JP2014504865A - 標的分子との結合親和性を有する核酸分子およびその生成方法 - Google Patents

標的分子との結合親和性を有する核酸分子およびその生成方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的分子と結合し得る核酸分子の生成方法であって、以下の：ａ）参照核酸分子を提供するステップ（ここで、前記参照核酸分子は前記標的分子と結合し得るし、前記参照核酸分子は、一ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列はｎ個のヌクレオチドを含む）；ｂ）前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体は１つのヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なり、前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸分子があるヌクレオチド位置にリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸があるヌクレオチド位置に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして取替えがなされるヌクレオチド位置は修飾化ヌクレオチド位置である）；ならびにｃ）前記参照核酸分子の各ヌクレオチド位置に関してステップｂ）を反復し、したがって、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の一群を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群はｎ個の第一次レベル誘導体からなり、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体の各々は単一ヌクレオチド置換により前記参照核酸分子と異なっており、そして前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の各々は、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群の他の第一次レベル誘導体の単一修飾化ヌクレオチド位置のすべての単一修飾化ヌクレオチドと異なる単一修飾化ヌクレオチド位置を有する）を包含する方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、標的分子と結合し得る核酸分子の生成方法、その方法により得られる核酸分子、前記核酸分子の使用、標的分子と結合し得る核酸分子に関するが、この場合、前記核酸分子は、参照核酸分子と比較して、標的分子との結合親和性増大を示すか、あるいは同一の結合親和性を有する。さらに本発明は、疾患の処置および／または診断の方法における増大結合親和性または同一結合親和性を有する核酸分子の使用に関する。
比較的小さい有機分子の使用に加えて、新規の治療概念の発達は、益々、モノクローナル抗体、ペプチドおよび機能性核酸分子、すなわち、標的構造または標的分子と特異的に結合するような核酸分子に頼っている。これらの機能性核酸分子の代表は、多数の異なる生体分子に対してすでに開発されている、いわゆるアプタマーである。それにより、Ｄ−核酸ライブラリーから出発して、その標的構造または標的分子に対する特に高い親和性により特性化される１つ以上のＤ−核酸分子、いわゆるアプタマーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択により数段階で単離される。このようなアプタマーの調製方法は、例えば欧州特許 ＥＰ ０ ５３３ ８３８に記載されている。
最初のアプタマーは、組換えＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーの使用により発見された。ＲＮＡアプタマーならびにＤＮＡアプタマーはＤ−核酸分子であって、治療的適用のためにそれらを役に立たなくするものであるヌクレアーゼによりヒトまたは動物身体のような生物学的系において急速に分解される。それゆえ、アプタマーの安定化は、アプタマー薬剤候補の開発過程において不可欠な段階である。安定化は、以下の：
ａ）アプタマーの５’−および３’−末端の両方でのキャッピング部分の付加によりアプタマーの５’−および３’−末端を保護すること、
ｂ）リボースまたはデオキシリボース主鎖に修飾を組入れること、あるいは
ｃ）リン酸主鎖構成成分を組入れること
により達成され得る。
アプタマーの５’末端にキャッピング部分を付加することにより、特に、ヒトおよび動物身体の体液中に存在する５’→３’ヌクレアーゼおよび５’→３’エキソヌクレアーゼに関して、アプタマーの血清およびｉｎ ｖｉｖｏ安定性が改善され得る。この種類の修飾は、慣用的固相合成における修飾化ホスホアミダイトとして、あるいは合成後カップリングにより、導入され得る。しばしば、５’−アミノ基を含有する５’−アミノ修飾因子が用いられ、それにより、５’−アミノ基はその後の誘導体化のための求核性試薬として役立ち得る。最も一般的な５’−修飾は、ポリエチレングリコールである。他の修飾は、コレステロール、脂肪酸、ポリカチオンおよびタンパク質の群から選択される。アプタマーの５’−末端の安定化を付与するほかに、このような修飾は、アプタマーの薬物動態プロフィールおよび／または生体内分布を変更するために用いられ得る。
アプタマーの３’末端でのキャッピング部分の付加は、ヒトおよび動物の血清中に存在する３’→５’エキソヌクレアーゼに対するアプタマー保護を付与する。ヌクレオチドおよび非ヌクレオチド３’−キャップが既知である。最も一般的に用いられる３’−キャップは、逆位チミジン（３’−ｉｄＴ）である。
アプタマーのリボースまたはデオキシリボース主鎖の２’位置での化学的修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏでのアプタマーの使用のための必要条件である。これらの２’−修飾は、典型的には、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−アミノの群から選択される。ＳＥＬＥＸ法内でアプタマー配列中に（ある程度まで）、あるいはいわゆるＳＥＬＥＸ最適化法において（この場合、個々のアプタマー配列は、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−アミノヌクレオチドによる天然ヌクレオチドの段階的置換により最適化される）、上記の２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−アミノの修飾を導入するための技法が、当該技術分野で利用可能である。
リン酸主鎖修飾は、非架橋ホスホジエステル酸素（単数または複数）の代わりにイオウ（単数または複数）を導入し、それによりアプタマーにヌクレアーゼ耐性を付与する。このようなイオウ修飾主鎖の好ましい形態は、ホスホロチオエートである。ホスホロチオエートは、ＳＥＬＥＸ法で、または固相合成により、アプタマー中に酵素的に組み入れられ得る。ホスホロジチオエート・アプタマーは、固相合成により産生されなければならない。
アプタマーのほかに、いわゆるスピーゲルマーは、さらなる形態の機能性核酸を構成する。アプタマーと同様に、スピーゲルマーは、標的分子または標的構造と特異的に結合する。スピーゲルマーは、エナンチオマー形態の標的分子または標的構造に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ選択のためにＤ−核酸ライブラリーを用いるプロセスにより同定され、その結果、エナンチオマー形態の標的分子または標的構造と結合するこのように同定されたＤ核酸は、対応するＬ−核酸として調製される。キラル相互性の原理の結果、スピーゲルマーと呼ばれるこれらのＬ−核酸は、真のまたは実際の標的分子と結合し得るが、しかし選択工程のために用いられるそのエナンチオマー形態とは結合し得ない。好ましくは、このような真のまたは実際の標的分子または標的構造は、ヒトまたは動物身体のような生物学的系において存在するような標的分子または標的構造である。このようなスピーゲルマーの調製方法は、例えば国際特許出願ＷＯ ９８／０８８５６に記載されている。
スピーゲルマーは、Ｌヌクレオチドから組み立てられるＬ−核酸分子、典型的にはＬ−オリゴヌクレオチドであるので、それらは天然酵素により分解され得ない。標的特異性のほかに、この特質は、例えば生物学的試料の分析、診断および治療といったような最も異なる領域における使用にそれらを適するようにする。
上記のようなヌクレアーゼによる分解に対して、それらの使用前に、安定化されなければならないアプタマーと対比して、例えば機能性検定において、細胞ベースの検定において、ｉｎ ｖｉｖｏ実験において、および／または治療または診断のためのｉｎ ｖｉｖｏ適用２置いて、その使用前にスピーゲルマーを安定化する必要はない。スピーゲルマーのｉｎ ｖｉｖｏ適用は、ヒトおよび種々の動物種で立証されている。スピーゲルマーＮＯＸ−Ｅ３６およびＮＯＸ−Ａ１２に関しては、２００９年に臨床試験が開始された。
安定化の目的のための化学的修飾がスピーゲルマーに関しては必要でないため、スピーゲルマーは、ヌクレオチド構成ブロックの点から見て、単にリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドで、さらに精確には、Ｌ−リボヌクレオチドまたはＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドで構成される。それから生じる薬剤開発におけるスピーゲルマーの利点は、修飾ヌクレオチド、例えば２’−Ｆ−リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドおよび２’−アミノリボヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドにより、非修飾ヌクレオチド、すなわちＬ−リボヌクレオチドおよびＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドを置換するという、多くの時間を要し、高価で、且つ今までのところ危険であるとみなされているプロセスが存在しないことである。薬剤開発におけるＬ−リボヌクレオチドおよびＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドのみで構成されるスピーゲルマーのさらなる利点は、このような化学的修飾ヌクレオチドおよび／またはその分解産物の潜在的毒性作用または不耐性が存在しないことである。
したがって、Ｌ−リボヌクレオチドおよびＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドのみで構成されるスピーゲルマーのｉｎ ｖｉｖｏ効力は、典型的には、標的分子とのそれらの親和性に、その結果として、標的分子または標的構造の機能ならびにヒトまたは動物身体におけるそれらの薬物動態的行動に及ぼすそれらの作用によって決まるだけである。
本発明の根本的な課題は、標的分子と結合している参照核酸分子から出発して、標的分子と結合し得る核酸分子を生成するための方法を提供することである。好ましくは、核酸分子が結合し得る標的分子は、参照核酸分子が結合している標的分子である。
本発明の根本的なさらなる課題は、標的分子と結合している参照核酸分子から出発して、標的分子と結合し得る核酸分子を生成するための方法を提供することであり、それにより、標的分子と結合し得る核酸分子は、参照核酸分子と比較して、同一のまたは改良された結合特質を有し、それにより好ましくは結合特質は標的分子との結合親和性である。
本発明の根本的なさらなる課題は、核酸分子を、さらに具体的には、参照核酸分子と比較して、その標的分子との改良された結合親和性または同一の結合親和性を有するアプタマーまたはスピーゲルマーのような機能性核酸分子を提供することである。
本発明の根本的なこれらのおよびその他の課題は、添付の個々の請求項の対象事項により解決される。好ましい実施形態は、従属請求項から採用され得る。
さらに具体的には、本発明の根本的な課題は、標的分子と結合し得る核酸分子の生成方法であって、以下の：
ａ）参照核酸分子を提供するステップ（ここで、前記参照核酸分子は前記標的分子と結合し得るし、前記参照核酸分子は、一ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列はｎ個のヌクレオチドを含む）；
ｂ）前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体は１つのヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なり、前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸分子があるヌクレオチド位置にリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸があるヌクレオチド位置に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして取替えがなされるヌクレオチド位置は修飾化ヌクレオチド位置である）；ならびに
ｃ）前記参照核酸分子の各ヌクレオチド位置に関してステップｂ）を反復し、したがって、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の一群を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群はｎ個の第一次レベル誘導体からなり、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体の各々は単一ヌクレオチド置換により前記参照核酸分子と異なっており、そして前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の各々は、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群の他の第一次レベル誘導体の単一修飾化ヌクレオチド位置のすべての単一修飾化ヌクレオチドと異なる単一修飾化ヌクレオチド位置を有する）
を包含する方法により、第一の態様の第一の実施形態でもある第一の態様において解決される。
第一の態様の第一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二の実施形態では、当該方法は、以下のステップｄ）および任意にステップｅ）を包含する：
ｄ）前記参照核酸のｎ個の第一次レベル誘導体の各々に関して前記標的分子との結合特質を確定するステップ；ならびに任意に
ｅ）その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第一次レベル誘導体（単数または複数）を同定するステップ。
第一の態様の第二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三の実施形態では、結合特質は、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である。
第一の態様の第二および第三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四の実施形態では、結合親和性はＫＤ値として表される。
第一の態様の第二、第三および第四の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五の実施形態では、前記予定閾値はＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第一次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０である。
第一の態様の第二、第三、第四および第五の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六の実施形態では、前記予定閾値はＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第一次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０である。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五および第六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第七の実施形態では、
ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
（ａ）前記ヌクレオチドがアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシアデノシン−５−ホスフェートであり；
（ｂ）前記ヌクレオチドがグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｃ）前記ヌクレオチドがシチジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
（ｄ）前記ヌクレオチドがウリジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシウリジン−５−ホスフェートまたはチミジン−５−ホスフェートであり；そして
ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
（ａ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはアデノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｂ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはグアノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｃ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
（ｄ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはウリジン−５’−ホスフェートまたは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第八の実施形態では、
ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
（ａ）前記ヌクレオチドがアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｂ）前記ヌクレオチドがグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｃ）前記ヌクレオチドがシチジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
（ｄ）前記ヌクレオチドがウリジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェートであり；そして
ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
（ａ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはアデノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｂ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはグアノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｃ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
（ｄ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五および第六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第九の実施形態では、前記参照核酸はリボ核酸分子であり、そしてステップｂ）において、あるヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
（ａ）前記ヌクレオチドがアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシアデノシン−５−ホスフェートであり；
（ｂ）前記ヌクレオチドがグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｃ）前記ヌクレオチドがシチジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
（ｄ）前記ヌクレオチドがウリジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェートまたはチミジン−５’−ホスフェートである。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八および第九の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十の実施形態では、前記参照核酸は２’−デオキシリボ核酸分子であり、そしてステップｂ）において、あるヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
（ａ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはアデノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｂ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはグアノシン−５’−ホスフェートであり；
（ｃ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
（ｄ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはウリジン−５’−ホスフェートまたは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである。
第一の態様の第十の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十一の実施形態では、前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十および第十一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十二の実施形態では、当該方法は、前記標的分子と結合し得る核酸分子の生成方法であって、この場合、前記核酸分子の結合親和性は、増大されるか、または前記参照核酸分子と前記標的分子との結合親和性と同じである。
第一の態様の第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一および第十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十三の実施形態では、その結合特質が予定閾値を上回る第一次レベル誘導体は、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である。
第一の態様の第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二および第十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十四の実施形態では、前記参照核酸分子の第二次レベル誘導体が調製され、この場合、前記第二次レベル誘導体は、少なくとも第一ヌクレオチド位置および第二ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
前記第一ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第二ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である。
第一の態様の第十四の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十五の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体および前記第二の第一次レベル誘導体は２つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであって、この場合、前記２つの第一次レベル誘導体の各々の前記結合特質は予定閾値を上回る。
第一の態様の第十四および第十五の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十六の実施形態では、第一の第一次レベル誘導体および第二次レベル誘導体は、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する２つの第一次レベル誘導体である。
第一の態様の第十四、第十五および第十六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十七の実施形態では、前記参照核酸分子の前記第二次レベル誘導体は前記標的分子と結合し得る。
第一の態様の第十五、第十六および第十七の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十ハチの実施形態では、当該方法は、以下の：
− 前記参照核酸分子の前記第二次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
− その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第二次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
を包含する。
第一の態様の第十八の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第十九の実施形態では、前記結合特質は、前記参照核酸分子の前記第二次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である。
第一の態様の第十八および第十九の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十の実施形態では、前記結合親和性はＫＤ値として表される。
第一の態様の第十八、第十九および第二十の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十一の実施形態では、前記予定閾値はＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第二次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である。
第一の態様の第十八、第十九、第二十および第二十一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十二の実施形態では、前記予定閾値はＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第二次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である。
第一の態様の第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一および第二十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十三の実施形態では、その結合特質が予定閾値を上回る前記第二次レベル誘導体は、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である。
第一の態様の第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二および第二十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十四の実施形態では、前記参照核酸分子の第三次レベル誘導体が調製され、この場合、前記第三次レベル誘導体は、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置および第三ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
前記第一ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第二ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第三ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である。
第一の態様の第二十四の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十五の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体および第三の第一次レベル誘導体は３つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記３つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質は予定閾値を上回る。
第一の態様の第二十四および第二十五の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十六の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体および第三の第一次レベル誘導体は、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する３つの第一次レベル誘導体である。
第一の態様の第二十四、第二十五および第二十六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十七の実施形態では、前記参照核酸分子の前記第三次レベル誘導体は前記標的分子と結合し得る。
第一の態様の第二十五、第二十六および第二十七の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十八の実施形態では、当該方法は、以下の：
− 前記参照核酸分子の前記第三次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
− その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第三次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
を包含する。
第一の態様の第二十八の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第二十九の実施形態では、前記結合特質は、前記参照核酸分子の前記第三次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である。
第一の態様の第二十八および第二十九の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十の実施形態では、前記結合親和性はＫＤ値として表される。
第一の態様の第二十八、第二十九および第三十の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十一の実施形態では、前記予定閾値はＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第三次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である。
第一の態様の第二十八、第二十九、第三十および第三十一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十二の実施形態では、前記予定閾値はＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第三次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である。
第一の態様の第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一および第三十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十三の実施形態では、その結合特質が予定閾値を上回る前記第三次レベル誘導体は、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である。
第一の態様の第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二および第三十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十四の実施形態では、前記参照核酸分子の第四次レベル誘導体が調製され、この場合、前記第四次レベル誘導体は、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置および第四ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
前記第一ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第二ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第三ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第四ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である。
第一の態様の第三十四の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十五の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体および第四の第一次レベル誘導体は４つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記４つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質は予定閾値を上回る。
第一の態様の第三十四および第三十五の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十六の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体および第四の第一次レベル誘導体は、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する４つの第一次レベル誘導体である。
第一の態様の第三十四、第三十五および第三十六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十七の実施形態では、前記参照核酸分子の前記第四次レベル誘導体は前記標的分子と結合し得る。
第一の態様の第三十五、第三十六および第三十七の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十八の実施形態では、当該方法は、以下の：
− 前記参照核酸分子の前記第四次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
− その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第四次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
を包含する。
第一の態様の第三十八の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第三十九の実施形態では、前記結合特質は、前記参照核酸分子の前記第四次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である。
第一の態様の第三十八および第三十九の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十の実施形態では、前記結合親和性はＫＤ値として表される。
第一の態様の第三十八、第三十九および第四十の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十一の実施形態では、前記予定閾値はＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第四次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である。
第一の態様の第三十八、第三十九、第四十および第四十一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十二の実施形態では、前記予定閾値はＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第一次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である。
第一の態様の第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一および第四十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十三の実施形態では、その結合特質が予定閾値を上回る前記第四次レベル誘導体は、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である。
第一の態様の第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二および第四十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十四の実施形態では、前記参照核酸分子の第五次レベル誘導体が調製され、この場合、前記第五次レベル誘導体は、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置、第四ヌクレオチド位置および第五ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
前記第一ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第二ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第三ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第四ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第五ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第五の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第五ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である。
第一の態様の第四十四の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十五の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体は５つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記５つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質は予定閾値を上回る。
第一の態様の第四十四および第四十五の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十六の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体および第五の第一次レベル誘導体は、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する５つの第一次レベル誘導体である。
第一の態様の第四十四、第四十五および第四十六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十七の実施形態では、前記参照核酸分子の前記第五次レベル誘導体は前記標的分子と結合し得る。
第一の態様の第四十語、第四十六および第四十七の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十八の実施形態では、当該方法は、以下の：
− 前記参照核酸分子の前記第五次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
− その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第五次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
を包含する。
第一の態様の第四十八の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第四十九の実施形態では、前記結合特質は、前記参照核酸分子の前記第五次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である。
第一の態様の第四十八および第四十九の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十の実施形態では、前記結合親和性はＫＤ値として表される。
第一の態様の第四十八、第四十九および第五十の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十一の実施形態では、前記予定閾値はＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第五次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である。
第一の態様の第四十八、第四十九、第五十および第五十一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十二の実施形態では、前記予定閾値はＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第五次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である。
第一の態様の第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一および第五十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十三の実施形態では、その結合特質が予定閾値を上回る前記第五次レベル誘導体は、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である。
第一の態様の第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二および第五十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十四の実施形態では、前記参照核酸分子の第六次レベル誘導体が調製され、前記第六次レベル誘導体は、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置、第四ヌクレオチド位置、第五ヌクレオチド位置および第六ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
