BRPI0714844A2

BRPI0714844A2 - Ácidos nucléicos ligando a sdf-1

Info

Publication number: BRPI0714844A2
Application number: BRPI0714844-5A
Authority: BR
Inventors: Werner Purschke; Florian Jarosch; Dirk Eulberg; Sven Klussmann; Klaus Buchner; Christian Maasch; Nicole Dinse
Original assignee: Noxxon Pharma Ag
Priority date: 2006-07-18
Filing date: 2007-07-18
Publication date: 2013-11-26
Also published as: WO2008009437A2; WO2008009437A3; JP5380287B2; CN101506364B; KR20130090428A; KR101466931B1; BRPI0714844B1; CN101506364A; US20210139909A1; KR20090039717A; US8314223B2; HK1131184A1; AU2007276435B2; CA2658267C; DK2041282T3; US20110112172A1; EP2041282A2; BRPI0714844B8; US20130041019A1; PT2041282T

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ÁCIDOS NU- CLÉICOS LIGANDO A SDF-1

A presente invenção se refere a ácidos nucléicos ligando ao fa- tor 1 derivado de células estromais de quimocina CXC (SDF-1), e seu uso na 5 fabricação de um medicamento, e seu uso na fabricação de um agente de diagnóstico.

As quimocinas são uma família de pequenas proteínas básicas de ligação de heparina, estruturalmente relacionadas, de 8 a 14 kDa. Fun- cionalmente, podem ser classificadas como pró-inflamatórias, homeostáti- 10 cas, ou de dupla função (Moser, Wolf et al. 2004). Quimocinas inflamatórias são induzidas por patógenos, citocinas, ou fatores de crescimento e recru- tam leucócitos efetores para sítios de infecção, inflamação, lesão tecidual, e tumor. As quimocinas referidas regulam o recrutamento, ativação, e prolife- ração de células brancas (leucócitos) (Schall and Bacon 1994; Springer 15 1995; Baggiolini 1998). Quimocinas induzem seletivamente quimiotaxia de neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, mastócitos, célu- las T e células B. Além de seu efeito quimotático, podem exercer seletiva- mente ourtos efeitos em células responsivas como alterações no formato celular, aumento transitório na concentração de íons cálcio intracelular livre, 20 desgranulação, regulação para cima de integrinas, formação de lipídeos bio- ativos (leucotrienos, prostaglandinas, tromboxanos), ou explosão respiratória (liberação de espécies de oxigênio reativo para destruição de organismos patogênicos ou células tumorais). Portanto, provocando a liberação de me- diadores pró-inflamatórios adicionais, quimiotaxia e extravasamento de Ieu- 25 cócitos em direção a sítios de infecção ou inflamação, quimocinas disparam aumento progressivo da reação inflamatória. Quimocinas homeostáticas, por outro lado, são expressadas predominantemente na medula óssea e nos tecidos linfóides e estão envolvidas na hematopoiese, vigilância imune, e reações imunes adaptivas (Godessart 2005).

Com base na disposição dos primeiros dois de quatro resíduos

cisteína conservados, as quimocinas são divididas em quatro classes: CC ou β-quimocinas (por exemplo,) nas quais as cisteínas estão em tandem, CXC ou α-quimocinas, onde são separadas por um resíduo aminoácido adicional, XC ou Y quimocinas (linfotactina/XCL1 como único representante até o mo- mento) que possuem somente uma ponte dissulfeto, e CX3C-quimocinas as quais caracterizam três resíduos aminoácido entre as cisteínas (fractalcina 5 ligada a membrana como único membro da classe; (Bazan, Bacon et al. 1997)).

As quimocinas CXC agem essencialmente sobre neutrófilos, em particular as quimocinas CXC que carregam a seqüência de aminoácido ELR sobre seu término amino. Exemplos de quimocinas CXC que são ativas 10 sobre neutrófilos são IL-8/CXCL8, GR0a/CXCL1, GROp/CXCL2, e GROY/CXCL3, NAP-2/CXCL7, ENA-78/CXCL5, SDF-1/CXCL12 e GCP- 2/CXCL6. As quimocinas CC agem sobre uma maior variedade de leucóci- tos, tais como monócitos, macrófagos, eosinófilos, basófilos, bem como Iin- fócitos TeB (Oppenheim, Zachariae et al. 1991; Miller and Krangel 1992; 15 Baggiolini, Dewald et al. 1994; Jose1 Griffiths-Johnson et al. 1994; Ponath, Qin et al. 1996). Exemplos destas são I-309/CCL1; MCP-1/CCL2, MCP- 2/CCL8, MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, MIP-1a/CCL3 e MIP-1p/CCL4, RAN- TES/CCL5, e eotaxina/CCL11.

Quimocinas agem através de receptores que pertemcem a uma superfamília de sete receptores acoplados a proteína G de transposição transmembrana (GPCRs; (Murphy, Baggiolini et al. 2000)). Falando de modo geral, interações de receptores de quimocina e quimocina tendem a ser promíscuas em que uma quimocina pode ligar muitos receptores de quimo- cina e de modo oposto um único receptor de quimocina pode interagir com várias quimocinas. Alguns receptores conhecidos para as quimocinas CXC incluem CXCR1, o qual liga GROa, GCP-2, e IL-8; CXCR2, o qual liga qui- mocinas incluindo GROa, GROP, GROy, ENA-78, e IL-8; CXCR3, o qual liga quimocinas incluindo PF4, MIG, IP-10, e l-TAC; CXCR4 o qual até o momen- to foi visto que somente sinaliza em reação a SDF-1, e CXCR5, o qual foi demonstrado que sinaliza em reação a BCA-1 (Godessart 2005).

SDF-1 (fator derivado de células estromais-1; sinônimos, CX- CL12; PBSF [fator estimulador do crescimento células pré-B]; TPAR-1 [gene TPA reprimido 1]; SCYB12; TLSF [fator estimulador de células de Iinfoma tímico]; hIRH [intércrino humano reduzido em hepatomas]) é uma quimocina CXC angiogênica que não contém o motivo ELR típico das quimocinas se- melhantes a IL-8 (Salcedo, Wasserman et al. 1999; Salcedo and Oppenheim 5 2003) que liga e ativa o receptor CXCR4 acoplado a proteína G. A quimocina foi descoberta por três grupos independentemente, ou por clonagem de cD- NAs que carregam seqüências de sinal de N-terminal (Tashiro, Tada et al. 1993), em virtude de sua capacidade para estimular progenitores de células B iniciais quando expressados pela linhagem de células estromais PA6 10 (Nagasawa, Kikutani et al. 1994), ou por isolamento de uma biblioteca de cDNA construída a partir de fibroblastos de embrião de camundongo trata- dos com o ativador de proteína quinase C- tetra dodecanoil forbol acetato (TPA) (Jiang, Zhou et al. 1994).

Em conseqüência de junção alternativa, há duas formas de SDF- 1, SDF-Ia (68 AA) e SDF-1 β, as quais carregam quatro resíduos adicionais no C-término (Shirozu, Nakano et al. 1995). A importância biológica destas duas variantes de junção não é completamente entendida.

A conservação de seqüência entre SDF-1 de diferentes espécies é notável: SDF-Ia humano (SEQ.ID. 1) e SDF-Ia murino (SEQ.ID. 2) são 20 virtualmente idênticos. Há uma única uma alteração conservativa única de V para I na posição 18 (Shirozu, Nakano et al. 1995). Outra característica in- comum que distingue SDF-1 da maioria das outras quimocinas é sua seleti- vidade. De fato, SDF-1 e o receptor CXCR4 parecem compreender um par de receptor-ligante monógamo.

Existe um modelo de estrutura de NMR (acesso de PDB, 1SDF)

para SDF-1 [8-68]. Foi visto que SDF-1 é um monômero com uma região de N-terminal desordenada. Foram encontradas diferenças com outras quimo- cinas principalmente no tamponamento do núcleo hidrofóbico e na distribui- ção de carga superficial (Crump, Gong et al. 1997).

Atividades fisiológicas de SDF-1: Como o receptor de SDF-1

CXCR4 é amplamente expressado sobre leucócitos, células dendríticas ma- duras, células endoteliais, células cerebrais, e megacariócitos, as atividades de SDF-1 são pleiotrópicas. Esta quimocina, mais do que qualquer outra i- dentificada até o momento, apresenta a faixa mais ampla de funções biológi- cas, especialmente fora do sistema imune. Os efeitos funcionais mais signifi- cativos de SDF-1 são:

5 Homing e fixação de células epiteliais a sítios neovasculares na

porção coróide da retina. Foi demonstrado que SDF-1 está envolvido em homing de células epiteliais para a coróide durante neovascularização em tecido dos olhos. O papel exato destas células ainda está sob investigação mas a hipótese publicada é que células epiteliais estão envolvidas na forma- ção de vasos sangüíneos aberrantes (Sengupta, Caballero et al. 2005).

Hematopoiese. SDF-1 é necessário para manter células progeni- toras hematopoiéticas (CD34+) na medula óssea do adulto. AMD3100, um antagonista de CXCR4 seletivo, pode ser usado para mobilizar células CD34+ para transplantação de células-tronco hematopoiéticas. Células 15 CD34+ migram in vitro e in vivo em direção a um gradiente de SDF-1 produ- zido por células estromais (Aiuti, Webb et al. 1997).

Desenvolvimento e quimiotaxia de células B. SDF-1 suporta pro- liferação de células pré-B e aumenta o crescimento de progenitores de célu- las B da medula óssea (Nagasawa, Kikutani et al. 1994); induz migração es- 20 pecífica de células pré- e pré-B, enquanto não agindo como um quimioatra- tor significativo para células B maduras (D'Apuzzo, Rolink et al. 1997; Bleul, Schultze et al. 1998). Presumivelmente, SDF-1 é importante para o posicio- namento de células B dentro de tecido linfóide secundário.

Quimiotaxia de células T. SDF-1 é um dos quimioatratores de células T mais eficazes; CXCR4 está presente em muitos subgrupos de cé- lulas T (Bleul, Farzan et al. 1996).

Desenvolvimento embrionário. SDF-1 e seu receptor CXCR4 é essencial para o desenvolvimento embrionário. Camundongos de nocaute SDF-1 e CXCR4 morrem perinatalmente; eles apresentam defeitos do septo 30 ventricular cardíaco ou desenvolvimento cerebelar anormal além de números reduzidos de progenitores mielóides e de células B (Nagasawa, Hirota et al. 1996; Ma, Jones et al. 1998; Zou, Kottmann et al. 1998). SDF-1 também é necessário para ontogenia normal do desenvolvimento sangüíneo durante a embriogênese (Juarez and Bendall 2004).

Infecção por HIV. SDF-1 tem capacidade de inibir a entrada de HIV-1 T-trópico em linhagens celulares portando CXCR4, e a expressão de 5 SDF-1 pode ter um importante comportamento sobre a patogênese da AIDS, uma vez que um polimorfismo no gene de SDF-1 humano afeta o surto de AIDS (Bleul, Farzan et al. 1996).

Níveis de expressão alterados de SDF-1 ou seu receptor CXCR4 ou reações alteradas em direção a estas moléculas estão associadas com muitas doenças humanas, tais como retinopatia (Brooks, Caballero et al. 2004; Butler, Guthrie et al. 2005; Meleth, Agron et al. 2005); câncer de mama (Muller, Homey et al. 2001; Cabioglu, Sahin et al. 2005), ovários (Scotton, Wilson et al. 2002), pâncreas (Koshiba, Hosotani et al. 2000), tiróide (Hwang, Chung et al. 2003), nasofaringe (Wang, Wu et al. 2005); glioma (Zhou, Lar- sen et al. 2002); neuroblastoma (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001); leucemia linfocítica crônica de células B (Burger, Tsukada et al. 2000); síndrome de WHIM (verrugas, hipogamaglobulinemia, infecções, mielocatexia) (Gulino, Moratto et al. 2004; Balabanian, Lagane et al. 2005; Kawai, Choi et al. 2005); síndromes de deficiência imunológica (Arya, Ginsberg et al. 1999; Marechal, Arenzana-Seisdedos et al. 1999; Soriano, Martinez et al. 2002); neovascula- rização patológica (Salvucci, Yao et al. 2002; Yamaguchi, Kusano et al. 2003; Grunewald, Avraham et al. 2006); inflamação (Murdoch 2000; Fedyk, Jones et al. 2001; Wang, Guan et al. 2001); esclerose múltipla (Krumbholz, Theil et al. 2006); artrite reumatóide / osteoartrite (Buckley, Amft et al. 2000; Kanbe, Takagishi et al. 2002; Grassi, Cristino et al. 2004).

Em situações de animais experimentais, antagonistas de SDF-1 ou seu receptor se comprovaram eficientes para bloqueio do crescimento e/ou disseminação metastática de células de câncer humano de diferentes origens tais como pâncreas (Guleng, Tateishi et al. 2005; Saur, Seidler et al. 30 2005), cólon (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et al. 2003; Guleng, Tateishi et al. 2005), mama (Muller, Homey et al. 2001; Lapteva, Yang et al. 2005), pul- mão (Phillips, Burdick et al. 2003), glioblastoma / meduloblastoma (Rubin, Kung et al. 2003), próstata (Sun, Schneider et al. 2005), osteossarcoma (Perissinotto, Cavalloni et al. 2005), melanoma (Takenaga, Tamamura et al. 2004), estômago (Yasumoto, Koizumi et al. 2006), mieloma múltiplo (Menu, Asosingh et al. 2006).

5 Além disso, terapia anti-SDF-1 foi benéfica em modelos animais

para prevenir neovascularização retinal (Butler, Guthrie et al. 2005), nefrite (Balabanian, Couderc et al. 2003) e artrite (Matthys, Hatse et al. 2001; Ta- mamura, Fujisawa et al. 2004; De Klerck, Geboes et al. 2005).

SDF-1 é um agente na patologia de doenças do fundo de olho tais como retinopatia diabética (DR) (Fong, Aiello et al. 2004 ) e degenera- ção macular relacionada com a idade (AMD) (Ambati, Anand et al. 2003). Ambas estas doenças danificam o olho e levam a perda gradual da visão culminando em cegueira. A lesão ocorre devido ao crescimento inadequado de vasos sangüíneos no fundo do olho, um processo conhecido como neo- vascularização coroidal (CNV). Durante a neovascularização coroidal, novos vasos sangüíneos que se originam da coróide migram através de um rompi- mento na membrana de Bruch para dentro do epitélio do pigmento sub- retinal (sub-RPE) ou espaço subretinal. Os vasos anormais podem sangrar (hemorragia intrarretinal) ou vazar fluido sobre a retina. Isto pode deixar cica- trizes e pode elevar a mácula, o que distorce a visão.

Imagina-se que o SDF-1 tenha um papel na neovascularização coroidal através do recrutamento de células precursoras endoteliais (EPCs) para o olho. Estas células precursoras então se tornam componentes estru- turais chave nos vasos sangüíneos aberrantes.

Retinopatia diabética é uma seqüela importante do diabetes, o-

correndo freqüentemente em pacientes tanto com diabetes tipo 1 quanto com tipo 2. Há aproximadamente 16 milhões de diabéticos nos Estados Uni- dos, com quase 8 milhões tendo alguma forma de retinopatia diabética. Quando a retinopatia diabética proliferativa (PDR) é deixada sem tratamento, 30 cerca de 60% dos pacientes se tornam cegos em um ou ambos os olhos dentro de 5 anos. Com o aumento alarmante na prevalência de diabetes na América do Norte, Europa e muitos países emergentes, a população de pa- cientes está crescendo rapidamente. Por exemplo, a incidência de cegueira é 25 vezes maior em pacientes com diabetes do que na população geral. Além disso, a retinopatia diabética (DR) é a causa mais comum de cegueira em indivíduos da meia idade, sendo responsável por no mínimo 12 por cento 5 de todos os novos casos nos Estados Unidos a cada ano. Programas de triagem estão sendo realizados de modo que a visão de pacientes com dia- betes possa ser monitorada e que o tratamento possa ser liberado em tem- po, tal como está disponível.

As causas diretas de retinopatia diabética são parcamente en- 10 tendidas, mas imagina-se que a doença tenha suas origens em uma combi- nação de fontes: auto-regulação prejudicada do fluxo sangüíneo da retina; acumulação de sorbitol dentro das células da retina; e acumulação de produ- tos finais de glicosilação avançada no fluido extracelular. Todos estes fatores estão relacionados diretamente ou indiretamente com hiperglicemia, a abun- 15 dância de açúcar na corrente sangüínea.

Os sintomas de retinopatia diabética são similares aos da dege- neração macular relacionada com a idade. Os pacientes perdem células na retina e ocorrem microaneurismas (escoamentos de sangue) na membrana de base da retina. Além disso, VEGF, IGF-1 e outros fatores transportados 20 pelo sangue, possivelmente incluindo SDF-1, atraem novas células vascula- res e estimulam a formação de vasos sangüíneos prejudiciais.

Degeneração macular relacionada com a idade (AMD) destrói a visão central de uma pessoa. Os estágios iniciais da doença podem mesmo não ser dignos de nota, porque os sintomas variam entre os pacientes. Al- 25 gumas vezes um paciente é afetado somente em um olho. Ou a visão pode ser prejudicada em ambos os olhos mas não significativamente. A doença causa distorção ou percepção defeituosa das cores. Freqüentemente há um ponto escuro no centro do campo visual.

A etiologia (curso) da doença é parcamente compreendida. Fre- qüentemente a degeneração macular relacionada com a idade é considera- da como o envelhecimento da camada mais externa da retina. As alterações físicas ocorrem no centro da retina, também conhecida como a mácula, a qual é a parte da retina responsável pela visão mais aguda.

Degeneração macular relacionada com a idade úmida se inicia como uma seqüela para a forma seca da doença. Uns 90% dos pacientes sofrem da forma seca de degeneração macular relacionada com a idade, o 5 que resulta no adelgaçamento de tecidos maculares e distúrbios em sua pigmentação. O resto tem a forma úmida, a qual envolve a hemorragia des- crita acima.

A forma úmida de degeneração macular relacionada com a ida- de representa um mercado ideal para um novo terapêutico: já a causa mais 10 comum de cegueira em pessoas acima da idade de 55, a degeneração ma- cular relacionada com a idade afeta uma estimativa de 4% a 5% da popula- ção dos Estados Unidos com idades de 65 a 74 e quase 10% daqueles com 75 anos de idade ou mais. Já há 5 milhões de pessoas nos Estados Unidos somente acima da idade de 80 que têm esta doença e espera-se que outros 15 5 milhões de pessoas sejam afetadas por volta de 2020.

Tumores não são somente massas de células cancerígenas: infiltração de tumores com células imunes é uma característica do câncer. Muitos cânceres humanos têm uma rede complexa de quimocina que influ- encia a extensão e o fenótipo deste infiltrado, bem como crescimento, so- 20 brevida e migração tumorais, e angiogênese. A maior parte dos tumores só- lidos contém muitas células estromais não-malignas. Na verdade, as células estromais algumas vezes superam em número as células cancerígenas. As células estromais predominantes que são encontradas em cânceres são macrófagos, linfócitos, células endoteliais e fibroblastos.

Células malignas de diferentes tipos de câncer têm diferentes

perfis de expressão de receptor de quimocina, mas o receptor de SDF-1 CXCR4 é o mais comumente encontrado em camundongo e no homem: cé- lulas tumorais de no mínimo 23 tipos diferentes de cânceres humanos de origem epitelial, mesenquimal, e hematopoiética expressam CXCR4 (Balkwill 30 2004). SDF-1 é o único ligante conhecido para CXCR4. À parte da medula óssea e de tecido linfóide secundário, onde é expressado constitutivamente, SDF-1 é encontrado em sítios tumorais primários em Iinfoma (Corcione, Ot- tonello et al. 2000) e tumores cerebrais tanto de linhagem neuronal quanto astrocítica. Além disso, está presente em algos níveis em câncer de ovário (Scotton, Wilson et al. 2002) e câncer pancreático (Koshiba, Hosotani et al.

2000) bem como em sítios de metástase em câncer de mama (Muller, Ho- mey et al. 2001) e da tíróide (Hwang, Chung et al. 2003), neuroblastoma e

malignidades hematológicas (Geminder, Sagi-Assif et al. 2001). Em contras- te, a expressão de CXCR4 é baixa ou está ausente sobre epitélios normais de mama (Muller, Homey et al. 2001), de ovário (Scotton, Wilson et al. 2002) e de próstata (Sun, Schneider et al. 2005). A expressão de CXCR4 portanto

parece ser uma característica geral da célula epitelial maligna e não seu complemento normal.

Inibição da sinalização de receptor de quimocina sobre células tumorais tem o potencial de induzir parada do crescimento ou apoptose, e evitar invasão e metástase in wVo:

Knockdown de CXCR4 por siRNA anulou o crescimento de tu-

mor de mama (Lapteva, Yang et al. 2005); células de hibridoma T as quais foram transfectadas com um constructo que previne a expressão superficial de CXCR4 não podem mais metastizar para órgãos distantes quando injeta- das por via intravenosa em camundongos (Zeelenberg, Ruuls-Van Stalle et 20 al. 2001); em experimentos similares com células de câncer colorretal, me- tástases de pulmão e de fígado foram muito reduzidas (Zeelenberg, Ruuls- Van Stalle et al. 2003); anticorpos anti-CXCR4 inibiram a disseminação de xenoenxertos de câncer de mama para os Iinfonodos (Muller, Homey et al.

2001); tratamento de células linfoblastóides com anticorpos anti-CXCR4 ou anti-SDF-1 retardou o crescimento tumoral em camundongos (NOD)/SCID

(Bertolini, DeH1AgnoIa et al. 2002); anticorpos anti-SDF-1 inibiram o desen- volvimento de metástases de órgãos de células de câncer pulmonar de célu- las não pequenas (NSCLC) (Phillips, Burdick et al. 2003); administração sis- têmica do CXCR4 antagonista AMD3100 (AnorMED) inibiu o crescimento de 30 glioblastoma intracranial e xenoenxertos de meduloblastoma, e aumento de apoptose de células tumorais dentro de 24 horas (Rubin, Kung et al. 2003); anticorpos anti-SDF-1 inibiram o crescimento de células de câncer de mama MCF-7 misturadas com fibroblastos associados a carcinoma (Orimo, Gupta et al. 2005); neutralização de CXCR4 com anticorpos bloqueou metástase de câncer de próstata e crescimento em sítios ósseos (Sun, Schneider et al. 2005); desenvolvimento de metástase pulmonar depois de injeção de células 5 de osteossarcoma foi evitado por administração do CXCR4 antagonista pep- tídico T134 (Perissinotto, Cavalloni et al. 2005).

Diferentes autores chegam à conclusão de que tendo por alvo o eixo SDF-1 / CXCR4 pode proporcionar novas opções terapêuticas para pa- cientes com câncer:

Tumores de ovário humano expressam fortemente SDF-1 mais,

em um menor nível, VEGF. Ambas as proteínas são disparadsa por hipoxia no tumor. Concentrações patológicas de quaisquer das proteínas somente não foram suficientes para induzir angiogênese in vivo, mas juntos, SDF-1 e VEGF em concentrações patológicas induziram de modo eficaz e sinergica- 15 mente neovascularização. Portanto, interromper este eixo sinérgico, ao invés de VEGF somente, pode ser uma nova estratégia antiangiogênese eficaz para tratar câncer (Kryczek, Lange et al. 2005);

Linhagens de células de câncer de mama, quando equipadas com o caminho de sinalização SDF-1 / CXCR4 autócrino, apresentam com- 20 portamento agressivo. Isto inclui um aumento na invasividade e migração junto com crescimento mais rápido. O eixo SDF-1 / CXCR4 pode portanto proporcionar importante informação para prognosticar a natureza agressiva e constituir importantes alvos terapêuticos em câncer de mama humano (Kang, Watkins et al. 2005);

A migração e a metástase de células de câncer pulmonar de cé-

lulas pequenas (SCLC) - as quais expressam altos níveis de CXCR4 - são reguladas pelo SDF-1. A ativação de CXCR4 promove adesão a células a- cessórias (tais como células estromais) e moléculas da matriz extracelular dentro do microambiente tumoral. Estas interações adesivas resultam em 30 uma aumentada resistência de células de câncer pulmonar de células pe- quenas a quimioterapia. Deste modo, inibidores do eixo SDF-1 / CXCR4 po- dem aumentar a quimossensibilidade de células de câncer pulmonar de cé- lulas pequenas e levar a novos caminhos terapêuticos para pacientes com câncer pulmonar de células pequenas (Hartmann1 Burger et al. 2004);

O eixo SDF-1 / CXCR4 surge como um regulador pivotal do trá- fico de vários tipos de células-tronco no corpo. Como a maioria caso não 5 todas as malignidades se originam no compartimento de células-tronco / cé- lulas progenitoras, as células-tronco cancerígenas também expressam CX- CR4 sobre sua superfície e, em conseqüência, o eixo SDF-1 / CXCR4 está envolvido em direcionar seu tráfico / sua metástase para órgãos que expres- sam SDF-1 (por exemplo, linfonodos, pulmões, fígado, ossos). Em conse- 10 qüência, estratégias tendo por alvo a modulação do eixo SDF-1 / CXCR4 pode ter importantes aplicações clínicas tanto em medicina regenerativa pa- ra liberar células-tronco normais para os tecidos quanto em oncologia clínica para inibir metástase de células-tronco cancerígenas (Kucia, Reca et al. 2005).

O problema básico da presente invenção é proporcionar um an-

tagonista específico para SDF-1. Um aspecto adicional do problema básico da presente invenção é proporcionar um composto para o tratamento de do- enças e distúrbios envolvendo SDF-1 e o CXCR4 receptor, respectivamente.

Um outro problema básico da presente invenção é proporcionar métodos para a detecção específica de SDF-1.

O problema básico da presente invenção é resolvido pelo tema das reivindicações independentes. Modalidades preferenciais podem ser tiradas das reivindicações dependentes.

Em um primeiro aspecto o problema básico da presente inven- 25 ção é resolvido por uma molécula de ácido nucléico, preferencialmente li- gando a SDF-1, selecionada entre o grupo compreendendo moléculas de ácido nucléico tipo A, moléculas de ácido nucléico tipo B, moléculas de ácido nucléico tipo C e moléculas de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácido nucléico de acordo com qualquer de SEQ. ID. No. 142, SEQ. ID. No. 143 e 30 SEQ. ID. No. 144.

Em uma modalidade as moléculas de ácido nucléico tipo A com- preendem a seguinte seqüência de nucleotídeos de núcleo: 5’ AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3’ (SEQ.ID. 19) por meio da qual Xa ou está ausente ou é A.

Em uma modalidade preferencial as moléculas de ácido nucléico tipo A compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo selecionada entre o grupo compreendendo

5’ AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ. ID. No.

20),

5’ AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ. ID. No.

21), e

5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ. ID. No. 22),

preferencialmente a seqüência de nucleotídeos de núcleo compreende 5’ AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3’ (SEQ. ID. No. 22).

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico compreende na direção 5’->3’ um primeiro trecho de nucleotídeos, a seqüência de nu- cleotídeos de núcleo, e um segundo trecho de nucleotídeos.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico compreende na direção 5’->3’ um segundo trecho de nucleotídeos, a seqüência de nu- cleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos.

Em uma modalidade preferencial a molécula de ácido nucléico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e o referido pri- meiro e o referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

Em uma modalidade preferencial adicional a estrutura de fila- mento duplo consiste de quatro a seis pares de bases, preferencialmente cinco pares de bases.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ XiX2NNBV 3’ (SEQ. ID. No. 44) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ BNBNX3X4 3’ (SEQ. ID. No. 45)

por meio da qual Xi ou está ausente ou R, X2 é S, X3 é S e X4 ou está ausente ou Y; ou

Xi está ausente, X2 ou está ausente ou é S, X3 ou está ausente ou é S e X4 está ausente.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ RSHRYR 3’ (SEQ. ID. No. 23) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ YRYDSY 3’(SEQ. ID. No. 24),

preferencialmente 0 primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5’ GCUGUG 3’ e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CGCAGC 3’.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ X2BBBS 3’ (SEQ. ID. No. 42) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ SBBVX3 3’ (SEQ. ID. No. 43),

por meio da qual X2 ou está ausente ou é S e X3 ou está ausente

ou é S;

preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CUGUG 3’ e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CGCAG 3’;

ou o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüên- cia de nucleotídeos de 5’ GCGUG 3’ e 0 segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CGCGC 3’.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico tem uma se- qüência de ácido nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 5 a 18, 25 a 41, 133, 137, 139 a 141.

