KR20190067260A - 목표 분자에 결합력을 갖는 ｌ-형 핵산 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 비교용 핵산 분자를 제공하는 제 1단계{여기에서, 상기 비교용 핵산 분자는 목표 분자와 결합 가능하고 상기 비교용 핵산 분자는 n개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함함}; (b) 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체를 준비하는 제 2단계{여기에서 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체는 1개의 뉴클레오티드 위치가 상기 비교용 핵산 분자와 상이하고, 상기 제 1급 유도체는 상기 비교용 핵산이 상기 뉴클레오티드 위치에서 리보뉴클레오티드를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서의 리보뉴클레오티드를 2’-데옥시리보뉴클레오티드로 치환시켜 제조하고, 상기 비교용 핵산이 상기 뉴클레오티드 위치에서 데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드로 치환시켜 제조하고, 상기 치환이 이루어지는 뉴클레오티드 위치는 변형된 뉴클레오티드 위치임); 및 (c) 상기 비교용 핵산 분자의 개개 뉴클레오티드 위치에서 상기 (b) 단계를 반복하여 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군을 제조하는 제 3단계 {상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군은 n 개의 제 1급 유도체들로 구성되고, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군의 각각은 단일의 뉴클레오티드 치환에 의하여 비교용 핵산 분자와는 상이하며, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 각각은, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군의 기타 다른 제 1차 유도체들의 모든 단일 변형 뉴클레오티드 위치들 중에 1개의 변형된 뉴클레오티드가 상이한 단일의 변형된 뉴클레오티드 위치를 갖음}를 포함하는, 목표 분자에 결합 가능한 핵산 분자를 제조하는 제조방법에 관한 것이다.

Description

목표 분자에 결합력을 갖는 Ｌ-형 핵산 및 이를 제조하는 방법 {L-Nucleic acid molecule having binding affinity to a target molecule and a method for generating the same}
본 발명은 목표 분자 (target molecule)에 결합가능한 핵산 분자(nucleic acid molecule)을 제조하는 제조방법, 상기 제조방법으로 제조 가능한 핵산, 상기 핵산의 용도(use), 및 목표 분자 (target molecule)에 결합가능한 핵산 분자(상기 핵산은 비교용 핵산 분자 (reference nucleic acid molecule)와 비교시에 목표 분자에 대하여 보다 증가되거나 또는 동일한 결합력을 갖는 핵산 분자임)에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 질환(disease)의 치료(treatment) 및/또는 진단(diagnosis) 방법에 있어서, 보다 증가되거나 또는 동일한 결합력을 갖는 핵산 분자의 용도(use)에 관한 것이다.
상대적으로 소분자인 유기 분자(small organic molecules)의 사용이외에도, 신규 치료학적 개념의 개발이 단일 클론 항체(monoclonal antibodies), 펩티드(peptides) 및 기능적 핵산 분자 (functional nucleic acid molecules), 즉, 목표 구조(target structure) 또는 목표 분자(target molecule)와 특이적으로 결합하는 핵산 분자들에 집중되고 있다. 이러한 기능적 핵산 분자들의 대표적인 예는 다수의 서로 상이한 생분자(biomolecules)에 대하여 이미 개발되어 온 소위 압타머(Raptamers)들이다. 따라서, D-핵산 라이브러리(nucleic acid library)로부터 출발하고 이들의 목표 구조 또는 목표 분자에 대하여 특히 강력한 친화력(affinity)을 나타냄을 특징으로 하는 소위 압타머(Raptamers)들을 시험관내 선별법(in vitro selection)에 의한 몇 단계의 공정으로 분리된다. 이러한 압타머의 제조방법들은 예를 들어, 유럽 특허 EP 0 533 838에 개시되어 있다.
최초의 압타머들은 조합성(combinatorial) RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드 라이브러리(oligonucleotide libraries)를 이용함으로서 발견되었다. RNA 압타머(aptamers)뿐만 아니라 DNA 압타머(aptamers)들은 D-핵산 분자이고 인체 또는 동물 체내 등의 생물학적 시스템에서 치료학적 적용에 무용하게 만드는 뉴클레아제(nucleases) 효소에 의하여 신속하게 분해된다. 따라서, 압타머의 안정화는 압타머 약물 후보물질(aptamer drug candidate)의 개발 과정중 필수적인 단계이다. 상기한 안정화는 (a) 압타머의 5’- 및 3’-말단(end) 양쪽에 캡핑 기(capping moieties)를 추가함으로서 압타머의 5’- 및 3’-말단기를 보호하고(protecting), (b)리보스(ribose) 또는 데옥시리보스 (deoxyribose) 골격(backbone)에 대한 변형(modifications)을 도입하거나, 또는 (c) 포스페이트(phosphate) 골격 구성요소를 도입함으로서 달성가능하다.
압타머의 5’-말단 위치에 캡핑 기(capping moieties)를 추가함으로서, 혈청 및 압타머의 생체내 (in vivo) 안정성, 특히, 인체 및 동물 체내의 신체 체액에 존재하는 5’-->3’ 뉴클레아제(nucleases) 및 5’-->3’ 엑소뉴클레아제(exonucleases)에 대하여, 안정성이 개선될 수 있다. 이러한 변형의 종류로는 고전적인 고체상 합성법(conventional solid-phase synthesis) 또는 합성후 커플링법 (post-synthesis coupling)에 의하여 변형된 포스포아미다이트 (modified phosphoamidites) 형태로서 도입가능하다. 종종 5’-아미노기를 포함한 5’-아미노 변형기 (amino modifier)가 이용되며, 여기에서 상기 5’-아미노기는 연속적인 유도체화 (derivatization)를 위한 친핵기 (nucleophile)로서 제공가능하다. 가장 통상적인 5’-변형(modification)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)이다. 기타 변형으로는 콜레스테롤(cholesterol), 지방산(fatty acids), 다가양이온(polycations) 및 단백질(proteins)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 압타머의 5’-말단의 안정화에 추가하여, 상기 변형은 압타머의 약동력학적 양상(pharmacokinetic profile) 및/또는 생체내 분포 (biodistribution) 특성을 전환시키는데 사용가능하다.
압타머의 3’말단에 캡핑 기를 추가하는 것은 압타머가 인체 및 동물의 혈청에 존재하는 3’-->5’ 엑소뉴클레아제 (exonucleases)에 대한 보호를 제공한다. 뉴클레오티드(Nucleotide) 및 비-뉴클레오티드(non-nucleotide) 3’-캡(caps)들은 공지되어 있다. 가장 통상적으로 사용되는 3’-캡 (cap)은 전환된 티미딘기(inverted thymidine; 3’-idT)이다.
압타머의 리보스(ribose) 또는 데옥시리보스(deoxyribose) 골격의 2’ 위치에서의 화학적 변형은 생체내(in vivo)에서 압타머를 이용하기에는 전재조건이다. 이러한 2’-변형(modifications)은 전형적으로 2’-F, 2’-O-메틸(methyl), 2’-아미노(amino)기로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다. 상기 2’-F, 2’-O-메틸(methyl), 2’-아미노(amino)기를 SELEX 공정 (어느 정도) 이내 또는 소위 후(post)-SELEX 적정화(optimization) 공정 하에서 압타머 서열로 변형하는 법은 당업계에 알려져 있으며, 여기에서 상기 개개 압타머 서열은 천연 뉴클레오티드(natural nucleotides)를 2’-F, 2’-O-메틸(methyl), 2’-아미노(amino) 뉴클레오티드(nucleotides)로 단계적 치환에 의하여 적정화된다.
포스페이트 골격 변형(Phosphate backbone modifications)은 비-가교성 (non-briding) 포스포디에스테르 산소(phosphodiester oxygens(s)) 위치에 황원자를 도입시켜, 뉴클레아제 저항성(nuclease resistance)을 압타머에 부여한다. 이러한 황원자 변형 골격(sulfur modified backbone)의 바람직한 형태는 포스포로티오에이트(phosphorothioates)기이다. 포스포로티오에이트(phosphorothioates)기는 압타머에 SELEX 공정 또는 고체상(solid-phase) 합성법으로 압타머에 효소학적으로 도입가능하다. 포스포로티오에이트(phosphorothioates) 압타머는 고체상 합성법으로 제조되어야 한다.
압타머와 별개로, 소위 스피에겔머(spiegelmers)는 기능적 핵산의 추가적인 형태를 구성된다. 압타머와 동일하게, 스피에겔머는 목표 분자 (target molecule) 또는 목표 구조체(target structure)와 특이적으로 결합한다. 스피에겔머(Spiegelmers)는 목표 분자 또는 목표구조체의 광학이성질체에 대하여 시험관내 시험법상의 선별(in vitro selection)을 위한 D-핵산 라이브러리(nucleic acid library)을 이용한 공정을 통하여 동정되고, 따라서 목표 분자 또는 목표구조체의 광학이성질체에 결합하는 동정된 D-핵산은 상응하는 L-핵산으로서 제조된다. 키랄 상호성(chiral reciprocity)의 원칙에 따라, 스피에겔머로 지칭되는 이러한 L-핵산(nucleic acids)은 상기 선별공정을 위하여 사용된 광학이성질체가 아닌 참(true) 또는 실제(actual) 목표 분자와 결합가능하다. 바람직하게는, 상기 참 또는 실제 목표 분자 또는 목표 구조체들은 인체 또는 동물 신체와 같은 생물학적 시스템상에 존재하는 목표 분자 또는 목표 구조체이다. 상기 스피에겔머의 제조방법은 예를 들어, 국제특허출원 제 WO 98/08856에 개시되어 있다.
스피에겔머는 L-핵산 분자, 전형적으로 L-뉴클레오티드(nucleotides)로부터 조립된 L-올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)이므로, 이는 천연 효소에 의하여 분해되지 않는다. 목표 특이성(target specificity)과는 별개로, 이러한 특성은 생물학적 시료 분석, 진단 및 치료 등과 같은 가장 다양한 분야에서의 사용을 제공한다.
상술한 바와 같이, 뉴클레아제에 대하여 사용 전에 안정화되어야 하는 압타머에 비하여, 스피에겔머는 기능성 어세이법(functional assays), 세포-기반 어세이법(cell-based assays), 생체내 실험법(in vivo experiments) 및/또는 치료 또는 진단을 위한 생체 내 적용법(in vivo applications) 등과 같은 사용 전에 안정화시켜야 할 필요성이 없다. 스피에겔머의 생체내 적용가능성은 인체 및 다양한 동물 종에서 입증된 바가 있다. 스피에겔머인 NOX-E36 및 NOX-A12에 대한 임상 실험(clinical trials)이 2009년에 시작되었다.
스피에겔머는 안정화을 위한 변형이 필요없으므로, 뉴클레오티드 조립 블록(nucleotide building blocks)의 관점에서, 스피에겔머는 오로지 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 또는 2’-데옥시뉴클레오티드(deoxyribonucleotides), 보다 구체적으로는, L-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 또는 L-2’-데옥시뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)로 구성된 것이다. 이로 인한 약물 개발 면에서의 스피에겔머의 장점은 시간-소요(time-consuming), 고비용(costly) 및 지금까지- 비-변형 뉴클레오티드(non-modified nucleotides)의 2’-F-리보뉴클레오티드(ribonucleotides), 2’-O-매틸리보뉴클레오티드(methylribonucleotides) 및 2’-아미노리보뉴클레오티드(aminoribonucleotides) 등과 같은 변형된 뉴클레오티드, 즉, 즉, L-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 L-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)로의 치환과 같은 위험한 공정에 관한 문제가 없다는 점이다. L-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 L-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)으로만 구성된 스피에겔머의 약물 개발에 있어서 추가적인 장점은 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및/또는 이의 분해 산물 등에 의한 독성 효과 또는 불내성(intolerance) 문제가 없다는 점이다.
따라서, L-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 L-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)으로만 구성된 스피에겔머의 생채 내 효력(in vivo potency)은 전형적으로 이들의 목표 분자에 대한 친화능, 그 결과인 목표 분자 또는 목표 구조체의 기능에 대한 효과, 및 인체 또는 동물 체내에서의 이들의 약물동력학적 양상에 좌우된다.
본 발명의 근본적인 해결 과제는 목표 분자에 결합하는 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)로부터 출발하는, 목표분자와 결합가능한 핵산 분자를 제조하는 제조방법을 제공하는 것이다(바람직하게는, 상기 핵산 분자가 결합 가능한 목표 분자는 비교용 핵산 분자가 결합하는 목표분자인 것이다)
본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 목표 분자에 결합하는 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)로부터 출발하는, 목표분자와 결합가능한 핵산 분자를 제조하는 제조방법을 제공하는 것이다 (여기에서 상기 목표 분자와 결합 가능한 핵산 분자는 상기 비교용 핵산 분자와 비교하여 동등하거나 우수한 결합 특성을 갖고 바람직하게는, 상기 결합 특성은 목표 분자에 대한 결합 친화능(binding affinity)인 것임).
본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 핵산 분자 및 보다 구체적으로는, 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)와 비교시에 목표 분자에 대하여 우수하거나 동등한 결합 친화능을 갖는 압타머 (aptamer) 또는 스피에겔머 (spiegelmer)와 같은 기능적 핵산 (functional nucleic acid molecule)을 제공하는 것이다.
본원에서 열거되는 상기 또는 기타 해결과제들은 첨부된 독립 항들의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 구현예는 종속항들로부터 획득가능하다.
본 발명의 해결과제는 독립 항들의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 구현예들은 종속항들의 영향을 받는다.
보다 상세하게는, 본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면인,
(a) 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)를 제공하는 제 1단계{여기에서, 상기 비교용 핵산 분자는 목표 분자와 결합 가능하고 상기 비교용 핵산 분자는 n개의 뉴클레오티드(nucleotides)를 포함하는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)을 포함함};
(b) 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체(first level derivative)를 준비하는 제 2단계{여기에서 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체는 1개의 뉴클레오티드 위치(nucleotide position)가 상기 비교용 핵산 분자와 상이하고, 상기 제 1급 유도체는 상기 비교용 핵산이 상기 뉴클레오티드 위치에서 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)를 2’-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)로 치환시켜 제조하고, 상기 비교용 핵산이 상기 뉴클레오티드 위치에서 데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로 치환시켜 제조하고, 상기 치환 (replacement)이 이루어지는 뉴클레오티드 위치는 변형된 뉴클레오티드 위치 (modified nucleotide position)임); 및
(c) 상기 비교용 핵산 분자의 개개 뉴클레오티드 위치에서 상기 (b) 단계를 반복하여 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)을 제조하는 제 3단계 {상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)은 n 개의 제 1급 유도체들로 구성되고, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)의 각각은 단일의 뉴클레오티드 치환(single nucleotide replacement)에 의하여 비교용 핵산 분자와는 상이하며, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 각각은, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)의 기타 다른 제 1차 유도체들의 모든 단일 변형 뉴클레오티드 위치(single modified nucleotide positions)들 중에 1개의 변형된 뉴클레오티드(single modified nucleotide)가 상이한 단일의 변형된 뉴클레오티드 위치(single modified nucleotide position)를 갖음}를 포함하는, 목표 분자에 결합 가능한 핵산 분자를 제조하는 제조방법에 의하여 해결 가능하다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 방법은 하기 단계 (d); 및 임의적으로 단계 (e)를 포함한다:
(d) 상기 비교용 핵산의 n 개의 제 1급 유도체 각각에 대한 상기 목표 분자의 결합 특성을 측정하는 단계; 및 임의적으로
(e) 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)를 넘는 결합 특성(binding characteristic)을 갖는, 비교용 핵산 분자의 상기 제 1차 유도체(들)를 동정하는 단계.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 결합 특성(binding characteristic)은 목표 분자에 대한 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 결합 친화능 (binding affinity)은 KD 수치(value)로 표기되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차 및 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 Y 이며 Y는 {비교용 핵산 분자의 결합 친화능 (binding affinity of the reference nucleic acid molecule) / 제 1급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity of the first level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 Y> 1, 보다 바람직하게는, Y≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, Y≥5 또는 Y ≥ 10인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차 및 제 5차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 X 이며 X는 {비교용 핵산 분자의 KD 수치 (KD value of the reference nucleic acid molecule) / 제 1급 유도체의 KD 수치 (KD value of the first level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 X> 1, 보다 바람직하게는, X≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, X≥5 또는 X ≥ 10인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 상기 단계 (b)에서 상기 제 1급 유도체가 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)가 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)에 의하여 치환되어 제조되고, (a) 상기 리보뉴클레오티드가 아데노신(adenosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(b) 상기 리보뉴클레오티드가 구아노신(guanosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(c) 상기 리보뉴클레오티드가 시티딘(cytidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(d) 상기 리보뉴클레오티드가 우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시우리딘(deoxyuridine)-5- 포스페이트(phosphate) 또는 티미딘(thymidine)-5- 포스페이트(phosphate)이며; 및
상기 단계 (b)에서 상기 제 1급 유도체가 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)에 의하여 치환되어 제조되고,
(a) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 아데노신(adenosine)-5-포스페이트(phosphate)이고;
(b) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 구아노신(guanosine)-5-포스페이트(phosphate)이고;
(c) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 시티딘(cytidine)-5-포스페이트(phosphate)이고; 및
(d) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 우리딘(uridine)-5-포스페이트(phosphate) 또는 5-메틸(methyl)-우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차 및 제 7차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 단계 (b)에서 상기 제 1급 유도체가 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)가 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)에 의하여 치환되어 제조되고, (a) 상기 리보뉴클레오티드가 아데노신(adenosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(b) 상기 리보뉴클레오티드가 구아노신(guanosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(c) 상기 리보뉴클레오티드가 시티딘(cytidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(d) 상기 리보뉴클레오티드가 우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시우리딘(deoxyuridine)-5- 포스페이트(phosphate)이며; 및
상기 단계 (b)에서 상기 제 1급 유도체가 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)에 의하여 치환되어 제조되고,
(a) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 아데노신(adenosine)-5-포스페이트(phosphate)이고;
(b) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 구아노신(guanosine)-5-포스페이트(phosphate)이고;
(c) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 시티딘(cytidine)-5-포스페이트(phosphate)이고; 및
(d) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 5-메틸(methyl)-우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 9 차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid)가 리보핵산 분자(ribonucleic acid molecule)이고 상기 단계 (b)에서 상기 제 1급 유도체가 1개의 뉴클레오티드 위치에서 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)가 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)에 의하여 치환되어 제조되고, (a) 상기 리보뉴클레오티드가 아데노신(adenosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(b) 상기 리보뉴클레오티드가 구아노신(guanosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(c) 상기 리보뉴클레오티드가 시티딘(cytidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5- 포스페이트(phosphate)이고;
(d) 상기 리보뉴클레오티드가 우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)는 2’-데옥시우리딘(deoxyuridine)-5- 포스페이트(phosphate) 또는 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트(phosphate)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차 및 제 9차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid)가 2-데옥시리보핵산 분자 (2’-deoxyribonucleic acid molecule)이고 상기 단계 (b)에서 상기 제 1급 유도체가 1개의 뉴클레오티드 위치에서 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)에 의하여 치환되어 제조되고,
(a) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 아데노신(adenosine)-5-포스페이트(phosphate)이고;
(b) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 구아노신(guanosine)-5-포스페이트(phosphate)이고;
(c) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2‘-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 시티딘(cytidine)-5-포스페이트(phosphate)이고; 및
(d) 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 5-메틸(methyl)-우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 10차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 11 차 구현예로서, 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)가 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트(phosphate)이라면, 상기 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)는 5-메틸(methyl)-우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차 제 9차, 제 10차 및 제 11차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 12차 구현예로서, 상기 방법은 목표 분자에 결합가능한 핵산 분자를 제조하는 방법이며, 상기 핵산 분자의 결합 친화능(binding affinity)은 비교용 핵산 분자의 목표 분자에 대한 결합 친화능보다 증가하거나 또는 동일한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차 제 9차, 제 10차, 제 11차 및 제 12차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 13차 구현예로서, 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는 상기 1급 유도체(first level derivative)는 a 이거나, 또는 a 또는 목표 분자에 결합가능한 핵산인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차 및 제 13차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 2 급 유도체(second level derivative)가 제조되는 것이며, 여기에서 상기 2 급 유도체는 적어도 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position) 및 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)에서 상기 비교용 핵산 분자와 상이한 것이며, 여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 1급 유도체(first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며,
상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차 및 제 14차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 15차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative) 및 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)는 어떠한 2개의 1급 유도체(first level derivatives)의 조합인 것이며, 여기에서 상기 2개의 1급 유도체(first level derivatives) 각각의 결합 특성은 미리 결정된 역치를 넘는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 14차 및 제 15차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 16차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative) 및 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)는 n개의 뉴클레오티드로 구성된 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 군의 나머지 1급 유도체보다 우월한 결합 특성을 갖는 2개의 1급 유도체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 14차, 제 15차 및 제 16차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 17차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 2급 유도체(second level derivative)는 목표 분자와 결합 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 15차, 제 16차 및 제 17차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 18차 구현예로서, 상기 방법은 (a) 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 2급 유도체의 결합특성을 측정하는 제 1단계; 및 임의적으로, (b) 미리 결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 2급 유도체(들)(second level derivative(s))를 동정하는 제 2단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 구현 예의 하나의 구현 예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 19차 구 현예로서, 상기 결합특성은 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 2급 유도체(second level derivative)의 결합 특성인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차 및 제 19차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 20차 구현예로서, 상기 결합 친화능 (binding affinity)은 KD 수치(value)로 표기되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차, 제 19차 및 제 20차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 21차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 Y 이며 Y는 {비교용 핵산 분자의 결합 친화능 (binding affinity of the reference nucleic acid molecule) / 제 2급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity of the second level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 Y> 1, 보다 바람직하게는, Y≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, Y≥5 또는 Y ≥ 10 또는 Y ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 18차, 제 19차, 제 20차 및 제 21차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 22차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 X 이며 X는 {비교용 핵산 분자의 KD 수치 (KD value of the reference nucleic acid molecule) / 제 2급 유도체의 KD 수치 (KD value of the second level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 X> 1, 보다 바람직하게는, X≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, X≥5 또는 X ≥ 10 또는 X ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 및 제 22차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 23차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는 상기 2급 유도체(second level derivative)는 a 이거나, 또는 a 또는 목표 분자에 결합가능한 핵산인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 22차, 제 23차, 및 제 24차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 25차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 3 급 유도체(third level derivative)가 제조되는 것이며, 여기에서 상기 3 급 유도체는 적어도 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position), 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position) 및 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)면에서 상기 비교용 핵산 분자와 상이한 것이며, 여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 1급 유도체(first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고, 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 24차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 25차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative) 및 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative)는 어떠한 3개의 1급 유도체(first level derivatives)의 조합인 것이며, 여기에서 상기 3개의 1급 유도체(first level derivatives) 각각의 결합 특성은 미리 결정된 역치를 넘는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 24차 및 제 25차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 26차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative) 및 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative)는 n개의 뉴클레오티드로 구성된 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 군의 나머지 1급 유도체들보다 우월한 결합 특성을 갖는 3개의 1급 유도체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 24차, 제 25차 및 제 26차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 27차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 3급 유도체(third level derivative)는 목표 분자와 결합 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 25차, 제 26차 및 제 27차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 28차 구현예로서, 상기 방법은 (a) 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 3급 유도체의 결합특성을 측정하는 제 1단계; 및 임의적으로, (b) 미리 결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 3급 유도체(들)(third level derivative(s))를 동정하는 제 2단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 28차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 29차 구현예로서, 상기 결합특성은 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 3급 유도체(third level derivative)의 결합 특성인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 28차 및 제 29차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 30차 구현예로서, 상기 결합 친화능 (binding affinity)은 KD 수치(value)로 표기되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 28차, 제 29차 및 제 30차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 31차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 Y 이며 Y는 {비교용 핵산 분자의 결합 친화능 (binding affinity of the reference nucleic acid molecule) / 제 3급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity of the third level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 Y> 1, 보다 바람직하게는, Y≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, Y≥5 또는 Y ≥ 10 또는 Y ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 28차, 제 29차, 제 30차 및 제 31차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 32차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 X 이며 X는 {비교용 핵산 분자의 KD 수치 (KD value of the reference nucleic acid molecule) / 제 3급 유도체의 KD 수치 (KD value of the third level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 X> 1, 보다 바람직하게는, X≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, X≥5 또는 X ≥ 10 또는 X ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 24차, 제 25차, 제 26차, 제 27차, 제 28차, 제 29차, 제 30차, 제 31차, 및 제 32차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 33차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는 상기 3급 유도체(third level derivative)는 a 이거나, 또는 a 또는 목표 분자에 결합가능한 핵산인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차, 제 27차, 제 28차, 제 29차, 제 30차, 제 31차, 제 32차 및 제 33차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 34차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 4 급 유도체(fourth level derivative)가 제조되는 것이며, 여기에서 상기 4 급 유도체는 적어도 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position), 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position), 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position) 및 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)면에서 상기 비교용 핵산 분자와 상이한 것이며, 여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며 상기 1급 유도체(first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고, 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 34차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 35차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative) 및 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative)는 어떠한 4개의 1급 유도체(first level derivatives)의 조합인 것이며, 여기에서 상기 4개의 1급 유도체(first level derivatives) 각각의 결합 특성은 미리 결정된 역치를 넘는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 34차 및 제 35차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 36차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative) 및 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative)는 n개의 뉴클레오티드로 구성된 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 군의 나머지 1급 유도체들보다 우월한 결합 특성을 갖는 4개의 1급 유도체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 34차, 제 35차 및 제 36차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 37차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 4급 유도체(fourth level derivative)는 목표 분자와 결합 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 35차, 제 36차 및 제 37차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 38차 구현예로서, 상기 방법은 (a) 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 4급 유도체의 결합특성을 측정하는 제 1단계; 및 임의적으로, (b) 미리 결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 4급 유도체(들)(fourth level derivative(s))를 동정하는 제 2단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 39차 구현예로서, 상기 결합특성은 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 4급 유도체(fourth level derivative)의 결합특성인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차, 및 제 39차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 40차 구현예로서, 상기 결합 친화능 (binding affinity)은 KD 수치(value)로 표기되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차, 제 39차 및 제 40차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 41차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 Y 이며 Y는 {비교용 핵산 분자의 결합 친화능 (binding affinity of the reference nucleic acid molecule) / 제 4급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity of the fourth level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 Y> 1, 보다 바람직하게는, Y≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, Y≥5 또는 Y ≥ 10 또는 Y ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 38차, 제 39차, 제 40차 및 제 41차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 42차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 X 이며 X는 {비교용 핵산 분자의 KD 수치 (KD value of the reference nucleic acid molecule) / 제 4급 유도체의 KD 수치 (KD value of the fourth level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 X> 1, 보다 바람직하게는, X≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, X≥5 또는 X ≥ 10 또는 X ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 34차, 제 35차, 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차, 및 제 42차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 43차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는 상기 4급 유도체(fourth level derivative)는 a 이거나, 또는 a 또는 목표 분자에 결합가능한 핵산인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차, 제 27차, 제 28차, 제 29차, 제 30차, 제 31차, 제 32차, 제 33차, 제 34차, 제 35차, 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차, 제 42차 및 제 43차구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 44차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 5 급 유도체(fifth level derivative)가 제조되는 것이며, 여기에서 상기 5 급 유도체는 적어도 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position), 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position), 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position), 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position) 및 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position)면에서 상기 비교용 핵산 분자와 상이한 것이며;
여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며 상기 1급 유도체(first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고, 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 5차 1급 유도체(fifth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 5차 1급 유도체(fifth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 44차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 45차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative), 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative) 및 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative)는 어떠한 5개의 1급 유도체(first level derivatives)의 조합인 것이며, 여기에서 상기 5개의 1급 유도체(first level derivatives) 각각의 결합 특성은 미리결정된 역치를 넘는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 44차 및 제 45차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 46차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative), 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative) 및 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative)는 n개의 뉴클레오티드로 구성된 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 군의 나머지 1급 유도체들보다 우월한 결합 특성을 갖는 5개의 1급 유도체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 44차, 제 45차 및 제 46차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 47차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 5 급 유도체(fifth level derivative)는 목표 분자와 결합 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 45차, 제 46차 및 제 47차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 48차 구현예로서, 상기 방법은 (a) 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 5급 유도체의 결합특성을 측정하는 제 1단계; 및 임의적으로, (b) 미리 결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 5급 유도체(들)(fifth level derivative(s))를 동정하는 제 2단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 48차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 49차 구현예로서, 상기 결합특성은 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 5 급 유도체(fifth level derivative)의 결합특성인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 48차, 및 제 49차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 50차 구현예로서, 상기 결합 친화능 (binding affinity)은 KD 수치(value)로 표기되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 48차, 제 49차 및 제 50차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 51차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 Y 이며 Y는 {비교용 핵산 분자의 결합 친화능 (binding affinity of the reference nucleic acid molecule) / 제 5급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity of the fifth level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 Y> 1, 보다 바람직하게는, Y≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, Y≥5 또는 Y ≥ 10 또는 Y ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 48차, 제 49차, 제 50차 및 제 51차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 52차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 X 이며 X는 {비교용 핵산 분자의 KD 수치 (KD value of the reference nucleic acid molecule) / 제 5급 유도체의 KD 수치 (KD value of the fifth level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 X> 1, 보다 바람직하게는, X≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, X≥5 또는 X ≥ 10 또는 X ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 44차, 제 45차, 제 46차, 제 47차, 제 48차, 제 49차, 제 50차, 제 51차, 및 제 52차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 53차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는 상기 5급 유도체(fifth level derivative)는 a 이거나, 또는 a 또는 목표 분자에 결합가능한 핵산인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차, 제 27차, 제 28차, 제 29차, 제 30차, 제 31차, 제 32차, 제 33차, 제 34차, 제 35차, 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차, 제 42차, 제 43차, 제 44차, 제 45차, 제 46차, 제 47차, 제 48차, 제 49차, 제 50차, 제 51차, 제 52차 및 제 53차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 54차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 6 급 유도체(sixth level derivative)가 제조되는 것이며, 여기에서 상기 6 급 유도체는 적어도 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position), 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position), 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position), 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position), 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position) 및 제 6차 뉴클레오티드 위치(sixth nucleotide position)면에서 상기 비교용 핵산 분자와 상이한 것이며;
여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며 상기 1급 유도체(first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고, 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 5차 1급 유도체(fifth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 5차 1급 유도체(fifth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 6차 뉴클레오티드 위치(sixth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 6차 1급 유도체(sixth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 6차 1급 유도체(sixth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 6차 뉴클레오티드 위치(sixth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 6차 1급 유도체(the sixth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 54차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 55차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative), 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative), 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative) 및 제 6차 1급 유도체(the sixth first level derivative)는 어떠한 6개의 1급 유도체(first level derivatives)의 조합인 것이며, 여기에서 상기 6개의 1급 유도체(first level derivatives) 각각의 결합 특성은 미리결정된 역치를 넘는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 54차 및 제 55차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 56차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative), 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative), 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative) 및 제 6차 1급 유도체(the sixth first level derivative)는 n개의 뉴클레오티드로 구성된 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 군의 나머지 1급 유도체들보다 우월한 결합 특성을 갖는 6개의 1급 유도체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 54차, 제 55차 및 제 56차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 57차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 6 급 유도체(sixth level derivative)는 목표 분자와 결합 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 55차, 제 56차 및 제 57차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 58차 구현예로서, 상기 방법은 (a) 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 6급 유도체의 결합특성을 측정하는 제 1단계; 및 임의적으로, (b) 미리 결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 6급 유도체(들)(sixth level derivative(s))를 동정하는 제 2단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 58차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 59차 구현예로서, 상기 결합특성은 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 6 급 유도체(sixth level derivative)의 결합특성인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 58차, 및 제 59차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 60차 구현예로서, 상기 결합 친화능 (binding affinity)은 KD 수치(value)로 표기되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 58차, 제 59차 및 제 60차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 61차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 Y 이며 Y는 {비교용 핵산 분자의 결합 친화능 (binding affinity of the reference nucleic acid molecule) / 제 6급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity of the sixth level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 Y> 1, 보다 바람직하게는, Y≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, Y≥5 또는 Y ≥ 10 또는 Y ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 58차, 제 59차, 제 60차 및 제 61차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 62차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 X 이며 X는 {비교용 핵산 분자의 KD 수치 (KD value of the reference nucleic acid molecule) / 제 6급 유도체의 KD 수치 (KD value of the sixth level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 X> 1, 보다 바람직하게는, X≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, X≥5 또는 X ≥ 10 또는 X ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 54차, 제 55차, 제 56차, 제 57차, 제 58차, 제 59차, 제 60차, 제 61차, 및 제 62차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 63차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는 상기 6급 유도체(sixth level derivative)는 a 이거나, 또는 a 또는 목표 분자에 결합가능한 핵산인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차, 제 27차, 제 28차, 제 29차, 제 30차, 제 31차, 제 32차, 제 33차, 제 34차, 제 35차, 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차, 제 42차, 제 43차, 제 44차, 제 45차, 제 46차, 제 47차, 제 48차, 제 49차, 제 50차, 제 51차, 제 52차, 제 53차, 제 54차, 제 55차, 제 56차, 제 57차, 제 58차, 제 59차, 제 60차, 제 61차, 제 62차, 제 63차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 64차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 7 급 유도체(seventh level derivative)가 제조되는 것이며, 여기에서 상기 7 급 유도체는 적어도 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position), 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position), 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position), 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position), 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position), 제 6차 뉴클레오티드 위치(sixth nucleotide position) 및 제 7차 뉴클레오티드 위치(seventh nucleotide position)면에서 상기 비교용 핵산 분자와 상이한 것이며;
여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며 상기 1급 유도체(first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고, 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며;
상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 3차 1급 유도체(third first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 3차 뉴클레오티드 위치(third nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 4차 1급 유도체(fourth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 4차 뉴클레오티드 위치(fourth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 5차 1급 유도체(fifth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 5차 1급 유도체(fifth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 5차 뉴클레오티드 위치(fifth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 6차 뉴클레오티드 위치(sixth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 6차 1급 유도체(sixth first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 6차 1급 유도체(sixth first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 6차 뉴클레오티드 위치(sixth nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 6차 1급 유도체(the sixth first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일하며;
상기 제 7차 뉴클레오티드 위치(seventh nucleotide position)의 뉴클레오티드는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 7차 1급 유도체(seventh first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 7차 1급 유도체(seventh first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 7차 뉴클레오티드 위치(seventh nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 7차 1급 유도체(the seventh first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 64차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 65차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative), 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative), 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative), 제 6차 1급 유도체(the sixth first level derivative) 및 제 7차 1급 유도체(the seventh first level derivative)는 어떠한 7개의 1급 유도체(first level derivatives)의 조합인 것이며, 여기에서 상기 7개의 1급 유도체(first level derivatives) 각각의 결합 특성은 미리결정된 역치를 넘는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 64차 및 제 65차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 66차 구현예로서, 상기 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative), 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative), 제 3차 1급 유도체(the third first level derivative), 제 4차 1급 유도체(the fourth first level derivative), 제 5차 1급 유도체(the fifth first level derivative), 제 6차 1급 유도체(the sixth first level derivative) 및 제 7차 1급 유도체(the seventh first level derivative)는 n개의 뉴클레오티드로 구성된 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 군의 나머지 1급 유도체들보다 우월한 결합 특성을 갖는 7개의 1급 유도체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 64차, 제 65차 및 제 66차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 67차 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자의 7 급 유도체(seventh level derivative)는 목표 분자와 결합 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 65차, 제 66차 및 제 67차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 68차 구현예로서, 상기 방법은 (a) 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 7급 유도체의 결합특성을 측정하는 제 1단계; 및 임의적으로, (b) 미리 결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 7급 유도체(들)(seventh level derivative(s))를 동정하는 제 2단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 68차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 69차 구현예로서, 상기 결합특성은 목표 분자에 대한 비교용 핵산 분자의 7 급 유도체(seventh level derivative)의 결합특성인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 68차, 및 제 69차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 70차 구현예로서, 상기 결합 친화능 (binding affinity)은 KD 수치(value)로 표기되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 68차, 제 69차 및 제 70차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 71차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 Y 이며 Y는 {비교용 핵산 분자의 결합 친화능 (binding affinity of the reference nucleic acid molecule) / 제 7급 유도체의 결합 친화능 (binding affinity of the seventh level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 Y> 1, 보다 바람직하게는, Y≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, Y≥5 또는 Y ≥ 10 또는 Y ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 68차, 제 69차, 제 70차 및 제 71차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 72차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치(predetermined threshold value)는 X 이며 X는 {비교용 핵산 분자의 KD 수치 (KD value of the reference nucleic acid molecule) / 제 7급 유도체의 KD 수치 (KD value of the seventh level derivative)}의 나눈 값이며 여기에서 X> 1, 보다 바람직하게는, X≥ 2 이며, 가장 바람직하게는, X≥5 또는 X ≥ 10 또는 X ≥ 20인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제 64차, 제 65차, 제 66차, 제 67차, 제 68차, 제 69차, 제 70차, 제 71차, 및 제 72차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 73차 구현예로서, 상기 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는 상기 7급 유도체(seventh level derivative)는 a 이거나, 또는 a 또는 목표 분자에 결합가능한 핵산인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 제1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차, 제 27차, 제 28차, 제 29차, 제 30차, 제 31차, 제 32차, 제 33차, 제 34차, 제 35차, 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차, 제 42차, 제 43차, 제 44차, 제 45차, 제 46차, 제 47차, 제 48차, 제 49차, 제 50차, 제 51차, 제 52차, 제 53차, 제 54차, 제 55차, 제 56차, 제 57차, 제 58차, 제 59차, 제 60차, 제 61차, 제 62차, 제 63차, 제 64차, 제 65차, 제 66차, 제 67차, 제 68차, 제 69차, 제 70차, 제 71차, 제 72차 및 제 73차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 제 74차 구현예로서, 상기 목표 분자에 결합가능한 핵산은 L-핵산이며, 상기 비교용 핵산 분자는 L-핵산이며, 상기 비교용 핵산 분자 유도체의 개개 및 전체는 L-핵산인 것이다.