前記第一ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第二ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第三ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第四ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第五ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第五の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第五ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第六ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第六の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第六ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である。
第一の態様の第五十四の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十五の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体および第六の第一次レベル誘導体は６つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記６つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質は予定閾値を上回る。
第一の態様の第五十四および第五十五の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十六の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体および第六の第一次レベル誘導体は、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する６つの第一次レベル誘導体である。
第一の態様の第五十四、第五十五および第五十六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十七の実施形態では、前記参照核酸分子の前記第六次レベル誘導体は前記標的分子と結合し得る。
第一の態様の第五十五、第五十六および第五十七の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十八の実施形態では、当該方法は、以下の：
− 前記参照核酸分子の前記第六次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
− その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第六次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
を包含する。
第一の態様の第五十八の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第五十九の実施形態では、前記結合特質は、前記参照核酸分子の前記第六次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である。
第一の態様の第五十八および第五十九の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十の実施形態では、前記結合親和性はＫＤ値として表される。
第一の態様の第五十八、第五十九および第六十の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十一の実施形態では、前記予定閾値はＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第六次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である。
第一の態様の第五十八、第五十九、第六十および第六十一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十二の実施形態では、前記予定閾値はＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第六次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である。
第一の態様の第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一および第六十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十三の実施形態では、その結合特質が予定閾値を上回る前記第六次レベル誘導体は、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である。
第一の態様の第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二および第六十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十四の実施形態では、前記参照核酸分子の第七次レベル誘導体が調製され、この場合、前記第七次レベル誘導体は、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置、第四ヌクレオチド位置、第五ヌクレオチド位置、第六ヌクレオチド位置および第七ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
前記第一ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第二ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第三ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第四ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第五ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第五の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第五ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
前記第六ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第六の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第六ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第七ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第七の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第七の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第七ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第七の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である。
第一の態様の第六十四の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十五の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体、第六の第一次レベル誘導体および第七の第一次レベル誘導体は７つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記７つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質は予定閾値を上回る。
第一の態様の第六十四および第六十五の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十六の実施形態では、前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体、第六の第一次レベル誘導体および第七の第一次レベル誘導体は、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する７つの第一次レベル誘導体である。
第一の態様の第六十四、第六十五および第六十六の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十七の実施形態では、前記参照核酸分子の前記第七次レベル誘導体は前記標的分子と結合し得る。
第一の態様の第六十五、第六十六および第六十七の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十八の実施形態では、当該方法は、以下の：
− 前記参照核酸分子の前記第七次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
− その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第七次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
を包含する。
第一の態様の第六十八の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第六十九の実施形態では、前記結合特質は、前記参照核酸分子の前記第七次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である。
第一の態様の第六十八および第六十九の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第七十の実施形態では、前記結合親和性はＫＤ値として表される。
第一の態様の第六十八、第六十九および第七十の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第七十一の実施形態では、前記予定閾値はＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第七次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である。
第一の態様の第六十八、第六十九、第七十および第七十一の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第七十二の実施形態では、前記予定閾値はＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第七次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である。
第一の態様の第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一および第七十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第七十三の実施形態では、その結合特質が予定閾値を上回る前記第七次レベル誘導体は、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である。
第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二および第七十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第一の態様の第七十四の実施形態では、一標的分子と結合し得る前記核酸はＬ−核酸であり、前記参照核酸分子はＬ−核酸であり、そして前記参照核酸分子の前記誘導体の各々およびいずれかはＬ−核酸である。
本発明の根本的な問題は、第一の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三および第七十四の実施形態のうちのいずれか１つによる方法によって得られる標的分子と結合し得る核酸分子により、第二の態様の第一の実施形態でもある第二の態様において解決される。
第二の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある第二の態様の第二の実施形態では、前記核酸分子は少なくとも１つの修飾を含む。
第二の態様の第一および第二の実施形態のうちの一実施形態でもある第二の態様の第三の実施形態では、前記核酸分子は、疾患の処置および／または防止のための方法に用いるためである。
第二の態様の第一および第二の実施形態のうちの一実施形態でもある第二の態様の第四の実施形態では、前記核酸分子は疾患の診断のための方法に用いるためである。
第二の態様の第三および第四の実施形態のうちの一実施形態でもある第二の態様の第五の実施形態では、前記疾患は前記標的分子を伴う疾患である。
本発明の根本的な課題は、疾患の前記処置のための医薬品の製造のためである第二の態様の第一および第二の実施形態のいずれか１つに従って核酸を用いることにより、第三の態様の第一の実施形態でもある第三の態様において解決される。
本発明の根本的な課題は、疾患の処置のための診断薬の製造のための第二の態様の第一および第二の実施形態のいずれか１つに従って核酸分子を用いることにより、第四の態様の第一の実施形態でもある第四の態様において解決される。
第四の態様の第二の実施形態、ならびに第三の態様の第一の実施形態の一実施形態および第四の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある第三の態様の第二の実施形態では、前記疾患は前記標的分子を伴う疾患である。
本発明の根本的な課題は、第二の態様の第一および第二の実施形態のいずれか１つによる核酸分子ならびに製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物により、第五の態様の第一の実施形態でもある第五の態様において解決される。
本発明の根本的な課題は、標的分子と結合し得る核酸分子であって、
前記核酸分子が前記標的分子との結合親和性を有し、
前記核酸分子と前記標的分子との結合親和性が、参照核酸分子と前記標的分子との結合親和性と比較して、増大されるかまたは同一であって、
この場合、
ａ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列を含み、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列を有するか、あるいは
ｂ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基を含み、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基をふくみ、
前記核酸分子の前記ヌクレオチド配列および前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチドの核酸塩基部分に関して少なくとも部分的に同一であるが、しかし前記ヌクレオチドの糖部分に関して異なり、
前記核酸分子の前記ヌクレオチド配列が、リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドの両方からなり、そして前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列がリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドのいずれかからなる
核酸分子により、第六の態様の第一の実施形態でもある第六の態様において解決される。
第六の態様の第一の実施形態の一実施形態でもある第六の態様の第二の実施形態では、
ａ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列からなり、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列からなるか、あるいは
ｂ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基からなり、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基からなるが、
この場合、前記核酸分子の前記ヌクレオチド配列および前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの核酸塩基部分に関して同一であるが、しかしヌクレオチドの糖部分に関して異なっている。
第六の態様の第二の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第三の実施形態では、前記核酸分子と前記標的分子との結合親和性は、参照核酸分子と前記標的分子との結合親和性と比較して増大される。
第二の態様の第六の実施形態、ならびに第二の態様の第一、第二、第三、第四および第五の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第一、第二および第三の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第四の実施形態では、前記リボヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドであり、そして前記２’−デオキシリボヌクレオチドはＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドである。
第二の態様の第七の実施形態、ならびに第二の態様の第一、第二、第三、第四、第五および第六の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第一、第二、第三および第四の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第五の実施形態では、前記核酸分子はＬ−核酸分子であり、前記Ｌ−核酸分子はＬ−ヌクレオチドからなり、ならびに前記参照核酸分子はＬ−参照核酸分子であり、前記Ｌ−参照核酸分子はＬ−ヌクレオチドからなる。
第二の態様の第八の実施形態、ならびに第二の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六および第七の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第一、第二、第三、第四および第五の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第六の実施形態では、前記核酸分子および／または前記参照核酸分子は前記標的分子により媒介される活性のアンタゴニストである。
第二の態様の第九の実施形態、ならびに第二の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第一、第二、第三、第四、第五および第六の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第七の実施形態では、一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基を含む前記核酸分子の生物体からの排泄率は、前記ヌクレオチド配列からなる核酸分子と比較して低減される。
第二の態様の第十の実施形態、ならびに第二の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七および第八の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第一、第二、第三、第四、第五および第六の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第八の実施形態では、一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾を含む前記核酸分子は、前記ヌクレオチド配列からなる核酸分子と比較して、生物体における保持時間増大を示す。
第二の態様の第十一の実施形態、ならびに第二の態様の第九および第十の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第七および第八の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第九の実施形態では、前記修飾基は、生分解性および非生分解性修飾からなる群から選択され、好ましくは前記修飾基はポリエチレングリコール、線状ポリエチレングリコール、分枝鎖ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミデートおよびポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンからなる群から選択される。
第二の態様の第十二の実施形態、ならびに第二の態様の第十一の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第九の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第十の実施形態では、前記修飾基は、好ましくは線状ポリエチレングリコールまたは分枝鎖ポリエチレングリコールからなるポリエチレングリコールであって、前記ポリエチレングリコールの分子量は、好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、さらに好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。
第二の態様の第十三の実施形態、ならびに第二の態様の第十一の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第九の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第十一の実施形態では、前記修飾基はヒドロキシエチルデンプンであって、好ましくは前記ヒドロキシエチルデンプンの分子量は約５０〜約１０００ｋＤａ、さらに好ましくは約１００〜約７００ｋＤａ、最も好ましくは２００〜５００ｋＤａである。
第二の態様の第十四の実施形態、ならびに第二の態様の第九、第十、第十一、第十二および第十三の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第七、第八、第九、第十、第十一および第十二の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第十二の実施形態では、前記生物体は動物またはヒト身体、好ましくはヒト身体である。
第二の態様の第十五の実施形態、ならびに第六の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一および第十二の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三および第十四の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第十三の実施形態では、前記核酸分子は、疾患の処置および／または防止のための方法における使用のためである。
第二の態様の第十六の実施形態、ならびに第二の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四および第十五の実施形態のうちの一実施形態、ならびに第六の態様の第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二および第十三の実施形態のうちの一実施形態でもある第六の態様の第十四の実施形態では、前記核酸分子および前記参照核酸分子はヌクレアーゼ活性に耐性である。
以下の実施例および特徴はさらにまた、本明細書中に記載される特徴および実施形態に関連して、特にここに添付される特許請求の範囲に従属するような態様および実施形態と関連して具体化され得る、と当業者は理解するであろう。
標的分子と結合し得る参照核酸分子から出発する以下の合理的アプローチにより、標的分子と結合するさらなる一核酸分子が生成され得るし、それにより、標的分子と結合し得る前記核酸分子が前記参照核酸分子の前記標的分子と結合する、ということも発明は見出した。このような合理的アプローチは、以下のステップを包含する方法を含む：
ａ）参照核酸分子を提供するステップ（ここで、前記参照核酸分子は前記標的分子と結合し得るし、前記参照核酸分子は、一ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列はｎ個のヌクレオチドを含む）；
ｂ）前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体は１つのヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なり、前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸分子があるヌクレオチド位置にリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸があるヌクレオチド位置にデオキシリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置のデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして取替えがなされるヌクレオチド位置は修飾化ヌクレオチド位置である）；ならびに
ｃ）前記参照核酸分子の各ヌクレオチド位置に関してステップｂ）を反復し、したがって、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の一群を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群はｎ個の第一次レベル誘導体からなり、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体の各々は単一ヌクレオチド置換により前記参照核酸分子と異なっており、そして前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の各々は、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群の他の第一次レベル誘導体の単一修飾化ヌクレオチド位置のすべての単一修飾化ヌクレオチドと異なる単一修飾化ヌクレオチド位置を有する）。
一実施形態では、前記第一次レベル誘導体は一ヌクレオチド列を含み、この場合、前記ヌクレオチド配列はｎ個のヌクレオチドを含む。
第一次レベル誘導体および参照核酸分子の第一次レベル誘導体という用語は、別記しない限り、同義的に用いられる。
第一次レベル誘導体の群および参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群という用語は、別記しない限り、同義的に用いられる、ということも本発明の範囲内である。
各第一次レベル誘導体は、参照核酸分子に比して、ヌクレオチド交換を１つのみ有する、ということは当業者に理解されるであろう。一実施形態では、ステップｂ）は（ｎ−１）回反復され、その結果、参照核酸分子のｎ個のヌクレオチド位置の各々およびいずれかがヌクレオチド置換を受ける、ということも理解されるであろう。参照核酸分子の第一次レベル誘導体のこのような群において、第一次レベル誘導体の群は、全体として、参照核酸分子から出発して調製され得るすべての誘導体を表し、この場合、誘導体の各々は、単一ヌクレオチド位置で参照核酸分子と異なる。
しかしながら、ステップｂ）が（ｎ−１）回未満反復される、ということも本発明の範囲内である。ステップｂ）が全く反復されず、その結果、１つのヌクレオチド位置でのみ、ヌクレオチドがデオキシヌクレオチドにより置き換えられ、そして、それぞれ、デオキシリボヌクレオチドはリボヌクレオチドにより置き換えられる。この後者実施形態は、好ましくは、単一ヌクレオチド置換が誘導体（これは、参照核酸分子と比較して、本明細書中に記載されるような改良された結合特質を当該誘導体が有する場合、第一次レベル誘導体である）を生じる場合には実施される。
本発明の方法の実施形態は、ステップｂ）の反復時に１、２、３・・・、しかし（ｎ−１）個未満の第一次レベル誘導体が得られ、これが参照核酸分子と比較して本明細書中に記載されるような改良された結合特質を有する場合、ステップｂ）の（ｎ−１）回未満の反復、好ましくは１回以上の反復を包含する。
本発明の方法のさらなる一実施形態では、当該方法は、参照核酸のｎ個の第一次レベル誘導体の各々に関して結合特質を確定するステップを包含する。好ましくは、第一次レベル誘導体と標的分子との結合に関する結合特質が確定される。本発明の方法のさらなる一実施形態では、結合特質は、ｎ個未満の第一次レベル誘導体に関して確定され、好ましくは結合特質は、ｎ個の第一次レベル誘導体の少なくとも１つに関して確定されるが、しかしｎ個の第一次レベル誘導体のすべてに関して確定されるわけではない。さらにまたこれらの実施形態では、第一次レベル誘導体と標的分子との結合に関する結合特質が確定される。
本発明の方法のさらなる一実施形態では、当該方法は、その結合特質が予定閾値を上回るかまたはそれに達する参照核酸分子のその／それらの第一次レベル誘導体（単数または複数）を同定するステップを包含する。その一実施形態では、予定閾値を上回るかまたはそれに達する第一次レベル誘導体のすべてが同定されるか、または予定閾値を上回るかまたはそれに達する第一次レベル誘導体のうちのいくつかだけが同定される。
閾値は参照核酸分子の結合親和性である、ということも本発明の範囲内である。この実施形態では、任意のレベルの参照核酸の誘導体は、参照核酸分子と同一のまたは類似の、標的分子との結合親和性を有する。この実施形態は、本明細書中に開示されるような任意のレベルの誘導体の一実施形態である。
本発明の方法に従って、生成されるべき核酸は、参照核酸分子の第一次レベル誘導体、あるいは参照核酸分子が結合し得る、そして閾値に達する標的分子と結合し得る参照核酸分子の任意レベルの誘導体である。
参照核酸分子がＲＮＡ分子であることは、本発明の範囲内である。この実施形態では、参照核酸分子はリボヌクレオチドからなる。
参照核酸分子がＤＮＡ分子であることは、本発明の範囲内である。この実施形態では、参照核酸分子はデオキシリボヌクレオチドからなる。
参照核酸分子がリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方からなり、それにより、参照核酸分子を形成するヌクレオチドの配列の各位置では、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。
本発明のさらなる一態様は、参照核酸分子の第二次レベル誘導体である。参照核酸分子のこのような第二次レベル誘導体は、本明細書中に開示されるような本発明の方法により生成され得るし、または生成可能であり、そして、本発明の方法に関連して本明細書中に記載される。さらに具体的には、第二次レベル誘導体は、少なくとも第一ヌクレオチド位置および第二ヌクレオチド位置で参照核酸分子と異なっており、
前記第一ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
前記第二ヌクレオチド位置は、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体は、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドは前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である。
本発明のさらなる態様は、参照核酸分子の第三次レベル誘導体、参照核酸分子の第四次レベル誘導体、参照核酸分子の第五次レベル誘導体、参照核酸分子の第六次レベル誘導体および参照核酸分子の第七次レベル誘導体に関する。参照核酸分子のこのような第三次、第四次、第五次、第六次および第七次レベル誘導体は、本明細書中に開示されるような本発明の方法により生成され得るし、または生成可能であり、そして本発明の方法に関連して本明細書中に記載される。
参照核酸分子の第二次、第三次、第四次、第五次、第六次および第七次レベル誘導体に関連して、そのすべてが本発明による核酸分子であり、置換の数は、参照核酸分子の第二次レベル誘導体に関連して２つのヌクレオチドに限定されないし、参照核酸分子の第三次レベル誘導体に関連して３つのヌクレオチドに限定されないし、参照核酸分子の第四次レベル誘導体に関連して４つのヌクレオチドに限定されないし、参照核酸分子の第五次レベル誘導体に関連して５つのヌクレオチドに限定されないし、参照核酸分子の第六次レベル誘導体に関連して６つのヌクレオチドに限定されないし、参照核酸分子の第七次レベル誘導体に関連して７つのヌクレオチドに限定されず、むしろこのような誘導体は他の位置にさらなる置換を含み得る、ということは承知されるべきことである。
最後に、参照核酸分子の高次レベル誘導体が包含され、開示され、したがって本発明に包含され、したがって、本発明による核酸分子である。このような高次レベル誘導体は、例えば、第八次レベル誘導体、第九次レベル誘導体等である。参照核酸分子はｎ個のヌクレオチドを含む、という事実にかんがみて、最大次数レベル誘導体は参照核酸分子のｎ次レベル誘導体である。参照核酸分子はｎ個のヌクレオチドを含むので、参照核酸分子の最大ｎ個のヌクレオチドが、本明細書中で提供される規則および指針に従って取り替えられる。参照核酸分子のこのような第ｎ次レベル誘導体においては、したがって各々のおよび任意のヌクレオチドが本発明に従って取り替えられる。しかしながら、高次レベル誘導体は第（ｎ−ｘ）次レベル誘導体である（ここで、ｘは１からｎ＋２までの任意の整数である）、ということも本発明の範囲内である。ｘが１からｎ＋２までの任意の整数であるこのような第（ｎ−ｘ）次レベル誘導体では、本明細書中で提供される技術的教示に従って、参照核酸分子に比して、このような誘導体の（ｎ−ｘ）個のヌクレオチドが取り替えられる（ここで、ｘは１からｎ＋２までの任意の整数である）。
参照核酸分子の種々の第一次レベル誘導体のヌクレオチド置換を高次レベル誘導体と結びつけると、種々の個々の第一次レベル誘導体が予定閾値に達するかまたはそれを上回る、ということも、本発明の方法の一実施形態である。しかしながら、参照核酸分子の種々の第一次レベル誘導体のヌクレオチド置換を高次レベル誘導体と結びつけると、参照核酸分子の種々の第一次レベル誘導体はどれも予定閾値に達しないし、またはそれを上回らない、ということも本発明の方法の一実施形態である。最後に、参照核酸分子の種々の第一次レベル誘導体のヌクレオチド置換を高次レベル誘導体と結びつけると、参照核酸分子の第一次レベル誘導体のいくつかは予定閾値に達するかまたはそれを上回るが、一方、参照核酸分子の第一次レベル誘導体の他のものは予定閾値に達しないかまたはそれを上回らない、ということは、本発明の方法の一実施形態である。
本発明は、参照核酸分子の結合親和性と比較して、標的との一核酸分子の結合親和性を増大することが可能である、という意外な知見にも基づいており、この場合、前記核酸分子は一ヌクレオチド配列を含み、参照核酸分子は一ヌクレオチド配列を含み、前記核酸分子の前記ヌクレオチド配列および前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドの核酸塩基部分に関して少なくとも部分的に同一であるが、しかしヌクレオチドの糖部分に関しては異なり、前記核酸分子の前記ヌクレオチド列はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方からなり、そして前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかで構成される。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、参照核酸分子は、一核酸分子および特に一方では本発明の核酸分子の両方に関して、そして他方で、（当該）参照核酸分子として作用するかまたは用いられている核酸分子に関して、査定されるかまたは確定されるべきものであるある特質に関する参照または水準点として用いられる核酸分子である。一実施形態では、前記特質は、本発明の核酸分子の標的分子に関する、そして参照核酸分子の標的分子に関する、核酸分子の、特に本発明の核酸分子の結合親和性、ならびに参照核酸分子の結合親和性である。好ましい一実施形態では、本発明の核酸分子の標的分子は、参照核酸分子の標的分子であり、さらに好ましくは本発明の核酸分子の標的分子は、参照核酸分子と同一の標的分子である。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、本発明の参照核酸分子の一ヌクレオチド配列中に含有されるヌクレオチドの少なくとも１つの核酸塩基が参照核酸分子のヌクレオチド配列中に含有されるヌクレオチドの少なくとも１つの核酸塩基と同一であるならば、本発明の核酸分子の一ヌクレオチド配列は、参照核酸分子の一ヌクレオチド配列と部分的に同一である。一実施形態では、本発明の核酸分子のヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも７５％、好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％より多く、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、参照核酸分子のヌクレオチドの核酸塩基と同一である。代替的一実施形態では、本発明の参照核酸分子のヌクレオチドの核酸塩基の少なくとも７５％、好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％より多く、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、本発明の核酸分子のヌクレオチドの核酸塩基と同一である。本発明の核酸分子のさらなる一実施形態では、２’−デオキシリボヌクレオチドがリボヌクレオチドにより取り替えられ、そしてデオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシアデノシン−５−ホスフェート；２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート；２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェート；チミジン−５’−ホスフェートである場合、リボヌクレオチドはアデノシン−５’−ホスフェート、グアノシン−５’−ホスフェート、シチジン−５’−５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートまたはウリジンウリジン−５’−ホスフェートであり、ならびにリボヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドにより取り替えられ、そしてリボヌクレオチドがアデノシン−５’−ホスフェート、グアノシン−５’−ホスフェート、シチジン−５’−ホスフェート、ウリジン−５’−ホスフェートである場合、デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシアデノシン−５−ホスフェート；２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート；２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェート；２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェートまたはチミジン−５−ホスフェートである場合を除いて、核酸塩基のすべてが参照核酸分子の核酸塩基と同一である。
本発明に従って、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列と、参照核酸分子のヌクレオチド配列との同一性または部分的同一性が、ヌクレオチドの核酸塩基部分に基づいて、またはヌクレオチドの核酸塩基部分に関して、決定される。それと関連して、そして本明細書中で好ましくは用いられる場合、核酸塩基または核酸塩基部分は、それぞれヌクレオシドおよびヌクレオチドの窒素塩基である。さらに好ましくは、核酸塩基は、アデノシン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルからなる群から選択される。したがって、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列と参照核酸分子のヌクレオチド配列の同一性または部分的同一性は、ヌクレオチドの核酸塩基の化学的性質により決定される。したがって、本発明と関連して、２’−デオキシアデノシン−５’−（トリ）ホスフェートはアデノシン−５’−（トリ）ホスフェートと同一であるとみなされ、２’−デオキシグアノシン−５’−（トリ）ホスフェートはグアノシン−５’−（トリ）ホスフェートと同一であるとみなされ、チミジン−５’−（トリ）ホスフェートは５−メチルウリジン ５’−（トリ）ホスフェートと同一であるとみなされ、２’−デオキシシチジン ５’−（トリ）ホスフェートはシチジン ５’−（トリ）ホスフェートと同一であるとみなされ、そしてデオキシウリジン ５’−（トリ）ホスフェートはウリジン ５’−（トリ）ホスフェートと同一であるとみなされる。
本特許出願全体を通して、核酸の組成を記載するために一般に既知の頭字語が用いられ、それにより、文字Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵおよびＴは、それぞれ核酸塩基アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミジンを含有するリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドを意味する。合成オリゴヌクレオチドの５’−末端に配置される場合、ヌクレオチドはヌクレオシドであり、すなわち、それは５’−ホスフェート基を保有しない。示された配列が主にリボヌクレオチド配列（ＲＮＡ）であっても、２’−デオキシリボヌクレオチド配列（デオキシリボヌクレオチド配列またはＤＮＡとも呼ばれる）であっても、それは、図、図の凡例または所定の実施例の本文から読者により決定されるべきものである。一般的に、その場合、リボヌクレオチドから２’−デオキシリボヌクレオチドに、またはその逆に交換される１個または数個の位置が存在する。主にリボヌクレオチド配列への１個または数個の２’デオキシリボヌクレオチドの組入れは、核酸塩基の同一性を示す大文字の前の小文字「ｄ」により示される（上記参照）。逆に、ヌクレオチド配列中への１個または数個の２’デオキシリボヌクレオチド組入れは、核酸塩基の同一性を示す大文字の前の小文字「ｄ」により示される。ヌクレオチドは、１’−位置に結合される核酸塩基を有するリボース−５’−ホスフェートまたは２’−デオキシリボース−５’−ホスフェートであるとして当業者に既知である。核酸塩基との連結は、９位置のプリン核酸塩基（Ａ、Ｇ）で、ならびに１位置のピリミジン核酸塩基（Ｃ、Ｔ、Ｕ）で起こる。
本発明による核酸は核酸分子である、ということは本発明の範囲内である。その限りにおいて、核酸および核酸分子という用語は本明細書中で、同義的（正反対を示さないとまではいかない）に用いられる。さらに、このような核酸は、好ましくは、本発明による核酸分子、本発明による核酸、当該発明の核酸または当該発明の核酸分子としても、本明細書中で言及される。