Em uma modalidade as moléculas de ácido nucléico tipo B com- preendem a seguinte seqüência de nucleotídeos de núcleo:

5’ GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3’ (SEQ. ID. No. 57).

Em uma modalidade preferencial as moléculas de ácido nucléico tipo B compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo de GUGU- GAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ. ID. No. 58):

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico compreende

na direção 5’->3’ um segundo trecho de nucleotídeos, a seqüência de nu- cleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos

Em uma modalidade preferencial a molécula de ácido nucléico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e o referido pri-

meiro e o referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

Em uma modalidade a estrutura de filamento duplo consiste de quatro a seis pares de bases, preferencialmente cinco pares de bases.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre-

ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ X1X2SVNS 3’ (SEQ. ID. No. 77) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ BVBSX3X4 3’ (SEQ. ID. No. 78), por meio da qual

Xi ou está ausente ou é A, X2 é G, X3 é C e X4 ou está ausente

ou é U; ou

Xi está ausente, X2 ou está ausente ou é G, X3 ou está ausente ou é C e X4 está ausente.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre-

ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ X1GCRWG 3’ (SEQ. ID. No. 59) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleo- tídeos de 5’ KRYSCX4 3’(SEQ. ID. No. 60),

por meio da qual Xi ou está ausente ou é A, e X4 ou está ausen- te ou é U.

Em uma modalidade 0 primeiro trecho de nucleotídeos compre-

ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ X1GCGUG 3’ (SEQ. ID. No. 75) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ UACGCX4 3’ (SEQ. ID. No. 76),

por meio da qual Xi ou está ausente ou é A, e X4 ou está ausen- te ou é U,

preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5’ AGCGUG 3’ e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ UACGCU 3’.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ X2SSBS 3’ (SEQ. ID. No. 73) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ BVSSX3 3’ (SEQ. ID. No. 74),

por meio da qual X2 ou está ausente ou G, e X3 ou está ausente

ou C,

preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5’ GCGUG 3’ e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ UACGC 3’.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico tem uma se- qüência de ácido nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 46 a 56, 61 a 72, 132.

Em uma modalidade as moléculas de ácido nucléico tipo C com-

preendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo de GGUYAGGGCU- HRXaAGUCGG (SEQ. ID. No. 90),

por meio da qual Xa ou está ausente ou é A.

Em uma modalidade preferencial as moléculas de ácido nucléico tipo C compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo selecionada entre o grupo compreendendo

5’ GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3’ (SEQ. ID. No. 91),

5’ GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3’ (SEQ. ID. No. 92), e 5’ GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ. ID. No. 93), prefe- rencialmente a seqüência de nucleotídeos de núcleo compreende 5’ GGUU- AGGGCUHGAAGUCGG 3’ (SEQ. ID. No. 93).

Em uma modalidade preferencial a molécula de ácido nucléico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e por meio da qual no mínimo uma parte do referido primeiro trecho e no mínimo uma parte do referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um 10 com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

Em uma modalidade a extensão do primeiro trecho e a extensão do segundo trecho é individualmente e independentemente 0 a 17 nucleotí- deos, preferencialmente 4 a 10 nucleotídeos e mais preferencialmente 4 a 6 nucleotídeos.

Em uma modalidade a estrutura de filamento duplo compreende

4 a 10 pares de bases, preferencialmente 4 a 6 pares de bases, mais prefe- rencialmente 5 pares de bases.

Em uma modalidade preferencial a estrutura de filamento duplo compreende 4 a 10 pares de bases consecutivos, preferencialmente 4 a 6 pares de bases consecutivos, mais preferencialmente 5 pares de bases con- secutivos.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ RKSBUSNVGR 3’ (SEQ. ID. No. 120) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ YYNRCASSMY 3’ (SEQ. ID. No. 121),

preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5’ RKSBUGSVGR 3’ (SEQ. ID. No. 122) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ YCNRCASSMY 3’ (SEQ. ID. No. 123).

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ XsSSSV 3’ (SEQ. ID. No. 124) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ BSSSXs 3’ (SEQ. ID. No. 125), por meio da qual Xs ou está au- sente ou é S.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ SSSSR 3’ (SEQ. ID. No. 130) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ YSBSS 3’ (SEQ. ID. No. 131),

preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5’ SGGSR 3’ (SEQ. ID. No. 126) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ YSCCS 3’ (SEQ. ID. No. 127).

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ GCSGG 3’ (SEQ. ID. No. 128) e

o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ CCKGC 3’ (SEQ. ID. No. 129),

preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5’ GCCGG 3’ e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CCGGC 3’.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CGUGCGCUUGAGAUAGG 3’ e

o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5’ CUGAUUCUCACG 3’.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ UGAGAUAGG 3’ e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CUGAUUCUCA 3’.

Em uma modalidade o primeiro trecho de nucleotídeos compre- ende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ GAGAUAGG 3’ e o segundo tre- cho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5’ CUGAUUCUC 3’.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico tem uma se- qüência de ácido nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 79 a 89, 94 a 119, 134 a 136.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico tem uma se- qüência de ácido nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 142 a 144.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico é um antago-

nista para SDF-1.

Em uma modalidade a molécula de ácido nucléico é um antago- nista do sistema receptor de SDF-1, preferencialmente o receptor de SDF-1 do sistema receptor de SDF-1 é o CXCR4 receptor.

Em uma modalidade o SDF-1 é um SDF-1 humano e/ou o recep-

tor de SDF-1 é um receptor de SDF-1 humano.

Em uma modalidade SDF-1 compreende uma seqüência de a- minoácido de acordo com a SEQ ID No. 1.

Em uma modalidade o ácido nucléico compreende uma modifi-

cação.

Em uma modalidade preferencial a modificação é selecionada entre o grupo compreendendo uma porção HES e uma porção PEG.

Em uma modalidade preferencial adicional a modificação é uma porção PEG consistindo de um PEG reto ou ramificado, por meio da qual o peso molecular da porção PEG é preferencialmente a partir de cerca de 2 até 180 kD, mais preferencialmente a partir de cerca de 60 até 140 kD e o mais preferencialmente cerca de 40 kD.

Em uma modalidade a modificação é uma porção HES, por meio da qual preferencialmente o peso molecular da porção HES é a partir de cerca de 10 até 130 kD, mais preferencialmente a partir de cerca de 30 até 130 kD e o mais preferencialmente cerca de 100 kD.

Em uma modalidade os nucleotídeos do ácido nucléico são L- nucleotídeos, preferencialmente os nucleotídeos das seqüências de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos.: 19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91, 92, e 93.

Em um segundo aspecto o problema básico da presente inven-

ção é resolvido por uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto e opcionalmente um constituinte adicional, por meio da qual o constituinte adicional é selecionado entre o grupo compreendendo excipientes farmaceuticamente aceitáveis e agentes farmaceuticamente ativos.

Em um terceiro aspecto o problema básico da presente invenção 5 é resolvido pelo uso de um ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto para a fabricação de um medicamento.

Em uma modalidade do terceiro aspecto o medicamento é para

o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúrbio, por meio do qual semelhante doença ou distúrbio é mediado por SDF-1, preferencialmente 10 semelhante doença ou distúrbio é selecionado entre o grupo compreenden- do doenças do fundo de olho como retinopatia diabética e degeneração ma- cular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome de WHIM; síndromes 15 de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflamação; escle- rose múltipla; artrite reumatóide / osteoartrite e nefrite.

Em uma modalidade do terceiro aspecto o medicamento é para inibir angiogênese, neovascularização, inflamação e metástase.

Em um quarto aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido pelo uso do ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto para a fabricação de um meio diagnóstico.

Em uma modalidade do quarto aspecto o meio diagnóstico é pa- ra o diagnóstico de uma doença, por meio do qual a doença é selecionada entre o grupo compreendendo doenças do fundo de olho como retinopatia 25 diabética e degeneração macular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome de WHIM; síndromes de deficiência imunológica; neovasculariza- ção patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatóide / osteoartri- 30 te e nefrite.

Em uma modalidade do quarto aspecto o meio diagnóstico é pa- ra diagnosticar angiogênese, neovascularização, inflamação e/ou metástase. Em um quinto aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido por um complexo compreendendo SDF-1 e um ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto, por meio da qual preferencialmente o com- plexo é um complexo cristalino.

Em um sexto aspecto o problema básico da presente invenção é

resolvido pelo uso do ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto para a detecção de SDF-1.

Em um sétimo aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido por um método para a triagem de um antagonista de SDF-1 ou

um SDF-1 agonista compreendendo as seguintes etapas:

proporcionar um antagonista de SDF-1 candidato e/ou um SDF-

1 agonista candidato,

- proporcionar um ácido nucléico de acordo com o primeiro as- pecto,

- proporcionar um sistema de teste o qual proporciona um sinal

na presença de um antagonista de SDF-1 e/ou um SDF-1 agonista, e

- determinar se o antagonista de SDF-1 candidato é um antago- nista de SDF-1 e/ou whether o SDF-1 agonista candidato é um SDF-1 ago- nista.

Em um oitavo aspecto o problema básico da presente invenção

é resolvido por um método para a triagem de um SDF-1 agonista e/ou um antagonista de SDF-1 compreende as seguintes etapas:

- proporcionar SDF-1 imobilizado para uma fase, preferencial- mente uma fase sólida,

- proporcionar um ácido nucléico de acordo com o primeiro as-

pecto, preferencialmente um ácido nucléico de acordo com o primeiro aspec- to o qual é marcado,

- adicionar um SDF-1 agonista candidato e/ou um antagonista de SDF-1 candidato, e

- determinar se o SDF-1 agonista candidato é um SDF-1 agonis-

ta e/ou se o antagonista de SDF-1 candidato é um antagonista de SDF-1.

Em uma modalidade do oitavo aspecto a determinação é reali- zada de tal modo que é avaliado se o ácido nucléico é substituído pelo SDF-

1 agonista candidato ou por um antagonista de SDF-1 candidato.

Em um nono aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido por um kit para a detecção de SDF-1, compreendendo um ácido nucléico de acordo com o primeiro aspecto.

Em um décimo aspecto o problema básico da presente invenção é resolvido por um antagonista de SDF-1 obtenível pelo método de acordo com o sétimo aspecto ou o oitavo aspecto.

A presente invenção se baseia no achado surpreendente que é possível gerar ácidos nucléicos ligando especificamente e com alta afinidade a SDF-1.

SDF-1 é um peptídeo básico tendo a seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ. ID. No. 1. O pl calculado de SDF-1 é 9,70. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo SDF-1 se refere a qual- 15 quer SDF-1 incluindo, mas não limitado a, SDF-1 mamífero. Preferencial- mente, o SDF-1 mamífero é selecionado entre o grupo compreendendo SDF-1 de camundongos, de rato, de coelho, de hamster, de macaco e hu- mano. O mais preferencialmente o SDF-1 é SDF-1 humano (SEQ.ID. 1).

A descoberta de que ácidos nucléicos ligando com alta afinidade 20 a SDF-1 podem ser identificados, é insofar surpreendente conforme Eaton et al. (Eaton, Gold et al. 1997) observaram que a produção de aptâmeros, isto é, D-ácidos nucléicos ligando a uma molécula alvo, dirigida para uma proteí- na básica é em geral muito difícil porque este tipo de alvo produz uma pro- porção de sinal para ruído elevada mas não específica. Esta elevada pro- 25 porção de sinal para ruído resulta da elevada afinidade não específica mos- trada por ácidos nucléicos para alvos básicos tais como SDF-1.

As características do ácido nucléico de acordo com a presente invenção conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, podem ser realizadas em qualquer aspecto da presente invenção onde o ácido nucléico é usado, quer sozinho quer em qualquer combinação.

Sem desejar serem limitados por qualquer teoria, os presentes inventores pressumem que a especificidade observada dos ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 de acordo com a presente invenção partilha algumas características estruturais e em particular uma das seqüências de nucleotí- deos as quais também são referidas no mesmo como seqüências de núcleo as quais serão discutidas em mais detalhes a seguir, por meio dos quais é 5 feita referência às Figs. 1 a 8 e ao Exemplo 1. No entanto, deve ser entendi- do que as Figs. e o Exemplo 1 referidos incorporam várias das característi- cas estruturais referidas as quais não têm de ser necessariamente realiza- das em cada um e quaisquer dos ácidos nucléicos de acordo com a presen- te invenção.

Conforme resumido em mais detalhes nas reivindicações e no

exemplo 1, as várias moléculas de ácido nucléico de ligação de SDF-1 hu- mano podem ser categorizadas com base nas referidas Caixas e algumas características estruturais e elementos, respectivamente. As várias categori- as definidas deste modo também são referidas aqui, neste requerimento de patente, como tipos e mais especificamente como Tipo A, Tipo B e Tipo C.

Em uma modalidade preferencial o ácido nucléico de acordo com a presente invenção é uma única molécula de ácido nucléico. Em uma modalidade adicional, a única molécula de ácido nucléico está presente co- mo uma multitude da única molécula de ácido nucléico. Preferencialmente, 20 os termos ácido nucléico e molécula de ácido nucléico são usados em uma maneira intercambiável aqui, neste requerimento de patente, caso não indi- cado ao contrário.

Será reconhecido por aqueles versados na técnica que a molé- cula de ácido nucléico de acordo com a invenção preferencialmente consiste de nucleotídeos os quais são encadeados de modo covalente una aos ou- tros, preferencialmente através de ligações ou cadeias fosfodiéster.

Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção tam- bém compreenderão ácidos nucléicos os quais são essencialmente homólo- gos às seqüências em particular reveladas aqui, neste requerimento de pa- 30 tente. O termo substancialmente homólogos será entendido tal como a ho- mologia é de no mínimo 75%, preferencialmente 85%, mais preferencialmen- te 90% e o mais preferencialmente mais de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99%. A percentagem real de nucleotídeos homólogos presentes no ácido nucléico de acordo com a presente invenção dependerá do número total de nucleotídeos presentes no ácido nucléico. A percentagem de modifi- cação pode ser baseada no número total de nucleotídeos presentes no ácido 5 nucléico.

A homologia pode ser determinada conforme de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Mais especificamente, um algoritmo de comparação de seqüências em seguida calcula a percentagem de identida- de de seqüência para a uma ou mais seqüências de teste em relação à se- 10 qüência de referência, com base nos parâmetros do programa designados. A seqüência de teste jé preferencialmente a seqüência ou molécula de ácido nucléico a qual se diz que é ou deve ser testada se é homóloga, e em caso positivo, em qual extensão, a outra molécula de ácido nucléico, por meio do que a outra molécula de ácido nucléico também é referida como a seqüência 15 de referência. Em uma modalidade, a seqüência de referência é uma molé- cula de ácido nucléico conforme descrito aqui, neste requerimento de paten- te, mais preferencialmente uma molécula de ácido nucléico tendo uma se- qüência de acordo com quaisquer das SEQ. ID. NOs. 5 a 144. Alinhamento de seqüências ótimo para comparação pode ser conduzido, por exemplo, 20 pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman (Smith & Waterman, 1981) pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch (Needleman & Wunsch, 1970) pela pesquisa para método de similaridade de Pearson & Lipman (Pearson & Lipman, 1988), por implementações compute- rizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin 25 Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção visual.

Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar a percentagem de identidade de seqüência é o algoritmo usado na ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (nas partes que se seguem "BLAST 30 "), vide, por exemplo, Altschul et al (Altschul et al. 1990 and Altschul et al, 1997). Software para realizar análises BLAST está disponível publicamente através do National Center for Biotechnology Information (nas partes que se seguem "NCBI"). Os parâmetros default usados na determinação da identi- dade de seqüência usando o software disponível na NCBI, por exemplo, BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) e BLASTP (para seqüências de aminoácidos) são descritos em McGinnis et al (McGinnis et al, 2004).

5 O termo ácido nucléico da invenção ou ácido nucléico de acordo

com a presente invenção também compreenderá os ácidos nucléicos com- preendendo as seqüências de ácidos nucléicos reveladas aqui, neste reque- rimento de patente, ou parte das mesmas, preferencialmente na extensão que os ácidos nucléicos ou as partes referidas estão envolvidos na ligação a 10 SDF-1. Um ácido nucléico semelhante pode ser derivado daqueles revela- dos aqui, neste requerimento de patente, por exemplo, por truncação. Trun- cação pode ser relacionada com qualquer uma ou ambas as extremidades dos ácidos nucléicos conforme revelado aqui, neste requerimento de paten- te. Além disso, truncação pode ser relacionada com a seqüência interna de 15 nucleotídeos, isto é, pode ser relacionada com o um ou mais nucleotídeos entre o nucleotídeo 5’ e o 3’ terminal, respectivamente. Além disso, trunca- ção compreenderá a eliminação de tão pouco quanto um único nucleotídeo da seqüência dos ácidos nucléicos revelados aqui, neste requerimento de patente. Truncação também pode ser relacionada a mais de um trecho do 20 um ou mais ácidos nucléicos da invenção, por meio da qual o trecho pode ser tão pouco quanto um nucleotídeo de extensão. A ligação de um ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser determinadapor aque- les versados na técnica usando experimentos de rotina ou usando ou ado- tando um método conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, 25 preferencialmente conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, na parte de exemplos.

Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção podem ser ou D-ácidos nucléicos ou L-ácidos nucléicos. Preferencialmente, os áci- dos nucléicos da invenção são L-ácidos nucléicos. Além disso é possível 30 que uma ou várias partes do ácido nucléico estejam presentes como D- ácidos nucléicos ou no mínimo uma ou várias partes dos ácidos nucléicos sejam L-ácidos nucléicos. O termo “parte” dos ácidos nucléicos significará tão pouco quanto um nucleotídeo. Semelhantes ácidos nucléicos são geral- mente referidos aqui, neste requerimento de patente, como D- e L-ácidos nucléicos, respectivamente. Portanto, em uma modalidade particularmente preferencial, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção consis- tem de L-nucleotídeos e compreendem no mínimo um D-nucleotídeo. Seme- lhante D-nucleotídeo é preferencialmente fixado a uma parte diferente dos trechos definindo os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, preferencialmente as partes dos mesmos, onde uma interação com outras partes do ácido nucléico está envolvida. Preferencialmente, semelhante D- nucleotídeo é fixado a um término de quaisquer dos trechos e de qualquer ácido nucléico de acordo com a presente invenção, respectivamente. Em uma modalidade preferencial adicional, semelhantes D-nucleotídeos podem agir como um espaçador ou um encadeador, preferencialmente anexando modificações tais como PEG e HES aos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção.

Também está dentro da presente invenção que cada e quais- quer das moléculas de ácido nucléico descritas aqui, neste requerimento de patente, em sua totalidade em termos de sua uma ou mais seqüências de ácido nucléico são limitadas à ou às seqüências de nucleotídeos em particu- 20 lar. Em outras palavras, os termos “compreendendo” ou “compreende(m)” serão interpretados em semelhante modalidade no significado de contendo ou consistindo de.

Também está dentro da presente invenção que os ácidos nucléi- cos de acordo com a presente invenção são parte de um ácido nucléico mais 25 longo por meio da qual este ácido nucléico mais longo compreende várias partes por meio das quais no mínimo uma parte semelhante é um ácido nu- cléico, ou uma parte do mesmo, de acordo com a presente invenção. A uma ou mais outras partes destes ácidos nucléicos mais longos podem ser ou um ou vários ácidos nucléicos-D ou ácidos nucléicos-L. Qualquer combinação 30 pode ser usada em conexão com a presente invenção. Estas outras uma ou mais partes do ácido nucléico mais longo podem apresentar uma função a qual é diferente de ligação, preferencialmente de ligação a SDF-1. Uma fun- ção possível é permitir interação com outras moléculas, por meio da qual as outras moléculas referidas preferencialmente são diferentes de SDF-1, tal como, por exemplo, para imobilização, reticulação, detecção ou amplifica- ção. Em uma modalidade adicional da presente invenção os ácidos nucléi- 5 cos de acordo com a invenção compreendem, como porções individuais ou combinadas, vários dos ácidos nucléicos da presente invenção. Semelhante ácido nucléico compreendendo vários dos ácidos nucléicos da presente in- venção também é englobado pelo termo ácido nucléico mais longo.

L-Ácidos nucléicos conforme usado aqui, neste requerimento de patente, são ácidos nucléicos consistindo de L-nucleotídeos, preferencial- mente consistindo completamente de L-nucleotídeos.

D-Ácidos nucléicos conforme usado aqui, neste requerimento de patente, são ácidos nucléicos consistindo de D-nucleotídeos, preferencial- mente consistindo completamente de D-nucleotídeos.

Os termos ácido nucléico e molécula de ácido nucléico são usa-

dos aqui, neste requerimento de patente, em uma maneira intercambiável caso não explicitamente indicados ao contrário.

Além disso, caso não indicado ao contrário, qualquer seqüência de nucleotídeos é determinada aqui, neste requerimento de patente, na dire- ção 5’ -> 3’.

Independente de se o ácido nucléico da invenção consiste de D- nucleotídeos, L-nucleotídeos ou uma combinação de ambos com a combi- nação sendo, por exemplo, uma combinação aleatória ou uma seqüência definida de trechos consistindo de no mínimo um L-nucleotídeo e no mínimo 25 um D-ácido nucléico, o ácido nucléico pode consistir de um ou mais desoxir- ribonucleotídeos, um ou mais ribonucleotídeos ou combinações dos mes- mos.

Desenhar os ácidos nucléicos da invenção como L-ácido nucléi- co é vantajoso por várias razões. L-ácidos nucléicos são enantiômeros de ácidos nucléicos que ocorrem naturalmente. D-ácidos nucléicos, no entanto, não são muito estáveis em soluções aquosas e particularmente em sistemas biológicos ou amostras biológicas devido à presença disseminada de nucle- ases. Nucleases que ocorrem naturalmente, particularmente nucleases de células animais não têm capacidade de degrar L-ácidos nucléicos. Por causa disto a meia-vida biológica do L-ácido nucléico é significativamente aumen- tada em um sistema semelhante, incluindo o corpo animal e humano. Devido 5 à falta de degradabilidade de L-ácido nucléico não são produzidos produtos da degradação de nuclease e portanto não são observados efeitos colaterais surgindo a partir dos mesmos. Este aspecto delimita o L-ácido nucléico de factualmente todos os outros compostos os quais são usados na terapia de doenças e/ou distúrbios envolvendo a presença de SDF-1. L-Ácidos nucléi- 10 cos os quais especificamente ligam a uma molécula alvo através de um me- canismo diferente de pareamento de bases de Watson Crick, ou aptâmeros os quais consistem parcialmente ou completamente de L-nucleotídeos, parti- cularmente com as partes do aptâmero estando envolvidas na ligação do aptâmero à molécula alvo, também são denominados spiegelmeros.

Está dentro da presente invenção que o primeiro e o segundo

trecho de nucleotídeos flanqueando a seqüência de nucleotídeos de núcleo podem, em princípio, hibridizar um com o outro. Na hibridização referida se forma uma estrutura de filamento duplo. Será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que semelhante hibridização pode ocorrer ou não, parti- 20 cularmente sob condições in vitro e/ou in vivo. Além disso, no caso de seme- lhante hibridização, não é necessariamente o caso de que a hibridização ocorra sobre toda a extensão dos dois trechos onde, no mínimo com base nas regras para pareamento de bases, pode ocorrer semelhante hibridização e portanto formação de uma estrutura de filamento duplo. Conforme prefe- 25 rencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, uma estrutura de filamento duplo é uma parte de uma molécula ou uma estrutura formada por dois ou mais filamentos separados, por meio da qual existem no mínimo um, preferencialmente dois ou mais pares de bases os quais são pareamento de bases preferencialmente de acordo com as regras de pareamento de bases 30 de Watson-Crick. Também será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que outro pareamento de bases tal como pareamento de bases de Hoogsten pode existir em ou formar a estrutura de filamento duplo referida. Também está dentro da presente invenção que os ácidos nucléi- cos da invenção, independente se estão presentes como D-ácidos nucléicos, L-ácidos nucléicos ou D,L-ácidos nucléicos ou se são DNA ou RNA, podem estar presentes como ácidos nucléicos de filamento único ou de filamento 5 duplo. Tipicamente, os ácidos nucléicos da invenção são ácidos nucléicos de filamento único os quais apresentam estruturas secundárias definidas devi- das às seqüência primárias e portanto também podem formar estruturas ter- ciárias. Os ácidos nucléicos da invenção, no entanto, também podem ser de filamento duplo no significado de que dois filamentos os quais são comple- 10 mentares ou parcialmente complementares um ao outro são hibridizados um ao outro. Isto confere estabilidade ao ácido nucléico a qual, em particular, será vantajosa se o ácido nucléico estiver presente na forma-D que ocorre naturalmente ao invés de na forma-L.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser modificados. Seme- 15 Ihantes modificações podem ser relacionadas com o único nucleotídeo do ácido nucléico e são de conhecimento geral na técnica. Exemplos de seme- lhante modificação são descritos por, entre outros, Venkatesan et al. (Venkatesan, Kim et al. 2003) e Kusser (Kusser 2000). Semelhante modifi- cação pode ser um átomo de H, um átomo de F ou grupamento O-CH3 ou 20 grupamento NH2 na posição 2’ do nucleotídeo individual do qual consiste o ácido nucléico. Além disso, o ácido nucléico de acordo com a presente in- venção pode compreender no mínimo um nucleotídeo de LNA. Em uma mo- dalidade o ácido nucléico de acordo com a presente invenção consiste de nucleotídeos de LNA.

Em uma modalidade, os ácidos nucléicos de acordo com a pre-

sente invenção podem ser um ácido nucléico multipartido. Um ácido nucléico multipartido conforme usado aqui, neste requerimento de patente, é um áci- do nucléico o qual consiste de no mínimo dois filamentos de ácido nucléico. Estes no mínimo dois filamentos de ácido nucléico formam uma unidade fun- 30 cional por meio da qual a unidade funcional é um Iigante para uma molécula alvo. Os no mínimo dois filamentos de ácido nucléico podem ser derivados de quaisquer dos ácidos nucléicos da invenção ou por clivagem do ácido nucléico para gerar dois filamentos ou sintetizando um ácido nucléico cor- respondente a uma primeira parte do ácido nucléico da invenção, isto é total e outro ácido nucléico correspondente à segunda parte do ácido nucléico total. Deve ser reconhecido que tanto a clivagem quanto a síntese podem 5 ser aplicadas para gerar um ácido nucléico multipartido onde há mais de dois filamentos conforme exemplificado acima. Em outras palavras, os no mínimo dois filamentos de ácido nucléico são tipicamente diferentes de dois filamentos sendo complementares e hibridizano um ao outro embora possa existir uma certa extensão de complementaridade entre as várias partes de 10 ácido nucléico.

Finalmente também está dentro da presente invenção que uma estrutura totamente fechada, isto é circular, para os ácidos nucléicos de a- cordo com a presente invenção é realizada, isto é que os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção são fechados, preferencialmente através 15 de uma ligação covalente, por meio da qual mais preferencialmente a referi- da ligação covalente é feita entre a extremidade 5’ e a extremidade 3’ das seqüências de ácido nucléico conforme revelado aqui, neste requerimento de patente.

Os presentes inventores descobriram que os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção apresentam uma faixa de valor de Kd muito favorável.

Uma possibilidade para determinar a constante de ligação é me- dição da ressonância de plasmon superficial pelo uso do denominado dispo- sitivo Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suécia), o qual também é conhecido 25 por uma pessoa versada na técnica. A afinidade conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, também foi medida pelo uso de “prova de ligação de pull dowrí’ conforme descrito nos exemplos. Uma medi- da apropriada de modo a expressar a intensidade da ligação entre o ácido nucléico e o alvo o qual é no presente caso SDF-1, é o denominado valor da 30 Kd o qual deste modo bem como o método para sua determinação são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica.

