BR112014016877B1 - Molécula de l-ácido nucleico capaz de se ligar a c5a humana, seus usos, bem como composição farmacêutica, complexo, método para a seleção de um antagonista de uma atividade mediada por c5a e kit para a detecção de c5a - Google Patents

Molécula de l-ácido nucleico capaz de se ligar a c5a humana, seus usos, bem como composição farmacêutica, complexo, método para a seleção de um antagonista de uma atividade mediada por c5a e kit para a detecção de c5a Download PDF

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Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO L, SEUS USOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPLEXO, MÉTODO PARA AVALIAÇÃO DE UM ANTAGONISTA DE UMA ATIVIDADE MEDIADA POR C5A, KIT E MÉTODO PARA A DETECÇÃO DE UM ÁCIDO NUCLEICO L. A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a C5a humana, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma extensão central de nucleotídeos, em que a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGAC-GCA 3' [SEQ ID NO: 61], em que n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e G, A, U, C, H, K e R são ribonucleotídeos e dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.

Description

[001] A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a C5a e /C5, ao uso da mesma para a fabricação de um medicamento, um agente de diagnóstico e um agente de detecção, respectivamente, uma composição compreendendo a dita molécula de ácido nucleico, um complexo compreendendo a dita molécula de ácido nucleico, um método para avaliação de um antagonista de uma atividade mediada por C5a e /C5 usando a dita molécula de ácido nucleico e um método para a detecção da dita molécula de ácido nucleico.
[002] A estrutura primária da anafilatoxina humana C5a (fator de complemento 5a; registro SwissProt P01031) foi determinada em 1978 (Fernandez & Hugli, 1978). Ela consiste em 74 aminoácidos sendo responsáveis por um peso molecular de 8.200 Da enquanto a porção carboidrato é responsável por aproximadamente 3.000 Da. A porção carboidrato de C5a existe como uma unidade de oligossacarídeo complexa única ligada a uma asparagina na posição 64. As três ligações dissulfeto conferem uma estrutura rígida, estável, à molécula.
[003] Embora uma estrutura tridimensional de formas de C5a de espécies de mamíferos diferentes tenha sido geralmente mantida, a sequência de aminoácido não foi particularmente bem conservada durante a evolução. Alinhamento de sequência demonstra 64% de identidade de sequência geral de C5a humana e de camundongo. C5a humana compartilha as porcentagens que seguem de aminoácidos idênticos com C5a de: • Macaca mulata (macacos rhesus) 85% • Macaca fascicularis (macaco cinomólogo) 85% • Bos taurus (bovino) 69% • Sus scrofa (porco) 68% • Mus musculos (camundongo) 64% • Rattus norvegicus (rato) 61%
[004] Além da homologia de sequência limitada, glicosilação é também heterogênea. Enquanto C5a humana é glicosilada em asparagina 64, o homólogo de murino não é glicosilado de modo algum. As proteínas humanas mais distantemente relacionadas C3a e C4a compartilham apenas 35 e 40%, respectivamente, de identidade com C5a.
[005] O sistema complementar foi encontrado no início do último centenário como uma fração de soro sensível ao calor que "complementava" a lise mediada por antissoro de células e bactérias. Sendo um componente humoral da resposta imune não específica natural (inata), ela desempenha um papel essencial em defesa do hospedeiro contra agentes infecciosos e no processo inflamatório. Complemento pode ser ativado via três cursos distintos (i) após um anticorpo se ligar a uma superfície celular ou bactérias (referido como curso clássico), (ii) diretamente por glicolipídeos bacterianos ou virais (referido como curso alternativo) ou (iii) através de carboidratos em bactérias (referido como curso de lectina). Todos esses cursos de ativação convergem no ponto de ativação dos componentes do complemento C3 e C5, em que o curso terminal comum se inicia, culminando em montagem do complexo de ataque de membrana (abr. MAC) (Membrane Attack Complex). O sistema complemento consiste em mais de 20 proteínas solúveis que funcionam ou como enzimas proteolíticas ou como proteínas de ligação e perfazendo cerca de 10% das globulinas totais em soro de vertebrado. Ainda, o sistema complemento inclui receptores de superfície celular distintos múltiplos que exibem especificidade para fragmentos proteolíticos de proteínas de complemento e que são expressos por células inflamatórias e células que regulam a resposta imune adaptativa. Há várias proteínas reguladoras que inibem ativação de complemento e então protegem as células hospedeiro de ataque de complemento acidental. O sistema complemento pode se tornar ativado independentemente ou junto com a resposta imune adaptativa.
[006] As funções de complemento incluem o processo de opsonização (isto é, tornando as bactérias mais suscetíveis à fagocitose), lise de bactérias e células estranhas através da inserção de um poro em sua membrana (referido como complexo de ataque de membrana), geração de substâncias quimiotaticamente ativas, aumento de permeabilidade vascular, evocação de concentração de músculo liso e promoção de desgranulação de mastócitos. Similar à cascata de coagulação, o processo de ativação de complemento é organizado em etapas enzimáticas sequenciais também conhecidas como uma cascata enzimática (Sim e Laich, 2000). A sequência detalhada dessas interações é mostrada a seguir.
[007] Curso Clássico. Este curso de ativação dependente de anticorpo complementa a resposta de anticorpo específica. Ele é elaboradamente controlado como o curso alternativo, mas não tem a habilidade de início espontâneo, isto é, a função de reconhecimento independente de anticorpo, e o mecanismo de amplificação de feedback. Dentre os ativadores do curso clássico estão complexos antígeno-anticorpo, β-amiloide, DNA, ácido poli-inosínico, complexos de poliânion-policátion tal como heparina/protamina, alguns vírus envelope, cristais de urato monossódico, lipídeo A de paredes de célula bacteriana, ácido plicático e polissacarídeo de veneno, membranas subcelulares (tais como mitocôndrias), bem como enzimas derivadas de célula e plasma tais como plasmina, calicreína, fator Hageman ativado, elastase ou catepsinas. O curso clássico induzido por anticorpo começa com C1, que se liga ao fragmento Fc de um anticorpo (IgM > IgG3 > IgG1 >> IgG2) ligado a um antígeno de superfície celular. C1 é um complexo de reconhecimento composto de 22 cadeias de polipeptídeo em 3 subunidades: C1q, C1r, C1s. C1q é a porção de reconhecimento real, uma glicoproteína contendo um domínio tipo colágeno (exibindo resíduos hidroxiprolina e hidroxilisina) que parece um buquê de tulipas. Quando da ligação via C1q, C1r é ativado para se tornar uma protease que cliva C1s para uma forma que ativa (através de clivagem) ambos C2 e C4 em C2a/b e C4a/b. C2a e C4b se combinam para produzir C4b2a, a C3 convertase (enzima de ativação de C3). C4a tem apenas atividade de anafilatoxina fraca, mas não é quimiotática. C3 é central para todos os três cursos de ativação. No curso clássico, C4b2a convertase cliva C3 em C3a/b. C3a é uma anafilatoxina. Cb3 combina com C4b2 para formar complexo C4b2a3b (C5 convertase). C3b também se liga diretamente a células tornando-as suscetíveis à fagocitose (opsonização).
[008] Curso alternativo. Este curso não requer anticorpos para ativação e é de grande importância na defesa do hospedeiro contra infecções bacterianas e virais porque - diferente do curso clássico - ele é diretamente ativado pelas estruturas de superfície de microorganismos invasores tais como glicolipídeos ou endotoxinas bacterianas/virais. Outros ativadores são inulinas, eritrócitos de coelho, eritrócitos humanos desialilados, fator de veneno de cobra ou oligonucleotídeos de fosforotioato. As seis proteínas C3, Fatores B, D, H, I e properdinas juntos realizam as funções de início, reconhecimento e ativação do curso que resulta na formação de C3/C5 convertase ligada a ativador. A cascata começa com C3. Uma quantidade pequena de C3b é sempre encontrada em circulação como um resultado de clivagem espontânea de C3 ("C3-tickover"), mas as concentrações são geralmente mantidas muito baixas por degradação subsequente. No entanto, quando C3b se liga a açúcares em uma superfície celular, ela pode servir como um núcleo para ativação de curso alternativo. O Fator B se liga a C3b. Na presença de Fator D, Fator B ligado é clivado para Ba e Bb; Bb contém o sítio ativo para uma C3 convertase. Em seguida properdinas se ligam a C3bBb para estabilizar a C3bBb convertase na superfície celular levando à clivagem de moléculas de C3 adicionais. Finalmente, a C5 convertase alternativa C3bBb3b se forma, a qual clivam C5 em C5a/b. Uma vez presente, C5b inicia a montagem do complexo de ataque à membrana conforme acima descrito. Em geral, apenas células Gram-negativas podem ser diretamente lisadas por anticorpo mais complemento; células Gram-positivas são a maioria resistentes. No entanto, fagocitose é bastante aumentada através de opsonização com C3b (fagócitos tem receptores de C3b em sua superfície) e anticorpo não é sempre requerido. Ainda, o complemento pode neutralizar partículas de vírus ou através de lise direta ou através de prevenção de penetração viral de células hospedeiro.
[009] Curso de lectina. O curso de lectina ou lectina de ligação à manana (abr. MBL) (Mannan-Binding Lectin) mais recentemente encontrado depende de reconhecimento inato de substâncias estranhas (isto é, superfícies bacterianas). Este curso tem similaridades estruturais e funcionais com o curso clássico. Ativação do curso de lectina é iniciado pela proteína de fase aguda MBL, que reconhece manose em bactérias, IgA e provavelmente estruturas expostas por endotélio danificado. MBL é homóloga a C1q e dispara as serinas proteases associadas à MBL (abr. MASPs) (MBL Associated Serine Proteases), cujas três formas MASP1, MASP2 e MASP3 foram descritas. Ativação de curso de lectina adicional é virtualmente idêntica à ativação de curso clássico formando as mesmas C3 e C5 convertase. Ainda, há alguma evidência que MASPs sob as mesmas condições podem ativar C3 diretamente.
[0010] Curso terminal. Todos os três cursos de ativação convergem na formação de C5 convertase (C4b2a3b nos cursos clássico e de lectina, C3bBb3b no curso alternativo), que cliva C5 em C5a/b. C5a tem atividade de anafilatoxina potente e é quimiotática. O outro fragmento de C5 C5b funciona com seu sítio de ligação hidrofóbico como uma âncora na superfície da célula alvo para a qual o complexo de ataque de membrana lítico (MAC ou complexo de complemento terminal, abr. TCC) (Terminal Complement Complex) se forma. O MAC é montado a partir de cinco proteínas precursoras: C5b, C6, C7, C8 e C9. O evento final é a formação de oligômeros C9, que se inserem como canais de transmembrana na membrana plasmática levando à lise osmótica da célula. A montagem de MAC é controlada por fatores solúveis no plasma proteína S (também conhecida como vitronectina) e SP-40,40 (também conhecida como clusterina) e por CD59 e HFR (fator de restrição homólogo) nas membranas de célula hospedeiro. Muitos tipos de células são sensíveis à lise mediada por complemento: eritrócitos, plaquetas, bactérias, vírus possuindo um envelope de lipoproteína e linfócitos.
[0011] O sistema complementar é um mecanismo potente para início e amplificação de inflamação. Isso é mediado por fragmentos dos componentes do complemento. Anafilatoxinas são os melhores fragmentos definidos e são fragmentos proteolíticos das serinas proteases do sistema complemento: C3a, C4a e C5a. Anafilatoxinas não são apenas produzidas no curso de ativação de complemento, mas também a partir da ativação de outros sistemas de enzima que podem clivar diretamente C3, C4 e C5. Tais enzimas incluem trombina, plasmina, calicreína, enzimas lisossomais de tecido e leucócito e proteases bacterianas. As anafilatoxinas têm efeitos poderosos sobre paredes do vaso sanguíneo, causando contração do músculo liso (por exemplo, músculos íleo, bronquial, uterino e vascular) e um aumento em permeabilidade vascular. Esses efeitos mostram taquifilaxia específica (isto é, estimulação repetida induz respostas menores) e podem ser bloqueados por anti-histaminas; eles são provavelmente mediados indiretamente via liberação de histamina a partir de mastócitos e basófilos. C5a é o produto de clivagem N-terminal de 74 aminoácidos da cadeia α da plasmaproteína C5. Ela é ligada pelo receptor C5aR (também conhecido como C5R1 ou CD88) com alta afinidade, uma molécula presente em muitos tipos de célula diferentes: mais proeminentemente em neutrófilos, macrófagos, células de músculo liso e células endoteliais. C5a é de longe a anafilatoxina mais potente, aproximadamente 100 vezes mais eficaz do que C3a e 1000 vezes mais eficaz do que C4a. Esta atividade diminui na ordem C5a > histamina > acetilcona > C3a >> C4a.
[0012] C5a é extremamente potente na estimulação de quimiotaxia, aderência, geração de carga respiratória e desgranulação de neutrófilo. C5a também estimula neutrófilos e células endoteliais a apresentar moléculas de mais adesão; a injeção intravenosa de C5a, por exemplo, leva rapidamente à neutropenia em experimentos animais através do disparo de aderência de neutrófilos às paredes do vaso sanguíneo. Ligação do receptor de C5a de neutrófilo é seguida por mobilização de ácido araquidônico de membrana que é metabolizado para prostaglandinas e leucotrienos incluindo LTB4, outro quimioatraente potente para neutrófilos e monócitos. Seguindo ligação de receptores de C5a de monócito, IL-1 é liberada. Desta maneira, a liberação local de C5a em sítios de inflamação resulta em estímulos pró-inflamatórios poderosos. Na realidade, a liberação de C5a é conectada diretamente ou indiretamente com muitas condições agudas ou crônicas, tais como doenças associadas com complexo imune em geral (Heller e outros, 1999); asma (Kohl, 2001); choque séptico (Huber-Lang e outros, 2001); síndrome da resposta inflamatória sistêmica (abr. SIRS) (Systemic Inflammatory Response Syndrome); falência múltipla dos órgãos (abr. MOF) (Multiorgan Failure); síndrome do desconforto respiratório agudo (abr. ARDS) (Acute Respiratory Distress Syndrome); síndrome do intestino inflamatório (abr. IBD) (Inflammatory Bowel Syndrome) (Woodruff e outros, 2003); infecções; queimaduras graves (Piccolo e outros, 1999); lesão por reperfusão de órgãos tal como coração (van der Pals e outros, 2010), baço, bexiga, pâncreas, estômago, pulmão, fígado, rim, membros, cérebro, músculo esqueletal ou intestino (Riley e outros, 2000); psoríase (Bergh e outros, 1993); miocardite; esclerose múltipla (Muller-Ladner e outros, 1996); e artrite reumatoide (abr. RA) (Rheumatoid Arthritis) (Woodruff e outros, 2002).
[0013] Várias visões globais sobre a relação entre este sistema complemento e doenças são publicadas (Kirschfink, 1997; Kohl, 2001; Makrides, 1998; Walport, 2001a; Walport, 2001b).
[0014] Lesão celular por complemento ocorre como uma consequência de ativação ou do curso clássico ou do alternativo na superfície de uma célula. O MAC constitui uma organização supramolecular que é composta de aproximadamente vinte moléculas de proteínas e representando um peso molecular de aproximadamente 1,7 milhão Da. O MAC totalmente montado contém uma molécula de cada um de C5b, C6, C7 e C8 e várias moléculas de C9. Todos esses componentes de MAC são glicoproteínas. Quando C5 é clivada por C5 convertase e C5b é produzida, automontagem de MAC começa. C5b e C6 formam um complexo biomolecular estável e solúvel que se liga a C7 e o induz a expressar um sítio metastável através do qual o complexo trimolecular nascente (C5b-7) pode se inserir em membranas, quando ele ocorre em ou em proximidade grande com uma bicamada de lipídeo alvo. Inserção é mediada por regiões hidrofóbicas no complexo C5b-7 que aparecem seguindo ligação de C7 a C5b-6. C5b-7 ligado à membrana realiza montagem de MAC para um sítio de membrana e forma o receptor para C8. A ligação de uma molécula C8 a cada complexo C5b-7 dá origem a canais de transmembrana pequenos de menos do que 1 nm de diâmetro funcional que podem perturbar membranas bacterianas e de eritrócito alvo. Cada complexo C5b-8 ligado à membrana age como um receptor para moléculas C9 múltiplas e aparece para facilitar inserção de C9 no núcleo do hidrocarboneto da membrana celular. Ligação de uma molécula de C9 inicia um processo de oligomerização de C9 no sítio de ataque de membrana. Depois de pelo menos 12 moléculas terem sido incorporadas ao complexo, uma estrutura de canal distinta é formada. Desta maneira, o produto da extremidade consiste no complexo C5b-8 tetramolecular (com um peso molecular de aproximadamente 550 kDa) e poli-C9 tubular (com um peso molecular de aproximadamente 1.100 kDa). Esta forma de MAC, uma vez inserida nas membranas celulares, cria canais de transmembrana completos levando à lise osmótica da célula. Os canais de transmembrana formados variam em tamanho dependendo do número de moléculas C9 incorporadas à estrutura do canal. Embora a presença de poli-C9 não seja absolutamente essencial para a lise de células vermelhas do sangue ou de células nucleadas, ela pode ser necessária para a morte de bactérias.
[0015] O sistema complemento é principalmente benéfico na defesa do corpo contra invasão de micro-organismos. Os primeiros componentes da cascata de complemento são importantes para opsonização de agentes infecciosos seguido por sua eliminação do corpo. Ainda, eles servem várias funções normais do sistema imune tal como controle de formação e eliminação de complexos imunes ou eliminação de restos, tecidos mortos e substâncias estranhas. Todos os três cursos de ativação que reconhecem padrões moleculares diferentes que (no corpo saudável) definem uma disposição extensiva de não autoestruturas ajudam a controlar invasores. O curso de complemento terminal - que culmina na moldagem do MAC - representa uma linha adicional de defesa através da lise de bactérias e células estranhas.
[0016] A importância de um sistema complemento funcional se torna clara quando os efeitos de deficiências de complemento são considerados. Por exemplo, os indivíduos que não têm uma das proteínas do curso alternativo ou componentes finais (C3-C9) tendem a ter infecções graves com organismos pirogênicos, particularmente espécie Neisseria. Deficiências nos componentes de curso clássico (tais como C1, C2, C4) estão também associadas com risco aumentado, embora não tão fortemente elevado, de infecção. Componentes de complemento tais como C1 e MBL também têm a habilidade em neutralizar vírus através da interferência com a interação viral com a membrana de célula hospedeiro, desta maneira prevenindo entrada na célula.
[0017] Importante, embora clivagem de C5 leve a C5a bem como ao MAC, as características clínicas de deficiência de C5 não diferem notadamente daquelas de outras deficiências de componente terminal (por exemplo, C6, C7, C8, C9) sugerindo que a ausência de C5a não contribui significantemente para o quadro clínico em pacientes deficientes em C5. Desta maneira, a antagonização seletiva de C5a promete ser a influência ótima, de maneira que as funções de prevenção de doença a montante e a jusante normais de complemento permanecem intactas. Desta maneira, apenas a produção excessiva prejudicial da anafilatoxina pró-inflamatória é bloqueada.
[0018] O fato de camundongos deficientes em C5aR - embora eles sejam mais suscetíveis a infecções com Pseudomonas aeruginosa - parecerem de outra maneira normais sugere que o bloqueio da função de C5a não tem efeitos prejudiciais.
[0019] Vários compostos que se direcionam a C5a ou C5 ou ao respectivo receptor são conhecidos e foram testados com sucesso em modelos in vivo. Alguns deles foram testados adicionalmente em testes clínicos. O anticorpo humanizado específico de C5, eculizumabe, é aprovado para hemoglobinúria noturna paroxismal e mostrou eficácia no tratamento de síndrome urêmica hemolítica atípica (aHUS) (atypical Haemolytic Uraemic Syndrome), rejeição de aloenxerto renal mediado por anticorpo aguda e doença de aglutinina. Ele previne a clivagem de C5 e inibe a ação de ambas a C5a e a C5b. Além de anticorpos e fragmentos de anticorpo para C5 de estágio de pesquisa similar, os anticorpos que rompem seletivamente a interação C5a:C5aR (CD88) e deixam a clivagem de C5 e formação de MAC dependente de C5b não afetadas são de interesse especial. Exemplos são o mAb anti-C5a humanizado MEDI-7814 que está na Fase I de desenvolvimento clínico para o tratamento i.v. potencial de distúrbios inflamatórios e lesão de tecido e o anticorpo C5a TNX-558 para o qual, no entanto, nenhum desenvolvimento foi relatado desde 2007. Um anticorpo para o receptor C5a, neutrazumabe, está sob desenvolvimento para artrite reumatoide e acidente vascular cerebral (Ricklin & Lambris, 2007; Wagner & Frank, 2010).
[0020] Um aptâmero anti-C5 PEGuilado (ARC-1905) está em desenvolvimento pré-clínico para AMD. CCX168 é um inibidor de C5aR de molécula pequena atualmente na Fase II de desenvolvimento clínico para vasculite associada a autoanticorpo citoplásmico antineutrófilo (ChemoCentryx Press Release, 17 de outubro de 2011). Outro antagonista de C5aR em desenvolvimento clínico é MP-435 para o tratamento de artrite reumatoide.
[0021] Nenhum desenvolvimento foi relatado para os antagonistas de receptor de C5a de molécula pequena/peptidomiméticos JPE-1375, JSM-7717 recentemente (Ricklin & Lambris, 2007). Outro inibidor do receptor de C5a CD88, o hexapeptídeo cíclico PMX53, tem sido eficaz em modelos de animal inflamatório, mas não satisfez pontos finais em estudos clínicos duplo-cego controlados por placebo em pacientes com artrite reumatoide. O desenvolvimento clínico para AMD foi também descontinuado (Wagner & Frank, 2010). Uma variante de estágio de pesquisa de PMX53, PMX205, foi publicada ser ativa em um modelo de murino de demência de Alzheimer (Fonseca e outros, 2009). Um composto de estágio clínico adicional é o antagonista de receptor de C5a (C5aR), CCX-168. Um teste de fase I foi iniciado para doenças inflamatórias e autoimunes em janeiro de 2010.
[0022] Além dos efeitos de C5a conforme descrito supra, novos dados supõem que a geração de C5a em um microambiente de tumor aumenta o crescimento do tumor pela supressão da resposta mediada por célula T CD8+ antitumor, de maneira que a dita supressão parece estar associada com o recrutamento de células supressoras derivadas de mieloide em tumores e aumento de suas habilidades supressivas direcionadas à célula T. Markiewski e outros mostraram que um bloqueio dos receptores de C5a por um antagonista de receptor de C5a peptídico levou a um crescimento de tumor retardado em um modelo de camundongo (Markiewski e outros, 2008).
[0023] A maioria dos compostos peptídicos é propensa à degradação e modificação por peptidases e ainda mostra uma taxa de eliminação rápida do corpo, preferivelmente do corpo humano. Desta maneira, esses compostos peptídicos não podem ser considerados moléculas tipo fármaco, um pré-requisito para o desenvolvimento de fármacos em geral a serem comercializados.
[0024] Vários Spiegelmers especificamente se ligando a C5a humana, mas não a C5a de outras espécies, foram desenvolvidos no passado (vide WO2009/040113 e WO2010/108657).
[0025] Devido ao fato dos modelos animais de desenvolvimento pré-clínicos e clínicos serem essenciais, o problema de base da presente invenção é prover um composto que interaja com C5a de camundongo. Mais especificamente, o problema de base da presente invenção é prover um composto que interaja com ambas a C5a de camundongo e a C5a humana.
[0026] Um problema adicional de base da presente invenção é prover um composto para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença humana e/ou não humana, em que a doença é caracterizada por C5a estando ou diretamente ou indiretamente envolvida no mecanismo patogenético de tal doença.
[0027] Um problema adicional que baseia a presente invenção é prover um composto para a fabricação de um agente de diagnóstico para o tratamento de uma doença, em que a doença é caracterizada por C5a estando ou diretamente ou indiretamente envolvida no mecanismo patogenético de tal doença.
[0028] Esses e outros problemas que baseiam a presente invenção são resolvidos pela matéria objeto das reivindicações independentes anexas. Modalidades preferidas podem ser obtidas das reivindicações dependentes.
[0029] O problema que baseia a presente invenção é resolvido em um primeiro aspecto, que é também a primeira modalidade do primeiro aspecto, por uma molécula de ácido nucleico capaz de se ligar a C5a humana, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma extensão central de nucleotídeos, em que a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 61], em que
[0030] n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e
[0031] G, A, U, C, H, K e R são ribonucleotídeos, e
[0032] dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
[0033] Em uma segunda modalidade do primeiro aspecto que também é uma modalidade da primeira modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 62], 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 63], 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 64], 5' AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 65], 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 66], 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 67], e 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 68], em que
[0034] n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e
[0035] G, A, U e C são ribonucleotídeos, e
[0036] dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
[0037] Em uma terceira modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 65] em que
[0038] n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e
[0039] G, A, U e C são ribonucleotídeos, e
[0040] dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
[0041] Em uma quarta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da terceira modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de
[0042] a) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 73],
[0043] b) 5' AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 74],
[0044] c) 5' AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 75],
[0045] d) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 76],
[0046] e) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 77],
[0047] f) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 78],
[0048] g) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3'[SEQ ID NO: 79],
[0049] h) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 80],
[0050] i) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3'[SEQ ID NO: 81],
[0051] j) 5' AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 82],
[0052] k) 5' AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 83],
[0053] l) 5' AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 84], preferivelmente a extensão central de nucleotídeos é 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 78] ou
[0054] 5' AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 84].
[0055] Em uma quinta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 66], em que
[0056] n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e
[0057] G, A, U e C são ribonucleotídeos, e
[0058] dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
[0059] Em uma sexta modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da segunda modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleosídeo de
[0060] 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 67], em que
[0061] n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e
[0062] G, A, U e C são ribonucleotídeos, e
[0063] dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
[0064] Em uma sétima modalidade do primeiro aspecto que também é uma modalidade da segunda modalidade do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de
[0065] 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 64], em que
[0066] n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e
[0067] G, A, U e C são ribonucleotídeos, e
[0068] dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
[0069] Em uma oitava modalidade do primeiro aspecto que também é uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta e sétima modalidades do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos consiste em ribonucleotídeos e 2'-desoxirribonucleotídeos.
[0070] Em uma nona modalidade do primeiro aspecto que também é uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quinta, sexta e sétima modalidades do primeiro aspecto, a extensão central de nucleotídeos consiste em ribonucleotídeos.
[0071] Em uma décima modalidade do primeiro aspecto que também é uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava e nona modalidades do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico compreende na direção 5'->3' uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos, em que
[0072] a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende um a cinco nucleotídeos, e
[0073] a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende um a cinco nucleotídeos,
[0074] preferivelmente
[0075] a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende três a cinco nucleotídeos, e
[0076] a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende três e cinco nucleotídeos,
[0077] mais preferivelmente
[0078] a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende três nucleotídeos, e
[0079] a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende três nucleotídeos.
[0080] Em uma décima primeira modalidade do primeiro aspecto que também é uma modalidade da décima modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' Z1Z2Z3Z4G 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' Z5Z6Z7Z8Z9 3', em que
[0081] Z1 é G ou ausente, Z2 é S ou ausente, Z3 é S ou ausente, Z4 é B ou ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V ou ausente, Z7 é S ou ausente, Z8 é S ou ausente, Z9 é C ou ausente, e
[0082] G, S, B, C, V são ribonucleotídeos, e
[0083] dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo,
[0084] preferivelmente
[0085] a) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é 5, Z8 é S, Z9 é C, ou
[0086] b) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[0087] c) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[0088] d) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[0089] e) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é W, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[0090] f) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[0091] g) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[0092] h) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[0093] i) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[0094] j) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[0095] k) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[0096] l) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é X, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[0097] m) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[0098] n) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[0099] o) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00100] p) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00101] q) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente.