本明細書中に記載されるような本発明による核酸の特徴は、本発明の任意の態様において具体化され得るが、この場合、核酸は、単独でまたは任意の組合せで用いられる。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、グルカゴンという用語は、任意のグルカゴン、例えば哺乳類グルカゴン（これに限定されない）を指す。好ましくは、哺乳類グルカゴンは、ヒト、ラット、マウス、サル、ブタ、ウサギ、ハムスター、イヌ、ヒツジ、ニワトリおよびウシのグルカゴンからなる群から選択される。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、Ｓ１Ｐという用語は、任意のＳ１Ｐ、例えば哺乳類Ｓ１Ｐ（これに限定されない）を指す。好ましくは、哺乳類Ｓ１Ｐは、ヒト、ラット、マウス、サル、ブタ、ウサギ、ハムスター、イヌ、ヒツジ、ニワトリおよびウシのＳ１Ｐからなる群から選択される。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、ＣＧＲＰという用語は、任意のＣＧＲＰ、例えば哺乳類ＣＧＲＰ（これに限定されない）を指す。好ましくは、哺乳類ＣＧＲＰは、ヒト、ラット、マウス、サル、ブタ、ウサギ、ハムスター、イヌ、ヒツジ、ニワトリおよびウシのＣＧＲＰからなる群から選択される。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、Ｃ５ａという用語は、任意のＣ５ａ、例えば哺乳類Ｃ５ａ（これに限定されない）を指す。好ましくは、哺乳類Ｃ５ａは、ヒト、ラット、マウス、サル、ブタ、ウサギ、ハムスター、イヌ、ヒツジ、ニワトリおよびウシのＣ５ａからなる群から選択される。
グルカゴンに対するアンタゴニストは、本明細書中で好ましくは用いられる場合、グルカゴンと結合する分子、例えば本明細書中に開示される核酸分子であり、好ましくは、例えば実施例に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定において、またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、グルカゴンの機能を抑制する。
Ｓ１Ｐに対するアンタゴニストは、本明細書中で好ましくは用いられる場合、Ｓ１Ｐと結合する分子、例えば本明細書中に開示される核酸分子であり、好ましくは、例えば実施例に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定において、またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、Ｓ１Ｐの機能を抑制する。
Ｃ５ａに対するアンタゴニストは、本明細書中で好ましくは用いられる場合、Ｃ５ａと結合する分子、例えば本明細書中に開示される核酸分子であり、好ましくは、例えば実施例に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定において、またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、Ｃ５ａの機能を抑制する。
ＣＧＲＰに対するアンタゴニストは、本明細書中で好ましくは用いられる場合、ＣＧＲＰと結合する分子、例えば本明細書中に開示される核酸分子であり、好ましくは、例えば実施例に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定において、またはｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて、ＣＧＲＰの機能を抑制する。
本発明による核酸分子、ならびに参照核酸は、好ましくは、ヌクレオチドの以下の３つの異なるストレッチを含む：ヌクレオチドの第一末端ストレッチ、ヌクレオチドの中央ストレッチおよびヌクレオチドの第二末端ストレッチ。核酸分子の分野においては、ヌクレオチドの任意の配列は５’→３’方向で示されるので、ヌクレオチドの第一末端ストレッチは中央ストレッチの５’末端に整列され、ヌクレオチドの第二末端ストレッチはヌクレオチドの中央ストレッチの３’末端に整列される。このために、ヌクレオチドの第一末端ストレッチはヌクレオチドの５’−末端ストレッチとしても本明細書中で言及されるし、ヌクレオチドの第二末端ストレッチはヌクレオチドの３’−末端ストレッチとしても本明細書中で言及される（その逆でも言及される）。しかしながら、ヌクレオチドの第一末端ストレッチがヌクレオチドの３’−末端ストレッチと本明細書中で言及され、そしてヌクレオチドの第二末端ストレッチがヌクレオチドの５’−末端ストレッチと本明細書中で言及される（その逆もあり）、ということも本発明の範囲内である。これは、特に、ヌクレオチドの第一ストレッチおよびヌクレオチドの第二ストレッチが互いに相補的な塩基である実施形態において当てはまる。
本発明の核酸分子の一実施形態では、ヌクレオチドの第一ストレッチおよびヌクレオチドの第二ストレッチは、互いに相補的な塩基である。本明細書中で好ましくは用いられる場合、ヌクレオチドの２つのストレッチは、前記２つのストレッチが、少なくとも文書でまたはコンピューターで、互いとハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーション時に、二本鎖構造が形成される場合、互いに相補的な塩基である。ハイブリダイゼーションは、好ましくはワトソン・クリック型塩基対合規則のような塩基対合に関する既知の規則に従って起こるかまたはなされる。しかしながら、そして当業者が認めるように、他の塩基対合規則、例えばフーグステン型塩基対合が起こり得るし、または適用され得る。さらにまた本発明の核酸分子と関連して、このようなハイブリダイゼーションは二本鎖構造を生じる、ということも当業者は認めるであろう。このような二本鎖構造は、単一核酸分子の一部であって、この場合、核酸分子の一本鎖の２つの空間的に分離されたストレッチがハイブリダイズされる。代替的には、このような二本鎖構造は、２つ以上の別個の核酸分子の２つ以上の別個の鎖により形成され得る。任意のハイブリダイゼーションは必ずしも２つのストレッチの全長に亘って起こっているかまたはなされるわけではない、ということも当業者は認めるであろう。
さらなる一実施形態では、ヌクレオチドの２つのストレッチは、前記２つのストレッチが、原則として、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ条件下でハイブリダイズし得るならば、互いに相補的な塩基である。互いに相補的な塩基であるヌクレオチドの第一ストレッチおよびヌクレオチドの第二ストレッチに関して、ならびに文書でまたはコンピューターでのヌクレオチドの第一ストレッチおよびヌクレオチドの第二ストレッチのハイブリダイゼーションに関して、本明細書中に開示される同一の考えは、この実施形態にも等しく当てはまる。しかしながら、このようなｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で、ハイブリダイゼーションは起こり得るし、起こらないこともある、ということは認められなければならない。
本発明に関連して、２つのストレッチが互いとハイブリダイズするという特徴は、このようなハイブリダイゼーションが２つのストレッチの塩基相補性のために起こると推定されるが、しかし必ずしも任意のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ条件下で起こる必要はない、ということも認められるべきである。
核酸分子のヌクレオチドの３つのストレッチ −すなわち、ヌクレオチドの第一末端ストレッチ、ヌクレオチドの中央ストレッチおよびヌクレオチドの第二末端ストレッチ− は、５’→３’方向：ヌクレオチドの第一末端ストレッチ−ヌクレオチドの中央ストレッチ−ヌクレオチドの第二末端ストレッチで互いに整列される。しかしながら、代替的には、ヌクレオチドの第二末端ストレッチ、ヌクレオチドの中央ストレッチおよびヌクレオチドの第一末端ストレッチが、５’→３’方向で互いに整列される。
一方では本発明の核酸分子および他方では参照核酸分子といったような異なる核酸分子間の限定ストレッチの配列における差は、本発明の核酸分子が結合し得る標的分子との結合親和性に影響を及ぼす。好ましい一実施形態では、本発明の核酸分子の結合分析に基づいて、本発明による核酸のヌクレオチドの中央ストレッチおよびそれを形成するヌクレオチドは、個々に、そしてさらに好ましくはそれらの全体として、本発明の核酸分子と標的分子との結合に不可欠である。
「ストレッチ」および「ヌクレオチドのストレッチ」という用語は、別記しない限り、本明細書中で同義的に用いられる。
好ましい一実施形態では、本発明による核酸は、単一核酸分子である。さらなる一実施形態では、単一核酸分子は、多数の単一核酸分子として、または多数の単一核酸分子種として存在する。
本発明の核酸分子は、好ましくは、ホスホジエステル結合または連結を介して互いに共有結合されるヌクレオチドからなる、と当業者は認めるであろう。
好ましい一実施形態では、整列という用語は、本明細書中で用いる場合、本明細書中に開示される核酸に関連して本明細書中に記載される構造的または機能的特徴または要素の順序または配列を意味する。
本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子と、特に本明細書中に開示される特定の配列（単数または複数）と本質的に相同である核酸分子も含む。実質的に相同のという用語は、例えば、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％より多く、９６％、９７％、９８％または９９％である、と理解される。
本発明の核酸分子中に存在する相同ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、核酸分子中に存在するヌクレオチドの総数によって決まる。修飾パーセントは、核酸分子中に存在するヌクレオチドの総数を基礎にされ得る。
２つの核酸分子の間の相同性は、当業者に既知であるように確定され得る。さらに具体的には、指示されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に比して試験配列（単数または複数）に関する配列相同性パーセントを算定するために、配列比較アルゴリズムが用いられ得る。試験配列は、好ましくは、異なる核酸分子と、相同であると言われるか、またはそれが相同であるか否か、そうであるならば、どの程度に相同であるかを試験されるべきものである配列または核酸分子であり、それにより、このような異なる核酸分子は相同参照配列とも呼ばれる。比較のための配列の最適アラインメントは、例えばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ （Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， １９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ （Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ （Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， １９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューター実装により（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）、または外観検査により、実行され得る。
配列同一性パーセントを確定するために適しているアルゴリズムの一例は、基本的局所アラインメント検索ツール（以後、「ＢＬＡＳＴ」）で用いられるアルゴリズムである（例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ等（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． １９９０ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ， １９９７）参照）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センター（以後、「ＮＣＢＩ」）を介して公的に利用可能である。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いて配列同一性を決定するのに用いられるデフォルトパラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓ等（ＭｃＧｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ ， ２００４）に記載されている。
本発明の核酸分子は、本発明の核酸分子に関して、特に本明細書中に開示され、それらのヌクレオチド配列により限定される本発明の特定の核酸分子に関して、ある程度の同一性を有する核酸分子も含む。さらに好ましくは、本発明は、本発明の核酸分子に関して、特に本明細書中に開示され、それらのヌクレオチド配列またはその一部分により限定される本発明の特定の核酸分子に関して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは９５％より多く、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する核酸分子も含む。
発明の核酸または本発明による核酸という用語は、好ましくは核酸または上記一部がグルカゴンに包含されるかまたはグルカゴンと結合し得る程度に、本明細書中に開示される核酸配列またはその一部を含む核酸分子、例えば本発明による核酸の代謝産物または誘導体を含む。このような核酸は、例えば切頭化により、本明細書中に開示されるものから得られる。さらにまた、切頭化はヌクレオチドの内部配列と関連し、すなわちそれは、それぞれ５’および３’末端ヌクレオチド間のヌクレオチド（単数または複数）と関連し得る。さらに、切頭化は、本明細書中に開示される核酸の配列からの単一ヌクレオチドと同じくらい小さい欠失を含む。切頭化は、本発明の核酸（単数または複数）の１つより多いストレッチにも関連し、それによりストレッチは一ヌクレオチド長と同じくらい小さい。本発明による核酸の結合は、慣例の実験を用いて、あるいは本明細書中に記載されるような、好ましくは実施例の部分で本明細書中に記載されるような方法を用いるかまたは採用することにより、確定され得る。
本発明の核酸分子はより長い核酸分子の一部であり、それによりこの長い核酸分子は数個の部分を含み、それにより少なくとも１つのこのような部分は本発明の核酸分子またはその一部である、ということも本発明の範囲内である。このような長い核酸分子の他の部分（単数または複数）は、１または数個のＤ−核酸（単数または複数）またはＬ−核酸（単数または複数）であり得る。本発明と関連して、任意の組合せが用いられ得る。長い核酸の他の部分（単数または複数）は、結合とは異なる機能を示し得る。考え得る一機能は、他の分子との相互作用を可能にすることであって、例えば固定化、架橋、検出または増幅のための他の分子である。本発明のさらなる一実施形態では、本発明による核酸は、個々の部分または組合せ部分として、本発明の核酸のうちのいくつかを含む。本発明の核酸のうちのいくつかを含むこのような核酸も、長い核酸という用語に包含される。
Ｌ−核酸分子は、本明細書中で用いる場合、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸分子であり、さらに好ましくはＬ−ヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドまたはＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドである。好ましい一実施形態では、Ｌ−核酸分子は、完全にＬ−リボヌクレオチドまたはＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。別の好ましい実施形態では、Ｌ−核酸分子は、Ｌ−リボヌクレオチドおよびＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。
Ｄ−核酸分子は、本明細書中で用いる場合、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸分子であり、さらに好ましくはＤ−ヌクレオチドはＤ−リボヌクレオチドまたはＤ−２’−デオキシリボヌクレオチドである。好ましい一実施形態では、Ｄ−核酸分子は、完全にＤ−リボヌクレオチドまたはＤ−２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。別の好ましい実施形態では、Ｄ−核酸分子は、Ｄ−リボヌクレオチドおよびＤ−２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。
核酸および核酸分子という用語は、明白にそうでないと示されない限り、互換的に本明細書中で用いられる。
さらにまた、別記されない場合、任意のヌクレオチド配列が５’→３’方向で本明細書中に記述される。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、配列、ストレッチまたはサブストレッチの５’末端に関して、ヌクレオチドの任意の位置が決定されるかまたは言及される。したがって、第二ヌクレオチドは、それぞれ配列、ストレッチおよびサブストレッチの５’末端から数えて２番目のヌクレオチドである。さらにまた、それに従って、最後から２番目のヌクレオチドは、それぞれ配列、ストレッチおよびサブストレッチの３’末端から数えて２番目のヌクレオチドである。
本発明の核酸分子をＬ−核酸分子として意図することは、いくつかの理由のために有益である。Ｌ−核酸は、天然Ｄ−核酸のエナンチオマーである。しかしながら、ヌクレアーゼの広範囲に及ぶ存在のために、Ｄ−核酸は、水溶液中で、特に生物学的系または生物試料中で非常に安定であるというわけではない。天然ヌクレアーゼ、特に動物細胞からのヌクレアーゼは、Ｌ−核酸を分解できない。このため、Ｌ−核酸の生物学的寿命は、動物およびヒト身体を含めて、このような系において有意に増大される。Ｌ−核酸の分解性を欠くため、ヌクレアーゼ分解産物は生成されず、したがって、それに起因する副作用は観察されない。この態様は、標的分子の存在を伴う疾患および／または障害の治療に用いられる事実上すべての他の化合物とＬ−核酸との間に境界を画する。ワトソン・クリック型塩基対合とは異なる機序により標的分子と特異的に結合するＬ−核酸、または部分的にまたは完全にＬ−ヌクレオチドからなるアプタマー（特に、アプタマーのその部分は標的分子とアプタマーの結合に関与する）は、スピーゲルマーとも呼ばれる。アプタマーおよびスピーゲルマーは、そのようなものとして、当業者に既知であり、特に‘Ｔｈｅ Ａｐｔａｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ’ （ｅｄｓ． Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ， ２００６）に記載されている。
本発明の核酸分子は、それがＤ−核酸分子として存在するか、Ｌ−核酸分子かまたはＤ，Ｌ−核酸分子かにかかわらず、一本鎖または二本鎖核酸分子として存在し得る、ということも本発明の範囲内である。好ましくは、本発明の核酸分子は、一次配列のために限定に次構造を示し、したがって三次構造も形成し得る一本鎖核酸分子である。しかしながら本発明の核酸分子は、互いに相補的または部分的に相補的である２つの鎖が互いとハイブリダイズされるという意味で二本鎖化もされ得る。
本発明の核酸分子は、修飾され得るし、または少なくとも１つの修飾基を含み得る。このような修飾は、核酸の単一ヌクレオチドに関連し得るし、当該技術分野で周知である。このような修飾の例は、特にＶｅｎｋａｔｅｓａｎ等（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ， Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． ２００３）およびＫｕｓｓｅｒ （Ｋｕｓｓｅｒ ２０００）により記載されている。このような修飾は、核酸が構成される個々のヌクレオチドの２’位置でのＨ原子、Ｆ原子、あるいはＯ−ＣＨ３基またはＮＨ２−基であり得る。さらにまた、本発明の核酸は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドを含み得る。一実施形態では、本発明による核酸は、ＬＮＡヌクレオチドからなる。
一実施形態では、本発明の核酸分子は多くの部分に分かれた核酸であり得る。多くの部分に分かれた核酸は、本明細書中で用いる場合、少なくとも２つの別個の核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２つの核酸鎖は機能的単位を形成し、それにより機能的単位は一標的分子、好ましくは当該標的分子に対するリガンドであるか、または一標的分子、好ましくは当該標的分子と結合し得る。少なくとも２つの核酸鎖は、当該核酸分子を切断して２つの鎖を生成することにより、または本発明の、すなわち全体的核酸の第一部分に対応する一核酸ならびに全体的核酸の第二部分に対応する別の核酸を合成することにより、本発明の任意の核酸分子から得られる。切断および合成はともに、多くの部分に分かれた核酸を生成するために適用され得るが、この場合、上記で例示されるような２つより多くの鎖が存在する、ということが認められるべきである。言い換えれば、少なくとも２つの別個の核酸鎖は、典型的には、相補性であり、互いとハイブリダイズする２つの鎖と異なるが、しかし上記の少なくとも２つの別個の核酸鎖間にはある程度の相補性が存在し、それによりこのような相補性が上記の別個の鎖のハイブリダイゼーションを生じ得る。
最後に、本発明の核酸に関する完全に閉じられた、すなわち環状の構造が具体化される、すなわち、本発明による核酸分子は、好ましくは共有結合により、一実施形態では閉じられており、それにより、さらに好ましくはこのような共有結合は、本発明の核酸分子の核酸配列（単数または複数）の５’末端および３’末端間に作られる、ということも本発明の範囲内である。
本発明の核酸分子の結合定数を決定するための実行可能な手段は、本発明の核酸分子が好都合なＫＤ値範囲を示すという上記知見を確証する実施例に記載されるような方法の使用である。個々の核酸分子と標的分子との間の結合の強度を表すための適切な測定値がいわゆるＫＤ値であって、そのようなものとして同様に、その決定方法は当業者に既知である。
好ましくは、本発明の核酸分子により示されるＫＤ値は、１μＭより低い。約１μＭというＫＤ値は、標的分子への核酸分子の非特異的結合に特徴的であるといわれている。当業者が認めるように、化合物の一群、例えば本発明の核酸分子のＫＤ値は、一定範囲内である。約１μＭという上記ＫＤは、ＫＤ値に関する好ましい上限である。標的結合核酸分子のＫＤに関する下限は、約１０ピコモルと同じくらい小さい値であり得るし、またはより高い値であり得る。標的分子に結合している個々の核酸分子のＫＤ値は好ましくはこの範囲内である、ということは本発明の範囲内である。好ましい範囲は、この範囲内の任意の第一の数およびこの範囲内の任意の第二の数を選択することにより限定され得る。好ましい上のＫＤ値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下のＫＤ値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。より好ましい上のＫＤ値は１０ｎＭであり、さらに好ましい低ＫＤ値は１００ｐＭである。
本発明の核酸分子の結合特性のほかに、本発明の核酸分子は、それぞれの標的分子の機能を抑制する。標的分子の機能の抑制−例えば前記のような標的分子のそれぞれの受容体の刺激−は、本発明の核酸分子が標的分子と結合し、本発明の核酸分子と標的分子の複合体を形成することにより達成される。核酸分子と標的分子のこのような複合体は、普通は標的分子により刺激される受容体（単数または複数）を刺激することができない。したがって、本発明の核酸分子による受容体機能の抑制は、標的分子により刺激され得ないそれぞれの受容体とは無関係であるが、しかし本発明による核酸分子により標的分子による受容体の刺激を防止することに起因する。
本発明の核酸分子の阻害定数を決定する実行可能な手段は、本発明の核酸分子が好都合な阻害定数を示すという上記知見を確証する実施例に記載されるような方法の使用であって、これが治療的処置スキームにおけるこのような核酸分子の使用を可能にする。標的分子、標的分子とそれぞれの受容体との相互作用に及ぼす個々の核酸分子の阻害作用の強度を表すための適切な測定値がいわゆる半最大阻害濃度（ＩＣ５０）であって、そのようなものとして同様に、その決定方法は当業者に既知である。
好ましくは、本発明の核酸分子により示されるＩＣ５０値は１μＭより低い。約１μＭというＩＣ５０値は、核酸分子による標的機能の非特異的阻害に特徴的であるといわれている。当業者が認めるように、化合物の一群、例えば本発明の核酸分子のＩＣ５０値は、一定範囲内である。約１μＭという上記ＩＣ５０は、ＩＣ５０値に関する好ましい上限である。標的結合核酸分子、例えば本発明の核酸分子のＩＣ５０に関する下限は、約１０ピコモルと同じくらい小さい値であり得るし、またはより高い値であり得る。本発明の核酸分子のＩＣ５０値は好ましくはこの範囲内である、ということは本発明の範囲内である。好ましい範囲は、この範囲内の任意の第一の数およびこの範囲内の任意の第二の数を選択することにより限定され得る。好ましい上のＩＣ５０値は２５０ｎＭおよび１００ｎＭであり、好ましい下のＩＣ５０値は５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭおよび１０ｐＭである。より好ましい上のＩＣ５０値は５ｎＭであり、さらに好ましい低ＩＣ５０値は１ｎＭである。
本発明の核酸分子は任意の長さを有し得るが、但し、それらは依然として標的分子と結合し得るし、または標的分子の機能を阻害し得る。本発明の核酸分子の好ましい長さが存在する、ということは当該技術分野で認められている。典型的には、その長さは１５〜１２０ヌクレオチドである。１５と１２０との間の任意の整数が、本発明の核酸分子の考え得る長さである、ということを当業者は認めるであろう。本発明による核酸の長さに関するさらに好ましい範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５４ヌクレオチドおよび約３９〜４４ヌクレオチドの長さである。
本明細書中に開示される核酸が、好ましくは高分子量部分である、および／または好ましくは特に動物身体、好ましくはヒト身体における滞留時間に関して核酸の特質を修飾させる修飾基を含む、ということは本発明の範囲内である。このような修飾の特に好ましい実施形態は、ペギル化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）およびヘシル化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ）である。本明細書中で用いる場合、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）を意味し、ＨＥＳはヒドロキシエチルデンプンを意味する。ペギル化は、本明細書中で好ましくは用いる場合、本発明による核酸の修飾であって、それによりこのような修飾は、本発明による核酸と結合されるＰＥＧ部分からなる。ヘシル化は、本明細書中で好ましくは用いる場合、本発明による核酸の修飾であって、それによりこのような修飾は、本発明による核酸と結合されるＨＥＳ部分からなる。これらの修飾は、このような修飾を用いて核酸を修飾する方法と同様に、欧州特許出願ＥＰ １ ３０６ ３８２（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
このような高分子量部分であるＰＥＧの場合、分子量は、好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、さらに好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである。このような高分子量部分であるＨＥＳの場合、分子量は、好ましくは約５０〜約１０００ｋＤａ、さらに好ましくは約１００〜約７００ｋＤａ、最も好ましくは約２００〜５００ｋＤａである。ＨＥＳは、０．１〜１．５、さらに好ましくは１〜１．５のモル置換を示し、そして約０．１〜１５、好ましくは約３〜１０のＣ２／Ｃ６比として表される置換試料を示す。ＨＥＳ修飾の方法は、例えば独国特許出願ＤＥ １ ２００４ ００６ ２４９．８（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
修飾は、原則として、その任意の位置で本発明の核酸分子になされ得る。好ましくは、このような修飾は、核酸分子の５’末端ヌクレオチド、３’末端ヌクレオチドおよび／または５’ヌクレオチドと３’ヌクレオチドの間の任意のヌクレオチドに対してなされ得る。
修飾、好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分は、直接的にまたは間接的に、好ましくはリンカーを介して、本発明の核酸分子に結合され得る。本発明による核酸分子が、１つ以上の修飾、好ましくは１つ以上のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含む、ということも本発明の範囲内である。一実施形態では、個々のリンカー分子は、１つより多いＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分を本発明による核酸分子と結びつける。本発明に関連して用いられるリンカーは、それ自体、線状または分枝鎖であり得る。この種のリンカーは当業者に既知であり、さらに、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３およびＷＯ２００３／０３５６６５に記載されている。
好ましい一実施形態では、リンカーは生分解性リンカーである。生分解性リンカーは、本発明による核酸からの修飾の解除のために、特に動物身体、好ましくはヒト身体における滞留時間に関して、本発明による核酸の特質を修飾させる。生分解性リンカーの使用は、本発明による核酸の滞留時間のより良好な制御を可能にし得る。このような生分解性リンカーの好ましい一実施形態は、国際特許出願ＷＯ２００６／０５２７９０、ＷＯ２００８／０３４１２２、ＷＯ２００４／０９２１９１およびＷＯ２００５／０９９７６８（これらに限定されない）に記載されているような生分解性リンカーである。
修飾または修飾基は生分解性修飾であり、それにより生分解性修飾が、直接的にまたは間接的に、好ましくはリンカーを介して、本発明の核酸分子に結合され得る、ということは本発明の範囲内である。生分解性修飾は、本発明による核酸からの修飾の解除または分解のために、特に動物身体、好ましくはヒト身体における滞留時間に関して、本発明による核酸の特質を修飾させる。生分解性修飾の使用は、本発明による核酸の滞留時間のより良好な制御を可能にし得る。このような生分解性修飾の好ましい一実施形態は、国際特許出願ＷＯ２００２／０６５９６３、ＷＯ２００３／０７０８２３、ＷＯ２００４／１１３３９４およびＷＯ２０００／４１６４７（これらに限定されない）に、好ましくはＷＯ２０００／４１６４７のページ１８の４〜２４行目に記載されているような生分解性修飾である。
上記のような修飾と並んで、本発明による核酸の特質を修飾するために他の修飾が用いられ、それにより、このような他の修飾は、タンパク質、脂質、例えばコレステロール、および糖鎖、例えばアミラーゼ、デキストラン等の群から選択され得る。
如何なる理論にも縛られること無く考えると、好ましくは生理学的に許容可能である高分子量部分、例えばポリマー、さらに特定的には本明細書中に開示されるポリマーのうちの１または数個のポリマーを有する本発明による核酸を修飾することにより、排泄動力学が変更されると思われる。さらに特定的には、このような修飾された本発明の核酸の分子量増大のため、そして代謝の影響を受けていない本発明の核酸のため、特にＬ型における場合、動物身体からの、好ましくは哺乳動物身体からの、さらに好ましくはヒト身体からの排泄が低減される、と思われる。排泄は、典型的には腎臓を介して起こるので、このような修飾化核酸の糸球体濾過速度が、この種の高分子量修飾を有さない核酸と比較して、有意に低減され、これが動物身体における滞留時間の増大を生じる、と本発明人等は推測する。それに関連して、このような高分子量修飾にもかかわらず、本発明による核酸の特異性は有害な意味で影響を及ぼさない、ということは特に注目に値する。その限り２置いて、本発明による核酸は、特に、普通は薬学的に活性な化合物から予期され得ない意外な特質を有し、したがって持続性放出を提供する薬学的処方物は、本発明による核酸の持続性放出を必ずしも提供する必要はない。むしろ高分子量部分を含むその修飾化形態の本発明による核酸はそのようなものとして、その修飾のため、それらがあたかも持続性放出処方物から放出されたかのようにそれらが作用する場合に、持続性放出処方物として既に用いられ得ている。その限りにおいて、本明細書中に開示されるような本発明による核酸分子および本発明に夜このような修飾化核酸分子ならびにそれを含む任意の組成物の修飾（単数または複数）は、別個の、好ましくはその制御化薬物動態および生体内分布を提供し得る。これは、循環における滞留時間および組織への分布も包含する。このような修飾はさらに、特許出願ＷＯ２００３／０３５６６５に記載されている。
しかしながら、本発明による核酸は、如何なる修飾も含まないし、特に、高分子量修飾、例えばペギル化またはヘシル化を含まない、ということも本発明の範囲内である。このような実施形態は、本発明による核酸が、身体中の任意の標的器官または組織への選択的分布を示す場合、あるいは投与後の身体からの本発明による核酸の迅速なクリアランスが所望される場合には、特に好ましい。身体中の任意の標的器官または組織に対する選択的分布プロフィールを有する本明細書中に開示されるような本発明による核酸は、核酸の全身濃度を低く保持しながら、標的組織における有効な局所濃度の確立を可能にする。これは、経済的見地から有益であるだけで無く、核酸作用物質への他の組織の不必要な曝露を低減する低用量の使用を可能にし、したがって副作用の潜在的危険を低減する。投与後の身体からの本発明による核酸の迅速なクリアランスは、特に本発明による核酸またはそれを含む医薬品を用いるｉｎ ｖｉｖｏ画像処理または特定の治療的用量投与要件の場合に所望され得る。
本発明のさらなる態様は、医薬品または診断薬の製造のための本発明の核酸分子および／または本発明のアンタゴニストの使用に関する。本発明のさらなる態様は、疾患の処置または防止の方法における本発明の核酸分子および／または本発明のアンタゴニストの使用に関する。
本発明のさらなる態様は、少なくとも本発明の核酸分子を、任意にさらに薬学的に活性な薬学的化合物問い一緒に含有し、それにより本発明の核酸物質が好ましくは薬学的に活性名化合物それ自体として作用する薬学的組成物に関する。このような薬学的組成物は、好ましい一実施形態では、少なくとも製薬上許容可能な担体を含む。このような担体は、例えば水、緩衝液、ＰＢＳ、グルコース溶液、好ましくは５％グルコース、塩平衡溶液、クエン酸塩、デンプン、糖、ゼラチンまたは任意の他の許容可能な担体物質であり得る。このような担体は、一般的に当業者に既知である。本発明の薬学的組成物の、またはそれに関連した、任意の実施形態、使用および態様も、本発明の医薬品に適用可能であるし、その逆もある、ということを当業者は認識するであろう。
本発明の核酸分子、それを含有する医薬品および／または薬学的組成物は、特に任意の疾患の処置および／または防止および／または診断に用いられ得る、ということを当業者は認識するであろうが、この場合、本発明の核酸分子が結合し得る標的分子が関与する。さらに具体的には、このような疾患は、本発明の核酸分子と標的分子との結合が、あるいは好ましくは本発明の核酸分子により標的分子の作用を相殺することが、原則的に、疾患を処置するのに、疾患を防止するのに、または疾患の症候を軽減するのに適している任意の疾患である。
本発明の医薬品の一実施形態では、このような医薬品は、本明細書中に開示される疾患のいずれか、特に本発明の医薬品が用いられるべきである疾患のための他の処置と組合せて用いるためである。
本発明の薬学的組成物の一実施形態では、このような薬学的組成物は、本明細書中に開示される疾患のいずれか、特に本発明の医薬品が用いられるべき疾患のための他の処置と組合せて用いるためである。
「併用療法」（または「同時療法」）は、本発明の医薬品と少なくとも第二のまたはさらなる作用物質を投与して、これらの治療薬、すなわち本発明の医薬品と前記の第二のまたはさらなる作用物質の同時作用から有益な作用を提供するよう意図することを包含する。組合せの有益な作用としては、治療薬に起因する薬物動態的または薬力学的同時作用が挙げられるが、これに限定されない。組合せにおけるこれらの治療薬の投与は、典型的には、限定時間（通常は、選択される組合せによって、数分、数時間、数日または数週間）に亘って実行される。
「併用療法」は、別個の単一療法レジメンの一部としてこれらの治療薬のうちの２つ以上の投与を包含するよう意図され得るが、しかし一般的には包含しない。「併用療法」は、逐次的なこれらの治療薬の投与（すなわち、この場合、各治療薬は異なる時点で投与される）、ならびに実質的に同時の、これらの治療薬または治療薬のうちの少なくとも２つの投与を含むよう意図される。実質的に同時の投与は、例えば、一定比率の各治療薬を有する単一カプセルを、または治療薬の各々に関する単一カプセルを複数で、被験体に投与することにより成し遂げられ得る。
各治療薬の逐次的投与または実質的同時投与は、任意の適切な経路により、例えば局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、ならびに粘膜組織を介した直接吸収（これらに限定されない）により実行され得る。治療薬は、同一経路により、または異なる経路により投与され得る。例えば、選択される組合せの第一治療薬は注射により投与され、一方、組合せの他の治療薬は局所的に投与され得る。
代替的には、例えばすべての治療薬は局所的に投与され得るし、または注射により投与され得る。治療薬が投与される順序は、別記されない限り、偏狭なまでに重要であるというわけではない。「併用療法」は、さらに他の生物学的に活性な成分と組合せた上記のような治療薬の投与も包含する。併用療法がさらに非薬剤処置を含む場合、治療薬および非薬剤処置の組合せの同時作用から有益な効果が達成される限り、非薬剤処置は任意の適切な時点で実行され得る。例えば、適切な場合には、非薬剤処置が治療薬の投与から一時的に、おそらくは数日（または数週間であることも）、取り除かれる場合、有益な効果は依然として達成される。
上記の一般的言い方で要約されるように、本発明による医薬品は、原則として、当業者に既知の任意の形態で投与され得る。好ましい投与経路は、全身投与、さらに好ましくは非経口投与による全身投与、好ましくは注射による全身投与である。代替的には、医薬品は局在的に投与され得る。他の投与経路は、筋肉内、腹腔内および皮下、ｐｅｒ ｏｒｕｍ、鼻内、気管内または肺経路を含み、効率を保証しながら、最小侵襲性である投与経路が選択される。
非経口投与は、一般的に、皮下、筋肉内または静脈内注射および注入のために用いられる。さらに、非経口投与のための一アプローチは、当業者に周知である緩徐放出または持続性放出系の埋込み（これは、一定レベルの投与量が保持される、ということを保証する）を用いる。
さらに、本発明の好ましい医薬品は、適切な鼻内ビヒクル、吸入剤の局所的使用により鼻内形態で、または経皮経路により、当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態のものを用いて、投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬量投与は、もちろん、投薬レジメン全体を通して、間欠的というよりむしろ連続的である。他の好ましい局所製剤としては、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられる。
本発明の方法に好ましくは応答する被験体としては、一般的に医学的および獣医学的被験体、例えばヒトおよびヒト患者が挙げられる。特に、本発明の方法および手段が有用である被験体は、ネコ、イヌ、大型動物、鳥類、例えばニワトリ等である。
本発明の医薬品は、一般的に、治療の有効量の活性構成成分（単数または複数）、例えば製薬上許容可能な媒質中に溶解されるかまたは分散される本発明の核酸分子（これに限定されない）を含む。製薬上許容可能な媒質または担体としては、任意のおよびすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は、当該技術分野で周知である。補助的活性成分も、本発明の医薬品中に組み入れられ得る。
さらなる一態様では、本発明は、薬学的組成物に関する。このような薬学的組成物は、本発明による核酸のうちの少なくとも１つ、および好ましくは製薬上許容可能な結合剤を含む。このような結合剤は、当該技術分野で用いられ、および／または既知である任意の結合剤であり得る。さらに特定的には、このような結合剤は、本明細書中に開示される医薬品の製造に関連して考察されるような任意の結合剤である。さらなる一実施形態では、薬学的組成物は、さらなる薬学的活性作用物質を含む。
医薬品および薬学的組成物の調製は、本発明の開示にかんがみて、当業者に既知である。典型的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液としての注射液；注射前の液体中の溶液または懸濁液中に使用するのに適した固体形態；経口投与のための錠剤または多の固形物として；長時間放出性カプセル；あるいは広く用いられる任意の他の形態で、例えば点眼薬、クリーム、ローション、膏薬、吸入剤等の形態で調製され得る。手術領域における特定区域を処置するための外科医、医者またはヘルスケア従業者による滅菌処方物、例えば生理食塩水ベースの洗浄剤の使用も、特に有用であり得る。組成物はさらにまた、微小装置、微小粒子またはスポンジを介して送達され得る。
処方に際して、医薬品は、投薬処方物と適合する方法で、そして薬理学的に有効な量で、投与される。処方物は、種々の剤形で、例えば上記の注射用溶液の型で容易に投与されるが、しかし薬剤放出カプセル等も用いられ得る。
本発明の医薬品は、時限放出および持続性放出錠剤またはカプセル、ピル、粉末、顆粒、エリキシル、チンキ剤、懸濁剤、シロップおよび乳濁液のような経口剤形でも投与され得る。坐薬は、脂肪性乳濁液または懸濁液から有益に調製される。
薬学的組成物または医薬品は、滅菌され得るし、および／またはアジュバント、例えば防腐剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤を含有し得る。組成物は、慣用的な混合、造粒またはコーティング方法に従って調製され、そして典型的には、約０．１％〜７５％、好ましくは約１％〜５０％の活性成分を含有する。
液体、特に注射用組成物は、例えば、溶解、分散により調製され得る。活性化合物は、薬学的に純粋な溶媒、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等に溶解されるかまたはそれらと混合されて、それにより注射用溶液または懸濁液を生成する。さらに、注射前に液体中に溶解するために適した固体形態が処方され得る。
本発明の医薬品および核酸分子はそれぞれ、例えば小型単一ラメラ小胞、大型単一ラメラ小胞および多重ラメラ小胞のようなリポソーム送達系の形態でも投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含有する種々のリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態では、脂質構成成分の皮膜は、薬剤の水溶液で水和されて、薬剤を封入する脂質層を形成するが、これは当業者によく知られている。例えば、本明細書中に記載される核酸分子は、当該技術分野で既知の方法を用いて構築される親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供され得る。さらに、リポソームは、標的化し、そして細胞殺害を媒介するために内部に細胞傷害剤を保有するためにその表面にこのような核酸分子を保有し得る。核酸会合複合体の一例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供されている。
