CN103339258A - 具有对于靶分子的结合亲和力的核酸分子及产生所述核酸分子的方法 - Google Patents

具有对于靶分子的结合亲和力的核酸分子及产生所述核酸分子的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103339258A
CN103339258A CN201280007720XA CN201280007720A CN103339258A CN 103339258 A CN103339258 A CN 103339258A CN 201280007720X A CN201280007720X A CN 201280007720XA CN 201280007720 A CN201280007720 A CN 201280007720A CN 103339258 A CN103339258 A CN 103339258A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid molecule
horizontal
derivative
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280007720XA
Other languages
English (en)
Inventor
F·雅罗什
S·克鲁斯曼
S·赛尔
W·普尔施克
C·玛氏
A·瓦特
K·霍利格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TME Pharma AG
Original Assignee
Noxxon Pharma AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2011/002068 external-priority patent/WO2011131371A1/en
Application filed by Noxxon Pharma AG filed Critical Noxxon Pharma AG
Publication of CN103339258A publication Critical patent/CN103339258A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法，所述方法包括下列步骤：a)提供参照核酸分子，其中参照核酸分子能够结合靶分子并且其中参照核酸分子包含核苷酸的序列，其中核苷酸的序列包含n个核苷酸；b)制备参照核酸分子的第一水平衍生物，其中参照核酸分子的第一水平衍生物与参照核酸分子相异在于一个核苷酸位置，其中如果参照核酸在核苷酸位置上具有核糖核苷酸，则第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且其中如果参照核酸在核苷酸位置上具有2’-脱氧脱氧核糖核苷酸，则第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且其中在其上进行替代的核苷酸位置是修饰核苷酸位置；和c)对于参照核酸分子的每一个核苷酸位置重复步骤b)，从而制备一组参照核酸分子的第一水平衍生物，其中参照核酸分子的第一水平衍生物的组由n种第一水平衍生物组成，其中参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种与参照核酸分子相异在于单个核苷酸置换，并且其中参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种具有单个修饰核苷酸位置，所述单个修饰核苷酸位置与所述参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其它第一水平衍生物的所有单个修饰核苷酸位置的单个修饰核苷酸不同。

Description

具有对于靶分子的结合亲和力的核酸分子及产生所述核酸分子的方法
本发明涉及用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法，可通过所述方法获得的核酸分子，所述核酸分子的用途，能够结合靶分子的核酸分子，其中所述核酸分子相较于参照核酸分子具有增加的对于靶分子的结合亲和力或相同的对于靶分子的结合亲和力。此外，本发明涉及具有增加的或相同的结合亲和力的核酸分子在治疗和/或诊断疾病的方法中的用途。
除了使用比较小的有机分子外，新型治疗概念的发展日益凭借于单抗隆抗体、肽和功能性核酸分子即特异性结合靶结构或靶分子的这类核酸分子。此类功能性核酸分子的代表是所谓的适体，已开发了针对许多不同生物分子的所述适体。因此，始于D-核酸文库，通过体外选择在几个步骤中分离一种或多种D-核酸分子(所谓的适体)，其特征在于特别高的针对它们靶结构或靶分子的亲和力。用于制备此类适体的方法描述于例如欧洲专利EP 0 533 838中。
通过使用组合RNA或DNA寡核苷酸文库发现了第一适体。RNA适体以及DNA适体是D-核酸分子并且在生物系统例如人或动物体中被核酸酶快速降解，这使得它们不能用于治疗性应用。因此，适体的稳定化是适体药物候选物的开发过程中的必需步骤。稳定化可通过如下步骤来实现
a)通过在适体的5’-和3’-末端添加加帽部分来保护适体的5’-和3’-末端，
b)将修饰掺入核糖或脱氧核糖主链，或
c)掺入磷酸主链组分。
通过在适体的5’-末端添加加帽部分，可改善适体的血清和体内稳定性(特别地针对于存在于人和动物体的体液中的5’-->3’核酸酶和5’-->3’外切核酸酶的稳定性)。可在常规固相合成中或通过合成后偶联(post-synthesis coupling)以修饰亚磷酰胺(modified phosphoamidite)的形式引入该类型的修饰。通常使用包含5’-氨基的5’-氨基修饰剂，由此5’-氨基可用作用于进行随后衍生的亲核基团。最常见的5’-修饰是聚乙二醇。其它修饰选自胆固醇、脂肪酸、聚阳离子和蛋白质。除了赋予适体的5’-末端的稳定性外，这样的修饰还可用于改变药代动力学类型(pharmacokinetic profile)和/或适体的生物分布。
在适体的3’-末端添加加帽部分赋予适体抗存在于人和动物的血清中的3’-->5’外切核酸酶的保护作用。核苷酸和非核苷酸3’-帽是已知的。最常使用的3’-帽是反向胸苷(3’-idT)。
适体的核糖或脱氧核糖主链的2’位置上的化学修饰是在体内使用适体所必须的。此类2’-修饰通常选自2’-F、2’-O-甲基、2’-氨基。在SELEX法(至一定程度)内或在所谓的SELEX后最优化法中将所述2’-F、2’-O-甲基、2’-氨基修饰引入适体序列的技术在本领域是可获得的，其中通过用2’-F、2’-O-甲基或2’-氨基核苷酸分步替代天然核苷酸来最优化单个适体序列。
磷酸主链修饰引入硫替代非桥键磷酸二酯氧，从而为适体赋予核酸酶抗性。这样的硫修饰的主链的优选形式是硫代磷酸酯。可利用SELEX法或通过固相合成将硫代磷酸酯酶促掺入适体。硫代磷酸酯适体必须通过固相合成产生。
除适体外，所谓的镜像异构适体(spiegelmer)构成了功能性核酸的另外的形式。与适体一样，镜像异构适体特异性结合靶分子或靶结构。通过方法鉴定镜像异构适体，所述方法使用D-核酸文库进行针对靶分子或靶结构的对映体形式的体外选择，因此所鉴定的结合靶分子或靶结构的对映体形式的D-核酸被制备为对应的L-核酸。作为手性互易(chiral reciprocity)的原理的结果，此类称为镜像异构适体的L-核酸能够结合真实或实际的靶分子并且不结合其对映体形式，从而用于选择法。优选这样的真实或实际的靶分子或靶结构是如存在于生物系统例如人或动物体中的靶分子或靶结构。用于制备此类镜像异构适体的方法描述于例如国际专利申请WO98/08856中。
由于镜像异构适体是从L-核苷酸装配而来的L-核酸分子，通常L-寡核苷酸，因此它们不能被天然酶降解。除靶特异性外，该特征使它们适合用于大多数不同领域，例如生物样品的分析、诊断和疗法。
与在它们的使用前必须进行稳定化以抗核酸酶降解(如上所概述的)的适体相反，不必在它们的使用(例如在功能性测定中、在基于细胞的测定中、在体内实验中和/或在用于疗法或诊断的体内应用中)之前稳定化镜像异构适体。镜像异构适体的体内适用性在人和各种动物物种中得到证明。在2009年开始了关于镜像异构适体NOX-E36和NOX-A12的临床试验。
因为对于镜像异构适体不需要为了稳定化而进行化学修饰，因此就核苷酸构件块而言镜像异构适体仅由核糖核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸，更准确地由L-核糖核苷酸或L-2’-脱氧核糖核苷酸组成。由此产生的镜像异构适体在药物开发中的有利方面是利用修饰核苷酸例如2’-F-核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖核苷酸和2’-氨基核糖核苷酸替代非修饰核苷酸即L-核糖核苷酸和L-2’-脱氧核糖核苷酸的耗时、昂贵以及迄今为止被认为是危险过程的不存在。仅由L-核糖核苷酸或L-2’-脱氧核糖核苷酸组成的镜像异构适体在药物开发中的其它有利方面是此类化学修饰核苷酸的潜在毒性作用或不耐性和/或其降解产物的不存在。
因此，仅由L-核糖核苷酸或L-2’-脱氧核糖核苷酸组成的镜像异构适体的体内效力通常仅取决于它们对靶分子的亲和力并且作为其结果，取决于它们对靶分子或靶结构的功能的作用以及它们在人或动物体内的药代动力学行为。
本发明背后的问题的是提供用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法，所述核酸分子始于结合靶分子的参照核酸分子。优选核酸分子能够结合的靶分子是参照核酸分子结合的靶分子。
本发明的背后的其它问题是提供用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法，所述核酸分子始于结合靶分子的参照核酸分子，其中能够结合靶分子的核酸分子相较于参照核酸分子具有相同的改善的结合特征，其中优选地结合特征是针对靶分子的结合亲和力。
本发明背后的其它问题是提供了核酸分子，更具体地功能性核酸分子例如适体或镜像异构适体，所述核酸分子相较于参照核酸分子具有改善的对于其靶分子的结合亲和力或相同的结合亲和力。
本发明背后的这些和其它问题可通过所附的独立权利要求的主题来解决。优选实施方案可获自从属权利要求。
更具体地，本发明背后的问题在也是第一方面的第一实施方案的第一方面中通过用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法来解决，所述方法包括下列步骤：
a)提供参照核酸分子，其中参照核酸分子能够结合靶分子并且其中参照核酸分子包含核苷酸的序列，其中核苷酸的序列包含n个核苷酸；
b)制备参照核酸分子的第一水平衍生物，其中参照核酸分子的第一水平衍生物与参照核酸分子相异在于一个核苷酸位置，其中如果参照核酸分子在所述核苷酸位置上具有核糖核苷酸，则第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且其中如果参照核酸在所述核苷酸位置上具有2’-脱氧核糖核苷酸，则第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代所述一个位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且其中在其上进行替代的核苷酸位置是修饰核苷酸位置；和
c)对于参照核酸分子的每一个核苷酸位置重复步骤b)，从而制备一组参照核酸分子的第一水平衍生物，其中参照核酸分子的第一水平衍生物的组由n种第一水平衍生物组成，其中参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种与参照核酸分子相异在于单个核苷酸置换，并且其中参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种具有单个修饰核苷酸位置，所述单个修饰核苷酸位置与参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其它第一水平衍生物的所有单个修饰核苷酸位置的单个修饰核苷酸不同。
在也是第一方面的第一实施方案的实施方案的第一方面的第二实施方案中，方法包括步骤d)和任选地步骤e)：
d)测定参照核酸的n种第一水平衍生物的每一种对于靶分子的结合特征；和任选地
e)鉴定其结合特征超过预定阈值的参照核酸分子的所述/那些第一水平衍生物。
在也是第一方面的第二实施方案的实施方案的第一方面的第三实施方案中，结合特征是参照核酸分子的第一水平衍生物对靶分子的结合亲和力。
在也是第一方面的第二实施方案和第三实施方案的实施方案的第一方面的第四实施方案中，结合亲和力表达为KD值。
在也是第一方面的第二、第三和第四实施方案的实施方案的第一方面的第五实施方案中，预定阈值是Y，Y是(参照核酸分子的结合亲和力)/(第一水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2以及最优选Y≥5或Y≥10。
在也是第一方面的第二、第三、第四和第五实施方案的实施方案的第一方面的第六实施方案中，预定阈值是X，X是(参照核酸分子的KD值)/(第一水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2以及最优选≥5或X≥10。
在也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案的第一方面的第七实施方案中，
如果在步骤b)中，第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5-磷酸；
(b)如果核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’磷酸；以及
(d)如果核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧尿苷-5’-磷酸或胸苷-5-磷酸；
以及
如果在步骤b)中，第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸；
(b)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’磷酸，则核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’磷酸，则核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸或5-甲基-尿苷-5’-磷酸。
在也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七实施方案的实施方案的第一方面的第八实施方案中，
如果在步骤b)中，第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸；
(b)如果核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧尿苷-5’-磷酸；
以及
如果在步骤b)中，第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸；
(b)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是5-甲基-尿苷-5’磷酸。
在也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案的第一方面的第九实施方案中，参照核酸是核糖核酸分子并且其中在步骤b)中，第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备并且其中如果
(a)核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸；
(b)核糖核苷酸是鸟苷5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸；
(c)核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸；
(d)核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧尿苷-5’-磷酸或胸苷-5’磷酸。
在也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八和第九实施方案的实施方案的第一方面的第十实施方案中，参照核酸是2’-脱氧核糖核酸分子并且其中在步骤b)中，第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来制备，并且其中如果
(a)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸；
(b)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’磷酸，则核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸或5-甲基-尿苷5’-磷酸。
在也是第一方面的第十实施方案的实施方案的第一方面的第十一实施方案中，如果2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’-磷酸，则核糖核苷酸是5-甲基-尿苷-5’-磷酸。
也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十和第十一实施方案的实施方案的第一方面的第十二实施方案中，方法是用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法，其中核酸分子的结合亲和力相较于参照核酸分子对于靶分子的结合亲和力增加或与其相同。
也是第一方面的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一和第十二实施方案的实施方案的第一方面的第十三实施方案中，其结合特征超过预定阈值的第一水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
也是第一方面的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十三实施方案的实施方案的第一方面的第十四实施方案中，制备参照核酸分子的第二水平衍生物，其中第二水平衍生物与参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置和第二核苷酸位置，
其中第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第一核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第二核苷酸位置上的核苷酸与参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
在也是第一方面的第十四实施方案的实施方案的第一方面的第十五实施方案中，第一第一水平衍生物和所述第二第一水平衍生物是两种第一水平衍生物的任意组合，其中所述两种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
在也是第一方面的第十四和第十五实施方案的实施方案的第一方面的第十六实施方案中，第一第一水平衍生物和所述第二水平衍生物是两种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
在也是第一方面的第十四、第十五和第十六实施方案的实施方案的第一方面的第十七实施方案中，参照核酸分子的第二水平衍生物能够结合靶分子。
在也是第一方面的第十五、第十六和第十七实施方案的实施方案的第一方面的第十八实施方案中，方法包括：
-测定参照核酸分子的第二水平衍生物对靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的参照核酸分子的所述/那些第二水平衍生物。
在也是第一方面的第十八实施方案的实施方案的第一方面的第十九实施方案中，结合特征是参照核酸分子的第二水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
在也是第一方面的第十八和第十九实施方案的实施方案的第一方面的第二十实施方案中，结合亲和力表达为KD值。
在也是第一方面的第十八、第十九和第二十实施方案的实施方案的第一方面的第二十一实施方案中，预定阈值是Y，Y为(参照核酸分子的结合亲和力)/(第二水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
在也是第一方面的第十八、第十九、第二十和第二十一实施方案的实施方案的第一方面的第二十二的实施方案中，预定阈值是X，X为(参照核酸分子的KD值)/(第二水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
在也是第一方面的第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一和第二十二实施方案的实施方案的第一方面的第二十三实施方案中，其结合特征超过预定阈值的第二水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
在也是第一方面的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二和第二十三实施方案的实施方案的第一方面的第二十四实施方案中，制备参照核酸分子的第三水平衍生物，其中第三水平衍生物与参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置和第三核苷酸位置，
其中第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第一核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第二核苷酸位置上的核苷酸与参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第三核苷酸位置上的核苷酸与参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
在也是第一方面的第二十四实施方案的实施方案的第一方面的第二十五实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物和第三第一水平衍生物是3种第一水平衍生物的任意组合，其中3种第一水平衍物的每一种的结合特征超过预定阈值。
在也是第一方面的第二十四和第二十五实施方案的实施方案的第一方面的第二十六实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物和第三第一水平衍生物是3种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
在也是第一方面的第二十四、第二十五和第二十六实施方案的实施方案的第一方面的第二十七实施方案中，参照核酸分子的第三水平衍生物能够结合靶分子。
在也是第一方面的第二十五、第二十六和第二十七实施方案的实施方案的第一方面的第二十八实施方案中，方法包括：
-测定参照核酸分子的第三水平衍生物对靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的参照核酸分子的所述/那些第三水平衍生物。
在也是第一方面的第二十八实施方案的实施方案的第一方面的第二十九实施方案中，结合特征是参照核酸分子的第三水平衍生物对靶分子的结合亲和力。
在也是第一方面的第二十八和第二十九实施方案的实施方案的第一方面的第三十实施方案中，结合亲和力表达为KD值。
在也是第一方面的第二十八、第二十九和第三十实施方案的实施方案的第一方面的第三十一实施方案中，预定阈值是Y，Y为(参照核酸分子的结合亲和力)/(第三水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
在也是第一方面的第二十八、第二十九、第三十和第三十一实施方案的实施方案的第一方面的第三十二实施方案中，预定阈值是X，X为(参照核酸分子的KD值)/(第三水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
在也是第一方面的第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一和第三十二实施方案的实施方案的第一方面的第三十三实施方案中，其结合特征超过预定阈值的第三水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
在也是第一方面的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二和第三十三实施方案的实施方案的第一方面的第三十四实施方案中，制备参照核酸分子的第四水平衍生物，其中第四水平衍生物与参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置和第四核苷酸位置，
其中第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第一核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第二核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第三核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第四核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
在也是第一方面的第三十四实施方案的实施方案的第一方面的第三十五实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物、第三第一水平衍生物和第四第一水平衍生物是4种第一水平衍生物的任意组合，其中4种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
在也是第一方面的第三十四和第三十五实施方案的实施方案的第一方面的第三十六实施方案中，其中第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物、第三第一水平衍生物和第四第一水平衍生物是4种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
在也是第一方面的第三十四、第三十五和第三十六实施方案的实施方案的第一方面的第三十七实施方案中，参照核酸分子的第四水平衍生物能够结合靶分子。
在也是第一方面的第三十五、第三十六和第三十七实施方案的实施方案的第一方面的第三十八实施方案中，方法包括：
-测定参照核酸分子的第四水平衍生物对靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的参照核酸分子的所述/那些第四水平衍生物。
在也是第一方面的第三十八实施方案的实施方案的第一方面的第三十九实施方案中，结合特征是参照核酸分子的第四水平衍生物对靶分子的结合亲和力。
在也是第一方面的第三十八和第三十九实施方案的实施方案的第一方面的第四十实施方案中，结合亲和力表达为KD值。
在也是第一方面的第三十八、第三十九和第四十实施方案的实施方案的第一方面的第四十一实施方案中，预定阈值是Y，Y为(参照核酸分子的结合亲和力)/(第四水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
在也是第一方面的第三十八、第三十九、第四十和第四十一实施方案的实施方案的第一方面的第四十二实施方案中，预定阈值是X，X为(参照核酸分子的KD值)/(第一水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
在也是第一方面的第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一和第四十二实施方案的实施方案的第一方面的第四十三实施方案中，其结合特征超过预定阈值的第四水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
在也是第一方面的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二和第四十三实施方案的实施方案的第一方面的第四十四实施方案中，制备参照核酸分子的第五水平衍生物，其中第五水平衍生物与参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置、第四核苷酸位置和第五核苷酸位置，