[00102] Em uma décima segunda modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das décima e décima primeira modalidades do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCCUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CAGGC 3' ou de 5' dCAGGC 3', em que
[00103] C, A, G e U são ribonucleotídeos, e
[00104] dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo.
[00105] Em uma 13a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima segunda modalidade do primeiro aspecto, a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGGC 3'.
[00106] Em uma 14a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da décima segunda modalidade do primeiro aspecto, a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CAGGC 3'.
[00107] Em uma 15a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das décima e décima primeira modalidades do primeiro aspecto, a
[00108] primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CCUG 3' ou 5' CUG 3' ou 5' UG 3' ou 5' G 3', e
[00109] a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGGC 3',
[00110] em que
[00111] C, A, G e U são ribonucleotídeos, e
[00112] dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo.
[00113] Em uma 16a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da 15a modalidade do primeiro aspecto, a
[00114] primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CCUG 3'.
[00115] Em uma 17a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da 15a modalidade do primeiro aspecto, a
[00116] primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CUG 3'.
[00117] Em uma 18a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das décima e décima primeira modalidades do primeiro aspecto,
[00118] a) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGC 3'; ou
[00119] b) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGGC 3'; ou
[00120] c) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GGCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGCC 3'; em que
[00121] C, A, G e U são ribonucleotídeos, e
[00122] dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo.
[00123] Em uma 19a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da 18a modalidade do primeiro aspecto,
[00124] a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GGCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGCC 3'.
[00125] Em uma 20a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das décima e décima primeira modalidades do primeiro aspecto, a
[00126] primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CUG 3' ou 5' UG 3' ou 5' CG 3' ou 5' G 3', e
[00127] a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGC 3',
[00128] em que
[00129] C, A, G e U são ribonucleotídeos, e
[00130] dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo.
[00131] Em uma 21a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das décima e décima primeira modalidades do primeiro aspecto,
[00132] a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCUG 3', e
[00133] a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAC 3' ou 5' dCC 3' ou 5' dCA 3', em que
[00134] C, A, G e U são ribonucleotídeos, e
[00135] dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo.
[00136] Em uma 22a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das décima e décima primeira modalidades do primeiro aspecto,
[00137] a) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAC 3'; ou
[00138] b) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' UG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCA 3'; ou
[00139] c) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGC 3'; ou
[00140] d) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGC 3'; ou
[00141] e) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' G 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGC 3'; ou
[00142] f) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCC 3'; ou
[00143] g) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dC 3'; ou
[00144] h) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCC 3';
[00145] i) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CGC 3'; em que
[00146] C, A, U e G são ribonucleotídeos, e
[00147] dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo.
[00148] Em uma 23a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da 22a modalidade do primeiro aspecto, a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo 5' dCGC 3';
[00149] Em uma 24a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quinta, sexta, sétima, nona, décima, décima primeira, décima segunda e 14a modalidades do primeiro aspecto, a molécula de nucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 90, ou uma molécula de ácido nucleico tendo uma identidade de pelo menos 85% com a molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 90, ou uma molécula de ácido nucleico que é homóloga à molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 90, em que a homologia é pelo menos 85%.
[00150] Em uma 25a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, oitava, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a e 23a modalidades do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 92, ou uma molécula de ácido nucleico tendo uma identidade de pelo menos 85% com a molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 92, ou uma molécula de ácido nucleico que é homóloga à molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 92, em que a homologia é pelo menos 85%.
[00151] Em uma 26a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a e 25a modalidades do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico é capaz de se ligar a C5a humana e C5a de camundongo.
[00152] Em uma 27a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a e 26a modalidades do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico compreende pelo menos uma porção de ligação que é capaz de se ligar a C5a humana e C5a de camundongo, em que tal porção de ligação consiste em nucleotídeos L.
[00153] Em uma 28a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a e 27a modalidades do primeiro aspecto, os nucleotídeos de ou os nucleotídeos que formam a molécula de ácido nucleico são nucleotídeos L.
[00154] Em uma 29a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a e 28a modalidades do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico L.
[00155] Em uma 30a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a e 29a modalidades do primeiro aspecto, o ácido nucleico é um antagonista de uma atividade mediada por C5a humano e/ou de camundongo.
[00156] Em uma 31a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29 e 30a modalidades do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico compreende um grupo de modificação, em que a taxa de excreção da molécula de ácido nucleico compreendendo o grupo de modificação de um organismo é diminuída comparado com um ácido nucleico não compreendendo o grupo de modificação.
[00157] Em uma 32a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a e 30a modalidades do primeiro aspecto, a molécula de ácido nucleico compreende um grupo de modificação, em que a molécula de ácido nucleico compreende o grupo de modificação tem um tempo de retenção aumentado em um organismo comparado com uma molécula de ácido nucleico não compreendendo o grupo de modificação.
[00158] Em uma 33a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das 31a e 32a modalidades do primeiro aspecto, o grupo de modificação é selecionado do grupo compreendendo modificações biodegradáveis e não biodegradáveis, preferivelmente o grupo de modificação é selecionado do grupo compreendendo polietileno glicol, polietileno glicol linear, polietieno glicol ramificado, amido de hidroxietila, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um esterol, polioxipropileno, polioxiamidato e poli(2-hidroxietil)-L- glutamina.
[00159] Em uma 34a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da 33a modalidade do primeiro aspecto, o grupo de modificação é um polietileno glicol, preferivelmente consistindo em um polietileno glicol linear ou polietileno glicol ramificado, em que o peso molecular do polietileno glicol é preferivelmente de a partir de cerca de 20.000 a cerca de 12.000 Da, mais preferivelmente de a partir de cerca de 30.000 a cerca de 80.000 Da e mais preferivelmente cerca de 40.000 Da.
[00160] Em uma 35a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade da 33a modalidade do primeiro aspecto, o grupo de modificação é amido de hidroxietila, em que preferivelmente o peso molecular do amido de hidroxietila é de a partir de cerca de 50 a cerca de 1000 kDa, mais preferivelmente de a partir de cerca de 100 a cerca de 700 kDa e mais preferivelmente de a partir de 200 a 500 kDa.
[00161] Em uma 36a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das 31a, 32a, 33a, 34a e 35a modalidades do primeiro aspecto, o grupo de modificação é acoplado à molécula de ácido nucleico via um ligante, em que preferivelmente o ligante é um ligante biodegradável.
[00162] Em uma 37a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das 31a, 32a, 33a, 34a, 35a e 36a modalidades do primeiro aspecto, o grupo de modificação é acoplado ao nucleotídeo terminal 5' e/ou ao nucleotídeo terminal 3' da molécula de ácido nucleico e/ou a um nucleotídeo da molécula de ácido nucleico entre o nucleotídeo terminal 5' da molécula de ácido nucleico e o nucleotídeo terminal 3' da molécula de ácido nucleico.
[00163] Em uma 38a modalidade do primeiro aspecto que é também uma modalidade das 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a e 37a modalidades do primeiro aspecto, o organismo é um corpo animal ou humano, preferivelmente um corpo humano.
[00164] O problema de base da presente invenção é resolvido em um segundo aspecto, que é também a primeira modalidade do segundo aspecto, por uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto, para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.
[00165] Em uma segunda modalidade do segundo aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do segundo aspecto, a doença está associada com ativação de complemento e mecanismos patogênicos mediados por C5a e/ou é selecionada do grupo consistindo em doença autoimune, doença inflamatória, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, doença do olho, lesões isquêmicas/por reperfusão, função de enxerto retardada, rejeição de transplante, doença cardiovascular, doença respiratória, reações agudas, doença infecciosa, doença neurológica, doença neurodegenerativa, doença fibrótica, doença hematológica, doença metabólica, tumores e complicações clínicas associadas com ativação de complemento por biomateriais, preferivelmente a síndrome da resposta inflamatória sistêmica é selecionada do grupo compreendendo sepse e danos secundários de trauma ou queimaduras graves.
[00166] O problema de base da presente invenção é resolvido em um terceiro aspecto, o qual é também a primeira modalidade do terceiro aspecto, por uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, e opcionalmente um constituinte adicional, em que o constituinte adicional é selecionado do grupo compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável, um veículo farmaceuticamente aceitável e um agente farmaceuticamente ativo.
[00167] Em uma segunda modalidade do terceiro aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do terceiro aspecto, a composição farmacêutica compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00168] O problema que baseia a presente invenção é resolvido em um quarto aspecto, que é também a primeira modalidade do quarto aspecto, através do uso de uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, para a fabricação de um medicamento.
[00169] Em uma segunda modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do quarto aspecto, o medicamento é para uso em medicina humana ou para uso em medicina veterinária.
[00170] Em uma terceira modalidade do quarto aspecto que é também uma modalidade das primeira e segunda modalidades do quarto aspecto, o medicamento é para o tratamento e/ou prevenção de doença autoimune, doença inflamatória, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, doença do olho, lesões por isquemia/reperfusão, função de enxerto retardada, rejeição de transplante, doença cardiovascular, doença respiratória, reações agudas, doenças infecciosas, doença neurológica, doença neurodegenerativa, doença fibrótica, doença hematológica, doença metabólica, tumores e complicações clínicas associadas com ativação de complemento por biomateriais, preferivelmente a síndrome da resposta inflamatória sistêmica é selecionada do grupo compreendendo sepse e danos secundários de trauma ou queimaduras graves.
[00171] O problema de base da presente invenção é resolvido em um quinto aspecto, que é também a primeira modalidade do quinto aspecto, através do uso de uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, para a fabricação de um meio de diagnóstico.
[00172] O problema de base da presente invenção é resolvido em um sexto aspecto, que é também a primeira modalidade do sexto aspecto, através de um complexo compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, e C5a, em que preferivelmente o complexo é um complexo cristalino.
[00173] O problema de base da presente invenção é resolvido em um sétimo aspecto, que é também a primeira modalidade do sétimo aspecto, através do uso de uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, para a detecção de C5a.
[00174] O problema de base da presente invenção é resolvido em um oitavo aspecto, que é também a primeira modalidade do oitavo aspecto, através de um método para a avaliação de um antagonista de uma atividade mediada por C5a compreendendo as etapas que seguem:
[00175] - provisão de um antagonista candidato da atividade mediada por C5a,
[00176] - provisão de uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto,
[00177] - provisão de um sistema de teste que provê um sinal na presença de um antagonista da atividade mediada por C5a, e
[00178] - determinação de se o antagonista candidato da atividade mediada por C5a é um antagonista da atividade mediada por C5a.
[00179] O problema de base da presente invenção é resolvido em um nono aspecto, que é também a primeira modalidade do nono aspecto, por um kit para a detecção de C5a, em que o kit compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, e pelo menos um panfleto com instruções ou um recipiente de reação.
[00180] O problema de base da presente invenção é resolvido em um décimo aspecto, que é também a primeira modalidade do decido aspecto, através de um método para detecção de um ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, em uma amostra, em que o método compreende as etapas de:
[00181] a) provisão de uma sonda de captura, em que a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte da molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, e uma sonda de detecção, em que a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte da molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto ou, alternativamente, a sonda de captura é pelo menos parcialmente complementar a uma segunda parte da molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, e a sonda de detecção é pelo menos parcialmente complementar a uma primeira parte da molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto;
[00182] b) adição da sonda de captura e da sonda de detecção separadamente ou combinadas com uma amostra contendo a molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, ou presumida conter a molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto;
[00183] c) permitir que a sonda de captura e a sonda de detecção reajam ou simultaneamente ou em qualquer ordem sequencialmente com a molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, ou parte da mesma;
[00184] d) opcionalmente detecção de se ou não a sonda de captura é hibridizada para a molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, provida na etapa a); e
[00185] e) detecção do complexo formado na etapa c) consistindo na molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto, a sonda de captura e a sonda de detecção.
[00186] Em uma segunda modalidade do décimo aspecto que é também uma modalidade da primeira modalidade do décimo aspecto, a sonda de detecção compreende um meio de detecção e/ou em que a sonda de captura é imobilizada em um apoio, preferivelmente um apoio sólido.
[00187] Em uma terceira modalidade do décimo aspecto que é também uma modalidade das primeira e segunda modalidades do décimo aspecto, qualquer sonda de detecção que não é parte do complexo formado na etapa c) é removida da reação de maneira que na etapa e) apenas uma sonda de detecção que é parte do complexo é detectada.
[00188] Em uma quarta modalidade do décimo aspecto que é também uma modalidade das primeira, segunda e terceira modalidade do décimo aspecto, a etapa e) compreende a etapa de comparação do sinal gerado pelo meio de detecção quando a sonda de captura e a sonda de detecção são hibridizadas na presença da molécula de ácido nucleico de acordo com as primeira, segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, décima primeira, décima segunda, 13a, 14a, 15a, 16a, 17a, 18a, 19a, 20a, 21a, 22a, 23a, 24a, 25a, 26a, 27a, 28a 29a, 30a, 31a, 32a, 33a, 34a, 35a, 36a, 37a e 38a modalidades do primeiro aspecto e de acordo com a primeira modalidade do segundo aspecto,
[00189] ou parte da mesma, e na ausência da dita.
[00190] Embora não desejando ser limitado por nenhuma teoria, os presentes inventores constataram surpreendentemente que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção se liga especificamente e com alta afinidade a C5a de camundongo e C5a humana, desta maneira inibindo a ligação de C5a e seu receptor de C5a, embora a homologia de sequência de C5a de camundongo e C5a humana seja apenas 64% na região homóloga e C5a de camundongo tendo 3 aminoácidos N-terminais. Além disso, em contraste com C5a humana, C5a de camundongo não é glicosilada. Asparagina64, o sítio de glicosilação em C5a humana, é mutada para glutamato em camundongo. Em particular a afinidade mostrada de vários ácidos nucleicos de ligação a C5a individuais na faixa picomolar não poderia ser prevista.
[00191] Ainda, os presentes inventores constataram surpreendentemente que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é adequada para bloquear a interação de C5a com o receptor de C5a. Até certo ponto, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode também ser vista como um antagonista do receptor de C5a e, respectivamente, como um antagonista dos efeitos de C5a, em particular os efeitos de C5a sobre seu receptor. Um antagonista para C5a é uma molécula que se liga a C5a - tal como as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção - e inibe a função de C5a, preferivelmente em um ensaio in vitro ou em um modelo in vivo conforme descrito nos Exemplos.
[00192] É compreendido pela presente invenção que o ácido nucleico de acordo com a presente invenção é uma molécula de ácido nucleico. Até certo ponto os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usados aqui de uma maneira sinônima se não indicado o contrário. Além disso, tal ácido(s) nucleico(s) é (são) preferivelmente também referido(s) aqui como a(s) molécula(s) de ácido nucleico de acordo com a (presente) invenção, o(s) ácido(s) nucleico(s) de acordo com a presente invenção, o(s) ácido(s) nucleico(s) da invenção ou a(s) molécula(s) de ácido nucleico(s) da invenção.
[00193] As características dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção conforme aqui descrito podem ser percebidas em qualquer aspecto da presente invenção em que o ácido nucleico for usado, ou sozinho ou em qualquer combinação.
[00194] Como para as várias doenças, condições e distúrbios que podem ser tratados ou prevenidos através do uso da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e composições, preferivelmente composições farmacêuticas compreendendo a mesma, deve ser reconhecido que tais doenças, condições e distúrbios são aqueles que são descritos aqui, incluindo e em particular aqueles descritos e mostrados na parte introdutória do presente pedido. Até certo ponto, as respectivas passagens do relatório e da parte introdutória do relatório formam uma parte integral da presente invenção ensinando a adequabilidade da molécula de ácido nucleico da presente invenção para a prevenção e tratamento, respectivamente, para as ditas doenças, condições e distúrbios. Ainda, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é preferida se o efeito fisiológico do eixo Ca5a-receptor de C5a for relacionado a níveis de C5a no plasma mais altos.
[00195] Conforme aqui usado, o termo C5a se refere a qualquer C5a incluindo, mas não limitado a, C5a de mamífero. Preferivelmente, a C5a de mamífero é selecionada do grupo compreendendo C5a humana, de rato, camundongo, macaco (vide alinhamento de espécie de C5a na Fig. 11). Mais preferivelmente a C5a é C5a humana. C5a humana é uma proteína básica tendo a sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:50. C5a de camundongo é uma proteína básica tendo a sequência de aminoácido de acordo com a SEQ ID NO:52.
[00196] Conforme mostrado em mais detalhes nas reivindicações e no exemplo 1, os presentes inventores puderam identificar com mais surpresa várias moléculas de ácido nucleico de ligação diferentes capazes de ligação a ambas C5a humana e de camundongo.
[00197] Conforme mostrado em mais detalhes aqui, os presentes inventores identificaram várias moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a diferentes capazes de se ligar a ambas as C5a humana e de camundongo, desta maneira as moléculas de ácido nucleico podem ser caracterizadas em termos de extensões de nucleotídeos que são também referidas aqui como revelado (vide Exemplo 1). Conforme experimentalmente mostrado nos exemplos 8 e 9, os inventores puderam demonstrar surpreendentemente em vários sistemas que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é adequada para o tratamento de sepse.
[00198] Cada um dos tipos diferentes de moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a da invenção que se liga a C5a compreende três extensões diferentes de nucleotídeos: uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, uma extensão central de nucleotídeos e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos. Em geral, as moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a da presente invenção compreendem em sua extremidade 5' e na extremidade 3' cada uma das extensões terminais de nucleotídeos, isto é, a primeira extensão terminal de nucleotídeos ou a segunda extensão terminal de nucleotídeos (também referida como extensão terminal 5' de nucleotídeos e extensão terminal 3' de nucleotídeos). A primeira extensão terminal de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos podem, a princípio devido à sua complementaridade de base, hibridizar uma para a outra, de maneira que quando a hibridização uma estrutura de filamento duplo é formada. No entanto, tal hibridização não é necessariamente realizada na molécula sob condições fisiológicas e/ou não fisiológicas. As três extensões de nucleotídeos de moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a - a primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos - são dispostas uma para a outra na direção 5' ^ 3': a primeira extensão terminal de nucleotídeos - a extensão central de nucleotídeos - a segunda extensão terminal de nucleotídeos. Alternativamente, a segunda extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a primeira extensão terminal de nucleotídeos estão dispostas uma para a outra na direção 5' ^ 3'.
[00199] O comprimento da extensão central de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção é preferivelmente 34.
[00200] O comprimento da primeira extensão terminal de nucleotídeos dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção está entre um e cinco nucleotídeos, preferivelmente entre três e cinco nucleotídeos, mais preferivelmente três nucleotídeos.
[00201] O comprimento da segunda extensão terminal de nucleotídeos do ácido nucleico de acordo com a presente invenção está entre um e cinco nucleotídeos, preferivelmente entre três e cinco nucleotídeos, mais preferivelmente três nucleotídeos.
[00202] Os termos "extensão" e "extensão de nucleotídeos" são usados aqui de uma maneira sinônima se não indicado o contrário.
[00203] As diferenças nas sequências das extensões definidas entre as moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a diferentes podem influenciar a afinidade de ligação a C5a. Com base na análise de ligação das moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a diferentes da presente invenção a extensão central e os nucleotídeos que formam a mesma são individualmente e mais preferivelmente em sua totalidade essenciais para ligação da molécula de ácido nucleico de ligação a C5a a Ca5.
[00204] Em uma modalidade preferida, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é uma molécula de ácido nucleico única. Em uma modalidade adicional, a molécula de ácido nucleico única está presente como uma grande quantidade de molécula de ácido nucleico única ou como uma grande quantidade das espécies de molécula de ácido nucleico única.
[00205] Será reconhecido por aqueles versados na técnica que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste preferivelmente em nucleotídeos que são covalentemente ligados uns aos outros, preferivelmente através de conexões ou ligações fosfodiéster.
[00206] É compreendido pela presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende duas ou mais extensões ou parte(s) das mesmas que podem, a princípio, hibridizar umas para as outras. Quando de tal hibridização uma estrutura de filamento duplo é formada. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que tal hibridização pode ou não ocorrer, particularmente sob condições in vitro e/ou in vivo. Também, no caso de hibridização, tal hibridização não ocorre necessariamente em todo o comprimento das duas extensões em que, pelo menos com base nas regras para emparelhamento de base, tal hibridização e então formação de uma estrutura de filamento duplo pode, a princípio, ocorrer. Conforme preferivelmente usado aqui, uma estrutura de filamento duplo é uma parte de uma molécula de ácido nucleico ou uma estrutura formada por dois ou mais filamentos separados ou duas extensões espacialmente separadas de um filamento único de uma molécula de ácido nucleico, de maneira que pelo menos um, preferivelmente dois ou mais pares de base existem, os quais estão em emparelhamento de base preferivelmente de acordo com as regras de emparelhamento de base Watson-Crick. Será também reconhecido por um versado na técnica que outro emparelhamento de base tal como emparelhamento de base Hoogsten pode existir em ou pode formar tal estrutura de filamento duplo. Deve ser também reconhecido que a característica que dois filamentos hibridizam preferivelmente indica que tal hibridização é suposta acontecer devido à complementaridade de base dos dois filamentos sem importar se tal hibridização realmente ocorre in vivo e/ou in vitro. De acordo com a presente invenção tais extensões são a primeira extensão terminal de nucleotídeos e a segunda extensão de nucleotídeos que, em uma modalidade, podem hibridizar conforme definido acima.
[00207] Em uma modalidade preferida o termo disposição conforme aqui usado significa a ordem ou sequência de características ou elementos estruturais ou funcionais descritos aqui com relação à(s) molécula(s) de ácido nucleico revelada(s) aqui.
[00208] Será reconhecido pelo versado na técnica que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são capazes de se ligar a ambas a C5a e a C5. Esta característica de ligação surge do fato que para a identificação dos ácidos nucleicos uma porção de C5a foi usada, a qual está presente em ambas a C5a e a C5. Desta maneira, os ácidos nucleicos de acordo com a persente invenção são adequados para a detecção ou de C5a ou C5 ou ambas. Também, será reconhecido pelo versado na técnica que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é um antagonista para ambas a C5 e a C5a. Devido a este fato os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são adequados para o tratamento e prevenção, respectivamente, de qualquer doença que esteja associada com ou causada ou por C5a ou C5 ou ambas. A razão científica pode ser obtida da técnica anterior que estabelece que C5a e C5, respectivamente, estão envolvidas ou associadas com uma variedade de doenças e condições, respectivamente, e que é incorporada aqui a título de referência.
[00209] A molécula de ácido nucleico de ligação a C5a da presente invenção revelada aqui foi mostrada reconhecer C5a no contexto de C5 (vide Exemplo 1). Desta maneira, foi investigado se clivagem de C5 para a anafilatoxina C5a e C5b, que é parte do complexo de ataque de membrana (MAC), é inibida por ácidos nucleicos de ligação a C5a. O MAC é o último produto da cascata de complemento: um poro consistindo em C5b-9. MAC é acreditado se inserir nas membranas citoplásmicas de patógenos e mata-los através da indução de vazamento citoplásmico. O ensaio para clivagem de C5 foi obtido usando um teste de hemólise de eritrócito de ovelha dependente de complemento. A molécula de ligação a C5a da invenção não inibiu hemólise (vide Exemplo 6). A molécula de ácido nucleico de ligação a C5a da invenção não interfere com clivagem de C5 e formação de MAC e é então antagonista seletivo de C5a apenas. Se usada como um medicamento, isso pode ser vantajoso em muitas doenças, uma vez que a formação do MAC que é benéfica em defesa de patógeno não é comprometida em sua presença.
[00210] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção deve também compreender ácidos nucleicos que são essencialmente homólogos às sequências particulares reveladas aqui. O termo substancialmente homólogo deve ser compreendido de maneira que a homologia seja pelo menos 75%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90% e mais preferivelmente mais de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.
[00211] A porcentagem real de nucleotídeos homólogos presentes no ácido nucleico de acordo com a presente invenção dependerá do número total de nucleotídeos presente no ácido nucleico. A modificação percentual pode ser baseada no número total de nucleotídeos presente no ácido nucleico.
[00212] A homologia entre duas moléculas de ácido nucleico pode ser determinada como conhecido do versado na técnica. Mais especificamente, um algoritmo de comparação de sequência pode ser usado para cálculo da homologia de sequência percentual para a(s) sequência(s) de teste com relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa projetados. A sequência de teste é preferivelmente a sequência ou molécula de ácido nucleico que é dita ser homóloga ou a ser testada se ela é homóloga, e se for, até qual ponto, a uma molécula de ácido nucleico diferente, desta maneira tal molécula de ácido nucleico diferente é também referida como a sequência de referência. Em uma modalidade, a sequência de referência é uma molécula de ácido nucleico conforme descrito aqui, preferivelmente uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 92. Alinhamento de sequências ótimo para comparação pode ser conduzido, por exemplo, através do algoritmo de homologia local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) através do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) através do método de pesquisa por similaridade de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), através de implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin GEnetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou através de inspeção visual.
[00213] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinação da identidade de sequência percentual é o algoritmo usado na ferramenta de pesquisa de alinhamento local básica (daqui em diante "BLAST"), vide, por exemplo, Altschul e outros (Altschul e outros, 1990 e Altschul e outros, 1997). Software para realização de análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (daqui em diante "NCBI"). Os parâmetros default usados na determinação de identidade de sequência usando o software disponível da NCBI, por exemplo, BLASTN (para sequências de nucleotídeo) e BLASTP (para sequências de aminoácido) são descritos em McGinnis e outros (McGinnis e outros, 2004).
[00214] Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção devem também compreender ácidos nucleicos que têm um certo grau de identidade com relação aos ácidos nucleicos revelados aqui e definidos pela sua sequência de nucleotídeo. Mais preferivelmente, a presente invenção também compreende essas moléculas de ácido nucleico que têm uma identidade de pelo menos 75%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90% e mais preferivelmente mais de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com relação aos ácidos nucleicos revelados aqui e definidos por sua sequência de nucleotídeo ou uma parte da mesma.
[00215] O termo ácido nucleico da invenção ou ácido nucleico de acordo com a presente invenção deve também compreender aqueles ácidos nucleicos compreendendo as sequências de ácido nucleico reveladas aqui ou parte das mesmas, preferivelmente até o ponto que os ácidos nucleicos ou as ditas partes estiverem envolvidos na ligação a C5a humana. Tal ácido nucleico é, em uma modalidade, uma das moléculas de ácido nucleico descritas aqui, ou um derivado e/ou um metabolito das mesmas, de maneira que tal derivado e/ou metabolito é preferivelmente um ácido nucleico truncado comparado com as moléculas de ácido nucleico descritas aqui. Truncamento pode ser relacionado a uma ou ambas as extremidades dos ácidos nucleicos conforme revelado aqui. Também, truncamento pode ser relacionado à sequência interna de nucleotídeos do ácido nucleico isto é, ele pode ser relacionado ao(s) nucleotídeo(s) entre os nucleotídeos terminais 5' e 3', respectivamente. Além disso, o truncamento deve compreender a deleção de no mínimo um único nucleotídeo da sequência de ácidos nucleicos revelada aqui. Truncamento pode também ser relacionado a mais de uma extensão do(s) ácido nucleico da invenção, de maneira que a extensão pode ser de no mínimo um nucleotídeo de comprimento. A ligação de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser determinada por um versado na técnica usando experimentação de rotina ou através do uso ou adoção de um método conforme descrito aqui, preferivelmente conforme descrito aqui na parte de exemplo.