本発明の医薬品および核酸分子はそれぞれ、さらにまた、標的可能薬剤担体として可溶性ポリマーと結合され得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノールまたはポリエチレンオキシデポリリシン（パルミトイル残基で置換される）が挙げられ得る。さらに、本発明の医薬品および核酸分子はそれぞれ、薬剤の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーの一クラス、例えばポリ乳酸、ポリエプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタル、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋化または両親媒性ブロックコポリマーと結合され得る。
所望により、投与されるべき薬学的組成物および医薬品はそれぞれ、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ならびにその他の物質、例えば酢酸ナトリウムおよびオレイン酸トリエタノールアミンも含有し得る。
本発明の核酸分子および医薬品をそれぞれ利用する投薬レジメンは、種々の因子、例えば患者の型、種、年齢、体重、性別および医学的症状；処置されるべき症状の重症度；投与経路；患者の腎臓および肝臓機能；ならびに用いられる特定のアプタマーまたはその塩に従って選択される。通常の熟練医師または獣医師は、症状の進行を防止し、無効にし、または引き止めるために必要とされる薬剤の有効量を容易に決定し、処方し得る。
本発明による核酸の有効血漿レベルは、本明細書中に開示される疾患のいずれかの処置において、好ましくは５００ｆＭ〜２００μＭ、好ましくは１ｎＭ〜２０μＭ、さらに好ましくは５ｎＭ〜２０μＭ、最も好ましくは５０ｎＭ〜２０μＭの範囲である。
本発明の核酸分子および医薬品はそれぞれ、好ましくは、１回１日用量で、２日目または３日目毎に、毎週、２週目毎に、１回毎月用量または３ヶ月目毎に投与され得る。
本明細書中に記載されるような医薬品が本明細書中に開示される薬学的組成物を構成する、ということは本発明の範囲内である。
さらなる一態様では、本発明は、このような処置を必要としている被験体の処置のための方法であって、本発明による核酸のうちの少なくとも１つを薬学的活性量で投与することを包含する方法に関する。一実施形態では、被験体は、疾患に罹患しているか、またはこのような疾患を発症する危険があり、当該疾患は、本明細書中に開示されるもののうちのいずれか、特に、医薬品の製造のための本発明による核酸のいずれかの使用に関連して開示される疾患のいずれかである。
本発明による核酸ならびにアンタゴニストは、医薬品としてまたは医薬品の製造のためだけでなく、美容目的のためにも用いられ得る、と理解されるべきである。
本明細書中で好ましくは用いられる場合、診断用薬または診断剤または診断手段は、直接的または間接的に標的（この場合、グルカゴンまたはＳ１Ｐ）を検出するのに適している。診断用薬は、標的（この場合、本明細書中に記載されるそれぞれグルカゴンまたはＳ１Ｐ）に関連した障害及び疾患のいずれかの検出および／または追跡調査に適している。このような検出は、本発明による核酸と標的との結合により可能である。このような結合は、直接的にまたは間接的に検出され得る。それぞれの方法および手段は、当業者に既知である。特に、本発明による核酸は、本発明による核酸、好ましくは標的と結合される核酸の検出を可能にする標識を含み得る。このような標識は、好ましくは、放射性、酵素および蛍光標識からなる群から選択される。原則として、抗体に関して開発された全ての既知の検定は、本発明による核酸に採用され得るが、一方、標的結合抗体は標的結合核酸に置換される。非標識化標的結合抗体を用いる抗体検定において、検出は、好ましくは、放射性、酵素および蛍光標識で修飾され、そのＦｃ断片で標的結合抗体と結合する二次抗体により実行される。核酸、好ましくは本発明による核酸の場合、核酸はこのような標識で修飾され、その場合、好ましくはこのような標識はビオチン、Ｃｙ−３およびＣｙ−５からなる群から選択され、そしてこのような標識は、このような標識に対して向けられる抗体、例えば抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ３抗体または抗Ｃｙ５抗体により検出され、あるいは標識がビオチンである場合、標識は自然にビオチンと結合するストレプトアビジンまたはアビジンにより検出される。このような抗体、ストレプトアビジンまたはアビジンは、順次、好ましくはそれぞれの標識、例えば放射性、酵素または蛍光標識で（二次抗体のように）修飾される。
さらなる一実施形態では、本発明による核酸分子は、第二検出手段により検出されるかまたは分析され、この場合、上記検出手段は分子標識である。分子標識の方法は当業者に既知であり、Ｍａｉｒａｌ等（Ｍａｉｒａｌ ｅｔ ａｌ．， ２００８）により再検討されている。
標的の検出に関連して、好ましい方法は、以下のステップを包含する：
（ａ）標的の存在に関して試験されるべきものである試料を提供するステップ、
（ｂ）本発明による核酸を提供するステップ、
（ｃ）好ましくは反応容器中で、上記試料を核酸と反応させるステップ
この場合、ステップ（ａ）はステップ（ｂ）の前に実施され得るし、またはステップ（ｂ）はステップ（ａ）の前に実施され得る。
好ましい一実施形態では、さらなるステップ（ｄ）が提供されるが、これは、試料と核酸との反応の検出にある。好ましくは、ステップ（ｂ）の核酸は表面に固定される。表面は、反応容器、例えば反応試験管、プレートのウェルの表面、またはこのような反応容器中に含有される用具、例えばビーズの表面であり得る。当該表面への核酸の固定化は、当業者に既知の任意の手段、例えば非共有または共有結合（これらに限定されない）によりなされ得る。好ましくは結合は、表面と核酸との間の共有化学結合を介して確立される。しかしながら、核酸は間接的に表面に固定され、それによるこのような間接的固定化は、さらなる構成成分または一対の相互作用相手の使用を伴う、ということも本発明の範囲内である。このようなさらなる構成成分は、好ましくは、固定されるべき核酸と特異的に相互作用する化合物であり、これは相互作用相手としても言及され、したがって表面への核酸の付着を媒介する。相互作用相手は、好ましくは核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体からなる群から選択される。好ましくは、相互作用相手は抗体であり、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。代替的には、相互作用相手は、核酸、好ましくは機能性核酸である。さらに好ましくは、このような機能性核酸は、アプタマー、スピーゲルマー、および当該核酸と少なくとも部分的に相補的である核酸からなる群から選択される。さらなる代替的一実施形態では、核酸と表面との結合は、多くの部分に分かれた相互作用相手により媒介される。このような多くの部分に分かれた相互作用相手は、好ましくは、一対の相互作用相手、または第一成員および第二成員からなる相互作用相手であり、この場合、第一成員は核酸により構成されるかまたは核酸に結合され、そして第二成員は表面に結合されるかまたは表面により構成される。多くの部分に分かれた相互作用相手は、好ましくは、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、およびビオチンとニュートラアビジンからなる相互作用相手の対の群から選択される。好ましくは、相互作用相手の対の第一成員はビオチンである。
このような方法の好ましい結果は、標的と核酸の固定化複合体の形成であり、さらに好ましくは、上記複合体が検出される。複合体から、標的が検出されるということは、一実施形態の範囲内である。
この要件に従っているそれぞれの検出手段は、例えば、標的のその／それらの部分（単数または複数）に特異的である任意の検出手段である。特に好ましい検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体（この生成は、当業者に既知である）からなる群から選択される検出手段である。
標的の検出方法は、ステップｃ）を実施するために用いられた反応容器から試料が取り出される、ということも包含する。
当該方法は、さらなる一実施形態では、表面、好ましくは上記の表面に標的の相互作用相手を固定するステップも包含し（この場合、相互作用相手は、それぞれの方法に関連して、本明細書におけるように、好ましくは上記のように限定される）、さらに好ましくは、それらの種々の実施形態において、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を包含する。この実施形態では、特に好ましい検出手段は本発明による核酸であって、この場合、このような核酸は、好ましくは標識され得るし、または非標識され得る。このような核酸が標識される場合、それは直接的または間接的に検出され得る。このような検出は、第二検出手段の使用も伴い、それらは、好ましくは核酸、ポリペプチド、タンパク質、ならびに本明細書中に記載される種々の実施形態における実施形態からなる群からも選択される。このような検出手段は、好ましくは、本発明による核酸に特異的である。さらなる好ましい一実施形態では、第二検出手段は分子標識である。核酸または第二検出手段またはその両方は、好ましい一実施形態では、検出標識を含み得る。検出標識は、好ましくは、ビオチン、ブロモ−デソキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ標識、放射性標識およびキレート剤分子からなる群から選択される。代替的には、第二検出手段は、好ましくは核酸に含有され、含まれ、または結合される検出標識と相互作用する。特に好ましい組合せを以下に示す：
検出標識がビオチンであり、第二検出手段がビオチンに向けられる抗体であるか、または
検出標識がビオチンであり、第二検出手段がアビジンまたはアビジン保有分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、第二検出手段がストレプトアビジンまたはストレプトアビジン保有分子であるか、または
検出標識がビオチンであり、第二検出手段がニュートラアビジンまたはニュートラアビジン保有分子であるか、または
検出標識がブロモ−デソキシウリジンであり、第二検出手段がブロモ−デソキシウリジンに向けられる抗体であるか、または
検出標識がジゴキシゲニンであり、第二検出手段がジゴキシゲニンに向けられる抗体であるか、または
検出標識がキレート剤であり、第二検出手段が放射性核種であって、
この場合、上記検出標識が核酸に結合される、というのが好ましい。この種の組合せは、核酸が表面に結合される実施形態にも適用可能である、ということは認知されるべきことである。このような実施形態では、検出標識は相互作用相手に結合される、というのが好ましい。
最後に、第二検出手段が第三検出手段を用いて検出される、ということも本発明の範囲内であって、好ましくは第三検出手段は酵素であり、さらに好ましくは、第二検出手段の検出時に酵素反応を示し、あるいは第三検出手段は、放射線、さらに好ましくは放射性核種により放出される放射線を検出するための手段である。好ましくは、第三検出手段は、第二検出手段を特異的に検出するかおよび／またはそれと相互作用する。
さらにまた表面に固定されている標的の相互作用相手を有し、本発明による核酸が好ましくは相互作用相手と標的との間に形成される複合体に付加される実施形態では、試料は、反応から、さらに好ましくはステップｃ）および／またはｄ）が実施される反応容器から取り出され得る。
一実施形態では、本発明による核酸は蛍光部分を含み、蛍光部分の蛍光は核酸と標的および遊離標的との間の複合体形成に際して異なる。
さらなる一実施形態では、核酸は本発明による核酸の誘導体であって、核酸の誘導体は、アデノシンに取って代わるアデノシンの少なくとも１つの蛍光誘導体を含む。好ましい一実施形態では、アデノシンの蛍光誘導体はエテノアデノシンである。
さらなる一実施形態では、本発明による核酸の誘導体および標的からなる複合体は、蛍光を用いて検出される。
当該方法の一実施形態では、シグナルはステップ（ｃ）またはステップ（ｄ）で作り出されて、好ましくはシグナルは試料中の標的の濃度と相関する。
好ましい一態様では、検定は９６ウェルプレートで実施され、この場合、構成成分は上記のような反応容器中に固定され、ウェルは反応容器として働く。
本明細書中に、さらに具体的には実施例部分に記載されるようなグルカゴンと結合し得る核酸分子は、本発明の核酸分子の一実施形態である、ということは認められなければならない。
本明細書中に、さらに具体的には実施例部分に記載されるようなＳ１Ｐと結合し得る核酸分子は、本発明の核酸分子の一実施形態である、ということは認められなければならない。
本明細書中に、さらに具体的には実施例部分に記載されるようなＣＧＲＰと結合し得る核酸分子は、本発明の核酸分子の一実施形態である、ということは認められなければならない。
本明細書中に、さらに具体的には実施例部分に記載されるようなＣ５ａと結合し得る核酸分子は、本発明の核酸分子の一実施形態である、ということは認められなければならない。
本発明による核酸分子および本明細書中で用いられるような標的分子の種々の配列番号、化学的性質、その実際の配列ならびに内部参照番号を、以下の表に要約する。
Figure 2014504865
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さらなる特徴、実施形態および利点が得られ得る図、実施例および配列表により、本発明をさらに例証する。
リボヌクレオチドからなる核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２および誘導体核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２および誘導体核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２および誘導体核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換化２１５−Ｆ９−００２（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２とも呼ばれる）誘導体の競合的スピーゲルマー・プルダウン検定の結果を示す：８ｎＭビオチニル化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐと結合する０．３ｎＭ放射能標識化Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇは、３７℃で、示されているように５０ｎＭ非標識化スピーゲルマーにより競合される（三重反復試験）； リボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換化２１５−Ｆ９−００２（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２とも呼ばれる）誘導体の競合的スピーゲルマー・プルダウン検定の結果を示す：この場合、 （Ａ）８ｎＭビオチニル化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐと結合する０．３ｎＭ放射能標識化Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇは、３７℃で３時間、示されているように３６ｎＭ非標識化スピーゲルマーにより競合される（三重反復試験）； （Ｂ）７ｎＭビオチニル化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐと結合する０．５ｎＭ放射能標識化Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇは、３７℃で２．５時間、滴定濃度の５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（環状）および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（正方形）により競合される； 以下の抑制の結果を示す（三重反復試験培養の平均値±ＳＤが示されている）： （Ａ）５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２および （Ｂ）５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３とも呼ばれる）によるＥＤＧ１を発現するレポーター細胞株における１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐ誘導β−アレスチン動員； リボヌクレオチドからなる核酸分子２２６−Ｆ２−００２および核酸分子２２６−Ｆ２−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２２６−Ｆ２−００２および核酸分子２２６−Ｆ２−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２２６−Ｆ２−００２および核酸分子２２６−Ｆ２−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２２６−Ｆ２−００２および核酸分子２２６−Ｆ２−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２２６−Ｆ２−００２および核酸分子２２６−Ｆ２−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； Ｂｉａｃｏｒｅ測定により決定した場合の親スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１に関する親和性における確定された変化のプロットを示す； リボヌクレオチドからなる核酸分子２２６−Ｆ２−００２および核酸２２６−Ｆ２−００２の誘導体２２６−Ｆ２−００２−４１、２２６−Ｆ２−００２−４４および２２６−Ｆ２−００２−４１／４４を示す。この場合、誘導体はリボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）および１または２つの２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＣ）を含む； スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１をヒトＣＧＲＰと結合するＣＧＲＰのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４をヒトＣＧＲＰと結合するＣＧＲＰのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／４４をヒトＣＧＲＰと結合するＣＧＲＰのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧ（中黒丸）およびＮＯＸ−Ｌ４１（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’４０ｋＤａ−ＰＥＧとも呼ばれる、中黒正方形）を結合するＣＧＲＰによるヒトＣＧＲＰ誘導ｃＡＭＰ産生の抑制を示す。この場合、結果は、対照と比較した場合に産生されるｃＡＭＰの相対量として示される（対照のパーセント）； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１および核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１および核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１および核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１および核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１および核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； Ｂｉａｃｏｒｅ測定により決定した場合の親スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１に関する親和性における確定された変化のプロットを示す； スピーゲルマー２２６−Ｆ２−ＮＯＸ−Ｄ１９００１および誘導体ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｄ１９００−ＤＯ０１７、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３２およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４０対ヒトＣ５ａのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； 核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は、多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； スピーゲルマー２２６−Ｆ２−ＮＯＸ−Ｄ１９００１およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−１６−１７−３０−３２−４０対ヒトＣ５ａのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； 走化性検定における５’−末端４０ｋＤａペギル化スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１−５’ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｄ１９とも呼ばれる）およびスピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１−６×ＤＮＡの効力を示す。この場合、種々の量のスピーゲルマーとともに３７℃で予備インキュベートされた０．１ｎＭのｈｕＣ５ａに向けて、細胞を移動させた。 核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は、多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→２’−デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２および核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２および核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２および核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２および核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２および核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重リボヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）→デオキシリボヌクレオチド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＧ、ｄＣ）置換を含む； Ｂｉａｃｏｒｅ測定により決定した場合の親スピーゲルマーＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２に関する親和性における確定された変化のプロットを示す； スピーゲルマーＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２１、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２２対固定化ビオチニル化ヒトグルカゴンのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； リボヌクレオチドからなる核酸分子２５９−Ｈ６−００２および核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＴ、ｒＧ、ｒＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２５９−Ｈ６−００２および核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＴ、ｒＧ、ｒＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２５９−Ｈ６−００２および核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＴ、ｒＧ、ｒＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２５９−Ｈ６−００２および核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＴ、ｒＧ、ｒＣ）置換を含む； リボヌクレオチドからなる核酸分子２５９−Ｈ６−００２および核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＴ、ｒＧ、ｒＣ）置換を含む； Ｂｉａｃｏｒｅ測定により決定した場合の親スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２に関する親和性における確定された変化のプロットを示す； スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２、２５９−Ｈ６−００２Ｒ１３、２５９−Ｈ６−００２Ｒ２４および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３６対固定化ビオチニル化ヒトグルカゴンのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２、２５９−Ｈ６−００２Ｒ１３、２５９−Ｈ６−００２Ｒ１３−Ｒ２４、２５９−Ｈ６−００２Ｒ１３−Ｒ３６および２５９−Ｈ６−００２Ｒ１３−Ｒ２４−Ｒ３６対固定化ビオチニル化ヒトグルカゴンのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２およびその誘導体２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３−Ｒ２４−Ｒ３６（２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３／２４／３６とも呼ばれる）のグルカゴン誘導性産生の抑制を示す。この場合、ａ）ｃＡＭＰ／ウェルの生成量を各データ組の最大値に正規化し、スピーゲルマー濃度に対する活性パーセントとして示した。ｂ）ｃＡＭＰ産生が５０％抑制されるスピーゲルマー濃度（ＩＣ５０）を、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアで非線状回帰を用いて算定した（４パラメーター適合度）。ｃ）用いたスピーゲルマーは、２５９−Ｈ６−００２（１７６ｎＭ）、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３（１２．５ｎＭ）および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３−Ｒ２４−Ｒ３６（６．２ｎＭ）であった。括弧内にそれぞれのＩＣ５０値を示す； スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３−Ｒ２４−Ｒ３６対固定化ビオチニル化ヒトグルカゴンのＢｉａｃｏｒｅ測定による動的評価を示す； デオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子２５７−Ｅ１−００１および核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重２’−デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、ｒＵ）置換を含む； デオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子２５７−Ｅ１−００１および核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重２’−デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、ｒＵ）置換を含む； デオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子２５７−Ｅ１−００１および核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重２’−デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、ｒＵ）置換を含む； デオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子２５７−Ｅ１−００１および核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重２’−デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、ｒＵ）置換を含む； デオキシリボヌクレオチドからなる核酸分子２５７−Ｅ１−００１および核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体を示す。この場合、誘導体は単一または多重２’−デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）→リボヌクレオチド（ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、ｒＵ）置換を含む； ２’−デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなる核酸分子２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１の誘導体を示す； 核酸分子２５７−Ｅ１−００１およびその誘導体２５７−Ｅ１−Ｒ１５−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２９−００１、２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１および２５７−Ｅ１−７×Ｒ−０３対ビオチニル化グルカゴンの競合的プルダウン検定の結果を示す。
実施例１：標的分子Ｓ１Ｐに対する増大された結合親和性を有する核酸分子
出発点としてＳＥＬＥＸ法の直接スクリーニング生成物を伴う開発過程の結果であるＳ１Ｐと結合する核酸分子から出発して、その標的に対する核酸分子の結合親和性を改良するために、本発明の方法を用いた。この場合、Ｓ１Ｐと結合する核酸分子は、核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２であった。
核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２はスピーゲルマー、すなわちＬ−核酸分子であって、これはＳ１Ｐと結合し得るし、配列番号５によるヌクレオチド配列を有し、４４個のリボヌクレオチドからなる。
競合的スピーゲルマー・プルダウン検定（実施例９に記載）により、核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の結合特質を確定した。核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２は、３１．５ｎＭの親和性でＳ１Ｐを結合する（図１および図３Ｂ）。
核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の結合特質を改良するために、核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の誘導体を合成した。前記誘導体は、核酸塩基 −グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルまたはチミン（２’デオキシリボヌクレオチドの場合）− の、核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２と同一の、配列を有するＬ−核酸分子であったが、しかしながら、リボヌクレオチドよりはむしろ２’−デオキシリボヌクレオチドであるヌクレオチドの糖部分に関して単一位置で異なった。それに従って、誘導体１は、配列番号６によるヌクレオチド配列の位置１に２’−デオキシリボヌクレオチドを有し、誘導体２は、配列番号７によるヌクレオチド配列の位置２に２’−デオキシリボヌクレオチドを有した。核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２は４４個のヌクレオチドからなるため、単一リボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換を保有する核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２のすべての考え得る誘導体の完全な一組を提供するために、合計４４個の誘導体を合成した。上記の完全組の誘導体を図１Ａ〜Ｃに示す。分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の配列中のウラシルの場合、ウリジン−５’−ホスフェートをチミジン−５’−ホスフェートに取り替えた。
核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の誘導体の上記の完全組の各誘導体のＳ１Ｐに対する結合親和性を、実施例９に記載される競合的プルダウン検定を用いて確定し、核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の結合親和性と比較した（図１Ａ〜Ｃ）。
図１Ａ〜Ｃから分かるように、スピーゲルマー内の位置によって、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２リボヌクレオチド→２’デオキシリボヌクレオチド置換は標的に関する結合親和性に異なる影響を及ぼし得る。意外にも、核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２内のいくつかの位置での２’デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの単一置換はＳ１Ｐに対する結合親和性改良を生じたが、一方、他の位置での置換は、Ｓ１Ｐに対する結合親和性の有意の変化を生じなかったか、またはＳ１Ｐに対する結合親和性を低減することさえあった。Ｓ１Ｐに対する核酸分子２１５−Ｆ９−００２の結合親和性と比較した場合の個々の誘導体の結合親和性および相対的変化を、図１Ａ〜Ｃに示す。
上記の図からわかるように、誘導体Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１９、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２２、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３２（これらはそれぞれ位置１、１１、１９、２１、２２および３２に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第一群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がＳ１Ｐに関する結合親和性改良を生じる核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の誘導体に属する（図１Ａ〜Ｃおよび図２）。上記誘導体の最良の結合親和性を、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１９およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１に関して示した（図１Ａ〜Ｃおよび図２）。したがって、位置１、１１、１９、２１、２２および３２、好ましくは１９および２１は、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２にＳ１Ｐに関する改良された結合親和性を付与するのに適している。位置１９でのアデノシン−５’−ホスフェート→２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート置換、および位置２１でのグアノシン−５’−ホスフェート→２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート置換は、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＫＤ：３１．５ｎＭ）と比較して、それぞれ１６ｎＭおよび１１．３ｎＭの改良された結合親和性を生じた（図１Ａ〜Ｃ）。
誘導体Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０５、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１２、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１３、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１４、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１５、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１６、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３９、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ４０、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ４１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ４２およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ４３（これらは、それぞれ位置５、１２、１３、１４、１５、１６、３９、４０、４１、４２および４３に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第二群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がＳ１Ｐに関する結合親和性に影響を及ぼさない誘導体に属する。したがって、位置５、１２、１３、１４、１５、１６、３９、４０、４１、４２および４３は、核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２と比較して、Ｓ１Ｐに対する結合親和性改良を付与するのに適していないか、またはその結合親和性に負の影響を及ぼす（図１Ａ〜Ｃ）。
最後に、結合親和性低減または結合親和性の顕著な損失を生じる誘導体を得た。これらの誘導体、すなわち、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０２、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０３、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０４、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０６、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０７、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０８、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０９、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１０、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１７、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ１８、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２０、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２３、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２４、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２５、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２６、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２７、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２８、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２９、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３０、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３１、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３３、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３４、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３５、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３６、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３７、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ３８およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ４４（これらは、それぞれ位置２、３、４、６、７、８、９、１０、１７、１８、２０、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８および４４に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第三群の誘導体、すなわち２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がＳ１Ｐに対する結合親和性に負の作用を及ぼす核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の誘導体に属する（図１Ａ〜Ｃ）。