其中第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第一核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第二核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第三核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第四核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中第五核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第五第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第五核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
在也是第一方面的第四十四实施方案的实施方案的第一方面的第四十五实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物、第三第一水平衍生物、第四第一水平衍生物和第五第一水平衍生物是5种第一水平衍生物的任意组合，其中5种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
在也是第一方面的第四十四和第四十五实施方案的实施方案的第一方面的第四十六实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物、第三第一水平衍生物、第四第一水平衍生物和第五第一水平衍生物是5种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
在也是第一方面的第四十四、第四十五和第四十六实施方案的实施方案的第一方面的第四十七实施方案中，参照核酸分子的第五水平衍生物能够结合靶分子。
在也是第一方面的第四十五、第四十六和第四十七实施方案的实施方案的第一方面的第四十八实施方案中，方法包括：
-测定参照核酸分子的第五水平衍生物对靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的参照核酸分子的所述/那些第五水平衍生物。
在也是第一方面的第四十八实施方案的实施方案的第一方面的第四十九实施方案中，结合特征是参照核酸分子的第五水平衍生物对靶分子的结合亲和力。
在也是第一方面的第四十八和第四十九实施方案的实施方案的第一方面的第五十实施方案中，结合亲和力表达为KD值。
在也是第一方面的第四十八、第四十九和第五十实施方案的实施方案的第一方面的第五十一实施方案中，预定阈值是Y，Y为(参照核酸分子的结合亲和力)/(第五水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
在也是第一方面的第四十八、第四十九、第五十和第五十一实施方案的实施方案的第一方面的第五十二实施方案中，预定阈值是X，X为(参照核酸分子的KD值)/(第五水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
在也是第一方面的第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一和第五十二实施方案的实施方案的第一方面的第五十三实施方案中，其结合特征超过预定阈值的第五水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
在也是第一方面的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二和第五十三实施方案的实施方案的第一方面的第五十四实施方案中，制备参照核酸分子的第六水平衍生物，其中第六水平衍生物与参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置、第四核苷酸位置、第五核苷酸位置和第六核苷酸位置，
其中第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第一核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第二核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第三核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第四核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第五核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第五第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第五核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中第六核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第六第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第六核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
在也是第一方面的第五十四实施方案的实施方案的第一方面的第五十五实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物、第三第一水平衍生物、第四第一水平衍生物、第五第一水平衍生物和第六第一水平衍生物是6种第一水平衍生物的任意组合，其中6种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
在也是第一方面的第五十四和第五十五实施方案的实施方案的第一方面的第五十六实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物、第三第一水平衍生物、第四第一水平衍生物、第五第一水平衍生物和第六第一水平衍生物是6种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
在也是第一方面的第五十四、第五十五和第五十六实施方案的实施方案的第一方面的第五十七实施方案中，参照核酸分子的第六水平衍生物能够结合靶分子。
在也是第一方面的第五十五、第五十六和第五十七实施方案的实施方案的第一方面的第五十八实施方案中，方法包括：
-测定参照核酸分子的第六水平衍生物对靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的参照核酸分子的所述/那些第六水平衍生物。
在也是第一方面的第五十八实施方案的实施方案的第一方面的第五十九实施方案中，结合特征是参照核酸分子的第六水平衍生物对靶分子的结合亲和力。
在也是第一方面第五十八和第五十九实施方案的实施方案的第一方面的第六十实施方案中，结合亲和力表达为KD值。
在也是第一方面的第五十八、第五十九和第六十实施方案的实施方案的第一方面的第六十一实施方案中，预定阈值是Y，Y为(参照核酸分子的结合亲和力)/(第六水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
在也是第一方面的第五十八、第五十九、第六十和第六十一实施方案的实施方案的第一方面的第六十二实施方案中，预定阈值是X，X为(参照核酸分子的KD值)/(第六水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
在也是第一方面的第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一和第六十二实施方案的实施方案的第一方面的第六十三实施方案中，其结合特征超过预定阈值的第六水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
在也是第一方面的第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二和第六十三实施方案的实施方案的第一方面的第六十四实施方案中，制备参照核酸分子的第七水平衍生物，其中第七水平衍生物与参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置、第四核苷酸位置、第五核苷酸位置、第六核苷酸位置和第七核苷酸位置，
其中第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第一核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第二核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第三核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第四核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第五核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第五第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第五核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中第六核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第六第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第六核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中第七核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第七第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第七第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第六核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第七第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
在也是第一方面的第六十四实施方案的实施方案的第一方面的第六十五实施方案中，第一第一水平衍生物、第二第一水平衍生物、第三第一水平衍生物、第四第一水平衍生物、第五第一水平衍生物、第六第一水平衍生物和第七第一水平衍生物是7种第一水平衍生物的任意组合，其中7种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
在也是第一方面的第六十四和第六十五实施方案的实施方案的第一方面的第六十六实施方案中，所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物、所述第四第一水平衍生物、所述第五第一水平衍生物、所述第六第一水平衍生物和所述第七第一水平衍生物是7种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
在也是第一方面的第六十四、第六十五和第六十六实施方案的实施方案的第一方面的第六十七实施方案中，参照核酸分子的第七水平衍生物能够结合所述靶分子。
在也是第一方面的第六十五、第六十六和第六十七实施方案的实施方案的第一方面的第六十八实施方案中，方法包括：
-测定参照核酸分子的第七水平衍生物对所述靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第七水平衍生物。
在也是第一方面的第六十八实施方案的实施方案的第一方面的第六十九实施方案中，结合特征是参照核酸分子的第七水平衍生物对靶分子的结合亲和力。
在也是第一方面的第六十八和第六十九实施方案的实施方案的第一方面的第七十实施方案中，结合亲和力表达为KD值。
在也是第一方面的第六十八、第六十九和第七十实施方案的实施方案的第一方面的第七十一实施方案中，预定阈值是Y，Y为(参照核酸分子的结合亲和力)/(第七水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
在也是第一方面的第六十八、第六十九、第七十和第七十一实施方案的实施方案的第一方面的第七十二实施方案中，预定阈值是X，X为(参照核酸分子的KD值)/(第七水平衍生物的KD值)的商并且其中X>1，更优选X≥2以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
在也是第一方面的第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一和第七十二实施方案的实施方案的第一方面的第七十三实施方案中，其结合特征超过预定阈值的第七水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
在也是第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二和第七十三实施方案的实施方案的第一方面的第七十四实施方案中，能够结合靶分子的核酸是L-核酸，参照核酸分子是L-核酸并且参照核酸分子的衍生物的每一种和任一种是L-核酸。
本发明的背后的问题在第二方面中利用可通过根据第一方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、第二十五、第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、第三十、第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、第三十五、第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、第四十、第四十一、第四十二、第四十三、第四十四、第四十五、第四十六、第四十七、第四十八、第四十九、第五十、第五十一、第五十二、第五十三、第五十四、第五十五、第五十六、第五十七、第五十八、第五十九、第六十、第六十一、第六十二、第六十三、第六十四、第六十五、第六十六、第六十七、第六十八、第六十九、第七十、第七十一、第七十二、第七十三和第七十四实施方案之任一的方法获得的能够结合靶分子的核酸分子来解决，所述第二方面也是第二方面的第一实施方案。
在也是第二方面的第一实施方案的实施方案的第二方面的第二实施方案中，核酸分子包含至少一个修饰。
在也是第二方面的第一和第二实施方案的实施方案的第二方面的第三实施方案中，核酸分子用于用于治疗和/或预防疾病的方法。
在也是第二方面的第一和第二实施方案的实施方案的第二方面的第四实施方案中，核酸分子用于用于诊断疾病的方法。
在也是第二方面的第三和第四实施方案的实施方案的第二方面的第五实施方案中，疾病是牵涉所述靶分子的疾病。
本发明背后的问题在也是第三方面的第一实施方案的第三方面中，通过使用根据第二方面的第一和第二实施方案之任一的核酸分子(用于制造用于治疗疾病的药剂)来解决。
本发明背后的问题在也是第四方面的第一实施方案的第四方面中，通过使用根据第二方面的第一和第二实施方案之任一的核酸分子(用于制造用于治疗疾病的诊断剂)来解决。
在也是第四方面的第二实施方案和第三方面的第一实施方案的实施方案，以及第四方面的第一实施方案的实施方案的第三方面的第二实施方案中，疾病是牵涉靶分子的疾病。
本发明背后的问题在也是第五方面的第一实施方案的第五方面中，利用包含根据第二方面的第一和第二实施方案的任一项所述的核酸分子和药学上可接受的载体的药物组合物来解决。
本发明背后的问题在也是第六方面的第一实施方案的第六方面中，利用能够结合靶分子的核酸分子来解决，
其中核酸分子具有对于靶分子的结合亲和力，
其中核酸分子对靶分子的结合亲和力相较于参照核酸分子对于靶分子结合亲和力增加或与其相同，
其中
a)核酸分子包含核苷酸的序列并且参照核酸分子包含核苷酸的序列，或
b)核酸分子包含核苷酸的序列和至少一个修饰基团，并且参照核酸分子包含核苷酸的序列和至少一个修饰基团，
其中核酸分子的核苷酸的序列与参照核酸分子的核苷酸的序列在核苷酸的核碱基部分方面至少部分相同但在核苷酸的糖部分方面不同，
其中核酸分子的核苷酸的序列由核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸组成，并且其中参照核酸分子的核苷酸的序列由核糖核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸组成。
在也是第六方面的第一实施方案的实施方案的第六方面的第二实施方案中，
a)核酸分子由核苷酸的序列组成并且参照核酸分子由核苷酸的序列组成，或
b)核酸分子由核苷酸的序列和至少一个修饰基团组成并且参照核酸分子由核苷酸的序列和至少一个修饰基团组成，
其中核酸分子的核苷酸的序列与参照核酸分子的核苷酸的序列在核苷酸的核碱基部分方面相同但在核苷酸的糖部分方面不同。
在也是第六方面的第二实施方案的实施方案的第六方面的第三实施方案中，核酸分子对靶分子的结合亲和力相较于参照核酸分子对靶分子的结合亲和力增加。
在也是第二方面的第六实施方案和第二方面的第一、第二、第三、第四和第五实施方案的实施方案，以及第六方面的第一、第二和第三实施方案的实施方案的第六方面的第四实施方案中，核糖核苷酸是L-核糖核苷酸并且其中2’-脱氧核糖核苷酸是L-2’-脱氧核糖核苷酸。
在也是第二方面的第七实施方案和第二方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案，以及第六方面的第一、第二、第三和第四实施方案的实施方案的第六方面的第五实施方案中，核酸分子是L-核酸分子，其中L-核酸分子由L-核苷酸组成，并且参照核酸分子是L-参照核酸分子，其中L-参照核酸分子由L-核苷酸组成。
在也是第二方面的第八实施方案和第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七实施方案的实施方案，以及第六方面的第一、第二、第三、第四和第五实施方案的实施方案的第六方面的第六实施方案中，核酸分子和/或参照核酸分子是由靶分子介导的活性的拮抗剂。
在也是第二方面的第九实施方案和第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案，以及第六方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案的第六方面的第七实施方案中，包含核苷酸的序列和至少一个修饰基团的核酸分子从生物体的排泄速率相较于由核苷酸的序列组成的核酸分子减小。
在也是第二方面的第十实施方案和第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七和第八实施方案的实施方案，以及第六方面的第一、第二、第三、第四、第五和第六实施方案的实施方案的第六方面的第八实施方案中，包含核苷酸的序列和至少一个修饰的核酸分子相较于由核苷酸的序列组成的核酸分子在生物体中具有增加的驻留时间。
在也是第二方面的第十一实施方案和第二方面的第九和第十实施方案的实施方案，以及第六方面的第七和第八实施方案的实施方案的第六方面的第九实施方案中，修饰基团选自包含生物可降解的和非生物可降解的修饰的基团，优选所述修饰基团选自聚乙二醇、线性聚乙二醇、分枝聚乙二醇、羟乙基淀粉、肽、蛋白质、多糖、固醇、聚环氧丙烷醚、聚乙二酰胺(polyoxyamidate)和聚(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺的基团。
在也是第二方面的第十二实施方案和第二方面的第十一实施方案的实施方案，以及第六方面的第九实施方案的实施方案的第六方面的第十实施方案中，修饰基团是聚乙二醇，优选由线性聚乙二醇或分枝聚乙醇组成，其中聚乙二醇的分子量优选为约20,000至约120,000Da，更优选约30,000至约80,000Da以及最优选约40,000Da。
在也是第二方面的第十三实施方案和第二方面的第十一实施方案的实施方案，以及第六方面的第九实施方案的实施方案的第六方面的第十一实施方案中，修饰基团是羟乙基淀粉，其中优选地羟乙基淀粉的分子量为约50至约1000kDa，更优选约100至约700kDa以及最优选约200至500kDa。
在也是第二方面的第十四实施方案和第二方面的第九、第十、第十一、第十二和第十三实施方案的实施方案，以及第六方面的第七、第八、第九、第十、第十一和第十二实施方案的实施方案的第六方面的第十二实施方案中，生物体是动物或人体，优选人体。
在也是第二方面的第十五实施方案和第六方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一和第十二实施方案的实施方案，以及第六方面的第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三和第十四实施方案的实施方案的第六方面的第十三实施方案中，核酸分子用于用于治疗和/或预防疾病的方法。
在也是第二方面的第十六实施方案和第二方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四和第十五实施方案以及第六方面的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二和第十三实施方案的实施方案的第六方面的第十四实施方案中，核酸分子和参照核酸分子抗核酸酶活性。
本领域技术人员应题解，还可结合本文中描述的特征和实施方案，特别地结合根据本说明书所附的权利要求的方面和实施方案来实现下列实施方案和特征。
本发明人也已发现通过进行始于能够结合靶分子的参照核酸分子的推理研究法，还可产生结合靶分子的核酸分子，其中优选地能够结合靶分子的所述核酸分子结合参照核酸分子的靶分子。这样的推理研究法包括包括下列步骤的方法：
a)提供参照核酸分子，其中参照核酸分子能够结合靶分子并且其中参照核酸分子包含核苷酸的序列，其中核苷酸的序列包含n个核苷酸；
b)制备参照核酸分子的第一水平衍生物，其中参照核酸分子的第一水平衍生物与参照核酸分子相异在于一个核苷酸位置，其中如果参照核酸在核苷酸位置上具有核糖核苷酸，则第一水平衍生物通过利用脱氧核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且其中如果参照核酸在核苷酸位置上具有脱氧核糖核苷酸，则第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代一个核苷酸位置上的脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且其中在其上进行替代的核苷酸位置是修饰核苷酸位置；和
c)对于参照核酸分子的每一个核苷酸位置重复步骤b)，从而制备一组参照核酸分子的第一水平衍生物，其中参照核酸分子的第一水平衍生物的组由n种第一水平衍生物组成，其中参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种与参照核酸分子相异在于单个核苷酸置换，并且其中参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种具有单个修饰核苷酸位置，所述单个修饰核苷酸位置与参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其它第一水平衍生物的所有单个修饰核苷酸位置的单个修饰核苷酸不同。
在实施方案中，第一水平衍生物包含核苷酸的序列，其中核苷酸的序列包含n个核苷酸。
在本发明内的是：如果没有相反的说明，则术语第一水平衍生物和参照核酸分子的第一水平衍生物以同义的方式使用。
也在本发明内的是：如果没有相反的说明，术语第一水平衍生物的组和参照核酸分子的第一水平衍生物的组以同义的方式使用。
本领域技术人员将理解，每一种第一水平衍生物相对于参照核酸分子仅具有一个核苷酸交换。还应理解，在实施方案中，重复步骤b)(n-1)次，以便参照核酸分子的n个核苷酸位置的每一个和任一个位置经历核苷酸置换。在参照核酸分子的第一水平衍生物的这样的组中，第一水平衍生物的组在其整体性上代表可始于参照核酸分子进行制备的所有衍生物，其中每一种衍生物与参照核酸分子相异于单个核苷酸位置。
然而，还在本发明内的是：重复步骤b)少于(n-1)次。还在本发明内的是根本不重复步骤b)，以便仅在一个核苷酸位置上利用脱氧核糖核苷酸替代核糖核苷酸以及，分别地，利用核糖核苷酸替代脱氧核糖核苷酸。如果单个核苷酸替代将导致作为第一水平衍生物的衍生物，如果衍生物相较于参照核酸分子具有改善的本文中定义的结合特征，则将优选进行该后一实施方案。
如果在重复步骤b)一次、二次、三次等但少于(n-1)次后，获得相较于参照核酸分子具有改善的本文中定义的结合特征的第一水平衍生物，则本发明的方法的实施方案将包括少于(n-1)个步骤b)的重复，但优选一个或超过一个重复。
在本发明的方法的其它实施方案中，方法包括测定参照核酸的n种第一水平衍生物的每一种的结合特征的步骤。优选，测定第一水平衍生物对靶分子的结合的结合特征。在本发明的方法的其它实施方案中，测定少于n种第一水平衍生物的结合特征，优选测定n种第一水平衍生物的至少一种但非全部n种第一水平衍生物的结合特征。同样地在此类实施方案中，测定第一水平衍生物对靶分子的结合的结合特征。
在本发明的方法的其它实施方案中，方法包括鉴定其结合特征超过或达到预定阈值的参照核酸分子的所述/那些第一水平衍生物的步骤。在其实施方案中，鉴定全部超过或达到预定阈值的第一水平衍生物，或仅鉴定一些超过或达到预定阈值的第一水平衍生物。
还在本发明内的是：阈值是参照核酸分子的结合亲和力。在该实施方案中，任何水平的参照核酸的衍生物对靶分子具有与参照核酸分子相同或相似的结合亲和力。该实施方案是本文中公开的任何水平衍生物的实施方案。
根据本发明的方法，待产生的核酸是参照核酸分子的第一水平衍生物，或能够结合所述参照核酸分子能够结合的靶分子并且达到阈值的参照核酸的任何水平的衍生物。
在本发明内的是：参照核酸分子是RNA分子。在该实施方案中，参照核酸分子由核糖核苷酸组成。
在本发明内的是：参照核酸分子是DNA分子。在该实施方案中，参照核酸分子由脱氧核糖核苷酸组成。
还在本发明内的是：参照核酸分子由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成，其中在形成参照核酸序列的核苷酸的序列的每一个位置上，核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
本发明的其它方面是参照核酸分子的第二水平衍生物。参照核酸分子的这样的第二水平衍生物可通过本文中公开的本发明的方法获得或是可通过所述方法获得的，并且与本发明的方法相结合地描述于本文中。更具体地，第二水平衍生物与参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置和第二核苷酸位置，
其中第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第一核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中第二核苷酸位置的核苷酸与参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
本发明的其它方面涉及参照核酸分子的第三水平衍生物、参照核酸分子的第四水平衍生物、参照核酸分子的第五水平衍生物、参照核酸分子的第六水平衍生物和参照核酸分子的第七水平衍生物。参照核酸分子的这样的第三、第四、第五、第六和第七水平衍生物可通过本文中公开的本发明的方法获得或是可通过所述方法获得的，并且与本发明的方法相结合地描述于本文中。
应承认，与参照核酸分子的第二、第三、第四、第五、第六和第七水平衍生物(其全部为根据本发明的核酸分子)结合，置换的数目不限于与参照核酸分子的第二水平衍生物结合的2个核苷酸，不限于与参照核酸分子的第三水平衍生物结合的3个核苷酸，不限于与参照核酸分子结合的第四水平衍生物结合的4个核苷酸，不限于与参照核酸分子的第五水平衍生物结合的5个核苷酸，不限于与参照核酸分子的第六水平衍生物结合的6个核苷酸，以及不限于与参照核酸分子的第七水平衍生物结合的7个核苷酸；相反此类衍生物可在其它位置上包含其它置换。
最后，本发明包括、公开，从而包含了参照核酸分子的更高级水平的衍生物，所述衍生物因此为根据本发明的核酸分子。此类更高级水平的衍生物是例如第八水平衍生物、第九级衍生物等。鉴于参照核酸分子包含n个核苷酸，最高级水平的衍生物为参照核酸分子的第n水平衍生物。由于参照核酸分子包含n个核苷酸，因此按照本文中提供的规则和指导方针替代参照核酸分子的最多n个核苷酸。在参照核酸分子的这样的第n水平衍生物中，从而按照本发明替代每一个和任一个核苷酸。然而，还在本发明内的是：更高级水平的衍生物是第(n-x)级水平衍生物，x为1至n+2的任何整数。在这样的第(n-x)级水平的衍生物中，x为1至n+2的任何整数，按照本文中提供的技术教导相对于参照核酸分子替代这样的衍生物的(n-x)个核苷酸，x为1至n+2的任何整数。
本发明的方法的实施方案还可以是：当将参照核酸分子的各种第一水平衍生物的核苷酸置换组合进入更高级水平的衍生物时，各种单个的第一水平衍生物达到或超过预定阈值或所述预定阈值。然而，本发明的方法的实施方案还可以是：当将参照核酸分子的各种第一水平衍生物的核苷酸置换组合进入更高级水平的衍生物时，各种单个的第一水平衍生物都未达到或超过预定阈值或所述预定阈值。最后，本发明的方法的实施方案是，当将参照核酸分子的各种第一水平衍生物的核苷酸置换组合进入更高级水平的衍生物时，参照核酸分子的一些第一水平衍生物达到或超过预定阈值或所述预定阈值，然而，参照核酸分子的第一水平衍生物的其它衍生物未达到或未超过预定阈值或所述预定阈值。