Os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção são caracterizados por um valor da Kd determinado. Preferencialmente, o valor da Kd mostrado pelos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção é abaixo de 1 μΜ. Diz-se que um valor da Kd de cerca de 1 μΜ é caracterís- tico para uma ligação não específica de um ácido nucléico a um alvo. Con- 5 forme será reconhecido por aqueles na técnica, o valor da Kd de um grupo de compostos tais como os ácidos nucléicos de acordo com a presente in- venção está dentro de uma certa faixa. A Kd mencionada acima de cerca de

1 μΜ é um limite superior preferencial para o valor da Kd. O limite inferior preferencial para a Kd de ácidos nucléicos de ligação alvo pode ser cerca de 10 10 picomolar ou superior. Está dentro da presente invenção que os valores da Kd de ácidos nucléicos individuais ligando a grelina preferencialmente estão dentro desta faixa. Faixas preferenciais podem ser definidas esco- lhendo qualquer primeiro número dentro desta faixa e qualquer segundo número dentro desta faixa. Valores superiores preferenciais são 250 nM e 15 100 nM, valores inferiores preferenciais são 50 nM, 10 nM, 1 nM , 100 pM e 10 pM.

As moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente in- venção podem ter qualquer extensão contanto que ainda sejam capazes de ligar à molécula alvo. Será reconhecido na técnica que são preferenciais ex- 20 tensões dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invençãos. Tipica- mente, a extensão é entre 15 e 120 nucleotídeos. Será reconhecido por a- queles versados na técnica que qualquer inteiro entre 15 e 120 é uma exten- são possível para os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Faixas mais preferenciais para a extensão dos ácidos nucléicos de acordo 25 com a presente invenção são extensões de cerca de 20 a 100 nucleotídeos, cerca de 20 a 80 nucleotídeos, cerca de 20 a 60 nucleotídeos, cerca de 20 a 50 nucleotídeos e cerca de 20 a 40 nucleotídeos.

Está dentro da presente invenção que os ácidos nucléicos reve- lados aqui, neste requerimento de patente, compreendem uma porção a qual preferencialmente é uma porção de alto peso molecular e/ou a qual prefe- rencialmente permite modificar as características do ácido nucléico em ter- mos de, entre outros, duração da permanência no corpo do animal, prefe- rencialmente o corpo humano. Uma modalidade particularmente preferencial de semelhante modificação é PEGuilação e HESilação dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Conforme usado aqui, neste requeri- mento de patente, PEG significa poli(etileno glicol) e HES significa hidroxietil 5 amido. PEGuilação conforme preferencialmente usado aqui, neste requeri- mento de patente, é a modificação de um ácido nucléico de acordo com a presente invenção por meio da qual semelhante modificação consiste de um porção PEG a qual é anexada a um ácido nucléico de acordo com a presen- te invenção. HESilação conforme preferencialmente usado aqui, neste re- 10 querimento de patente, é a modificação de um ácido nucléico de acordo com a presente invenção por meio da qual semelhante modificação consiste de uma porção HES a qual é anexada a um ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Estas modificações bem como o processo para modificar um ácido nucléico usando semelhantes modificações, são descritas no re- 15 querimento de patente Européia No. EP 1 306 382, cuja descoberta é deste modo incorporada em sua totalidade por meio de referência.

Preferencialmente, o peso molecular de uma modificação con- sistindo de ou compreendendo uma porção de alto peso molecular é cerca de a partir de 2.000 a 200.000 Da, preferencialmente 40.000 a 120.000 Da, 20 particularmente em caso de PEG sendo semelhante porção de alto peso molecular, e é preferencialmente cerca de a partir de 3.000 a 180.000 Da, mais preferencialmente a partir de 60.000 a 140.000 Da, particularmente em caso de HES sendo semelhante porção de alto peso molecular. O processo de modificação por HES é descrito, por exemplo, no requerimento de paten- 25 te Alemã No. DE 1 2004 006 249.8 cuja descoberta é deste modo incorpora- da em sua totalidade por meio de referência.

Está dentro da presente invenção que qualquer um de PEG e HES pode ser usado como ou um linear ou ramificado de conforme adicio- nalmente descrito nos requerimentos de patente No. W02005074993 e No. 30 PCT/EP02/11950. Semelhante modificação pode ser feita, em princípio, às moléculas de ácido nucléico da presente invenção em qualquer posição das mesmas. Preferencialmente semelhante modificação é feita ou ao nucleotí- deo de 5’ -terminal, ao nucleotídeo de 3’-terminal e/ou qualquer nucleotídeo entre o nucleotídeo 5’ e o nucleotídeo 3’ da molécula de ácido nucléico.

A modificação e preferencialmente a porção PEG e/ou HES po- de ser anexada à molécula de ácido nucléico da presente invenção quer di- 5 retamente ou através de um encadeador. Também está dentro da presente invenção que a molécula de ácido nucléico de acordo com a presente inven- ção compreende uma ou mais modificações, preferencialmente uma ou mais porções PEG e/ou HES. Em uma modalidade a molécula encadeadora indi- vidual anexa mais de uma porção PEG ou porção HES a uma molécula de 10 ácido nucléico de acordo com a presente invenção. O encadeador usado em conexão com a presente invenção pode ser o próprio linear ou ramificado. Este tipo de encadeadores é de conhecimento daqueles versados na técnica e estes são adicionalmente descritos nos requerimentos de patente No. W02005074993 e No. PCT/EP02/11950.

Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, parece que modifi-

cando os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção com porção de alto peso molecular tal como um polímero e mais particularmente os polí- meros revelados aqui, neste requerimento de patente, os quais são prefe- rencialmente fisiologicamente aceitáveis, a cinética de excreção é alterada. 20 Mais particularmente, parece que devido ao aumentado peso molecular de semelhantes ácidos nucléicos modificados da invenção e devido aos ácidos nucléicos não estarem sujeitos a metabolismo particularmente quando na forma L, a excreção a partir de um corpo animal, preferencialmente de um corpo de mamífero e mais preferencialmente de um corpo humano é reduzi- 25 da. Como a excreção tipicamente ocorre através dos rins, os presentes in- ventores presumiram que a taxa de filtração glomerular do ácido nucléico modificado deste modo é significativamente reduzida comparados com os ácidos nucléicos não tendo este tipo de modificação de alto peso molecular o qual resulta em um aumento na duração da permanência no corpo. Em 30 conexão com isto é particularmente digno de nota que, apesar de semelhan- te modificação de alto peso molecular a especificidade do ácido nucléico de acordo com a presente invenção não é afetada em uma maneira prejudicial. Insofar, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção têm carac- terísticas surprendeentes - as quais normalmente não podem ser esperadas de compostos farmaceuticamente ativos - de tal modo que uma formulação farmacêutica proporcionando uma liberação gradual não é necessariamente 5 requerida para proporcionar uma liberação gradual. Ao contrário os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção em sua forma modificada compreendendo uma porção de alto peso molecular, já podem ser usados no estado em que se encontram como uma formulação de liberação gradual. Insofar, a uma ou mais modificações das moléculas de ácido nucléico con- 10 forme revelado aqui, neste requerimento de patente, e as moléculas de áci- do nucléico modificadas deste modo e qualquer composição compreenden- do as mesmas podem proporcionar uma farmacocinética e biodistribuição das mesmas distintas e preferencialmente controladas. Isto também inclui duração da permanência na circulação e distribuição para tecidos. As modi- 15 ficações referidas são adicionalmente descritas no requerimento de patente No. PCT/EP02/11950.

No entanto, está dentro da presente invenção que os ácidos nu- cléicos revelados aqui, neste requerimento de patente, não compreendem qualquer modificação e particularmente nenhuma modificação de alto peso 20 molecular tal como PEGuilação ou HESilação. A modalidade referida é parti- cularmente preferenciais quando se deseja um clearance rápido dos ácidos nucléicos do corpo depois da administração. O clearance rápido referido po- de ser desejado em caso de estudo por imagens in vivo ou requisitos especí- ficos de dosagem terapêutica usando os ácidos nucléicos ou medicamentos 25 compreendendo os mesmos, de acordo com a presente invenção.

Os ácidos nucléicos da invenção, os quais também são referidos aqui, neste requerimento de patente, como os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, e/ou os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser usados para a produção ou fabricação de um medica- 30 mento. O medicamento referido contém no mínimo um dos ácidos nucléicos da invenção, opcionalmente junto com compostos farmaceuticamente ativos adicionais, por meio da qual o ácido nucléico da invenção preferencialmente age como o próprio composto farmaceuticamente ativo. Os medicamentos referidos compreendem em modalidades preferenciais no mínimo um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo referido pode ser, por exemplo, á- gua, tampão, PBS, solução de glicose, solução de sacarose, solução de ma- 5 nose, preferencialmente uma solução balanceada a 5% de sacarose, amido, açúcar, gelatina ou qualquer outra substância de veículo aceitável. Os veícu- los referidos são geralmente conhecidos por uma pessoa versada na técni- ca. Será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que quaisquer modalidades, uso e aspectos de ou relacionados com o medicamento da 10 presente invenção também são aplicáveis à composição farmacêutica da presente invenção e vice versa.

A indicação, doenças e distúrbios para o tratamento e/ou pre- venção das quais os ácidos nucléicos, as composições farmacêuticas e me- dicamentos de acordo com ou preparados de acordo com a presente inven- ção resultam do envolvimento, quer direto ou indireto, de SDF-1 no meca- nismo patogênico respectivo.

Logicamente, como os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 de acordo cm a presente invenção interagem com ou ligam a SDF-1 humano ou murino, uma pessoa versada geralmente entenderá que os ácidos nucléicos 20 de ligação de SDF-1 de acordo com a presente invenção podem ser facil- mente usados para o tratamento, a prevenção e/ou diagnóstico de qualquer doença conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, de humanos e animais.

Doença e/ou distúrbios e/ou condições de doença para o trata- 25 mento e/ou a prevenção das quais o medicamento referido pode ser usado incluem, mas não estão limitadas a doenças do fundo de olho como retino- patia, retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade, tanto a forma seca quanto úmida; câncer; câncer de mama, ovários, prósta- ta, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteosarcoma; 30 melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; leucemia linfocítica crônica de células B; mieloma múltiplo; linfoma; síndrome de WHIM; síndro- mes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite, artrite reumatóide, osteoartrite e nefrite.

Em uma modalidade adicional, o medicamento compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional. Semelhantes compostos farma- ceuticamente ativos adicionais podem ser os conhecidos por aqueles versa- 5 dos na técnica e são preferencialmente selecionados entre o grupo compre- endendo antagonistas de citocina ou quimocina, corticosteróides, e seme- lhantes. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que dadas as várias indicações as quais podem ser tratadas de acordo com a presente invenção pelos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, o um 10 ou mais agentes farmaceuticamente ativos adicionais referidos podem ser qualquer um o qual em princípio é adequado para o tratamento e/ou preven- ção de semelhantes doenças. As moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, particularmente caso presentes ou usadas como um medicamento, são preferencialmente combinadas com inibidores de 15 VEGF tais como Macugen (Pegatanib) da Pfizer Ophthalmics, Lucentis (Ra- nitizumab) da Novartis Ophthalmics, Avastin (Bevacizumab) da Roche (off- Iabel use); ou com terapia fotodinâmica tal como Visudyne (Verteporfing) da Novartis Ophthalmics e derivado de cortisona injetável intravitrealmente tal como Retaane (Anecortave acetate) da Alcon Inc.

Alternativamente, ou adicionalmente, o agente farmaceuticamen-

te ativo adicional referido é um ácido nucléico adicional de acordo com a presente invenção. Alternativamente, o medicament compreende no mínimo mais um ácido nucléico o qual liga a uma molécula alvo diferente de SDF-1 ou apresenta uma função a qual é diferente da função dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção.

Conforme será reconhecido por aqueles da técnica os ácidos nucléicos da invenção podem ser usados efetivamente em qualquer doença onde um antagonista para SDF-1 pode ser administrado a um paciente que necessite de semelhante antagonista e semelhante antagonista seja ade- 30 quado para eliminar a causa da doença ou do distúrbio ou no mínimo para reduzir os efeitos da doença ou do distúrbio. O efeito referido inclui, mas não está limitado a neovascularização patológica, inflamação e metástase. A a- plicabilidade dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção em conexão com estas e outras doenças ou distúrbios resulta, entre outros, do envolvimento de SDF-1 conforme resumido na parte introdutória da presente especificação a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por 5 meio de referência de modo a evitar qualquer repetição desnecessária.

Está dentro da presente invenção que o medicamento é alterna- tivamente ou adicionalmente usado, em princípio, para a prevenção de quaisquer das doenças reveladas em conexão com o uso do medicamento para o tratamento das doenças referidas. Marcadores respectivos portanto, 10 isto é, para as doenças respectivas são conhecidos por aqueles versados na técnica. Preferencialmente, o marcador respectivo é SDF-1. Alternativamen- te e/ou adicionalmente, o marcador respectivo é selecionado entre o grupo de marcadores de stress oxidativo, compreendendo transmembrana reduta- se de ferricianeto (TMR), aumentada atividade do caminho do sorbitol que 15 inclui depois de acumulação de sorbitol, aumentada proporção de NA- DH/NAD citosólico, depleção de NADPH e acumulação de frutose com a produção não enzimática resultante de produtos finais de glicação avançada (AGES) e conseqüente ativação da proteína quinase C, eventos a jusante mediados por stress oxidativo e nitrosativo tais como ativação da MAP qui- 20 nase; marcadores inflamatórios, compreendendo ICAM-1, VCAM-1, RAN- TES, haptoglobina, ou proteína C reativa; e marcadores pró-angiogênicos como eritropoetina ou VEGF. Em vista disto, os marcadores referidos podem ser usados para determinar se ou não um sujeito ou um paciente pode ser tratado com quaisquer das moléculas de ácido nucléico de acordo com a 25 presente invenção. Portanto, em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a semelhante método, por meio do qual a presença ou ausência e mais especificamente a concentração do um ou mais marcadores respecti- vos é/são determinada(s). Métodos para a detecção dos marcadores referi- dos e opcionalmente sua quantificação, bem como a faixa dentro da qual o 30 marcador respectivo estará presente ou ausente de modo a decidir se ou não o sujeito ou paciente está sofrendo de quaisquer das doenças referidas ou está em risco de desenvolver as doenças referidas, e, por conseguinte, pode portanto ser tradado de acordo com a presente invenção, são conheci- dos por aqueles versados na técnica.

Em uma modalidade do medicamento da presente invenção, o medicamento é para uso em combinação com outros tratamentos para 5 quaisquer das doenças reveladas aqui, neste requerimento de patente, par- ticularmente aquelas para as quais o medicamento da presente invenção deve ser usado.

"Terapia de combinação" (ou "co-terapia") inclui a administração de um medicamento da invenção e no mínimo um segundo agente como 10 parte de um regime de tratamento específico pretendido para proporcionar o efeito benéfico da co-ação destes agentes terapêuticos, isto é, o medica- mento da presente invenção e o segundo agente referido. O efeito benéfico da combinação inclui, mas não está limitado a, co-ação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A ad- 15 ministração destes agentes terapêuticos em combinação tipicamente é reali- zada durante um período de tempo definido (geralmente minutos, horas, dias ou semanas dependendo da combinação selecionada).

"Terapia de combinação" pode, mas geralmente não, pretender englobar a administração de dois ou mais destes agentes terapêuticos como 20 parte de regimes de monoterapia separada que incidentalmente e arbitrari- amente resultam nas combinações da presente invenção. "Terapia de com- binação" pretende englobar a administração destes agentes terapêuticos em uma maneira seqüencial, isto é, em que cada agente terapêutico é adminis- trado em uma hora diferente, bem como a administração destes agentes 25 terapêuticos, ou no mínimo dois dos agentes terapêuticos, em uma maneira substancialmente simultânea. Administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, administrando a um sujeito uma única cáp- sula tendo uma proporção fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas, cápsulas únicas para cada um dos agentes terapêuticos.

Administração seqüencial ou substancialmente simultânea de

cada agente terapêutico pode ser realizada por qualquer via apropriada in- cluindo, mas não limitada a, vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares, e absorção direta através dos tecidos das membranas mu- cosas. Os agentes terapêuticos podem ser administrados pela mesma via ou por vias diferentes. Por exemplo, um primeiro agente terapêutico da combi- nação selecionada pode ser administrado por injeção ao passo que os ou- 5 tros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados topica- mente.

Alternativamente, por exemplo, todos os dos agentes terapêuti- cos podem ser administrados topicamente ou todos os dos agentes terapêu- ticos podem ser administrados por injeção. A seqüência na qual os dos a- gentes terapêuticos são administrados não é estreitamente crítica a menos que mencionado de modo diverso. "Terapia de combinação" também pode englobar a administração dos agentes terapêuticos conforme descrito acima em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos. Onde a terapia de combinação compreende adicionalmente um tratamento não fármaco, O tratamento não fármaco pode ser conduzido em qualquer momento adequado na medida que seja obtido um efeito benéfico da co- ação da combinação dos agentes terapêuticos e o tratamento não fármaco. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico ainda é obtido quanto o tratamento não fármaco é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.

Conforme resumido em termos gerais acima, o medicamento de acordo com a presente invenção pode ser administrado, em princípio, em qualquer forma de conhecimento daqueles versados na técnica. Uma via de administração preferencial é administração sistêmica, mais preferencialmen- 25 te por administração parenteral, preferencialmente por injunção. Alternativa- mente, o medicamento pode ser administrado localmente. Outras vias de administração compreendem intramuscular, intraperitoneal, e subcutânea, per orum, intranasal, intratraqueal ou pulmonary com preferência dada à via de administração que é a menos invasiva, ao mesmo tempo que asseguran- 30 do a eficiência.

Administração parenteral é geralmente usada para injeções e infusões subcutâneas, intramusculares ou intravenosas. Adicionalmente, uma abordagem para administração parenteral emprega a implantação de alguns sistemas de liberação lenta ou de liberação gradual, os quais assegu- ram que seja mantido um nível de dosagem constante, que são de conheci- mento geral daqueles ordinariamente versados na técnica.

5 Além disso, medicamentos preferenciais da presente invenção

podem ser administrados em forma intranasal através de uso tópico de veí- culos intranasais adequados, inalantes, ou através de vias transdérmicas, usando as formas de emplastros de pele transdérmicos de conhecimento geral daqueles ordinariamente versados na técnica. Para ser administrada 10 sob a forma de um sistema de liberação transdérmica, a administração da dosagem, logicamente, será contínua ao invés de intermitente do início ao fim do regime da dosagem. Outras preparações tópicas preferenciais inclu- em cremes, pomadas, loções, sprays de aerosol e géis, em que a concen- tração de ingrediente ativo tipicamente variaria de 0,01% a 15%, em peso / 15 peso ou em peso / volume.

O medicamento da presente invenção geralmente compreenderá uma quantidade eficaz do um ou mais componentes ativos da terapia, inclu- indo, mas não limitado a, uma molécula de ácido nucléico da presente in- venção, dissolvida ou dispersada em um meio farmaceuticamente aceitável. 20 Meios ou carregadores farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacteri- anos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes. O uso de semelhantes meios e agentes para substâncias ati- vas farmacêuticas é de conhecimento geral na técnica. Ingredientes ativos 25 suplementares também podem ser incorporados no medicamento da presen- te invenção.

Em um aspecto adicional a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica referida compreende no mínimo um dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e 30 preferencialmente um aglutinante farmaceuticamente aceitável. O aglutinan- te referido pode ser qualquer aglutinante usado e/ou conhecido na técnica. Mais particularmente o aglutinante referido é qualquer aglutinante conforme discutido em conexão com a fabricação do medicamento revelado aqui, nes- te requerimento de patente. Em uma modalidade adicional, a composição farmacêutica compreende um agente farmaceuticamente ativo adicional.

A preparação de um medicamento e uma composição farmacêu- tica será de conhecimento daqueles versados na técnica à Iuz da presente descoberta. Tipicamente, as composições referidas podem ser preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção; como comprimidos ou outros sólidos para administração oral; como cápsulas de liberação com o tempo (time release); ou em qualquer outra forma atual- mente usada, incluindo gotas oculares, cremes, loções, pomadas, inalantes e semelhantes. The uso de formulações estéreis, tais como lavagens à base de salina, por cirurgiões, médicos ou funcionários de tratamento de saúde para tratar uma área particular no campo de operação também pode ser par- ticularmente útil. Composições também podem ser liberadas através de mi- crodispositivo, micropartícula ou esponja.

Na formulação, um medicamento será administrado em uma maneira compatível com a formulação da dosagem, e em uma quantidade tal qual é farmacologicamente eficaz. As formulações são facilmente admi- 20 nistradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de so- luções injetáveis descritas acima, mas também podem ser empregadas cáp- sulas de liberação de fármaco e semelhantes.

Neste contexto, a quantidade de ingrediente ativo e o volume da composição a ser administrado depende do indivíduo ou do sujeito a ser tra- tado. Quantidades específicas de composto ativo requeridas para adminis- tração dependem do critério do clínico e são peculiares a cada indivíduo.

Tipicamente é utilizado um volume mínimo de um medicament requerido para dispersar os compostos ativos. Regimes adequados para administração também são variáveis, mas seriam tipificados inicialmente administrando o composto e monitorando os resultados e em seguida admi- nistrando doses controladas adicionais em intervalos adicionais.

Por exemplo, para administração oral sob a forma de um com- primido ou cápsula (por exemplo, uma cápsula de gelatina), o componente de fármaco ativo, isto é, uma molécula de ácido nucléico da presente inven- ção e/ou qualquer agente farmaceuticamente ativo adicional, também referi- dos aqui, neste requerimento de patente, como agente(s) terapêutico(s) ou 5 composto(s) ativo(s) podem ser combinados com um carregador inerte oral, não-tóxico, farmaceuticamente aceitável tal como etanol, glicerol, água e semelhantes. Além disso, quando desejado ou necessário, aglutinantes, lu- brificantes, agentes desintegrantes, e agentes colorantes adequados tam- bém podem ser incorporados na mistura. Aglutinantes adequados incluem 10 amido, silicato de alumínio de magnésio, pasta de amido, gelatina, metilcelu- lose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona, açúcares natu- rais tais como glucose ou beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas tais como acacia, tragacanto ou alginato de sódio, polietileno glicol, ceras, e semelhantes. Lubrificantes usados nestas formas de dosa- 15 gem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, sílica, talco, ácido es- teáric, seu sal de magnésio ou de cálcio e/ou polietileno glicol, e semelhan- tes. Desintegrantes incluem, sem limitação, amido, metil celulose, agar, ben- tonita, amidos de goma xantano, agar, ácido algínico ou seu sal de sódio, ou 20 misturas efervescentes, e semelhantes. Diluentes, incluem, por exemplo, lactose, dextrose, sucrose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina.

O medicamento da invenção também pode ser administrado em formas de dosagens orais tais como comprimidos ou cápsulas de liberação cronometrada e de liberação gradual, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Supositórios são preparados vantajosa- mente a partir de suspensões ou emulsões oleosas.

A composição farmacêutica ou medicamento pode ser esteriliza- da e/ou conter adjuvantes, tais como agentes preservantes, estabilizantes, umectantes ou emulsificantes, estimula dores de solução, sais para regular a 30 pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, também podem conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos convencionais de mistura, granulação, ou revestimen- to, e tipicamente contêm cerca de 0,1% a 75%, preferencialmente cerca de 1% a 50%, do ingrediente ativo.

Composições líquidas, particularmente injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, dispersando, e etc. O composto ativo 5 é dissolvido em ou misturado com um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e seme- lhantes, para deste modo formar a solução ou suspensão injetável. Adicio- nalmente, podem ser formuladas formas sólidas adequadas para dissolver em líquido antes da injeção.

Para composições sólidas, excipientes incluem graus farmacêu-

ticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco, celulose, glucose, sucrose, carbonato de magnésio, e semelhantes. O composto ativo definido acima, também pode ser formulado como supositó- rios, usando, por exemplo, polialquileno glicóis, por exemplo, propileno glicol, 15 como o carregador. Em algumas modalidades, supositórios são preparados vantajosamente a partir de suspensões ou emulsões oleosas.

Os medicamentos e moléculas de ácido nucléico, respectiva- mente, da presente invenção também podem ser administrados sob a forma de sistemas de liberação de lipossomas, tais como pequenas vesículas uni- 20 lamelares, grandes vesículas unilamelares e vesículas multilamelares. Li- possomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídeos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas modali- dades, um filme de componentes lipídicos é hidratado com uma solução a- quosa de fármaco para uma forma de camada Iipfdica encapsulando o fár- 25 maco, o que é de conhecimento geral das pessoas ordinariamente versadas na técnica. Por exemplo, as moléculas de ácido nucléico descritas aqui, nes- te requerimento de patente, podem ser proporcionadas como um complexo com um composto lipofílico ou composto não-imunogênico, de alto peso mo- lecular construído usando métodos conhecidos na técnica. Adicionalmente, 30 lipossomas podem portar as moléculas de ácido nucléico referidas sobre sua superfície para direcionar e carregar agentes citotóxicos internamente para mediar destruição celular. Um exemplo de complexos associados a ácidos nucléicos é proporcionado na Patente dos Estados Unidos No. 6.011.020.

Os medicamentos e moléculas de ácido nucléico, respectiva- mente, da presente invenção também podem ser acoplados com polímeros solúveis como veículos de fármacos direcionáveis. Os polímeros referidos 5 podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropil- metacrilamida-fenol, polihidroxietilaspanamidafenol, ou polietilenoóxidopolili- sina substituída com resíduos palmitoíla. Além disso, os medicamentos e moléculas de ácido nucléico, respectivamente, da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para obter 10 liberação controlada de uma drag, por exemplo, ácido poliláctico, poliépsilon capro lactona, ácido polihidróxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidii- dropiranos, policianoacrilatos e copolímeros em bloco reticulados ou antipá- ticos de hidrogéis.

Caso desejado, a composição farmacêutica e medicamento, respectivamente, a serem administrados também podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como agentes umectan- tes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e outras substân- cias tais como, por exemplo, acetato de sódio, e oleato de trietanolamina.

O regime de dosagem utilizando as moléculas de ácido nucléico 20 e medicamentos, respectivamente, da presente invenção é selecionado de acordo com uma variedade de fatores incluindo tipo, espécie, idade, pedo, sexo e condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratada; a via de administração; a função renal e hepática do paciente; e o aptâmero em particular ou sal do mesmo empregado. Um médico ou veterinário ordi- 25 nariamente versado pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz do fármaco requerida para prevenir, neutralizar ou interromper o pro- gresso da condição.

Níveis plasmáticos eficazes do ácido nucléico de acordo com a presente invenção preferencialmente variam de 500 fM a 500 μΜ no trata- mento de quaisquer das doenças reveladas aqui, neste requerimento de pa- tente.

As moléculas de ácido nucléico e medicamentos, respectiva- mente, da presente invenção podem preferencialmente ser administrados em uma única dose diária, a cada dois ou três dias, semanalmente, a cada duas semanas, em uma única dose mensal ou a cada três meses.

Está dentro da presente invenção que o medicamento conforme 5 descrito aqui, neste requerimento de patente, constitua a composição farma- cêutica revelada aqui, neste requerimento de patente.

Em um aspecto adicional a presente invenção se refere a um método para o tratamento de um sujeito que esteja necessitando de seme- lhante tratamento, por meio do qual o método compreende a administração 10 de uma quantidade farmaceuticamente ativa de no mínimo um dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, o sujei- to sofre de uma doença ou está em risco de desenvolver a referida doença, por meio da qual a doença é qualquer uma das reveladas aqui, neste reque- rimento de patente, particularmente qualquer uma das doenças reveladas 15 em conexão com o uso de quaisquer dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção para a fabricação de um medicamento.

Conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, um diagnóstico ou agente de diagnóstico ou meio diagnóstico é a- dequado para detectar, quer diretamente ou indiretamente SDF-1 conforme 20 descrito aqui, neste requerimento de patente, em conexão com os vários distúrbios e doenças descritos aqui, neste requerimento de patente. O diag- nóstico é adequada para a detecção e/ou o seguimento de quaisquer dos distúrbios e doenças, respectivamente, descritos aqui, neste requerimento de patente. Semelhante detecção é possível através da ligação dos ácidos 25 nucléicos de acordo com a presente invenção a SDF-1. Semelhante ligação pode ser detectada quer diretamente quer indiretamente. Os métodos e mei- os respectivos são de conhecimento daqueles versados na técnica. Entre outros, os ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção podem com- preender uma etiqueta a qual permite a detecção dos ácidos nucléicos de 30 acordo com a presente invenção, preferencialmente o ácido nucléico liga a SDF-1. Uma etiqueta semelhante é preferencialmente selecionada entre o grupo compreendendo etiquetas radioativas, enzimáticas e fluorescentes. Em princípio, todos os testes conhecidos desenvolvidos para anticorpos po- dem ser adotados para os ácidos nucléicos de acordo com a presente in- venção visto que o anticorpo de ligação alvo é substituído por um ácido nu- cléico de ligação alvo. Em provas de anticorpo usando anticorpos de ligação 5 alvo não marcados a detecção é feita preferencialmente por um anticorpo secundário o qual é modificado com etiquetas radioativas, enzimáticas e flu- orescentes e ligam ao anticorpo de ligação alvo em seu fragmento Fe. No caso de um ácido nucléico, preferencialmente um ácido nucléico de acordo com a presente invenção, o ácido nucléico é modificado com uma etiqueta 10 semelhante, por meio da qual preferencialmente uma etiqueta semelhante é selecionada entre o grupo compreendendo biotina, Cy-3 e Cy-5, e a etiqueta referida é detectada por um anticorpo dirigido contra a etiqueta referida, por exemplo, um anticorpo anti-biotina, um anticorpo anti-Cy3 ou um anticorpo anti-Cy5, ou - no caso que a etiqueta é biotina - a etiqueta é detectada por 15 estreptavidina ou avidina as quais ligam naturalmente a biotina. O referido anticorpo, estreptavidina ou avidina por sua vez é preferencialmente modifi- cado com uma etiqueta respectiva, por exemplo, uma etiqueta radioativa, enzimática ou fluorescente (como um anticorpo secundário).

Em uma modalidade adicional as moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção são detectadas ou analisadas por um segundo meio de detecção, em que o referido meio de detecção é um sinal molecular. A metodologia de sinal molecular é de conhecimento das pessoas versadas na técnica. Em resumo, sondas de ácidos nucléicos as quais também são refe- ridas como sinais moleculares, são um complemento reverso para a amostra de ácidos nucléicos a ser detectada e hibridizam devido a isto a uma parte da amostra de ácido nucléico a ser detectada. Ao ligar à amostra de ácido nucléico os grupamentos fluorofóricos do sinal molecular são separados o que resulta em uma mudança do sinal de fluorescência, preferencialmente uma mudança na intensidade. Esta mudança se correlaciona com a quanti- dade da amostra de ácidos nucléicos presente.

Será entendido por uma pessoa versada na técnica que devido à relação resumida aqui, neste requerimento de patente, entre SDF-1 e seu receptor correspondente, as doenças e condições as quais podem ser diag- nosticadas usando as moléculas de ácido nucléico da presente invenção, são, em princípio, as mesmas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em conexão com o uso das referidas moléculas de ácido nucléico para o tratamento e/ou prevenção da referida doença.

À parte disto, usos adicionais das moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção residem em uma redução na hemato- poiese, uma redução na invasão ou metástase, uma redução no desenvol- vimento e quimiotaxia de células B, uma redução na quimoatração de célu- Ias T e uma indução de parada de crescimento de apoptose.

Em conexão com a detecção de SDF-1 um método preferencial compreende as seguintes etapas:

(a) proporcionar uma amostra a qual deve ser testada para a presença de SDF-1,

(b) proporcionar um ácido nucléico de acordo com a presente

invenção,

(c) reagir a amostra com o ácido nucléico, preferencialmente em um vaso de reação

por meio do qual a etapa (a) pode ser realizada antes da etapa (b), ou a etapa (b) realizada antes da etapa (a).

Em uma modalidade preferencial é proporcionada uma etapa adicional d), a qual consiste na detecção da reação da amostra com o ácido nucléico. Preferencialmente, o ácido nucléico da etapa b) é imobilizado a uma superfície. A superfície pode ser a superfície de um vaso de reação tal 25 como um tubo de reação, uma cavidade de uma lâmina, ou a superfície de um dispositivo contido em semelhante vaso de reação tal como, por exem- plo, uma conta. A imobilização do ácido nucléico à superfície pode ser feita por quaisquer meios de conhecimento daqueles versados na técnica incluin- do, mas não limitados a, ligações não-covalentes ou covalentes. Preferenci- 30 almente, a ligação é estabelecida através de uma ligação química covalente entre a superfície e o ácido nucléico. No entanto, também está dentro da presente invenção que o ácido nucléico é indiretamente imobilizado a uma superfície, por meio da qual semelhante imobilização indireta envolve o uso de um componente adicional ou um par de parceiros de interação. Seme- lhante componente adicional é preferencialmente um composto o qual espe- cificamente interage com o ácido nucléico a ser imobilizado o qual também é 5 referido como parceiro de interação, e portanto media a fixação do ácido nu- cléico à superfície. O parceiro de interação é preferencialmente selecionado entre o grupo compreendendo ácidos nucléicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos. Preferencialmente, o parceiro de interação é um anticorpo, mais preferencialmente um anticorpo monoclonal. Alternativamente, o parceiro de 10 interação é um ácido nucléico, preferencialmente um ácido nucléico funcio- nal. Mais preferencialmente semelhante ácido nucléico funcional é selecio- nado entre o grupo compreendendo aptâmeros, spiegelmeros, e ácidos nu- cléicos os quais são no mínimo parcialmente complementares ao ácido nu- cléico. Em uma modalidade alternativa adicional, a ligação do ácido nucléico 15 à superfície é mediada por um parceiro de interação multi-partite. Semelhan- te parceiro de interação multi-partite é preferencialmente um par de parcei- ros de interação ou um parceiro de interação consistindo de um primeiro membro e um segundo membro, por meio do qual o primeiro membro é compreendido por ou anexado ao ácido nucléico e o segundo membro é a- 20 nexado a ou compreendido pela superfície. O parceiro de interação multi- partite é preferencialmente selecionado entre o grupo de pares de parceiros de interação compreendendo biotina e avidina, biotina e estreptavidin, e bio- tina e neutravidina. Preferencialmente, o primeiro membro do par de parcei- ros de interação é biotina.

Um resultado preferencial de semelhante método é a formação

de um complexo imobilizado de SDF-1 e o ácido nucléico, por meio do qual mais preferencialmente o referido complexo é detectado. Está dentro de uma modalidade que a partir do complexo o SDF-1 é detectado.

O método para a detecção de SDF-1 também compreende que a amostra é removida do vaso de reação o qual preferencialmente foi usado para realizar a etapa c).

O método compreende em uma modalidade adicional também a etapa de imobilizar um parceiro de interação de SDF-1 sobre uma superfície, preferencialmente uma superfície conforme definido acima, por meio da qual o parceiro de interação é definido conforme aqui, neste requerimento de pa- tente, e preferencialmente como acima em conexão com o método respecti- 5 vo e mais preferencialmente compreende ácidos nucléicos, polipeptídeos, proteínas e anticorpos em suas várias modalidades. Nesta modalidade, um meio de detecção particularmente preferencial é um ácido nucléico de acor- do com a presente invenção, por meio do qual o ácido nucléico referido pre- ferencialmente pode ser marcado ou não marcado. No caso do ácido nucléi- 10 co referido ser marcado, pode ser detectado diretamente ou indiretamente. Semelhante detecção também pode envolver o uso de um segundo meio de detecção o qual é, preferencialmente, também selecionado entre o grupo compreendendo ácidos nucléicos, polipeptídeos, proteínas e modalidades nas várias modalidades descritas aqui, neste requerimento de patente. Se- 15 melhantes meios de detecção são preferencialmente específicos para o áci- do nucléico de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade mais preferencial, o segundo meio de detecção é um sinal molecular. Ou o ácido nucléico ou o segundo meio de detecção ou ambos podem compreender em uma modalidade preferencial uma etiqueta de detecção. A etiqueta de de- 20 tecção é preferencialmente selecionada entre o grupo compreendendo bioti- na, uma etiqueta de bromo-desoxiuridina, uma etiqueta de digoxigenina, uma etiqueta de fluorescência, uma etiqueta UV, uma radio- etiqueta, e uma molécula queladora. Alternativamente, o segundo meio de detecção interage com a etiqueta de detecção a qual é preferencialmente contida por, compre- 25 endida por ou anexada ao ácido nucléico. Combinações particularmente pre- ferenciais são como se segue:

a etiqueta de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra biotina, ou em que

a etiqueta de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma avidina ou uma molécula carrregando avidina, ou em que

a etiqueta de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma estreptavidina ou uma molécula carrregando estretavidina, ou em que a etiqueta de detecção é biotina e o segundo meio de detecção é uma neutravidina ou uma molécula carrregando neutravidina, ou

em que a etiqueta de detecção é uma bromo-desoxiuridina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra bromo- desoxiuridina, or em que

a etiqueta de detecção é uma digoxigenina e o segundo meio de detecção é um anticorpo dirigido contra digoxigenina, ou

em que a etiqueta de detecção é um quelador e o segundo meio de detecção é um radionuclídeo, por meio da qual é preferencial que a refe- 10 rida etiqueta de detecção seja anexada ao ácido nucléico. Deve ser reco- nhecido que este tipo de combinação também é aplicável à modalidade em que o ácido nucléico é anexado à superfície. Em semelhante modalidade é preferencial que a etiqueta de detecção seja anexada ao parceiro de intera- ção.

Finalmente, também está dentro da presente invenção que e o

segundo meio de detecção é detectado usando um terceiro meio de detec- ção, preferencialmente o terceiro meio de detecção é uma enzima, mais pre- ferencialmente apresentando uma reação enzimática na detecção do segun- do meio de detecção, ou o terceiro meio de detecção é um meio para detec- 20 tar radiação, mais preferencialmente radiação emitida por um radionuclídeo. Preferencialmente, o terceiro meio de detecção é especificamente detectar e/ou interagir com o segundo meio de detecção.

Além disso na modalidade com um parceiro de interação de SDF-1 sendo imobilizado sobre uma superfície e o ácido nucléico de acordo 25 com a presente invenção sendo preferencialmente adicionado ao complexo formado entre o parceiro de interação e o SDF-1, a amostra pode ser remo- vida da reação, mais preferencialmente do vaso de reação onde são realiza- das a etapa c) e/ou a etapa d).

Em uma modalidade o ácido nucléico de acordo com a presente invenção compreende uma porção de fluorescência e por meio da qual a fluorescência da porção de fluorescência é diferente na formação de com- plexo entre o ácido nucléico e SDF-1 e SDF-1 livre. Em uma modalidade adicional o ácido nucléico é um derivado do ácido nucléico de acordo com a presente invenção, por meio da qual o deri- vado do ácido nucléico compreende no mínimo um derivado fluorescente de adenosina substituindo adenosina. Em uma modalidade preferencial o deri- 5 vado fluorescente de adenosina é etenoadenosina.

Em uma modalidade adicional o complexo consistindo do deri- vado do ácido nucléico de acordo com a presente invenção e o SDF-1 é de- tectado usando fluorescência.

Em uma modalidade do método um sinal é criado na etapa (c) ou na etapa (d) e preferencialmente o sinal está correlacionado com a con- centração de SDF-1 na amostra.

Em um aspecto preferencial, as provas podem ser realizadas em lâminas de 96 cavidades, onde os componentes são imobilizados nos vasos de reação conforme descrito acima e as cavidades agem como vasos de reação.

O ácido nucléico da invenção pode ser usado adicionalmente como matéria-prima para design de fármaco. Basicamente há duas aborda- gens possíveis. Uma abordagem é a triagem de bibliotecas de compostos visto que semelhantes bibliotecas de compostos são preferencialmente bibli- 20 otecas de compostos de baixo peso molecular. Em uma modalidade, a tria- gem é uma triagem de alta produtividade. Preferencialmente, triagem de alta produtividade é a avaliação de tentativa e erro rápida e eficiente de compos- tos em uma prova à base de alvo. No melhor caso as análises são realiza- das por algumas medições colormáticas. Bibliotecas conforme usado em 25 conexão com isso são de conhecimento de uma pessoa versada na técnica.

Alternativamente, o ácido nucléico de acordo com a presente invenção pode ser usado para design do fundamento racional de fármacos. Preferencialmente, design de fármaco racional é o design de uma estrutura de orientação farmacêutica. Iniciando a partir da estrutura tridimensional do 30 alvo a qual é tipicamente identificada por métodos tais como cristalografia de raios X ou espectroscopia por ressonância magnética nuclear, programas de computador são usados para pesquisar através de bancos de dados conten- do estruturas de muitos compostos químicos diferentes. A seleção é feita por um computador, os compostos identificados podem ser em seguida testados no laboratório.

O design racionai de fármacos pode se iniciar a partir de quais- quer dos ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção e envolve uma estrutura, preferencialmente uma estrutura tridimensional, a qual é simi- lar à estrutura dos ácidos nucléicos da invenção ou idêntica às partes medi- ando ligação da estrutura dos ácidos nucléicos da invenção. Em qualquer caso semelhante estrutura ainda mostra a mesma característica de ligação ou uma característica de ligação similar aos ácidos nucléicos da invenção. Em quer uma etapa adicional ou como uma etapa alternativa no design ra- cional de fármacos preferencialmente a estrutura tridimensional destas par- tes dos ácidos nucléicos ligando ao neurotransmissor são simuladas por grupamentos químicos os quais são diferentes de nucleotídeos e ácidos nu- cléicos. Por esta simulação pode ser desenhado um composto diferente dos ácidos nucléicos. O composto referido é preferencialmente uma molécula pequena ou um peptídeo.

Em caso de triagem de bibliotecas de compostos, tal como u- sando uma prova competitiva as quais são de conhecimento de uma pessoa 20 versada nas artes, SDF-1 análogos, SDF-1 agonistas ou antagonistas de SDF-1 apropriados podem ser encontrados. As provas competitivas referidas podem ser estabelecidas como se segue. O ácido nucléico da invenção, pre- ferencialmente um spiegelmero o qual é um L-ácido nucléico de ligação alvo, é ligado a uma fase sólida. De modo a identificar SDF-1 análogos marcados 25 SDF-1 pode ser adicionado à prova. Um análogo potencial competiria com as moléculas de SDF-1 ligando ao spiegelmero o qual iria junto com uma redução no sinal obtido pela etiqueta respectiva. Triagem para agonistas ou antagonistas pode envolver o uso de uma prova de cultura celular conforme de conhecimento daqueles versados na técnica.

O kit de acordo com a presente invenção pode compreender no

mínimo um ou vários dos ácidos nucléicos da invenção. Adicionalmente, o kit pode compreender no mínimo um ou vários controles positivos ou negativos. Um controle positivo pode ser, por exemplo, SDF-1, particularmente o SDF-1 contra o qual o ácido nucléico da invenção é selecionado ou ao qual liga, preferencialmente, em forma líquida. Um controle negativo pode ser, por e- xemplo, um peptídeo o qual é definido em termos de propriedades biofísicas 5 similares a SDF-1, mas o qual não é reconhecido pelos ácidos nucléicos da invenção. Além disso, o kit referido pode compreender um ou vários tam- pões. Os vários ingredientes podem ser contidos no kit em forma seca ou Iiofilizada ou solvidos em um líquido. O kit pode compreender um ou vários recipientes os quais por sua vez podem conter um ou vários ingredientes do 10 kit. Em uma modalidade adicional, o kit compreende uma instrução ou folhe- to de instruções o qual proporcionao ao usuário informação sobre como usar o kit e seus vários ingredientes.

Conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de patente, o termo tratamento compreende em uma modalidade preferencial adicionalmente ou alternativamente prevenção e/ou seguimento.

A determinação farmacêutica e bioanalítica do ácido nucléico de acordo com a presente invenção é elementarmente para a avaliação de seu perfil farmacocinético e biodinâmico em vários humores, tecidos e órgãos do corpo humano e não-humano. Para semelhante finalidade, podem ser usa- dos quaisquer dos métodos de detecção revelados aqui, neste requerimento de patente, ou de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Em um aspecto adicional da presente invenção é proporcionada uma prova de hibri- dização de sanduíche para a detecção do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Dentro do teste de detecção são usadas uma sonda de captura e uma sonda de detecção. A sonda de captura é complementar à primeira parte e a sonda de detecção à segunda parte do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Ambas, sonda de captura e de detecção, podem ser formadas por nucleotídeos de DNA, nucleotídeos de DNA modifi- cados, nucleotídeos de RNA modificados, nucleotídeos de RNA, nucleotí- deos de LNA e/ou nucleotídeos de PNA.

Portanto, a sonda de captura compreende um trecho de seqüên- cia complementar à extremidade 5’ do ácido nucléico de acordo com a pre- sente invenção e a sonda de detecção compreende um trecho de seqüência complementar à extremidade 3’ do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Neste caso a sonda de captura é imobilzada para uma superfície ou matriz através de sua extremidade 5’ por meio da qual a sonda de captu- 5 ra pode ser imobilzada diretamente em sua extremidade 5’ ou através de um encadeador entre sua extremidade 5’ e a superfície ou matriz. No entanto, em princípio o encadeador pode ser encadeado a cada nucleotídeo da son- da de captura. O encadeador pode ser formado por encadeadores hidrofíli- cos de versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de 10 D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modi- ficados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L- RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modificados, nucleotí- deos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.

Alternativamente, a sonda de captura compreende um trecho de 15 seqüência complementar à extremidade 3’ do ácido nucléico de acordo com a presente invenção e a sonda de detecção compreende um trecho de se- qüência complementar à extremidade 5’ do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Neste caso a sonda de captura é imobilzada para uma superfície ou matriz através de sua extremidade 3’ por meio da qual a sonda 20 de captura pode ser imobilzada diretamente em sua extremidade 3’ ou atra- vés de um encadeador entre sua extremidade 3’ e a superfície ou matriz. No entanto, em princípio, o encadeador pode ser encadeado a cada nucleotídeo do trecho da seqüência que é complementar ao ácido nucléico de acordo com a presente invenção. O encadeador pode ser formado por encadeado- 25 res hidrofílicos de versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nu- cleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotí- deos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L-RNA modifica- dos, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.

O número de nucleotídeos da sonda de captura e detecção que

podem hibridizar ao ácido nucléico de acordo com a presente invenção é variável e pode ser dependente do número de nucleotídeos da sonda de captura e/ou detecção e/ou o próprio ácido nucléico de acordo com a pre- sente invenção. O número total de nucleotídeos da sonda de captura e de detecção que podem hibridizar ao ácido nucléico de acordo com a presente invenção deve ser máximo o número de nucleotídeos que são compreendi- 5 dos pelo ácido nucléico de acordo com a presente invenção. O número mí- nimo de nucleotídeos (2 a 10 nucleotídeos) da sonda de detecção e captura deve permitir hibridização à extremidade 5’ ou à extremidade 3’, respectiva- mente, do ácido nucléico de acordo com a presente invenção. De modo a realizar alta especificidade e seletividade entre o ácido nucléico de acordo 10 com a presente invenção e outros ácidos nucléicos ocorrendo em amostras que são analisadas o número total de nucleotídeos da sonda de captura e detecção deve ser ou máximo o número de nucleotídeos que são compre- endidos pelo ácido nucléico de acordo com a presente invenção.

Além disso a sonda de detecção preferencialmente carrega uma molécula de marcador ou etiqueta que pode ser detectada conforme previa- mente descrito aqui, neste requerimento de patente. A molécula de marca- dor ou etiqueta pode em princípio ser encadeada a cada nucleotídeo da sonda de detecção. Preferencialmente, a etiqueta ou marcador está locali- zada na extremidade 5’ ou na extremidade 3’ da sonda de detecção, por meio da qual entre os nucleotídeos dentro da sonda de detecção que são complementares ao ácido nucléico de acordo com a presente invenção, e a etiqueta pode ser inserido um encadeador. O encadeador pode ser formado por encadeadores hidrofílicos dos versados na técnica ou por nucleotídeos de D-DNA, nucleotídeos de D-DNA modificados, nucleotídeos de D-RNA, nucleotídeos de D-RNA modificados, nucleotídeos de D-LNA, nucleotídeos de PNA, nucleotídeos de L-RNA, nucleotídeos de L-DNA, nucleotídeos de L- RNA modificados, nucleotídeos de L-DNA modificados e/ou nucleotídeos de L-LNA.

A detecção do ácido nucléico de acordo com a presente inven- ção pode ser realizada como se segue:

O ácido nucléico de acordo com a presente invenção hibridisa com uma de suas extremidades à sonda de captura e com a outra extremi- dade à sonda de detecção. Depois disso a sonda de detecção não ligada é removida, por exemplo, por uma ou várias etapas de lavagem. A quantidade de sonda de detecção ligada a qual preferencialmente carrega uma molécula de marcador ou etiqueta, pode ser medida em seguida.

5 Conforme preferencialmente usado aqui, neste requerimento de

patente, os termos doença e distúrbio serão usados em uma maneira inter- cambiável, caso não indicado ao contrário.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo compreendem preferencialmente não pretende limitar o temo seguido ou descrito por semelhante termo. No entanto, em uma modalidade alternativa o termo compreende será entendido no significado de contendo e portanto como limitando o tema seguido ou descrito por semelhante termo.

As várias SEQ. ID. Nos., a natureza química das moléculas de ácido nucléico de acordo com a presente invenção e as moléculas SDF-1 alvo conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a real seqüência das mesmas e o número de referência interno são resumidos na tabela se- guinte.

Também foi observado que os ácidos nucléicos foram caracteri- zados no nível de aptâmero, isto é, D-ácido nucléico (D-RNA) com o D-SDF- 20 1 humano biotinilado (SEQ.ID. 4) ou no nível de Spiegelmero, isto é, L-ácido nucléico (L-RNA) com a configuração natural de SDF-1, o L- SDF-1 (SDF-1 α humano, SEQ-ID. 1). Os diferentes ácidos nucléicos compartilham um nome de referência interno mas uma SEQ. ID para a molécula de D-RNA (Aptâme- ro) e uma SEQ. ID. para a molécula de L-RNA (Spiegelmero), respectiva- 25 mente.