본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 두 번째 측면으로서, 본 발명의 첫 번째 측면의 제1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차, 제 15차, 제 16차, 제 17차, 제 18차, 제 19차, 제 20차, 제 21차, 제 23차, 제 24차, 제 25차, 제 26차, 제 27차, 제 28차, 제 29차, 제 30차, 제 31차, 제 32차, 제 33차, 제 34차, 제 35차, 제 36차, 제 37차, 제 38차, 제 39차, 제 40차, 제 41차, 제 42차, 제 43차, 제 44차, 제 45차, 제 46차, 제 47차, 제 48차, 제 49차, 제 50차, 제 51차, 제 52차, 제 53차, 제 54차, 제 55차, 제 56차, 제 57차, 제 58차, 제 59차, 제 60차, 제 61차, 제 62차, 제 63차, 제 64차, 제 65차, 제 66차, 제 67차, 제 68차, 제 69차, 제 70차, 제 71차, 제 72차, 제 73차 및 제 74차 구현예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로 제조 가능한 목표분자에 결합 가능한 핵산 분자에 의하여 해결가능하다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 두 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 핵산 분자는 하나 이상의 변형체 ( modification)를 포함하는 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 두 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 핵산 분자는 질환(disease)의 치료(treatment) 및/또는 예방(prevention)을 위한 방법에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 두 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 핵산 분자는 질환(disease)의 진단(diagnosis)을 위한 방법에 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 3차 및 제 3차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 두 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 질환(disease)은 목표분자와 관련된 질환(disease which involves the target molecule)인 것이다.
본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 본 발명의 세 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면으로서, 본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예 중 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 분자의 질환(disease) 치료를 위한 약제(medicament)의 제조를 위한 용도(use)에 의하여 해결가능하다.
본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 본 발명의 네 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 네 번째 측면으로서, 본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예 중 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 분자의 질환(disease) 치료를 위한 진단제(diagnostic agent)의 제조를 위한 용도(use)에 의하여 해결가능하다.
본 발명의 네 번째 측면의 제 2차 구현예, 세 번째 측면의 제 1차 구현예 및 제 4차 구현예의 제 1차 구현예이기도 한, 세 번째 측면의 제 2차 구현예로서, 상기 질환(disease)은 목표분자와 관련된 질환(disease which involves the target molecule)인 것이다.
본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 본 발명의 다섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 다섯 번째 측면으로서, 본 발명의 두 번째 측면의 제 1차 및 제 2차 구현예 중 어느 하나의 구현예에 따른 핵산 분자및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 함유하는 약학 조성물에 의하여 해결가능하다.
본 발명의 또 다른 근본적인 해결 과제는 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면으로서, 목표 분자와 결합 가능한 하기의 핵산 분자에 의하여 해결가능하다:
여기에서 상기 핵산 분자는 목표 분자에 결합 친화능을 갖고;
여기에서 상기 핵산 분자의 목표분자에 대한 결합 친화능은 비교용 핵산 분자의 목표분자에 대한 결합 친화능보다 증가하거나 또는 동일하며;
여기에서 (a) 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)를 포함하고 상기 비교용 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)를 포함하거나; 또는 (b) 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides) 및 적어도 1개 이상의 변형기(modification group)를 포함하고 상기 비교용 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides) 및 적어도 1개 이상의 변형기(modification group)를 포함하며;
여기에서 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides) 및 상기 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)은 뉴클레오티드의 핵염기성 기(nucleobase moiety)면에서 적어도 부분적으로 동일하나 뉴클레오티드의 당(sugar)기면에서 상이하며;
여기에서 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)은 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides) 모두로 구성되며 상기 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)은 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 또는 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides) 중 하나로 구성되는 것이다.
본 발명의 여섯 번째 측면의 제 1차 구현예이기도 한, 여섯 번째 측면의 제 2차 구현예로서, (a) 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)로 구성되며 상기 비교용 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)로 구성되거나, 또는 (b) 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides) 및 하나 이상의 변형기(modification group)로 구성되며 상기 비교용 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides) 및 하나 이상의 변형기(modification group)로 구성되며;
여기에서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides) 및 상기 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)은 뉴클레오티드의 핵염기성 기(nucleobase moiety)면에서 동일하나 뉴클레오티드의 당(sugar)기면에서 상이한 것이다.
본 발명의 여섯 번째 측면의 제 2차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 여섯 번째 측면의 제 3차 구현예로서, 상기 핵산 분자의 목표분자에 대한 결합 친화능은 비교용 핵산 분자의 목표분자에 대한 결합 친화능보다 증가한 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 6차 구현예, 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 및 제 5차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 및 제 3차 구현예이기도 한, 여섯 번째 측면의 제 4차 구현예로서, 상기 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)은 L-리보뉴클레오티드(ribonucleotides)이고 상기 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)는 L-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)인 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 7차 구현예, 두 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차 및 제 4차 구현예이기도 한, 여섯 번째 측면의 제 5차 구현예로서, 상기 핵산 분자는 L-핵산 분자(nucleic acid molecule)이며, 여기에서 상기 L-핵산 분자는 L-뉴클레오티드(nucleotides)로 구성되고 상기 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)는 L-비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)이며 상기 L-비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)는 L-뉴클레오티드 (nucleotides)로 구성된 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 8차 구현예, 두 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차 및 제 7차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차 및 제 5차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 6차 구현예로서, 상기 핵산 분자 및/또는 비교용 핵산 분자는 목표 분자에 의하여 매개되는 활성의 길항제(antagonist)인 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 9차 구현예, 두 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차 및 제 8차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 7차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides) 및 하나 이상의 변형기(modification group)을 포함한 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)로 구성된 핵산 분자와 비교하여 유기체에서의 배설율(excretion rate)이 증가된 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 10차 구현예, 두 번째 측면의 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 및 제 8차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차 및 제 6차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 8차 구현예로서, 상기 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)을 포함한 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)로 구성된 핵산 분자와 비교하여 유기체에서 증가된 체류시간(retention time )을 갖는 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 11차 구현예, 두 번째 측면의 제 9차 및 제 10차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 7차 및 제 8차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 9차 구현예로서, 상기 변형기 (modification group)는 생분해성(biodegradable) 및 비-생분해성(non-biodegradable) 변형체(modifications)를 포함한 군으로부터 선택되며, 바람직하게는, 상기 변형기(modification group)는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 선형 폴리에틸렌 글리콜(linear polyethylene glycol), 쇄상 폴리에틸렌 글리콜(branched polyethylene glycol), 히드록시에틸 전분 (hydroxyethyl starch), 펩티드(peptide), 단백질(protein), 다당체(polysaccharide), 스테롤(sterol), 폴리옥시프로필렌(polyoxypropylene), 폴리옥시아미데이트(polyoxyamidate) 및 폴리(2-히드록시에틸)-L-글루타민{poly (2-hydroxyethyl)L-glutamine}을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 12차 구현예, 두 번째 측면의 제 11차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 7차 및 제 8차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 10차 구현예로서, 상기 변형기 (modification group)는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 바람직하게는 선형 폴리에틸렌 글리콜(linear polyethylene glycol) 또는 쇄상 폴리에틸렌 글리콜(branched polyethylene glycol)으로 구성된 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 상기 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol)의 분자량은 바람직하게는, 약 20,000 내지 약 120,000 Da, 보다 바람직하게는, 약 30,000 내지 약 80,000 Da 및 가장 바람직하게는, 약 40,000 Da 범위인 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 13차 구현예, 두 번째 측면의 제 11차 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 9차 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 11차 구현예로서, 상기 변형기 (modification group)는 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch), 바람직하게는 상기 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)의 분자량은 약 50 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게는, 약 100 내지 약 700 kDa 및 가장 바람직하게는, 200 내지 500 kDa 범위인 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 14차 구현예, 두 번째 측면의 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차 및 제 13차 구현예의 하나의 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차 및 제 12차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 12차 구현예로서, 상기 유기체(organism)은 동물 또는 인체, 바람직하게는 인체인 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 15차 구현예, 여섯 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차 및 제 12차 구현예의 하나의 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차 및 제 14차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 13차 구현예로서, 상기 핵산 분자는 질환(disease)의 치료(treatment) 및/또는 예방(prevention)을 위한 방법에서의 용도(use)인 것이다.
본 발명의 두 번째 측면의 제 16차 구현예, 두 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 제 13차, 제 14차 및 제 15차 구현예의 하나의 구현예 및 여섯 번째 측면의 제 1차, 제 2차, 제 3차, 제 4차, 제 5차, 제 6차, 제 7차, 제 8차, 제 9차, 제 10차, 제 11차, 제 12차, 및 제 13차 구현예의 하나의 구현예이기도 한, 본 발명의 여섯 번째 측면의 제 14차 구현예로서, 상기 핵산 분자 및 비교용 핵산 분자는 뉴클레아제(nuclease) 활성에 저항성이 있는 것이다.
하기한 구현예 및 기술적 특징들은 본원에서 개시된 바와 같은 기술적 구성 및 구현예들, 특히 첨부되는 청구항에 종속하는 측면들 및 구현예들과 연관되어 당업자라면 구현가능한 것임을 인지하여야 할 것이다.
본원 발명자들은 목표분자에 결합 가능한 비교용 핵산 분자로부터 출발하는 합리적인 접근법에 의해, 핵산 분자가 목표 분자와 결합하여 생성될 수 있으며, 여기에서 상기 목표 분자와 결합 가능한 핵산 분자가 비교용 핵산 분자의 목표 물질과 결합함이 바람직함을 또한 발견하였다.
상기한 합리적인 접근법은 하기 단계를 포함하는 방법을 포함한다:
(a) 비교용 핵산 분자(reference nucleic acid molecule)를 제공하는 제 1단계{여기에서, 상기 비교용 핵산 분자는 목표 분자와 결합 가능하고 상기 비교용 핵산 분자는 n개의 뉴클레오티드(nucleotides)를 포함하는, 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)을 포함함};
(b) 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체(first level derivative)를 준비하는 제 2단계{여기에서 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체는 1개의 뉴클레오티드 위치(nucleotide position)가 상기 비교용 핵산 분자와 상이하고, 상기 제 1급 유도체는 상기 비교용 핵산이 상기 뉴클레오티드 위치에서 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)를 2’-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)로 치환시켜 제조하고, 상기 비교용 핵산이 상기 뉴클레오티드 위치에서 데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로 치환시켜 제조하고, 상기 치환 (replacement)이 이루어지는 뉴클레오티드 위치는 변형된 뉴클레오티드 위치 (modified nucleotide position)임); 및
(c) 상기 비교용 핵산 분자의 개개 뉴클레오티드 위치에서 상기 (b) 단계를 반복하여 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)을 제조하는 제 3단계 {상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)은 n 개의 제 1급 유도체들로 구성되고, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)의 각각은 단일의 뉴클레오티드 치환(single nucleotide replacement)에 의하여 비교용 핵산 분자와는 상이하며, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 각각은, 상기 비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군(group)의 기타 다른 제 1차 유도체들의 모든 단일 변형 뉴클레오티드 위치(single modified nucleotide positions)들 중에 1개의 변형된 뉴클레오티드(single modified nucleotide)가 상이한 단일의 변형된 뉴클레오티드 위치(single modified nucleotide position)를 갖음}.
본 발명의 하나의 구현예로서, 1급 유도체(first level derivatives)는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)을 포함하고, 여기에서 상기 뉴클레오티드 서열은 n 개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이다.
본원에서 정의되는 용어, “1급 유도체(first level derivatives)” 및 “비교용 핵산 분자의 1급 유도체(first level derivatives of the reference nucleic acid molecule)” 은 역으로 지시되지 않는 한, 동의어로 사용됨도 본 발명의 범위 내이다.
본원에서 정의되는 용어, “1급 유도체의 군(group of first level derivatives)” 및 “비교용 핵산 분자의 1급 유도체(group of first level derivatives of the reference nucleic acid molecule)” 도 역으로 지시되지 않는 한, 동의어로 사용됨도 본 발명의 범위 내이다.
개개 1급 유도체가 비교용 핵산 분자에 상대적으로 오직 1개의 뉴클레오티드 치환(nucleotide exchange)을 나타냄은 당업자에게 자명한 것으로 인지되어야 할 것이다. 상기한 구현예에서, 단계 (b)가 (n-1)번 반복되므로 상기 핵산 분자의 개개 및 모든 n 뉴클레오티드 위치 (nucleotide positions)는 뉴클레오티드 치환 (nucleotide replacement)됨도 자명한 것으로 인지되어야 할 것이다. 이러한 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 군에서, 상기 1급 유도체 군 전체로서, 개개의 유도체들이 단일 뉴클레오티드 위치면에서 서로 상이한 비교용 핵산 분자로부터 출발하여 제조가능한 모든 유도체들이다.
그러나, 상기 단계 (b)를 (n-1) 회 이하로 반복함도 본 발명의 범위 내이다. 그러나, 상기 단계 (b)를 오직 1개의 뉴클레오티드 위치에서, 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)를 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)로 치환하고, 역으로, 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로 치환하도록 전혀 반복하지 않는 것도 본 발명의 범위 내이다. 후자의 구현예는 바람직하게는, 단일 뉴클레오티드 치환 (single nucleotide replacement)이 유도체를 초래하고, 이것이 1급 유도체인 경우에 상기 유도체가 비교용 핵산 분자와 비교시에 본원에서 정의된 바와 같이, 향상된 결합 특성을 갖는 경우라면 수행될 것이다.
본 발명의 방법상의 구현예로서, 본 발명은 단계 (b)의 (n-1)이하의 반복(repetitions)을 포함하나, 바람직하게는, 만일, 반복되는 단계 (b)가 1, 2, 3회라면 1회 이상의 반복을 포함하는 것일 것이다. 그러나, (n-1)이하의 반복시에 비교용 핵산 분자와 비교시에 본원에서 정의된 바와 같이, 향상된 결합 특성을 갖는 1급 유도체들이 수득된다.
본 발명의 방법상의 추가적인 구현예로서, 상기 방법은 비교용 핵산 분자의 n 개 1급 유도체 각각에 대한 결합 특성을 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 목표 분자에 대한 상기 1급 유도체의 결합에 관한 결합특성을 측정하는 것이다. 본 발명의 방법상의 추가적인 구현예로서, 상기 결합 특성은 n 개 이하의 1급 유도체을 대상으로 측정되고, 바람직하게는, 상기 결합 특성은 n 개 1급 유도체 중 1개 이상를 대상으로 측정하나, n 개 1급 유도체 전부를 대상으로 하는 것은 아니다. 또한, 이러한 구현예로서, 상기 목표 분자에 대한 상기 1급 유도체의 결합에 관한 결합특성을 측정하는 것이다.
본 발명의 방법상의 추가적인 구현예로서, 상기 방법은 미리 결정된 역치를 넘거나 또는 이에 도달하는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 1 급 유도체(들)를 동정하는 단계를 포함하는 것이다. 상기 구현예로서, 미리 결정된 역치를 넘거나 또는 이에 도달하는 결합특성을 갖는 비교용 핵산 분자의 1 급 유도체(들) 모두를 동저하거나 미리 결정된 역치를 넘거나 또는 이에 도달하는 결합특성을 갖는 상기 1 급 유도체 일부만을 동정하는 것이다.
본 발명의 구현예로서, 임의의 급(level)의 비교용 핵산 분자 유도체는 비교용 핵산 분자와 동일 또는 유사한 결합능을 갖는 것이다. 이러한 구현예는 본원에서 개시된 바와 같은 임의의 급(level) 유도체의 하나의 구현예이다.
상기 역치는 비교용 핵산 분자의 결합능임도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 방법에 따라, 상기 제조될 핵산은 비교용 핵산 분자가 결합가능하고 역치에 도달하는, 목표 분자에 결합 가능한 비교용 핵산 분자의 1급 유도체 또는 임의 급(level) 유도체인 것이다.
상기 비교용 핵산 분자는 RNA 분자임도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자는 리보뉴클레오티드로 구성되는 것이다.
상기 비교용 핵산 분자는 DNA 분자임도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 구현예로서, 상기 비교용 핵산 분자는 데옥시리보뉴클레오티드로 구성되는 것이다.
상기 비교용 핵산 분자가 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드로 구성되고, 상기 핵산 서열을 형성하는 뉴클레오티드 서열의 개개 위치가 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드인 것도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 추가적인 측면은 상기 비교용 핵산 분자의 2급 유도체(second level derivative)인 것이다. 상기 비교용 핵산 분자의 2급 유도체는 본원에서 개시되거나 본원 발명의 방법과 연관되어 개시한 바와 같은 방법으로 수득가능하거나 또는 수득할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 2급 유도체는 1개 이상의 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position) 및 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position) 면에서 비교용 핵산 분자와 상이하며;
여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 1급 유도체(first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치(first nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 1차 1급 유도체(the first first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며,
상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)는 n개 유도체로 구성된 비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)의 변형된 뉴클레오티드 위치(modified nucleotide position)인 것이며, 상기 제 2차 1급 유도체(second first level derivative)는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치(second nucleotide position)의 뉴클레오티드는 비교용 핵산 분자의 제 2차 1급 유도체(the second first level derivative)의 변형된 위치(modified position)면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면은 상기 비교용 핵산 분자의 3급 유도체(third level derivative), 비교용 핵산 분자의 4급 유도체(fourth level derivative), 비교용 핵산 분자의 5급 유도체(fifth level derivative), 비교용 핵산 분자의 6급 유도체(sixth level derivative) 및 비교용 핵산 분자의 7급 유도체(seventh level derivative)에 관한 것이다. 상기 비교용 핵산 분자의 3급 유도체(third level derivative), 4급 유도체(fourth level derivative), 5급 유도체(fifth level derivative), 6급 유도체(sixth level derivative) 및 7급 유도체(seventh level derivative)는 본원에서 개시되거나 본원 발명의 방법과 연관되어 개시한 바와 같은 방법으로 수득가능하거나 또는 수득할 수 있다.
모두가 본 발명에 따른 핵산 분자인, 상기 비교용 핵산 분자의 2급 유도체(second level derivative), 3급 유도체(third level derivative), 4급 유도체(fourth level derivative), 5급 유도체(fifth level derivative), 6급 유도체(sixth level derivative) 및 7급 유도체(seventh level derivative)와 연관되어, 는 치환(replacements)은 상기 비교용 핵산 분자의 2급 유도체(second level derivative)에만 연관된 2개의 뉴클레오티드에만 제한되지 않으며, 상기 비교용 핵산 분자의 3급 유도체(third level derivative)에만 연관된 3개의 뉴클레오티드에만 제한되지 않으며, 상기 비교용 핵산 분자의 4급 유도체(fourth level derivative)에만 연관된 4개의 뉴클레오티드에만 제한되지 않으며, 상기 비교용 핵산 분자의 5급 유도체(fifth level derivative)에만 연관된 5개의 뉴클레오티드에만 제한되지 않으며, 상기 비교용 핵산 분자의 6급 유도체(sixth level derivative)에만 연관된 6개의 뉴클레오티드에만 제한되지 않으며, 상기 비교용 핵산 분자의 7급 유도체(seventh level derivative)에만 연관된 7개의 뉴클레오티드에만 제한되지 않으며, 오히려, 상기 유도체들은 기타 다른 위치에서, 추가적인 치환을 포함할 수 있다.
결국, 상기 비교용 핵산 분자의 고위 급(higher order level) 유도체들을 포함하고, 개시하고 본 발명의 범위에 포함되며, 결론적으로, 이들도 본 발명에 따른 핵산들이다. 이러한 고위 급(higher order level) 유도체들은 예를 들어, 8급(eighth level), 9급(ninth ordr level) 유도체들이다. 가장 높은 급의 유도체는 상기 핵산 분자가 n 개 뉴클레오티드를 포함한다는 사실을 본다면, n 급(nth level) 유도체이다. 상기 비교용 핵산 분자가 n 개 뉴클레오티드를 포함하므로 상기 비교용 핵산 분자의 n 개 뉴클레오티드 중 최대치는 본원에서 제공된 규칙 및 지침에 따라 대체된다. 이러한 상기 비교용 핵산 분자의 n 급(nth level) 유도체에서, 개개 및 임의의 뉴클레오티드는 본 발명에 따라 대체된다. 그러나, 상기 고위 급(higher order level) 유도체는 (n-x)th 급 유도체이며(상기 x는 1 내지 n+2 범위의 임의의 정수임). 이러한 (n-x)th 급 유도체에서(상기 x는 1 내지 n+2 범위의 임의의 정수임), 이러한 유도체들의 (n-x) 뉴클레오티드 본원에서 기술적으로 교시한 바와 따른 비교용핵산 분자에 관련하여, 1 내지 n+2 범위의 임의의 정수의 x로 치환되는 것이다.
상기 비교용 핵산 분자의 다양한 1급 유도체들을 보다 높은 고위급 유도체들로 조합하는 경우에 다양한 1급 유도체들이 a 또는 미리 예정된 역치에 도달하거나 넘어서는 것도 본 발명 방법의 하나의 구현예이다. 그러나, 상기한 바와 같이, 상기 비교용 핵산 분자의 다양한 1급 유도체들을 보다 높은 고위급 유도체들로 조합하는 경우에도 다양한 개개의 1급 유도체들이 a 또는 미리 예정된 역치에 도달하거나 넘어설 수 없음도 본 발명 방법의 하나의 구현예이다. 결국, 상기 비교용 핵산 분자의 다양한 1급 유도체들을 보다 높은 고위급 유도체들로 조합하는 경우에, 상기 비교용 핵산 분자의 일부 1급 유도체들은 미리 예정된 역치에 도달하거나 넘어서는 반면에, 상기 비교용 핵산 분자의 기타 1급 유도체들은 a 또는 미리 예정된 역치에 도달하거나 넘어설 수 없음도 본 발명 방법의 하나의 구현예이다.
또한, 본 발명은 목표에 대한 핵산 분자의 결합능을 상기 비교용 핵산 분자의 결합능과 비교시에 증가시킬 수 있다는 놀라운 사실에 기반하며, 여기에서 상기 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)을 포함하고 상기 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)을 포함하고, 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 상기 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 핵염기성 기(nucleobase moiety)면에서 적어도 부분적으로 동일하나 뉴클레오티드의 당(sugar)기면에서 상이하며; 여기에서 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)은 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides) 모두로 구성되며 상기 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열(a sequence of nucleotides)은 리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 또는 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides) 중 하나로 구성되는 것이다.
본원에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 비교용 핵산 분자는 본 발명의 하나의 핵산 분자 및 핵산 분자를 직접, 또는 간접적으로 비교용 핵산 분자로 작용하거나 또는 사용될 핵산 분자를 분석 또는 측정할 특정한 특성(characteristic)을 위한 참고(reference) 또는 벤치마크(benchmark)로서 사용되는 핵산이다. 본 발명의 구현예로서, 상기 특성은 핵산 분자, 바람직하게는, 본 발명의 핵산의 결합능(binding affinity) 및 본 발명의 핵산 분자의 목표분자 및 비교용 핵산 분자의 목표 분자를 위한 비교용 핵산 분자의 결합친화능이다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명의 핵산 분자의 목표 분자(target molecule)는 비교용 핵산 분자의 목표 분자이며, 보다 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자의 목표 분자는 비교용 핵산 분자와 동일한 목표 물질인 것이다.
본원에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 본 발명의 하나의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은, 만일 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 포함된 뉴클레오티드의 1개 이상의 핵염기(nucleobase)가 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 포함된 뉴클레오티드의 1개 이상의 핵염기(nucleobase)와 동일하다면, 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열과 부분적으로 동일하거나 또는 동일한 것이다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오티드의 핵염기(nucleobase)의 75 % 이상, 바람직하게는, 85%, 보다 바람직하게는, 90% 이상, 가장 바람직하게는, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% 또는 100 % 가 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드의 핵염기(nucleobase)와 동일한 것이다. 본 발명의 호환적인 하나의 구현예로서, 본 발명의 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드의 핵염기(nucleobase)의 75 % 이상, 바람직하게는, 85%, 보다 바람직하게는, 90% 이상, 가장 바람직하게는, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% 또는 100 % 가 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오티드의 핵염기(nucleobase)와 동일한 것이다. 본 발명의 핵산 분자의 추가적인 구현예로서, 모든 핵염기(nucleobase)는 2’-데옥시리보유클레오티드(deoxyribonucleotide)가 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로 치환되고 데옥시리보유클레오티드(deoxyribonucleotide)가 2’-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5-포스페이트(phosphate); 2’-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5’-포스페이트(phosphate);2’-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5’-포스페이트(phosphate); 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트(phosphate)로 치환되고 , 상기 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)가 아데노신(adenosine)-5’-포스페이트(phosphate), 구아노신(guanosine)-5’-포스페이트(phosphate), 시티딘(cytidine)-5’-5-메틸(methyl)-우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate) 포스페이트(phosphate) 또는 우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate); 및 리보유클레오티드(ribonucleotide)가 데옥시리보유클레오티드(deoxyribonucleotide)로 치환되고 리보유클레오티드(ribonucleotide)가 아데노신(adenosine)-5’-포스페이트(phosphate), 구아노신(guanosine)-5’-포스페이트(phosphate), 시티딘(cytidine)-5’-포스페이트(phosphate), 우리딘(uridine)-5’-포스페이트(phosphate)로 치환되고 상기 데옥시리보유클레오티드 (deoxyribonucleotide)가 2’-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5- 포스페이트(phosphate)e; 2’-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5’-포스페이트(phosphate); 2’-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5’-포스페이트(phosphate); 2’-데옥시우리딘(deoxyuridine)-5’-포스페이트(phosphate) 또는 티미딘(thymidine)-5-포스페이트(phosphate) 로 치환되는 경우를 제외하고 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드의 핵염기(nucleobase)와 동일하다.
본 발명에 따라, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열과 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열과의 동일성(identity) 또는 부분 동일성( partial identity)은 뉴클레오티드의 핵염기 부위(nucleobase moiety)에 바탕 또는 관하여 측정하는 것이다. 이와 관련하여, 본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 핵염기(nucleobase) 또는 핵염기 부위(nucleobase moiety)는 각각 뉴클레오시드(nucleoside) 및 뉴클레오티드(nucleotide)의 질소성 염기(nitrogenous base)인 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 핵염기(nucleobase) 는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 티민(thymine), 시토신(cytosine) 및 우라실(uracil)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열과 비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열과의 동일성(identity) 또는 부분 동일성(partial identity)은 뉴클레오티드의 핵염기(nucleobase)의 화학구조에 따라 결정된다. 따라서, 본 발명과 관련하여, 2’-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5’-(트리(tri))포스페이트(phosphate)는 아데노신(adenosine)-5’-(트리)포스페이트와 동일하고, 2’-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5’-(트리)포스페이트는 구아노신(guanosine)-5’-(트리)포스페이트와 동일하고, 티미딘(thymidine)-5’-(트리)포스페이트는 5-메틸우리딘(Methyluridine) 5’-(트리)포스페이트와 동일하고, 2’-데옥시시티딘(deoxycytidine) 5’-(트리)포스페이트는 시티딘(cytidine) 5’-(트리)포스페이트와 동일하고, 데옥시우리딘(deoxyuridin) 5’-(트리)포스페이트는 우리딘(uridine) 5’-(트리)포스페이트는 동일한 것으로 간주된다.
본원 전체를 통하여, 통상적으로 알려진 두문어가 핵산의 조성을 묘사하기 위하여 사용되는데, 여기에서, 글자, A, G, C, U 및 T는 핵염기인 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 우라실(uracil) 또는 티민(thymine)을 각각 포함하는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 또는 2‘-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)을 의미한다. 합성 올리고뉴클레오티드(synthetic oligonucleotide)의 5’-말단(end)에 위치시에 상기 뉴클레오티드는 뉴클레오시드(nucleoside), 즉, 5’-포스페이트 기(phosphate group)가 없는 기이다. 나타난 서열이 주로 리보뉴클레오티드 서열(ribonucleotide sequences; RNA) 또는 2’-데옥시리보뉴클레오티드 서열 (deoxyribonculeotide sequences, 데옥시리보뉴클레오티드 서열 (deoxyribonucleotide sequences) 또는 DNA로 지칭됨)인지 여부는 주어진 시료(sample)의 도(figure), 도면(figure legend) 또는 문서(text)로부터 판독기로 결정되어질 것이다. 일반적으로, 하나의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)의 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)로의 변환 또는 그 반대로 변환되는 하나 이상의 위치가 있다. 하나 이상의 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)를 주로 리보뉴클레오티드 서열(ribonucleotide sequence)에 삽입하는 것은 핵염기의 동일성을 의미하는 대문자 전에 아랫 첨자(“d”)로 표기한다(상술함). 역으로, 하나 이상의 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)의 리보뉴클레오티드 서열(ribonucleotide sequence)로의 삽입은 핵염기의 동일성을 의미하는 대문자 전에 아랫 첨자(“d”)로 표기한다. 뉴클레오티드(nucleotide)는 당업자에게 1’-위치에 부착된 핵염기를 갖는 리보스(ribose)-5’-포스페이트(phosphate) 또는 2’-데옥시리보스(deoxyribose)-5’-포스페이트(phosphate)로서 공지되어 있다. 핵염기를 갖는 연결(linkage)은 퓨린 핵염기 (purine nucleobases; A, G)의 9-위치 및 피리미딘 핵염기(pyrimidine nucleobases; C, T, U)의 1-위치에서 발생한다.
본 발명에 따른 핵산은 핵산 분자임이 본 발명의 범위 내이다. 역으로 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어인 핵산 (nucleic acid) 및 핵산 분자(nucleic acid molecule)은 동의어로 사용된다. 이러한 핵산(nucleic acids)은 바람직하게는, 본원에서 또한 본 발명에 따른 핵산 분자(nucleic acid molecules according to the present invention), 본 발명에 따른 핵산(the nucleic acids according to the present invention) 또는 발명적 핵산(the inventive nucleic acids) 또는 발명적 핵산 분자(inventive nucleic acid molecules)로 지칭되는 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 본 발명에 의한 핵산의 특징은 상기 핵산이 단독 또는 임의의 조합으로 사용되는 본 발명의 어떠한 측면으로 실현될 수 있다.
본원에 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어, “글루카곤(glucagon)”은 이에 제한되지는 않으나, 포유동물 글루카곤 (mammalian glucagon)을 포함하는 임의의 글루카곤을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 포유동물 글루카곤은 인간(human), 래트(rat), 마우스(mouse), 원숭이(monkey), 돼지(pig), 토끼(rabbit), 햄스터(hamster), 개(dog), 양(sheep), 닭(chicken) 및 소(bovine)의 글루카곤을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.
본원에 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어, “S1P”은 이에 제한되지는 않으나, 포유동물 S1P(mammalian S1P)을 포함하는 임의의 S1P을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 포유동물 S1P은 인간(human), 래트(rat), 마우스(mouse), 원숭이(monkey), 돼지(pig), 토끼(rabbit), 햄스터(hamster), 개(dog), 양(sheep), 닭(chicken) 및 소(bovine)의 S1P을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.