核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２の誘導体の結合親和性が１つより多い置換を導入することによりさらに増大され得るか否かを査定するために、さらなる誘導体の群を生成した（図１Ｃ）。さらなる誘導体の前記群は、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がＳ１Ｐに関する結合親和性改良を生じた第一群の誘導体から出発した。核酸分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２から出発して、誘導体は、位置１９、２１および／または２２での２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの少なくとも２つの置換を有した。位置１９および２１でのリボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換は、Ｓ１Ｐに関する結合親和性における最強の改良を核酸Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２に付与したが、一方、位置２２での置換は弱い作用を有したに過ぎない（図２）。
これらの誘導体の競合的スピーゲルマー・プルダウン検定は、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２スピーゲルマーの多重位置でのリボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換を組み合わせると、Ｓ１Ｐに関する結合親和性のさらなる改良を生じる、ということを示した。
２つの置換、すなわち位置１９でのアデノシン−５‘−ホスフェート→２’−デオキシアデノシン−５‘−ホスフェートおよび位置２１でのグアノシン−５’−ホスフェート→２‘−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートを含有するスピーゲルマー（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９と呼ばれる）は、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２と、ならびに単一置換を含有するＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１、すなわち、位置２１でのグアノシン−５‘−ホスフェート→２’−デオキシグアノシン−５‘−ホスフェートと比較して、結合親和性改良を示した（図３Ａ）。位置２２でのシチジン−５’−ホスフェート→２‘−デオキシシチジン−５’−ホスフェートの付加的置換は、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−２２のようなさらなる改良を生じなかったし、ならびにＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９−２２は、それぞれＳ１Ｐに関する同様の結合親和性を示した（図１Ｃおよび図３Ａ）。これに対比して、４つの置換を含有するスピーゲルマー、すなわち、位置０１でのグアノシン→２‘−デオキシグアノシン、位置２１でのグアノシン−５’−ホスフェート→２‘−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート、および位置１９および３２でのアデノシン−５‘−ホスフェート→２’−デオキシアデノシン−５‘−ホスフェート（Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２とも呼ばれる）は、スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ２１−１９（２つの置換のみを含有する）と比較して、結合親和性の有意の改良を示した（図１Ｃおよび図３Ａ）。親分子Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２（ＫＤ：３１．５ｎＭ）置換との比較において、Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２における、４つの位置でのリボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド（ＫＤ：５ｎＭ）は、Ｓ１Ｐに関する結合親和性の６．３倍の改良を生じた（図３Ｂ）。Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２の位置１１でのシチジン−５’−ホスフェート→２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートという付加的置換は、Ｓ１Ｐに関する結合親和性に及ぼすさらなる正の作用を有した（図１Ｃおよび図３Ａ）。
スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２およびＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２の機能性を立証し、比較するために、それらの５’末端にアミノ基を含む両核酸分子を合成した。アミノ修飾化スピーゲルマーに、４０ｋＤａのＰＥＧ−部分をカップリングして、スピーゲルマー５‘−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３としても言及される）をもたらした。スピーゲルマーの合成およびペギル化は、実施例７に記載される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養検定（プロトコール：実施例１１参照）は、Ｓ１Ｐに対する親和性改良がＳ１Ｐ機能の抑制増強になる、ということを確証した。５‘−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２および５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ−Ｌ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−Ｄ０１−１９−２１−３２（ＮＯＸ−Ｓ９３としても言及される）は、それぞれ２２．５ｎＭおよび１０．３ｎＭのＩＣ５０値で、ヒトＳ１Ｐ−受容体ＥＤＧ１を発現するレポーター細胞株におけるＳ１Ｐ誘導性アレスチン動員を抑制した（図４Ａ、４Ｂ）。したがって、競合的スピーゲルマー・プルダウン検定（実施例９、図３Ｂ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養実験（実施例１１、図４）は、同じく、リボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチドの置換が、Ｓ１Ｐ−結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１の結合親和性および抑制活性を有意に改良する、ということを示した。
実施例２：標的分子ヒトＣＧＲＰに対する増大された結合親和性を有する核酸分子
出発点としてＳＥＬＥＸ法の直接スクリーニング生成物を伴う開発過程の結果であるＣＧＲＰと結合する核酸分子から出発して、その標的に対する核酸分子の結合親和性を改良するために、本発明の方法を用いた。この場合、ヒトＣＧＲＰと結合する核酸分子は、核酸分子２２６−Ｆ２−００１であった。
核酸分子２２６−Ｆ２−００１はスピーゲルマー、すなわちＬ−核酸分子であって、これはヒトＣＧＲＰと結合し得るし、配列番号５５によるヌクレオチド配列を有し、５０個のリボヌクレオチドからなる。
表面プラズモン共鳴測定（実施例８に記載）により、核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合特質を確定した。核酸分子２２６−Ｆ２−００１は、２．６ｎＭの親和性でヒトＣＧＲＰを結合する（図７、図８および８Ｂ）。
核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合特質を改良するために、核酸分子２２６−Ｆ２−００１の誘導体を合成した。前記誘導体は、核酸塩基 −グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルまたはチミン（２’デオキシリボヌクレオチドの場合）− の、核酸分子２２６−Ｆ２−００１と同一の、配列を有するＬ−核酸分子であったが、しかしながら、リボヌクレオチドよりはむしろ２’−デオキシリボヌクレオチドであるヌクレオチドの糖部分に関して単一位置で異なった。それに従って、誘導体１（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０１とも呼ばれる）は、配列番号５６によるヌクレオチド配列の位置１に２’−デオキシリボヌクレオチドを有し、誘導体２（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０２とも呼ばれる）は、配列番号５７によるヌクレオチド配列の位置２に２’−デオキシリボヌクレオチドを有した。核酸分子２２６−Ｆ２−００１は５０個のヌクレオチドからなるため、単一リボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換を保有する核酸分子２２６−Ｆ２−００１のすべての考え得る誘導体の完全な一組を提供するために、合計５０個の誘導体を合成した。上記の完全組の誘導体を図５Ａ〜Ｅに示す。分子２２６−Ｆ２−００１の配列中のウラシルの場合、ウリジン−５’−ホスフェートをチミジン−５’−ホスフェートに取り替えた。
核酸分子２２６−Ｆ２−００１の誘導体の上記の完全組の各誘導体のヒトＣＧＲＰに対する結合親和性を、実施例８に記載される表面プラズモン共鳴測定を用いて確定し、核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合親和性と比較した。２２６−Ｆ２−００１の少なくとも５つの個々に確定されたＫＤ値の一組から、平均値（平均＋／−標準誤差）を算定した。個々の誘導体のＫＤ値を確定し、親和性における変化を２２６−Ｆ２−００１の平均ＫＤと比較してｘ倍の改良として示すが、この場合、ｘ倍改良の値は２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１の誘導体のＫＤの商である。確定された標準誤差は、陽性ヒットに関する切断点を示す。ｘ倍改良親和性のデータを、図５Ａ〜Ｅに示し、図６にプロットする。
図５Ａ〜Ｅから分かるように、スピーゲルマー内の位置によって、スピーゲルマーリボヌクレオチド→２’デオキシリボヌクレオチド置換は標的に関する結合親和性に異なる影響を及ぼし得る。意外にも、核酸分子２２６−Ｆ２−００１内のいくつかの位置で、単一リボヌクレオチド→２’デオキシリボヌクレオチド置換はヒトＣＧＲＰに対する結合親和性改良を生じたが、一方、他の位置での置換は、ヒトＣＧＲＰに対する結合親和性の有意の変化を生じなかったか、またはヒトＣＧＲＰに対する結合親和性を低減することさえあった。ヒトＣＧＲＰに対する核酸分子２２６−Ｆ２−００１の結合親和性と比較した場合の個々の誘導体の結合親和性および相対的変化を、図５Ａ〜Ｅおよび図６に示す。
上記の図からわかるように、誘導体２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０３、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０５、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２２、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２３、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２５、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３０、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３３、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３７、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４２、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４５、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４７、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ５０（これらはそれぞれ位置０３、０５、０８、０９、１４、１６、１９、２２、２３、２４、２５、２６、２８、３０、３３、３４、３７、３９、４１、４２、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第一群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣＧＲＰに関する結合親和性改良を生じる核酸分子２２６−Ｆ２−００１の誘導体に属する（図５Ａ〜Ｅおよび図６）。上記誘導体の最良の結合親和性を、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４に関して示した（図５Ａ〜Ｅおよび図６）。したがって、位置１９、４１および４４は、２２６−Ｆ２−００１にヒトＣＧＲＰに対する改良された結合親和性を付与するのに適している。核酸分子２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４のみを、表面プラズモン共鳴測定によりさらに特性化した。位置４１および４４での単一シチジン−５’−ホスフェート→２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェート置換は、２２６−Ｆ２−００１に関する２．６ｎＭというＫＤと比較して、それぞれ０．５５ｎＭおよび０．５２ｎＭの改良された結合親和性を生じた（図７および図８Ａ、Ｂ）。
誘導体２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０４および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２７（これらは、それぞれ位置４および２７に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第二群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣＧＲＰに関する結合親和性に影響を及ぼさない誘導体に属する。したがって、位置４および２７は、核酸分子２２６−Ｆ２−００１と比較して、ヒトＣＧＲＰに対する結合親和性改良を付与するのに適していないか、またはその結合親和性に負の影響を及ぼす（図５Ａ〜Ｅおよび図６）。
最後に、結合親和性低減または結合親和性の顕著な損失を生じる誘導体を得た。これらの誘導体、すなわち、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０２、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ０７、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１０、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１２、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１３、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１５、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１７、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ１８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２０、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ２９、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３１、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３２、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３５、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３６、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ３８、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４０および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４３（これらは、それぞれ位置１、２、６、７、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１８、２０、２１、２９、３１、３２、３５、３６、３８、４０および４３に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第三群の誘導体、すなわち２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣＧＲＰに対する結合親和性に負の作用を及ぼす核酸分子２２６−Ｆ６−００１の誘導体に属する（図５Ａ〜Ｅおよび図６）。
核酸分子２２６−Ｆ６−００１の誘導体の結合親和性が１つより多い置換を導入することによりさらに増大され得るか否かを査定するために、別の誘導体を生成した。上記誘導体は、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣＧＲＰに関する結合親和性改良を生じた第一群の誘導体から出発した。核酸分子２２６−Ｆ６−００１から出発して、誘導体は、２つの位置４１および４４での２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換を有した（２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４として言及される）。すなわちそれらの位置は、位置１９に加えて、結合親和性における最強の改良を核酸２２６−Ｆ２−００１に付与した。
２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４の表面プラズモン共鳴測定は、２２６−Ｆ２−００１１つより多い位置でのリボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換、すなわち、位置４１および４４でのシチジン−５’−ホスフェート→２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートを組み合わせると、単一置換を含有する誘導体、すなわち２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１または２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４４と比較して、ヒトＣＧＲＰに対する結合親和性のさらなる改良を生じる、ということを示した（図７、図８Ａ、Ｂおよび図９）。親核酸分子２２６−Ｆ２−００１（ＫＤ＝２．６ｎＭ）と比較して、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／Ｄ４４（ＫＤ＝０．２ｎＭ）における２’−デオキシリボヌクレオチドによる２つのリボヌクレオチドの置換は、表面プラズモン共鳴により測定した場合、ヒトＣＧＲＰに対する結合親和性の１３倍の改良を生じた（図７および図９）。
スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１および２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１の機能性を立証し、比較するために、それらの５’末端にアミノ基を含む両核酸分子を合成した。アミノ修飾化スピーゲルマーに、４０ｋＤａのＰＥＧ−部分をカップリングして、スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１−５‘−４０ｋＤａ−ＰＥＧおよび２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｌ４１としても言及される）をもたらした。スピーゲルマーの合成およびペギル化は、実施例７に記載される。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養検定（プロトコール：実施例１２参照）は、ヒトＣＧＲＰ受容体を発現するレポーター細胞株におけるヒトＣＧＲＰ誘導性ｃＡＭＰ産生を有効に抑制したということを示すことにより、両スピーゲルマーに関する機能性を確証した（図１０）。２２６−Ｆ２−００１−５‘−４０ｋＤａ−ＰＥＧおよび２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１−５’−４０ｋＤａ−ＰＥＧ（ＮＯＸ−Ｌ４１）は、それぞれ３．８ｎＭおよび０．３９ｎＭのＩＣ５０値で、ヒトＣＧＲＰ誘導性の機能を抑制した。したがって、表面プラズモン共鳴測定（実施例８、図８Ａ）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養実験（実施例１２、図１０）は、同じく、２’−デオキシリボヌクレオチドによる単一リボヌクレオチドの置換が、ＣＧＲＰ結合スピーゲルマー２２６−Ｆ２−００１の結合親和性および抑制活性を有意に改良するのに十分である、ということを示した。親和性は、２２６−Ｆ２−００１−Ｄ４１／４４に関して示されたような１つより多い位置でのリボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換によりさらに改良され得る（図７および図９）。
実施例３：標的分子ヒトＣ５ａに対する増大された結合親和性を有する核酸分子
出発点としてＳＥＬＥＸ法の直接スクリーニング生成物を伴う開発過程の結果であるＣ５ａと結合する核酸分子から出発して、その標的に対する核酸分子の結合親和性を改良するために、本発明の方法を用いた。この場合、ヒトＣ５ａと結合する核酸分子は、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１であった。
核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１はスピーゲルマー、すなわちＬ−核酸分子であって、これはヒトＣ５ａと結合し得るし、配列番号１０７によるヌクレオチド配列を有し、４４個のリボヌクレオチドからなる。
表面プラズモン共鳴測定（実施例８に記載）により、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の結合特質を確定した。核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１は、図１３にも示されているように、１．４ｎＭの親和性でヒトＣ５ａを結合する。
核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の結合特質を改良するために、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体を合成した。前記誘導体は、核酸塩基 −グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシル− （核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の場合）の、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１と同一の、配列を有するＬ−核酸分子であったが、しかしながら、リボヌクレオチドよりはむしろ２’−デオキシリボヌクレオチドであるヌクレオチドの糖部分に関して単一位置で異なった。それに従って、誘導体１（ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０１とも呼ばれる）は、配列番号１０８によるヌクレオチド配列の位置１に２’−デオキシリボヌクレオチドを有し、誘導体２（ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０２とも呼ばれる）は、配列番号１０９によるヌクレオチド配列の位置２に２’−デオキシリボヌクレオチドを有した。核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１は４４個のヌクレオチドからなるため、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの単一置換の上記要件を満たしている核酸分子のすべての考え得る誘導体の完全な一組を提供するために、合計４４個の誘導体を合成した。上記の完全組の誘導体を図１１Ａ〜Ｅに示す。分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の配列中のウラシルの場合、ウリジン−５’−ホスフェートを２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェートに取り替えた。
核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体の上記の完全組の各誘導体のヒトＣ５ａに対する結合親和性を、実施例８に記載される表面プラズモン共鳴測定を用いて確定し、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の結合親和性と比較した。ＮＯＸ−Ｄ１９００１の少なくとも５つの個々に確定されたＫＤ値の一組から、平均値を算定した（平均＋／−標準誤差）。個々の誘導体のＫＤ値を確定し、親和性における変化を平均ＮＯＸ−Ｄ１９００１と比較してｘ倍の改良として示すが、この場合、ｘ倍改良の値はＮＯＸ−Ｄ１９００１およびＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体のＫＤの商である。確定された標準誤差は、陽性ヒットに関する切断点を示す。ｘ倍改良親和性のデータを、図１１Ａ〜Ｅに示し、図１２にプロットする。
図１１Ａ〜Ｅから分かるように、スピーゲルマー内の位置によって、ｘ倍改良親和性リボヌクレオチド→２’デオキシリボヌクレオチド置換は標的に関する結合親和性に異なる影響を及ぼし得る。意外にも、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１内のいくつかの位置で、２’デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの単一置換は改良され、すなわちヒトグルカゴンに対する結合親和性を下げるが、一方、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１内のいくつかの点での２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの他の位置での置換は、ヒトＣ５ａに対する結合親和性の有意の変化を生じなかったか、またはヒトＣ５ａに対する結合親和性を低減することさえあった。ヒトＣ５ａに対する核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の結合親和性と比較した場合の個々の誘導体、ヒトＣ５ａに対するそれらの結合親和性および相対的変化を、図１１Ａ〜Ｅに示す。
上記の図からわかるように、誘導体ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０１、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１７、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２５、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２９、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４２およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４３（これらはそれぞれ位置１、２、９、１６、１７、２２、２５、２９、３０、３２、４０、４２および４３に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第一群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣ５ａに関する結合親和性改良を生じる誘導体に属する（図１１Ａ〜Ｅおよび図１２）。上記誘導体の最良の結合親和性を、誘導体ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１７、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３２およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４０に関して示した（図１１Ａ〜Ｅおよび図１２）。したがって、位置９、１６，１７、３０、３２および４０は、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１にヒトＣ５ａに対する改良された結合親和性を付与するのに適している。核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１７、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３２およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４０を、表面プラズモン共鳴測定によりさらに特性化し、それにより結合親和性を確定した（図１３）。位置０９でのウリジン−５’−ホスフェート→２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェート置換は、２つのうちの一因子による結合親和性改良を生じた（図１３）。
誘導体ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０３、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２３、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２６、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３５、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３８、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３９およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４４（これらは、それぞれ位置３、２３、２６、３５、３８、３９および４４に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第二群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣ５ａに関する結合親和性を変えないかまたは影響を及ぼさない誘導体に属する。したがって、位置３、２３、３８および３９は、ヒトＣ５ａに対する結合親和性改良を核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１に付与するのに適していないが、しかしながら、ヒトＣ５ａに対する核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の結合親和性に負の影響を及ぼさない。
最後に、結合親和性低減または結合親和性の顕著な損失を生じる誘導体を得た。これらの誘導体、すなわち、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０４、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０５、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０６、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０７、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０８、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１１、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１３、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１４、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１５、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１８、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ１９、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２１、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２４、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２７、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ２８、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３１、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３３、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３４、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３６、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３８およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ４１は、したがって、第三群の誘導体、すなわち２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣ５ａに関する結合親和性に（負の）作用を及ぼす核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体に属する。したがって、位置４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、３１、３３、３４、３６および４１は、ヒトＣ５ａに対する核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１の結合親和性に負の影響を及ぼす。
核酸分子Ｌ−ＮＯＸ−Ｄ１９００１の誘導体の結合親和性が１つより多い置換を導入することによりさらに増大され得るか否かを査定するために、さらなる誘導体の一群を生成した。さらなる誘導体のこのような群は、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトＣ５ａに関する結合親和性改良を生じた誘導体を含む上記第一群の誘導体から出発した。核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１から出発して、誘導体のさらなる群の誘導体は、位置９、３０、３２および４０のうちの少なくとも２つの位置に、すなわち、ヒトＣ５ａに対する改良された結合親和性を核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１に付与するのに適していることが立証された位置に、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換を有した。
これらの代表例の表面プラズモン共鳴測定は、図８および９に示されるように、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１の多重位置でのリボヌクレオチド→２’−デオキシリボヌクレオチド置換の組合せが、結合親和性の改良を生じる、ということを示した。
２つの置換、すなわち位置９／３０、９／３２、９／４０、３０／３２、３０／４０および３２／４０でのウリジン−５‘−ホスフェート→２’−デオキシウリジン−５‘−ホスフェートをすべて含有するスピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−４０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０−３２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０−４０およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３２−４０は、１つの置換、すなわち位置９、３０、３２または４０でのウリジン−５‘−ホスフェート→２’−デオキシウリジン−５‘−ホスフェートを含有する分子と同様に良好な結合親和性を示した（図１４）。
スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０−３２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０−４０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３２−４０およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０−３２−４０を合成して、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１における３つの置換、すなわち位置９／３０／３２、９／３０／４０、９／３２／４０および３０／３２／４０でのウリジン−５‘−ホスフェート→２’−デオキシウリジン−５‘−ホスフェートが、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−４０、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０−３２、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３０−４０およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ３２−４０（すべて、２つの置換を含有する）と比較して、結合親和性のさらなる改良をもたらすか否かを試験した。３つの置換、すなわち、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０−４０およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３２−４０（すべて、位置９／３０／４０および９／３２／４０でのウリジン−５’−ホスフェート→２’−デオキシ−ウリジン−５’−ホスフェートを含有する）は、２つの置換、すなわち、位置９、３０、３２または４０でのウリジン−５‘−ホスフェート→２’−デオキシウリジン−５‘−ホスフェートを含有する分子と同様に良好な結合親和性を示した（図１４）。
置換のための位置９、３０、３２または４０（核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１）を組合せると、すなわち位置９／３０／３２／４０でのウリジン−５’−ホスフェート→２’−デオキシ−ウリジン−５’−ホスフェートは、スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０−４０およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３２−４０（すべて３つの置換を含有）と比較して、さらなる改良をもたらした（図１４）。
ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０−３２−４０の位置１６または１７での２’−デオキシリボヌクレオチドによる付加的リボヌクレオチドの置換は、ヒトＣ５ａに対する結合親和性に及ぼすさらなる陽性作用を示した（ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−１６−３０−３２−４０参照、およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−１７−３０−３２−４０参照、図１４）。ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−３０−３２−４０の位置１６または１７での２’−デオキシリボヌクレオチドによる２つの付加的リボヌクレオチドの置換は、ヒトＣ５ａに対する結合親和性に及ぼすさらなる陽性作用を示さなかった（ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０９−１６−１７−３０−３２−４０参照、ＮＯＸ−Ｄ１９００１−６×ＤＮＡとしても言及される。図１４および１５）。核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１と比較して、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９００１−６×ＤＮＡは、因数４．２でのヒトＣ５ａに対する結合の改良を示した（図１５）。
スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９００１およびＮＯＸ−Ｄ１９００１−６×ＤＮＡの機能性を立証し、比較するために、両核酸分子をｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養検定に付した（プロトコール：実施例１４参照）。図１６に示したように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養検定は、ヒトＣ５ａに対する親和性改良がＣ５ａ機能の抑制増強に平行移動する、ということを確証した。ペギル化スピーゲルマーＮＯＸ−Ｄ１９およびＮＯＸ−Ｄ１９−６×ＤＮＡは、それぞれ２．３９ｎＭおよび０．２７ｎＭのＩＣ５０値で、Ｃ５ａ誘導性走化性を抑制した。
前に示したように、核酸分子ＮＯＸ−Ｄ１９−００１における２’−デオキシリボヌクレオチドによる多重リボヌクレオチドの置換は、ヒトＣ５ａに対する親和性改良をもたらした。しかしながら、このような改良は、多重置換が、ヒトＣ５ａとの結合における改良を既にもたらしている単一置換の結果である場合に、到達され得るに過ぎない。２’−デオキシリボヌクレオチドによる位置７でのリボヌクレオチドの置換は、親和性低減をもたらした（図１７参照）。この親和性低減は、他の位置、例えば１６、１７、３０、３２および４０での付加的置換により、わずかに「治され」得る（ＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０７−３０と比較した場合のＮＯＸ−Ｄ１９００１−Ｄ０７−１６−１７−３０−３２−４０参照、図１７）。
実施例４：標的分子グルカゴンに対する増大された結合親和性を有する核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体
