの悪性度を鑑別することが可能ではないかと考えた。

本発明者らは、このＮＲＦ２に対してマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の役割に着目した。ｍｉＲＮＡは、３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）への結合を通じて標的転写物の翻訳又は安定化を妨害することにより遺伝子発現を調節する内因性の小分子の非コーディングＲＮＡである（非特許文献１７、１８）。いくつかのｍｉＲＮＡは、腫瘍遺伝子を負に調節することが可能であり、腫瘍抑制型ｍｉＲＮＡの不活性化は、発がん経路の活性化に導く（非特許文献１９〜２２）。重要なことに、一つの転写産物は、複数のｍｉＲＮＡによって標的にされ、反対に、一つのｍｉＲＮＡは複数の転写産物を標的にすることができる（非特許文献２３、２４）。これは、腫瘍遺伝子を標的にする複数のｍｉＲＮＡの発現低下が、発がん経路の活性化をもたらすこと、及び、一つの発がん経路に寄与する複数の遺伝子を標的にすることができるｍｉＲＮＡの投与は、がん治療において効果的であり得ること、を意味している。

このように本発明者らは、腫瘍におけるＮＲＦ２の安定化に強く関係するｍｉＲＮＡを見出し、それらをがんの診断と治療に活用する手段を提供することを、本発明の具体的な課題とした。

本発明者らは、上記の課題を解決するために、ＡＲＥリポーターシステムを用いてｍｉＲＮＡライブラリーの４７０種類のマイクロＲＮＡについて、スクリーニングを行った。具体的には、４７０種類それぞれのｍｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ活性を測定することでＡＲＥ活性値を算出して、当該ＡＲＥ活性値がコントロールｍｉＲＮＡに比べて大きく減少した８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６）と、大きく上昇した８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２＊、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９）を特定した。そして、特定されたこれらのマイクロＲＮＡを用いることによって、生体、特に腫瘍細胞、におけるＮＲＦ２の活性化を検出することが可能であり、これにより、腫瘍の悪性度、又は、がん患者の予後、を鑑別することができることを見出した。さらに、上記ＡＲＥ活性値の減少に係わるマイクロＲＮＡ配列を含む核酸を、がん治療剤として用いることができることを見出した。

すなわち、本発明は下記の発明を提供する。

本発明は第一に、ヒト検体における、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上を定量して、当該定量値の低下を指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、がん患者の予後、を鑑別することを特徴とする、マイクロＲＮＡの測定方法（以下、本発明の低値測定方法ともいう）を提供する発明である。本発明の低値測定方法の主題となる上記の８種類のマイクロＲＮＡのうち、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、の４種のマイクロＲＮＡは、悪性腫瘍における定量値が低くなる特徴がある。

本発明は第二に、ヒト検体における、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２＊、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上を定量して、当該定量値の上昇を指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、患者の予後、を鑑別することを特徴とする、マイクロＲＮＡの測定方法（以下、本発明の高値測定方法ともいう）を提供する発明である。

本発明の低値測定方法と高値測定方法は共に、さらに腫瘍におけるＮＲＦ２遺伝子の変異、ＫＥＡＰ１遺伝子の変異、及び、ｐ６２蛋白の蓄積、からなる群から選ばれる１〜３種を検出して、これらの要素を指標として加入することで、鑑別精度を向上させることが可能である。

本発明の低値測定方法と高値測定方法では、腫瘍の悪性度の増大、ＮＲＦ２の活性化、又は、がん患者の予後の悪化、に向かうことを示す個別指標の総数をスコア指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、患者の予後、を鑑別することが好適である。

本発明の低値測定方法と高値測定方法のがんの悪性度等の鑑別対象となる腫瘍（がん）は、ＮＲＦ２の活性化が悪性化等において問題になる腫瘍（がん）であれば特に限定されるものではなく、食道がん、肺がん、乳がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、子宮がん、骨肉腫、皮膚がん等、あらゆる悪性腫瘍に適用可能である。

本発明は第三に、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上を含む核酸からなるがん治療剤（以下、本発明のがん治療剤ともいう）を提供する発明である。本発明のがん治療剤の主題となる上記の８種類のマイクロＲＮＡのうち、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、の４種のマイクロＲＮＡは一般的な抗がん効果に優れている。

さらに本発明のがん治療剤は、がん細胞に対するストレスの付与手段と組み合わせて用いることが適している。

第四に本発明は、本発明のがん治療剤を含有することを特徴とする、がん治療のための医薬組成物（以下、本発明の医薬組成物ともいう）を提供する発明である。

本発明のがん治療剤、及び、医薬組成物の投与対象となる腫瘍（がん）は、ＮＲＦ２の活性化が悪性化等において問題になる腫瘍（がん）であれば特に限定されるものではなく、食道がん、肺がん、乳がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、子宮がん、骨肉腫、皮膚がん等、あらゆる悪性腫瘍に適用可能である。特に、局所投与が可能ながんであることが好適である。

下記に、本発明のｍｉＲＮＡの配列を開示する。表１−１は、本発明の低値測定方法において測定する対象となる８種類のｍｉＲＮＡ（以下、低値ｍｉＲＮＡともいう）であり、表１−１の上からの順に配列番号１〜８を割り振った。表１−２は、本発明の高値測定方法において測定する対象となる８種類のｍｉＲＮＡ（以下、高値ｍｉＲＮＡともいう）であり、表１−２の上からの順に配列番号９〜１６を割り振った。

本発明により、特定のｍｉＲＮＡを測定することにより、ＮＲＦ２の活性化を鑑別し、かつ、腫瘍の悪性度やがん患者の予後を鑑別することが可能な測定方法が提供される。さらに、特定のｍｉＲＮＡを含む核酸を用いて腫瘍におけるＮＲＦ２の活性化や安定化を阻害する、抗腫瘍効果を発揮するがん治療剤、並びに、がん治療のための医薬品組成物が提供される。本発明のがん治療剤及び医薬品組成物は、各種のがん治療や検査、例えば、抗癌剤治療、放射線治療、外科的手術、さらには生検によって与えられる「がん細胞に対するストレス」に伴って投与することが効果的である。

ｓｉＲＮＡを用いたＡＲＥレポーターシステムの検証の結果を示す図面である。ＮＲＦ２の転写活性をネガティブに制御するｍｉＲＮＡのスクリーニングの結果を示す図面である。ＮＲＦ２標的遺伝子の発現解析の結果を示す図面である。４種類の候補ｍｉＲＮＡの直接的なターゲットとしてのＮＲＦ２の確認の結果を示す図面である。ｍｉＲＮＡでのトランスフェクト細胞中のＮＲＦ２発現に関するウェスタンブロット分析の結果を示す図面である。食道がん（食道扁平上皮癌：ＥＳＣＣ）由来の原発腫瘍検体における臨床的な意義とｍｉＲＮＡの負の調節の関わりに関して検討した図面である。食道がん（食道扁平上皮癌：ＥＳＣＣ）由来の原発腫瘍検体中のＮＲＦ２及びＫＥＡＰ１遺伝子の変異分析の結果を示す図面である。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の標的としてのＮＲＦ２の転写標的遺伝子の同定の結果を示す図面である。４つのｍｉＲＮＡの発現分析、及び、Ａ５４９細胞中のシスプラチン処理により引き起こされる細胞ストレス下での細胞生存に及ぼすｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のトランスフェクションの効果を示す図面である。インビボにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の腫瘍抑制効果を示す図面である。ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導効果についてインビトロで検討した結果を示す図面である。食道癌細胞株ＫＹＳＥ１７０におけるインビトロにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の腫瘍抑制効果を示す図面である。食道癌細胞株ＫＹＳＥ１７０におけるインビボにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の腫瘍抑制効果を示す図面である。骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳ細胞へのｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の導入による標的遺伝子ＸＩＡＰ (X-linked inhibitor of apoptosis protein)の発現抑制効果を、ルシフェラーゼアッセイとウェスタンブロッティングにより示した図面である。骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳ細胞へのｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の導入による標的遺伝子ＡＰＩＰ (APAF1 interacting protein)の発現抑制効果を、ルシフェラーゼアッセイとウェスタンブロッティングにより示した図面である。骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳ細胞へのｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の導入による標的遺伝子ＯＰＡ１(optic atrophy 1)の発現抑制効果を、ルシフェラーゼアッセイとウェスタンブロッティングにより示した図面である。骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳ細胞へのｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の導入による標的遺伝子ＴＦＡＭ (transcription factor A, mitochondrial)の発現抑制効果を、ルシフェラーゼアッセイとウェスタンブロッティングにより示した図面である。

＜本発明の測定方法＞
（１）本発明の低値測定方法
上記の通り本発明の低値測定方法は、「ヒト検体における『低値ｍｉＲＮＡ』を定量して、当該定量値の低下を指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、がん患者の予後、を鑑別することを特徴とするマイクロＲＮＡの測定方法」である。

測定の対象となる低値ｍｉＲＮＡとは、上述したように、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上であり、特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上は、悪性腫瘍における定量値が低くなる特徴があり、優先的に当該４種のマイクロＲＮＡを測定対象として選択することが好適である。

ヒト検体は、文字通りヒト（人間）由来の検体であり、検体提供者は多くの場合はがん患者であるが、がんに罹患しているか否かが不明の場合を含めて検体提供者とすることができる。検体の種類は、腫瘍細胞における低値ｍｉＲＮＡの変化を反映することが可能な検体であれば特に限定されない。直接的には腫瘍そのものである腫瘍検体であり、具体的には、外科的手術又は内視鏡下により摘出された腫瘍検体、生検検体等が挙げられる。その限りでは、どのような人体組織でも検体組織として用いることができる。さらに一般的な選択可能性として、血清、血漿、全血等の血液検体、尿検体、肺洗浄液検体、痰検体、リンパ液検体、脊髄液検体等を必要に応じて用いることができる。

低値ｍｉＲＮＡの定量手段は、特に限定されず、既存の手段、さらには将来開発される手段を含めて用いることができる。典型的には、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を基礎とするＲＮＡの定量方法を挙げることができる。大量処理と迅速性という観点から、自動化された検出機器によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法はより好ましい方法の一つとして例示することができる。その他、ノーザンブロット法等が挙げられる。

この低値ｍｉＲＮＡ個々の定量値が、相対的に内部標準コントロールよりも閾値において低い場合は、「当該個別ｍｉＲＮＡの定量値が低下した」と判断される。具体的な閾値は個別具体的に設定することができるが、少なくとも３０％の低下を閾値とすることが好適であり、後述する本実施例に開示されているように５０％以上の低下を閾値とすることがさらに好適である。

８種類の低値ｍｉＲＮＡのうち、個々の定量値の低下を指標とすることもできるが、「定量値低下」となったｍｉＲＮＡの個数が多いほど、腫瘍の悪性度が強く、特に腫瘍内のＮＲＦ２が活性化されており、かつ、患者の予後の悪化が鑑別される。

すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上の定量値の低下を、腫瘍の悪性度の上昇、ＮＲＦ２の活性化、又は、患者の予後の悪化の指標とすることが可能である。

ここに挙げた８種類の低値ｍｉＲＮＡのうち、上述した４種類「ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上」に絞り込んで本発明の低値測定方法を行うことがより好適である。この４種類のマイクロＲＮＡを用いて腫瘍の悪性度等を検証した結果は、後述する実施例において開示した。

