JP5798320B2 - Ｃ５ａに結合する核酸 - Google Patents

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Description

本発明は、Ｃ５ａおよび／またはＣ５に結合する核酸、ならびに医薬品および診断薬をそれぞれ製造するためのそれらの使用に関する。
アナフィラトキシンＣ５ａ（補体因子５ａ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリはＰ０１０３１）の一次構造は、１９７８年に決定された（ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＨｕｇｌｉ、１９７８）。Ｃ５ａは、８，２００Ｄａの分子量に相当する７４個のアミノ酸からなるが、炭水化物部分は、およそ３，０００Ｄａに相当する。Ｃ５ａの炭水化物部分は、６４位においてアスパラギンにつながる単一の複雑なオリゴ糖単位として存在する。３つのジスルフィド結合が、分子に安定で硬い構造をもたらす。
Ｃ５ａの三次構造は、ＮＭＲ解析によって決定された。このタンパク質は、分子表面に位置するペプチドループによって連結される、ほぼ逆平行のトポロジーで並ぶ４つのへリックスからなる（Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇら、１９８９）。
異なる哺乳動物種に由来するＣ５ａの形態の三次元構造は一般に維持されているが、アミノ酸配列は、進化の間にそれほど十分には保存されてきたとはいえない。配列アライメントの結果から、マウスＣ５ａとは、６４％の全体的な配列同一性が実証されている。ヒトＣ５ａは、以下に示すパーセントで、以下に由来するＣ５ａと同一のアミノ酸を共有している。
・ Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル） ８５％
・ Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル） ８５％
・ Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ） ６９％
・ Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ） ６８％
・ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス） ６４％
・ Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ラット） ６１％
より遠縁のヒトタンパク質であるＣ３ａおよびＣ４ａはそれぞれ、Ｃ５ａとわずか３５％および４０％の同一性を共有するに過ぎない。
前世紀の始めに、補体系が、細胞および細菌の抗血清媒介性溶解を「補完する」熱感受性血清画分として発見された。補体系は、生来の非特異的（自然）免疫応答の液性構成成分であり、感染病原体に対する宿主防御、および炎症過程において不可欠な役割を果たす。補体は、３つの明確に異なる経路、すなわち、（ｉ）抗体自体が細胞表面もしくは細菌に付着した後の経路（古典経路と呼ばれる）、（ｉｉ）細菌もしくはウイルスの糖脂質による直接的な経路（代替経路と呼ばれる）、または（ｉｉｉ）細菌上の炭水化物による経路（レクチン経路と呼ばれる）を介して活性化され得る。これらの活性化経路は全て、補体構成成分Ｃ５の活性化の点に収束し、ここから共通の最終経路が始まり、最後には膜侵襲複合体（略語：ＭＡＣ）の集合に至る。補体系は、タンパク質分解性酵素または結合性タンパク質のいずれかとして機能する２０個を超える可溶性タンパク質からなり、脊椎動物血清中の全グロブリンの約１０％を構成する。さらに、補体系には、補体タンパク質のタンパク質分解性断片に対して特異性を示し、炎症細胞および適応免疫応答を調節する細胞によって発現される複数の異なる細胞表面受容体も含まれる。補体の活性化を阻害し、したがって、宿主細胞を偶発的な補体攻撃から保護する調節タンパク質がいくつかある。補体系は、適応免疫応答と独立にまたは一緒に活性化され得る。
補体の機能には、オプソニン化過程（すなわち、細菌を食作用に対してより感受性にする過程）、細菌および外来細胞の膜に細孔を挿入することによる細菌および外来細胞の溶解（膜侵襲複合体と呼ばれる）、走化性の点で活性を示す物質の生成、血管透過性の増加、平滑筋収縮の誘起、ならびに肥満細胞の脱顆粒化の促進が含まれる。凝固カスケードと同様に、補体活性化の過程も、酵素カスケードとしても知られている順次的な酵素によるステップとして編成される（ＳｉｍおよびＬａｉｃｈ、２０００）。これらの一連の相互作用の詳細を、以下に概説する。
古典経路。この抗体依存性の活性化経路は、特異的な抗体応答を補完する。古典経路は、代替経路と同様に精巧に制御されるが、自発的な開始能力、すなわち、抗体非依存性の認識機能、およびフィードバック増幅機構を欠く。古典経路の活性化物質には、抗原−抗体複合体、β−アミロイド、ＤＮＡ、ポリイノシン酸、ヘパリン／プロタミンのようなポリアニオン−ポリカチオン複合体、いくつかのエンベロープウイルス、尿酸ナトリウム結晶、細菌の細胞壁のリピドＡ、プリカト酸、アリ毒の多糖、ミトコンドリア等のオルガネラ膜、ならびに細胞および血漿に由来する酵素、すなわち、プラスミン、カリクレイン、活性化されたハーゲマン因子、エラスターゼまたはカテプシン等がある。抗体誘発性の古典経路はＣ１によって始まり、Ｃ１は、細胞表面の抗原に連結する抗体（ＩｇＭ＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２）のＦｃ断片に結合する。Ｃ１は、２２個のポリペプチド鎖でできている認識複合体であり、３つのサブユニットすなわちＣ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓからなる。Ｃ１ｑが、実際の認識部分であり、チューリップの花束の様に見えるコラーゲン様ドメイン（ヒドロキシプロリン残基およびヒドロキシリジン残基を提示する）を含有する糖タンパク質である。Ｃ１ｑを介して結合すると、Ｃ１ｒが活性化されてプロテアーゼになり、これがＣ１ｓを切断し、Ｃ１ｓは、Ｃ２およびＣ４の両方を（切断により）Ｃ２ａ／ｂおよびＣ４ａ／ｂに活性化する形態に変化する。Ｃ２ａとＣ４ｂとが組み合わさって、Ｃ４ｂ２ａすなわちＣ３コンバターゼ（Ｃ３活性化酵素）を生じる。Ｃ４ａは、弱いアナフィラトキシン活性しか示さないが、走化性ではない。Ｃ３が、全ての３つの活性化経路の中心となる。古典経路では、Ｃ４ｂ２ａコンバターゼが、Ｃ３をＣ３ａ／ｂに切断する。Ｃ３ａはアナフィラトキシンである。Ｃ３ｂは、Ｃ４ｂ２ａと組み合わさって、Ｃ４ｂ２ａ３ｂ複合体（Ｃ５コンバターゼ）を形成する。Ｃ３ｂはまた、細胞に直接結合して、それらの細胞を食作用に対して感受性にすること（オプソニン化）もできる。
代替経路。この経路は、活性化のために抗体を必要とせず、細菌感染およびウイルス感染に対する宿主防御において非常に重要である。これは、この経路が、古典経路とは異なり、侵入微生物の表面構造、すなわち細菌／ウイルスの糖脂質等、または内毒素によって直接活性化されるからである。その他の活性化物質には、イヌリン、ウサギ赤血球、脱シアル化ヒト赤血球、コブラ毒液因子またはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがある。６つのタンパク質、すなわち、Ｃ３、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、Ｉ因子、およびプロパージンが一緒になって、この経路の開始、認識、および活性化の機能を果たし、その結果、活性化物質が結合したＣ３／Ｃ５コンバターゼの形成に至る。カスケードは、Ｃ３によって始まる。少量のＣ３ｂが、Ｃ３の自発的な切断（「Ｃ３−ｔｉｃｋｏｖｅｒ」）の結果として循環中に常に見い出されるが、それに続く分解によって、この濃度は通常は非常に低く保たれる。しかし、Ｃ３ｂが、細胞表面上の糖に共有結合すると、これは、代替経路の活性化のための核として働くことができる。次いで、Ｂ因子がＣ３ｂに結合する。Ｄ因子の存在下で、結合したＢ因子は、ＢａおよびＢｂに切断され、Ｂｂは、Ｃ３コンバターゼの活性部位を含有する。次に、プロパージンがＣ３ｂＢｂに結合して、細胞表面上のＣ３ｂＢｂコンバターゼを安定化させ、このことがさらなるＣ３分子の切断を引き起こす。最後に、代替のＣ５コンバターゼＣ３ｂＢｂ３ｂが形成され、これが、Ｃ５をＣ５ａ／ｂに切断する。Ｃ５ｂの出現により、上記の膜侵襲複合体の集合が開始される。一般に、グラム陰性細胞のみが、抗体と補体とによって直接溶解され得、グラム陽性細胞は、ほとんどの場合抵抗性である。しかし、食作用が、Ｃ３ｂによるオプソニン化によって大幅に増強され（食細胞は、表面上にＣ３ｂ受容体を有する）、抗体は必ずしも必要であるとは限らない。さらに、補体は、ウイルス粒子を、直接的な溶解またはウイルスの宿主細胞への侵入の阻止のいずれかによって中和することもできる。
（３）レクチン経路。最も最近になって発見されたレクチン経路またはマンナン結合レクチン（略語：ＭＢＬ）経路は、外来物質（すなわち、細菌表面）の生得的な認識に依存する。この経路は、古典経路に対して構造的および機能的な類似性を示す。レクチン経路の活性化は、急性期タンパク質ＭＢＬによって開始され、急性期タンパク質ＭＢＬは、細菌上のマンノース、ＩｇＡや、おそらく損傷を受けた内皮によって暴露される構造も認識する。ＭＢＬは、Ｃ１ｑに対して相同性を示し、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（略語：ＭＡＳＰ）を引き起こし、これらのうち、３つの形態であるＭＡＳＰ１、ＭＡＳＰ２、およびＭＡＳＰ３が説明されてきた。その後のレクチン経路の活性化は、古典経路の活性化と事実上同一であり、同じＣ３コンバターゼおよびＣ５コンバターゼを形成する。さらに、ＭＡＳＰは、いくつかの条件下ではＣ３を直接活性化することができるといういくつかの証拠もある。
（４）最終経路。３つの活性化経路は全て、Ｃ５コンバターゼの形成に収束し（古典経路およびレクチン経路ではＣ４ｂ２ａ３ｂ、代替経路ではＣ３ｂＢｂ３ｂ）、Ｃ５コンバターゼは、Ｃ５をＣ５ａ／ｂに切断する。Ｃ５ａは、強力なアナフィラトキシン活性を示し、走化性である。他方のＣ５断片であるＣ５ｂは、その疎水性結合部位によって標的細胞表面上でアンカーとして機能し、そうした細胞に対して、溶解性の膜侵襲複合体（ＭＡＣ、または最終補体複合体、略語：ＴＣＣ）が生じる。ＭＡＣは、５つの前駆体タンパク質、すなわち、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９の集合体である。最後の事象が、Ｃ９オリゴマーの形成であり、Ｃ９オリゴマーは、それ自体を膜貫通チャネルとして細胞膜中に挿入して、細胞の浸透圧溶解を起こす。ＭＡＣ集合体は、可溶性血漿因子であるＳタンパク質（ビトロネクチンとしても知られている）およびＳＰ−４０，４０（クラスタリンとしても知られている）、ならびに宿主細胞膜上のＣＤ５９およびＨＲＦ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）によって制御される。多くの種類の細胞、すなわち、赤血球、血小板、細菌、リポタンパク質エンベロープをもつウイルス、およびリンパ球が、補体媒介性溶解に対して感受性である。
補体系は、炎症を開始し、増幅するための強力な機構である。これは、補体構成成分の断片を通して媒介される。アナフィラトキシン、すなわち、Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、およびＣ５ａは、補体系のセリンプロテアーゼの最も十分に定義されている断片でもあり、タンパク質分解性断片でもある。アナフィラトキシンは、補体の活性化の過程においてのみならず、また、Ｃ３、Ｃ４、およびＣ５を直接切断することができるその他の酵素系の活性化からも生じる。そのような酵素には、プラスミン、カリクレイン、組織および白血球のリソソーム酵素、ならびに細菌のプロテアーゼがある。アナフィラトキシンは、血管壁に対して力強い効果を示し、平滑筋（例えば、回腸、気管支、子宮、および血管の筋肉）の収縮を引き起こし、血管透過性を増加させる。これらの効果は、特異的なタキフィラキシーを示し（すなわち、反復刺激が、応答の減少を誘発し）、抗ヒスタミン剤によって遮断することができる。これらはおそらく、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミンの放出を介して間接的に媒介されるであう。Ｃ５ａは、Ｃ５血漿タンパク質α鎖の、７４個のアミノ酸からなるＮ末端切断産物である。Ｃ５ａには、多くの異なる細胞型上、すなわち、最も注目すべきは、好中球、マクロファージ、平滑筋細胞、および内皮細胞の上に存在する分子である受容体Ｃ５ａＲ（Ｃ５Ｒ１またはＣＤ８８としても知られている）が高い親和性で結合する。Ｃ５ａは、圧倒的に最も強力なアナフィラトキシンであり、Ｃ３ａよりおよそ１００倍超有効であり、Ｃ４ａより１０００倍超有効である。この活性は、Ｃ５ａ＞ヒスタミン＞アセチルコリン＞Ｃ３ａ＞＞Ｃ４ａの順で減少する。
Ｃ５ａは、好中球の走化性、接着性、呼吸性バーストの発生、および脱顆粒を刺激する点で極めて強力である。Ｃ５ａはまた、好中球および内皮細胞を刺激して、より多くの接着分子も提示させる。例えば、動物実験では、Ｃ５ａを静脈内注射すると、好中球の血管壁への接着が引き起こされることによって好中球減少が急速に生じる。好中球Ｃ５ａ受容体の連結に続いて、プロスタグランジン、ならびに好中球および単球のもう１つの強力な化学誘引物質であるＬＴＢ４を含めたロイコトリエンに代謝される膜アラキドン酸が可動化される。単球Ｃ５ａ受容体の連結に続いて、ＩＬ−１が放出される。こうして、Ｃ５ａの炎症部位における局所性放出の結果、強力な炎症促進性刺激が生じる。実際に、Ｃ５ａの放出は、多くの急性または慢性の状態、すなわち、免疫複合体関連疾患全般（Ｈｅｌｌｅｒら、１９９９）、喘息（Ｋｏｈｌ、２００１）、敗血症性ショック（Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇら、２００１）、全身性炎症反応症候群（略語：ＳＩＲＳ）、多臓器不全（略語：ＭＯＦ）、急性呼吸促迫症候群（略語：ＡＲＤＳ）、炎症性腸症候群（略語：ＩＢＤ）（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、２００３）、感染、重度の熱傷（Ｐｉｃｃｏｌｏら、１９９９）、心臓、脾臓、膀胱、膵臓、胃、肺、肝臓、腎臓、肢、脳、骨格筋または腸等の臓器の再灌流傷害（Ｒｉｌｅｙら、２０００）、乾癬（Ｂｅｒｇｈら、１９９３）、心筋炎、多発性硬化症（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌａｄｎｅｒら、１９９６）、および関節リウマチ（略語：ＲＡ）（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、２００２）等に直接的または間接的に関係する。
補体系と疾患との間の関係について、多数の概説が公開されている（Ｋｉｒｓｃｈｆｉｎｋ、１９９７；Ｋｏｈｌ、２００１；Ｍａｋｒｉｄｅｓ、１９９８；Ｗａｌｐｏｒｔ、２００１ａ；Ｗａｌｐｏｒｔ、２００１ｂ）。
補体による細胞傷害は、細胞表面上において、古典経路または代替経路のいずれかの活性化の結果として生じる。ＭＡＣは、およそ２０個のタンパク質分子でできており、およそ１．７×１０６Ｄａの分子量に相当する超分子組織を構成する。完全に集合したＭＡＣは、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、およびＣ８を各１分子、ならびに数分子のＣ９を含有する。これらのＭＡＣ構成成分は全て糖タンパク質である。Ｃ５が、Ｃ５コンバターゼによって切断され、Ｃ５ｂが生じると、ＭＡＣの自己集合が始まる。Ｃ５ｂとＣ６とが、安定で可溶性の二分子複合体を形成する。二分子複合体はＣ７に結合し、Ｃ７が準安定部位を発現するよう促し、新生三分子複合体（Ｃ５ｂ−７）が標的脂質二重層上またはそれにごく接近して生じた場合には、その準安定部位を通して、この三分子複合体はそれ自体を膜中に挿入することができる。挿入は、Ｃ７のＣ５ｂ−６への結合後に出現する、Ｃ５ｂ−７複合体上の疎水性領域によって媒介される。膜に結合したＣ５ｂ−７は、ＭＡＣ集合体を膜部位に収容し、Ｃ８のための受容体を形成する。１分子のＣ８が各Ｃ５ｂ−７複合体に結合すると、１ｎｍ未満の有効な直径の小さな膜貫通型チャネルが生じ、このチャネルは、標的の細菌および赤血球の膜を撹乱させることができる。膜に結合した各Ｃ５ｂ−８複合体は、複数のＣ９分子のための受容体として作用し、Ｃ９の、細胞膜の炭化水素コア中への挿入を促進するようである。１分子のＣ９の結合によって、膜の侵襲部位におけるＣ９オリゴマー形成の過程が開始される。少なくとも１２個の分子が複合体中に組み込まれると、個別のチャネル構造が形成される。したがって、最終産物は、４分子のＣ５ｂ−８複合体（およそ５５０ｋＤａの分子量を有する）および管状のポリＣ９（およそ１，１００ｋＤａの分子量を有する）からなる。この形態のＭＡＣは、細胞膜中に挿入されると、完全な膜貫通型チャネルを生み出し、細胞の浸透圧溶解を起こす。形成された膜貫通型チャネルは、チャネル構造中に組み込まれたＣ９分子の数に依存してサイズが異なる。ポリＣ９の存在が、赤血球細胞や有核細胞の溶解のためには必ずしも絶対不可欠であるとは限らないが、細菌を死滅させるためには必要である場合がある。
補体系は、侵入微生物に対する体の防御において主として有益である。補体カスケードの早期の構成成分は、感染病原体のオプソニン化に重要であり、オプソニン化に続いて、感染病原体は体から排除される。さらに、それらの構成成分は、免疫複合体の形成およびクリアランスの制御またはデブリ、死滅組織、および外来物質の浄化のような免疫系のいくつかの正常機能も果たす。（健常な体においては）広範な種類の非自己構造を定義する異なる分子パターンを認識するこれらの活性化経路は全て、侵入物の制御に役立つ。最後にはＭＡＣ集合体に至る最終補体経路は、細菌および外来細胞を溶解することによるさらなる防衛線を示す。
補体欠損の効果を考察すると、有効な補体系の重要性が明らかになる。例えば、代替経路のタンパク質または後期の構成成分（Ｃ３〜Ｃ９）のうちの１つがない個体は、化膿性の生物体、特にナイセリア種によって重度の感染を起こす傾向がある。また、古典経路の構成成分（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４等）の欠損にも、あまり大きくは上昇しないが、感染のリスクの増加が伴う。また、Ｃ１およびＭＢＬのような補体構成成分は、ウイルスの宿主細胞膜との相互作用を妨害し、したがって、ウイルスが細胞中へ入るのを阻止することにより、ウイルスを中和する能力も有する。
注目すべきことには、Ｃ５の切断からＣ５ａおよびＭＡＣが生じるが、Ｃ５欠損の臨床上の特徴は、その他の最終構成成分（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９）の欠損の臨床上の特徴と著しく異なることはなく、このことは、Ｃ５ａの不在が、Ｃ５欠損患者の臨床像に顕著に寄与するわけではないことを示唆している。したがって、Ｃ５ａの選択的な拮抗が、補体の正常な上流および下流の疾患予防機能が損なわれないままであるように、最適な手助けとなることが期待される。したがって、炎症促進性のアナフィラトキシンの有害な過剰産生のみが遮断される。
Ｃ５ａＲ欠損マウスは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）感染に対してより感受性であるが、それ以外は正常に見えるという事実から、Ｃ５ａ機能の遮断には有害な作用はないことが示唆されている。
本発明の根本的な課題は、Ｃ５ａと特異的に相互作用する手段を提供することである。より具体的には、本発明の根本的な課題は、Ｃ５ａと特異的に相互作用する核酸に基づいた手段を提供することである。
さらなる本発明の根本的な課題は、ヒトまたは非ヒトの疾患を治療するための医薬品を製造するための手段を提供することであり、Ｃ５ａがそのような疾患の発症機構に直接的にまたは間接的にのいずれかで関与することによって、疾患を特徴付ける。
その上さらなる本発明の根本的な課題は、疾患を治療するための診断薬を製造するための手段を提供することであり、Ｃ５ａがそのような疾患の発症機構に直接的にまたは間接的にのいずれかで関与することによって、疾患を特徴付ける。
本発明の根本的な、これらおよびその他の課題は、付属の独立請求項に記載の事項によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項から引き出すことができる。
より具体的には、本発明の根本的な課題は、第１の態様において、Ａ型核酸、Ｂ型核酸、Ｃ型核酸、Ｄ型核酸、および配列番号７３〜７９のいずれかに記載の核酸配列を有する核酸を含む群から選択され、Ｃ５ａに結合することができる核酸によって解決され、第１の態様はまた、第１の実施形態でもある。Ａ型核酸は、第１の態様の第１の従属態様を構成し、Ｂ型核酸は、第１の態様の第２の従属態様を構成し、Ｃ型核酸は、第１の態様の第３の従属態様を構成し、Ｄ型核酸は、第４の従属態様を構成し、配列番号７３〜７９のうちのいずれかに記載の核酸配列を有する核酸は、第１の態様の第５の従属態様を構成する。
第１の従属態様の第１の実施形態によれば、Ａ型核酸は、５’−＞３’方向に、第１のストレッチと、第２のストレッチと、第３のストレッチとを含み、
第１のストレッチと第３のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、５〜９個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチは、ＧＵＣＣＧＡＵＵＧＧＣＧＧＣＡＣＣＣＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＧＧＧのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチは、５〜９個のヌクレオチドを含む。
第１の従属態様の第２の実施形態はまた、第１の従属態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、核酸は、５’−＞３’方向に、第３のストレッチと、第２のストレッチと、第１のストレッチとを含み、
第１のストレッチと第３のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、５〜９個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチは、ＧＵＣＣＧＡＵＵＧＧＣＧＧＣＡＣＣＣＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＧＧＧのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチは、５〜９個のヌクレオチドを含む。
第１の従属態様の第３の実施形態はまた、第１の従属態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチは、Ｃ５ａへの結合のために不可欠である。
第１の従属態様の第４の実施形態はまた、第１の従属態様の第１、第２、および第３の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、二本鎖構造は、５〜９個の塩基対からなる。
第１の従属態様の第５の実施形態はまた、第１の従属態様の第１、第２、第３、および第４の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＹＧＣＸ４Ｙ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第３のストレッチは、５’ＧＸ５ＧＹＲＣＸ６Ｘ７Ｘ８３’のヌクレオチド配列を含み、
Ｘ１は、Ａもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｃもしくは不在であり、
Ｘ４は、Ｕであり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ７は、Ｃもしくは不在であり、かつ
Ｘ８は、Ｕもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ａもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｃもしくは不在であり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ７は、Ｃもしくは不在であり、かつ
Ｘ８は、Ｕもしくは不在であり、
好ましくは、
Ｘ１は、不在であり、
Ｘ２は、不在であり、
Ｘ３は、Ｃもしくは不在であり、
Ｘ４は、Ｕであり、
Ｘ５は、Ａであり、
Ｘ６は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ７は、不在であり、かつ
Ｘ８は、不在である。
第１の従属態様の第６の実施形態はまた、第１の従属態様の第５の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’Ｘ３ＧＹＧＣＸ４Ｕ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第３のストレッチは、５’ＧＸ５ＧＹＧＣＸ６３’のヌクレオチド配列を含み、
Ｘ３は、Ｃまたは不在であり、
Ｘ４は、Ｕであり、
Ｘ５は、Ａであり、かつ
Ｘ６は、Ｇまたは不在である。
第１の従属態様の第７の実施形態はまた、第１の従属態様の第１〜第６の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチは、第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチを含み、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとは、相互にハイブリダイズすることができ、ハイブリダイゼーションによって、二本鎖構造が形成される。
第１の従属態様の第８の実施形態はまた、第１の従属態様の第７の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチはそれぞれ、３個のヌクレオチドからなる配列を含み、好ましくは、第１のサブストレッチは、第２のストレッチの１６〜１８位においてこのヌクレオチドを含み、第２のサブストレッチは、第２のストレッチの２３〜２５位においてこのヌクレオチドを含む。
第１の従属態様の第９の実施形態はまた、第１の従属態様の第８の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチの３個のヌクレオチドからなる配列は独立に、ＣＣＣまたはＧＧＧであり、ただし、３個のヌクレオチドからなる配列は、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとで異なる。
第１の従属態様の第１０の実施形態はまた、第１の従属態様の第７、第８および第９の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとは、第２のストレッチ内部で、少なくとも３個のヌクレオチドを含む分離ストレッチ、またはスペーサーによって分離されており、好ましくは、分離ストレッチのヌクレオチドは相互にハイブリダイズしない。
第１の従属態様の第１１の実施形態はまた、第１の従属態様の第１０の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、分離ストレッチは、少なくとも３個のヌクレオチドを含み、好ましくは、４個のヌクレオチドからなる。
第１の従属態様の第１２の実施形態はまた、第１の従属態様の第１０および第１１の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、分離ストレッチ内部で、最低２個のヌクレオチドがスペーサーに置き換えられる。
第１の従属態様の第１３の実施形態はまた、第１の従属態様の第１０、第１１、および第１２の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、分離ストレッチはスペーサーからなる。
第１の従属態様の第１４の実施形態はまた、第１の従属態様の第１０〜第１３の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、スペーサーは、親水性スペーサーである。
第１の従属態様の第１５の実施形態はまた、第１の従属態様の第１４の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、親水性スペーサーはポリエチレン部分からなる。
第１の従属態様の第１６の実施形態はまた、第１の従属態様の第１〜第１５の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、核酸は、配列番号３、１１〜１４、および１６７に記載の核酸配列を含む。
第２の従属態様の第１の実施形態によれば、Ｂ型核酸は、５’−＞３’方向に、第１のストレッチと、第２のストレッチのボックスＡと、第３のストレッチのボックスＬと、第４のストレッチのボックスＢと、第５のストレッチとを含み、
第１のストレッチと第５のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、４〜８個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチのボックスＡは、ＡＳＡＣＧＣＣＧＶＲＹＡＧＧＷＣのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチのボックスＬは、４〜１１個のヌクレオチドを含み、
第４のストレッチのボックスＢは、ＧＷＡＧＡＡＵＳＧのヌクレオチド配列を含み、
第５のストレッチは、４〜８個のヌクレオチドを含む。
第２の従属態様の第２の実施形態はまた、第２の従属態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、５’−＞３’方向の第２のストレッチのボックスＡと、第３のストレッチのボックスＬと、第４のストレッチのボックスＢとの配置は、Ｃ５ａへの結合のために不可欠である。
第２の従属態様の第３の実施形態はまた、第２の従属態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、二本鎖構造は、４〜８個の塩基対からなる。
第２の従属態様の第４の実施形態はまた、第２の従属態様の第１、第２および第３の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第１のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとは、１〜４個のヌクレオチドによって分離されている。
第２の従属態様の第５の実施形態はまた、第２の従属態様の第１、第２、第３および第４の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第１のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、好ましくは、前記１個のヌクレオチドはＡである。
第２の従属態様の第６の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第５の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第４のストレッチのボックスＢと第５のストレッチとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、好ましくは、前記１個のヌクレオチドはＧである。
第２の従属態様の第７の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第６の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第１のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、第４のストレッチのボックスＢと第５のストレッチとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、第１のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとを分離する１個のヌクレオチドと、第４のストレッチのボックスＢと第５のストレッチとを分離する１個のヌクレオチドとは相互にハイブリダイズしない。
第２の従属態様の第８の実施形態によれば、Ｂ型核酸は、５’−＞３’方向に、第５のストレッチと、第２のストレッチのボックスＡと、第３のストレッチのボックスＬと、第４のストレッチのボックスＢと。第１のストレッチとを含み、
第１のストレッチと第５のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、４〜８個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチのボックスＡは、ＡＳＡＣＧＣＣＧＶＲＹＡＧＧＷＣのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチのボックスＬは、４〜１１個のヌクレオチドを含み、
第４のストレッチのボックスＢは、ＧＷＡＧＡＡＵＳＧのヌクレオチド配列を含み、
第５のストレッチは、４〜８個のヌクレオチドを含む。
第２の従属態様の第９の実施形態はまた、第２の従属態様の第８の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、５’−＞３’方向の第２のストレッチのボックスＡと、第３のストレッチのボックスＬと、第４のストレッチのボックスＢとの配置は、Ｃ５ａへの結合のために不可欠である。