本发明还基于令人惊讶的发现：相较于参照核酸分子的结合亲和力，可能增加核酸分子对靶的结合亲和力，其中核酸分子包含核苷酸的序列并且参照分子包含核苷酸的序列，其中核酸分子的核苷酸的序列与参照核酸分子的核苷酸的序列在核苷酸的核碱基部分方面至少部分相同，但在核苷酸的糖部分方面不同，其中核酸分子的核苷酸的序列由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成，并且其中参照核酸分子的核苷酸的序列由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成。
如优选地本文中使用的，参照核酸分子是这样的核酸分子，其用作对于核酸分子和本发明的核酸分子，具体地一方面对于用作参照核酸分子以及另一方面对于待用作(所述)参照核酸分子的核酸分子待评估或测定的某一特征的参照或基准(benchmark)。在实施方案中，特征是核酸分子，优选本发明的核酸分子对于本发明的核酸分子的靶分子和对于参照核酸分子的靶分子的结合亲和力，以及参照核酸分子对于所述靶分子的结合亲和力。在优选实施方案中，本发明的核酸分子的靶分子是参照核酸分子的靶分子，更优选本发明的核酸分子的靶分子是与参照核酸分子相同的靶分子。
如本文中优选地使用的，如果本发明的核酸分子的核苷酸的序列中包含的核苷酸的至少一个核碱基与参照核酸分子的核苷酸的序列中包含的核苷酸的至少一个核碱基相同，则本发明的核酸分子的核苷酸的序列与或对参照核酸分子的核苷酸的序列部分相同。在实施方案中，至少75%，优选85%，更优选90%，最优选超过95%、96%、97%、98%、99%或100%的本发明的核酸分子的核苷酸的核碱基与参照核酸分子的核苷酸的核碱基相同。在替代性实施方案中，至少75%，优选85%，更优选90%，最优选超过95%、96%、97%、98%、99%或100%的本发明的参照核酸分子的核苷酸的核碱基与本发明的核酸分子的核苷酸的核碱基相同。在本发明的核酸分子的其它实施方案中，所有核碱基与参照核酸分子的核碱基相同，除了如果2’-脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸替代外(并且脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5-磷酸、2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸、2’-脱氧胞苷-5’磷酸、胸苷-5’-磷酸，核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸、鸟苷-5’-磷酸胞苷-5’-5-甲基-尿苷-5’-磷酸磷酸或尿苷-5’-磷酸)，以及如果核糖核苷酸被脱氧核糖核苷酸替代外(并且核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸、鸟苷-5’-磷酸胞苷-5’磷酸、尿苷-5’-磷酸，脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5-磷酸、2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸、2’-脱氧胞苷-5’磷酸、2’-脱氧尿苷-5’-磷酸或胸苷-5-磷酸)。
根据本发明，基于或根据核苷酸的核碱基部分测定本发明的核酸分子的核苷酸的序列与或对参照核酸分子的核苷酸的序列的同一性或部分同一性。与其结合以及如本文中优选地使用的，核碱基或核碱基部分分别是核苷和核苷酸的含氮碱基。更优选，核碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶。因此，通过核苷酸的核碱基的化学测定本发明的核酸分子的核苷酸的序列与或对参照核酸分子的核苷酸的序列的同一性或部分同一性。因此，与本发明相组合，2’-脱氧腺苷-5’-(三)磷酸被认为与腺苷-5’-(三)磷酸同一，2’-脱氧鸟苷-5’-(三)磷酸被认为与鸟苷-5’-(三)磷酸同一，胸苷-5’-(三)磷酸被认为与5-甲基尿苷5’-(三)磷酸同一，2’-脱氧胞苷5’-(三)磷酸被认为与胞苷5’-(三)磷酸同一以及脱氧尿嘧啶5’-(三)磷酸被认为与尿苷5’-(三)磷酸同一。
在整个本专利申请中，将公知的首字母缩写用于描述核酸的组成，其中字母A、G、C、U和T分别表示包含核碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的核糖核苷酸或2‘-脱氧核糖核苷酸。当位于合成寡核苷酸的5’-末端时，核苷酸是核苷，即其不具有5’-磷酸基团。将由读者根据给定的实例的图、图例或文本文件来确定显示的序列是一级核糖核苷酸序列(RNA)还是2’-脱氧核糖核苷酸序列(也称为脱氧核糖核苷酸序列或DNA)。通常，存在一个或几个随后从核糖核苷酸交换成2’-脱氧核糖核苷酸或反之亦然的位置。一个或几个2’脱氧核糖核苷酸至一级核糖核苷酸序列中的掺入通过在表示核碱基的本体的大写字母(参见上文)之前使用小写字母“d”来表示。相反地，一个或几个2’脱氧核糖核苷酸至核糖核苷酸序列内的掺入通过在表示核碱基的本体的大字字母之前利用小写字母“d”来表示。对于本领域技术人员而言，已知核苷酸为核糖-5’-磷酸或2’-脱氧核糖-5’-磷酸，核碱基连接在1’-位。与核碱基的键合发生在嘌呤核碱基(A、G)的9-位上以及嘧啶核碱基(C、T、U)的1-位上。
在本发明内的是，根据本发明的核酸是核酸分子。在术语范围内，核酸和核酸分子在本文中以同义的方式使用，如果未指明相反的话。此外，此类核酸优选在本文中也称为根据本发明的核酸分子、根据本发明的核酸、本发明的核酸或本发明的核酸分子。
可单独地或以任意组合在其中使用核酸的本发明的任何方面实现本文中描述的根据本发明的核酸的特征。
如在本文中优选使用的，术语胰高血糖素是指任何胰高血糖素，包括但不限于哺乳动物胰高血糖素。优选哺乳动物胰高血糖素选自人、大鼠、小鼠、猴、猪、兔、仓鼠、狗、绵羊、鸡和牛胰高血糖素。
如本文中优选使用的，术语S1P是指任何S1P，包括但不限于，哺乳动物S1P。优选地，哺乳动物S1P选自人、大鼠、小鼠、猴、猪、兔、仓鼠、狗、绵羊、鸡和牛S1P。
如本文中优选使用的，术语CGRP是指任何CGRP，包括但不限于，哺乳动物CGRP。优选地，哺乳动物CGRP选自人、大鼠、小鼠、猴、猪、兔、仓鼠、狗、绵羊、鸡和牛CGRP。
如本文中优选使用的，术语C5a是指任何C5a，包括但不限于，哺乳动物C5a。优选地，哺乳动物C5a选自人、大鼠、小鼠、猴、猪、兔、仓鼠、狗、绵羊、鸡和牛C5a。
如本文中优选使用的，针对胰高血糖素的拮抗剂是优选在体外测定或体内模型(如例如实施例中描述的)中结合胰高血糖素-例如本文中公开的核酸分子-并且抑制胰高血糖素的功能的分子。
本文中优选使用的，针对S1P的拮抗剂是优选在体外测定或体内模型(如例如实施例中描述的)中结合S1P-例如本文中公开的核酸分子-并且抑制S1P的功能的分子。
本文中优选使用的，针对C5a的拮抗剂是在体外测定或体内模型(如例如实施例中描述的)中结合C5a-例如本文中公开的核酸分子-并且抑制C5a的功能的分子。
本文中优选使用的，针对CGRP的拮抗剂是在体外测定或体内模型(如例如实施例中描述的)中结合CGRP-例如本文中公开的核酸分子-并且抑制CGRP的功能的分子。
根据本发明的核酸分子以及参照核酸优选包括3个不同的核苷酸区段：第一末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段。如在核酸分子的领域中，以5’→3’-方向显示任何核苷酸序列，第一末端核苷酸区段排列在中央区段的5’末端，第二末端核苷酸区段排列在中央核苷酸区段的3’末端。由此，第一末端核苷酸区段在本文中也称为5’-末端核苷酸区段，第二末端核苷酸区段在本文中也称为3’-末端核苷酸区段，反之亦然。然而，也在本发明内的是第一末端核苷酸区段在本文中称为3’-末端核苷酸区段，第二末端核苷酸区段在本文中称为5’-末端核苷酸区段，反之亦然。这特别地应用于其中第一核苷酸区段与第二核苷酸区段彼此碱基互补的那些实施方案。
在本发明的核酸分子的实施方案中，第一核苷酸区段与第二核苷酸区段彼此碱基互补。如在本文中优选使用的，如果两个区段，至少在纸上或在芯片中，彼此杂交，由此在杂交后形成双链结构，则所述两个核苷酸区段彼此碱基互补。杂交按照已知的碱基配对法则例如，优选地沃尔森-克里克碱基配对法则发生或进行。然而，如本领域技术人员将承认的，可发生或可应用其它碱基配对法则例如胡斯坦碱基配对(Hoogsten base pairing)。本领域技术人员还将承认，同样地，与本发明的核酸分子相结合，此类杂交导致双链结构。此类双链结构可以是其中使核酸分子的单链的两个空间上分开的区段杂交的单个核酸分子的部分。或者，可通过两个或更多个单独的核酸分子的两条或更多条分开的链形成这样的双链结构。本领域技术人员还应承认，在两个区段的整个长度上不一定发生或进行任何杂交。
在其它实施方案中，如果两个区段原则上可在体外和/或体内条件下杂交，则所述两个核苷酸区段彼此碱基互补。本文中公开的关于第一核苷酸区段与第二核苷酸区段彼此碱基互补以及关于第一核苷酸区段与第二核苷酸区段在纸上或在芯片中的杂交的相同考虑同样地应用于该实施方案。然而，必须承认，在此类体外和/或体内条件下杂交可以发生或可以不发生。
还应承认，与本发明结合，两个区段彼此杂交的特征优选地表明这样的杂交假定因两个区段的碱基互补而发生，但在任何体外和/或体内条件下不一定必须发生。
核酸分子的3个核苷酸区-第一末端核苷酸区段、中央核苷酸区段和第二末端核苷酸区段-彼此以5’→3’-方向排列：第一末端核苷酸区段-中央核苷酸区段-第二末端核苷酸区段。然而，替代性地，第二末端核苷酸、中央核苷酸区段和末端第一核苷酸区段彼此以5’→3’-方向排列。
不同核酸分子例如一方面本发明的核酸分子与另一方面参照分子之间的确定区段的序列的差异影响对本发明的核酸分子能够结合的靶分子的结合亲和力。在优选实施方案中，基于本发明的核酸分子的结合分析，根据本发明的核酸的中央核苷酸区段和形成所述区段的核苷酸单独地，更优选以其整体是本发明的核酸分子对靶分子的结合所必需的。
如果未表明相反的话，术语“区段”和“核苷酸的区段”在本文中以同义的方式使用。
在优选实施方案中，根据本发明的核酸是单个核酸分子。在其它实施方案中，单个核酸分子以大量单个核酸分子的形式或以大量单个核酸分子种类的形式存在。
本领域技术人员应承认，本发明的核酸分子优选由彼此共价连接(优选通过磷酸二酯连接或键合)的核苷酸组成。
在优选实施方案中，如本文中所用，术语排列意指与本文中公开的核酸结合的本文中描述的结构或功能特征或元件的次序或顺序。
本发明的核酸分子还将包括与本发明的核酸分子，特别地本文中公开的特定序列基本上同源的核酸分子。术语基本上同源的应当理解为例如同源性为至少75%，优选85%，更优选90%，最优选超过95%、96%、97%、98%或99%。
存在于本发明的核酸分子中的同源核苷酸的实际百分比将取决于存在于核酸分子中的核苷酸的总数。百分比修饰可基于存在于核酸分子中的核苷酸的总数。
可测定两个核酸分子之间的同源性，这对于本领域技术人员来说是已知的。更具体地，可基于指定的程序参数，将序列比较算法用于计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同源性。测试序列优选地是被认为与不同的核酸分子同源或将被测试以确定其是否与不同的核酸分子同源以及如果同源，达到什么程度的序列或核酸分子，因此此类不同的核酸分子也称为同源参照序列。可以例如通过Smith&Waterman的局部同源性算法(Smith&Waterman,1981)，通过Needleman&Wunsch的同源性比对算法(Needleman&Wunsch,1970)，通过Pearson&Lipman的相似性搜索法(Pearson&Lipman,1988)，通过此类算法的计算机执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过目测观察来进行序列的最佳比对，以进行比较。
适合于测定百分比序列同一性的算法的一个实例是基本局部比对搜索工具(basic local alignment search tool)(在下文中称为"BLAST")中使用的算法，参见，例如，Altschul等人(Altschul等人1990和Altschul等人,1997)。用于进行BLAST分析的软件是可通过美国国家生物技术信息中心(在下文中称为"NCBI")公共地获得的。在使用可从NCBI获得的软件例如BLASTN(对于核苷酸序列)和BLASTP(对于氨基酸序列)测定序列同一性中使用的缺省参数描述于McGinnis等人(McGinnis等人,2004)中。
本发明的核酸分子还将包括相对于本发明的核酸分子，特别地相对于本文中公开的和由它们的核苷酸序列确定的本发明的特定核酸分子具有一定程度的同一性的核酸分子。更优选，本发明还包括相对于本发明的核酸分子，特别地相对于本文中公开的和由它们的核苷酸序列确定的本发明的特定核酸分子或其部分具有至少75%、优选85%、更优选90%，最优选超过95%、96%、97%、98%或99%的同一性的那些核酸分子。
术语发明的核酸或根据本发明的或本发明的核酸还将包括包含本文中公开的核酸序列或其部分(例如根据本发明的核酸的代谢产物或衍生物)，优选达到核酸或所述部分参与对胰高血糖素的结合或能够结合胰高血糖素的那些核酸分子。这样的核酸可来源于本文中公开的核酸(例如通过截断)。截断可与本文中公开的核酸的任一末端或两个末端相关。同样地，截断可与内部核苷酸序列相关，即其可分别与5’与3’末端核苷酸之间的核苷酸相关。此外，截断将包括小至单个核苷酸从本文中公开的核酸的序列的缺失。截断还可与超过一个本发明的核酸的区段相关，由此区段可小至一个核苷酸长。根据本发明的核酸的结合可由本领域技术人员使用常规实验或通过使用或采用本文中描述的方法，优选在本文中实施例部分描述的方法来测定。
还在本发明内的是本发明的核酸分子是更长的核酸分子的部分，其中该更长的核酸分子包含几个部分，其中至少一个这样的部分是本发明的核酸分子或其部分。这样的更长的核酸分子的其它部分可以是一个或几个D-核酸或L-核酸。可结合本发明使用任意组合。更长核酸的此类其它部分可显示与结合不同的功能。一个可能的功能是允许与其它分子的相互作用，其中此类其它分子例如用于固定、交联、检测或扩增。在本发明的其它实施方案中，根据本发明的核酸包含(作为单个部分或组合的部分)几个本发明的核酸。包含几个本发明的核酸的这样的核酸也包括在术语更长的核酸中。
如本文中所用，L-核酸分子是由L-核苷酸组成，优选完全由L-核苷酸组成的核酸分子，更优选L-核苷酸是L-核糖核苷酸或L-2’-脱氧核糖核苷酸。在优选实施方案中，L-核酸分子完全由L-核糖核苷酸或L-2’-脱氧核糖核苷酸组成。在另一个优选实施方案中，L-核酸分子由L-核糖核苷酸和L-2’-脱氧核糖核苷酸组成。
如本文中所用，D-核酸分子是由D-核苷酸组成，优选完全由D-核苷酸组成的核酸分子，更优选D-核苷酸是D-核糖核苷酸或D-2’-脱氧核糖核苷酸。在优选实施方案中，D-核酸分子完全由D-核糖核苷酸或D-2’-脱氧核糖核苷酸组成。在另一个优选实施方案中，D-核酸分子由D-核糖核苷酸和D-2’-脱氧核糖核苷酸组成。
如果未明确地表明相反的话，术语核酸和核酸分子在本文中以可互换的方式使用。
同样地，如果未表明相反的话，任何核苷酸序列在本文中以5’→3’方向显示。
如本文中优选使用的，核苷酸的任何位置是相对于序列、区段或亚区段(substretch)的5’末端测定或提及的。因此，第二核苷酸是分别从序列、区段和亚区段的5’末端计数的第二个核苷酸。同样地，根据其，倒数第二核苷酸是分别从序列、区段和亚区段的3’末端计数的第二个核苷酸。
将本发明的核酸分子设计为L-核酸分子出于几个原因是有利的。L-核酸是天然存在的D-核酸的对映体。然而，D-核酸在水溶液中，特别地在生物系统或生物样品中因核酸酶的广泛存在而极不稳定。天然存在的核酸酶，特别地来自动物细胞的核酸酶不能降解L-核酸。因此，L-核酸的生物半衰期在这样的系统，包括动物和人体中显著增加。由于缺乏L-核酸的降解性，因此未产生核酸酶降解产物，从而未观察到从其产生的副作用。该方面使L-核酸与用于治疗牵涉靶分子的存在的疾病和/或病症的实际上所有其它化合物相区别。通过与沃尔森-克里克碱基配对不同的机制特异性结合靶分子的L-核酸，或部分或完全由L-核苷酸组成的适体(特别地对于参与适体对靶分子的结合的适体的那些部分)也称为镜像异构适体。适体和镜像异构适体本身对于本领域技术人员来说是已知的，并且除其它以外描述于‘适体手册’(Klussmann编,2006)中。
还在本发明内的是本发明的核酸分子，无论其以D-核酸分子、L-核酸分子还是D,L-核酸分子的形式存在，可以以单链或双链核酸分子的形式存在。优选，本发明的核酸分子是单链核酸分子，其因一级序列而显示确定的二级结构，从而也可形成三级结构。然而，本发明的核酸分子在彼此互补或部分互补的两条链彼此杂交的意义上也可以是双链的。
本发明的核酸分子可被修饰或可包含至少一个修饰基团。此类修饰可与核酸的单个核苷酸相关并且在本领域是公知的。这样的修饰的实例，除其它以外，由Venkatesan等人(Venkatesan,Kim等人2003)和Kusser(Kusser2000)描述。这样的修饰可以是组成核酸的单个核苷酸的2’位上的H原子、F原子或O-CH3基团或NH2-基团。同样地，本发明的核酸还可包含至少一个LNA核苷酸。在实施方案中，根据本发明的核酸由LNA核苷酸组成。
在实施方案中，本发明的核酸分子可以是分成多部分的核酸。如本文中所用，分成多部分的核酸是由至少两个单独的核酸链组成的核酸。此类至少两个核酸链形成功能单位，其中所述功能单位是靶分子，优选所述靶分子的配体，或能够结合靶分子，优选所述靶分子。所述至少两个核酸链可通过切割核酸分子(以产生两条链)来从本发明的任何核酸分子产生或通过合成对应于本发明的核酸(即整体核酸)的第一部分的一个核酸和对应于整体核酸的第二部分的另一个核酸来产生。应承认，切割和合成可用于产生其中存在超过两条上文中示例的链的分成多部分的核酸。换句话说，至少两条单独的核酸链通常与彼此互补和杂交的两条链不同，尽管在所述至少两条单独的核酸链之间可存在一定程度的互补性，其中这样的互补性可导致所述单独的链杂交。
最后，还在本发明内的是实现本发明的核酸的完全闭合即环状结构，即优选通过共价键合在实施方案中使根据本发明的核酸分子闭合，其中更优选在本发明的核酸分子的核酸序列的5’末端与3’末端之间进行这样的共价键合。
测定本发明的核酸分子的结合常数的可能是性是使用实施例中描述的方法，所述方法确认上述发现：本发明的核酸分子显示有利的KD值范围。为了表达单个核酸分子与靶分子之间的结合强度的适当测量是所谓的KD值，其与用于其测定的方法对于本领域技术人员来说都是已知的。
优选地，由本发明的核酸分子显示的KD值低于1μM。约1μM的KD值被认为是核酸分子对靶分子的非特异性结合的特征。如本领域技术人员将承认的，一组化合物例如本发明的核酸分子的KD值在一定的范围内。上文提及的约1μM的KD值是KD值的优选上限。靶结合核酸分子的KD的下限可以小至约10皮摩尔或可更高。在本发明内的是单个核酸分子结合靶分子的KD值优选在该范围内。优选范围可通过选择该范围内的任何第一数值和该范围内的任何第二数值来界定。优选上限KD值是250nM和100nM，优选下限KD值是50nM、10nM、1nM、100pM和10pM。更优选上限KD值是10nM，更优选下限KD值是100pM。
除了本发明的核酸分子的结合性质外，本发明的核酸分子抑制各自靶分子的功能。靶分子的功能的抑制-例如先前描述的靶分子的各自受体的刺激-可通过本发明的核酸分子对靶分子的结合，从而形成本发明的核酸分子与靶分子的复合物来实现。核酸分子与靶分子的这样的复合物不能刺激通常被靶分子刺激的受体。因此，本发明的核酸分子对受体功能的抑制不依赖于可被靶分子刺激的各自受体，但因根据本发明的核酸分子阻止靶分子对受体的刺激而引起。
测定本发明的核酸分子的抑制常数的可能性是使用实施例中描述的方法，所述方法确认上述发现：本发明的核酸分子显示有利的抑制常数，所述抑制常数允许此类核酸分子用于治疗性治疗方案。为了表达单个核酸分子对与靶分子、靶分子与各自受体的相互作用的抑制作用的强度的适当测量是所谓的半最大抑制浓度(缩写为IC50)，其与用于测量其的方法对于本领域技术人员来说都是已知的。
优选地，由本发明的核酸分子显示的IC50值低于1μM。约1μM的IC50值被认为是核酸分子对靶功能的非特异性抑制的特征。如本领域技术人员将承认的，一组化合物例如本发明的核酸分子的IC50值在一定的范围内。上文提及的约1μM的IC50是IC50值的优选上限。靶结合核酸分子例如本发明的核酸分子的IC50的下限可小至约10皮摩尔或可以更高。在本发明内的是本发明的核酸分子的IC50值优选在该范围内。优选范围可通过选择该范围内的任何第一数值和该范围内的任何第二数值来确定。优选上限IC50值是250nM和100nM，优选下限IC50值是50nM、10nM、1nM、100pM和10pM。更优选上限IC50值是5nM，更优选下限IC50值是1nM。
本发明的核酸分子可具有任何长度，只要它们仍然能够结合或抑制靶分子的功能。在本领域应承认，存在本发明的核酸分子的优选长度。通常，长度为15至120个核苷酸。本领域技术人员将承认，15与120之间的任何整数是本发明的核酸分子的可能长度。根据本发明的核酸的长度的更优选范围是约20至100个核苷酸、约20至80个核苷酸、约20至60个核苷酸、约20至54个核苷酸和约39至44个核苷酸的长度。
在本发明内的是本文中公开的核酸包含修饰基团，所述修饰基团优选是高分子量部分和/或优选允许，除其它以外，在动物体(优选人体)内的驻留时间方面改变核酸的特征。这样的改变的特别优选实施方案是根据本发明的核酸的PEG化和HES化。如本文中所用，PEG代表聚(乙二醇)，HES代表羟乙基淀粉。如本文中优选地使用的PEG化是根据本发明的核酸的修饰，其中这样的修饰由连接至根据本发明的核酸的PEG部分组成。如本文中优选地使用的HES化是根据本发明的核酸的修饰，其中这样的修饰由连接至根据本发明的核酸的HES部分组成。此类修饰以及使用此类修饰改变核酸的方法描述于欧洲专利申请EP 1306 382，将其公开内容通过引用整体并入本文。
在PEG是这样的高分子量部分的情况下，分子量优选为约20,000至约120,000Da，更优选约30,000至约80,000Da，最优选约40,000Da。在HES是这样的高分子量部分的情况下，分子量优选为约50至约1000kDa，更优选约100至约700kDa，最优选约200至500kDa。HES显示0.1至1.5，更优选1至1.5的摩尔置换，以及显示表达为约0.1至15，优选约3至10的C2/C6比的置换样品。HES修饰的方法例如描述于德国专利申请DE12004006249.8中，将其公开内容通过引用整体并入本文。
原则上可在其任何位置上对本发明的核酸分子进行修饰。优选，对核酸分子的5’-末端核苷酸、3’-末端核苷酸和/或5’核苷酸与3’核苷酸之间的任何核苷酸进行这样的修饰。
可将修饰和优选地PEG和/或HES部分直接或优选地通过接头间接地连接至本发明的核酸分子。还在本发明内的是根据本发明的核酸分子包含一个或多个修饰，优选一个或多个PEG和/或HES部分。在实施方案中，单个接头分子将超过一个PEG部分或HES部分连接至根据本发明的核酸分子。与本发明结合使用的接头自身可以是线性的或分枝的。该类型的接头对于本领域技术人员来说是已知的并且进一步描述于专利申请WO2005/074993和WO2003/035665中。
在优选实施方案中，接头是生物可降解的接头。生物可降解的接头因从根据本发明的核酸释放修饰而允许在，除其它以外，动物体(优选人体)内的驻留时间方面改变根据本发明的核酸的特征。生物可降解的接头的使用可允许更好地控制根据本发明的核酸的驻留时间。这样的生物可降解的接头的优选实施方案是如但不限于国际专利申请WO2006/052790、WO2008/034122、WO2004/092191和WO2005/099768中描述的生物可降解的接头。
在本发明内的是修饰或修饰基团是生物可降解的修饰，其中生物可降解的修饰可直接或优选通过接头间接地连接至本发明的核酸分子。生物可降解的修饰因从根据本发明的核酸释放或降解修饰而允许在，除其它以外，动物体(优选人体)内的驻留时间方面改变根据本发明的核酸的特征。生物可降解的修饰的使用可允许更好地控制根据本发明的核酸的驻留时间。这样的生物可降解的修饰的优选实施方案是如但不限于国际专利申请WO2002/065963、WO2003/070823、WO2004/113394和WO2000/41647中，优选WO2000/41647，第18页，第4至24行中描述的生物可降解的修饰。
除了上述修饰外，还可使用其它修饰来改变根据本发明的核酸的特征，其中此类其它修饰可选自蛋白质、脂质例如胆固醇和糖链例如淀粉酶、葡聚糖等。
不希望受任何理论束缚，似乎通过利用高分子量部分例如聚合物，更具体地一种或几种本文中公开的聚合物修饰根据本发明的核酸，可改变排泄动力学，所述聚合物优选是生理可接受的。更具体地，似乎归因于此类修饰的发明的核酸的增加的分子量和归因于未经历代谢(特别地当以L形式存在时)的本发明的核酸，从动物体，优选从哺乳动物体，更优选从人体的排泄减少。由于排泄通常通过肾进行，因此本发明人假定所修饰的核酸的肾小球滤过率相较于不具有该类型的高分子量修饰的核酸显著减小，这导致动物体内的驻留时间的增加。与其相结合地，特别值得注意的是，尽管存在这样的高分子量修饰，但不会以有害的方式影响根据本发明的核酸的特异性。在这个范围内，根据本发明的核酸，除其它以外，具有令人惊讶的特征-所述特征通常不能期望从药物活性化合物产生-以便不必需要提供持续释放的药物制剂来提供根据本发明的核酸的持续释放。相反地，以它们的修饰形式存在的包含高分子量部分的根据本发明的核酸，由于它们的修饰，当它们作用时可以本身已用作持续释放制剂，就好象它们从持续释放制剂释放一样。在这个范围内，如本文中公开的根据本发明的核酸分子的修饰和所修饰的根据本发明的核酸分子以及包含所述核酸分子的任何组合物可提供不同的，优选地受控的药代动力学及其生物分布。这还包括循环中的驻留时间和至组织的分布。此类修饰进一步描述于专利申请WO2003/035665中。
然而，还在本发明内的是根据本发明的核酸不包含任何修饰，特别地无高分子量修饰例如PEG化或HES化。当根据本发明的核酸显示至身体中的任何靶器官或组织的优先分布时或当期望在施用后根据本发明的核酸从身体快速清除时，此类实施方案是特别优选的。本文中公开的具有至身体中任何靶器官或组织的优先分布的根据本发明的核酸可允许在靶组织中建立有效的局部浓度，同时使核酸的全身性浓度保持较低。这允许使用低剂量，这不仅从经济的观点来看是有益的而且还减少其它组织对核酸试剂的不必要暴露，从而减少副作用的潜在风险。施用后根据本发明的核酸从身体快速清除可能，除其它以外，在使用根据本发明的核酸或包含所述核酸的药剂进行的体内成像或特定治疗性给药需要的情况下是期望的。
本发明的其它方面涉及本发明的核酸分子和/或本发明的拮抗剂用于产生或制造药剂或诊断剂的用途。本发明的其它方面涉及本发明的核酸分子和/或本发明的拮抗剂在治疗或预防疾病中的用途。
本发明的其它方面涉及本发明的药物组合物，所述药物组合物包含至少本发明的核酸分子(任选地与其它药物活性化合物一起)，其中本发明的核酸分子优选本身用作药物活性剂。此类药物组合物在优选实施方案中包含至少药学上可接受的载体。此类载体可以是例如水、缓冲液、PBS、葡萄糖溶液，优选5%的葡萄糖、盐平衡的溶液、柠檬酸盐、淀粉、糖、明胶或任何其它可接受的载体物质。此类载体对于本领域技术人员来说是公知的。本领域技术人员将承认，本发明的药物组合物的或与所述组合物相关的任何实施方案、用途和方面也适用于本发明的药剂，反之亦然。
本领域技术人员将承认，本发明的核酸分子、包含所述核酸分子的药剂和/或药物组合物可特别地用于治疗和/或预防和/或诊断其中牵涉本发明的核酸分子能够结合的靶分子的任何疾病。更具体地，这样的疾病是其中本发明的核酸分子对靶分子的结合，或其中拮抗靶分子的作用(优选通过本发明的核酸分子)原则上适合于治疗疾病，预防疾病或减轻疾病的症状的任何疾病。
在本发明的药剂的一个实施方案中，将这样的药剂与其它治疗组合，用于本文中公开的任何疾病，特别地将对其使用本发明的药剂的那些疾病。
在本发明的药物组合物的一个实施方案中，将这样的药物组合物与其它治疗组合用于本文中公开的任何疾病，特别地将对其使用本发明的药剂的那些疾病。
“联合治疗”(或“协同治疗”)包括施用本发明的药剂和至少第二或其它试剂(作为特定治疗方案的部分)，所述治疗方案意欲通过此类治疗剂(即本发明的药剂和所述第二或其它试剂)的协同作用提供有益效应。组合的有益作用包括但不限于由治疗剂的组合产生的药代动力学或药效学协同作用。通常在确定的时间段(通常数分钟、数小时、数天或数周，取决于选择的组合)中进行此类治疗剂的组合施用。
“联合治疗”可以有意地包括，但通常无意包括施用两种或更多种此类治疗剂(作为单独的单一疗法方案的部分)。“联合治疗”意欲包括以相继方式施用此类治疗剂，即，其中在不同时间施用每一种治疗剂，以及以大体上同时的方式施用此类治疗剂或至少两种所述治疗剂。大体上同时的施用可以例如通过给受试者施用单个胶囊(所述胶囊具有固定比例的每一种治疗剂)或多个胶囊(每一种治疗剂一个胶囊)来实现。