[00216] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser ou uma molécula de ácido nucleico D ou uma molécula de ácido nucleico L. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é uma molécula de ácido nucleico L. Mais preferivelmente, a molécula de ácido nucleico da presente invenção é uma Spiegelmer.
[00217] É também compreendido pela presente invenção que, em uma modalidade, cada uma e qualquer uma das moléculas de ácido nucleico descritas aqui em sua totalidade em termos de sua(s) sequência(s) de ácido nucleico é limitada à(s) sequência(s) de nucleotídeo particular(es) indicada(s). Em outras palavras, o termo "compreendendo" ou "compreende" deve ser interpretado em tal modalidade no sentido de conter ou consistir em.
[00218] É também compreendido pela presente invenção que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são parte de um ácido nucleico mais longo, em que este ácido nucleico mais longo compreende várias partes, em que pelo menos tal parte é um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, ou uma parte do mesmo. A(s) outra(s) parte(s) desses ácidos nucleicos mais longos podem ser um ou vários ácidos nucleicos D ou um ou vários ácidos nucleicos L. Qualquer combinação pode ser usada em relação à presente invenção. Essa(s) outra(s) parte(s) do ácido nucleico mais longo ou sozinhas ou juntas, ou em sua totalidade ou em uma combinação particular, podem exibir uma função que é diferente de ligação, preferivelmente de ligação a C5a. Uma função possível é permitir a interação com outras moléculas, em que tais outras são preferivelmente diferentes de C5a, tal como, por exemplo, para imobilização, reticulação, detecção ou amplificação. Em uma modalidade adicional da presente invenção os ácidos nucleicos de acordo com a invenção compreendem, como porções individuais ou combinadas, vários dos ácidos nucleicos da presente invenção. Tal ácido nucleico compreendendo vários dos ácidos nucleicos da presente invenção é também compreendido pelo termo ácido nucleico mais longo.
[00219] Um ácido nucleico L conforme aqui usado é um ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico consistindo em nucleotídeos L, preferivelmente consistindo completamente em nucleotídeos L.
[00220] Um ácido nucleico D conforme aqui usado é um ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico consistindo em nucleotídeos D, preferivelmente consistindo completamente em nucleotídeos D.
[00221] Os termos ácido nucleico e molécula de ácido nucleico são usados aqui de uma maneira intercomutável se não explicitamente indicado o contrário.
[00222] Também, se não indicado o contrário, qualquer sequência de nucleotídeo é mostrada aqui na direção 5' ^ 3'.
[00223] Conforme preferivelmente aqui usado qualquer posição de um nucleotídeo é determinada ou referida com relação à extremidade 5' de uma sequência, uma extensão ou uma subextensão contendo tal nucleotídeo. Desta maneira, um segundo nucleotídeo é o segundo nucleotídeo contado a partir da extremidade 5' da sequência, extensão e subextensão, respectivamente. Também, de acordo com o mesmo, um penúltimo nucleotídeo é o segundo nucleotídeo contado a partir da extremidade 3' de uma sequência, extensão e subextensão, respectivamente.
[00224] Sem importar se a molécula de ácido nucleico da invenção consiste em nucleotídeos D, nucleotídeos L ou uma combinação de ambos com a combinação sendo, por exemplo, uma combinação aleatória ou uma sequência definida de extensões consistindo em pelo menos um nucleotídeo L e pelo menos um nucleotídeo D, o ácido nucleico pode consistir em desoxirribonucleotídeo(s), ribonucleotídeos(s) ou combinações dos mesmos.
[00225] É também compreendido pela presente invenção que a molécula de ácido nucleico consiste em ambos os ribonucleotídeos e 2'- desoxirribonucleotídeos. Os 2'-desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos são mostrados nas Figuras 22 e 23. A fim de distinguir entre ribonucleotídeos e 2'-desoxirribonucleotídeos nas sequências das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o código de referência que segue é usado aqui.
[00226] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste em 2'-desoxirribonucleotídeos, em que
[00227] dG é 2'desóxi-guanosina-5'-monofosfato,
[00228] dC é 2'desóxi-citidina-5'-monofosfato,
[00229] dA é 2'desóxi-adenosina-5'-monofosfato,
[00230] dU é 2'desóxi-urigina-5'-monofosfato.
[00231] A molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste em ribonucleotídeos, em que
[00232] G é guanosina-5'-monofosfato,
[00233] C é citidina-5'-monofosfato,
[00234] A é adenosina-5'-monofosfato,
[00235] U é uridina-5'-monofosfato.
[00236] Para definição de motivos de sequência de ribonucleotídeos, as abreviações IUPAC para nucleotídeos ambíguos são usadas: S forte G ou C; W fraco A ou U; R purina G ou A; Y pirimidina C ou U; K ceto G ou U; M imino A ou C; B não A C ou U ou G; D não C A ou G ou U; H não G A ou C ou U; V não U A ou C ou G; N todos A ou G ou C ou U
[00237] Projeto da molécula de ácido nucleico da invenção como uma molécula de ácido nucleico L é vantajoso por várias razões. Moléculas de ácido nucleico L são enantiômeros de ácidos nucleicos de ocorrência natural. Moléculas de ácido nucleico D, no entanto, não são muito estáveis em soluções aquosas e particularmente em sistemas biológicos ou amostras biológicas devido à presença disseminada de nucleases. Nucleases de ocorrência natural, particularmente nucleases de células animais, não são capazes de degradar ácidos nucleicos L. Por esse motivo, a meia-vida biológica de uma molécula de ácido nucleico L é significantemente aumentada em tal sistema, incluindo os corpos animal e humano. Devido à falta de degradabilidade de moléculas de ácido nucleico L quaisquer produtos de degradação de nuclease são gerados e então quaisquer efeitos colaterais se originando deles observados em tal sistema incluindo os corpos animal e humano. Este aspecto distingue moléculas de ácido nucleico L de factualmente todos os outros compostos que são usados na terapia de doenças e/ou distúrbios envolvendo a presença de C5. Uma molécula de ácido nucleico L que se liga especificamente a uma molécula alvo através de um mecanismo diferente de emparelhamento de base Watson Crick, ou aptâmero que consiste parcialmente ou completamente em nucleotídeos L, particularmente com aquelas partes do aptâmero estando envolvidas na ligação do aptâmero à molécula alvo, é também chamada uma Spiegelmer. Aptâmeros e Spiegelmers do tipo são conhecidos do versado na técnica e são, dentre outros, descritos em 'The Aptamer Handbook' (eds. Klussmann, 2006).
[00238] É também compreendido pela presente invenção que a molécula de ácido nucleico da presente invenção, sem importar se ela está presente como um ácido nucleico D, ácido nucleico L ou ácido nucleico D,L ou se ela é um DNA ou RNA, pode estar presente como uma molécula de ácido nucleico de filamento simples ou filamento duplo. Tipicamente, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico de filamento simples que exibe uma estrutura secundária definida devido à sua sequência primária e pode então também formar uma estrutura terciária. A molécula de ácido nucleico, no entanto, pode também ser de filamento duplo no sentido que dois filamentos que são complementares ou parcialmente complementares um para o outro são hibridizados um para o outro.
[00239] A molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser modificada. Tal modificação pode ser relacionada ao único nucleotídeo da molécula de ácido nucleico e é bem conhecida na técnica. Exemplos de tal modificação são descritos por, dentre outros, Venkatesan e outros (Venkatesan e outros, 2003) e Kusser (Kusser, 2000). Tal modificação pode ser um átomo de H, um átomo de F ou um grupo O-CH3 ou grupo NH2 na posição 2' de um, vários de todos dos nucleotídeos individuais dos quais a molécula de ácido nucleico consiste. Também, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um nucleotídeo de LNA. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção consiste em nucleotídeos de LNA.
[00240] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser uma molécula de ácido nucleico multidividida. Uma molécula de ácido nucleico multidividida conforme aqui usado é uma molécula de ácido nucleico que consiste em pelo menos dois filamentos de ácido nucleico separados. Esses pelo menos dois filamentos de ácido nucleico formam uma unidade funcional em que a unidade funcional é um ligante para uma molécula alvo e, preferivelmente, um antagonista para a molécula alvo, no presente caso de C5a. Os pelo menos dois filamentos de ácido nucleico podem ser derivados de qualquer molécula de ácido nucleico da invenção através ou de clivagem da molécula de ácido nucleico da invenção para gerar pelo menos dois filamentos ou através de síntese de uma molécula de ácido nucleico correspondendo a uma primeira parte da molécula de ácido nucleico de comprimento integral da invenção e outra molécula de ácido nucleico correspondendo a outra parte da molécula de ácido nucleico de comprimento integral da invenção. Dependendo do número de partes que forma as moléculas de ácido nucleico de comprimento integral o número correspondente de partes tendo a sequência de nucleotídeo requerida será sintetizado. Deve ser reconhecido que ambas a abordagem de clivagem e a abordagem de síntese podem ser aplicadas para gerar uma molécula de ácido nucleico multidividida em que há mais de dois filamentos conforme exemplificado acima. Em outras palavras, os pelo menos dois filamentos de ácido nucleico separados são tipicamente diferentes de dois filamentos sendo complementares e hibridizando um para o outro embora um certo grau de complementaridade entre os ditos pelo menos dois filamentos de ácido nucleico separados possa existir e em que tal complementaridade pode resultar na hibridização dos ditos filamentos separados.
[00241] Finalmente, é também compreendido pela presente invenção que uma estrutura totalmente fechada, isto é, circular, para a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é obtida, isto é, que as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção são fechadas em uma modalidade, preferivelmente através de uma ligação covalente, em que mais preferivelmente tal ligação covalente é feita entre a extremidade 5' e a extremidade 3' da sequência de ácido nucleico da molécula de ácido nucleico da invenção conforme revelado aqui ou qualquer derivado da mesma.
[00242] Uma possibilidade para determinar as constantes de ligação das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é o uso dos métodos conforme descrito nos Exemplos 3 e 4 que confirma a constatação acima que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção exibem uma faixa de valor KD favorável. Uma medição apropriada a fim de expressar a intensidade da ligação entre a molécula de ácido nucleico individual e o alvo que é no presente C5a é o chamado valor KD que da mesma maneira que o método para sua determinação são conhecidos de um versado na técnica.
[00243] Preferivelmente, o valor KD mostrado pelos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção está abaixo de 1 μM. Um valor KD de cerca de 1 μM é dito ser característico para uma ligação não específica de um ácido nucleico a um alvo. Como será reconhecido pelo versado na técnica, o valor KD de um grupo de compostos tais como os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção está dentro de uma certa faixa. O KD mencionado acima de cerca de 1 μM é um limite superior preferido para o valor KD. O limite inferior para o KD dos ácidos nucleicos de ligação alvo pode ser tão baixo quanto cerca de 10 picomolar ou pode ser maior. É compreendido pela presente invenção que os valores KD de ácidos nucleicos individuais se ligando a C5a estão preferivelmente dentro desta faixa. As faixas preferidas podem ser definidas através de escolha de qualquer primeiro número dentro desta faixa e qualquer segundo número dentro desta faixa. Valores KD superiores preferidos são 250 nM e 100 nM, preferivelmente valores KD menores são 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM. O valor KD superior mais preferidos é 10 nM, o valor KD inferior mais preferido é 100 pM.
[00244] Em adição às propriedades de ligação das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção inibem a função da respectiva molécula alvo que é C5a no presente caso. A inibição da função de C5a - por exemplo, a estimulação dos respectivos receptores conforme anteriormente descrito - é obtida através de ligação de moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção a C5a e formação de um complexo de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e C5a. Tal complexo de uma molécula de ácido nucleico e C5a não pode estimular os receptores que normalmente são estimulados por C5a, isto é, C5a não está presente em um complexo com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Desta maneira, a inibição de função de receptor pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é dependente do respectivo receptor que pode ser estimulado por C5a, mas resulta da prevenção da estimulação do receptor por C5a pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[00245] Uma possibilidade para determinar a constante inibidora das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção é o uso dos métodos conforme descrito no Exemplo 5 que confirmam a constatação acima que os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção exibem uma constante inibidora favorável que permite o uso dos ditos ácidos nucleicos em um esquema de tratamento terapêutico. Uma medida apropriada a fim de expressar a intensidade do efeito inibidor da molécula de ácido nucleico individual ou interação do alvo que é no presente caso C5a e o respectivo receptor é a chamada concentração inibidora metade-máxima (abr. IC50) que bem como o método para a sua determinação são conhecidos de um versado na técnica.
[00246] Preferivelmente, o valor de IC50 mostrado pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção está abaixo de 1 μM. Um valor de IC50 de cerca de 1 μM é dito ser característico para uma inibição não específica de funções alvo por uma molécula de ácido nucleico. Como será reconhecido por aqueles versados na técnica, o valor de IC50 de um grupo de compostos tais como as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção está dentro de uma certa faixa. A IC50 mencionada acima de cerca de 1 μM é um limite superior preferido para o valor de IC50. O limite inferior para a IC50 de moléculas de ácido nucleico de ligação alvo pode ser tão baixo quanto 10 picomolar ou pode ser maior. É compreendido pela presente invenção que os valores de IC50 de ácidos nucleicos individuais se ligando a C5a estão preferivelmente dentro desta faixa. As faixas preferidas podem ser definidas através da escolha de qualquer primeiro número dentro desta faixa e qualquer segundo número dentro desta faixa. Os valores de IC50 superiores preferidos são 250 nM e 100 nM, os valores de IC50 inferiores preferidos são 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM. O valor de IC50 superior mais preferido é 5 nM, o valor de IC50 inferior mais preferido é 100 pM.
[00247] As moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ter qualquer comprimento contanto que elas ainda sejam capazes de se ligar à molécula alvo. Será reconhecido na técnica que há comprimentos preferidos dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Tipicamente, o comprimento está entre 15 e 120 nucleotídeos. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que qualquer inteiro entre 15 e 120 é um comprimento possível para os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. As faixas mais preferidas para o comprimento dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são comprimentos de cerca de 20 a 100 nucleotídeos, cerca de 20 a 80 nucleotídeos, cerca de 20 a 60 nucleotídeos, cerca de 38 a 44 nucleotídeos e cerca de 40 nucleotídeos.
[00248] É compreendido pela presente invenção que a molécula de ácido nucleico da presente invenção compreende uma porção que preferivelmente é uma porção de peso molecular alto e/ou que preferivelmente permite modificar as características da molécula de ácido nucleico em termos de, dentre outros, tempo de residência no corpo do animal, preferivelmente no corpo humano. Uma modalidade particularmente preferida de tal modificação é PEGuilação e HESilação dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Conforme aqui usado, PEG significa poli(etileno glicol) e HES amido de hidroxietila. PEGuilação conforme preferivelmente usado aqui é a modificação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção em que tal modificação consiste em uma porção de PEG que é ligada a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. HESilação conforme preferivelmente usado aqui é a modificação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção em que tal modificação consiste em uma porção HES que é ligada à molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Essas modificações bem como processos de modificação de uma molécula de ácido nucleico usando tais modificações são descritos no Pedido de Patente Europeu EP 1 306 382, cujo relatório descritivo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[00249] No caso de PEG ser tal porção de peso molecular alto o peso molecular é preferivelmente cerca de 20.000 a cerca de 120.000 Da, mais preferivelmente de a partir de cerca de 30.000 a cerca de 80.000 Da e mais preferivelmente cerca de 40.000 Da. No caso de HES ser tal porção de peso molecular alto o peso molecular alto é preferivelmente de a partir de cerca de 50 kDa a cerca de 1000 kDa, mais preferivelmente de a partir de cerca de 100 kDa a cerca de 700 kDa e mais preferivelmente de a partir de 200 kDa a 500 kDa. HES exibe uma substituição molar de 0,1 a 1,5, mais preferivelmente de 1 a 1,5, e exibe um grau de substituição expresso como a razão C2/C6 de aproximadamente 0,1 a 15, preferivelmente de aproximadamente 3 para 10. O processo de modificação de HES é, por exemplo, descrito no Pedido de Patente Alemão DE 1 2004 006 249.8, cujo relatório descritivo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.
[00250] A modificação pode, a princípio, ser feita na molécula de ácido nucleico da presente invenção em qualquer posição da mesma. Preferivelmente, tal modificação é feita ou no nucleotídeo terminal 5', no nucleotídeo terminal 3' e/ou qualquer nucleotídeo entre o nucleotídeo 5' e o nucleotídeo 3' da molécula de ácido nucleico.
[00251] A modificação e preferivelmente a porção PEG e/ou HES pode ser ligada à molécula de ácido nucleico da presente invenção ou diretamente ou indiretamente, preferivelmente indiretamente através de um ligante. É também compreendido pela presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais modificações, preferivelmente uma ou mais porções PEG e/ou HES. Em uma modalidade a molécula ligante individual liga mais de uma porção PEG ou porção HES a uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O ligante usado em relação à presente invenção pode ser em si ou linear ou ramificado. Este tipo de ligantes é conhecido dos versados na técnica e é ainda descrito nos Pedidos de Patente Internacionais WO2005/074993 e WO2003/035665.
[00252] Em uma modalidade preferida, o ligante é um ligante biodegradável. O ligante biodegradável permite modificar as características da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção em termos de, dentre outros, tempo de residência no corpo de um animal, preferivelmente em um corpo humano, devido à liberação da modificação da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uso de ligante biodegradável pode permitir um controle melhor do tempo de residência de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uma modalidade preferida de tal ligante biodegradável é um ligante biodegradável conforme descrito em, mas não limitado a, Pedidos de Patente Internacionais WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191 e WO2005/099768.
[00253] É ainda compreendido pela presente invenção que a modificação ou grupo de modificação é uma modificação biodegradável, em que a modificação biodegradável pode estar ligada à molécula de ácido nucleico da presente invenção ou diretamente ou indiretamente, preferivelmente através de um ligante. A modificação biodegradável permite modificação das características da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção em termos de, dentre outros, tempo de residência no corpo do animal, preferivelmente em um corpo humano, devido à liberação ou degradação da modificação a partir da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uso de uma modificação biodegradável pode permitir um controle melhor do tempo de residência de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Uma modalidade preferida de tal modificação biodegradável é conforme descrito em, mas não restrito a, Pedidos de Patente Internacionais WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/113394 e WO2000/41647, preferivelmente no WO2000/41647, página 18, linhas 4 a 24.
[00254] Além das modificações conforme descrito acima, outras modificações podem ser usadas para modificar as características da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção, em que tais outras modificações podem ser selecionadas do grupo de proteínas, lipídeos tais como colesterol e cadeias de açúcar tais como amilase, dextrano, etc.
[00255] Sem desejar ser limitado por nenhuma teoria, através da modificação da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção com uma porção de peso molecular alto tal como um polímero e mais particularmente um ou vários dos polímeros revelados aqui, que são preferivelmente fisiologicamente aceitáveis, a cinética de excreção da molécula de ácido nucleico então modificada da invenção a partir de um corpo animal ou humano ao qual a molécula de ácido nucleico modificada da invenção é administrada é mudada. Mais particularmente, devido ao peso molecular aumentado da molécula de ácido nucleico então modificada da invenção e devido à molécula de ácido nucleico da invenção não ser submetida a metabolismo particularmente quando na forma L, isto é, sendo uma molécula de ácido nucleico L, excreção a partir de um corpo animal, preferivelmente de um corpo de mamífero e mais preferivelmente de um corpo humano é diminuída. Como a excreção tipicamente ocorre através dos rins, os presentes inventores supõem que a taxa de filtragem glomerular da molécula de ácido nucleico então modificada é significantemente reduzida comparado com uma molécula de ácido nucleico não tendo este tipo de modificação de alto peso molecular que resulta em um aumento no tempo de residência da molécula de ácido nucleico modificada no corpo do animal. Em relação a isso é particularmente notável que, apesar de tal modificação de alto peso molecular, a especificidade da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção não é afetada de uma maneira prejudicial. Na medida em que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção tem, dentre outras, a surpreendente característica - que normalmente não pode ser esperada de um composto farmaceuticamente ativo - que uma formulação farmacêutica provendo uma liberação sustentada não é necessariamente requerida para provisão de uma liberação sustentada da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Ao contrário, a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção está em sua forma modificada compreendendo uma porção de alto peso molecular, este tipo já pode ser usado como uma formulação de liberação sustentada uma vez que ele age, devido à sua modificação, já como se fosse liberada a partir de uma formulação de liberação sustentada. Na medida em que a(s) modificação(ões) da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção conforme revelado aqui e então a molécula de ácido nucleico modificada de acordo com a presente invenção e qualquer composição compreendendo a mesma pode(m) prover uma farmacocinética preferivelmente controlada, distinta, e sua distribuição. Isso também inclui tempo de residência na circulação do corpo do animal ou humano e distribuição em tecidos em tais animal e humano. Tais modificações são descritas adicionalmente no Pedido de Patente WO2003/035665.
[00256] No entanto, é também compreendido pela presente invenção que a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção não compreende nenhuma modificação e particularmente nenhuma modificação de alto peso molecular tal como PEG ou HES. Tal modalidade é particularmente preferida quando a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção mostra distribuição preferencial para qualquer órgão ou tecido alvo no corpo ou quando uma eliminação rápida da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção a partir do corpo após administração é desejada. Uma molécula de ácido nucleio de acordo com a presente invenção conforme revelado aqui com um perfil de distribuição preferencial para qualquer órgão ou tecido alvo no corpo permitiria estabelecimento de concentrações locais eficazes no tecido alvo enquanto mantendo a concentração sistêmica da molécula de ácido nucleico baixa. Isso permitiria o uso de doses baixas que é benéfico não apenas do ponto de vista econômico, mas também reduz exposição desnecessária de outros tecidos à molécula de ácido nucleico, desta maneira reduzindo o risco potencial de efeitos colaterais. Eliminação rápida da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção a partir do corpo após administração seria desejada, dentre outros, em caso de imagem in vivo ou necessidades de dosagem terapêutica específica usando a molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção ou medicamentos compreendendo a mesma.
[00257] Os ácidos nucleicos da presente invenção, que são também referidos aqui como ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, e/ou os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados para a geração ou fabricação de um medicamento. Tal medicamento ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém pelo menos um dos ácidos nucleicos da invenção, opcionalmente junto com compostos farmaceuticamente ativos adicionais, em que o ácido nucleico da invenção preferivelmente age como um composto farmaceuticamente ativo em si. Tais medicamentos compreendem em modalidades preferidas pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal veículo pode ser, por exemplo, água, tampão, PBS, solução de glicose, preferivelmente uma solução equilibrada de sal de glicose de 5%, amido, açúcar, gelatina ou qualquer outra substância carreadora aceitável. Tais veículos são geralmente conhecidos do versado na técnica. Será compreendido pelo versado na técnica que quaisquer modalidades, uso e aspectos de ou relacionados ao medicamento da presente invenção são também aplicáveis à composição farmacêutica da presente invenção e vice versa.
[00258] A indicação, doenças e distúrbios para o tratamento e/ou prevenção dos quais os ácidos nucleicos, as composições farmacêuticas e medicamentos de acordo com ou preparados de acordo com a presente invenção resultam do envolvimento, ou direto ou indireto, de C5a no respectivo mecanismo patogênico.
[00259] A liberação local de C5a em sítios de inflamação resulta em estímulos pró-inflamatórios poderosos. Desta maneira, neutralização de C5a seria benéfica em muitas condições agudas ou crônicas, tais como doenças associadas com complexo imune em geral (Huller e outros, 1999); neurodegeneração e inflamação, por exemplo, em doença de Alzheimer (Bonifati & Kishore, 2007), em que o agonista de receptor de C5a de complemento PMX205 melhorou os parâmetros comportamentais e uma redução de marcadores patológicos tais como depósitos fibrilares e glias ativadas (Fonseca e outros, 2009). Outras doenças inflamatórias com envolvimento de C5a são lúpus eritematoso sistêmico (Jacob e outros, 2010a; Jacob e outros, 2010b), asma (Kohl, 2001); danos secundários de trauma (Yao e outros, 1998); choque séptico (Huber-Lang e outros, 2001); síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS); falência múltipla dos órgãos (MOF); síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS); síndrome inflamatória intestinal (IBD) (Woodruff e outros, 2003); doença renal mediada por complexo imune (Wang, 2006), por exemplo, como uma complicação de lúpus eritematoso sistêmico (Manderson e outros, 2004); infecções e suas consequências (por exemplo, vazamento vascular ou perda óssea tal como perda óssea secundária à periodontite (Breivik e outros, 2011); queimaduras graves (Piccolo e outros, 1999); lesão por reperfusão de órgãos tais como coração, baço, bexiga, pâncreas, estômago, pulmão, fígado, rim, membros, cérebro, músculo esqueletal ou intestino (Riley e outros, 2000)(Gueler e outros, 2008; Khan e outros, 2011; van der Pals e outros, 2010; Zheng e outros, 2008) que podem levar dentre outras coisas à função de enxerto retardada (Lewis e outros, 2008) ou fibrose e/ou remodelagem do órgão, por exemplo, após um infarto cardíaco, cérebro ou pulmão levando a dano secundário; psoríase (Bergh e outros, 1993); miocardite; esclerose múltipla (Muller-Ladner e outros, 1996); hemoglobinúria noturnal paroxismal (PNH) (Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria), hemólise, tromboembolismo (Hillmern e outros, 2007) e artrite reumatoide (RA) (Woodruff e outros, 2002), ressecção de carcinoma de célula renal e ativação de osteoclastos promovendo destruição óssea, por exemplo, resultando em osteoartrite ou cicatrização retardada. C5a de complemento foi encontrada também em quantidades elevadas em drusa em degeneração macular relacionada com a idade e foi mostrada levar à expressão de VEGF aumentada e promover neovascularização coroidal que pode levar à prejuízo e perda da visão (Nozaki e outros, 2006).
[00260] Ativação do sistema complemento foi também mostrada aumentar a susceptibilidade a desenvolver malária cerebral em um modelo de camundongo. C5a ou bloqueio de receptor de C5a usando soro de camundongos imunizados com essas moléculas conferiu resistência à malária cerebral. Desta maneira, bloqueio do eixo C5 C5a pode ser benéfico na prevenção de desenvolvimento de malária, especialmente malária cerebral em humanos (Patel e outros, 2008).
[00261] Doenças inflamatórias autoimunes com envolvimento de complemento foram revistas recentemente (Chen e outros, 2010). Uma revisão especializada de terapias direcionadas a complemento possíveis e já existentes apareceu em Nature Biotechnology (Ricklin & Lambris, 2007). Uma atualização foi publicada em Molecular Medicine em 2011 (Ehrnthaller e outros, 2011).
[00262] Com certeza, devido ao fato dos ácidos nucleicos de ligação a C5a de acordo com a presente invenção interagirem com ou se ligarem a C5a humana, um versado na técnica vai geralmente compreender que os ácidos nucleicos de ligação a C5a de acordo com a presente invenção podem ser facilmente usados para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de qualquer doença de humanos e animais conforme descrito aqui. Com relação a isso, deve ser reconhecido que as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ser usadas para o tratamento e prevenção de qualquer uma das doenças, distúrbio ou condição descritos aqui, sem importar o modo de ação que baseia tal doença, distúrbio ou condição.