第２の従属態様の第１０の実施形態はまた、第２の従属態様の第８および第９の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、二本鎖構造は、４〜８個の塩基対からなる。
第２の従属態様の第１１の実施形態はまた、第２の従属態様の第８、第９、および第１０の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第５のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとは、１〜４個のヌクレオチドによって分離されている。
第２の従属態様の第１２の実施形態はまた、第２の従属態様の第８の〜第１１の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第５のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、好ましくは、前記１個のヌクレオチドはＡである。
第２の従属態様の第１３の実施形態はまた、第２の従属態様の第８〜第１２の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第４のストレッチのボックスＢと第１のストレッチとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、好ましくは、前記１個のヌクレオチドはＧである。
第２の従属態様の第１４の実施形態はまた、第２の従属態様の第８〜第１３の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第５のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、第４のストレッチのボックスＢと第１のストレッチとは、１個のヌクレオチドによって分離されており、第５のストレッチと第２のストレッチのボックスＡとを分離する１個のヌクレオチドと、第４のストレッチのボックスＢと第１のストレッチとを分離する１個のヌクレオチドとは相互にハイブリダイズしない。
第２の従属態様の第１５の実施形態はまた、第２の従属態様の第８〜第１４の実施形態のいずれかのある実施形態でもある。請求項１８〜３１のいずれかに記載の核酸分子であって、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２ＳＢＢＸ３Ｘ４Ｘ５３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第５のストレッチは、５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＶＳＸ９Ｘ１０３’のヌクレオチド配列を含み、
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｂであり、
Ｘ４は、Ｙであり、
Ｘ５は、Ｍであり、
Ｘ６は、Ｋであり、
Ｘ７は、Ｇであり、
Ｘ８は、Ｎであり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｂであり、
Ｘ４は、Ｙであり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、不在であり、
Ｘ７は、Ｇであり、
Ｘ８は、Ｎであり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｂであり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、Ｍであり、
Ｘ６は、Ｋであり、
Ｘ７は、不在であり、
Ｘ８は、Ｎであり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、不在であり、
Ｘ４は、Ｙであり、
Ｘ５は、Ｍであり、
Ｘ６は、Ｋであり、
Ｘ７は、Ｇであり、
Ｘ８は、不在であり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｂであり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、不在であり、
Ｘ７は、不在であり、
Ｘ８は、Ｎであり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、不在であり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、Ｍであり、
Ｘ６は、Ｋであり、
Ｘ７は、不在であり、
Ｘ８は、不在であり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、不在であり、
Ｘ４は、Ｙであり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、不在であり、
Ｘ７は、Ｇであり、
Ｘ８は、不在であり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｕもしくは不在であり、
Ｘ３は、不在であり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、不在であり、
Ｘ７は、不在であり、
Ｘ８は、不在であり、
Ｘ９は、Ａもしくは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃもしくは不在である。
第２の従属態様の第１６の実施形態はまた、第２の従属態様の第１５の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２ＳＳＢＸ３Ｘ４Ｘ５３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第５のストレッチは、５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＳＳＸ９Ｘ１０３’のヌクレオチド配列を含み、
Ｘ１は、Ｇまたは不在であり、
Ｘ２は、Ｕまたは不在であり、
Ｘ３は、Ｓであり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、不在であり、
Ｘ７は、不在であり、
Ｘ８は、Ｓであり、
Ｘ９は、Ａまたは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃまたは不在であり、
好ましくは、
Ｘ１は、不在であり、
Ｘ２は、不在であり、
Ｘ３は、Ｓであり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、不在であり、
Ｘ７は、不在であり、
Ｘ８は、Ｓであり、
Ｘ９は、不在であり、かつ
Ｘ１０は、不在である。
第２の従属態様の第１７の実施形態はまた、第２の従属態様の第１５および第１６の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１ストレッチは、５’ＧＣＵＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第５のストレッチは、５’ＣＡＧＣ３’のヌクレオチド配列を含むか、または
ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’ＣＧＣＣ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第５のストレッチは、５’ＧＧＣＧ３’のヌクレオチド配列を含むか、または
ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’ＣＣＧＧ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド第の５のストレッチは、５’ＣＣＧＧ３’のヌクレオチド配列を含む。
第２の従属態様の第１８の実施形態はまた、第２の従属態様の第１５の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２ＧＣＶＸ３Ｘ４Ｘ５３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第５のストレッチは、５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＡＧＣＸ９Ｘ１０３’のヌクレオチド配列を含み、
Ｘ１は、Ｇまたは不在であり、
Ｘ２は、Ｕまたは不在であり、
Ｘ３は、Ｇであり、
Ｘ４は、Ｃであり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、不在であり、
Ｘ７は、Ｇであり、
Ｘ８は、Ｃであり、
Ｘ９は、Ａまたは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃまたは不在である。
第２の従属態様の第１９の実施形態はまた、第２の従属態様の第１５の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２ＧＣＣＸ３Ｘ４Ｘ５３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第５のストレッチは、５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＡＧＣＸ９Ｘ１０３’のヌクレオチド配列を含み、
Ｘ１は、Ｇまたは不在であり、
Ｘ２は、Ｕまたは不在であり、
Ｘ３は、Ｇであり、
Ｘ４は、Ｃであり、
Ｘ５は、Ｃであり、
Ｘ６は、Ｇであり、
Ｘ７は、Ｇであり、
Ｘ８は、Ｃであり、
Ｘ９は、Ａまたは不在であり、かつ
Ｘ１０は、Ｃまたは不在である。
第２の従属態様の第２０の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第１９の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチのボックスＡの５’末端から２番目のヌクレオチドが、Ｃであり、第４のストレッチのボックスＢの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドが、Ｇであるか、または
第２のストレッチのボックスＡの５’末端から２番目のヌクレオチドが、Ｇであり、第４のストレッチのボックスＢの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドが、Ｃである。
第２の従属態様の第２１の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第２０の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチのボックスＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドが、Ａであり、第４のストレッチのボックスＢの５’末端から２番目のヌクレオチドが、Ｕであるか、または
第２のストレッチのボックスＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドが、Ｕであり、第４のストレッチのボックスＢの５’末端から２番目のヌクレオチドが、Ａである。
第２の従属態様の第２２の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第２１の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチのボックスＡは、ＡＳＡＣＧＣＣＧＭＲＹＡＧＧＷＣのヌクレオチド配列、好ましくは、ＡＣＡＣＧＣＣＧＣＧＵＡＧＧＡＣのヌクレオチド配列を含む。
第２の従属態様の第２３の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第２２の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第４のストレッチのボックスＢは、ＧＵＡＧＡＡＵＧＧのヌクレオチド配列を含む。
第２の従属態様の第２４の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第２３の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第３のストレッチのボックスＬは、第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチを含み、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとは相互にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションによって、二本鎖構造が形成される。
第２の従属態様の第２５の実施形態はまた、第２の従属態様の第２４の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第１のサブストレッチの配列および第２のサブストレッチの配列は独立に、ＣＣまたはＧＧであり、ただし、ヌクレオチドからなる配列は、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとで異なる。
第２の従属態様の第２６の実施形態はまた、第２の従属態様の第２４および第２５の実施形態のいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとは、第２のストレッチ内部で、スペーサーまたはＡＡＵのヌクレオチド配列を含む分離ストレッチによって分離されており、好ましくは、分離ストレッチのヌクレオチドは相互にハイブリダイズしない。
第２の従属態様の第２７の実施形態はまた、第２の従属態様の第２６の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、分離ストレッチの最低２個のヌクレオチドは、スペーサーに置き換えられる。
第２の従属態様の第２８の実施形態はまた、第２の従属態様の第２６および第２７の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、分離ストレッチはスペーサーからなる。
第２の従属態様の第２９の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第２８の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、スペーサーは、親水性スペーサーである。
第２の従属態様の第３０の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第２９の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、親水性スペーサーはポリエチレン部分からなる。
第２の従属態様の第３１の実施形態はまた、第２の従属態様の第１〜第３０の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、核酸は、配列番号２１〜２３、３３、３４、３６、３７、４０、４６、４７、および１６８に記載の核酸配列を含む。
第３の従属態様の第１の実施形態によれば、Ｃ型核酸は、５’−＞３’方向に、第１のストレッチと、第２のストレッチと、第３のストレッチとを含み、
第１のストレッチと第３のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、５〜８個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチは、ＧＵＧＵＵＵＡＹＵＹＧＣＵＵＡＡＵＡＧＧＧＲのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチは、５〜８個のヌクレオチドを含む。
第３の従属態様の第２の実施形態はまた、第３の従属態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、Ｃ型核酸は、５’−＞３’方向に、第３のストレッチ、第２のストレッチおよび第１のストレッチを含み、
第１のストレッチと第３のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、５〜８個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチは、ＧＵＧＵＵＵＡＹＵＹＧＣＵＵＡＡＵＡＧＧＧＲのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチは、５〜８個のヌクレオチドを含む。
第３の従属態様の第３の実施形態はまた、第３の従属態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチは、Ｃ５ａへの結合のために不可欠である。
第３の従属態様の第４の実施形態はまた、第３の従属態様の第１、第２および第３の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、二本鎖構造は、５〜８個の塩基対からなる。
第３の従属態様の第５の実施形態はまた、第３の従属態様の第１〜第４の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第１および第３のストレッチはそれぞれ、独立に、５個のヌクレオチドを含む。
第３の従属態様の第６の実施形態はまた、第３の従属態様の第１〜第５の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＫＶＧＸ４Ｍ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第３のストレッチは、５’ＤＸ５ＹＢＨＸ６Ｘ７Ｘ８３’のヌクレオチド配列を含み、
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｃもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｂもしくは不在であり、
Ｘ４は、Ｇであり、
Ｘ５は、Ｃであり、
Ｘ６は、Ｖもしくは不在であり、
Ｘ７は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ８は、Ｃもしくは不在であるか、
または
Ｘ１は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ２は、Ｃもしくは不在であり、
Ｘ３は、Ｂもしくは不在であり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、Ｖもしくは不在であり、
Ｘ７は、Ｇもしくは不在であり、
Ｘ８は、Ｃもしくは不在である。
第３の従属態様の第７の実施形態はまた、第３の従属態様の第６の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、
Ｘ１は、Ｇであり、
Ｘ２は、Ｃであり、
Ｘ３は、Ｂであり、
Ｘ４は、不在であり、
Ｘ５は、不在であり、
Ｘ６は、Ｖであり、
Ｘ７は、Ｇであり、
Ｘ８は、Ｃである。
第３の従属態様の第８の実施形態はまた、第３の従属態様の第６および第７の実施形態ある実施形態でもあり、これによれば、ヌクレオチドの第１のストレッチは、５’ＧＧＧＧＣ３’のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの第３のストレッチは、５’ＧＣＣＣＣ３’のヌクレオチド配列を含む。
第３の従属態様の第９の実施形態はまた、第３の従属態様の第１〜第８の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチは、ＧＵＧＵＵＵＡＣＵＵＧＣＵＵＡＡＵＡＧＧＧＧのヌクレオチド配列を含む。
第３の従属態様の第１０の実施形態はまた、第３の従属態様の第１〜第９の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、核酸は、配列番号４９、６５、１７０および１７１に記載の核酸配列を含む。
第４の従属態様の第１の実施形態によれば、Ｄ型核酸は、５’−＞３’方向に、第１のストレッチ、第２のストレッチおよび第３のストレッチを含み、
第１のストレッチと第３のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、７個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチは、ＧＵＵＣＧＧＡＣＧＵＧＧＣＡＵＧＵＵＣＣＵＵＧＡＹＡＡＡＣＧＧＵＵＧのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチは、７個のヌクレオチドを含む。
第４の従属態様の第２の実施形態はまた、第４の従属態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、Ｄ型核酸は、５’−＞３’方向に、第３のストレッチ、第２のストレッチおよび第１のストレッチを含み、
第１のストレッチと第３のストレッチとは場合により相互にハイブリダイズし、ハイブリダイズすると二本鎖構造が形成され、
第１のストレッチは、７個のヌクレオチドを含み、
第２のストレッチは、ＧＵＵＣＧＧＡＣＧＵＧＧＣＡＵＧＵＵＣＣＵＵＧＡＹＡＡＡＣＧＧＵＵＧのヌクレオチド配列を含み、
第３のストレッチは、７個のヌクレオチドを含む。
第４の従属態様の第３の実施形態はまた、第４の従属態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチは、Ｃ５ａおよび／またはＣ５への結合のために不可欠である。
第４の従属態様の第４の実施形態はまた、第４の従属態様の第１、第２および第３の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、二本鎖構造は、７個の塩基対からなる。
第４の従属態様の第５の実施形態はまた、第４の従属態様の第４の実施形態のある実施形態でもあり、これによれば、第２のストレッチは、ＧＵＵＣＧＧＡＣＧＵＧＧＣＡＵＧＵＵＣＣＵＵＧＡＣＡＡＡＣＧＧＵＵＧのヌクレオチド配列を含む。
第４の従属態様の第６の実施形態はまた、第４の従属態様の第１〜第５の実施形態のうちのいずれかのある実施形態でもあり、これによれば、核酸は、配列番号６９〜７１に記載の核酸配列を含む。
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の従属態様のある実施形態では、核酸は、Ｃ５ａおよびＣ５、好ましくは、グリコシル化Ｃ５ａおよびグリコシル化Ｃ５に結合することができる。
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の従属態様のさらなる実施形態では、核酸は、Ｃ５および／またはＣ５ａに結合することができ、Ｃ５および／またはＣ５ａは、ヒト、サル、ウマ、ウサギ、ウシ、イヌ、ブタのＣ５および／またはＣ５ａ、好ましくは、ヒトＣ５および／またはヒトＣ５ａである。
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の従属態様のある実施形態では、Ｃ５ａは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の従属態様のある実施形態では、Ｃ５は、２本の鎖、すなわち、アルファ鎖およびベータ鎖を有し、核酸は、Ｃ５のアルファ鎖に結合することができ、Ｃ５のアルファ鎖は、配列番号１７１に記載のアミノ酸配列を有する。
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の従属態様のある実施形態では、核酸は、改変基を含み、改変基は、好ましくは、高分子量部分であり、かつ／または改変基は、好ましくは、動物もしくはヒトの体、好ましくはヒトの体における滞留時間に関して、第１の態様の第１、第２、第３、第４、および第５の従属態様のいずれかの実施形態による核酸の特徴の改変を可能にする。
好ましい実施形態では、そのような改変基は、ＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分を含む基、または生分解性の改変から選択される。
より好ましい実施形態では、改変基は、直鎖ＰＥＧまたは分枝ＰＥＧからなるＰＥＧ部分であり、ＰＥＧ部分の分子量は、好ましくは約２０，０００〜１２０，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。
代替のより好ましい実施形態では、改変基は、ＨＥＳ部分であり、好ましくは、ＨＥＳ部分の分子量は、約１０，０００〜２００，０００Ｄａ、より好ましくは約３０，０００〜１７０，０００Ｄａ、最も好ましくは約１５０，０００Ｄａである。
その上さらなる実施形態では、改変基は、核酸にリンカーを介して結合し、リンカーは、リンカーまたは生分解性リンカーである。
ある実施形態では、改変基は、核酸に、この核酸の５’末端のヌクレオチドおよび／もしくは３’末端のヌクレオチドにおいて、かつ／または核酸のヌクレオチドに、この核酸の５’末端のヌクレオチドと核酸３’末端のヌクレオチドとの間で結合する。
ある実施形態では、核酸のヌクレオチドまたは核酸を形成するヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチドである。
第１の態様の第１、第２、第３、第４および第５の従属態様のある実施形態では、核酸は、Ｌ−核酸である。
好ましい実施形態では、核酸は、Ｃ５ａに結合することができる少なくとも１つの部分を含み、そのような部分は、Ｌ−ヌクレオチドからなる。
第２の態様はまた、第２の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第２の態様において、疾患を治療および／もしくは予防するための医薬品、または疾患、より好ましくは、本発明のその他の態様に関連して本明細書に記載する疾患もしくは状態を治療および／もしくは予防するための方法において使用するための医薬品を製造するための、第１の態様の第１、第２、第３、第４、および第５の従属態様のいずれかの実施形態による核酸によって解決される。
第３の態様はまた、第３の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第３の態様において、第１の態様の第１、第２、第３、第４、および第５の従属態様のいずれかの実施形態による核酸ならびに場合によりさらなる構成要素を含む医薬組成物によって解決され、さらなる構成要素は、薬学的に許容できる賦形剤、薬学的に許容できる担体、および薬学的に活性な薬剤を含む群から選択される。
第３の態様の第２の実施形態はまた、第３の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、医薬組成物が、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸ならびに薬学的に許容できる担体を含む。
第４の態様はまた、第４の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第４態様において、医薬品を製造するための、第１および第２の態様の実施形態のうちのいずれかによる核酸の使用によって解決される。
第４の態様の第２の実施形態はまた、第４の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、医薬品は、ヒト用医薬における使用のためのものまたは獣医用医薬における使用のためのものである。
第５の態様はまた、第５の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第５態様において、診断手段を製造するための、第１および第２の態様の実施形態のうちのいずれかによる核酸の使用によって解決される。
第４の態様の第３の実施形態はまた、第４の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、医薬品は、自己免疫性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、免疫複合体関連疾患、眼疾患、局所性炎症、ショック、サルコイドーシス、敗血症性ショック、出血性ショック、アナフィラキシー性ショック、全身性炎症反応症候群、多臓器不全、喘息、アレルギー；血管炎、好ましくは、側頭動脈炎、血管炎、血管漏出およびアテローム動脈硬化；心筋炎、皮膚筋炎、急性呼吸不全、脳卒中、心筋梗塞、熱傷、全身性疾患の局所的徴候、１型糖尿病および２型糖尿病、糖尿病の徴候、血栓塞栓症、糸球体腎炎、免疫複合体障害、胎児拒絶、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、膵炎、腹膜炎、歯肉炎、ならびに外傷、全身性炎症反応症候群、多臓器不全の二次的損傷；アルツハイマー病、認知神経科学的機能不全、急性中枢神経系傷害等における神経変性および炎症を含む群から選択される疾患または障害を治療および／または予防するためのものである。
第４の態様の第４の実施形態はまた、第４の態様の第３の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、蕁麻疹、円形脱毛症、温式および冷式の自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性副腎炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーおよび多発性硬化症等の自己免疫性神経変性、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、クレスト症候群、尋常性天疱瘡および落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬性関節炎、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、強皮症、セリアック病、全身硬直症候群、高安動脈炎、一過性グルテン不耐症、自己免疫性ブドウ膜炎、白斑、多発性軟骨炎、疱疹状皮膚炎またはジューリング病、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、クローン病および潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患、重症筋無力症、糸球体腎炎、腎線維症、結節性多発動脈炎、抗リン脂質症候群、多腺性自己免疫性症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑、自己免疫性不妊、若年性関節リウマチ、自己免疫性心筋症、眼におけるリウマチ性疾患、脳におけるリウマチ性疾患、血管系におけるリウマチ性疾患、心臓におけるリウマチ性疾患、肺におけるリウマチ性疾患、腎臓におけるリウマチ性疾患、肝臓におけるリウマチ性疾患、消化管におけるリウマチ性疾患、脾臓におけるリウマチ性疾患、皮膚におけるリウマチ性疾患、骨におけるリウマチ性疾患、リンパ系におけるリウマチ性疾患、血液またはその他の臓器系におけるリウマチ性疾患、ランバート・イートン症候群、硬化性苔癬、ライム病、グレーブス病、ベーチェット病、メニエル病、反応性の関節炎を含む群から選択される自己免疫性疾患である。
第４の態様の第５の実施形態はまた、第４の態様の第３の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、疾患は、眼の炎症性疾患および血管系の炎症性疾患の群から選択される炎症性疾患である。
第４の態様の第６の実施形態はまた、第４の態様の第３の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、疾患は、ウイルス、好ましくは、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、または細胞内寄生生物、好ましくは、リーシュマニア、リケッチア、クラミジア、コクシエラ、マラリア原虫、ブルセラ、マイコバクテリア、リステリア、トキソプラズマ、およびトリパノソーマによって引き起こされる感染性疾患またはそれらに関連する感染性疾患である。
第４の態様の第７の実施形態はまた、第４の態様の第３の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、疾患は、全身性エリテマトーデスの合併症等の免疫複合体媒介性腎臓疾患の群から選択される免疫複合体関連疾患である。
第４の態様の第８の実施形態はまた、第４の態様の第３の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、疾患は、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜血管閉塞、脈絡膜血管新生、緑内障眼類天疱瘡、角結膜炎、スティーブン・ジョンソン症候群、およびグレーブス眼症を含む群から選択される眼疾患である。
第４の態様の第９の実施形態はまた、第４の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、医薬品は、手術の間および／または後、好ましくは、冠状動脈バイパスグラフト、オフポンプ冠状動脈バイパスグラフト、最小限侵襲直接冠状動脈バイパスグラフト、経皮経管的冠状動脈血管形成術、血栓溶解、臓器移植、脳および脊髄の手術、再建手術ならびに血管クランプ手術の間および／または後の予防および／または支援および／または術後治療のためのものである。
第６の態様はまた、第６の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第６の態様において、移植された臓器もしくは移植しようとする臓器の臓器損傷の予防のため、または移植された臓器についての移植片拒絶の治療もしくは予防における使用のための、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸の使用によって解決され、そのような臓器は、好ましくは、肝臓、腎臓、腸、肺、心臓、皮膚、肢、角膜、ランゲルハンス島、骨髄、血管、および膵臓を含む群から選択される。