每一种治疗剂的相继或大体上同时的施用可通过任何适当的途径来实现，包括但不限于局部途径、口服途径、静脉内途径、肌内途径以及通过粘膜组织的直接吸收。可通过相同途径或通过不同途径来施用治疗剂。例如，可通过注射施用选择的组合的第一治疗剂，然而可局部施用组合的另一种治疗剂。
或者，例如，可局部施用所有治疗剂，或可通过注射施用所有治疗剂。除非另外指出，否则其中施用的治疗剂的顺序不是至关重要的。“联合治疗”还可包括进一步与其它生物活性成分组合来施用上述治疗剂。当联合治疗还包括非药物治疗时，非药物治疗可在任何适当的时间进行，只要可实现来自治疗剂与非药物治疗的组合的协同作用的有益效应。例如，在适当的情况下，当从治疗剂的施用暂时除去非药物治疗(可能数天或甚至数周日)时，仍然获得有益效应。
如上述一般术语中所概括的，原则上可以以本领域技术人员已知的任何形式施用根据本发明的药剂。优选施用途径是全身性施用，更优选通过胃肠外施用(优选通过注射)。或者，可局部施用药剂。施用的其它途径包括肌内、腹膜内和皮下、per orum、鼻内、气管内或经肺，优先提供具有最小侵入同时确保效能的施用途径。
胃肠外施用通常用于皮下、肌内或静脉内注射和输注。此外，用于胃肠外施用的一个方法使用缓释或持续释放系统的植入，所述系统确保维持恒定水平的剂量，这对于本领域技术人员来说是公知的。
此外，可使用本领域技术人员公知的经皮肤贴剂的那些形式，通过适当的鼻内媒介物、吸入剂的局部施用或通过经皮途径施用本发明的优选药剂。为了以经皮肤递送系统的形式进行施用，剂量施用在整个给药方案中当然是连续的而非间断性的。其它优选局部制剂包括乳膏剂、软膏、洗剂、气雾喷雾器和凝胶。
对本发明的方法作出有利地反应的受试者包括医学和兽医学受试者，通常包括人类和人患者。除其它以外，本发明的方法和装置对其有用的受试者是猫、狗、大型动物、禽类例如鸡等。
本发明的药剂通常包括有效量的治疗活性剂，包括但不限于溶解或分散在药学上可接受的介质中的本发明的核酸分子。药学上可接受的介质或载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。此类媒介物和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是公知的。还可将补充活性成分掺入本发明的药剂中。
在其它方面，本发明涉及药物组合物。此类药物组合物包含至少一种根据本发明的核酸和优选药学上可接受的粘合剂。这样的粘合剂可以是本领域使用和/或已知的任何粘合剂。更具体地，这样的粘合剂是结合本文中公开的药剂的制造论述的任何粘合剂。在其它实施方案中，药物组合物包含其它药学物活性剂。
根据本公开内容，药剂和药物组合物的制备对于本领域技术人员来说是已知的。通常，可将此类组合物制备为可注射的液体或悬浮剂；适用于在注射之前在液体中配制成溶液或悬浮剂的固体形式；配制为用于口服施用的片剂或其它固体；配制为定时释放胶囊；或以目前使用的任何其它形式进行配制，包括滴眼剂、乳膏剂、洗剂、软膏、吸入剂等。被外科医生、医生或医护人员用于处理手术区的特定区域的无菌制剂例如基于盐水的洗液的使用也可以是特别有用的。还可通过微装置、微粒或海绵来递送组合物。
在配制后，以与给药制剂相容的方式以及以这样的量如药理学上有效的量施用药剂。制剂可以以多种剂型例如上述可注射溶液的类型来容易地进行施用，但也可使用药物释放胶囊等。
本发明的药剂可还可以以口服剂型如定时释放和持续释放片剂或胶囊、丸剂、粉剂、粒剂、酏剂、酊剂、悬浮剂、糖浆剂和乳剂施用。有利地从脂肪乳剂或悬浮剂制备栓剂。
可对药物组合物或药剂进行灭菌和/或其可包含佐剂例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶液促进剂(solution promoter)、用于调节渗透压和/或缓冲液的盐。此外，它们还可包含其它具有治疗价值的物质。可按照常规混合、粒化或涂覆方法制备组合物，所述组合物通常包含约0.1%至75%，优选约1%至50%的活性成分。
可以例如通过溶解、分散等制备液体，特别地可注射组合物。将活性化合物溶解在药用纯溶剂例如水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等中或与所述溶剂混合，从而形成可注射溶液或悬浮剂。此外，可配制适用于在注射之前溶解在溶液中的固体形式。
本发明药剂和核酸分子分别地还可以以脂质体递送系统的形式(例如小单室囊泡(small unilamellar vesicle)、大单室囊泡(large unilamellar vesicle)和多室囊泡(multilamellar vesicle))进行施用。可从多种包含胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱的磷脂形成脂质体。在一些实施方案中，利用药物的水溶液水化脂质组分的薄膜以形成封装药物的脂质层，这对于本领域技术人员来说是公知的。例如，可以以与亲脂化合物或使用本领域已知的方法构建的非免疫原性、高分子量化合物的复合物的形式提供本文中描述的核酸分子。此外，脂质体可在它们的表面上具有此类核酸分子，以用于内部靶向和运载细胞毒性剂来介导细胞杀伤。在美国专利No.6,011,020中提供了核酸缔合的复合物的实例。
还可用可溶性聚合物例如可靶向药物载体分别偶联本发明的药剂和核酸分子。此类聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或聚氧化乙烯聚赖氨酸(利用棕榈酰残基取代的)。此外，可将本发明的药剂和核酸分子分别偶联至一类用于实现药物的受控释放的生物可降解的聚合物，例如聚乳酸、聚ε-己内酯(polyepsilon capro lactone)、聚羟基丁酸、多正酯、聚缩醛、聚二羟基吡喃(polydihydropyran)、聚腈基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
需要时，待施用的药物组合物和药剂还可分别包含少量非毒性辅助物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂以及其它物质例如乙酸钠和三乙醇胺油酸酯。
根据多个因素选择分别利用本发明的核酸分子和药剂的给药方案，所述因素包括患者的类型、物种、年龄、重量、性别和医学状况；待治疗的病况的严重度；施用途径；患者的肾和肝功能；和使用的具体适体或其盐。普通熟练医生或兽医可容易地确定和指定预防、抵消或阻止病况的进展所需的药物的有效量。
在本文中公开的任何疾病的治疗中，根据本发明的核酸的有效血浆水平的范围优选为500fM至200μM，优选为1nM至20μM，更优选5nM至20μM，最优选50nM至20μM。
优选可以以单次日剂量，每两天天1次或每三天1次、每周1次、每两周1次、以单次月剂量或每三个月1次分别施用本发明的核酸分子和药剂。
在本发明内的是本文中描述的药剂组成了本文中公开的药物组合物。
在其它方面，本发明涉及用于治疗需要此类治疗的受试者的方法，其中所述方法包括施用药物活性量的至少一种根据本发明的核酸。在实施方案中，受试者患有疾病或处于发生此类疾病的风险中，其中所述疾病是本文中公开的疾病的任一种，特别地与根据本发明的核酸的任一种用于制造药剂的用途相关的公开的那些疾病的任一种。
应理解，根据本发明的核酸以及拮抗剂可以不仅用作药剂或用于制造药剂，而且还可用于化妆品目的。
如本文中优选地使用的，诊断法或诊断剂或诊断工具适合直接或间接检测靶-所述靶在本案例中是胰高血糖素或S1P中。诊断法适用于检测和/或随访与靶相关的任何病症和疾病-所述靶在本案例中分别是本文中描述的胰高血糖素或S1P。这样的检测可能通过根据本发明的核酸对靶的结合来进行。可直接或间接检测这样的结合。各自的方法和工具对于本领域技术人员来说是已知的。除其它以外，根据本发明的核酸可包含允许检测根据本发明的核酸，优选与靶结合的核酸的标记。这样的标记优选选自放射性标记、酶促标记和荧光标记。原则上，可对根据本发明的核酸采用针对抗体开发的所有已知的测定，其中用靶结合抗体取代靶结合核酸。在使用未标记的靶结合抗体的抗体测定中，优选利用放射性、酶促和荧光标记修饰的并且在其Fc-片段上结合靶结合抗体的二抗进行检测。在核酸，优选根据本发明的核酸的情况下，利用这样的标记修饰核酸，其中优选这样的标记选自生物素、Cy-3和Cy-5，并且这样的标记利用针对这样的标记的抗体例如抗生物素抗体、抗Cy3抗体或抗Cy5抗体来检测或-在标记是生物素的情况下-利用天然结合生物素的链霉亲和素或亲和素来检测标记。这样的抗体、链霉亲和素或亲和素反过来优选用各自的标记例如放射性、酶促或荧光标记(如二抗)来进行修饰。
在其它实施方案中，利用第二检测工具来检测或分析根据本发明的核酸分子，其中所述检测工具是分子信标。分子信标的方法对于本领域技术人员来说是已知的并且由Mairal等人(Mairal等人,2008)进行了综述。
与靶的检测相结合，优选方法包括下列步骤：
(a)提供有待测试其靶的存在的样品，
(b)提供根据本发明的核酸，
(c)使样品与核酸优选在反应容器中进行反应
其中可在步骤(b)之前进行步骤(a)，或可在步骤(a)之前进行步骤(b)。
在优选实施方案中，提供进一步步骤d)，所述步骤在于检测样品与核酸的反应。优选地，将步骤b)的核酸固定至表面。表面可以是反应容器例如反应试管、平板的孔的表面或这类反应容器中包含的装置例如珠粒的表面。可通过本领域技术人员已知的任何工具来将核酸固定至表面，所述工具包括但不限于非共价或共价键合。优选地，通过表面与核酸之间的共价化学键建立键合。然而，也在本发明内的是将核酸间接地固定至表面，其中此类间接固定包括使用另外的组分或一对相互作用伴侣。这样的另外的组分优选是与待固定的核酸特异性相互作用的化合物(所述化合物也称为相互作用伴侣)，从而介导核酸至表面的附着。相互作用伴侣优选选自核酸、多肽、蛋白质和抗体。优选地，相互作用伴侣是抗体，更优选单克隆抗体。或者，相互作用伴侣是核酸，优选功能性核酸。更优选，这样的功能性核酸选自适体、镜像异构适体和与所述核酸至少部分互补的核酸。在其它替代性实施方案中，核酸对表面的结合由分成多部分的相互作用伴侣介导。这样的分成多部分的相互作用伴侣优选是一对相互作用伴侣或由第一成员和第二成员组成的相互作用伴侣，其中第一成员由核酸包含或附着至核酸，并且第二成员附着至表面或由表面包含。分成多部分的相互作用伴侣优选选自成对相互作用伴侣，所述相互作用伴侣包含生物素与亲和素、生物素与链霉亲和素以及生物素与中性亲和素。优选，相互作用伴侣的对的第一成员是生物素。
这样的方法的优选结果是靶与核酸的固定的复合物的形成，其中更优选检测所述复合物。在实施方案中的是从复合物检测靶。
遵照该需要的各自的检测工具是例如对于靶的该部分/那些部分是特异性的任何检测工具。特别优选检测工具是选自核酸、多肽、蛋白质和抗体的检测工具，其产生对于本领域技术人员来说是已知的。
用于检测靶的方法还包括从优选已被用于进行步骤c)的反应容器除去样品。
方法在进一步的实施方案中还包括将靶的相互作用伴侣固定在表面(优选上文中定义的表面)上，其中相互作用伴侣是如本文中以及在上文中结合各自的方法所定义的，并且更优选在它们的各种实施方案中包括核酸、多肽、蛋白质和抗体。在该实施方案中，特别优选检测工具是根据本发明的核酸，其中这样的核酸可优选地可被标记或未被标记。如果这样的核酸被标记，则其可被直接或间接检测。这样的检测还可包括使用第二检测工具，在本文中描述的各种实施方案中，所述第二检测工具优选也选自核酸、多肽、蛋白质和实施方案。此类检测工具优选对于根据本发明的核酸是特异性的。在更优选实施方案中，第二检测工具是分子信标。核酸或第二检测工具或两者可在优选实施方案中包含检测标记。检测标记优选选自生物素、溴-脱氧尿苷标记、地高辛标记、荧光标记、UV-标记、放射性标记和螯合剂分子。或者，第二检测工具与检测标记相互作用，所述检测标记优选包含、包括在核酸中或连接至核酸。特别优选组合如下：
检测标记是生物素并且第二检测工具是针对生物素的抗体，或其中
检测标记是生物素并且第二检测工具是亲和素或具有亲和素的分子，或其中
检测标记是生物素并且第二检测工具是链霉亲和素或具有链霉亲和素的分子，或其中
检测标记是生物素并且第二检测工具是中性亲和素或具有中性亲和素的分子，或
其中检测标记是溴-脱氧尿苷并且第二检测工具是针对溴-脱氧尿苷的抗体，或其中
检测标记是地高辛并且第二检测工具是针对地高辛的抗体，或其中
检测标记是螯合剂并且第二检测工具是放射性核素，其中优选地将所述检测标记连接至核酸。应承认，该类型的组合也适用于其中将核酸连接至表面的实施方案。在这样的实施方案中，优选将检测标记连接至相互作用伴侣。
最后，还在本发明内的是使用第三检测工具检测第二检测工具，优选地第三检测工具是酶，更优选在检测第二检测工具时显示酶促反应，或第三检测工具是用于检测辐射，更优选由放射性核素发射的辐射的工具。优选，第三检测工具特异性检测第二检测工具和/或与其相互作用。
同样地在实施方案中，将靶的相互作用伴侣固定在表面上，优选将根据本发明的核酸添加至在相互作用伴侣与靶之间形成的复合物中，可从反应，更优选从其中进行步骤c)和/或d)的反应容器中除去样品。
在实施方案中，根据本发明的核酸包含荧光部分并且其中荧光部分的荧光在核酸与靶与游离靶之间形成复合物后不同。
在其它实施方案中，核酸是根据本发明的核酸的衍生物，其中核酸的衍生物包含至少一种腺苷的荧光衍生物来替代腺苷。在优选实施方案中，腺苷的荧光衍生物是亚乙烯基腺苷。
在其它实施方案中，使用荧光检测由根据本发明的核酸的衍生物和靶组成的复合物。
在方法的实施方案中，在步骤(c)或步骤(d)中产生信号，优选地所述信号与样品中靶的浓度相关。
在优选方面，可在96孔板中进行测定，其中将组分固定在上述反应容器和用作反应容器的孔中。
必须承认，本文中和更具体地实施例部分中描述的能够结合胰高血糖素的核酸分子是本发明的核酸分子的实施方案。
必须承认，本文中和更具体地实施例部分中描述的能够结合S1P的核酸分子是本发明的核酸分子的实施方案。
必须承认，本文中和更具体地实施例部分中描述的能够结合CGRP的核酸分子是本发明的核酸分子的实施方案。
必须承认，本文中和更具体地实施例部分中描述的能够结合C5a的核酸分子是本发明的核酸分子的实施方案。
各种SEQ.ID.No.、根据本发明的核酸分了的化学性质以及本文中使用的靶分子、其实际序列和内部参照编号概述于下表中。
Figure BDA00003620129700391
Figure BDA00003620129700401
Figure BDA00003620129700411
Figure BDA00003620129700431
Figure BDA00003620129700441
Figure BDA00003620129700451
Figure BDA00003620129700461
Figure BDA00003620129700471
Figure BDA00003620129700481
Figure BDA00003620129700491
Figure BDA00003620129700501
Figure BDA00003620129700511
Figure BDA00003620129700521
Figure BDA00003620129700531
Figure BDA00003620129700541
Figure BDA00003620129700551
Figure BDA00003620129700561
Figure BDA00003620129700571
Figure BDA00003620129700581
本发明进一步通过附图、实施例和序列表来进行举例说明，根据所述附图、实施例和序列表可获得进一步的特征、实施例和有利方面，其中
进一步通过附图、实施例和序列表来进行举例说明，根据所述附图、实施例和序列表可获得进一步的特征、实施例和有利方面，其中
图1A-C显示由核糖核苷酸组成的核酸分子L-S1P-215-F9-002和核酸分子L-S1P-215-F9-002的衍生物，其中衍生物包含单个或多个核糖核苷酸(A、U、G、C)至2′-脱氧核糖核苷酸(dA、dT、dG、dC)的置换；
图2显示核糖-至2′-脱氧核糖核苷酸置换的215-F9-002(也称为L-S1P-215-F9-002)衍生物的竞争性镜像异构适体拉下测定的结果：在37℃下利用50nM未标记的镜像异构适体(一式三份)竞争0.3nM放射性标记的L-S1P-215-F9-002-5′diD-G对8nM生物素化的D-e-S1P的结合，如所指示的；
图3显示核糖-至2′-脱氧核糖核苷酸置换的215-F9-002(也称为L-S1P-215-F9-002)衍生物的竞争性镜像异构适体拉下测定的结果，其中
(A)在37℃下利用36nM未标记的镜像异构适体(一式三份)竞争0.3nM放射性标记的L-S1P-215-F9-002-5′diD-G对8nM生物素化的D-e-S-1-P的结合，进行3小时，如所指示的；
(B)在37℃下利用滴定浓度的5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002(圆圈)和5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32(方块)竞争0.5nM放射性标记的L-S1P-215-F9-002-5′diD-G对7nM生物素化的D-e-S-1-P的结合，进行2.5小时；
图4显示(显示了一式三份培养物的平均值±SD)的抑制的结果：
10nM D-e-S1P-诱导的β-抑制蛋白被如下物质募集在表达EDG1的报道细胞系中:
(A)5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002和
(B)5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32(也称为NOX-S93)
图5A-E显示由核糖核苷酸组成的核酸分子226-F2-002和核酸分子226-F2-002的衍生物，其中衍生物包含单个核糖核苷酸(A、U、G、C)至2′-脱氧核糖核苷酸(dA、dT、dG、dC)的置换；
图6显示如通过Biacore测量法测定的相对于亲代镜像异构适体226-F2-001的亲和力的测定的变化的曲线；
图7显示由核糖核苷酸组成的核酸分子226-F2-002和核酸分子226-F2-002的衍生物226-F2-002-41、226-F2-002-44及226-F2-002-41/44，其中衍生物包含核糖核苷酸(A、U、G、C)和1或2个2′-脱氧核糖核苷酸(dC)；
图8A显示通过Biacore测量法进行的CGRP结合镜像异构适体226-F2-001和226-F2-001-D41对人CGRP的动力学评估；
图8B显示通过Biacore测量法进行的CGRP结合镜像异构适体226-F2-001和226-F2-001-D44对人CGRP的动力学评估；
图9显示通过Biacore测量法进行的CGRP结合镜像异构适体226-F2-001-D41和226-F2-001-D41/44对人CGRP的动力学评估；
图10显示CGRP结合镜像异构适体226-F2-001-5′40kDa-PEG(黑色圆圈)和NOX-L41(也称为226-F2-001-D41-5′40kDa-PEG，黑色方块)对人CGRP诱导的cAMP产生的抑制，其中结果也显示为相较于对照的产生的cAMP的相对量(对照的百分比)；
图11A-E显示由核糖核苷酸组成的核酸分子NOX-D19001和核酸分子NOX-D19001的衍生物，其中衍生物包含单个核糖核苷酸(A、U、G、C)至2′-脱氧核糖核苷酸(dA、dU、dG、dC)的置换；
图12显示通过Biacore测量法测定的相对于亲代NOX-D19001的亲和力的测定的变化的曲线；
图13显示通过Biacore测量法进行的镜像异构适体226-F2-NOX-D19001和衍生物NOX-D19001-D09、NOX-D19001-D16、NOX-D1900-D017、NOX-D19001-D30、NOX-D19001-D32和NOX-D19001-D40对人C5a的动力学评估；
图14显示核酸分子NOX-D19001的衍生物，其中衍生物包含多个核糖核苷酸(A、U、G、C)至2′-脱氧核糖核苷酸(dA、dU、dG、dC)的置换；
图15显示通过Biacore测量法进行的镜像异构适体226-F2-NOX-D19001和NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40对人C5a的动力学评估；
图16显示5′-末端40kDa PEG化的镜像异构适体NOX-D19001-5′PEG(也称为NOX-D19)和镜像异构适体NOX-D19001-6xDNA在趋化作用测定中的效力，其中使细胞朝向在37℃利用不同量的镜像异构适体预孵育的0.1nM huC5a迁移；
图17显示核酸分子NOX-D19001的衍生物，其中衍生物包含多个核糖核苷酸(A、U、G、C)至2′-脱氧核糖核苷酸(dA、dU、dG、dC)的置换；
图18A-E显示由核糖核苷酸组成的核酸分子NOX-G11stabi2和核酸分子NOX-G11stabi2的衍生物，其中衍生物包含单个或多个核糖核苷酸(A、C、G、U)至2’-脱氧核糖核苷酸(dA、dC、dG、dT)的置换；
图19显示如通过Biacore测量法测定的相对于亲代镜像异构适体NOX-G11stabi2的亲和力的测定的变化的曲线；
图20显示通过Biacore测量法进行的镜像异构适体NOX-G11stabi2、NOX-G11-D07、NOX-G11-D16、NOX-G11-D19、NOX-G11-D21、NOX-G11-D22对固定的生物素化的人胰高血糖素的动力学评估，
图21A-E显示由核糖核苷酸组成的核酸分子259-H6-002和核酸分子259-H6-002的衍生物，其中衍生物包含单个或多个脱氧核糖核苷酸(A、T、G、C)至核糖核苷酸(rA、rU、rG、rC)的2′-置换；
图22显示相对于亲代镜像异构适体259-H6-002的亲和力的测定的变化(如通过Biacore测量法测定的)的曲线；
图23显示通过Biacore测量进行的镜像异构适体259-H6-002、259-H6-002R13、259-H6-002R24和259-H6-002-R36对固定的生物素化的人胰高血糖素的动力学评估，
图24显示通过Biacore测量法进行的镜像异构适体259-H6-002、259-H6-002R13、259-H6-002R13-R24、259-H6-002R13-R36和259-H6-002R13-R24-R36对固定的生物素化的人胰高血糖素的动力学评估，
图25显示镜像异构适体259-H6-002及其衍生物259-H6-002-R13和259-H6-002-R13-R24-R36(也称为259-H6-002-R13/24/36)对胰高血糖素诱导的cAMP的产生的抑制，其中a)将每孔cAMP的产生量针对每一个数据组的最大值进行标准化，将百分比活性对镜像异构适体浓度作图，b)利用Prism5软件，使用非线性回归(4参数拟合)计算cAMP产量被抑制50%时的镜像异构适体浓度(IC50)，c)使用的镜像异构适体是259-H6-002(176nM)、259-H6-002-R13(12.5nM)和259-H6-002-R13-R24-R36(6.2nM)，在括号内给出了各自的IC50值。
图26显示通过Biacore测量法进行的镜像异构适体259-H6-002R13-R24-R30-R36对固定的生物素化的人胰高血糖素的动力学评估，
图27A-E显示由2’-脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子257-E1-001和核酸分子257-E1-001的衍生物，其中衍生物包含单个或多个2’-脱氧核糖核苷酸(A、C、G、T)至核糖核苷酸(rA、rC、rG、rU))的置换；
图27F显示由2’-脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸组成的核酸分子257-E1-6xR-001的衍生物；
图28显示核酸分子257-E1-001及其衍生物257-E1-R15-001、257-E1-R29-001、257-E1-6xR-001和257-E1-7xR-03对生物素化的胰高血糖素的竞争性拉下测定的结果。
实施例1:具有增加的对靶分子S1P的结合亲和力的核酸分子
作为包括将SELEX过程的立即筛选产物作为起始点的开发过程的结果，始于结合S1P的核酸分子，使用本发明的方法以改善核酸分子对其靶的结合亲和力。在本案例中，结合S1P的核酸分子是核酸分子L-S1P-215-F9-002。
核酸分子L-S1P-215-F9-002是镜像异构适体，即L-核酸分子，其能够结合S1P，具有根据SEQ ID NO:5的核苷酸序列并且由44个核糖核苷酸组成。
通过竞争性镜像异构适体拉下测定(如实施例9中描述的)测定核酸分子L-S1P-215-F9-002的结合特征。核酸分子L-S1P-215-F9-002以31.5nM的亲和力结合S1P(图1和图3B)。
为了改善核酸分子L-S1P-215-F9-002的结合特征，合成的核酸分子L-S1P-215-F9-002的衍生物。所述衍生物是具有与核酸分子L-S1P-215-F9-002相同的核碱基-鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶(在2’-脱氧核糖核苷酸的情况下)-的序列，然而单个位置上在关于核苷酸的糖部分上不同(所述糖部分为2′-脱氧核糖核苷酸而非核糖核苷酸)的L-核酸分子。与之相一致地，衍生物1在根据SEQ ID NO:6的核苷酸序列的位置1上具有2′-脱氧核糖核苷酸，衍生物2在根据SEQ ID NO:7的核苷酸序列的位置2上具有2′-脱氧核糖核苷酸等。因为核酸分子L-S1P-215-F9-002由44个核苷酸组成，因此合成总共44种衍生物以提供具有单个核糖核苷酸至2’-脱氧核糖核苷酸的置换的核酸分子L-S1P-215-F9-002的所有可能的衍生物的完整组。所述衍生物的完整组示于图1A-C中。在尿嘧啶的情况下，在分子L-S1P-215-F9-002的序列中，尿苷-5′-磷酸被胸苷-5′-磷酸替代。
使用实施例9中描述的竞争性拉下测定来测定核酸分子L-S1P-215-F9-002的所述衍生物的完整组的每一种衍生物的对S1P的结合亲和力，将所述结合亲和力与核酸分子L-S1P-215-F9-002的结合亲和力相比较(图1A-C)。
如可从图1A-C获得的，取决于镜像异构适体L-S1P-215-F9-002内的位置，核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换对于对靶的结合亲和力可具有不同的影响。令人惊讶地，2’脱氧核糖核苷酸在核酸分子L-S1P-215-F9-002内的一些位置上对核糖核苷酸的单个置换导致改善的对S1P的结合亲和力，然而在其它位置上的置换不导致对S1P的结合亲和力的显著变化，或甚至减小对S1P的结合亲和力。单个衍生物和相较于核酸分子215-F9-002对S1P的结合亲和力它们的结合亲和力的相对变化示于图1A-C中。
如可从所述附图获得的，衍生物L-S1P-215-F9-002-D01、L-S1P-215-F9-002-D11、L-S1P-215-F9-002-D19、L-S1P-215-F9-002-D21、L-S1P-215-F9-002-D22、L-S1P-215-F9-002-D32(所述衍生物分别在位置1、11、19、21、22和32上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第一组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换导致改善的对S1P的结合亲和力的核酸分子L-S1P-215-F9-002的衍生物(图1A-C和图2)。对于衍生物L-S1P-215-F9-002-D19和L-S1P-215-F9-002-D21，显示了所述衍生的最佳结合亲和力(图1A-C和图2)。因此，位置1、11、19、21、22和32，优选19和21，适用于赋予改善的S1P对核酸分子L-S1P-215-F9-002的结合亲和力。位置19上的腺苷-5′-磷酸至2′-脱氧腺苷-5′-磷酸的置换和位置21上的鸟苷-5′-磷酸至2′-脱氧鸟苷-5′-磷酸的置换分别导致相较于L-S1P-215-F9-002(31.5nM的KD)改善的16nM和11.3nM的结合亲和力(图1A-C)。
衍生物L-S1P-215-F9-002-D05、L-S1P-215-F9-002-D12、L-S1P-215-F9-002-D13、L-S1P-215-F9-002-D14、L-S1P-215-F9-002-D15、L-S1P-215-F9-002-D16、L-S1P-215-F9-002-D39、L-S1P-215-F9-002-D40、L-S1P-215-F9-002-D41、L-S1P-215-F9-002-D42和L-S1P-215-F9-002-D43(所述衍生物分别在位置5、12、1314、15、16、39、40、41、42和43上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第二组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不影响对S1P的结合亲和力的衍生物。因此，位置5、12、13、14、15、16、39、40、41、42和43不适合于赋予改善的对S1P的结合亲和力并且它们对于对S1P的结合亲和力没有不利的影响(相较于核酸分子L-S1P-215-F9-002)(图1A-C)。