[00263] A seguir, e sem desejar ser limitado a nenhuma teoria, a razão para o uso das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção com relação às várias doenças, distúrbios e condições é provida, desta maneira tornando as aplicabilidades terapêutica, preventiva e de diagnóstico reivindicadas das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção plausíveis. A fim de evitar qualquer repetição desnecessária, deve ser reconhecido que devido ao envolvimento do eixo C5a - receptor de C5a conforme mostrado em relação ao mesmo o dito eixo pode ser endereçado pelas moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção de maneira que o efeito terapêutico, preventivo e de diagnóstico é obtido. Deve ser ainda reconhecido que as particularidades das doenças, distúrbios e condições dos pacientes e qualquer detalhe do regime de tratamento descrito em relação ao mesmo devem ser submetidos a modalidades preferidas da presente invenção.
[00264] Células supressoras derivadas de mieloide (abr. MDS) (Myeloid-Derived Suspressor) foram originalmente observadas em pacientes com câncer > 30 anos de idade, seu papel como spoilers de imunidade antitumor apenas agora está sendo compreendido. Uma população heterogênea de células mielóides normais aprisionadas em estágios intermediários de diferenciação, células MDS acumulam no sangue, nós linfáticos e em sítios de tumor em virtualmente todos os pacientes com câncer. Em indivíduos saudáveis, essas células diferenciam em macrófagos, células dendríticas e neutrófilos, mas os tumores secretam uma faixa de fatores que rompem diferenciação de células progenitoras imunes (Ostrand-Rosenberg, 2008). Conforme mostrado para células MSD isoladas de sangue periférico e baços de camundongos saudáveis, as células MDS expressam o receptor de C5a em sua superfície a um ponto similar - uma expressão de abundância - àquele de seus granulócitos e monócitos de contraparte maduros. Também em camundongos carregando tumor, as células MDS expressam o receptor de C5a, mas o nível de expressão é menor na superfície de células MSD associadas a tumor do que em células MSD no sangue periférico e baço. A razão é que o receptor de C5a é internalizado em células associadas a tumor conforme mostrado por Markiewski e outros, um antagonista de receptor de C5a pode bloquear a função do receptor de C5a na superfície das células MSD e levar a um crescimento de tumor prejudicado (Markiewski e outros, 2008). C5a também age como um supressor de funções de célula assassina natural (célula NK) (Natural Killer cell) provendo uma explicação para impacto negativo de complemento sobre sobrevivência de tumor e distúrbios de função de NK em pacientes com certas doenças imunes (Li e outros, 2012; Min e outros, 2012).
[00265] Desta maneira, doenças e/ou distúrbios e/ou condições de doença para o tratamento e/ou prevenção dos quais o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado incluem, mas não estão associados a, doenças e/ou distúrbios e/ou condições de doença associados a tumor.
[00266] Em uma modalidade preferida, tumor é o nome de um inchaço ou lesão formado por um crescimento anormal de células (chamadas neoplásticas). Um tumor pode ser tumor benigno, pré- maligno ou maligno. Além disso um tumor pode ser um tumor sólido, preferivelmente carcininoma, sarcoma, aoteoma, fibrossarcoma e condrossoma.
[00267] Os tumores que podem em particular ser tratados por um medicamento ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção são preferivelmente aqueles tumores que são selecionados do grupo compreendendo tumores do sistema endócrino, do olho, do trato gastrintestinal, do sistema genital, do sistema hematopotiético (incluindo tumores mistos e embriônicos), da glândula mamária, do sistema nervoso, do sistema respiratório, do esqueleto, da pele, de tecidos moles, do sistema de fluxo urinário.
[00268] Preferivelmente, esses tumores são selecionados do grupo compreendendo câncer de mama, carcinoma de ovário, carcinoma de próstata, osteossarcoma, glioblastoma, melanoma, carcinoma de pulmão de célula pequena e carcinoma colorretal.
[00269] É compreendido pela presente invenção que o medicamento e a composição farmacêutica, respectivamente, contendo um ácido nucleico de acordo com a presente invenção podem ser usados para o tratamento de tal maneira.
[00270] Em uma modalidade adicional, o medicamento compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional para o tratamento de tumores. Tais compostos farmaceuticamente ativos adicionais são, entre outros, mas não limitado a eles, aqueles conhecidos para substâncias ativas antineoplásticas como agentes de alquilação, antimetabolitos, agentes antiangiogênicos, agentes de inibição de mitose, inibidores de topoisomerase, inibidores da transdução de sinal celular, hormônios, anticorpos, conjugados imunes e proteínas de fusão.
[00271] Outros compostos farmaceuticamente ativos são, dentre outros, mas não limitado a eles, aqueles conhecidos para Bleomicina, inibidores de timidilatosintase, tais como Raltitrexede e Pemetrexede, enzimas tais como L-asparaginase, Miltefosina e ANAgrelida, inibidores da proteassoma tal como Bortezomiba.
[00272] Além disso, o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado para o tratamento e/ou prevenção de doença pulmonar obstrutiva crônica.
[00273] Doença pulmonar obstrutiva crônica (abr. COPD) é uma doença pulmonar que é caracterizada por um bloqueio persistente do fluxo de ar dos pulmões. Ela é uma doença pulmonar ameaçadora à vida, subdiagnosticada, que interfere com a respiração normal e não é totalmente reversível. COPD inclui algumas doenças pulmonares: as mais comuns são bronquite crônica e enfisema. Muitas pessoas com COPD têm ambas as doenças. O enfisema é um dano aos sacos de ar nas pontas das vias aéreas, o que torna difícil para o corpo absorver o oxigênio que ele precisa. Durante a bronquite crônica, as vias aéreas estão irritadas, vermelhas e produzem muito muco pegajoso. As paredes das vias aéreas estão inchadas e bloqueiam parcialmente o ar de passar por elas.
[00274] Os neutrófilos são atraídos para um gradiente de C5a, liberam radicais superóxido para matar patógenos e liberam betaglucuronidase para hidrolisar conjugados de glucuronida complexos no sítio de inflamação. No entanto, esses mecanismos de defesa valiosos podem ser prejudiciais para o corpo se os neutrófilos forem recrutados para sítios de inflamação livre de patógeno, por exemplo, em sítios reperfundidos após infarto, acidente vascular cerebral ou transplante de órgão ou no caso de doença autoimune, doença de Alzheimer e outras que são listadas abaixo.
[00275] Por sua vez, concentrações excessivamente altas de C5a - especialmente se elas não estiverem apenas localmente elevadas como elas aparecem durante a sepse - levam à ativação sistêmica dos neutrófilos (levando a dano do órgão) com subsequente exaustão e desativação por meio de expressão de receptor de C5a reduzida na superfície da célula de neutrófilo. Isso torna o paciente ainda mais vulnerável aos patógenos que persistem neste corpo (Huber-Lang e outros, 2002).
[00276] Um ácido nucleico de ligação a C5a que é também inibidor para os efeitos mediados por C5a sobre seu receptor (CD88) (conforme mostrado por ensaios de quimiotaxia usando células BAF-3 diferenciadas) tem então o potencial de bloquear as consequências mencionadas acima de sinalização de C5a e poderia provar ser benéfico como parte de um medicamento em várias doenças e condições nas quais sinalização de C5a aberrante está implicada. Uma dessas condições é sepse polimicrobiana. Há um corpo rico de evidência de coleta na literatura para o papel prejudicial de sinalização de C5a em sepse (Ward, 2010b). Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção foram verificados melhorar a sobrevivência de camundongos e parâmetros de função de órgão em estudos de ligação cecal e punção (CLP) (Cecal Ligation and Puncture). CLP é um modelo de roedor bem estabelecido para sepse polimicrobiana. Recentemente o papel de C5 de complemento em sepse induzida por ligação cecal e punção foi investigado em camundongos do tipo selvagem e deficientes em C5 (Flierl e outros, 2008). Camundongos C5-/- não tinham nenhuma vantagem de sobrevivência comparado com camundongos do tipo selvagem (WT) (Wild Type) e exibiram um aumento de 400 vezes de bactérias de origem sanguínea quando comparado com camundongos do tipo selvagem. Esses efeitos foram ligados à incapacidade de camundongos C5 (-/-) em montar o complexo de ataque de membrana terminal (MAC). Os autores concluem que, durante a sepse, bloqueio seletivo de C5a ou seu receptor (ao invés de C5) parece uma estratégia mais promissora, porque o bloqueio de C5a ainda permite a formação de MAC enquanto os efeitos adversos de C5a são prevenidos. Em concordância, deleção genética de receptores de C5a CD88 e CL2, bloqueio farmacológico de CD88 ou neutralização farmacológica de C5a foram mostrados ser protetores em sepse induzida por ligação cecal e punção (CLP) (Czermak e outros, 1999; Rittirsch e outros, 2008). Um modelo in vitro traducional de sepse meningocócica usando sangue integral humano confirma que inibição seletiva de C5a (em contraste com bloqueio de clivagem de C5) previne ativação de leucócito potencialmente prejudicial sem comprometer a eliminação bacteriana (Sprong e outros, 2003). Inibição de C5a previne falência múltipla dos órgãos em sepse experimental através da limitação de inflamação sistêmica, coagulação e outros mecanismos patogênicos (Huber-Lang e outros, 2001; Huber-Lang e outros, 2002; Laudes e outros, 2002; Rittirsch e outros, 2008; Ward, 2010a). Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, embora se ligando a C5, não bloqueiam clivagem de C5 para C5a e C5b que são requeridas para formação de MAC. Pelo contrário, os ácidos nucleicos da invenção ocupam a proteína C5, que também aumenta a meia-vida no plasma terminal e seletivamente bloqueia a ação de C5a uma vez essa tendo sido liberada, por exemplo, pela C5 convertase. Em um modelo de sepse, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção foram mostrados limitar inflamação, prevenir falência múltipla dos órgãos e formação de edema e melhorar a sobrevivência.
[00277] Os pacientes com sepse frequentemente requerem ventilação mecânica devido à lesão pulmonar aguda (ALI) (Acute Lung Injury) e síndrome do desconforto respiratório agudo (ARDS) (Acute Respiratory Distress Syndrome). ALI/ARDS podem também se desenvolver a partir de uma infecção do pulmão direta através de infecções adquiridas na comunidade ou hospital em pneumonia. Há uma evidência abundante para um papel patogênico de C5a em ALI/ARDS. Expressão de fator de tecido induzida por C5a contribui para deposição de fibrina dentro dos alvéolos pulmonares de pacientes com ALI/ARDS (Kambas e outros, 2008). ALI experimental é atenuada em camundongos C5-/- e neutralização ou silenciamento de C5a de C5aR nos pulmões suprime a resposta inflamatória e previne vazamento vascular (Bosmann & Ward, 2012).
[00278] Além disso, outras doenças e/ou distúrbios e/ou condições de doença para o tratamento e/ou prevenção dos quais o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser usado incluem, mas não estão limitados a, são doenças autoimunes tais como artrite reumatoide (abr. AR), espondilite anquilosante (abr. AS - Ankylosing Spondylitis), lúpus eritematoso sistêmico (abr. SLE) , esclerose múltipla (abr. MS - Multiple Sclerosis), psoríase, alopecia areata, anemia hemolítica autoimune quente e fria (abr. AIHA - Autoimmune Hemolytic Anemia), uremia hemolítica atípica, anemia perniciosa, doenças inflamatórias agudas, adrenalite autoimune, polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (abr. CIDP - Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy), síndrome de Churg-Strauss, síndrome de Cogan, síndrome de CREST, pênfigo vulgar e pênfigo foliáceo, pênfigo bolhoso, polimialgia reumática, polimiosite, cirrose biliar primária, pancreatite, peritonite, artrite psoriática, febre reumática, sarcoidose, síndrome de Sjorgensen, escleroderma, doença celíaca, síndrome stiff-man, arterite de Takayasu, intolerância a glúten transiente, uveíte autoimune, vitiligo, policondrite, dermatite herpetiforme (abr. DH - Dermatitis Herpetiformis) ou doença de Duhring, fibromialgia, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barré, tireoidite de Hashimoto, hepatite autoimune, doença inflamatória intestinal (abr. IBD), doença de Crohn, colite ulcerosa, miastenia grave, distúrbios do complexo imune, glomerulonefrite, poliarterite nodosa, síndrome antifosfolipídeo, síndrome autoimune poliglandular, fibrose pulmonar idiopática, trombocitopenia púrpura idiopática (abr. ITP) (Idiopathic Thrombocytopenic Purpura), urticária, infertilidade autoimune, artrite reumatoide juvenil, sarcoidose, cardiomiopatia autoimune, síndrome Lambert-Eaton, esclerose de líquen, doença de Lyme, doença de Graves, doença de Behçet, doença de Ménière, artrite reativa (síndrome de Reiter); infecções com vírus tais como HIV, HBV, HCV, CMV ou parasitas intracelulares tais como Leishmania, Rickettsia, Clamídia, Coxiella, Plasmódio, Brucella, micobactérias, Listeria, Toxoplasma e Tripanossoma; danos secundários de trauma; inflamação local, choque, choque anafilático, queimadura, choque séptico, choque hemorrágico, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (abr. SIRS, Systemic Inflammatory Response Syndrome), falência múltipla dos órgãos (abr. MOF), asma e alergia, vasculite tal como arterite temporal, vasculite, vazamento vascular e aterosclerose; lesões agudas do sistema nervoso central, miocardite, dermatomiosite, gengivite, insuficiente respiratória aguda, doença pulmonar obstrutiva crônica, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, lesão por reperfusão, disfunção neurocognitiva, queimadura, doenças inflamatórias do olho tais como uveíte, degeneração macular relacionada com a idade (abr. AMD - Age- Related Macular Degeneration), retinopatia diabética (abr. DR - Diabetic Retinopathy), edema macular diabético (abr. DME) (Diabetic Macular Edema), penfigoide ocular, queratoconjuntivite, síndrome de Stevens-Johnson e oftalmopatia de Graves; manifestações locais de doenças sistêmicas, doenças inflamatórias da vasculatura, lesões agudas do sistema nervoso central, diabetes tipos 1 e 2, as manifestações do diabetes, SLE e doença reumática no olho, cérebro, vasculatura, coração, pulmão, rins, fígado, trato gastrintestinal, baço, pele, ossos, sistema linfático, sangue e outros sistemas de órgão, para a prevenção e/ou apoio e/ou tratamento pós-operatório de enxerto de bypass de artéria coronária (abr. CABG - Coronary Artery Bypass Graft), enxerto de bypass da artéria coronária sem circulação extracorpórea "off-pump" (abr. OPCABG - Off-pump Coronary Artery Bypass Graft), enxerto de bypass da artéria coronária direto minimamente invasivo (abr. MIDCAB - Minimally Invasive Direct Coronary Artery Bypass Graft), angioplastia coronária transluminal percutânea (abr. PTCA - Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty), trombólise, transplante de órgão e cirurgia de fixação de vaso; para a prevenção de dano a órgão de um órgão transplantado ou de um órgão a ser transplantado ou para uso de tratamento de rejeição de transplante para órgãos transplantados tais como fígado, rim, intestino, pulmão, coração, pele, membros, córnea, ilhota de Langerhans, medula óssea, vasos sanguíneos e pâncreas; rejeição fetal.
[00279] As várias doenças e distúrbios para o tratamento e/ou prevenção dos quais os ácidos nucleicos podem ser usados podem ser agrupados como segue:
[00280] 1. Doenças autoimunes/inflamatórias
[00281] 1.1 Doenças autoimunes e/ou inflamatórias sistêmicas compreendendo alergia, choque séptico, danos secundários de trauma, anemia hemolítica quente e fria (abr. AIHA), síndrome da resposta inflamatória sistêmica (abr. SIRS), choque hemorrágico, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, as manifestações do diabetes, escleroderma difuso, periodontite e sua perda óssea associada, policondrite, síndrome autoimune poliglandular, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico (abr. SLE) e suas manifestações, artrite reativa (também conhecida como síndrome de Reiter).
[00282] 1.2 Doenças autoimunes e/ou inflamatórias do trato gastrintestinal compreendendo doença de Crohn, colite ulcerosa, doença celíaca, intolerância a glúten transiente, doença inflamatória intestinal (abr. IBD), pancreatite, hipersensibilidade alérgica gastrintestinal, enterocolite necrotizante.
[00283] 1.3 Doenças autoimunes e/ou inflamatórias da pele compreendendo psoríase, urticária, dermatomiosite, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, pênfigo bolhoso, escleroderma morfea/linear, vitiligo, dermatite herpetiforme (abr. DH) ou doença de Duhring, esclerose de líquen.
[00284] 1.4 Doenças autoimunes e/ou inflamatórias da vasculatura compreendendo vasculites (preferivelmente arterite temporal), vasculite, púrpura de Henoch Schonlein, vasculite associada a anticorpo citoplásmico antineutrófilo (ANCA) (Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody), vazamento vascular, polimialgia reumática, aterosclerose, síndrome de Churg-Strauss, arterite Takayasu, síndrome de Goodpasture (=doença da membrana de base antiglomerular; afetando principalmente os glomérulos renais e os pulmões), glomerulonefrite, poliarterite nodosa, doença de Behçet.
[00285] 1.5 Doenças autoimunes e/ou inflamatórias do sistema nervoso compreendendo esclerose múltipla (abr. MS), polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (abr. CIDP), disfunção neurocognitiva, síndrome stiff-man, síndrome Guillain-Barré, miastenia grave, síndrome Lambert-Eaton, neuromielite óptica (síndrome Devic).
[00286] 1.6 Doenças autoimunes e/ou inflamatórias músculo- esqueletais compreendendo artrite reumatoide, doença reumática no olho, cérebro, pulmão, rins, coração, fígado, trato gastrintestinal, baço, pele, ossos, sistema linfático, sangue e outros órgãos, espondilite anquilosante (abr. AS), sarcoidose, periodontite e perda óssea associada, polimialgia reumática, polimiosite, artrite psoriática, febre reumática, policondrite, fibromialgida, artrite reumatoide juvenil, doença de Lyme, artrite reativa (também conhecida como síndrome de Reiter).
[00287] 1.7 Outras doenças autoimunes e/ou inflamatórias compreendendo síndrome de Cogan, adrenalite autoimune, distúrbios imunes complexos, doença de Ménière, inflamações locais, alopecia areata, doenças inflamatórias agudas, cirrose biliar primária, síndrome de Sjorgen, escleroderma, escleroderma difuso, síndrome de CREST, escleroderma Morphea/linear, uveíte autoimune, tireoidite de Hashimoto (destruição autoimune da tireóideo), doença de Grave, hepatite autoimune, esteatoepatite não alcoólica, glomerulonefrite, peritonite, síndrome antifosfolipídeo, fibrose pulmonar idiopática, fibrose renal, fibrose hepática, infertilidade autoimune, rejeição fetal ou aborto espontâneo e doença exerto-versus-hospedeiro.
[00288] 2. Doenças do olho compreendendo uveíte, conjuntivite, degeneração macular relacionada com a idade (abr. AMD), retinopatia diabética (abr. DR), edema macular diabético (abr. DME), oclusão do vaso retinal, glaucoma, catarata, doença inflamatória retinal e intraocular autoimune, penfigoide ocular, queratoconjuntivite, síndrome Steven-Johnson e oftalmopatia de Graves.
[00289] 3. Lesões por reperfusão e rejeições de transplante compreendendo acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, lesões por reperfusão, microangiopatia trombótica pós-transplante ou dano de órgão a órgãos transplantados, tais como fígado (Arumugam e outros, 2004), rim (Arumugam e outros, 2003), intestino, pulmão, coração, pele, membros, córnea, ilhotas de Langerhans (Tokodai e outros, 2010), medula óssea, vasos sanguíneos e pâncreas, dano ao rim após transplante de órgão ou medula óssea.
[00290] 4. Prevenção de rejeição de transplante compreendendo rejeição de transplante de órgãos transplantados, tais como fígado, rim, intestino, pulmão, coração, pele, membros, córnea, ilhotas de Langerhans, medula óssea, vasos sanguíneos e pâncreas.
[00291] 5. Doenças cardiovasculares compreendendo aterosclerose, miocardite, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, hipertensão arterial pulmonar (PAH) (Pulmonary Arterial Hypertension), Aneurisma Aórtico Abdominal, doenças inflamatórias da vasculatura, vasculite, preferivelmente arterite temporal, vasculite, derrame vascular, as manifestações do diabetes, pré-eclâmpsia, cardiomiopatia autoimune, doença do hospedeiro da veia, displasia/cardiomiopatia arritmogênica do ventrículo direito, para a prevenção e/ou apoio e/ou tratamento pós- operatório de enxerto de bypass da artéria coronária (abr. CABG).
[00292] 6. Disfunção metabólica compreendendo resistência à inulina, intolerância à glicose, inflamação adiposa e disfunção cardiovascular em obesidade induzida por dieta.
[00293] 7. Doenças respiratórias compreendendo asma, insuficiência respiratória aguda, lesão pulmonar aguda, lesão pulmonar relacionada à transfusão, síndrome do desconforto respiratório agudo, doença pulmonar obstrutiva crônica, lesão pulmonar induzida por ventilador, pneumonia e suas complicações.
[00294] 8. Doenças inflamatórias compreendendo doença inflamatória do olho, uveíte autoimune (Copland e outros, 2010), conjuntivite, conjuntivite vernal, manifestações locais de doenças sistêmicas.
[00295] 9. Reações agudas compreendendo danos secundários de traumas e fraturas, choque, queimadura, choque anafilático, choque hemorrágico, falência múltipla dos órgãos (abr. MOF), lesões agudas do sistema nervoso central, dano agudo devido à produção excessiva de C5a por um sistema de coagulação ativado tal como após transplante de órgão ou ilhota.
[00296] 10. Dor, dor aguda, dor crônica, dor neuropática, tolerância à morfina e hiperalgesia induzida por retirada.
[00297] 11. Distúrbios neurológicos e neurodegenerativos compreendendo neuropatias, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) (Amyotrophic Lateral Sclerosis), doença de Alzheimer e doença de Parkinson (Farkas e outros, 1998).
[00298] 12. Doenças infecciosas compreendendo
[00299] 12.1 infecções bacterianas, preferivelmente meningite, doença de Lyme, artrite reativa (também conhecida como síndrome de Reiter), infecção do trato urinário e rim, sepse e suas complicações tais como falência de órgão, disfunções cardíacas, hipoperfusão sistêmica, acidose, síndrome do desconforto respiratório adulto, infecções com patógenos intracelulares (Klos e outros, 2009),
[00300] 12.2 infecções virais, preferivelmente HIV, HBV, HCV, CMV, meningite viral
[00301] 12.3 parasitas intracelulares, preferivelmente Leishmania, Rickettsia, Clamídia, Coxiella, plasmódio, especialmente malária cerebral, Brucella, micobactérias, Listeria, Toxoplasma e Tripanossoma.
[00302] 13. Doenças hematológicas compreendendo doenças associadas com ativação de coagulação e coagulação intravascular disseminada por sistemas fibrinolíticos (DIC) (Disseminated Intravascular Coagulation) e/ou trombose, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune (abr. AIHA), síndrome antifosfolipídeo e suas complicações associadas, tromboses arterial e venosa, complicações da gravidez tal como aborto espontâneo recorrente e morte fetal, preeclâmpsia, insuficiente placental, restrição de crescimento fetal, remodelagem cervical e parto prematuro, púrpura trombocitopênica idiopática (abr. ITP), síndrome urêmica hemolítica (aHUS), hemoglobinúria noturna paroxismal (PNH) e reações de transfusão alérgica.
[00303] 14. Complicações clínicas associadas com ativação por biomateriais de cascatas de complemento e coagulação ocorrendo em procedimentos compreendendo hemodiálise, aferese, viscossuplementação de juntas artríticas, bypass cardiopulmonar, enxertos vasculares protéticos e uso de dispositivos cardiovasculares.
[00304] Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser também usados de uma maneira intraoperatória para evitar efeitos prejudiciais do sistema imune do paciente, mais preferivelmente para a prevenção e/ou apoio e/ou tratamento pós-operatório de enxerto de bypass da artéria coronária (abr. CABG), enxerto de bypass da artéria coronária sem circulação extracorpórea (abr. OPCABG), enxerto de bypass da artéria coronária direto minimamente invasivo (abr. MIDCAB), angioplastia coronária transluminal percutânea (abr. PTCA), trombólise, transplante de órgão, cirurgia do cordão cerebral e espinhal, cirurgia reconstrutiva e cirurgia de fixação de vaso, durante qualquer tratamento com ventilação artificial ou auxílio de ventilação para evitar lesão pulmonar induzida por ventilador de pulmão ou danos secundários, tal como derrame vascular e/ou enfisema, para a prevenção de dano ao órgão de um órgão de transplante ou de um órgão a ser transplantado ou para uso de tratamento de rejeição de transplante e lesão por reperfusão para órgãos transplantados, tais como fígado, rim, intestino, pulmão, coração, pele, córnea, ilhotas de Langerhans, medula óssea, vasos sanguíneos e pâncreas.
[00305] A presente invenção também compreende que o medicamento e a composição farmacêutica, respectivamente, contendo o ácido nucleico de acordo com os presentes inventores podem ser usados para o tratamento de tal maneira.
[00306] Em uma modalidade adicional, o medicamento compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional. Tais compostos farmaceuticamente ativos adicionais são, dentre outros, mas não limitado a eles, aqueles conhecidos suprimir o sistema imune tal como inibidores de calcineurina, ciclosporina A, metotrexato, azatioprina, tacrolimus, rapamicina, clorambucil, leflunomida, mofetil micofenolato, brequinar, mizoribina, talidomida ou desoxispergualina. O composto farmaceuticamente ativo adicional pode ser, em uma modalidade adicional, também um dos compostos que reduzem a produção de histamina tais como meclozina, clemastina, dimetindeno, bamipina, cetotifeno, cetirizina, lovecetirizina, cesloratadina, azelastina, mizolastina, levocabastina, terfenadina, fexofenadina ou ebastina. Tais compostos podem ser também, mas não estão limitados a, esteroides e são preferivelmente selecionados do grupo compreendendo corticosteroides tais como prednisona, metilprednisolona, hidrocortisona, dexametasona, triamcinolona, betametasona, efervescente ou budenosida. Ainda, tal composto pode ser um ou vários antibióticos tais como, mas não restrito a, aminoglicosídeos, antibióticos β-lactama, inibidores de girase, antibióticos de glicopeptídeo, lincosamida, antibióticos macrolídeos, derivados de nitroimidazol, antibióticos de polipeptídeo, sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclina. Ainda, agentes biológicos anti-inflamatórios ou antiangiogênicos mais específicos podem ser usados em combinação tais como bevacizumabe, ranibizumabe, IL-10, erlizumabe, tolermabe, rituximabe, gomiliximabe, basiliximabe, daclizumabe, HuMax-TAC, visilizumabe, HuMaxCD4, clenoliximabe, MAX 16H5, TNX 100, toralizumabe, alemtuzumabe, CY 1788, galiximabe, pexelizumabe, eculizumabe, PMX-53, ETI 104, FG 3019, bertilimumabe, 249417 (anti-fator IX) abciximabe, YM 337, omalizumabe, talizumabe, fontolizumabe, J695 (anti-IL2), HuMaxIL-15, mepolizumabe, elsilimomabe, HuDREG, anaquinra, Xoma-052, adalimumabe, infliximabe, certolizumabe, afelimomabe, CytoFab, AME 527, Vapaliximabe, bevacizumabe, ranibizumabe, vitaxina, belimumabe, MLN 1202, volociximabe, F200 (anti-α5β1), efalizumabe, m60.11 (anti.CD11b), etanercepte, onercepte, rilonacepte, abatacepte, natalizumabe ou siplizumabe, tocilizumabe, ustequinumabe, ABT-874. Finalmente, o agente farmaceuticamente ativo adicional pode ser um modulador da atividade de qualquer outra quimiocina que possa ser um agonista ou antagonista de quimiocina ou um agonista ou antagonista de receptor de quimiocina em que a quimiocina pode ser também um lipídeo quimiotático. Um exemplo é o modulador de receptor de S1P fingolimode. Alternativamente, ou adicionalmente, tal agente farmaceuticamente ativo adicional é um ácido nucleico adicional de acordo com a presente invenção. Alternativamente, o medicamento compreende pelo menos mais um ácido nucleico que se liga a uma molécula alvo diferente de C5a ou exibe uma função que é diferente daquela dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.