第７の態様はまた、第７の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第７の態様において、心臓、脾臓、膀胱、膵臓、胃、肺、肝臓、腎臓、肢、脳、骨格筋、または腸等の臓器の再灌流傷害、および臓器移植後臓器機能障害を予防するための、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸の使用によって解決される。
第８の態様はまた、第８の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第８の態様において、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸を含む貯蔵溶液および／または輸送溶液であって、好ましくは、臓器の貯蔵または臓器の輸送のための貯蔵溶液および／または輸送溶液によって解決される。
第９の態様はまた、第９の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第９の態様において、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸を含む複合体によって解決され、好ましくは、複合体は、結晶複合体である。
第９の態様の第２の実施形態はまた、第９の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、Ｃ５ａが、ヒトＣ５ａ、サルＣ５ａ、ウマＣ５ａ、ウサギＣ５ａ、ウシＣ５ａ、イヌＣ５ａ、およびブタＣ５ａを含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５ａは、ヒトＣ５ａである。
第９の態様の第３の実施形態はまた、第９の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、Ｃ５が、ヒトＣ５、サルＣ５、ウマＣ５、ウサギＣ５、ウシＣ５、イヌＣ５、およびブタＣ５を含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５は、ヒトＣ５である。
第１０の態様はまた、第１０の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第１０の態様において、Ｃ５および／またはＣ５ａを検出するための、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸の使用によって解決される。
第１０の態様の第２の実施形態はまた、第１０の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、Ｃ５ａが、ヒトＣ５ａ、サルＣ５ａ、ウマＣ５ａ、ウサギＣ５ａ、ウシＣ５ａ、イヌＣ５ａ、およびブタＣ５ａを含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５ａは、ヒトＣ５ａである。
第１０の態様の第３の実施形態はまた、第１０の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、Ｃ５が、ヒトＣ５、サルＣ５、ウマＣ５、ウサギＣ５、ウシＣ５、イヌＣ５、およびブタＣ５を含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５は、ヒトＣ５である。
第１１の態様はまた、第１１の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第１１の態様において、補体系タンパク質のアンタゴニストまたはアゴニストをスクリーニングするための方法によって解決され、この方法は、
補体系タンパク質の候補アンタゴニストおよび／または候補アゴニストを用意するステップと、
第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸を用意するステップと、
補体系タンパク質のアンタゴニストおよび／またはアゴニストの存在下でシグナルを発生する試験系を用意するステップと
候補アンタゴニストが、補体系タンパク質のアンタゴニストであるかどうか、および／または候補アゴニストが、補体系タンパク質のアゴニストであるかどうかを決定するステップと
を含み、補体系タンパク質は、Ｃ５ａおよびＣ５を含む群から選択される。
第１１の態様の第２の実施形態はまた、第１１の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質が、ヒトＣ５ａおよびヒトＣ５を含む群から選択される。
第１１の態様の第３の実施形態はまた、第１１の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５ａであり、Ｃ５ａは、好ましくは、ヒトＣ５ａ、サルＣ５ａ、ウマＣ５ａ、ウサギＣ５ａ、ウシＣ５ａ、イヌＣ５ａ、およびブタＣ５ａを含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５ａは、ヒトＣ５ａである。
第１１の態様の第４の実施形態はまた、第１１の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５であり、Ｃ５は、好ましくは、ヒトＣ５、サルＣ５、ウマＣ５、ウサギＣ５、ウシＣ５、イヌＣ５、およびブタＣ５を含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５は、ヒトＣ５である。
第１２の態様はまた、第１２の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第１２の態様において、補体系タンパク質のアゴニストおよび／またはアンタゴニストをスクリーニングするための方法によって解決され、この方法は、
相、好ましくは固相に固定化されている補体系タンパク質を用意するステップと、
第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸を用意するステップであって、そのような核酸は、好ましくは、標識されているステップと、
補体系タンパク質の候補アゴニストおよび／またはケモカインアンタゴニストを添加するステップと、
候補アゴニストが、補体系タンパク質のアゴニストであるかどうか、かつ／または候補アンタゴニストが、補体系タンパク質のアンタゴニストであるかどうかを決定するステップと
を含み、補体系タンパク質は、Ｃ５ａおよびＣ５を含む群から選択される。
第１２の態様の第２の実施形態はまた、第１２の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、決定のステップは、核酸が、補体系タンパク質の候補アゴニストまたは候補アンタゴニストによって置き換えられるかどうかを判定するように実施される。
第１２の態様の第３の実施形態はまた、第１２の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質が、ヒトのＣ５ａおよびＣ５を含む群から選択される。
第１２の態様の第４の実施形態はまた、第１２の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５ａであり、Ｃ５ａは、好ましくは、ヒトＣ５ａ、サルＣ５ａ、ウマＣ５ａ、ウサギＣ５ａ、ウシＣ５ａ、イヌＣ５ａ、およびブタＣ５ａを含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５ａは、ヒトＣ５ａである。
第１２の態様の第５の実施形態はまた、第１２の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５であり、Ｃ５は、好ましくは、ヒトＣ５、サルＣ５、ウマＣ５、ウサギＣ５、ウシＣ５、イヌＣ５、およびブタＣ５を含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５は、ヒトＣ５である。
第１３の態様はまた、第１３の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第１３の態様において、Ｃ５および／またはＣ５ａの検出のための、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸を含むキットによって解決される。
第１３の態様の第２の実施形態はまた、第１３の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、Ｃ５および／またはＣ５ａが、ヒトＣ５および／またはヒトＣ５ａである。
第１４の態様はまた、第１４の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第１４の態様において、第１２の態様のいずれかの実施形態よる方法によって得られる補体系タンパク質のアンタゴニストによって解決され、補体系タンパク質は、Ｃ５ａおよびＣ５を含む群から選択される。
第１４の態様の第２の実施形態はまた、第１４の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、ヒトＣ５ａおよびヒトＣ５を含む群から選択される。
第１４の態様の第３の実施形態はまた、第１４の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５ａであり、Ｃ５ａは、好ましくは、ヒトＣ５ａ、サルＣ５ａ、ウマＣ５ａ、ウサギＣ５ａ、ウシＣ５ａ、イヌＣ５ａ、およびブタＣ５ａを含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５ａは、ヒトＣ５ａである。
第１４の態様の第４の実施形態はまた、第１４の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５であり、Ｃ５は、好ましくは、ヒトＣ５、サルＣ５、ウマＣ５、ウサギＣ５、ウシＣ５、イヌＣ５、およびブタＣ５を含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５は、ヒトＣ５である。
第１５の態様はまた、第１５の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第１５の態様において、第１２の態様のいずれかの実施形態よる方法によって得ることができる補体系タンパク質のアゴニストによって解決され、補体系タンパク質は、Ｃ５ａおよびＣ５を含む群から選択される。
第１５の態様の第２の実施形態はまた、第１５の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質が、ヒトＣ５ａおよびヒトＣ５を含む群から選択される。
第１５の態様の第３の実施形態はまた、第１５の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５ａであり、Ｃ５ａは、好ましくは、ヒトＣ５ａ、サルＣ５ａ、ウマＣ５ａ、ウサギＣ５ａ、ウシＣ５ａ、イヌＣ５ａ、およびブタＣ５ａを含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５ａは、ヒトＣ５ａである。
第１５の態様の第４の実施形態はまた、第１５の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、補体系タンパク質の１つが、Ｃ５であり、Ｃ５は、好ましくは、ヒトＣ５、サルＣ５、ウマＣ５、ウサギＣ５、ウシＣ５、イヌＣ５およびブタＣ５を含む群から選択され、より好ましくは、Ｃ５は、ヒトＣ５である。
第１６の態様はまた、第１６の態様の第１の実施形態でもあり、本発明の根本的な課題は、第１６の態様において、試料中の、第１および第２の態様の実施形態のうちのいずれかによる核酸を検出するための方法によって解決され、この方法は、
ａ）本発明による核酸を含有する試料を用意するステップと、
ｂ）捕捉プローブおよび検出プローブを用意するステップであって、捕捉プローブは、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸の第１の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、検出プローブは、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸の第２の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すか、または、捕捉プローブは、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸の第２の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、検出プローブは、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸の第１の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すステップと、
ｃ）捕捉プローブおよび検出プローブを、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸またはその一部と、同時にまたは任意の順番で順次にのいずれかで反応させるステップと、
ｄ）場合により、捕捉プローブが、ステップａ）で用意された、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸にハイブリダイズするか否かを検出するステップと、
ｅ）ステップｃ）で形成された、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸ならびに捕捉プローブおよび検出プローブからなる複合体を検出するステップと
を含む。
第１６の態様の第２の実施形態はまた、第１６の態様の第１の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、検出プローブは、検出手段を含み、および／または捕捉プローブは、支持体、好ましくは、固体支持体に固定化され得る。
第１６の態様の第３の実施形態はまた、第１６の態様の第１および第２の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、複合体の一部ではない検出プローブはいずれも、反応から除去され、したがって、ステップｅ）において、複合体の一部である検出プローブのみが検出される。
第１６の態様の第４の実施形態はまた、第１６の態様の第１、第２および第３の実施形態のある実施形態でもあり、ここでは、ステップｅ）が、第１および第２の態様のいずれかの実施形態による核酸またはその一部が存在する場合と、前記核酸またはその一部が存在しない場合とで、捕捉プローブおよび検出プローブがハイブリダイズしたときに検出手段が発生させるシグナルを比較するステップを含む。
本発明のさらなる態様では、本発明は、本発明による核酸を含む医薬品に関する。好ましい実施形態では、医薬品は、疾患を治療するためのものであり、そのような疾患は、本明細書に開示するいずれかの疾患、好ましくは、治療および／または予防のために、本発明による核酸を使用することができるいずれかの疾患である。
また、本発明による貯蔵溶液が、外植された組織、臓器、または臓器系を貯蔵、保存、または輸送するために使用されることも本発明の範囲に含まれる。最後には、そのような溶液は、ある実施形態では、そのような外植された組織、臓器、または臓器系のレシピエントに投与することができる。そのような投与は、そのような外植された組織、臓器、または臓器系の埋込みの前に、同時に、および／またはその後に行うことができる。
本発明は、Ｃ５ａに特異的かつ高い親和性で結合する核酸をもたらすことができるという驚くべき知見に基づいている。また、そのような核酸は、好ましくは、本明細書では、本発明による核酸分子、本発明による核酸、本発明の核酸、または本発明の核酸分子とも呼ぶ。
本明細書に記載する本発明による核酸の特徴は、核酸が、単独でまたは何らかの組合せのいずれかで使用される、本発明の任意の態様において理解することができる。
ヒトＣ５ａは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する塩基性タンパク質である。
塩基性タンパク質に対して作られたアプタマー、すなわち標的分子に結合するＤ−核酸を創出することは一般に非常に困難であるとＥａｔｏｎら（１９９７）が観察する限りにおいて、ヒトＣ５ａに高い親和性で結合する短い核酸を同定することができたという発見は驚くべきことである。これは、この種の標的は、高いが、非特異的なシグナル対ノイズの比をもたらすからである。この高いシグナル対ノイズの比は、核酸がヒトＣ５ａ等の塩基性標的に対して示す高い非特異的な親和性の結果として生じる。
特許請求の範囲および実施例１においてより詳細に概説するが、より驚くべきことには、本発明者は、いくつかの異なるヒトＣ５ａ結合性核酸分子を同定することができ、そうした核酸の大部分は、本明細書ではボックスとも呼ぶヌクレオチドのストレッチの観点から特徴付けることができた。種々のヒトＣ５ａ結合性核酸分子は、前記ボックス、ならびにいくつかの構造的な特徴および要素に基づいてそれぞれ類別することができる。こうして定義した種々のカテゴリーを、明細書では、型、より具体的には、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型とも呼ぶ。
本発明による核酸、あるいはそのストレッチまたはその任意の（１つもしくは複数の）部分が、原則として、相互にハイブリダイズすることができることは本発明の範囲に含まれる。そのようにハイブリダイズすると、二本鎖構造が形成される。当業者であれば、そのようなハイブリダイゼーションが、特に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏの条件下では、起こる場合もあれば、起こらない場合もあることを認識するであろう。また、そのようなハイブリダイゼーションの場合、少なくとも塩基対合則に基づいてそのようなハイブリダイゼーション、したがって二本鎖構造の形成が原則として起こることができるところ、２つのストレッチの全長にわたってハイブリダイゼーションが必ずしも起こるとは限らないこともある。本明細書で使用する場合、好ましくは、二本鎖構造は、分子の一部、または２つ以上の別個の鎖もしくは一本鎖の２つの空間的に別個のストレッチによって形成された構造の一部であり、好ましくはワトソン−クリック塩基対合則に従って塩基対を形成する少なくとも１つ、好ましくは２つ以上の塩基対が存在する。また、当業者であれば、フーグスティーン塩基対等のその他の塩基対合も、そのような二本鎖構造中に存在するかまたはそれを形成する場合があることを認識するであろう。
好ましい実施形態では、本明細書で使用する場合、配置という用語は、本明細書に開示する核酸に関連して本明細書に記載する構造的または機能的な特徴または要素の順または順番を意味する。
当業者であれば、本発明による核酸は、Ｃ５ａおよびＣ５の両方に結合することができることを認識するであろう。この結合の特徴は、核酸の同定のために、Ｃ５ａおよびＣ５の両方の中に存在するＣ５ａの部分が使用されたという事実から派生する。したがって、本発明による核酸は、Ｃ５ａ、Ｃ５、または両方のいずれかの検出に適している。また、当業者であれば、本発明による核酸は、Ｃ５およびＣ５ａの両方に対するアンタゴニストでもあることを認識するであろう。このことから、本発明による核酸は、Ｃ５ａもしくはＣ５のいずれかまたは両方に関連があるか、あるいはそれらによって引き起こされた、いずれかの疾患の治療および予防のそれぞれに適している。科学的な理論的根拠は、Ｃ５ａおよびＣ５がそれぞれ、多様な疾患および状態のそれぞれに関与するか関連があることを確立している先行技術から得ることができる。そうした先行技術は、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
本発明による核酸が核酸分子であることは本発明の範囲に含まれる。核酸および核酸分子という用語に限っては、本明細書では別段の記載がない限り同義として使用する。本出願の１つの実施形態では、核酸、したがって核酸分子は、核酸分子を形成する連続したヌクレオチドの全てが１または２つ以上の共有結合によって相互に連結または接続しているという点で特徴付けられる核酸分子を含む。より具体的には、そのような各ヌクレオチドが、２個のその他のヌクレオチドに、好ましくはリン酸ジエステル結合またはその他の結合を通して連結または接続しており、連続したヌクレオチドのストレッチを形成する。しかし、そのような配置の場合、２個の末端ヌクレオチド、すなわち、好ましくは、５’末端のヌクレオチドおよび３’末端のヌクレオチドはそれぞれ、単一のヌクレオチドのみに連結している。ただし、そのような配置は、環状ではなく直鎖状の配置であり、したがって、分子は、環状ではなく直鎖状となる。
本出願の別の実施形態では、核酸、したがって核酸分子は、連続したヌクレオチドの少なくとも２つの群を含み、連続したヌクレオチドの各群の内部では、各ヌクレオチドが、２個のその他のヌクレオチドに、好ましくはリン酸ジエステル結合またはその他の結合を通して連結または接続しており、連続したヌクレオチドのストレッチを形成する。しかし、そのような配置の場合、２個の末端ヌクレオチド、すなわち、好ましくは、５’末端のヌクレオチドおよび３’末端のヌクレオチドはそれぞれ、単一のヌクレオチドのみに連結している。しかし、そのような実施形態では、連続したヌクレオチドの２つの群が、一方の群の１個のヌクレオチドと別または他方の群の１個のヌクレオチドとを連結する共有結合、好ましくは、前記２個のヌクレオチドの一方の糖部分と前記２個のヌクレオチドの他方のリン酸部分またはヌクレオシドとの間に形成される共有結合を通しては、相互に連結も接続もしていない。しかし、代替の実施形態では、連続したヌクレオチドの２つの群が、一方の群の１個のヌクレオチドと別または他方の群の１個のヌクレオチドとを連結する共有結合、好ましくは、前記２個のヌクレオチドの一方の糖部分と前記２個のヌクレオチドの他方のリン酸部分またはヌクレオシドとの間に形成される共有結合を通して、相互に連結または接続している。好ましくは、連続したヌクレオチドの少なくとも２つの群が、いずれの共有結合を通しても連結していない。別の好ましい実施形態では、少なくとも２つの群が、リン酸ジエステル結合とは異なる共有結合を通して連結している。さらに別の実施形態では、少なくとも２つの群が、リン酸ジエステル結合である共有結合を通して連結している。
また、本発明による核酸は、本明細書に開示する特定の配列に対して本質的に相同性を示す核酸も含むものとする。実質的に相同性を示すという用語は、相同性が、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、または９９％超であると理解されたい。
本発明による核酸中に存在する相同性を示すヌクレオチドの実際のパーセントは、核酸中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。パーセントの改変は、核酸中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。
相同性は、当業者に知られているように、決定することができる。この場合、より具体的には、配列比較アルゴリズムによって、指定したプログラムのパラメータに基づいて、参照配列と比べた（１つまたは複数の）試験配列についてのパーセント配列同一性が計算される。試験配列は、好ましくは、別の核酸分子に対して相同性を示すはずであるかまたは相同性を示すかどうかを試験すべきであるといわれている核酸分子の配列、および相同性を示す場合には、その程度を試験すべきであるといわれている核酸分子の配列であり、そのような別の核酸分子は、参照配列とも呼ばれている。ある実施形態では、参照配列は、本明細書に記載する核酸分子、より好ましくは、配列番号３〜４０、配列番号４３〜７９、配列番号１６８〜１７１、および配列番号１７４〜１７９のうちのいずれかに記載の配列を有する核酸分子である。比較のために配列アラインメントの最適化を、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性を検索する方法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．製）、または目視検査によって行うことができる。
パーセント配列同一性を決定するために適しているアルゴリズムの１つの例が、基本的な局所的アラインメント検索ツール（以下「ＢＬＡＳＴ」）において使用されているアルゴリズムである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を参照されたい。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアが、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下「ＮＣＢＩ」）から公的に入手可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウエア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列の場合）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列の場合）を使用して配列同一性を決定する場合に使用するデフォルトパラメータが、ＭｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら、２００４）に記載されている。
また、本発明の核酸または本発明による核酸という用語は、好ましくは、核酸または前記一部が、ヒトＣ５ａへの結合に関与する範囲内で、本明細書に開示する核酸配列またはその一部を含む核酸も含む。そのような核酸は、ある実施形態では、本明細書に記載する核酸分子のうちの１つ、またはその誘導体および／もしくは代謝産物であり、そのような誘導体および／または代謝産物は、好ましくは、本明細書に記載する核酸分子と比較してトランケートされた核酸である。トランケートは、本明細書に開示する核酸のいずれかまたは両方の末端に関してでよい。また、トランケートは、核酸のヌクレオチドの内部配列に関してでもよく、すなわち、それぞれの５’末端のヌクレオチドと３’末端のヌクレオチドとの間の（１個または複数の）ヌクレオチドに関してでよい。さらに、トランケートは、本明細書に開示する核酸配列からのわずか１個のヌクレオチドの欠失も含むものとする。また、トランケートは、（１個または複数の）本発明の核酸の２つ以上のストレッチに関してでもよく、ストレッチは、わずか１ヌクレオチド長であってもよい。本発明による核酸の結合は、当業者であれば、日常的な実験を使用して、または本明細書に記載する、好ましくは、本明細書の実施例の部分に記載する方法を使用もしくは採用することによって決定することができる。
本発明による核酸は、Ｄ−核酸またはＬ−核酸のいずれかであってよい。好ましくは、本発明の核酸は、Ｌ−核酸である。さらに、核酸の１つもしくはいくつかの部分がＤ−核酸として存在するか、または核酸の少なくとも１つもしくはいくつかの部分がＬ−核酸であってもよい。核酸の「部分」という用語は、わずか１個のヌクレオチドも意味するものとする。そのような核酸は一般に、本明細書では、それぞれＤ−核酸およびＬ−核酸と呼ぶ。したがって、特に好ましい実施形態では、本発明による核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなり、少なくとも１個のＤ−ヌクレオチドを含む。そのようなＤ−ヌクレオチドは、好ましくは、核酸のその他の部分との相互作用が関与する、本発明による核酸を定義するストレッチ、好ましくは、それらの部分とは異なる部分につながっている。好ましくは、そのようなＤ−ヌクレオチドは、ストレッチのうちのいずれかの末端、および任意の本発明による核酸の末端にそれぞれ付着している。さらなる好ましい実施形態では、そのようなＤ−ヌクレオチドは、スペーサーまたはリンカーとして作用し、好ましくは、ＰＥＧおよびＨＥＳ等の改変を本発明による核酸に付着させることできる。
また、本明細書に記載する核酸分子全体のそれぞれおよびいずれかが、それらの（１つまたは複数の）核酸配列に関して、特定の（１つまたは複数の）ヌクレオチド配列に限定されることも本発明の実施形態の範囲に含まれる。すなわち、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」という用語は、そのような実施形態では、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）またはからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）を意味すると解釈するものとする。
また、本発明による核酸は、より長い核酸の一部であり、このより長い核酸は、いくつかの部分を含み、少なくとも１つのそのような部分は、本発明による核酸またはその一部であることも本発明の範囲に含まれる。これらのより長い核酸のその他の（１つまたは複数の）部分は、１つもしくはいくつかのＤ−核酸、または１つもしくはいくつかのＬ−核酸のいずれかであってよい。本発明に関連して、いずれの組合せも使用することができる。より長い核酸のその他の（１つまたは複数の）部分は、単独でまたは一緒になってのいずれかで、全体または特定の組合せのいずれかとして、結合、好ましくは、Ｃ５ａへの結合とは異なる機能を示すことができる。１つの可能な機能は、例えば、固定化、架橋結合、検出、または増幅のため等、その他の分子との相互作用を可能にすることであり、そのようなその他の分子は、好ましくは、Ｃ５ａとは異なる。本発明のさらなる実施形態では、本発明による核酸は、個々の部分または組み合わせた部分として、本発明の核酸のいくつかを含む。また、本発明の核酸のいくつかを含むそのような核酸も、より長い核酸という用語に包含される。
本明細書で使用する場合、Ｌ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは、完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸である。
本明細書で使用する場合、Ｄ−核酸は、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは、完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸である。
核酸および核酸分子という用語を、明確に別段の記載がない限り、互換的に使用する。
また、別段の記載がない限り、いずれのヌクレオチド配列も、本明細書では、５’−＞３’方向に記載する。
好ましくは、本明細書で使用する場合、ヌクレオチドの位置はいずれも、配列、ストレッチ、またはサブストレッチの５’末端に対して決定または言及する。したがって、第２のヌクレオチドとは、配列、ストレッチ、およびサブストレッチのそれぞれの５’末端から数えて２番目のヌクレオチドである。また、それに従って、最後から２番目のヌクレオチドとは、配列、ストレッチ、およびサブストレッチのそれぞれの３’末端から数えて２番目のヌクレオチドである。
本発明の核酸が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、または例えば、ランダムな組合せもしくは少なくとも１個のＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなる、定義された配列のストレッチである、両方の組合せからなるかどうかに関わらず、核酸は、（１個もしくは複数の）デオキシリボヌクレオチド、（１個もしくは複数の）リボヌクレオチド、またはそれらの組合せからなることができる。
本発明の核酸をＬ−核酸として設計することは、いくつかの理由で好都合である。Ｌ−核酸は、天然に存在する核酸の鏡像異性体である。しかし、Ｄ−核酸は、水溶液中、ならびに特に、生物学的系および生物学的試料においてはヌクレアーゼの広範な存在によりあまり安定ではない。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞由来のヌクレアーゼには、Ｌ−核酸を分解する能力はない。このことから、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物およびヒトの体を含めた、そのような系においては顕著に延長する。Ｌ−核酸の分解性がないことにより、ヌクレアーゼによる分解産物が生じることはなく、したがって、そこから発生する副作用は観察されない。この態様によって、Ｌ−核酸の、Ｃ５ａの存在が関与する疾患および／または障害の療法において使用される事実上全てのその他の化合物との違いが生じる。ワトソン−クリック塩基対合とは異なる機構を通して標的分子に特異的に結合するＬ−核酸、またはＬ−ヌクレオチドから部分的もしくは完全になるアプタマー、特に標的分子への結合に関与するアプタマーの部分を有するものは、スピーゲルマーとも呼ばれている。
また、本発明の核酸が、Ｄ−核酸、Ｌ−核酸もしくはＤ，Ｌ−核酸として存在するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかであるかに関わらず、本明細書では、本発明による核酸とも呼ぶ本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖の核酸として存在することができることも本発明の範囲に含まれる。典型的には、本発明の核酸は、一次配列によって定義された二次構造を示す一本鎖核酸であり、したがって、三次構造も形成することができる。しかし、本発明の核酸はまた、相互に相補性または部分的な相補性を示す２つの鎖が相互にハイブリダイズしているという意味での二本鎖であってもよい。これによって、核酸に安定性がもたらされ、これは特に、核酸がＬ型ではなく天然に存在するＤ型として存在する場合には好都合である。