出発点としてＳＥＬＥＸ法の直接スクリーニング生成物を伴う開発過程の結果であるグルカゴンと結合する核酸分子から出発して、その標的に対する核酸分子の結合親和性を改良するために、本発明の方法を用いた。この場合、ヒトグルカゴンと結合する核酸分子は、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２であった。
核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２はスピーゲルマー、すなわちＬ−核酸分子であって、これはヒトグルカゴンと結合し得るし、配列番号１７２によるヌクレオチド配列を有し、５４個のリボヌクレオチドからなる。
表面プラズモン共鳴測定（実施例８に記載）により、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の結合特質を確定した。核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２は、図２０にも示されているように、６７．１ｎＭの親和性でヒトグルカゴンを結合する。
核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の結合特質を改良するために、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体を合成した。前記誘導体は、核酸塩基 −グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルまたは代替的にはチミン（２’−デオキシリボヌクレオチドの場合）− の、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２と同一の、配列を有するＬ−核酸分子であったが、しかしながら、リボヌクレオチドよりはむしろ２’−デオキシリボヌクレオチドであるヌクレオチドの糖部分に関して単一位置で異なった。それに従って、誘導体１（ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０１と呼ばれる）は、配列番号１７２によるヌクレオチド配列の位置１に２’−デオキシリボヌクレオチドを有し、誘導体２（ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０２と呼ばれる）は、配列番号１７３によるヌクレオチド配列の位置２に２’−デオキシリボヌクレオチドを有した。核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２は５４個のヌクレオチドからなるため、２’−デオキシリボヌクレオチドによる２’−リボヌクレオチドの単一置換の上記要件を満たしている核酸分子のすべての考え得る誘導体の完全な一組を提供するために、合計５４個の誘導体を合成した。上記の完全組の誘導体を図１８Ａ〜Ｅに示す。分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の配列中のウラシルの場合、ウリジン−５’−ホスフェートをチミジン−５’−ホスフェートに取り替えた。
核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体の上記の完全組の各誘導体のヒトグルカゴンに対する結合親和性を、実施例８に記載される表面プラズモン共鳴測定により確定し、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の結合親和性と比較した。ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の少なくとも５つの個々に確定されたＫＤ値の一組から、平均値を算定した（平均＋／−標準誤差）。個々の誘導体のＫＤ値を確定し、親和性における変化を平均ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２と比較してｘ倍の改良として示すが、この場合、ｘ倍改良の値はＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２およびＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体のＫＤの商である。確定された標準誤差は、陽性ヒットに関する切断点を示す。ｘ倍改良親和性のデータを、図１８Ａ〜Ｅに示す。
図１８Ａ〜Ｅから分かるように、スピーゲルマー内の位置によって、ｘ倍改良親和性リボヌクレオチド→２’デオキシリボヌクレオチド置換は標的に関する結合親和性に異なる影響を及ぼし得る。意外にも、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２内のいくつかの位置で、２’デオキシリボヌクレオチドによる２‘リボヌクレオチドの単一置換は改良され、すなわちヒトグルカゴンに対する結合親和性を下げるが、一方、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２内のいくつかの点での２’−デオキシリボヌクレオチドによる２‘リボヌクレオチドの他の位置での置換は、ヒトグルカゴンに対する結合親和性の有意の変化を生じなかったか、またはヒトグルカゴンに対する結合親和性を低減することさえあった。ヒトグルカゴンに対するＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の結合親和性と比較した場合の個々の誘導体、ヒトグルカゴンに対するそれらの結合親和性および相対的変化を、図１８Ａ〜Ｅに示す。
上記の図からわかるように、誘導体ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０１、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０２、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０３、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０４、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０５、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０８、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１０、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１２、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１３、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１４、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１５、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１８、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２０、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２１、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２２、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２３、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２４、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２５、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２８、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３０、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３２、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３８、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４４、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４８およびＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ５３（これらはそれぞれ位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３６、３８、４４、４６、４８および５３に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第一群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性改良を生じる誘導体に属する（図１１Ａ〜Ｅおよび図１９）。上記誘導体の最良の結合親和性を、誘導体ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２１およびＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２２に関して示した（図１１Ａ〜Ｅ、図２０）。したがって、位置７、１６，１９、２１および２２は、核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２にヒトグルカゴンに対する改良された結合親和性を付与するのに適している。核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ０７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１６、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２１およびＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ２２を、表面プラズモン共鳴測定によりさらに特性化し、それにより結合親和性を確定した（図２０）。
誘導体ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１１、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ１７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３１、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３３、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３４、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３５、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４０、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４３、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４５、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ５０およびＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ５２（これらは、それぞれ位置１１、１７、３１、３３、３４、３５、３９、４０、４３、４５、５０および５２に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する）は、第二群の誘導体、すなわち、２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性を変えないかまたは影響を及ぼさない誘導体に属する。したがって、位置１１、１７、３１、３３、３４、３５、３９、４０、４３、４５、５０および５２は、ヒトグルカゴンに対する結合親和性改良を核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２に付与するのに適していないが、しかしながら、ヒトグルカゴンに対する核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の結合親和性に負の影響を及ぼさない。
最後に、結合親和性低減または結合親和性の顕著な損失を生じる誘導体を得た。これらの誘導体、すなわち、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ３７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４１、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４２、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４７、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ４９、ＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ５１およびＮＯＸ−Ｇ１１−Ｄ５４は、したがって、第三群の誘導体、すなわち２’−デオキシリボヌクレオチドによるリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性に（負の）作用を及ぼす核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の誘導体に属する。したがって、位置３７、４１、４２、４７、４９、５１および５４は、ヒトグルカゴンに対する核酸分子ＮＯＸ−Ｇ１１ｓｔａｂｉ２の結合親和性に負の影響を及ぼす。
実施例５：標的分子グルカゴンに対する増大された結合親和性を有する核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体
出発点としてＳＥＬＥＸ法の直接スクリーニング生成物を伴う開発過程の結果であるグルカゴンと結合する核酸分子から出発して、その標的に対する核酸分子の結合親和性を改良するために、本発明の方法を用いた。この場合、ヒトグルカゴンと結合する核酸分子は、核酸分子２５９−Ｈ６−００２であった。
核酸分子２５９−Ｈ６−００２はスピーゲルマー、すなわちＬ−核酸分子であって、これはヒトグルカゴンと結合し得るし、配列番号２８７によるヌクレオチド配列を有し、４６個の２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。
表面プラズモン共鳴測定（実施例Ｘに記載）により、核酸分子２５９−Ｈ６−００２の結合特質を確定した。核酸分子２５９−Ｈ６−００２は、図２３にも示されているように、１０．９ｎＭの親和性でヒトグルカゴンを結合する。
核酸分子２５９−Ｈ６−００２の結合特質を改良するために、核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体を合成した。前記誘導体は、核酸塩基 −グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシル− の、核酸分子２５９−Ｈ６−００２と同一の、配列を有するＬ−核酸分子であったが、しかしながら、デオキシリボヌクレオチドよりはむしろ２’−リボヌクレオチドであるヌクレオチドの糖部分に関して単一位置で異なった。それに従って、誘導体１（２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０１と呼ばれる）は、配列番号２８８によるヌクレオチド配列の位置１にリボヌクレオチドを有し、誘導体２（２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０２と呼ばれる）は、配列番号２８９によるヌクレオチド配列の位置２に２’−リボヌクレオチドを有した。核酸分子２５９−Ｈ６−００２は４６個のヌクレオチドからなるため、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの単一置換の上記要件を満たしている核酸分子のすべての考え得る誘導体の完全な一組を提供するために、合計４６個の誘導体を合成した。上記の完全組の誘導体を図２１Ａ〜Ｅに示す。分子２５９−Ｈ６−００２の配列中のチミジンの場合、チミジン−５’−ホスフェートをウリジン−５’−ホスフェートに取り替えた。
核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体の上記の完全組の各誘導体のヒトグルカゴンに対する結合親和性を、実施例８に記載される表面プラズモン共鳴測定により確定し、核酸分子２５９−Ｈ６−００２の結合親和性と比較し、それにより、核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体の上記完全組の各誘導体のヒトグルカゴンに対する結合親和性を、実施例８に記載される表面プラズモン共鳴測定により確定し、核酸分子２５９−Ｈ６−００２の結合親和性と比較した。２５９−Ｈ６−００２の少なくとも５つの個々に確定されたＫＤ値の一組から、平均値を算定した（平均＋／−標準誤差）。個々の誘導体のＫＤ値を確定し、親和性における変化を平均２５９−Ｈ６−００２と比較してｘ倍の改良として示すが、この場合、ｘ倍改良の値は２５９−Ｈ６−００２および２５９−Ｈ６−００２の誘導体のＫＤの商である。確定された標準誤差は、陽性ヒットに関する切断点を示す。ｘ倍改良親和性のデータを、図２１Ａ〜Ｄに示し、図２２にプロットする。
図２１Ａ〜Ｄから分かるように、スピーゲルマー内の位置によって、２’デオキシリボヌクレオチド→リボヌクレオチド置換は標的に関する結合親和性に異なる影響を及ぼし得る。意外にも、核酸分子２５９−Ｈ６−００２内のいくつかの位置で、リボヌクレオチドによる２’デオキシリボヌクレオチドの単一置換は改良され、すなわちヒトグルカゴンに対する結合親和性を高めるが、一方、核酸分子２５９−Ｈ６−００２内のリボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの他の位置での置換は、ヒトグルカゴンに対する結合親和性の有意の変化を生じなかったか、またはヒトグルカゴンに対する結合親和性を低減することさえあった。グルカゴンに対する核酸分子２５９−Ｈ６−００２の結合親和性と比較した場合の個々の誘導体およびそれらの結合親和性の相対的変化を、図２１Ａ〜Ｄに示す。
上記の図からわかるように、誘導体２５９−Ｈ６−００２−Ｒ８、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２２、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２４、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３０、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３１、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３６、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３８、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３９および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ４４（これらはそれぞれ位置８、１３、２２、２４、３０、３１、３６、３８、３９および４４にリボヌクレオチドを有する）は、第一群の誘導体、すなわち、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性改良を生じる誘導体に属する（図２１Ａ〜Ｄ、図２２）。上記誘導体の最良の結合親和性を、２．１〜５．８の改良因数を有する誘導体２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２４、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３０および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３６に関して示した（図２１Ａ〜Ｄ、図２２）。したがって、位置１３、２４、３０および３６は、核酸分子２５９−Ｈ６−００２にヒトグルカゴンに対する改良された結合親和性を付与するのに適している。核酸分子２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２４および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３６を、表面プラズモン共鳴測定によりさらに特性化し、それにより結合親和性を確定した（図２３）。
誘導体２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０４、２５９−Ｈ６−Ｒ０６および２５９−Ｈ６−Ｒ４６（これらは、それぞれ位置４、６および４６に２’−リボヌクレオチドを有する）は、第二群の誘導体、すなわち、２’−リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性を有意に変えないかまたは影響を及ぼさない誘導体に属する。したがって、位置４、６および４６は、ヒトグルカゴンに対する結合親和性改良を核酸分子２５９−Ｈ６−００２に付与するのに適していないが、しかしながら、ヒトグルカゴンに対する核酸分子２５９−Ｈ６−００２の結合親和性に負の影響を及ぼさない。
誘導体２５９−Ｈ６−Ｒ０９および２５９−Ｈ６−Ｒ４５は、Ｂｉａｃｏｒｅで二相性結合行動を示す。したがって、改良因子は人工的であると判断され、位置９および４５は結合親和性の改良のためにさらに考察されなかった。
最後に、結合親和性低減または結合親和性の顕著な損失を生じる誘導体を得た。これらの誘導体、すなわち、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０１、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０２、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０３、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０５、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ０７、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１０、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１１、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１２、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１４、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１５、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１６、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１７、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１８、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１９、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２０、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２１、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２３、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２５、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２６、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２７、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２８、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ２９、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３２、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３３、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３４、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３５、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ３７、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ４０、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ４１、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ４２、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ４３は、したがって、第三群の誘導体、すなわちリボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性に（負の）作用を及ぼす核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体に属する。したがって、位置１、２、３、５、７、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３３、３４、３５、３７、４０、４１、４２および４３は、ヒトグルカゴンに対する核酸分子２５９−Ｈ６−００２の結合親和性に負の影響を及ぼす。
核酸分子２５９−Ｈ６−００２の誘導体の結合親和性が１つより多い置換を導入することによりさらに増大され得るか否かを査定するために、さらなる誘導体の一群を生成した。さらなる誘導体のこのような群は、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性改良を生じた誘導体を含む上記第一群の誘導体から出発した。核酸分子２５９−Ｈ６−００２から出発して、誘導体のさらなる群の誘導体は、位置１３、２４、３０および３６のうちの少なくとも２つの位置に、すなわち、ヒトグルカゴンに対する改良された結合親和性を核酸分子２５９−Ｈ６−００２に付与するのに適していることが立証された位置に、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換を有した。
これらの代表例の表面プラズモン共鳴測定は、図２４に示されるように、スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２の多重位置でのリボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチド置換の組合せが結合親和性の改良を生じる、ということを示した。
２つの置換、すなわち位置１３でのデオキシアデノシン−５‘−ホスフェート→アデノシン−５‘−ホスフェート、位置２４でのデオキシグアノシン→グアノシン５’−ホスフェート、および／または位置３６でのチミジン−５’−ホスフェート→ウリジン−５’−ホスフェートをすべて含有するスピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ２４および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ３６は、１つの置換を含有する分子と同様に良好な結合親和性を示した（図２４）。
スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ２４＿Ｒ３６を合成して、核酸分子２５９−Ｈ６−００２における３つの置換、すなわち位置１３でのデオキシアデノシン−５‘−ホスフェート→アデノシン−５‘−ホスフェート、位置２４でのデオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、および位置３６でのチミジン−５’−ホスフェート→ウリジン−５’−ホスフェートが、スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ２４および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ３６（すべて、２つの置換を含有する）と比較して、結合親和性のさらなる改良をもたらすか否かを試験した（図２４）。
置換のための位置１３、２４、３０および３６（核酸分子２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ２４＿Ｒ３０＿Ｒ３６）を組合せると、すなわち位置１３でのデオキシアデノシン−５‘−ホスフェート→アデノシン５‘−ホスフェート、位置２４および３０でのデオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、および位置３６でのチミジン−５’−ホスフェート→ウリジン−５’−ホスフェートが、スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ２４＿Ｒ３６（すべて３つの置換を含有）と比較して、わずかな改良をもたらした（図２６）。
スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ２４＿Ｒ３６の機能性を立証し、比較するために、すべての核酸分子をｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養検定で試験した（プロトコール：実施例１４参照）。図２５に示したように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養検定は、ヒトグルカゴンに対する親和性改良がヒトグルカゴン機能の抑制増強に平行移動する、ということを確証した。スピーゲルマー２５９−Ｈ６−００２、２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３および２５９−Ｈ６−００２−Ｒ１３＿Ｒ２４＿Ｒ３６は、それぞれ１７６ｎＭ、１２．５ｎＭおよび６．２ｎＭのＩＣ５０値で、細胞内ｃＡＭＰのグルカゴン誘導性形成を抑制した（図２５）。
実施例６：標的分子グルカゴンに対する増大された結合親和性を有する核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体
出発点としてＳＥＬＥＸ法の直接スクリーニング生成物を伴う開発過程の結果であるグルカゴンと結合する核酸分子から出発して、その標的に対する核酸分子の結合親和性を改良するために、本発明の方法を用いた。この場合、ヒトグルカゴンと結合する核酸分子は、核酸分子２５７−Ｅ１−００１であった。
核酸分子２５７−Ｅ１−００１はスピーゲルマー、すなわちＬ−核酸分子であって、これはヒトグルカゴンと結合し得るし、配列番号２７によるヌクレオチド配列を有し、４７個の２’−デオキシリボヌクレオチドからなる。
競合的プルダウン検定フォーマット（実施例１０に記載）で、核酸分子２５７−Ｅ１−００１の結合特質を確定した。核酸分子２５７−Ｅ１−００１は、１８６ｎＭの親和性でヒトグルカゴンを結合する（図２８も参照）。
核酸分子２５７−Ｅ１−００１の結合特質を改良するために、核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体を合成した（実施例７に記載）。前記誘導体は、核酸塩基 −グアニン、シトシン、アデニンおよびウラシルまたは代替的にはチミン（２’デオキシリボヌクレオチドの場合）− の、核酸分子２５７−Ｅ１−００１と同一の、配列を有するＬ−核酸分子であったが、しかしながら、２’−デオキシリボヌクレオチドよりはむしろリボヌクレオチドであるヌクレオチドの糖部分に関して単一位置で異なった。それに従って、誘導体１（２５７−Ｅ１−Ｒ１−００１と呼ばれる）は、配列番号２２８によるヌクレオチド配列の位置１にリボヌクレオチドを有し、誘導体２（２５７−Ｅ１−Ｒ２−００１）は、配列番号２２９によるヌクレオチド配列の位置２にリボヌクレオチドを有した。核酸分子２５７−Ｅ１−００１は４７個のヌクレオチドからなるため、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの単一置換の上記要件を満たしている核酸分子すべての考え得る誘導体の完全な一組を提供するために、合計４７個の誘導体を合成した。上記の完全組の誘導体を図２７Ａ〜Ｄに示す。分子２５７−Ｅ１−００１の配列中のチミジン−５’−ホスフェートの場合、チミジン−５’−ホスフェートをウリジン−５’−ホスフェートに取り替えた。
核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体の上記の完全組の各誘導体のヒトグルカゴンに対する結合親和性を、実施例１０に記載される競合的プルダウン検定を用いて確定し、核酸分子２５７−Ｅ１−００１の結合親和性と比較した。図２７Ａ〜Ｄから分かるように、スピーゲルマー内の位置によって、２’デオキシリボヌクレオチド→リボヌクレオチド置換は標的に関する結合親和性に異なる影響を及ぼし得る。意外にも、核酸分子２５７−Ｅ１−００１内のいくつかの位置でのリボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの単一置換はヒトグルカゴンに対する改良された、すなわちより高い結合親和性を生じたが、一方、他の位置でのリボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換は、ヒトグルカゴンに対する結合親和性の有意の変化を生じなかったか、またはヒトグルカゴンに対する結合親和性を低減することさえあった。グルカゴンに対する核酸分子２５７−Ｅ１−００１の結合親和性と比較した場合の個々の誘導体およびそれらの結合親和性の相対的変化を、図２７Ａ〜Ｄに示す。
上記の図からわかるように、誘導体２５７−Ｅ１−Ｒ９−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１５−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１８−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１９−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２９００１および２５７−Ｅ１−Ｒ３０−００１（これらはそれぞれ位置９、１５、１８、１９、２９または３０にリボヌクレオチドを有する）は、第一群の誘導体、すなわち、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性改良を生じる誘導体に属する（図２７Ａ〜Ｃ、２８）。上記誘導体の最良の結合親和性を、誘導体２５７−Ｅ１−Ｒ１５−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２９−００１および２５７−Ｅ１−Ｒ３０−００１に関して示した（図２７Ｂ〜Ｃ、２８）。したがって、位置１５、２９および３０は、核酸分子２５７−Ｅ１−００１にヒトグルカゴンに対する改良された結合親和性を付与するのに適している。核酸分子２５７−Ｅ１−Ｒ１５−００１および２５７−Ｅ１−Ｒ２９−００１を競合的プルダウン検定でさらに特性化し、それにより結合親和性を確定した（図２８）。
誘導体２５７−Ｅ１−Ｒ２６−００１および２５７−Ｅ１−Ｒ４６−００１（これらは、それぞれ位置２６および４６にリボヌクレオチドを有する）は、第二群の誘導体、すなわち、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性を変えないかまたは影響を及ぼさない誘導体に属する。したがって、位置２６および４６は、核酸分子２５７−Ｅ１−００１にヒトグルカゴンに対する改良された結合親和性を付与するのに適していないが、しかしながら、ヒトグルカゴンに対する核酸分子２５７−Ｅ１−００１の結合親和性に負の影響を及ぼさない。
最後に、結合親和性低減または結合親和性の顕著な損失を生じる誘導体を得た。これらの誘導体、すなわち、２５７−Ｅ１−Ｒ１−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３−００１、 ２５７−Ｅ４−Ｒ１−００１、２５７−Ｅ５−Ｒ１−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ６−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ７−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ８−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１０−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１１−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１２−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１３−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１４−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１６−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ１７−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２０−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２１−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２２−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２３−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２４−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２５−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２７−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ２８−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３１−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３２−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３３−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３４−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３５−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３６−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３７−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３８−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ３９−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ４０−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ４１−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ４２−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ４３−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ４４−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ４５−００１、２５７−Ｅ１−Ｒ４７−００１は、したがって、第三群の誘導体、すなわちリボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性に（負の）作用を及ぼす核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体に属する。したがって、位置１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２８、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４７は、ヒトグルカゴンに対する核酸分子２５７−Ｅ１−００１の結合親和性に負の影響を及ぼす。
核酸分子２５７−Ｅ１−００１の誘導体の結合親和性が１つより多い置換を導入することによりさらに増大され得るか否かを査定するために、さらなる誘導体の群を生成した。さらなる誘導体のこのような群は、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換がヒトグルカゴンに関する結合親和性改良を生じた誘導体を含む第一群の誘導体から出発した。核酸分子２５７−Ｅ１−００１から出発して、誘導体のさらなる群の誘導体は、位置９、１５、１８、１９、２９および３０（すなわち、ヒトグルカゴンに対する改良された結合親和性を核酸分子２５７−Ｅ１−００１に付与するのに適していることが立証された位置）のうちの少なくとも２つで、リボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチドの置換を有した。
競合的プルダウン検定において、代表例は、図２７Ｅ、Ｆおよび２８に示されているように、スピーゲルマー２５７−Ｅ１−００１の多重位置でのリボヌクレオチドによる２’−デオキシリボヌクレオチド置換を組み合わせると、結合親和性の改良を生じる、ということを示した。少なくとも２つの２’−デオキシリボヌクレオチド→リボヌクレオチド置換の組合せを含有する誘導体のヒトグルカゴンに対する結合親和性を、実施例１０に記載される競合的プルダウン検定で確定し、それぞれ核酸分子２５７−Ｅ１−００１または２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１の結合親和性と比較した。それぞれ２５７−Ｅ１−００１または２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１の２または１０の個々の確定されたＫＤ値の一組から、平均値を算定した（平均＋／−標準誤差）。組合せ置換を有するスピーゲルマーのＫＤ値を確定し、親和性における変化をそれぞれ２５７−Ｅ１−００１または２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１の平均と比較して親和性の改良因数として示すが、この場合、ｘ倍改良の値は２５７−Ｅ１−００１と２５７−Ｅ１−００１の誘導体のＫＤの商である。確定された標準誤差は、改良または減少に関する切断点を示す。親和性の改良因数を、図２７ＥおよびＦに示す。