[00307] Em geral, o antagonista de C5a pode ser combinado com inibidores de outras moléculas pró-inflamatórias ou seus receptores. Exemplos de moléculas pró-inflamatórias cuja ação pode ser atenuada em combinação com o antagonista de C5a são IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, IL- 8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-23, TNF, α4β7, α5β1, BlyS, caderina, CCR2, CD11a, CD11b, CD125, CD130, CD16, CD18, CD2, CD20,CD22, CD23, CD25, CD28, CD3, CD30, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45R, CD54, CD62E, CD62L, CD68, CD8, CD80, CD86, CD95, CEP, gastrina-R, C1, C1-esterase, C5, fator D, MBL, receptor de complemento 1, receptor de CRTH2, CTGF, E- e P- selectina, eotaxina, fator IX, FGF-20, Fgl-2, GM-CSF, receptor de GP Ilb/IIIa, HMG1, ICAM-1, IgE, timócitos, IFNY, IFNr, IP-10, MCP-1, receptor de M-CSF, MIF, MMP9, PDGF-D, SDF-1, TGFβ1, fator de tecido, receptor de tirosina cinase, VAP-1, VCAM-1, VEGF, VLA1, fator von Willebrandt, esfingosina 1 Fosfato, ceramida-1 fosfato e inibidores de mitógeno, por exemplo, inibidores do ácido lisofosfatídico.
[00308] Finalmente, o agente farmaceuticamente ativo adicional pode ser um modulador da atividade de qualquer outra quimiocina que pode ser um agonista ou antagonista de quimiocina ou um agonista ou antagonista de receptor de quimiocina. Alternativamente, ou adicionalmente, tal agente farmaceuticamente ativo adicional é um ácido nucleico adicional de acordo com a presente invenção. Alternativamente, o medicamento compreende pelo menos mais um ácido nucleico que se liga a uma molécula alvo diferente de C5a ou exibe uma função que é diferente de um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção.
[00309] É compreendido pela presente invenção que o medicamento é alternativamente ou adicionalmente usado, a princípio, para a prevenção de qualquer uma das doenças reveladas com relação ao uso do medicamento para o tratamento das ditas doenças. Os respectivos marcadores, portanto, isto é, para as respectivas doenças, são conhecidos dos versados na técnica. Preferivelmente, o respectivo marcador é C5a.
[00310] Em uma modalidade do medicamento da presente invenção, tal medicamento é para uso em combinação com outros tratamentos para qualquer uma das doenças reveladas aqui, particularmente aquelas para as quais o medicamento da presente invenção deve ser usado.
[00311] "Terapia de combinação" (ou "coterapia") inclui a administração de um medicamento da invenção e pelo menos um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico pretendido prover o efeito benéfico a partir da coação desses agentes terapêuticos, isto é, o medicamento da presente invenção e o dito segundo agente. O efeito benéfico da combinação inclui, mas não está limitado a, coação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. Administração desses agentes terapêuticos em combinação é tipicamente realizada durante um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias ou semanas dependendo da combinação selecionada).
[00312] "Terapia de combinação" pode, mas geralmente não, pretende compreender a administração de dois ou mais desses agentes terapêuticos como parte de regimes de monoterapia separados que incidentalmente ou arbitrariamente resultam nas combinações da presente invenção. "Terapia de combinação" pretende compreender administração desses agentes terapêuticos de uma maneira sequencial, isto é, em que cada agente terapêutico é administrado em um momento diferente, bem como administração desses agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, de uma maneira substancialmente simultânea. Administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, através da administração a um indivíduo de uma cápsula única tendo uma razão fixa de cada agente terapêutico ou em cápsulas únicas, múltiplas, para cada um dos agentes terapêuticos.
[00313] Administração sequencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser realizada através de qualquer via apropriada incluindo, mas não limitado a, vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares e absorção direta através de tecidos da membrana da mucosa. Os agentes terapêuticos podem ser administrados através da mesma via ou através de vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado através de injeção enquanto os outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topicamente.
[00314] Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados topicamente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados através de injeção. A sequência em que os agentes terapêuticos são administrados não é estritamente crítica a menos que de outro modo mencionado. "Terapia de combinação" também compreende a administração dos agentes terapêuticos conforme acima descrito em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos. Onde a terapia de combinação compreende ainda um tratamento não fármaco, o tratamento não fármaco pode ser conduzido em qualquer momento adequado contanto que o efeito benéfico a partir da coação da combinação dos agentes terapêuticos e tratamento não fármaco seja obtido. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda obtido quando o tratamento não fármaco é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou até mesmo semanas.
[00315] Conforme mostrado em termos gerais acima, o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser administrado, a princípio, em qualquer forma conhecida daqueles versados na técnica. Uma via de administração preferida é administração sistêmica, mais preferivelmente através de administração parenteral, preferivelmente através de injeção. Alternativamente, o medicamento pode ser administrado oralmente. Outras vias de administração compreendem intramuscular, intraperitoneal e subcutânea, oral, intranasal, intratraqueal ou pulmonar com preferência dada à via de administração que é a menos invasiva, enquanto assegurando eficácia.
[00316] A administração parenteral é geralmente usada para injeções e infusões subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Ainda, uma abordagem para administração parenteral emprega o implante de um sistema de liberação lenta ou liberação sustentada, que assegura que um nível de dosagem constante seja mantido, que são bem conhecidos do versado comum na técnica.
[00317] Ainda, os medicamentos preferidos da presente invenção podem ser administrados em forma intranasal através de uso tópico de veículos intranasais adequados, inalantes, ou através de vias transdermais, usando aquelas formas de emplastros para a pele transdermais bem conhecidos daqueles de habilidade comum na técnica. Para ser administrada na forma de um sistema de administração transdermal, a administração de dosagem será, com certeza, contínua ao invés de intermitente durante o regime de dosagem. Outras preparações tópicas preferidas incluem cremes, unguentos, loções, sprays aerossóis e géis, em que a concentração de ingrediente ativo tipicamente variaria de a partir de 0,01% a 15%, p/p ou p/v.
[00318] O medicamento da presente invenção compreenderá geralmente uma quantidade eficaz do(s) componente(s) ativo(s) da terapia incluindo, mas não limitado a, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção, dissolvida ou dispersa em um meio farmaceuticamente aceitável. Meios ou veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similar. O uso de tais meios ou agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares podem ser também incorporados ao medicamento da presente invenção.
[00319] Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica. Tal composição farmacêutica compreende pelo menos um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção e preferivelmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal veículo pode ser qualquer veículo ou qualquer ligante usado e/ou conhecido na técnica. Mais particularmente tal ligante ou veículo é qualquer ligante ou veículo conforme discutido com relação à fabricação do medicamento revelado aqui. Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional.
[00320] A preparação de um medicamento e uma composição farmacêutica será conhecida daqueles de habilidade na técnica à luz da presente invenção. Tipicamente, tais composições podem ser preparadas como injetáveis, ou como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em, suspensão em, líquido antes da injeção; como comprimidos ou outros sólidos para administração oral; como cápsulas de liberação com o tempo; ou em qualquer outra forma atualmente usada, incluindo colírios, cremes, loções, pastas, inalantes e similar. O uso de formulações estéreis, tais como lavagens à base de solução salina, por cirurgiões, médicos ou profissionais de cuidado de saúde para tratar uma área particular no campo de operação pode também ser particularmente útil. As composições podem também ser administradas através de microdispositivos, micropartícula ou esponja.
[00321] Quando da formulação, um medicamento será administrado de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade que seja farmacologicamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tal como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas as cápsulas de administração de fármaco e similar podem também ser empregadas.
[00322] Neste contexto, a quantidade de ingrediente ativo e o volume da composição a ser administrada dependem do indivíduo ou do sujeito a ser tratado. Quantidades específicas de composto ativo requeridas para administração dependem do julgamento do praticamente e são peculiares a cada indivíduo. Um volume mínimo de um medicamento requerido para dispersar os compostos ativos é tipicamente utilizado. Regimes adequados para administração são também variáveis, mas seriam tipificados administrando inicialmente o composto e monitorando os resultados e então fornecendo doses controladas adicionais em intervalos adicionais.
[00323] Por exemplo, para administração oral na forma de um comprimido ou cápsula (por exemplo, uma cápsula de gelatina), o componente de fármaco ativo, isto é, uma molécula de ácido nucleico da presente invenção e/ou qualquer agente farmaceuticamente ativo adicional, também referido aqui como agente(s) terapêutico ou composto(s) ativo(s), pode ser combinado com um veículo inerte farmaceuticamente aceitável, não tóxico, oral, tais como etanol, glicerol, água e similar. Além disso, quando desejado ou necessário, ligantes, lubrificantes, agentes de desintegração e agentes de coloração adequados podem ser também incorporados à mistura. Ligantes adequados incluem amido, silicato de magnésio alumínio, pasta de amido, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona, açúcares naturais tal como glicose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas tal como acácia, tragacanto ou alginato de sódio, polietileno glicol, ceras e similar. Lubrificantes usados nessas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietilenoglicol, e similar. Desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil celulose, ágar, bentonita, goma xantana, amidos, ágar, ácido algínico ou seu sal de sódio, ou misturas efervescentes, e similar. Diluentes incluem, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina.
[00324] O medicamento da invenção pode ser também administrado em tais formas de dosagem oral como comprimidos ou cápsulas de liberação cronometrada ou liberação sustentada, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões graxas.
[00325] A composição farmacêutica ou o medicamento pode ser esterilizado e/ou conter adjuvantes, tais como agentes conservantes, de estabilização, umectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regulagem da pressão osmótica e/ou tampões. Ainda, eles podem também conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos de mistura, granulação ou revestimento convencionais, e tipicamente contêm cerca de 0,1% a 75%, preferivelmente cerca de 1% a 50%, do ingrediente ativo.
[00326] Composições líquidas, particularmente injetáveis, podem, por exemplo, ser preparadas através da dissolução, dispersão, etc. O composto ativo é dissolvido em ou misturado com um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol e similar, para então formar a solução ou suspensão injetável. Ainda, formas sólidas adequadas para dissolução em líquido antes da injeção podem ser formuladas.
[00327] Para composições sólidas, excipientes incluem graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose, carbonato de magnésio e similar. O composto ativo definido acima pode também ser formulado como supositórios usando, por exemplo, polialquileno glicóis, por exemplo, propileno glicol, como o veículo. Em algumas modalidades, supositórios são vantajosamente preparados a partir de emulsões ou suspensões graxas.
[00328] Os medicamentos e as moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de administração de lipossoma, tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídeos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas modalidades, uma película de componentes de lipídeo é hidratada com uma solução aquosa de fármaco para formar camada de lipídeo encapsulando o fármaco, o que é bem conhecido do versado comum na técnica. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico descritas aqui podem ser providas como um complexo com um composto lipofílico ou composto de peso molecular alto, não imunogênico, construído usando métodos conhecidos na técnica. Ainda, lipossomas podem carregar tais moléculas de ácido nucleico em sua superfície para direcionamento e transporte de agentes citotóxicos internamente para mediar morte celular. Um exemplo de complexos associados a ácido nucleico é provido na Patente U.S. No. 6.011.020.
[00329] Os medicamentos e as moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção podem também ser acoplados a polímeros solúveis como veículos de fármaco alvo. Tais polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, poli-idroxipropil- metacrilamida-fenol, poli-idroxietilaspanamidofenol e polietilenooxipolilisina substituído com resíduos palmitoíla. Ainda, os medicamentos e as moléculas de ácido nucleico, respectivamente, da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis na obtenção de liberação controlada de um fármaco, por exemplo, ácido poliláctico, poliepsilon caprolactona, ácido poli-idroxibutírico, poliortoésteres, poliacetais, polidi-hidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros em bloco de hidrogéis reticulados ou anfifáticos.
[00330] Se desejado, a composição farmacêutica e o medicamento, respectivamente, a serem administrados podem também conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento do pH e outras substâncias tais como, por exemplo, acetato de sódio e oleato de trietanolamina.
[00331] O regime de dosagem que utiliza as moléculas de ácido nucleico e medicamentos, respectivamente, da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo tipo, espécie, idade, peso, sexo e condição médica do paciente; a severidade da condição a ser tratada; a via de administração; as funções renal e hepática do paciente; e o aptâmero particular ou sal do mesmo empregado. Um médico ou veterinário versado comum pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco requerida para prevenir, combater ou parar o progresso da condição.
[00332] Níveis eficazes no plasma do ácido nucleico de acordo com apresente invenção preferivelmente variam de a partir de 500 fM a 500 μM no tratamento de qualquer uma das doenças reveladas aqui.
[00333] As moléculas de ácido nucleico e os medicamentos, respectivamente, da presente invenção podem ser preferivelmente administrados em uma dose diária única, a cada dois ou três dias, semanalmente, a cada dois dias, em uma dose mensal única ou a cada três meses.
[00334] É compreendido pela presente invenção que o medicamento conforme descrito aqui constitui a composição farmacêutica revelada aqui.
[00335] Em um aspecto adicional a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de um indivíduo que tem necessidade de tal tratamento, em que o método compreende a administração de uma quantidade farmaceuticamente ativa de pelo menos um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o indivíduo sofre de uma doença ou está sob risco de desenvolver tal doença, em que a doença é qualquer uma daquelas reveladas aqui, particularmente qualquer uma daquelas doenças reveladas com relação ao uso de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento.
[00336] Deve ser compreendido que o ácido nucleico bem como os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados não apenas como um medicamento ou para a fabricação de um medicamento, mas também para propósitos cosméticos, particularmente com relação ao envolvimento de C5a em lesões de pele regionais inflamadas. Desta maneira, uma condição ou doença adicional para o tratamento ou prevenção da qual o ácido nucleico, o medicamento e/ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser usado são lesões de pele regional inflamadas.
[00337] Conforme preferivelmente usado aqui um diagnóstico ou agente de diagnóstico ou meio de diagnóstico é adequado para detectar, ou diretamente ou indiretamente, C5a, preferivelmente C5a conforme descrito aqui e mais preferivelmente C5a conforme descrito aqui com relação aos vários distúrbios e doenças descritos aqui. O diagnóstico é adequado para a detecção e/ou acompanhamento de qualquer um dos distúrbios e doenças, respectivamente, descritos aqui. Tal detecção é possível através da ligação dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção a C5a. Tal ligação pode ser ou diretamente ou indiretamente detectada. Os respectivos métodos e meios são conhecidos do versado na técnica. Dentre outros, os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem compreender um marcador que permite a detecção dos ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção, preferivelmente o ácido nucleico ligado a C5a. Tal marcador é preferivelmente selecionado do grupo compreendendo marcadores radioativos, enzimáticos e fluorescentes. A princípio, todos os ensaios conhecidos desenvolvidos para anticorpos podem ser adotados para os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção enquanto o anticorpo de ligação a alvo é substituído por um ácido nucleico de ligação ao alvo. Em ensaios de anticorpo usando anticorpos de ligação ao alvo não marcados a detecção é preferivelmente feita por um anticorpo secundário que é modificado com marcadores radioativos, enzimáticos e fluorescentes e se liga ao anticorpo de ligação ao alvo em seu fragmento Fc. No caso de um ácido nucleico, preferivelmente um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico é modificado com tal marcador, em que preferivelmente tal marcador é selecionado do grupo compreendendo biotina, Cy-3 e Cy-5, e tal marcador é detectado por um anticorpo direcionado contra tal marcador, por exemplo, um anticorpo antibiotina, um anticorpo anti-Cy3 ou um anticorpo anti-Cy5, ou - no caso do marcador se biotina - o marcador é detectado por estreptavidina ou biotina que se liga naturalmente à biotina. Tal anticorpo, estreptavidina ou avidina, por sua vez é preferivelmente modificado com um respectivo marcador, por exemplo, um marcador radioativo, enzimático ou fluorescente (tal como um anticorpo secundário).
[00338] Em uma modalidade adicional as moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção são detectadas ou analisadas através de um segundo meio de detecção, em que o dito meio de detecção é um farol molecular. A metodologia de farol molecular é conhecida de versados na técnica. Em suma, as sondas de ácido nucleico, que são também referidas como faróis moleculares, são um complemento reverso para a amostra de ácidos nucleicos a ser detectada e hibridizam devido a isso para uma parte da amostra de ácido nucleico a ser detectada. Quando da ligação à amostra de ácido nucleico os grupos fluoróficos do farol molecular são separados, o que resulta em uma mudança do sinal de fluorescência, preferivelmente uma mudança em intensidade. Esta mudança se relaciona com a quantidade de amostra de ácidos nucleicos presente.
[00339] Será reconhecido que a detecção de C5a usando os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção permitirá particularmente a detecção de C5a conforme aqui definido.
[00340] Com relação à detecção de C5a um método preferido compreende as etapas que seguem:
[00341] (a) provisão de uma amostra que deve ser testada quanto à presença de C5a,
[00342] (b) provisão de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção,
[00343] (c) reação da amostra com o ácido nucleico, preferivelmente em um recipiente de reação. em que a etapa (a) pode ser realizada antes da etapa (b) ou a etapa (b) pode ser realizada antes da etapa (a).
[00344] Em uma modalidade preferida, uma etapa d) adicional é provida, a qual consiste na detecção da reação da amostra com o ácido nucleico. Preferivelmente, o ácido nucleico da etapa b) é imobilizado na superfície. A superfície pode ser a superfície de um recipiente de reação tal como um tubo de reação, uma cavidade de uma placa ou a superfície de um dispositivo contido em tal recipiente de reação tal como, por exemplo, uma conta. A imobilização do ácido nucleico na superfície pode ser feita através de qualquer meio conhecido daqueles versados na técnica incluindo, mas não limitado a, ligações não covalentes ou covalentes. Preferivelmente, a ligação é estabelecida via uma ligação química covalente entre a superfície e o ácido nucleico. No entanto, é compreendido pela presente invenção que o ácido nucleico é indiretamente imobilizado em uma superfície, em que tal imobilização indireta envolve o uso de um componente adicional ou um par de contrapartes de interação. Tal componente adicional é preferivelmente um composto que interage especificamente com o ácido nucleico a ser imobilizado que é também referido como contraparte de interação, e então faz a mediação da ligação do ácido nucleico à superfície. A contraparte de interação é preferivelmente selecionada do grupo compreendo ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos. Preferivelmente, a contraparte de interação é um anticorpo, mais preferivelmente um anticorpo monoclonal. Alternativamente, a contraparte de interação é um ácido nucleico, preferivelmente um ácido nucleico funcional. Mais preferivelmente, tal ácido nucleico funcional é selecionado do grupo compreendendo aptâmeros, Spiegelmers e ácidos nucleicos que são pelo menos parcialmente complementares ao ácido nucleico. Em uma modalidade alternativa adicional, a ligação do ácido nucleico à superfície é mediada por uma contraparte de interação multidividido. Tal contraparte de interação multidividido é preferivelmente um par de contrapartes de ligação ou uma contraparte de interação consistindo em um primeiro membro e um segundo membro, em que o primeiro membro é compreendido de ou ligado ao ácido nucleico e o segundo membro é ligado a ou compreendido pela superfície. A contraparte de interação multidividida é preferivelmente selecionada do grupo de pares de contrapartes de interação compreendendo biotina e avidina, biotina e estreptavidina e biotina e neutravidina. Preferivelmente, o primeiro membro do par de contrapartes de interação é biotina.
[00345] Um resultado preferido de tal método é a formação de um complexo imobilizado de C5a e o ácido nucleico, em que mais preferivelmente o dito complexo é detectado. É compreendido por uma modalidade que a partir do complexo a C5a é detectada.
[00346] Um respectivo meio de detecção que está de acordo com a necessidade é, por exemplo, qualquer meio de detecção que seja específico para essa(s) parte(s) da C5a. Um meio de detecção particularmente preferido é um meio de detecção que é selecionado do grupo compreendendo ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos, cuja geração é conhecida dos versados na técnica.
[00347] O método para a detecção de C5a também compreende aquela amostra que é removida do recipiente de reação que foi preferivelmente usado para realizar a etapa c).
[00348] O método compreende em uma modalidade adicional também a etapa de imobilização de uma contraparte de interação de C5a sobre uma superfície, preferivelmente uma superfície conforme acima definido, em que a contraparte de interação é definida aqui e preferivelmente como acima com relação ao respectivo método e mais preferivelmente compreende ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos em suas várias modalidades. Nesta modalidade, um meio de detecção particularmente preferido é um ácido nucleico de acordo com a presente invenção, em que tal ácido nucleico pode ser preferivelmente marcado ou não marcado. No caso de tal ácido nucleico ser marcado, ele pode ser diretamente ou indiretamente detectado. Tal detecção pode também envolver o uso de um segundo meio de detecção que é, preferivelmente, também selecionado do grupo compreendendo ácidos nucleicos, polipeptídeos, proteínas e modalidades nas várias modalidades descritas aqui. Tais meios de detecção são preferivelmente específicos para o ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade mais preferida, o segundo meio de detecção é um farol molecular. Ou o ácido nucleico ou o segundo meio de detecção ou ambos podem compreender em uma modalidade preferida um marcador de detecção. O marcador de detecção é preferivelmente selecionado do grupo compreendendo biotina, um marcador de bromodesoxiuridina, um marcador de digoxigenina, um marcador fluorescente, um marcador de UV, um radiomarcador e uma molécula quelante. Alternativamente, o segundo meio de detecção interage com o marcador de detecção que está preferivelmente contido por, compreendido por ou ligado ao ácido nucleico. Particularmente as combinações preferidas são como segue:
[00349] o marcador de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é um anticorpo direcionado contra biotina, ou em que
[00350] o marcador de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma avidina ou uma molécula de transporte de avidina, ou em que
[00351] o marcador de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma estreptavidina ou uma molécula transportando estreptavidina, ou em que
[00352] o marcador de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma neutravidina ou molécula transportadora de neutravidina, ou
[00353] em que o marcador de detecção é uma bromo-desoxiurigina e o segundo meio de detecção é um anticorpo direcionado contra bromo-desoxiuridina, ou em que
[00354] o marcador de detecção é uma digoxigenina ou o segundo meio de detecção é um anticorpo direcionado contra digoxigenina, ou em que
[00355] o marcador de detecção é um quelante e o segundo meio de detecção é um radionuclídeo, em que é preferido que o dito marcador de detecção seja ligado ao ácido nucleico. Deve ser reconhecido que este tipo de combinação é também aplicável à modalidade em que o ácido nucleico é ligado à superfície. Em tal modalidade é preferido que o marcador de detecção seja ligado à contraparte de interação.
[00356] Finalmente, é também compreendido pela presente invenção que o segundo meio de detecção é detectado usando um terceiro meio de detecção, preferivelmente o terceiro meio de detecção é uma enzima, mais preferivelmente mostrando uma reação enzimática quando da detecção do segundo meio de detecção, ou o terceiro meio de detecção é um meio para detecção de radiação, mais preferivelmente radiação emitida por um radionuclídeo. Preferivelmente, o terceiro meio de detecção está especificamente detectando e/ou interagindo com o segundo meio de detecção.
[00357] Também na modalidade com uma contraparte de interação de C5a sendo imobilizada sobre uma superfície e o ácido nucleico de acordo com a presente invenção sendo preferivelmente adicionado ao complexo formado entre a contraparte de interação e a C5a, a amostra pode ser removida da reação, mais preferivelmente do recipiente de reação em que as etapas c) e/ou d) são realizadas.
[00358] Em uma modalidade o ácido nucleico de acordo com a presente invenção compreende uma porção fluorescente e em que a fluorescência da porção fluorescente é diferente quando da formação de complexo entre o ácido nucleico e C5a e C5a livre.
[00359] Em uma modalidade adicional o ácido nucleico é um derivado do ácido nucleico de acordo com a presente invenção, em que o derivado do ácido nucleico compreende pelo menos um derivado fluorescente de adenosina substituindo adenosina. Em uma modalidade preferida o derivado fluorescente de adenosina é etenoadenosina.
[00360] Em uma modalidade adicional o complexo consistindo em um derivado do ácido nucleico de acordo com a presente invenção e a C5a é detectado usando fluorescência.
[00361] Em uma modalidade do método é criado um sinal na etapa (c) ou etapa (d) e preferivelmente o sinal está relacionado com a concentração de C5a na amostra.
[00362] Em um aspecto preferido, os ensaios podem ser realizados em placas de 96 cavidades, em que os componentes são imobilizados nos recipiente de reação conforme acima descrito e as cavidades agindo como recipientes de reação.
[00363] O ácido nucleico da invenção pode ser ainda usado como material de partida para projeto de fármaco. Basicamente há duas abordagens possíveis. Uma abordagem é a avaliação de bibliotecas de composto em que tais bibliotecas de composto são preferivelmente bibliotecas de composto de baixo peso molecular. Em uma modalidade, a avaliação é uma avaliação de alto rendimento. Preferivelmente, avaliação de alto rendimento é a avaliação rápida, eficiente, de teste e erro de compostos em um ensaio baseado em alvo. Nos melhores casos as análises são realizadas através de uma medição colorimétrica. As bibliotecas conforme usado em relação a elas são conhecidas daqueles versados na técnica.
[00364] Alternativamente, o ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser usado para projeto racional de fármacos. Preferivelmente, o projeto racional de fármacos é o projeto de uma estrutura que leva ao fármaco. Iniciando da estrutura tridimensional do alvo que é tipicamente identificada através de métodos tal como cristalografia de raio X ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear, programas de computador são usados para pesquisar bancos de dados contendo estruturas de muitos compostos químicos diferentes. A seleção é feita por um computador, os compostos identificados podem ser subsequentemente testados no laboratório.
[00365] O projeto racional de fármacos pode se iniciar a partir de qualquer ácido nucleico de acordo com a presente invenção e envolve uma estrutura, preferivelmente uma estrutura tridimensional, que é similar à estrutura dos ácidos nucleicos da invenção ou idêntica às partes de mediação de ligação da estrutura dos ácidos nucleicos da invenção. Em qualquer caso tal estrutura ainda mostra a mesma característica de ligação ou similar que os ácidos nucleicos da invenção. Ou em uma etapa adicional ou como uma etapa alternativa no projeto racional de fármacos a estrutura preferivelmente tridimensional dessas partes dos ácidos nucleicos se ligando ao neurotransmissor são imitadas por grupos químicos que são diferentes dos nucleotídeos e ácidos nucleicos. Através desta imitação um composto diferente dos ácidos nucleicos pode ser projetado. Tal composto é preferivelmente uma molécula pequena ou um peptídeo.