본원에 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어, “CGRP”은 이에 제한되지는 않으나, 포유동물 CGRP( mammalian CGRP)을 포함하는 임의의 S1P을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 포유동물 S1P은 인간(human), 래트(rat), 마우스(mouse), 원숭이(monkey), 돼지(pig), 토끼(rabbit), 햄스터(hamster), 개(dog), 양(sheep), 닭(chicken) 및 소(bovine)의 S1P을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.
본원에 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용어, “C5a”은 이에 제한되지는 않으나, 포유동물 C5a( mammalian C5a)을 포함하는 임의의 C5a을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 포유동물 C5a은 인간(human), 래트(rat), 마우스(mouse), 원숭이(monkey), 돼지(pig), 토끼(rabbit), 햄스터(hamster), 개(dog), 양(sheep), 닭(chicken) 및 소(bovine)의 C5a을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 글루카곤 (glucagon)에 대한 길항제(antagonist)는 글루카곤에 결합하고 (예를 들어, 본원에서 개시된 핵산과 같은) 및 글루카곤의 기능을, 바람직하게는, 예를 들어, 실시예에서 개시된 바와 같은, 시험관내 시험법(in vitro assay) 또는 생체내 실험 모델(in vivo model)에서 글루카곤의 기능을 저해하는 분자이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 S1P에 대한 길항제(antagonist)는 S1P에 결합하고 (예를 들어, 본원에서 개시된 핵산과 같은) 및 S1P의 기능을, 바람직하게는, 예를 들어, 실시예에서 개시된 바와 같은, 시험관내 시험법(in vitro assay) 또는 생체내 실험 모델(in vivo model)에서 S1P의 기능을 저해하는 분자이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 C5a에 대한 길항제(antagonist)는 C5a에 결합하고 (예를 들어, 본원에서 개시된 핵산과 같은) 및 C5a의 기능을, 바람직하게는, 예를 들어, 실시예에서 개시된 바와 같은, 시험관내 시험법(in vitro assay) 또는 생체내 실험 모델(in vivo model)에서 C5a의 기능을 저해하는 분자이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 CGRP에 대한 길항제(antagonist)는 CGRP에 결합하고 (예를 들어, 본원에서 개시된 핵산과 같은) 및 CGRP의 기능을, 바람직하게는, 예를 들어, 실시예에서 개시된 바와 같은, 시험관내 시험법(in vitro assay) 또는 생체내 실험 모델(in vivo model)에서 CGRP의 기능을 저해하는 분자이다.
본 발명에 따른 핵산 분자뿐만 아니라 비교용 핵산 분자들은 서로 상이한 3개의 뉴클레오티드 스트레치 (stretches of nucleotides): 즉, 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides), 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides) 및 뉴클레오티드의 제 2차 말단 스트레치(second terminal stretch of nucleotides)를 포함한다. 일반적으로, 핵산 분자 분야에서, 뉴클레오티드의 임의의 서열은 5’→ 3’-방향을 의미하는데, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides)가 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides)의 5‘-말단(end)에 배열되고, 제 2차 말단 스트레치(second terminal stretch of nucleotides)는 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides)의 3‘-말단(end)에 배열된다, 이러한 이유로, 상기 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides)를 본원에서 뉴클레오티드의 5’-말단 스트레치 (terminal stretch of nucleotides)으로 지칭되며, 상기 뉴클레오티드의 제 2차 말단 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides)를 본원에서 뉴클레오티드의 3’-말단 스트레치 (terminal stretch of nucleotides)으로 지칭되며, 역으로도 지칭된다. 그러나, 본원에서는 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides)를 뉴클레오티드의 3’-말단 스트레치 (terminal stretch of nucleotides)으로 지칭되며, 상기 뉴클레오티드의 제 2차 말단 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides)를 뉴클레오티드의 5’-말단 스트레치 (terminal stretch of nucleotides)으로 지칭되며, 역으로도 지칭됨도 본 발명의 범위 내이다. 특히, 본 발명의 구현예에서, 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides) 및 제 2차 말단 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides)가 상호 상보적인(complementary) 염기로 적용된다.
본 발명의 핵산 분자의 하나의 구현예에서, 상기 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides) 및 제 2차 말단 스트레치 (second terminal stretch of nucleotides)가 상호 상보적인(complementary) 염기로 적용된다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 2개의 뉴클레오티드의 스트레치들은 만일 2개의 스트레치들이 적어도 종이 또는 실리코(silico)상에서 서로 혼성화되어 이중 가닥형(double-stranded) 구조가 생성되면 서로 염기 상보적(base complementary)이다. 상기 혼성화는 와트슨-크리크(Watson-Crick) 염기 쌍 규칙에 따른 염기 쌍을 대상으로 공지된 규칙에 따라 발생하거나 생성된다. 그러나 후그스텐(Hoogsten) 염기 쌍과 같은 기타 염기 쌍은 이러한 이중-가닥 구조로 또는 이 구조를 형성할 수 있음도 당업계에 인지 가능할 것이다. 본 발명의 핵산분자와 연관되어, 상기한 혼성화는 이중-가닥 구조를 초래함은 당업자에게 인지 가능할 것이다. 이러한 이중-가닥 주조는 햅산 분자의 단일 가닥의 2개의 공간적으로 분리된 스트레치들이 혼성화되는 경우에 단일 핵산 분자의 일부가 될 것이다. 호환적으로, 상기 이중-가닥 구조는 2개 이상의 분리된 핵산 분자에 의하여 형성될 수도 이다. 어떠한 혼성화도 2개의 스트레치들의 전장에 걸쳐 발생하거나 형성되지는 않음도 당업자에게 인지가능할 것이다.
본 발명의 뉴클레오티드의 2개의 스트레치들은 상기 2개의 스트레치들이 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo) 조건하에서 원칙적으로 혼성화된다면 상호 염기 상보적(base complementary)이다. 서로 염기 상보적인 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 및 제 2차 말단 스트레치; 종이 또는 실리코(silico)상에서 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 및 제 2차 말단 스트레치의 혼성화에 대하여도 본원에서도 동일하게 구현예로서 적용된다. 그러나, 이러한 혼성화가 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo) 조건하에서 발생되거나 발생되지 않을 수 있음도 당업계에 인지가능할 것이다.
본원 발명과 연관되어, 서로 혼성화되는 2개의 스트레치들이 현상은 이러한 혼성화가 상호 염기 상보적(base complementary) 이유로 발생하나 모든 시험관 내(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo) 조건하에서 필연적으로 발생하지는 않을 수 있음도 당업계에 인지가능할 것이다.
핵산 분자들의 3개의 뉴클레오티드 스트레치 (stretches of nucleotides): 즉, 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides), 뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides) 및 뉴클레오티드의 제 2차 말단 스트레치(second terminal stretch of nucleotides)들은 5’→ 3’-방향으로 서로 배열된다 : 즉, 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides)-뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides)- 뉴클레오티드의 제 2차 말단 스트레치(second terminal stretch of nucleotides). 그러나, 호환적으로, 서로 5’→ 3’ 방향으로 역으로도 서로 배열된다 : 즉, 뉴클레오티드의 제 2차 말단 스트레치(second terminal stretch of nucleotides)-뉴클레오티드의 중간 스트레치 (the central stretch of nucleotides)- 뉴클레오티드의 제 1차 말단 스트레치 (first terminal stretch of nucleotides).
본원 발명의 핵산 분자가 한편이면 상기 비교용 핵산 분자는 다른 한편인 것같이 서로 상이한 핵산 분자들간의 한정된 스트레치들의 서열상의 상이성은 본 발명의 핵산 분자와 결합가능한 목표 분자에 대한 결합능에 영향을 준다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명의 핵산 분자의 결합력 분석법에 기초하여, 본 발명에 따른 핵산의 뉴클레오티드의 중간 스트레치 및 이를 형성하는 뉴클레오티들은 개별적이며 보다 바람직하게는 전체적으로 목표 분자에 대한 본 발명의 핵산 분자의 결합력에 필수적인 것이다.
용어 ‘스트레치(stretch)’ 및 ‘뉴클레오티드의 스트레치 (stretch of nucleotide)’들은 역으로 지시하지 않는 한은 유의어로 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 단일 핵산 분자 (single nucleic acid molecule)이다. 본 발명의 추가적인 구현예로서, 상기 단일 핵산 분자는 다수의 단일 핵산 분자(multitude of the single nucleic acid molecule) 또는 다수의 단일 핵산 종 (multitude of the single nucleic acid molecule species)으로서 존재한다.
본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는, 서로 상호가 공유적으로, 보다 바람직하게는 포스포디에테르 결합(phosphodiester link) 또는 결합(linkage)을 통해 결합되는 뉴클레오티드로 구성된 것으로 당업계에서 인지되어야 할 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본원에서 사용되는 용어, 배열(arrangement)은 본원에서 개시된 핵산과 연계되어 개시된 구조적 (structural) 또는 기능적(functional) 특징(features) 또는 요소(elements)의 순서(order) 또는 서열(sequence)을 의미한다.
본 발명에 따른 핵산들은 또한 특정 본원에 개시된 특정 서열들과 필수적으로 상동성(homologous)을 갖는 핵산들도 포함할 것이다. 본원에서 정의되는 용어 실질적으로 상동성(substantially homologous)은 최소한 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 핵산에 존재하는 상동성을 갖는 뉴클레오티드의 실제적인 백분율은 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 전체 개수에 의존할 것이다. 상기 백분율 변형체(percent modification)는핵산 분자에 존재하는 전체 뉴클레오티드 숫자를 바탕으로 할 수 있다.
상기 2개의 핵산 분자들간의 상동성은 당업자에게 널리 알려진 측정법으로 결정될 수 있다. 보다 상세하게는, 지정된 프로그램 파라미터(designated program parameters)를 바탕으로 하여, 비교용 서열(reference sequence)과 관련된 시험용 서열(test sequence)에 대한 백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 계산하는 것이다. 상기 시험용 서열은 바람직하게는, 또 다른 핵산 분자에 대하여 상동성인지, 만약 그렇다면, 어느 정도까지 인지 여부를 시험되거나 시험될 서열 또는 핵산 분자이며, 상기 또 다른 핵산 분자는 또한 비교용 서열(reference sequence)이라고도 지칭된다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 스미스 및 워터맨 (Smith 및 Waterman, 1981)의 국부적 상동성 알고리즘법(local homology algorithm)에 의해, 니들맨 및 운츠 (Needleman 및 Wunsch, 1970)의 상동성 정렬 알고리즘법(homology alignment algorithm)에 의해, 피어슨 및 립맨 (Pearson 및 Lipman, 1988)의 유사 방법을 위한 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행법 (computerized implementations)(위스콘 제네틱 소프트웨어 패키지의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) 또는 시각적 조사(visual inspection)에 의해서 수행될 수 있다.
백분율 서열 동일성(percent sequence identity)을 결정하기에 적합한 알고리즘의 하나의 예로서는 기본 국소 정렬 조사 도구 분석법(basic local alignment search tool; 이하 BLAST"이라 명명함)에 사용되는 알고리즘, 예를 들어, 알쯔슐 등의 문헌(Altschul et al. 1990 및 Altschul et al, 1997)에 개시된 알고리즘이다. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀러지 인포메이션(National Center for biotechnology Information; 이하 NCBI이라 명명함)을 통하여 공중에서 입수 가능하다. NCBI에서 입수가능한 스포트웨어, 예들 들어, BLASTN(뉴클레오티드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용)를 이용하여 서열 동일성(sequence identity)을 결정하는데 사용되는 디폴트 함수(default parameters)는 맥기니스 등의 문헌(McGinnis et al, 2004)에 개시되어 있다.
또한 본 발명에 따른 핵산은 본원 발명의 핵산 분자 및 특히 본원에서 개시되고 이의 뉴클레오티드 서열에 의하여 한정된 핵산과 관련하여 특정한 정도의 동일성(identity)을 갖는 핵산분자도 포함되어야 한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 본원 발명의 핵산 분자 및 특히 본원에서 개시되고 이의 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부에 의하여 한정된 핵산과 관련하여 최소한 75%, 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 것도 포함하는 것이다.
본원에 기재된 용어 발명적 핵산(inventive nucleic acid) 또는 본 발명에 따른 핵산(nucleic acid according to the present invention)은 본원에 개시된 핵산 또는 에를 들어, 본 발명에 따른 핵산의 대사체(metabolite) 또는 유도체(derivatives)와 같은 이들의 일부를 포함하는 핵산들, 바람직하게는 상기 핵산 또는 상기 핵산의 일부들이 글루카곤과 연관 또는 이와 결합가능한 정도까지를 또한 포함하는 것이다.
상기 핵산은 예를 들어, 절단(truncation)과 같은 본원에서 개시된 것으로부터 유래될 수 있다. 절단은 본원에서 개시된 상기 핵산의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단과 연관될 수 있다. 또한, 절단은 핵산의 뉴클레오티드 내 서열(inner sequence)과 관련될 수 있다, 즉, 5 및 3 말단 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드(들)와 각각 관련될 수 있다. 게다가, 절단은 본원에서 개시된 핵산 서열로부터 최소한 하나의 뉴클레오티드의 결실(deletion)을 포함할 것이다. 절단은 발명적 핵산(들)의 하나 이상의 스트레치와 관련될 수 있으며, 여기에서 상기 스트레치는 최소한 하나의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 본 발명에 따르는 핵산의 결합은 당업자들에게 통상적인 실험법, 또는 본원에 개시된, 바람직하게는 실시예 부분에 개시된 방법을 사용 또는 적용함으로서 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 비교적 긴 핵산(longer nucleic acid)의 일부분이며, 상기 비교적 긴 핵산은 최소한 본 발명의 한 부분이 본 발명에 따른 핵산 또는 그 일부분인 여러 부분을 포함한다는 것도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 D-핵산 또는 L-핵산 중 어느 것일 수 있다. 본 발명에서는 이들의 임의 조합이 사용될 수 있을 것이다. 이러한 비교적 긴 핵산의 다른 일부분은 결합(binding)면에서 다른 기능을 나타낼 수 있다. 하나의 가능한 기능은 다른 분자와의 상호작용(interaction), 예를 들어, 고정화(immobilization), 가교결합(cross-linking), 검출(detection) 또는 증폭(amplification)등과 같은 작용을 허용하는 것이다. 본 발명의 추가의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 독립적 또는 조합된 부위, 몇 개의 본 발명의 핵산을 포함하는 것이다. 이와 같은 본 발명의 여러 가지 핵산을 포함하는 핵산은 비교적 긴 핵산의 용어로서 또한 포함한다.
본 발명에 따른 핵산은 D-핵산 또는 L-핵산일 수 있다. 바람직하게는, 상기 발명적 핵산은 L-핵산이다. 추가적으로, 상기 핵산의 하나 내지 여러 부분은 D-핵산형으로 존재 가능하며, 또는 상기 핵산의 하나 이상 내지 여러 부분은 L-핵산형이다. 상기 핵산의 일부(part)라는 용어는 최소한 1개 이상의 뉴클레오티드를 의미하는 것일 것이다. 이러한 핵산들은 일반적으로, 각각 D- 및 L-핵산으로 지칭된다. 따라서, 특히 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산들은 L-뉴클레오티드로 구성되고 최소 하나 이상의 D-뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 L-핵산분자(nucleic acid molecules)들은 L-뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 L-뉴클레오티드로만 구성된 핵산분자들이며, 보다 바람직하게는, 상기 L-뉴클레오티드(nucleotides)는 L-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 또는 L-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)이다. 본 발명의 또 하나의 바람직한 구현예로서, 상기 L-핵산 분자(nucleic acid molecules)는 L-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 L-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)로 구성된 것이다.
본원에서 사용되는 D-핵산분자(nucleic acid molecules)들은 L-뉴클레오티드, 바람직하게는 오로지 D-뉴클레오티드로만 구성된 핵산분자들이며, 보다 바람직하게는, 상기 D-뉴클레오티드(nucleotides)는 D-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 또는 D-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)이다. 본 발명의 또 하나의 바람직한 구현예로서, 상기 D-핵산 분자(nucleic acid molecules)는 D-리보뉴클레오티드(ribonucleotides) 및 D-2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)로 구성된 것이다.
본원에서 사용되는 용어 핵산(nucleic acid) 및 핵산 분자(nucleic acid molecule)는 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 호환가능한 방식으로 사용된다.
또한, 역으로 명백하게 지시되지 않은 한, 본원에서 기술된 임의의 뉴클레오티드 서열은 5 → 3 방향이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 뉴클레오티드의 임의의 위치는 서열(sequence), 스트레치(stretch) 또는 아스트레치(substretch)의 5’ 말단과 관련되어 결정되거나 참고화되는 것이다. 결론적으로, 제 2차 뉴클레오티드( second nucleotide)는 서열(sequence), 스트레치(stretch) 또는 아스트레치(substretch)의 5’ 말단으로부터 계산시에 각각 2번째 뉴클레오티드인 것이다. 또한, 이와 관련하여, 끝에서 두 번째의 뉴클레오티드(penultimate nucleotide)는 서열(sequence), 스트레치(stretch) 또는 아스트레치(substretch)의 3’ 말단으로부터 계산시에 각각 2번째 뉴클레오티드인 것이다.
L-핵산과 같은 본 발명의 핵산 분자를 고안하는 것은 여러 가지 장점을 갖는다. L-핵산은 자연 발생적 핵산들의 거울상 이성질체이다. 그러나 D-핵산은 수용액상, 및 특히 핵산 분해 효소(nucleases)의 광범위한 분포에 기인하는 생체 조직(biological systems) 또는 생체 표본(biological samples)에서 매우 불안정하다. 자연 발생적 핵산 분해효소, 특히 동물 세포 유래 핵산 분해 효소는 L-핵산에 대한 분해 능력이 없다. 이와 같은 이유로 L-핵산의 생물학적 반감기(biological halflife)는 동물체 및 인체를 포함한 상기 조직에서 두드러지게 증가한다. L-핵산의 분해능 결핍으로 인해, 핵산 분해 효소의 분해산물이 발생되지 않으며, 상기 결과로 어떠한 부작용도 일어나지 않음을 관찰할 수 있다. 이러한 측면은 목표 분자(target molecule)와 관련한 질환 및/또는 장애의 치료를 위해 사용되고 있는 사실상 모든 기타 화합물의 L-핵산으로 한정되지 않는 것이다. 특이적으로 왓슨와 크릭의 염기 결합과는 다른 기전을 통한 목표 분자와 결합을 하는 L-핵산 또는 L-뉴클레오티드로 일부 또는 온전히 구성되는 압타머(aptamer), 특히 상기 목표물질(target molecule)과 압타머와의 결합과 관련되는 압타머의 일부분을 갖는 압타머를 또한 스피에겔머(spiegelmer)이라고 지칭된다. 상기 압타머(aptamer) 및 스피에겔머(spiegelmer)는 당업자들에게 공지되어 있으며, 문헌에 개시된 내용이다(‘The Aptamer Handbook’, eds. Klussmann, 2006).
또한, 본 발명에 따른 핵산으로 또한 지칭되는 발명적 핵산은 그 핵산이 D-핵산, L-핵산 또는 D-, L-핵산으로 존재하는가 여부 또는 DNA 또는 RNA인가 여부와 상관없이 단일 가닥(single strand) 또는 이중 가닥(double strand) 핵산으로 존재할 수도 있는 것도 본 발명의 범주 내이다. 전형적으로, 본 발명의 발명적 핵산은 일차원 구조에 기인한 한정된 이차원 구조(defined secondary structure)를 나타내는 단일 가닥 핵산으로서, 삼차 구조(tertiary structure)를 또한 형성할 수도 있다. 그러나 본 발명의 발명적 핵산은 서로 상보적인 또는 서로 일부가 상보적인 이중 가닥이 서로 혼성화 된다는 의미에서 이중 가닥도 또한 포함될 수도 있다.
본 발명의 발명적 핵산은 변형가능하다. 이러한 변형은 상기 핵산의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 변형의 예는 그 중에서도, 하기 문헌들, 즉, 벤카테산 외(Venkatesan, Kim et al, 2003) 및 커서(Kusser 2000)에 의해 서술되어 있다. 이러한 변형은 핵산을 구성하는 개별적인 뉴클레오티드의 2번 위치에서의 수소 원자, 불소 원자 혹은 O-CH3 그룹 또는 NH2 그룹이 될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 LNA 뉴클레오티드로 구성된 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 다중 분할된 핵산(multipartite nucleic acid)일 수 있다. 본원에서 사용되는 다중 분할된 핵산(multipartite nucleic acid)은 두 개 이상의 핵산 가닥으로 구성된 핵산이다. 상기 두 개 이상의 핵산 가닥은 목표 분자에 대한 리간드 (ligand)로 작용하는 기능적 부위(functional unit)를 형성한다(여기에서 상기 기능적 부위는 목표 분자에 대한 리간드, 바람직하게는, 목표 분자, 또는 목표 분자와 결합가능한 리간드, 바람직하게는 목표 물질임). 이 두 개 이상의 핵산 가닥은 본 발명의 임의의 핵산으로부터 핵산을 두 개의 가닥으로 분할시키는 방법 또는 본 발명 핵산의 첫 번째 부분에 상응하는 한 개의 핵산 합성, 즉 전체 핵산(overall nucleic acid) 및 전체 핵산의 두 번째 부분에 상응하는 다른 한 개의 핵산을 합성하는 합성 방법으로 유래될 수 있다. 상기 분할(cleavage) 및 합성(synthesis) 방법 모두는 상기에서 예시한 바로 2개 이상의 가닥을 갖는 다중 분할된 핵산을 제조함에도 적용될 수 있음도 알아야 한다. 환원하면, 2개 이상의 핵산 가닥은 비록 다양한 핵산의 일부분 사이에 어느 정도의 상보적 구역(complementarity)이 존재한다 할지라도 서로 상보성 및 혼성화를 갖는 이중 가닥과는 전형적으로 구별된다는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 구현예에서, 온전히 닫힌, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산을 위한 원형 구조가 보여 진다, 예를 들어서 본 발명에 따른 핵산이 닫혀있으며, 바람직하게는 공유결합을 통해 닫혀있으며, 보다 더 바람직하게는 그와 같은 공유결합은 본원에 기재된 바와 같이 핵산 서열을 5 말단 및 3 말단 사이에 만들어진다는 점도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 결합상수(binding constants)를 결정할 가능성은 본 발명의 핵산이 유익한 KD 수치 범위를 발휘함을 확인한 하기 실시예에서 개시된 방법을 사용하는 것이다. 개별 핵산 분자 및 본 발명인 경우는 목표 분자 간의 결합 강도(intensity of the binding)를 표현하기 위한 적절한 방법은 당업계에 잘 알려진 측정 방법과 같은 소위 Kd치(Kd value)이다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 특정한 Kd치에 의해 특징화 될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 분자의 Kd치는 1 μM 이하이다. 약 1 μM 정도의 Kd치는 목표 분자에 대한 핵산의 비특이적 결합(nonspecific binding)으로 특정된다고 간주 된다. 당업자에게 인지된 것인 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산과 같은 화합물군의 Kd치가 일정 범위 내에 존재함은 인지될 것이다. 상기한 약 1 μM 정도의 Kd치는 Kd치의 바람직한 상한치에 해당한다. 바람직한 목표 물질 결합 핵산의 Kd치 하한선은 약 10 pM(picomolar) 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명에서 목표 분자와 결합하는 개별적인 핵산의 Kd치는 바람직하게 이 범위 내에 속함도 본 발명의 범주 내이다. 바람직하게는 이 범주 내의 임의의 첫 번째 숫자로 및 이 범주 내의 임의의 두 번째 숫자를 선택함으로서 바람직한 범위가 정의될 수 있다. 바람직한 상위 값은 250 nM 및 100 nM이며, 바람직한 하위 값은 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10 pM이며, 보다 바람직한 Kd치 상한선 2.5 nM이며, 보다 더 바람직한 Kd치 하한선 100pM이다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 결합특성에 추가하여, 본 발명에 따른 핵산 분자는 본원에서는 개개 목표 분자(target molecule)의 기능을 저해한다. 목표 분자의 기능 저해(예를 들어, 상술한 바와 같은 목표 분자의 개개 수용체들의 자극)는 본 발명에 따른 핵산 분자의 목표 분자에 대한 결합 및 본 발명에 따른 핵산 분자 및 목표 분자의 복합체(complex) 형성으로 달성된다. 상기한 핵산 분자 및 목표 분자와의 복합체는 통상적으로는 목표 분자에 의하여 자극되는 수용체를 자극할 수 없다. 결국, 본 발명에 따른 핵산 분자에 의한 수용체 기능의 저해는 목표 분자에 의해서는 자극되나 본 발명에 따른 핵산 분자에 의한 목표 분자에 의하여 수용체 자극을 차단함으로서 자극하는 개개 수용체와는 독립적이다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 저해상수(inhibitory constants)를 결정할 가능성은 본 발명의 핵산이 치료적 치료 스킴(therapeutic treatment scheme)상에서 상기 핵산의 용도를 허용하는 유익한 저해상수를 발휘함을 확인한 하기 실시예에서 개시된 방법을 사용하는 것이다. 개별 핵산 분자의 본 발명인 경우는 목표 분자인 목표에 대한 저해효과의 강도를 표현하기 위한 적절한 방법은 당업계에 잘 알려진 측정 방법과 같은 소위 반 최대치 저해 농도(IC50)이다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산의 IC50 수치는 1 μM 이하이다. 약 1 μM 정도의 IC50 수치는 목표 분자에 대한 핵산의 비특이적 저해(nonspecific inhibition)으로 특정된다고 간주 된다. 당업자에게 인지된 것인 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산분자와 같은 화합물군의 IC50 수치가 일정 범위 내에 존재함은 인지될 것이다. 상기한 약 1 μM 정도의 IC50 수치는 IC50 수치의 바람직한 상한치에 해당한다. 바람직한 목표 물질 결합 핵산의 IC50 수치 하한선은 약 10 pM(picomolar) 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명에서 목표 분자과 결합하는 개별적인 핵산의 IC50 수치는 바람직하게 이 범위 내에 속함도 본 발명의 범주 내이다. 바람직하게는 이 범주 내의 임의의 첫 번째 숫자로 및 이 범주 내의 임의의 두 번째 숫자를 선택함으로서 바람직한 범위가 정의될 수 있다. 바람직한 IC50 수치의 상위 값은 250 nM 및 100 nM이며, 바람직한 하위 값은 50 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM 및 10pM이며, 보다 바람직한 IC50 수치의 상한선 5 nM이며, 보다 더 바람직한 IC50 수치 하한선 1 nM이다.
본 발명의 핵산분자는 목표 분자와 결합하거나 또는 기능을 저해할 수 만 있다면 어떠한 길이일 수도 있다. 본 발명의 핵산 부자의 바람직한 길이는 당업계에 인지가능할 것이다. 전형적으로 15 내지 120 뉴클레오티드(nucleotide) 범위 내이다. 당업자라면 상기 15 내지 120 뉴클레오티드(nucleotide) 범위 내의 어떠한 정수도 본 발명의 핵산분자에 가능한 길이임이 자명할 것이다. 본 발명에 따른 핵산의 바람직한 길이 범위는 약 20 내지 100뉴클레오티드 , 약 20 내지 80뉴클레오티드, 약 20 내지 60 뉴클레오티드, 약 20 내지 54 nucleotides and 약 39 내지 44 뉴클레오티드(nucleotide) 범위이다.
본원에서 개시된 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 높은 분자량 기 및/또는 동물 신체, 바람직하게는 인체 내에서 그들 중에 체류 시간을 통한 핵산 특성을 변형시키는 기를 포함함도 본 발명의 범주 내이다. 상기 변형의 특정 바람직한 구현예는 본 발명에 따른 PEG화 반응(PEGylation) 및 HES화 반응(HESylation)이다. 본원에서 사용되는 PEG는 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol))의 약어이고, HES는 히드록시에틸 전분(hydroxyethyl starch)의 약자로 사용된다. 본원에서 바람직하게 사용되는 PEG화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 PEG기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 본원에서 바람직하게 사용되는 HES화 반응은 본 발명에 따른 핵산에 부착되어 있는 HES기로 구성되는 변형과 같은 핵산의 변형이다. 상기 변형체뿐만 아니라 상기 변형법을 이용하여 핵산을 변형하는 제조방법은 유럽특허출원 EP 1 306 382호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
바람직하게는, 높은 분자량 부위를 함유하거나 구성하고 있는 상기 변형체의 분자량은 구체적으로 매우 높은 분자량 부위인 PEG의 경우에는, 약 2,000 내지 120,000 Da이며, 바람직하게는 약 30,000 내지 80,000 Da이며,가장 바람직하게는 약 40,000 Da인 것이다. 구체적으로 매우 높은 분자량 기인 HES의 경우에는 바람직하게는 약 50 내지 1000 kDa, 보다 더 바람직하게는 100 내지 700 kDa이며, 가장 바람직하게는, 200 내지 500 kDa인 것이다. HES는 0.1 내지 1.5 범위, 바람직하게는 1 내지 1.5 범위의 몰 치환율(molar substitution)을 나타내고, 약 0.1 내지 15 범위, 바람직하게는 3 내지 10 범위의 C2/C6 비(ratio)로 표현되는 치환 시료(substitution sample)를 나타내는 것이다. 이러한 HES 변형의 제조방법은 독일특허출원 제 DE 1 2004 006 249.8호에 개시되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 본원에서 참고로서 그 전체를 인용하는 것이다.
원칙적으로, 본 발명의 핵산 분자의 어떠한 위치에서 만들어질 수 있다. 바람직하게, 그와 같은 변형은 5'-말단 뉴클레오티드, 3-말단 뉴클레오티드 및/또는 핵산 분자의 5뉴클레오티드와 3뉴클레오티드 사이의 어떠한 뉴클레오티드 중 어느 하나에 만들어진다.
상기 변형 및 바람직하게는, 상기 PEG 및/또는 HES기는 본 발명의 핵산 분자와 직접 또는 간접적으로, 바람직하게는 링커(linker)를 통하여 부착되는 것이다. 또한 본 발명에 따르는 핵산 분자가 하나 또는 그 이상의 변형체, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 PEG 및/또는 HES기를 포함함은 본 발명의 범주 내이다. 본 발명의 구현예로서, 상기 독립적인 링커 분자(linker molecule)는 본 발명에 따르는 핵산에 하나 이상의 PEG기 또는 HES기를 부착한다. 본 발명과 관련되어 사용된 링커는 그 자체로 쇄상 또는 가지상이 될 수 있다. 이와 같은 링커는 당업자에게 널리 알려져 있으며, 더 나아가 특허출원 WO2005/074993 및 WO2003/035665에 서술되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 상기 링커는 생분해성 링커(biodegradable linker)이다. 상기 생분해성 링커는 본 발명의 핵산 특성을 다른 특성 중에 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체에서 본 발명의 핵산으로부터 상기 변형체가 유리되도록 함으로서, 체류 시간에 관한 특성이 변형하도록 한다. 생분해성 링커의 사용은 본 발명의 핵산의 체류 시간의 보다 나은 조절을 가능하게 할 수 있을 것이다. 이러한 바람직한 상기 생분해성 링커로는 이에 제한되지는 않으나, 국제특허 출원 WO2006/052790, WO2008/034122, WO2004/092191, WO2005/099768, WO2004/092191 및 WO2005/099768 들에 개시된 바와 같은 생분해성 링커들이다.
상기 변형체는 생분해성 변형체이고, 여기에서 상기 생분해성 변형체는 본 발명의 핵산에 링커와 직접 또는 이를 통하여 부착가능함도 본 발명의 범위 내이다. 상기 생분해성 변형체는 본 발명의 핵산 특성을 다른 특성 중에 동물 신체, 바람직하게는 인간 신체에서 본 발명의 핵산으로부터 상기 변형체가 유리되도록 함으로서, 체류 시간에 관한 특성이 변형하도록 한다. 생분해성 변형체의 사용은 본 발명의 핵산의 체류 시간의 보다 나은 조절을 가능하게 할 수 있을 것이다. 이러한 바람직한 상기 생분해성 변형체의 바람직한 구현예로는 이에 제한되지는 않으나, 국제특허 출원 WO2002/065963, WO2003/070823, WO2004/113394 및 WO2000/41647, 바람직하게는 WO2000/41647 18 페이지, 4 내지 24줄들에 개시된 바와 같은 생분해성 변형체들이다.
상술한 바와 같은 변형체이외에도, 본 발명의 핵산의 특성을 변형하는데 다른 변형체도 사용가능하다. 여기에서 상기 다른 변형체는 단백질(proteins), 콜레스테롤(cholesterol)과 같은 지질(lipid) 아밀라제(Amylase), 덱스트란(dextran) 등과 같은 당사슬(sugar chains)로부터 선택가능하다.