１つの実施形態では、本発明による核酸の１つまたは複数のヌクレオチドは、リンカーまたはスペーサーの分子によって置き換えることができる。好ましい実施形態では、そのようなリンカーまたはスペーサーは、本明細書で定義する分離ストレッチである。そのようなリンカーまたはスペーサーの分子は、好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは複数のエチレングリコール部分を含む親水性スペーサーである。種々のリンカーおよびスペーサーのそれぞれが、当業者には知られており、例えば、ＰｉｌｓおよびＭｉｃｕｒａ（ＰｉｌｓおよびＭｉｃｕｒａ、２０００）によって記載されている以下の判断基準を使用して選択することができる。リンカーはそれ自体が、塩基対を妨げてはならず、塩基対を妨げることもない。芳香族炭素環を含有するリンカーの型は、末端の塩基対上に積み重なってしまい、したがって適切ではない（Ｌｅｗｉｓら、１９９９）。しかし、エチレングリコールに基づいたリンカーまたはエチレングリコールから得たリンカーは、良好な水溶性および高い構造的柔軟性の利点を有することから、これらの要件を満たす（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９３；Ｍａら、１９９３；Ｄｕｒａｎｄら、１９９０）。好ましくは、スペーサーは、１つまたはいくつかのエチレングリコール部分を含むかそれらからなり、酸素が、ＣＨ２、リン酸、または硫黄によって置き換えられているか置換されている。
本発明の核酸は、改変することができる。そのような改変は、核酸の単一のヌクレオチドに関することができ、当技術分野ではよく知られている。そのような改変の例が、とりわけ、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ（２００３）、Ｋｕｓｓｅｒ（２０００）、Ａｕｒｕｐ（１９９４）、Ｃｕｍｍｉｎｓ（１９９５）、Ｅａｔｏｎ（１９９５）、Ｇｒｅｅｎ（１９９５）、Ｋａｗａｓａｋｉ（１９９３）、Ｌｅｓｎｉｋ（１９９３）、およびＭｉｌｌｅｒ（１９９３）に記載されている。そのような改変は、核酸をなす個々のヌクレオチドの２’位のＨ原子、Ｆ原子、またはＯ−ＣＨ３基もしくはＮＨ２基であってよい。また、本発明による核酸は、少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドも含むことができる。ある実施形態では、本発明による核酸は、ＬＮＡヌクレオチドからなる。
ある実施形態では、本発明による核酸は、分節核酸であってよい。本明細書で使用する場合、分節核酸は、少なくとも２つの核酸の鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２つの核酸の鎖は、機能性の単位を形成し、機能性の単位は、標的分子に対するリガンドとなる。少なくとも２つの核酸の鎖は、本発明の核酸のうちのいずれかから、核酸を切断して２つの鎖を得ることによって、または本発明の、すなわち、全体的な核酸の第１の部分に対応する１つの核酸および全体的な核酸の第２の部分に対応する別の核酸を合成することによってのいずれかで得ることができる。切断および合成の両方を適用して、上記で例示した２つの鎖より多い鎖をもつ分節核酸を得ることができることを認識されたい。すなわち、種々の核酸の部分の間には特定の程度で相補性が存在するが、これら少なくとも２つの核酸の鎖は典型的には、相補性を示し相互にハイブリダイズする２つの鎖とは異なる。
最後にまた、本発明による核酸の完全に閉じた、すなわち、環状の構造も実現されており、すなわち、本発明による核酸は、好ましくは、共有結合による連結を通して閉じており、より好ましくは、そのような共有結合による連結は、本明細書に開示する核酸配列の５’末端と３’末端との間で作製されることも本発明の範囲に含まれる。
本発明は、本発明による核酸が、非常に好都合なＫＤ値の範囲を示すことを発見するに至った。
実施例に記載する「プルダウンアッセイ」を使用して、本発明による核酸分子の結合定数を決定することができる。個々の核酸分子と、本発明ではＣ５ａである標的との間の結合強度を表すための適切な尺度が、いわゆるＫＤ値であり、これは、その決定方法と共に、当業者であれば知っている。
本発明による核酸は、特定のＫＤ値によって特徴付けられる。好ましくは、本発明による核酸が示すＫＤ値は、１μＭ未満である。約１μＭのＫＤ値は、核酸の標的に対する非特異的な結合の特徴であるといわれている。当業者であれば認識するであろうが、本発明による核酸等の化合物群のＫＤ値は、特定の範囲に収まる。約１μＭの上記で言及したＫＤは、ＫＤ値の好ましい上限である。標的に結合する核酸のＫＤの好ましい下限は、約１０ピコモラー以上であってよい。個々の核酸のＣ５ａに対する結合のＫＤ値が、好ましくは、この範囲に収まることは本発明の範囲に含まれる。好ましい範囲は、この範囲内の任意の第１の数およびこの範囲内の任意の第２の数を選ぶことによって定義することができる。好ましい上限値は、２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下限値は、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、および１０ｐＭである。
本発明による核酸分子は、標的分子に依然として結合できるならば、いずれの長さであってもよい。当技術分野では、本発明による核酸の好ましい長さがあることが認識されるであろう。典型的には、その長さは、１５〜１２０ヌクレオチド長である。当業者であれば、本発明による核酸については、１５と１２０との間の任意の整数の長さが可能であることを認識するであろう。本発明による核酸の長さのより好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド長、約２０〜８０ヌクレオチド長、約２０〜６０ヌクレオチド長、約２０〜５０ヌクレオチド長、および約３０〜５０ヌクレオチド長である。
本明細書に開示する核酸が、好ましくは、高分子量部分であり、かつ／または好ましくは、とりわけ、動物の体、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関する核酸の特徴を改変することを可能にする部分を含むことは本発明の範囲に含まれる。そのような改変の特に好ましい実施形態が、本発明による核酸のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書で使用する場合、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を、ＨＥＳはヒドロキシエチルデンプンを表す。好ましくは、本明細書で使用する場合、ＰＥＧ化は、本発明による核酸の改変であり、そのような改変は、本発明による核酸につながっているＰＥＧ部分からなる。好ましくは、本明細書で使用する場合、ＨＥＳ化は、本発明による核酸の改変であり、そのような改変は、本発明による核酸につながっているＨＥＳ部分からなる。これらの改変、およびそのような改変を使用する核酸の改変プロセスが、欧州特許出願第ＥＰ１ ３０６ ３８２号に記載されており、その開示は、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
好ましくは、高分子量部分からなるかまたはそれを含む改変の分子量は、約２，０００〜２５０，０００Ｄａ、好ましくは、２０，０００〜２００，０００Ｄａである。ＰＥＧがそのような高分子量部分である場合には、分子量は、好ましくは、２０，０００〜１２０，０００Ｄａ、より好ましくは、４０，０００〜８０，０００Ｄａである。ＨＥＳがそのような高分子量部分である場合には、分子量は、好ましくは、２０，０００〜２００，０００Ｄａ、より好ましくは、４０，０００〜１５０，０００Ｄａである。ＨＥＳの改変プロセスは、例えば、ドイツ特許出願第ＤＥ１ ２００４ ００６ ２４９．８号に記載されており、その開示全体が、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
特許出願ＷＯ２００５０７４９９３および第ＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０号にさらに記載されているように、ＰＥＧおよびＨＥＳのいずれかを直鎖状または分枝状の形態のいずれかとして使用することができることは本発明の範囲に含まれる。そのような改変は、原則として、本発明の核酸分子に対して、その任意の位置においてなされることができる。好ましくは、そのような改変は、核酸分子の５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチド、および／または５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドとの間の任意のヌクレオチドのいずれかに対してなされる。
改変、ならびに好ましくはＰＥＧ部分および／またはＨＥＳ部分は、本発明の核酸分子に、直接にまたはリンカーを通してのいずれかで付着させることができる。また、本発明による核酸分子が、１つまたは複数の改変、好ましくは、１つまたは複数のＰＥＧ部分および／またはＨＥＳ部分を含むことも本発明の範囲に含まれる。ある実施形態では、個々のリンカー分子が、２つ以上のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を、本発明による核酸分子に付着させる。本発明に関連して使用するリンカーはそれ自体が、直鎖状または分枝状のいずれかであってよい。この種のリンカーは、当業者には知られており、特許出願ＷＯ２００５０７４９９３および第ＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０号にさらに記載されている。
好ましい実施形態では、リンカーは、生分解性リンカーである。生分解性リンカーによって、とりわけ、動物の体、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関する本発明による核酸の特徴を、本発明による核酸からの放出の改変により改変することが可能になる。生分解性リンカーの使用によって、本発明による核酸の滞留時間をより良好に制御することが可能となる場合がある。そのような生分解性リンカーの好ましい実施形態が、これらに限定されないが、国際特許出願第ＷＯ２００６／０５２７９０号、第ＷＯ２００８／０３４１２２号、第ＷＯ２００４／０９２１９１号および第ＷＯ２００５／０９９７６８号に記載されている生分解性リンカーであり、国際特許出願第ＷＯ２００４／０９２１９１号および第ＷＯ２００５／０９９７６８号では、リンカーは、本明細書に記載する１または２つの改変、核酸分子、および間の生分解性リンカーからなるポリマー性のオリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。
改変が、生分解性の改変であり、生分解性の改変は、本発明の核酸分子に、直接にかまたはリンカーを通してのいずれかでつなげることができることは本発明の範囲に含まれる。生分解性の改変によって、とりわけ、本発明による核酸からの改変の放出に起因する、動物の体、好ましくはヒトの体内における滞留時間に関する本発明による核酸の特徴を改変することが可能になる。生分解性リンカーの使用によって、本発明による核酸の滞留時間をより良好に制御することが可能となる場合がある。好ましくは、そのような生分解性リンカーの好ましい実施形態が、これらに限定されないが、国際特許出願ＷＯ２００２／０６５９６３、ＷＯ２００３／０７０８２３、ＷＯ２００４／１１３３９４、およびＷＯ２０００／４１６４７に、ＷＯ２０００／４１６４７では、好ましくは、１８頁、４〜２４行に記載されている。
いずれの説にも縛られる意図はないが、本発明による核酸を、ポリマーおよびより具体的には本明細書に開示するポリマー等の高分子量部分を用いて改変することによって、排泄の動態が変化するようである。これらは、好ましくは、生理学的に許容できるポリマーである。より具体的には、そのような改変した本発明の核酸の分子量の増加、および核酸が特にＬ型である場合には代謝を受けないことにより、動物の体、好ましくは哺乳動物の体、およびより好ましくはヒトの体からの排泄が低下するようである。排泄は典型的には、腎臓を介して起こることから、本発明者らは、こうして改変した核酸の糸球体ろ過の速度がこの種の高分子量の改変を有しない核酸と比較して顕著に低下し、その結果、体内における滞留時間が延長すると推測している。それに関連して、そのような高分子量の改変にも関わらず、本発明による核酸の特異性が、有害な様式では影響を受けないことは特に注目に値する。本発明による核酸が、通常であれば薬学的に活性な化合物からは期待することができない、驚くべき特徴を有する限り、持続性放出をもたらす薬学的製剤に、持続性放出をもたらすようにすることが必ずしも求められるとは限らない。したがって、むしろ、高分子量部分を含む改変形態をとる本発明による核酸は、持続性放出製剤としてすでに使用することができる。この限りでは、本明細書に開示する核酸分子の（１つまたは複数の）改変、したがって改変した核酸分子、およびそれらを含む任意の組成物は、それらの明確に異なる、好ましくは制御された薬物動態および体内分布をもたらす。また、これには、循環における滞留時間および組織への分布も含まれる。そのような改変は、特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０２／１１９５０号にさらに記載されている。
しかしまた、本明細書に開示する核酸が、いずれの改変、特にＰＥＧ化またはＨＥＳ化等の高分子量の改変も含まないことも本発明の範囲に含まれる。そのような実施形態は、核酸が体内のいずれかの標的の臓器もしくは組織に対して優先的な分布を示す場合または投与後に体からの核酸の急速なクリアランスが望まれる場合には特に好ましい。体内のいずれかの標的の臓器または組織に対して優先的な分布プロファイルを示す本明細書に開示する核酸によって、核酸の全身濃度は低く保ちながら、標的組織において有効な局所濃度を確立することが可能となるであろう。これによって、低い用量を使用することが可能になり、これは、経済的な観点から有益であるのみならず、また、その他の組織の核酸薬剤に対する不必要な暴露も減少し、したがって、副作用の潜在的なリスクが低下するであろう。それぞれ本発明に従う、核酸またはそれを含む医薬品を使用するｉｎ ｖｉｖｏにおける画像診断または特異的な治療投与要件の場合には、投与後に体からの本明細書に開示する核酸の急速なクリアランスが望まれることもあろう。
本明細書では本発明による核酸とも呼ぶ本発明の核酸、および／または本発明によるアンタゴニストを、医薬品を生成または製造するために使用することができる。そのような医薬品、または本発明による医薬組成物は、本発明の核酸のうちの少なくとも１つを、場合によりさらなる薬学的に活性な化合物と共に含有し、本発明の核酸はそれ自体が、好ましくは、薬学的に活性な化合物として作用する。そのような医薬品は、好ましい実施形態では、少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む。そのような担体は、例えば、水、緩衝剤、ＰＢＳ、グルコース溶液、好ましくは、５％グルコース塩平衡化溶液、デンプン、糖、ゼラチン、または任意のその他の許容可能な担体物質であってよい。そのような担体は一般に当業者に知られている。また、当業者であれば、本発明の医薬品またはそれに関するいずれの実施形態、使用、および態様も、本発明の医薬組成物に適用可能であり、逆もまた同様であることを認識するであろう。
治療および／または予防のために、本発明によって、または本発明に従って調製した核酸、医薬組成物、および医薬品を使用することができる適応症、疾患、および障害は、それぞれの発症機構においてＣ５ａが直接的にまたは間接的にのいずれかで関与した結果生じる。
Ｃ５ａの炎症部位における局所放出の結果、力強い炎症促進性の刺激が生じる。したがって、Ｃ５ａの中和が、多くの急性または慢性の状態、すなわち、免疫複合体関連疾患全般（Ｈｅｌｌｅｒら、１９９９）、例えば、アルツハイマー病における神経変性および炎症（ＢｏｎｉｆａｔｉおよびＫｉｓｈｏｒｅ、２００７）、喘息（Ｋｏｈｌ、２００１）、外傷の二次的損傷（Ｙａｏら、１９９８）、敗血症性ショック（Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇら、２００１）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器不全（ＭＯＦ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、炎症性腸症候群（ＩＢＤ）（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、２００３）、例えば全身性エリテマトーデスの合併症として（Ｍａｎｄｅｒｓｏｎら、２００４）の免疫複合体媒介性腎臓疾患（Ｗａｎｇ、２００６）、感染、重度の熱傷（Ｐｉｃｃｏｌｏら、１９９９）、とりわけ臓器移植後臓器機能障害に至る恐れのある（Ｌｅｗｉｓら、２００８）心臓、脾臓、膀胱、膵臓、胃、肺、肝臓、腎臓、肢、脳、骨格筋、または腸等の臓器の再灌流傷害（Ｒｉｌｅｙら、２０００）、乾癬（Ｂｅｒｇｈら、１９９３）、心筋炎、多発性硬化症（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌａｄｎｅｒら、１９９６）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、溶血、血栓塞栓症（Ｈｉｌｌｍｅｒｎら、２００７）、ならびに関節リウマチ（ＲＡ）（Ｗｏｏｄｒｕｆｆら、２００２）等において有益な場合があるであろう。また、補体Ｃ５ａは、加齢黄斑変性においては硫黄顆粒の量の増加として見い出されており、ＶＥＧＦ発現の増加に至り、視覚機能障害および失明に至る恐れがある脈絡膜血管新生を促進することが示されている（Ｎｏｚａｋｉら、２００６）。
最近、実行可能なおよびすでに追求されている補体標的療法について、Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに専門家が総説している（ＲｉｃｋｌｉｎおよびＬａｍｂｒｉｓ、２００７）。
もちろん、本発明によるＣ５ａ結合性核酸は、ヒトＣ５ａと相互作用するかまたはそれに結合するので、当業者であれば一般に、本発明によるＣ５ａ結合性核酸を、本明細書に記載するヒトおよび動物のいずれかの疾患の治療、予防および／または診断のために容易に使用することができることを理解するであろう。それに関連して、本発明による核酸分子を、本明細書に記載する疾患、障害、または状態のうちのいずれかの治療および予防のために、そのような疾患、障害、および状態の根底にある作用様式に関わらず使用することができることを認識されたい。
以下に、いずれの説にも縛られる意図はないが、本発明による核酸分子を、種々の疾患、障害、および状態に関して使用することについての理論的根拠を提供し、したがって、請求している本発明による核酸分子の治療、予防、および診断への適用を妥当なものとする。いずれの不必要な反復も回避するために、それに関連して概説されるように、Ｃ５ａ−ＳＤＦ−１受容体の軸が関与することから、前記軸は、本発明による核酸分子によって対処することができ、したがって、請求している治療、予防、および診断の効果が達成されることを認識されたい。患者の疾患、障害、および状態の詳細な事項、ならびにそれに関連して記載する治療計画の詳細のいずれもが、本出願の好ましい実施形態の対象となることができることもさらに認識されたい。
したがって、治療および／または予防のために、本発明による医薬品を使用することができる疾患および／または障害および／または疾患状態として、これらに限定されないが、自己免疫性疾患、例として、関節リウマチ（略語：ＲＡ）、強直性脊椎炎（略語：ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（略語：ＳＬＥ）、多発性硬化症（略語：ＭＳ）、乾癬、円形脱毛症、温式および冷式の自己免疫性溶血性貧血（略語：ＡＩＨＡ）、悪性貧血、急性炎症性疾患、自己免疫性副腎炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（略語：ＣＩＤＰ）、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、クレスト症候群、尋常性天疱瘡および落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、膵炎、腹膜炎、乾癬性関節炎、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェーグレン症候群、強皮症、セリアック病、全身硬直症候群、高安動脈炎、一過性グルテン不耐症、自己免疫性ブドウ膜炎、白斑、多発性軟骨炎、疱疹状皮膚炎（略語：ＤＨ）またはジューリング病、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（略語：ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、免疫複合体障害、糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、抗リン脂質症候群、多腺性自己免疫性症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑（略語：ＩＴＰ）、蕁麻疹、自己免疫性不妊、若年性関節リウマチ、サルコイドーシス、自己免疫性心筋症、ランバート・イートン症候群、硬化性苔癬、ライム病、グレーブス病、ベーチェット病、メニエル病、反応性の関節炎（ライター症候群）；ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ等のウイルス、またはリーシュマニア、リケッチア、クラミジア、コクシエラ、マラリア原虫、ブルセラ、マイコバクテリア、リステリア、トキソプラズマおよびトリパノソーマ等の細胞内寄生生物による感染；外傷の二次的損傷；局所性炎症、ショック、アナフィラキシー性ショック、熱傷、敗血症性ショック、出血性ショック、全身性炎症反応症候群（略語：ＳＩＲＳ）、多臓器不全（略語：ＭＯＦ）、喘息およびアレルギー；側頭動脈炎、血管炎、血管漏出等の血管炎、およびアテローム動脈硬化；急性中枢神経系傷害、心筋炎、皮膚筋炎、歯肉炎、急性呼吸不全、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、心筋梗塞、再灌流傷害、認知神経科学的機能不全、熱傷；ブドウ膜炎、加齢黄斑変性（略語：ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（略語：ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（略語：ＤＭＥ）、眼類天疱瘡、角結膜炎、スティーブン・ジョンソン症候群およびグレーブス眼症等の炎症性眼疾患；全身性疾患の局所的徴候、血管系の炎症性疾患、急性中枢神経系傷害、１型および２型の糖尿病、糖尿病の徴候、ＳＬＥ、ならびに眼、脳、血管系、心臓、肺、腎臓、肝臓、消化管、脾臓、皮膚、骨、リンパ系、血液もしくはその他の臓器系におけるリウマチ性疾患、冠状動脈バイパスグラフト（略語：ＣＡＢＧ）、オフポンプ冠状動脈バイパスグラフト（略語：ＯＰＣＡＢＧ）、最小限侵襲直接冠状動脈バイパスグラフト（略語：ＭＩＤＣＡＢ）、経皮経管的冠状動脈血管形成術（略語：ＰＴＣＡ）、血栓溶解、臓器移植および血管クランプ手術の予防および／または支援および／または術後治療のため；肝臓、腎臓、腸、肺、心臓、皮膚、肢、角膜、ランゲルハンス島、骨髄、血管および膵臓等の移植された臓器もしくは移植しようとする臓器の臓器損傷の予防のため、または移植された臓器についての移植片拒絶の治療における使用のため；胎児拒絶が挙げられる。
治療および／または予防のために、核酸を使用することができる種々の疾患および障害を、以下のようにグループ化することができる。
［自己免疫性／炎症性の疾患］
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、全身性の自己免疫性および／または炎症性の疾患である。そのような全身性疾患として、
アレルギー
敗血症性ショック、
外傷の二次的損傷
温式および冷式の自己免疫性溶血性貧血（略語：ＡＩＨＡ）、
全身性炎症反応症候群（略語：ＳＩＲＳ）、
出血性ショック、
糖尿病１型、
糖尿病２型、糖尿病の徴候、
びまん性強皮症、
多発性軟骨炎、
多腺性自己免疫性症候群、
関節リウマチ、
全身性エリテマトーデス（略語：ＳＬＥ）およびその徴候、
反応性の関節炎（ライター症候群としても知られている）
が含まれる。
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、消化管の自己免疫性および／または炎症性の疾患である。そのような消化管疾患として、
クローン病、
潰瘍性大腸炎、
セリアック病、
一過性グルテン不耐症、
炎症性腸疾患（略語：ＩＢＤ）
膵炎
が含まれる。
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、皮膚の自己免疫性および／または炎症性の疾患である。そのような皮膚疾患として、
乾癬、
蕁麻疹、
皮膚筋炎、
尋常性天疱瘡、
落葉状天疱瘡、
水疱性類天疱瘡、
モルフェア／線状強皮症、
白斑、
疱疹状皮膚炎（略語：ＤＨ）またはジューリング病、
硬化性苔癬
が含まれる。
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、血管系の自己免疫性および／または炎症性の疾患である。そのような血管系の疾患として、
血管炎（好ましくは、側頭動脈炎）、
血管炎、
血管漏出、
リウマチ性多発筋痛症
アテローム動脈硬化
チャーグ・ストラウス症候群
高安動脈炎
グッドパスチャー症候群（多くの場合、腎臓（糸球体）および肺に影響を及ぼす）
糸球体腎炎
結節性多発動脈炎、
ベーチェット病
が含まれる。
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、神経系の自己免疫性および／または炎症性の疾患である。そのような神経系疾患として、
多発性硬化症（略語：ＭＳ）、
慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー（略語：ＣＩＤＰ）、
認知神経科学的機能不全、
全身硬直症候群、
ギラン・バレー症候群、
重症筋無力症、
ランバート・イートン症候群
が含まれる。
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、筋肉、骨格の自己免疫性および／または炎症性の疾患である。そのような筋肉、骨格の疾患として、
関節リウマチ、
眼、脳、肺、腎臓、心臓、肝臓、消化管、脾臓、皮膚、骨、リンパ系、血液またはその他の臓器におけるリウマチ性疾患、
強直性脊椎炎（略語：ＡＳ）、
サルコイドーシス、
リウマチ性多発筋痛症、
多発性筋炎、
乾癬性関節炎、
リウマチ熱、
多発性軟骨炎、
線維筋痛症、
若年性関節リウマチ、
ライム病、
反応性の関節炎（ライター症候群としても知られている）
が含まれる。
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、その他の自己免疫性および／または炎症性の疾患である。そのようなその他の疾患として、
コーガン症候群（自己免疫性の眼の炎症および難聴）、
自己免疫性副腎炎、
免疫複合体障害、
メニエル病、
局所性炎症、
円形脱毛症、
急性炎症性疾患、
原発性胆汁性肝硬変、
シェーグレン症候群、
強皮症、
びまん性強皮症、
クレスト症候群、
モルフェア／線状強皮症、
自己免疫性ブドウ膜炎、
橋本甲状腺炎（自己免疫性の甲状腺破壊）、
グレーブス病、
自己免疫性肝炎、
糸球体腎炎、
腹膜炎、
抗リン脂質症候群、
特発性肺線維症、
腎線維症
自己免疫性不妊、
胎児拒絶
が含まれる。
自己免疫性および／または炎症性の疾患のサブグループは、血液学的障害である。そのような血液学的障害として、
悪性貧血（クローン病の二次的損傷または内因子産生胃粘膜壁細胞の自己免疫性破壊として観察される）、
温式および冷式の自己免疫性溶血性貧血（略語：ＡＩＨＡ）、
抗リン脂質症候群、
特発性血小板減少性紫斑（略語：ＩＴＰ）
が含まれる。
［眼疾患］
そのような眼疾患として、
ブドウ膜炎、
加齢黄斑変性（略語：ＡＭＤ）、
糖尿病性網膜症（略語：ＤＲ）、
糖尿病性黄斑浮腫（略語：ＤＭＥ）、
網膜血管閉塞、
緑内障、
眼類天疱瘡、角結膜炎、
スティーブン−ジョンソン症候群、
およびグレーブス眼症
が含まれる。
［再灌流傷害、臓器移植後臓器機能障害および移植片拒絶］
そのような再灌流傷害および移植片拒絶として、
脳卒中、
心筋梗塞、
肝臓、腎臓、腸、肺、心臓、皮膚、肢、角膜、ランゲルハンス島、骨髄、血管および膵臓等の移植された臓器に対する再灌流傷害または臓器損傷
臓器または骨髄の移植後の腎臓損傷
が含まれる。
［移植片拒絶の予防］
そのような移植片拒絶の予防として、
肝臓、腎臓、腸、肺、心臓、皮膚、肢、角膜、ランゲルハンス島、骨髄、血管および膵臓等の移植された臓器の移植片拒絶
が含まれる。
［心血管疾患］
そのような心血管疾患として、
アテローム動脈硬化、
心筋炎、
心筋梗塞、
脳卒中、
血管系の炎症性疾患、
血管炎、好ましくは、側頭動脈炎、
血管炎、
血管漏出、
糖尿病の徴候、
妊娠高血圧腎症、
自己免疫性心筋症、
冠状動脈バイパスグラフト（略語：ＣＡＢＧ）の予防および／または支援および／または術後治療のため
が含まれる。
［呼吸器疾患］
そのような呼吸器疾患として、
喘息、
急性呼吸不全、
成人呼吸促迫症候群
慢性閉塞性肺疾患
が含まれる。
［炎症性疾患］
そのような炎症性疾患として、
炎症性眼疾患、
自己免疫性ブドウ膜炎、
全身性疾患の局所的徴候
が含まれる。
［急性反応］
そのような急性反応として、
外傷の二次的損傷、
ショック、
熱傷、
アナフィラキシー性ショック、
出血性ショック、
多臓器不全（略語：ＭＯＦ）、
急性中枢神経系傷害、
急性中枢神経系傷害
が含まれる。
［感染性疾患］
そのような感染性疾患として、
細菌感染、好ましくは、
髄膜炎、
ライム病、
反応性の関節炎（ライター症候群としても知られている）、
敗血症、および臓器不全、心機能不全、全身性低灌流、アシドーシス、成人呼吸促迫症候群等のその合併症、
ウイルス感染、好ましくは、
ＨＩＶ、
ＨＢＶ、
ＨＣＶ、
ＣＭＶ、
ウイルス性髄膜炎、または
細胞内寄生生物、好ましくは、
リーシュマニア、
リケッチア、
クラミジア、
コクシエラ、
マラリア原虫、
ブルセラ、
マイコバクテリア、
リステリア、
トキソプラズマおよび
トリパノソーマ
が含まれる。
また、本発明による核酸は、患者の免疫系への有害な作用を回避するために、手術中に使用することもでき、より好ましくは、
冠状動脈バイパスグラフト（略語：ＣＡＢＧ）の予防および／または支援および／または術後治療のため、
オフポンプ冠状動脈バイパスグラフト（略語：ＯＰＣＡＢＧ）、
最小限侵襲直接冠状動脈バイパスグラフト（略語：ＭＩＤＣＡＢ）、
経皮経管的冠状動脈血管形成術（略語：ＰＴＣＡ）、
血栓溶解、
臓器移植、
脳および脊髄の手術、
再建手術
ならびに血管クランプ手術；
移植された臓器もしくは移植しようとする臓器の臓器損傷の予防のため、または
肝臓、腎臓、腸、肺、心臓、皮膚、肢、角膜、ランゲルハンス島、骨髄、血管および膵臓等の移植された臓器についての移植片拒絶および再灌流傷害の治療における使用のため
が含まれる。
本発明者らによる核酸を含有する医薬品および医薬組成物をそれぞれ、そのような場合における治療のために使用することができることは本発明に含まれる。
さらなる実施形態では、医薬品は、薬学的に活性な薬剤をさらに含む。そのようなさらなる薬学的に活性な化合物は、これらに限定されないが、とりわけ、免疫系を抑制することが知られているもの、例として、カルシニューリン阻害剤、シクロスポリンＡ、メトトレキセート、アザチオプリン、タクロリムス、ラパマイシン、クロラムブシル、レフルノミド、ミコフェノール酸モフェチル、ブレキナル、ミゾリビン、サリドマイドまたはデオキシスパガリンである。また、さらなる薬学的に活性な化合物は、さらなる実施形態では、ヒスタミン産生を低下させる化合物、例として、メクロジン、クレマスチン、ジメチンデン、バミピン、ケトチフェン、セチリジン、ロベセチリジン（ｌｏｖｅｃｅｔｉｒｉｚｉｎ）、セスロラタジン（ｃｅｓｌｏｒａｔａｄｉｎ）、アゼラスチン、ミゾラスチン、レボカバスチン、テルフェナジン、フェキソフェナジンまたはエバスチンのうちの１つであってもよい。また、そのような化合物は、これらに限定されないが、ステロイドであってもよく、好ましくは、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、エファーヴェセント（ｅｆｆｅｒｖｅｓｃｅｎｔ）またはブデソニドのような副腎皮質ステロイドを含む群から選択される。さらに、そのような化合物は、１つまたはいくつかの抗生物質、例として、これらに限定されないが、アミノグリコシド、β−ラクタム抗生物質、ジャイレース阻害剤、糖ペプチド抗生物質、リンコサミド、マクロライド抗生物質、ニトロイミダゾール誘導体、ポリペプチド抗生物質、スルホンアミド、トリメトプリムおよびテトラサイクリンであってもよい。さらに、より特異的な抗炎症性または抗血管新生の生物学的製剤、例として、ＩＬ−１０、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、トレルマブ（ｔｏｌｅｒｍａｂ）、リツキシマブ、ゴミリキシマブ（ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、バシリキシマブ、ダクリズマブ、ＨｕＭａｘ−ＴＡＣ、ビジリズマブ、ＨｕＭａｘＣＤ４、クレノリキシマブ、ＭＡＸ１６Ｈ５、ＴＮＸ１００、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、アレムツズマブ、ＣＹ１７８８、ガリキシマブ、パキセリズマブ、エクリズマブ、ＰＭＸ−５３、ＥＴＩ１０４、ＦＧ３０１９、ベルチリムマブ（ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、２４９４１７（抗第ＩＸ因子）アブシキシマブ、ＹＭ３３７、オマリズマブ、タリズマブ、フォントリズマブ（ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、Ｊ６９５（抗ＩＬ１２）、ＨｕＭａｘＩＬ−１５、メポリズマブ、エルシリモマブ（ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、ＨｕＤＲＥＧ、アナキンラ、Ｘｏｍａ−０５２、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブ、アフェリモマブ、ＣｙｔｏＦａｂ、ＡＭＥ５２７、ヴァパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ヴィタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ＭＬＮ１２０２、ボロシキシマブ（ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、Ｆ２００（抗α５β１）、エファリズマブ、ｍ６０．１１（抗ＣＤ１１ｂ）、エタネルセプト、オナセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）、ナタリズマブまたはシプリズマブ（ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ＡＢＴ−８７４を組み合わせて使用することもできる。最後に、さらなる薬学的に活性な薬剤は、いずれかのその他のケモカインの活性調節物質であってもよく、それらは、ケモカインのアゴニストもしくはアンタゴニスト、またはケモカイン受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストであってよい。それに代わってまたは追加して、そのようなさらなる薬学的に活性な薬剤は、本発明によるさらなる核酸である。あるいは、医薬品は、Ｃ５ａとは異なる標的分子に結合するかまたは本発明による核酸の１つとは異なる機能を示す、少なくとも１つのさらなる核酸を含む。