最后，获得导致减小的结合亲和力或结合的重大损失的衍生物。此类衍生物即L-S1P-215-F9-002-D02、L-S1P-215-F9-002-D03、L-S1P-215-F9-002-D04、L-S1P-215-F9-002-D06、L-S1P-215-F9-002-D07、L-S1P-215-F9-002-D08、L-S1P-215-F9-002-D09、L-S1P-215-F9-002-D10、L-S1P-215-F9-002-D17、L-S1P-215-F9-002-D18、L-S1P-215-F9-002-D20、L-S1P-215-F9-002-D23、L-S1P-215-F9-002-D24、L-S1P-215-F9-002-D25、L-S1P-215-F9-002-D26、L-S1P-215-F9-002-D27、L-S1P-215-F9-002-D28、L-S1P-215-F9-002-D29、L-S1P-215-F9-002-D30、L-S1P-215-F9-002-D31、L-S1P-215-F9-002-D33、L-S1P-215-F9-002-D34、L-S1P-215-F9-002-D35、L-S1P-215-F9-002-D36、L-S1P-215-F9-002-D37、L-S1P-215-F9-002-D38和L-S1P-215-F9-002-D44(所述衍生物分别在位置2、3、4、6、7、8、9、10、17、18、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38和44上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第三组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不利地影响对S1P的结合亲和力的核酸分子L-S1P-215-F9-002的衍生物(图1A-C)。
为了评估核酸分子L-S1P-215-F9-002的衍生物的结合亲和力是否可通过引入超过1个置换来进一步增加，产生一组另外的衍生物(图1C)。所述组的另外的衍生物始于其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换导致改善的对S1P的结合亲和力的第一组衍生物。始于核酸分子L-S1P-215-F9-002，衍生物在位置19、21和/或22上具有至少2个2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换。位置19和21上的核糖核苷酸至2’-脱氧核糖核苷酸的置换赋予S1P对核酸分子L-S1P-215-F9-002的结合亲和力的最强改善然而位置22上的置换仅具有微弱的作用(图2)。
此类衍生物的竞争性镜像异构适体拉下测定显示组合L-S1P-215-F9-002镜像异构适体的多个位置上的核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换导致对S1P的结合亲和力的进一步改善。包含两个置换即位置19上的腺苷-5′-磷酸至2′-脱氧腺苷-5′-磷酸的置换和位置21上的鸟苷-5′-磷酸至2′-脱氧鸟苷-5′-磷酸的置换的镜像异构适体(称为L-S1P-215-F9-002-D21-19)显示相较于L-S1P-215-F9-002以及相较于包含单个置换即位置21上的鸟苷-5′-磷酸至2′-脱氧鸟苷-5′-磷酸的置换的L-S1P-215-F9-002-D21改善的结合亲和力(图3A)。位置22上的胞苷-5′-磷酸至2′-脱氧胞苷-5′-磷酸的其它置换不导致进一步的改善，因为L-S1P-215-F9-002-D21与L-S1P-215-F9-002-D21-22以及L-S1P-215-F9-002-D21-19与L-S1P-215-F9-002-D21-19-22分别显示相似的对S1P的结合亲和力(图1C和图3A)。相反地，包含4个置换即位置01上的鸟苷至2′-脱氧鸟苷、位置21上的鸟苷-5′-磷酸至2′-脱氧鸟苷-5′-磷酸以及位置19和32上的腺苷-5′-磷酸至2′-脱氧腺苷-5′-磷酸的置换的镜像异构适体(称为L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32)显示相较于仅包含两个置换的镜像异构适体L-S1P-215-F9-002-D21-19显著改善的结合亲和力(图1C和图3A)。与亲代分子L-S1P-215-F9-002(31.5nM的KD)相比较，L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32(5nM的KD)中4个位置上的核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换导致为6.3倍的对S1P的结合亲和力的改善(图3B)。L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32的位置11上的胞苷-5′-磷酸至2′-脱氧胞苷-5′-磷酸的其它置换对于对S1P的结合亲和力没有进一步的正效应(图1C和图3A)。
为了证明和比较镜像异构适体L-S1P-215-F9-002和L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32的功能性，合成两种在它们的5’-末端包含氨基的核酸分子。将40kDa PEG-部分偶联至氨基修饰的镜像异构适体，从而导致镜像异构适体5′-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002和5′-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32(也称为NOX-S93)。镜像异构适体的合成和PEG化描述于实施例7中。
体外细胞培养测定(方案参见实施例11)验证了改善的对S1P的亲和力转化成增强的对S1P功能的抑制。5′-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002和5′-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32(也称为NOX-S93)在表达人S1P-受体EDG1的报道细胞系中抑制S1P-诱导的抑制蛋白募集，IC50值分别为22.5nM和10.3nM(图4A、4B)。因此，竞争性镜像异构适体拉下测定(实施例9，图3B)和体外细胞培养实验(实施例11，图4)一致地显示核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换显著改善了S1P-结合镜像异构适体226-F2-001的结合亲和力和抑制活性。
实施例2:具有增加的对靶分子人CGRP的结合亲和力的核酸分子
作为包括将SELEX法的立即筛选产物作为起始的开发过程的结果，始于结合CGRP的核酸分子，使用本发明的方法以改善核酸分子对其靶的结合亲和力。在本案例中，结合人CGRP的核酸分子是核酸分子226-F2-001。
核酸分子226-F2-001是镜像异构适体，即L-核酸分子，其能够结合人CGRP，具有根据SEQ ID NO:55的核苷酸序列并且由50个核糖核苷酸组成。
通过表面等离子体共振测量法(如实施例8中描述的)测定核酸分子226-F2-001的结合特征。核酸分子226-F2-001以2.6nM的亲和力结合人CGRP(图7、图8A和8B)。
为了改善核酸分子226-F2-001的结合特征，合成的核酸分子226-F2-001的衍生物。所述衍生物是具有与核酸分子226-F2-001相同的核碱基-鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶(在2’脱氧核糖核苷酸的情况下)-的序列，然而在单个位置上在关于核苷酸的糖部分上不同(所述糖部分为2′脱氧核糖核苷酸而非核糖核苷酸)的L-核酸分子。与之相一致地，衍生物1(称为226-F2-001-D01)在根据SEQ ID NO:56的核苷酸序列的位置1上具有2′-脱氧核糖核苷酸，衍生物2(称为226-F2-001-D02)在根据SEQ ID NO:57的核苷酸序列的位置2上具有2′-脱氧核糖核苷酸等。因为核酸分子226-F2-001由50个核苷酸组成，因此合成总共50种衍生物以提供具有单个核糖核苷酸至2’-脱氧核糖核苷酸的置换的核酸分子226-F2-001的所有可能的衍生物的完整组。所述衍生物的完整组示于图5A-E中。在尿嘧啶的情况下，在分子226-F2-001的序列中，尿苷-5′-磷酸被胸苷-5′-磷酸替代。
使用实施例8中描述的表面等离子体共振测量法来测定核酸分子226-F2-001的所述衍生物的完整组的每一种衍生物的对人CGRP的结合亲和力，将所述结合亲和力与核酸分子226-F2-001的结合亲和力相比较。从一组至少5个单个的226-F2-001的测定的KD值计算平均值(平均值+/-标准差)。测定单个衍生物的KD值，亲和力的变化显示为相较于226-F2-001的平均KD为x倍的改善，其中为x倍改善的值是226-F2001与226-F2001的衍生物的KD之商。测定的标准差表示阳性命中的分界点(cutting point)。x倍改善的亲和力的数据示于图5A-E中并且作图于图6中。
如可从图5A-E获得的，取决于镜像异构适体内的位置，核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换对于对靶的结合亲和力可具有不同的影响。令人惊讶地，在核酸分子226-F2-001内的一些位置上，2’-脱氧核糖核苷酸对单个核糖核苷酸的置换导致改善的对人CGRP的结合亲和力，然而在其它位置上的置换不导致对人CGRP的结合亲和力的显著变化，或甚至减小对人CGRP的结合亲和力。单个衍生物和相较于核酸分子226-F2-001对人CGRP的它们的结合亲和力的相对变化示于图5A-E和图6中。
如可从所述附图获得的，衍生物226-F2-001-D03、226-F2-001-D05、226-F2-001-D08、226-F2-001-D09、226-F2-001-D14、226-F2-001-D16、226-F2-001-D19、226-F2-001-D22、226-F2-001-D23、226-F2-001-D24、226-F2-001-D25、226-F2-001-D26、226-F2-001-D28、226-F2-001-D30、226-F2-001-D33、226-F2-001-D34、226-F2-001-D37、226-F2-001-D39、226-F2-001-D41、226-F2-001-D42、226-F2-001-D44、226-F2-001-D45、226-F2-001-D46、226-F2-001-D47、226-F2-001-D48、226-F2-001-D49、226-F2-001-D50(所述衍生物分别在位置03、05、08、09、14、16、19、22、23、24、25、26、28、30、33、34、37、39、41、42、44、45、46、47、48、49、50上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第一组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换导致改善的对人CGRP的结合亲和力的核酸分子226-F2-001的衍生物(图5A-E和图6)。对于226-F2-001-D19、226-F2-001-D41和226-F2-001-D44，显示了所述衍生的最佳结合亲和力(图5A-E和图6)。因此，位置19、41和44适用于赋予核酸分子226-F2-001改善的对人CGRP的结合亲和力。利用表面等离子体共振测量法，仅对核酸分子226-F2-001-D41和226-F2-001-D44进行进一步表征。位置41和44上的单个胞苷-5′-磷酸至2′-脱氧胞苷-5′-磷酸的置换导致相较于226-F2-001(2.6nM的KD)改善的结合亲和力，KD分别为0.55nM和0.52nM(图7和图8A、B)。
衍生物226-F2-001-D04和226-F2-001-D27(所述衍生物分别在位置4和27上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第二组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不影响对人CGRP的结合亲和力的衍生物。因此，位置4和27不适合于赋予改善的结合亲和力并且它们对于对人CGRP的结合亲和力也没有不利的影响(相较于核酸分子226-F2-001)(图5A-E和图6)。
最后，获得导致减小的结合亲和力或结合的重大损失的衍生物。此类衍生物即226-F2-001-D01、226-F2-001-D02、226-F2-001-D06、226-F2-001-D07、226-F2-001-D10、226-F2-001-D11、226-F2-001-D12、226-F2-001-D13、226-F2-001-D15、226-F2-001-D17、226-F2-001-D18、226-F2-001-D20、226-F2-001-D21、226-F2-001-D29、226-F2-001-D31、226-F2-001-D32、226-F2-001-D35、226-F2-001-D36、226-F2-001-D38、226-F2-001-D40和226-F2-001-D43(所述衍生物分别在位置1、2、6、7、10、11、12、13、15、17、18、20、21、29、31、32、35、36、38、40和43上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第三组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不利地影响对人CGRP的结合亲和力的核酸分子226-F2-001的衍生物(图5A-E和图6)。
为了评估核酸分子226-F2-001的衍生物的结合亲和力是否可通过引入超过1个置换来进一步增加，产生另一种衍生物。所述衍生物始于其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换导致改善的对人CGRP的结合亲和力的第一组衍生物。始于核酸分子226-F2-001，衍生物在两个位置41和44(即除了位置19以外，还赋予核酸分子226-F2-001最强的结合亲和力的改善的那些位置)上具有2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换(称为226-F2-001-D41/D44)。
226-F2-001-D41/44的表面等离子体共振测量法显示组合226-F2-001的超过一个位置上的核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换(即位置41和44上的胞苷-5′-磷酸至2′-脱氧胞苷-5′-磷酸的置换)导致对人CGRP的结合亲和力的进一步改善(相较于包含单个置换的衍生物，即226-F2-001-D41或226-F2-001-D44)(图7、图8A、B和图9)。与亲代核酸分子226-F2-001(KD=2.6nM)相比较，226-F2-001-D41/44(KD=0.2nM)中2′-脱氧核糖核苷酸对2个核糖核苷酸的置换导致对人CGRP的结合亲和力的为13倍的改善，如通过表面等离子体共振术测量的(图7和图9)。
为了证明和比较镜像异构适体226-F2-001和226-F2-001-D41的功能性，合成两种在它们的5’-末端包含氨基的核酸分子。将40kDa PEG-部分偶联至氨基修饰的镜像异构适体，从而导致镜像异构适体226-F2-001-5′40kDa-PEG和226-F2-001-D41-5′40kDa-PEG(也称为NOX-L41)。镜像异构适体的合成和PEG化描述于实施例7中。
体外细胞培养测定(方案参见实施例12)通过显示它们在表达人CGRP受体的报道细胞系中有效地抑制人CGRP-诱导的cAMP产生验证了两种镜像异构适体的功能性(图10)。226-F2-001-5′40kDa-PEG和226-F2-001-D41-5′40kDa-PEG(NOX-L41)抑制人CGRP-诱导的功能，IC50值分别为3.8nM和0.39nM。因此，表面等离子体共振测量法(实施例8，图8A)和体外细胞培养实验(实施例12，图10)一致地显示2′-脱氧核糖核苷酸对单个核糖核苷酸的置换足以显著改善了CGRP结合镜像异构适体226-F2-001的结合亲和力和抑制活性。亲和力可通过在超过1个位置上的核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换来进一步改善，如对于226-F2-001-D41/44所显示的(图7和图9)。
实施例3:具有增加的对靶分子人C5a的结合亲和力的核酸分子
作为包括将SELEX法的立即筛选产物作为起始点的开发过程的结果，始于结合C5a的核酸分子，使用本发明的方法以改善核酸分子对其靶的结合亲和力。在本案例中，结合人C5a的核酸分子是核酸分子NOX-D19001。
核酸分子NOX-D19001是镜像异构适体，即L-核酸分子，其能够结合人C5a，具有根据SEQ ID NO:107的核苷酸序列并且由44个核糖核苷酸组成。
通过表面等离子体共振测量法(如实施例8中描述的)测定核酸分子NOX-D19001的结合特征。核酸分子NOX-D19001以1.4nM的亲和力结合人C5a(如也于图13中显示的)。
为了改善核酸分子NOX-D19001的结合特征，合成的核酸分子NOX-D19001的衍生物。所述衍生物是具有与核酸分子NOX-D19001相同的核碱基-鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶-的序列，然而在单个位置上在关于核苷酸的糖部分上不同(所述糖部分为2′-脱氧核糖核苷酸而非核糖核苷酸)的L-核酸分子。与之相一致地，衍生物1(称为NOX-D19001-D01)在根据SEQ ID NO:108的核苷酸序列的位置1上具有2′-脱氧核糖核苷酸，衍生物2(称为NOX-D19001-D02)在根据SEQ ID NO:109的核苷酸序列的位置2上具有2′-脱氧核糖核苷酸等。因为核酸分子NOX-D19001由44个核苷酸组成，因此合成总共44种衍生物以提供满足2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的单个置换的上述要求的核酸分子的所有可能的衍生物的完整组。所述衍生物的完整组示于图11A-E中。在尿嘧啶的情况下，在分子NOX-D19001的序列中，尿苷-5′-磷酸被2’-脱氧尿苷-5′-磷酸替代。
使用实施例8中描述的表面等离子体共振测量法来测定核酸分子NOX-D19001的所述衍生物的完整组的每一种衍生物的对人C5a的结合亲和力，将所述结合亲和力与核酸分子NOX-D19001的结合亲和力相比较。从一组至少5个单个的NOX-D19001的测定的KD值计算平均值(平均值±标准差)。测定单个衍生物的KD值，亲和力的变化显示为相较于NOX-D19001的平均值为x倍的改善，其中为x倍改善的值是NOX-D19001与NOX-D19001的衍生物的KD之商。测定的标准差表示阳性命中的分界点。为x倍改善的亲和力的数据示于图11A-E中并且作图于图12中。
如可从图11A-E获得的，取决于镜像异构适体内的位置，核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换的为x倍改善的亲合力对于对靶的结合亲和力可具有不同的影响。令人惊讶地，在核酸分子NOX-D19001内的一些位置上，2‘-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的单个置换导致改善的，即更低的对人胰高血糖素的结合亲和力，然而在核酸分子NOX-D19001内的一些位置上，2‘-脱氧核糖核苷酸在其它位置上对核糖核苷酸的置换不导致对人C5a的结合亲和力的显著变化，或甚至减小对人C5a的结合亲和力。单个衍生物、它们对人C5a的结合亲和力和它们相较于核酸分子NOX-D19001对人C5a的结合亲和力的结合亲和力的相对变化示于图11A-E中。
如可从所述附图获得的，衍生物NOX-D19001-D01、NOX-D19001-D02、NOX-D19001-D09、NOX-D19001-D16、NOX-D19001-D17、NOX-D19001-D22、NOX-D19001-D25、NOX-D19001-D29、NOX-D19001-D30、NOX-D19001-D32、NOX-D19001-D40、NOX-D19001-D42和NOX-D19001-D43(所述衍生物分别在位置1、2、9、16、17、22、25、29、30、32、40、42和43上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第一组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换导致改善的对人C5a的结合亲和力的衍生物(图11A-E、图12)。对于衍生物NOX-D19001-D09、NOX-D19001-D16、NOX-D19001-D17、NOX-D19001-D30、NOX-D19001-D32和NOX-D19001-D40，显示了所述衍生物的最佳结合亲和力(图11A-E，图12)。因此，位置9、16、17、30、32和40适用于赋予核酸分子NOX-D19001改善的对人C5a的结合亲和力。利用表面等离子体共振测量法进一步表征核酸分子NOX-D19001-D09、NOX-D19001-D16、NOX-D19001-D17、NOX-D19001-D30、NOX-D19001-D32和NOX-D19001-D40，其中测定结合亲和力(图13)。位置09上的尿苷-5′-磷酸至2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸的置换导致结合亲和力的为2倍的改善(图13)。
衍生物NOX-D19001-D03、NOX-D19001-D23、NOX-D19001-D26、NOX-D19001-D35、NOX-D19001-D38、NOX-D19001-D39和NOX-D19001-D44(所述衍生物分别在位置3、23、26、35、38、39和44上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第二组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不改变或影响对人C5a的结合亲和力的衍生物。位置35和44导致改善的NOX-D19001对人C5a的结合亲和力。因此，位置3、23、38和39不适合于赋予核酸分子NOX-D19001改善的对人C5a的结合亲和力，然而，对于核酸分子NOX-D19001对人C5a的结合亲和力也没有不利的影响。
最后，获得导致减小的结合亲和力或结合的重大损失的衍生物。此类衍生物即NOX-D19001-D04、NOX-D19001-D05、NOX-D19001-D06、NOX-D19001-D07、NOX-D19001-D08、NOX-D19001-D10、NOX-D19001-D11、NOX-D19001-D12、NOX-D19001-D13、NOX-D19001-D14、NOX-D19001-D15、NOX-D19001-D18、NOX-D19001-D19、NOX-D19001-D20、NOX-D19001-D21、NOX-D19001-D24、NOX-D19001-D27、NOX-D19001-D28、NOX-D19001-D31、NOX-D19001-D33、NOX-D19001-D34、NOX-D19001-D36、NOX-D19001-D38和NOX-D19001-D41相应地属于第三组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不利地影响对人C5a的结合亲和力的核酸分子NOX-D19001的那些衍生物。因此，位置4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、24、27、28、31、33、34、36和41对于核酸分子NOX-D19001对人C5a的结合亲和力具有不利的影响。
为了评估核酸分子L-NOX-D19001的衍生物的结合亲和力是否可通过引入超过1个置换来进一步增加，产生一组另外的衍生物。所述组的另外的衍生物始于包括其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换导致改善的对人C5a的结合亲和力的衍生物的上述第一组衍生物。始于核酸分子NOX-D19001，衍生物的其它组的衍生物在位置9、30、32和40(即已证明适合于赋予核酸分子NOX-D19001改善的对人C5a的结合亲和力的那些位置)的至少两个上具有2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换。
此类代表性实例的表面等离子体共振测量法显示(如图8和9中所描述的)组合镜像异构适体NOX-D19001的多个位置上的核糖核苷酸至2′-脱氧核糖核苷酸的置换导致结合亲和力的改善。
全都包含两个置换(即位置9/30、9/32、9/40、30/32、30/40和32/40上的尿苷-5′-磷酸至2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸的置换)的镜像异构适体NOX-D19001-D09-30、NOX-D19001-D09-32、NOX-D19001-D09-40、NOX-D19001-D30-32、NOX-D19001-D30-40和NOX-D19001-D32-40显示比包含1个置换(即位置9、30、32或40上的尿苷-5′-磷酸至2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸的置换)的分子更好的结合亲和力(图14)。
合成镜像异构适体NOX-D19001-D09-30-32、NOX-D19001-D09-30-40、NOX-D19001-D09-32-40和NOX-D19001-D30-32-40以测试核酸分子NOX-D19001中的3个置换(即位置9/30/32、9/30/40、9/32/40和30/32/40上的尿苷-5′-磷酸至2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸的置换)是否导致进一步改善的结合亲和力(相较于全都包含两个置换的NOX-D19001-D09-30、NOX-D19001-D09-32、NOX-D19001-D09-40、NOX-D19001-D30-32、NOX-D19001-D30-40和NOX-D19001-D32-40)。全都包含3个置换(即位置9/30/40和9/32/40上的尿苷-5′-磷酸至2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸的置换)的镜像异构适体NOX-D19001-D09-30-40和NOX-D19001-D09-32-40显示比包含两个置换(即位置9、30、32或40上的尿苷-5′-磷酸至2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸的置换)分子更好的结合亲和力(图14)。
组合4个位置9、30、32或40(核酸分子NOX-D19001-D09-30-32-40)的置换(即位置9/30/32/40上的尿苷-5′-磷酸至2′-脱氧-尿苷-5′-磷酸的置换)导致相较于全都包含3个置换的镜像异构适体NOX-D19001-D09-30-40和NOX-D19001-D09-32-40进一步的改善(图14)。
2’-脱氧核糖核苷酸在NOX-D19001-D09-30-32-40的位置16或17上对额外的核糖核苷酸的置换对于对C5a的结合亲和力具有进一步的正效应(参见NOX-D19001-D09-16-30-32-40和参见NOX-D19001-D09-17-30-32-40图14)。2’-脱氧核糖核苷酸在NOX-D19001-D09-30-32-40的位置16或17上对两个额外的核糖核苷酸的置换对于对人C5a的结合亲和力没有进一步的正效应(参见NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40，也称为NOX-D19001-6xDNA，图14和15)。与核酸分子NOX-D19001相比较，核酸分子NOX-D19001-6xDNA显示了为4.2倍的对人C5a的结合的改善(图15)。
为了证明和比较镜像异构适体NOX-D19001和NOX-D19001-6xDNA的功能性，在体外细胞培养测定(方案参见实施例14)中测试两种核酸分子。如图16中所示，体外细胞培养测定确认了改善的对人C5a的亲和力转化成增强的对C5a功能的抑制。PEG化的镜像异构适体NOX-D19和NOX-D19-6xDNA抑制C5a诱导的趋化作用，IC50值分别为2.39nM和0.27nM(图16)。
如先前所示，核酸分子NOX-D19-001中2’-脱氧核糖核苷酸对多个核糖核苷酸的置换导致改善的对人C5a的亲和力。然而，只有当多个置换是已导致对人C5a的结合的改善的单个置换的结果，才可达到这样的改善。2’-脱氧核糖核苷酸对位置7上的核糖核苷酸的置换导致减小的亲和力(参见图17)。该减小的亲和力可通过其它位置例如16、17、30、32和40上的另外的置换“恢复”一点(参见NOX-D19001-D07-16-17-30-32-40与NOX-D19001-D07-30的比较，图17)。