本発明の低値測定方法においては、さらに腫瘍におけるＮＲＦ２遺伝子の変異、ＫＥＡＰ１遺伝子の変異、及び、ｐ６２蛋白の蓄積、からなる群から選ばれる１〜３種を検出して、これらの遺伝子変異を、腫瘍の悪性度、特に腫瘍内のＮＲＦ２の活性化、及び、患者の予後の指標として加入することができる。この指標の加入を行うことにより、本発明の低値測定方法の鑑別の確実性をいっそう向上させることができる。上記のＮＲＦ２遺伝子の変異、及び／又は、ＫＥＡＰ１遺伝子の変異は、点突然変異を含むミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、及び、フレームシフト突然変異のいずれかであり、実施例の上記アミノ酸置換変異は、ミスセンス突然変異の一例を示している。当該遺伝子変異の検出方法は特に限定されず、例えば、Pyrosequencing法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法、ＲＦＬＰ法、ＳＳＣＰ法、ＳＳＯＰ法、ＲＮアーゼプロテクション法、ＲＤＡ法、ＲＡＰＤ法、ＡＦＬＰ法等のＰＣＲ依存型タイピング法；TaqMan ＰＣＲ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等のＰＣＲ非依存型タイピング法等を挙げることができる。

上記の腫瘍におけるＮＲＦ２遺伝子の変異、ＫＥＡＰ１遺伝子の変異、及び、ｐ６２蛋白の蓄積、からなる群から選ばれる１〜３種を本発明の低値測定方法の指標として加入する場合には、これらの遺伝子変異や蛋白の蓄積の有無のうち「有り」を腫瘍の悪性度の増加、ＮＲＦ２の活性化、及び、患者の予後の悪化の指標として加入することができる。後述する実施例では上記４種の低値ｍｉＲＮＡの定量値の「低下」の数（スコア）に、これらの遺伝子変異の「有り」を数（スコア）として加えて、これを最終的な腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、及び、患者の予後の指標としている。この数（スコア）が０又は１を「ロースコア群」とし、２以上を「ハイスコア群」として、両群の間において顕著な患者における予後の差違を見出している。このようにして本発明の低値測定方法では、指標である要素の個々のレベルで腫瘍の悪性度の増加等を意味するか否かを検出し、当該増加を意味する要素の数の多さ（スコア）を腫瘍の悪性度等の指標とすることが可能、かつ、好適である。ただし、そのスコアの閾値をどのように設定するかは、対象となるがんの種類や選択した指標の内容等により異なるものであり、後述する実施例の内容に限定されるものではない。本発明の低値測定方法の本質的意義は、特に鑑別の指標となるｍｉＲＮＡの定量値の「低下」が、がんの悪性度の増加に繋がるＮＲＦ２の活性化と密接に関連しており、これが的確なるがんの予後の鑑定を可能にすることを見出したことであり、閾値の設定等の形式的な要素に主要な意義が存在する訳ではない。なお、本発明の低値測定方法により、がんがハイリスクであることが判明した患者には、後述する本発明のがん治療剤を投与する等の治療措置を行うことが可能になる。

（２）本発明の高値測定方法
上記の通り本発明の高値測定方法は、「ヒト検体における『高値ｍｉＲＮＡ』を定量して、当該定量値の上昇を指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、がん患者の予後、を鑑別することを特徴とするマイクロＲＮＡの測定方法」である。

測定の対象となる高値ｍｉＲＮＡとは、上述したように、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２＊、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上である。

「ヒト検体」、「高値ｍｉＲＮＡの定量手段」は、上述した「本発明の低値測定方法」と同様である。

この高値ｍｉＲＮＡ個々の定量値が、相対的に内部標準コントロールよりも閾値において高い場合は、「当該個別ｍｉＲＮＡの定量値が上昇した」と判断される。具体的な閾値は個別具体的に設定することができるが、少なくとも３０％の上昇を閾値とすることが好適であり、後述する本実施例に開示されているように５０％以上の上昇を閾値とすることがさらに好適である。

８種類の高値ｍｉＲＮＡのうち、個々の定量値の上昇を指標とすることもできるが、「定量値上昇」となったｍｉＲＮＡの個数が多いほど、腫瘍の悪性度が強く、特に腫瘍内のＮＲＦ２が活性化されており、かつ、患者の予後の悪化が鑑別される。

すなわち、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２＊、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上の定量値の上昇を、腫瘍の悪性度の上昇、ＮＲＦ２の活性化、又は、患者の予後の悪化の指標とすることが可能である。

本発明の高値測定方法においては、さらに腫瘍におけるＮＲＦ２遺伝子の変異、ＫＥＡＰ１遺伝子の変異、及び、ｐ６２蛋白の蓄積、からなる群から選ばれる１〜３種を検出して、これらの遺伝子変異を、腫瘍の悪性度、特に腫瘍内のＮＲＦ２の活性化、及び、患者の予後の指標として加入することができることについては、上述の「本発明の低値測定方法」と同様である。

これらの遺伝子の変異や蛋白の蓄積を本発明の高値測定方法の指標として加入する場合には、これらの遺伝子変異の有無のうち「有り」を腫瘍の悪性度の増加、ＮＲＦ２の活性化、及び、患者の予後の悪化の指標として加入することができる。

このようにして本発明の高値測定方法では、指標である要素の個々のレベルで腫瘍の悪性度の増加等を意味するか否かを検出し、当該増加を意味する要素の数の多さ（スコア）を腫瘍の悪性度等の指標とすることが可能、かつ、好適である。ただし、そのスコアの閾値をどのように設定するかは、対象となるがんの種類や選択した指標の内容等により異なるものである。本発明の高値測定方法の本質的意義は、特に鑑別の指標となるｍｉＲＮＡの定量値の「上昇」が、がんの悪性度の増加に繋がるＮＲＦ２の活性化と密接に関連しており、これが的確なるがんの予後の鑑定を可能にすることを見出したことにあり、閾値の設定等の形式的な要素に主要な意義が存在する訳ではない。なお、本発明の高値測定方法により、がんがハイリスクであることが判明した患者には、拮抗性のがん治療剤を投与する等の治療措置を行うことが可能になる。拮抗性のがん治療剤とは、例えば、本発明の高値測定方法で発現の亢進が認められたｍｉＲＮＡに拮抗して、その機能を阻害することができる合成オリゴを本質的成分とするがん治療剤である。

＜本発明のがん治療剤＞
（１）本発明のがん治療剤
上述のように本発明のがん治療剤は、「ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の塩基配列である配列番号１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａの塩基配列である配列番号３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐの塩基配列である配列番号４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９の塩基配列である塩基配列５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７の塩基配列である配列番号６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３の塩基配列である配列番号７、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６の塩基配列である配列番号８、からなる群の塩基配列から選ばれる１種又は２種以上を含む核酸からなるがん治療剤」である。

上記の配列番号１〜８の塩基配列を有するそれぞれのマイクロＲＮＡは、上述したようにＮＲＦ２活性が亢進又は安定化して、治療抵抗性が高く、悪性度も高いがん細胞において、発現が抑制されているマイクロＲＮＡである。本発明のがん治療剤は、そのような治療抵抗性を有し、悪性度が高いがんに対して、発現が抑制されているマイクロＲＮＡの働きをする核酸を投与することにより、当該ＮＲＦ２を不活化してがんの生命力を弱め、がんの治療を行うことを旨とするがん治療剤である。

がん細胞におけるＮＲＦ２活性は、最初から高いものもあるが、多くの場合がん細胞にストレスを与えることにより活性化する。このストレス要因とは、がんに対する治療行為が挙げられる。具体的には、抗癌剤治療、放射線治療、外科的手術が挙げられる。これらの行為は、一方ではがんを治癒させ得る行為ではあるが、逆に考えればがん細胞の生命を奪う行為である。このような行為によるストレスにより、がん細胞におけるＮＲＦ２活性は亢進すると考えられている。よってここに挙げた抗癌剤治療等のがんに対するストレス付与と組み合わせて、本発明のがん治療剤を用いることは、当該がん治療剤の好適な使用態様の一つである。なお、生検によるがん細胞に対する刺激も、外科手術と同様にがん細胞に対する物理的なストレスを与えると考えられるので、本発明のがん治療剤との組み合わせ対象となり得る。なお、「組み合わせる」とは、「前」、「同時」、「後」の時間的な概念を包含している。すなわち、他の抗癌剤の投与や外科的手術や生検等のストレス付与行為の「前」に本発明のがん治療剤の投与を行うことも可能である。また「同時」に、例えば、他の抗がん剤と同時に服用すること、他の抗癌成分との混合物（医薬組成物）として服用することも可能である。そして他の抗癌剤の投与や外科的手術や生検等のストレス付与行為の「後」に本発明のがん治療剤の投与を行うことも可能である。

本発明のがん治療剤の本質成分を構成する、「上記の８種類のｍｉＲＮＡの塩基配列を含む核酸」とは、当該塩基配列を含みがん細胞においてｍｉＲＮＡとしての機能を発揮可能である限り限定されるものではない。一本鎖ＲＮＡとして生体内に存在する「ｍｉＲＮＡそのもの」であっても良いが、この場合生体における安定性という観点から、むしろ二本鎖の核酸であることが好適である。二本鎖の核酸とは、具体的にはｍｉＲＮＡの配列と相補的なＲＮＡとの組により構成される「二本鎖のＲＮＡ」、同じく「ＲＮＡとＤＮＡの複合二本鎖」、さらに「ＲＮＡとＰＮＡの複合二本鎖」や「ＲＮＡとＬＮＡとの複合二本鎖」等が挙げられる。ここでＰＮＡ(peptide nucleic acid)とは、核酸骨格の骨格構造であるデオキシリボース−リン酸骨格を（２−アミノエチル）グリシンに置き換えた骨格を有する核酸類似体である。またＬＮＡ(locked nucleic acid)（別名ＢＮＡ:bridged nucleic acid）とは、糖部分の２’位と４’位が一つの炭素鎖によって結合することにより安定性が向上した人工核酸である(D.A.Braasch,D.R.Corey,Chem Biol.,8,1(2001))。後述する実施例では「二本鎖のＲＮＡ」が用いられている。

公知ＲＮＡの合成法等を用いて、所望の核酸を合成することが可能である。ＲＮＡの合成法は、例えばホスホロアミダイド法とその改良法（M.Kataoka,Y.Hayakawa,J.Org.Chem.,64,6087(1999)）、Ｈ−ホスホネート法とその改良法(T.Wada,F.Handa,Y.Sato,S.Kawahara,M.Sekine,Nucleic Acids Symp.Ser.,37,19(1997))、酵素合成法(in vitro転写法)等が挙げられる。また、必要に応じて核酸のリン酸部位のα酸素のモノ修飾（Ｓ−オリゴ修飾等）、リン酸エステル部位の修飾、ＰＮＡ等を用いるリン酸骨格の改変、上記のＬＮＡ等を用いる糖部位の修飾等を行うことができる。また、市販品の当該核酸や製造委託された当該核酸を本発明に適用することも可能である。

このようにして得られる特定のｍｉＲＮＡの塩基配列を含有する核酸を、本発明のがん治療剤の本質成分として用いることができる。本発明のがん治療剤を人体に投与する場合は、後述する本発明の医薬組成物として投与されることが原則であるが、本発明のがん治療剤を人体に投与する場合の投与量は、1日成人1人当たり０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度である。この投与は、一日１回ないし２〜５回、さらに数日おきに行うことも可能である。