TABELA (A) Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 1 L-peptídeo KPVSLSYRCPCRFFESH SDF-Ia humano / VARANVKHLKILNTPNCA de macaco / de LQIVARLKNNNRQV- gato CIDPKLKWIQEYLE- SDF-1 humano / de KALNK macaco / de gato 2 L-peptídeo KPVSLSYRCPCRFFESH SDF-1 β humano/ VARANVKHLKILNTPNCA de macaco / de LQIVARLKNNNRQV- gato CIDPKLKWIQEYLE- KALNKRFKM 3 L-peptídeo KPVSLSYRCPCRFFESHI SDF-Ia murino ARANVKHLKILNTPNCAL SDF-1 murino QIVARLKNNNRQVCIDP- KLKWIQEYLEKALNK 4 D-peptídeo KPVSLSYRCPCRFFESH D-SDF-1 hu biotini- VARANVKHLKILNTPNCA Iado LQIVARLKNNNRQV- CIDPKLKWIQEYLE- KALNKRFK-Biotin L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGCAA- 192-A10-001 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 6 L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGUAA- 192-G10 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACCACAGC 7 L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGUAA- 192-F10 GELMER) CACGUCAAUGAAAG- GUAACCGCAGC 8 L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGUAA- 192-B11 GELMER) CACGUCAAUGAAAG- GUAACCACAGC 9 L-RNA (SPIE- GCUGUAAAAGUAA- 192-C9 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACUACAGC L-RNA (SPIE- GCUGUAAAAGUAACA- 192-E10 GELMER) AGUCAAUGAAAGGUA- ACUACAGC I 11 L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGUAACA- 192-C10 GELMER) AGUCAAUGAAAGGUA- ACCACAGC 12 L-RNA (SPIE- GCAGUGAAAGUAA- 192-D11 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACCACAGC 13 L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGUAA- 192-G11 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACCACUGC 14 L-RNA (SPIE- GCUAUGAAAGUAA- 192-H11 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACCAUAGC L-RNA (SPIE- GCUGCGAAAGCGA- 192-D10 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 16 L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGCAA- 192-E9 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCACAGC 17 L-RNA (SPIE- GCUGUGAAAGUAA- 192-H9 GELMER) CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC TABELA 1 (B)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 18 L-RNA (SPIE- AGCGUGAAAGUAA- 191-A6 GELMER) CACGUAAAAUGAAAG- GUAACCACGCU 19 L-RNA (SPIE- AAAGYRACAHGUMAA- Fórmula-1 Tipo A GELMER) XaUGAAAGGUARC; Xa = A ou ausente L-RNA (SPIE- AAAGYRACAHGUMA- Fórmula-2 Tipo A GELMER) AUGAAAGGUARC 21 L-RNA (SPIE- AAAGYRACAHGUMAA- Fórmula-3 Tipo A GELMERJ AUGAAAGGUARC 22 L-RNA (SPIE- AAAGYAACAHGUCA¬ Fórmula-4 Tipo A GELMER) AUGAAAGGUARC 23 L-RNA (SPIE- RSHRYR Fórmula-5-5’ Tipo GELMER A 24 L-RNA (SPIE- YRYDSY Fórmula-5-3’ Tipo GELMER A L-RNA (SPIE- CUGUGAAAGCAACAU- 192-A10-002 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAG 26 L-RNA (SPiE- UGUGAAAGCAACAU- 192-A10-003 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCA 27 L-RNA (SPIE- GUGAAAGCAACAUGU- 192-A10-004 GELMER) CAAUGAAAG- GUAGCCGC 28 L-RNA (SPIE- UGAAAGCAACAUGU- 192-A10-005 GELMER) CAAUGAAAGGUAGCCG 29 L-RNA (SPIE- GAAAGCAACAUGUCA- 192-A10-006 GELMER) AUGAAAGGUAGCC L-RNA (SPIE- AAAGCAACAUGUCA- 192-A10-007 GELMER) AUGAAAGGUAGC 31 L-RNA (SPIE- GCGUGAAAGCAACAU- 192-A10-008 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCGC 32 L-RNA (SPIE- GCGCGAAAGCAACAU- 192-A10-015 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCGC 33 L-RNA (SPiE- GCGGAAAGCAACAU- 192-A10-014 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCCCGC 34 L-RNA (SPIE- CGUGAAAGCAACAU- 192-A10-016 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCG L-RNA (SPIE- GCGCAAAGCAACAU- 192-A10-017 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCGUGC 36 L-RNA (SPIE- GUGCAAAGCAACAU- 192-A10-018 GELMER) G U CAA U GAAAG- GUAGCGCGC TABELA 1 (C)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 37 L-RNA (SPIE- CGCGAAAGCAACAU- 192-A10-019 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGUG 38 L-RNA (SPIE- GGGCAAAGCAACAU- 192-A10-020 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCGCCC 39 L-RNA (SPIE- GGCCAAAGCAACAU- 192-A10-021 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCGGCC 40 L-RNA (SPIE- GCCCAAAGCAACAU- 192-A10-022 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCGGGC 41 L-RNA (SPIE- CCCCAAAGCAACAU- 192-A10-023 GELMER) GUCAAUGAAAG- GUAGCGGGG 42 L-RNA (SPIE- X2BBBS; X2 = S ou au¬ Fórmula-6-5’ Tipo GELMER) sente A 43 L-RNA (SPIE- SBBVX3; X3 = S ou ausen¬ Fórmula-6-3’ Tipo GELMER) te A 44 L-RNA (SPIE- X1X2NNBV; X1 = R ou au¬ Fórmula-7-5’ Tipo GELMER) sente, X2 = S ou ausente A 45 L-RNA (SPIE- BNBNX3X4; X3 = R ou au- Fórmula-7-3’ Tipo GELMER) sente, X4 = Y ou ausente A 46 L-RNA (SPIE- AGCGUGGUGUGAUCUA 193-C2-001 GELMER) GAUGUAGUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUACGCU 47 L-RNA (SPIE- AGCGUGGUGUGAUCUA 193-G2-001 GELMER) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUACGCU 48 L-RNA (SPIE- AGCGUGGUGUGAUCUA 193-F2-001 GELMER) GAUGUAAUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUGCGCU 49 L-RNA (SPIE- GCGAGGUGUGAUCUAG 193-G1-002 GELMER) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUGCGC 50 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-D2-002 GELMER) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUGCGC 51 L-RNA (SPIE- GCAUGGUGUGAUCUAG 193-A1-002 GELMER) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUGCCC 52 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-D3-002 GELMER) AUGUAAUGGCUGAUC- CUAGUCAGGGACGC TABELA 1 (D)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 53 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-B3-002 GELMER) AUGUAGAGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 54 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-H3-002 GELMER) AUGUAAAGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 55 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-E3-002 GELMER) AUGUAGUGGCUGUUC- CUAGUCAGGUAUGC 56 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-D1-002 GELMER) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUUAGGUACGC 57 L-RNA (SPIE- GUGUGAUCUAGAU- Fórmula-1 Tipo B GELMER) GUADWGGCUGWUC- CUAGUYAGG 58 L-RNA (SPI E- GUGUGAUCUAGAU- Fórmula-2 Tipo B GELMER) GUADUGGCUGAUCCU- AGUCAGG 59 L-RNA (SPIE- X1GCRWG; Xi = A ou au¬ Fórmula-3-5’ Tipo GELMER) sente B 60 L-RNA (SPIE- KRYSCX4; X4 = U ou au¬ Fórmula-3-3’ Tipo GELMER) sente B 61 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-C2-002 GELMER) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 62 L-RNA (SPI E- CGUGGUGUGAUCUA- 193-C2-003 GELMER) GAUGUAGUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUACG 63 L-RNA (SPIE- GUGGUGUGAUCUA- 193-C2-004 GELMER) GAUGUAGUGGCU- GAUCCUAGUCAGGUAC 64 L-RNA (SPIE- UGGUGUGAUCUAGAU- 193-C2-005 GELMER) GUAGUGGCUGAUCCU- AGUCAGGUA 65 L-RNA (SPIE- GGUGUGAUCUAGAU- 193-C2-006 GELMER) GUAGUGGCUGAUCCU- AGUCAGGU 66 L-RNA (SPIE- GUGUGAUCUAGAU- 193-C2-007 GELMER) GUAGUGGCUGAUCCU- AGUCAGG 67 L-RNA (SPIE- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-G2-012 GELMER) AUGUAUUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC TABELA 1 (E)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 68 L-RNA (SPIE- GCGCGGUGUGAUCUAG 193-G2-013 GELMER) AUGUAUUGGCUGAUC- CUAGUCAGGCGCGC 69 L-RNA (SPIE- GCGCGUGUGAUCUA- 193-G2-014 GELMER) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGCGC 70 L-RNA (SPIE- GGGCGUGUGAUCUA- 193-G2-015 GELMER) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGCCC 71 L-RNA (SPIE- GGCCGUGUGAUCUA- 193-G2-016 GELMER) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGGCC 72 L-RNA (SPIE- GCCCGUGUGAUCUA- 193-G2-017 GELMER) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGGGC 73 L-RNA (SPIE- X2SSBS; X2 = G ou au¬ Fórmula-4-5’ Tipo GELMER) sente B 74 L-RNA (SPIE- BVSSX3; X3 = C ou ausen¬ Fórmula-4-3’ Tipo GELMER) te B 75 L-RNA (SPIE- X1GCGUG; Xi = A ou au¬ Fórmula-5-5’ Tipo GELMER) sente B 76 L-RNA (SPIE- UACGCX4; X4 = U ou au¬ Fórmula-5-3’ Tipo GELMER) sente B 77 L-RNA (SPIE- X1X2SVNS; X1 = A ou au¬ Fórmula-6-5’ Tipo GELMER) sente, X2 = G ou ausente B 78 L-RNA (SPIE- BVBSX3X4; X3 = C ou au¬ Fórmula-6-3’ Tipo GELMER) sente, X4 = U ou ausente B 79 L-RNA (SPIE- GUGCUGCGGGGGUU- 197-B2 GELMER) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGCAC 80 L-RNA (SPIE- AGCGUGGCGAGGUU- 191-D5-001 GELMER) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACACGCU 81 L-RNA (SPIE- GUGUUGCGGAGGUU- 197-H1 GELMER) AGGGCUAGAAGUCG- GUCAGCAGCAC 82 L-RNA (SPIE- CGUGCGCUUGAGAUAG 190-A3-001 GELMER) GGGUUAGGGCUUAAA- GUCGGCUGAUUCU- CACG 83 L-RNA (SPIE- AGCGUGAAGGGGUU- 191-A5 GELMER) AGGGCUCGAAGUCGG- CUGACACGCU TABELA 1 (F)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 84 L-RNA (SPIE- GUGCUGCGGGGGUU- 197-H3 GELMER) AGGGCUCGAA- GUCGGCCCGCAGCAC 85 L-RNA (SPIE- GUGUUCCCGGGGUU- 197-B1 GELMER) AGGGCUUGAA- GUCGGCCGGCAGCAC 86 L-RNA (SPI E- GUGUUGCAGGGGUU- 197-E3 GELMER) AGGGCUUGAA- GUCGGCCUGCAGCAC 87 L-RNA (SPI E- GUGCUGCGGGGGUU- 197-H2 GELMER) AGGGCUCAAA- GUCGGCCUGCAGCAC 88 L-RNA (SPIE- GUGCUGCCGGGGUU- 197-D1 GELMER) AGGGCUAA- AGUCGGCCGACAGCAC 89 L-RNA (SPIE- GUGCUGUGGGGGU- 197-D2 GELMER) CAGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGCAC 90 L-RNA (SPIE- GGUYAGGGCUHRXaA- Fórmula-1 Tipo C GELMER) GUCGG; Xa = A ou au¬ sente 91 L-RNA (SPIE- GGUYAGGGCUHRAA- Fórmula-2 Tipo C GELMER) GUCGG 92 L-RNA (SPIE- GGUYAGGGCUHRA- Fórmula-3 Tipo C GELMER) GUCGG 93 L-RNA (SPIE- GGUUAGGGCUHGAA- Fórmula-4 Tipo C GELMER) GUCGG 94 L-RNA (SPIE- UGAGAUAGGGGUU- 190-A3-003 GELMER) AGGGCUUAAAGUCGG- CUGAUUCUCA 95 L-RNA (SPIE- GAGAUAGGGGUU- 190-A3-004 GELMER) AGGGCUUAAAGUCGG- CUGAUUCUC 96 L-RNA (SPIE- GGGGUUAGGGCUUAA- 190-A3-007 GELMER) AGUCGGCUGAUUCU 97 L-RNA (SPI E- GCGUGGCGAGGUU- 191-D5-002 GELMER) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACACGC 98 L-RNA (SPIE- CGUGGCGAGGUU- 191-D5-003 GELMER) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACACG 99 L-RNA (SPIE- CGGGCGAGGUU- 191-D5-004 GELMER) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACCG 100 L-RNA (SPIE- CGGGCGAGGUU- 191-D5-005 GELMER) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGCCCG TABELA 1 (G)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 101 L-RNA (SPIE- CGGCGAGGUUAGGG- 191-D5-006 GELMER) CUAGAAGUCG- GUCGCCG 102 L-RNA (SPI E- CGGGAGGUUAGGGCU- 191-D5-007 GELMER) AGAAGUCGGUCCCG 103 L-RNA (SPIE- GGGAGGUUAGGGCU- 191-D5-010 GELMER) AGAAGUCGGUCCC 104 L-RNA (SPIE- CCGCGGUUAGGGCUA- 191-D5-017 GELMER) GAAGUCGGGCGG 105 L-RNA (SPIE- CCCGGGUUAGGGCUA- 191-D5-029 GELMER) GAAGUCGGCGGG 106 L-RNA (SPIE- GGCGGGUUAGGGCU- 191-D5-024 GELMER) AGAAGUCGGCGCC 107 L-RNA (SPIE- CCCGCGGUUAGGGCU- 191-D5-017-29a GELMER) AGAAGUCGGGCGGG 108 L-RNA (SPIE- GCCGCGGUUAGGGCU- 191-D5-017-29b GELMER) AGAAGUCGGGCGGC 109 L-RNA (SPIE- CCCCGGGUUAGGGCU- 191-D5-019-29a GELMER) AGAAGUCGGCGGGG 110 L-RNA (SPIE- CGGCGGGUUAGGG- 191 -D5-024-29a GELMER) CUAGAAGUCGGCGCCG 111 L-RNA (SPIE- GGGCGGGUUAGGG- 191-D5-024-29b GELMER) CUAGAAGUCGGCGCCC 112 L-RNA (SPIE- UGCUGCGGGGGUU- 197-B2-001 GELMER) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGCA 113 L-RNA (SPIE- GCUGCGGGGGUU- 197-B2-002 GELMER) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGC 114 L-RNA (SPIE- CUGCGGGGGUU- 197-B2-003 GELMER) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAG 115 L-RNA (SPIE- UGCGGGGGUUAGGG- 197-B2-004 GELMER) CUAGAAGUCGGCCUG- CA 116 L-RNA (SPIE- GCGGGGGUUAGGG- 197-B2-005 GELMER) CUAGAAGUCGGCCUGC TABELA 1 (H)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 117 L-RNA (SPIE- GCCGGGGUUAGGG- 197-B2-006 GELMER) CUAGAAGUCGGCCGGC 118 L-RNA (SPIE- GGCCGGGGUUAGGG- 197-B2-006-31a GELMER) CUAGAA- GUCGGCCGGCC 119 L-RNA (SPIE- CGCCGGGGUUAGGG- 197-B2-006-31b GELMER) CUAGAA- GUCGGCCGGCG 120 L-RNA (SPIE- RKSBUSNVGR Fórmula-5-5’ Tipo GELMER) C 121 L-RNA (SPIE- YYNRCASSMY Fórmula-5-3’ Tipo GELMER) C 122 L-RNA (SPIE- RKSBUGSVGR Fórmula-6-5’ Tipo GELMER) C 123 L-RNA (SPIE- YCNRCASSMY Fórmula-6-3’ Tipo GELMER) C 124 L-RNA (SPIE- XsSSSV; Xs = S ou ausen¬ Fórmula-7-5’ Tipo GELMER) te C 125 L-RNA (SPIE- BSSSXs; Xs = S ou ausen¬ Fórmula-7-3’ Tipo GELMER) te C 126 L-RNA (SPIE- SGGSV Fórmula-8-5’ Tipo GELMER) C 127 L-RNA (SPIE- YSCCS Fórmula-8-3’ Tipo GELMER) C 128 L-RNA (SPIE- GCSGG Fórmula-9-5’ Tipo GELMER) C 129 L-RNA (SPIE- CCKGC Fórmula-9-3’ Tipo GELMER) C 130 L-RNA (SPIE- SSSSR Fórmula-10-5’ Tipo GELMER) C 131 L-RNA (SPIE- YSBSS Fórmula-10-3’ Tipo GELMER) C I TABELA 1 (I)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 132 L-RNA (SPIE- 5’-40 kDa-PEG- 193-G2-012-5’- GELMER) GCGUGGUGUGAUCUAG PEG AUGUAUUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 133 L-RNA (SPIE- 5’-40 kDa-PEG- 192-A10-008-5’- GELMER) GCGUGAAAGCAACAU- PEG GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCGC 134 L-RNA (SPIE- 5’-40 kDa-PEG- 191-D5-007-5’- GELMER) CGGGAGGUUAGGGCU- PEG AGAAGUCGGUCCCG 135 L-RNA (SPIE- 5’-40 kDa-PEG- 197-B2-006-5’- GELMER) GCCGGGGUUAGGG- PEG CUAGAAGUCGGCCGGC 136 L-RNA (SPIE- 5’-40 kDa-PEG- 197-B2-006-31b- GELMER) CGCCGGGGUUAGGG- 5’PEG CUAGAA- GUCGGCCGGCG 137 L-RNA (SPI E- 5’-40 kDa-PEG- 192-A10-001-5’- GELMER) GCUGUGAAAGCAA- PEG CAUGUCAAUGAAAG- 192-A10-001-5’- GUAGCCGCAGC PEG40 138 L-RNA (SPIE- UAAGGAAACUCGGU- Spiegelmero Con¬ GELMER) CUGAUGCGGUAGCG- trole CUGUGCAGAGCU 139 L-RNA (SPI E- 5’-30 kDa-PEG- 192-A10-001-5’- GELMER) GCUGUGAAAGCAA- PEG30 CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 140 L-RNA (SPIE- 5’-100 kDa-HES- 192-A10-001-5’- GELMER) GCUGUGAAAGCAA- HES100 CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 141 L-RNA (SPIE- 5’-130 kDa-HES- 192-A10-001-5’- GELMER) GCUGUGAAAGCAA- HES130 CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 142 L-RNA (SPIE- CGUGGUCCGUUGUGU 194-A2-001 GELMER) CAGGUCU- AUUCGCCCCGGUG- CAGGGCAUCCGCG 143 L-RNA (SPIE- GCAGUGUGACGCGGAC 196-B12-003 GELMER) GUGAUAGGACAGAG- CUGAUCCCGCUCAG- GUGAG 144 L-RNA (SPIE- CAACAGCAGUGUGACG 196-B12-004 GELMER) CGGACGUGAUAGGA- CAGAGCUGAUCCCG- CUCAG TABELA 1 (J)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 145 D-RNA (AP- GCUGUGAAAGCAA- 192-A10-001 tâmero; CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 146 D-RNA (AP- GCUGUGAAAGUAA- 192-G10 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- G UAACCACAGC 147 D-RNA (AP- GCUGUGAAAGUAA- 192-F10 TÂMERO) CACGUCAAUGAAAG- GUAACCGCAGC 148 D-RNA (AP- GCUGUGAAAGUAA- 192-B11 TÂMERO) CACGUCAAUGAAAG- GUAACCACAGC 149 D-RNA (AP- GCUGUAAAAGUAA- 192-C9 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACUACAGC 150 D-RNA (AP- GCUGUAAAAGUAACA- 192-E10 TÂMERO) AGUCAAUGAAAGGUA- ACUACAGC 151 D-RNA (AP- GCUGUG AAAG UAACA- 192-C10 TÂMERO) AGUCAAUGAAAGGUA- ACCACAGC 152 D-RNA (AP- GCAGUGAAAGUAA- 192-D11 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACCACAGC 153 D-RNA (AP- GCUGUGAAAGUAA- 192-G11 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACCACUGC 154 D-RNA (AP- GCUAUGAAAGUAA- 192-H11 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- GUAACCAUAGC 155 D-RNA (AP- GCUGCGAAAGCGA- 192-D10 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 156 D-RNA (AP- GCUGUGAAAGCAA- 192-E9 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCACAGC 157 D-RNA (AP- GCUGUGAAAGUAA- 192-H9 TÂMERO) CAUGUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAGC 158 D-RNA (AP- AGCGUGAAAGUAA- 191-A6 TÂMERO) CACGUAAAAUGAAAG- GUAACCACGCU 159 D-RNA (AP- CUGUGAAAGCAACAU- 192-A10-002 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCAG 160 D-RNA (AP- UGUGAAAGCAACAU- 192-A10-003 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCA TABELA 1 (K)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 161 D-RNA (AP- GUGAAAGCAACAUGU- 192-A10-004 TÂMERO) CAAUGAAAG- GUAGCCGC 162 D-RNA (AP- UGAAAGCAACAUGU- 192-A10-005 TÂMERO) CAAUGAAAGGUAGCCG 163 D-RNA (AP- GAAAGCAACAUGUCA- 192-A10-006 TÂMERO) AUGAAAGGUAGCC 164 D-RNA (AP- AAAGCAACAUG UCA- 192-A10-007 TÂMERO) AUGAAAGGUAGC 165 D-RNA (AP- GCGUGAAAGCAACAU- 192-A10-008 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCGC 166 D-RNA (AP- GCGCGAAAGCAACAU- 192-A10-015 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCGC 167 D-RNA (AP- GCGGAAAGCAACAU- 192-A10-014 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCCCGC 168 D-RNA (AP- CGUGAAAGCAACAU- 192-A10-016 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGCG 169 D-RNA (AP- GCGCAAAGCAACAU- 192-A10-017 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCGUGC 170 D-RNA (AP- GUGCAAAGCAACAU- 192-A10-018 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCGCGC 171 D-RNA (AP- CGCGAAAGCAACAU- 192-A10-019 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCCGUG 172 D-RNA (AP- GGGCAAAGCAACAU- 192-A10-020 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCGCCC 173 D-RNA (AP- GGCCAAAGCAACAU- 192-A10-021 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCGGCC 174 D-RNA (AP- GCCCAAAGCAACAU- 192-A10-022 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCGGGC 175 D-RNA (AP- CCCCAAAGCAACAU- 192-A10-023 TÂMERO) GUCAAUGAAAG- GUAGCGGGG 176 D-RNA (AP- AGCGUGGUGUGAUCUA 193-C2-001 TÂMERO) GAUGUAGUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUACGCU TABELA 1 (L)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 177 D-RNA (AP- AGCGUGGUGUGAUCUA 193-G2-001 TÂMERO) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUACGCU 178 D-RNA (AP- AGCGUGGUGUGAUCUA 193-F2-001 TÂMERO) GAUGUAAUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUGCGCU 179 D-RNA (AP- GCGAGGUGUGAUCUAG 193-G1-002 TÂMERO) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUGCGC 180 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-D2-002 TÂMERO) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUGCGC 181 D-RNA (AP- GCAUGGUGUGAUCUAG 193-A1-002 TÂMERO) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUGCCC 182 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-D3-002 TÂMERO) AUGUAAUGGCUGAUC- CUAGUCAGGGACGC 183 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-B3-002 TÂMERO) AUGUAGAGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 184 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-H3-002 TÂMERO) AUGUAAAGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 185 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-E3-002 TÂMERO) AUGUAGUGGCUGUUC- CUAGUCAGGUAUGC 186 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-D1-002 TÂMERO) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUUAGGUACGC 187 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-C2-002 TÂMERO) AUGUAGUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 188 D-RNA (AP- CGUGGUGUGAUCUA- 193-C2-003 TÂMERO) GAUGUAGUGGCU- GAUCCUAGUCAG- GUACG 189 D-RNA (AP- GUGGUGUGAUCUA- 193-C2-004 TÂMERO) GAUGUAGUGGCU- GAUCCUAGUCAGGUAC 190 D-RNA (AP- UGGUGUGAUCUAGAU- 193-C2-005 TÂMERO) GUAGUGGCUGAUCCU- AGUCAGGUA 191 D-RNA (AP- GGUGUGAUCUAGAU- 193-C2-006 TÂMERO) GUAGUGGCUGAUCCU- AGUCAGGU TABELA 1 (M)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 192 D-RNA (AP- GUGUGAUCUAGAU- 193-C2-007 TÂMERO) GUAGUGGCUGAUCCU- AGUCAGG 193 D-RNA (AP- GCGUGGUGUGAUCUAG 193-G2-012 TÂMERO) AUGUAUUGGCUGAUC- CUAGUCAGGUACGC 194 D-RNA (AP- GCGCGGUGUGAUCUAG 193-G2-013 TÂMERO) AUGUAUUGGCUGAUC- CUAGUCAGGCGCGC 195 D-RNA (AP- GCGCGUGUGAUCUA- 193-G2-014 TÂMERO) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGCGC 196 D-RNA (AP- GGGCGUGUGAUCUA- 193-G2-015 TÂMERO) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGCCC 197 D-RNA (AP- GGCCGUGUGAUCUA- 193-G2-016 TÂMERO) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGGCC 198 D-RNA (AP- GCCCGUGUGAUCUA- 193-G2-017 TÂMERO) GAUGUAUUGGCU- GAUCCUAGU- CAGGGGGC 199 D-RNA (AP- GUGCUGCGGGGGUU- 197-B2 TÂMERO) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGCAC 200 D-RNA (AP- AGCGUGGCGAGGUU- 191-D5-001 TÂMERO) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACACGCU 201 D-RNA (AP- GUGUUGCGGAGGUU- 197-H1 TÂMERO) AGGGCUAGAAGUCG- GUCAGCAGCAC 202 D-RNA (AP- CGUGCGCUUGAGAUAG 190-A3-001 TÂMERO) GGGUUAGGGCUUAAA- GUCGGCUGAUUCU- CACG 203 D-RNA (AP- AGCGUGAAGGGGUU- 191-A5 TÂMERO) AGGGCUCGAAGUCGG- CUGACACGCU 204 D-RNA (AP- GUGCUGCGGGGGUU- 197-H3 TÂMERO) AGGGCUCGAA- GUCGGCCCGCAGCAC 205 D-RNA (AP- GUGUUCCCGGGGUU- 197-B1 TÂMERO) AGGGCUUGAA- GUCGGCCGGCAGCAC TABELA 1 (N)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 206 D-RNA (AP- GUGUUGCAGGGGUU- 197-E3 TÂMERO) AGGGCUUGAA- GUCGGCCUGCAGCAC 207 D-RNA (AP- GUGCUGCGGGGGUU- 197-H2 TÂMERO) AGGGCUCAAA- GUCGGCCUGCAGCAC 208 D-RNA (AP- GUGCUGCCGGGGUU- 197-D1 TÂMERO) AGGGCUAA- AG UCGGCCGACAGCAC 209 D-RNA (AP- GUGCUGUGGGGGU- 197-D2 TÂMERO) CAGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGCAC 210 D-RNA (AP- UGAGAUAGGGGUU- 190-A3-003 TÂMERO) AGGGCUUAAAGUCGG- CUGAUUCUCA 211 D-RNA (AP- GAGAUAGGGGUU- 190-A3-004 TÂMERO) AGGGCUUAAAGUCGG- CUGAUUCUC 212 D-RNA (AP- GGGGUUAGGGCUUAA- 190-A3-007 TÂMERO) AGUCGGCUGAUUCU 213 D-RNA (AP- GCGUGGCGAGGUU- 191-D5-002 TÂMERO) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACACGC 214 D-RNA (AP- CGUGGCGAGGUU- 191-D5-003 TÂMERO) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACACG 215 D-RNA (AP- CGGGCGAGGUU- 191-D5-004 TÂMERO) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGACCG 216 D-RNA (AP- CGGGCGAGGUU- 191-D5-005 TÂMERO) AGGGCUAGAAGUCG- GUCGCCCG 217 D-RNA (AP- CGGCGAGGUUAGGG- 191-D5-006 TÂMERO) CUAGAAGUCG- GUCGCCG 218 D-RNA (AP- CGGGAGGUUAGGGCU- 191-D5-007 TÂMÉRO) AGAAGUCGGUCCCG 219 D-RNA (AP- GGGAGGUUAGGGCU- 191-D5-010 TÂMERO) AGAAGUCGGUCCC 220 D-RNA (AP- CCGCGGUUAGGGCUA- 191-D5-017 TÂMERO) GAAGUCGGGCGG 221 D-RNA (AP- CCCGGGUUAGGGCUA- 191-D5-029 TÂMERO) GAAGUCGGCGGG 222 D-RNA (AP- GGCGGGUUAGGGCU- 191-D5-024 TÂMERO) AGAAGUCGGCGCC 223 D-RNA (AP- CCCGCGGUUAGGGCU- 191-D5-017-29a TÂMERO) AGAAGUCGGGCGGG TABELA 1 (O)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 224 D-RNA (AP- GCCGCGGUUAGGGCU- 191-D5-017-29b TÂMERO) AGAAGUCGGGCGGC 225 D-RNA (AP- CCCCGGGUUAGGGCU- 191-D5-019-29a TÂMERO) AGAAGUCGGCGGGG 226 D-RNA (AP- CGGCGGGUUAGGG- 191-D5-024-29a TÂMERO) CUAGAAGUCGGCGCCG 227 D-RNA (AP- GGGCGGGUUAGGG- 191-D5-024-29b TÂMERO) CUAGAAGUCGGCGCCC 228 D-RNA (AP- UGCUGCGGGGGUU- 197-B2-001 TÂMERO) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGCA 229 D-RNA (AP- GCUGCGGGGGUU- 197-B2-002 TÂMERO) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAGC 230 D-RNA (AP- CUGCGGGGGUU- 197-B2-003 TÂMERO) AGGGCUAGAA- GUCGGCCUGCAG 231 D-RNA (AP- UGCGGGGGUUAGGG- 197-B2-004 TÂMERO) CUAGAAGUCGGCCUG- CA 232 D-RNA (AP- GCGGGGGUUAGGG- 197-B2-005 TÂMERO) CUAGAAGUCGGCCUGC 233 D-RNA (AP- GCCGGGGUUAGGG- 197-B2-006 TÂMERO) CUAGAAGUCGGCCGGC 234 D-RNA (AP- GGCCGGGGUUAGGG- 197-B2-006-31a TÂMERO) CUAGAA- GUCGGCCGGCC 235 D-RNA (AP- CGCCGGGGUUAGGG- 197-B2-006-31b TÂMERO) CUAGAA- GUCGGCCGGCG 236 D-RNA (AP- CGUGGUCCGUUGUGU 194-A2-001 TÂMERO) CAGGUCU- AUUCGCCCCGGUG- CAGGGCAUCCGCG 236 D-RNA (AP- GCAGUGUGACGCGGAC 196-B12-003 TÂMERO) GUGAUAGGACAGAG- CUGAUCCCGCUCAG- GUGAG 238 D-RNA (AP- CAACAGCAGUGUGACG 196-B12-004 TÂMERO) CGGACGUGAUAGGA- CAGAGCUGAUCCCG- CUCAG TABELA 1 (P)

Seq.-ID RNA/Peptídeo Seqüência Referência Interna 239 L-RNA (Spie- 5’-PEG- Spiegelmero Con¬ gelmero) UAAGGAAACUCGGU- trole PEGuiIado CUGAUGCGGUAGCG- CUGUGCAGAGCU 240 L-RNA (Spie- GAT CACACCACGC- sonda de captura gelmero) (C18-PEG-espaçador)- 193-G2-012-5’- (C18-PEG-espaçador)-1 - PEG NH2-3’ 241 L-RNA (Spie- 5’-NH2-(C18-PEG- sonda de detecção gelmero) espaçador)-(C18-PEG- de 193-G2-012-5’- espaçador)- PEG GCGUACCUGAC A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelas figuras, exemplos e a listagem de seqüência dos quais características adicionais, modalidades e vantagens podem ser tiradas, em que A Fig. 1 mostra um alinhamento de seqüências de Iigantes de

RNA relacionados ligando a SDF-1 humano indicando o motivo de seqüên- cia (“Tipo A”) que é em uma modalidade preferencial em sua totalidade es- sencial para ligar a SDF-1 humano;

A Fig. 2A mostra derivados de Iigante de RNA 192-A10-001 (li- gante de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo A”);

A Fig. 2B mostra derivados de Iigante de RNA 192-A10-001 (li- gante de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo A”); A Fig. 3 mostra um alinhamento de seqüências de Iigantes de RNA relacionados ligando a SDF-1 humano indicando o motivo de seqüên- cia (“Tipo B”) que é em uma modalidade preferencial em sua totalidade es- sencial para ligar a SDF-1 humano;

A Fig. 4A mostra derivados de Iigantes de RNA 193-C2-001 e

193-G2-001 (ligantes de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo B”);

A Fig. 4B mostra derivados de ligantes de RNA 193-C2-001 e 193-G2-001 (ligantes de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo B”);

A Fig. 5 mostra um alinhamento de seqüências de ligantes de RNA relacionados ligando a SDF-1 humano indicando o motivo de seqüên- cia (“Tipo C”) que é em uma modalidade preferencial em sua totalidade es- sencial para ligar a SDF-1 humano;

A Fig. 6 mostra derivados de Iigante de RNA 190-A3-001 (ligante

de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo C”);

A Fig. 7A mostra derivados de ligante de RNA 190-D5-001 (li- gante de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo C”);

A Fig. 7B mostra derivados de ligante de RNA 190-D5-001 (li- gante de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo C”);

A Fig. 8 mostra derivados de ligante de RNA 197-B2 (ligante de RNA de SDF-1 humano de motivo de seqüência “Tipo C”);

A Fig. 9 mostra ligantes de RNA adicionais ligando a SDF-1 hu- mano;

A Fig. 10 mostra a quimiotaxia induzida por SDF-1 humano de

células de leucemia de células T humanas Jurkat visto que depois de 3 ho- ras de migração de células de leucemia de células T humanas Jurkat em direção a várias concentrações de SDF-1 humano foi obtida uma curva de dose-resposta para SDF-1 humano, representada como sinal de fluorescên- cia sobre concentração de SDF-1 humano;