实施例4:具有增加的对靶分子胰高血糖素的结合亲和力的核酸分子 NOX-G11stabi2的衍生物
作为包括将SELEX法的立即筛选产物作为起始点的开发过程的结果，始于结合胰高血糖素的核酸分子，使用本发明的方法以改善核酸分子对其靶的结合亲和力。在本案例中，结合人胰高血糖素的核酸分子是核酸分子NOX-G11stabi2。
核酸分子NOX-G11stabi2是镜像异构适体，即L-核酸分子，其能够结合人胰高血糖素，具有根据SEQ ID NO:172的核苷酸序列并且由54个核糖核苷酸组成。
通过表面等离子体共振测量法(如实施例8中描述的)测定核酸分子NOX-G11stabi2的结合特征。核酸分子NOX-G11stabi2以67.1nM的亲和力结合人胰高血糖素，也如图20中显示的。
为了改善核酸分子NOX-G11stabi2的结合特征，合成的核酸分子NOX-G11stabi2的衍生物。所述衍生物是具有与核酸分子NOX-G11stabi2相同的核碱基-鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶或可选择地胸腺嘧啶(在2’脱氧核糖核苷酸的情况下)-的序列，然而在单个位置上在关于核苷酸的糖部分上不同(所述糖部分为2’-脱氧核糖核苷酸而非核糖核苷酸)的L-核酸分子。与之相一致地，衍生物1(称为NOX-G11-D01)在根据SEQ ID NO:172的核苷酸序列的位置1上具有2’-脱氧核糖核苷酸，衍生物2(称为NOX-G11-D02)在根据SEQ ID NO:173的核苷酸序列的位置2上具有2′-脱氧核糖核苷酸等。由于核酸分子NOX-G11stabi2由54个核苷酸组成，因此合成总共54种衍生物以提供满足2’-脱氧核糖核苷酸对2’-核糖核苷酸的单个置换的上述要求的核酸分子的所有可能的衍生物的完整组。所述衍生物的完整组示于图18A-E中。在尿嘧啶的情况下，在分子NOX-G11stabi2的序列中，利用胸苷-5’-磷酸替代尿苷-5’-磷酸。
利用如实施例8中描述的表面等离子体共振测量法测定所述核酸分子NOX-G11stabi2的衍生物的完整组的每一种衍生物的对人胰高血糖素的结合亲和力，将所述亲和力与核酸分子NOX-G11stabi2的结合亲和力相比较。从一组至少5个单个的NOX-G11stabi2的测定的KD值计算平均值(平均值±标准差)。测定单个衍生物的KD值，亲和力的变化显示为相较于NOX-G11stabi2的平均值为x倍的改善，其中x倍改善的值是NOX-G11stabi2与NOX-G11stabi2的衍生物的KD之商。测定的标准差表示阳性命中的分界点。x倍改善的亲和力的数据示于图18A-E中。
如可从图18A-E获得的，取决于镜像异构适体内的位置，核糖-至2′-脱氧核糖核苷酸的置换的为x倍改善的亲和力对于对靶的结合亲和力可具有不同的影响。令人惊讶地，在核酸分子NOX-G11stabi2内的一些位置上，2’脱氧核糖核苷酸对2‘核糖核苷酸的单个置换导致改善的，即更低的对人胰高血糖素的结合亲和力，然而在核酸分子NOX-G11stabi2内的一些位置上，2’脱氧核糖核苷酸在其它位置上对2‘核糖核苷酸的置换不导致对人胰高血糖素的结合亲和力的显著变化，或甚至减小对人胰高血糖素的结合亲和力。单个衍生物、它们对人胰高血糖素的结合亲和力和它们相较于核酸分子NOX-G11stabi2对胰高血糖素的结合亲和力的结合亲和力的相对变化示于图18A-E中。
如可从所述附图获得的，衍生物NOX-G11-D01、NOX-G11-D02、NOX-G11-D03、NOX-G11-D04、NOX-G11-D05、NOX-G11-D06、NOX-G11-D07、NOX-G11-D08、NOX-G11-D09、NOX-G11-D10、NOX-G11-D12、NOX-G11-D13、NOX-G11-D14、NOX-G11-D15、NOX-G11-D16、NOX-G11-D18、NOX-G11-D19、NOX-G11-D20、NOX-G11-D21、NOX-G11-D22、NOX-G11-D23、NOX-G11-D24、NOX-G11-D25、NOX-G11-D26、NOX-G11-D27、NOX-G11-D28、NOX-G11-D29、NOX-G11-D30、NOX-G11-D32、NOX-G11-D36、NOX-G11-D38、NOX-G11-D44、NOX-G11-D46、NOX-G11-D48和NOX-G11-D53(所述衍生物分别在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、36、38、44、46、48和53上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第一组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换导致改善的对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物(图11A-E，图19)。对于NOX-G11-D07、NOX-G11-D16、NOX-G11-D19、NOX-G11-D19、NOX-G11-D21和NOX-G11-D22，显示了所述衍生的最佳结合亲和力(图11A-E，图20)。因此，位置7、16、19、21和22适用于赋予核酸分子NOX-G11stabi2改善的对人胰高血糖素的结合亲和力。利用表面等离子体共振测量法，对核酸分子NOX-G11-D07、NOX-G11-D16、NOX-G11-D19、NOX-G11-D19、NOX-G11-D21和NOX-G11-D22进行进一步表征，其中测定结合亲和力(图20)。
衍生物NOX-G11-D11、NOX-G11-D17、NOX-G11-D31、NOX-G11-D33、NOX-G11-D34、NOX-G11-D35、NOX-G11-D39、NOX-G11-D40、NOX-G11-D43、NOX-G11-D45、NOX-G11-D50和NOX-G11-D52(所述衍生物分别在位置11、17、31、33、34、35、39、40、43、45、50和52上具有2’-脱氧核糖核苷酸)属于第二组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不改变或影响对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物。因此，位置11、17、31、33、34、35、39、40、43、45、50和52不适合于赋予核酸分子NOX-G11stabi2改善的对人胰高血糖素的结合亲和力，然而对于核酸分子NOX-G11stabi2对人胰高血糖素的结合亲和力也没有不利的影响。
最后，获得导致减小的结合亲和力或结合亲和力的重大损失的衍生物。此类衍生物即NOX-G11-D37、NOX-G11-D41、NOX-G11-D42、NOX-G11-D47、NOX-G11-D49、NOX-G11-D51和NOX-G11-D54因此属于第三组衍生物，即其中2’-脱氧核糖核苷酸对核糖核苷酸的置换不利地影响对人胰高血糖素的结合亲和力的核酸分子NOX-G11stabi2的那些衍生物。因此，位置37、41、42、47、49、51和54对于核酸分子NOX-G11stabi2对人胰高血糖素的结合亲和力具有不利的影响。
实施例5:具有增加的对靶分子胰高血糖素的结合亲和力的核酸分子 259-H6-002的衍生物
作为包括将SELEX法的立即筛选产物作为起始点的开发过程的结果，始于结合胰高血糖素的核酸分子，使用本发明的方法以改善核酸分子对其靶的结合亲和力。在本案例中，结合人胰高血糖素的核酸分子是核酸分子259-H6-002。
核酸分子259-H6-002是镜像异构适体，即L-核酸分子，其能够结合人胰高血糖素，具有根据SEQ ID NO:287的核苷酸序列并且由46个2’-脱氧核糖核苷酸组成。
通过表面等离子体共振测量法(如实施例X中描述的)测定核酸分子259-H6-002的结合特征。核酸分子259-H6-002以10.9nM的亲和力结合人胰高血糖素，也如图23中显示的。
为了改善核酸分子259-H6-002的结合特征，合成的核酸分子259-H6-002的衍生物。所述衍生物是具有与核酸分子259-H6-002相同的核碱基-鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶-的序列，然而在单个位置上在关于核苷酸的糖部分上不同(所述糖部分为2’-核糖核苷酸而非脱氧核糖核苷酸)的L-核酸分子。与之相一致地，衍生物1(称为259-H6-002-R01)在根据SEQ ID NO:288的核苷酸序列的位置1上具有核糖核苷酸，衍生物2(称为259-H6-002-R02)在根据SEQ ID NO:289的核苷酸序列的位置2上具有2′-核糖核苷酸等。由于核酸分子259-H6-002由46个核苷酸组成，因此合成总共46种衍生物以提供满足核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的单个置换的上述要求的核酸分子的所有可能的衍生物的完整组。所述衍生物的完整组示于图21A-E中。在胸苷的情况下，在分子259-H6-002的序列中，利用尿苷5’磷酸替代胸苷-5’磷酸。
利用实施例8中描述的表面等离子体共振测量法测定所述核酸分子259-H6-002的衍生物的完整组的每一种衍生物的对人胰高血糖素的结合亲和力，将所述亲和力与核酸分子259-H6-002的结合亲和力相比较，其中利用实施例8中描述的表面等离子体共振测量法测定所述核酸分子259-H6-002的衍生物的完整组的每一种衍生物的对人胰高血糖素的结合亲和力，将所述亲和力与核酸分子259-H6-002的结合亲和力相比较。从一组至少5个单个的259-H6-002的测定的KD值计算平均值(平均值+/-标准差)。测定单个衍生物的KD值，亲和力的变化显示为相较于259-H6-002的平均值为x倍的改善，其中为x倍改善的值是259-H6-002与259-H6-002的衍生物的KD之商。测定的标准差表示阳性命中的分界点。x倍改善的亲和力的数据示于图21A-D中并且作图于图22中。
如可从图21A-D获得的，取决于镜像异构适体内的位置，2’-脱氧核糖核苷酸至核糖核苷酸的置换对于对靶的结合亲和力可具有不同的影响。令人惊讶地，在核酸分子259-H6-002内的一些位置上，核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的单个置换导致改善的，即更高的对人胰高血糖素的结合亲和力，然而在核酸分子259-H6-002内，核糖核苷酸在其它位置上对2’-脱氧核糖核苷酸的置换不导致对人胰高血糖素的结合亲和力的显著变化，或甚至减小对人胰高血糖素的结合亲和力。单个衍生物和它们相较于核酸分子259-H6-002对胰高血糖素的结合亲和力的结合亲和力的相对变化示于图21A-D中。
如可从所述附图获得的，衍生物259-H6-002-R8、259-H6-002-R13、259-H6-002-R22、259-H6-002-R24、259-H6-002-R30、259-H6-002-R31、259-H6-002-R36、259-H6-002-R38、259-H6-002-R39和259-H6-002-R44(所述衍生物分别在位置8、13、22、24、30、31、36、38、39和44上具有核糖核苷酸)属于第一组衍生物，即其中核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换导致改善的对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物(图21A-D，图22)。对于衍生物259-H6-002-R13、259-H6-002-R24、259-H6-002-R30和259-H6-002-R36，显示了所述衍生的最佳结合亲和力，改善倍数为2.1至5.8(图21A-D，图22)。因此，位置13、24、30和36适用于赋予核酸分子259-H6-002改善的对人胰高血糖素的结合亲和力。利用表面等离子体共振测量法，对核酸分子259-H6-002-R13、259-H6-002-R24和259-H6-002-R36进行进一步表征，其中测定结合亲和力(图23)。
衍生物259-H6-002-R04、259-H6-R06和259-H6-R46(所述衍生物分别在位置4、6和46上具有2’-核糖核苷酸)属于第二组衍生物，即其中2’-核糖核苷酸对2’脱氧核糖核苷酸的置换不显著改变或影响对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物。因此，位置4、6和46不适合于赋予核酸分子259-H6-002改善的对人胰高血糖素的结合亲和力，然而对于核酸分子259-H6-002对人胰高血糖素的结合亲和力也没有不利的影响。
衍生物259-H6-R09和259-H6-R45在Biacore上显示双相结合行为。因此判断改善倍数是假的，并且未进一步考虑位置9和45的结合亲和力的改善。
最后，获得导致减小的结合亲和力或结合亲和力的重大损失的31种衍生物。此类衍生物即259-H6-002-R01、259-H6-002-R02、259-H6-002-R03、259-H6-002-R05、259-H6-002-R07、259-H6-002-R10、259-H6-002-R11、259-H6-002-R12、259-H6-002-R14、259-H6-002-R15、259-H6-002-R16、259-H6-002-R17、259-H6-002-R18、259-H6-002-R19、259-H6-002-R20、259-H6-002-R21、259-H6-002-R23、259-H6-002-R25、259-H6-002-R26、259-H6-002-R27、259-H6-002-R28、259-H6-002-R29、259-H6-002-R32、259-H6-002-R33、259-H6-002-R34、259-H6-002-R35、259-H6-002-R37、259-H6-002-R40、259-H6-002-R41、259-H6-002-R42、259-H6-002-R43因此属于第三组衍生物，即其中核糖核苷酸对2′-脱氧核糖核苷酸的置换不利地影响对人胰高血糖素的结合亲和力的核酸分子259-H6-002的那些衍生物。因此，位置1、2、3、5、7、10、11、12、14、15、16、17、18、19、20、21、23、25、26、27、28、29、32、33、34、35、37、40、41、42和43对于核酸分子259-H6-002对人胰高血糖素的结合亲和力具有不利的影响。
为了评估核酸分子L-259-H6-002的衍生物的结合亲和力是否可通过引入超过1个置换来进一步增加，产生一组另外的衍生物。所述组的另外的衍生物始于包括其中核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换导致改善的对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物的上述第一组衍生物。始于核酸分子259-H6-002，衍生物的其它组的衍生物在位置13、24、30和36(即已证明适合于赋予核酸分子259-H6-002改善的对人胰高血糖素的结合亲和力的那些位置)的至少两个上具有核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换。
此类代表性实例的表面等离子体共振测量法显示(如图24中所描述的)组合镜像异构适体259-H6-002的多个位置上的核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换导致结合亲和力的改善。
全都包含两个置换(即位置13上的脱氧腺苷-5′-磷酸至腺苷-5′-磷酸的置换、位置24上的脱氧鸟苷至鸟苷-5'-磷酸的置换和/或位置36上的胸苷-5'-磷酸至尿苷-5'-磷酸的置换)的镜像异构适体259-H6-002-R13_R24和259-H6-002-R13_R36显示比包含1个置换的分子更好的结合亲和力(图24)。
合成镜像异构适体259-H6-002-R13_R24_R36以测试核酸分子259-H6-002中的3个置换(即位置13上的脱氧腺苷-5-磷酸至腺苷-5'-磷酸的置换、位置24上的脱氧鸟苷-5'-磷酸至鸟苷-5'-磷酸的置换和位置36上的胸苷-5'-磷酸至尿苷-5'-磷酸的置换)是否导致进一步改善的结合亲和力(相较于全都包含两个置换的镜像异构适体259-H6-002-R13_R24和259-H6-002-R13_R36)(图24)。
组合4个位置13、24、30和36(核酸分子259-H6-002-R13_R24_R30_R36)的置换(即位置13上的脱氧腺苷-5'-磷酸至腺苷-5'-磷酸的置换、位置24和30上的脱氧鸟苷-5-磷酸至鸟苷-5'-磷酸的置换以及位置36上的胸苷-5'-磷酸至尿苷-5'-磷酸的置换)导致相较于包含3个置换的镜像异构适体259-H6-002-R13_R24_R36微小的改善(图26)。
为了证明和比较镜像异构适体259-H6-002、259-H6-002-R13和259-H6-002-R13_R24_R36的功能性，在体外细胞培养测定(方案参见实施例14)中测试所有核酸分子。如图25中所示，体外细胞培养测定确认了改善的对人胰高血糖素的亲和力转化成增强的对胰高血糖素功能的抑制。镜像异构适体259-H6-002、259-H6-002-R13和259-H6-002-R13_R24_R36抑制胰高血糖素诱导的细胞内cAMP形成，IC50值分别为176nM、12.5nM和6.2nM(图25)。
实施例6:具有增加的对靶分子胰高血糖素的结合亲和力的核酸分子 257-E1-001的衍生物
作为包括将SELEX法的立即筛选产物作为起始点的开发过程的结果，始于结合胰高血糖素的核酸分子，使用本发明的方法以改善核酸分子对其靶的结合亲和力。在本案例中，结合人胰高血糖素的核酸分子是核酸分子257-E1-001。
核酸分子257-E1-001是镜像异构适体，即L-核酸分子，其能够结合人胰高血糖素，具有根据SEQ ID NO:27的核苷酸序列并且由47个2’-脱氧核糖核苷酸组成。
以竞争性拉下测定形式(如实施例10中描述的)测定核酸分子257-E1-001的结合特征。核酸分子257-E1-001以186nM的亲和力结合人胰高血糖素，也如图28中显示的。
为了改善核酸分子257-E1-001的结合特征，合成核酸分子257-E1-001的衍生物(如实施例7中所描述的)。所述衍生物是具有与核酸分子257-E1-001相同的核碱基-鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶或可选择地胸腺嘧啶(在2’脱氧核糖核苷酸的情况下)-的序列，然而在单个位置上在关于核苷酸的糖部分上不同(所述糖部分为核糖核苷酸而非2’-核糖核苷酸)的L-核酸分子。与之相一致地，衍生物1(称为257-E1-R1-001)在根据SEQ ID NO:228的核苷酸序列的位置1上具有核糖核苷酸，衍生物2(称为257-E1-R2-001)在根据SEQ ID NO:229的核苷酸序列的位置2上具有核糖核苷酸等。由于核酸分子257-E1-001由47个核苷酸组成，因此合成总共47种衍生物以提供满足核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的单个置换的上述要求的核酸分子的所有可能的衍生物的完整组。所述衍生物的完整组示于图27A-D中。在胸苷-5’-磷酸的情况下，在分子257-E1-001的序列中，利用尿苷-5’-磷酸替代胸苷-5’-磷酸。
利用实施例10中描述的竞争性拉下测定法测定所述核酸分子257-E1-001的衍生物的完整组的每一种衍生物的对人胰高血糖素的结合特征，将所述结合特征与核酸分子257-E1-001的结合亲和力相比较。如可从图27A-D获得的，取决于镜像异构适体内的位置，2′-脱氧核糖核苷酸至核糖核苷酸的置换对于对靶的结合亲和力可具有不同的影响。令人惊讶地，在核酸分子257-E1-001内的一些位置上，核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的单个置换导致改善的，即更高的对人胰高血糖素的结合亲和力，然而在核酸分子257-E1-001内，核糖核苷酸在其它位置上对2’脱氧核糖核苷酸的置换不导致对人胰高血糖素的结合亲和力的显著变化，或甚至减小对人胰高血糖素的结合亲和力。单个衍生物和它们相较于核酸分子257-E1-001对胰高血糖素的结合亲和力的结合亲和力的相对变化示于图27A-D中。
如可从所述附图获得的，衍生物257-E1-R9-001、257-E1-R15-001、257-E1-R18-001、257-E1-R19-001、257-E1-R29-001和257-E1-R30-001(所述衍生物分别在位置9、15、18、19、29或30上具有核糖核苷酸)属于第一组衍生物，即其中核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换导致改善的对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物(图27A-C、28)。对于衍生物257-E1-R15-001、257-E1-R29-001和257-E1-R30-001，显示了所述衍生的最佳结合亲和力(图27B-C、28)。因此，位置15、29和30适用于赋予核酸分子257-E1-001改善的对人胰高血糖素的结合亲和力。在竞争性拉下测定中进一步表征核酸分子257-E1-R15-001和257-E1-R29-001，其中测定结合亲和力(图28)。
衍生物257-E1-R26-001和257-E1-R46-001(所述衍生物分别在位置26和46上具有核糖核苷酸)属于第二组衍生物，即其中核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换不改变或影响对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物。因此，位置26和46不适合于赋予核酸分子257-E1-001改善的对人胰高血糖素的结合亲和力，然而对于核酸分子257-E1-001对人胰高血糖素的结合亲和力也没有不利的影响。
最后，获得导致减小的结合亲和力或结合亲和力的重大损失的衍生物。此类衍生物即257-E1-R1-001、257-E1-R2-001、257-E1-R3-001、257-E4-R1-001、257-E5-R1-001、257-E1-R6-001、257-E1-R7-001、257-E1-R8-001、257-E1-R10-001、257-E1-R11-001、257-E1-R12-001、257-E1-R13-001、257-E1-R14-001、257-E1-R16-001、257-E1-R17-001、257-E1-R20-001、257-E1-R21-001、257-E1-R22-001、257-E1-R23-001、257-E1-R24-001、257-E1-R25-001、257-E1-R27-001、257-E1-R28-001、257-E1-R31-001、257-E1-R32-001、257-E1-R33-001、257-E1-R34-001、257-E1-R35-001、257-E1-R36-001、257-E1-R37-001、257-E1-R38-001、257-E1-R39-001、257-E1-R40-001、257-E1-R41-001、257-E1-R42-001、257-E1-R43-001、257-E1-R44-001、257-E1-R45-001、257-E1-R47-001因此属于第三组衍生物，即其中核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换不利地影响对人胰高血糖素的结合亲和力的核酸分子257-E1-001的那些衍生物。因此，位置1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、16、17、20、21、22、23、24、25、27、28、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47对于核酸分子257-E1-001对人胰高血糖素的结合亲和力具有不利的影响。
为了评估核酸分子257-E1-001的衍生物的结合亲和力是否可通过引入超过一个置换来进一步增强，产生一组另外的衍生物。该组另外的衍生物始于上述第一组衍生物，包括其中核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换导致改善的对人胰高血糖素的结合亲和力的衍生物。始于核酸分子257-E1-001，衍生物的其它组的衍生物在位置9、15、18、19、29和30(即已证明适合于赋予核酸分子257-E1-001改善的对人胰高血糖素的结合亲和力的那些位置)的至少两个上具有核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换。
在竞争性拉下测定中，代表性实例显示(如图27E、F和28中所描述的)组合镜像异构适体257-E1-001的多个位置上的核糖核苷酸对2’-脱氧核糖核苷酸的置换导致结合亲和力的改善。在实施例10中描述的竞争性拉下测定法中测定包含至少两个2’-脱氧核糖核苷酸至核糖核苷酸的置换的组合的衍生物的对人胰高血糖素的结合亲和力，将所述结合亲和力分别与核酸分子257-E1-001或257-E1-6xR-001的结合亲和力相比较。分别从一组2或10个单个的257-E1-001或257-E1-6xR-001的测定的KD值计算平均值(平均值+/-标准差)。测定具有组合的置换的镜像异构适体的KD值，亲和力的变化分别显示为相较于257-E1-001或257-E1-6xR-001的平均值的亲和力的改善倍数，其中为x倍改善的值是257-E1-001与257-E1-001的衍生物的KD之商。测定的标准差表示改善或下降的分界点。亲和力的改善倍数示于图27E和F中。
镜像异构适体257-E1-R15/29-001和257-E1-R29/30-001(两者都包含两个置换，即位置15上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸的置换、位置29上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸的置换和/或位置30上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸的置换)显示了比包含1个置换的分子更好的结合亲和力(图27E)。
合成镜像异构适体257-E1-R15/29/30-001和257-E1-R18/29/30-001以测试核酸分子257-E1-001中的3个置换是否导致相较于镜像异构适体257-E1-R15/29-001和257-E1-R29/30-001(全都包含两个置换)进一步改善的结合亲和力。即，位置15上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸、位置29上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸以及位置30上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸的置换导致相较于镜像异构适体257-E1-R29/30-001进一步改善的结合亲和力。然而，3倍置换的镜像异构适体257-E1-R15/29/30-001对胰高血糖素的结合亲和力与包含两个置换的镜像异构适体257-E1-R15/29-001的所述结合亲和力相当。镜像异构适体257-E1-R18/29/30-001中位置18上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸的置换而非位置15上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸的置换导致相较于257-E1-R29/30-001增加的结合亲和力，但相较于257-E1-R15/29/30减小的亲和力(图27E)。
组合4个位置15、18、29和30(核酸分子257-E1-R15/18/29/30-001)的置换，即位置15上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸、位置18上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸、位置29上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸以及位置30上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸的置换，不导致相较于包含3个置换的镜像异构适体257-E1-R15/29/30-001的进一步的改善(图27E)。