어떠한 이론에 국한되지 않은 범위 내에서, 중합체(polymer)와 같은 고분자량 기, 더욱 상세하게는, 본원에 개시된, 바람직하게는 생리학적으로 수용이 가능한 중합체를 갖는 본 발명에 따른 핵산을 변형시킴에 따라 배출 역학(excretion kinetic)은 변화될 것이다. 더욱 상세하게는, 이러한 변형된 발명적 핵산의 증가된 분자량 및 핵산, 특히 L형인 경우에 대사과정의 대상이 되지 않는 핵산으로 기인하는 경우에 동물세포, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터의 배출은 감소된다. 상기 배출은 신장을 통해 전형적으로 일어나므로, 본원 발명자들은 상기 변형된 핵산의 사구체의 여과속도가 이와 같은 높은 분자량의 변형을 거치지 않아 결과적으로 생체 내의 체류시간이 증가 되는 이러한 고분자량의 변형체를 갖지 않은 핵산과 비교시에 현저하게 감소 된다. 이와 연관지어, 본 발명에 따른 핵산의 특성이 상기와 같은 높은 분자량 변형에도 불구하고 불리한 영향을 받지 않음은 매우 두드러진 사실이다. 지금까지, 본 발명에 따른 핵산은 정상인 경우는 약학 활성 성분으로부터 기대할 수 없는 예를 들어 지체된 방출을 제공하기 위해 지체된 방출속도(sustained release)를 제공하는 약학적 제형이 필수적이지는 않다는 것과 같은 놀라운 특성을 갖는다. 오히려 높은 분자량 부위를 함유하고 있는 변형된 본 발명에 따른 핵산은 서방형(sustained release formulation)으로서 즉시 사용가능하다. 지금까지, 본원에 기재된 핵산의 변형체(들) 및 이리하여 변형된 핵산 분자 및 이를 포함하는 어떠한 조성물은 명확한, 바람직하게는 조절된 약물동력(pharmacokinetics) 및 그들의 생물분소(biodistribution). 이는 또한 조직으로의 순환(circulation) 및 분산(distribution)의 잔류시간(residence time)을 포함한다. 이와 같은 변형체는 특허출원 WO2003/035665에 서술되어 있다. 그러나 본 발명의 핵산이 어떠한 변형, 특히 PEG화 반응(PEGylation) 및 HES화 반응(HESylation)과 같은 고분자 변형을 포함하지 않는 것도 본 발명의 범위 내이다. 이러한 구현예로서 특히 바람직하기로는, 신체의 임의의 목표 기관 또는 조직으로 바람직한 분산을 나타내거나 또는 본 발명의 핵산이 투여 후에 신체로부터 신속하게 배출됨이 요구되는 경우이다. 상기 구현예는 특히 본원에서 개시된 핵산이 신체상의 임의 기관 또는 조직에 선호적인 분산(preferential distribution)을 나타내거나 또는 본원에서 개시된 핵산이 투여후에 신속하게 배출되는 것이 바람직하다. 신체상의 임의 기관 또는 조직에 선호적인 분산양상을 나타내는 본원에서 개시된 핵산은 핵산 분자의 전신적 농도를 낮게 유지하면서 목표 조직에서 국소적으로 효과적인 농도를 나타내는 것이다, 이는 경제적인 관점에서 뿐만 아니라, 핵산 분자 치료제에 대한 다른 조직의 불필요한 노출을 감소시킴으로서, 부작용 위험성을 경감시키는 낮은 농도를 가능하게 할 것이다. 본원에서 개시된 핵산의 투여 후에 신속한 배출은 이와 같은 빠른 제거율은 본 발명의 따른 핵산 또는 이를 포함하는 약제를 사용하는 생체 내 실험 이미징(imaging) 또는 특이적 치료적 투약 요건(specific therapeutic dosing requirements)의 경우에서 바람직하다.
본 발명의 추가적인 측면으로서, 본 발명은 약제(medicament) 또는 진단제(diagnostic agent)의 생성 또는 제조를 위한 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 길항제(antagonists)의 용도(use)에 관한 것이다. 본 발명의 추가적인 측면으로서, 본 발명은 질한(disease)의 치료(treating) 또는 예방(preventing)에서의 본 발명의 핵산 및/또는 본 발명의 길항제(antagonists)의 용도(use)에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 측면으로서, 본 발명은 적어도 본원 발명의 핵산 분자 및 임의적으로 추가적인 약학적 활성 화합물(pharmaceutically active compounds)을 함유한 본 발명의 약학조성물 (pharmaceutical composition )에 관한 것이며, 여기에서 상기 본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 핵산 그 자체가 약학적 활성 화합물로서 작용하는 것이다. 바람직한 구현예로서, 본 발명에 따른 상기 약제 및 약학 조성물(pharmaceutical composition)은 적어도 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함할 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 물, 완충액, PBS, 글루코스 수용액, 바람직하게는 5% 포도당 염 조절 수용액, 전분, 당, 젤라틴 또는 기타 임의의 허용되는 담체 물질 등을 들 수 있다. 상기 담체들은 일반적으로 당업계에 널리 알려져 있다. 당업자에게 있어, 본 발명의 임의의 구현예, 사용 및 측면들 또는 약제는 또한 본 발명의 약학 조성물에게도 적용가능하고 그 반대(vice versa)도 인지 가능할 것이다.
본원 발명의 핵산 분자, 이를 함유한 약제 및/또는 약학조성물은 본원 발명의 핵산 분자와 결합가능한 목표 분자가 관련된, 임의의 질환(disease)의 치료, 예방 및/또는 진단을 위하여 용이하게 사용가능함은 당계에 인지 가능할 것이다. 보다 구체적으로, 상기 질환은 목표분자에 대한 본 발명의 핵산 분자의 결합, 또는 목표 분자의 작용을, 바람직하게는, 본 발명의 핵산을 수단으로 하는 길항이 상기 질환을 치료, 질환을 예방 또는 질환의 증상을 경감시키는데 적합한 모든 질환이다.
본 발명의 약제의 하나의 구현예로서, 상기 약제는 본원에서 개시된 임의 질환, 특히, 본원 발명의 약제가 사용되어야 할, 임의의 질환을 위한 기타 치료법과 조합하여 사용되는 것이다.
본 발명의 약학 조성물의 하나의 구현예로서, 상기 약학조성물은 본원에서 개시된 임의 질환, 특히, 본원 발명의 약제가 사용되어야 할, 임의의 질환을 위한 기타 치료법과 조합하여 사용되는 것이다.
조합 치료법(combination therapy)(또는 공동-치료법 (co-therapy))은 본 발명의 약제 투여 및 적어도 상기 2차 작용제 (second agent) 또는 추가적 치료제를 공동-작용 (co-action)함으로서 유리한 효과를 제공하기 위한 특정 치료 처방 (specific treatment regimen)의 부분으로서, 최소한 2차 작용제를 포함, 즉, 본 발명의 약제 및 상기 2차 작용제 (second agent) 또는 추가적 치료제와의 조합 투여를 포함한다. 상기 조합의 유리한 효과는, 이에 제한되지는 않으나, 치료제들의 조합으로 초래되는 약물동력학적(pharmacokinetic) 또는 약물역학적(pharma codynamic) 공동-작용을 포함한다. 이러한 치료제들의 조합 투여는 전형적으로 한정된 일정 기간(선택된 조합에 따라 보통 분, 시간, 일 또는 주 단위)이상 수행된다.
일반적이지는 않으나, 조합 치료(combination therapy)는 본 발명의 조합을 우발적 및 자발적으로 초래하는 분리된 단독요법 처방의 일부분으로서 2개 이상의 이러한 치료제 조합 투여를 포함하는 의도일 수 있다.
조합 치료는 상기 치료제 투여를 연속적인 순서, 즉 상기 이러한 치료제들의 투여뿐만 아니라 개개 치료제를 상이한 시각에 투여하거나 또는 2개 이상의 치료제들을 실질적 동시 투여방법(substantially simultaneously manner)을 포함할 의도이다. 이러한 실질적 동시 투여 방법은 예를 들어, 고정된 비를 갖는 개개 치료제를 함유한 단일 캡슐 또는 개개 치료제의 다중, 단일 캡슐을 투여객체에 투여함으로써 달성가능하다.
각 치료제의 연속적 또는 실질적 동시 투여방법은 이에 제한되지는 않으나, 국소투여 경로(topocal routes), 경구투여 경로(oral routes), 정맥내투여경로 (intraveneous routes), 근육내 투여 경로(intramuscular routes) 및 점막 조직을 통한 직접 흡수(direct absorption) 경로를 포함하는, 임의의 모든 적절한 경로로 영향을 미칠 수 있다. 상기 치료제들은 동일한 경로 또는 서로 상이한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 조합의 첫 번째 치료제는 주사를 통해 투여되면서, 조합의 또 다른 치료 작용제는 국소적으로 투여될 수도 있다.
호환적으로, 예를 들어, 모든 치료제들은 국소적으로 투여될 수도 있거나 또는 모든 치료제들을 주사로 투여할 수도 있다. 투여되는 치료제의 순서는 별도로 지적하지 않은 한은 엄밀하게 중요하지 않다. 또한 조합 치료는 다른 생물학적 활성 성분들과 추가적인 상기한 치료제와의 조합 투여를 포함할 수도 있다. 상기 조합 치료가 추가적으로 비-약물 치료법(non-drug treatment)을 포함하는 경우는 상기 비-약물 치료법은 상기 치료제 미 비-약물 치료법의 조합상의 공동-작용이 유리한 효과를 유지할 수 있는 한 임의의 적절한 시간동안에도 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 사례에서, 상기 비-약물 치료법이 치료제의 투여로부터 일시적, 아마도 수일 또는 수주일 동안 제거될 때에도 상기 유리한 효과는 달성될 수 있다.
상기와 같이 일반적인 정의로 실시된 바와 같이, 본 발명에 따른 약제는 원칙적으로 당업자에게 알려진 임의의 형태로 투여될 수 있다. 바람직한 투여경로는 전신 투여법이며, 보다 바람직하게는 비경구적 투여법, 가장 바람직하게는 주사법이다. 호환적으로, 상기 약제는 국소 투여가 가능하다. 기타 투여 경로로는 근육 투여법, 복강 투여법, 피하 투여법, 경구 투여 또는 바람직하게는 효능을 유지하면서도 최소한 침투성을 갖는 투여 경로가 주어지는 선호도를 갖는 비강 투여법(intranasal), 기관내 투여(intratracheal) 또는 경폐 투여법(pulmonary)들이다.
비경구 투여는 일반적으로 피하, 근육 내 또는 정맥내 주사 또는 주입으로 사용된다. 추가적으로, 비경구 투여를 위한 하나의 접근법으로 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 일정한 투여용량을 유지하게 보장하는 지연성 방출 시스템 또는 서방성 방출 시스템의 적용 방법도 포함한다.
더 나아가, 본 발명의 바람직한 약제는 당업계에 종사하는 자에게 잘 알려진, 적절한 비강 매개물, 흡입기의 국소적 사용을 통해 경비 투여 형태, 또는 경피 투여 피부용 패취(transdermal skin patches) 형태와 같은 형태를 이용한 경피 경로(transdermanl route)를 통해 투여될 수 있다. 경피 전달 시스템(transdermal delivery system)의 형태로 투여되기 위해서는, 상기 용량 투여(dosage administration)는 물론, 용량 처방(dosage regimen) 내내 간헐적 보다는 연속적 투여용량일 것이다. 기타 바람직한 국소 제제로는 전형적으로 활성 성분 농도가 0.01% 내지 15%(w/w 또는 w/v)인, 크림제(creams), 연고제(ointments), 로션제(lotions), 분무제(sprays) 및 겔제(gels)를 포함한다.
본 발명의 방법에 이롭게 반응하는 객체(Subjects)는 의학적 및 수의학적 객체, 일반적으로 인간 및 인간 환자를 포함한다. 본 발명의 방법 및 수단이 유용한 기타 다른 객체로는 고양이, 개, 대동물, 닭 및 그 유사동물과 같은 조류를 포함한다.
본 발명의 약제는 일반적으로, 이에 한정되지는 않으나, 약학적으로 허용된 매질에 용해 또는 분산된 본 발명의 핵산을 포함하는, 치료학적으로 유효량의 활성 작용제를 포함할 것이다. 약학적으로 허용가능한 매질 또는 담체로는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균성 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 저해제 및 그 유사체를 포함한다. 이러한 약학적 활성 물질을 위한 이와 같은 매질 및 작용제의 사용은 이미 당업계에 잘 알려져 있다. 보조 활성 성분(supplementary active ingredient)도 또한 본 발명의 약제 내에 혼입될 수도 있다.
본 발명의 추가적인 측면은 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산, 및 바람직하게는 약학적으로 허용된 담체(vehicle)를 함유한다. 상기 담체는 당업계에 공지 및/또는 사용되는 임의의 담체 또는 임의의 결합제(binder)일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 결합제 또는 담체는 본원에 개시된 약제의 제조와 관련되어 실시한 임의의 결합제 또는 담체이다. 추가적인 구현예로서, 상기 약학 조성물은 추가적인 약학 활성 성분을 포함하는 것이다.
약제 및 약학 조성물의 제조는 본원 개시 내용으로 보아 당업계에 종사하는 자에게 널리 알려진 것일 것이다. 전형적으로, 상기 조성물은 액제 또는 현탁제와 같은 주사가능 형태; 주사 전에 현탁제 또는 액제 내의 용액을 위해 적절한 고형 형태; 경구투여를 위한 정제 또는 기타 고형물; 시간 방출형 캡슐제; 또는 안약, 크림, 로션, 연고, 흡입제 등을 포함하는 현재 통상적으로 사용되는 형태로 제조될 수 있다. 외과의사, 내과의사 또는 보건직이 수술분야에서 특정 부위를 치료하기 위해 사용하는, 예를 들어 염수-기초 세척제(saline-based washes)와 같은 멸균된 제형의 사용도 특히 유용할 수 있다. 조성물은 또한 마이크로장치(microdevice), 미세입자 (microparticle) 또는 스폰지(sponge)를 통해 운반될 수도 있다.
제형에 있어서, 약제는 용량 제형과 양립될 수 있는 방법으로 투여될 수 있으며, 상기 함량은 약학적으로 효과적인 것이다. 상기 제형은 상술한 주사제 형태와 같은, 다양한 투여용량 형태로 용이하게 투여될 수 있으나 약물 방출형 캡슐 및 그 유사체도 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 약제는 이와 같은 지효성 및 서방성 정제 또는 캡슐, 환약, 분말, 과립제, 엘렉시르(elixirs), 팅크제(tinctures), 현탁제, 시럽제 및 유화 액제(emulsion)와 같은 경구 투여 형태로 투여될 수도 있다. 좌약(suppositories)은 지방성 유화액제 또는 현탁액제에서 유리하게 제조된다.
상기 약학조성물 또는 약제는 살균될 수 있거나 또는 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제와 같은 보조제, 용액 촉진제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액을 함유할 수 있다. 추가적으로, 그들은 또한 기타 치료적으로 유용한 성분들을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 통상적 혼합법, 과립화법, 또는 코팅법에 따라 전형적으로 활성 성분의 약 0.1% 내지 75%, 바람직하게는 1% 내지 50%을 함유하여 제조된다.
액제, 특히 주사용 조성물은, 예를 들어, 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 상기 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매, 예를 들어, 물, 식염수, 수용성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해되거나 혼합될 수 있으며, 이로써 주사용 용액 또는 현탁액을 생성한다. 추가적으로, 주사 전 액체 용해에 적절한 고형 형태는 제조될 수 있다.
본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 예를 들어 소형 단층 소포 (small unilamellar vesicles), 대형 단층 소포(large unilamellar vesicles) 및 다층 소포(multilamellar vesicles)과 같은 리포좀 전달 시스템(liposome delivery system)의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀(liposome)은 콜레스테롤, 스테아릴아민(stearylamine) 또는 포스페티딜콜린 (phosphatidylcholines)을 포함하는 다양한 인지질(phospholipids)로부터 형성될 수 있다. 몇몇 구현예로서, 당업계에 널리 알려진 바와 같이, 지질 성분의 필름이 약물의 수용액으로 수화되어 약물을 캡슐화한 지질층을 제조할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 상술하고 있는 핵산 분자는 당업계에 널리 알려진 제조방법을 이용하여 구성되는, 친유성 화합물 또는 비-면역성(non-immuogenic), 고분자량 화합물로 복합체(complex) 형태로 제공될 수 있다. 추가적으로, 리포좀은 세포 독성을 내부적으로 매개하는 세포 독성제(cytotoxic agent)를 목표 또는 운반하기 위하여 그 표면상에 상기 핵산 분자를 함유할 수 있다. 핵산 수반 복합체의 예는 미국 특허번호 제 6,011,020호에서 제공된다.
본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 표적 가능한 약물 운반체로서 가용성 중합체와 결합될 수 있다. 상기 중합체로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrro lidone), 피란 공중합체(pyran copolymer), 폴리히드록시프로필-메트아크릴아미드-페놀(polyhydroxypropyl-methacrylamide-phenol), 폴리히드록시에틸아스판아미드페놀(polyhydroxyethylaspanamidephenol), 또는 팔미토일기(palmitoyl residue)로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신 (polyethylene oxide polylysine)을 포함할 수 있다. 게다가, 본 발명의 약제 및 핵산 분자는, 각각 약물 방물 조절에 유용한 생분해성 중합체 (biodegradable polymer)류, 예를 들어, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리엡실론 카프로 락톤(polyepsilon capro lactone), 폴리히드록시 부티르산 (polyhydroxy butyric acid), 폴리오로토에스테르(polyorthoesters), 폴리아세탈(polyacetals), 폴리히드로피란(polydihydropyrans), 폴리시아노아크릴레이트 (polycyanoacrylates) 및 가교화 또는 양친매성 하이드로젤 블록 공중합체(block copolymer)와 결합될 수 있다.
요구된다면, 상기 투여될 약학조성물 및 약제는, 각각 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 미량의 비독성 보조 물질(non-toxic auxiliary substance) 및 나트륨 아세테이트(sodium acetate) 및 트리에탄올아민 올레이트(triethanolamine oleate)와 같은 기타 물질을 미량 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각을 이용하는 용량 처방(dosage regimen)은 환자의 유형, 종, 나이, 무게, 성 및 건강 상태; 치료될 상태 정도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 적용되는 특정 압타머 및 이들의 염을 포함한 다양한 요인에 따라 선정된다. 당업계에 숙련된 의사 또는 수의사는 병적 상태의 진행을 저해, 대항(counter) 또는 저지(arrest)하기 위해 요구되는 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산의 효과적인 혈장 수준은 본원에 개시된 모든 질병의 치료에 있어서 바람직하게는 500 fM 내지 200 , 바람직하게는, 1 nM 내지 20 , 보다 바람직하게는 5 nM 내지 20 , 가장 바람직하게는 50 nM 내지 20 의 범위이다.
본 발명의 핵산 분자 및 약제, 각각은 바람직하게는 매일, 매 둘째 또는 셋째 날, 매주, 매 둘째 주당 단회 투여용법, 또는 매달 또는 매 셋째 달 당일 투여용법으로 투여될 수 있다.
본원에서 개시된 약제가 본원에 개시된 약학조성물을 구성한다는 것도 본 발명의 범위 내이다.
본 발명의 추가적인 측면으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 유효량의 하나 이상의 핵산을 치료가 요구되는 객체에 투여함을 포함하는, 치료 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예로서, 상기 객체는 질병으로부터 고통받거나 이와 같은 질병으로 진행될 위험성이 있으며, 여기에서 상기 질병은 본원에서 개시된 임의의 질병, 특히 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 임의의 핵산의 사용과 연관된 임의의 질병이다.
본 발명에 따른 핵산뿐만 아니라 길항제는 약제 또는 약제의 제조뿐만 아이라 화장품적 용도(cosmetic purposes)로 사용될 수 있는 것으로 인식되어야 할 것이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 진단(diagnostic) 또는 진단제(diagnostic agent) 또는 진단 수단(diagnostic means)은 목표(본원에서는 글루카곤 또는 SIP)를 직접 또는 간접적으로 탐지하기에 적합한 것이다. 상기 진단은 목표(target)(본원에서는 글루카곤 또는 SIP)과 관련된 임의의 장애(disorder) 및 질환(disease)을 탐지(setection) 및/또는 추적치료 (follow-up)을 하기에 적합한 것이다. 상기 탐지( detection)는 목표에 대한 본 발명의 핵산의 결합을 통하여 가능하다. 상기 결합(binding)은 직접 또는 간접적으로 탐지될 수 있다. 개개의 방법 및 수단들은 당업자에게 공지되었다. 이들 중에서, 본 발명의 핵산은 본 발명에 따른 핵산, 바람직하게는 목표에 결합하는 핵산을 탐지하게 하는 라벨(label)을 포함가능하다. 상기 라벨은 바람직하게는, 방사성(radioactive), 효소성(enzymatic) 및 형광성(fluorescent) 라벨을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다. 원칙적으로, 항체개발을 위한 모든 공지된 어세이법(assay)을 본 발명의 핵산에 적용가능하나, 목표-결합 항체( target-binding antibody)은 목표-결합 핵산(target-binding nucleic acid)으로 치환되는 것이다. 비표지 목표-결합 항체(unlabeled target-binding antibodies)을 이용한 항체-어세이법(antibody-assays)에서, 상기 탐지는 바람직하게는, 방사성(radioactive), 효소성(enzymatic) 및 형광성(fluorescent) 라벨로 변형되고 이의 Fc-단편(fragment)에서 목표-결합 항체와 결합하는 2차 항체(secondary antibody)에 의하여 수행되는 것이다. 핵산, 바람직하게는, 본 발명의 핵산의 경우에, 상기 핵산(nucleic acid)은 상기 라벨로 변형되고 여기에서 상기 라벨은 바람직하게는, 비오틴(biotin), Cy-3 및 Cy-5을 포함하는 군으로부터 선택된 것이며 상기 라벨은 이러한 라벨, 예를 들어, 항-비오틴 항체 (anti-biotin antibody), 항-Cy3 항체 (anti-Cy3 antibody) 또는 항- Cy5 항체 (anti-Cy5 antibody)에 대한 항체 또는 상기 라벨이 비오틴인 경우는 상기 라벨은 비오틴과 자연적으로 결합하는 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)에 의하여 탐지된다. 상기 항체, 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin)은 바람직하게는 개개 라벨, 예를 들어, 방사성(radioactive), 효소성(enzymatic) 및 형광성(fluorescent) 라벨로 변형( 2차 항체와 같이)되는 것이다.
본원 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 2차 탐지 수단(second detection means)에 의하여 탐지 또는 분석되는 것이며, 여기에서 상기 탐지 수단은 분자 비콘(molecular beacon)인 것이다. 분자 비콘의 방법론적 내용은 당업자에게 공지되어 있으며 문헌에 보고되었다(Mairal et al., 2008).
목표의 검출과 관련하여, 바람직한 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 모교(target)의 존재를 시험할 시료를 제공하는 단계,
(b) 본 발명에 따른 핵산을 제공하는 단계,
(c) 핵산과 시료를, 바람직하게는 반응용기 내에서 반응시키는 단계,
상기 단계 (a)는 단계 (b) 이전에 수행, 또는 단계 (b)는 단계 (a) 이전에 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 핵산과 시료간의 반응을 검출하는 단계로 구성되는 추가적인 단계 (d)가 제공된다. 바람직하게는, 단계 (b)의 상기 핵산은 표면에 고정화된다. 상기 표면은 반응 튜브 (reaction tube), 플레이트의 웰, 또는 예를 들어 비드 (bead)와 같은 이러한 반응 용기 내에 포함된 장치 표면일 수 있다. 상기 표면에 대한 상기 핵산의 고정화는 당업자에게 잘 알려진 임의의 수단, 이네 한정되지는 않으나 비공유 또는 공유 결합으로도 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 (linkage)은 상기 표면과 상기 핵산간의 공유 화합결합을 통해 성립된다. 그러나 상기 핵산이 표면에 간접적으로 고정화되는 것, 여기에서 상기 간접적 고정화는 추가적인 구성성분 (further component) 또는 상호작용 파트너 (interaction partner)의 쌍의 사용과 관련됨도 또한 본 발명의 범위 내이다. 상기의 추가적인 구성성분은, 바람직하게 상호작용 파트너로도 불리는 고정화될 핵산과 특이적으로 상호작용하여, 표면에 핵산 부착을 매개하는 화합물이다. 상기 상호작용 파트너는 바람직하게는 핵산, 폴리펩티드 (polypeptide), 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 바람직하게 상호작용 파트너는 항체, 보다 바람직하게는 단일 클론 항체 (monoclonal antibody)이다. 호환적으로, 상기 상호작용 파트너는 핵산, 바람직하게는 기능성 핵산(functional nucleic acid)이다. 보다 바람직하게는, 상기 기능성 핵산은 압타머 (aptamer), 스피에겔머 (spiegelmer) 및 핵산에 최소한 부분적으로 상보적인 핵산을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 보다 추가적인 구현예로서, 상기 표면으로의 상기 핵산의 상기 결합은 다중-분산형 상호작용 파트너 (multi-partite interaction partner)에 의해서 중재된다. 상기 다중-분산형 상호작용 파트너는, 바람직하게는 상호작용 파트너의 쌍 또는 첫 번째 멤버 (member) 및 두 번째 멤버로 구성되는 상호작용 파트너이며, 여기에서 상기 첫 번째 멤버는 상기 핵산에 의해 포함되거나 부착되며, 두 번째 멤버는 상기 표면에 부착되거나 포함되는 것이다. 상기 다중-분산형 상호작용 파트너는 바람직하게는 비오틴 (biotin) 및 아비딘 (avidin), 비오틴 (biotin) 및 스트렙타비딘 (streptavidin) 및 비오틴 (biotin) 및 뉴트라비딘 (neutravidin)을 포함하는 상호작용 파트너의 쌍의 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 상호작용 파트너의 쌍의 첫 번째 멤버는 비오틴 (biotin)이다.
상기 방법의 바람직한 결과는 목표 및 상기 핵산의 고정화 복합체 (immobilised complex)의 형성이며, 보다 바람직하게는 상기 복합체는 검출되는 것이다. 상기 복합체로부터 상기 목표를 검출되는 것은 구현예의 범위 내이다.
이러한 요건에 상응하는 각각의 검출 방법은 예를 들어, 상기 목표의 해당/해당(들)에 특이적인 임의의 검출 방법이다. 특히 바람직한 검출 수단은 당업자들에게 있어서 그 제조법이 잘 알려진, 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 군으로부터 선택된 검출 수단 (detection means)이다.
목표의 검출을 위한 방법은 또한 시료를 단계 (c)를 수행하는데 바람직하게 사용되는 반응 용기로부터 제거하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 본 발명의 추가적인 구현예로서, 표면상, 바람직하게는 상기에서 정의된 표면상에서 목표의 상호작용 파트너를 고정화하는 단계를 또한 포함하는 것이며, 여기에서 상기 상호작용 파트너는 본원에서 정의되며, 바람직하게는 각각 방법과 관련하여 상기와 같은, 보다 바람직하게는 그 다양한 구현예에서 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 항체를 포함하는 것이다. 이 구현예로서, 특히 바람직한 검출 수단은 본 발명에 따른 핵산이며, 여기에서 상기 핵산은 표지되거나 또는 표지되지 않은 것이다. 상기 핵산이 표지된 경우에는, 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 상기 검출은 또한 핵산, 폴리펩티드, 단백질 및 본원에 개시된 다양한 구현예에서의 구현예를 포함하는 군으로부터 선택된 이차 검출 수단 (second detection means)의 사용도 관여될 수 있다. 상기 검출 수단은 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산에 특이적이다. 보다 바람직한 구현예로서 상기 이차 검출 수단 (second detection means)은 분자 비콘 (molecular beacon)이다. 상기 핵산 또는 상기 이차 검출 수단 중 어느 하나 또는 이들 모두는 바람직한 구현예로서 검출용 표지 (detection label)를 포함하는 것이다. 상기 검출용 표지는 바람직하게는 비오틴, 브로모-디속시우리딘 표지 (bromo-desoxyuridine label), 디곡시게닌 표지 (digoxigenin label), 형광 표지 (fluorescence label), UV-표지 (UV-label), 방사성-표지 (radio-label) 및 킬레이트제 분자 (chelator molecule)를 포함하는 군으로부터 선택됨이 바람직하다. 호환적으로, 상기 이차 검출 수단은 바람직하게는 상기 핵산이 함유 (contained), 포함 (comprised) 또는 부착 (attached)되어 있는 검출용 표지 (detection label)와 상호작용하는 것이다. 특히 바람직한 조합은 하기와 같다:
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 비오틴에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 아비딘 (avidin) 또는 아비딘 운반 분자 (avidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 스트렙타비딘 (streptavidin) 또는 스트렙타비딘 운반 분자 (streptavidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 비오틴이고 이차 검출 수단은 뉴트라비딘 (neutravidin) 또는 뉴트라비딘 운반 분자 (neutravidin carrying molecule)이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 브로모-디속시우리딘 (bromo-desoxyuridine)이고 이차 검출 수단은 브로모-디속시유리딘 (bromo-desoxyuridine)에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서,
상기 검출용 표지는 디곡시게닌 (digoxigenin)이고 이차 검출 수단은 디곡시게닌 (digoxigenin)에 직접적으로 대항하는 항체이거나 또는 여기에서
상기 검출용 표지는 킬레이트제 (chelator)이고 이차 검출 수단은 방사성 핵종 (radio-nuclide)이며, 여기에서, 바람직하게는 상기 검출용 표지는 상기 핵산에 부착되는 것이다. 이와 같은 조합 (combination)의 종류는 상기 표지에 상기 핵산이 부착되는 구현예에서도 적용가능하다는 것으로 이해되어야 할 것이다. 이와 같은 구현예로서, 상기 검출용 표지는 상기 상호작용 파트너 (interaction partner)에 부착되는 것이 바람직하다.
마지막으로, 상기 이차 검출 수단은 3차 검출 수단 (third detection means), 바람직하게는 3차 검출 수단은 효소이며, 보다 바람직하게는 이차 검출 수단의 검출에서 효소 반응을 나타내는 3차 검출 수단을 이용하여 검출되거나, 또는 상기 3차 검출 수단은 방사능 검출용 수단, 보다 바람직하게는 방사성 핵종 (radio-nuclide)에 의해 방출되는 방사능을 이용한 방사능 검출용 수단을 이용하여 검출함도 또한 본 발명의 범위 내이다. 바람직하게는, 3차 검출 수단은 2차 검출 수단을 특이적으로 검출 및/ 또는 상호작용하는 것이다.
또한 본 발명의 하나의 구현예로서, 표면상에 고정화되는 목표의 상호작용 파트너 (interaction partner) 및 본 발명에 따른 핵산을, 바람직하게는 목표와 상호작용 파트너 (interaction partner) 간에 형성된 상기 복합체에 첨가하는 것이며, 상기 시료는 반응으로부터, 보다 바람직하게는 단계 (c) 및/또는 단계 (d)가 수행되는 반응 용기 (reaction vessel)로부터 제거될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산은 형광성 기 (fluorescence moiety)를 포함하며, 상기 형광성 기 (fluorescence moiety)의 형광은 상기 핵산과 목표 및 유리형 목표(free target) 간의 복합체 형성면에서 상이하다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 상기 핵산은 본 발명에 따른 핵산 유도체(derivative)이며, 여기에서 상기 핵산 유도체는 아데노신 (adenosine)을 대체하는 하나 이상의 형광성 유도체 (fluorescent derivative)를 포함한다. 바람직한 구현예로서, 상기 아데노신의 형광성 유도체는 에테노아데노신 (ethenoadenosine)이다.
본 발명의 추가적인 구현예로서, 본 발명에 따른 핵산 유도체 및 상기 목표로 구성되는 복합체를 형광도 (fluoreacence)를 이용하여 검출하는 것이다.
상기 방법의 구현예로서, 신호 (signal)는 단계 (c) 또는 단계 (d)에서 발생되며, 상기 신호는 바람직하게는 시료 내의 목표의 농도와 상호관련성을 갖는 것이다.
본 발명의 바람직한 측면으로서, 상기 어세이법 (assay)은 96웰 플레이트에서 수행될 수 있으며, 그 구성성분들이 상술된 바와 같은 반응 용기 내에서 고정화되며 상기 웰들은 반응 용기 역할을 하는 것이다.
당업자에게 있어 본원에 개시된 바와 같은 글루카곤과 결합가능한 핵산 분자, 보다 구체적으로는, 본 발명의 실시예 부분의 핵산 분자가 본 발명의 핵산 분자의 구현예들임은 당업자에게 이해될 것이다.
당업자에게 있어 본원에 개시된 바와 같은 S1P과 결합가능한 핵산 분자, 보다 구체적으로는, 본 발명의 실시예 부분의 핵산 분자가 본 발명의 핵산 분자의 구현예들임은 당업자에게 이해될 것이다.
당업자에게 있어 본원에 개시된 바와 같은 CGRP과 결합가능한 핵산 분자, 보다 구체적으로는, 본 발명의 실시예 부분의 핵산 분자가 본 발명의 핵산 분자의 구현예들임은 당업자에게 이해될 것이다.
당업자에게 있어 본원에 개시된 바와 같은 C5a과 결합가능한 핵산 분자, 보다 구체적으로는, 본 발명의 실시예 부분의 핵산 분자가 본 발명의 핵산 분자의 구현예들임은 당업자에게 이해될 것이다.
본 발명에 따른 상기 핵산 분자 및 본원에서 사용된 바와 같은 목표 분자 (target molecules)의 다양한 서열번호(SEQ.ID.Nos.), 화학적 본질, 이의 실질적인 서열 및 내부 참고번호(internal reference number)는 하기 표에 요약된다.