上述したように、本発明のがん治療剤が適用され得るがんは、その種類よりもむしろ特定のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６の８種、さらに典型的にはｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐの４種）の発現が抑制されて、当該がん細胞におけるＮＲＦ２活性が亢進又は安定化していることが適用の優先的な条件である。つまり、上述した本発明の低値測定方法により、上記特定のマイクロＲＮＡの発現が抑制されてＮＲＦ２が抑制されていると鑑別されたがん患者に対して、本発明のがん治療剤の投与が積極的に検討される訳である。その意味で本発明のがん治療剤の本質成分であるｍｉＲＮＡの塩基配列を含有する核酸は既製の組み合わせ（典型的には上記４種のｍｉＲＮＡの塩基配列を含有する核酸）のマイクロＲＮＡであってもよいが、発現抑制が特定されたｍｉＲＮＡの塩基配列を含む核酸を本質成分とする本発明のがん治療剤をオーダーメードとして処方することも可能である。このように本発明のがん治療剤の本質成分である特定のｍｉＲＮＡは、一種類を単独で用いることも可能であり、２種以上を組み合わせて用いることも可能である。本発明のがん治療剤が適用され得るがんの種類として、上記の食道がん、肺がん、乳がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、子宮がん、皮膚がん、又は、骨肉腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明のがん治療剤と組み合わせて用いられるがん細胞に対するストレス手段の一つである抗癌剤は、イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン、メルファラン等のアルキル化剤；イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ラパチニブ、リツキシマブ等の分子標的薬；エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オラテシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート等の代謝拮抗剤；イリノテカン、エトポシド、エリブリン、ゾブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン等の植物アルカロイド；アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチラマー、ダウノビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、リポソーマドキソルビシン等の抗がん性抗生物質；オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、ネダプラチン等のプラチナ製剤；アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストホール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾール等のホルモン製剤；インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ、レンチナン等の生物学的応答調節剤；等が挙げられる。これらの抗癌剤の治療により、ＮＲＦ２の活性化が認められると本発明のがん治療剤の好適な適用対象となる。放射線治療としては、従来の放射線治療の他に、粒子線治療等も対象となる。そして、上述のように外科的手術や生検も対象となる。

さらにこれらのがんへのストレス付与状態への考慮とは別個に、「がんとの共存」を目指す場合も本発明のがん治療剤の適用対象となり得る。すなわち、がんにおけるＮＲＦ２の活性化を抑制することによりがんの悪性化を防ぎ、天寿の全うを目指す場合に本発明のがん治療剤は適していると考えられる。

＜本発明の医薬組成物＞
上述のように本発明の医薬組成物は「上記のがん治療剤を含有することを特徴とする、がん治療のための医薬組成物」である。

上述したように本発明のがん治療剤は、両者とも「医薬組成物」の有効成分として人体に投与される。当該がん治療剤の直接投与の場合も、注射剤等を用時混合することになるので、これも医薬組成物に含められる。

本発明の医薬組成物は、本発明のがん治療剤と共に適切な医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製される。当該製剤担体としては、使用形態に応じた担体を選択することが可能であり、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等の賦形剤ないし希釈剤を使用することができる。組成物の形態は、本発明のがん治療剤を効果的に含有可能な形態であれば特に限定されるものではなく、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤や軟膏剤であってもよいが、通常は、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのが好適である。また、本発明のがん治療剤を適切な担体の添加によって使用時に液状となし得る乾燥品とすることも可能である。さらに本発明の医薬品組成物において、シクロデキストリン含有ポリマーで構成されたナノ粒子、高分子ミセル、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）、多機能エンベローブ型ナノ構造体（ＭＥＮＤ）等のドラッグデリバリーシステム活用して、本発明のがん治療剤の効果をより向上させることが可能である。

得られた医薬品組成物は、その形態に応じた適切な投与経路、例えば、注射剤形態の医薬品組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により、固剤形態の医薬品組成物は、経口ないし経腸にて投与される。医薬品組成物中の本発明のがん治療剤の量は、当該組成物の投与方法、投与形態、使用目的、患者の症状等に応じて適宜選択され一定ではないが、通常、本発明のがん治療剤を、０．１〜９５質量％程度含有する組成物形態に調製して、上述した投与量（1日成人1人当たり０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度であり、一日１回ないし２〜５回、さらに数日おきに行うことも可能である）、にて投与を行うことが好ましい。

下記に本発明の実施例を示す。
１．材料と方法
実施例の結果の開示に先立ち、それに用いられた材料と試験方法について説明する。

（１）細胞培地及び原発腫瘍検体
ＨｅＬａ，Ｌｋ−２，Ａ５４９及びＪＨＨ−５細胞は、アメリカンカルチャーコレクション（米国）から購入した。当該細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＨｅＬａ，Ｌｋ−２細胞用）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ａ５４９細胞用）、又は、ウイリアムＥ培地（ＪＨＨ−５細胞用)に、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、及び、ストレプトマイシンを添加して、５％ＣＯ_２・３７℃にて培養した。

全体で３０例の原発性の食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）のサンプルと、対照となる非がん性の食道粘膜は、東京医科歯科大学病院で２００５年４月から２００７年６月の間に治療を受けた患者から得たものであり、当該サンプルは素早く液体窒素で凍結され、ＤＮＡとＲＮＡが抽出されるまで−８０℃で保管された。承諾書は常に正式に得られたものである。患者のサンプルの収集と解析は東京医科歯科大学の治験審査委員会による承諾を得た（認可＃２０１０−５−２）。ホルマリンで固定されパラフィン包埋がなされた腫瘍のサンプルは、免疫組織化学解析に用いられた。関連する臨床データと生存データは、全ての患者から入手された。患者は誰も手術前に化学療法と放射線療法を受けていなかった。疾病のステージは、食道癌の腫瘍―リンパ・結節−転移分類(the tumor-lymph node-metastases classification)に従って定義された。非根治切除又は他の疾病で死亡した患者は、この調査には含まれていない。追跡期間の中央値は３５ヶ月（４〜６９ヶ月）であった。

（２）抗体と試薬
ウェスタンブロッティング用の抗ＮＲＦ２ウサギポリクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）、免疫組織化学解析用の抗ＮＲＦ２ウサギポリクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）、抗ＫＥＡＰ１ウサギポリクローナル抗体（プロテインテック社）、抗ＭＥ−１マウスモノクローナル抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社）、抗ＸＩＡＰウサギ抗体（Cell signaling社）、抗ＡＰＩＰウサギ抗体（Ａｂｃａｍ社）、抗ＯＰＡ１ウサギ抗体（Ａｂｃａｍ社）、抗ＴＦＡＭウサギ抗体（シグマ社）、及び、抗β−アクチンマウスモノクローナル抗体（シグマ社）、を用いた。培養細胞の処理のために過酸化水素（和光純薬社）又はシスプラチン（和光純薬社）を用いた。

（３）細胞生存アッセイ
細胞の生存は、クリスタルバイオレット（ＣＶ）染色アッセイにより評価した。細胞はＰＢＳで洗浄され、０．２％ＣＶ含有１０％ホルムアルデヒドＰＢＳにおいて３分間固定した。過剰なＣＶ溶液は除去され、完全に空気乾燥した後、染色細胞は２％ＳＤＳ溶液に接触させつつ、プレートを１時間振とうすることにより溶解した。光学密度（ＯＤ）吸光度は、マイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯｍｘ；ペルキンエルマー社）を用いて５６０ｎｍにて計測し、吸光度百分率はウエル毎に算出した。コントロールウエルにおける細胞のＯＤ吸光度値は、生存細胞の百分率を決定するために、任意に１００％にセットした。

（４）ＡＲＥルシフェラーゼレポーターを用いるスクリーニングシステム
ルシラーゼレポータープラスミドは、抗酸化応答エレメント（ＡＲＥ）を含んだヒトＮＱＯ−１プロモーター領域「5’-CTCAGCCTTCCAAATCGCAGTCACAGTGACTCAGCAGAATC-3’」（配列番号１９）を、ｐＧＬ３ベクター（プロメガ社）のＭｌｕ１／Ｘｈｏ１サイトに挿入することを目的として、下記表２の互いに相補的な合成オリゴの組（上段は配列番号２０、下段は配列番号２１）をアニールして二本鎖ＤＮＡとし、Ｍｌｕ１とＸｈｏ１を用いて当該Ｍｌｕ１／Ｘｈｏ１サイトに相補的な粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡを調製した。これを当該Ｍｌｕ１／Ｘｈｏ１サイトに挿入することにより、所望の組換えｐＧＬ３（レポータープラスミド）を作出した。

第一に、当該レポータープラスミドは、１０センチメートルディッシュ上でＨｅＬａ細胞（１×１０^７cells／dish）中に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間後に、当該細胞は９６穴プレートに播種され（１×１０^４cells／well）、次の日にＰｒｅ−ｍｉＲｍｉＲＮＡ前駆体ライブラリー−ＨｕｍａｎＶ３（アンビオン社）又はコントロールｍｉＲＮＡ、に由来する二本鎖ＲＮＡ４７０種の各々２０nmol/Lをトランスフェクトした。２日後、ホタルルシフェラーゼ活性がＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（プロメガ社）を用いるマイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯｍｘ：ペルキンエルマー社）で計測した。同時に、生存細胞はＣＶ染色アッセイにより検出した。ARE活性は、生存細胞毎のルシフェラーゼ活性によって算出した。

（５）microＲＮＡｓ（ｍｉＲＮＡｓ）及びsmall interferenceＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）
２０nmol/LのｍｉＲＮＡｓ又はｓｉＲＮＡｓが個別にLipofectamin ＲＮＡｉＭＡＸ(インビロトロゲン社)を用いて細胞に操作用マニュアルに従ってトランスフェクトされた。ヒト成熟ｍｉＲＮＡに模した二本鎖ＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７（ＰＭ１０５０９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ（ＰＭ１０１９５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ（ＰＭ１１１９２）、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４（ＰＭ１１５３８））、並びに、コントロールｍｉＲＮＡ（ネガティブコントロール＃１）は、アンビオン社から入手した。ＮＲＦ２に対するｓｉＲＮＡ（siGENOME SMARTpool；Ｍ−００３７５５−０２−０００５）とＫＥＡＰ１に対するｓｉＲＮＡ（siGENOME SMARTpool；Ｍ−０１２４５３−００−０００５）は、サーモサイエンティフィックダルマコン社から入手した。

（６）伝統的なルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼリポータープラスミドは、pmirGlo Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector（プロメガ社）のルシフェラーゼ遺伝子の下流に、ＮＲＦ２、ＭＥ１、又は、ＮＱＯ１の３’非翻訳領域（ＵＴＲ：配列番号４９〜５１）を挿入することで作出した。全ての部位特異性変異は、GeneTailor site-directed mutagenesis system（インビトロゲン社）、又は、ＫＯＤ mutagenesis kit（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて行った。ルシフェラーゼレポータープラスミドと、内部標準コントロールとしてのｐＴＫプラスミドには、共にＨｅＬＡ細胞にトランスフェクトされ、次の日にヒト成熟ｍｉＲＮＡに模した二本鎖ＲＮＡ又はコントロールｍｉＲＮＡをトランスフェクトした。２日後、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assay System（プロメガ社）を用いて計測し、相対的ルシフェラーゼ活性は、対応する内部標準コントロールのウミシイタケルシフェラーゼで読み取りながらホタルルシフェラーゼ活性を標準化することにより算出された。