一般に、Ｃ５ａアンタゴニストは、その他の炎症促進性の分子またはそれらの受容体の阻害剤と組み合わせることができる。その作用を、Ｃ５ａアンタゴニストと組み合わせて減弱させることができる炎症促進性の分子についての例には、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＴＮＦ、α４β７、α５β１、ＢｌｙＳ、カドヘリン、ＣＣＲ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１２５、ＣＤ１３０、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ５４、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＥＰ、ガストリン−Ｒ、Ｃ１、Ｃ１−エステラーゼ、Ｃ５、Ｄ因子、ＭＢＬ、補体受容体１、ＣＲＴＨ２−受容体、ＣＴＧＦ、Ｅ−およびＰ−セレクチン、エオタキシン、第ＩＸ因子、ＦＧＦ−２０、Ｆｇｌ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、ＨＭＧ１、ＩＣＡＭ−１、ＩｇＥ、胸腺細胞、ＩＦＮγ、ＩＦＮｒ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、Ｍ−ＣＳＦ受容体、ＭＩＦ、ＭＭＰ９、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＳＤＦ−１、ＴＧＦβ１、組織因子、チロシンキナーゼ受容体、ＶＡＰ−１、ＶＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、ＶＬＡ１ならびにフォン・ヴィルブランド因子がある。
原則として、疾患を治療するための医薬品の使用に関連して開示される前記疾患のうちのいずれかを予防するために、代わりにまたは追加して医薬品が使用されることは本発明の範囲に含まれる。したがって、それぞれのマーカー、すなわち、それぞれの疾患についてのマーカーが当業者には知られている。好ましくは、それぞれのマーカーはＣ５ａである。
本発明の医薬品の１つの実施形態では、そのような医薬品は、本明細書に開示する疾患、特に本発明の医薬品を使用すべき疾患のうちのいずれかのために、その他の治療と組み合わせて使用するためのものである。
「併用療法（「ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ」または「ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｙ」）」は、本発明の医薬品と、特異的な治療計画の一部としての少なくとも１つの第２の薬剤との投与を含み、これらの治療剤、すなわち、本発明の医薬品と前記第２の薬剤との共同作用からの有益な効果をもたらす。組合せの有益な効果として、これらに限定されないが、治療剤の組合せの結果として生じる薬物動態学的または薬力学的な共同作用が挙げられる。これらの治療剤を組み合わせた投与は典型的には、（通常、選択された組合せに依存して、分、時間、日、または週の）定義された期間にわたり実施される。
「併用療法」は、一般にはそうではないが、偶発的かつ任意に本発明の組合せに至る別個の単独療法の投与計画の一部としての、これらの治療剤のうちの２つ以上の投与を包含することを意図することができる。「併用療法」は、これらの治療剤を順次に投与すること、すなわち、各治療剤を異なる時期に投与すること、およびこれらの治療剤または治療剤のうちの少なくとも２つを実質的に同時に投与することを包含することを意図する。実質的な同時投与は、例えば、対象に、各治療剤の一定比を有する単一のカプセル剤を投与するか、または各治療剤についての単一のカプセル剤を複数投与することによって達成することができる。
各治療剤の順次投与または実質的な同時投与は、これらに限定されないが、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路および粘膜組織を通しての直接的な吸収を含めた、いずれかの適切な経路によってもたらすことができる。治療剤は、同じ経路によって投与しても、または異なる経路によって投与してもよい。例えば、選択された組合せのうちの第１の治療剤を注射により投与することができ、一方、組合せの他方の治療剤を局所的に投与することができる。
あるいは、例えば、全ての治療剤を局所的に投与してもよく、または全ての治療剤を注射によって投与してもよい。治療剤を投与する順番には、別段の記載がない限り、あまり重大な意味はない。また、「併用療法」は、上記に記載した治療剤をその他の生物学的に活性な成分とさらに組み合わせた投与も包含することができる。併用療法が非薬物治療をさらに含む場合、治療剤と非薬物治療の組合せの同時作用から有益な効果が達成される限り、非薬物治療をいずれかの適切な時期において実施することができる。例えば、適切な場合には、非薬物治療が治療剤の投与から一時的に、おそらく数日または数週の間除外された場合でも有益な効果が依然として達成される。
上記で大まかに概説したように、本発明による医薬品は原則として、当業者に知られているいずれかの形態で投与することができる。好ましい投与経路は、全身投与であり、より好ましくは非経口投与、好ましくは注射によるものである。あるいは、医薬品は、局所投与することもできる。その他の投与経路には、筋肉内、腹腔内、および皮下、経口、鼻腔内、気管内、または肺からの経路があり、効率を保証する一方で侵襲性が最も低い投与経路が選好される。
非経口投与は一般に、皮下、筋肉内、または静脈内への注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、徐放性または持続放出性のシステムの埋込みを利用し、このシステムによって、一定レベルの投与量の維持が保証され、これは、当業者にはよく知られている。
さらに、本発明の好ましい医薬品は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所的な使用を介する鼻腔内への形態で、すなわち、吸入剤としてか、または経皮経路を介して当業者にはよく知られている経皮皮膚パッチの形態を使用して投与することができる。経皮送達システムの形態として投与するためには、もちろん、投与量は、投与計画全体を通して間欠的ではなくむしろ連続的に投与される。その他の好ましい局所調製物には、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、エアロゾルスプレー剤、およびジェル剤があり、活性成分の濃度は典型的には、０．０１％〜１５％ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲である。
本発明の医薬品は一般に、これらに限定されないが、薬学的に許容可能な媒体中に溶解または分散される本発明の核酸分子を含めて、療法の（１つまたは複数の）活性な構成成分の有効量を含む。薬学的に許容可能な媒体または担体には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は、当技術分野ではよく知られている。また、補助的な活性成分も、本発明の医薬品中に組み込むことができる。
さらなる態様では、本発明は、医薬組成物に関する。そのような医薬組成物は、本発明による核酸の少なくとも１つ、および好ましくは薬学的に許容可能なビヒクルを含む。そのようなビヒクルは、当技術分野で使用されているおよび／または知られている任意のビヒクルまたは任意の結合剤であってよい。より具体的には、そのような結合剤またはビヒクルは、本明細書に開示する医薬品の製造に関連して論じる任意の結合剤またはビヒクルであってよい。さらなる実施形態では、医薬組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤を含む。
医薬品および医薬組成物の調製は、当業者には本開示に照らせば分かるだろう。典型的には、そのような組成物を、液剤もしくは懸濁剤のいずれかとしての注射剤、注射前に液体となす液剤もしくは懸濁剤の中において適した固体の形態、経口投与のための錠剤もしくはその他の固体、時間放出性のカプセル剤、または点眼剤、クリーム剤、ローション剤、軟膏剤、吸入剤等を含めた、現在使用されている任意のその他の形態として調製することができる。また、手術分野においては、外科医、内科医ま、たは医療従事者による、食塩水に基づいた洗浄液等の無菌製剤の、特定の領域を治療するための使用が特に有用な場合もある。また、組成物を、微小デバイス、微小粒子、またはスポンジを介して送達することもできる。
製剤化したら、医薬品を、投与製剤に適合した様式で、薬理学的に有効である量で投与する。製剤は、例として、上記の注射用液剤型等の多様な投与剤型で容易に投与されるが、また、薬物放出カプセル剤等も利用することができる。
こうした状況では、投与すべき活性成分の分量および組成物の体積は、治療しようとする個体または対象に依存する。投与に必要な活性化合物の特異的な量は、開業医の判断によって決まり、各個体に特有である。
活性化合物を分散させるために必要な医薬品の最少体積を、典型的には活用する。また、適切な投与計画は可変であるが、典型的には、最初に化合物を投与し、結果をモニターし、次いで、さらに間を置いて制御した用量をさらに与える。
例えば、錠剤またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）の形態で経口投与する場合、活性な薬物構成成分、すなわち、本発明の核酸分子および／あるいは本明細書で（１つもしくは複数の）治療剤または（１つもしくは複数の）活性化合物とも呼ぶ任意のさらなる薬学的に活性な薬剤を、経口で無毒性の薬学的に許容可能な不活性な担体、例として、エタノール、グリセロール、水等と組み合わせることができる。またさらに、所望するか必要とする場合には、適切な結合剤、滑沢剤、崩壊剤、および着色剤も混合物中に組み込むことができる。適切な結合剤には、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン、グルコースまたはベータ−ラクトース等の天然の糖、トウモロコシ甘味剤、アカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム等の天然および合成のガム、ポリエチレングリコール、ろう等がある。これらの投与剤型中で使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウムの塩、および／またはポリエチレングリコール等がある。崩壊剤には、これらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物等がある。希釈剤には、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシンがある。
また、本発明の医薬品は、徐放および持続性放出の錠剤、またはカプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、懸濁剤、シロップ剤および乳剤等の経口投与剤型で投与することもできる。坐剤は、脂肪乳剤または懸濁剤から好都合に調製される。
医薬組成物または医薬品は、滅菌することができ、かつ／あるいは保存剤、安定化剤、湿潤剤、もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝剤等のアジュバントを含有することができる。またさらに、それらは、その他の治療上価値のある物質も含有することができる。組成物は、従来の混合、顆粒化または被覆の方法に従って調製され、典型的には、活性成分を約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％含有する。
液体、特に注射用組成物は、例えば、溶解させること、分散させること等によって調製することができる。活性化合物を、薬学的に純粋な溶媒、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等に溶解させるか、またはそれらと混合し、これにより、注射用の液剤または懸濁剤を形成する。さらに、注射前に液体中に溶解させるために適した固体の形態としても製剤化することができる。
固体の組成物のための賦形剤には、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等がある。また、上記で定義した活性化合物は、坐剤として、例えば、担体としてポリアルキレングリコール、例えば、プロピレングリコールを使用して製剤化することもできる。いくつかの実施形態では、坐剤は、脂肪乳剤または懸濁剤から好都合に調製される。
また、本発明の医薬品および核酸分子はそれぞれ、リポソーム送達システムの形態、例として、小型の単層状ベシクル、大型の単層状ベシクルおよび多層状ベシクルで投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンを含有する多様なリン脂質から形成することができる。いくつかの実施形態では、脂質の構成成分の薄膜を薬物の水溶液を用いて水和させて、薬物を被包する脂質層を形成する。これは、当業者にはよく知られている。例えば、本明細書に記載する核酸分子を、当技術分野で知られている方法を使用して構築した、親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供することができる。さらに、リポソームは、表面上には、標的化のためにそのような核酸分子を持ち、内部には、細胞の死滅を媒介するための細胞傷害性を示す薬剤を担持することもできる。核酸関連複合体の例が、米国特許第６，０１１，０２０号に提供されている。
また、本発明の医薬品および核酸分子はそれぞれ、標的化を行うことができる薬物担体としての可溶性ポリマーと結合させることもできる。そのようなポリマーとして、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メチルアクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌａｓｐａｎａｍｉｄｅｐｈｅｎｏｌ）、またはパルミトイル残基で置換されているポリエチレンオキシドポリリジンを挙げることができる。さらに、本発明の医薬品および核酸分子はそれぞれ、薬物の制御された放出を達成する場合に有用な種類の生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋結合性または両親媒性のブロックコポリマーに結合させることもできる。
また所望により、投与すべき医薬組成物および医薬品はそれぞれ、微量の無毒性の補足的な物質、例として湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ならびにその他の物質、例えば、酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミン等を含有することもできる。
本発明の核酸分子および医薬品をそれぞれ活用する投与計画は、患者の型、種、年齢、体重、性別、および医学的状態、治療しようとする状態の重症度、投与経路、患者の腎臓および肝臓の機能、ならびに利用する特定のアプタマーまたはその塩を含めた、多様な要因に従って選択される。通常の技術を有する内科医または獣医であれば、状態の進行を予防するため、無効にするため、または静止させるために必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。
本発明による核酸の有効な血漿レベルは、好ましくは、本明細書に開示する疾患のいずれかの治療の場合には、５００ｆＭ〜５００μＭの範囲である。
本発明の核酸分子および医薬品はそれぞれ、好ましくは、１日１回の用量で、２日もしくは３日に１回、毎週、２週に１回、月１回の用量で、または３ヵ月に１回投与することができる。
本明細書に記載する医薬品が本明細書に開示する医薬組成物を構成することは本発明の範囲に含まれる。
さらなる態様では、本発明は、そのような治療を必要とする対象を治療するための方法に関し、この方法は、本発明による核酸のうちの少なくとも１つを薬学的に活性な量で投与するステップを含む。ある実施形態では、対象は、ある疾患に罹患しているかそのような疾患を発症するリスクを有し、疾患は、本明細書に開示する疾患のいずれかであり、特に、医薬品を製造するための本発明による核酸のいずれかの使用に関連して開示する疾患のうちのいずれかである。
本発明による核酸およびアンタゴニストは、医薬品として、もしくは医薬品を製造するためのみならず、美容上の目的でも、特に皮膚病変の炎症領域におけるＣ５ａの関与に関して使用することができることを理解されたい。したがって、治療または予防のために本発明による核酸、医薬品、および／または医薬組成物を使用することができる、さらなる状態または疾患は、皮膚病変の炎症領域である。
好ましくは、本明細書で使用する場合、診断器具または診断薬または診断手段は、Ｃ５ａ、好ましくは本明細書に記載するＣ５ａ、およびより好ましくは本明細書に記載する種々の障害および疾患に関連して本明細書に記載するＣ５ａを直接的にまたは間接的にのいずれかで検出するために適している。診断器具は、本明細書に記載する障害および疾患のいずれかをそれぞれ検出および／または追跡するために適している。そのような検出は、本発明による核酸のＣ５ａへの結合を通して可能である。そのような結合は、直接的にかまたは間接的にのいずれかで検出することができる。それぞれの方法および手段が当業者には知られている。とりわけ、本発明による核酸は、本発明による核酸、好ましくはＣ５ａに結合した核酸の検出を可能にする標識を含むことができる。そのような標識は、好ましくは、放射性標識、酵素標識、および蛍光標識を含む群から選択される。原則として、本発明による核酸について、抗体について開発されている全ての既知のアッセイを採用することができ、標的結合性抗体が、標的結合性核酸に置換される。未標識の標的結合性抗体を使用する抗体アッセイの場合、検出は、好ましくは、放射性標識、酵素標識および蛍光標識を用いて改変され、標的結合性抗体にそのＦｃ断片において結合する第２の抗体によって行われる。核酸、好ましくは本発明による核酸の場合、核酸をそのような標識を用いて改変し、好ましくは、そのような標識は、ビオチン、Ｃｙ−３、およびＣｙ−５を含む群から選択され、そのような標識は、そのような標識に対して作られた抗体、例えば、抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ−３抗体、もしくは抗Ｃｙ−５抗体によって検出されるか、または標識がビオチンである場合には、標識は、ビオチンに自然に結合するストレプトアビジンもしくはアビジンによって検出される。この場合、そのような抗体、ストレプトアビジン、またはアビジンは、好ましくは、（第２の抗体と同様に）それぞれの標識、例えば、放射性標識、酵素標識、または蛍光標識を用いて改変されている。
さらなる実施形態では、本発明による核酸分子を、第２の検出手段によって検出または解析し、前記検出手段は、分子ビーコンである。分子ビーコンの方法は、当業者には知られている。簡潔にいうと、分子ビーコンとも呼ばれている核酸プローブが、検出しようとする核酸試料に対する逆向きの相補体であり、このために、検出しようとする核酸試料の一部にハイブリダイズする。核酸試料に結合すると、分子ビーコンのフルオロフォア基が分離し、その結果、蛍光シグナルの変化、好ましくは強度の変化が生じる。この変化は、存在する核酸試料の量と相関する。
本発明による核酸を使用するＣ５ａの検出によって、特に、本明細書で定義するＣ５ａの検出が可能となることを認識するであろう。
Ｃ５ａの検出に関連して、好ましい方法は、
（ａ）Ｃ５ａの存在について試験しようとする試料を用意するステップと、
（ｂ）本発明による核酸を用意するステップと、
（ｃ）試料を核酸と、好ましくは反応槽中で反応させるステップと
を含み、ステップ（ａ）をステップ（ｂ）の前に実施してもよく、または（ｂ）をステップ（ａ）の前に実施してもよい。
好ましい実施形態では、試料の核酸との反応を検出することからなる、さらなるステップｄ）を提供する。好ましくは、ステップｂ）の核酸は、表面に固定化されている。表面は、反応チューブ、プレートのウエル等の反応槽の表面であっても、またはそのような反応槽中に収容されている装置、例えば、ビーズ等の表面であってもよい。核酸の表面への固定化は、これらに限定されないが、非共有結合性または共有結合性の連結を含めた、当業者に既知の任意の手段によって行うことができる。好ましくは、連結は、表面と核酸との間の共有結合性の化学結合を介して確立される。しかしまた、核酸が表面に間接的に固定化され、そのような間接的な固定化には、さらなる構成成分または一対の相互作用のパートナーの使用が関与することも本発明の範囲に含まれる。そのようなさらなる構成成分は、好ましくは、固定化しようとする核酸と特異的に相互作用し、したがって、核酸が表面へ付着することを媒介する、相互作用のパートナーとも呼ばれる化合物である。相互作用のパートナーは、好ましくは、核酸、ポリペプチド、タンパク質、および抗体を含む群から選択される。好ましくは、相互作用のパートナーは、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。あるいは、相互作用のパートナーは、核酸、好ましくは機能性の核酸である。より好ましくは、そのような機能性の核酸は、アプタマー、スピーゲルマー、および当該核酸に対して少なくとも部分的に相補性を示す核酸を含む群から選択される。さらなる代替の実施形態では、核酸の表面への結合は、分節の相互作用のパートナーによって媒介される。そのような分節の相互作用のパートナーは、好ましくは、一対の相互作用のパートナー、または第１のメンバーと第２のメンバーとからなる相互作用のパートナーであり、第１のメンバーは、核酸によって構成されているかまたは核酸に付着しており、第２のメンバーは、表面に付着しているかまたは表面によって構成されている。分節の相互作用のパートナーは、好ましくは、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、およびビオチンとニュートラアビジンを含む相互作用のパートナーの対の群から選択される。好ましくは、相互作用のパートナーの対の第１のメンバーは、ビオチンである。
そのような方法の好ましい結果が、Ｃ５ａと核酸との固定化された複合体の形成であり、より好ましくは、前記複合体が検出される。複合体から、Ｃ５ａが検出されることは、ある実施形態の範囲に含まれる。
この要件に従うそれぞれの検出手段は、例えば、Ｃ５ａの（１つまたは複数の）部分に対して特異的である任意の検出手段である。特に好ましい検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む群から選択される検出手段であり、これらの生成は当業者に知られている。
また、Ｃ５ａを検出する方法は、好ましくはステップｃ）を実施するために使用された反応槽から、試料を取り出すステップも含む。
また、さらなる実施形態では、この方法は、Ｃ５ａの相互作用のパートナーを表面、好ましくは上記で定義した表面上に固定化するステップも含み、相互作用のパートナーは、本明細書に従って定義され、好ましくは、それぞれの方法に関連して上記した通りであり、より好ましくは、種々の実施形態における核酸、ポリペプチド、タンパク質、および抗体を含む。この実施形態では、特に好ましい検出手段は、本発明による核酸であり、そのような核酸は、好ましくは、標識しても標識しなくてもよい。そのような核酸が標識されている場合、核酸は直接的または間接的に検出することができる。また、そのような検出には、第２の検出手段の使用が関与してよく、第２の検出手段もまた、好ましくは、本明細書に記載する種々の実施形態における核酸、ポリペプチド、タンパク質および実施形態を含む群から選択される。そのような検出手段は、好ましくは、本発明による核酸に対して特異的である。より好ましい実施形態では、第２の検出手段は、分子ビーコンである。好ましい実施形態では、核酸もしくは第２の検出手段のいずれか、または両方が、検出標識を含むことができる。検出標識は、好ましくは、ビオチン、ブロモ−デオキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射標識、およびキレート分子を含む群から選択される。あるいは、第２の検出手段が、好ましくは、核酸に含有されている、核酸によって構成されている、または核酸に付着している検出標識と相互作用する。特に好ましいのは、以下の組合せである。
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がビオチンに対する抗体であるか、または
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がアビジンもしくはアビジン担持分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がストレプトアビジンもしくはストレプトアビジン担持分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、第２の検出手段がニュートラアビジンもしくはニュートラアビジン担持分子であるか、または
検出標識がブロモ−デオキシウリジンであり、第２の検出手段がブロモ−デオキシウリジンに対する抗体であるか、または
検出標識がジゴキシゲニンであり、第２の検出手段がジゴキシゲニンに対する抗体であるか、または
検出標識がキレート剤であり、第２の検出手段が放射性核種であり、前記検出標識が核酸につながっていることが好ましい。また、この種類の組合せは、核酸が表面につながっている実施形態にも適用可能であることを認識されたい。そのような実施形態では、検出標識が相互作用のパートナーにつながっていることが好ましい。
最後に、第２の検出手段が第３の検出手段を使用して検出され、好ましくは、第３の検出手段は、酵素であり、より好ましくは、第２の検出手段の検出時には酵素反応を示すか、または第３の検出手段は、放射線、より好ましくは、放射性核種から放射された放射線を検出するための手段であることも本発明の範囲に含まれる。好ましくは、第３の検出手段は、第２の検出手段を特異的に検出し、かつ／または第２の検出手段と相互作用する。
また、Ｃ５ａの相互作用のパートナーが表面上に固定化されている実施形態においては、本発明による核酸を、好ましくは、相互作用のパートナーとＣ５ａとの間に形成された複合体に添加し、試料を、反応から、より好ましくは、ステップｃ）および／またはステップｄ）が実施される反応槽から取り出すことができる。
ある実施形態では、本発明による核酸は、蛍光部分を含み、蛍光部分の蛍光が、核酸とＣ５ａとの間での複合体形成時には、遊離のＣ５ａとは異なる。
さらなる実施形態では、核酸が本発明による核酸の誘導体であり、核酸の誘導体は、アデノシンに置き換わっている少なくとも１つのアデノシン蛍光誘導体を含む。好ましい実施形態では、アデノシン蛍光誘導体は、エテノアデノシンである。
さらなる実施形態では、本発明による核酸の誘導体およびＣ５ａからなる複合体を、蛍光を使用して検出する。
方法のある実施形態では、シグナルが、ステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）において生み出され、好ましくは、シグナルは、試料中のＣ５ａ濃度と相関する。
好ましい態様では、アッセイを、９６ウエルプレート中で実施することができ、構成成分が、上記に記載するように、反応槽中に固定化されており、ウエルが反応槽として働く。
本発明の核酸は、薬物設計のための出発材料としてもさらに使用することができる。基本的には、２つの可能なアプローチがある。１つのアプローチは、化合物ライブラリーのスクリーニングであり、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは低分子量化合物ライブラリーである。ある実施形態では、スクリーニングは、高スループットスクリーニングである。好ましくは、高スループットスクリーニングは、標的に基づいたアッセイにおいての、化合物の迅速、効率的な試行錯誤評価である。最良の場合には、解析を比色分析測定によって実施する。それに関連して使用するライブラリーが当業者に知られている。
あるいは、本発明による核酸は、理論的薬物設計ために使用することができる。好ましくは、理論的薬物設計は、薬学的なリード構造の設計である。典型的にはＸ線結晶解析または核磁気共鳴分光法等の方法によって同定される標的の三次元構造から出発して、コンピュータプログラムを使用して、多くの異なる化合物の構造を含有するデータベースをくまなく検索する。選択はコンピュータによって行われ、それに続いて、同定された化合物を実験室で試験することができる。
理論的薬物設計は、本発明による核酸のいずれかから出発することができ、本発明の核酸の構造に類似するか、または本発明の核酸の構造の結合媒介部分と同一である構造、好ましくは、三次元構造に関する。いずれの場合も、そのような構造は、本発明の核酸と同じかまたはそれに類似する結合の特徴を依然として示す。理論的薬物設計において、さらなるステップまたは代替のステップとしてのいずれかにおいて、好ましくは、神経伝達物質に結合する核酸の部分の三次元構造が、ヌクレオチドとも核酸とも異なる化学基によって模倣される。この模倣によって、核酸とは異なる化合物を設計することができる。そのような化合物は、好ましくは、小型分子またはペプチドである。
化合物ライブラリーをスクリーニングする場合、当業者に知られている競合アッセイを使用すること等によって、適切なＣ５ａ類似体、Ｃ５ａアゴニスト、またはＣ５ａアンタゴニストを見出すことができる。そのような競合アッセイは、以下のように組み立てることができる。本発明の核酸、好ましくは、標的結合性Ｌ−核酸であるスピーゲルマーを、固相に結合させる。Ｃ５ａ類似体を同定するために、標識したＣ５ａをアッセイに添加することができる。見込みのある類似体であれば、スピーゲルマーに結合するＣ５ａ分子と競合し、これには、それぞれの標識によって得られるシグナルの減少が伴う。アゴニストまたはアンタゴニストについてのスクリーニングには、当業者には知られている細胞培養アッセイの使用が関与することができる。
本発明によるキットは、本発明の核酸の少なくとも１つまたはいくつかを含むことができる。さらに、キットは、少なくとも１つまたはいくつかの陽性または陰性の対照を含むこともできる。陽性対照は、例えば、Ｃ５ａ、特に、それに対して本発明の核酸が選択されるか、またはそれに本発明の核酸が結合する、好ましくは、液体の形態をとるＣ５ａであってよい。陰性対照は、例えば、生物物理学的特性の観点からＣ５ａに類似すると定義されるが、本発明の核酸としては認められないペプチドであってよい。さらに、前記キットは、１つまたはいくつかの緩衝剤も含むことができる。キット中には、種々の成分を、乾燥もしくは凍結乾燥させた形態で、または液体中に溶解させて含有することができる。キットは、１つまたはいくつかの容器を含むことができ、これは、この場合、キットの１つまたはいくつかの成分を含有することができる。さらなる実施形態では、キットは、キットの使用方法およびその種々の成分についての情報を使用者に提供する指示または指示書を含む。
本発明による核酸の薬学的決定および生物分析決定は、基本的に、ヒトおよび非ヒトの体のいくつかの体液、組織、および臓器において、その薬物動態および生物力学のプロファイルを判定するためである。そのような目的では、本明細書に開示する検出方法または当業者に知られている検出方法のいずれかを使用することができる。本発明のさらなる態様では、本発明による核酸を検出するために、サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを提供する。検出アッセイ内部では、捕捉プローブおよび検出プローブを使用する。捕捉プローブは、本発明による核酸の第１の部分に対して相補性を示し、検出プローブは、第２の部分に対して相補性を示す。捕捉プローブおよび検出プローブの両方を、ＤＮＡヌクレオチド、改変したＤＮＡヌクレオチド、改変したＲＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、および／またはＰＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