ともに２つの置換、すなわち位置１５での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置２９での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートおよび位置３０での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートを含有するスピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９−００１および２５７−Ｅ１−Ｒ２９／３０−００１は、１つの置換を含有する分子と同様に良好な結合親和性を示した（図２７Ｅ）。
スピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９／３０−００１および２５７−Ｅ１−Ｒ１８／２９／３０−００１を合成して、核酸分子２５７−Ｅ１−００１おける３つの置換が、スピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９−００１および２５７−Ｅ１−Ｒ２０／３０−００１（すべて、２つの置換を含有する）と比較して、結合親和性のさらなる改良をもたらすか否かを試験した。すなわち、位置１５での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置２９での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートおよび位置３０での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートは、スピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ２９／３０−００１と比較して、結合親和性のさらなる改良をもたらした。しかしながら、グルカゴンに対する３倍置換化スピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９／３０−００１の結合親和性は、２つの置換を含有するスピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９−００１の結合親和性に匹敵する。スピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１８／２９／３０−００１における位置１５での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート置換の代わりの位置１８での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェートの置換は、２５７−Ｅ１−Ｒ２９／３０−００１と比較して結合親和性増大をもたらしたが、しかし２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９／３０−００１と比較して親和性低減をもたらした（図２７Ｅ）。
置換のための位置１５、１８、２９および３０（核酸分子２５７−Ｅ１−Ｒ１５／１８／２９／３０−００１）を組合せると、すなわち位置１５での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置１８での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置２９での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートおよび位置３０での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートは、は、３つの置換を含有するスピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９／３０−００１と比較して、さらなる改良をもたらさなかった（図２７Ｅ）。
意外にも、位置９、１５、１８、１９、２９、３０での６つの２’デオキシリボヌクレオチド→リボヌクレオチド置換の組合せ（スピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ９／１５／１８／１９／２９／３０−００１＝２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１）、すなわち、位置９での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置１５での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置１８での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置１９での２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート、位置２９での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートおよび位置３０での２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェートは、それぞれ２および４つの置換を含有するスピーゲルマー２５７−Ｅ１−Ｒ１５／２９−００１および２５７−Ｅ１−Ｒ１５／１８／２９／３０−００１と比較して、グルカゴンに対する結合親和性のさらなる改良をもたらした（図２７Ｅおよび２８）。
６つの２’−デオキシリボヌクレオチド→リボヌクレオチド置換を含有するスピーゲルマー２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１のグルカゴンに対する結合親和性が、ウリジン−５’−ホスフェートの代わりに５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートを用いてチミジン−５’−ホスフェートを交換することによりさらに増大され得るか否かを査定するために、核酸分子２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１の誘導体を合成した。前記誘導体は、チミジン−５’−ホスフェート→５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートの付加的な第七の置換を含有する。これを図２７Ｆに示す。実際、７つの置換（核酸分子２５７−Ｅ１−７×Ｒ−０２３）、すなわち位置９、１５、１８および１９での４つの２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェート→グアノシン−５’−ホスフェート置換、位置２９および３０での１つのチミジン−５’−ホスフェート→５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェート置換および２つの２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェート→アデノシン−５’−ホスフェート置換を含有する単一誘導体核酸分子は、スピーゲルマー２５７−Ｅ１−６×Ｒ−００１と比較して、わずかに改良された結合親和性を生じた（図２７Ｆおよび２８）。
最後に、グルカゴンに対するスピーゲルマー２５７−Ｅ１−７×Ｒ−０２３の結合親和性は、ＳＥＬＥＸ誘導体化非修飾スピーゲルマー２５７−Ｅ１−００１と比較して、４３という因数だけ改良された。
実施例７：スピーゲルマーの合成および誘導体化
小規模合成
標準環外アミン保護基とともに２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡおよびＤＮＡホスホルアミダイト化学（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｇｉｌｖｉｅ， １９９３）を用いて、ＡＢＩ ３９４合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）での固相合成により、スピーゲルマー（Ｌ−ＲＮＡ核酸またはＬ−ＤＮＡ修飾Ｌ−ＲＮＡ核酸）を産生した。オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分に関しては、Ｄ−（必要な場合。実施例９／１０参照）およびＬ−立体配置でのｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｒＣ（Ｎ−Ａｃ）−、ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびｒＵ−ホスホルアミダイトを用いたが、一方、ＤＮＡ部分に関しては、Ｄ−およびＬ−立体配置でのｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−、ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびｄＴを適用した。ホスホルアミダイトはすべて、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡから購入した。合成および脱保護化後、アプタマーおよびスピーゲルマーをゲル電気泳動により精製した。
大規模合成＋修飾
標準環外アミン保護基とともに２’ＴＢＤＭＳ ＲＮＡおよびＤＮＡホスホルアミダイト化学（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｇｉｌｖｉｅ， １９９３）を用いて、ＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００合成機（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）での固相合成により、スピーゲルマーを産生した。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ｎ−Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、Ｌ−ｒＵ−、Ｌ−ｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−、Ｌ−ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、およびＬ−ｄＴ−ホスホルアミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＭＡから購入した。５’−アミノ−修飾因子は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．（Ｆ， ＭＡ， ＵＳＡ）から購入した。 非修飾化または５’−アミノ修飾化スピーゲルマーを、リボＡ、Ｌ−リボＣ、Ｌ−リボＧ、Ｌ−リボＵ、Ｌ−２’デオキシＡ、Ｌ−２’デオキシＣ、Ｌ−２’デオキシＧまたはＬ−２’デオキシＴ修飾化ＣＰＧ孔サイズ１０００Å（Ｌｉｎｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｇｌａｓｇｏｗ， ＵＫ）で出発した。ＲＮＡおよびＤＮＡホスホルアミダイトのカップリング（１５分／周期）に関しては、アセトニトリル中の０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（ＣＭＳ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ａｂｉｎｇｄｏｎ， ＵＫ）、ならびに２当量のアセトニトリル中のそれぞれ０．２Ｍのホスホルアミダイト溶液を用いた。酸化−キャッピング周期を用いた。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる溶媒および試薬は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ， ＮＬ）から購入した。スピーゲルマーを合成した ＤＭＴ−ＯＮ；脱保護化後、それを、Ｓｏｕｒｃｅｌ１５ＲＰＣ培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９５）により精製した。５’ＤＭＴ基を、８０％酢酸で除去した（ＲＴで３０分）。５’アミノ修飾化スピーゲルマーの場合、５’ＭＭＴ基を８０％酢酸で除去した（ＲＴで９０分）。その後、水性２Ｍ ＮａＯＡｃ溶液を付加して、５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）を用いて、接線流濾過によりスピーゲルマーを脱塩した。
スピーゲルマーのペギル化
ｉｎ ｖｉｖｏでのスピーゲルマーの血漿滞在時間を延長するために、４０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分をスピーゲルマーの５’末端で共有結合した。
ペギル化（ペギル化のための方法の技術的詳細に関しては、欧州特許出願ＥＰ １ ３０６ ３８２参照）のために、精製５’−アミノ修飾化スピーゲルマーを、Ｈ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）および緩衝液Ａ（５ｍｌ；クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］および１Ｍ ＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、水を付加して最終容積を１リットルとすることにより調製；ｐＨ＝８．４を、１Ｍ ＨＣｌで調整した）中に溶解した。
スピーゲルマー溶液のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨで８．４にした。次いで、最大収率が７５〜８５％に達するまで、０．２５当量で６回に分けて３０分毎に、３７℃で、４０ｋＤａ ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｊｅｎｋｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ａｌｌｅｎ， ＴＸ， ＵＳＡ）を付加した。ＰＥＧ−ＮＨＳエステルの付加中は、１Ｍ ＮａＯＨで反応混合物のｐＨを８〜８．５に保持した。
反応混合物を４ｍｌの尿素溶液（８Ｍ）および４ｍｌの緩衝液Ｂ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）と配合して、９５℃に１５分間加熱した。次に、アセトニトリル勾配（緩衝液Ｂ；緩衝液Ｃ；アセトニトリル中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ １５ＲＰＣ培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でＲＰ−ＨＰＬＣにより、ペギル化スピーゲルマーを精製した。過剰量のＰＥＧを、５％緩衝液Ｃで溶離し、１０〜１５％緩衝液Ｃでペギル化スピーゲルマーを溶離した。＞９５％の純度（ＨＰＬＣにより査定）を有する生成物分画を併合し、４０ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡｃと混合した。接線流濾過（５Ｋ再生セルロース膜；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）によりスピーゲルマーを脱塩した。
実施例８：Ｂｉａｃｏｒｅ測定
Ｂｉａｃｏｒｅ検定設定
Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｓｗｅｄｅｎ）を、３７℃の一定温度に設定した。その機器をＤＥＳＯＲＢ法を用いて清浄にした後、新規チップの各実験／固定化を開始した。メインテナンスチップをドッキング後、脱着溶液１（０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）、脱着溶液２（５０ｍＭグリシン、ｐＨ９．５）およびＨＢＳ−ＥＰ ｐＨ７．４緩衝液を機器に連続して詰め込んだ。最後に、そのシステムにＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．４緩衝液を詰めた。試薬はすべて、別記しない限り、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。
標的固定化
各標的に関して個々に、標的固定化手法を確立した。本明細書中に記載される標的に関する例を、以下に列挙する：
ビオチニル化ヒトＬ−グルカゴンの固定化
固定化緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．４緩衝液であった。合成ビオチニル化ヒトＬ−グルカゴン（グルカゴン−２９−ＡＥＥＡｃ−ビオチン、ＢＡＣＨＥＭ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによる受託合成）を、カルボキシメチル化デキストラン被覆センサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定したが、このチップは、０．４Ｍ ＥＤＣ（Ｈ２Ｏ中の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と０．１Ｍ ＮＨＳ（Ｈ２Ｏ中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の１：１混合物を用いて、可溶性ニュートラアビジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の共有結合的固定化により調製されたものであった。同一センサーチップ上の参照フローセルを、ビオチンで遮断した。
ヒトＬ−Ｃ５ａの固定化
固定化緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．４緩衝液であった。１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５中の組換えヒトＬ−Ｃ５ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を、カルボキシメチル化デキストラン被覆センサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にアミンカップリングにより固定したが、このチップは、０．４Ｍ ＥＤＣ（Ｈ２Ｏ中の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と０．１Ｍ ＮＨＳ（Ｈ２Ｏ中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の１：１混合物を用いて活性化されたものであった。
ヒトＬ−アルファ−ＣＧＲＰの固定化
固定化緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．４緩衝液であった。１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５中の合成ヒトＬ−αＣＧＲＰ（Ｂａｃｈｅｍ）を、カルボキシメチル化デキストラン被覆センサーチップ（ＣＭ５、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にアミンカップリングにより固定したが、このチップは、０．４Ｍ ＥＤＣ（Ｈ２Ｏ中の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と０．１Ｍ ＮＨＳ（Ｈ２Ｏ中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の１：１混合物を用いて活性化されたものであった。
改良された結合親和性を有するスピーゲルマー誘導体の同定
個々の単一位置修飾化スピーゲルマー誘導体の結合分析および動的パラメーター査定を、３７℃の装置温度で１μＭの濃度でスピーゲルマーを注入することにより実施した。センサーチップ表面の再生手法および／または限定ペプチド安定性のために、全体的注入シリーズの前後に、ならびに１０回注入毎に、ブランク実行緩衝液の、ならびにスピーゲルマー参照の注入を施して、センサーチップ劣化を監視した。
親（全ＤＮＡまたは全ＲＮＡ）スピーゲルマーの少なくとも５つの個々に確定されたＫＤ値から、平均値を算定した（平均±標準誤差）。個々の誘導体のＫＤ値を確定し、親和性の変化を、親分子の平均と比較した場合のｘ倍改良として示すが、この場合、ｘ倍改良の値は、親分子および親分子の誘導体のＫＤの商である。確定標準誤差は、陽性ヒットに関する切断点を示す。
データ分析および解離定数（Ｋｄ）の算定を、平均値および標準誤差の算定のためのＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１．１ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）およびＰｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアで実行した。
標的認識（解離定数ｋａ）または／およびスピーゲルマー標的複合体安定性（解離定数ｋｄ）に関して改良された結合特性を示して、全体的に改良された親和性（解離定数Ｋｄ）を生じた親分子の誘導体を、詳細結合動力学を測定（それぞれのスピーゲルマーの濃度シリーズの注入）することにより特性化した。
親分子の選定誘導体の詳細動力学評価
最低濃度で出発して、実行緩衝液中に希釈した２，０００−１，０００−５００−２００−１２５−６２．５−３１．３−１５．６（２ｘ）−７．８−３．９−１．９５−０．９８−０．４８−０．２４−０．１２−０ｎＭの濃度での一連のスピーゲルマー注入により、動力学的パラメーターおよび解離定数を評価した。全実験において、３０μｌ／分の流量で、２４０〜３６０秒の会合時間および２４０〜３６０秒の解離時間を限定するＫｉｎｊｅｃｔコマンドを用いて、３７℃で分析を実施した。検定を二重基準し、一方、フローセル（ＦＣｌ）は（遮断）表面対照として役立てて（各スピーゲルマー濃度が大きく関与）、分析物を含有しない一連の緩衝液注入は、緩衝液それ自体の多大な関与を確定した。少なくとも１つのスピーゲルマー濃度を２回注入して、実験中の再生効率およびチップ完全性をモニタリングした。データ解析および解離定数（Ｋｄ）の算定を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１．１ソフトウェア（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）で実行した。
結合改良をもたらす同定された交換位置の組合せ
最後に、置換のための陽性単一位置のうちの２つ以上を組合せて、その結果生じる配列を再び詳細結合動力学で試験した。
Ｂｉａｃｏｒｅ測定の結果は、実施例２〜５に記載されている。
実施例９：Ｓ１Ｐスピーゲルマーの競合的スピーゲルマープルダウン検定
Ｓ１Ｐスピーゲルマーの親和定数を、競合的プルダウン検定により決定した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによるスピーゲルマーの放射能標識を可能にするために、Ｄ型の２つのグアノシン残基をＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２スピーゲルマーの５’末端に付加した。次に、非標識化スピーゲルマーを、一定量のビオチニル化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐとの結合に関して３００〜６００ｐＭ放射能標識化スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇと競合するそれらの能力、すなわち、Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐに対する非標識化スピーゲルマーの結合親和性による結合シグナルの低減に関して試験した。Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐを８ｎＭの濃度で用いて、競合体スピーゲルマーの非存在下で、放射能標識化スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇの約１０％の最終結合を生じた。２５０μｌの選定緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＣａＣｌ２；０．１％［ｗ／ｖｏｌ］トゥイーン２０；４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン；１０μｇ／ｍｌ 酵母ＲＮＡ）中で、３７℃で３〜４時間、検定を実施した。ビオチニル化Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐおよびスピーゲルマーとビオチニル化Ｓ１Ｐの複合体を、５μｌのニュートラアビジン・ウルトラリンク・プラスビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＵＳＡ）（結合反応液の付加前に、選定緩衝液で予備平衡させておいた）上に固定した。サーモミキサー中で３７℃で３０分間、ビーズを懸濁液中に保持した。上清を取り出し、適切に洗浄した後、固定化放射能をシンチレーション計数器で定量した。結合放射能標識化スピーゲルマーＬ−Ｓ１Ｐ−２１５−Ｆ９−００２−５’ｄｉＤ−Ｇの結合パーセンテージまたは正規化パーセンテージを、競合体スピーゲルマーの対応する濃度に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、解離定数を得た。同一検定を、一組の異なるスピーゲルマーの比較等級付けのために用いた。この場合、指示されたような単一濃度で、競合体スピーゲルマーを用いた。
実施例１０：グルカゴンに対する結合親和性の確定（プルダウン検定）
グルカゴンに対する結合分析のために、グルカゴン結合核酸分子を、Ｌ−ヌクレオチドからなるスピーゲルマーとして合成した。スピーゲルマーの結合分析を、Ｌ−アミノ酸からなるビオチニル化ヒトＬ−グルカゴンで実行した。
直接プルダウン検定
スピーゲルマーの５’末端でのＤ型の２つの付加的アデノシン残基は、［γ−３２Ｐ］−標識化ＡＴＰ（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）による５’−ホスフェート標識を可能にした。標識化核酸の具体的放射能は、２００，０００〜８００，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌであった。変性および復元（１’ ９４°Ｃ、氷／Ｈ２Ｏ）後、標識化核酸を、選定緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１３７ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＫＣｌ；１ｍＭ ＭｇＣｌ２；１ｍＭ ＣａＣｌ２；０．１％［ｗ／ｖｏｌ］トゥイーン２０；０．１％［ｗ／ｖｏｌ］ＣＨＡＰＳ）中で、３７℃で、１００〜７００ｐＭの濃度で、それぞれ種々の量のビオチニル化ヒトＤ−またはＬ−グルカゴンと一緒に２〜６時間インキュベートして、低濃度で平衡に到達させた。選定緩衝液に、１００μｇ／ｍｌヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ， ＵＳＡ）を補足して、用いられるプラスチック容器の表面への、または固定化マトリックスへの結合相手の非特異的吸着を防止した。スピーゲルマー結合に関するビオチニル化Ｌ−グルカゴンの濃度範囲を、０．３２ｎＭ〜５μＭに設定した；総反応容積は５０μｌであった。ビオチニル化グルカゴン、および核酸とビオチニル化グルカゴンの複合体を、４μｌの高容量ニュートラアビジンアガロース粒子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＵＳＡ）（選定緩衝液で予備平衡させておいた）上に固定した。サーモミキサー中でそれぞれの温度で２０分間、粒子を懸濁液中に保持した。上清を取り出し、適切に洗浄した後、シンチレーション計数器で固定化放射能を定量した。結合パーセンテージをビオチニル化グルカゴンの濃度に対してプロットし、解離定数を、ソフトウェアアルゴリズム（ＧＲＡＦＩＴ；Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ； Ｓｕｒｒｅｙ Ｕ．Ｋ．）を用いることにより得て、１：１化学量論を推定した。
グルカゴン結合核酸の等級付けのための競合的プルダウン検定
グルカゴンとの異なるスピーゲルマーの結合を比較するために、競合的等級付け検定を実施した。この目的のために、利用可能な大半の擬似スピーゲルマーを放射能標識し（上記参照）、それぞれグルカゴン結合スピーゲルマーに関する参照として役立てた。変性および復元後、１．５μｌの高容量ニュートラアビジンアガロース粒子（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＵＳＡ）上での固定化、および競合を伴わない洗浄後に、ビオチニル化グルカゴンとの約５〜１０％結合を生じるという条件で、標識化核酸を、５０または１００μｌの選定緩衝液中で、ビオチニル化グルカゴンとともに、３７℃で、インキュベートした。過剰量の変性および復元化非標識化スピーゲルマー変異体を異なる濃度で、標識化参照スピーゲルマーと一緒に、結合反応と平行して、付加した。変性および復元化スピーゲルマー誘導体を、１、１０および１００ｎＭの濃度で、参照スピーゲルマーと一緒に、平行結合反応において適用した。試験されるべき核酸は、標的結合に関して参照核酸と競合し、したがって、それらの結合特質の依存関係における結合シグナルを低減した。この検定において最も活性であることが判明したアプタマーまたはスピーゲルマーは、それぞれ、次に、他のグルカゴン結合核酸分子の比較分析のための新規の参照として役立ち得た。
親和性の確定のための競合的プルダウン検定
比較等級付け実験のほかに、競合的プルダウン検定も実施して、グルカゴン結合核酸の親和定数を決定した。この目的のために、どれかのＬ−グルカゴン結合スピーゲルマーを放射能標識して、上記のように参照として役立てた。変性および復元後、標識化参照核酸、ならびに５倍希釈、例えば０．１２８〜２０００ｎＭの範囲の競合体分子の一組を、０．１または０．２ｍｌの選定緩衝液中の一定量のビオチニル化グルカゴンとともに、３７℃で２〜４時間、インキュベートした。選択タンパク質濃度は、最低競合体濃度で約５〜１０％の放射能標識化参照分子の最終結合を引き起こすはずである。誘導体核酸配列の結合定数を測定するために、過剰量の適切な変性および復元化非標識化スピーゲルマー変異体を競合体として役立てたが、一方、スピーゲルマーに関しては、非修飾化ならびにペギル化形態を試験した。別の検定アプローチでは、異なる濃度での非ビオチニル化グルカゴンは、スピーゲルマー結合に関してビオチニル化グルカゴンに対して競合した。ビオチニル化グルカゴンおよび結合核酸を１．５μｌの高容量ニュートラアビジンアガロースマトリックス上で固定し、洗浄およびシンチレーション計数後に（上記参照）、結合放射能標識化スピーゲルマーの正規化パーセンテージを、競合体分子の対応する濃度に対してプロットした。その結果生じた解離定数を、ＧｒａＦｉｔソフトウェアを用いて算定した。
実施例１１：Ｓ１Ｐ結合スピーゲルマーによりＥＤＧ１受容体を介してＳ１Ｐにより誘導されるβ−アレスチン動員の抑制
ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）ｅＸｐｒｅｓｓ ＥＤＧ−１ ＣＨＯ−Ｋ１ β−アレスチンＧＰＣＲ細胞（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を、１×１０４細胞／ウェルで透明底を有する白色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に植えつけて、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間、１００μｌの培養培地（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）中で培養した。刺激溶液（Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐ＋種々の濃度のスピーゲルマー）を、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補足したＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）中の１１倍濃縮溶液として作製し、十分に混合して、３７℃で３０分間インキュベートした。１０μｌ刺激溶液をウェル当たりで付加し（三重反復試験）、細胞を３７℃で５％ＣＯ２で９０分間、インキュベートした。
Ｄ−ｅ−Ｓ１Ｐによる受容体活性化時に、活性化ＥＤＧ１とβ−アレスチンとの相互作用は、β−ガラクトシダーゼ酵素断片相補性をもたらした。
β−ガラクトシダーゼ活性の定量のために、５５μｌの作業用検出試薬溶液（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を付加し、室温で９０分間インキュベートした。その後、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ多重検出プレート読取機（ＢＭＧ）で冷光を測定した。
抗Ｓ１Ｐスピーゲルマーの効力を示すために、１０ｎＭのＤ−ｅ−Ｓ１Ｐ、または種々の量のスピーゲルマーで予備インキュベートされたＤ−ｅ−Ｓ１Ｐで細胞を刺激した。結果は、スピーゲルマーの付加なしで得られたシグナルに対して正規化された冷光シグナルのパーセンテージを示す。三重反復試験培養からの平均値±ＳＤを示す。
実施例１２：ヒト神経芽細胞腫細胞におけるアルファＣＧＲＰ誘導性ｃＡＭＰ産生の抑制
ＣＧＲＰ結合スピーゲルマーの生物学的効力を、以下のように分析した：
ＳＫ−Ｎ−ＭＣヒト神経芽細胞腫細胞（ＤＳＭＺ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）を、５×１０ｅ４細胞／ウェルで平底９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中に植えつけて、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、４ｍＭ Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ）、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０ミクロンｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１００μｌ中で培養した。
刺激溶液（１ｎＭヒトまたはラットＬ−アルファＣＧＲＰ（Ｂａｃｈｅｍ）＋漸増濃度のスピーゲルマー）を、ｖ底０．２ｍｌ低プロフィール９６ウェルプレートを用いて、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補足したＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）中で三重反復試験として調製し、３７℃で全体で６０分間インキュベートした。ブランク値（無Ｌ−アルファＣＧＲＰ、無スピーゲルマー）および対照値（１ｎＭ Ｌ−アルファＣＧＲＰ、無スピーゲルマー）を、三重反復試験として含めた。刺激の２０分前に、１ｍＭホスホジエステラーゼ阻害薬３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ；ＨＢＳＳ／ＢＳＡ／ＨＥＰＥＳ中に希釈されたＤＭＳＯ中５０ｍＭストック）を細胞および刺激溶液に付加した。刺激のために、細胞培地を細胞から除去し、１００μｌの予備インキュベート化刺激溶液に取り替えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間刺激した。刺激溶液の除去後、５０μｌ／ウェルの検定／溶解緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｒｏｐｉｘ ｃＡＭＴ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ Ｓｙｓｔｅｍキット）を３７℃で３０分間付加することにより、細胞を溶解した。
その後、ウェル当たりのｃＡＭＰ産生量を、メーカーの使用説明書に従って、Ｔｒｏｐｉｘ ｃＡＭＴ−Ｓｃｒｅｅｎ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｓｙｓｔｅｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。要するに、６ｎｍｏｌ〜０．６ｐｍｏｌ ｃＡＭＰ／ウェルの範囲の検定／溶解緩衝液で、標準曲線を作成する。検定／溶解緩衝液中に希釈した細胞溶解物、および標準曲線を、ヤギ抗ウサギＩｇＧで予備被覆したマイクロプレートに付加する。ｃＡＭＰアルカリ性ホスファターゼ共役体および抗ｃＡＭＰ抗体を試料に付加し、室温で６０分間インキュベートする。その後、プレートを洗浄し、化学発光基質を付加する。３０分後、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡプレート読取機ユニット（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）で化学発光を測定する。ｃＡＭＴ−Ｓｃｒｅｅｎ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｓｙｓｔｅｍは、競合的イムノアッセイフォーマットである。したがって、光信号強度は、試料または標準調製物におけるｃＡＭＰと反比例する。この検定を用いて、本明細書中に記載される実施例１および７の範囲内のスピーゲルマーを試験した。結果を、図７および８に示す。産生されたｃＡＭＰの量を、対照のパーセンテージとして示す。対照に比してｃＡＭＰ産生の５０％抑制のために必要とされるスピーゲルマーの濃度は、阻害定数ＩＣ５０を限定する。
実施例１３：走化性検定における阻害濃度の決定
Ｃ５ａに関するヒト受容体を発現する細胞株の生成
ヒトＣ５ａ受容体をコードするプラスミド（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿００１７３６；ｐｃＤＮＡ３．１＋））でＢＡ／Ｆ３マウスプロＢ細胞をトランスフェクトすることにより、Ｃ５ａに関するヒト受容体を発現する安定的トランスフェクト化細胞株を生成した。Ｃ５ａを発現する細胞をゲネチシンでの処置により選択し、ＲＴ−ＰＣＲで発現に関して、そして走化性検定で機能性に関して試験した。
走化性検定
実験前日、細胞を０．３×１０６／ｍｌで新しいフラスコ中に植えつける。実験のために、細胞を遠心分離し、ＨＢＨ（ＨＢＳＳ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含有）で１回洗浄し、１．３３×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。この懸濁液７５μｌを、５μｍ孔を有する９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３３８８；ＮＹ， ＵＳＡ）の上部区画に付加した。下部区画では、組換えヒトＣ５ａ（配列番号５０）またはマウスＣ５ａ（配列番号５４）を、細胞の付加前に、３７℃で２０〜３０分間、２３５μｌのＨＢＨ中に種々の濃度でスピーゲルマーと一緒に予備インキュベートした。細胞を、３７℃で３時間、移動させた。その後、挿入プレート（上部区画）を取り出し、リン酸塩緩衝生理食塩水中の４４０μＭ レサズリン（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）３０μｌを下部区画に付加した。３７℃で２．５時間インキュベーション後、励起波長 ５４４ｎｍおよび発光波長 ５９０ｎｍで蛍光を測定した。
蛍光値をバックグラウンド蛍光（ウェル中にＣ５ａなし）に関して補正し、スピーゲルマー濃度に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて非線形回帰（４パラメーター・フィット）で、ＩＣ５０値を決定した。代替的には、スピーゲルマーを有さない試料（Ｃ５ａのみ）に関する値を１００％に設定し、スピーゲルマーを有する試料に関する値をこのパーセントとして算定する。パーセント値をスピーゲルマー濃度に対してプロットして、ＩＣ５０値を上記のように決定する。
ヒトおよびマウスＣ５ａに関する半数効果濃度（ＥＣ５０）の決定
種々のヒトＣ５ａまたはマウスＣ５ａ濃度の方向へのＢＡ／Ｆ３／ｈｕＣ５ａＲ細胞の３時間移動後、ヒトおよびマウスＣ５ａに関する用量応答曲線を得たが、これは、ｈｕＣ５ａに関しては０．１ｎＭおよびｍＣ５ａに関しては０．３ｎＭという半数効果濃度（ＥＣ５０）を示した。スピーゲルマーによる走化性の抑制に関する実験のために、０．１ｎＭヒトＣ５ａおよび０．３ｎＭマウスＣ５ａを用いた。
実施例１４：グルカゴン結合スピーゲルマーによるグルカゴン誘導性ｃＡＭＰ産生の阻害
ｐＣＲ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でヒトグルカゴン受容体をコードする配列（ＮＣＢＩ寄託番号ＮＭ＿０００１６０）をクローニングすることにより、グルカゴンに関するヒト受容体を発現する安定的トランスフェクト化細胞株を生成した。無血清培地（ＵｌｔｒａＣＨＯ、Ｌｏｎｚａ）中で増殖させるために適合されたＣＨＯ細胞を、グルカゴン受容体プラスミドでトランスフェクトして、安定的トランスフェクト化細胞を、ゲネチシンでの処置により選択した。
阻害実験のために、グルカゴン受容体を発現するＣＨＯ細胞を、４〜６かける１０４／ウェルの密度で９６ウェルプレート（処置済細胞培養、平底）上にプレート化して、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した後、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）の刺激溶液を付加して、最終濃度を１ｍＭとした。
ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ中で刺激溶液（グルカゴン＋種々の濃度のスピーゲルマー）を作成し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞への付加の直前に、ＩＢＭＸを付加して、最終濃度を１ｍＭとした。刺激のために、培地を細胞から除去して、刺激溶液（グルカゴン＋スピーゲルマー）を付加した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、溶液を除去し、ｃＡＭＰ−Ｓｃｒｅｅｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の一構成成分である溶解緩衝液中に溶解した。このキットを、供給元の使用説明書に従って、ｃＡＭＰ含量の決定のために用いた。
参考文献
本明細書中で引用される文書の完全な文献目録は、別記しない限り、以下の通りである（これらの記載内容は、参照により本明細書中で援用される）：
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本明細書、特許請求の範囲および／または図面中に開示される本発明の特徴は、別々に、ならびにその任意の組合せで、その種々の形態で本発明を具体化するための構成要素であり得る。

Claims (97)

  1. 標的分子と結合し得る核酸分子の生成方法であって、以下の：
    ａ）参照核酸分子を提供するステップ（ここで、前記参照核酸分子は前記標的分子と結合し得るし、前記参照核酸分子は、一ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列はｎ個のヌクレオチドを含む）；