A Fig. 11 mostra o resultado de uma análise de ligação do ap- tâmero 192-A10-001 de ligação de SDF-1 humano a d-SDF-1 humano bioti- nilado 37°C, representado como ligação do aptâmero sobre concentração de d-SDF-1 humano biotinilado;

A Fig. 12 mostra a eficácia de Spiegelmero 192-A10-001 de li- gação de SDF-1 humano em uma prova de quimiotaxia; as células foram 5 deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmero 192-A10-001, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmero 192- A10-001;

A Fig. 13 mostra o resultado de uma análise de ligação competi- tiva dos aptâmeros de ligação de SDF-1 humano 192-A10-001, 192-F10- 001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11-001,

192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 e 192-H9-001 a d-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero marcado 192- A10-001 (usado como referência que é deslocado pelos aptâmeros não 15 marcados) a 1 nM e 5 nM de aptâmeros não marcados 192-A10-001, 192- F10-001, 192-C9-001, 192-E10-001, 192-C10-001, 192-D11-001, 192-G11- 001, 192-H11-001, 192-D10-001, 192-E9-001 e 192-H9-001;

A Fig. 14 mostra o resultado de uma análise de ligação do ap- tâmero 192-A10-008 de ligação de SDF-1 humano a d-SDF-1 humano bioti- nilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero sobre concentração de d-SDF-1 humano biotinilado;

A Fig. 15 mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando o valor Kd do Spiegelmero 192-A10-008 de ligação de SDF-1 humano ligando a SDF-1 humano o qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerFI por 25 procedimento de ligação de amina, representado como resposta (RU) sobre tempo, adicionalmente são listados as taxas ligado (on) e desligado (off) e os valores K0 dos Spiegelmeros 192-A10-008 e 192-A10-001;

A Fig. 16 mostra a eficácia de Spiegelmero 192-A10-008 de li- gação de SDF-1 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmero 192-A10-008, representadas como percentagem de controle sobre concentração do Spiegelmero 192-A10-008; A Fig. 17 mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando o valor Kd de Spiegelmero 193-G2-01 ligando a SDF-1 humano o qual foi imo- bilizado sobre um chip sensor PioneerFI por procedimento de ligação de amina, representado como resposta (RU) sobre tempo, adicionalmente as 5 taxas ligado (on) e desligado (off) e os valores K0 dos Spiegelmeros 193-G2- 001 e 193-C2-001 são listados;

A Fig. 18 mostra o resultado de uma análise de ligação do ap- tâmero 193-G2-012 anti-SDF-1 humano a d-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero sobre concentração de D- SDF-1 humano biotinilado;

A Fig. 19 mostra o resultado de uma análise de ligação competi- tiva dos aptâmeros de ligação de SDF-1 humano 190-A3-001, 190-A3-003,

190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5-003, 191-D5- 004, 191-D5-005, 191-D5-006 e 191-D5-007 a d-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero marcado 190-A3-001 ou 191- D5-001 (usado como referência que é deslocado pelos aptâmeros não mar- cados) a 500 nM, 50 nM e 10 nM de aptâmeros não marcados 190-A3-001,

190-A3-003, 190-A3-004, 190-A3-007, 191-D5-001, 191-D5-002, 191-D5- 003, 191-D5-004, 191-D5-005, 191-D5-006 e 191-D5-007;

A Fig. 20 mostra o resultado de uma análise de ligação dos ap-

tâmeros de ligação de SDF-1 humano 190-A3-004 e 191-D5-007 a d-SDF-1 humano biotinilado a 37°C, representada como ligação do aptâmero sobre concentração de d-SDF-1 humano biotinilado;

A Fig. 21 mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando o 25 valor K0 de Spiegelmero 191-D5-007 ligando a SDF-1 humano o qual foi i- mobilizado sobre um chip sensor PioneerFI por procedimento de ligação de amina, representada como resposta (RU) sobre tempo, adicionalmente as taxas ligado (on) e desligado (off) e os valores K0 dos Spiegelmeros 191-D5- 001, 191-D5-007, 190-A3-003 e 197-B2 são listados;

A Fig. 22 mostra a eficácia de Spiegelmero 190-A3-004 de liga-

ção de SDF-1 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmero 190-A3-004, representadas como per- centagem de controle sobre concentração de Spiegelmero 190-A3-004;

A Fig. 23A mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 193-G2-012-5’-PEG, 197-B2-006-5’-PEG, 191-D5-007-5’-PEG e 191- 5 A10-008-5’-PEG em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 193-G2-012-5’-PEG, 197-B2-006- 5’-PEG, 191-D5-007-5’-PEG e 191-A10-008-5’-PEG, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmeros 193-G2-012- 10 5’-PEG, 197-B2-006-5’-PEG, 191-D5-007-5’-PEG e 191-A10-008-5’-PEG;

A Fig. 23B mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 197-B2-006-5’PEG e 197-B2-006-31b-5’-PEG em uma prova de qui- miotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelme- 15 ros 197-B2-006-5’PEG e 197-B2-006-31b-5’-PEG, representadas como per- centagem de controle sobre concentração de Spiegelmeros 197-B2-006- 5’PEG e 197-Β2-Ό06-31 b-5’-PEG;

A Fig. 24A mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando os valores de K0 de Spiegelmeros 193-G2-012-5’-PEG, 191-A10-008-5’-PEG e 191-A10-001-5’-PEG ligando a SDF-1 humano o qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerFI por procedimento de ligação de amina, represen- tado como resposta (RU) sobre tempo;

A Fig. 24B mostra um sensorgrama Biacore 2000 indicando os valores de K0 de Spiegelmeros 197-B2-006-5’PEG, 197-B2-006-31b-5’-PEG e 191-D5-007-5’-PEG ligando a SDF-1 humano o qual foi imobilizado sobre um chip sensor PioneerFI por procedimento de ligação de amina, represen- tado como resposta (RU) sobre tempo;

A Fig. 25A mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-1 192-A10-001, 192-A10-001-5’-HES130 e 192-A10-001-5’-HES100 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-001-5’-HES130 e 192-A10-001-5’- HES100, representadas como percentagen de controle sobre concentração de Spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-001-5’-HES130 e 192-A10-001-5’- HES100;

A Fig. 25B mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de 5 SDF-1 192-A10-001, 192-A10-001-5’-PEG30 e 192-A10-001-5’-PEG40 em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-001-5’-PEG30 e 192-A10-001-5’- PEG40, representadas como percentagem de controle sobre concentração 10 de Spiegelmeros 192-A10-001, 192-A10-001-5’-PEG30 e 192-A10-001-5’- PEG40;

A Fig. 26 mostra a ineficácia de um Spiegelmero controle em uma prova de quimiotaxia; as células foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 humano ou murineo pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmero controle, representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmero controle;

A Fig. 27 mostra a quimiotaxia induzida por SDF-1 murino de células de leucemia de células T humanas Jurkat visto que depois de 3 ho- ras de migração de células de leucemia de células T humanas Jurkat em direção a várias concentrações de SDF-1 foi obtida uma curva de dose- resposta para SDF-1, representada como sinal de fluorescência;

A Fig. 28 mostra a eficácia de Spiegelmeros de ligação de SDF-

1 192-A10-001 e 191-D5-007-5’PEG em uma prova de quimiotaxia; as célu- las foram deixadas para migrar em direção a 0,3 nM de SDF-1 murino pré- incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 192-A10-001 e 191-D5-007-5’PEG representadas como percentagem de controle sobre concentração de Spiegelmeros 192-A10-001 e 191-D5-007-5’PEG;

A Fig. 29 mostra a eficácia de Spiegelmero 192-A10-001 de li- gação de SDF-1 em uma prova de ligação de CXCR4-receptor usando [125J]- SDF-1 □ humano que foi pré-incubado a 37°C com várias quantidades de Spiegelmeros 192-A10-001, [125J]-SDF-1 □ especificamente ligado foi plotado sobre concentração de Spiegelmero 192-A10-001; e A Fig. 30 mostra a inibição da estimulação de MAP-quinase de células expressando CXCR4 com 1 nM de SDF-1 □ humano por Spiegelme- ro 192-A10-001 de ligação de SDF-1 humano;

A Fig. 31 mostra a inibição de germinação induzida por SDF-1 5 por Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano e por Spiegelmero Controle PEGuiIado em prova de germinação do anel aórtico, por meio da qual anéis de aorta de rato foram embutidos em matriz de colá- geno e incubados por 6 dias com SDF-1 com ou sem Spiegelmeros (a: con- trole; b: 10 nM de SDF-1; c: 10 nM de SDF-1 + 1 μΜ de Spiegelmero 193- 10 G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano; d: 10 nM de SDF-1 + 1 μΜ de Spiegelmero Controle PEGuilado);

A Fig. 32 mostra a inibição de germinação induzida por SDF-1 por Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano e por Spiegelmero Controle PEGuilado em prova de germinação do anel aórtico 15 por meio da qual οέ índices de germinação são mostrados como média +/- desvio padrão para 5 anéis por condição (*: o valor para SDF-1 é significati- vamente diferente do controle (teste de Mann-Whitney; p = 0,009); **: o valor para SDF-1 + Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5’- PEG é significativamente diferente do valor para SDF-1 (teste de Mann- 20 Whitney; p = 0,028);

A Fig. 33 mostra o nível plasmático de Spiegelmero 193-G2- 012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano e de SDF-1 em ratos depois um bolo intravenoso de Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano em comparação com o nível plasmático de SDF-1 de rato que não 25 foi tratado com Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 hu- mano, por meio do qual o nível plasmático de Spiegelmero 193-G2-012-5’- PEG de ligação de SDF-1 humano e de SDF-1 foram determinados durante um período de 96 horas;

Exemplo 1: Ácidos nucléicos que ligam SDF-1 humano

Usando d-SDF-1 humano biotinilado como um alvo, vários áci-

dos nucléicos que ligam a SDF-1 humano podem ser gerados cujas seqüên- cias de nucleotídeos são representadas nas Figuras 1 a 9. Os ácidos nucléi- cos foram caracterizados no nível de aptâmero, isto é, nível de ácido nucléi- co-D com D-SDF-1 humano biotinilado ou no nível de Spiegelmero, isto é, ácido nucléico-L com a configuração natural de SDF-1 (l- SDF-1).

Aptâmeros foram analisados com D- SDF-1 humano biotinilado 5 usando provas de ligação de pull down competitiva ou direta com d-SDF-1 humano biotinilado (Exemplo 4). Spiegelmeros foram testados com a confi- guração natural de SDF-1 (l-SDF-1) por medição da ressonância de plas- mon superficial usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6) e uma prova de quimiotaxia in vitroàe cultura celular (Exemplo 5).

As moléculas de ácido nucléico produzidas deste modo apresen-

tam diferentes motivos de seqüência, três tipos principais são definidos nas Figs. 1, 2A e 2B (Tipo A), Figs. 3, 4A e 4B (Tipo B), Figs. 5, 6, 7A, 7B e 8 (Tipo C). Para definição de motivos de seqüência de nucleotídeos, são usa- das as abreviações IUPAC para nucleotídeos ambíguos:

S forte G ou C; W fraca A ou U; R purina O o C > Y pirimidina C ou U; K ceto G ou U; M imino A ou C; B não A C ou U ou G; D não C A ou G ou U; H não G A ou C ou U; V não U A ou C ou G; N todas A ou G ou C ou Caso não indicado ao contrário, qualquer seqüência de ácido nucléico ou seqüência de trechos e caixas, respectivamente, é indicada na direção 5’ 3’.

1.1 Ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A

Conforme representado na Fig. 1 todas as seqüências de ácidos

nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo a qual é flanqueada por trechos de 5’- e 3’-terminal que podem hibridizar uns com os outros. No entanto, semelhante hibridiza- ção não é necessariamente dada na molécula.

Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmero usando provas de ligação de pull down direta e competitiva com d-SDF-1 5 humano biotinilado de modo a classificar os mesmos com respeito a seu comportamento de ligação (Exemplo 4). Seqüências selecionadas foram sin- tetizadas como Spiegelmeros (Exemplo 3) e foram testadas usando a confi- guração natural de SDF-1 (L-SDF) em uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Exemplo 5) e por medição da ressonância de plasmon super- 10 ficial usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6).

As seqüências das caixas definidas ou trechos pode ser diferen- te entre os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A o que influencia a afinidade de ligação a SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferen- tes ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 resumidos como ácidos nucléicos 15 de ligação de SDF-1 do Tipo A, a seqüência de nucleotídeos de núcleo e suas seqüências de nucleotídeos conforme descrito a seguir são individual- mente e mais preferencialmente em sua totalidade essenciais para ligar a SDF-1:

A seqüência de nucleotídeos de núcleo de todas as seqüências identificadas de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A comparti-

lham a seqüência |AAAGÍRACAHGUfMAgAUGAAAGGUAl|C| (Fórmula-1 de Tipo A), por meio da qual Xa ou está ausente ou é ‘A’. Se ‘A’ está ausen- te, a seqüência da seqüência de nucleotídeos de núcleo pode ser resumida

como Fórmula-2 de Tipo A (lAAAGIRACAjGUBAAjUGAAAGGUAiCl). Aci- do nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 191-A6 (seqüência de nucleotí- deos de núcleo: lAAAGlkACApGuiAAlUGAAAGGUAlCl) carregando o nucleotídeo adicional ‘A’ dentro da seqüência de nucleotídeos de núcleo e ainda ligando a SDF-1 deixa inferir uma seqüência de nucleotídeos de nú-

_P_m m m_«■

cleo alternativa (lAAAGlRACAHGUMAAAUGAAAGGUAljCl, Fórmula-3 de Tipo A). Exemplarmente para todos os outros ácidos nucléicos de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A, o ácido nucléico 192-A10-001 de ligação de SDF-1 do Tipo A foi caracterizado por sua afinidade de ligação a SDF-1 humano. A constante de ligação de equilíbrio Kd foi determinada u- sando a prova de ligação de pull down (KD = 1,5 nM, Fig. 11) e por medição da ressonância de plasmon superficial (KD = 1,0 nM, Fig. 15). A IC5o (con- centração inibitória de 50%) de 0,12 nM para 192-A10-001 foi medida usan- 5 do uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Fig. 12). Conseqüen- temente, todos os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A conforme representado na Fig. 1 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. 192-A10-001 (Fig. 13; nem todos os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A testados são mostrados na Fig. 13). Os áci- 10 dos nucléicos 192-B11 e 192-C10 de ligação de SDF-1 do Tipo A apresenta- ram afinidades de ligação iguais a 192-A10-001 nestes experimentos de competição. Afinidade de ligação mais fraca foi determinada para ácidos nu- cléicos 192-G10, 192-F10, 192-C9, 192-E10, 192-D11, 192-G11, 192-H11 e

191-A6 de ligação de SDF-1 do Tipo A. Os ácidos nucléicos 192-D10, 192- E9 e 192-H9 de ligação de SDF-1 do Tipo A têm afinidade de ligação muito mais fraca do que 192-A10-001 (Fig. 13).

Conforme mencionado acima, o ácido nucléico 192-B11 e 192- C10 de ligação de SDF-1 do Tipo A apresemta igual afinidade de ligação a SDF-1 que 192-A10-001. No entanto, apresentam ligeiras diferenças na se- 20 qüência de nucleotídeos da seqüência de nucleotídeos de núcleo. Portanto a seqüência de consenso das três moléculas ligando a SDF-I com quase a mesma alta afinidade de pode resumida pela seqüência de nucleotídeos

AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARCI (Fórmula-4 de Tipo A) por meio da qual a seqüência de nucleotídeos da seqüência de nucleotídeos de núcleo

de 192-A10-001 (seqüência de nucleotídeos: [AAAGCAACAUGUCAAUGA-

AAGGUAGC|) representa a seqüência de nucleotídeos com a melhor afini- dade de ligação de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A.

Cinco ou seis dos seis nucleotídeos do trecho de 5’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A podem hibridizar aos cinco ou seis nucleotídeos respectivos dos seis nucleotídeos dos ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A do trecho de 3’-terminal para formar uma hé- lice de terminal. Embora estes nucleotídeos sejam variáveis em várias posi- ções, os diferentes nucleotídeos permitem hibridização de cinco ou seis dos seis nucleotídeos dos trechos de 5’- e 3’-terminal cada. Os trechos de 5’- terminal e 3’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A conforme mostrado na Fig. 1 podem ser resumidos em uma fórmula genéri- 5 ca para o trecho de 5’-terminal (‘RSHRYR’, Fórmula-5-5’ de Tipo A) e para o trecho de 3’-terminal (‘YRYDSY’, Fórmula-5-3’ de Tipo A). Derivados trunca- dos de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. A molécu- la original 192-A10-001 e 192-A10-008 (Fig. 2A e 2B). Estes experimentos 10 mostraram que uma redução dos seis nucleotídeos de terminal (extremidade 5’: GCUGUG; extremidade 3’: CGCAGC) de 192-A10-001 a cinco nucleotí- deos (extremidade 5’: CUGUG; extremidade 3’: CGCAG) do derivado 192- A10-002 pode ser feita sem redução da afinidade de ligação. No entanto, a truncação para quatro nucleotídeos terminais (extremidade 5’: UGUG; ex- 15 tremidade 3’: CGCA; 192-A10-003) ou menos (192-A10-004/ -005/ -006/ - 007) levou a afinidade de ligação reduzida para SDF-1 (Fig. 2A). Os trechos de 5’-terminal e 3’-terminal determinados com uma extensão de cinco e qua- tro nucleotídeos dos derivados de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 conforme mostrado na Figs. 2A e B podem ser descritos 20 em uma fórmula genérica para o trecho de 5’-terminal (1X2BBBS', Fórmula-6- 5’ de Tipo A) e do trecho de 3’-terminal (1SBBVX3'; Fórmula-6-3’ de Tipo A), por meio da qual X2 ou está ausente ou é ‘S’ e X3 ou está ausente ou é ‘S’.

A seqüência de nucleotídeos dos trechos de 5’- e 3’-terminal tem uma influência sobre a afinidade de ligação de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A. Isto é não somente mostrado pelos ácidos nucléicos

192-F10 e 192-E10, mas também por derivados de 192-A10-001 (Fig. 2B;). As seqüências de nucleotídeos de núcleo 192-F10 e 192-E10 são idênticas a 192-B11 e 192-C10, mas compreendem ligeiras diferenças na extremidade 3’ do trecho de 5’-terminal e na extremidade 5’ do trecho de 3’-terminal resul- tando em afinidade de ligação reduzida.

A substituição de nucleotídeos de 5’- e 3’-terminal ‘CUGUG’ e ‘CGCAG’ de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-002 por ‘GCGCG’ e ‘CGCGC’ (192-A10-015) resultou em uma reduzida afinidade de ligação ao passo que substituições por ‘GCGUG’ e ‘CGCGC’ (192-A10-008) resultou na mesma afinidade de ligação conforme mostrado para 192-A10-

002 (Fig. 2B, Fig. 15, Fig. 12, Fig. 16). Adicionalmente, nove derivados de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 (192-A10-014/ - 015/ -016/ -017/ -018/ -019/ -020/ -021/ -022/ -023) portando quatro nucleotí- deos de 5’- e 3’-terminal respectivamente foram testados como aptâmeros para sua afinidade de ligação vs. 192-A10-001 ou seu derivado 192-A10-008 (ambos têm a afinidade de ligação idêntica para SDF-1). Todos os clones apresentaram afinidade de ligação mais fraca, muito mais fraca ou muiíssi- mo mais fraca para SDF-1 que 192-A10-001 (seis nucleotídeos formando uma hélice terminal) ou como 192-A10-008 com cinco nucleotídeos termi- nais, respectivamente (Fig. 2B). Conseqüentemente, a seqüência e o núme- ro de nucleotídeos dos trechos de 5’- e 3’-terminal são essenciais para uma ligação eficaz a SDF-1. Conforme mostrado para ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-002 e 192-A10-08 a combinação preferencial de trechos de 5’-' e 3’ -terminal são ‘CUGUG’ e ‘CGCAG’ (trechos de 5’- e 3’- terminal de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-002) e ‘GCGUG’ e ‘CGCGC’ (trechos de 5’- e 3’-terminal de ácido nucléico de Iiga- ção de SDF-1 do Tipo A 192-A10-008).

No entanto, combinando os trechos de 5’- e 3’-terminal de todos os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A testados a fórmula gené- rica para o trecho de 5’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A é 1XiX2NNBV' (Fórmula-7-5’ do Tipo A) e a fórmula genérica para o 25 trecho de 3’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo A é 1BNBNX3X4' (Fórmula-7-3’ do Tipo A), ao passo que

X1 é ‘Fl’ ou está ausente , X2 é ‘S’, X3 é ‘S’ e X4 é Ύ’ ou está au- sente; ou

Xi está ausente, X2 é ‘S’ ou está ausente, X3 é ‘S’ ou está au-

sente e X4 está ausente.

1.2 Ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B Conforme representado na Fig. 3 todas as seqüências de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo a qual é flanqueada por trechos de 5’- e 3’-terminal que podem hibridizar uns aos outros. No entanto, semelhante hibridização não é necessariamente dada na molécula.

Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmeros usando provas de ligação de pull down direta e competitiva com d-SDF-1 humano biotinilado de modo a classificar os mesmos com respeito a seu comportamento de ligação (Exemplo 4). Seqüências selecionadas foram sin- 10 tetizadas como Spiegelmeros (Exemplo 3) e foram testadas usando a confi- guração natural de SDF-1 (L-SDF) em uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Exemplo 5) e por medição da ressonância de plasmon super- ficial usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6).

As seqüências das caixas ou trechos definidos podem ser dife- 15 rentes entre os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B o que influ- encia a afinidade de ligação para SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 resumidos como ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B, a seqüência de nucleotídeos de núcleo e suas seqüências de nucleotídeos conforme descrito a seguir são 20 individualmente e mais preferencialmente em sua totalidade essenciais para ligara SDF-1:

A seqüência de nucleotídeos de núcleo de todas as seqüências de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B identificadas comparti-

lham a seqüência GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG

(Fórmula-1 do Tipo B). Os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001 que diferem em uma posição da se- qüência de nucleotídeos de núcleo foram analisados em uma prova de liga- ção de pull down competitiva vs. O ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 (KD de 1,5 nM determinada em uma prova de ligação de 30 pull down [Fig. 11], K0 de 1,0 nM determinada por medição da ressonância de plasmon superficial [Fig. 15], IC50 de 0,12 nM; [Fig. 12]). Cada um dos três ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B testados apresentou ligação superior a SDF-1 humano em comparação a ácido nucléico de liga- ção de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 por meio da qual a afinidade de liga- ção de 193-G2-001 é tão boa quanto 193-C2-001 e 193-F2-001 (Fig. 3). Os dados sugerem que a diferença na seqüência de nucleotídeos da seqüência 5 de nucleotídeos de núcleo de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001, 193-C2-001 e 193-F2-001 não tem influência sobre a afinida- de de ligação a SDF-1. Exemplarmente o ácido nucléico de ligação de SDF-

1 do Tipo B 193-G2-001 foi caracterizado por sua afinidade de ligação a SDF-1 humano. A constante de ligação de equilíbrio K0 foi determinada u- sando a prova de ligação de pull down (K0 = 0,3 nM) e por medição da res- sonância de plasmon superficial (Kd = 0,5 nM, Fig. 17). A IC50 (concentração inibitória de 50%) de 0,08 nM para 193-G2-001 foi medida usando uma pro- va de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Em contraste, os ácidos nucléi- cos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-B3-002, 193-H3-002, 193-E3-002 e 193-D1-002 que diferem na seqüência da seqüência de nucleotídeos de nú- cleo têm piores propriedades de ligação (Fig. 3). Em conseqüência ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B com aprimorada afinidade de liga- ção a SDF-1 compartilham uma seqüência de nucleotídeos de núcleo com a seqüência |GUGUGAUCUAGAUGUADUGGCUGAUCCUAGUCAGG| (Fór- mula-2 do Tipo B).

Quatro, cinco ou seis nucleotídeos dos seis nucleotídeos do tre- cho de 5’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B podem hibridizar aos respectivos quatro, cinco ou seis dos seis nucleotídeos do tre- cho de 3’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B para 25 formar uma hélice terminal. Embora os nucleotídeos sejam variáveis em vá- rias posições, os diferentes nucleotídeos permitem a hibridização para qua- tro, cinco ou seis nucleotídeos dos seis nucleotídeos dos trechos de 5’- e 3’- terminal cada. Os trechos de 5’-terminal e de 3’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B conforme mostrado na Fig. 3 podem ser re- 30 sumidos em uma fórmula genérica para 0 trecho de 5’-terminal (Fórmula-3-5’ do Tipo B; 1X1GCRWG' ao passo que X1 é ‘A’ ou está ausente) e do trecho de 3’-terminal (Fórmula-3-3’ do Tipo B; 1KRYSCX41 ao passo que X4 é 1U' ou está ausente). Ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G1-002,

193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-002 têm afinidades de ligação mais fraca para SDF-1 embora partilhem a seqüência de nucleotídeos de núcleo idênti- ca (Fórmula-2 do Tipo B) com 193-C2-001, 193-G2-001 e 193-F2-001 (Fig.

3). As propriedades de ligação desfavoráveis dos ácidos nucléicos de liga- ção de SDF-1 do Tipo B 193-G1-002, 193-D2-002, 193-A1-002 e 193-D3-

002 podem ser devidas ao número de nucleotídeos e seqüência dos trechos de 5’- e 3’-terminal.

Derivados truncados dos ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 10 do Tipo B 193-G2-001 e 193-C2-001 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. 193-G2-001 e 193-G2-012, respectiva- mente (Fig. 4A e 4B). Estes experimentos mostraram que uma redução dos seis terminal nucleotídeos (extremidade 5’: AGCGUG; extremidade 3’: U- ACGCU) de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 e 15 193-C2-001 a cinco nucleotídeos (extremidade 5’: GCGUG; extremidade 3’: UACGC) leva a moléculas com afinidade de ligação similar (193-C2-002 e

193-G2-012). A constante de dissociação de equilíbrio Kd foi determinada usando a prova de ligação de pull down (KD = 0,3 nM, Fig. 18). Uma trunca- ção para quatro (extremidade 5’: CGUG; extremidade 3’: UACG; 193-C2- 20 003) ou menos nucleotídeos (193-C2-004, 193-C2-005, 193-C2-006, 193- C2-007) resultou em uma reduzida afinidade de ligação para SDF-1 a qual foi medida usando a prova de ligação de pull down de competição (Fig. 4A). A seqüência de nucleotídeos dos cinco nucleotídeos terminais na extremida- de 5’- e 3’, respectivamente, tem uma influência sobre a afinidade de ligação 25 de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B. A substituição dos nu- cleotídeos de 5’- e 3’-terminal ‘GCGUG’ e ‘UACGC’ (193-C2-002, 193-G2- 12) por ‘GCGCG’ e ‘CGCGC’ (193-G2-013) resultou em uma reduzida afini- dade de ligação. Adicionalmente, foram testados os quatro diferentes deri- vados de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 com 30 uma hélice terminal com uma extensão de quatro nucleotídeos de parea- mento de bases (193-G2-014/ -015/ -016/ -017). Todos eles apresentatam reduzida afinidade de ligação a SDF-1 (Fig. 4B). Portanto a seqüência e a extensão dos nucleotídeos de 5’- e 3’-terminal são essenciais para uma liga- ção eficaz a SDF-1. Os trechos de 5’-terminal e de 3’-terminal com uma ex- tensão de cinco e quatro nucleotídeos dos derivados de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-C2-003 e 193-G2-012 conforme mostrado 5 na Figs. 4A e 4B podem ser descritos em uma fórmula genérica para o tre- cho de 5’-terminal (‘X2SSBS’, Fórmula-4-5’ do Tipo B), por meio da qual X2 ou está ausente ou é ‘G’, e do trecho de 3’-terminal (1BVSSX3', Fórmula-4-3’ do Tipo B), e por meio da qual X3 ou está ausente ou é ‘C’. Conforme mos- trado para ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B 193-G2-001 e 10 193-C2-01 e seus derivados 193-G2-012 e 193-C2-002 a combinação prefe- rencial de trechos de 5’- e 3’-terminal são ‘X1GCGUG’ (trecho de 5’*terminal; Fórmula 5-5’ do Tipo B) e ‘UACGCX4’ (trecho de 3’-terminal; Fórmula 5-3’ do Tipo B), visto que Xi é ou ‘A’ ou está ausente e X4 é ‘U’ ou está ausente.