（７）ウェスタンブロッティング
全細胞の溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに付されて、蛋白はＰＶＤＦメンブレン（ＧＥヘルスケア社）に転写された。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と５％のスキムミルクを含有するＴＢＳで１時間ブロッキングを行った後、当該膜を抗体と共に一晩反応した。初期の抗体の希釈は、抗ＮＲＦ２ウサギ抗体（１／１０００）、抗ＫＥＡＰ１ウサギ抗体（１／１０００）、抗ＭＥ１マウス抗体（１／１０００）、及び、抗βアクチンマウス抗体（１／５０００）であった。当該膜は洗浄され、ＨＲＰ結合抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ抗体（共に１／２０００）で２時間曝露した。結合した抗体は、ＨＲＰ染色溶液又はＥＣＬウェスタンブロッティングキット（セルシグナリングテクノロジー社）の操作用マニュアルに従って、視覚化された。

（８）定量ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（インビトロゲン社）を標準的方法にて用いて分離した。当該全ＲＮＡから調製された一本鎖ｃＤＮＡは、各々の遺伝子に特異的なプライマーで増幅された。定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＫＡＰＡＳＹＢＲＳｙｓｔｅｍ（カパバイオシステム社）とＡＢＩＰＲＩＳＭ７５００配列検出システム（アプライドバイオシステム社）を用いて、操作用マニュアルに従い行った。遺伝子発現値は、遺伝子産物(the genes of interest)と内部標準コントロール（ＧＡＰＤＨ）若しくはＵ６の間の比率（Ｃｔ値の差違）により与えられ、そして引き続いてコントロール細胞における値と一緒に標準化される（相対的発現レベル）。用いられたプライマーとＴａｑＭａｎプローブの情報は表３と表４を参照のこと。表３において、フォワードプライマーを示す左側の欄の塩基配列の配列番号として、上から順番に配列番号２２〜３２を割り振り、リバースプライマーを示す右側の欄の塩基配列の配列番号として、上から順番に３３〜４３を割り振った。また、表４においてＴａｑＭａｎプローブの塩基配列の配列番号として、上から順に配列番号４４〜４８を割り振った。

ｍｉＲＮＡに対するリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、ABI Prizm 7500 Fast Real-time PCR System（アプライドバイオシステム社）、Taqman Universal PCR Master Mix（アプライドバイオシステム社）、Taqman Reverse Transcription kit（アプライドバイオシステム社）、及び、Taqman MicroRNA Assays（アプライドバイオシステム社）を用いて、操作マニュアルに従い行った。ｍｉＲＮＡ遺伝子の発現レベルは、全ＲＮＡの初期量の標準化コントロールとしてのＲＮＵ６Ｂの転写物の量に関連するターゲットメッセージ量に基礎付けられる。

（９）免疫組織化学
腫瘍検体は、１０％のホルムアルデヒド含有ＰＢＳによって固定化し、パラフィン包埋を行い、４μｍ厚の切片へと薄片化し、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ法でＮＲＦ２又はＭＥ１の免疫組織化学的染色を行った。パラフィンで包埋された腫瘍検体からの切片はキシレンで脱パラフィンを行い、エタノール中で再水和を行った。１０mMのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中での煮沸による抗原の回復の後、当該切片は、内因性のペルオキシダーゼを不活性化するために０．３％過酸化水素含有メタノールで処理した。そして当該切片は、抗ＮＲＦ２抗体(１／１０００希釈)又は抗ＭＥ１抗体(１／５００希釈)と一緒に４℃で一晩インキュベートした。結合した抗体は、色原体としてのジアミノベンディジン（VECTASTAIN-EluteABC Kit,ベクターラボラトリー社）を用いて可視化し、当該切片は素早くヘマトキシリンにて対比染色した。

（10）ＮＲＦ２とＫＥＡＰ１の変異解析
ＮＲＦ２のエクソン２又はＫＥＡＰ１の全てのコーディング領域を含む遺伝子領域は、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケア社）を用いて精製され、配列解析を行った。プライマーの情報は、上記表３を参照のこと。

（11）発現アレイ解析及びＩＰＡを用いた経路解析
遺伝子発現のアレイ解析のために、Agilent４×４４Ｋ遺伝子発現アレイ（アジレントテクノロジーズ社）を、操作用マニュアルに従い用いた。各々の遺伝子アレイ実験は、二重に行われ、データはGeneSpring(アジレントテクノロジー社)で解析した。

発現データとTargetScanプログラムは、ingenuity pathway analysis（ＩＰＡ）(インジュニティシステムス社)に付した。

（12）in vivo腫瘍増大アッセイ及びｍｉＲＮＡの投与
７週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをオリエンタル酵母工業株式会社から購入し、無菌状態を保った。１×１０^７cellsを含むＰＢＳ２００μｌをマウスの横腹に皮下注射した。１nmolの２本鎖ＲＮＡ（アンビオン社）と２００μｌのAteroGene（ＫＯＫＥＮ社）の混合物を、腫瘍と皮膚の間の空隙に投与した。マウスに、５mg/kg体重のシスプラチンの腹腔内投与を施した。細胞投与３５日間後、マウスを安楽死させ腫瘍を摘出した。全てのマウスに対して行った実験の手順は、東京医科歯科大学の動物保護と利用委員会の承認を受けた。

（13）統計分析
サブグループ間の差違は、Student"s t-testによって検討した。対応する患者に関係する臨床病理学的な変化は、Χ^２テスト、又は、フィッシャーの抽出テストによって解析された。生存の解析を行うために、Kaplan-Meierカーブが一変量の予測に基礎付けられた群のために構築され、群間の差違はlog-rank testによって検討した。インビボの実験の結果とＡ５４９細胞における細胞生存試験は、変化に対するｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡ（二要因の分散分析）を用いて統計学的有意性を解析した。計算されたＰ値が０．０５未満（＜０．０５）の場合に統計学的な有意性有りと判断した。

２．実施例の開示
［実施例１］ＮＲＦ２の転写活性をネガティブ制御しているｍｉＲＮＡのスクリーニング
ＮＲＦ２の転写活性をネガティブ制御しているｍｉＲＮＡを確認するために、我々はルシフェラーゼレポーターシステムを用いてｍｉＲＮＡライブラリーをスクリーニングした。当該システムは、antioxidative responsible element（ＡＲＥ）を動かすことでルシフェラーゼの発現の計測が可能である。このレポーターシステムを用いて、当該ＡＲＥ活性が、ＨｅＬａ細胞におけるＮＲＦ2蛋白レベルに依存して変化することを確認した（図１）。図１は、ｓｉＲＮＡを用いたＡＲＥレポーターシステムの検証の結果を示す図面である。具体的には、ＡＲＥルシフェラーゼレポータープラスミド及び内部標準コントロールベクターを用いて、ＨｅＬａ細胞に共トランフェクションを行い、２４時間後、コントロールｓｉＲＮＡ、又は、ＮＲＦ２−ｓｉＲＮＡ（ａ）、若しくは、ＫＥＡＰ１−ｓｉＲＮＡ（ｂ）でトランフェクションを行った。ｓｉＲＮＡでのトランフェクションの４８時間後、当該細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、各々の抗体での免疫反応を行った（上部パネル）。一方で、ホタル又はウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定し、Ｍｏｃｋ中のＡＲＥ活性に対するＡＲＥ活性を縦軸に示した（下部パネル）。バーは、標準偏差（ＳＤ）である。

図２−１は、ＮＲＦ２の転写活性をネガティブに制御するｍｉＲＮＡのスクリーニングの結果を示す図面である。図２−１（ａ）では、ＡＲＥリポーターシステムを用いるｍｉＲＮＡライブラリースクリーニングの方法を示している。４７０の二本鎖ＲＮＡをスクリーニングするために、連続してＨｅＬａ細胞に各々のｍｉＲＮＡを、レポータープラスミドと一緒にトランスフェクトし、クリスタルバイオレット（ＣＶ）染色アッセイによって計測した生存細胞毎のルシフェラーゼ活性としてトランスフェクトされた細胞におけるＡＲＥ活性を算出した。すなわち、ＡＲＥルシフェラーゼレポータープラスミド及びライブラリーに由来する各々のｍｉＲＮＡは、順次ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトされ、４８時間後にルシフェラーゼ活性又は生存細胞数は、Bright-GIoルシフェラーゼアッセイシステム又はＣＶ染色アッセイを用いて個別に計測された。各々のｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞のＡＲＥ活性は、生存細胞毎のルシフェラーゼ活性として算出された。

図２−１（ｂ）は、ｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞におけるＡＲＥ活性の結果の要約を示している。コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞に対するＡＲＥ活性は縦軸に示されている。相対値が０．５以下の８種類のｍｉＲＮＡはこのスクリーニングシステムによる候補として特定された。さらに相対値が１．５以上の８種類のｍｉＲＮＡもこのスクリーニングシステムによる候補として特定された。

図２−１（ｃ）は、４種類の候補ｍｉＲＮＡのルシフェラーゼアッセイによる検証の結果を示している。ＨｅＬａ細胞にはＡＲＥルシフェラーゼレポータープラスミドと内部標準コントロールベクターが共にトランスフェクトされ、２４時間後に、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、−１２９−５ｐ、又は、コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた。ｍｉＲＮＡのトランスフェクションから４８時間後に、ホタルルシフェラーゼ活性又はウミシイタケルシフェラーゼ活性が計測された。コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞に対するＡＲＥ活性は縦軸に示されている。バーは標準偏差（ＳＤ）である。

図２−１（ｄ）は、ｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞におけるＮＱＯ１ｍＲＮＡの発現解析の結果を示している。ＨｅＬａ細胞は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、−１２９−５ｐ、又は、コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされている。トランスフェクションから４８時間後に、ＮＱＯ１遺伝子のｍＲＮＡレベルがｑＲＴ−ＰＣＲにより計測された。ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現は、内部標準コントロールとして用いられた。コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞に対する発現レベルは縦軸に示されている。バーは標準偏差（ＳＤ）である。

図２−２は、ＮＲＦ２標的遺伝子の発現解析の結果を示す図面である。ｓｉＲＮＡ（コントロール、ＮＲＦ２、若しくはＫＥＡＰ１）（ａ）、又はｍｉＲＮＡ（コントロールｍｉＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、若しくは−１２９−５ｐ）（ｂ）を用いて、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクションを行った。当該トランスフェクションの４８時間後、４つのＮＲＦ２標的遺伝子であるＮＱＯ１、ＧＰＸ２、及びＴＸＮＲＤ１のｍＲＮＡ発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＧＡＰＤＨの発現を内部標準コントロールとして用いた。コントロールｓｉＲＮＡ又はコントロールｍｉＲＮＡでのトランスフェクト細胞中の発現レベルに対する発現レベルを縦軸に示した。バーは標準偏差（ＳＤ）である。なお、（ｂ）に示された、ウェスタンブロッテイングの結果及びＮＱＯ１発現に関する結果は、それぞれ、図３ａ及び図２−１（ｄ）にも示されている。