    ｂ）前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体は１つのヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なり、前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸分子があるヌクレオチド位置にリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして前記第一次レベル誘導体は、前記参照核酸があるヌクレオチド位置に２’−デオキシリボヌクレオチドを有する場合、そのヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより調製され、そして取替えがなされるヌクレオチド位置は修飾化ヌクレオチド位置である）；ならびに
    ｃ）前記参照核酸分子の各ヌクレオチド位置に関してステップｂ）を反復し、したがって、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の一群を調製するステップ（ここで、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群はｎ個の第一次レベル誘導体からなり、前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体の各々は単一ヌクレオチド置換により前記参照核酸分子と異なっており、そして前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の各々は、前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の前記群の他の第一次レベル誘導体の単一修飾化ヌクレオチド位置のすべての単一修飾化ヌクレオチドと異なる単一修飾化ヌクレオチド位置を有する）
    を包含する方法。
  2. 以下のステップｄ）および任意にステップｅ）を包含する請求項１記載の方法：
    ｄ）前記参照核酸のｎ個の第一次レベル誘導体の各々に関して前記標的分子との結合特質を確定するステップ；ならびに任意に
    ｅ）その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第一次レベル誘導体（単数または複数）を同定するステップ。
  3. 前記結合特質が前記参照核酸分子の前記第一次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である請求項２記載の方法。
  4. 前記結合親和性がＫＤ値として表される請求項２〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記予定閾値がＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第一次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０である請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記予定閾値がＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第一次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０である請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
    （ａ）前記ヌクレオチドがアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシアデノシン−５−ホスフェートであり；
    （ｂ）前記ヌクレオチドがグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｃ）前記ヌクレオチドがシチジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
    （ｄ）前記ヌクレオチドがウリジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシウリジン−５−ホスフェートまたはチミジン−５−ホスフェートであり；そして
    ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
    （ａ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはアデノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｂ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはグアノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｃ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
    （ｄ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはウリジン−５’−ホスフェートまたは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
    （ａ）前記ヌクレオチドがアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシアデノシン−５−ホスフェートであり；
    （ｂ）前記ヌクレオチドがグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｃ）前記ヌクレオチドがシチジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
    （ｄ）前記ヌクレオチドがウリジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェートであり；そして
    ステップｂ）において、あるヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
    （ａ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはアデノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｂ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはグアノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｃ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
    （ｄ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである
    請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記参照核酸がリボ核酸分子であり、そしてステップｂ）において、あるヌクレオチド位置のリボヌクレオチドを２’−デオキシリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
    （ａ）前記ヌクレオチドがアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシアデノシン−５−ホスフェートであり；
    （ｂ）前記ヌクレオチドがグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｃ）前記ヌクレオチドがシチジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
    （ｄ）前記ヌクレオチドがウリジン−５’−ホスフェートであるならば、２’−デオキシリボヌクレオチドは２’−デオキシウリジン−５’−ホスフェートまたはチミジン−５’−ホスフェートである
    請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記参照核酸が２’−デオキシリボ核酸分子であり、そしてステップｂ）において、あるヌクレオチド位置の２’−デオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに取り替えることにより前記第一次レベル誘導体が調製される場合、
    （ａ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシアデノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはアデノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｂ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシグアノシン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはグアノシン−５’−ホスフェートであり；
    （ｃ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドが２’−デオキシシチジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはシチジン−５’−ホスフェートであり；ならびに
    （ｄ）前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドはウリジン−５’−ホスフェートまたは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである
    請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記２’−デオキシリボヌクレオチドがチミジン−５’−ホスフェートであるならば、前記リボヌクレオチドは５−メチル−ウリジン−５’−ホスフェートである請求項１０記載の方法。
  12. 前記標的分子と結合し得る核酸分子の生成方法である請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法であって、前記核酸分子の結合親和性が増大されるか、または前記参照核酸分子と前記標的分子との結合親和性と同じである方法。
  13. その結合特質が予定閾値を上回る前記第一次レベル誘導体が、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記参照核酸分子の第二次レベル誘導体が調製される請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記第二次レベル誘導体が、少なくとも第一ヌクレオチド位置および第二ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
    前記第一ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第二ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である
    請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第一の第一次レベル誘導体および前記第二の第一次レベル誘導体が２つの第一次レベル誘導体の任意の組合せである請求項１４記載の方法であって、前記２つの第一次レベル誘導体の各々の前記結合特質が予定閾値を上回る方法。
  16. 第一の第一次レベル誘導体および第二次レベル誘導体が、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する２つの第一次レベル誘導体である請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記参照核酸分子の前記第二次レベル誘導体が前記標的分子と結合し得る請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 以下の：
    − 前記参照核酸分子の前記第二次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
    − その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第二次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
    を包含する請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記結合特質が、前記参照核酸分子の前記第二次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である請求項１８記載の方法。
  20. 前記結合親和性がＫＤ値として表される請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記予定閾値がＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第二次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記予定閾値がＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第二次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. その結合特質が予定閾値を上回る前記第二次レベル誘導体が、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記参照核酸分子の第三次レベル誘導体が調製される請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法であって、前記第三次レベル誘導体が、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置および第三ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
    前記第一ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第二ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第三ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である
    請求項２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体および第三の第一次レベル誘導体が３つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記３つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質が予定閾値を上回る請求項２４記載の方法。
  26. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体および第三の第一次レベル誘導体が、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する３つの第一次レベル誘導体である請求項２４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記参照核酸分子の前記第三次レベル誘導体が前記標的分子と結合し得る請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 以下の：
    − 前記参照核酸分子の前記第三次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
    − その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第三次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
    を包含する請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記結合特質が、前記参照核酸分子の前記第三次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である請求項２８記載の方法。
  30. 前記結合親和性がＫＤ値として表される請求項２８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記予定閾値がＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第三次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記予定閾値がＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第三次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. その結合特質が予定閾値を上回る前記第三次レベル誘導体が、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記参照核酸分子の第四次レベル誘導体が調製される請求項２〜３３のいずれか一項に記載の方法であって、前記第四次レベル誘導体が、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置および第四ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
    前記第一ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第二ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第三ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第四ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である
    請求項２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体および第四の第一次レベル誘導体が４つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記４つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質が予定閾値を上回る請求項３４記載の方法。
  36. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体および第四の第一次レベル誘導体が、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する４つの第一次レベル誘導体である請求項３４〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記参照核酸分子の前記第四次レベル誘導体が前記標的分子と結合し得る請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 以下の：
    − 前記参照核酸分子の前記第四次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
    − その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第四次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
    を包含する請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記結合特質が、前記参照核酸分子の前記第四次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である請求項３８記載の方法。
  40. 前記結合親和性がＫＤ値として表される請求項３８〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記予定閾値がＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第四次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記予定閾値がＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第一次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. その結合特質が予定閾値を上回る前記第四次レベル誘導体が、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である請求項３４〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記参照核酸分子の第五次レベル誘導体が調製される請求項２〜４３のいずれか一項に記載の方法であって、前記第五次レベル誘導体が、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置、第四ヌクレオチド位置および第五ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
    前記第一ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第二ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第三ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第四ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第五ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第五の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第五ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である
    請求項２〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体および第五の第一次レベル誘導体が５つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記５つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質が予定閾値を上回る請求項４４記載の方法。
  46. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体および第五の第一次レベル誘導体が、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する５つの第一次レベル誘導体である請求項４４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記参照核酸分子の前記第五次レベル誘導体が前記標的分子と結合し得る請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 以下の：
    − 前記参照核酸分子の前記第五次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
    − その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第五次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
    を包含する請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記結合特質が、前記参照核酸分子の前記第五次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である請求項４８記載の方法。
  50. 前記結合親和性がＫＤ値として表される請求項４８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記予定閾値がＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第五次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記予定閾値がＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第五次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. その結合特質が予定閾値を上回る前記第五次レベル誘導体が、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記参照核酸分子の第六次レベル誘導体が調製される請求項２〜５３のいずれか一項に記載の方法であって、前記第六次レベル誘導体が、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置、第四ヌクレオチド位置、第五ヌクレオチド位置および第六ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
    前記第一ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第二ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第三ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第四ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第五ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第五の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第五ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第六ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第六の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第六ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である
    請求項２〜５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体および第六の第一次レベル誘導体が６つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記６つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質が予定閾値を上回る請求項５４記載の方法。
  56. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体および第六の第一次レベル誘導体が、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する６つの第一次レベル誘導体である請求項５４〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記参照核酸分子の前記第六次レベル誘導体が前記標的分子と結合し得る請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 以下の：
    − 前記参照核酸分子の前記第六次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
    − その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第六次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
    を包含する請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記結合特質が、前記参照核酸分子の前記第六次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である請求項５８記載の方法。
  60. 前記結合親和性がＫＤ値として表される請求項５８〜５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記予定閾値がＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第六次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である請求項５８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記予定閾値がＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第六次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. その結合特質が予定閾値を上回る前記第六次レベル誘導体が、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記参照核酸分子の第七次レベル誘導体が調製される請求項２〜６３のいずれか一項に記載の方法であって、前記第七次レベル誘導体が、少なくとも第一ヌクレオチド位置、第二ヌクレオチド位置、第三ヌクレオチド位置、第四ヌクレオチド位置、第五ヌクレオチド位置、第六ヌクレオチド位置および第七ヌクレオチド位置で前記参照核酸分子と異なっており、
    前記第一ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第一ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第一の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第二ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第二の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第二ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第二の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第三ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第三の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第三ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第三の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第四ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第四の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第四ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第四の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第五ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第五の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第五ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第五の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、
    前記第六ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第六の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第六ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第六の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一であり、ならびに
    前記第七ヌクレオチド位置が、ｎ個の誘導体からなる前記参照核酸分子の誘導体の群からの前記参照核酸分子の第七の第一次レベル誘導体の修飾化ヌクレオチド位置であり、そして前記第七の第一次レベル誘導体が、その結合特質が予定閾値を上回るものであり、前記第七ヌクレオチド位置のヌクレオチドが前記参照核酸分子の第七の第一次レベル誘導体の修飾化位置のヌクレオチドと同一である
    請求項２〜６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体、第六の第一次レベル誘導体および第七の第一次レベル誘導体が７つの第一次レベル誘導体の任意の組合せであり、前記７つの第一次レベル誘導体の各々の結合特質が予定閾値を上回る請求項６４記載の方法。
  66. 前記第一の第一次レベル誘導体、第二の第一次レベル誘導体、第三の第一次レベル誘導体、第四の第一次レベル誘導体、第五の第一次レベル誘導体、第六の第一次レベル誘導体および第七の第一次レベル誘導体が、ｎ個のヌクレオチドからなる前記参照核酸分子の第一次レベル誘導体の群の第一次レベル誘導体の残りのものより優れた結合特質を有する７つの第一次レベル誘導体である請求項６４〜６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記参照核酸分子の前記第七次レベル誘導体が前記標的分子と結合し得る請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
  68. 以下の：
    − 前記参照核酸分子の前記第七次レベル誘導体と前記標的分子との結合特質を確定すること；そして任意に、
    − その結合特質が予定閾値を上回る前記参照核酸分子のその／それらの第七次レベル誘導体（単数または複数）を同定すること
    を包含する請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記結合特質が、前記参照核酸分子の前記第七次レベル誘導体（単数または複数）と前記標的分子との結合親和性である請求項６８記載の方法。
  70. 前記結合親和性がＫＤ値として表される請求項６８〜６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記予定閾値がＹであって、Ｙは（前記参照核酸分子の結合親和性）／（前記第七次レベル誘導体の結合親和性）の商であり、そしてＹ＞１、さらに好ましくはＹ≧２、最も好ましくはＹ≧５またはＹ≧１０またはＹ≧２０である請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記予定閾値がＸであって、Ｘは（前記参照核酸分子のＫＤ値）／（前記第七次レベル誘導体のＫＤ値）の商であり、そしてＸ＞１、さらに好ましくはＸ≧２、最も好ましくはＸ≧５またはＸ≧１０またはＸ≧２０である請求項６８〜７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. その結合特質が予定閾値を上回る前記第七次レベル誘導体が、一または前記標的分子と結合し得る一または前記核酸分子である請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 一標的分子と結合し得る前記核酸がＬ−核酸であり、前記参照核酸分子がＬ−核酸であり、そして前記参照核酸分子の前記誘導体の各々およびいずれかがＬ−核酸である請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法により得られる一標的分子と結合し得る核酸分子。
  76. 少なくとも１つの修飾を含む請求項７５記載の核酸分子。
  77. 疾患の処置および／または防止のための方法に用いるためである請求項７５〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  78. 疾患の診断のための方法に用いるためである請求項７５〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  79. 前記疾患が前記標的分子を伴う疾患である請求項７７〜７８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  80. 疾患の前記処置のための医薬品の製造のためである請求項７５〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
  81. 疾患の処置のための診断薬の製造のための請求項７５〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
  82. 前記疾患が前記標的分子を伴う疾患である請求項８０〜８１のいずれか一項に記載の使用。
  83. 請求項７５〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子ならびに製薬上許容可能な担体を含む薬学的組成物。
  84. 標的分子と結合し得る核酸分子であって、
    前記核酸分子が前記標的分子との結合親和性を有し、
    前記核酸分子と前記標的分子との結合親和性が、参照核酸分子と前記標的分子との結合親和性と比較して、増大されるかまたは同一であって、
    この場合、
    ｃ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列を含み、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列を有するか、あるいは
    ｄ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基を含み、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基をふくみ、
    前記核酸分子の前記ヌクレオチド配列および前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチドの核酸塩基部分に関して少なくとも部分的に同一であるが、しかし前記ヌクレオチドの糖部分に関して異なり、
    前記核酸分子の前記ヌクレオチド配列が、リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドの両方からなり、そして前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列がリボヌクレオチドまたは２’−デオキシリボヌクレオチドのいずれかからなる
    核酸分子。
  85. ａ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列からなり、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列からなるか、あるいは
    ｂ）前記核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基からなり、そして前記参照核酸分子が一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基からなる
    請求項８４記載の核酸分子であって、
    前記核酸分子の前記ヌクレオチド配列および前記参照核酸分子の前記ヌクレオチド配列が、ヌクレオチドの核酸塩基部分に関して同一であるが、しかしヌクレオチドの糖部分に関して異なっている
    核酸分子。
  86. 前記核酸分子と前記標的分子との結合親和性が、参照核酸分子と前記標的分子との結合親和性と比較して増大される請求項８５記載の核酸分子。
  87. 前記リボヌクレオチドがＬ−リボヌクレオチドであり、そして前記２’−デオキシリボヌクレオチドがＬ−２’−デオキシリボヌクレオチドである請求項７５〜８６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  88. 前記核酸分子がＬ−核酸分子であり、前記Ｌ−核酸分子がＬ−ヌクレオチドからなり、ならびに前記参照核酸分子がＬ−参照核酸分子であり、前記Ｌ−参照核酸分子がＬ−ヌクレオチドからなる請求項７５〜８７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  89. 前記核酸分子および／または前記参照核酸分子が前記標的分子により媒介される活性のアンタゴニストである請求項７５〜８８のいずれか一項に記載の核酸分子。
  90. 一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾基を含む前記核酸分子の生物体からの排泄率が、前記ヌクレオチド配列からなる核酸分子と比較して低減される請求項７５〜８９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  91. 一ヌクレオチド配列および少なくとも１つの修飾を含む前記核酸分子が、前記ヌクレオチド配列からなる核酸分子と比較して、生物体における保持時間増大を示す請求項７５〜８９のいずれか一項に記載の核酸分子。
  92. 前記修飾基が、生分解性および非生分解性修飾からなる群から選択され、好ましくは前記修飾基はポリエチレングリコール、線状ポリエチレングリコール、分枝鎖ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、ペプチド、タンパク質、多糖、ステロール、ポリオキシプロピレン、ポリオキシアミデートおよびポリ（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミンからなる群から選択される請求項９０および９１のいずれか一項に記載の核酸分子。
  93. 前記修飾基が、好ましくは線状ポリエチレングリコールまたは分枝鎖ポリエチレングリコールからなるポリエチレングリコールである請求項９２記載の核酸分子であって、前記ポリエチレングリコールの分子量が好ましくは約２０，０００〜約１２０，０００Ｄａ、さらに好ましくは約３０，０００〜約８０，０００Ｄａ、最も好ましくは約４０，０００Ｄａである核酸分子。
  94. 前記修飾基がヒドロキシエチルデンプンである請求項９２記載の核酸分子であって、好ましくは前記ヒドロキシエチルデンプンの分子量が約５０〜約１０００ｋＤａ、さらに好ましくは約１００〜約７００ｋＤａ、最も好ましくは２００〜５００ｋＤａである核酸分子。
  95. 前記生物体が動物またはヒト身体、好ましくはヒト身体である請求項９０〜９４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  96. 疾患の処置および／または防止のための方法における使用のための請求項８４〜９５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  97. 前記核酸分子および前記参照核酸分子がヌクレアーゼ活性に耐性である請求項７５〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子。
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