No entanto, combinando os trechos de 5’- e 3’-terminal de todos 15 os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B testados a fórmula gené- rica para o trecho de 5’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B é 1XiX2SVNS' (Fórmula-6-5’ do Tipo B) e a fórmula genérica para o trecho de 3’-terminal ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo B é 'BVBSX3X4 (Fórmula-6-3’ do Tipo B), ao passo que 20 X1 é ‘A’ ou está ausente, X2 é ‘G’, X3 é ‘C’ e X4 é ‘U’ ou está au-

sente;

ou X1 está ausente, X2 é ‘G’ ou está ausente, X3 é Ό’ ou ausente e X4 está ausente;

1.3 Ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C

Conforme representado na Fig. 5 todas as seqüências de ácidos

nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo a qual é flanqueada por trechos de 5’- e 3’-terminal que podem hibridizar uns aos outros. No entanto, semelhante hibridização não é necessariamente dada na molécula.

Os ácidos nucléicos foram caracterizados no nível de aptâmeros

usando provas de ligação de pull down direta e competitiva com d-SDF-1 humano biotinilado de modo a classificar os mesmos com respeito a seu comportamento de ligação (Exemplo 4). Seqüências selecionadas foram sin- tetizadas como Spiegelmeros (Exemplo 3) e foram testadas usando a confi- guração natural de SDF-1 (l-SDF) em uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Exemplo 5) e por medição da ressonância de plasmon super- ficial usando um instrumento Biacore 2000 (Exemplo 6).

As seqüências das caixas ou trechos definisod podem ser dife- rentes entre os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C o que influ- encia a afinidade de ligação a SDF-1. Com base na análise de ligação dos diferentes ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 resumida como ácidos nu- 10 cléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C, a seqüência de nucleotídeos de nú- cleo e sua seqüência de nucleotídeos conforme descrito a seguir são indivi- dualmente e mais preferencialmente em sua totalidade essenciais para ligar a SDF-1:

As seqüência de nucleotídeos de núcleo de todas as seqüências 15 identificadas de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C comparti- lham a seqüência GGUYAGGGCUHRXaAGUCGGI (Fórmula-1 do Tipo C), por meio da qual Xa ou está ausente ou é ‘A’. Com a exceção de ácido nu- cléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-D1 a seqüência de nucleotídeos de núcleo de todas as seqüências identificadas de ácidos nucléicos de Iiga- 20 cão de SDF-1 do Tipo C compartilham a seqüência de nucleotídeos |GGU-| iVAGGGCUHRAAGUCGGl (Fórmula-2 do Tipo C). Ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-D1 (seqüência de nucleotídeos de núcleo: |GGUU^

mm?

AGGGCUAA»AGUCGG|) faltando um nucleotídeo ‘A’ dentro da seqüência de nucleotídeos de núcleo e ainda ligando a SDF-1 deixa inferir uma seqüência 25 alternativa de nucleotídeos de núcleo (GGUYAGGGCUHR-AGUCGGl, Fór- mula-3 do Tipo C). Inicialmente, todos os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C conforme representado na Fig. 5 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo A 192-A10-001 (KD = 1,5 nM determinada por prova de pull 30 down e por medições da ressonância de plasmon superficial; IC50 = 0,12 nM). Os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001, 197- B2, 190-A3-001, 197-H1, 197-H3 e 197-E3 apresentaram afinidades de liga- ção mais fracas do que 192-A10-001 em experimentos de competição. Afini- dade de ligação muito mais fraca foi determinada para 191-A5, 197-B1, 197- D1, 197-H2 e 197-D2 (Fig. 5). As moléculas ou derivados das mesmas foram adicionalmente caracterizadas por provas de ligação de pull down competiti- 5 va adicionais, medições da ressonância de plasmon e uma prova de quimio- taxia in vitro. O ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 foi caracterizado por sua afinidade de ligação a SDF-1 humano ao passo que a constante de ligação de equilíbrio Kd foi determinada por medição da resso- nância de plasmon superficial (Kd = 0,8 nM, Fig. 21). A IC50 (concentração 10 inibitória de 50%) de 0,2 nM para 191-D5-001 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular. A afinidade de ligação de ácido nu- cléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2 para SDF-1 humano foi deter- minada por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 0,9 nM), sua IC50 (concentração inibitória de 50%) de 0,2 nM foi analisada em uma 15 prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Estes dados indicam que áci- dos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 e 197-B2 têm a afinidade de ligação similar a SDF-1 (Fig. 5 e 8).

Ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 190-A3-001 (48 nt) compreende um trecho de 5’-terminal de 17 nucleotídeos e um trecho de 3’-terminal de 12 nucleotídeos por meio do qual por um lado os quatro nu- cleotídeos na extremidade 5’ do trecho de 5’-terminal e os quatro nucleotí- deos na extremidade 3’ do trecho de 3’-terminal podem hibridizar uns aos outros para formar uma hélice de terminal. Alternativamente os nucleotídeos ‘UGAGA’ no trecho de 5’-terminal pode hibridizar aos nucleotídeos ‘UCUCA’ no trecho de 3’-terminal para formar uma hélice de terminal. Uma redução para oito nucleotídeos do trecho de 5’-terminal (‘GAGAUAGG’) e para nove nucleotídeos do trecho de 3’-terminal (‘CUGAUUCUC’) de molécula 190-A3- 001 (por meio da qual seis dos oito / nove nucleotídeos do trecho de 5’- e 3’- terminal podem hibridizar uns aos outros) não tem uma influência sobre a afinidade de ligação a SDF-1 (190-A3-004; Fig. 6 e Fig. 19). A constante de ligação de equilíbrio Kd od 190-A3-004 foi determinada usando a prova de ligação de pull down (Kd = 4,6 nM, Fig. 20) e por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 4,7 nM). A IC50 (concentração inibitória de 50%) de

0,1 nM para 190-A3-004 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular (Fig. 22). No entanto, a truncação a dois nucleotídeos no trecho de 5’-terminal leva a uma redução muito forte da afinidade de ligação (190-A3-007; Fig. 6 e Fig. 19).

Os ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001, 197-B2 e 197-H1 (seqüência de nucleotídeos de nú- cleo: IGGUUAGGGCUAGAAGUCGGI). 197-H3/191-A5 (seqüência de nucle- otídeos de núcleo: |GGUUAGGGCUCGAAGUCGG|) e 197-E3/197-B1 (se- 10 qüência de nucleotídeos de núcleo: IGGUUAGGGCUAGAAGUCGGI) com- partilham uma seqüência de nucleotídeos de núcleo quase idêntica (Fórmu-

^mm^

la-4 do Tipo C; seqüência de nucleotídeos: GGUUAGGGCUjtGAAGUCGG|).

191-D5-001, 197-B2 e 197-H1 não compartilham um trecho similar de 5’- e 3’-terminal (197-H3 e 197-E3 têm o trecho de 5’- e 3’-terminal idêntico a 197- B2). No entanto, o respectivos dez (197-B2, 197-E3, 197-H3) ou nove dos dez (191-D5-001, 197-H1) nucleotídeos do trecho de 5’-terminal podem hi- bridizar aos respectivos dez (197-B2, 197-E3, 197-H3) ou nove dos dez (191-D5-001, 197-H1) nucleotídeos do trecho de 3’-terminal (Fig. 5). Portan- to, o trecho de 5’-terminal dos ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197-H3 conforme mencionado acima mais 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 e 197-D2 compreendem uma seqüência de nucleotídeos genérica comum de ‘RKSBUSNVGR’ (Fórmula-5- 5’ do Tipo C). O trecho de 3’-terminal dos ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3, e 197-H3 conforme mencioado acima mais 191-A5, 197-B1, 197-H2, 197-D1 e 197-D2 compre- ende uma seqüência de nucleotídeos genérica comum de ‘YYNRCASSMY’ (Fórmula-5-3’ do Tipo C), por meio da qual os trechos de 5’ e o 3’-terminal de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197-H3 são preferenciais. Estes trechos de 5’- e 3’- terminal preferenciais de ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 197-E3 e 197-H3 podem ser resumidos na fórmula genérica ‘RKSBUGSVGR’ (Fórmula-6-5’ do Tipo C; trecho de 5’- terminal) e ‘YCNRCASSMY’ (Fórmula-6-3’ do Tipo C; trecho de 3’-terminal).

Derivados truncados de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 foram construídos e testados em uma prova de ligação de pull down competitiva vs. a molécula original 191-D5-001 (Fig. 7A, Fig. 7B 5 e Fig. 19). Primeiro a extensão dos trechos de 5’- e 3’-terminal foram encur- tadas de dez nucleotídeos (191-D5-001) cada para sete nucleotídeos cada (191-D5-004) conforme representado na Fig. 7A por meio da qual nove dos (191-D5-001) ou seis dos sete nucleotídeos (191-D5-004) do trecho de 5’- terminal e do trecho de 3’-terminal, respectivamente podem hibridizar uns 10 aos outros. A redução para sete nucleotídeos do trecho de 5’- e 3’- terminal respectivamente (ao passo que seis dos sete nucleotídeos podem hibridizar uns aos outros) levou a reduzida afinidade de ligação para SDF-1 (191-D5- 004). Os trechos terminais de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C

191-D5-004 foram modificados por meio da qual o nucleotídeo não pareand- te ‘A’ dentro do trecho de 3’-terminal de 191-D5-004 foi substituído por um ‘C’ (191-D5-005). Esta modificação levou a um aprimoramento da ligação. Este derivado, ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-005, apresentou ligação a SDF-1 similar a 191-D5-001. Truncação adicional do trecho de 5’- e 3’-terminal a cinco nucleotídeos respectivamente levou a uma molécula com uma extensão total de 29 nucleotídeos (191-D5-007). Devido às similaridades de 191-D5-001 e dos ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 197-B2, 191-D5-001, 197-H1, 191-A5, 197-H3, 197-B1, 197-E3, 197-D1, 197-H2 e 197-D2 e devido aos dados mostrados para 191-D5-007 pode-se presumir que o trecho de 5’- e de 3’-terminal pode em princípio ser truncado para baixo para cinco nucleotídeos por meio da qual a seqüência de nucleotídeos ‘CGGGA’ para o trecho de 5’-terminal e ‘UCCCG’ para o trecho de 3’-terminal foi testado com sucesso (ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-007 O+θ). Ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-007 liga surpreendentemente um tanto melhor a SDF-1 do que 191-D5-001 (determinado no nível de aptâmeros usando a prova de li- gação de competição). A constante de ligação de equilíbrio Kd de 191-D5- 007 foi determinada usando a prova de ligação de pull down (KD = 2,2 nM, Fig. 20) e por medição da ressonância de plasmon superficial (Kd = 0,8 nM, Fig. 21). A IC5O (concentração inibitória de 50%) de 0,1 nM para 191-D5-007 foi medida usando uma prova de quimiotaxia in vitro de cultura celular. Trun- cação adicional de ambos os trechos terminais para quatro nucleotídeos (191-D5-010, Fig.7A).

Derivados adicionais de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-Q01 (191-D5-017/ -024/ -029) portando trechos de 5’- e 3’- terminal de respectivamente quatro nucleotídeos também apresentaram re- duzida afinidade de ligação para SDF-1 na prova de ligação de pull down de 10 competição vs. 191-D5-007 (Fig. 7B). Trechos alternativos de 5’- e 3’- terminal com uma extensão de respectivamente cinco nucleotídeos foram adicionalmente testados, também (191-D5-017-29a, 191-D5-017-29b, 191- D5-019-29a, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b). A fórmula genérica destes derivados para o trecho de 5’-terminal é ‘XsSSSV’ (Fórmula-7-5’ do Tipo C) e 15 para o trecho 3’ é ‘BSSSXs’ Fórmula-7-3’ do Tipo C), por meio da qual Xs está ausente ou ,S’. Duas das cinco variantes testadas apresentaram idênti- ca afinidade de ligação a SDF-1 que 191-D5-007 (191-D5-024-29a, 191-D5- 024-29b; Fig. 7B). As seqüências dos trechos de 5’-terminal e 3’-terminal dos derivados 191-D5-001 que mostram a melhor afinidade de ligação a SDF-1 e 20 compreendem um trecho de 5’-terminal e 3’-terminal de cinco nucleotídeos respectivamente (191-D5-007, 191-D5-024-29a, 191-D5-024-29b) podem ser resumidas em uma fórmula genérica (trecho de 5’-terminal: ‘SGGSR’, Fór- mula-8-5’ do Tipo C; trecho de 3’-terminal: , YSCCS’, Fórmula-8-3’ do Tipo C).

Derivados truncados de ácido nucléico de ligação de SDF-1 do

Tipo C 197-B2 foram analisados em uma prova de ligação de pull down competitivo versus a molécula original 197-B2 e 191-D5-007 (Fig. 8). Usando a prova de ligação de pull down competitivo versus 191-D5-007 foi mostrado que 197-B2 tem a mesma afinidade de ligação para SDF-1 que 191-D5-007. 30 Os trechos de 5’- e 3’-terminal foram encurtados sem perda de afinidade de ligação a partir de dez nucleotídeos (197-B2) cada a cinco nucleotídeos cada (197-B2-005) por meio da qual os nucleotídeos do trecho de 5’-terminal e do trecho de 3’-terminal podem hibridisar completamente um ao outro. Se o tre- cho de 5’-terminal (‘GCGGG’) e 3’-terminal (‘CCUGC’) de 197-B2-005 foi substituído por ‘GCCGG’ (trecho de 5’-terminal) e por ‘CCGGC’ (trecho de 3’-terminal) de 197-B2-006, a afinidade de ligação a SDF-1 persistiu total- mente. Como 197-B2 e 191-D5-001 (e seus derivados) compartilham a se- qüência de nucleotídeos de núcleo idêntica (GGUUAGGGCUAGAA-j GUCGG|) e vários derivados de 191-D5 com trechos de 5’- e 3’-terminal com

uma extensão de respectivamente quatro nucleotídeos foram testados, uma truncação adicional do trecho de 5’- e 3’-terminal foi omitida. Dois derivados 10 adicionais foram designados que compreendem seis nucleotídeos na extre- midade 5’ e 3’ (trechos de 5’- e 3’-terminal) respectivamente. A afinidade de ligação a SDF-1 de ambas as moléculas (197-B2-006-31a e 197-B2-006- 31b) é a mesma que mostrado para 191-D5-007 e 197-B2-006 (Fig. 8). As seqüências dos trechos de 5’-terminal e 3’-terminal de 197-B2 derivados que 15 mostram a melhor afinidade de ligação para SDF-1 e compreendem um tre- cho de 5’-terminal e 3’-terminal de cinco nucleotídeos respectivamente po- dem ser resumidas em uma fórmula genérica (trecho de 5’-terminal: ‘GCSGG’, Fórmula-9-5’ Tipo C; trecho de 3’-terminal: ,CCKGC’, Fórmula-9-3’ Tipo C).

Combinando os trechos 5’ e 3’ de derivados truncados de ácidos

nucléicos de ligação de SDF-1 do Tipo C 191-D5-001 (trecho de 5’-terminal: ‘SGGSR’, Fórmula-8-5’ Tipo C; trecho de 3’-terminal: ,YSCCS’, Fórmula-8-3’ Tipo C) e 197-B2 (trecho de 5’-terminal: ‘GCSGG’, Fórmula-9-5’ Tipo C; tre- cho de 3’-terminal: ,CCKGC’, Fórmula-9-3’ Tipo C) a fórmula genérica prefe- 25 rencial comum para o trecho de 5’-terminal e o 3’-terminal é ‘SSSSR’ (trecho de 5’-terminal, Fórmula-10-5’ Tipo C) e ‘YSBSS’ (trecho de 3’-terminal: Fór- mula-10-3’ Tipo C).

1.4 ácidos nucléicos de ligação de SDF-1 adicionais

Adicionalmente, foram identificados três ácidos nucléicos de Ii- gação de SDF-1 adicionais que não compartilham os motivos de ligação de SDF-1 de ‘Tipo A’, ‘Tipo B’ e ‘Tipo C’. Eles foram analisados como aptâme- ros usando a prova de ligação de pull down (Fig. 9). Deve ser entendido que quaisquer das seqüências mostradas nas Figs. 1 a 9 são ácidos nucléicos de acordo com a presente invenção, incluindo as formas truncadas das mesmas m as também incluindo as for- mas estendidas das mesmas com a condição, no entanto, de que as molé- 5 cuias de ácido nucléico deste modo truncadas e estendidas, respectivamen- te, ainda são capazes de ligar ao alvo.

Exemplo 2: 40kda-PEG e outra Modificação de Spiegelmeros ligado SDF

De modo a prolongar a duração da permanência plasmática de 10 Spiegelmeros in vivo, os Spiegelmeros 193-G2-012, 192-A10-008, 191-D5- 007, 197-B2-006 e 197-B2-006-31 b foram ligados de modo covalente a uma porção de 40 kDa de polietileno glicol (PEG) na extremidade 5’ conforme descrito no capítulo 3 (clones PEGuilados: 193-G2-012-5’-PEG, 192-A10- 008-5’PEG, 191 -D5-007-5’PEG, 197-B2-006-5’PEG e 197-B2-006-31b- 15 5’PEG).

As moléculas de Spiegelmeros PEGuilados foram analisadas em uma prova TAX de cultura celular in vitro (Capítulo 5) e por medições da res- sonância de plasmon usando um Biacore (Capítulo 6). Todos os Spiegelme- ros modificados com 40 kDa-PEG ainda são capazes de inibir quimiotaxia 20 induzida por SDF-1 e ligar a SDF-1 em baixa faixa nanomolar (Fig. 23A, 23B, 24A e Fig. 24B).

Adicionalmente, Spiegelmero 192-A10-001 ligando SDF foi mo- dificado com 40kDa-PEG, 30 kDa-PEG, IOOkDa-HES ou 130 kDa-HES (clo- nes PEGuilados: 192-A10-001-5’PEG40, 192-A10-001-5’PEG30, 192-A10- 25 001-5’HES100, 192-A10-001-5’HES130; procedimento de ligação no capítu- lo 3). Conforme representado na Fig. 25A e na Fig. 25B nem uma porção PEG ou uma porção HES tem uma influência sobre a potência de Spiegel- meros para inibir quimiotaxia induzida por SDF-1.

Exemplo 3: Síntese e derivação de Aptâmeros e Spiegelmeros 3.1 SÍNTESE EM PEQUENA ESCALA

Aptâmeros e Spiegelmeros foram produzidos por síntese de fase sólida com um sintetizador ABI 394 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) usando química de fosforamidita de 2’TBDMS RNA (Damha and Ogil- vie, 1993). rA(N-Bz)-, rC(Ac)-, rG(N-ibu)-, e rU- fosforamiditas na configura- ção D- e L- foram adquiridas da ChemGenes1 Wilmington, MA. Aptâmeros e Spiegelmeros foram purificados por eletroforese de gel.

3.2 SÍNTESE EM LARGA ESCALA MAIS MODIFICAÇÃO

Os Spiegelmeros foram produzidos por síntese de fase sólida com um sintetizador AktaPiIotIOO (Amersham Biosciences; General Electric Healthcare, Freiburg) usando química de fosforamidita de 2’TBDMS RNA (Damha and Ogilvie, 1993). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, e L-rU- fosfo- 10 ramiditas foram adquiridas da ChemGenes (Wilmington, MA, EUA). O 5’- amino-modificador foi adquirido da American International Chemicals Inc. (Framingham, MA, EUA). A síntese dos Spiegelmeros foi iniciada sobre L- riboG; L-riboC, L-riboA, L-riboU respectivamente modificou CPG tamanho de poro de 1000 Á (Link Technology, Glasgow, Reino Unido). Para acoplamento 15 (15 min por ciclo), 0,3 M de benziltiotetrazol (American International Chemi- cals Inc., Framingham, MA, EUA) em acetonitrilo, e 3,5 equivalentes da so- lução respectiva'a 0,2 M de fosforamidita em acetonitrilo foi usado. Foi usa- do um ciclo de capeamento de oxidação. Solventes e reagentes de rotina para síntese de oligonucleotídeo foram adquiridos da Biosolve (Valkenswa- 20 ard, Países Baixos). Os Spiegelmeros foram sintetizados DMT-ON; depois de desproteção, foi purificado através de RP-HPLC do preparativo (Wincott F. et aí., 1995) usando meio Sourcel 5RPC (Amersham). O grupo 5’DMT foi removido com 80% de ácido acético (90 min em temperatura ambiente). Subseqüentemente, solução aquosa a 2 M de NaOAc foi adicionada e o 25 Spiegelmero foi dessalgado por filtração de fluxo tangencial usando uma membrana de celulose regenerada 5 K (Millipore, Bedford, MA).

3.3 PEGUILAÇÃO

De modo a prolongar a duração da permanência plasmática dos Spiegelmeros in vivo, os Spiegelmeros foram acoplados de modo covalente a uma porção de 40 kDa de polietileno glicol (PEG) na extremidade 5’.

Para PEGuilação (para detalhes técnicos do método para PE- Guilação vide o requerimento de patente Européia No. EP 1 306 382), os Spiegelmeros 5’-amino modificados purificados foram dissolvidos em uma mistura de H2O (2,5 ml), DMF (5 ml), e tampão A (5 ml; preparado misturan- do ácido cítrico · H2O [7 g], ácido bórico [3,54 g], ácido fosfórico [2,26 ml], e 1 M de NaOH [343 ml] e adicionando água para um volume final de 1 I; pH = 8.4 foi ajustado com 1 M de HCI).

O pH da solução de Spiegelmero foi trazido para 8.4 com 1 M de NaOH. Em seguida, 40 kDa de PEG-NHS éster (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL) foi adicionado a 37°C a cada 30 min em seis porções de 0,25 equivalentes até uma produção máxima de 75 a 85% ser atingida. O pH da 10 mistura da reação foi mantido a 8 a 8.5 com 1 M de NaOH durante adição do PEG-NHS éster.

A mistura da reação foi combinada com 4 ml de solução de uréia (8 M), , e 4 ml de tampão B (0,1 M de acetato de trietilamônio em H2O) e a- quecida até 95°C por 15 min. O Spiegelmero PEGuilado foi em seguida puri- 15 ficado por RP-HPLC com meio Source 15RPC (Amersham), usando um gra- diente de acetonitrilo (tampão B; tampão C: 0,1 M de acetato de trietilamônio em acetonitrilo). Excesso de PEG elutriou a 5% de tampão C, Spiegelmero PEGuilado a 10 a 15% de tampão C. Frações de produto com uma pureza de >95% (conforme avaliado por HPLC) foram combinadas e misturadas 20 com 40 ml de NaOAC a 3 M. O Spiegelmero PEGuilado foi dessalgado por filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada 5 K, Millipo- re, Bedford MA).

3.4 HESilação

De modo a prolongar a duração da permanência plasmática de Spiegelmeros in vivo, os Spiegelmeros foram acoplados de modo covalente a Hidroxil Etil Amido (HES) de vários pesos moleculares de >130 kDa e grau de substituição >0,5. A extremidade 5’ do Spiegelmero é o sítio preferencial para conjugação.

Para HESilação (para detalhes técnicos do método para Hesila- ção de ácidos nucléicos vide o requerimento de patente alemã No. German Offenlegungsschrift DE 101 12 825 A1, e para D/L-ácidos nucléicos vide o requerimento de patente internacional No. PCT WO 02/080979 A2), o Spie- gelmero 5’-amino modificado purificado foi dissolvido em bicarbonato de só- dio (0,3 M, 1 ml) e o pH é ajustado para 8.5.

Em respeito ao Spiegelmero, um excesso de 5 vezes do ácido HES livre (3,3 mmol, Supramol, Rosbach, Alemanha) e di(N-succinimidil) 5 carbonato (3,3 mmol) foram adicionados a N,N-dimetilformamida (1 ml) para produzir uma solução do éster de N-hidroxissuccimida ativado de HES. Para dissolver todos os reagentes a mistura foi agitada brevemente a 60°C, resfri- ada até 25 0C e em seguida agitada por 1,5 h a 25 °C. A solução de Spie- gelmero foi adicionada à solução de HES ativado, e a mistura resultante foi 10 agitada a 25°C e pH 8.5. A reação foi monitorada por IEX-HPLC analítica. Tipicamente a conjugação prosseguiu até >75 % dentro de 1 hora.

Para purificação por IEX-HPLC através de meio Source 15Q (GE, Freiburg, Alemanha) A mistura da reação foi combinada com uma quantidade de 10 vezes de tampão A (1 mM de EDTA, 25 mM de Tris, 10 15 mM de NaCI04 em água / acetonitrilo a 9:1, pH 4). Excesso de HES elutria a 5% de tampão A (1 mM de EDTA, 25 mM de Tris, 500 mM de NaCI04 em água / acetonitrilo a 9:1, pH 4), ao passo que o conjugado HES-SpiegeImero elutria a 20 a 30% de tampão B. Frações de produto com uma pureza de >95% (conforme avaliado por HPLC) foram combinadas e dessalgadas por 20 filtração de fluxo tangencial (membrana de celulose regenerada 5 K, Millipo- re, Bedford MA).

Exemplo 4: Determinação de constantes de ligação (Prova de ligação de pull down)

4.1 Prova de ligação de pull down direta

A afinidade de aptâmeros para d-SDF-1 humano biotinilado foi

medida em um formato de prova de ligação de pull down a 37°C. Aptâmeros foram marcados com 5’-fosfato por T4 polinucleotídeo quinase (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) usando ATP marcada com [γ-32Ρ] (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemanha). A radioatividade específica de aptâmeros marca- 30 dos foi 200.000 a 800.000 cpm/pmol. Aptâmeros foram incubados depois de desnaturação e renaturação em concentração de 10, 20, 30 ou 40 pM a 37°C em tampão de seleção (20 mM de Tris-HCI pH 7.4; 137 mM de NaCI; 5 mM de KCI; 1 mM de MgCI2; 1 mM de CaCI2; 0,1% [peso/ vol] de Tween-20) junto com quantidades variáveis de d-SDF-1 humano biotinilado por 4 a 12 horas de modo a atingir equilíbrio em baixas concentrações. Tampão de se- leção foi suplementado com 10 pg/ml de albumina sérica humana (Sigma- 5 Aldrich, Steinheim, Alemanha), e 10 pg/ml de RNA de levedura (Ambion, Austin, EUA) de modo a prevenir adsorção de parceiros de ligação com su- perfícies de plasticware usadas ou a matriz de imobilização. A faixa de con- centração de d-SDF-1 humano biotinilado foi ajustada de 8 pM a 100 nM; o volume total da reação foi de 1 ml. Peptídeo e complexos de peptídeo- 10 aptâmero foram imobilizados sobre 1,5 μΙ de partículas Streptavidin Ultralink Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, EUA) as quais tinham sido pré- equilibradas com tampão de seleção e ressuspendidas em um volume total de 6 μΙ. As partículas foram mantidas em suspensão por 30 min na tempera- tura respectiva em um termomisturador (thermomixer). A radioatividade ίππο- ι 5 bilizada foi quantificada em um contador de cintilação depois de destacar o sobrenadante e apropriada lavagem. A percentagem de ligação foi plotada contra a concentração de d-SDF-1 humano biotinilado e foram obtidas cons- tantes de dissociação usando algoritmos do programa (GRAFIT; Erithacus Software; Surrey, Reino Unido) presumindo uma estequiometria de 1:1.

4.2 Prova de ligação de pull down competitiva

De modo a comparar diferentes aptâmeros de ligação de d-SDF-

1, foi realizada uma prova de classificação competitiva. Para esta finalidade

o aptâmero mais affine disponível foi marcado radioativamente (vide acima) e serviu como referência. Depois de desnaturação e renaturação foi incuba- 25 do a 37°C com d-SDF-1 humano biotinilado em 1 ml de tampão de seleção em condições que resultaram em torno de 5 a 10 % de ligação ao peptídeo depois de imobilização e lavagem sobre agarose NeutrAvidin ou Streptavidin Ultralink Plus (ambos da Pierce) sem competição. Um excesso de variantes de aptâmero de D-RNA não marcado desnaturado e renaturado foi adiciona- 30 do a diferentes concentrações (por exemplo, 2, 10, e 50 nM) com o aptâme- ro de referência marcado para reações de ligação paralela. O aptâmeros a ser testado competiu com o aptâmero de referência para ligação alvo, deste modo diminuindo o sinal de ligação em dependência de suas características de ligação. O aptâmero que foi considerado mais ativo neste teste pode en- tão servir como uma nova referência para análise comparativa de variantes de aptâmeros adicionais.