上記図２−１（ｃ）、図２−１（ｄ）ｄ、及び、図２−２において、上位４種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、及び、−１２９−５ｐ）に絞り込んで、それらのトランスフェクトは、現にＡＲＥ活性を減じること、そして、既知のＮＲＦ２のターゲット遺伝子「ＮＱＯ１、ＨＯ１、ＧＰＸ２、及び、ＴＸＮＲＤ１」の転写活性を低下制御していることが確認された。

これらの結果は、この既知のターゲット遺伝子スクリーニングシステムは、少なくとも４つの候補ｍｉＲＮＡがＮＲＦ２の転写活性をネガティブに調節したことを成功裏に同定することができることを示している。また、図２−１（ｂ）に示すように、ＡＲＥ活性が、コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞との比較で１．５以上を示した８種類のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈａｓ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２＊、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９）を同定した。

［実施例２］候補ｍｉＲＮＡの機能的標的としてのＮＲＦ２の同定
４つの候補ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ）のための機能的標的を同定するために、まず、ＮＲＦ２経路に関連していることが知られている遺伝子が、ＩＰＡ(Ingenuity Systems Pathway Analysis, Redwood City, CA)(http://www.ingenity.com)を用いて、TargetScanプログラム（http://www.targetscan.org）により予測された標的の中に存在するかを調査した。コンピュータ内での分析により、意外にも、４つの候補ｍｉＲＮＡ全てが、ＮＲＦ２それ自体を機能的に標的にしていることを見出した。なぜならば、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａではない３つのｍｉＲＮＡのためのシード配列は、ＮＲＦ２の３’−ＵＴＲの中にマップされたからである（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７において２箇所、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４において１箇所、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐにおいて２箇所）（図３（ｂ））。図３（ｂ）は、ＮＲＦ２の３’ＵＴＲ配列内における、４種の候補ｍｉＲＮＡのシード配列（ｓｅｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ）の相同配列とレポータープラスミドのデザインを示している。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７（２カ所）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４（１カ所）、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ（２カ所）のシード配列が、ＮＲＦ２の３’ＵＴＲにおいてマップされた。ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａのシード配列はｈｓａ−ｍｉＲ−５０７と高度に相同している（７シード配列のうち６）から、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａのシード配列はｈｓａ−ｍｉＲ−５０７と同じサイトとして示されている。領域１（Ｒ１）、領域２（Ｒ２）又は変異Ｒ２はルシフェラーゼアッセイにおいて用いられた。黒い×印は、各々のシード配列に挿入された変異サイトを示している。

さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａのシード配列は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のシード配列に高度の相同性（７つのシード配列のうちの６つ）を示した。実際にＮＲＦ２蛋白質のレベルが、対照のｍｉＲＮＡトランスフェクト細胞と比べて、各ｍｉＲＮＡで導入された細胞内で著しく低下していることを示した（図３（ａ））。この図３（ａ）は、ｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞におけるＮＲＦ２の発現のウェスタンブロット解析の結果を示している。ＨｅＬａ細胞は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、−１２９−５ｐ、又は、コントロールｍｉＲＮＡでトランスフェクトされている。トランスフェクションから４８時間後、細胞の溶解物を用いてウェスタンブロッテイングを行い、示された抗体と免疫反応を行った。

図３（ａ）に示されたｍｉＲＮＡの過剰発現によるＮＲＦ２の負の調節は、ＮＲＦ２安定化癌細胞株、ＮＲＦ２変異を有するＬＫ２（ＮＳＣＬＣ）、ＫＥＡＰ１変異を有するＡ５４９（ＮＳＣＬＣ）、及びｐ６２蛋白の凝集を有するＪＨＨ−５（ＨＣＣ）においても観察されたことが図４に示されている。図４は、ｍｉＲＮＡでのトランスフェクト細胞中のＮＲＦ２発現に関するウェスタンブロット分析の結果を示す図面であり、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、若しくは−１２９−５ｐ、又はコントロールｍｉＲＮＡをＬＫ２細胞（肺扁平上皮がん細胞）、Ａ５４９細胞（肺腺がん細胞）、及びＪＨＨ−５細胞（肝細胞がん細胞）にトランスフェクションを行い、さらに当該トランスフェクションの４８時間後、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、示された抗体での免疫反応を行った結果を示している。

それ故、各ｍｉＲＮＡがＮＲＦ２の３’−ＵＴＲに直接的に結合することができるかを調べるために、さらに、３’−ＵＴＲの２つのフラグメント、Ｒｅｇｉｏｎ−１（Ｒ１）及びＲｅｇｉｏｎ−２（Ｒ２）、のそれぞれ、又はＲ２の５つの異なる突然変異体、を有するレポータープラスミドベクターを用いてルシフェラーゼアッセイを行った結果を示したものが、上記の図３（ｂ）である。

図３（ｃ）は、上記図３（ｂ）において示された各々の領域を有するレポータープラスミドを用いたルシフェラーゼアッセイの結果を示している。ＨｅＬａ細胞はレポータープラスミドと内部標準コントロールベクターが共にトランスフェクトされ、２４時間後に、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、−１２９−５ｐ、又は、コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた。ｍｉＲＮＡのトランスフェクションから４８時間後に、ホタル若しくはウミシイタケのルシフェラーゼ活性が計測された。コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞に対応するルシフェラーゼ活性は、縦軸で示されている。グラフ下部の横線は、ｍｉＲＮＡがトランスフェクトされた細胞において関連性のある変異プラスミドを示している。バーは標準偏差（ＳＤ）である。図３（ｃ）では、Ｒ２ベクターのためのルシフェラーゼ活性は、各ｍｉＲＮＡを用いて導入された細胞中の空き及びＲＡベクターのためのルシフェラーゼ活性と比べて著しく低下し、Ｒ２のシード配列中の突然変異を有するベクターで完全に修復されたことが示されている。

さらに図３（ｄ）は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）（左）又は酸化ストレス（過酸化水素）（右）によって引き起こされた細胞ストレス下における細胞生存を指標としたｍｉＲＮＡのトランスフェクションの効果に関する検討の結果を示している。ＨｅＬａ細胞は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、−１２９−５ｐ、又は、コントロールｍｉＲＮＡがトランスフェクトされ、翌日にシスプラチン（１５μＭ)が２４時間、又は、過酸化水素(１００μＭ)で１２時間処理した。細胞の溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに付され、示された抗体と免疫反応を行った。ＮＲＦ２の発現はウェスタンブロッティングにより検討した（上パネル）。未処理のコントロールｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、ＣＶ染色アッセイで評価した（下パネル）。バーは、標準偏差（ＳＤ）である。各ｍｉＲＮＡのトランスフェクションは、ＮＲＦ２蛋白質の発現を示しただけでなく、シスプラチンでの治療、又は、過酸化水素に対する曝露に対する感度を著しく高めたことを、この図３（ｄ）は示している。

これらの実施例２の結果は、４つの候補ｍｉＲＮＡ全てが３’−ＵＴＲに直接結合し、ＮＲＦ２を機能的な標的にして、細胞ストレスの上昇にもかかわらず、ＮＲＦ２がかかわるがん細胞の生存を抑制することを示唆している。

［実施例３］４種のｍｉＲＮＡの負の調節の原発性の食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）に対する臨床的特徴
原発性の食道扁平上皮癌患者からの３０検体においてｑＲＴ−ＰＣＲ解析による各々のｍｉＲＮＡのレベルを検討した。図５は、食道がん（食道扁平上皮癌：ＥＳＣＣ）由来の原発腫瘍検体における臨床的な意義とｍｉＲＮＡの負の調節の関わりに関して検討した図面である。

図５−１（ａ）は、３０種の原発性検体における４種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、及び、−１２９−５ｐ）の発現解析の結果と、同ＮＲＦ２とＫＥＡＰ１遺伝子の変異解析の結果の解析の要約である。塗りつぶされた四角形はＮＲＦ２又はＫＥＡＰ１遺伝子の変異、あるいは、ｍｉＲＮＡの現低下を各々のケースにおいて示している。各々のケースにおける異常の数は、異常スコア（０〜４）として示され、３０症例は異常スコアに基づいて２つのグループに割り当てられた；ハイスコア群（ｎ＝１４；異常スコアは２〜４）とロースコア群（ｎ＝１６；異常スコアは０又は１）である。図５（ｂ）は、異常スコアに照らしてＥＳＣＣの３０患者全ての生存率を示すKapian-Meier曲線である。ハイスコア群は顕著に悪い生存率と関連している（ｐ＝０．００４，log-rank test）。図５（ｃ）は、ハイスコア群（症例１、４、７）（上パネル）とロースコア群（症例２１、２５、２６）（下パネル）の原発性ＥＳＣＣにおけるＮＲＦ2蛋白の免疫染色の代表的な画像を示している。黒い棒はスケールバーで１００μｍを示している。

さらに図５−２は、食道がん（食道扁平上皮癌：ＥＳＣＣ）由来の原発腫瘍検体中のＮＲＦ２及びＫＥＡＰ１遺伝子の変異分析の結果を示す図面である。当該腫瘍検体のうち、ＮＲＦ２又はＫＥＡＰ１におけるアミノ酸の置換変異が認められた５検体において検出された変異を、配列クロマトグラフィーで示した。上段のａに示す３検体はＮＲＦ２遺伝子における変異が認められた例であり、下段のｂに示す２検体はＫＥＡＰ１遺伝子における変異が認められた例である。上矢印は、対応する正常組織中の野生型配列を示し、下矢印は、原発腫瘍組織中の変異配列及びアミノ酸配列の変化を示す。また最下段に示す、例えば「Ｄ７７Ｇ」は、「ＮＲＦ２遺伝子がコードする野生型アミノ酸配列の７７番目のＤ（アスパラギン酸）が、Ｇ（グリシン）に置換される変異」であることを示している（他の例について同様）。他のアミノ酸の一文字表記として、「Ｒはアルギニン」、「Ｑはグルタミン」、「Ｌはロイシン」、「Ｍはメチオニン」を、それぞれ示す。ＮＲＦ２遺伝子及びＫＥＡＰ１遺伝子の遺伝子塩基配列は公知であるが、これらをそれぞれ配列番号１７（ＮＲＦ２：NCBI Reference Sequence: NM_006164.4）及び配列番号１８（ＫＥＡＰ１：NCBI Reference Sequence: NM_012289.3）として示す。

これらの解析では原発腫瘍組織が対応する非腫瘍組織と比べて５０％以上の当該ｍｉＲＮＡレベルの低下は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７に対して９例（３０．０％）、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４に対して１２例（４０．０％）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａに対して２例（６．７％）、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐに対して１８例（６０．０％）であった（図５−１（ａ））。これに加えて突然変異解析により、ＮＲＦ２のミスセンス変異が３例（１０％）、ＫＥＡＰ１のミスセンス変異が２例（６．７％）認められた（図５−１（ａ）、５−２）。そして、上記の４種のｍｉＲレベルの低下、及び、２種の遺伝子のミスセンス変異の該当件数をそのままスコア（数）として示した指標である「異常スコア」を定義し、当該「異常スコア」に基づいて、ＮＲＦ２若しくはＫＥＡＰ１、及び／又は、各々のｍｉＲＮＡの負の調節を検討し、３０症例を２つの群に割り当てた。すなわち「異常スコア２〜４」の１４原発性ＥＳＣＣ症例は「高スコア群」、「異常スコア０又は１」の１６原発性ＥＳＣＣ症例は「低スコア群」とした（図５−１（ａ））。重要なことに「高スコア群」は顕著に遠隔転移と相関しており（ｐＭカテゴリー，ｐ＝０．０３９４，表５）、Kaplan-Meierの生存評価に認められる生存率の悪化を伴っていた（log rank test:ｐ＝０．００４）（図５−１（ｂ)）。