したがって、捕捉プローブは、本発明による核酸の５’末端に対して相補性を示す配列ストレッチを含み、検出プローブは、本発明による核酸の３’末端に対して相補性を示す配列ストレッチを含む。この場合、捕捉プローブは、表面またはマトリックスに５’末端を介して固定化されており、捕捉プローブは、その５’末端において直接的に、またはその５’末端と表面もしくはマトリックスとの間のリンカーを介して固定化することができる。しかし原則として、リンカーは、捕捉プローブの各ヌクレオチドに連結することができる。リンカーは、当業者の親水性リンカーによって、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、改変したＤ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、改変したＤ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、改変したＬ−ＲＮＡヌクレオチド、改変したＬ−ＤＮＡヌクレオチド、および／もしくはＬ−ＬＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
あるいは、捕捉プローブは、本発明による核酸の３’末端に対して相補性を示す配列ストレッチを含み、検出プローブは、本発明による核酸の５’末端に対して相補性を示す配列ストレッチを含む。この場合、捕捉プローブは、表面またはマトリックスに３’末端を介して固定化されており、捕捉プローブは、その３’末端において直接的に、またはその３’末端と表面もしくはマトリックスとの間のリンカーを介して固定化することができる。しかし原則として、リンカーは、本発明による核酸に対して相補性を示す配列ストレッチの各ヌクレオチドに連結することができる。リンカーは、当業者の親水性リンカーによって、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、改変したＤ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、改変したＤ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、改変したＬ−ＲＮＡヌクレオチド、改変したＬ−ＤＮＡヌクレオチド、および／もしくはＬ−ＬＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
本発明による核酸にハイブリダイズすることができる捕捉プローブおよび検出プローブのヌクレオチドの数は可変であり、捕捉プローブおよび／もしくは検出プローブのヌクレオチドの数、ならびに／または本発明による核酸自体に依存してよい。本発明による核酸にハイブリダイズすることができる捕捉プローブと検出プローブとのヌクレオチドの総数は、最高でも本発明による核酸によって構成されるヌクレオチドの数でなければならない。検出プローブおよび捕捉プローブのヌクレオチドの最低数（２〜１０個のヌクレオチド）によっても、本発明による核酸の５’末端または３’末端にそれぞれハイブリダイゼーションが可能とならなければならない。本発明による核酸と解析する試料中に存在するその他の核酸との間で、高い特異性および選択性を実現するためには、捕捉プローブと検出プローブとのヌクレオチドの総数は、本発明による核酸によって構成されるヌクレオチドの数、または最高数でなければならない。
さらに、検出プローブは、好ましくは、先の本明細書の記載に従って検出することができるマーカー分子または標識を担持する。標識またはマーカー分子は原則として、検出プローブの各ヌクレオチドに連結することができる。好ましくは、標識またはマーカーは、検出プローブの５’末端または３’末端に位置し、本発明による核酸に対して相補性を示す検出プローブ内のヌクレオチドと標識との間には、リンカーを挿入することができる。リンカーは、当業者の親水性リンカーによってか、またはＤ−ＤＮＡヌクレオチド、改変したＤ−ＤＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＲＮＡヌクレオチド、改変したＤ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｄ−ＬＮＡヌクレオチド、ＰＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＲＮＡヌクレオチド、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、改変したＬ−ＲＮＡヌクレオチド、改変したＬ−ＤＮＡヌクレオチド、および／もしくはＬ−ＬＮＡヌクレオチドによって形成することができる。
本発明による核酸の検出を、以下に従って実施することができる。本発明による核酸を、その一方の末端で捕捉プローブに、他方の末端で検出プローブにハイブリダイズさせる。その後、未結合の検出プローブを、例えば、１回または複数回の洗浄ステップによって除去する。それに続いて、好ましくは標識またはマーカー分子を担持する結合された検出プローブの量を、例えば、参照より本明細書に組み込まれているＷＯ／２００８／０５２７７４のより詳細な概説に従って測定することができる。
好ましくは、本明細書で使用する場合、治療という用語は、好ましい実施形態では、追加または代替の予防および／または追跡を含む。
好ましくは、本明細書で使用する場合、疾患および障害という用語は、別段の記載がない限り、互換的に使用するものとする。
本明細書で使用する場合、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、好ましくは、そのような用語に続くかまたはそれが説明する事項を制限しないものとする。しかし、代替の実施形態では、この用語は、含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）を意味し、したがって、そのような用語に続くかまたはそれが説明する事項を制限するものと理解されたい。
本発明による核酸分子および本明細書で使用する標的分子であるＣ５ａの種々の配列番号、化学的性質、それらの実際の配列、および内部参照番号を、以下の表に要約する。
Figure 0005798320
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さらなる特徴、実施形態、および利点を示すことができる図、実施例、および配列表によって、本発明をさらに例示する。
ヒトＣ５ａに結合する、ＲＮＡリガンド１７２−Ｄ７−０００およびＲＮＡリガンド１７２−Ｄ７−０００の誘導体の配列アラインメントを示す図であり、これは、好ましい実施形態では、その全体が、ヒトＣ５ａに結合するために不可欠である配列モチーフ（「Ａ型」）を示す。 ＲＮＡリガンド１７２−Ｄ７−０００のさらなる誘導体を示す図である（配列モチーフ「Ａ型」のヒトＣ５ａ ＲＮＡリガンド）。 ヒトＣ５ａに結合する、関連のＲＮＡリガンドの配列アラインメントを示す図であり、これは、好ましい実施形態では、その全体が、ヒトＣ５ａに結合するために不可欠である配列モチーフ（「Ｂ型」）を示す。 ＲＮＡリガンド１７９−Ａ３の誘導体を示す図である（配列モチーフ「Ｂ型」のヒトＣ５ａ ＲＮＡリガンド）。 ＲＮＡリガンド１７９−Ａ３のさらなる誘導体を示す図である（配列モチーフ「Ｂ型」のヒトＣ５ａ ＲＮＡリガンド）。 ヒトＣ５ａに結合する、関連のＲＮＡリガンドの配列アラインメントを示す図であり、これは、好ましい実施形態では、その全体が、ヒトＣ５ａに結合するために不可欠である配列モチーフ（「Ｃ型」）を示す。 ＲＮＡリガンド１８５−Ｈ３−００１および１８５−Ｂ４の誘導体を示す図である（配列モチーフ「Ｃ型」のヒトＣ５ａ ＲＮＡリガンド）。 ヒトＣ５ａに結合する、関連のＲＮＡリガンドの配列アラインメントを示す図であり、これは、好ましい実施形態では、その全体が、ヒトＣ５ａに結合するために不可欠である配列モチーフ（「Ｄ型」）を示す。 Ｃ５ａに結合する配列モチーフ「Ａ型」、「Ｂ型」、「Ｃ型」および「Ｄ型」に関係付けることができない、ヒトＣ５ａに結合するいくつかの異なるＲＮＡリガンドの配列の表を示す図である。 ３７°ＣにおけるＣ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００および１７２−Ｄ７−０１３のアプタマーの、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａへの結合解析の結果を示す図である。ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの濃度に対するアプタマーの結合として示す。 カルシウム放出アッセイにおけるスピーゲルマー１７２−Ｄ７−０１３−５’−ＰＥＧの有効性を示す図である。種々の量のスピーゲルマー１７２−Ｄ７−０１３−５’−ＰＥＧと共に３７°Ｃでプレインキュベートした３ｎＭのヒトＣ５を用いて、細胞を刺激した。１７２−Ｄ７−０１３−５’−ＰＥＧの濃度に対する、対照のパーセントとして示す。 ３７°ＣにおけるＣ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３のアプタマーの、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａへの結合解析の結果を示す図である。ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの濃度に対するアプタマーの結合として示す。 走化性アッセイにおけるスピーゲルマー１７９−Ａ３の有効性を示す図である。種々の量のスピーゲルマー１７９−Ａ３と共に３７°Ｃでプレインキュベートした０．１ｎＭのヒトＣ５ａに向けて、細胞を遊走させた。スピーゲルマー１７９−Ａ３の濃度に対する、対照のパーセントとして示す。 走化性アッセイにおけるスピーゲルマー１７９−Ａ３−０１４−５’−ＰＥＧの有効性を示す図である。種々の量のスピーゲルマー１７９−Ａ３−０１４−５’−ＰＥＧと共に３７°Ｃでプレインキュベートした０．１ｎＭのヒトＣ５ａに向けて、細胞を遊走させた。スピーゲルマー１７９−Ａ３−０１４−５’−ＰＥＧの濃度に対する、対照のパーセントとして示す。 ３７°ＣにおけるＣ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１のアプタマーの、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａへの結合解析の結果を示す図である。ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの濃度に対するアプタマーの結合として示す。 ３７°ＣにおけるＣ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−０１４のアプタマーの、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａへの結合解析の結果を示す図である。ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの濃度に対するアプタマーの結合として示す。 走化性アッセイにおけるスピーゲルマー１８５−Ｈ３−００１−５’−ＰＥＧおよび１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧの有効性を示す図である。種々の量のスピーゲルマー１８５−Ｈ３−００１−５’−ＰＥＧおよび１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧと共に３７°Ｃでプレインキュベートした０．１ｎＭのヒトＣ５ａに向けて、細胞を遊走させた。スピーゲルマー１８５−Ｈ３−００１−５’−ＰＥＧおよび１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧの濃度に対する、対照のパーセントとして示す。 ３７°ＣにおけるＣ５ａ結合性核酸１８２−Ｅ５のアプタマーの、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａへの結合解析の結果を示す図である。ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの濃度に対するアプタマーの結合として示す。 走化性アッセイにおけるスピーゲルマー１８２−Ｅ５の有効性を示す図である。種々の量のスピーゲルマー１８２−Ｅ５と共に３７°Ｃでプレインキュベートした０．１ｎＭのヒトＣ５ａに向けて、細胞を遊走させた。スピーゲルマー１８２−Ｅ５の濃度に対する、対照のパーセントとして示す。 ３７°Ｃにおける、Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０１３、１７９−Ａ３−０１４および１８５−Ｈ３−０１４のスピーゲルマー（これらは、スピーゲルマーの５’末端においてＤ−立体配置で２つの追加のＤ−グアノシンを有するように改変されており、それにより、キナーゼを使用して５’末端を放射標識した）の、ヒトＬ−Ｃ５への結合解析の結果を示す図である。ヒトＬ−Ｃ５の濃度に対するスピーゲルマーの結合として示す。 スナネズミにおけるＣ５ａが誘発した好中球減少の阻害を示す図である。スナネズミにおける、試験物質（スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧまたは逆スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−逆−５’−ＰＥＧ）、およびビヒクルをそれぞれ適用してから、Ｃ５ａを注入した後の好中球含有量を時間に対して示す。試験物質（スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧもしくは逆スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−逆−５’−ＰＥＧ）、またはビヒクルを、ｔ＝−１０分において、表示した用量でｉ．ｖ．注射した。１００μｇ／ｋｇ ｒｅｃ．ヒトＣ５ａ（ｉ．ｖ．）を使用して好中球減少を誘発する直前に、血液を採集した。Ｃ５ａ注入後３分および５分それぞれにおいて、血液をさらに採集した。 走化性アッセイにおけるスピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧ、１７９−Ａ３−０１４−５’−ＰＥＧ、および１８５−Ｈ３−００１の有効性を示す図である。種々の量のスピーゲルマーと共に３７°Ｃでプレインキュベートした０．１ｎＭのヒトＣ５ａまたは０．８ｎＭのサルＣ５ａに向けて、細胞を遊走させた。スピーゲルマーの濃度に対する、対照のパーセントとして示す。
［ヒトＣ５に結合する核酸］
ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを標的として使用して、ヒトＣ５ａに結合するいくつかの核酸を生成することができた。それらのヌクレオチド配列を、図１〜９に示す。核酸を、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた競合的もしくは直接的なプルダウンアッセイ（実施例３）を使用するアプタマー、すなわち、Ｄ−核酸のレベルで特徴付けるか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養Ｃａ２＋放出アッセイ（実施例４）もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ走化性アッセイ（実施例５）によるスピーゲルマーレベル、すなわち、ヒトＣ５ａの天然の立体配置（ヒトＬ−Ｃ５ａ）を有するＬ−核酸で特徴付けた。スピーゲルマーおよびアプタマーを、実施例２に記載するように合成した。
こうして生成した核酸分子は、異なる配列モチーフを示し、４つの主要な型を、図１および２（Ａ型）、図３〜５（Ｂ型）、図６および７（Ｃ型）、ならびに図８（Ｄ型）に示すように同定および定義した。相互にも、本明細書に記載する異なる配列モチーフにも関係付けることができない、追加のＣ５ａ結合性核酸を、図９中に列挙する。ヌクレオチド配列モチーフを定義するために、多義性ヌクレオチドについてのＩＵＰＡＣの略語を使用する。
Ｓ 強い ＧまたはＣ、
Ｗ 弱い ＡまたはＵ、
Ｒ プリン ＧまたはＡ、
Ｙ ピリミジン ＣまたはＵ、
Ｋ ケト ＧまたはＵ、
Ｍ イミノ ＡまたはＣ、
Ｂ Ａでない ＣまたはＵまたはＧ、
Ｄ Ｃでない ＡまたはＧまたはＵ、
Ｈ Ｇでない ＡまたはＣまたはＵ、
Ｖ Ｕでない ＡまたはＣまたはＧ、
Ｎ 全て ＡまたはＧまたはＣまたはＵ
別段の記載がない限り、核酸配列またはストレッチおよびボックスの配列それぞれをいずれも５’−＞３’方向に示す。
１．１ Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸
図１および図２に示すように、Ａ型のＣ５ａ結合性核酸の配列は全て、潜在的なＣ５ａ結合モチーフを定義する、１つの中心配列のストレッチまたはボックスを含み、これには、相互にハイブリダイズすることができる５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチが隣接する。中心配列ストレッチ内部でも、いくつかのヌクレオチドが相互にハイブリダイズすることができる。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、必ずしも分子内で生じるとは限らない。さらに、中心配列ストレッチの単一の位置において、ヌクレオチドの１つまたは複数を、親水性スペーサー、例えば、Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーによって置き換えることもできる。
Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸に関しては、用語「５’末端のストレッチ」と「第１のストレッチ」、「中心配列」と「第２のストレッチ」、および「３’末端のストレッチ」と「第３のストレッチ」をそれぞれ、本明細書では、別段の記載がない限り、同義として使用することは本発明の範囲に含まれる。
核酸を、それらの結合挙動に関してランク付けするために、アプタマーのレベルで、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた直接的および競合的なプルダウン結合アッセイを使用して特徴付けた（実施例３）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例２）、細胞培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａ２＋アッセイ（実施例４）または走化性アッセイ（実施例５）において、ヒトＣ５ａの天然の立体配置（ヒトＬ−Ｃ５ａ）を使用して試験した。
定義したボックスまたはストレッチの配列が、Ａ型のＣ５ａ結合性核酸間で異なる場合があり、このことは、ヒトＣ５ａに対する結合親和性に影響を及ぼす。Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸として要約した、異なるＣ５ａ結合性核酸の結合解析に基づくと、以下に記載する中心ボックスおよびそのヌクレオチド配列が個々に、より好ましくはそれらの全体が、ヒトＣ５ａへの結合のために不可欠である。
Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の全ての同定した配列の中心ボックスが、中心配列
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 を共有し、中心配列ストレッチ内部では、いくつかのヌクレオチド（太字かつ斜体で示した文字）が相互にハイブリダイズすることができ、中心配列ストレッチの単一の位置においては、ヌクレオチドの１つまたは複数を、親水性スペーサー、例えば、Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーによって置き換えることができる。
相互にハイブリダイズすることができる、中心配列ストレッチ内部のヌクレオチドは、それぞれ３個のヌクレオチドの２つのサブストレッチであり、第１のサブストレッチが、１６〜１８位において当該ヌクレオチドを含み、第２のサブストレッチが２３〜２５位において当該ヌクレオチドを含む。第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチの３個のヌクレオチドの配列は独立に、ＣＣＣまたはＧＧＧであり、第１のサブストレッチの配列と第２のサブストレッチの配列とは異なるが、いずれも場合も、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとは相互に相補性を示す。
全てのＡ型Ｃ５ａ結合性核酸の起源は、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００であり、いくつかの異なるアッセイにおいて、ヒトＣ５ａに対するその結合親和性を特徴付けた。平衡結合定数ＫＤを、プルダウン結合アッセイを使用して決定した（ＫＤ＝３０ｎＭ、図１０）。２〜３ｎＭのＡ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００のＩＣ５０（５０％阻害剤濃度）を、細胞培養Ｃａ２＋放出を使用して測定した。Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００の誘導体を、アプタマーとして、プルダウンアッセイを使用すること（結合定数ＫＤの決定）によって、または競合アッセイを使用することによってＡ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００と比較して解析した。
Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００の５’末端のストレッチの９個のヌクレオチドは、３’末端のストレッチの９個のヌクレオチドそれぞれにハイブリダイズして、９個の塩基対号ヌクレオチドの末端ヘリックスを形成することができる。しかし、５’末端のストレッチの３’末端のヌクレオチド「Ｕ」は、結合活性を低下させることなく、「Ｃ」で置き換えることはできない（１７２−Ｄ７−００３、ＫＤ＝３７２ｎＭ）。最初に示されたように、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００の誘導体１７２−Ｄ７−００１、１７２−Ｄ７−０１０および１７２−Ｄ７−０１１については、Ｃ５ａ結合活性を維持するためには、７個の塩基対のヘリックスであれば十分であるようであった。中心配列ストレッチに、５’末端および３’末端において６個のヌクレオチド（５’末端：「ＧＵＧＣＵＵ」、３’末端：「ＧＡＧＵＡＣ」）のみが隣接し、６個の塩基対でヘリックスを形成する場合には、結合親和性が低下した（１７２−Ｄ７−００２、ＫＤ＝１０８ｎＭ）。驚くべきことに、その後の実験によって、５’末端のストレッチ「ＧＣＧＣＵＵ」と３’末端のストレッチ「ＧＡＧＣＧＣ」とによって形成された６個の塩基対のヘリックスであれば、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の完全に活性な構造を形成するのに十分であることが明らかになった（１７２−Ｄ７−０１２、１７２−Ｄ７−０１３、１７２−Ｄ７−０１４）。５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチを５個のヌクレオチドに減少させると、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の完全に活性な三次元構造の形成に対して負の効果を示す場合がある（１７２−Ｄ７−０１７）。
しかし、全ての試験したＡ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチを組み合わせると、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについての一般式は、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＹＧＣＸ４Ｙ３’（Ａ型式２−５’）となり、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチについての一般式は、５’ＧＸ５ＧＹＲＣＸ６Ｘ７Ｘ８３’（Ａ型式２−３’）となる（式中、Ｘ１はＡもしくは不在であり、Ｘ２はＧもしくは不在であり、Ｘ３はＣもしくは不在であり、Ｘ４はＵであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＧもしくは不在であり、Ｘ７はＣもしくは不在であり、かつＸ８はＵもしくは不在であるか、または
Ｘ１はＡもしくは不在であり、Ｘ２はＧもしくは不在であり、Ｘ３はＣもしくは不在であり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６はＧもしくは不在であり、Ｘ７はＣもしくは不在であり、かつＸ８はＵもしくは不在である）。
上記で言及したように、Ｃ５ａ結合活性を維持するためには、６個または７個の塩基対のヘリックスであれば十分であるようであった。したがって、好ましい５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチは、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについては、一般式５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＧＹＧＣＸ４Ｙ３’（Ａ型式２−５’）によって特定され、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチについての一般式は、５’ＧＸ５ＧＹＲＣＸ６Ｘ７Ｘ８３’（Ａ型式２−３’）である（式中、Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＣまたは不在であり、Ｘ４はＵであり、Ｘ５はＡであり、Ｘ６はＧまたは不在であり、Ｘ７は不在であり、かつＸ８は不在である）。
最も良好な結合親和性は、５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチが、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについての一般式、すなわちＡ型式３−５’（５’Ｘ３ＧＹＧＣＸ４Ｕ３’）、およびＡ型Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチについての一般式、すなわちＡ型式３−３’（５’ＧＸ５ＧＹＧＣＸ６３’）によって特定される場合に達成することができる（式中、Ｘ３はＣまたは不在であり、Ｘ４はＵであり、Ｘ５はＡであり、かつＸ６はＧまたは不在である）。
ヌクレオチドの数を減少させるための別の戦略は、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の中心配列ストレッチ内部のいくつかのヌクレオチドを、Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーによって置き換えることであった。中心配列ストレッチ内部ではそれぞれ、３個のヌクレオチドが相互にハイブリダイズすることができ、ヘリックスを形成する可能性がある。誘導体１７２−Ｄ７−００５、１７２−Ｄ７−００８、１７２−Ｄ７−００９、１７２−Ｄ７−０１３および１７２−Ｄ７−０１４について示すように、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の中心配列ストレッチ中の、ヘリックスが隣接する４個のヌクレオチドは、Ｃ５ａに対する分子の結合親和性を顕著に低下させることなく、Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーによって置き換えることができる。中心配列ストレッチ内部のヘリックスを形成する３個のヌクレオチドから１個を欠失させると、結合親和性の低下が生じた（１７２−Ｄ７−０１８）。Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸の中心ストレッチのその他の配列セグメントの感受性は、上記の置き換えの戦略に関しては、さらにより高い。したがって、この選択肢を決定するために設計した誘導体は、Ｃ５ａに対する結合親和性の低下を示した（１７２−Ｄ７−００４、１７２−Ｄ７−０１５、１７２−Ｄ７−０１６）。
Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０１３のＰＥＧ化誘導体１７２−Ｄ７−０１３−５’−ＰＥＧについて、Ｃａ＋＋放出アッセイにおいて、およそ６．５ｎＭのＩＣ５０を決定した（図１１）。
１．２ Ｂ型Ｃ５ａ合性核酸
図３、図４、および図５に示すように、Ｂ型のＣ５ａ結合性核酸の配列は全て、２つの高度に保存された配列のストレッチまたはボックス、すなわち、ボックスＡおよびボックスＢを含み、これらは、ボックスＬと呼ばれる最大１１個のヌクレオチドのストレッチによって相互に連結されており、これらには、相互にハイブリダイズすることができる５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチが隣接する。ボックスＬ内部でも、いくつかのヌクレオチドが相互にハイブリダイズすることができる。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、必ずしも分子内で生じるとは限らない。さらに、ボックスＬの単一の位置において、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数を、親水性スペーサー、例えば、Ｃ１８−ＰＥＧスペーサーによって置き換えることもできる。
Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸に関しては、用語「５’末端のストレッチ」と「第１のストレッチ」、「ボックスＡ」と「第２のストレッチ」、「ボックスＬ」と第３のストレッチ、「ボックスＢ」と「第４のストレッチ」、および「３’末端のストレッチ」と「第５のストレッチ」をそれぞれ、本明細書では、別段の記載がない限り、同義として使用することは本発明の範囲に含まれる。
核酸を、それらの結合挙動に関してランク付けするために、アプタマーのレベルで、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた直接的および競合的なプルダウン結合アッセイを使用して特徴付けた（実施例３）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例２）、走化性アッセイにおいて、ヒトＣ５ａの天然の立体配置（ヒトＬ−Ｃ５ａ）を使用して試験した（実施例５）。
定義したボックスまたはストレッチの配列が、Ｂ型のＣ５ａ結合性核酸間で異なる場合があり、このことは、ヒトＣ５ａに対する結合親和性に影響を及ぼす。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸として要約した、異なるＣ５ａ結合性核酸の結合解析に基づくと、以下に記載する配列のストレッチまたはボックスおよびそのヌクレオチド配列が個々に、より好ましくはそれらの全体が、ヒトＣ５ａへの結合のために不可欠である。
Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸は、潜在的なＣ５ａ結合モチーフを定義する２つの高度に保存された配列のストレッチ、すなわち、ボックスＡおよびボックスＢを含む。ボックスＡとボックスＢとは、「ボックスＬ」と呼ばれる最大１１個のヌクレオチドによって相互に連結されている。このように連結されている配列ストレッチのボックスＡおよびボックスＢには、相互にハイブリダイズすることができる５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチが隣接する。５’末端のストレッチとボックスＡとの間、および３’末端のストレッチとボックスＢとの間には、ゼロから４個までの追加のヌクレオチドが位置してよい。これらのヌクレオチドは、相互にも、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸分子内部のその他のヌクレオチドにもハイブリダイズしないようである。
Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸の全ての同定した配列のボックスＡが、コンセンサス配列
Figure 0005798320
 を共有する。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸のボックスＢコンセンサス配列は、
Figure 0005798320