SEQ ID NO RNA/
Peptide 		Internal Reference Sequence 5’3’
1 L-Peptide CGRP ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKN
NFVPTNVGSKAF-NH2
2 L-Peptide Human C5a TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVN
NDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVAS
QLRANISHKDMQLGR
3 L-Peptide Biotin-Glucagon HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-Biotin
4 L-Peptide Glucagon HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT
5 L-RNA L-S1P-215-F9-002 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
6 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D01 dG CGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
7 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D02 G dC GUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
8 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D03 GC dG UGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
9 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D04 GCG dT GAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
10 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D05 GCGU dG AAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
11 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D06 GCGUG dA AUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
12 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D07 GCGUGA dA UAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
13 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D08 GCGUGAA dT AGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
14 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D09 GCGUGAAU dA GCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
15 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D10 GCGUGAAUA dG CCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
16 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D11 GCGUGAAUAG dC CGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
17 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D12 GCGUGAAUAGC dC GUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
18 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D13 GCGUGAAUAGCC dG UUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
19 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D14 GCGUGAAUAGCCG dT UGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
20 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D15 GCGUGAAUAGCCGU dT GAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
21 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D16 GCGUGAAUAGCCGUU dG AAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
22 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D17 GCGUGAAUAGCCGUUG dA AACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
23 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D18 GCGUGAAUAGCCGUUGA dA ACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
24 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D19 GCGUGAAUAGCCGUUGAA dA CGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
25 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D20 GCGUGAAUAGCCGUUGAAA dC GCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
26 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D21 GCGUGAAUAGCCGUUGAAAC dG CCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
27 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D22 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACG dC CUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
28 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D23 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGC dC UUUAGAGAAGCACUAGCACGC
29 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D24 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCC dT UUAGAGAAGCACUAGCACGC
30 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D25 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCU dT UAGAGAAGCACUAGCACGC
31 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D26 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUU dT AGAGAAGCACUAGCACGC
32 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D27 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUU dA GAGAAGCACUAGCACGC
33 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D28 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUA dG AGAAGCACUAGCACGC
34 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D29 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAG dA GAAGCACUAGCACGC
35 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D30 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGA dG AAGCACUAGCACGC
36 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D31 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAG dA AGCACUAGCACGC
37 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D32 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGA dA GCACUAGCACGC
38 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D33 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAA dG CACUAGCACGC
39 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D34 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAG dC ACUAGCACGC
40 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D35 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGC dA CUAGCACGC
41 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D36 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCA dC UAGCACGC
42 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D37 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCAC dT AGCACGC
43 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D38 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACU dA GCACGC
44 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D39 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUA dG CACGC
45 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D40 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAG dC ACGC
46 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D41 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGC dA CGC
47 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D42 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCA dC GC
48 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D43 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCAC dG C
49 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D44 GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACG dC
50 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D21-22 GCGUGAAUAGCCGUUGAAAC dGdC CUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
51 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D21-19 GCGUGAAUAGCCGUUGAA dA C dG CCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
52 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D21-19-22 GCGUGAAUAGCCGUUGAA dA C dGdC CUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
53 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32 dG CGUGAAUAGCCGUUGAA dA C dG CCUUUAGAGA dA GCACUAGCACGC
54 L-DNA / L-RNA L-S1P-215-F9-002-D01-11-19-21-32 dG CGUGAAUAG dC CGUUGAA dA C dG CCUUUAGAGA dA GCACUAGCACGC
55 L-RNA 226-F2-001 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
56 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D01 dC CGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
57 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D02 C dC GUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
58 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D03 CC dG UGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
59 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D04 CCG dT GCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
60 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D05 CCGU dG CUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
61 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D06 CCGUG dC UGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
62 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D07 CCGUGC dT GUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
63 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D08 CCGUGCU dG UCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
64 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D09 CCGUGCUG dT CGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
65 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D10 CCGUGCUGU dC GGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
66 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D11 CCGUGCUGUC dG GAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
67 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D12 CCGUGCUGUCG dG AGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
68 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D13 CCGUGCUGUCGG dA GACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
69 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D14 CCGUGCUGUCGGA dG ACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
70 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D15 CCGUGCUGUCGGAG dA CUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
71 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D16 CCGUGCUGUCGGAGA dC UACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
72 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D17 CCGUGCUGUCGGAGAC dT ACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
73 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D18 CCGUGCUGUCGGAGACU dA CUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
74 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D19 CCGUGCUGUCGGAGACUA dC UCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
75 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D20 CCGUGCUGUCGGAGACUAC dT CGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
76 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D21 CCGUGCUGUCGGAGACUACU dC GUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
77 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D22 CCGUGCUGUCGGAGACUACUC dG UCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
78 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D23 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCG dT CGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
79 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D24 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGU dC GAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
80 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D25 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUC dG AGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
81 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D26 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCG dA GUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
82 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D27 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGA dG UAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
83 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D28 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAG dT AGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
84 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D29 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGU dA GAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
85 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D30 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUA dG AAAUAGGUCCCCUCCCACGG
86 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D31 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAG dA AAUAGGUCCCCUCCCACGG
87 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D32 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGA dA AUAGGUCCCCUCCCACGG
88 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D33 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAA dA UAGGUCCCCUCCCACGG
89 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D34 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAA dT AGGUCCCCUCCCACGG
90 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D35 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAU dA GGUCCCCUCCCACGG
91 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D36 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUA dG GUCCCCUCCCACGG
92 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D37 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAG dG UCCCCUCCCACGG
93 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D38 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGG dT CCCCUCCCACGG
94 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D39 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGU dC CCCUCCCACGG
95 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D40 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUC dC CCUCCCACGG
96 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D41 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCC dC CUCCCACGG
97 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D42 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCC dC UCCCACGG
98 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D43 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCC dT CCCACGG
99 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D44 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCU dC CCACGG
100 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D45 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUC dC CACGG
101 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D46 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCC dC ACGG
102 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D47 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCC d ACGG
103 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D48 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCA dC GG
104 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D49 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCAC dG G
105 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D50 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACG dG
106 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D41/D44 CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCC dC CU dC CCACGG
107 L-RNA NOX-D19001 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
108 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D01 dG CCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
109 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D02 G dC CUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
110 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D03 GC dC UGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
111 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D04 GCC dU GAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
112 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D05 GCCU dG AUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
113 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D06 GCCUG dAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
114 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D07 GCCUGAdUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
115 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D08 GCCUGAUdGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
116 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
117 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D10 GCCUGAUGUdGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
118 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D11 GCCUGAUGUGdGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
119 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D12 GCCUGAUGUGGdUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
120 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D13 GCCUGAUGUGGUdGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
121 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D14 GCCUGAUGUGGUGdGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
122 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D15 GCCUGAUGUGGUGGdUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
123 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D16 GCCUGAUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
124 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D17 GCCUGAUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
125 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D18 GCCUGAUGUGGUGGUGAdAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
126 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D19 GCCUGAUGUGGUGGUGAAdGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
127 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D20 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGdGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
128 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D21 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGdGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
129 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D22 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGdUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
130 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D23 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUdUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
131 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D24 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUdGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
132 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D25 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGdUUGGGUGUCGACGCACAGGC
133 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D26 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUdUGGGUGUCGACGCACAGGC
134 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D27 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUdGGGUGUCGACGCACAGGC
135 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D28 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGdGGUGUCGACGCACAGGC
136 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D29 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGdGUGUCGACGCACAGGC
137 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D30 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCACAGGC
138 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D31 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUdGUCGACGCACAGGC
139 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D32 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCACAGGC
140 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D33 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUdCGACGCACAGGC
141 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D34 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCdGACGCACAGGC
142 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D35 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGdACGCACAGGC
143 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D36 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGAdCGCACAGGC
144 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D37 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACdGCACAGGC
145 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D38 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGdCACAGGC
146 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D39 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCdA CAGGC
147 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D40 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA dC AGGC
148 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D41 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCAC dA GGC
149 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D42 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACA dG GC
150 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D43 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAG dG C
151 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D44 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGG dC
152 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-30 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCACAGGC
153 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-32 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCACAGGC
154 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-40 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCA dC AGGC
155 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D30-32 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCACAGGC
156 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D30-40 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA dC AGGC
157 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D32-40 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA dC AGGC
158 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-30-32 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCACAGGC
159 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-30-40 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA dC AGGC
160 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-32-40 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGdUCGACGCA dC AGGC
161 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D30-32-40 GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
162 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-30-32-40 GCCUGAUGdUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
163 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-16-30-32-40 GCCUGAUGdUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
164 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-17-30-32-40 GCCUGAUGdUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
165 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40
(= NOX-D19001-6xDNA)		 GCCUGAUGdUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
166 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D07-30 GCCUGAdUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCACAGGC
167 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D07-30-40 GCCUGAdUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGUCGACGCA dC AGGC
168 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D07-30-32-40 GCCUGAdUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
169 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D07-16-30-32-40 GCCUGAdUGUGGUGGUdGAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
170 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D07-17-30-32-40 GCCUGAdUGUGGUGGUGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
171 L-DNA / L-RNA NOX-D19001-D07-16-17-30-32-40 GCCUGAdUGUGGUGGUdGdAAGGGUUGUUGGGdUGdUCGACGCA dC AGGC
172 L-RNA NOX-G11stabi2 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
173 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D01 dC AGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
174 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D02 C dA GACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
175 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D03 CA dG ACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
176 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D04 CAG dA CGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
177 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D05 CAGA dC GUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
178 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D06 CAGAC dG UGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
179 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D07 CAGACG dT GUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
180 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D08 CAGACGU dG UGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
181 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D09 CAGACGUG dT GUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
182 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D10 CAGACGUGU dG UGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
183 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D11 CAGACGUGUG dT GGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
184 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D12 CAGACGUGUGU dG GGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
185 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D13 CAGACGUGUGUG dG GUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
186 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D14 CAGACGUGUGUGG dG UAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
187 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D15 CAGACGUGUGUGGG dT AGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
188 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D16 CAGACGUGUGUGGGU dA GAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
189 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D17 CAGACGUGUGUGGGUA dG AUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
190 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D18 CAGACGUGUGUGGGUAG dA UGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
191 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D19 CAGACGUGUGUGGGUAGA dT GCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
192 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D20 CAGACGUGUGUGGGUAGAU dG CACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
193 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D21 CAGACGUGUGUGGGUAGAUG dC ACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
194 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D22 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGC dA CCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
195 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D23 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCA dC CUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
196 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D24 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCAC dC UGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
197 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D25 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACC dT GCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
198 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D26 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCU dG CGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
199 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D27 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUG dC GAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
200 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D28 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGC dG AUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
201 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D29 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCG dA UUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
202 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D30 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGA dT UCGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
203 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D31 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAU dT CGCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
204 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D32 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUU dC GCUAAAAAGUGCCACACGUCUG
205 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D33 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUC dG CUAAAAAGUGCCACACGUCUG
206 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D34 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCG dC UAAAAAGUGCCACACGUCUG
207 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D35 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGC dT AAAAAGUGCCACACGUCUG
208 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D36 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCU dA AAAAGUGCCACACGUCUG
209 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D37 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUA dA AAAGUGCCACACGUCUG
210 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D38 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAA dA AAGUGCCACACGUCUG
211 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D39 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAA dA AGUGCCACACGUCUG
212 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D40 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAA dA GUGCCACACGUCUG
213 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D41 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAA dG UGCCACACGUCUG
214 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D42 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAG dT GCCACACGUCUG
215 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D43 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGU dG CCACACGUCUG
216 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D44 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUG dC CACACGUCUG
217 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D45 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGC dC ACACGUCUG
218 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D46 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCC dA CACGUCUG
219 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D47 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCA dC ACGUCUG
220 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D48 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCAC dA CGUCUG
221 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D49 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACA dC GUCUG
222 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D50 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACAC dG UCUG
223 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D51 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACG dT CUG
224 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D52 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGU dC UG
225 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D53 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUC dT G
226 L-DNA / L-RNA NOX-G11-D54 CAGACGUGUGUGGGUAGAUGCACCUGCGAUUCGCUAAAAAGUGCCACACGUCU dG
227 L-DNA 257-E1-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
228 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R1-001 rG CAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
229 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R2-001 G rC AGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
230 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R3-001 GC rA GTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
231 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R4-001 GCA rG TGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
232 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R5-001 GCAG rU GGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
233 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R6-001 GCAGT rG GGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
234 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R7-001 GCAGTG rG GGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
235 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R8-001 GCAGTGG rG GAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
236 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R9-001 GCAGTGGG rG AAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
237 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R10-001 GCAGTGGGG rA AATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
238 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R11-001 GCAGTGGGGA rA ATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
239 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R12-001 GCAGTGGGGAA rA TGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
240 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R13-001 GCAGTGGGGAAA rU GGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
241 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R14-001 GCAGTGGGGAAAT rG GGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
242 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R15-001 GCAGTGGGGAAATG rG GAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
243 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R16-001 GCAGTGGGGAAATGG rG AGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
244 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R17-001 GCAGTGGGGAAATGGG rA GGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
245 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R18-001 GCAGTGGGGAAATGGGA rG GGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
246 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R19-001 GCAGTGGGGAAATGGGAG rG GCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
247 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R20-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGG rG CTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
248 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R21-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGG rC TAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
249 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R22-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGC rU AGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
250 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R23-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCT rA GGTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
251 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R24-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTA rG GTGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
252 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R25-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAG rG TGGAAGGAATCTGAGCTACTGC
253 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R26-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGG rU GGAAGGAATCTGAGCTACTGC
254 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R27-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGT rG GAAGGAATCTGAGCTACTGC
255 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R28-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTG rG AAGGAATCTGAGCTACTGC
256 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R29-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGG rA AGGAATCTGAGCTACTGC
257 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R30-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGA rA GGAATCTGAGCTACTGC
258 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R31-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAA rG GAATCTGAGCTACTGC
259 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R32-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAG rG AATCTGAGCTACTGC
260 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R33-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGG rA ATCTGAGCTACTGC
261 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R34-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGA rA TCTGAGCTACTGC
262 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R35-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAA rU CTGAGCTACTGC
263 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R36-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAAT rC TGAGCTACTGC
264 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R37-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATC rU GAGCTACTGC
265 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R38-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCT rG AGCTACTGC
266 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R39-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTG rA GCTACTGC
267 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R40-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGA rG CTACTGC
268 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R41-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAG rC TACTGC
269 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R42-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGC rU ACTGC
270 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R43-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCT rA CTGC
271 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R44-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTA rC TGC
272 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R45-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTAC rU GC
273 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R46-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACT rG C
274 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R47-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGGAAGGAATCTGAGCTACTG rC
275 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R15/29-001 GCAGTGGGGAAATG rG GAGGGCTAGGTGG rA AGGAATCTGAGCTACTGC
276 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R29/30-001 GCAGTGGGGAAATGGGAGGGCTAGGTGG rArA GGAATCTGAGCTACTGC
277 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R15/29/30-001 GCAGTGGGGAAATG rG GAGGGCTAGGTGG rArA GGAATCTGAGCTACTGC
278 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R18/29/30-001 GCAGTGGGGAAATGGGA rG GGCTAGGTGG rArA GGAATCTGAGCTACTGC
279 L-DNA/ L-RNA 257-E1-R15/18/29/30-001 GCAGTGGGGAAATG rG GA rG GGCTAGGTGG rArA GGAATCTGAGCTACTGC
280 L-DNA/ L-RNA 257-E1-6xR-001
(=257-E1-R9/15/18/19/29/30-001)		 GCAGTGGG rG AAATG rG GA rGrG GCTAGGTGG rArA GGAATCTGAGCTACTGC
281 L-RNA NOX-D19 5‘-40kDa-PEG-GCCUGAUGUGGUGGUGAAGGGUUGUUGGGUGUCGACGCACAGGC
282 L-DNA/ L-RNA 257-E1-7xR-021 GCGCGGG rG AAA rT G rG GA rGrG GCTAGGTGG rArA GGAATCTGAGCCGCGC
283 L-DNA/ L-RNA 257-E1-7xR-022 GCGCGGG rG AAATG rG GA rGrG GC rT AGGTGG rArA GGAATCTGAGCCGCGC
284 L-DNA/ L-RNA 257-E1-7xR-023 GCGCGGG rG AAATG rG GA rGrG GCTAGG rT GG rArA GGAATCTGAGCCGCGC
285 L-DNA/ L-RNA 257-E1-7xR-024 GCGCGGG rG AAATG rG GA rGrG GCTAGGTGG rArA GGAA rT CTGAGCCGCGC
286 L-DNA/ L-RNA 257-E1-7xR-025 GCGCGGG rG AAATG rG GA rGrG GCTAGGTGG rArA GGAATC rT GAGCCGCGC
287 L-DNA 259-H6-002 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
288 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R01 rA CTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
289 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R02 A rC TCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
290 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R03 AC rU CGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
291 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R04 ACT rC GAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
292 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R05 ACTC rG AGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
293 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R06 ACTCG rA GAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
294 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R07 ACTCGA rG AGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
295 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R08 ACTCGAG rA GGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
296 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R09 ACTCGAGA rG GAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
297 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R10 ACTCGAGAG rG AAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
298 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R11 ACTCGAGAGG rA AAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
299 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R12 ACTCGAGAGGA rA AGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
300 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R13 ACTCGAGAGGAA rA GGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
301 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R14 ACTCGAGAGGAAA rG GTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
302 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R15 ACTCGAGAGGAAAG rG TTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
303 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R16 ACTCGAGAGGAAAGG rU TGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
304 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R17 ACTCGAGAGGAAAGGT rU GGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
305 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R18 ACTCGAGAGGAAAGGTT rG GTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
306 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R19 ACTCGAGAGGAAAGGTTG rG TAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
307 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R20 ACTCGAGAGGAAAGGTTGG rU AAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
308 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R21 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGT rA AAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
309 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R22 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTA rA AGGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
310 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R23 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAA rA GGTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
311 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R24 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAA rG GTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
312 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R25 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAG rG TTCGGTTGGATTCACTCGAGT
313 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R26 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGG rU TCGGTTGGATTCACTCGAGT
314 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R27 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGT rU CGGTTGGATTCACTCGAGT
315 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R28 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTT rC GGTTGGATTCACTCGAGT
316 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R29 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTC rG GTTGGATTCACTCGAGT
317 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R30 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCG rG TTGGATTCACTCGAGT
318 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R31 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGG rU TGGATTCACTCGAGT
319 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R32 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGT rU GGATTCACTCGAGT
320 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R33 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTT rG GATTCACTCGAGT
321 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R34 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTG rG ATTCACTCGAGT
322 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R35 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGG rA TTCACTCGAGT
323 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R36 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGA rU TCACTCGAGT
324 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R37 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGAT rU CACTCGAGT
325 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R38 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTrCACTCGAGT
326 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R39 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTC rA CTCGAGT
327 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R40 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCArCTCGAGT
328 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R41 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCAC rU CGAGT
329 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R42 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTrCGAGT
330 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R43 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTC rG AGT
331 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R44 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCG rA GT
332 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R45 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGA rG T
333 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R46 ACTCGAGAGGAAAGGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGATTCACTCGAG rU
334 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R13_R24 ACTCGAGAGGAA rA GGTTGGTAAA rG GTTCGGTTGGATTCACTCGAGT
335 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R13_R36 ACTCGAGAGGAA rA GGTTGGTAAAGGTTCGGTTGGA rU TCACTCGAGT
336 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R13_R24_R36 ACTCGAGAGGAA rA GGTTGGTAAA rG GTTCGGTTGGA rU TCACTCGAGT
337 L-DNA/ L-RNA 259-H6-002-R13_R24_R30_R36 ACTCGAGAGGAA rA GGTTGGTAAA rG GTTCG rG TTGGA rU TCACTCGAGT
338 L-RNA 226-F2-001-5‘-40kDa-PEG 5‘-40kDa-PEG-CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCCCCUCCCACGG
339 L-DNA / L-RNA 226-F2-001-D41-5‘-40kDa-PEG,
NOX-L41		 5‘-40kDa-PEG-CCGUGCUGUCGGAGACUACUCGUCGAGUAGAAAUAGGUCC dC CUCCCACGG
340 L-RNA 5‘-40kDa-PEG-
L-S1P-215-F9-002		 5‘-40kDa-PEG-GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC
341 L-DNA / L-RNA 5‘-40kDa-PEG-
L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32		 5‘-40kDa- dG CGUGAAUAGCCGUUGAA dA C dG CCUUUAGAGA dA GCACUAGCACGC
342 D-RNA/L-RNA L-S1P-215-F9-002-5´diD-G GG-GCGUGAAUAGCCGUUGAAACGCCUUUAGAGAAGCACUAGCACGC

5’-GG is D-RNA
본 발명은 나아가 구현예 및 장점들이 적용됨을 나타내는 도면, 실시예 및 서열목록에 의해 기술된다.
도 1A-C은 리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002 및 핵산 분자 유도체 L-S1P-215-F9-002를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 리보뉴클레오티드(A, U, G, C)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (dA, dT, dG, dC)로의 단일 또는 다중 치환을 포함함);
도 2은 리보뉴클레오티드에서 2‘-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 215-F9-002 (L-S1P-215-F9-002으로 지칭) 유도체의 경쟁적 스피에겔머 풀-다운 어세이법(competitive spiegelmer pull-down assay) 실험 결과이며 (여기에서 8nM 비오틴화 D-e-S1P에 결합하는 0.3nM 방사성 표지된 L-S1P-215-F9-002-5´diD-G이 37°C에서 50nM 비표지 스피에겔머 (삼중치)와의 경쟁에 의함);
도 3은 리보뉴클레오티드에서 2‘-리보뉴클레오티드로 치환된 215-F9-002 (L-S1P-215-F9-002으로 지칭) 유도체의 경쟁적 스피에겔머 풀-다운 어세이법(competitive spiegelmer pull-down assay) 실험 결과이며 {여기에서, (A) 0.3nM 방사성 표지된, 8nM 비오틴화 D-e-S-1-P와 결합한 L-S1P-215-F9-002-5´diD-G은 37°C에서 3시간 동안 36nM 비표지 스피에겔머 (삼중치)와 경쟁하고; (B) 0.5nM 방사성 표지된, 7nM 비오틴화 D-e-S-1-P와 결합한 L-S1P-215-F9-002-5´diD-G은 37°C에서 2.5시간 동안 적정농도의5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002 (원형:circles) 및 5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32 (사각형:squares)와 경쟁함)};
도 4은 (A) 5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002 및 (B) 5’-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32 (NOX-S93으로 지칭)에 의한 EDG1 발현 리포터 세포주에서 10nM D-e-S1P-유도 b-어레스틴 순항에 대한 저해실험 결과(삼중 배양의 평균 수치 ± SD 로 표시)를 나타내며:
도 5A-E은 리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 226-F2-002 및 핵산 분자 유도체 226-F2-002를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 리보뉴클레오티드(A, U, G, C)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (dA, dT, dG, dC) 로의 단일 치환을 포함함);
도 6은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 모 스피에겔머 (parental Spiegelmer) 226-F2-001에 대한 친화능의 측정된 변화를 구도한 것이며;
도 7은 리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 226-F2-002 및 이 핵산 분자의 유도체 226-F2-002-41, 226-F2-002-44 및 226-F2-002-41/44 를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 리보뉴클레오티드(A, U, G, C) 및 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (dC) 를 포함함);
도 8A은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 인간 CGRP에 대한 CGRP 결합 스피에겔머 226-F2-001 및 226-F2-001-D41의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 8B은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 인간 CGRP에 대한 CGRP 결합 스피에겔머 226-F2-001 및 226-F2-001-D44의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 9은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 인간 CGRP에 대한 CGRP 결합 스피에겔머 226-F2-001-D41 및 226-F2-001-D41/44의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 10은 CGRP 결합 스피에겔머 226-F2-001-5´40kDa-PEG (흑색 원형) 및 NOX-L41 (226-F2-001-D41-5´40kDa-PEG으로도 지칭, 흑색 사각형:black squares), 인간 CGRP-유도 cAMP 생성 저해 효과를 나타낸 도이며(여기에서 결과는 대조군(control) 대비 (대조군 백분율) 생성된 cAMP의 상대적 양을 나타냄);
도 11 A-E은 리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 NOX-D19001 및 이 핵산 분자의 유도체 NOX-D19001를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 리보뉴클레오티드(A, U, G, C) 및 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (dA, dU, dG, dC)를 포함함);
도 12은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 모 스피에겔머 (parental Spiegelmer) NOX-D19001에 대한 친화능의 측정된 변화를 구도한 것이며;
도 13은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 인간 C5a에 대한 스피에겔머 226-F2- NOX-D19001 및 이의 유도체 NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D16, NOX-D1900-D017, NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D32 및 NOX-D19001-D40의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 14은 핵산 분자 유도체 NOX-D19001를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 리보뉴클레오티드(A, U, G, C)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (dA, dT, dG, dC) 로의 다중 치환을 포함함);
도 15은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 인간 C5a에 대한 스피에겔머 226-F2- NOX-D19001 및 NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 16은 화학주성 어세이법에서 5´-말단 40kDa PEG화 스피에겔머 NOX-D19001-5´PEG (NOX-D19으로도 지칭) 및 스피에겔머 NOX-D19001-6xDNA 의 효능을 나타낸 것이며(여기에서 세포를 다양한 양의 스피에겔머와 같이, 37°C에서 전배양한 0.1 nM huC5a으로의 이주를 허용함);
도 17은 핵산 분자 유도체 NOX-D19001를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 리보뉴클레오티드(A, U, G, C)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (dA, dT, dG, dC) 로의 다중 치환을 포함함);
도 18 A-E은 리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 NOX-G11stabi2 및 이 핵산 분자의 유도체 NOX-G11stabi2를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 리보뉴클레오티드(A, U, G, C)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (dA, dT, dG, dT) 로의 단일 또는 다중 치환을 포함함);
도 19은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 모 스피에겔머 (parental Spiegelmer) NOX-G11stabi2에 대한 친화능의 측정된 변화를 구도한 것이며;
도 20은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 고정화된 비오틴화 인간 글루카곤에 대한 스피에겔머 NOX-G11stabi2, NOX-G11-D07, NOX-G11-D16, NOX-G11-D19, NOX-G11-D21, 및 NOX-G11-D22의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 21 A-E은 리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 259-H6-002 및 이 핵산 분자의 유도체 259-H6-002를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 데옥시리보뉴클레오티드 (A, T, G, C)의 2‘-리보뉴클레오티드 (rA, rU, rG, rC) 로의 단일 또는 다중 치환을 포함함);
도 22은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 모 스피에겔머 (parental Spiegelmer) 259-H6-002에 대한 친화능의 측정된 변화를 구도한 것이며;
도 23은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 고정화된 비오틴화 인간 글루카곤에 대한 스피에겔머 259-H6-002, 259-H6-002R13, 259-H6-002R24 및259-H6-002-R36 의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 24은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 고정화된 비오틴화 인간 글루카곤에 대한 스피에겔머 259-H6-002, 259-H6-002R13, 259-H6-002R13-R24, 259-H6-002R13-R36 및 259-H6-002R13-R24-R36의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 25은 스피에겔머 259-H6-002 및 이의 유도체 259-H6-002-R13 및 259-H6-002-R13-R24-R36 (259-H6-002-R13/24/36으로도 지칭)에 의한 cAMP의 글루카곤-유도 생성에 대한 억제효과를 나타낸 도이며 {여기에서, (a) 웰당 생성된 cAMP의 양을 개개 데이터 세트(data set)의 최대치로 정상화하고 스피에겔머 농도에 대한 백분율 활성 (per cent activity)으로 구도하고, (b) cAMP 생성이 50% (IC50) 저해되는 스피에겔머 농도는 소프트웨어(Prism5 software)로 비선형회귀법 (nonlinear regression; 4개 매개변수 피트: parameter fit)을 이용하여 계산하고, c) 사용된 스피에겔머들 259-H6-002 (176 nM), 259-H6-002-R13 (12.5 nM) 및 259-H6-002-R13-R24-R36 (6.2 nM) 의 개개 IC50 수치는 브라켓(brackets)에 표기함};
도 26은 비아코아 측정법에 의하여 측정된, 고정화된 비오틴화 인간 글루카곤에 대한 스피에겔머 259-H6-002R13-R24-R30-R36의 역학 평가(kinetic evaluation)를 나타낸 것이며;
도 27 A-E은 2‘-데옥시리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 257-E1-001 및 이 핵산 분자의 유도체 257-E1-001를 나타내며 (여기에서 상기 유도체는 2‘-데옥시리보뉴클레오티드 (A, T, G, C)의 리보뉴클레오티드 (rA, rU, rG, rC) 로의 단일 또는 다중 치환을 포함함);
도 27 F은 2‘-데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드로 구성된 핵산 분자 257-E1-6xR-001 를 나타내며;
도 28은 핵산 분자 257-E1-001 및 이의 유도체인 257-E1-R15-001, 257-E1-R29-001, 257-E1-6xR-001 및 257-E1-7xR-03의 비오틴화 글루카곤에 대한 경쟁적 풀-다운 어세이법 실험 결과이다.
하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1. 목표 분자 S1P에 대한 증가된 결합능을 갖는 핵산 분자
SELEX 공정(process)의 직접적인 스크리닝 산물(immediate screening product)이며, 출발물질로서 개발공정의 결과인 S1P 결합 핵산 분자를 출발점으로 하여, 본 발명의 방법을 그 목표(target)에 대한 핵산의 결합능을 향상시키기 위하여 사용하였다. 이번에는 S1P 결합 핵산 분자로는 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002을 사용하였다.
핵산 분자 L-S1P-215-F9-002 은 S1P에 결합 가능한 스피에겔머(Spiegelmer), 즉, L-핵산 분자(nucleic acid molecule)로서 서열번호(SEQ ID NO: 5)에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖고 44 개 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)로 구성되었다.
핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 결합 특성은 경쟁적 스피에겔머 풀-다운 어세이법 (competitive Spiegelmer pull-down assay; 실시예 9에 개시)으로 측정하였다. 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002 은 S1P와 31.5nM의 친화능으로 결합하였다 (도 1 및 도 3B).
핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 결합능을 향상시키기 위하여, 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 유도체들을 합성하였다. 상기 유도체들은 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002와 동일한 핵염기 서열 (sequence of nucleobases 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실 또는 티민; 2’-데옥시리보뉴클레오티드인 경우) 을 갖으나, 리보뉴클레오티드가 아닌 2´-데옥시리보뉴클레이티드인 뉴클레오티드의 당부위, 한 위치만 상이한 L-핵산 분자들이다. 이에 따라, 유도체(derivative) 1은 1번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 6)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물; 유도체(derivative) 2는 2번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 7)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물 등을 제조하였다. 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002가 44 개의 뉴클레오티드로 구성되므로 총 44 개의 유도체들을 단일 리보뉴클레오티드(single ribonucleotide)를 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 치환반응을 수행하는 가능한 모든 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 유도체 세트(set)를 제공하기 위하여 합성하였다. 상기 유도체의 완전한 세트를 도 1에 표시하였다. 분자 L-S1P-215-F9-002의 서열중 우라실인 경우는, 우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)를 티미딘(thymidine)-5´-포스페이트(phosphate)로 치환하였다.
개개의 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002 유도체들의 완전한 세트 유도체들의 S1P에 대한 결합 친화능을 실시예 9에 개시된 경쟁적 풀-다운 어세이법 (competitive pull-down assay)을 이용하여 측정하고 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 결합 친화능과 비교하였다 (도 1 A-C).
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 스피에겔머(Spiegelmer) L-S1P-215-F9-002내에서 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)로 치환하는 위치에 따라, 목표에 대한 결합 친화능에 대하여 서로 상이할 수 있다. 놀랍게도, 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 특정 위치에서의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)로의 단일 치환 (single substitution)은 S1P에 대한 결합 친화능을 향상시켰는데 반하여, 다른 위치에서의 치환들은 S1P에 대한 결합 친화능에 유의적인 변화를 초래하지 않았거나 오히려 S1P에 대한 결합 친화능을 감소시켰다. 핵산 분자 215-F9-002의 S1P에 대한 결합 친화능과 비교한 개개 유도체 및 이들의 결합 친화능상의 상대적인 변화를 도 1에 나타냈다.
상기 도에서 알 수있는 바와 같이, 유도체들 L-S1P-215-F9-002-D01, L-S1P-215-F9-002-D11, L-S1P-215-F9-002-D19, L-S1P-215-F9-002-D21, L-S1P-215-F9-002-D22, L-S1P-215-F9-002-D32 {1, 11, 19, 21, 22, 및 32 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 1차 유도체군 (first group of derivatives)에 속함}이 S1P에 대하여 향상된 결합능을 나타냈다 (도 1A-C 및 도 2). 상기 유도체들중 가장 강한 친화능은 유도체 L-S1P-215-F9-002-D19 및 L-S1P-215-F9-002-D21에서 나타났다 (도 1 및 도 2). 결론적으로, 1, 11, 19, 21, 22, 및 32, 바람직하게는 19 및 21 위치가 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 S1P에 대한 친화능을 이끄는데 적합하였다. 19 위치에서의 아데노신(Adenosine)-5´-포스페이트(phosphate)의 2´-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5´-포스페이트로의 치환 및 21 위치에서의 구아노신(guanosine)-5´-포스페이트(phosphate)의 2´-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5´-포스페이트로의 치환은 L-S1P-215-F9-002 (KD : 31.5nM)와 비교시에 향상된 결합능 (16nM 및 11.3nM)을 나타내었다 (도 1 A-C)
유도체들 L-S1P-215-F9-002-D05, L-S1P-215-F9-002-D12, L-S1P-215-F9-002-D13, L-S1P-215-F9-002-D14, L-S1P-215-F9-002-D15, L-S1P-215-F9-002-D16, L-S1P-215-F9-002-D39, L-S1P-215-F9-002-D40, L-S1P-215-F9-002-D41, L-S1P-215-F9-002-D42 및 L-S1P-215-F9-002-D43 {5, 12, 13 14, 15, 16, 39, 40, 41, 42 및 43 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 2차 유도체군 (second group of derivatives)에 속함} 들은 S1P에 대한 결합 친화능면에서 영향을 나타내지 않았다. 결론적으로, 5, 12, 13, 14, 15, 16, 39, 40, 41, 42 및 43 위치들은 결합 친화능 향상에 적합하지 않으며, 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002와 비교시에 S1P에 대한 결합 친화능에 부정적 영향을 미치는 것으로 나타났다 (도 1 A-C).
결론적으로, 결합친화능 면에서 감소되거나 심각한 소실을 초래하는 유도체를도 수득하였다. 이러한 유도체들은 즉, L-S1P-215-F9-002-D02, L-S1P-215-F9-002-D03, L-S1P-215-F9-002-D04, L-S1P-215-F9-002-D06, L-S1P-215-F9-002-D07, L-S1P-215-F9-002-D08, L-S1P-215-F9-002-D09, L-S1P-215-F9-002-D10, L-S1P-215-F9-002-D17, L-S1P-215-F9-002-D18, L-S1P-215-F9-002-D20, L-S1P-215-F9-002-D23, L-S1P-215-F9-002-D24, L-S1P-215-F9-002-D25, L-S1P-215-F9-002-D26, L-S1P-215-F9-002-D27, L-S1P-215-F9-002-D28, L-S1P-215-F9-002-D29, L-S1P-215-F9-002-D30, L-S1P-215-F9-002-D31, L-S1P-215-F9-002-D33, L-S1P-215-F9-002-D34, L-S1P-215-F9-002-D35, L-S1P-215-F9-002-D36, L-S1P-215-F9-002-D37, L-S1P-215-F9-002-D38 및 L-S1P-215-F9-002-D44 {2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 17, 18, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38 및 44 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 3차 유도체군 (third group of derivatives)에 속함}로서 이러한 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환은 S1P에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 나타냈다 (도 1 A-C).
핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 유도체들의 결합 친화능이 1개 이상의 치환을 도입시에 더욱 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 추가적인 유도체군 (further derivatives)을 제조하였다 (도 1C). 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 1차 유도체군으로부터 출발한 상기 추가적인 유도체군 (further derivatives)들은 S1P에 대한 결합친화능에 향상된 결과를 나타냈다. 상기 유도체들은 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002로부터 출발하여, 19, 21 및/또는 22 위치에서 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 2개 이상 치환하였다. 한 19 및 21 위치에서의 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환은 핵산 분자 L-S1P-215-F9-002의 S1P에 대한 결합친화능에 가장 향상된 결과를 나타냈으나, 22 위치에서의 치환은 미약한 영향을 나타냈다 (도 2).