※表５においては「有意差有り」は太文字で示した。Ｐ値はΧ^２テスト又はフィッシャーの抽出テストを行い、両側評価で＜０．０５の場合を「有意差有り」と評価した。

ランダムに選択された原発性ＥＳＣＣ検体の免疫組織化学的解析は、ＮＲＦ２蛋白のレベルは「高スコア群」の方が「低スコア群」よりも著しく高いことを示した（図５−１（ｃ））。これらの知見は、これらのｍｉＲＮＡの発現の負の調節は、ＮＲＦ２又はＫＥＡＰ１の変異に加えて、原発性ＥＳＣＣ腫瘍におけるＮＲＦ２の安定化に寄与することを示している。さらに、「異常スコア」の増加を指標とすることにより、ＮＲＦ２が安定化した腫瘍を分別し、腫瘍の悪性度や、がん患者の予後を鑑別することができることを示している。

当該３０検体は、それぞれの抽出ＤＮＡを鋳型として、表３に列挙するプライマーを使用してＰＣＲによる遺伝子増幅を行い、そのＰＣＲ産物をサンガー法により配列決定した。その結果を示す配列クロマトグラフィーのチャートが図５−２である。当該図に示すように、ＮＲＦ２遺伝子に関し計３症例において、公知のアミノ酸置換を伴う機能獲得性の遺伝子変異（Ｄ７７Ｇ；１症例、Ｄ２９Ｇ；２症例）を検出した。また、ＫＥＡＰ１遺伝子に関して、計２症例においてアミノ酸置換を伴う遺伝子変異が認められ、一方は公知の機能喪失性の遺伝子変異（Ｒ３２０Ｑ）であり、異常スコアが「３」の症例４においては新規の遺伝子変異（Ｌ２７６Ｍ）を検出した。

［実施例４］ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の投与によるインビボでの腫瘍抑制効果
一つのｍｉＲＮＡは、一つのがん性経路に貢献する複数の遺伝子をターゲットにすることができるから、当該ｍｉＲＮＡはこのがん性経路を伴う腫瘍に対して効果的であると考えられる。そして、当該４つのｍｉＲＮＡのうちｈｓａ−ｍｉＲ−５０７について、それがＮＲＦ２によって転写制御されている遺伝子を機能的にターゲットとすることができるかどうかを、発現アレイと経路解析を用いて検討し、これらの解析においてｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のトランスフェクションによって抑制されている、８種類のＮＲＦ２の転写標的遺伝子を見出した。そしてそれらの中でＭＥ１は、ＮＲＦ２の３’−ＵＴＲへの結合を通じｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の直接的な標的であることを確認した（図６）。図６は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の標的としてのＮＲＦ２の転写標的遺伝子の同定の結果を示す図面である。図６（ａ）は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７により負に制御されたＮＲＦ２の転写標的遺伝子の検証の結果を示している。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７又はＮＲＦ２−ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより発現低下した遺伝子のうち、１８１は、TargetScanプログラムによりｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の標的として予測されたことを示している。図６（ｂ）は、ＩＰＡを用いて、１８１の遺伝子の中で、ＮＲＦ２の８つの転写標的（ＭＥ１，ＰＳＭＢ６，ＳＬＣ７Ａ１１，ＭＧＬＬ，ＤＮＡＪＢ５，ＬＧＡＬＳ８，Ｂ４ＧＡＬＮＴ１，ＥＩＦ４Ｇ２）が、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の標的とされることが予測されたことを示している。図６（ｃ）は、ＭＥ１３’−ＵＴＲ中のｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のためのシード配列及びレポータープラスミドのための設計のマッピングを示している。ルシフェラーゼ分析を行うことによって、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７が、ＭＥ１３’−ＵＴＲに直接的に結合するかを調べた結果を示している。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のためのシード配列は、ＭＥ１３’ＵＴＲ中にマッピングされている。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７（野生型；ＷＴ）のためのシード配列又はその突然変異体のゲノム領域を有するレポータープラスミドをルシフェラーゼ分析において用いた。黒色の十字形は変異部位を示している。図６（ｄ）は、レポータープラスミドを用いたルシフェラーゼ分析の結果を示している。レポータープラスミド及び内部標準コントロールベクターでＨｅＬａ細胞の共トランスフェクションを行い、２４時間後、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７又はコントロールｍｉＲＮＡでのトランスフェクションを行った結果を示している。ｍｉＲＮＡでのトランスフェクションの４８時間後、ホタル又はウミシイタケのルシフェラーゼ活性を測定した。コントロールｍｉＲＮＡでのトランスフェクト細胞のルシフェラーゼ活性に対するルシフェラーゼ活性を縦軸に示す。空ベクターのルシフェラーゼ活性よりＷＴ領域を持つベクターのルシフェラーゼ活性が弱かったが、シード配列中に変異を挿入することにより完全に修復された。バーは標準偏差（ＳＤ）である。図６（ｅ）は、ｍｉＲＮＡでのトランスフェクト細胞中のＭＥ１発現に関するウェスタンブロット分析の結果を示している。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７又はコントロールｍｉＲＮＡでＨｅＬａ細胞のトランスフェクションを行った結果を示している。トランスフェクションの４８時間後、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、指示された抗体での免疫反応を行い、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のトランスフェクションが、実際に、ＭＥ１タンパク質に関する発現レベルの低下を引き起こすことを確認した。

これらの図６に示す結果はｈｓａ−ｍｉＲ−５０７が、ＮＲＦ２とその標的遺伝子を直接的な標的とすることにより、ＮＲＦ２が仲介するがん性経路を阻害することができることを示すものである。

次に、インビボでＡ５４９細胞から形成された腫瘍の周囲の皮下スペースへの、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７を模した二本鎖ＲＮＡ若しくはコントロールｍｉＲＮＡの投与による腫瘍抑制効果を検討した。図７は、４つのｍｉＲＮＡの発現分析、及び、Ａ５４９細胞中のシスプラチン（ＣＤＤＰ）処理により引き起こされる細胞ストレス下での細胞生存に及ぼすｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のトランスフェクションの効果を示す図面である。

さらに、インビボでＡ５４９細胞から形成された腫瘍の周囲の皮下スペースへの、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７を模した二本鎖ＲＮＡ若しくはコントロールｍｉＲＮＡの投与による腫瘍抑制効果を検討した。カルボプラティン(carboplatin)とＮＲＦ２に特異的なｓｉＲＮＡの組み合わせ処理は、Ａ５４９細胞から形成された腫瘍の増大の阻害に有効であることが、ｓｉｎｇｈらによって報告されており、この細胞株はＫＥＡＰ１の変異と、ｈｓａ−ｍｉＲ４５０ａを除いたｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐの３種のｍｉＲＮＡの負の調節を伴う「高スコア群」に割り当てられた（図７（ａ））。図７（ａ）は、４つのｍｉＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、−６３４、−４５０ａ、及び−１２９−５ｐの、ｑＲＴ−ＰＣＲによる発現分析である。内部標準コントロールとしてＲＮＵ６Ｂの発現レベルを用いた。正常肺組織における発現レベルに対するＡ５４９細胞における発現レベルを縦軸に示す。バーは標準偏差（ＳＤ）である。

また、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の外因的な過剰発現が、緩慢に細胞増殖を阻害することと、インビボにおけるシスプラチンによる細胞ストレスに対する感受性の増加を示した（図７（ｂ）、７（ｃ））。図７（ｂ）は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７でのトランスフェクトＡ５４９細胞における細胞増殖分析ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７又はコントロールｍｉＲＮＡでＡ５４９細胞のトランスフェクションを行い、生きている細胞の数を、示された日にＣＶ染色分析により測定した結果を示している。相対細胞増殖率を縦軸に示す。バーは標準偏差（ＳＤ）である。Student"s t-testにより有意差を分析した。その結果、^＊ｐ＝０．０１７２（２日目）、ｐ＝０．０２９３（４日目）、ｐ＝０．００６７（６日目）、であった。図７（ｃ）は、Ａ５４９細胞中でシスプラチン（ＣＤＤＰ）により引き起こされる細胞ストレス下での細胞生存に及ぼすｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のトランスフェクションの効果を示している。具体的には、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７又はコントロールｍｉＲＮＡで当該細胞のトランスフェクションを行い、次の日に、ＰＢＳ又はシスプラチン（２μＭ）で４８時間処理し、コントロールｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡでのトランスフェクト細胞について、未処理細胞中の細胞生存率に対する細胞生存率を、ＣＶ染色分析により評価した。バーは標準偏差（ＳＤ）である。ｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡ（二要因の分散分析）により有意差を分析した。その結果、^＊ｐ＝０．０００２（コントロールｍｉＲＮＡとｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の間）、ｐ＝０．１８４４（ＰＢＳとＣＤＤＰの間）であった。相互作用（ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７×ＣＤＤＰ）は、ｐ＝０．００４９であった。Ｆ_ｍｉＲ− _５０７＝４３．２００６、Ｆ_ＣＤＤＰ＝１１．２５６４、Ｆ_{ｍｉＲ−５０７×ＣＤＤＰ}＝１４．７６６５、であった。

図８は、インビボにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の腫瘍抑制効果を示す図面である。図８（ａ）は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７とシスプラチン（ＣＤＤＰ）の組み合わせ投与の実験スケジュールである。腫瘍は、ヌードマウスにＡ５４９細胞を皮下注射することによって形成された。コントロールｍｉＲＮＡ又はｈｓａ−ｍｉＲ−５０７はＡ５４９細胞から皮下に形成された腫瘍の周囲に全部で４回投与された（Ａ５４９細胞の注射から７、１４、２１及び２８日後）。加えてマウスは、ＰＢＳ又はシスプラチンの腹腔内投与を翌日に３回受けた（Ａ５４９細胞の注射から８、１５、２２日後）。Ａ５４９細胞の注射から３５日後にマウスは安楽死され、腫瘍は摘出された。腫瘍の重量はｈｓａ−ｍｉＲ−５０７との組み合わせにおけるＰＢＳとシスプラチンの補助的使用により顕著に減少した（図８（ｂ）、８（ｃ））。図８（ｂ）は、腫瘍が形成されたマウスの典型的な画像（左）とＡ５４９細胞の注射から３５日後に摘出された腫瘍（右）である。なお、左のマウスの画像において２カ所の白抜き文字の「ｍｉＲ−５０７」は、いずれも「ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７」である。図８（ｃ）は、摘出された腫瘍の重量を示している。マウスはＡ５４９細胞の注射から３５日後に安楽死され各々の摘出された腫瘍の重量が計量された。グラフは４個体のＰＢＳが用いられたマウスと３個体のシスプラチンが用いられたマウスにおける「平均±ＳＤ値」を示している。顕著な差違がｔｗｏ−ｗａｙＡＮＯＶＡ（二要因の分散分析）によって解析された：ｐ＝０．０４８６がコントロールｍｉＲＮＡ群とｈｓａ−ｍｉＲ−５０７群間で認められ、ｐ＝０．５７１６がＰＢＳ群とシスプラチン群間で認められた。連関性（ｈｓａ−ｍｉＲ５０７×ＣＤＤＰ）はｐ＝０．８７５７であり、Ｆ_ｍｉ _{Ｒ−５０７}＝１７０．６６７、Ｆ_ＣＤＤＰ＝１３０４４４４、Ｆ_{ｍｉＲ−５０７×ＣＤＤ} _Ｐ＝０．０２６６０１であった。