[00366] No caso de avaliação de bibliotecas de composto, tal como usando um ensaio competitivo que é conhecido de um versado na técnica, análogos de C5a, agonistas de C5a ou antagonistas de C5a apropriados podem ser encontrados. Tais ensaios competitivos podem ser ajustados como segue. O ácido nucleico da invenção, preferivelmente uma Spiegelmer que é um ácido nucleico L de ligação a alvo, é acoplado a uma fase sólida. A fim de identificar análogos de C5a, C5a marcadas podem ser adicionados ao ensaio. Um análogo potencial competiria com as moléculas de C5a se ligando à Spiegelmer que acompanharia uma diminuição no sinal obtido pelo respectivo marcador. Avaliação de agonistas ou antagonistas pode envolver o uso de um ensaio de cultura celular como conhecido dos versados na técnica.
[00367] O kit de acordo com a presente invenção pode compreender pelo menos um ou vários dos ácidos nucleicos da invenção. Ainda, o kit pode compreender pelo menos um ou vários controles positivos ou negativos. Ainda, o kit pode compreender pelo menos um ou vários controles positivos ou negativos. Um controle positivo pode, por exemplo ser C5a, particularmente aquele contra o qual o ácido nucleico da invenção é selecionado ou ao qual ele se liga, preferivelmente em forma líquida. Um controle negativo pode, por exemplo, ser um peptídeo que é definido em termos de propriedades biofísicas similares a C5a, mas que não é reconhecido pelos ácidos nucleicos da invenção. Ainda, o dito kit pode compreender um ou vários tampões. Os vários ingredientes podem estar contidos no kit em forma seca ou liofilizada ou dissolvidos em um líquido. O kit pode compreender um ou vários recipientes que por sua vez podem conter um ou vários ingredientes do kit. Em uma modalidade adicional, o kit compreende uma instrução ou panfleto de instruções que provê o usuário com informação de como usar o kit e seus vários ingredientes.
[00368] As determinações farmacêutica e bioanalítica do ácido nucleico de acordo com a presente invenção são elementares para a avaliação de seus perfis farmacocinético e biodinâmico em vários tumores, tecidos e órgãos dos corpos humano e não humano. Para tal propósito, qualquer um dos métodos de detecção revelados aqui ou conhecidos de um versado na técnica pode ser usado. Em um aspecto adicional da presente invenção um ensaio de hibridização sanduíche para a detecção do ácido nucleico de acordo com a presente invenção é provido. Dentro do ensaio de detecção uma sonda de captura e uma sonda de detecção são usadas. A sonda de captura é complementar à primeira parte e a sonda de detecção à segunda parte do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Ambas, a sonda de captura e a de detecção, podem ser formadas por nucleotídeos de DNA, nucleotídeos de DNA modificado, nucleotídeos de RNA modificado, nucleotídeos de RNA, nucleotídeos de LNA e/ou nucleotídeos de PNA.
[00369] Desta maneira, a sonda de captura compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade 5' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade 3' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Neste caso a sonda de captura é imobilizada em uma superfície ou matriz através de sua extremidade 5' em que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente em sua extremidade 5' ou via um ligante entre sua extremidade 5' e a superfície ou matriz. No entanto, a princípio o ligante pode ser ligado a cada nucleotídeo da sonda de captura. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos de habilidade na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos e L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.
[00370] Alternativamente, a sonda de captura compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade 3' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreende uma extensão de sequência complementar à extremidade 5' do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Neste caso, a sonda de captura é imobilizada em uma superfície ou matriz através da sua extremidade 3', em que a sonda de captura pode ser imobilizada diretamente em sua extremidade 3' ou através de um ligante entre sua extremidade 3' e a superfície ou matriz. No entanto, a princípio, o ligante pode ser ligado a cada nucleotídeo da extensão de sequência que é complementar ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos de habilidade na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.
[00371] O número de nucleotídeos das sondas de captura e detecção que podem hibridizar para o ácido nucleico de acordo com a presente invenção é variável e pode depender do número de nucleotídeos da sonda de captura e/ou detecção e/ou do ácido nucleico de acordo com a presente invenção em si. O número total de nucleotídeos das sondas de captura e detecção que podem hibridizar para o ácido nucleico de acordo com a presente invenção deve ser no máximo o número de nucleotídeos que são compreendidos pelo ácido nucleico de acordo com a presente invenção. O número mínimo de nucleotídeos (2 a 10 nucleotídeos) das sondas de detecção e captura deve permitir a hibridização para a extremidade 5' ou 3', respectivamente, do ácido nucleico de acordo com a presente invenção. A fim de obter especificidade e seletividade altas entre o ácido nucleico de acordo com a presente invenção e outros ácidos nucleicos que ocorrem em amostras que são analisadas, o número total de nucleotídeos das sondas de captura e detecção deve ser no máximo o número de nucleotídeos que são compreendidos pelo ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[00372] Além disso, a sonda de detecção preferivelmente transporta uma molécula marcadora ou marcador que pode ser detectado conforme anteriormente descrito aqui. O marcador ou molécula marcadora pode a princípio ser ligado a cada nucleotídeo da sonda de detecção. Preferivelmente, o marcador está localizado na extremidade 5' ou 3' da sonda de detecção, em que entre os nucleotídeos dentro da sonda de detecção que são complementares ao ácido nucleico de acordo com a presente invenção e o marcador um ligante pode ser inserido. O ligante pode ser formado por ligantes hidrofílicos de habilidade na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.
[00373] A detecção do ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser realizada como segue:
[00374] O ácido nucleico de acordo com a presente invenção hibridiza com uma de suas extremidades para a sonda de captura e com a outra extremidade para a sonda de detecção. Em seguida, sonda de detecção não ligada é removida através de, por exemplo, uma ou várias etapas de lavagem. A quantidade de sonda de detecção ligada que preferivelmente transporta um marcador ou molécula marcadora pode ser medida subsequentemente como, por exemplo, mostrado em mais detalhes no WO/2008/052774 que é aqui incorporado a título de referência.
[00375] Conforme preferivelmente usado aqui, o termo tratamento compreende em uma modalidade preferida adicionalmente ou alternativamente prevenção e/ou acompanhamento.
[00376] Conforme aqui preferivelmente usado, o termo doença ou distúrbio deve ser usado de uma maneira intercomutável, se não indicado o contrário.
[00377] Conforme aqui usado, o termo compreende preferivelmente não pretende limitar a matéria objeto seguida ou descrita por tal termo. No entanto, em uma modalidade alternativa o termo compreende deve ser entendido no sentido de conter e então como limitante da matéria objeto ou descrita por tal termo.
[00378] As várias SEQ ID Nos:, a natureza química das moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção e as moléculas alvo C5a conforme aqui usado, a sua sequência real e o número de referência interno são sumarizados na tabela que segue.
Figure img0001
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[00379] A presente invenção é ainda ilustrada pelas figuras, exemplos e listagem de sequência das quais características, modalidades e vantagens adicionais podem ser obtidas, em que
[00380] a Figura 1 mostra alinhamento de sequências de moléculas de ácido nucleico capazes de se ligar a C5a humana e de camundongo incluindo o valor KD e atividade de ligação relativa a C5a humana e de camundongo conforme determinado por medição de ressonância de plasmon de superfície;
[00381] a Figura 2 mostras derivados de molécula de ácido nucleico NOX-D19001 com uma substituição de ribonucleotídeos por 2'- desoxirribonucleotídeo única incluindo o valor KD e atividade de ligação relativa a C5a humana conforme determinado através de medição de ressonância de plasmon de superfície;
[00382] a Figura 3 mostra derivados de molécula de ácido nucleico NOX-D19001 com dois, três, quatro, cinco ou seis substituições de ribonucleotídeos por 2'-desoxirribonucleotídeo incluindo o valor KD e atividade de ligação relativa a C5a humana conforme determinado através de medição de ressonância de plasmon de superfície;
[00383] a Figura 4+B mostra truncamentos de molécula de ácido nucleico NOX-D19001-6xDNA incluindo o valor KD e a atividade de ligação relativa a C5a humana conforme determinado através de medição de ressonância de plasmon de superfície;
[00384] a Figura 5 mostra derivados de molécula de ácido nucleico NOX-D20001 com nenhuma, uma, duas, três ou quatro substituições de ribonucleotídeos por 2'-desoxirribonucleotídeo incluindo o valor KD e atividade de ligação relativa a C5a humana conforme determinado através de medição de ressonância de plasmon de superfície;
[00385] a Figura 6 mostra a avaliação cinética através de medição Biacore de moléculas de ácido nucleico NOX-D19001, NOX-D19001- D09 e NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40 (também referidas como NOX-D19001-6xDNA) a C5a humana em que os dados para 500 nM de Spiegelmer NOX-D19001, NOX-D19-001-D09 (abr. D09) e NOX- D19001-D09-16-17-20-32-40 (abr. D09-16-17-30-32-40) são mostrados.
[00386] a Figura 7 é um diagrama mostrando a eficácia de Spiegelmers de ligação a C5a PEGuiladas de 40 kDa terminais 5' NOX- D19001-5' PEG (também referidas como NOX-D19), NOX-D20 (também referidas como NOX-D19001-6xDNA-020-5' 40kDa PEG) em ensaios de quimiotaxia, em que as células foram deixadas migrar em direção à huC5a 0,1 nM pré-incubada a 37° C com várias quantidades de Spiegelmers.
[00387] a Figura 8 mostra a avaliação cinética através de medição Biacore de moléculas de ácido nucleico NOX-D20 (também referidas como NOX-D19001-6xDNA-020-5' 40kDa PEG) para C5a humana, C5a de rato, C5a de camundongo, C5a de macaco; em que os dados para 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8, 3,9 e 1,95-0 nM de Spiegelmer NOX-D20 são mostrados;
[00388] a Figura 9 mostra a avaliação cinética através da medição Biacore de moléculas de ácido nucleico NOX-D20 (também referidas como NOX-D19001-6xDNA-020-5' 40kDa PEG) para C5 humana, desArg-C5a humana; em que os dados para 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8, 3,9 e 1,95-0 nM de Spiegelmer NOX-D20 são mostrados.
[00389] a Figura 10 mostra a avaliação cinética de medição Biacore de moléculas de ácido nucleico NOX-D21 (também referidas como NOX-D19001-2dU-1dC-020-5' 40kDa PEG) para C5a humana, C5 humana, desArg-C5a humana, C5a de camundongo e desArg-C5a de camundongo; em que os dados para 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,8, 3,9 e 1,95-0 nM de Spiegelmer NOX-D21 se ligando a C5a humana e C5 humana são mostrados.
[00390] a Figura 11 mostra o alinhamento de sequência de polipeptídeo de C5a de humano, macaco rhesus, camundongo e rato;
[00391] a Figura 12A é um diagrama mostrando a eficácia de ligação de Spiegelmers NOX-D20 de ligação a C5a em ensaios de quimiotaxia com C5a humana e C5a de camundongo, as células foram deixadas migrar em direção à huC5a 0,1 nM ou mC5a 0,3 nM pré-incubada a 37° C com várias quantidades de Spiegelmer; em que a) as contagens de célula foram normalizadas para o valor maior de cada conjunto de dados e mostradas como contagem percentual contra concentrações de Spiegelmer, b) as concentrações de Spiegelmer nas quais a quimiotaxia é inibida em 50% (IC50) foram calculadas usando regressão não linear (ajuste de quatro parâmetros) com software Prism5;
[00392] a Figura 12B é um diagrama mostrando a eficácia de Spiegelmers de ligação a C5a NOX-D21 em ensaios de quimiotaxia com C5a humana, as células foram deixadas migrar em direção à huC5a 0,1 nM pré-incubada a 37° C com várias quantidades de Spiegelmer; em que a) as contagens de célula foram normalizadas para o valor mais alto de cada conjunto de dados e mostradas como contagem percentual contra concentração de Spiegelmer, b) as concentrações de Spiegelmer nas quais a quimiotaxia é inibida em 50% (IC50) foram calculadas usando regressão não linear (ajuste de quatro parâmetros) com software Prism5;
[00393] a Figura 13 é um diagrama mostrando a eficácia de Spiegelmers de ligação a C5a NOX-D19 e NOX-D20 em (A) ensaios de quimiotaxia e (B) ensaios de liberação de elastase de PMNs humanos primários com C5a humana; em que as células foram deixadas migrar em direção à huC5a 1 nM e a liberação de elastase foi estimulada por huC5a 30 nM pré-incubada a 37° C com várias quantidades de Spiegelmer;
[00394] a Figura 14 é um diagrama mostrando avaliação de inibição de clivagem de C5 usando um ensaio de hemólise de eritrócito de ovelha com Spiegelmers (A) NOX-19 e NOX-D20 e (B) NOX-D21. Controles positivos (C5C6) e negativos (revNOX-D19 e revNOX-D21) são mostrados;
[00395] a Figura 15 é um diagrama mostrando sobrevivência no modelo de camundongo de ligação cecal e punção (CLP) de sepse polimicrobiana; NOX-D19 nas doses ou veículo indicados foi injetada intraperitonealmente diariamente iniciando logo após cirurgia de CLP. Os animais simulados receberam cirurgia sem CLP, seguido por injeções de veículo;
[00396] a Figura 16 é um diagrama mostrando (A) níveis de creatinina no soro e (B) níveis de nitrogênio ureia no sangue pré-cirurgia (dia -4) e 1 dia após cirurgia de CLP em camundongos tratados com NOX-D19 nas doses indicadas, em camundongos tratados com veículo e em animais simulados. Creatinina e BUN no soro são biomarcadores para função renal;
[00397] a Figura 17 é um diagrama mostrando (A) níveis no soro de alanina aminotransferase (ALT) e (B) níveis no soro de aspartato aminotransferase (AST) pré-cirurgia (dia -4) e 1 dia após cirurgia CLP em camundongos tratados com NOX-D19 nas doses indicadas, em camundongos tratados com veículo e em animais simulados. ALT no soro é um biomarcador para dano hepatocelular. AST no soro é um biomarcador para falência múltipla dos órgãos;
[00398] a Figura 18 é um diagrama mostrando sobrevivência no modelo de camundongo de ligação cecal e punção (CLP) de sepse polimicrobiana; NOX-D20 nas doses ou veículo indicados foi injetada intraperitonealmente diariamente começando logo após cirurgia de CLP. Um grupo recebeu uma dose única de 1 mg/kg de NOX-D20 logo após cirurgia de CLP seguido por injeções de veículo diárias. Os animais simulados receberam cirurgia sem CLP, seguido por injeções de veículo.
[00399] a Figura 19 é um diagrama mostrando (A) níveis de creatinina no soro, (B) níveis de nitrogênio ureia no sangue (BUN) e (C) níveis no soro de alanina aminotransferase (ALT) no dia 1 após cirurgia de CLP em camundongos tratados com NOX-D20 nas doses indicadas, em camundongos tratados com veículo e em animais simulados. Creatinina e BUN no soro são biomarcadores para função renal. ALT no soro é um biomarcador para dano hepatocelular;
[00400] a Figura 20 é um diagrama mostrando o efeito de tratamento de NOX-D20 nas doses indicadas sobre (A) lactato desidrogenase no soro (LDH), um biomarcador para lesão de tecido, (B) derrame vascular e (C) infiltração de PMN no peritônio no dia 1 após cirurgia de CLP. Os camundongos tratados com veículo e animais simulados são mostrados como controles;
[00401] a Figura 21 é um diagrama mostrando sobrevivência em um modelo de lesão renal aguda induzida por lesão por isquemia/reperfusão; NOX-D21 nas doses ou veículo indicados foi injetada intravenosamente 1 h antes da cirurgia e subsequentemente intraperitonealmente a cada 24 h por 3 dias;
[00402] a Figura 22 mostra os 2'-desoxirribonucleotídeos que as moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção consistem;
[00403] a Figura 23 mostra os ribonucleotídeos, os quais estão compreendidos pelasmoléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção . Exemplo 1: Moléculas de ácido nucleico capazes de se ligar a C5a humana e de camundongo
[00404] Várias moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a e derivados das mesmas foram identificados: cujas sequências de nucleotídeo são mostradas nas Figuras 1 a 5. As moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a foram caracterizadas como
[00405] a) Aptâmeros, isto é, moléculas de ácido nucleico D usando um ensaio de afinidade pull-down direto (Exemplo 3) e/ou um ensaio de pull-down de competição comparativo (Exemplo 3)
[00406] b) Spiegelmers, isto é, moléculas de ácido nucleico L através de medição de ressonância de plasmon de superfície (Exemplo 4) e através de um ensaio in vitro com células expressando o receptor de C5a humana (Exemplo 5). Além disso, Spiegelmers foram testadas quanto à inibição de ativação induzida por C5a de neutrófilos humanos primários (Exemplo 6) e in vivo (Exemplos 8, 9 e 10). As Spiegelmers e os aptâmeros foram sintetizados conforme descrito no Exemplo 2.
[00407] As moléculas de ácido nucleico então geradas exibem sequências ligeiramente diferentes, em que as sequências podem ser sumarizadas ou agrupadas como uma família de sequência.
[00408] Para definição de motivos de sequência de ribonucleotídeos, as abreviações IUPAC para nucleotídeos ambíguos são usadas: S forte G ou C; W fraco A ou U; R purina G ou A; Y pirimidina C ou U; K ceto G ou U; M imino A ou C; B não A C ou U ou G; D não C A ou G ou U; H não G A ou C ou U; V não U A ou C ou G; N todos A ou G ou C ou U
[00409] Se não indicado o contrário, qualquer sequência de ácido nucleico ou sequência de extensões, respectivamente, é indicada na direção 5' ^ 3'.
[00410] Para diferenciação entre os 2'-desoxirribonucleotídeos e os ribonucleotídeos as abreviações que seguem são usadas:
[00411] Para 2'-desoxirribonucleotídeos: dG, dC, dT, dA e dU (vide Fig. 22).
[00412] Para ribonucleotídeos: G, C, T, U (vide Fig. 23).
[00413] Conforme mostrado nas Figuras 1 a 5, moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a compreendem uma extensão central de nucleotídeos definindo um motivo de ligação a C5a potencial, em que a Fig. 1 mostra as sequências diferentes da família de sequência, as Fig. 2 a 5 mostram derivados da molécula de ácido nucleico NOX-D19001 incluindo NOX-D20001 (também referida como NOX-D19001-6x-DNA- 020, Fig. 4A) e NOX-D21001 (também referida como NOX-D19001- 2dU-1dC-020, Fig. 5).
[00414] Em geral, as moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a compreendem nas extensões terminais extremidade 5' e extremidade 3' de nucleotídeos: a primeira extensão terminal de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos. A primeira extensão terminal de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos podem hibridizar uma para a outra, em que quando da hibridização uma estrutura de filamento duplo é formada. No entanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula in vivo e in vitro.
[00415] As três extensões de nucleotídeos de moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a - a primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos - são dispostas uma para a outra na direção 5' ^ 3': a primeira extensão terminal de nucleotídeos - a extensão central de nucleotídeos - a segunda extensão terminal de nucleotídeos. No entanto, alternativamente, a primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos são dispostas uma para a outra na direção 5' ^ 3': a segunda extensão terminal de nucleotídeos - a extensão central de nucleotídeos - a primeira extensão terminal de nucleotídeos.
[00416] As sequências das extensões definidas podem ser diferentes entre as moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a, o que influencia a afinidade de ligação a C5a. Com base na análise de ligação das moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a diferentes, a extensão central de nucleotídeos e suas sequências de nucleotídeo conforme descrito a seguir são individualmente e mais preferivelmente em sua totalidade essenciais para ligação a C5a humana.
[00417] As moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a de acordo com a presente invenção conforme mostrado na Fig. 1 consistem em ribonucleotídeos e são mostradas nas Figuras 1 a 5. A molécula de ácido nucleico de ligação a C5a 274-H6-002 foi testada como aptâmero em um ensaio de pull-down de competição comparativo (quanto ao protocolo vide Exemplo 3) vs. ácido nucleico de ligação a C5a 274-D5- 002. A molécula de ácido nucleico de ligação a C5a 274-H6-002 mostrou afinidade de ligação mais fraca em comparação com a molécula de ácido nucleico de ligação a C5a 274-D5-002. As moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a 274-B5-002, 274-D5-002, 274-C8- 002, 274-C8-002-G14 (= NOX-D19001), 274-C5-002 e 274-G6-002 foram testadas como Spiegelmers quanto à sua habilidade em se ligar a C5a humana e de camundongo através de medição de ressonância de plasmon (vide Exemplo 4, Figura 1).
[00418] A molécula de ácido nucleico de ligação a C5a 274-C8-002- G14 (= NOX-D19001) mostra a melhor afinidade de ligação com uma KD de 0,3 nM para C5a de camundongo e com uma KD de 1,38 nM para C5a humana (Figura 1).
[00419] As moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a 274-B5- 002, 274-D5-002, 274-C8-002, 274-C8-002-G14 (= NOX-D19001), 274- C5-002, 274-G6-002 e 274-H6-002 compartilham a sequência
[00420] 5' AUGUGGUGKUGARGGGHUGUKGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 69], em que G, A, U, C, H, K e R são ribonucleotídeos.
[00421] As moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a 274-C8- 002, 274-C8-002-G14 (= NOX-D19001) e 274-C5-002 mostraram a melhor afinidade de ligação com C5a e compreendem as sequências que seguem para a extensão central:
[00422] a) 274-C8-002: 5' AUGUGGUGUUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3'[SEQ ID NO: 70],
[00423] b) 274-C8-002-G14: 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 71],
[00424] c) 274-C5-002: 5' AUGUGGUGGUGAGGGGUUGUGGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 72], em que d, G, A, U e C são ribonucleotídeos.
[00425] Os inventores mostraram surpreendentemente que a afinidade de ligação da molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-DI19001 foi melhorada através da substituição dos ribonucleotídeos por 2'-desoxirribonucleotídeos dentro da sequência da extensão central de nucleotídeos e da segunda extensão terminal de nucleotídeos. Em particular substituição de até seis ribonucleotídeos por 2'-desoxirribonucleotídeos na molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada a C5a humana por um fator de 3,5. Em mais detalhes, os inventores constataram surpreendentemente que
[00426] a) substituição de um ribonucleotídeo por 2'- desoxirribonucleotídeo na posição 4, 11, 12, 25 ou 27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada com C5a humana em comparação com a afinidade de ligação da molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 2; Spiegelmers NOX-D19001, NOX-D19001-D16, NOX-D19001-D17, NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D32);
[00427] b) substituição de um ribonucleotídeo por 2'- desoxirribonucleotídeo na posição 1 na segunda extensão terminal de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX- D19001 resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada a C5a humana em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Fig. 2; Spiegelmers NOX- D19001-D40);
[00428] c) substituição de dois ribonucleotídeos por 2'- desoxirribonucleotídeo na posição 4/25, 4/27 ou 25/27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada com C5a biotinilada em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 3; Spiegelmers NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-32, NOX- D19001-D30-32);
[00429] d) substituição de dois ribonucleotídeos, em que um ribonucleotídeo foi substituído por um 2'-desoxirribonucleotídeo na posição 1 na segunda extensão terminal de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 e um ribonucleotídeo foi substituído por um 2'-desoxirribonucleotídeo na posição 4, 25 ou 27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001, resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada com C5a em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 3; Spiegelmers NOX-D19001-D09-40, NOX-D19001-D30-40, NOX- D19001-D32-40);
[00430] e) substituição de três ribonucleotídeos, em que um ribonucleotídeo foi substituído por um 2'-desoxirribonucleotídeo na posição 1 na segunda extensão terminal de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico e ligação a C5a NOX-D19001 e dois ribonucleotídeos foram substituídos por dois 2'-desoxirribonucleotídeos na posição 4/25, 4/27, 25/27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001, resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada a C5a humana em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 3; Spiegelmers, NOX-D19001-D09-30-40, NOX-D19001- D09-32-40, NOX-D19001-D30-32-40);
[00431] f) substituição de três ribonucleotídeos por três 2'- desoxirribonucleotídeos na posição 04/25/27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX- D19001 resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada a C5a biotinilada em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 3; Spiegelmer NOX-D19001-D09-30-32);
[00432] g) substituição de quatro ribonucleotídeos, em que um ribonucleotídeo foi substituído por 2'-desoxirribonucleotídeo na posição 1 na segunda extensão terminal de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 e três ribonucleotídeos foram substituídos por três 2'-desoxirribonucleotídeos na posição 04/25/27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001, resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada com C5a humana em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 3; Spiegelmer NOX-D19001-D09-30-32-40);
[00433] h) substituição de cinco ribonucleotídeos, em que um ribonucleotídeo foi substituído por um 2'-desoxirribonucleotídeo na posição 1 na segunda extensão terminal de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 e quatro ribonucleotídeos foram substituídos por 2'-desoxirribonucleotídeos na posição 04/11/25/27 ou 04/12/25/27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX- D19001, resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada a C5a humana em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 3; Spiegelmer NOX-D19001-D09-16-30-32-40, NOX-D19001-D09-17-30-32-40);
[00434] i) substituição de seis ribonucleotídeos, em que um ribonucleotídeo foi substituído por um 2'-desoxirribonucleotídeo na posição 1 na segunda extensão terminal de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 e cinco ribonucleotídeos foram substituídos por cinco 2'- desoxirribonucleotídeos na posição 04/11/12/25/27 na extensão central de nucleotídeos de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX- D19001, resultou em afinidade de ligação aperfeiçoada a C5a humana em comparação com a afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 (vide Figura 3; Spiegelmer NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40 = NOX-D19-001-6xDNA).
[00435] Com base nos dados mostrados que substituição de ribonucleotídeos por 2'-desoxirribonucleotideos em várias posições na extensão central de nucleotídeos de moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a levou à ligação aperfeiçoada a C5a a extensão central de todas as moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a testadas pode ser sumarizada na fórmula que segue
[00436] 5' AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 61], em que n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU
[00437] e G, A, U, C, H, K,
[00438] e R são ribonucleotídeos e dU, dG e dA são 2'- desoxirribonucleotídeos, em que
[00439] a) em uma modalidade preferida a extensão central de nucleotídeos compreende a sequência 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 62] (vide 274-B5-002); ou
[00440] b) em uma modalidade preferida a extensão central de nucleotídeos compreende a sequência 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 63] (vide 274-D5-002); ou
[00441] c) em uma modalidade preferida a extensão central de nucleotídeos compreende a sequência 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 64] (vide 274-C8-002); ou
[00442] d) em uma modalidade preferida a extensão central de nucleotídeos compreende a sequência 5' AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 65] (vide NOX-D19001); ou
[00443] e) em uma modalidade preferida a extensão central de nucleotídeos compreende a sequência 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 66] (vide 274-C5-002); ou
[00444] f) em uma modalidade preferida a extensão central de nucleotídeos compreende a sequência 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 67] (vide 274-G6-002); ou
[00445] g) em uma modalidade preferida a extensão central de nucleotídeos compreende a sequência 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 68] (vide 274-H6-002).