이러한 유도체들의 경쟁적 스피에겔머 풀-다운 어세이법 (Competitive Spiegelmer pull-down assays)에서 L-S1P-215-F9-002 스피에겔머의 복수(multiple) 위치에서의 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환을 조합하면 S1P에 대한 결합 친화능면에서 보다 향상된 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 2개의 치환을 한 스피에겔머, 즉, 19 위치에서의 아데노신(Adenosine)-5´-포스페이트(phosphate)의 2´-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5´-포스페이트로의 치환 및 21 위치에서의 구아노신(guanosine)-5´-포스페이트(phosphate)의 2´-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5´-포스페이트로의 치환 ( L-S1P-215-F9-002-D21-19로 지칭함)은 L-S1P-215-F9-002 및 단일 치환, 즉, 21 위치에서의 구아노신(guanosine)-5´-포스페이트의 2´-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5´-포스페이트로의 치환을 한 L-S1P-215-F9-002-D21 들과 비교시 보다 향상된 결합 친화능을 나타냈다 (도 3A). 22 위치에서의 시티딘(cytidine)-5´-포스페이트의 2´-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5´-포스페이트로의 추가적인 치환은 L-S1P-215-F9-002-D21보다 향상된 친화능을 나타내지 않았으며 L-S1P-215-F9-002-D21-22, L-S1P-215-F9-002-D21-19 및 L-S1P-215-F9-002-D21-19-22은 각각 S1P에 대하여 유사한 결합 친화능을 나타냈다 (도 1C 및 도 3A). 반면에, 4개의 치환을 한 스피에겔머, 즉, 01 위치에서 구아노신 (guanosine)의 2´-데옥시구아노신 (deoxyguanosine)로의 치환, 21 위치에서의 구아노신(guanosine)-5´-포스페이트 (phosphate)의 2´-데옥시구아노신 (deoxyguanosine)-5´-포스페이트로의 치환, 및 19 및 32 위치에서의 아데노신(Adenosine)-5´-포스페이트 (phosphate)의 2´-데옥시아데노신 (deoxyadenosine)-5´-포스페이트로의 치환 (L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32으로 지칭함)은 오로지 2개의 치환을 한 스피에겔머 L-S1P-215-F9-002-D21-19 와 비교시에 유의적으로 향상된 결합친화능을 나타냈다 (도 1C 및 도 3A). 모분자(parental molecule)인 L-S1P-215-F9-002 (KD : 31.5nM)와 비교시에, 4개의 위치에서 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32 (KD: 5nM)은 S1P에 대한 결합 친화능면에서 6.3배의 향상 효과를 나타냈다 (도 3B). 11 위치에서의 시티딘(cytidine)-5´-포스페이트의 2´-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5´-포스페이트로의 추가적인 치환은 ( L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32) S1P에 대한 결합 친화능면에서 추가적으로 긍정적인 효과를 나타내지 못했다 (도 1C 및 도 3A).
스피에겔머인 L-S1P-215-F9-002 및 L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32의 기능성을 입증하고 비교하기 위하여 모든 핵산 분자들을 이들의 5’-말단에서 아미노기를 포함하여 합성하였다. 상기 아미노기-변형된(amino-modified) 스피에겔머에 40kDa PEG-기(moiety)를 커플링(coupled)시켜 스피에겔머들인 5´-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002 및 5´-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32 (NOX-S93으로도 지칭)을 제조하였다. 스피에겔머의 합성 및 PEG화(PEGylation)반응을 실시예 7에 개시하였다.
시험관내(in vitro) 세포-배양 어세이법(cell-culture assay; 실시예 11의 프로토콜 참조)에서 S1P에 대한 향상된 친화능이 S1P 기능의 향상된 저해를 유도함이 확인되었다. 5´-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002 및 5´-40kDa-PEG-L-S1P-215-F9-002-D01-19-21-32 (NOX-S93으로도 지칭됨) 들은 인간 S1P-수용체 EDG1를 발현하는 리포터 세포주(reporter cell line)에서의 S1P-유도(induced) 어레스틴 순항 (arrestin recruitment)을 저해하였다 (IC50 수치: 각각 22.5nM 및 10.3nM, 도 4A, 4B). 따라서, 경쟁적 스피에겔머 풀-다운 어세이법 (Competitive Spiegelmer pull-down assays) (실시예 9, 도 3B) 및 시험관내(in vitro) 세포-배양 어세이법 (실시예 11, 도 4)들의 모두에서 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환들이 S1P-결합 스피에겔머 226-F2-001의 결합 친화능 및 저해활성을 유의적으로 향상시킴을 보여 주었다.
실시예 2. 목표 분자 CGRP에 대한 증가된 결합능을 갖는 핵산 분자
SELEX 공정(process)의 직접적인 스크리닝 산물(immediate screening product)이며, 출발물질로서 개발공정의 결과인 CGRP 결합 핵산 분자를 출발점으로 하여, 본 발명의 방법을 그 목표(target)에 대한 핵산의 결합능을 향상시키기 위하여 사용하였다. 이번에는 CGRP 결합 핵산 분자로는 핵산 분자 226-F2-001을 사용하였다.
핵산 분자 226-F2-001 은 인간 CGRP에 결합 가능한 스피에겔머(Spiegelmer), 즉, L-핵산 분자(nucleic acid molecule)로서 서열번호(SEQ ID NO: 55)에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖고 50 개 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)로 구성되었다.
핵산 분자 226-F2-001의 결합 특성은 표면 플라즈몬 공명 측정법 (surface plasmon resonance measurement; 실시예 8에 개시)으로 측정하였다. 핵산 분자 226-F2-001 은 인간 CGRP와 2.6nM의 친화능으로 결합하였다 (도 7, 8A 및 도 8B).
핵산 분자 226-F2-001의 결합능을 향상시키기 위하여, 핵산 분자 226-F2-001의 유도체들을 합성하였다. 상기 유도체들은 핵산 분자 226-F2-001와 동일한 핵염기 서열 (sequence of nucleobases 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실 또는 티민; 2’-데옥시리보뉴클레오티드인 경우) 을 갖으나, 리보뉴클레오티드가 아닌 2´-데옥시리보뉴클레이티드인 뉴클레오티드의 당부위, 한 위치만 상이한 L-핵산 분자들이다. 이에 따라, 유도체(derivative) 1(226-F2-001-D01으로 지칭)은 1번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 56)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물; 유도체(derivative) 2(226-F2-001-D02으로 지칭)는 2번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 57)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물 등을 제조하였다. 핵산 분자 226-F2-001가 50 개의 뉴클레오티드로 구성되므로 총 50 개의 유도체들을 단일 리보뉴클레오티드(single ribonucleotide)를 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 치환반응을 수행하는 가능한 모든 핵산 분자 226-F2-001의 유도체 세트(set)를 제공하기 위하여 합성하였다. 상기 유도체의 완전한 세트를 도 5 A-E에 표시하였다. 분자 226-F2-001의 서열중 우라실인 경우는, 우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)를 티미딘(thymidine)-5´-포스페이트(phosphate)로 치환하였다.
개개의 핵산 분자 226-F2-001 유도체들의 완전한 세트 유도체들의 인간 CGRP에 대한 결합 친화능을 실시예 8에 개시된 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 측정하고 핵산 분자 226-F2-001 의 결합 친화능과 비교하였다 (도 1 A-C). 5개 이상의 개별적으로 측정된 226-F2-001 의 KD 수치 세트로부터 평균값을 계산하였다 {평균(mean) +/ 표준오차(standard error)}. 개별 유도체들의 KD 수치를 측정하고 친화능의 변화를 226-F2-001 의 평균 KD 수치와 비교하여 x-배(fold) 향상(improvement)으로 표시하고, 여기에서 x-배(fold) 향상(improvement)은 226-F2 001 의 KD 수치를 226-F2 001 유도체의 KD 수치로 나눈 값이다. 상기 표준 오차는 양성 히트(positive hits)에 대한 절단 점(cutting point)을 의미한다. x-배(fold) 향상된 친화능의 데이타는 도 5 A-E에 나타냈고 도 6로 구도하였다.
도 5A-E 에서 알 수 있는 바와 같이, 스피에겔머(Spiegelmer) 내에서 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)로 치환하는 위치에 따라, 목표에 대한 결합 친화능에 대하여 서로 상이할 수 있다. 놀랍게도, 핵산 분자 226-F2-001의 특정 위치에서의 1개 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)로의 단일 치환 (single substitution)은 인간 CGRP에 대한 결합 친화능을 향상시켰는데 반하여, 다른 위치에서의 치환들은 인간 CGRP에 대한 결합 친화능에 유의적인 변화를 초래하지 않았거나 오히려 인간 CGRP에 대한 결합 친화능을 감소시켰다. 핵산 분자 226-F2-001의 인간 CGRP에 대한 결합 친화능과 비교한 개개 유도체 및 이들의 결합 친화능상의 상대적인 변화를 도 5 A-E 및 도 6에 나타냈다.
상기 도에서 알 수 있는 바와 같이, 유도체들 226-F2-001-D03, 226-F2-001-D05, 226226-F2-001-D09, 226-F2-001-D14,226-F2-001-D16, 226-F2-001-D19, 226-F2-001-D22, 226-F2-001-D23, 226-F2-001-D24, 226-F2-001-D25, 226-F2-001-D26, 226-F2-001-D28, 226-F2-001-D30, 226-F2-001-D33, 226-F2-001-D34, 226-F2-001-D37, 226-F2-001-D39, 226-F2-001-D41, 226-F2-001-D42, 226-F2-001-D44, 226-F2-001-D45, 226-F2-001-D46, 226-F2-001-D47, 226-F2-001-D48, 226-F2-001-D49, 226-F2-001-D50 { 03, 05, 08, 09, 14, 16, 19, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 30, 33, 34, 37, 39, 41, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 226-F2-001의 1차 유도체군 (first group of derivatives)에 속함}이 인간 CGRP에 대하여 향상된 결합능을 나타냈다 (도 5 A-E 및 도 6). 상기 유도체들중 가장 강한 친화능은 유도체 226-F2-001-D19, 226-F2-001-D41 및 226-F2-001-D44에서 나타났다 (도 5 A-E 및 도 6). 결론적으로, 19, 41 및 44 위치가 핵산 분자 226-F2-001의 인간 CGRP에 대한 친화능을 이끄는데 적합하였다. 핵산 분자 226-F2-001-D41 및 226-F2-001-D44에 대하여 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 추가로 측정하였다. 41 및 44위치에서의 1개의 시티딘(Cytidine)-5´-포스페이트(phosphate)의 2´-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5´-포스페이트로의 치환은 226-F2-001-D44 (KD : 2.6nM)와 비교시에 향상된 결합능 (0.55nM 및 0.52nM)을 나타내었다 (도 7A-E 및 도 8A, B).
유도체들 226-F2-001-D04 및 226-F2-001-D27 {4 및 27 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자의 2차 유도체군 (second group of derivatives)에 속함} 들은 인간 CGRP에 대한 결합 친화능면에서 영향을 나타내지 않았다. 결론적으로, 4 및 27 위치들은 결합 친화능 향상에 적합하지 않으며, 핵산 분자 226-F2-001와 비교시에 인간 CGRP에 대한 결합 친화능에 부정적 영향을 미치는 것으로 나타났다 (도 5A-E 및 도 6).
결론적으로, 결합친화능 면에서 감소되거나 심각한 소실을 초래하는 유도체를도 수득하였다. 이러한 유도체들은 즉, 226-F2-001-D01, 226-F2-001-D02, 226F2-001-D06, 226-F2-001-D07, 226-F2-001-D10, 226-F2-001-D11, 226-F2-001-D12, 226-F2-001-D13, 226-F2-001-D15, 226-F2-001-D17, 226-F2-001-D18, 226-F2-001-D20, 226-F2-001-D21, 226-F2-001-D29, 226-F2-001-D31, 226-F2-001-D32, 226-F2-001-D35, 226-F2-001-D36, 226-F2-001-D38, 226-F2-001-D40 및 226-F2-001-D43 {1, 2, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, 29, 31, 32, 35, 36, 38, 40 및 43 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 226-F2-001 의 3차 유도체군 (third group of derivatives)에 속함}로서 이러한 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환은 인간 CGRP에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 나타냈다 (도 5A-E 및 도 6).
핵산 분자 226-F2-001의 유도체들의 결합 친화능이 1개 이상의 치환을 도입시에 더욱 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 또 다른 유도체군 (another derivatives)을 제조하였다. 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 1차 유도체군으로부터 출발한 상기 유도체들은 인간 CGRP에 대한 결합 친화능에 향상된 결과를 나타냈다. 상기 유도체들은 핵산 분자 226-F2-001로부터 출발하여, 41 및/또는 44 위치에서 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환 (19 위치이외에, 226-F2-001-D41/D44으로 지칭)은 핵산 분자 226-F2-001의 인간 CGRP에 대한 결합친화능에 가장 향상된 결과를 나타냈다 (도 2).
226-F2-001-D41/44의 표면 플라즈몬 공명 측정법에서 226-F2-001의 1개 이상의 위치에서의 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환, 즉, 41 및 44위치에서의 시티딘(cytidine)-5´-포스페이트의 2´-데옥시시티딘(deoxycytidine)-5´-포스페이트로의 치환을 조합하면, 단일 치환을 포함한 유도체들 즉, 226-F2-001-D41 또는 226-F2-001-D44와 비교시에 인간 CGRP에 대한 결합 친화능면에서 보다 향상된 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. (도 7, 도 8A, B 및 도 9). 모분자(parental molecule)인 226-F2-001 (KD : 2.6nM)에 비하여, 2개의 위치에서 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 226-F2-001-D41/44 (KD : 0.2nM)은 표면 플라즈몬 공명 측정법에서 인간 CGRP에 대한 결합 친화능면에서 13배의 향상 효과를 나타냈다 (도 7 및 도 9).
스피에겔머인 226-F2-001 및 226-F2-001-D41의 기능성을 입증하고 비교하기 위하여 모든 핵산 분자들을 이들의 5’-말단에서 아미노기를 포함하여 합성하였다. 상기 아미노기-변형된(amino-modified) 스피에겔머에 40kDa PEG-기(moiety)를 커플링(coupled)시켜 스피에겔머들인 226-F2-001-5´40kDa-PEG 및 226-F2-001-D41-5´40kDa-PEG (NOX-L41으로도 지칭)을 제조하였다. 스피에겔머의 합성 및 PEG화(PEGylation)반응을 실시예 7에 개시하였다.
시험관내(in vitro) 세포-배양 어세이법(cell-culture assay; 실시예 12의 프로토콜 참조)에서 226-F2-001-5´40kDa-PEG 및 226-F2-001-D41-5´40kDa-PEG이 인간 CGRP-수용체를 발현하는 리포터 세포주(reporter cell line)에서의 인간 CGRP-유도(induced) cAMP 생성을 효과적으로 저해함을 확인하였다 (도 10). 226-F2-001-5´40kDa-PEG 및 226-F2-001-D41-5´40kDa-PEG(NOX-L41)은 인간 CGRP-유도(induced) cAMP 생성을 IC50 수치 (3.8nM 및 0.39nM, 각각)로 저해하였다. 따라서, 표면 플라즈몬 공명 측정법 (실시예 8, 도 8A) 및 시험관내(in vitro) 세포-배양 어세이법 (실시예 12, 도 10)들의 모두에서 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 단일 치환들이 CGRP-결합 스피에겔머 226-F2-001의 결합 친화능 및 저해활성을 유의적으로 향상시키기 충분함을 입증하였다. 상기 친화능은 226-F2-001-D41/44에서 나타난 바와 같이, 1개 이상 위치에서의 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환에 의하여 추가적으로 향상됨을 알 수 있었다 (도 7 및 도 9).
실시예 3. 목표 분자 C5a에 대한 증가된 결합능을 갖는 핵산 분자
SELEX 공정(process)의 직접적인 스크리닝 산물(immediate screening product)이며, 출발물질로서 개발공정의 결과인 인간 C5a 결합 핵산 분자를 출발점으로 하여, 본 발명의 방법을 그 목표(target)에 대한 핵산의 결합능을 향상시키기 위하여 사용하였다. 이번에는 인간 C5a 결합 핵산 분자로는 핵산 분자 NOX-D19001을 사용하였다.
핵산 분자 NOX-D19001 은 인간 C5a에 결합 가능한 스피에겔머(Spiegelmer), 즉, L-핵산 분자(nucleic acid molecule)로서 서열번호(SEQ ID NO: 107)에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖고 44 개 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)로 구성되었다.
핵산 분자 NOX-D19001 의 결합 특성은 표면 플라즈몬 공명 측정법 (surface plasmon resonance measurement; 실시예 8에 개시)으로 측정하였다. 핵산 분자 NOX-D19001 은 인간 C5a와 1.4nM의 친화능으로 결합하였다 (도 13).
핵산 분자 NOX-D19001의 결합능을 향상시키기 위하여, 핵산 분자 NOX-D19001의 유도체들을 합성하였다. 상기 유도체들은 핵산 분자 NOX-D19001와 동일한 핵염기 서열 (sequence of nucleobases 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실 또는 티민)을 갖으나, 리보뉴클레오티드가 아닌 2´-데옥시리보뉴클레이티드인 뉴클레오티드의 당부위, 한 위치만 상이한 L-핵산 분자들이다. 이에 따라, 유도체(derivative) 1(NOX-D19001-D01으로 지칭)은 1번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 108)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물; 유도체(derivative) 2(NOX-D19001-D02으로 지칭)는 2번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 109)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물 등을 제조하였다. 핵산 분자 NOX-D19001가 44 개의 뉴클레오티드로 구성되므로 총 44 개의 유도체들을 단일 리보뉴클레오티드(single ribonucleotide)를 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 치환반응을 수행하기에 부합되는 가능한 모든 핵산 분자의 유도체 세트(set)를 제공하기 위하여 합성하였다. 상기 유도체의 완전한 세트를 도 11 A-E에 표시하였다. 도 11에 나타난 바와 같이, 분자 NOX-D19001의 서열중 우라실인 경우는, 우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)를 2‘-데옥시우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)로 치환하였다.
개개의 핵산 분자 NOX-D19001 유도체들의 완전한 세트 유도체들의 인간 C5a에 대한 결합 친화능을 실시예 8에 개시된 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 측정하고 핵산 분자 NOX-D19001의 결합 친화능과 비교하였다. 5개 이상의 개별적으로 측정된 NOX-D19001의 KD 수치 세트로부터 평균값을 계산하였다 {평균(mean) ± 표준오차(standard error)}. 개별 유도체들의 KD 수치를 측정하고 친화능의 변화를 NOX-D19001의 평균 KD 수치와 비교하여 x-배(fold) 향상(improvement)으로 표시하고, 여기에서 x-배(fold) 향상(improvement)은 NOX-D19001의 KD 수치를 NOX-D19001 유도체의 KD 수치로 나눈 값이다. 상기 표준 오차는 양성 히트(positive hits)에 대한 절단 점(cutting point)을 의미한다. x-배(fold) 향상된 친화능의 데이타는 도 11A-E에 나타냈고 도 12로 구도하였다.
도 11A-E 에서 알 수 있는 바와 같이, 스피에겔머(Spiegelmer) 내에서 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)로 치환하는 위치에 따라, 목표에 대한 결합 친화능에 대하여 서로 상이할 수 있다. 놀랍게도, 핵산 분자 NOX-D19001의 특정 위치에서의 1개 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)로의 단일 치환 (single substitution)은 인간 C5a에 대한 결합 친화능을 향상시켰는데, 즉, 인간 글루카곤에 대한 더 낮은 결합 친화능을 나타낸데 반하여, 다른 위치에서의 치환들은 인간 C5a에 대한 결합 친화능에 유의적인 변화를 초래하지 않았거나 오히려 인간 C5a에 대한 결합 친화능을 감소시켰다. 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 결합 친화능과 비교한 개개 유도체 및 이들의 결합 친화능상의 상대적인 변화를 도 11 A-E에 나타냈다.
상기 도에서 알 수 있는 바와 같이, 유도체들 NOX-D19001-D01, NOX-D19001-D02, NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D16, NOX-D19001-D17, NOX-D19001-D22, NOX-D19001-D25, NOX-D19001-D29, NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D32, NOX-D19001-D40, NOX-D19001-D42, 및 NOX-D19001-D43 { 1, 2, 9, 16, 17, 22, 25, 29, 30, 32, 40, 42, 및 43 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자의 1차 유도체군 (first group of derivatives)에 속함}이 인간 C5a에 대하여 향상된 결합능을 나타냈다 (도 11 A-E, 및 도 12). 상기 유도체들중 가장 강한 친화능은 유도체 NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D16, NOX-D19001-D17, NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D32 및 NOX-D19001-D40에서 나타났다 (도 11 A-E, 및 도 12). 결론적으로, 9, 16, 17, 30, 32 및 40 위치가 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 친화능을 이끄는데 적합하였다. 핵산 분자 NOX-D19001-D09, NOX-D19001-D16, NOX-D19001-D17, NOX-D19001-D30, NOX-D19001-D32 및 NOX-D19001-D40 에 대하여 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 추가로 측정하였다. (도 13) 09위치에서의 1개의 우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)를 2‘-데옥시우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)로의 치환은 2배의 향상을 나타내었다 (도 13).
유도체들 NOX-D19001-D03, NOX-D19001-D23, NOX-D19001-D26, NOX-D19001-D35, NOX-D19001-D38, NOX-D19001-D39 및 NOX-D19001-D44 {3, 23, 26, 35, 38, 39 및 44 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자의 2차 유도체군 (second group of derivatives)에 속함} 들은 인간 C5a에 대한 결합 친화능면에서 영향을 나타내지 않았다. 결론적으로, 35 및 44 위치들은 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 결합 친화능에 향상을 나타났다. 결론적으로, 3, 23, 38, 및 39 위치들은 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 결합 친화능 향상에 적합하지는 않으나, 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 결합 친화능에 부정적 영향을 미치지는 않는 것으로 나타냈다.
결론적으로, 결합친화능 면에서 감소되거나 심각한 소실을 초래하는 유도체를도 수득하였다. 이러한 유도체들은 즉, NOX-D19001-D04, NOX-D19001-D05, NOX-D19001-D06, NOX-D19001-D07, NOX-D19001-D08, NOX-D19001-D10, NOX-D19001-D11, NOX-D19001-D12, NOX-D19001-D13, NOX-D19001-D14, NOX-D19001-D15, NOX-D19001-D18, NOX-D19001-D19, NOX-D19001-D20, NOX-D19001-D21, NOX-D19001-D24, NOX-D19001-D27, NOX-D19001-D28, NOX-D19001-D31, NOX-D19001-D33, NOX-D19001-D34, NOX-D19001-D36, NOX-D19001-D38 및 NOX-D19001-D41{리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 NOX-D19001 의 3차 유도체군 (third group of derivatives)에 속함}로서 이러한 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환은 인간 C5a에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 나타냈다 (도 5A-E 및 도 6). 따라서, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28, 31, 33, 34, 36 및 41 위치는 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타냈다.
핵산 분자 L-NOX-D19001의 유도체들의 결합 친화능이 1개 이상의 치환을 도입시에 더욱 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 또 추가적 유도체군 (further derivatives)을 제조하였다. 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환한 1차 유도체군으로부터 출발한 상기 유도체들은 인간 C5a에 대한 결합 친화능에 향상된 결과를 나타냈다. 상기 유도체들은 핵산 분자 NOX-D19001로부터 출발하여, 9, 30, 32 및 40 위치중 2개 이상의 위치에서 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 것으로서, 이러한 위치들은 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 결합친화능에 가장 향상된 결과를 나타내기에 적합했다.
도 8 및 9에 도시한 바와 같이, 스피에겔머 NOX-D19001의 다중 위치에서의 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환한, 이러한 대표 실시예 유도체들의 표면 플라즈몬 공명 측정법에서 결합 친화능면에서 보다 향상된 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
9/30, 9/32, 9/40, 30/32, 30/40 및 32/40 위치에서 우리딘-5´-포스페이트를 2´-데옥시-우리딘-5´-포스페이트로 2개 치환한 스피에겔머들인, NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-32, NOX-D19001-D09-40, NOX-D19001-D30-32, NOX-D19001-D30-40 및 NOX-D19001-D32-40 은 9, 30, 32 또는 40 위치에서 우리딘-5´-포스페이트를 2´-데옥시-우리딘-5´-포스페이트로 1개 치환한 분자들보다 우수한 결합능을 나타냈다 (도 14).
핵산 분자 NOX-D1900의 9/30/32, 9/30/40, 9/32/40 및 30/32/40 위치에서 우리딘-5´-포스페이트를 2´-데옥시-우리딘-5´-포스페이트로 3개 치환한 스피에겔머들인, NOX-D19001-D09-30-32, NOX-D19001-D09-30-40, NOX-D19001-D09-32-40 및 NOX-D19001-D30-32-40들을 합성하여 이들이 2개 치환한 스피에겔머들인, NOX-D19001-D09-30, NOX-D19001-D09-32, NOX-D19001-D09-40, NOX-D19001-D30-32, NOX-D19001-D30-40 및 NOX-D19001-D32-40에 비하여 우수한 결합능을 나타냄을 확인하였다. 9/30/40 및 9/32/40 위치에서 우리딘-5´-포스페이트를 2´-데옥시-우리딘-5´-포스페이트로 3개 치환한 스피에겔머들인 NOX-D19001-D09-30-40 및 NOX-D19001-D09-32-40들은 9, 30, 32 또는 40 위치에서 우리딘-5´-포스페이트를 2´-데옥시-우리딘-5´-포스페이트로 2개 치환한 분자들보다 우수한 결합능을 나타냈다(도 14).
9/30/32/40 위치에서 우리딘-5´-포스페이트를 2´-데옥시-우리딘-5´-포스페이트로 9, 30, 32 또는 40 위치에 치환한 핵산 분자들(NOX-D19001-D09-30-32-40)은 3개 치환을 한 스피에겔머들인 NOX-D19001-D09-30-40 및 NOX-D19001-D09-32-40와 비교시에 보다 향상된 결합능을 나타냈다 (도 14).
NOX-D19001-D09-30-32-40의 16 또는 17 위치에서 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 추가적인 치환은 인간 C5a에 대한 결합 친화능에 추가적인 긍정적인 효과를 나타냈다 (NOX-D19001-D09-16-30-32-40 및 NOX-D19001-D09-17-30-32-40, 도 14 참조). NOX-D19001-D09-30-32-40의 16 또는 17 위치에서 리보뉴클레오티드를 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 추가적인 2개의 치환은 인간 C5a에 대한 결합 친화능에 보다 추가적인 긍정적인 효과를 나타내지 않았다 (NOX-D19001-D09-16-17-30-32-40 참조, NOX-D19001-6xDNA로 지칭, 도 14 및 15 참조). 핵산 분자인 NOX-D19001와 비교시에, 핵산 분자인 NOX-D19001-6xDNA은 인간 C5a에 대한 결합 친화능면에서 4.2배로 향상을 나타냈다 (도 15).
스피에겔머인 NOX-D19001 및 NOX-D19001-6xDNA의 기능성을 입증하고 비교하기 위하여 모든 핵산 분자들을 시험관내 세포배양 어세이법하에서 측정하였다 (실시예 14의 프로토콜 참조). 도 16에 나타난 바와 같이, 상기 시험관내 세포배양 어세이법은 인간 C5a에 대한 향상된 친화능은 C5a 기능의 향상된 저해를 의미함을 입증하였다. PEG화(PEGylation)된 스피에겔머들인 NOX-D19 및 NOX-D19-6xDNA은 C5a-유도(induced) 화학주성(chemotaxis)을 각각 저해하였다 (IC50 수치: 2.39 nM 및 0.27 nM, 각각) (도 16).
상기한 바와 같이, 핵산 분자 NOX-D19-001에서의 복수의 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환은 인간 C5a에 대한 향상된 친화능을 나타냈다. 그러나 이러한 향상(improvement)은 복수의 치환이 인간 C5a에 대한 결합능면에서 향상을 나타냈던 단일 치환들의 결과인 경우에만이 달성될 수 있다. 7 위치에서의 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환은 감소된 친화능을 나타냈다 (도 17). 이러한 감소된 친화능은 16, 17, 30, 32 및 40 위치와 같은 기타 위치에서의 추가적인 치환들에 의하여 약간 “치유(healed)‘될 수 있다. ( NOX-D19001-D07-30와 비교한 NOX-D19001-D07-16-17-30-32-40 참조, 도 17).
실시예 4. 목표 분자 글루카곤에 대한 증가된 결합능을 갖는 핵산 분자 NOX-G11stabi2 유도체
SELEX 공정(process)의 직접적인 스크리닝 산물(immediate screening product)이며, 출발물질로서 개발공정의 결과인 글루카곤 결합 핵산 분자를 출발점으로 하여, 본 발명의 방법을 그 목표(target)에 대한 핵산의 결합능을 향상시키기 위하여 사용하였다. 이번에는 글루카곤 결합 핵산 분자로는 핵산 분자 NOX-G11stabi2을 사용하였다.
핵산 분자 NOX-G11stabi2 은 글루카곤에 결합 가능한 스피에겔머(Spiegelmer), 즉, L-핵산 분자(nucleic acid molecule)로서 서열번호(SEQ ID NO: 172)에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖고 54 개 리보뉴클레오티드(ribonucleotides)로 구성되었다.
핵산 분자 NOX-G11stabi2 의 결합 특성은 표면 플라즈몬 공명 측정법 (surface plasmon resonance measurement; 실시예 8에 개시)으로 측정하였다. 핵산 분자 NOX-G11stabi2 은 글루카곤와 67.1nM의 친화능으로 결합하였다 (도 20).
핵산 분자 NOX-G11stabi2의 결합능을 향상시키기 위하여, 핵산 분자 NOX-G11stabi2의 유도체들을 합성하였다. 상기 유도체들은 핵산 분자 NOX-G11stabi2와 동일한 핵염기 서열 (sequence of nucleobases 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실 또는 티민; 2’d-데옥시리보뉴클레오티드인 경우)을 갖으나, 리보뉴클레오티드가 아닌 2´-데옥시리보뉴클레이티드인 뉴클레오티드의 당부위, 한 위치만 상이한 L-핵산 분자들이다. 이에 따라, 유도체(derivative) 1(NOX-G11-D01으로 지칭)은 1번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 172)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물; 유도체(derivative) 2(NOX-G11-D02으로 지칭)는 2번 위치(position)에 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 173)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물 등을 제조하였다. 핵산 분자 NOX-G11stabi2가 54 개의 뉴클레오티드로 구성되므로 총 54 개의 유도체들을 단일 리보뉴클레오티드(single ribonucleotide)를 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 치환반응을 수행하기에 부합되는 가능한 모든 핵산 분자의 유도체 세트(set)를 제공하기 위하여 합성하였다. 상기 유도체의 완전한 세트를 도 18 A-E에 표시하였다. 분자 NOX-G11stabi2의 서열중 우라실인 경우는, 우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)를 티미딘(thymidine_-5´-포스페이트(phosphate)로 치환하였다.
개개의 핵산 분자 NOX-G11stabi2 유도체들의 완전한 세트 유도체들의 글루카곤에 대한 결합 친화능을 실시예 8에 개시된 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 측정하고 핵산 분자 NOX-G11stabi2의 결합 친화능과 비교하였다. 5개 이상의 개별적으로 측정된 NOX-G11stabi2의 KD 수치 세트로부터 평균값을 계산하였다 {평균(mean)±표준오차(standard error)}. 개별 유도체들의 KD 수치를 측정하고 친화능의 변화를 NOX-G11stabi2의 평균 KD 수치와 비교하여 x-배(fold) 향상(improvement)으로 표시하고, 여기에서 x-배(fold) 향상(improvement)은 NOX-G11stabi2의 KD 수치를 NOX-G11stabi2 유도체의 KD 수치로 나눈 값이다. 상기 표준 오차는 양성 히트(positive hits)에 대한 절단 점(cutting point)을 의미한다. x-배(fold) 향상된 친화능의 데이타는 도 18A-E에 나타냈다.
도 18A-E 에서 알 수 있는 바와 같이, 스피에겔머(Spiegelmer) 내에서 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)로 치환하는 위치에 따라, 목표에 대한 결합 친화능에 대하여 서로 상이할 수 있다. 놀랍게도, 핵산 분자 NOX-G11stabi2의 특정 위치에서의 1개 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)로의 단일 치환 (single substitution)은 글루카곤에 대한 결합 친화능을 향상시켰는데, 즉, 인간 글루카곤에 대한 더 낮은 결합 친화능을 나타낸데 반하여, 다른 위치에서의 치환들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 유의적인 변화를 초래하지 않았거나 오히려 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 감소시켰다. 핵산 분자 NOX-G11stabi2의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능과 비교한 개개 유도체 및 이들의 결합 친화능상의 상대적인 변화를 도 18 A-E에 나타냈다.
상기 도에서 알 수 있는 바와 같이, 유도체들 NOX-G11-D01, NOX-G11-D02, NOX-G11-D03, NOX-G11-D04, NOX-G11-D05, NOX-G11-D06, NOX-G11-D07, NOX-G11-D08, NOX-G11-D09, NOX-G11-D10, NOX-G11-D12, NOX-G11-D13, NOX-G11-D14, NOX-G11-D15, NOX-G11-D16, NOX-G11-D18, NOX-G11-D19, NOX-G11-D20, NOX-G11-D21, NOX-G11-D22, NOX-G11-D23, NOX-G11-D24, NOX-G11-D25, NOX-G11-D26, NOX-G11-D27, NOX-G11-D28, NOX-G11-D29, NOX-G11-D30, NOX-G11-D32, NOX-G11-D36, NOX-G11-D38, NOX-G11-D44, NOX-G11-D46, NOX-G11-D48 및 NOX-G11-D53 { 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 36, 38, 44, 46, 48 및 53 위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자의 1차 유도체군 (first group of derivatives)에 속함}이 인간 글루카곤에 대하여 향상된 결합능을 나타냈다 (도 11 A-E, 도 20). 상기 유도체들중 가장 강한 친화능은 유도체 NOX-G11-D07, NOX-G11-D16, NOX-G11-D19, NOX-G11-D19, NOX-G11-D21 및 NOX-G11-D22에서 나타났다 (도 11 A-E, 및 도 12). 결론적으로, 7, 16, 19, 21 및 22 위치가 핵산 분자 NOX-G11stabi2의 인간 글루카곤에 대한 친화능을 이끄는데 적합하였다. 핵산 분자 NOX-G11-D07, NOX-G11-D16, NOX-G11-D19, NOX-G11-D19, NOX-G11-D21 및 NOX-G11-D22 에 대하여 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 추가로 측정하였다. (도 20)
유도체들 NOX-G11-D11, NOX-G11-D17, NOX-G11-D31, NOX-G11-D33, NOX-G11-D34, NOX-G11-D35, NOX-G11-D39, NOX-G11-D40, NOX-G11-D43, NOX-G11-D45, NOX-G11-D50 및 NOX-G11-D52 {11, 17, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 43, 45, 50 및 52위치에 각각 2’-데옥시리보뉴클레오티드를 갖고, 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자의 2차 유도체군 (second group of derivatives)에 속함} 들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능면에서 영향을 나타내지 않았다. 결론적으로, 35 및 44 위치들은 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 C5a에 대한 결합 친화능에 향상을 나타났다. 결론적으로, 11, 17, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 43, 45, 50 및 52 위치들은 핵산 분자 NOX-G11stabi2의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능 향상에 적합하지는 않으나, 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 부정적 영향을 미치지는 않는 것으로 나타냈다.