 である。異なるＢ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３、１７９−Ｃ１、１７９−Ｄ３、１７９−Ｅ１、１７９−Ａ４、１８２−Ｅ６、１７９−Ｇ１、１８２−Ｄ５、１７９−Ｆ２のヒトＣ５ａに対する結合親和性を決定するために、それらを、アプタマーのレベルで、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた直接的および競合的なプルダウン結合アッセイを使用して試験した（実施例３）。参照として、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００を使用した。（ＫＤ＝３０ｎＭ、ＩＣ５０＝２〜３ｎＭ）。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３、１７９−Ｃ１、１７９−Ｄ３、１７９−Ｅ１、１８２−Ｅ６および１８２−Ｄ５は、ほぼ類似する、ヒトＣ５ａに対する結合親和性を示し、これらの結合親和性は、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００の結合親和性より良好である。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ４、１７９−Ｇ１および１７９−Ｆ２は、Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００に類似するヒトＣ５ａへの結合を示した。ボックスＡの配列については、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ｆ２
Figure 0005798320
 および１７９−Ｇ１
Figure 0005798320
 は、Ｃ５ａに対して最も良好な親和性を示すＢ型Ｃ５ａ結合性核酸、すなわち、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３、１７９−Ｃ１および１７９−Ｄ３とは異なることから、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸についてのボックスＡの好ましいコンセンサス配列は、
Figure 0005798320
 となり、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸についてのボックスＡの好ましいコンセンサス配列は、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３、１７９−Ｃ１、および１７９−Ｄ３のボックスＡ配列に由来する。
Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸のボックスＡおよびボックスＢのヌクレオチドは、配列特異的に相互作用する。ボックスＡの５’末端から２番目のヌクレオチドが「Ｃ」であると、この場合には、ボックスＢ中の対応するヌクレオチドは「Ｇ」である（ボックスＢの３’末端の最後の次のヌクレオチド、１７９−Ａ３および１７９−Ｃ１を参照されたい）。あるいは、ボックスＡの５’末端から２番目のヌクレオチドは「Ｇ」であり、ボックスＢ中の対応するヌクレオチドは「Ｃ」である（ボックスＢの３’末端の最後の次のヌクレオチド、１７９−Ｄ３、１７９−Ｅ１、１７９−Ａ４、１８２−Ｅ６、１７９−Ｇ１、１８２−Ｄ５、１７９−Ｆ２を参照されたい）。さらに、ボックスＡの３’末端の最後の次のヌクレオチドが「Ａ」であると、この場合には、ボックスＢ中の対応するヌクレオチドは「Ｕ」である（ボックスＢの５’末端の２番目のヌクレオチド、１７９−Ａ３、１８２−Ｄ５および１７９−Ｆ２を参照されたい）。あるいは、ボックスＡの３’末端の最後の次のヌクレオチドは「Ｕ」であり、ボックスＢ中の対応するヌクレオチドは「Ａ」である（ボックスＢの５’末端の２番目のヌクレオチド、１７９−Ｃ１、１７９−Ｄ３、１７９−Ｅ１、１７９−Ａ４、１８２−Ｅ６および１７９−Ｇ１を参照されたい）。
ボックスＡの３’末端がボックスＢの５’末端に、「ボックスＬ」と呼ばれる最大１１個のヌクレオチドによって連結されており、ボックスＬの中心ヌクレオチドは相互にハイブリダイズすることはなく、したがって、いわゆる「ループ」構造を形成する。３〜７個までのヌクレオチドが、そのような「ループ」構造を形成することができる。「ループ」構造を形成しない追加のヌクレオチドが、相互に、かつ／またはボックスＡの３’末端およびボックスＢの５’末端それぞれにハイブリダイズする。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸の連結ボックス（ボックスＬ）のそれぞれの配列は、相互に非常に異なり、ヌクレオチドの配列および数は高度に可変である（図３を参照されたい）。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３に基づいて、異なる誘導体を設計し、試験した（図４および５）。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１４について示すように、２個のヌクレオチドを、ヒトＣ５ａに対する結合親和性を何ら低下させることなく欠失させることができた。さらに、ループの一部である３個のヌクレオチドを、Ｃ１８−ＰＥＧ−スペーサーによって置き換えても、分子１７９−Ａ３−０４２は、起源の分子１７９−Ａ３−０１４と同程度に活性であった。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０４２について示すように、ボックスＬは、第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチを含み、第１のサブストレッチと第２のサブストレッチとが相互にハイブリダイズする。ハイブリダイズした場合には、二本鎖構造が形成される。第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチの最低配列は独立に、ＣＣまたはＧＧであり、第１のサブストレッチの配列および第２のサブストレッチの配列は、第１のサブストレッチおよび第２のサブストレッチについては異なる。しかし、これらの結果として、おそらく、ボックスＬのヌクレオチドはヒトＣ５ａへの結合には関与しないが、ボックスＡおよびボックスＢを相互に配置するためには重要であると思われる。
Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸は、５’末端および３’末端それぞれにおいて、４〜８個のヌクレオチドを含み、これらは相互にハイブリダイズして、ヘリックスを形成することができる。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸分子１７９−Ａ３（ＫＤ＝７．２ｎＭ、図１２、ＩＣ５０＝０．９ｎＭ、図１３）をトランケートするために、異なる数のヌクレオチドおよび異なるヌクレオチド配列を有するいくつかの誘導体（１７９−Ａ３−０１４、１７９−Ａ３−００３、１７９−Ａ３−００７、１７９−Ａ３−００８）を、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３に対する競合実験において試験した。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３の５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチとして存在する配列に基づいて、分子の５’末端および３’末端それぞれにおいて、ヌクレオチドを３個にまでトランケートすると、結合親和性の低下が生じた（１７９−Ａ３−００８を参照されたい）。起源の分子であるＢ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３と同一の結合親和性を示す誘導体１７９−Ａ３−０１に基づいて、分子の５’末端および３’末端におけるヘリックス配置をさらに試験した（１７９−Ａ３−０１５、１７９−Ａ３−０２０、１７９−Ａ３−０２１、１７９−Ａ３−０２４、１７９−Ａ３−０２６、１７９−Ａ３−０２９、１７９−Ａ３−０３０、１７９−Ａ３−０３４、１７９−Ａ３−０３７）。Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１４に対する競合実験においては、相互にハイブリダイズする、両端の最低４個のヌクレオチドがＢ型Ｃ５ａ結合性核酸の完全に活性な構造のためには不可欠であることを示すことができた（１７９−Ａ３−０３０、５’末端：ＣＧＣＣ、３’末端：ＧＧＣＧ；１７９−Ａ３−０３４、５’末端：ＣＣＧＧ、３’末端：ＣＣＧＧ）。さらに、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−００７（５’末端：ＧＣＵＧ、３’末端：ＣＡＧＣ）も、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３の完全に活性な誘導体である。
しかし、全ての試験したＢ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチを組み合わせると、（図３、４および５に示すように）Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについての一般式は、５’Ｘ１Ｘ２ＳＢＢＸ３Ｘ４Ｘ５３’（Ｂ型式４−５’）となり、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチについての一般式は、５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＶＳＸ９Ｘ１０３’（Ｂ型式４−３’）となる。
（式中、
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＭであり、Ｘ６はＫであり、Ｘ７はＧであり、Ｘ８はＮであり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、Ｘ７はＧであり、Ｘ８はＮであり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３は不在であり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５はＭであり、Ｘ６はＫであり、Ｘ７はＧであり、Ｘ８は不在であり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５はＭであり、Ｘ６はＫであり、Ｘ７は不在であり、Ｘ８はＮであり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、Ｘ７は不在であり、Ｘ８はＮであり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３は不在であり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５はＭであり、Ｘ６はＫであり、Ｘ７は不在であり、Ｘ８は不在であり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３は不在であり、Ｘ４はＹであり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、Ｘ７はＧであり、Ｘ８は不在であり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＵもしくは不在であり、Ｘ３は不在であり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、Ｘ７は不在であり、Ｘ８は不在であり、Ｘ９はＡもしくは不在であり、かつＸ１０はＣもしくは不在である。）
上記で言及したように、Ｃ５ａ結合活性を維持するためには、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３およびその誘導体について示すように、４〜６個の塩基対のヘリックスであれば十分であるようであった。したがって、好ましい５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチは、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについては、一般式５’Ｘ１Ｘ２ＳＳＢＸ３Ｘ４Ｘ５３’（Ｂ型式７−５’）、およびＢ型Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチについては、一般式５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＳＳＸ９Ｘ１０３’（Ｂ型式７−３’）によって特定することができる（式中、Ｘ１はＧまたは不在であり、Ｘ２はＵまたは不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、Ｘ７は不在であり、Ｘ８はＳであり、Ｘ９はＡまたは不在であり、かつＸ１０はＣまたは不在であり、好ましくは、Ｘ１は不在であり、Ｘ２は不在であり、Ｘ３はＳであり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６は不在であり、Ｘ７は不在であり、Ｘ８はＳであり、Ｘ９は不在であり、かつＸ１０は不在である）。
４個のヌクレオチドを有する５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチを含むＢ型Ｃ５ａ結合性核酸の最も良好な結合親和性が、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０３０（５’末端：ＣＧＣＣ、３’末端：ＧＧＣＧ）、１７９−Ａ３−０３４（５’末端：ＣＣＧＧ、３’末端：ＣＣＧＧ）、および１７９−Ａ３−００７（５’末端：ＧＣＵＧ、３’末端：ＣＡＧＣ）の場合に示される。
しかし、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ｃ１およびその潜在的な誘導体は、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについては、一般式５’Ｘ１Ｘ２ＧＣＹＸ３Ｘ４Ｘ５３’（Ｂ型式５−５’）によって特定することができ、Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチＢ型についての一般式は、５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＡＧＣＸ９Ｘ１０３’（Ｂ型式５−３’）である（式中、Ｘ１はＧまたは不在であり，Ｘ２はＵまたは不在であり，Ｘ３はＧであり，Ｘ４はＣであり，Ｘ５は不在であり，Ｘ６は不在であり，Ｘ７はＧであり，Ｘ８はＣであり，Ｘ９はＡまたは不在であり、かつＸ１０はＣまたは不在である）。
さらに、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ｄ３およびその潜在的な誘導体は、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについては、一般式５’Ｘ１Ｘ２ＧＣＣＸ３Ｘ４Ｘ５３’（Ｂ型式６−５’）によって特定することができ、Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチＢ型についての一般式は、５’Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＡＧＣＸ９Ｘ１０３’（Ｂ型式５−３’）であり、Ｘ１はＧまたは不在である（式中、Ｘ２はＵまたは不在であり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４はＣであり、Ｘ５はＣであり、Ｘ６はＧであり、Ｘ７はＧであり、Ｘ８はＣであり、Ｘ９はＡまたは不在であり、かつＸ１０はＣまたは不在である）。
５’末端のヘリックス形成配列ストレッチの３’末端は、ボックスＡの５’末端に、０〜４個のヌクレオチドによって連結されており、これらの１〜５個のヌクレオチドは、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸分子内部のその他のヌクレオチドにハイブリダイズすることはない。さらに、ボックスＢの３’末端は、３’末端のヘリックス形成配列ストレッチの５’末端に、０個または１個のヌクレオチドによって連結されており、これらの１個または２個のヌクレオチドは、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸分子内部のその他のヌクレオチドにハイブリダイズすることはない。これらのハイブリダイズしないボックスＡの５’末端の５’ヌクレオチドおよびボックスＢの３’末端の３’ヌクレオチドは、好ましくは、存在しないか、または「Ａ」および「Ｇ」であるかのいずれかである（これは、図３〜５に列挙するようにＢ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ｇ１以外の全てのＢ型Ｃ５ａ結合性核酸についていえる）。
Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１４、１７９−Ａ３−０１４−５’−ＰＥＧのＰＥＧ化誘導体について、ＴＡＸアッセイにおいて、およそ１．８ｎＭのＩＣ５０を決定した（図１４）。
１．３ Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸
図６および図７に示すように、Ｃ型のＣ５ａ結合性核酸の配列は全て、潜在的なＣ５ａ結合モチーフを定義する、１つの中心配列のストレッチまたはボックスを含み、これには、相互にハイブリダイズすることができる５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチが隣接する。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、必ずしも分子内で生じるとは限らない。
Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸に関しては、用語「５’末端のストレッチ」と「第１のストレッチ」、「中心配列」と「第２のストレッチ」、および「３’末端のストレッチ」と「第３のストレッチ」をそれぞれ、本明細書では、別段の記載がない限り、同義として使用することは本発明の範囲に含まれる。
核酸を、それらの結合挙動に関してランク付けするために、アプタマーのレベルで、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた直接的および競合的なプルダウン結合アッセイを使用して特徴付けた（実施例３）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例２）、細胞培養ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃａ２＋−アッセイ（実施例４）または走化性アッセイ（実施例５）において、ヒトＣ５ａの天然の立体配置（ヒトＬ−Ｃ５ａ）を使用して試験した。
定義したボックスまたはストレッチの配列が、Ｃ型のＣ５ａ結合性核酸間で異なる場合があり、このことは、ヒトＣ５ａに対する結合親和性に影響を及ぼす。Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸として要約した、異なるＣ５ａ結合性核酸の結合解析に基づくと、以下に記載する中心ボックスおよびそのヌクレオチド配列が個々に、より好ましくはそれらの全体が、ヒトＣ５ａへの結合のために不可欠である。
Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸の全ての同定した配列の中心ボックスが、中心配列
Figure 0005798320
 を共有する。異なるＣ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１、１８５−Ｄ３、１８５−Ｂ３、１８５−Ｂ１、１８４−Ｆ４、１８５−Ａ３、１８５−Ｂ４、１８５−Ｇ４、１８５−Ｈ４、および１８５−Ｃ３のヒトＣ５ａに対する結合親和性を決定するために、それらを、アプタマーのレベルで、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた直接的および競合的なプルダウン結合アッセイを使用して試験した（実施例３）。参照として、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１５（ＫＤ＞７．２ｎＭ）、またはＣ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１（ＫＤ＝５ｎＭ、ＩＣ５０＝１〜３ｎＭ、図１５）を使用した。Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１は、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１５よりもはるかに良好なヒトＣ５ａに対する合親和性を示す。Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｄ３、１８５−Ｂ３、１８４−Ｂ４および１８５−Ｇ４は、ほぼ類似する、ヒトＣ５ａに対する結合親和性を示し、その結合親和性は、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１５の結合親和性に類似する。Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１が、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸のうちで最も良好な結合親和性を示すことから、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸についての中心配列の好ましい配列は、
Figure 0005798320
 となる。中心配列ストレッチについてのこのコンセンサス配列Ｃ型式２は、１８５−Ｄ３、１８５−Ｂ３、１８５−Ｂ４、および１８５−Ｇ４のさらなる特徴でもある。Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｄ３、１８５−Ｂ３、１８５−Ｂ４、および１８５−Ｇ４は、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１よりも弱いヒトＣ５ａに対する結合親和性を示すことから、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１と比較した場合のそれらの異なる結合挙動は、５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチの異なる配列中に見い出されるはずである（以下を参照されたい）。
Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチの７個または８個のヌクレオチドは、３’末端のストレッチの７個または８個のヌクレオチドそれぞれにハイブリダイズして、潜在的には７個または８個の塩基対号ヌクレオチドの末端ヘリックスを形成することができる。いくつかの位置において可変である（図６を参照されたい）が、これらの異なるヌクレオチドによって、５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチそれぞれの７個または８個のヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能となり、同一のボックスＡを有するＣ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１、１８５−Ｄ３、１８５−Ｂ３、１８５−Ｂ４および１８５−Ｇ４について示すように、５’末端のストレッチの配列および３’末端のストレッチの配列が、Ｃ５ａへの結合挙動に影響を及ぼす（図６）。さらに、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１および１８５−Ｂ４（両方の配列が同じ中心配列を含む）のトランケートした誘導体を、起源の分子１８５−Ｈ３−００１に対する競合的なプルダウン結合アッセイにおいて解析した（図７）。これらの実験から、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１の７個の末端のヌクレオチド（５’末端：ＧＣＵＧＧＧＣ、３’末端：ＧＣＣＣＡＧＣ）を５個のヌクレオチドまで減少させた場合、一対の５個の末端のヌクレオチドの場合にのみ、結合親和性を低下させることなく良好にトランケートすることができることが示された（５’末端：ＧＧＧＧＣ、３’末端：ＧＣＣＣＣ、１８５−Ｈ３−０１４、プルダウンアッセイ、図１６を参照されたい）。しかし、４個の末端のヌクレオチド（５’末端：ＧＧＧＣ、３’末端：ＧＣＣＣ、１８５−Ｈ３−００３）または（５’末端：ＧＧＧＡ、３’末端：ＵＣＣＣ、１８５−Ｂ４−００３）にまでトランケートすると、Ｃ５ａに対する結合親和性の低下が生じた（図７）。
しかし、全ての試験したＣ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチを組み合わせると、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチについての一般式は、５’Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＫＶＧＸ４Ｍ３’（Ｃ型式３−５’）となり、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸の３’末端のストレッチについての一般式は、５’ＤＸ５ＹＢＨＸ６Ｘ７Ｘ８３’（Ｃ型式３−３’）となる。
（式中、Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＣもしくは不在であり、Ｘ３はＢもしくは不在であり、Ｘ４はＧであり、Ｘ５はＣであり、Ｘ６はＶもしくは不在であり、Ｘ７はＧもしくは不在であり、Ｘ８はＣもしくは不在であるか、
または
Ｘ１はＧもしくは不在であり、Ｘ２はＣもしくは不在であり、Ｘ３はＢもしくは不在であり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６はＶもしくは不在であり、Ｘ７はＧもしくは不在であり、Ｘ８はＣもしくは不在であり、
好ましくは、Ｘ１はＧであり、Ｘ２はＣであり、Ｘ３はＢであり、Ｘ４は不在であり、Ｘ５は不在であり、Ｘ６はＶであり、Ｘ７はＧであり、Ｘ８はＣである。）
４個のヌクレオチドを有する５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチを含むＣ型Ｃ５ａ結合性核酸のうちの最も良好な結合親和性が、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−０１４（５’末端：ＧＧＧＧＣ、３’末端：ＧＣＣＣＣ）の場合に示される。
Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１および１８５−Ｈ３−０１４のＰＥＧ化誘導体１８５−Ｈ３−００１−５’−ＰＥＧおよび１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧについて、ＴＡＸアッセイにおいて、およそ３．２ｎＭおよび１．５ｎＭのＩＣ５０を決定した（図１７）。
１．４ Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸
図８に示すように、Ｄ型のＣ５ａ結合性核酸の配列は全て、潜在的なＣ５ａ結合モチーフを定義する、１つの中心配列のストレッチまたはボックスを含み、これには、相互にハイブリダイズすることができる５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチが隣接する。しかし、そのようなハイブリダイゼーションは、必ずしも分子内で生じるとは限らない。
Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸に関しては、用語「５’末端のストレッチ」と「第１のストレッチ」、「中心配列」と「第２のストレッチ」、および「３’末端のストレッチ」と「第３のストレッチ」をそれぞれ、本明細書では、別段の記載がない限り、同義として使用することは本発明の範囲に含まれる。
核酸を、それらの結合挙動に関してランク付けするために、アプタマーのレベルで、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた直接的および競合的なプルダウン結合アッセイを使用して特徴付けた（実施例３）。選択された配列を、スピーゲルマーとして合成し（実施例２）、走化性アッセイにおいて、ヒトＣ５ａの天然の立体配置（ヒトＬ−Ｃ５ａ）を使用して試験した（実施例５）。
定義したボックスまたはストレッチの配列が、Ｄ型のＣ５ａ結合性核酸間で異なる場合があり、このことは、ヒトＣ５ａに対する結合親和性に影響を及ぼす。Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸として要約した、異なるＣ５ａ結合性核酸の結合解析に基づくと、以下に記載する中心ボックスおよびそのヌクレオチド配列が個々に、より好ましくはそれらの全体が、ヒトＣ５ａへの結合のために不可欠である。
Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸の全ての同定した配列の中心ボックスが、中心配列
Figure 0005798320
 を共有する（図８）。異なるＤ型Ｃ５ａ結合性核酸１８２−Ｅ５、１８２−Ｃ５、および１８２−Ａ８のヒトＣ５ａに対する結合親和性を決定するために、それらを、アプタマーのレベルで、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａを用いた直接的および競合的なプルダウン結合アッセイを使用して試験した（実施例３）。参照として、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１４（ＩＣ５０＝０．９ｎＭ）を使用した。Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸１８２−Ｅ５および１８２−Ｃ５は、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１４よりも良好なヒトＣ５ａに対する合親和性を示す。Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸１８２−Ａ８（ＫＤ＝３．２ｎＭ）は、直接的な結合アッセイにおいては、Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸１８２−Ｅ５（ＫＤ＝２．４ｎＭ、図１８；ＩＣ５０＝１．２ｎＭ、図１９）および１８２−Ｃ５（ＫＤ＝２．２ｎＭ）とほぼ同じ程度の結合親和性を示した。
Ｄ型Ｃ５ａ結合性核酸の５’末端のストレッチの７個のヌクレオチドは、３’末端のストレッチの７個のヌクレオチドそれぞれにハイブリダイズして、潜在的には７個の塩基対号ヌクレオチドの末端ヘリックスを形成することができる。この７個の塩基対号ヌクレオチドは、いくつかの位置において可変である（図８を参照されたい）が、これらの異なるヌクレオチドによって、５’末端のストレッチおよび３’末端のストレッチそれぞれの７個のヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能となる。
１．５ Ｃ５ａに結合するさらなる核酸
さらに、Ｃ５ａ結合性核酸のＡ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型について示してきたヌクレオチド配列要素の組合せによっては説明することができない７つのその他のＣ５ａ結合性核酸も同定された。これらの配列を、図９に列挙する。
図１〜９に示す配列のうちのいずれもが、それらのトランケートした形態のみならず、またそれらの伸長させた形態も含めて、本発明による核酸であるが、ただし、これは、こうしたトランケートした分子および伸長させた分子それぞれが、依然として標的に結合することができるという条件下に限られることを理解されたい。
［アプタマーおよびスピーゲルマーの合成および誘導体化］
［小規模な合成］
アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ核酸）およびスピーゲルマー（Ｌ−ＲＮＡ核酸）を、ＡＢＩ３９４合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）を用いて、２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホラミダイト化学（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ、１９９３）を使用する固相合成によって生成した。Ｄ−立体配座およびＬ−立体配置のｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホラミダイト、ｒＣ（Ａｃ）−ホスホラミダイト、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホラミダイトおよびｒＵ−ホスホラミダイトをＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから購入した。アプタマーおよびスピーゲルマーを、ゲル電気泳動によって精製した。
大規模な合成および改変