[00446] As moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a NOX- D19001-D09, NOX-D19001-D16, NOX-D19001-D17, NOX-D19001- D30, NOX-D19001-D32, NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-32, NOX-D19001-D09-40, NOX-D19001-D30-32, NOX-D19001-D30-40, NOX-D19001-D32-40, NOX-D19001-D09-30-32, NOX-D19001-D09-30- 40, NOX-D19001-D09-32-40, NOX-D19001-D30-32-40, NOX-D19001- D09-30-32-40, NOX-D19001-D09-16-30-32-40, NOX-D19001-D09-17- 30-32-40, NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40 (vide Figuras 2 e 3) mostraram a melhor afinidade de ligação com C5a e compreendem a sequência que seguem para a extensão central de nucleotídeos:
[00447] a) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 73] (vide NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D09-40); ou
[00448] b) 5' AUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 74] (vide NOX-D19001-D16); ou
[00449] c) 5' AUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 75] (vide NOX-D19001-D17); ou
[00450] d) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 76] (vide NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D30-40); ou
[00451] e) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 77] (vide NOX-D19001-D32, NOX-D19001-D32-40); ou
[00452] f) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 78] (vide NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-30-40); ou
[00453] g) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA 3'[SEQ ID NO: 79] (vide NOX-D19001-D09-32, NOX-D19001-D09-32-40);
[00454] h) 5' AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 80] (vide NOX-D19001-D30-32, NOX-D19001-D30-32-40); ou
[00455] i) 5' AUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3'[SEQ ID NO: 81] (NOX-D19001-D09-30-32, NOX-D19001-D09-30-32-40); ou
[00456] j) 5' AUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 82] (vide NOX-D19001-D09-16-30-32-40); ou
[00457] k) AUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 83] (vide NOX-D19001-D09-17-30-32-40); ou
[00458] l) 5' AUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA 3' [SEQ ID NO: 84] (vide NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40 = NOX-D19001- 6xDNA), em que G, A, U e C são ribonucleotídeos e dG, dA e dU são 2'- desoxirribonucleotídeos.
[00459] A afinidade de ligação de molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001 foi significantemente aperfeiçoada através de substituição de um até seis ribonucleotídeos por 2'- desoxirribonucleotídeos conforme determinado através de medição de ressonância de plasmon de superfície e exemplarmente mostrado para os ácidos nucleicos de ligação a C5a NOX-D19001-D09 e NOX- D19001-D09-16-17-30-32-40 (também referida como NOX-D19001- 6xDNA) (Figura 6):
[00460] NOX-D19001: KD de 1,38 nM,
[00461] NOX-D19001-D09: KD de 709 pM,
[00462] NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40: KD de 361 pM.
[00463] NOX-D19001-6xDNA compreende uma extensão central de nucleotídeos com cinco 2'-desoxirribonucleotídeos ao invés de ribonucleotídeos, uma primeira extensão terminal de nucleotídeos com cinco ribonucleotídeos e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos com quatro ribonucleotídeos e um 2'- desoxirribonucleotídeo. Surpreendentemente, os inventores puderam mostrar que as primeira e segunda extensões terminais de nucleotídeos podem ser truncadas sem redução em afinidade com quatro ou três nucleotídeos. Conforme mostrado aqui, as primeira e segunda extensões terminais de nucleotídeos de NOX-D19001-6xDNA poderiam ser truncadas de cinco a três nucleotídeos (vide NOX-D19001-6xDNA- 020 também referida como NOX-D20001) enquanto retendo afinidade (Figura 4A).
[00464] A Figura 4 demonstra a combinação bem sucedida de substituição e truncamento de ribonucleotídeo-para-2'- desoxirribonucleotídeo: a molécula mãe de NOX-D19001-6xDNA e NOX-D19001-6xDNA-020 (também referida como NOX-D20001), NOX- D19001, consistindo em ribonucleotídeos e primeira e segunda extensões terminais de nucleotídeos com cinco nucleotídeos cada tem uma afinidade de ligação (KD) de 1,38 nM. Após seis substituições de ribonucleotídeo-para-2'-desoxirribonucleotídeo (levando à NOX- D19001-6xDNA) e truncamento para uma primeira e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos com três nucleotídeos (levando à NOX-D19001-6xDNA-020, também referida como NOX-D20001) a afinidade de ligação com C5a humana foi aperfeiçoada em um fator de mais de quatro (NOX-D20001, KD de 0,3 nM). Truncamento da primeira ou da segunda extensão de nucleotídeos para um nucleotídeo levou à atividade reduzida, mas tais moléculas ainda se ligam a C5a com KD's menores do que 10 nM (vide Figuras 4A, 4B).
[00465] Outro exemplo para substituição bem sucedida de ribonucleotídeos por 2'-desoxirribonucleotídeos é mostrado na Figura 5. A molécula NOX-D19001-020 é um derivado truncado de NOX-D19001 e tem uma KD de 11,3 nM (vide Figura 5) ao invés de 1,38 nM conforme determinado para NOX-D19001 (vide Figuras 1 e 2). Ambas as moléculas compreendem a extensão central idêntica de ribonucleotídeos, mas NOX-D19001-020 compreende uma primeira extensão terminal de três ao invés de cinco ribonucleotídeos e uma segunda extensão terminal de apenas três ao invés de cinco ribonucleotídeos. Através de substituição de dois ou três ribonucleotídeos por 2'-desoxiribonucleotídeos na extensão central de nucleotídeos e opcionalmente de um ribonucleotídeo por 2'- desoxirribonucleotídeo na segunda extensão terminal de nucleotídeos, a afinidade de ligação de NOX-D19001-020 pode ser aperfeiçoada por um fator de mais de 10 (vide Figura 5, NOX-D19001-2xDNA-020, NOX- D19001-3xDNA-020, NOX-D19001-2dU-1dC-020 também referida como NOX-D21001, NOX-D19001-3dU-1dC-020).
[00466] Juntas, as primeira e segunda extensões terminais de moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a compreende um, dois, três, quatro ou cinco nucleotídeos (Figura 1 até a Figura 5), em que as extensões hibridizam opcionalmente uma com a outra, em que quando da hibridização uma estrutura de filamento duplo é formada. Esta estrutura de filamento duplo pode consistir em um a cinco pares de base. No entanto, tal hibridização não é necessariamente dada na molécula.
[00467] Analisando a primeira extensão terminal de nucleotídeos e a segunda extensão terminal de nucleotídeos de todas as moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a testadas a fórmula genérica para a primeira extensão terminal de nucleotídeo é 5' Z1Z2Z3Z4G 3' e a fórmula genérica para a segunda extensão terminal de nucleotídeo é5' Z5Z6Z7Z8 Z9 3',
[00468] em que
[00469] Z1 é G ou ausente, Z2 é S ou ausente, Z3 é S ou ausente, Z4 é B ou ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V ou ausente, Z7 é S ou ausente, Z8 é S ou ausente, Z9 é C ou ausente, e
[00470] G, S, B, C, V são ribonucleotídeos e dC é um 2'- desoxirribonucleotídeo,
[00471] em que em uma primeira modalidade preferida
[00472] a) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[00473] b) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[00474] c) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00475] d) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00476] e) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[00477] f) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[00478] g) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[00479] h) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou
[00480] i) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[00481] j) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[00482] k) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou
[00483] l) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00484] m) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00485] n) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00486] o) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00487] p) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou
[00488] q) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente; em uma segunda modalidade preferida
[00489] a) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCCUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo 5' CAGGC , ou
[00490] b) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCCUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGGC 3', ou
[00491] c) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CCUG 3' ou 5' CUG 3' ou 5' UG 3'ou 5' G 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGGC 3', ou
[00492] d) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGC 3', ou
[00493] e) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGGC 3', ou
[00494] f) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GGCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGCC 3', ou
[00495] g) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CUG 3' ou 5' UG 3'ou 5' CG 3' ou 5' G 3, e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAGC 3', ou
[00496] h) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAC 3' ou 5' dCC 3' ou 5' dCA 3', ou
[00497] i) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GUG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCAC 3', ou
[00498] j) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' UG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCA 3', ou
[00499] k) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGC 3', ou
[00500] l) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGC 3', ou
[00501] m) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' G 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCGC 3', ou
[00502] n) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCC 3', ou
[00503] o) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dC 3', ou
[00504] p) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' dCC 3', ou
[00505] q) a primeira extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' GCG 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos compreende uma sequência de nucleotídeo de 5' CGC 3'.
[00506] A fim de prover sua funcionalidade, as moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19001, NOX-D20001 e NOX-D210001 foram sintetizadas como uma Spiegelmer compreendendo um grupo amino em sua extremidade 5'. Às ditas Spiegelmers modificadas com amino uma porção de PEG de 40 kDa foi acoplada levando a Spiegelmers de ligação a C5a NOX-D19, NOX-D20 e NOX-D21. Síntese e peguilação dos Spiegelmer são descritas no Exemplo 2.
[00507] O efeito de afinidade de ligação aperfeiçoada poderia ser mostrado para a funcionalidade de moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a. Conforme determinado através do ensaio de quimiotaxia (Exemplo 5), a molécula de ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19 (IC50 = 1,9 nM) consistindo exclusivamente em ribonucleotídeos era menos potente em inibir a função de C5a humana do que a NOX-D20, uma molécula de ácido nucleico de ligação a C5a derivada de NOX-D19 compreendendo seis substituições de ribonucleotídeo-para-2'- desoxirribonucleotídeo (IC50 = 0,28 nM) (Figura 7).
[00508] NOX-D20 mostrou uma ligação de afinidade muito alta com C5a de murino com uma constante de dissociação KD de 19 pM, enquanto para C5a humana uma KD de 299 pM foi determinada (Exemplo 4, Figura 8). NOX-D20 inibe a função de C5a humana com uma constante inibidora IC50 de 275 pM conforme determinado através de um ensaio de quimiotaxia (Exemplo 5, Figuras 7 e 12A). Por razões estequiométricas, a sensibilidade dos ensaio de quimiotaxia para C5a de camundongo é limitada a 150 pM devido à concentração estimuladora de C5a de camundongo de 300 pM. Desta maneira, para C5a de camundongo uma IC50 de 140 pM foi medida para NOX-D20 (Exemplo 5, Figura 12A).
[00509] NOX-D20 não mostrou nenhuma ligação a C5a de rato ou macaco rhesus, indicando especificidade de alvo muito alta (Figura 8). Do alinhamento de sequência de polipeptídeo de C5a humana, de camundongo, rato e macaco rhesus e da especificidade determinada é mais provável que os resíduos Serina16 e Valina28 de C5a humana sejam resíduos de ligação essenciais em C5a (Figura 11). Esses são conservados em C5a humana e de murino, mas são diferentes em C5a de macaco rhesus e rato.
[00510] NOX-D21 contém os principais sítios de aperfeiçoamento de afinidade de NOX-D20 e mostraram uma afinidade alta com C5a humana e de murino conforme mostrado por medição Biacore (KD(C5a de murino) = 29 pM, KD (C5a humana) = 815 pM, KD(C5 humana) = 413 pM, vide Figura 11). NOX-D21 inibe a função de C5a humana com uma constante de inibição IC50 de 476 pM, conforme determinado através de um ensaio de quimiotaxia (Exemplo 5, Figura 12B).
[00511] In vivo uma versão truncada de C5a é gerada através de clivagem enzimática do resíduo arginina C-terminal, conhecido como des-Arg-C5a (também referido como C5adesArg). A função biológica de des-Arg-C5a não é totalmente compreendida, mas há evidência que des-Arg-C5a retém funções de ativação de leucócito. Desta maneira foi investigado se NOX-D20 também se ligou a des-Arg-C5a. NOX-D20 mostrou uma ligação dependente da dose a des-Arg-C5a humano recombinante imobilizado (Figura 9).
[00512] Avaliação cinética detalhada conforme descrito mostrou que des-Arg-C5a humano é ligado por NOX-20 com afinidade comparável com a C5a humana de comprimento integral com uma constante de dissociação de 316 pM e 299 pM, respectivamente. NOX-D21 se ligou a des-Arg-C5a de camundongo ou humano com constantes de dissociação de 28 pM e 854 pM, respectivamente (Figura 10). Desta maneira, mesmo após clivagem de C5a para des-Arg-C5a, moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a tais como NOX-20 e NOX-D21 ainda se ligam ao seu alvo.
[00513] Surpreendentemente, NOX-D20 e NOX-D21 também mostraram ligação a C5 purificada de plasma humano com uma afinidade de 164 pM e 413 pM, respectivamente (Figuras 9 e 10). Este fenômeno não poderia ser previsto. No entanto, ele é plausível uma vez que C5a é uma parte de C5 que é clivada pela C5 convertase quando o sistema de complemento é ativado ou por trombina ou outros membros de um sistema de coagulação ativado. Ainda, a C5 purificada de plasma humano carrega a estrutura de glicosilação nativa em asparagina 64. A glicosilação não tinha estado presente no polipeptídeo C5a de imagem de espelho de murino que foi usado para identificação de NOX-D19, NOX-D20, NOX-D21 e outras moléculas de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.
[00514] Ligação a C5 pode influenciar a farmacocinética devido à eliminação baixa esperada da proteína C5 grande e uma concentração no plasma publicada de 350-390 nM. Ligação a C5 pode também influenciar a farmacodinâmica. C5 é ligada por moléculas de ácido nucleico de ligação a C5a tais como NOX-20 e NOX-D21 e então C5a já está bloqueada pela Spiegelmer antes dela estar liberada e pode levar à sinalização de receptor. Exemplo 2: Síntese e derivação de aptâmeros e Spiegelmers Síntese em pequena escala
[00515] Aptâmeros (ácidos nucleicos de D-RNA) e Spiegelmers (ácidos nucleicos de L-RNA) foram produzidos através de síntese de fase sólida com um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) usando química de fosforamidita de RNA 2'TBDMS (Damha e Ogilvie, 1993). Fosforamiditas rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)- e rU- nas configurações D- e L- foram compradas da ChemGenes, Wilmington, MA. Aptâmeros e Spiegelmers foram purificados através de eletroforese em gel. Síntese mais modificação em larga escala
[00516] Spiegelmers foram produzidas através de síntese de fase sólida com um sintetizador ÃktaPilotlOO (Amersham Biosciences; General Eletric Healthcare, Freiburg) usando química de fosforamidita de RNA 2'TBDMS (Damha e Ogilvie, 1993). As fosforamiditas L-rA(N- Bz)-, LrC(Ac)-, L-rG(N-ibu)- e rU- foram compradas da ChemGenes, Wilmington, MA. O modificador 5'-amino foi comprado da American International Chemicals Inc., (Framingham, MA, USA). A síntese de Spiegelmer não modificada ou modificada com 5'-amino foi iniciada em CPG modificada com L-riboG, L-riboC, L-riboA ou r-LiboU de tamanho de poro de 1000 Â (Link Technology, Glasgow, RU. Para acoplamento (15 min por ciclo), 0,3M de benziltetrazol (CMS-Chemicals, Abingdon, RU) em acetonitrila e 3,5 equivalentes da respectiva solução de fosforamidita 0,1M em acetonitrila foram usados. Um ciclo de capeamento de oxidação foi usado. Solventes e reagentes padrão adicionais para síntese de oligonucleotídeo foram comprados da Biosolve (Valkenswaard, NL). A Spiegelmer foi sintetizada DMT-ON; após desproteção, ela foi purificada através de RP-HPLC preparativa (Wincott e outros, 1995) usando meio Source15RPC (Amersham). O grupo 5'-DMT foi removido com ácido acético 80% (30 min em RT). Subsequentemente, solução de NaOAc aquosa 2M foi adicionada e a Spiegelmer foi dessalinizada por filtragem em fluxo tangencial usando uma membrana de celulose regenerada 5K (Millipore, Bedford, MA). PEGuilação de Spiegelmers
[00517] A fim de prolongar o tempo de residência no plasma de Spiegelmer in vivo, Spiegelmers foram covalentemente acopladas a uma porção de polietileno glicol (PEG) de 40 kDa na extremidade 5' para PEGuilação (quanto a detalhes técnicos do método para PEGuilação vide Pedido de Patente Europeu EP 1 306 382), a Spiegelmer modificada com 5'-amino purificada foi dissolvida em uma mistura de H2O (2,5 mL), DMF (5 ml) e tampão A (5 ml; preparado misturando ácido cítrico • H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml] e NaOH 1M [343 ml] e adicionando água para um volume final de 1 l; pH = 8,4 foi ajustado com HCl 1M).
[00518] O pH da solução de Spiegelmer foi trazido para 8,4 com NaOH 1M. Então PEG-éster de NHS 40 kDa (Jenkem Technology, Allen, TX, USA) foi adicionado a 37° C a cada 30 minutos em seis porções de 0,25 equivalente até que um rendimento máximo de 75 a 85% foi atingido. O pH da mistura de reação foi mantido a 8-8,5 com NaOH 1M durante adição do éster de PEG-NHS.
[00519] A mistura de reação foi misturada com 4 ml de solução de ureia (8 M) e tampão B 4 ml (acetato de trietilamônio 0,1M em H2O) e aquecida para 95° C por 15 minutos. A Spiegelmer PEGuilada foi então purificada através de RP-HPLC com meio Source 15RPC (Amesham), usando um gradiente de acetonitrila (tampão B; tampão C: acetato de trietilamônio 0,1M em acetonitrila). PEG em excesso eluiu em tampão 5%, Spiegelmer PEGuilada em 10-15% de tampão C. As frações de produto com uma pureza de >95% (conforme avaliado através de HPLC) foram combinadas e misturadas com 40 ml de NaOAc 3M. A Spiegelmer PEGuilada foi dessalinizada por filtragem de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada 5K, Millipore, Bedford, MA). Exemplo 3: Determinação de Constantes de Ligação a C5a para Aptâmeros (ensaio de Pull-Down) Ensaio de pull-down direto
[00520] A afinidade de ácidos nucleicos de ligação a C5a foi medida como ligação de aptâmeros (ácidos nucleicos de RNA D) à D-C5a de camundongo biotinilada (SEQ ID NO:89) em um formato de ensaio pull-down a 37° C. Os aptâmeros eram 5'-fosfato marcados por polinucleotídeo cinase T4 (Invitrogen) usando ATP marcado com [Y-32P] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha). A radioatividade específica de aptâmeros marcados era 200.000 - 800.000 cpm-pmol. Os ensaios foram realizados em tampão de seleção (Tris-HCl 20 mM pH 7,4; NaCl 150 mM; KCl 5 mM; MgCl2 1 mM; CaCl2 1 mM; inibidor de Rnase 4 u/ml (RNaseOUT, Invitrogen); Tween-20 0,1% [p/vol] suplementado com 50 μg/ml de albumina de soro bovino fetal (Sigma) e 10 μg/ml de Spiegelmer não específico a fim de prevenir adsorção de contrapartes de ligação com superfícies de artigo plástico usado ou a matriz de imobilização). Os aptâmeros foram incubados após de- e renaturação em concentração de 0,2-1 nM a 37° C em tampão de seleção junto com quantidades variáveis de D-C5a de camundongo biotinilada por 3-4 horas a fim de atingir equilíbrio em concentrações baixas. A faixa de concentração de D-C5a de camundongo biotinilada foi ajustada de 640 pM para 10 μM; o volume de reação total foi 80-200 μl. D-C5a de camundongo biotinilada e complexos de aptâmero e D- C5a de camundongo biotinilada foram imobilizados em 5 μl de partículas de NeutrAvidin Agarose Plus (Pierce Biotechnology) que tinham sido pré-equilibradas com tampão de seleção. As partículas foram mantidas em suspensão por 30 minutos a 37° C em um termomisturador. A radioatividade imobilizada foi quantificada em um contador de cintilação após separação do sobrenadante e lavagem apropriada. A porcentagem de ligação foi posta em gráfico contra a concentração de D-C5a de camundongo biotinilada e as constantes de dissociação obtidas usando algoritmos de software (GraphPad Prism) supondo uma estequiometria 1:1. Ensaio de pull-down competitivo
[00521] A fim de comparar ácidos nucleicos de ligação à D-C5a diferentes, um ensaio de classificação competitiva foi realizado. Para este propósito o aptâmero mais afim disponível foi radioativamente marcado (vide acima) e serviu como uma referência. Após a de- e renaturação ele foi incubado em tampão de seleção a 37° C com D-C5a de camundongo biotinilada em condições que resultaram em torno de 5-10% de ligação à D-C5a de camundongo biotinilada após imobilização e lavagem em 4 μl de partículas de NeutrAvidin Agarose Plus (Pierce Biotechnology) sem competição. Um excesso de variantes de aptâmero de D-RNA de- e renaturadas não marcadas foi adicionado em concentrações variando de 9 pM - 400 nM com o aptâmero de referência marcado para fazer um paralelo de reações de ligação; o volume de reação total era 160-400 μl. Depois de 3-4 horas de incubação a D-C5a de camundongo biotinilada e complexos de aptâmero e biotinilada foram imobilizados e os ensaios foram analisados conforme descrito acima. Os aptâmeros a serem testados competem com o aptâmero de referência para ligação ao alvo, desta maneira diminuindo o sinal de ligação em dependência de suas características de ligação. O aptâmero que foi verificado ser mais ativo neste ensaio poderia então servir como uma nova referência para análise comparativa de variantes de aptâmero adicionais. Exemplo 4: Medição de Biacore de ligação de Spiegelmer a C5a e peptídeos relacionados
[00522] O instrumento foi ajustado para uma temperatura estável de 37° C. O instrumento Biacore 2000 foi limpo usando o método DESORB antes do início de cada experimento/imobilização de um novo chip. Após acoplamento de um chip de manutenção, o instrumento foi consecutivamente inicializado com solução de dessorção 1 (dodecil sulfato de sódio 0,5%, SDS), solução de dessorção 2 (glicina 50 mM, pH 9,5) e tampão de HBS-EP. Finalmente, o sistema foi inicializado com tampão de HBS-EP.
[00523] Para experimentos Biacore as Spiegelmers de ligação a C5a foram preparados em água estéril e tinham uma concentração de 100 μM.
[00524] O chip CM5 foi inicializado com tampão HBS-EP e equilibrado até que uma linha de base fosse observada. As células de fluxo foram imobilizadas começando da célula de fluxo 4 para a célula de fluxo 1. 100 μl de uma mistura 1:1 de EDC 0,4M e NHS 0,1M foram injetados usando o comando QUICKINJECT em um fluxo de 10 μl/min. Ativação da célula de fluxo foi monitorada através de um aumento em RU após injeção de NHS/EDC (tipicamente 150-500 RU para chips CM5). Soluções de 0,1-1 μg/ml em NaAc 10 mM pH 5,5 para C5a ou NaAc 10 mM pH 5,5 para C5 humana foram transferidas para um frasco e injetadas usando o comando MANUALINJECT em um fluxo de 10 μl/min. 1000-3000 RU foram imobilizados no chip. Todas as células de fluxo foram então bloqueadas com uma injeção de 70 μl de cloridrato de etanolamina 1M, pH 8 em um fluxo de 10 μl/min. Injeção de 30 μl da solução de regeneração (NaCl 1M) em um fluxo de 30 μl/min foi realizada para remover proteína não especificamente ligada da superfície do chip.
[00525] Parâmetros cinéticos e constantes de dissociação foram avaliados por uma série de injeções de Spiegelmer em concentrações de 2.000 - 1.000 - 500 - 200 - 125 - 62,5 - 31,3 - 15,6 (2x) - 7,8 - 3,9 - 1,95 - 0,98 - 0,48 - 0,24 - 0,12 - 0 nM diluídas em tampão de processo, começando com a concentração mais baixa. Em todos os experimentos, a análise foi realizada a 37° C usando o comando Kinject definindo um tempo de associação de 240 e um tempo de dissociação de 240 segundos em um fluxo de 30 μl/min. O ensaio era de referência dupla, enquanto FC1 serviu como controle de superfície (bloqueado) (contribuição em volume de cada concentração de Spiegelmer) e uma série de injeções de tampão sem analito determinou a contribuição em volume do tampão sozinho. Pelo menos uma concentração de Spiegelmer foi injetada duas vezes para monitorar a eficiência de regeneração e integridade do chip durante os experimentos. A regeneração foi realizada através de injeção de 60 μl de NaCl 1M em um fluxo de 30 μl/min. A estabilização de linha de base após cada ciclo de regeneração foi ajustada para 1 min a 30 μl/min.
[00526] Análise de dados e cálculo de constantes de dissociação (KD) foram feitos com o software de BIAevaluation 3.1.1 (BIACORE AB, Uppsala, Suécia) usando um algoritmo de ajuste estequiométrico 1:1 Langmuir modificado, com uma constante RI e avaliação de transferência de massa com um coeficiente de transporte de massa kt de 1 x 107 [RU/M*s]. Exemplo 5: Determinação de Concentração Inibidora em um Ensaio de Quimiotaxia Geração de uma linhagem celular expressando o receptor humano para C5a
[00527] Uma linhagem celular estavelmente transfectada expressando o receptor humano para C5a foi gerada através de transfecção de células pro B de camundongo BA/F3 com um plasmídeo codificando o receptor de C5a humana (acesso NCBI NM_001736 em pcDNA3.1+). As células expressando C5aR foram selecionadas através de tratamento com geneticina e testadas quanto à expressão com RT- PCR e quanto à funcionalidade com ensaio de quimiotaxia. Ensaio de quimiotaxia
[00528] Um dia antes do experimento, as células foram semeadas em um frasco novo a 0,3 x 106/ml. Para o experimento, as células foram centrifugadas, lavadas uma vez em HBH (HBSS, contendo 1 mg/ml de albumina de soro bovino e HEPES 20 mM) e ressuspensas a 1,33 x 106 células/ml. 75 μl desta suspensão foram adicionados aos compartimentos superiores de uma placa Corning Transwell de 96 cavidades com poros de 5 μm (Costar Corning, No.3388; NY, USA). Nos compartimentos inferiores C5a humana recombinante (SEQ ID NO:50) ou C5a de camundongo (SEQ ID NO:54) foi pré-incubada junto com Spiegelmers em várias concentrações em 235 μl de HBH a 37° C por 20 a 30 minutos antes da adição de células. As células foram deixadas migrar a 37° C por 3 horas. Em seguida a placa de inserção (compartimentos superiores) foi removida e 30 μl de 400 μM de ressazurina (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) em solução salina tamponada com fosfato foram adicionados aos compartimentos inferiores. Após incubação a 37° C por 2,5 horas, fluorescência foi medida em um comprimento de onda de excitação de 544 nm e um comprimento de onda de emissão de 590 nm.