加えて、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の発現増加に伴うＮＲＦ２とＭＥ１蛋白の負の調節が、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７処理を施した腫瘍において確認された（図８（ｄ）、８（ｅ））。図８（ｄ）は、摘出された腫瘍におけるｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の発現解析を示している。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のｍＲＮＡの発現レベルはｑＲＴ−ＰＣＲによって計測された。ＲＮＵ６Ｂの発現は、内部標準コントロールとして用いられた。ＰＢＳが用いられたマウスのうちコントロールｍｉＲＮＡが投与されたマウス腫瘍に対応する発現レベルは縦軸に示されている。バーは標準偏差（ＳＤ）を示している。図８（ｅ）は、摘出された腫瘍におけるＮＲＦ２とＭＥ１の免疫染色の典型的な画像である。スケールバーは１００μｍを示している。

このようにこれらの結果は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７は、ＮＲＦ２が介在するがん性経路を標的にすることにより、腫瘍の増大を阻害することが可能であることを示している。これらのことは、本発明におけるｍｉＲＮＡを基礎とする分子的な検査と、ＮＲＦ２が安定化した腫瘍における治療の有効性を示している。

また、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７とシスプラチンを組み合わせて投与することにより、相乗的な抗がん効果が発揮され得ることが明らかになった。すなわち本発明により、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の塩基配列である配列番号１を含む核酸からなるがん治療剤とシスプラチン等のプラチナ製剤を組み合わせてなるがん治療剤が提供される。なお、ここでｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の塩基配列である配列番号１を含む核酸からなるがん治療剤とシスプラチン等のプラチナ製剤の組み合わせの態様は、特に限定されない。同一の組成物の中に両剤が含有されていてもよいし、両剤を別々に投与してもよい。投与時間の前後・同時を問わないことも前述した通りである。ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の塩基配列である配列番号１を含む核酸からなるがん治療剤の投与態様は前述した通りであり、例えば、シスプラチンの投与態様は、公知の方式に従う。具体的には、通常大人一人当たり一日７０〜８０mg／ｍ^２（体表面積）を、一日１回程度で、２〜５ヶ月間を投薬期間とし、投薬頻度（概ね１〜４週に１度）を決めて、通常は点滴にて投与される。

［実施例５］ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の投与による抗腫瘍効果
（１）ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の投与によるインビトロでの腫瘍の細胞死誘導効果（１）（図９）
図９は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導効果についてインビトロで検討した結果を示す図面である。ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４のインビトロでの腫瘍抑制効果を調べるために、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を模した二本鎖ＲＮＡ若しくはコントロールｍｉＲＮＡをリポフェクション法により子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞に導入し、その後、３日間培養した。導入１、２、３日後、それぞれ１％クリスタルバイオレットを含むＰＢＳ溶液で１分間染色し、水洗浄後、２％ＳＤＳを含むＰＢＳバッファーにより１時間反応させた。その後、マルチプレートリーダーにより、染色強度を測定することにより、生存細胞の定量を行った。その結果、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を発現させた細胞では、顕著な細胞増殖抑制および細胞死の誘導が確認された。ここで図９（Ａ）は導入２日後の顕微鏡像であり、ＨｅＬａ細胞に対して、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４をトランスフェクトして、これを５％ＣＯ_２・３７℃で４８時間インキュベートした際の形態変化を顕微鏡写真にて表している。上段がコントロールｍｉＲをトランスフェクトした細胞であり、下段がｈｓａ−ｍｉＲ−６３４をトランスフェクトした細胞である。右側の写真は左側の写真の拡大図である。図９（Ｂ）は経時的な細胞増殖の抑制効果を追った結果を示しており、上記図９（Ａ）のインキュベートを行いつつ、１日後、２日後及び３日後における細胞増殖の傾向を、ＣＶ染色による蛍光強度を指標に検討した図面である。Ｍｏｃｋのみ用いた細胞群、コントロールｍｉＲをトランスフェクトした細胞群、及び、ｍｉＲ−６３４をトランスフェクトした細胞群における結果を示している。

さらに導入２日後において、遠心により細胞を回収し、その細胞ペレットを、７０％エタノールを含むＰＢＳで３０分間４℃にて固定した。その後、ＲＮａｓｅ処理を行った後、ＰＩ溶液（１μｇ／ｍｌ）で染色し、フローサイトメーターを用いて、ＦＡＣＳ解析を行った（図９（Ｃ））。左のチャートはコントロールｍｉＲをトランスフェクトした細胞の分布を示し、右のチャートはｈｓａ−ｍｉＲ−６３４をトランスフェクトした細胞の分布を示している。その結果、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を発現させた細胞では、アポトーシス細胞を示すＳｕｂＧ１領域の細胞（ピークＧ１）が顕著に増加していたことが分かった。

これらのことから、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の腫瘍細胞への導入によりアポトーシスを介した細胞死を誘導することが可能であり、明らかな腫瘍の抑制効果が認められた。この結果は、本発明のがん治療剤の明白ながん治療効果を裏付けている。

（２）ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４とシスプラチンの投与によるインビトロでの腫瘍の細胞死誘導効果（２）（図１０）
ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を模した二本鎖ＲＮＡ若しくはコントロールｍｉＲＮＡをリポフェクション法により食道癌細胞株ＫＹＳＥ１７０に導入した。図１０の上段には、このｈｓａ−ｍｉＲ−６３４とシスプラチン（ＣＤＤＰ）の組み合わせ投与のｉｎｖｉｔｒｏ実験スケジュールを示した。このスケジュールに記載されているように、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を模した二本鎖ＲＮＡ若しくはコントロールｍｉＲＮＡの添加量は、それぞれ０．２ｎＭであり、シスプラチンを２．５μＭ添加した群と、５．０μＭ添加した群についてインキュベートを行い、検証した。インキュベート時間は７２時間である。細胞死の誘導効果は、トリパンブルー染色により、細胞死した細胞をカウントし、全細胞数に対する細胞死した細胞数の頻度（％）で評価した。図１０の下段のグラフはその結果を示している。縦軸が前記頻度を示している。特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４とシスプラチンを同時投与された細胞では、高頻度に細胞死が誘導されていることを表している。これにより、本発明の治療剤とシスプラチンとの併用による相乗的な抗がん効果が明らかになった。

（３）ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４とシスプラチンの投与によるインビボでの腫瘍の細胞死誘導効果（図１１）
インビボでのｈｓａ−ｍｉＲ−６３４とシスプラチンの併用効果の検討は、ヌードマウスにＫＹＳＥ１７０細胞を皮下注射することによって腫瘍を形成させることにより行った。図１１の上段には、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を模した二本鎖ＲＮＡ若しくはコントロールｍｉＲＮＡと、シスプラチン（ＣＤＤＰ）の組み合わせ投与のｉｎｖｉｖｏ実験スケジュールを示した。腫瘍を形成させるためのインキュベート期間は７日間である。インキュベート７日目に、コントロールｍｉＲＮＡ又はｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を、ＫＹＳＥ１７０細胞によりヌードマウスの皮下に形成された腫瘍の周囲に計５回注射により投与した。加えてマウスにおける、ＰＢＳ又はシスプラチンの腹腔内投与は、ｍｉＲＮＡ投与の１回目と４回目に、ｍｉＲＮＡ投与と同時に計２回行った。ＫＹＳＥ１７０細胞の注射から２１日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出した。図１１の下段のグラフは、摘出された腫瘍の重量（縦軸）を示している。当該下段のグラフにおいては７個体のＰＢＳが用いられたマウスと、８個体のシスプラチンが用いられたマウスにおける、腫瘍の重量の「平均±ＳＤ値」を示している。両群間における顕著な差違がｔ−ｔｅｓｔによる解析により明らかになった。すなわち、ｐ＝０．０１８２がシスプラチン処理群でコントロールｍｉＲＮＡ群とｈｓａ−ｍｉＲ−６３４投与間で認められ、ｐ＝０．００８１３がｈｓａ−ｍｉＲ−６３４投与群でＰＢＳとシスプラチン間で認められた。

（４）ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の骨肉腫細胞における標的遺伝子の発現抑制効果の検討
図１２（図１２−１〜４）は、骨肉腫細胞株であるＵ２ＯＳ細胞へのｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の導入による標的遺伝子の発現抑制効果を示している。図１２−１〜４の各図面の左側のグラフに結果を示したルシフェラーゼアッセイは、前述の「伝統的なルシフェラーゼアッセイ」の手法に従って行った。すなわち、各標的遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をpmirGlo Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector（プロメガ社）のルシフェラーゼ遺伝子の下流に挿入することにより、各々の検討に用いるルシフェラーゼリポータープラスミドを調製した。各々の標的遺伝子は、(a)ＸＩＡＰ (X-linked inhibitor of
apoptosis protein：図１２−１)、 (b)ＡＰＩＰ (APAF1 interacting protein：図１２−２)、 (c)ＯＰＡ１(optic atrophy 1：図１２−３)、及び、(d)ＴＦＡＭ(transcription factor A, mitochondrial：図１２−４)、である。これらの４種の蛋白をコードする遺伝子のＵＴＲのシード配列を、配列番号５２（ＸＩＡＰ）、５３（ＡＰＩＰ）、５４（ＯＰＡ１）、及び、５５（ＴＦＡＭ）にて、配列表において示した。また全ての部位特異性変異は、ＫＯＤ mutagenesis kit（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて行った。また、各グラフの「ｍｔ」は、各々の変異挿入プラスミド（ｍｕｔａｎｔ：ｍｔ）を示している。

ルシフェラーゼレポータープラスミド、又は、変異挿入プラスミド（ｍｔ）と、内部標準コントロールとしてのｐＴＫプラスミドには、共にＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクトされ、次の日にｈｓａ−ｍｉＲ−６３４に模した二本鎖ＲＮＡ、コントロールｍｉＲＮＡをトランスフェクトした。２日後、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase Reporter Assay System（プロメガ社）を用いて計測し、相対的ルシフェラーゼ活性は、対応する内部標準コントロールのウミシイタケルシフェラーゼで読み取りながらホタルルシフェラーゼ活性を標準化することにより算出された。

これらのルシフェラーゼアッセイの結果により、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４には、腫瘍細胞における上記の標的遺伝子各々の３’ＵＴＲ領域のシード配列に直接的に結合し、これらの遺伝子の発現抑制を行う機能があることが明らかになった。また、これらの標的遺伝子発現の亢進が、がん細胞の悪性度を増長し、これらの遺伝子の発現状態を本発明の測定方法の指標として加入することにより、さらに測定の信頼性を高めることが可能であることも明らかになった。