令人惊讶地，位置9、15、18、19、29、30上的6个2’脱氧核糖核苷酸至核糖核苷酸的置换的组合(镜像异构适体257-E1-R9/15/18/19/29/30-001=257-E1-6xR-001)，即位置9上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸、位置15上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸、位置18上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸、位置19上的2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸、位置29上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸以及位置30上的2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸的置换，导致相较于镜像异构适体257-E1-R15/29-001和257-E1-R15/18/29/30-001(分别包含2个和4个置换)进一步改善的对胰高血糖素的结合亲和力(图27E和28)。
为了评估镜像异构适体257-E1-6xR-001(包含6个2’-脱氧核糖核苷酸至核糖核苷酸的置换)的对胰高血糖素的结合亲和力是否可通过胸苷-5’-磷酸与5-甲基-尿苷-5’-磷酸而非与尿苷-5’-磷酸的交换来进一步增加，合成核酸分子257-E1-6xR-001的衍生物。所述衍生物包含另外的胸苷-5’-磷酸至5-甲基-尿苷-5’-磷酸的第七置换，并且示于图27F中。事实上，单个包含7个置换(即位置9、15、18和19上的4个2′-脱氧鸟苷-5’-磷酸至鸟苷-5’-磷酸的置换、1个胸苷-5’-磷酸至5-甲基-尿苷-5’-磷酸的置换和位置29和30上的2个2′-脱氧腺苷-5’-磷酸至腺苷-5’-磷酸的置换)的衍生核酸分子(核酸分子257-E1-7xR-023)，导致相较于镜像异构适体257-E1-6xR-001略微改善的结合亲和力(图27F和28)。
最后，镜像异构适体257-E1-7xR-023对胰高血糖素的结合亲和力相较于SELEX产生的未修饰的镜像异构适体257-E1-001获得为43倍的改善。
实施例7:镜像异构适体的合成和衍生
小规模合成
利用ABI394合成仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)，使用2’TBDMS RNA和DNA亚磷酰胺化学(使用标准环外胺保护基团)(Damha和Ogilvie,1993)通过固相合成来产生镜像异构适体(L-RNA核酸或L-DNA修饰的L-RNA核酸)。对于寡核苷酸的RNA部分，使用以D-(需要时，参见实施例9/10))和L-构型存在的rA(N-Bz)-、rC(N-Ac)-、rG(N-ibu)-和rU-亚磷酰胺，然而对于DNA部分，应用以D-和L-构型存在的dA(N-Bz)-、dC(N-Ac)-、dG(N-ibu)-和dT。所有亚磷酰胺全都购自ChemGenes,Wilmington,MA。在合成和去保护后，通过凝胶电泳纯化适体和镜像异构适体。
大规模合成+修饰
利用
Figure BDA00003620129700791
合成仪(GE Healthcare,Freiburg)，使用2’TBDMS RNA和DNA亚磷酰胺化学(使用标准环外胺保护基团)(Damha和Ogilvie,1993)通过固相合成来产生镜像异构适体。L-rA(N-Bz)-、L-rC(N-Ac)-、L-rG(N-ibu)-、L-rU-、L-dA(N-Bz)-、L-dC(N-Ac)-、L-dG(N-ibu)-和L-dT-亚磷酰胺购自ChemGenes,Wilmington,MA。5’-氨基-改性剂购自American International ChemicalsInc.(Framingham,MA,USA)。未修饰的或5’-氨基-修饰的镜像异构适体的合成始于L-核糖A、L-核糖C、L-核糖G、L-核糖U、L-2’脱氧A、L-2’脱氧C、L-2’脱氧G或L-2’脱氧T修饰的CPG孔径
Figure BDA00003620129700792
(Link Technology,Glasgow,UK。为了偶联RNA和DNA亚磷酰胺(每循环15分钟)，使用0.3M的乙腈中的苄基硫代四唑(benzylthiotetrazole)(CMS-Chemicals,Abingdon,UK)和2个当量的各自0.2M的乙腈中的亚磷酰胺溶液。使用氧化加帽循环。用于寡核苷酸合成的其它标准溶剂和试剂购自Biosolve(Valkenswaard,NL)。在DMT-ON上合成镜像异构适体；在去保护后，使用Source15RPC介质(Amersham)通过制备型RP-HPLC(Wincott等人,1995)将其纯化。利用80%乙酸(在RT下进行30分钟)除去5’DMT-基团。在5’氨基修饰的镜像异构适体的情况下，利用80%乙酸(在RT下进行90分钟)除去5’MMT-基团。随后，添加2M NaOAc水溶液，使用5K再生纤维素膜(Millipore,Bedford,MA)通过正切流动过滤使镜像异构适体脱盐。
镜像异构适体的PEG化
为了延长镜像异构适体的体内血浆驻留时间，将40kDa的聚乙二醇(PEG)部分共价偶联在镜像异构适体的5’-末端。
为了进行PEG化(关于进行PEG化的方法的技术细节，参见欧洲专利申请EP1306382)，将纯化的5’-氨基修饰的镜像异构适体溶解在H2O(2.5ml)、DMF(5ml)和缓冲液A(5ml；通过将柠檬酸·H2O[7g]、硼酸[3.54g]、磷酸[2.26ml]和1M NaOH[343ml]混合并添加水至1l的终体积制备的；利用1M HCl调整pH=8.4)的混合物中。
利用1M NaOH将镜像异构适体溶液的pH调整至8.4。随后，以6份0.25当量在37℃下每30分钟添加40kDa PEG-NHS酯(Jenkem Technology,Allen,TX,USA)，直至达到75至85%的最大产率。在PEG-NHS酯的添加过程中利用1MNaOH使反应混合物的pH维持在8-8.5。
将反应混合物与4ml尿素溶液(8M)和4ml缓冲液B(0.1M的H2O中的三乙基乙酸铵)混合，加热至95℃进行15分钟。随后使用乙腈梯度(缓冲液B；缓冲液C:0.1M的乙腈中的三乙基乙酸铵)通过利用的Source15RPC介质(Amersham)的RP-HPLC纯化PEG化的镜像异构适体。过量PEG在5%缓冲液C处洗脱，PEG化的镜像异构适体在10-15%的缓冲液C处洗脱。将纯度大于>95%(如通过HPLC评估的)的产物级分组合并且与40ml3M NaOAC混合。利用正切流动过滤(5K再生纤维素膜，Millipore,Bedford MA)使PEG化的镜像异构适体脱盐。
实施例8:Biacore测量法
Biacore测定的设置
将Biacore2000仪(Biacore AB,Sweden)设置至37℃的恒定温度。在开始每一个实验/新芯片的固定之前，使用DESORB法清洁仪器：在停靠维持芯片上后，利用解吸溶液1(0.5%十二烷基硫酸钠，SDS)、解吸溶液2(50mM甘氨酸，pH9.5)和HBS-EP pH7.4缓冲液连续灌注仪器。最后，利用HBS-EP pH7.4缓冲液灌注系统。除非另外指出，否则所有试剂购自GE Healthcare。
靶的固定
对于每一个靶单独地建立靶的固定方法。下文中列出了本文中描述的靶的实例：
生物素化的人L-胰高血糖素的固定
固定缓冲液为HBS-EP pH7.4缓冲液。将合成的生物素化的人L-胰高血糖素(胰高血糖素1-29-AEEAc-AEEAc-生物素，由BACHEM,Switzerland委托合成)固定在羧甲基化的葡聚糖涂覆的传感器芯片(CM5,GE Healthcare)上，所述芯片是使用0.4M EDC(H2O中的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)与0.1MNHS(H2O中的N-羟基琥珀酰亚胺)的1:1混合物通过可溶性中性亲和素(SigmaAldrich,Germany)的共价固定制备的。利用生物素封闭相同传感器芯片上的参照流动池。
人L-C5a的固定
固定缓冲液是HBS-EP pH7.4缓冲液。通过在已使用0.4M EDC(H2O中的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)与0.1M NHS(H2O中的N-羟基琥珀酰亚胺)的1:1混合物活化的羧甲基化葡聚糖涂覆的传感器芯片(CM5,GE Healthcare)上进行胺偶联固定10mM NaOAc pH5.5中的重组人L-C5a(Sigma Aldrich)。
人L-α-CGRP的固定
固定缓冲液是HBS-EP pH7.4缓冲液。通过在已使用0.4M EDC(H2O中的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)与0.1M NHS(H2O中的N-羟基琥珀酰亚胺)的1:1混合物活化的羧甲基化葡聚糖涂覆的传感器芯片(CM5,GE Healthcare)上进行胺偶联固定10mM NaOAc pH5.5中的合成人L-αCGRP(Bachem)。
具有改善的结合亲和力的镜像异构适体衍生物的鉴定
通过在37°的装置温度下以1μM的浓度注射镜像异构适体来进行单个单位置修饰的镜像异构适体衍生物的结合分析和动力学参数评估。在进行总的注射系列之前和之后，以及每10次注射时，由于再生法和/或传感器芯片表面上有限的肽稳定性的原因，进行空白电泳缓冲液和镜像异构适体参照的注射以监测传感器芯片衰变。
从至少5个单独地测量的亲代(所有DNA或所有RNA)镜像异构适体的Kd值计算平均值(平均值±标准差)。测定单种衍生物的Kd值，亲和力的变化显示为相较于亲代分子的平均值为x倍的改善，其中为x倍的改善的值是亲代分子与亲代分子的衍生物KD之商。测定的标准差表示阳性命中的分界点。
利用BIAevaluation3.1.1软件(BIACORE AB,Uppsala,Sweden)和Prism5.0(GraphPad)软件进行数据分析和解离常数(Kd)的计算以计算平均值和标准差。
通过测量详细的结合动力学(注射一系列浓度的各镜像异构适体)来表征显示改善的靶识别方面的结合性质(缔合常数ka)和/或导致总体改善的亲和力(解离常数kd)的镜像异构适体靶复合物稳定性(解离常数kd)的亲代分子的衍生物。
选择的亲代分子的衍生物的详细动力学评估
通过以始于最低浓度的2,000-1,000-500-200-125-62.5-31.3-15.6(2x)-7.8-3.9-1.95-0.98-0.48-0.24-0.12-0nM(于电泳缓冲液中稀释的)的浓度进行一系列镜像异构适体注射来评估动力学参数和解离常数。在所有实验中，使用Kinject命令(Kinject command)在37℃进行分析，确定了在30μl/分钟的流动下240至360秒的缔合时间和240至360秒的解离时间。测定具有双参照，而流动池1(FC1)用作(封闭的)表面对照(每一个镜像异构适体浓度的散装贡献(bulk contribution))并且一系列缓冲液注射(无分析物)测定缓冲液本身的散装贡献。至少一个镜像异构适体浓度被注射2次以在实验过程中监测再生效率和芯片完整性。利用BIAevaluation3.1.1软件(BIACOREAB)进行解离数据分析和常数(Kd)的计算。
导致改善的结合的鉴定的交换位置的组合
最后，组合两个或更多个用于置换的阳性单个位置，再次地研究所得序列的详细的结合动力学。
Biacore测量的结果描述于实施例2至5中。
实施例9:S1P镜像异构适体的竞争性镜像异构适体拉下测定
利用竞争性拉下测定来测定S1P结合镜像异构适体的亲和常数。为了允许利用T4多核苷酸激酶放射性标记镜像异构适体，将以D-构型存在的两个鸟苷残基添加至L-S1P-215-F9-002镜像异构适体的5’-末端。随后测试未标记的镜像异构适体与300-600pM放射性标记的镜像异构适体L-S1P-215-F9-002-5′diD-G竞争对恒定量的生物素化的D-e-S1P的结合(即减少根据非标记的镜像异构适体对D-e-S1P的结合亲和力的结合信号)的能力。以8nM的浓度使用D-e-S1P，导致在竞争镜像异构适体不存在的情况下约10%的放射性标记的镜像异构适体L-S1P-215-F9-002-5′diD-G的最终结合。在37℃下在250μl选择缓冲液(20mMTris-HCl pH7.4；150mM NaCl；5mM KCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；0.1%[w/vol]Tween-20；4mg/ml牛血清白蛋白；10μg/ml酵母-RNA)进行测定，进行3-4小时。将生物素化的D-e-S1P和镜像异构适体与生物素化的S1P的复合物固定在5μl中性亲和素Ultralink Plus珠粒(Pierce Biotechnology,Rockford,USA)上，在添加至结合反应之前所述珠粒已用选择缓冲液进行了预平衡。将珠粒在恒温混匀器中在37℃下保持悬浮30分钟。在除去上清液和适当的洗涤后，在闪烁计数器中定量固定的放射性。将结合的放射性标记的镜像异构适体L-S1P-215-F9-002-5′diD-G的结合百分比或标准化的百分比对竞争镜像异构适体的相应浓度作图。使用GraphPad Prism软件获得解离常数。将相同的测定形式用于一组不同的镜像异构适体的比较分级。在该情况下，以指定的单个浓度使用竞争镜像异构适体。
实施例10:对胰高血糖素的结合亲和力的测定(拉下测定)
为了进行对胰高血糖素的结合分析，将胰高血糖素结合性核酸分子合成为由L-核苷酸组成的镜像异构适体。利用由L-氨基酸组成的生物素化的人L-胰高血糖素进行spieglmer的结合分析。
直接拉下测定
镜像异构适体的5’-末端上以D-构型存在的两个额外的腺苷残基使得能够使用[γ-32P]-标记的ATP(Hartmann Analytic,Braunschweig,Germany)通过T4多核苷酸激酶(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)进行5’-磷酸标记。标记的核酸的比放射活性为200,000-800,000cpm/pmol。在变性和复性(1’94℃，冰/H2O)后，将标记的核酸以100-700pM的浓度在37℃于选择缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.4；137mM NaCl；5mM KCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；0.1%[w/vol]Tween-20；0.1%[w/vol]CHAPS)分别与不同量的生物素化的人D-或L-胰高血糖素一起孵育2-6小时，以在低浓度下达到平衡。选择缓冲液补充有100μg/ml人血清白蛋白(Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany)和10μg/ml酵母RNA(Ambion,Austin,USA)以防止结合伴侣至使用的塑料器具或至固定基质的非特异性吸附。将用于镜像异构适体结合的生物素化的L-胰高血糖素的浓度范围设置为0.32nM至5μM；总反应体积是50μl。将生物素化的胰高血糖素和核酸与生物素化的胰高血糖素的复合物固定在4μl高容量中性亲和素琼脂糖颗粒(Thermo Scientific,Rockford,USA)上，所述颗粒已用选择缓冲液进行了预平衡。将颗粒在恒温混匀器中在各自温度下保持悬浮20分钟。在除去上清液和进行适当洗涤后，在闪烁计数器中定量固定的放射性。将结合的百分比对生物素化的胰高血糖素的浓度作图，通过使用软件算法(GRAFIT；Erithacus Software；Surrey U.K.)，假定1:1的化学计量，获得解离常数。
用于胰高血糖素结合核酸的评级的竞争性下接测定
为了比较不同镜像异构适体对胰高血糖素的结合，进行竞争性分级测定。为了该目的，放射性标记(参见上文)可获得的最仿射(affine)镜像异构适体，将其分别用作胰高血糖素结合镜像异构适体的参照。在变性和复性后，在于1.5μl高容量中性亲和素琼脂糖颗粒(Thermo Scientific,Rockford,USA)上固定和在无竞争的情况下洗涤后导致约5-10%的对生物素化的胰高血糖素的结合的条件下，将标记的核酸与生物素化的胰高血糖素在50或100μl选择培养基中于37℃进行孵育。将不同的浓度的过量的变性和复性非标记镜像异构适体变体与标记参照镜像异构适体一起添加至平行结合反应。将浓度为1、10和100nM的浓度的变性和复性非标记镜像异构适体衍生物与参照镜像异构适体一起用于平行结合反应。待测试的核酸与参照核酸竞争靶结合，从而减少依赖于它们的结合特征的结合信号。在该测定中被发现最活跃的适体或镜像异构适体随后分别可用作其它胰高血糖素结合核酸分子的比较分析的新参照。
用于测定亲和力的竞争性拉下测定
为了进行比较分级实验，也可进行竞争性拉下测定来测定胰高血糖素结合核酸的亲和常数。为此目的，放射性标记L-胰高血糖素结合镜像异构适体，将其用作上述参照。在变性和复性后，将标记的参照核酸和一组范围为例如0.128至2000nM的竞争分子的5倍稀释物与恒定量的生物素化的胰高血糖素在0.1或0.2ml的选择缓冲液中在37℃孵育2-4小时。选择的蛋白质浓度应当在最低竞争剂浓度下引起约5-10%的放射性标记的参照分子的最终结合。为了测量衍生物核酸序列的结合常数，将过量的适当的变性和复性非标记镜像异构适体变体用作竞争剂，然而测试未修饰的以及PEG化的形式的镜像异构适体。在另一个测定方法中，不同浓度的非生物素化的胰高血糖素与生物素化的胰高血糖素竞争镜像异构适体结合。在将生物素化的胰高血糖素和结合的核酸固定在1.5μl高容量中性亲和素琼脂糖基质上、洗涤和闪烁计数(参见上文)后，将结合的放射性标记的镜像异构适体的标准化百分比对相应的竞争分子的浓度作图。使用GraFit软件计算所得的解离常数。
实施例11：S1P-结合镜像异构适体对由S1P经由EDG1受体诱导的β-抑制 蛋白募集的抑制
将PathHunterTM eXpress EDG-1CHO-K1β-抑制蛋白GPCR细胞(DiscoverX)以1x104个细胞/孔接种在白色96孔平底板(Greiner)中，在37℃和5%CO2下于100μl培养基(DiscoverX)中培养48小时。将刺激溶液(D-e-S1P+不同浓度的镜像异构适体)制备为补充有1mg/ml BSA和20mM HEPES的HBSS(Gibco)中的11X浓缩液，将其充分混合，在37℃下孵育30分钟。每孔(一式三份)添加10μl刺激溶液，将细胞在37℃和5%CO2下孵育90分钟。
在利用D-e-S1P激活受体后，激活的EDG1与β-抑制蛋白的相互作用导致β-半乳糖苷酶的酶片段互补。
为了定量β-半乳糖苷酶活性，添加55μl工作检测试剂溶液(DiscoverX)，将所述溶液在室温下孵育90分钟。随后在Fluostar Optima multidetection板读数器(BMG)中测量发光。
为了显示抗-S1P-镜像异构适体的效能，利用用不同量的镜像异构适体预孵育的10nM D-e-S1P或D-e-S1P刺激细胞。结果显示针对在未添加镜像异构适体的情况下获得的信号标准化的发光信号的百分比。显示了一式三份培养物的平均值±SD。
实施例12:人神经母细胞瘤细胞中αCGRP-诱导的cAMP产生的抑制
如下分析CGRP-结合镜像异构适体的生物效能。
将SK-N-MC人神经母细胞瘤细胞(DSMZ,Braunschweig)以5x10e4个细胞/孔接种在平底96孔板(Greiner)中，在37℃和5%CO2下于100μl的DMEM(1000mg/L葡萄糖,Invitrogen)(补充有10%热灭活胎牛血清(FCS)、4mML-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GLUTAMAX)、50个单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素)中培养48小时。
使用v形底的0.2ml薄断面96孔板，以一式三份于HBSS(Gibco)(补充有1mg/ml BSA和20mM HEPES)中制备刺激溶液(1nM人或大鼠L-αCGRP(Bachem)+浓度递增的镜像异构适体)，在37℃下孵育总共60分钟。以一式三份包括空白试验值(无L-αCGRP，无镜像异构适体)和对照值(1nML-αCGRP，无镜像异构适体)。在刺激前20分钟，将1mM磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX,Sigma；于HBSS/BSA/HEPES中稀释的DMSO中的50mM原液)添加至细胞和刺激溶液中。为了进行刺激，从细胞除去细胞培养基，利用100μl预孵育的刺激溶液替代所述培养基。在37℃、5%CO2下刺激细胞30分钟。在除去刺激溶液后，通过添加50μl/孔测定/裂解缓冲液(AppliedBiosystems,Tropix cAMP-ScreenTM System kit)在37℃进行30分钟来裂解细胞。
随后按照制造商的说明书，使用Tropix cAMP-ScreenTM ELISA System试剂盒(Applied Biosystems)测量每孔产生的cAMP的量。简而言之，在测定/裂解缓冲液中制备范围为6nmol至0.6pmol cAMP/孔的标准曲线。将在测定/裂解缓冲液中稀释的细胞裂解物和标准曲线添加至利用山羊抗-兔IgG预涂覆的微量培养板。将cAMP碱性磷酸酶缀合物和抗-cAMP抗体添加至样品，在室温下孵育60分钟。随后，洗涤板，添加化学发光底物。30分钟后，在FLUOstar OPTIMA板读数器单元(BMG Labtech)中测量化学发光。cAMP-ScreenTM ELISA系统是竞争性免疫测定形式。因此，光信号强度与样品或标准制剂中的cAMP水平成反比。
将该系统用于测试本文中描述的实施例1和7的范围内的镜像异构适体。结果示于图7和8。产生的cAMP的量以对照的百分比表示。相对于对照对cAMP的产生进行50%的抑制所需的镜像异构适体的浓度定义了抑制常数IC50。
实施例13:趋化作用测定中抑制浓度的测定
表达C5a的人受体的细胞系的产生
通过用编码人C5a受体(NCBI登录号NM_001736，于pcDNA3.1+中)的质粒转染BA/F3小鼠原B细胞(pro B cell)来产生表达C5a的人受体的稳定转染的细胞系。通过用利用遗传霉素的处理来选择表达C5aR的细胞，利用RT-PCR测试其表达，利用趋化作用测定来测试其功能性。
趋化作用测定
在实验前一天，将细胞以0,3x106/ml接种在新培养瓶中。关于实验，将细胞离心，于HBH(HBSS，包含1mg/ml牛血清白蛋白和20mM HEPES)中洗涤1次，以1.33x106个细胞/ml重悬浮。将75μl的该悬浮液添加至具有5μm孔的96孔Corning Transwell板(Costar Corning,#3388；NY,USA)的上室(uppercompartment)。在下室中，将重组人C5a(SEQ.ID.50)或小鼠C5a(SEQ.ID.54)与235μl HBH中的不同浓度的镜像异构适体一起在37℃下预孵育20至30分钟，随后添加细胞。使细胞在37℃下迁移3小时。随后，取出插入板(上室)，将30μl的磷酸缓冲盐溶液中的440μM刃天青(Sigma,Deisenhofen,Germany)添加至下室。在于37℃下孵育2.5小时后，在544nm的激发波长和590nm的发射波长下测量荧光。
针对本底荧光(孔中无C5a)校正荧光值，将其对镜像异构适体浓度作图。使用GraphPad Prism利用非线性回归(4参数拟合)测定IC50值。或者，将无镜像异构适体(仅C5a)的样品的值设置为100%，将具有镜像异构适体的样品的值计算为该值的百分数。将百分数-值对镜像异构适体浓度作图，如上所述测定IC50-值。
人和小鼠C5a的半最大有效浓度(EC50)的测定
在BA/F3/huC5aR细胞向不同的人C5a或小鼠C5a浓度迁移3小时后，获得人和小鼠C5a的剂量-反应曲线，显示了0.1nM(对于huC5a)和0.3nM(对于mC5a)的半有效浓度(EC50)。为了进行关于镜像异构适体对趋化作用的抑制的实验，使用0.1nM人C5a和0.3nM小鼠C5a。
实施例14:胰高血糖素-结合镜像异构适体对胰高血糖素诱导的cAMP产 生的抑制
通过将编码人胰高血糖素受体(NCBI登录号NM_000160)的序列克隆进入pCR3.1载体(Invitrogen)来产生表达胰高血糖素的人受体的稳定转染的细胞系。利用胰高血糖素受体质粒转染适合于在无血清培养基(UltraCHO,Lonza)中生长的CHO细胞，通过利用遗传霉素的处理选择稳定转染的细胞。
为了进行抑制实验，将表达胰高血糖素受体的CHO细胞以4-6x104/孔的密度涂铺在96孔板(细胞培养物处理的，平底)上，在37℃5%CO2下于UltraCHO培养基(包含100个单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.5mg/ml遗传霉素)中培养过夜。在刺激前20分钟，将3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的溶液添加至1mM的终浓度。
在汉克平衡盐浓度(Hank's balanced salt solution)(HBSS)+1mg/ml BSA中制备刺激溶液(胰高血糖素+不同浓度的镜像异构适体)，将所述溶液在37℃下孵育30分钟。在即将添加至细胞时，将IBMX添加至1mM的终浓度。
为了进行刺激，从细胞除去培养基，添加刺激溶液(胰高血糖素+镜像异构适体)。在于37℃下孵育30分钟后，除去溶液，将细胞在裂解缓冲液中进行裂解，所述裂解缓冲液是cAMP-ScreenTM System试剂盒(Applied Biosystems)的组分。该试剂盒用于按照提供商的说明书测定cAMP含量。
参考文献
如果没有相反的说明，则本文中引用的文献的完整著书目录资料如下，其中所述参考资料的公开内容通过引用并入本文。
Altschul S.F.,Gish W.,et al.(1990)Basic local alignment search tool.J Mol Biol.215(3):403-10.
Altschul S.F.,Madden T.L.,et al.(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST:a newgeneration of protein database search programs.Nucleic Acids Res.25(17):3389-402.
Damha MJ,Ogilvie KK.(1993)Oligoribonucleotide synthesis.Thesilyl-phosphoramidite method.Methods Mol Biol.20:81-114
Klussmann S.(2006).The Aptamer Handbook–Functional Oligonucleotidesand their Applications.Edited by S.Klussmann.WILEY-VCH,Weinheim,Germany,ISBN3-527-31059-2
Kusser W.(2000)Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitroselections:evolving evolution.J Biotechnol74(1):27-38.
Mairal T.,Ozalp V.C.,Lozano Sánchez P.,et al.(2008)Aptamers:molecular toolsfor analytical applications.Anal Bioanal Chem.390(4):989-1007
McGinnis S.,Madden T.L.et al.(2004)BLAST:at the core of a powerful anddiverse set of sequence analysis tools.Nucleic Acids Res.32(Web Serverissue):W20-5.
Needleman and Wunsch(1970)A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins.J Mol Biol.48(3):443-53.
Pearson and Lipman(1988)Improved tools for biological sequence comparison.Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444
Smith and Waterman(1981),Adv.Appl.Math.2:482
Venkatesan N.,Kim S.J.,et al.(2003)Novel phosphoramidite building blocks insynthesis and applications toward modified oligonucleotides.Curr Med Chem10(19):1973-91
Wincott F,DiRenzo A,et al.(1995).Synthesis,deprotection,analysis andpurification of RNA and ribozymes.Nucleic Acids Res.;23(14):2677-84.