スピーゲルマーを、ＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００合成機（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を用いて、２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホラミダイト化学（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ、１９９３）を使用する固相合成によって生成した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−ホスホラミダイト、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−ホスホラミダイトおよびＬ−ｒＵ−ホスホラミダイトを、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから購入した。５’−アミノ改変体を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ、米国）から購入した。未改変または５’−アミノ改変のスピーゲルマーの合成を、Ｌ−ｒｉｂｏＧ、Ｌ−ｒｉｂｏＣ、Ｌ−ｒｉｂｏＡまたはＬ−ｒｉｂｏＵ改変ＣＰＧポアサイズ１０００Å（Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｌａｓｇｏｗ、英国）上で開始した。カップリング（１サイクル当たり１５分）のために、アセトニトリル中の０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（ＣＭＳ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）、およびアセトニトリル中の３．５当量のそれぞれの０．１Ｍホスホラミダイト溶液を使用した。酸化−キャッピングのサイクルを使用した。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる標準的な溶媒および試薬は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ、オランダ）から購入した。スピーゲルマーをＤＭＴ−ＯＮで合成した。脱保護の後、スピーゲルマーを調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗｉｎｃｏｔｔら、１９９５）によって、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して精製した。５’ＤＭＴ基を、８０％酢酸を用いて除去した（室温にて３０分）。それに続いて、２ＭのＮａＯＡｃ水溶液を添加し、スピーゲルマーを、接線フローろ過によって、５Ｋ再生セルロースメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して脱塩した。
［スピーゲルマーのＰＥＧ化］
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるスピーゲルマーの血漿滞留時間を延長させるために、スピーゲルマーを、５’末端において４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合によって結合させた。
スピーゲルマーの５’−ＰＥＧ化
ＰＥＧ化するために（ＰＥＧ化のための方法の技術的な詳細については、欧州特許出願第ＥＰ１ ３０６ ３８２号を参照されたい）、精製した５’−アミノ改変スピーゲルマーを、Ｈ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）および緩衝液Ａ（５ｍｌ；クエン酸Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］および１ＭのＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、水を添加して１ｌの最終容積となすことによって調製し、１ＭのＨＣｌを用いてｐＨ＝８．４に加減した）の混合液中に溶解させた。
スピーゲルマー溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨを用いて８．４とし、次いで、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｊｅｎｋｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）を、３７°Ｃにおいて各０．２５当量を６回に分けて３０分毎に添加して、７５〜８５％の収率を達成した。反応混合物のｐＨは、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを添加する間、１ＭのＮａＯＨを用いて８〜８．５に保った。
反応混合物を、４ｍｌの尿素溶液（８Ｍ）および４ｍｌの緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）と混ぜ、１５分かけて９５°Ｃまで加熱した。次いで、ＰＥＧ化スピーゲルマーを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ、緩衝液Ｃ、アセトニトリル中の０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を使用して精製した。過剰なＰＥＧは５％緩衝液Ｃにおいて、ＰＥＧ化スピーゲルマーは１０〜１５％緩衝液Ｃにおいて溶出した。＞９５％の純度（ＨＰＬＣによって判定）を有する生成物の画分を組み合わせ、４０ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡＣと混合した。ＰＥＧ化スピーゲルマーは、接線フローろ過（５Ｋ再生セルロースメンブラン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）によって脱塩した。
［Ｃ５ａへの結合定数の決定（プルダウンアッセイ）］
［直接的なプルダウンアッセイ］
Ｃ５ａ結合性核酸の親和性を、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａ（配列番号２）に対するアプタマー（Ｄ−ＲＮＡ核酸）として、プルダウンアッセイのフォーマットにおいて３７°Ｃで測定した。アプタマーは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）によって、［γ−３２Ｐ］−標識ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）を使用して５’−リン酸標識した。標識されたアプタマーの特異的な放射活性は、２００，０００〜８００，０００ｃｐｍ／ピコモルであった。低い濃度において平衡を達成するために、アプタマーを、変性および再生の後に、２０ｐＭの濃度で、選択緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％［ｗ／ｖｏｌ］ツイーン２０）中、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの変化させた量と一緒に３７°Ｃで４〜１２時間インキュベートした。結合パートナーが、使用するプラスチック製品または固定化マトリックスの表面に吸着するのを阻止するために、選択緩衝液には、１０μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）および１０μｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、米国）を補った。ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの濃度範囲は、７ｐＭ〜２００ｎＭに設定し、全反応容積は１ｍｌであった。選択緩衝液を用いてあらかじめ平衡化し、１２μｌの全容積中に懸濁させてある４μｌのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ粒子（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、米国）上に、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａ、およびアプタマーとビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａとの複合体を固定化した。粒子を、サーモミキサー中で、懸濁液中にそれぞれの温度で３０分間保った。上清を取り除き適切に洗浄した後、固定化した放射活性をシンチレーションカウンター中で定量化した。結合のパーセントを、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａの濃度に対してプロットし、解離定数を、１：１の化学量論を想定し、ソフトウエアアルゴリズム（ＧＲＡＦＩＴ、Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、英国）を使用することによって得た。
［競合的なプルダウンアッセイ］
ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａに結合した異なるアプタマーを比較するために、競合的なランク付けアッセイを実施した。この目的では、利用可能な最もアファインなアプタマーを放射標識し（上記を参照されたい）、参照として用いた。それを、変性および再生の後、１ｍｌの選択緩衝液中で、ビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａと共に３７°Ｃで、競合がない場合にはＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎアガロース上またはＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ上（共にＰｉｅｒｃｅ製）への固定化および洗浄の後に約５〜１０％のビオチン化ヒトＤ−Ｃ５ａへの結合をもたらす条件下でインキュベートした。過剰量の変性および再生した非標識Ｄ−ＲＮＡアプタマー変異体を、異なる濃度（例えば、２、１０および５０ｎＭ）で、標識参照アプタマーと共に平行結合反応に添加した。試験しようとするアプタマーは、参照アプタマーと競合して標的に結合し、したがって、それらの結合の特徴に依存して、結合のシグナルが減少した。次いで、このアッセイにおいて最も活性であることが見出されたアプタマーを、さらなるアプタマー変異体の競合解析のための新しい参照として用いることができた。
［Ｃａ＋＋放出アッセイにおける阻害濃度の決定］
Ｕ９３７細胞（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）をＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を有し、さらに１０％ウシ胎仔血清、５０ｕｎｉｔ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２において培養した。実験の２日前には、新しいフラスコ中で、１ｍＭの最終濃度を得るようにジブチリル−ｃＡＭＰを添加した標準的な培地中に細胞を０．２×１０６／ｍｌ（６×１０６／３０ｍｌ）の密度で播種する。
スピーゲルマーを、０．２ｍｌの薄型の９６チューブプレート中、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５ｍＭプロベネシドおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＨＢＳＳ＋）を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で、組換えヒトＣ５ａ（配列番号１）と一緒に、３７°Ｃで１５〜６０分間インキュベートした（「刺激溶液」）。
カルシウム指示染料を添加するために、細胞を３００×ｇで５分間遠心分離し、４ｍｌの指示染料溶液（ＨＢＳＳ＋中の１０μＭのｆｌｕｏ−４［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］、０．０８％ｐｌｕｒｏｎｉｃ１２７［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］）中に再懸濁し、３７°Ｃで６０分間インキュベートした。その後、１１ｍｌのＨＢＳＳ＋を添加し、細胞を上記に従って遠心分離し、１５ｍｌのＨＢＳＳ＋を用いて１回洗浄し、次いで、ＨＢＳＳ＋中に再懸濁して、１．１×１０６／ｍｌの細胞密度を得た。９０μｌのこの細胞懸濁液を、黒色９６ウエルプレートの各ウエルに添加した。
蛍光シグナルを、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎプレートリーダー（ＢＭＧ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、ドイツ）中で、４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長において測定した。いくつかの試料を平行して測定するために、９６ウエルプレートの１つの（垂直な）列を一緒に記録した。４秒の時間のずれを有する第１の３回の読取りを行い、ベースラインを決定した。次いで、読取りを中断し、プレートを機器から取り外した。多経路ピペットを使用して、１０μｌの刺激溶液をウエルに添加し、次いで、プレートを機器中に再度移動させ、測定を継続した。４秒の時間間隔で、全部で２０回の読取りを実施した。
各ウエルについて、最大蛍光とベースライン値との間の差を決定し、Ｃ５ａ濃度に対して、またはスピーゲルマーによるカルシウム放出の阻害についての実験の場合には、スピーゲルマーの濃度に対してプロットした。
［ヒトＣ５ａについての最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の決定］
Ｕ９３７細胞を種々のＣ５ａ濃度を用いて刺激し、最大シグナルとベースラインシグナルとの間の差をプロットして、ヒトＣ５ａについての用量反応曲線を得、これは、約１ｎＭの半量有効濃度（ＥＣ５０）を示した。この濃度を、スピーゲルマーによるＣａ＋＋−放出の阻害についてのその後の実験のために使用した。
［走化性アッセイにおける阻害濃度の決定］
上記に従って増殖および分化させたＵ９３７細胞を、遠心分離し、ＨＢＨ（ＨＢＳＳ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する）中で１回洗浄し、３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌのこの懸濁液を、５μｍのポアを有するＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３４２１、ＮＹ、米国）に添加した。下側のコンパートメント中で、組換えヒトＣ５ａ（配列番号１）を、６００μｌのＨＢＨ中の種々の濃度のスピーゲルマーと一緒に３７°Ｃで２０〜３０分間プレインキュベートしてから、細胞を添加した。細胞を、３７°Ｃで３時間遊走させた。その後、インサートを取り外し、リン酸緩衝食塩水の４４０μＭレサズリン（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）６０μｌを下側のコンパートメントに添加した。３７°Ｃで２．５時間インキュベーションした後、蛍光を、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎプレートリーダー（ＢＭＧ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、ドイツ）中で、５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長において測定した。
蛍光値を、バックグラウンドの蛍光（ウエル中に細胞がない場合）について補正する。次いで、Ｃ５ａがある実験条件とＣ５ａがない実験条件との間の差を計算する。これらの結果は、ヒストグラムとして示すことができる。これに加えてまたは代わって、スピーゲルマーがない場合（Ｃ５ａのみ）の試料についての値を１００％として、スピーゲルマーがある場合の試料の値を、これのパーセントとして計算する。用量反応曲線のためには、このパーセント値を、スピーゲルマーの濃度に対してプロットし、ＩＣ５０値（スピーゲルマーがない場合の活性の５０％を示すスピーゲルマーの濃度）を、得られた曲線からグラフを使って決定する。
［ヒトＣ５ａについての最大半量有効濃度（ＥＣ５０）の決定］
Ｕ９３７細胞を種々のヒトＣ５ａ濃度に向けて３時間遊走させた後、ヒトＣ５ａについての用量反応曲線を得、これは、約１ｎＭの最大有効濃度およびより高い濃度における活性化の低下を示した。スピーゲルマーによる走化性の阻害についてのその後の実験のために、０．１ｎＭのＣ５ａ濃度を使用した。
［Ｃ５への結合定数の決定（フィルター結合アッセイ）］
スピーゲルマーのヒト血液由来の補体構成成分５（ヒトＬ−Ｃ５；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ（カタログ番号：Ｃ３１６０）；ヒトＣ５アルファ鎖、配列番号１７１を参照、ヒトＣ５ベータ鎖、配列番号１７２を参照、からなる）に対する親和性を、フィルター結合アッセイのフォーマットにおいて３７°Ｃで測定した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いた標識化を可能にする５’末端に２つの追加のＤ−グアノシン部分を有するスピーゲルマーを合成した。標識されたスピーゲルマーの特異的な放射活性は、３００，０００〜５００，０００ｃｐｍ／ピコモルであった。スピーゲルマーを、熱変性および再生の後に、３０ｐＭ濃度で、結合緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌの１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、０．００１％［ｗ／ｖｏｌ］ツイーン２０）中、Ｃ５の変化させた量と一緒に３７°Ｃで４〜６時間インキュベートした。結合パートナーが、使用するプラスチック製品の表面に吸着するのを阻止するために、結合緩衝液には１０μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを補った。Ｃ５の濃度範囲は、７ｐＭ〜１００ｎＭに設定し、全反応容積は０．４ｍｌであった。０．２２μｍのポアサイズおよび１０ｍｍの直径を有するニトロセルロース（ＮＣ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、ドイツ）を、Ｈ２Ｏ中に５分間浸漬し、真空マニホールド（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ、ドイツ）上に置いた。−５インチのＨｇに対応する真空を、真空マニホールドを介してフィルター上に適用してから、結合反応物をＮＣフィルターに移行させた。結合反応物を、フィルターに通し、標識されたスピーゲルマーがＣ５と複合体を形成している場合には、Ｃ５は、フィルター上に、標識されたスピーゲルマーと一緒になって保持された。ＢＳＡを有さない緩衝液を用いて適切に洗浄した後、結合したスピーゲルマーのパーセントをシンチレーションカウンター中で測定した。フィルターに結合したスピーゲルマーのパーセントを、Ｃ５の濃度に対してプロットし、解離定数を、１：１の化学量論を想定し、ソフトウエア（ＧＲＡＦＩＴ、Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓｕｒｒｅｙ、英国）を使用することによって得た。
Ａ型Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０００（配列番号３）および１７２−Ｄ７−０１３（配列番号１４）、Ｂ型Ｃ５ａ結合性核酸１７９−Ａ３−０１４（配列番号３６）および１７９−Ａ３−０１５（配列番号３８）、Ｃ型Ｃ５ａ結合性核酸１８５−Ｈ３−００１（配列番号４９）、１８５−Ｈ３−００２（配列番号６３）、１８５−Ｈ３−０１４（配列番号６５）および１８５−Ｈ３−００３（配列番号６７）、ならびにＤ型Ｃ５ａ結合性核酸１８２−Ｅ５（配列番号６９）および１８２−Ｃ５（配列番号７０）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによる［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰを用いた標識化を可能にする５’末端に２つのＤ−グアノシン部分を有するスピーゲルマーとして合成した。全てのそのような改変スピーゲルマー（配列番号１５７〜１６７）は、ヒトＣ５ａへのそれらのそれぞれの結合挙動に匹敵するヒトＣ５に対する結合親和性を示した（合成ヒトＤ−Ｃ５ａに対する対応するアプタマー配列の個々の結合親和性については、図１〜８を参照されたい）。Ｃ５ａ結合性核酸１７２−Ｄ７−０１３、１７９−Ａ３−０１４、および１８５−Ｈ３−０１４についてのデータを、図２０に示す。
これらの分子がＣ５分子全体に結合するという事実以外に、この実験によって、また、ヒト血清由来の生物学的Ｃ５にも、したがって、その天然にグリコシル化されたＣ５にも、本明細書に記載するスピーゲルマーが結合することが示されている。
［概念実証：選択されたＣ５ａスピーゲルマーのｉｎ ｖｉｖｏにおける活性］
スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧがＣ５ａの活性をｉｎ ｖｉｖｏにおいて遮断する能力を試験するために、ヒトＣ５ａがスナネズミにおいて好中球減少を誘発する既知の特性（Ｓｕｍｉｃｈｉｋａら、２００２）を敗血症性ショックのモデルとして活用した。
方法
麻酔を施した雌のスナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ ｇｅｒｂｉｌ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ドイツ、７〜８週齢、１群当たりｎ＝７）に、抗Ｃ５ａスピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧの単回ｉ．ｖ．注射を投与した（５％グルコース中の２ｍｇ／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド、またはビヒクル（５％グルコース））。基本組成は同じであるが逆配列の、Ｃ５に結合しないＰＥＧ化スピーゲルマーを使用して、スピーゲルマーによるモデルを用いた場合の一般的な非特異的干渉と、Ｃ５ａ結合に関係する作用を区別した。また、逆スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−逆−５’−ＰＥＧも、追加の対照群において、５％グルコース中の２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドで投与した。８〜９分後、血液を動物から心臓内穿刺を介して収集した。これに続いて、１００μｇ／ｋｇのヒト組換えＣ５ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ、カタログ番号：Ｃ５７８８）をｉ．ｖ．ボーラス注入した。それに続いて、Ｃ５ａ注入の１、３および５分後に血液を収集した。試料を、抗凝固薬としてＥＤＴＡを含有するチューブ内に即時に移した。
血液塗抹標本を、血液試料から調製し、メイ−グリュンワルド−ギムザ染色を用いて染色した。各血液塗抹標本上で１００個の白血球細胞を数え、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球について、分化細胞の数を決定した。各動物について、好中球のパーセントを、１および５分の時点について決定し、０時点の好中球のパーセントとして表した。
結果
Ｃ５ａの注入によって、血液中の好中球が迅速に減少する。注入１分後には、好中球カウントが、注入前の値の約３０％にまで減少した。３分後には、この値は、すでに増加し（約５５％）、Ｃ５ａの注入５分後には約７０％にまで上昇する。このことから、この過程は可逆的であることが示されている。これらのｉｎ ｖｉｖｏにおける知見は、非常に類似した実験において約２０％までの減少を報告するＳｕｍｉｃｈｉｋａらが公開したデータと極めて一致する。Ｃ５ａの注入前のスピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−５’−ＰＥＧ（１０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド）の適用によって、この好中球数の低下（好中球減少）は、図２１に示すように、Ｃ５ａ適用後１分および３分において顕著に減弱する。２ｍｇ／ｋｇの投与群では、好中球減少の阻害が生じなかった。これは、Ｃ５ａが媒介する作用の急速な動態に起因し得る。逆スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−逆−５’−ＰＥＧは、両方の試験濃度で、ヒト組換えＣ５ａが誘発した好中球減少の抑制をもたらさなかった。
［Ｃ５ａ結合性スピーゲルマーのアカゲザルＣ５ａへの結合］
方法
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）Ｃ５ａの配列を、補体構成成分５について予測されている配列（アクセッションＸＭ＿００１０９５７５０）から推定した。Ｃ５ａをおそらくコードすると思われる配列を、アカゲザルの全肝臓ＲＮＡ（ＢｉｏＣａｔ）から、ＲＴ−ＰＣＲによって、プライマー５’−ＡＴＧＣＴＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴＡＧＡＡＧ（Ｃ５ａ−プライマー−Ｉ）および５’−ＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＡＴＴＧＣ（Ｃ５ａ−プライマー−ＩＩ）を使用して増幅し、ｐＱＥ３０Ｘａベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）中にクローニングした。
得られたタンパク質（Ｐｕｂｍｅｄアクセッション番号：ＸＰ＿００１０９５７５０、配列番号１８６）は、ヒトＣ５ａ（配列番号１）に対して８５％（７４個のアミノ酸中６３個）の同一性を示す。
Ｈｉｓ６タグ付タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１中で発現させ、８Ｍ尿素を含有する緩衝液中でニッケル親和性クロマトグラフィー（ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、ドイツ）を用いて精製した。タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを用いて溶出し、−２０°Ｃで保管した。タンパク質を、走化性アッセイ（実施例５を参照されたい）において使用する前に、再生緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．００５％ツイーン２０、２ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭ酸化型グルタチオン）中に希釈（１：１０）し、室温で少なくとも１０分間インキュベートしてから、ＨＢＨ中にさらに希釈した。
走化性アッセイを、実施例５の記載に従って、精製したサルＣ５ａ（Ｈｉｓ６−ｍａｃＣ５ａ）または組換えヒトＣ５ａを使用して実施した。Ｈｉｓ６−ｍａｃＣ５ａの最終濃度は、ＢＣＡ法を用いたタンパク質決定によるとおよそ０．８ｎＭであり、０．１ｎＭのヒトＣ５ａに類似するＵ９３７細胞の走化性応答を示した。試験したスピーゲルマーは、１００ｎＭで適用した。
結果
スピーゲルマー１８５−Ｈ３−０１４−５’ＰＥＧおよび１８５−Ｈ３−００１は、Ｈｉｓ６ｍａｃＣ５ａの作用を阻害することはできなかったが、一方、スピーゲルマー１７９−Ａ３−０１４−５’ＰＥＧは、Ｈｉｓ６ｍａｃＣ５ａが誘発したＵ９３７細胞の走化性を完全に遮断した（図２２）。
参照文献
本明細書に列挙した文献の完全な書誌データを以下に示す。これらの開示は、別段の記載がない限り、参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
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本明細書に開示した本発明の特徴、特許請求の範囲、配列表、および／または図面は、別個にも、これらを任意に組み合わせても、本発明をその種々の形態として実現するための材料となり得る。

Claims (17)

  1. 配列番号３、１１、１２、１３、１４、３６、２１、２２、２３、３３、３４、３７、４０、４６、４７、６３、６５、４９、６９、７０、および７５のいずれかに記載の核酸配列を有する核酸を含む群から選択される、Ｃ５ａに結合することができるＬ−核酸。
  2. Ｃ５ａおよびＣ５に結合することができる、請求項１に記載のＬ−核酸。
  3. グリコシル化Ｃ５ａおよびグリコシル化Ｃ５に結合することができる、請求項２に記載のＬ−核酸。
  4. 改変基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−核酸。
  5. 前記改変基が、高分子量部分であり、かつ／または、前記改変基が、動物もしくはヒトの体における滞留時間の点において、請求項１〜３のいずれかに記載のＬ−核酸の特性の改変を可能にする、請求項４に記載のＬ−核酸。
  6. 前記改変基が、ＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分または生分解性の改変を含む群から選択される、請求項４または５に記載のＬ−核酸。
  7. 疾患を治療および／または予防するための医薬品を製造するための、請求項１〜６のいずれかに記載のＬ−核酸。
  8. 請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸、およびさらなる構成要素を含む医薬組成物であって、前記さらなる構成要素が、薬学的に許容可能な賦形剤、薬学的に許容可能な担体、および薬学的に活性な薬剤を含む群から選択される医薬組成物。
  9. 医薬品を製造するための、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸の使用。
  10. 診断手段を製造するための、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸の使用。
  11. 前記医薬品が、自己免疫性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、免疫複合体関連疾患、眼疾患、局所性炎症、ショック、サルコイドーシス、敗血症性ショック、出血性ショック、アナフィラキシー性ショック、全身性炎症反応症候群、多臓器不全、喘息、アレルギー；血管炎；心筋炎、皮膚筋炎、急性呼吸不全、脳卒中、心筋梗塞、熱傷、全身性疾患の局所的症状、１型糖尿病および２型糖尿病、糖尿病の徴候、血栓塞栓症、糸球体腎炎、免疫複合体障害、胎児拒絶、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、膵炎、腹膜炎、歯肉炎、ならびに外傷、全身性炎症反応症候群、多臓器不全の二次的損傷、神経変性および炎症を含む群から選択される疾患または障害を治療および／または予防するためのものである、請求項９に記載の使用。
  12. 前記医薬品が、手術の間および／または後の予防および／または支援および／または術後治療のためのものである、請求項９に記載の使用。
  13. 請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸を含む貯蔵溶液および／または輸送溶液であって、臓器の貯蔵または臓器の輸送のための貯蔵溶液および／または輸送溶液。
  14. 請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸、ならびにＣ５および／またはＣ５ａを含む複合体。
  15. Ｃ５および／またはＣ５ａを検出するための、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸の使用。
  16. 請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸を含む、Ｃ５および／またはＣ５ａの検出のためのキット。
  17. 試料中の、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸を検出するための方法であって、
    ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸を含有する試料を用意するステップと、
    ｂ）捕捉プローブおよび検出プローブを用意するステップであって、前記捕捉プローブが、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸の第１の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、前記検出プローブが、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸の第２の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すか、または、前記捕捉プローブが、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸の第２の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示し、前記検出プローブが、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸の第１の部分に対して少なくとも部分的に相補性を示すステップと、
    ｃ）前記捕捉プローブおよび前記検出プローブを、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸またはその一部と、同時にまたは任意の順番で順次にのいずれかで反応させるステップと、
    ｄ）ステップｃ）で形成された、請求項１〜７のいずれかに記載のＬ−核酸、前記捕捉プローブ、および前記検出プローブからなる複合体を検出するステップと
    を含む方法。
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