さらに、図１２−１〜４の各図面の右側の電気泳動図に結果を示したウェスタンブロッティングは、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４を模した二本鎖ＲＮＡ若しくはコントロールｍｉＲＮＡをリポフェクション法により骨肉腫細胞株Ｕ２ＯＳ細胞に、２ｎＭまたは２０ｎＭ導入して調製した。このように調製された各々の全細胞の溶解物はＳＤＳ−ＰＡＧＥに付されて、蛋白はＰＶＤＦメンブレン（ＧＥヘルスケア社）に転写された。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と５％のスキムミルクを含有するＴＢＳで１時間ブロッキングを行った後、当該膜を抗体と共に一晩反応した。初期の抗体の希釈は、抗ＸＩＡＰウサギ抗体（１／１０００希釈）、抗ＡＰＩＰウサギ抗体（１／１０００希釈）、抗ＯＰＡ１ウサギ抗体（１／１０００希釈）、抗ＴＦＡＭウサギ抗体（１／１０００希釈）、及び、抗βアクチンマウス抗体（１／５０００希釈）であった。当該膜は洗浄され、ＨＲＰ結合抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ抗体（共に１／２０００希釈）で２時間曝露した。結合した抗体は、ＨＲＰ染色溶液又はＥＣＬウェスタンブロッティングキット（セルシグナリングテクノロジー社）の操作用マニュアルに従って、視覚化された。

これらのウェスタンブロッティングの結果により、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の腫瘍細胞へ導入することにより、各々の標的遺伝子のタンパク質レベルが低下することを示している。

ここに示されたルシフェラーゼアッセイとウェスタンブロティングの結果は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４のがん治療剤としての優れた効果を示すと共に、特に、ＮＲＦ２は無論のこと、これに加えて、ＸＩＡＰ、ＡＰＩＰ、ＯＰＡ１、又は、ＴＦＡＭの遺伝子発現が亢進又は安定化したがん細胞に対して、特に有用であることを示している。

また、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４とシスプラチンを組み合わせて投与することにより、相乗的な抗がん効果が発揮され得ることが明らかになった。すなわち本発明により、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２を含む核酸からなるがん治療剤とシスプラチン等のプラチナ製剤を組み合わせてなるがん治療剤が提供される。なお、ここでｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２を含む核酸からなるがん治療剤とシスプラチン等のプラチナ製剤の組み合わせの態様は、特に限定されない。同一の組成物の中に両剤が含有されていてもよいし、両剤を別々に投与してもよい。投与時間の前後・同時を問わないことも前述した通りである。ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２を含む核酸からなるがん治療剤の投与態様は前述した通りであり、例えば、シスプラチンの投与態様は、公知の方式に従う。投与態様は前述した通りであり、例えば、シスプラチンの投与態様は、公知の方式に従う。具体的には、通常大人一人当たり一日７０〜８０mg／ｍ^２（体表面積）を、一日１回程度で、２〜５ヶ月間を投薬期間とし、投薬頻度（概ね１〜４週に１度）を決めて、通常は点滴にて投与される。

上述のように、本発明者らはＮＲＦ２遺伝子を直接標的とするｍｉＲＮＡが、ＮＲＦ２が介在するがん性経路を抑制することを見出し、本発明を完成した。ＮＲＦ２は、ＮＲＦ２の機能獲得型変異、ＫＥＡＰ１の機能喪失型変異、及び、ｐ６２蛋白の蓄積によるＫＥＡＰ１の機能的不活性化を含むサバイバル機構により、多くのタイプのヒトのがんにおいて構造的に安定化されている。本発明者らは特定のｍｉＲＮＡが、がんの症例において異常低値調整が認められることを示した。重要なことは、ＮＲＦ２若しくはＫＥＡＰ１の変異と、さらにｐ６２蛋白の蓄積と同時に起こる一つ若しくはそれ以上のｍｉＲＮＡの異常低値調整が、腫瘍におけるＮＲＦ２の安定性とがん患者の予後不良と密接に連関していることであった。

さらに本発明者らは、直接的にＮＲＦ２を標的とする特定のｍｉＲＮＡの発現状態の検討を行い、これらのｍｉＲＮＡの低値調整は、基礎的なＮＲＦ２活動レベルを増大させることを助け、腫瘍におけるＮＲＦ２又はＫＥＡＰ１の遺伝子異常、並びにｐ６２蛋白の蓄積と一緒に若しくは別個に、ＮＲＦ２蛋白を相乗的に安定化させていることを明らかにした。

本発明者らは上記の事実に基づき、がんの悪性度やがん患者の予後を鑑別することが可能な本発明の測定方法を提供するに至ったのである。

ＮＲＦ２、ＫＥＡＰ１、又はｐ６２の各蛋白の蓄積、さらに、ＸＩＡＰ、ＡＰＩＰ、ＯＰＡ１、又はＴＦＡＭの各遺伝子の発現の亢進又は安定化は、ＮＲＦ２が安定化した腫瘍のスクリーニングを行う際の指標となる。それと同時に、腫瘍のＮＲＦ２活性を阻害すること自体は、ＮＲＦ２が安定化された腫瘍の治療に対するまさに合理的なアプローチである。

従来の研究によっても、一つのｍｉＲＮＡは各々の遺伝子の３’−ＵＴＲに直接結合することにより、複数の標的の発現を阻害することができることが示されている（非特許文献２５）。このことは、一つのｍｉＲＮＡは一つの情報伝達系に係わっているいくつかの遺伝子を同時に標的とすることを示唆している。実際にｍｉＲ−１６は、ＣＤＫ１とＣＤＫ２を直接的な標的とすることによりセルサイクルをネガティブに調整することが報告されている（非特許文献２６）。

さらにｍｉＲ−３４ａは、複合遺伝子ＣＣＮＤ１，ＣＤＫ４，ＣＤＫ６，ＭＹＣを直接標的とすることにより、腫瘍増大と転移のネガティブ調節因子として働くことが知られている（非特許文献２７）。本発明者らはｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の投与は、ＮＲＦ２の転写標的であるＮＲＦ２とＭＥ１を標的とすることにより、実際にヌードマウスにおけるＡ５４９細胞から形成された腫瘍の増大を阻害する効果が認められることを示した。本発明者らによるインビボにおける解析により、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７のトランスフェクションは、Ａ５４９細胞におけるシスプラチン等のプラチナ製剤の細胞成長抑制の感受性の増加に導くことが明らかとなった。化学療法の際の細胞ストレスに対する抵抗性の獲得に加えて、ＮＲＦ２は代謝の調節による腫瘍細胞の増大をも後押しする。これに対して本発明者らは、インビトロとインビボの両方でｈｓａ−ｍｉＲ−５０７によって腫瘍の増大が阻害されることを示した。このｈｓａ−ｍｉＲ−５０７による成長阻害は、ＮＲＦ２とその標的遺伝子の抑制を通じての内的代謝の変化に起因する可能性がある。

本発明者らは、さらにｈｓａ−ｍｉＲ−６３４のインビトロとインビボでの腫瘍抑制効果を明らかにした。この腫瘍抑制効果は、腫瘍細胞をアポトーシスに導くことにより実現されるものであった。さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４とシスプラチン等のプラチナ製剤を併用することによって、著しく増強されることが見出された。この事実も、本発明のがん治療剤の有効性を強く裏付けるものである。

如上のように本発明は、ｍｉＲＮＡに基づく分子的診断と、ＮＲＦ２等が安定化した腫瘍の治療の新たな手段を提供するものである。

Claims

ヒト検体における、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上を定量して、当該定量値の低下を指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、がん患者の予後、を鑑別することを特徴とする、マイクロＲＮＡの測定方法。
ヒト検体における、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａ、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐ、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上を定量して、当該定量値の低下を指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、がん患者の予後、を鑑別することを特徴とする、マイクロＲＮＡの測定方法。
ヒト検体における、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２＊、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９、からなる群のマイクロＲＮＡから選ばれる１種又は２種以上を定量して、当該定量値の上昇を指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、患者の予後、を鑑別することを特徴とする、マイクロＲＮＡの測定方法。
さらに腫瘍におけるＮＲＦ２遺伝子の変異、ＫＥＡＰ１遺伝子の変異、及び、ｐ６２蛋白の蓄積、からなる群から選ばれる１〜３種を検出して、これらの遺伝子変異を指標として加入することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のマイクロＲＮＡの測定方法。
さらに腫瘍におけるＸＩＡＰ、ＡＰＩＰ、ＯＰＡ１、及び、ＴＦＡＭからなる群から選ばれる１〜４種の遺伝子の発現の亢進又は安定化を検出して、これらを指標として加入することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロＲＮＡの測定方法。
腫瘍の悪性度の増大、ＮＲＦ２の活性化、又は、がん患者の予後の悪化、に向かうことを示す個別指標の総数をスコア指標として、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、患者の予後、を鑑別することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のマイクロＲＮＡの測定方法。
ヒト検体は腫瘍検体又は血液検体であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロＲＮＡの測定方法。
食道がん、肺がん、乳がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、子宮がん、若しくは、皮膚がんにおける、腫瘍の悪性度、ＮＲＦ２の活性化、又は、患者の予後、を鑑別することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロＲＮＡの測定方法。
ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の塩基配列である配列番号１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａの塩基配列である配列番号３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐの塩基配列である配列番号４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３９の塩基配列である塩基配列５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３７の塩基配列である配列番号６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３の塩基配列である配列番号７、及び、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６の塩基配列である配列番号８、からなる群の塩基配列から選ばれる１種又は２種以上を含む核酸からなるがん治療剤。
ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の塩基配列である配列番号１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５０ａの塩基配列である配列番号３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−５ｐの塩基配列である配列番号４、からなる群の塩基配列から選ばれる１種又は２種以上を含む核酸からなるがん治療剤。
核酸は二本鎖ＲＮＡであることを特徴とする、請求項９又は１０に記載のがん治療剤。
がん細胞に対するストレスの付与手段と組み合わせて用いることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれかに記載のがん治療剤。
がん細胞に対するストレスの付与手段は、抗癌剤、放射線療法、外科的手術、又は、生検、であることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれかに記載のがん治療剤。
がん細胞は、ＮＲＦ２が亢進又は安定化したがん細胞である、請求項９〜１３のいずれかに記載のがん治療剤。
がん細胞は、ＮＲＦ２に加えて、ＸＩＡＰ、ＡＰＩＰ、ＯＰＡ１、及び、ＴＦＡＭからなる群から選ばれる１〜４種が亢進又は安定化したがん細胞である、請求項１４に記載のがん治療剤。
がん治療剤の本質成分は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２を含む核酸からなる、請求項１５に記載のがん治療剤。
（１）プラチナ製剤、及び、（２）ｈｓａ−ｍｉＲ−５０７の塩基配列である配列番号１を含む核酸又はｈｓａ−ｍｉＲ−６３４の塩基配列である配列番号２を含む核酸、を組み合わせてなる、がん治療剤。
プラチナ製剤はシスプラチンである、請求項１７に記載のがん治療剤。
がん細胞は、食道がん、肺がん、乳がん、口腔がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、子宮がん、骨肉腫、又は、皮膚がんのがん細胞であることを特徴とする、請求項９〜１８のいずれかに記載のがん治療剤。
請求項９〜１９のいずれかに記載のがん治療剤を含有することを特徴とする、がん治療のための医薬組成物。