결론적으로, 결합친화능 면에서 감소되거나 심각한 소실을 초래하는 유도체를도 수득하였다. 이러한 유도체들은 즉, NOX-G11-D37, NOX-G11-D41, NOX-G11-D42, NOX-G11-D47, NOX-G11-D49, NOX-G11-D51 및 NOX-G11-D54 {리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 NOX-G11stabi2 의 3차 유도체군 (third group of derivatives)에 속함}로서 이러한 리보뉴클레오티드의 2´-데옥시리보뉴클레오티드로의 치환은 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 나타냈다. 따라서, 37, 41, 42, 47, 49, 51 및 54 위치는 핵산 분자 NOX-G11stabi2의 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타냈다.
실시예 5. 목표 분자 글루카곤에 대한 증가된 결합능을 갖는 핵산 분자259-H6-002 유도체
SELEX 공정(process)의 직접적인 스크리닝 산물(immediate screening product)이며, 출발물질로서 개발공정의 결과인 인간 글루카곤 결합 핵산 분자를 출발점으로 하여, 본 발명의 방법을 그 목표(target)에 대한 핵산의 결합능을 향상시키기 위하여 사용하였다. 이번에는 인간 글루카곤 결합 핵산 분자로는 핵산 분자 259-H6-002을 사용하였다.
핵산 분자 259-H6-002 은 인간 글루카곤에 결합 가능한 스피에겔머(Spiegelmer), 즉, L-핵산 분자(nucleic acid molecule)로서 서열번호(SEQ ID NO: 287)에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖고 46 개 2‘-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)로 구성되었다.
핵산 분자 259-H6-002 의 결합 특성은 표면 플라즈몬 공명 측정법 (surface plasmon resonance measurement; 실시예 X에 개시)으로 측정하였다. 핵산 분자 259-H6-002은 인간 글루카곤와 10.9 nM의 친화능으로 결합하였다 (도 23).
핵산 분자 259-H6-002의 결합능을 향상시키기 위하여, 핵산 분자 259-H6-002의 유도체들을 합성하였다. 상기 유도체들은 핵산 분자 259-H6-002와 동일한 핵염기 서열 (sequence of nucleobases 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실 또는 티민)을 갖으나, 리보뉴클레오티드가 아닌 2´-데옥시리보뉴클레이티드인 뉴클레오티드의 당부위, 한 위치만 상이한 L-핵산 분자들이다. 이에 따라, 유도체(derivative) 1(259-H6-002-R01으로 지칭)은 1번 위치(position)에 리보뉴클레오시드(ribonucleoside)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 288)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물; 유도체(derivative) 2(259-H6-002-R02으로 지칭)는 2번 위치(position)에 2´-리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 289)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물 등을 제조하였다. 핵산 분자 259-H6-002가 46 개의 뉴클레오티드로 구성되므로 총 46 개의 유도체들을 단일 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 리보뉴클레오티드(single ribonucleotide)로의 치환반응을 수행하기에 부합되는 가능한 모든 핵산 분자의 유도체 세트(set)를 제공하기 위하여 합성하였다. 상기 유도체의 완전한 세트를 도 21 A-E에 표시하였다. 분자 259-H6-002의 서열중 티미딘인 경우는, 티미딘(thymidine)-5´-포스페이트(phosphate)를 우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)로 치환하였다.
개개의 핵산 분자 259-H6-002 유도체들의 완전한 세트 유도체들의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 실시예 8에 개시된 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 측정하고 핵산 분자 259-H6-002의 결합 친화능과 비교하였다. 5개 이상의 개별적으로 측정된 259-H6-002의 KD 수치 세트로부터 평균값을 계산하였다 {평균(mean) +/ 표준오차(standard error)}. 개별 유도체들의 KD 수치를 측정하고 친화능의 변화를 259-H6-002의 평균 KD 수치와 비교하여 x-배(fold) 향상(improvement)으로 표시하고, 여기에서 x-배(fold) 향상(improvement)은 259-H6-002의 KD 수치를 259-H6-002유도체의 KD 수치로 나눈 값이다. 상기 표준 오차는 양성 히트(positive hits)에 대한 절단 점(cutting point)을 의미한다. x-배(fold) 향상된 친화능의 데이타는 도 21A-E에 나타냈고 도 22로 구도하였다.
도 21A-D 에서 알 수 있는 바와 같이, 스피에겔머(Spiegelmer) 내에서 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로 치환하는 위치에 따라, 목표에 대한 결합 친화능에 대하여 서로 상이할 수 있다. 놀랍게도, 핵산 분자 259-H6-002의 특정 위치에서의 1개 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)로의 단일 치환 (single substitution)은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 향상시켰는데, 즉, 인간 글루카곤에 대한 더 높은 결합 친화능을 나타낸데 반하여, 다른 위치에서의 치환들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 유의적인 변화를 초래하지 않았거나 오히려 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 감소시켰다. 핵산 분자 259-H6-002의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능과 비교한 개개 유도체 및 이들의 결합 친화능상의 상대적인 변화를 도 21 A-D에 나타냈다.
상기 도에서 알 수 있는 바와 같이, 유도체들 259-H6-002-R8, 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R22, 259-H6-002-R24, 259-H6-002-R30, 259-H6-002-R31, 259-H6-002-R36, 259-H6-002-R38, 259-H6-002-R39, 및 259-H6-002-R44{ 8, 13, 22, 24, 30, 31, 36, 38, 39, 및 44 위치에 각각 리보뉴클레오티드를 갖고, 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)로 치환된 핵산 분자의 1차 유도체군 (first group of derivatives)에 속함}이 인간 글루카곤에 대하여 향상된 결합능을 나타냈다 (도 21 A-D, 도 22). 상기 유도체들중 가장 강한 친화능은 유도체 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24, 259-H6-002-R30 및 259-H6-002-R36에서 2.1 및 5.8배로 높게 나타났다 (도 21 A-D, 도 22). 결론적으로, 13, 24, 30 및 36 위치가 핵산 분자 259-H6-002의 인간 글루카곤에 대한 친화능을 이끄는데 적합하였다. 핵산 분자 259-H6-002-R13, 259-H6-002-R24, 및 259-H6-002-R36 에 대하여 표면 플라즈몬 공명 측정법을 이용하여 추가로 결합 친화능을 측정하였다. (도 23)
유도체들 259-H6-002-R04, 259-H6-R06, 및 259-H6-R46 {4, 6, 및 46 위치에 각각 2’-리보뉴클레오티드를 갖고, 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)로 치환된 핵산 분자의 2차 유도체군 (second group of derivatives)에 속함} 들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능면에서 영향을 나타내지 않았다. 결론적으로, 35 및 44 위치들은 핵산 분자 259-H6-002의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 향상을 나타났다. 결론적으로, 4, 6, 및 46 위치들은 핵산 분자 NOX-D19001의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능 향상에 적합하지는 않으나, 핵산 분자 259-H6-002의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 부정적 영향을 미치지는 않는 것으로 나타냈다.
유도체들 259-H6-R09 및 259-H6-R45들은 비아코아(Biacore)상에서 양쪽성 결합 양상(biphasic binding behaviour)을 나타낸다. 따라서, 상기 향상 배수는 (improvement factor)는 잘못된 수치인 것으로 판단되고 9 및 45 위치는 결합 친화능의 향상에 추가적인 향상에 영향을 미치지 않는 것으로 간주되었다.
결론적으로, 결합친화능 면에서 감소되거나 심각한 소실을 초래하는 31개 유도체를도 수득하였다. 이러한 유도체들은 즉, 259-H6-002-R01, 259-H6-002-R02, 259-H6-002-R03, 259-H6-002-R05, 259-H6-002-R07, 259-H6-002-R10, 259-H6-002-R11, 259-H6-002-R12, 259-H6-002-R14, 259-H6-002-R15, 259-H6-002-R16, 259-H6-002-R17, 259-H6-002-R18, 259-H6-002-R19, 259-H6-002-R20, 259-H6-002-R21, 259-H6-002-R23, 259-H6-002-R25, 259-H6-002-R26, 259-H6-002-R27, 259-H6-002-R28, 259-H6-002-R29, 259-H6-002-R32, 259-H6-002-R33, 259-H6-002-R34, 259-H6-002-R35, 259-H6-002-R37, 259-H6-002-R40, 259-H6-002-R41, 259-H6-002-R42, 259-H6-002-R43 {2´-데옥시리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 259-H6-002의 3차 유도체군 (third group of derivatives)에 속함}로서 이러한 2´-데옥시리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드로의 치환은 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 나타냈다. 따라서, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 41, 42, 및 43 위치는 핵산 분자 259-H6-002의 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타냈다.
핵산 분자 L- 259-H6-002의 유도체들의 결합 친화능이 1개 이상의 치환을 도입시에 더욱 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 또 추가적 유도체군 (further derivatives)을 제조하였다. 2´-데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드로 치환한 1차 유도체군으로부터 출발한 상기 유도체들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 향상된 결과를 나타냈다. 상기 유도체들은 핵산 분자 259-H6-002로부터 출발하여, 13, 24, 30 및 36 위치중 2개 이상의 위치에서 2´-데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드로 치환된 것으로서, 이러한 위치들은 핵산 분자 259-H6-002의 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 향상된 결과를 나타내기에 적합했다.
도 24에 도시한 바와 같이, 스피에겔머 259-H6-002의 다중 위치에서의 2´-데옥시리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드로의 치환한, 이러한 대표 실시예 유도체들의 표면 플라즈몬 공명 측정법에서 결합 친화능면에서 보다 향상된 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
13 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 24 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 및/또는 36 위치에서 티미딘-5´-포스페이트(thymidine-5'-phosphate)를 우리딘-5´-포스페이트(uridine-5'-phosphate)로, 2개 치환한 스피에겔머들인, 259-H6-002-R13_R24 및 259-H6-002-R13_R36은 1개 치환한 분자들보다 우수한 결합능을 나타냈다 (도 24).
핵산 분자 259-H6-002 내에서 13 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 24 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 및 36 위치에서 티미딘-5´-포스페이트(thymidine-5'-phosphate)를 우리딘-5´-포스페이트(uridine-5'-phosphate)로, 3개의 치환한 스피에겔머인 259-H6-002-R13_R24_R36은 2개의 치환을 한, 스피에겔머인 259-H6-002-R13_R24 및 259-H6-002-R13_R36와 비교시에 보다 우수한 결합능을 나타냈다 (도 24).
13 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 24 및 20번 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 및 36 위치에서 티미딘-5´-포스페이트(thymidine-5'-phosphate)를 우리딘-5´-포스페이트(uridine-5'-phosphate)로, 13, 24, 30 및 36번의 4개의 치환한 핵산 분자인 259-H6-002- R13_R24_R30_R36은 3개의 치환을 한, 스피에겔머인 259-H6-002-R13_R24_R36 와 비교시에 보다 약간 향상된 우수한 결합능을 나타냈다 (도 26).
스피에겔머인 259-H6-002, 259-H6-002-R13 및 259-H6-002-R13_R24_R36 의 기능성을 입증하고 비교하기 위하여 모든 핵산 분자들을 시험관내 세포배양 어세이법하에서 측정하였다 (실시예 14의 프로토콜 참조). 도 25에 나타난 바와 같이, 상기 시험관내 세포배양 어세이법은 인간 글루카곤에 대한 향상된 친화능은 인간 글루카곤 기능의 향상된 저해를 의미함을 입증하였다. 스피에겔머들인 259-H6-002, 259-H6-002-R13 및 259-H6-002-R13_R24_R36은 글루카곤 유도 세포내 cAMP 형성을 저해하였다 (IC50 수치: 각각 176 nM, 12.5 nM 및 6.2 nM, ) (도 25).
실시예 6. 목표 분자 글루카곤에 대한 증가된 결합능을 갖는 핵산 분자257-E1-001 유도체
SELEX 공정(process)의 직접적인 스크리닝 산물(immediate screening product)이며, 출발물질로서 개발공정의 결과인 인간 글루카곤 결합 핵산 분자를 출발점으로 하여, 본 발명의 방법을 그 목표(target)에 대한 핵산의 결합능을 향상시키기 위하여 사용하였다. 이번에는 인간 글루카곤 결합 핵산 분자로는 핵산 분자 257-E1-001을 사용하였다.
핵산 분자 257-E1-001은 인간 글루카곤에 결합 가능한 스피에겔머(Spiegelmer), 즉, L-핵산 분자(nucleic acid molecule)로서 서열번호(SEQ ID NO: 27)에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖고 47 개 2‘-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotides)로 구성되었다.
핵산 분자 257-E1-001의 결합 특성은 경쟁적 풀-다운 어세이 포맷법 (competitive pull-down assay format ; 실시예 10에 개시)으로 측정하였다. 핵산 분자 257-E1-001은 인간 글루카곤와 186 nM의 친화능으로 결합하였다 (도 28).
핵산 분자 257-E1-001의 결합능을 향상시키기 위하여, 핵산 분자 257-E1-001의 유도체들을 합성하였다. 상기 유도체들은 핵산 분자 257-E1-001와 동일한 핵염기 서열 {sequence of nucleobases 구아닌, 시토신, 아데닌, 및 우라실 또는 티민(2’-데옥시리보뉴클레오티드인 경우))을 갖으나, 2´-데옥시리보뉴클레이티드가 아닌 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드의 당부위, 한 위치만 상이한 L-핵산 분자들이다. 이에 따라, 유도체(derivative) 1(257-E1-R1-001으로 지칭)은 1번 위치(position)에 리보뉴클레오시드(ribonucleoside)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 228)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물; 유도체(derivative) 2(257-E1-R2-001으로 지칭)는 2번 위치(position)에 2´-리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 갖고 서열번호(SEQ ID NO: 229)의 뉴클레오티드 서열번호 (nucleotide sequence)을 갖는 화합물 등을 제조하였다. 핵산 분자 257-E1-001가 47 개의 뉴클레오티드로 구성되므로 총 47 개의 유도체들을 단일 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)를 리보뉴클레오티드(single ribonucleotide)로의 치환반응을 수행하기에 부합되는 가능한 모든 핵산 분자의 유도체 세트(set)를 제공하기 위하여 합성하였다. 상기 유도체의 완전한 세트를 도 27 A-D에 표시하였다. 분자 257-E1-001의 서열중 티미딘인 경우는, 티미딘(thymidine)-5´-포스페이트(phosphate)를 우리딘(uridine)-5´-포스페이트(phosphate)로 치환하였다.
개개의 핵산 분자 257-E1-001 유도체들의 완전한 세트 유도체들의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 실시예 10에 개시된 경쟁적 풀-다운 어세이 포맷법을 이용하여 측정하고 핵산 분자 257-E1-001의 결합 친화능과 비교하였다.
도 27 A-D에서 알 수 있는 바와 같이, 스피에겔머(Spiegelmer) 내에서 2´-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로 치환하는 위치에 따라, 목표에 대한 결합 친화능에 대하여 서로 상이할 수 있다. 놀랍게도, 핵산 분자 257-E1-001 의 특정 위치에서의 1개 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)로의 단일 치환 (single substitution)은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 향상시켰는데, 즉, 인간 글루카곤에 대한 더 높은 결합 친화능을 나타낸데 반하여, 다른 위치에서의 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)로의 치환들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 유의적인 변화를 초래하지 않았거나 오히려 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 감소시켰다. 핵산 분자 257-E1-001 의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능과 비교한 개개 유도체 및 이들의 결합 친화능상의 상대적인 변화를 도 27A-D에 나타냈다.
상기 도에서 알 수 있는 바와 같이, 유도체들 257-E1-R9-001, 257-E1-R15-001, 257-E1-R18-001, 257-E1-R19-001, 257-E1-R29-001, 및 257-E1-R30-001{ 9, 15, 18, 19, 29, 또는 30 위치에 각각 리보뉴클레오티드를 갖고, 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)로 치환된 핵산 분자의 1차 유도체군 (first group of derivatives)에 속함}이 인간 글루카곤에 대하여 향상된 결합능을 나타냈다 (도 27 A-D, 도 28). 상기 유도체들중 가장 강한 친화능은 유도체 257-E1-R15-001, 257-E1-R29-001, 및 257-E1-R30-001에서 나타났다 (도 27 B-C, 28). 결론적으로, 5, 29, 및 30 위치가 핵산 분자 257-E1-001의 인간 글루카곤에 대한 친화능을 이끄는데 적합하였다. 핵산 분자 257-E1-R15-001, 및 257-E1-R29-001에 대하여 경쟁적 풀-다운 어세이 법을 이용하여 추가로 결합 친화능을 측정하였다. (도 28)
유도체들 257-E1-R26-001 및 257-E1-R46-001 {26 및 46 위치에 각각 2’-리보뉴클레오티드를 갖고, 2´-데옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드 (ribonucleotide)로 치환된 핵산 분자의 2차 유도체군 (second group of derivatives)에 속함} 들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능면에서 영향을 나타내지 않았다. 결론적으로, 26 및 46 위치들은 핵산 분자 257-E1-001의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 향상을 나타내나, 핵산 분자 257-E1-001 의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 부정적 영향을 미치지는 않는 것으로 나타냈다.
결론적으로, 결합친화능 면에서 감소되거나 심각한 소실을 초래하는 유도체를도 수득하였다. 이러한 유도체들은 즉, 257-E1-R1-001, 257-E1-R2-001, 257-E1-R3-001, 257-E4-R1-001, 257-E5-R1-001, 257-E1-R6-001, 257-E1-R7-001, 257-E1-R8-001, 257-E1-R10-001, 257-E1-R11-001, 257-E1-R12-001, 257-E1-R13-001, 257-E1-R14-001, 257-E1-R16-001, 257-E1-R17-001, 257-E1-R20-001, 257-E1-R21-001, 257-E1-R22-001, 257-E1-R23-001, 257-E1-R24-001, 257-E1-R25-001, 257-E1-R27-001, 257-E1-R28-001, 257-E1-R31-001, 257-E1-R32-001, 257-E1-R33-001, 257-E1-R34-001, 257-E1-R35-001, 257-E1-R36-001, 257-E1-R37-001, 257-E1-R38-001, 257-E1-R39-001, 257-E1-R40-001, 257-E1-R41-001, 257-E1-R42-001, 257-E1-R43-001, 257-E1-R44-001, 257-E1-R45-001, 257-E1-R47-001 {2´-데옥시리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드로 치환된 핵산 분자 257-E1-001의 3차 유도체군 (third group of derivatives)에 속함}로서 이러한 2´-데옥시리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드로의 치환은 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 나타냈다. 따라서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47 위치는 핵산 분자 257-E1-001의 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타냈다.
핵산 분자 257-E1-001의 유도체들의 결합 친화능이 1개 이상의 치환을 도입시에 더욱 증가하는지 여부를 확인하기 위하여, 또 추가적 유도체군 (further derivatives)을 제조하였다. 2´-데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드로 치환한 1차 유도체군으로부터 출발한 상기 유도체들은 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능에 향상된 결과를 나타냈다. 상기 유도체들은 핵산 분자 257-E1-001로부터 출발하여, 9, 15, 18, 19, 29, 및 30위치중 2개 이상의 위치에서 2´-데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드로 치환된 것으로서, 이러한 위치들은 핵산 분자 257-E1-001의 인간 글루카곤에 대한 결합친화능에 향상된 결과를 나타내기에 적합했다.
도 27E, F 및 28에 도시한 바와 같이, 스피에겔머 257-E1-001의 다중 위치에서의 2´-데옥시리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드로의 치환한, 이러한 대표 실시예 유도체들의 경쟁적 풀-다운 어세이 법에서 결합 친화능면에서 보다 향상된 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
2개 이상의 2´-데옥시리보뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드로의 치환한, 조합의 인간 글루카곤에 대한 결합 친화능을 실시예 10의 경쟁적 풀-다운 어세이 법을 이용하여 측정하고 핵산 분자 257-E1-001 또는 257-E1-6xR-001의 결합 친화능과 각각 비교하였다.
2개 이상의 개별적으로 측정된 257-E1-001 또는 257-E1-6xR-001의 KD 수치 2 또는 10개의 세트로부터 평균값을 계산하였다 {평균(mean) ± 표준오차(standard error)}. 상기 조합된 치환을 갖는 스피에겔머들의 KD 수치를 측정하고 친화능의 변화를 257-E1-001 또는 257-E1-6xR-001의 평균 KD 수치와 비교하여 x-배(fold) 향상(improvement)으로 표시하고, 여기에서 x-배(fold) 향상(improvement)은 257-E1-001의 KD 수치를 257-E1-001 유도체의 KD 수치로 나눈 값이다. 상기 표준 오차는 양성 히트(positive hits)에 대한 절단 점(cutting point)을 의미한다. x-배(fold) 향상된 친화능의 데이타는 도 27 E 및 F에 나타냈다.
15 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 29 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 및/또는 30 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 2개 치환한 스피에겔머들인, 257-E1-R15/29-001 및 257-E1-R29/30-001은 1개 치환한 분자들보다 우수한 결합능을 나타냈다 (도 27E).
핵산 분자 257-E1-001 내에서 3개의 치환한 스피에겔머인 257-E1-R15/29/30-001 및 257-E1-R18/29/30-001은 2개의 치환을 한, 스피에겔머인 257-E1-R15/29-001 및 257-E1-R29/30-001와 비교시에 보다 우수한 결합능을 나타냈다. 즉, 15 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 29 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 및 30 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로의 치환들은 스피에겔머인 257-E1-R29/30-001와 비교시에 보다 우수한 결합능을 나타냈다. 그러나, 글루카곤에 대하여 1개 치환된 스피에겔머 257-E1-R15/29/30-001의 결합 친화능은 2개 치환된 스피에겔머 257-E1-R15/29-001의 결합 친화능과 필적하였다. 스피에겔머 257-E1-R18/29/30-001에서의 18 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로의 치환은 15 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로의 치환은 257-E1-R29/30-001과 비교시에 증가된 결합 친화능을 초래하나 257-E1-R15/29/30과 비교시에는 감소한 친화능을 나타냈다 (도 27E).
15 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 18번 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 29 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)로, 30 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)로 핵산 분자 257-E1-R15/18/29/30-001의 15, 18, 29 및 30번의 4개의 치환한 핵산 분자는 3개의 치환을 한 스피에겔머인 257-E1-R15/29/30-001와 비교시에 보다 향상된 결합능을 나타내지 못했다 (도 27E).
놀랍게도, 9, 15, 18, 19, 29, 30 (스피에겔머 257-E1-R9/15/18/19/29/30-001 = 257-E1-6xR-001) 위치에서 6개의 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로의 치환들( substitutions), 즉, 9번 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 15번 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)를 아데노신-5´-포스페이트(adenosine-5'-phosphate)로, 18번 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 19번 위치에서 데옥시구아노신-5´-포스페이트(deoxyguanosine)를 구아노신-5´-포스페이트(guanosine-5'-phosphate)로, 29 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)로, 30 위치에서 데옥시아데노신-5´-포스페이트(deoxyadenosine-5'-phosphate)로 6개의 치환을 한 핵산 분자는 2개 및 4개의 치환을 각각 수행한 스피에겔머들인 257-E1-R15/29-001 및 257-E1-R15/18/29/30-001와 비교시에 보다 향상된 결합능을 나타냈다 (도 27E 및 28).
6개의 2’-데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)로부터 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)로의 치환(substitutions)을 한 스피에겔머 257-E1-6xR-001가 글루카곤에 대한 결합 친화능이 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트를 우리딘(uridine)-5’-포스페이트 대신에 5-메틸-우리딘-5’-포스페이트로의 치환에 의하여 추가로 증가되는지 여부를 확인하기 위하여, 핵산 분자 257-E1-6xR-001 의 유도체들을 합성하였다. 상기 유도체들은 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트에서 5-메틸-우리딘-5’-포스페이트로의 추가의 7번째 치환도 포함하고 도 27 F에 나타냈다. 사실상, 7개 치환(substitutions) (핵산 분자 257-E1-7xR-023)를 한 단일의 핵산 유도체, 즉, 9, 15, 18, 및 19번 위치에서의 4개의 2´-데옥시구아노신(deoxyguanosine)-5’-포스페이트에서 구아노신(guanosine)-5’-포스페이트(phosphate)로의 치환, 29 및 30번 위치에서의 1개의 티미딘(thymidine)-5’-포스페이트에서 5-메틸(methyl)-우리딘(uridine)-5’-포스페이트로의 치환 및 2개의 2´-데옥시아데노신(deoxyadenosine)-5’-포스페이트에서 아데노신(adenosine)-5’-포스페이트로의 치환을 한 분자는 스피에겔머 257-E1-6xR-001와 비교시보다 약간 향상된 결합 친화능을 나타냈다 (도 27F 및 28).
결론적으로, 스피에겔머 257-E1-7xR-023의 글루카곤에 대한 결합 친화능은 SELEX 유래의, 비변형(unmodified) 스피에겔머 257-E1-001와 비교시에 43배의 향상을 나타냈다.
실시예 7. 스피에겔머의 합성 및 유도체화
7.1 소규모 합성법
스피에겔머들 (l-RNA 핵산 또는 l-DNA 변형(modified) l-RNA 핵산)은 표준 환외 아민 보호기 (standard exocyclic amine protecting groups) 를 갖는 2TBDMS RNA 및 DNA 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화학법(Damha 및 Ogilvie, 1993)을 이용한 ABI 394 합성기 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 고체-상 합성법(solid-phase synthesis)으로 생산하였다. D- (필요시, 실시예 9 및 10 참조) 및 L- 입체 배위를 갖는 올리고뉴클레오티드들의 RNA 부분인 rA(N-Bz)-, rC(N-Ac)-, rG(N-ibu)-, 및 rU- 포스포라미다이트 및 D- 및 L- 입체 배위를 갖는 올리고뉴클레오티드들의 DNA 부분인 dA(N-Bz)-, dC(N-Ac)-, dG(N-ibu)-, 및 dT들을 적용하였다, 상기 모든 포스포라미다이트들은 회사(ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 합성 및 탈보호후에, 압타머 및 스피에겔머들은 겔 전기영동법(Gel electrophoresis)로 정제하였다.
7.2 대규모 합성법 및 변형
상기 스피에겔머들은 표준 환외 아민 보호기(standard exocyclic amine protecting groups) 를 갖는 2’TBDMS RNA 및 DNA 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화학법(Damha 및 Ogilvie, 1993)을 이용한 합성기(synthesizer, Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg)로 고체-상 합성법(solid-phase synthesis)으로 생산하였다. l-rA(N-Bz)-, l-rC(N-Ac)-, l-rG(N-ibu)-, l-rU-, l-dA(N-Bz)-, l-dC(N-Ac)-, l-dG(N-ibu)-, 및 l-dT- 포스포라미다이트들은 회사(ChemGenes, Wilmington, MA)에서 구입하였다. 5-아미노-변형기 (amino-modifier)는 회사(American International Chemicals Inc. Framingham, MA, USA)에서 구입하였다. 상기 비변형(unmodified) 또는 5’-아미노-변형(Amino-modified) 스피에겔머의 합성은 l-riboA, l-riboC, l-riboG, l-riboU, l-2’deoxyA, l-2’deoxyC, l-2’deoxyG, or l-2’deoxyT 변형(modified) CPG 공극 크기(pore size) 1000 (Link Technology, Glasgow, UK)으로 출발하였다. RNA 및 DNA 포스포라미다이트 (사이클 당 15 분)의 커플링반응(coupling)을 위하여, 0.3 M 아세토니트릴 중 벤질티오테트라졸 (CMS-Chemicals, Abingdon, UK), 및 아세토니트릴 중 2 당량의 개개 0.2 M 포스포라미다이트 용액을 사용하였다. 산화-캡핑 사이클 (oxidation-capping cycle)이 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 추가적인 표준 용매 및 시약들은 회사(Biosolve, Valkenswaard, NL)에서 구입하였다. 스피에겔머는 DMT-ON 합성되고; 탈보호화한 후에, Source 15RPC 배양액(Amersham)을 이용한 예비(preparative) RP-HPLC(Wincott F. 등. 1995)을 통해 정제되었다. 5DMT-그룹은 80% 초산으로 제거되었다(실온에서 30분). 연속적으로, 수용성 2 M NaOAc 용액을 가하고 상기 스피에겔머는 5 K 재생 셀룰로오스 막(Millipore, Bedford, MA)을 이용한 탄젠셜-유동 여과법(tangential-flow filtration)으로 탈염되었다.
7.3 PEG화 반응(PEGylation)
생체 내 실험(in vivo)에서 스피에겔머의 혈장 체류 시간(plasma residence time)을 연장시키기 위하여, 상기 스피에겔머를 40 kDa 폴리에틸렌글리콜 (PEG)기의 5-말단에 공유 결합시켰다.
PEG화 반응을 위하여(PEG화 반응 방법의 구체적인 기술은 유럽특허 출원 제 1 306 382호를 참고), 상기 정제한 5-아미노 변형된 스피에겔머(5-amino modified Spiegelmer)는 물(2.5 ml), DMF(5 ml) 및 완충액 A(5 ml; 구연산ㆍ1 수화물 [7 g], 붕산 [3.54 g], 인산 [2.26 ml] 및 1M NaOH [343 ml]를 혼합하고 물을 가하여 1 L의 최종 용량을 만들고; 1 M 염산으로 pH=8.4로 적정하였다)의 혼합물에 용해시켰다.
상기 스피에겔머 용액의 pH는 1 M NaOH으로 8.4로 적정하였다. 그리고, 40 kDa PEG-NHS 에스테르(JenKem Technology USA Inc., Allen, TX)를 최대 수율이 75-85%에 도달하도록 0.25 당량의 6 부분(portions)으로 매 30분씩 37℃에서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 pH는 PEG-NHS 에스테르 첨가 중에 1 M NaOH로 8-8.5를 유지토록 하였다.
상기 반응 혼합물을 4 ml 우레아(urea) 용액(8 M), 4 ml 완충액 B(수중 0.1 M 트리에틸암모니움 아세테이트)와 혼합하고, 15분간 95℃로 가열하였다. 그리고 상기 PEG화된 스피에겔머를 아세토니트릴 경사법(완충액 B; 완충액 C: 아세토니트릴 중 0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트)을 이용하여 Source 15RPC 배양액(Amersham)으로 RP-HPLC로 정제하였다. 과잉의 PEG를 5% 완충액 C로, PEG화 스피에겔머는 10-15% 완충액 C로 용출시켰다. 95% 이상의 순도(HPLC로 측정)를 갖는 목적 분획물은 회수시켜 3 M NaOAC 40 ml와 혼합하였다. 상기 PEG화된 스피에겔머는 탄젠셜-유동 여과법 (tangential-flow filtration; 5 K 재생 셀룰로오스 막 (Millipore,Bedford, MA)을 이용)으로 탈염하였다.
실시예 8. 비아코아 측정법(Biacore measurement)
8.1 비아코아 어세이법 준비( Biacore assay setup)
기기(Biacore 2000 instrument; Biacore AB, Sweden)을 37℃의 고정온도로 맞추었다. 기기를 새로운 칩(chip)의 각 실험/고정화의 시작 전에 DESORB 방법을 이용하여 세척하였다. 유지용 칩(maintenance chip)을 장착후에, 기기를 흡수제거 용액(desorb solution) 1 (0.5% 소듐 도데실 설페이트, SDS), 흡수제거 용액 2 (50glycine, pH) 및 HBS-EP pH 완충액)로 연속으로 준비하였다. 결론적으로, 상기 시스템은 HBS-EP pH7.4 왼충액으로 준비하였다. 모든 시약은 별다른 지시가 없는 한 회사(GE Healthcare)에서 구입하여 사용하였다.
8.2. 목표 고정화(Target immobilization)
목표 고정화 과정을 개개 목표에 따라 개별적으로 확립하였다. 본원에서 개시된 목표에 대한 실시예들을 하기에 기재하였다.
8.3. 비오틴화 인간 L-글루카곤의 고정화 (Immobilization of biotinylated human L-glucagon)
고정화 완충액은 HBS-EP pH7.4 완충액을 이용했다. 합성된 비오틴화 인간 L-글루카곤 (glucagon1-29-AEEAc-AEEAc-biotin, BACHEM에서 통상적인 합성, Switzerland)을 0.4M EDC 1:1 혼합물 (물 중 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드) 및 0.1M NHS {물중 N-히드록시숙시미드 (hydroxysuccinimide)}을 이용하여 수용성 뉴트라빈(soluble neutravidin; Sigma Aldrich, Germany)을 공유적으로 고정화시켜 제조한 센서 칩 (carboxymethylated dextran-coated sensor chip; CM5, GE Healthcare)상에 고정화였다. 동일한 센서 칩상에서의 비교용 유동 세포 (reference flow cell)를 비오틴(biotin)으로 차단하였다.
8.4. 인간 L-C5a의 고정화 (Immobilization of human L-C5a)
고정화 완충액은 HBS-EP pH 완충액이다. 10mM NaOAc 중 재조합 인간 L-C5a (Sigma Aldrich) (pH 5.5)을 0.4M EDC (물 중 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드) 및 0.1M NHS {물중 N-히드록시숙시미드 (hydroxysuccinimide)}의 1:1 혼합물을 이용하여 활성화된 센서칩 (carboxymethylated dextran-coated sensor chip; CM5, GE Healthcare)상에 아민기 커플링 (amine coupling)하여 고정화하였다.
8.5. 인간 L-알파-CGRP의 고정화 (Immobilization of human L-alpha-CGRP)
고정화 완충액은 HBS-EP pH 완충액이다. 10mM NaOAc 중 합성된 인간 L-알파-CGRP (Bachem) (pH 5.5)을 0.4M EDC (물 중 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드) 및 0.1M NHS {물중 N-히드록시숙시미드 (hydroxysuccinimide)}의 1:1 혼합물을 이용하여 활성화된 센서칩 (carboxymethylated dextran-coated sensor chip; CM5, GE Healthcare)상에 아민기 커플링 (amine coupling)하여 고정화하였다.
8.6. 향상된 결합 친화능을 갖는 스피에겔머 유도체의 동정
개별적인 단일-위치 변형된 스피에겔머 유도체들의 결합력 분석(Binding analysis) 및 역학적 매개변수 분석(kinetic parameter assessment)을 37℃의 기기온도에서 1μM 농도로 스피에겔머를 주입함으로 수행되었다. 전체 주입의 전후에, 블랭크 작동 완충액(blank running buffer) 및 비교용 스피에겔머(Spiegelmer reference) 주입의 매 10번째 주입을 센서 칩 표면상의 재생 과정(regeneration procedure) 및/또는 제한된 펩티드 안정성(limited peptide stability)으로 인한 센서 칩 부식을 감시하기 위에 주사하였다.