[00529] Os valores de fluorescência são corrigidos para fluorescência de base (nenhuma C5a na cavidade) e postos em gráfico contra concentração de Spiegelmer. Os valores de IC50 são determinados com regressão não linear (ajuste de 4 parâmetros) usando GraphPad Prism. Alternativamente, o valor para a amostra sem Spiegelmer (C5a apenas) é ajustado 100% e os valores para as amostras com Spiegelmer são calculados como porcentagem disso. Os valores percentuais são postos em gráfico contra concentração de Spiegelmer e os valores IC50 são determinados conforme descrito acima. Determinação da concentração eficaz da metade-máxima (EC50) para C5a humana e de camundongo
[00530] Depois de 3 horas de migração de células BA/F3/huC5aR com relação a várias concentrações de C5a humana ou C5a de camundongo, curvas de dose-resposta para C5a humana e de camundongo foram obtidas, indicando concentrações metade eficazes (EC50) de 0,1 nM para huC5a e 0,3 nM para mC5a. Para os experimentos sobre inibição de quimiotaxia por Spiegelmers, C5a humana 0,1 nM e C5a de camundongo 0,3 nM foram usadas. Exemplo 6: Inibição de ativação induzida por C5a de neutrófilos humanos primários Isolamento de PMNs
[00531] Leucócitos polimorfonucleares (PMN) (Polymorphonuclear Leukocytes) foram isolados de sangue integral através de centrifugação de gradiente descontínua em temperatura ambiente. Sangue foi coletado em tubos de coleta de sangue contendo dextrose citrato ácida (Sarstedt). Dextran 500 (Accurate Chemical) foi adicionado para uma concentração final de 2% p/v e o sangue/dextrano foi posto em camada em Histopaque (1,077 g/ml, Sigma). Após centrifugação todos os líquidos e células acima da interface do gradiente foram descartados. Pelete e cerca de 80% de líquido restante acima foram coletados e diluídos 1:1 com uma mistura de Voluven 80% v/v (Fresenius Kabi), PBS 16% v/v (Sigma) e ACD 4% v/v (Sigma). A mistura foi centrifugada a 400 rpm por 15 minutos. Sobrenadante foi coletado e centrifugado a 1.000 rpm por 7 minutos. O pelete foi suavemente ressuspenso e eritrócitos restantes foram removidos através de lise. Inibição de quimiotaxia induzida por C5a de PMNs humanos
[00532] C5a humana (1 nM) foi pré-incubada com concentrações indicadas de NOX-D19 ou NOX-D20 em HBSS + BSA 0,01% + HEPES 25 mM na câmara inferior de uma placa de quimiotaxia. Neutrófilos humanos foram adicionados às câmaras superiores de uma placa de quimiotaxia e a quimiotaxia foi realizada durante 25 minutos a 37° C e CO2 5%. Seguindo a incubação a câmara superior foi ajustada para uma placa de luminescência branca contendo Accutase para coletar células ligadas à parte inferior da malha de quimiotaxia. Reagente Glo (Promega) foi adicionado e equilibrado por 10 minutos. A luminescência foi medida usando uma leitora de placa Biotek Synergy 2. Inibição de liberação de elastase induzida por C5a por PMNs humanos
[00533] Neutrófilos humanos foram inicializados com TNFα (10 ng/ml) e citocalasina B (5 μg/ml) por 30 minutos a 37° C, CO2 5%. As células foram estimuladas por 45 minutos com C5a humana (30 nm) que tinha sido pré-incubada com NOX-D19 ou NOX-D20 nas concentrações indicadas. As células foram então separadas através de centrifugação e 25 μl de sobrenadante foram incubados com substrato de elastase (Calbiochem) em Tris-HCl 0,1 M pH 7,4 por 1 hora a 37° C com leituras sendo feitas em uma absorbância de 405 nm a cada 5 minutos. Os dados cinéticos foram analisados para determinar a Vmax para cada amostra. A atividade de elastase de porcentagem média com relação ao controle foi calculada para cada amostra (base não subtraída). Resultados
[00534] NOX-D19 e NOX-D20 inibem eficientemente a ativação de PMN de sangue periférico humano recém-isolado por C5a. NOX-D19 ou NOX-D20 10 nM foi suficiente para bloquear mais de 85% de quimiotaxia induzida por huC5a de PMN humano (Figura 13A). A liberação induzida por huC5a de elastase antimicrobiana foi eficientemente inibida por NOX-D19 e NOX-D20 (Figura 13B). NOX- D19 e NOX-D20 30 nM suprimiram cerca de 50% de liberação de elastase induzida por C5a. De nota, por razões estequiométricas, a sensibilidade deste ensaio é limitada à IC50 = 15 nM, como a liberação de elastase é induzida por huC5a 30 nM. Exemplo 7: Ácidos nucleicos de ligação a C5a não interferem com a hemólise dependente de complemento
[00535] O produto final da cascata de complemento é o complexo de ataque de membrana (MAC), um poro consistindo em C5b-9. MAC é acreditado se inserir nas membranas citoplásmicas de patógenos e mata-los por indução de derrame citoplásmico.
[00536] Os ácidos nucleicos de ligação a C5a (Spiegelmers) apresentados aqui foram mostrados reconhecer C5a no contexto de C5 (vide Exemplo 1, Figura 9 e Figura 10). Desta maneira foi investigado se a clivagem de C5 para as anafilatoxinas C5a e C5b, que são parte do MAC, é inibida por esses Spiegelmers. Isso foi obtido usando um teste de hemólise de eritrócito de ovelha dependente de complemento. Métodos
[00537] Soro liofilizado humano reconstituído ('Soro de Complemento Humano' (Sigma Aldrich, Alemanha) foi pré-incubado com Spiegelmers PEGuilados NOX-D19, NOX-D20 e NOX-D21 na faixa de 10 mM a 10.000 nM em placas de 96 cavidades (Nunc-Immuno® Plate, MaxiSorp Surface®). Como um controle positivo o aptâmero de ligação a C5 C5C6 com substituição de purina 2'-OME e 2'-fluor pirimidina máxima (Biesecker e outros, 1999) (sintetizada na casa) que inibe clivagem de C5 foi usado na mesma faixa de concentração. Como um controle para efeitos de Spiegelmer não específicos potenciais sobre o ensaio Spiegelmers PEGuilados com sequência reversa de NOX-D19 e NOX-D21, revNOX-D19 e revNOX-D21 foram incluídas. revNOX-D19 e revNOX-D21 foram inicialmente mostradas inibir C5a em ensaios Biacore e baseados em célula. Depois de 1 hora de incubação a 37° C eritrócitos de ovelha opsonizados com anticorpos de eritrócito anti- ovelha de coelho, conhecidos como sistema hemolítico (Institut Virion/Serion GmbH, Alemanha) foram adicionados à mistura de inibidor de complemento de soro pré-incubada. O complemento é ativado via o curso clássico levando à clivagem de C5 em C5a e C5b. C5b então se associa com C6-C9 para formar o complexo de ataque de membrana lítico (MAC). Hemólise de eritrócito de ovelha devido à formação de MAC foi determinada 30 minutos depois através de uma medição colorimétrica após centrifugação de células intactas. Quanto maior o grau de hemólise maior a absorção a 405 nm (medida em uma leitora de placa Fluo Star). Resultados
[00538] O aptâmero C5C6 inibiu a lise dependente de complemento dos eritrócitos de ovelha com uma IC50 de aproximadamente 1 μM (Figuras 14A, B). As Spiegelmers testadas, a saber ácidos nucleicos de ligação a C5 e C5a NOX-D19 e NOX-D20 (Figura 14A) e NOX-D21 (Figura 14B) e as Spiegelmers de não ligação a C5 ou C5a revNOX- D19 (Figura 14A) e revNOX-D21 (Figura 14B) não inibiram hemólise. Discussão
[00539] As Spiegelmers de ligação a C5a testadas foram mostradas inibir formação de MAC e são então antagonistas seletivos de C5a apenas. Se usadas como um remédio, isso pode ser vantajoso, uma vez que inibição de formação de MAC pode comprometer o mecanismo de defesa do corpo para patógenos invasores, principalmente bactérias Gram-negativas. Exemplo 8: O ácido nucleico de ligação a C5a NOX-D19 mostra eficácia em modelo de ligação cecal e punção de murino para sepse polimicrobiana
[00540] O efeito de injeções intraperitoneais de NOX-D19 sobre o curso de sepse polimicrobiana foi testado em um modelo de ligação cecal e punção de roedor (CLP). Métodos Modelo animal
[00541] Camundongos C57BL/6 machos de 10-12 semanas de vida (Charles River Laboratories, Alemanha) foram usados para o estudo. Peritonite foi cirurgicamente induzida sob anestesia com isoflurano leve. As incisões foram feitas no quadrante superior esquerdo da cavidade peritoneal (localização normal do ceco). O ceco foi exposto e uma ligadura firme foi posta ao redor do ceco com suturas distais para a inserção do intestino delgado (75% foram ligados). Um ferimento por punção foi feito com uma agulha de 24 gauges no ceco e quantidades pequenas de teores do ceco foram expressas através da ferida. O ceco foi recolocado na cavidade peritoneal e o sítio da laparotomia foi fechado. 500 μl de solução salina foram dados s.c. como substituição de fluido. Animais simulados sofreram o mesmo procedimento exceto ligação e punção do ceco. Finalmente, os animais foram retornados para as suas gaiolas com acesso livre à comida e água. Grupos de estudo
[00542] 4 grupos (n=6 camundongos para cirurgia simulada e n=10 camundongos por grupo para cirurgia CLP) foram testados: (1) cirurgia simulada com tratamento com veículo (solução salina), (2) cirurgia de CLP com tratamento com veículo, (3) cirurgia com CLP com tratamento com dose baixa de NOX-D19 (1 mg/kg) e (4) cirurgia de CLP com tratamento com dose alta de NOX-D19 (10 mg/kg). Os investigadores eram cegos para a estratégia de tratamento e não sabiam qual composto contém veículo ou verum. A via de administração foi i.p. todos os dias por 6 dias começando no momento da cirurgia de CLP. Sobrevivência
[00543] O acompanhamento foi 7 dias em cada grupo. Os camundongos foram monitorados diariamente e curvas de sobrevivência Kaplan Meier foram geradas usando software GraphPrism 4. Retirada de sangue
[00544] Amostras de sangue foram obtidas sob anestesia com éter leve do sino cavernoso com um capilar antes da cirurgia (linha de base, dia -4) e no dia 1 após cirurgia para permitir medição de marcadores no soro de rotina de lesão renal aguda (creatinina no soro e nitrogênio ureia no sangue, BUN) e falência hepática aguda (alanina-aminotransferase no soro, ALT no soro). O nível de aspartato aminotransfersae (AST no soro) foi medido no soro como um marcador de falência múltipla dos órgãos. Medição de parâmetros químicos clínicos foi realizada em um analisador Olympus (AU400). Estatística
[00545] Significância estatística foi calculada através do teste T de Student. Para sobrevivência curvas Kaplan Meier foram geradas e teste log rank para significância foi realizado. Software GraphPad Prism 4 foi usado. Resultados Sobrevivência
[00546] Conforme esperado, nenhuma mortalidade ocorreu em animais com cirurgia simulada sem CLP (Figura 15). Em camundongos que receberam cirurgia de CLP e foram tratados apenas com veículo, a sobrevivência média foi de 1,5 dia, tratamento com NOX-D19 após cirurgia de CLP melhorou a sobrevivência média (Figura 15). Os camundongos tratados com dose baixa de NOX-D19 (1 mg/kg) mostraram a sobrevivência média mais longa (5 dias, p<0,0001 vs. veículo). Os camundongos tratados com dose alta de NOX-D19 (10 mg/kg) tinham uma sobrevivência média de 3 dias que era significantemente maior do que em camundongos tratados com veículo (p=0,0401), mas não significantemente diferente do tratamento com dose baixa de NOX-D19 (p=0,4875). 100% de camundongos veículo morreram dentro de 4 dias após cirurgia com CLP. 100% e 90% de mortalidade não ocorreram antes de 7 dias em camundongos tratados com doses baixa e alta de NOX-D19, respectivamente (Figura 15). Química clínica Função renal
[00547] As concentrações de creatinina no soro e nitrogênio ureia no sangue (BUN) são parâmetros para função renal. A função renal foi avaliada antes do início do estudo (dia -4) e no dia 1 após cirurgia de CLP.
[00548] Por volta do dia 1 CLP induziu um aumento significante em níveis de creatinina no soro em camundongos tratados com veículo. Tratamento com dose baixa de NOX-D19 (1 mg/kg) preveniu este aumento (Figura 16A). Em camundongos tratados com dose alta de NOX-D19 (10 mg/kg) um aumento moderado, mas estatisticamente não significante, em níveis de creatinina no soro foi observado (p=0,1873 vs. veículo) (Figura 16A).
[00549] BUN (Figura 16B), que é um parâmetro mais sensível para função renal do que a creatinina, aumentou significantemente no dia 1 após cirurgia de CLP em camundongos tratados com veículo. O tratamento de camundongos com doses baixa e alta de NOX-D19 suprimiu significantemente o aumento de BUN quando da CLP (Figura 16B). Função hepática
[00550] O marcador mais confiável de lesão ou necrose hepatocelular é alanina aminotransferase no soro (ALT no soro). Todos os grupos mostraram um aumento em ALT no soro no dia 1 após cirurgia de CLP. No entanto, ambos os grupos de camundongos sépticos tratados com NOX-D19 demonstraram função hepática aperfeiçoada comparado com camundongos tratados com veículo (Figura 17A). Falência múltipla dos órgãos
[00551] O nível de aspartato aminotransferase no soro (AST no soro) (Figura 17B) foi medido como um marcador de falência múltipla dos órgãos uma vez que AST foi mostrada se elevada em doenças afetando outros órgãos além do fígado, tais como infarto do miocárdio, pancreatite aguda, anemia hemolítica aguda, queimaduras severas, doença renal aguda, doenças músculo esqueletais e trauma.
[00552] Similar à ALT, todos os grupos mostraram um aumento de níveis de AST no dia 1 após cirurgia de CLP (p<0,001 vs. simulado). No entanto, similar à função hepática, ambos os grupos de camundongos sépticos tratados com NOX-D19 demonstraram níveis de AST menos pronunciados comparado com camundongos tratados com veículo (Figura 17B). Exemplo 9: O ácido nucleico de ligação a C5a aperfeiçoada NOX-D20 mostra eficácia no modelo de ligação cecal e punção de murino para sepse polimicrobiana
[00553] O efeito de injeções intraperitoneais de NOX-D20 sobre o curso de sepse polimicrobiana foi testado em um modelo de ligação cecal e punção (CLP) de roedor. Métodos Modelo animal
[00554] Sepse polimicrobiana foi induzida em camundongos C57BL/6 machos de 12 semanas de vida (Charles River Laboratories, Alemanha) conforme descrito no Exemplo 8 com 60-75% do ceco sendo ligados. Sobrevivência
[00555] Acompanhamento de 7 dias em cada grupo. Os camundongos foram monitorados diariamente e curvas de sobrevivência Kaplan Meier foram geradas usando software GraphPrism 4. Grupos de estudo
[00556] 5 grupos (n=5 camundongos para cirurgia simulada e n=10 camundongo por grupo para cirurgia de CLP) foram testados: (1) cirurgia simulada com tratamento com veículo (solução salina), (2) cirurgia de CLP com tratamento com veículo, (3) cirurgia de CLP com tratamento com dose baixa diária de NOX-D20 (1 mg/kg), (4) cirurgia de CLP com tratamento com dose alta diária de NOX-D20 (3 mg/kg) e (5) cirurgia de CLP com um tratamento com dose baixa única de NOX-D20 (1 mg/kg) após cirurgia seguido por tratamento com veículo diário. Os investigadores eram cegos para a estratégia de tratamento e não sabiam qual composto contém veículo ou verum. A via de administração foi i.p. Parâmetros químicos e inflamatórios clínicos
[00557] Amostras de sangue foram obtidas conforme descrito no Exemplo 8 sob anestesia com éter leve a partir do sino cavernoso com um capilar no dia 1 após cirurgia. Marcadores no soro de rotina de lesão hepática aguda (creatinina no soro e nitrogênio ureia no sangue, BUN), falência hepática aguda (ALT no soro) e lesão endotelial (lactato desidrogenase no soro, LDH no soro) foram medidos. Lavagem peritoneal (PL) (Peritoneal Lavage) foi realizada usando 3 ml de PBS. O volume da PL coletada foi medido em cada amostra, e a contagem celular total foi avaliada usando hemocitômetro (Neubauer Zaehlkammer, Gehrden, Alemanha). Níveis no soro e PL de fator alfa de necrose de tumor (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) e CCL2 (=proteína 1 quimioatraente de macrófago, MCP-1) foram quantificados através de ensaio de citometria de fluxo baseado em conta (CBA Kit, BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Concentrações no soro e PL de CXCL1 (=quimioatraente de queratinócito, KC) e CXCL2 (= proteína inflamatória de macrófago 2, MIP-2) foram determinadas através de ELISA (R&D Systems, Wiesbaden, Alemanha). Contagem celular diferencial na PL foi realizada em citospinas tingidas com hematoxilina e eosina (H&E) (citospina4, Thermo Scientific). Vazamento capilar
[00558] Imediatamente após cirurgia de CLP, 0,25% p/v de azul Evans (200 μl) foi injetado intravenosamente. Após 18 h os camundongos foram sacrificados e PL foi realizada conforme descrito acima. As concentrações de corante Azul Evans no soro e fluidos de PL foram medidas espectrofotometricamente a 620 nm. A fórmula que segue foi usada para corrigir as densidades ópticas para contaminação com pigmentos hemo: E620 (corrigido) = E620 (bruto) - (E405 (bruto) x 0,014). A exudação no plasma foi quantificada como a razão de extinção em fluido de PL para extinção em plasma. Estatística
[00559] Significância estatística foi calculada por um teste ANOVA e de Dunnett de uma via. Para sobrevivência teste log-rank para significância foi realizado. Software GraphPad Prism 4 foi usado. Resultados Sobrevivência
[00560] Conforme esperado nenhuma mortalidade ocorreu em camundongos operados com simulação dentro de 7 dias após a cirurgia (Figura 18). Em camundongos CLP tratados com veículo a sobrevivência média foi 3 dias. Tratamento diário de camundongos com 1 mg/kg de NOX-D20 prolongou significantemente a sobrevivência média para 7 dias (p=0,0043 vs. veículo). Um aumento da dosagem para 3 mg/kg de NOS-D20 não teve nenhum efeito de proteção adicional com uma sobrevivência média similar de 6,5 dias (p=0,0092 vs. veículo). Notadamente, uma injeção única de 1 mg/kg de NOX-D20 após cirurgia de CLP foi tão eficaz quanto o tratamento diário e prolongou significantemente a sobrevivência média para 6,5 dias (Figura 18). Enquanto 100% de camundongos tratados com veículo morrem dentro de 5 dias, 30-40% de camundongos tratados com NOX-D20 ainda estavam vivos no final do experimento no dia 7 (Figura 18). Função de órgão
[00561] Inflamação sistêmica frequentemente causa falência múltipla dos órgãos. Níveis no soro aumentados de creatinina e BUN são parâmetros para taxa de filtragem glomerular diminuída e falência renal. Ambos os parâmetros estavam significantemente aumentados em camundongos tratados com veículo um dia após cirurgia com CLP comparado com camundongos simulados. Tratamento com NOX-D20 preveniu eficientemente o aumento de ambos os marcadores implicando um efeito protetor de NOX-D20 sobre a função renal (Figura 19A). Alanina aminotransferase (ALT) é um marcador comum de lesão e necrose hepatocelular e sepse induzida por CLP foi associada com aumento de níveis de ALT no soro. Camundongos tratados com NOX- D20 demonstraram níveis significantemente reduzidos de ALT no soro comparado com camundongos tratados com veículo sugerindo função hepática aperfeiçoada (Figura 19C). Níveis elevados no soro de lactato desidrogenase (LDH) ocorrem após lesão a tecido e são desta maneira um marcador geral de falência de órgão. O aumento em níveis de LDH provocado por CLP foi eficazmente bloqueado por NOX-D20 (Figura 2A). Quebra da barreira endotelial e formação de edema é um evento comum em sepse. Indução de sepse resultou em um aumento de duas vezes em extravasamento de proteína no plasma relativo na cavidade peritoneal em camundongos tratados com veículo comparado com operados com simulação. Tratamento com NOX-D20 inibiu significantemente vazamento capilar (Figura 20B). Para todos os parâmetros testados aqui 1 mg/kg de NOX-D20 foi suficiente para melhorar significantemente a função de órgão que é refletida em sobrevivência aperfeiçoada de camundongos tratados com NOX-D20. Inflamação
[00562] CLP resultou em uma suprarregulagem local e sistêmica forte de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias. Bloqueio de C5a por NOX-D20 reduziu eficientemente as concentrações de TNF-α, IL-6, CCL2, CXCL1 e CXCL2 no peritônio e em soro no dia 1 após CLP. A suprarregulagem dessas quimiocinas está associada com um recrutamento de leucócitos polimorfonucleares (PMN) para o peritônio. Desta maneira, inibição de C5a por NOX-D20 inibiu o acúmulo de PMN na cavidade peritoneal (Figura 20C). Similarmente, infiltração de monócitos foi bloqueada por NOX-D20. Exemplo 10: Eficácia de NOX-D21 em um modelo de lesão renal aguda induzida por isquemia reperfusão
[00563] O efeito de NOX-D21 sobre lesão renal aguda (AKI) (Acute Kidney Injury) foi testado em modelo de roedor de lesão por isquemia/reperfusão renal (IRI) (Ischemia/Reperfustion Injury). Métodos Modelo animal
[00564] Camundongos C57BL/6 machos de 12-15 semanas de vida (Charles River, Alemanha) foram anestesiados usando isoflurano via uma máscara no nariz e postos em supino em uma mesa de aquecimento para manter a temperatura corporal em torno de 32° C. Incisão na linha média foi realizada e os pedículos renais direito e esquerdo foram pregados com um grampo de microaneurisma por 30 minutos. Após remoção do grampo e sutura da pele os camundongos foram retornados para as gaiolas e monitorados até que totalmente despertos. Grupos de estudo
[00565] 3 grupos (n=10 camundongos por grupo) foram testados: (1) cirurgia IRI com tratamento com veículo, (2) cirurgia IRI com tratamento com dose baixa de NOX-D21 (1 mg/kg), (3) cirurgia IRI com tratamento com dose alta de NOX-D21 (10 mg/kg). Os investigadores eram cegos para a estratégia de tratamento e não sabiam qual composto continha veículo ou verum. NOX-D21 foi dado i.v. 1 h antes da cirurgia em d0 e durante os próximos 3 dias (d1-d3) ele foi dado i.p. uma vez por dia. Sobrevivência
[00566] Os camundongos foram monitorados diariamente por 14 dias. Curvas de sobrevivência Kaplan Meier foram geradas e a significância foi determinada por teste log-rank usando software GraphPrism 4. Resultados
[00567] A sobrevivência foi significantemente aperfeiçoada através de tratamento com dose alta de NOX-D21 (Figura 21). O tratamento com dose baixa de NOX-D21 resultou em um aperfeiçoamento evidente ainda que não estatisticamente significante de sobrevivência. No grupo controle tratado com veículo apenas um camundongo sobreviveu até o dia 14. Tratamento com NOX-D21 aumentou a porcentagem de camundongos sobreviventes para 40-55% (Figura 21). Referências Bibliográficas
[00568] Os dados bibliográficos completos dos documentos mencionados aqui cujo relatório descritivo é incorporado a título de referência são, se não indicado o contrário, como segue.
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[00636] As características da presente invenção reveladas no relatório descritivo, nas reivindicações, listagem de sequência e/ou desenhos podem ambos separadamente e em qualquer combinação dos mesmos ser material para realização da invenção em várias formas da mesma.

Claims (17)

1. Molécula de L-ácido nucleico capaz de se ligar a C5a humana, caracterizada pelo fato de que a molécula de L-ácido nucleico compreende uma extensão central de nucleotídeos, em que a extensão central de nucleotídeos consiste em uma sequência de nucleotídeo de 5' AUGn1GGUGKUn2n3RGGGHUGUKGGGn4Gn5CGACGCA 3' [SEQ ID NO: 61], em que n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e G, A, U, C, H, K, e R são ribonucleotídeos, e dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
2. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a extensão central de nucleotídeos consiste em uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de a) 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUGGGGn4Gn5C- GACGCA 3' [SEQ ID NO: 62], b) 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGA- CGCA 3' [SEQ ID NO: 63], c) 5' AUGn1GGUGUUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5C- GACGCA 3' [SEQ ID NO: 64], d) 5' AUGn1GGUGGUn2n3AGGGUUGUUGGGn4Gn5CG- ACGCA 3' [SEQ ID NO: 65], e) 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGUUGUGGGGn4Gn5CGA- CGCA 3' [SEQ ID NO: 66], f) 5' AUGn1GGUGGUn2n3GGGGAUGUGGGGn4Gn5CG- ACGCA 3'[SEQ ID NO: 67], e g) 5' AUGn1GGUGUUn2n3GGGGCUGUGGGGn4Gn5CG- ACGCA 3' [SEQ ID NO: 68], em que n1 é U ou dU, n2 é G ou dG, n3 é A ou dA, n4 é U ou dU, n5 é U ou dU e G, A, U e C são ribonucleotídeos, e dU, dG e dA são 2'-desoxirribonucleotídeos.
3. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a extensão central de nucleotídeos consiste em ribonucleotídeos e 2'- desoxirribonucleotídeos.
4. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a extensão central de nucleotídeos consiste em ribonucleotídeos.
5. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a molécula de L-ácido nucleico compreende na direção 5'->3' uma primeira extensão terminal de nucleotídeos, a extensão central de nucleotídeos e uma segunda extensão terminal de nucleotídeos, em que a primeira extensão terminal de nucleotídeos consiste em um a cinco nucleotídeos, e a segunda extensão terminal de nucleotídeos consiste em um a cinco nucleotídeos, preferivelmente a primeira extensão terminal de nucleotídeos consiste em três a cinco nucleotídeos, e a segunda extensão terminal de nucleotídeos consiste em três a cinco nucleotídeos, mais preferivelmente a primeira extensão terminal de nucleotídeos consiste em três nucleotídeos, e a segunda extensão terminal de nucleotídeos consiste em três nucleotídeos.
6. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a primeira extensão terminal de nucleotídeos consiste em uma sequência de nucleotídeo de 5' Z1Z2Z3Z4G 3' e a segunda extensão terminal de nucleotídeos consiste em uma sequência de nucleotídeo de 5' Z5Z6Z7Z8 Z9 3', em que Z1 é G ou ausente, Z2 é S ou ausente, Z3 é S ou ausente, Z4 é B ou ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V ou ausente, Z7 é S ou ausente, Z8 é S ou ausente, Z9 é C ou ausente, e G, S, B, C, V são ribonucleotídeos, e dC é um 2'-desoxirribonucleotídeo, preferivelmente a) Z1 é G, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou b) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou c) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou d) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou e) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou f) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou g) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou h) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 é C, ou i) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou j) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou k) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 é S, Z9 está ausente, ou l) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou m) Z1 está ausente, Z2 é S, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou n) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 está ausente, Z5 é C, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou o) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 está ausente, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 é S, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou p) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 é V, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente, ou q) Z1 está ausente, Z2 está ausente, Z3 é S, Z4 é B, Z5 é C ou dC, Z6 está ausente, Z7 está ausente, Z8 está ausente, Z9 está ausente.
7. Molécula de ácido nucleico L de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e 4 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de L-ácido nucleico consiste em uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 90.
8. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 5 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de L-ácido nucleico consiste em uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 91 e SEQ ID NO: 92.
9. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o L-ácido nucleico é um antagonista de uma atividade mediada por C5a humana e/ou de camundongo.
10. Molécula de L-ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a molécula de L-ácido nucleico compreende um grupo de modificação, em que o grupo de modificação é selecionado do grupo compreendendo polietileno glicol, polietileno glicol linear, polietileno glicol ramificado, amido de hidroxietila, um peptídeo, uma proteína, um polissacarídeo, um esterol, polioxipropileno, polioxiamidato e poli (2-hidroxietil)-L- glutamina.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de L-ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um constituinte adicional, em que o constituinte adicional é selecionado do grupo compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável, um veículo farmaceuticamente aceitável e um agente farmaceuticamente ativo.
12. Uso de uma molécula de L-ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença, em que a doença é selecionada do grupo compreendendo sepse, lesão renal, pneumonia, rejeição a transplante de pulmão, câncer de pulmão, cardiomiopatia, degeneração macular relacionada com a idade, politrauma e choque hemorrágico.
13. Uso de uma molécula de L-ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um meio de diagnóstico.
15. Complexo, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de L-ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e C5a, em que preferivelmente o complexo é um complexo cristalino.
16. Uso de uma molécula de L-ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para a detecção de C5a.
17. Método para a seleção de um antagonista de uma atividade mediada por C5a, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: - prover um antagonista candidato da atividade mediada por C5a, - prover uma molécula de L-ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, - prover um sistema de teste que provê um sinal na presença de um antagonista da atividade mediada por C5a, e - determinar se o antagonista candidato da atividade mediada por C5a é um antagonista da atividade mediada por C5a.
18. Kit para a detecção de C5a, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de L-ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e pelo menos um folheto de instruções ou um recipiente de reação.
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