本说明书、权利要求和/或附图中公开的本发明的特征可以(单独地和以其任意组合)是以其各种形式实现本发明的材料。
Figure IDA00003620130200011
Figure IDA00003620130200021
Figure IDA00003620130200031
Figure IDA00003620130200041
Figure IDA00003620130200051
Figure IDA00003620130200061
Figure IDA00003620130200071
Figure IDA00003620130200081
Figure IDA00003620130200091
Figure IDA00003620130200101
Figure IDA00003620130200111
Figure IDA00003620130200121
Figure IDA00003620130200131
Figure IDA00003620130200141
Figure IDA00003620130200161
Figure IDA00003620130200171
Figure IDA00003620130200181
Figure IDA00003620130200191
Figure IDA00003620130200201
Figure IDA00003620130200211
Figure IDA00003620130200221
Figure IDA00003620130200231
Figure IDA00003620130200241
Figure IDA00003620130200261
Figure IDA00003620130200271
Figure IDA00003620130200281
Figure IDA00003620130200291
Figure IDA00003620130200301
Figure IDA00003620130200321
Figure IDA00003620130200331
Figure IDA00003620130200341
Figure IDA00003620130200351
Figure IDA00003620130200361
Figure IDA00003620130200371
Figure IDA00003620130200381
Figure IDA00003620130200391
Figure IDA00003620130200401
Figure IDA00003620130200411
Figure IDA00003620130200421
Figure IDA00003620130200431
Figure IDA00003620130200461
Figure IDA00003620130200481
Figure IDA00003620130200491
Figure IDA00003620130200511
Figure IDA00003620130200521
Figure IDA00003620130200531
Figure IDA00003620130200541
Figure IDA00003620130200551
Figure IDA00003620130200561
Figure IDA00003620130200581
Figure IDA00003620130200591
Figure IDA00003620130200601
Figure IDA00003620130200611
Figure IDA00003620130200621
Figure IDA00003620130200631
Figure IDA00003620130200641
Figure IDA00003620130200651
Figure IDA00003620130200661
Figure IDA00003620130200671
Figure IDA00003620130200681
Figure IDA00003620130200701
Figure IDA00003620130200711
Figure IDA00003620130200721
Figure IDA00003620130200731
Figure IDA00003620130200741
Figure IDA00003620130200751
Figure IDA00003620130200761
Figure IDA00003620130200771
Figure IDA00003620130200781
Figure IDA00003620130200791
Figure IDA00003620130200811
Figure IDA00003620130200821
Figure IDA00003620130200831
Figure IDA00003620130200851
Figure IDA00003620130200861
Figure IDA00003620130200871
Figure IDA00003620130200881
Figure IDA00003620130200901
Figure IDA00003620130200911
Figure IDA00003620130200931
Figure IDA00003620130200941
Figure IDA00003620130200951
Figure IDA00003620130200961
Figure IDA00003620130200981
Figure IDA00003620130201001
Figure IDA00003620130201011
Figure IDA00003620130201031
Figure IDA00003620130201041
Figure IDA00003620130201051
Figure IDA00003620130201061
Figure IDA00003620130201071
Figure IDA00003620130201081
Figure IDA00003620130201091
Figure IDA00003620130201101
Figure IDA00003620130201111
Figure IDA00003620130201121
Figure IDA00003620130201141
Figure IDA00003620130201151
Figure IDA00003620130201161
Figure IDA00003620130201171
Figure IDA00003620130201181
Figure IDA00003620130201191
Figure IDA00003620130201211
Figure IDA00003620130201221
Figure IDA00003620130201231
Figure IDA00003620130201241
Figure IDA00003620130201251
Figure IDA00003620130201271
Figure IDA00003620130201281
Figure IDA00003620130201291
Figure IDA00003620130201311
Figure IDA00003620130201321
Figure IDA00003620130201331
Figure IDA00003620130201351
Figure IDA00003620130201361
Figure IDA00003620130201371
Figure IDA00003620130201381
Figure IDA00003620130201391
Figure IDA00003620130201401
Figure IDA00003620130201431
Figure IDA00003620130201441
Figure IDA00003620130201451
Figure IDA00003620130201491
Figure IDA00003620130201501
Figure IDA00003620130201511
Figure IDA00003620130201521
Figure IDA00003620130201531
Figure IDA00003620130201541
Figure IDA00003620130201551
Figure IDA00003620130201561
Figure IDA00003620130201571
Figure IDA00003620130201591
Figure IDA00003620130201601
Figure IDA00003620130201621
Figure IDA00003620130201631
Figure IDA00003620130201641
Figure IDA00003620130201651
Figure IDA00003620130201661
Figure IDA00003620130201681
Figure IDA00003620130201691
Figure IDA00003620130201701
Figure IDA00003620130201711
Figure IDA00003620130201721
Figure IDA00003620130201731
Figure IDA00003620130201741
Figure IDA00003620130201751
Figure IDA00003620130201761
Figure IDA00003620130201771
Figure IDA00003620130201791
Figure IDA00003620130201801
Figure IDA00003620130201821
Figure IDA00003620130201831
Figure IDA00003620130201841
Figure IDA00003620130201851
Figure IDA00003620130201861
Figure IDA00003620130201871
Figure IDA00003620130201881
Figure IDA00003620130201901
Figure IDA00003620130201911
Figure IDA00003620130201921
Figure IDA00003620130201931
Figure IDA00003620130201941
Figure IDA00003620130201951
Figure IDA00003620130201981
Figure IDA00003620130201991
Figure IDA00003620130202011
Figure IDA00003620130202021
Figure IDA00003620130202031
Figure IDA00003620130202041
Figure IDA00003620130202051
Figure IDA00003620130202061
Figure IDA00003620130202071
Figure IDA00003620130202081
Figure IDA00003620130202091
Figure IDA00003620130202101
Figure IDA00003620130202111
Figure IDA00003620130202121
Figure IDA00003620130202131
Figure IDA00003620130202141
Figure IDA00003620130202151
Figure IDA00003620130202161
Figure IDA00003620130202181
Figure IDA00003620130202211
Figure IDA00003620130202221
Figure IDA00003620130202231
Figure IDA00003620130202241
Figure IDA00003620130202251
Figure IDA00003620130202261
Figure IDA00003620130202271
Figure IDA00003620130202291
Figure IDA00003620130202321
Figure IDA00003620130202331
Figure IDA00003620130202341
Figure IDA00003620130202351
Figure IDA00003620130202361
Figure IDA00003620130202371

Claims (97)

1.一种用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法，其包括下列步骤：
a)提供参照核酸分子，其中所述参照核酸分子能够结合所述靶分子并且其中所述参照核酸分子包含核苷酸的序列，其中所述核苷酸的序列包含n个核苷酸；
b)制备所述参照核酸分子的第一水平衍生物，其中所述参照核酸分子的第一水平衍生物与所述参照核酸分子相异在于一个核苷酸位置，其中如果所述参照核酸分子在所述核苷酸位置上具有核糖核苷酸，则所述第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且其中如果所述参照核酸在所述核苷酸位置上具有2’-脱氧核糖核苷酸，则所述第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代所述一个位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且其中在其上进行替代的核苷酸位置是修饰核苷酸位置；和
c)对于所述参照核酸分子的每一个核苷酸位置重复步骤b)，从而制备一组所述参照核酸分子的第一水平衍生物，其中所述参照核酸分子的第一水平衍生物的组由n种第一水平衍生物组成，其中所述参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种与所述参照核酸分子相异在于单个核苷酸置换，并且其中所述参照核酸分子的第一水平衍生物的每一种具有单个修饰核苷酸位置，所述单个修饰核苷酸位置与所述参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其它第一水平衍生物的所有单个修饰核苷酸位置的单个修饰核苷酸不同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括步骤d)和任选地步骤e)：
d)测定所述参照核酸的n种第一水平衍生物的每一种对于所述靶分子的结合特征；和任选地
e)鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第一水平衍生物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述结合特征是所述参照核酸分子的第一水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
4.根据权利要求2至3中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力表达为KD值。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是Y，Y是(所述参照核酸分子的结合亲和力)/(所述第一水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是X，X是(所述参照核酸分子的KD值)/(所述第一水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选≥5或X≥10。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中
如果在步骤b)中所述第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5-磷酸；
(b)如果核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’磷酸；以及
(d)如果核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸，则2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧尿苷-5’-磷酸或胸苷-5-磷酸；
以及
如果在步骤b)中所述第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸；
(b)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’磷酸，则所述核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’磷酸，则所述核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸或5-甲基-尿苷-5’-磷酸。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中
如果在步骤b)中所述第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果所述核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸；
(b)如果所述核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果所述核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果所述核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧尿苷-5’-磷酸；
以及
如果在步骤b)中所述第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来进行制备，并且
(a)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸；
(b)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是5-甲基-尿苷-5’磷酸。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述参照核酸是核糖核酸分子并且其中在步骤b)中，所述第一水平衍生物通过利用2’-脱氧核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的核糖核苷酸来进行制备，并且其中如果
(a)所述核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸；
(b)所述核糖核苷酸是鸟苷5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸；
(c)所述核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸；
(d)所述核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸，则所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧尿苷-5’磷酸或胸苷-5’磷酸。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述参照核酸是2’-脱氧核糖核酸分子并且其中在步骤b)中，所述第一水平衍生物通过利用核糖核苷酸替代所述一个核苷酸位置上的2’-脱氧核糖核苷酸来制备，并且其中如果
(a)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧腺苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是腺苷-5’-磷酸；
(b)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧鸟苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是鸟苷-5’-磷酸；
(c)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是2’-脱氧胞苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是胞苷-5’-磷酸；以及
(d)如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’磷酸，则所述核糖核苷酸是尿苷-5’-磷酸或5-甲基-尿苷5’-磷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中如果所述2’-脱氧核糖核苷酸是胸苷-5’-磷酸，则所述核糖核苷酸是5-甲基-尿苷-5’-磷酸。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法是用于产生能够结合靶分子的核酸分子的方法，其中所述核酸分子的结合亲和力相较于所述参照核酸分子对于所述靶分子的结合亲和力增加或与其相同。
13.根据权利要求2至12中任一项所述的方法，其中其结合特征超过预定阈值的所述第一水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的方法，其中制备所述参照核酸分子的第二水平衍生物，其中所述第二水平衍生物与所述参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置和第二核苷酸位置，
其中所述第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第一核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中所述第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第二核苷酸位置上的核苷酸与所述参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物和所述第二第一水平衍生物是两种第一水平衍生物的任意组合，其中所述两种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物和所述第二水平衍生物是两种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述参照核酸分子的第二水平衍生物能够结合所述靶分子。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
-测定所述参照核酸分子的第二水平衍生物对所述靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第二水平衍生物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述结合特征是所述参照核酸分子的第二水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力表达为KD值。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是Y，Y为(所述参照核酸分子的结合亲和力)/(所述第二水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是X，X为(所述参照核酸分子的KD值)/(所述第二水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的方法，其中其结合特征超过预定阈值的第二水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
24.根据权利要求2至23中任一项所述的方法，其中制备所述参照核酸分子的第三水平衍生物，其中所述第三水平衍生物与所述参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置和第三核苷酸位置，
其中所述第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第一核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第二核苷酸位置上的核苷酸与所述参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第三核苷酸位置上的核苷酸与所述参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物和所述第三第一水平衍生物是3种第一水平衍生物的任意组合，其中所述3种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
26.根据权利要求24至25中任一项所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物和所述第三第一水平衍生物是3种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述参照核酸分子的第三水平衍生物能够结合所述靶分子。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
-测定所述参照核酸分子的第三水平衍生物对所述靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第三水平衍生物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述结合特征是所述参照核酸分子的第三水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
30.根据权利要求28至29中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力表达为KD值。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是Y，Y为(所述参照核酸分子的结合亲和力)/(所述第三水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是X，X为(所述参照核酸分子的KD值)/(所述第三水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
33.根据权利要求24至32中任一项所述的方法，其中其结合特征超过预定阈值的第三水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
34.根据权利要求2至33中任一项所述的方法，其中制备所述参照核酸分子的第四水平衍生物，其中所述第四水平衍生物与所述参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置和第四核苷酸位置，
其中所述第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第一核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第二核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第三核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中所述第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第四核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物和所述第四第一水平衍生物是4种第一水平衍生物的任意组合，其中所述4种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
36.根据权利要求34至35中任一项所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物和所述第四第一水平衍生物是4种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述参照核酸分子的第四水平衍生物能够结合所述靶分子。
38.根据权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
-测定所述参照核酸分子的第四水平衍生物对所述靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第四水平衍生物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述结合特征是所述参照核酸分子的第四水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
40.根据权利要求38至39中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力表达为KD值。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是Y，Y为(所述参照核酸分子的结合亲和力)/(所述第四水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是X，X为(所述参照核酸分子的KD值)/(所述第一水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法，其中其结合特征超过预定阈值的第四水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
44.根据权利要求2至43中任一项所述的方法，其中制备所述参照核酸分子的第五水平衍生物，其中所述第五水平衍生物与所述参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置、第四核苷酸位置和第五核苷酸位置，
其中所述第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第一核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第二核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第三核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第四核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中所述第五核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第五第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第五核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物、所述第四第一水平衍生物和所述第五第一水平衍生物是5种第一水平衍生物的任意组合，其中所述5种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
46.根据权利要求44至45中任一项所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物、所述第四第一水平衍生物和所述第五第一水平衍生物是5种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法，其中所述参照核酸分子的第五水平衍生物能够结合所述靶分子。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
-测定所述参照核酸分子的第五水平衍生物对所述靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第五水平衍生物。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述结合特征是所述参照核酸分子的第五水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
50.根据权利要求48至49中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力表达为KD值。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是Y，Y为(所述参照核酸分子的结合亲和力)/(所述第五水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是X，X为(所述参照核酸分子的KD值)/(所述第五水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
53.根据权利要求44至52中任一项所述的方法，其中其结合特征超过预定阈值的第五水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
54.根据权利要求2至53中任一项所述的方法，其中制备所述参照核酸分子的第六水平衍生物，其中所述第六水平衍生物与所述参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置、第四核苷酸位置、第五核苷酸位置和第六核苷酸位置，
其中所述第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第一核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第二核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第三核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第四核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第五核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第五第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第五核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中所述第六核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第六第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第六核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物、所述第四第一水平衍生物、所述第五第一水平衍生物和所述第六第一水平衍生物是6种第一水平衍生物的任意组合，其中所述6种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
56.根据权利要求54至55中任一项所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物、所述第四第一水平衍生物、所述第五第一水平衍生物和所述第六第一水平衍生物是6种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述参照核酸分子的第六水平衍生物能够结合所述靶分子。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
-测定所述参照核酸分子的第六水平衍生物对所述靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第六水平衍生物。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述结合特征是所述参照核酸分子的第六水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
60.根据权利要求58至59中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力表达为KD值。
61.根据权利要求58至60中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是Y，Y为(所述参照核酸分子的结合亲和力)/(所述第六水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是X，X为(所述参照核酸分子的KD值)/(所述第六水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
63.根据权利要求54至62中任一项所述的方法，其中其结合特征超过预定阈值的第六水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
64.根据权利要求2至63中任一项所述的方法，其中制备所述参照核酸分子的第七水平衍生物，其中所述第七水平衍生物与所述参照核酸分子相异在于至少第一核苷酸位置、第二核苷酸位置、第三核苷酸位置、第四核苷酸位置、第五核苷酸位置、第六核苷酸位置和第七核苷酸位置，
其中所述第一核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第一核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第一第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第二核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第二第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第二核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第二第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第三核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第三第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第三第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第三核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第三水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第四核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第四第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第四核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第四第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第五核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第五第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第五核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第五第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，
其中所述第六核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第六第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第六核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第六第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同，以及
其中所述第七核苷酸位置是来自由n种衍生物组成的参照核酸分子的衍生物的组的参照核酸分子的第七第一水平衍生物的修饰核苷酸位置，并且其中所述第七第一水平衍生物是其结合特征超过预定阈值的衍生物，并且其中所述第六核苷酸位置的核苷酸与所述参照核酸分子的第七第一水平衍生物的修饰位置上的核苷酸相同。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物、所述第四第一水平衍生物、所述第五第一水平衍生物、所述第六第一水平衍生物和所述第七第一水平衍生物是7种第一水平衍生物的任意组合，其中所述7种第一水平衍生物的每一种的结合特征超过预定阈值。
66.根据权利要求64至65中任一项所述的方法，其中所述第一第一水平衍生物、所述第二第一水平衍生物、所述第三第一水平衍生物、所述第四第一水平衍生物、所述第五第一水平衍生物、所述第六第一水平衍生物和所述第七第一水平衍生物是7种具有优于由n个核苷酸组成的参照核酸分子的第一水平衍生物的组的其余第一水平衍生物的结合特征的第一水平衍生物。
67.根据权利要求64至66中任一项所述的方法，其中所述参照核酸分子的第七水平衍生物能够结合所述靶分子。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
-测定所述参照核酸分子的第七水平衍生物对所述靶分子的结合特征；和任选地
-鉴定其结合特征超过预定阈值的所述参照核酸分子的所述/那些第七水平衍生物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述结合特征是所述参照核酸分子的第七水平衍生物对所述靶分子的结合亲和力。
70.根据权利要求68至69中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力表达为KD值。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是Y，Y为(所述参照核酸分子的结合亲和力)/(所述第七水平衍生物的结合亲和力)的商，并且其中Y>1，更优选Y≥2，以及最优选Y≥5或Y≥10或Y≥20。
72.根据权利要求68至71中任一项所述的方法，其中所述预定阈值是X，X为(所述参照核酸分子的KD值)/(所述第七水平衍生物的KD值)的商，并且其中X>1，更优选X≥2，以及最优选X≥5或X≥10或X≥20。
73.根据权利要求64至72中任一项所述的方法，其中其结合特征超过预定阈值的第七水平衍生物是能够结合靶分子的核酸分子或能够结合所述靶分子的所述核酸分子。
74.根据权利要求1至73中任一项所述的方法，其中能够结合靶分子的所述核酸是L-核酸，所述参照核酸分子是L-核酸并且所述参照核酸分子的衍生物的每一种和任一种是L-核酸。
75.一种能够结合靶分子的核酸分子，其可通过根据权利要求1至74中任一项所述的方法获得。
76.根据权利要求75所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含至少一个修饰。
77.根据权利要求75至76中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子用于用于治疗和/或预防疾病的方法。
78.根据权利要求75至76中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子用于用于诊断疾病的方法。
79.根据权利要求77至78中任一项所述的核酸分子，其中所述疾病是牵涉所述靶分子的疾病。
80.根据权利要求75至76中任一项所述的核酸分子的用途，其用于制造用于治疗疾病的药剂。
81.根据权利要求75至76中任一项所述的核酸分子的用途，其用于制造用于治疗疾病的诊断试剂。
82.根据权利要求80至81中任一项所述的用途，其中所述疾病是牵涉所述靶分子的疾病。
83.一种药物组合物，其包含根据权利要求75至76中任一项所述的核酸分子和药学上可接受的载体。
84.一种能够结合靶分子的核酸分子，
其中所述核酸分子具有对于所述靶分子的结合亲和力，
其中所述核酸分子对于所述靶分子的结合亲和力相较于参照核酸分子对于所述靶分子结合亲和力增加或与其相同，
其中
c)所述核酸分子包含核苷酸的序列并且所述参照核酸分子包含核苷酸的序列，或
d)所述核酸分子包含核苷酸的序列和至少一个修饰基团并且所述参照核酸分子包含核苷酸的序列和所述至少一个修饰基团,
其中所述核酸分子的核苷酸的序列与所述参照核酸分子的核苷酸的序列在核苷酸的核碱基部分方面至少部分相同但在核苷酸的糖部分方面不同，
其中所述核酸分子的核苷酸的序列由核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸组成，并且其中所述参照核酸分子的核苷酸的序列由核糖核苷酸或2’-脱氧核糖核苷酸组成。
85.根据权利要求84所述的核酸分子，其中
a)所述核酸分子由核苷酸的序列组成并且所述参照核酸分子由核苷酸的序列组成，或
b)所述核酸分子由核苷酸的序列和至少一个修饰基团组成并且所述参照核酸分子由核苷酸的序列和所述至少一个修饰基团组成，
其中所述核酸分子的核苷酸的序列与所述参照核酸分子的核苷酸的序列在核苷酸的核碱基部分方面相同但在核苷酸的糖部分方面不同。
86.根据权利要求85所述的核酸分子，其中所述核酸分子对于所述靶分子的结合亲和力相较于参照核酸分子对于所述靶分子的结合亲和力增加。
87.根据权利要求75至86中任一项所述的核酸分子，其中所述核糖核苷酸是L-核糖核苷酸并且其中所述2’-脱氧核糖核苷酸是L-2’-脱氧核糖核苷酸。
88.根据权利要求75至87中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是L-核酸分子，其中所述L-核酸分子由L-核苷酸组成，并且所述参照核酸分子是L-参照核酸分子，其中所述L-参照核酸分子由L-核苷酸组成。
89.根据权利要求75至88中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子和/或所述参照核酸分子是通过所述靶分子介导的活性的拮抗剂。
90.根据权利要求75至89中任一项所述的核酸分子，其中包含核苷酸的序列和至少一个修饰基团的核酸分子从生物体的排泄速率相较于由核苷酸的序列组成的核酸分子减小。
91.根据权利要求75至89中任一项所述的核酸分子，其中包含核苷酸的序列和至少一个修饰的核酸分子相较于由核苷酸的序列组成的核酸分子在生物体中具有增加的驻留时间。
92.根据权利要求90和91中任一项所述的核酸分子，其中所述修饰基团选自包含生物可降解的和非生物可降解的修饰的基团，优选所述修饰基团选自聚乙二醇、线性聚乙二醇、分枝聚乙二醇、羟乙基淀粉、肽、蛋白质、多糖、固醇、聚环氧丙烷醚、聚乙二酰胺和聚(2-羟乙基)-L-谷氨酰胺的基团。
93.根据权利要求92所述的核酸分子，其中所述修饰基团是聚乙二醇，优选由线性聚乙二醇或分枝聚乙二醇组成，其中所述聚乙二醇的分子量优选为约20,000至约120,000Da，更优选约30,000至约80,000Da以及最优选约40,000Da。
94.根据权利要求92所述的核酸分子，其中所述修饰基团是羟乙基淀粉，其中优选所述羟乙基淀粉的分子量为约50至约1000kDa，更优选约100至约700kDa以及最优选约200至500kDa。
95.根据权利要求90至94中任一项所述的核酸分子，其中所述生物体是动物或人体，优选人体。
96.根据权利要求84至95中任一项所述的核酸分子，其用于用于治疗和/或预防疾病的方法。
97.根据权利要求75至96中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子和所述参照核酸分子抗核酸酶活性。
CN201280007720XA 2011-01-10 2012-01-10 具有对于靶分子的结合亲和力的核酸分子及产生所述核酸分子的方法 Pending CN103339258A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11000117 2011-01-10
EP11000117.9 2011-01-10
PCT/EP2011/002068 WO2011131371A1 (en) 2010-04-21 2011-04-21 Lipid binding nucleic acids
EPPCT/EP2011/002068 2011-04-21
EP11008467.0 2011-10-21
EP11008467 2011-10-21
PCT/EP2012/000089 WO2012095303A1 (en) 2011-01-10 2012-01-10 Nucleic acid molecule having binding affinity to a target molecule and a method for generating the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN103339258A true CN103339258A (zh) 2013-10-02

Family

ID=45464586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280007720XA Pending CN103339258A (zh) 2011-01-10 2012-01-10 具有对于靶分子的结合亲和力的核酸分子及产生所述核酸分子的方法

Country Status (8)

Country Link
US (2) US9976145B2 (zh)
EP (1) EP2663640B1 (zh)
JP (2) JP2014504865A (zh)
KR (2) KR102080142B1 (zh)
CN (1) CN103339258A (zh)
AU (1) AU2012206750A1 (zh)
CA (1) CA2824073A1 (zh)
WO (1) WO2012095303A1 (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201401362TA (en) * 2011-10-21 2014-05-29 Noxxon Pharma Ag Glucagon binding nucleic acids
MX362061B (es) 2012-01-10 2019-01-07 Noxxon Pharma Ag Ácidos nucleicos de enlace c5a nuevos.
WO2013104539A1 (en) * 2012-01-10 2013-07-18 Noxxon Pharma Ag Nucleic acids specifically binding cgrp
JP7140848B2 (ja) 2018-05-17 2022-09-21 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 毛髪被覆率分析のためのシステム及び方法
US11172873B2 (en) 2018-05-17 2021-11-16 The Procter & Gamble Company Systems and methods for hair analysis
EP3814504A1 (en) 2018-06-29 2021-05-05 The Procter & Gamble Company Aptamers for personal care applications
US11806419B2 (en) 2019-04-16 2023-11-07 The Procter & Gamble Company Aptamers for odor control applications
EP4306640A1 (en) 2022-06-21 2024-01-17 TME Pharma AG Method for treating a tumor in a subject
WO2023247651A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 TME Pharma AG Methods for treating a tumor in a subject

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010014572A2 (en) * 2008-07-28 2010-02-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of toll-like receptor 9 expression by antisense oligonucleotides

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2763958B2 (ja) 1990-06-11 1998-06-11 ネクスター ファーマスーティカルズ，インコーポレイテッド 核酸リガンド
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
ATE228529T1 (de) 1996-08-30 2002-12-15 Jens Peter Fuerste Spiegelselektion und spiegelevolution von nucleinsäuren
US6395029B1 (en) 1999-01-19 2002-05-28 The Children's Hospital Of Philadelphia Sustained delivery of polyionic bioactive agents
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
DE60140863D1 (de) 2001-06-10 2010-02-04 Noxxon Pharma Ag Verwendung von L-Polynukleotiden zur diagnostischen Bilderzeugung
EP1306382A1 (de) 2001-10-26 2003-05-02 Noxxon Pharma AG Modifizierte L-Nukleinsäure
JP4713082B2 (ja) 2001-10-26 2011-06-29 ノクゾン ファルマ アーゲー 修飾ｌ−核酸
AU2003219796A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Beth Israel Deaconess Medical Center Conjugates comprising a biodegradable polymer and uses therefor
AU2004230927B9 (en) 2003-04-13 2011-12-01 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric oligonucleotide prodrugs
GB0314472D0 (en) 2003-06-20 2003-07-23 Warwick Effect Polymers Ltd Polymer
JP4823067B2 (ja) 2003-11-10 2011-11-24 ノクソン・フアルマ・アクチエンゲゼルシヤフト 生物活性グレリンに特異的に結合する核酸
EP1713509A2 (de) 2004-02-09 2006-10-25 Noxxon Pharma AG Verfahren zur herstellung von konjugaten aus polysacchariden und polynukleotiden
US8377917B2 (en) 2004-03-23 2013-02-19 Complex Biosystems Gmbh Polymeric prodrug with a self-immolative linker
US7579450B2 (en) 2004-04-26 2009-08-25 Archemix Corp. Nucleic acid ligands specific to immunoglobulin E and their use as atopic disease therapeutics
JP5107716B2 (ja) 2004-11-05 2012-12-26 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア 分子治療用生分解性リンカー
JP5665272B2 (ja) 2005-10-07 2015-02-04 スピーデクス ピーティーワイ リミテッド 多成分核酸酵素およびそれらの使用方法
US20120101267A1 (en) 2005-10-07 2012-04-26 Alison Velyian Todd Multicomponent nucleic acid enzymes with cleavage, ligase or other activity and methods for their use
JP2010503707A (ja) 2006-09-15 2010-02-04 エンゾン ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドの送達を目的としたヒンダードエステル系生体分解性リンカー
AU2008235256B2 (en) 2007-04-05 2014-05-15 Speedx Pty Ltd Nucleic acid enzymes and complexes and methods for their use
WO2008134077A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-06 Archemix Corp. Metabolic profile directed aptamer medicinal chemistry
WO2011131371A1 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Noxxon Pharma Ag Lipid binding nucleic acids

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010014572A2 (en) * 2008-07-28 2010-02-04 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of toll-like receptor 9 expression by antisense oligonucleotides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRUCE E. EATON,ET AL: "Post-SELEX Combinatorial Optimization of Aptamers", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *
ELOY BERNAL-ME´NDEZ AND CHRISTIAN J. LEUMANN: "Conformational Diversity Versus Nucleic Acid Triplex Stability, a Combinatorial Study", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
GRANT R. ZIMMERMANN,ET AL: "Molecular interactions and metal binding in the theophylline-binding core of an RNA aptamer", 《RNA》 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012206750A1 (en) 2013-07-18
JP2014504865A (ja) 2014-02-27
US20190367921A1 (en) 2019-12-05
EP2663640A1 (en) 2013-11-20
US9976145B2 (en) 2018-05-22
KR20140026357A (ko) 2014-03-05
EP2663640B1 (en) 2020-11-04
WO2012095303A1 (en) 2012-07-19
KR20190067260A (ko) 2019-06-14
KR102080142B1 (ko) 2020-02-21
CA2824073A1 (en) 2012-07-19
JP2017148055A (ja) 2017-08-31
US20140350088A1 (en) 2014-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103339258A (zh) 具有对于靶分子的结合亲和力的核酸分子及产生所述核酸分子的方法
CN101189337B (zh) 生长素释放肽结合核酸
RU2633510C2 (ru) Аптамер против ngf и его применение
US20100062436A1 (en) Methods for Detection of a Single- or Double-Stranded Nucleic Acid Molecule
WO2005062937A2 (en) Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna
US20160130581A1 (en) Targeting domain and related signal activated molecular delivery
US20110257251A1 (en) Telomerase inhibitors and methods of use thereof
CN101809154A (zh) C5a结合核酸
CN104136612A (zh) 特异性结合cgrp的核酸
CN103958682A (zh) 结合胰高血糖素的核酸
Cheng et al. Oligodeoxyribonucleotide length and sequence effects on intramolecular and intermolecular G-quartet formation
US11479772B2 (en) Thiomorpholino oligonucleotides for the treatment of muscular dystrophy
US7750140B2 (en) Ghrelin binding nucleic acids
EP3065744B1 (en) A ccl2 antagonist for use in treating proteinuria
ES2368041T3 (es) Ácidos nucleicos de unión a ghrelina.
BOIZIAU et al. Identification of aptamers against the DNA template for in vitro transcription of the HIV-1 TAR element
US20230193266A1 (en) Thiomorpholino Oligonucleotides For The Treatment of Muscular Dystrophy
WO2015075622A1 (en) Aptamers against the myelin basic protein as neuroprotective agents
Manimala SELEX: a tool to study the sequence specific molecular recognition of single stranded nucleic acids
DE10116829A1 (de) Neuropeptid bindende Nukleinsäuren

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20131002

RJ01 Rejection of invention patent application after publication