5개 이상 개별적으로 측정된 모 스피에겔머(parent spiegelmer; 모든-DNA 또는 모든-RNA)의 Kd 수치로부터, 평균 값을 계산하였다 (평균 ± 표준오차). 개별 유도체들의 Kd 수치를 측정하고 친화력의 변화를 모 분자(parent molecule)의 평균치와 비교하여 x-배(fold) 향상으로 표시하였으며, 여기에서 x-배(fold) 향상의 수치는 모 분자의 KD 값을 모 분자 유도체의 KD 값으로 나눈 값이다. 측정된 표준 오차는 양성 히트 (positive hits)에 대한 절단 점(cutting point)을 의미한다.
데이터 분석 및 해리 상수(dissociation constants; Kd) 계산은 평균 치 및 표준 오차를 구하기 위하여 소프트웨어 (BIAevaluation 3.1.1 software; BIACORE AB, Uppsala, Sweden) 및 소프트웨어 (Prism 5.0 (GraphPad) software)를 이용하여 수행하였다.
전체적인 향상된 친화능(해리상수 Kd)을 초래하는, 목표 인지(target recognition; 집합상수 ka) 및/또는 스피에겔머 목표 복합체 안정성 (해리상수 kd)와 관련된 향상된 결합 특성을 나타내는 모분자의 유도체들을 구체적인 결합 역학(일련 농도의 개개 스피에겔머 주입)을 측정하기 위하여 특정하였다.
8.7. 선별된 모분자 유도체의 상세한 역학 평가
역학 매개변수(Kinetic parameters) 및 해리상수(dissociation constants)는 가장 낮은 농도에서 시작한, 작동 완충액(blank running buffer)중 여러 농도, 즉, 2,000 - 1,000 500 200 125 62.5 31.3 15.6 (2x) 7.8 3.9 - 1.95 -0.98 0.48 0.24 - 0.12 - 0 nM 농도로 일련의 스피에겔머를 주입하여 평가하였다. 모든 실험에서, 상기 분석법은 30μl /분의 속도로 240 내지 360 초의 집합 시간(association time) 및 240 내지 360 초의 해리 시간(dissociation time)을 정의하는 명령어(Kinject command)을 이용하여 37℃에서 수행하였다. 상기 실험은 이중으로 비교하였고, 여기에서, (차단된) 표면 대조군((blocked) surface control; 개개 스피에겔머의 용량 분배)으로 제공된 유동 세포(Flow Cell 1; FC1) 및 분석시료가 없이 대용량의 완충액 자체로 결정되는 일련의 완충액 주입군(buffer injection)을 사용하였다. 1개 이상의 스피에겔머 농도는 실험 중 재생효율(regeneration efficiency) 및 칩 일체성(chip integrity)를 검사하기 위하여 2회 주입하였다. 데이터 분석 및 해리상수 (dissociation constants; Kd) 계산은 소프트웨어(BIAevaluation 3.1.1 software; BIACORE AB) 로 수행하였다.
8.8. 향상된 결합력을 초래하는 동정된 위치 변화의 조합
최종적으로, 치환체들에 대한 긍정적인 단일 치환 위치를 조합하고 얻어진 결과 서열을 상세한 결합 역학실험(binding kinetics)으로 재연구하였다.
비아코아 측정법 (Biacore measurements)를 실시예 2 내지 5에 개시하였다.
실시예 9: S1P 스피에겔머의 경쟁적 스피에겔머 풀-다운 어세이법
S1P 결합 스피에겔머의 친화력 상수(Affinity constant)를 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법(Competitive pull-down binding assay)으로 측정하였다. T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (polynucleotide kinase)로 스피에겔머들을 방사성 표지화(radioactive labeling)하기 위하여, D-입체 배위의 2개의 구아노신 기(guanosine residues)를 L-S1P-215-F9-002 스피겔머의 5’-말단에 추가하였다. 그리고 비표지된(Unlabeled) 스피에겔머를 고정양의 비오틴화(biotinylated) D-e-S1P에 대한 결합을 위하여 300-600pM 방사성 표지된(radiolabeled) 스피에겔머 L-S1P-215-F9-002-5´diD-G과의 경쟁력, 즉, D-e-S1P에 대한 비표지 스피에겔머의 결합력에 따른 결합 신호를 감소시키는 능력을 시험하였다. D-e-S1P 은 경쟁적 스피에겔머(competitor spiegelmers)의 존재없이, 약 10% 방사성표지된 스피에겔머 L-S1P-215-F9-002-5´diD-G의 최종 결합에 따라, 8nM 농도로 사용하였다. 어세이는 250μl 선택용 완충액(selection buffer; 20 mM Tris-HCl pH 7.4; 150 mM NaCl; 5 mM KCl; 1 mM MgCl2 1 mM CaCl2 0.1% [w/vol] Tween-20; 4mg/ml 우혈청 알부민; 10μg/ml Yeast-RNA) 로 37℃에서 3-4시간 동안 수행되었다. 비오틴화 D-e-S1P 및 스피에겔머 및 비오틴화 S1P와의 복합체들을 결합 반응을 추가로 수행하기 전에 선택용 완충액으로 예비-평형화시킨(pre-equilibrated) 비드 (5μl Neutravidin Ultralink Plus beads; Pierce Biotechnology, Rockford, USA)상에서 고정화시켰다. 상기 비드(Beads)를 열혼합기(thermomixer)에서 37℃로 30분간동안 현탁하여 보관하였다. 상등액을 제거하고 적절한 세척후에, 고정환된(immobilized) 방사능을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)로 정량화하였다. 결합된(bound) 방사선 표지된 스피에겔머 L-S1P-215-F9-002-5´diD-G의 결합 백분율(percentage of binding) 또는 정상화 백분율(normalized percentage)을 상응하는 농도의 경쟁적 스피에겔머(competitor spiegelmer)에 대하여 구도하였다. 해리상수(Dissociation constants)를 소프트웨어(GraphPad Prism software)로 구하였다. 동일한 어세이 포맷(assay format)을 서로 상이한 스피에겔머 세트(set)의 비교용 서열화(comparative ranking)에 사용되었다. 본 실험에서는 경쟁적 스피에겔머는 지시된 단일 농도로 사용되었다.
실시예 10: 글루카곤에 대한 친화능 측정(풀-다운 어세이법)
핵산 분자의 글루카곤에 대한 결합능을 분석하게 위하여, L-뉴클레오티드(nucleotides)로 구성된 스피에겔머들을 합성하였다. 스피에겔머의 결합능 분석을 L-아미노산으로 구성된, 비오틴화 인간 L-글루카곤으로 수행하였다.
10.1 직접 풀-다운 어세이법(Direct pull-down assay)
스피에겔머의 5‘-말단에서의 D-배위의 2개의 추가적인 아데노신 치환기들은 [γ-32P]-표지 ATP(Hartmann Analytic, Braunschweig, 독일)을 이용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase; Invitrogen, Karlsruhe, 독일)에 의해 5포스페이트 표지화되었다. 표지 핵산들의 특이적 방사능은 200,000 내지 800,000 cpm/pmol이었다. 표지된 핵산들은 선택용 완충액 (20 mM Tris-HCl pH 7.4; 137 mM NaCl; 5 mM KCl; 1 mM MgCl2; 1 mM CaCl2; 0.1% [w/vol] Tween-20; 0.1% [w/vol] CHAPS) 중에서 다양한 농도의 비오틴화 인간 D- 또는 L-글루카곤과 같이, 저농도에서 평형에 도달하도록 2-6시간동안 37℃에서 100-700 pM 농도에서 변성(denaturation) 및 재생(renaturation)후에 배양되었다. 선택용 완충액은 사용된 플라스틱 용기 또는 고정화 매트릭스(matrix) 표면으로의 결합 파트너들의 비특이적 흡수를 억제하기 위하여, 100 ㎍/ml 인간 혈청 알부민(human serum albumin; Sigma-Aldrich, Steinheim, 독일) 및 10 ㎍/ml 효모 RNA (Ambion, Austin, 미국)를 첨가하였다. 스피에겔머 결합을 위하여 비오틴화 L-글루카곤의 농도 범위를 0.32 nM 내지 5 μM으로 조정하고; 총 반응 부피는 50μl였다. 비오틴화 글루카곤 및 핵산 및 비오틴화 글루카곤과의 복합체는 선택용 완충액으로 예비-평형화(pre-equilibrated)된 4 ㎕ μl 아가로스 입자(High Capacity Neutravidin Agarose particles; Thermo Scientific, Rockford, USA) 상에 고정화시켰다. 상기 입자들을 열 혼합기(thermomixer)에서 각각의 온도로 20분간 현탁 상태로 유지하였다. 고정화된 방사능은 상등액을 분리하고 적절한 세척을 마친 후에 신틸레이션 계수기(scintillation counter)로 정량화하였다. 고정화된 방사능은 상등액을 떼어 내고 적절한 세척 후에 판독기(scintillation counter)로 정량화하였다. 상기 결합의 백분율은 비오틴화글루카곤의 농도에 따라 구도되었고, 해리상수(dissociation constants)는 1:1 화학양론으로 추정되는 소프트웨어 알고리즘(software algorithms)을 이용하여 계산되었다(GRAFIT; Erithacus Software; Surrey 영국).
10.2. 글루카곤 결합 핵산의 서열화를 위한 경쟁적 풀-다운 결합 어세이법
서로 상이한 스피에겔머들의 글루카곤에 대한 결합력을 비교하기 위하여, 경쟁적 서열화 어세이법(competitive ranking assay)을 수행하였다. 상기 목적을 위하여 입수 가능한 가장 근접한 스피에겔머를 방사선으로 표지하고(상기 참조) 글루카곤 결합 스피에겔머에 대한 비교군(reference)으로 사용하였다. 변성 및 재생과정 후에, 표지된 핵산을 경쟁 없이 1.5 μl 아기로스 입자(High Capacity Neutravidin Agarose particles; Thermo Scientific, Rockford, USA)상에 고정화한 후에 세척시에 상기 비오틴화 글루카곤에 대하여 약 5-10% 결합하는 조건하에서 50 또는 100 μl 선택용 완충액에서 37℃에서 비오틴화 글루카곤과 같이 배양하였다. 과량의 변성 및 재생된 비-표지된(non-labeled) 다양한 농도의 스피에겔머 변이체(spiegelmer variants)들을 표지된 비교용 스피에겔머들과 함께 평형 결합반응(parallel binding reactions)을 수행하도록 하였다. 변성 및 재생된 비-표지된 스피에겔머 유도체들을 평형 결합반응(parallel binding reactions)하에서 비교용 스피에겔머와 같이, 1, 10, 및 100 nM 농도에서 적용하였다. 시험될 상기 핵산들은 목표 결합을 위해 상기 비교용 핵산(reference nucleic acid)과 경쟁하였고, 결국, 이들의 결합 특성에 따라서 상기 결합 신호를 감소시켰다. 본 어세이법에서 가장 활성이 강한 압타머 또는 스피에겔머들는 기타 글루카곤 결합 핵산 분자들과의 비교분석시험을 위해 새로운 비교물질(reference)로 제공될 수 있을 것이다.
10.3. 친화능 측정을 위한 경쟁적 풀-다운 어세이법
비교용 서열화 실험(comparative ranking experiments)에 추가하여 경쟁적 풀-다운 어세이법 (competitive pull-down assay)을 글루카곤 결합 핵산의 친화력 상수 (affinity constants)를 측정하기 위하여 수행되었다. 이러한 목적으로, L-글루카곤 결합 스피에겔머를 방사성으로 표지하였고 상기한 바와 같이 비교군(reference)으로 제공되었다. 변성 및 재생과정 후에, 표지된 비교용 핵산 및 0.128 내지 2000 nM 범위의 5배 희석법의 경쟁 분자(competitor molecules) 세트를 0.1 또는 0.2 ml 선택용 완충액중 일정한 양의 비오틴화 글루카곤과 같이 37℃에서 2 - 4 시간동안 배양하였다. 선택된 단백질 농도를 최저 경쟁 농도(lowest competitor concentration)에서 방사성 표지된 비교용 분자들이 약 5 - 10% 최종 결합율을 되도록 해야 한다. 핵산 분자 유도체 서열의 결합 상수를 측정하기 위하여, 과잉의 적절한 변성 및 재생 비표지된 변이체들을 경쟁자 (competitors)로 제공하였고, 비표지된 스피에겔머 및 PEG화 (PEGylated) 형태도 시험하였다. 또 다른 어세이적 접근으로서(assay approach), 서로 상이한 농도의 비-비오틴화(non-biotinylated) 글루카곤들을 스피에겔머 결합에 대하여 비오틴화 글루카곤과 경쟁시켰다. 비오틴화 글루카곤 및 결합된 핵산들을 아가로스 매트릭스(1.5 High Capacity Neutravidin Agarose matrix)상에서 고정화하고, 세척하고 판독(washing and scintillation counting)한 후에 (상기 참조), 결합된 방서성표지된 스피에겔머(bound radiolabeled Spiegelmer)의 정상화 백분율(normalized percentage)을 상응하는 농도의 경쟁자 분자(competitor molecules)에 대하여 구도화하였다. 얻어진 해리 상수를 소프트웨어(GraFit Software)를 채용하여 계산하였다.
실시예 11: S1P-결합 스피에겔머에 의한, S1P 경유 EDG1 수용 유도 b-어레스틴 (arrestin) 순항 저해효과
GPCR 세포 (PathHunterTMeXpress EDG-1 CHO-K1b-arrestin GPCR cells, Discover X)를 깨끗한 바닥면의 백색 96 웰-플레이트 (Greiner)에서 1 x 104 세포/웰로 접종하고 100배양용 배지(Culture Medium Discover X)에서 5% CO2 및 37℃ 온도 하에서 48시간 동안 배양하였다. 자극용 용액(Stimulation solutions; D-e-S1P + 다양한 농도의 스피에겔머)을 1mg/ml BSA 및 20mM HEPES를 첨가하고, 완전하게 혼합하고 30분간 37℃에서 배양하여 제조한 HBSS (Gibco) 중 11X 농축 용액을 완성했다. 10μl 자극용 용액을 웰당 첨가하고 (삼중치) 세포를 5% CO2 조건하에서 37℃에서 90분간 배양하였다.
활성화된 EDG1 및 b-어레스틴(arrestin)과의 상호작용은 b-갈락토시다제(galactosidase) 효소 단편 완성화(fragment complementation)을 유도하였다.
b-갈락토시다제 활성의 정량화를 위하여, 용액(55μl Working Detection Reagent Solution; DiscoverX)을 첨가하고 상온에서 90분간 배양하였다. 형광도(Luminescence)를 판독기(Fluostar Optima multidetection plate reader; BMG)상에서 연속으로 측정하였다.
항-S1P-스피에겔머의 효능을 확인하기 위하여, 세포를 다양한 농도의 스피에겔머로 전배양한 10nM D-e-S1P 또는 D-e-S1P 로 자극하였다. 결과는 스피에겔머가 없이 얻은 신호에 대한 정상화한 형광 신호(luminescence signal)의 백분율로 나타냈다. 삼중치 배양(triplicate cultures)의 평균치 ± SD을 나타냈다.
실시예 12: 인간 신경아세포종에서 알파-CGRP-유도 cAMP 생산의 저해 효과
CGRP-결합 스피에겔머들의 생물학적 효능은 하기와 같이 분석하였다:
인간 신경아세포종 세포 (SK-N-MC human neuroblastoma cells; DSMZ, Braunschweig)을 5x10e4 세포/웰 농도로 바닥이 편평한 96-웰 플레이트 (Greiner)에서 접종하고 10%열-비활성화 우태아 혈청(heat-inactivated fetal calf serum; FCS), 4 mM L-알리닐(alanyl)-L-글루타민(glutamine) (GLUTAMAX ), 50 units/ml 페니실린(Penicillin) 및 50 μg/ml 스트렙토마이신(Streptomycin)을 첨가한 100DMEM (1000mg/L glucose, Invitrogen)에서 for 48h at 37℃ 및 5% CO2 조건하에 48시간동안 배양하였다.
자극용 용액(Stimulation solutions; 1nM 인간 또는 래트(rat) L-alphaCGRP (Bachem) + 증가농도의 스피에겔머)을 v-바닥형 0.2ml 저 프로파일(low profile) 96-웰 플레이트을 이용하여 1mg/ml BSA 및 20mM HEPES을 첨가하고 HBSS (Gibco)에서 삼중치로 제조하고 37℃에서 60분간 전부 배양하였다. 블랭크 값(Blank values; L-alphaCGRP 무, 스피에겔머 무) 및 대조용 값(control values; 1nM L-alphaCGRP, 스피에겔머 무)을 삼중치로 포함시켰다. 자극 20분 전에, 1mM 포스포디에스테라제(phosphodiesterase) 저해제인 3-이소부틸(Isobutyl)-1-메틸크산틴(methylxanthine) (IBMX, Sigma; 50mM 스톡(stock): HBSS/BSA/HEPES에서 희석한 DMSO 중)을 세포 및 자극용 용액에 첨가하였다.
자극을 위하여, 세포 배양 배지를 세포로부터 제거하고 100예비-배양된 자극용 용액(stimulation solution)으로 치환하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2. 조건 하에서 30분간 자극시켰다. 자극용 용액을 제거 한 후에, 세포에 50μl/웰 어세이(assay)/용해(lysis) 완충액 (AppliedBiosystems, Tropix cAMP-ScreenTM System kit)을 첨가하여 37℃에서 30분간 용해시켰다.
웰(well)당 생성된 cAMP의 양을 제조자의 지시대로 키트(Tropix cAMP-ScreenTM ELISA System kit; Applied Biosystems)를 이용하여 연속적으로 측정하였다. 요약하면, 표준 곡선(standard curve)는 6nmol 내지 0.6pmol cAMP/웰 범위에서 어세이/용해 완충액에서 준비하였다. 어세이/용해 완충액에서 희석한 세포 용해물 및 표준 곡선을 염소(goat) 항(anti)-토끼(rabbit) IgG로 미리피복(precoated)된 마이크로프플레이트(microplates)에 첨가하였다. cAMP 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase) 접합체(conjugate) 및 항(anti)-cAMP 항체(antibody)를 시료에 첨가하고 상온에서 60분간 배양하였다. 연속적으로, 플레이트들을 세척하고 화학발광(chemiluminescent) 기질(substrate)을 첨가하였다. 30분 후에 화학발광도(chemiluminescence)를 판독기 (FLUOstar OPTIMA plate reader unit; BMG Labtech)에서 측정하였다. 시스템(cAMP-ScreenTMELISA system)은 경쟁적 면역어세어 포맷(competitive immunoassay format)이다. 따라서, 광 신호 강도(light signal intensity)는 시료(sample) 또는 표준물질(standard)중 cAMP 수준(level)에 역 비례하였다.
본 어세이 시스템은 본원에서 개시된 실시예 1 및 7의 범위 내의 시험용 스피에겔머를 시험하는데 사용되었다. 결과를 도 7 및 8에 표시하였다. 생성된 cAMP의 양은 대조군(control)에 대한 백분율로 표시하였다. 대조군대비 cAMP 생성(production)의 50% 저해에 필요한 스피에겔머의 농도를 저해 상수 (inhibitory constant IC50. )로 표시하였다.
실시예 13. 화학주성 어세이법에서의 저해 농도의 측정
13.1. C5a에 대한 인간 수용체를 발현하는 세포주의 생산
C5a에 대한 인간 수용체를 발현하는 안정적으로 감염된 세포주(cell line)를 세포(BA/F3 mouse pro B cells)를 인간 C5a 수용체 (NCBI 접근번호(accession): pcDNA3.1+중 NM_001736)를 코딩(coding)하는 플라스미드(plasmid)로 감염시킴으로서 생산하였다. C5aR 발현 세포들을 게네티신(geneticin)으로 처치함으로서 선별하였고 RT-PCR로 발현을 시험하고 화학주성 어세이법(chemotaxis assay)으로 기능성을 시험하였다.
13.2. 화학주성 어세이법(Chemotaxis assay)
실험 하루 전 날, 세포를 새로운 플라스크에 0.3x106/ml로 접종하였다. 실험을 위하여 세포를 원심분리하고, HBH (HBSS, 1 mg/ml 우혈청 알부민 및 20 mM HEPES 함유) 로 1회 세척 및 1.33 x 106 cells/ml로 재현탁하였다. 75μl 의 상기 현탁액을 5μm 공극크기의 96 웰 플레이트(Corning Transwell plate; Costar Corning, #3388; NY, USA)의 상단 분획(upper compartments)에 첨가하였다. In the 하단 분획(lower compartments)에서, 재조합 인간(recombinant human) C5a (서열번호 50) 또는 마우스 C5a (서열 번호 54)를 세포 첨가전 20 내지 30분 동안 전에 37℃에서 235μl HBH중의 다양한 농도의 스피에겔머와 같이 전배양(pre-incubated)을 하였다 이후에, 삽입 플레이트(insert plate; 상단 분획)을 제거하고 30μl 의 인산 완충액 염수(phosphate buffered saline) 중 440μM 레자주린(resazurin; Sigma, Deisenhofen, Germany)을 하단 분획에 첨가하였다. 2.5 시간동안 37℃에서 배양한 후에, 형광도(fluorescence)를 여기 파장(excitation wavelength; 544 nm) 및 방출 파장(emission wavelength; 590 nm)에서 측정하였다.
형광 수치 (Fluorescence values)를 배경 형광도(background fluorescence; 웰에 C5a없음)로 보정하고 스피에겔머로 구도하였다. IC50 값을 프리즘(GraphPad Prism)을 이용하여 비선형 회귀법(non-linear regression; 4 parameter fit) 으로 측정하였다. 호환적으로, 스피에겔머가 없는 시료(C5a 만있음)에 대한 수치를 100%으로 고정하고 스피에겔머 처치 시료에 대한 값을 이에 대한 백분율(percent)로 계산하였다. 상기 백분율(percent)-값(values)을 스피에겔머 농도에 따라 구도하였고 IC50-수치를 하기한 바와 같이 측정하였다.
13.3. 인간 및 마우스 C5a에 대한 절반-최대 유효 농도(half-maximal effective concentration; EC 50 ) 측정
다양한 인간 C5a 또는 마우스 C5a 농도에 지향하는 BA/F3/huC5aR 세포의 이주 3 시간 후에, 인간 C5a 및 마우스 C5a에 대한 용량-반응 곡선 (dose-response curves)을 얻고 여기에서, 절반 유효 농도 (half effective concentrations; EC50) 는 huC5a (0.1 nM) 및 mC5a (0.3 nM)를 각각 나타냈다. 스피에겔머에 의한 화학주성의 저해 실험을 위하여 0.1 nM 인간 C5a 및 0.3 nM 마우스 C5a를 사용하였다.
실시예 14: 글루카곤-결합 스피에겔머에 의한 글루카곤-유도 cAMP 생성의 저해
글루카곤에 대한 인간 수용체를 발현하는 안정적으로 감염된 세포주(cell line)를 인간 글루카곤 수용체 (NCBI 접근번호(accession): NM_000160)를 코딩(coding)하는 서열을 pCR3.1 벡터(vector; Invitrogen)로 클로닝(cloning)하여 생산하였다. 무혈청 배지(serum-free medium; UltraCHO, Lonza) 중에서 성장하도록 적응된 CHO를 글루카곤 수용체 플라즈미드 (glucagon receptor plasmid)로 감염시키고 안정적으로 감염된 세포들을 게네티신(geneticin)으로 처치하여 선별되었다.
저해실험을 위하여, 글루카곤 수용체를 발현하는 CHO 세포를 4 - 6 x 104/웰(well)의 밀도로 96 웰 플레이트(well plate) (세포 배양물 처치, 편평한 바닥)상에 위치하고 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 0.5 mg/ml 게네티신(geneticin)을 함유한 UltraCHO 배지에서 37℃ 5% CO2 조건하에서 하룻밤동안 배양하였다. 자극 20 분 전에, 3-이소부틸(isobutyl)-1-메틸크산틴(methylxanthine) (IBMX) 용액을 1 mM의 최종농도로 첨가하였다.
자극용 용액(stimulation solutions; 글루카곤 + 다양한 농도의 스피에겔머) 은 혼합용액(Hank's balanced salt solution (HBSS) + 1 mg/ml BSA)에서 제조하고 37℃에서 30분간 배양하였다. 세포에 첨가하자마자, IBMX를 1 mM의 최종농도로 첨가하였다.
자극을 위하여, 배지를 세포로부터 제거하고 자극용 용액 (글루카곤 + 다양한 농도의 스피에겔머)을 첨가하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후에, 용액을 제거하고 세포를 키트(cAMP-ScreenTM System kit; Applied Biosystems)의 구성품인 용해용-완충액(lysis-buffer)에서 용해시켰다. 상기 키트(kit)는 공급자의 지시에 따라 cAMP 양 측정에 사용하였다.
본원 명세서, 청구항 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 모두 각각 개별적으로 및 조합되어 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료가 될 수 있을 것이다.
[참고문헌]
역으로 지시하지 않는 한, 본원에서 개시된 완전한 서지적 데이터들은 하기와 같고 상기 참고문헌의 개시내용은 본원에서 참고로 인용된다.
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misc_feature <222> (40)..(46) <223> L-DNA <400> 326 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagt 46 <210> 327 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (41)..(46) <223> L-DNA <400> 327 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagt 46 <210> 328 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (42)..(46) <223> L-DNA <400> 328 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac ucgagt 46 <210> 329 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (43)..(46) <223> L-DNA <400> 329 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagt 46 <210> 330 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (44)..(46) <223> L-DNA <400> 330 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagt 46 <210> 331 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (45)..(46) <223> L-DNA <400> 331 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagt 46 <210> 332 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> L-DNA <400> 332 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagt 46 <210> 333 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> L-RNA <400> 333 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagu 46 <210> 334 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(23) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (25)..(46) <223> L-DNA <400> 334 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggattcac tcgagt 46 <210> 335 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(35) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (37)..(46) <223> L-DNA <400> 335 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggautcac tcgagt 46 <210> 336 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(23) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (25)..(35) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (37)..(46) <223> L-DNA <400> 336 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggautcac tcgagt 46 <210> 337 <211> 46 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (14)..(23) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (25)..(29) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (31)..(35) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (37)..(46) <223> L-DNA <400> 337 actcgagagg aaaggttggt aaaggttcgg ttggautcac tcgagt 46 <210> 338 <211> 50 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(50) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 40kDa-PEG-moiety attached to 5'-end <400> 338 ccgugcuguc ggagacuacu cgucgaguag aaauaggucc ccucccacgg 50 <210> 339 <211> 50 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 40kDa-PEG-moiety attached to 5'-end <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (42)..(50) <223> L-RNA <400> 339 ccgugcuguc ggagacuacu cgucgaguag aaauaggucc ccucccacgg 50 <210> 340 <211> 44 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 40kDa-PEG-moiety attached to 5'-end <400> 340 gcgugaauag ccguugaaac gccuuuagag aagcacuagc acgc 44 <210> 341 <211> 44 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 40kDa-PEG-moiety attached to 5'-end <220> <221> misc_feature <222> (2)..(18) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (22)..(31) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> L-DNA <220> <221> misc_feature <222> (33)..(44) <223> L-RNA <400> 341 gcgugaauag ccguugaaac gccuuuagag aagcacuagc acgc 44 <210> 342 <211> 46 <212> RNA <213> artificial <220> <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> D-RNA <220> <221> misc_feature <222> (3)..(46) <223> L-RNA <400> 342 gggcgugaau agccguugaa acgccuuuag agaagcacua gcacgc 46

Claims (11)

  1. (a) L- 비교용 핵산 분자를 제공하는 제 1단계 {여기에서, 상기 L- 비교용 핵산 분자는 목표 분자와 결합 가능하고 상기 L-비교용 핵산 분자는 n개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함함};
    (b)상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체를 준비하는 제 2단계 {여기에서 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체는 1개의 뉴클레오티드 위치가 상기 L-비교용 핵산 분자와 상이하고, 상기 제 1급 유도체는 상기 L-비교용 핵산 분자가 상기 뉴클레오티드 위치에서 리보뉴클레오티드를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서의 리보뉴클레오티드를 2'-데옥시리보뉴클레오티드로 치환시켜 제조하고, 상기 L-비교용 핵산 분자가 상기 뉴클레오티드 위치에서 2'-데옥시리보뉴클레오티드를 갖는 경우에는, 상기 1개의 뉴클레오티드 위치에서 2'-데옥시리보뉴클레오티드를 리보뉴클레오티드로 치환시켜 제조하고, 상기 치환이 이루어지는 뉴클레오티드 위치는 변형된 뉴클레오티드 위치임}; 및
    (c)상기 L-비교용 핵산 분자의 개개 뉴클레오티드 위치에서 상기 (b)단계를 반복하여 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군을 제조하는 제 3단계 {상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군은 n 개의 제 1급 유도체들로 구성되고, 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군의 각각은 단일의 뉴클레오티드 치환에 의하여 비교용 핵산 분자와는 상이하며, 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 각각은, 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체 군의 기타 다른 제 1차 유도체들의 모든 단일 변형 뉴클레오티드 위치들 중에 1개의 변형된 뉴클레오티드가 상이한 단일의 변형된 뉴클레오티드 위치를 갖음};
    (d) 상기 L-비교용 핵산의 n 개의 제 1급 유도체 각각에 대한 상기 목표 분자의 결합 특성을 측정하는 단계; 및 임의적으로
    (e) 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는, L-비교용 핵산 분자의 상기 제 1급 유도체(들)를 동정하는 단계(상기 결합 특성은 상기 목표 분자에 대한 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1급 유도체의 결합 친화능임)를 포함하는,
    목표 분자에 결합 가능한 L-핵산 분자를 염기쌍(base paring) 법이외의 기전(mechanism)으로 제조하는 제조방법 {여기에서, 상기 L-핵산 분자는 스피에겔머이고, 상기 L-핵산 분자의 목표분자에 대한 결합 친화능은 비교용 L-핵산 분자의 결합 친화능보다 상대적으로 증가한 것임}.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 결합 친화능은 KD 수치(value)로 표기되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 미리 결정된 역치는 Y 이며 Y는 {L-비교용 핵산 분자의 결합 친화능/ 제 1급 유도체의 결합 친화능}의 나눈 값이며, 여기에서 Y> 1인 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    (a) 상기 목표 분자에 대한 상기 L-비교용 핵산의 n 개의 제 2급 유도체 (second level derivative)의 결합 특성을 측정하는 단계; 및 임의적으로
    (b) 미리 결정된 역치를 넘는 결합 특성을 갖는, L-비교용 핵산 분자의 상기 제 2급 유도체(들)를 동정하는 단계(상기 결합 특성은 상기 목표 분자에 대한 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 2급 유도체의 결합 친화능임)를 포함하는,
    상기 L-비교용 핵산 분자의 제 2급 유도체를 제조하는 것이며, 여기에서 상기 제 2급 유도체는 적어도 제 1차 뉴클레오티드 위치 및 제 2차 뉴클레오티드 위치에서 상기 L-비교용 핵산 분자와 상이한 것이며, 여기에서 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치는 n개 유도체로 구성된 L-비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 1차 제 1급 유도체의 변형된 뉴클레오티드 위치인 것이며, 상기 제 1급 유도체는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 1차 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드는 L-비교용 핵산 분자의 제 1차 제 1급 유도체의 변형된 위치면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것이며,
    상기 제 2차 뉴클레오티드 위치는 n개 유도체로 구성된 L-비교용 핵산 분자 유도체 군으로부터 상기 L-비교용 핵산 분자의 제 2차 제 1급 유도체의 변형된 뉴클레오티드 위치인 것이며, 상기 제 2차 제 1급 유도체는 미리결정된 역치를 넘는 결합특성을 갖는 것이고 상기 제 2차 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드는 L-비교용 핵산 분자의 제 2차 제 1급 유도체의 변형된 위치 면에서 상기 뉴클레오티드와 동일한 것인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제 1차 제 1급 유도체 및 제 2차 제 1급 유도체는 어떠한 2개의 제 1급 유도체들의 조합인 것이며, 여기에서 상기 2개의 제 1급 유도체들의 각각의 결합 특성은 미리 결정된 역치를 넘는 것인 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 결합 친화능은 KD 수치로 표기되는 것인 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 미리 결정된 역치는 Y 이며 Y는 { L-비교용 핵산 분자의 결합 친화능/ 제 2급 유도체의 결합 친화능}의 나눈 값이며, 여기에서 Y> 1인 것인 방법.
  8. 제 1항에 따른 제조방법으로 제조 가능한 목표분자에 염기쌍(base paring) 법이외의 기전(mechanism)으로 결합 가능한 L-핵산 분자.
  9. 제 8항에 따른 L-핵산 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물.
  10. 하기 특성을 갖는 목표 분자와 염기쌍(base paring) 법이외의 기전(mechanism)으로 결합 가능한 하기의 L-핵산 분자:
    여기에서 상기 L-핵산 분자는 목표 분자에 결합 친화능을 갖고;
    여기에서 상기 L-핵산 분자의 목표분자에 대한 결합 친화능은 비교용 L-핵산 분자의 목표분자에 대한 결합 친화능보다 증가하거나 또는 동일하며;
    여기에서
    (a) 상기 L-핵산 분자는 뉴클레오티드 서열를 포함하고 상기 L-비교용 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열들을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 L-핵산 분자는 뉴클레오티드 서열 및 적어도 1개 이상의 변형기를 포함하고 상기 L-비교용 핵산 분자는 뉴클레오티드 서열 및 적어도 1개 이상의 변형기를 포함하며;
    여기에서 상기 L-핵산 분자의 뉴클레오티드 서열 및 상기 L-비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드의 핵염기성 기(nucleobase moiety)면에서 적어도 부분적으로 동일하나 뉴클레오티드의 당 기(sugar moiety)면에서 상이하며;
    여기에서 상기 L-핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 리보뉴클레오티드 및 2-데옥시리보뉴클레오티드 모두로 구성되며 상기 L-비교용 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열은 리보뉴클레오티드 또는 2-데옥시리보뉴클레오티드중 하나로 구성되는 것이다.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 L-핵산 분자 및/또는 L-비교용 핵산 분자는 목표 분자에 의하여 매개되는 활성의 길항제인 것인 핵산 분자.
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