Exemplo 5: Análise da inibição de quimiotaxia induzida por SDF-1 por Spiegelmeros de ligação de SDF-1

Células de leucemia de células T humanas Jurkat (obtidas da DSMZ, Braunschweig) foram cultivadas a 37°C e 5% de CO2 em meio RPMI 1640 com Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) o qual contém 10% 10 de soro bovio fetal, 100 unidades/ml de penicilina e 100 pg/ml de estrepto- micina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Um dia antes do experimento, as células foram semeadas em um novo frasco com uma densidade de 0,3 x 106/ml (9 x 106/30 ml) em meio de rotina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha).

Para o experimento, as células foram centrifugadas (5 min a 15 300g ), ressuspendidas, contadas e lavadas uma vez com 15 ml de HBH (solução salina balanceada de Hanks contendo 1 mg/ml de albumina sérica bovina e 20 mM' de HEPES; Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). Em seguida as células foram ressuspendidas a 3 x 106/ml ou 1,33 x 106/ml, dependendo do tipo de placa de filtro usada. Em seguida as células foram deixadas para 20 migrar através das membranas porosas das placas de filtro por várias horas para uma solução contendo SDF-1 e várias quantidades de Spiegelmero. Foram usados ou placas Transwell e insertos com membrana de Policarbo- nato porosa, tamanho de poro de 5 pm (Corning; 3421) ou placas MuItiScre- en MIC (Millipore, MAMIC5S10).

5.1 Protocolo para placas Transwell

As soluções de estimulação (SDF-1 + várias concentrações de Spiegelmero) foram preparadas em 600 μΙ de HBH nos compartimentos infe- riores das placas Transwell e incubadas por 20 a 30 min. Todas as condi- ções foram dispostas no mínimo duas vezes. Os insertos foram transferidos 30 para as cavidades contendo as soluções de estimulação e 100 μΙ de uma suspensão celular com 3 x 106/ml foram adiiconadas aos insertos (3 x 105 células/ cavidade). Em seguida as células foram deixadas para migrar por 3 h a 37°C.

Depois disso, os insertos foram removidos e 60 μΙ de solução de trabalho de resazurin (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) (440 μΜ em PBS; Biochrom, Berlin, Alemanha) foram adicionados às cavidades (também a cavidades de calibração). As placas em seguida foram incubadas a 37°C por

2,5 a 3 h. Depois de incubação, 200 μΙ de cada cavidade foram transferidos para uma placa de 96 cavidades preta. Foi feita medição dos sinais de fluo- rescência a 544 nm (excitação) e 590 nm (emissão) em uma leitora de lâmi- nas de multidetecção Fluostar Optima (BMG, Offenburg, Alemanha).

5.2 Protocolo para lâminas Millipore MuItiScreen

As soluções de estimulação (SDF-1 + várias concentrações de Spiegelmero) foram preparadas como 10X soluções em uma lâmina de 96 tubos de 0,2 ml de perfil baixo. 135 μΙ de HBH foram pipetados para dentro dos compartimentos inferiores da lâmina MuItiScreen e foram adicionados 15 15 μΙ das soluções de estimulação. All condições were made up como triplica- tes. Depois de 20 a 30 min a placa de filtro foi inserida na placa contendo as soluções de estimulação e 75 μΙ de uma suspensão celular com 1,33 x 106/ml foram adicionados às cavidades da placa de filtro (1 x 105 células/ cavidade). As células foram em seguida deixadas para migrar por 3 h a 20 37°C.

Depois disso, a lâmina do inserto é removida e 20 μΙ de solução de trabalho de resazurin (440 μΜ em PBS) são adicionados às cavidades inferiores. As lâminas foram em seguida incubadas a 37°C por 2,5 a 3 horas.

Depois de incubação, 100 μΙ de cada cavidade foram transferi- das para uma lâmina de 96 cavidades preta. Foi realizada medição dos si- nais de fluorescência conforme descrito acima.

5.3 Avaliação

Para avaliação, valores de fluorescência foram corrigidos para fluorescência de fundo (sem células na cavidade). Em seguida foi calculada a diferença entre condições experimentais com e sem SDF-1. O valor para a amostra sem Spiegelmero (SDF-1 somente) foi determinado 100% e os valo- res para as amostras com Spiegelmero foram calculados como percentagem disto. Para uma curva de dose-resposta os valores de percentagem foram plotados contra concentração de Spiegelmero e o valor da IC50 (concentra- ção de Spiegelmero na qual está presente 50% da atividade sem Spiegelme- ro) foi determinado graficamente a partir da curva resultante.

5.4 Resultados

5.4.1 Estimulação dose dependente de células por SDF-1 humano

Foi visto que SDF-1 humano estimula a migração de células Jur- kat em uma maneira dose dependente, com estimulação meia-máxima a cerca de 0,3 nM (Fig. 11).

5.4.2 Inibição dose dependente de quimiotaxia induzida por SDF-1 humano por Spieoelmeros de ligação de SDF-1

Quando as células foram deixadas para migrar para uma solu- ção contendo SDF-1 humano mais concentrações crescentes de Spiegelme- ros de ligação de SDF-1, foi observada inibição dose-dependente. As IC50s 15 respectivas dos Spiegelmeros testados são especificadas no Exemplo 1. Quando foi usado um Spiegelmero Controle inespecífico ao invés de Spie- gelmeros de ligação de SDF-1, não foi observado efeito inibitório até 1 μΜ (Fig. 26).

5.4.3 Inibição dose dependente de quimiotaxia induzida por SDF-1 de ca- mundonqo. por Spieaelmeros ligando SDF-1

SDF-1 é bem conservado entre as espécies: SDF-1 de camun- dongo difere de SDF-Ia humano em um aminoácido (isoleucina na posição 18 ao invés de valina). SDF-1 murino pode estimular quimiotaxia de células Jurkat (Fig. 27) e foi visto que esta ação é inibida por Spiegelmeros 192- 25 A10-001 e 191-D5-007-5’-PEG com a mesma potência como no caso de SDF-1 humano (Fig. 28).

Exemplo 6: Análise de Ligação por Medição da Ressonância de Plas- mon Superficial

O instrumento Biacore 2000 (Biacore AB1 Uppsala, Suécia) foi usado para analisar a ligação de Spiegelmeros a SDF-1 □ humano. Quando a ligação de SDF-1 çdevia ser obtida através de grupamentos amina, SDF-

1 pfoi dialisado contra água por 1 a 2 horas (Millipore VSWP ésteres celuló- sicos mistos; tamanho de poro, 0,025 μΜ) para remover aminas interferen- tes. Chips sensores CM4 (Biacore AB, Uppsala, Suécia) foram ativados an- tes de ligação de proteína por uma injeção de 35 μΙ de uma diluição a 1:1 de NHS a 0,4 M e EDC a 0,1 M em um fluxo de 5 μΙ/min. Quimocina foi em se- guida injetada em concentrações de 0,1 a 1,5 μg/ml em um fluxo de 2 μΙ/min até a resposta do instrumento estar na faixa de 1000 a 2000 RU (unidades relativas). Esteres de NHS não reagidos foram desativados por injeção de 35 μΙ de solução de cloridreto de etanolamina (pH 8.5) em um fluxo de 5 μΙ/min. O chip sensor foi primed duas vezes com tampão de ligação e equilibrado a 10 μΙ/min por 1 a 2 horas atá a linha basal parecer estável. Para todas as protepubas, parâmetros cinéticos e constantes de dissociação foram avalia- dos por uma série de injeções de Spiegelmero em concentrações de 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, e 0 nM em tampão de seleção (Tris-HCI, 20 mM; NaCI, 137 mM; KCI, 5 mM; CaCI2, 1 mM; MgCI2, 1 mM; Tween20, 0,1% [pe- so/ vol]; pH 7.4). Em todos os experimentos, a análise foi realizada a 37°C usando o comando Kinject definindo um tempo de associação de 180 e um tempo de dissociação de 360 segundos em um fluxo de 10 μΙ/min. Foi feita análise dos dados e cálculo das constantes de dissociação (K0) com o soft- ware BIAevaIuation 3.0 (BIACORE AB, Uppsala, Suécia) usando o algoritmo de ajustamento estequiométrico de Langmuir a 1:1.

Exemplo 7: Inibição, de ligàção de [125J]-SDF-1 a células expressando CXCR4, por Spiegelmeros de ligação de SDF-1

7.1 Método

Um clone de cDNA codificando para CXCR4-receptor humano 25 (NM_003467.2) foi adquirido da OriGene Technologies (Rockville, MD) e clonado no pCR3.1-vector (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha). O vetor resul- tante foi transfectado em células CHO-K1 (DSMZ, Braunschweig1 Alemanha) usando Lipofectamin 2000 (Invitrogen) e linhagens celulares de expressão estável foram selecionadas por tratamento com geneticina. A expressão de 30 receptores foi verificada por RT-PCR.

Para provas de ligação células expressando CXCR4 foram se- meadas em lâminas de 24 cavidades revestidas com polilisina em uma den- sidade celular de 1 x 105 células/ cavidade e cultivadas de um dia para o ou- tro a 37°C e 5% de CO2 em meio CHO-UItra (Cambrex, Verviers, Bélgica) contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina e 0.5 mg/ml de geneticina.

Para 0 experimento de ligação, 0 meio foi removido e as células

foram lavadas uma vez com solução salina balanceada de Hanks, contendo adicionalmente 20 mM de HEPES, 1 mg/ml de albumina sérica bovina, 0,1 mg/ml de bacitracin (HBB). Em seguida as células foram incubadas em 0,2 ml de HBB por 1 h em temperatura ambiente junto com 50 pM de [125JJ-SDF- 10 1 (PerkinElmer, Rodgau, Alemanha) e concentrações variáveis de Spiegel- mero.

Lgação não-específica foi determinada adicionando SDF-1 hu- mano não marcado (R & D Systems, Wiesbaden, Alemanha) para uma con- centração final de 0,5 μΜ a várias cavidades.

Depois do período de incubação o sobrenadante foi removido e

as cavidades foram lavadas 3 vezes com HBB gelado. Depois disso as célu- las foram Iisadas com 0,1 ml de NaOH a 0,1 M. Os Iisados foram transferi- dos para frascos de cintilação e depois da adição de 4 ml de coquetel de cintilação Unisafe 1 Liquid Szintillation (Zinsser, Frankfurt, Alemanha) foram contados em um contador de cintilação Beckman LS6500.

Como os valores para ligação não-específica (ligação na pre- sença de quantidade elevada de SDF-1 não marcado) foram um tanto maio- res do que os valores para ligação total na presença de altas concentrações (500 pM) de Spiegelmero, a diferença entre ligação máxima ("max") e Iiga- 25 ção na presença de 500 pM de Spiegelmero foi usada para cálculo dos valo- res da IC50·

7.2 Resultados

Plotagem de [125J]-SDF-1 ligado contra concentração de Spie- gelmeros revelou que a ligação de SDF-1 pode ser bloqueada por Spiegel- mero 192-A10-001 com uma IC5o de cerca de 60 pM (Fig. 29).

Exemplo 8: Inibição, de ativação de MAP-quinase induzida por SDF-1, por Spiegelmeros de ligação de SDF-1 8.1 Método

Células CHO expressando CXCR4 foram semeadas em lâminas de 6 cavidades em uma densidade de 0,5 x 106 células/ cavidade e cultiva- das por cerca de três horas a 37°C e 5% de CO2 em meio CHO-UItra (Cam- brex, Verviers, Bélgica) contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 μς/ιηΙ de estreptomicina e 0,5 mg/ml de geneticina. Depois de fixação celular o meio foi removido e substituído por meio F12 de Ham contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina. Em seguida as células foram incuba- das de um dia para o outro a 37°C e 5% de CO2. Três horas antes da esti- mulação o meio foi substituído mais uma vez por meio fresco F12 de Ham. As células foram estimuladas com 1 nM de SDF-1 humano e várias quanti- dades de Spiegelmero por 5 ou 10 minutos. Depois disso o meio foi removi- do e as células foram rapidamente lavadas uma vez com 1 ml de salina tam- ponada com fosfato gelada (PBS), seguida por Iise com tampão de amostra SDS (Tris/HCI, pH 6.8, 62,5 mM; glicerol, 10%; SDS, 2%; azul bromofenol, 0,01 %; beta-mercaptoetanol, 5%). 1 μΙ de 0,5 u/μΙ de Benzonase (Merck, Darmstadt, Alemanha) foi adicionado a cada cavidade e depois de incuba- ção por 5 a 10 min em temperatura ambiente, os Iisados foram transferidos para tubos Eppendorf, incubados a 95°C por 5 min e armazenados a-20°C até análise posterior.

25 μΙ dos Iisados foram separados sobre 10% de géis de SDS- poliacrilamida desnaturante. Em seguida as proteínas foram transferidas por electroblotting sobre membranas de nitrocelulose HybondECL (Amer- sham/GE Healthcare, Munich, Alemanha). Depois de blotting, as membranas 25 foram coradas com vermelho de Ponceau (0,2% em 3% de ácido tricloroacé- tico) para controle da carga protéica e transferência e em seguida bloquea- das por incubação em TBS-T (salina Tris-tamponada (20 mM de Tris/HCI, pH 7.6, 137 mM de NaCI) com 0,1% de Tween 20) contendo 10% de leite em pó sem gordura a 2 a 8°C de um dia para o outro.

Em seguida a membrana foi incubada com um anticorpo anti-

Fosfo-MAP-quinase de coelho (1:1000 em 10% de leite em TBS-T) por 2 h em temperatura ambiente. Depois de lavar três vezes por 5 min com TBS-T, a membrana foi incubada com anti-coelho-lgG-HRP-conjugado (1:2000 em 10% de leite em TBS-T) por 1 h em temperatura ambiente. Em seguida a membrana foi novamente lavada três vezes por 5 min com TBS-T, seguida por incubação por 1 min em reagente quimiluminescente LumiGIop. A Iumi- 5 nescência foi detectada por exposição a filmes de quimiluminescência Hy- perfilm™ECL (Amersham/GE Healthcare) por 30 segundos a 2 minutos. Os anticorpos e o reagente de detecção de luminescência foram componentes do kit PhosphoPIus p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204) Antibody da Cell Signaling Technology (New England Biolabs, Frankfurt a.M., Alemanha).

8.2 Resultados

Estimulação de células expressando CXCR4 com 1 nM de SDF- 1 humano por 5 min levou a uma profunda estimulação de MAP-quinase, indicada por um aumento na intensidade da banda refletindo MAP-quinase ativada. Esta ativação de MAP-quinase pode ser inibida de modo dose- dependente pelo Spiegelmero 191-A10-001 (Fig. 30).

Exemplo 9: Análise funcional de Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano em uma prova de germinação de anel aórtico Para testar se Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano é funcional também em uma prova de cultura de orgãos de angiogênese de rotina, foram realizadas provas de germinação de anel aór- tico. Esta prova, na qual são avaliadas a extensão e a abundância de exten- sões semelhantes a vaso dos explantes, se tornou o modelo de cultura de órgãos mais amplamente usado para angiogênese (Auerbach et al. 2003). Já foi mostrado que SDF-1 induz germinação neste tipo de prova (Salcedo et al. 1999).

Aortas de ratos foram cortadas em anéis, embutidas em uma matriz de colágeni e incubadas com SDF-1 e SDF-1 mais Spiegelmero 193- G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano ou SDF mais um Spiegelmero Controle PEGuiIado não-funcional que não liga SDF-1. Depois de 6 a 7 dias, 30 a germinação (isto é, desenvolvimento de células endoteliais) foi analisada tirando fotografias e determinando um índice de germinação.

Método Aortas de ratos machos foram obtidas da Bagheri Life sciences (Berlin, Alemanha). As aortas foram preparadas recentemente e transporta- das sobre gelo em meio MCDB 131-Medium (Invitrogen, Karlsruhe, Alema- nha) contendo 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina 5 (ambas da Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e 2,5 pg/ml de fungizona (Cam- brex, EUA).

Para um experimento uma única aorta fiu transferida para uma placa de cultura celular junto com o meio e foi removido tecido conjuntivo residual. Em seguida a aorta foi cortada com um bisturi em anéis de cerca de 1 a 2 mm de extensão. Os anéis foram lavados intensivamente (no míni- mo cinco vezes) em meio Medium 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e em seguida colocados dentro de cavidades de uma lâmina de 24 cavidades, contendo 450 μΙ de solução de colágeno por cavidade. Esta solução de co- lágeno foi preparada misturando 9 ml de colágeno da cauda de rato (3 mg/ml em 0,1% de ácido acético; Sigma, Deisenhofen, Alemanha) com 1,12 ml de 10X Medium 199 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha), 1,12 ml de 10X tampão de Colágeno (0,05 N de NaOH, 200 mM de HEPES, 260 mM de NaHCOe) e 0,6 ml de Glutamina a 200 mM. Os anéis foram orientados de tal modo que as bordas equilibradas ficassem perpendiculares ao fundo da cavidade. O colágeno foi deixado para solidificar incubando as lâminas por no mínimo uma hora a 37°C. Depois disso 1 ml de meio MCDB131 com adições (SDF-1 e Spiegelmeros) foi acrescentado por cavidade. Em seguida os anéis foram incubados a 37°C por seis a sete dias. Como controle para germinação os experimentos foram feitos adicionalmente com VEGF (Fator de crescimento endotelial vascular).

A germinação foi documentada tirando fotografias com uma câ- mera digital. Em alguns casos anéis foram fixados por adição de 1 ml de pa- raformaldeído a 10% e armazenados em 2 a 8°C para documentação poste- rior. As fotos foram analisadas com o software de processamento de ima- 30 gens Scion Image. Depois de calibração com o auxílio de uma foto tirada de um micrômetro de estágio, uma linha foi desenhada em uma distância de 0,33 mm de uma borda de um anel. Um gráfico de histograma ao longo des- ta linha foi gerada pelo software, histogramas foram impressos e picos (re- presentando germinações cruzando a linha) foram contados. Este número foi tomado como índice de germinação. Foram avaliados 4 a 5 anéis por condi- ção. Foi realizada análise estatística com WinSTAT for Excel.

Resultados

Pode ser demonstrado que SDF-1 induz germinação e que este efeito pode ser bloqueado com Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano. Não foi observado bloqueio de germinação induzida por SDF-1 pelo Spiegelmero Controle PEGuiIado não-funcional (Figs. 31 e 32).

Exemplo 10:Nível plasmático de SDF-1 e Spiegelmero 193-G2-012-5’- PEG de ligação de SDF-1 humano administrado a ratos como bolo in- travenoso único de Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF- 1 humano

Para testar se o Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193- 15 G2-012-5’-PEG é funcional in vivo, Spiegelmero de ligação de SDF-1 huma- no 193-G2-012-5’-PEG foi administrado em ratos como um bolo intravenoso e o nível plasmático de Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2- 012-5’-PEG e de SDF-1 foram determinados. Como controle foram determi- nados os níveis plasmáticos de SDF-1 de ratos não tratados.

Animais, administração e coleta de amostra

Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano foi dissolvido em PBS para uma concentração final de 0,5 mg/ml e filtrado estéril. Ratos machos Sprague Dawley (peso de aproximadamente 300 g) foram administrados com 1,0 mg/kg de Spiegelmero de ligação de SDF-1 25 humano 193-G2-012-5’-PEG como bolo intravenoso único. Amostras de sangue foram coletadas em vários pontos de tempo (conforme mostrado na Fig. 33) para seguir o clearance plasmático de Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5’-PEG.

Prova de hibridização de sanduíche para quantificação de Spiegelmero

A quantidade de Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-

G2-012-5’-PEG nas amostras foi quantificada por uma prova de hibridização de sanduíche. O princípio da prova de hibridização de sanduíche é bastante similiar a um ELISA comumente usado (Ensaio Imunossorvente ligado a En- zima): imobilização e detecção do Spiegelmero. A detecção se baseia na hibridização de uma sonda de detecção biotinilada a uma extremidade do Spiegelmero. A extremidade de filamento único remanescente da imobiliza- 5 ção do meio de Spiegelmero do complexo na hibridização a uma sonda de captura imobilizada. Depois de complexos não ligados terem sido removidos, a sonda de detecção hibridisada ao Spiegelmero é finalmente detectada por um conjugado de estreptavidina / fosfatase alcalina convertendo um substra- to de quimiluminescência. Uma prova de hibridização de sanduíche seme- 10 Ihante também foi aplicada para detecção e quantificação de um aptâmero de RNA conforme descrito por Drolet etal. (Drolet et. al, 2000).

Preparação de lâmina de hibridização

A sonda de captura 193-G2-012 (Seq. ID.: 240) foi imobilizada para lâminas de 96 cavidades DNA-BIND brancas (Corning Costar, Wiesba- 15 den, Alemanha) a 100 nM em 0,5 M de fosfato de sódio, 1 mM de EDTA, pH 8.5 de um dia para o outro a 4°C. As cavidades foram lavadas duas vezes e bloqueadas com 0,5% em peso/ vol de BSA em 0,25 M de fosfato de sódio, 0,5 mM de EDTA, pH 8.5 por 2 h a 25°C, lavadas de novo e armazendas em temperatura ambiente até o uso. Antes de hibridização, lavadas duas vezes 20 com tampão de lavagem (3xSSC, 0,5% [em peso/ vol] dodecil sarcosinato de sódio, pH 7.0; previamente um estoque de 20x [3 M de NaCI, 0,3 M de Na3Citrato] é preparado sem Iauroil sarcosina de sódio e diluído desta ma- neira).

Preparação da amostra Todas as amostras foram testadas em duplicatas. Amostras de

plasma foram degeladas sobre gelo, turbilhonadas e centrifugadas breve- mente em uma centrifuga de tabletop resfriada. Homogenados de tecido fo- ram degelados em temperatura ambiente e centrifugados 5 min em veloci- dade máxima e temperatura ambiente. As amostras foram diluídas com tam- 30 pão de hibridização (40 nM de sonda de detecção 193-G2-012 [Seq. ID. 241] em tampão de lavagem) em temperatura ambiente de acordo com o seguin- te esquema: 1:10 10 μΙ de amostra + 90 μΙ de tampão de hibridização

1:100 20 μΙ 1:10 + 180 μΙ de tampão de hibridização

Todas as diluições das amostras foram testadas. Spiegelmero de ligação de SDF-1 humano 193-G2-012-5’-PEG padrão foi diluído serial- mente para uma curva de calibração de 12 pontos transpondo a faixa de

0,001 a 40 nM. O padrão de calibração foi idêntico ao das amostras em es- tudo.

Hibridização e detecção

As amostras foram aquecidas por 5 min a 95°C e resfriadas até a temperatura ambiente. Complexos de Spiegelmero / sonda de detecção foram recozidos para sondas de captura imobilizadas por 45 min a 25°C a 500 rpm sobre um shaker. Spiegelmeros não ligados foram removidos la- vando duas vezes com tampão de lavagem e 1x TBST (20 mM de Tris-CI, 137 mM de NaCI, 0,1% de Tween 20, pH 7.5), respectivamente. Complexos hibridizados foram detectados por estreptavidina fosfatase alcalina diluída a 1:5000 em 1x TBST por 1 ha 25°C a 500 rpm sobre um shaker. Para remo- ver conjugado rião ligado, as cavidades foram lavadas de novo com 1x TBST. As cavidades foram finalmente preenchidas com 100 ml de substrato CSDP (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha) e incubadas por 45 min a 25°C. A quimiluminescência foi meida em uma leitora de microlâmina FLU- Ostar Optima (BMG Labtechnologies, Offenburg, Alemanha).

Análise dos dados

Foram usadas as seguintes diluições das amostras testadas pa- ra análise quantitativa dos dados:

EDTApIasmaderato 1:100

Os dados obtidos do grupo de veículo (nenhum Spiegelmero foi administrado) foram subtraídos como sinal de fundo.

ELISA para quantificação de Spiegelmero

A quantidade de SDF-1 presente nas amostras de plasma foi quantificada com um ensaio imunossorvente ligado a enzima in vitro o qual emprega um anticorpo específico para SDF-Ia humano revestido sobre uma lâmina de 96 cavidades (kit Human SDF-Ia ELISA; RayBiotech, Norcross GA, EUA). O teste foi realizado de acordo com as instruções do vendedor. Resultados

Conforme mostrado na Fig. 33 o nível plasmático regular de SDF-1 em ratos não tratados está na faixa picomolar baixa (aproximadamen- te 50 pM). Em contraste o nível plasmático de ratos que foram tratados com Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano parece dife- rente: Dentro das primeiras oitos horas depois da administração de Spiegel- mero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano o nível plasmático de SDF-1 aumentou para aproximadamente 700 pM. Entre 12 e 72 horas o nível plasmático de SDF-1 diminuiu para aproximadamente 50 pM novamen- te. Este curso de tempo do nível plasmático de SDF-1 pode ser diretamente correlacionado com o nível plasmático do Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano. Devido à eliminação renal do Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano, o nível plasmático do Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano diminuiu de aproximadamente 1100 nM para abaixo de 50 nM dentro de 72 horas. No entanto, o Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano (MW appproximately 54000 Da) não foi eliminado do corpo dentro de uma hora conforme pode ser visto para Spiegelmeros não-PEGuilados (aproxi- madamente 15000 Da) ou outras moléculas com uma massa molecular a- baixo do limite de fiitração do rim como SDF-1. O SDF-1 endógeno foi ligado por Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano forman- do complexos de SDF-1- Spiegelmero por meio dos quais a eliminação e/ou degradação de SDF-1 foi retardado o que levou como conseqüência a níveis plasmáticos de SDF-1 elevados dentro das primeiras oito horas. Devido ao prosseguimento da eliminação de Spiegelmero 193-G2-012-5’-PEG de liga- ção de SDF-1 humano durante o tempo - por meio da qual a taxa de elimi- nação é muito mais lenta do que para moléculas muito menores como SDF- 1 - o nível plasmático dos complexos formados por Spiegelmero 193-G2- 012-5’-PEG de ligação de SDF-1 humano e SDF-1 diminuiu (Fig. 33). Referências

Os dados bibliográficos completos dos documentos menciona- dos aqui, neste requerimento de patente, caso não indicados ao contrário, são como se segue, por meio dos quais a revelação das referidas referên- cias é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de refe- rência.

Aiuti, A., I. J. Webb, et al. (1997). "The chemokine SDF-1 is a

chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provi- des a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood." J Exp Med 185 (1): 111 -20.

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ (1990), Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3): 403-10.

Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-402.

Ambati, J., A. Anand, et al. (2003). An animal model of age- related macular degeneration in senescent Ccl-2- or Ccr-2-deficient mice. Nat Med. 9: 1390-7.

Arya,* S. K., C. C. Ginsberg, et al. (1999). "In vitro phenotype of SDF1 gene mutant that delays the onset of human immunodeficiency virus disease in vivo." J Hum Virol 2 (3): 133-8.

Auerbach et al. (2003) Angiogenesis assays: a criticai overview.

Clin.Chem. 49: 32-40.

Baggiolini, M. (1998). "Chemokines and Ieukocyte traffic." Nature 392 (6676): 565-8.

Baggiolini, M., B. Dewald, et al. (1994). "lnterleukin-8 and related chemotactic cytokines--CXC and CC chemokines." Adv Immunol 55: 97-179.

Balabanian, Κ., B. Lagane, et al. (2005). "WHIM syndromes with different genetic anomalies are accounted for by impaired CXCR4 desensiti- zation to CXCL12." Blood 105 (6): 2449-57.

Balabanian, K., J. Couderc, et al. (2003). "Role of the chemokine stromal cell-derived factor 1 in autoantibody production and nephritis in muri- ne lupus." J Immunol 170 (6): 3392-400.

Balkwill, F. (2004). "Cancer and the chemokine network." Nat Rev Cancer 4 (7): 540-50.

Bazan, J. F., Κ. B. Bacon, et al. (1997). "A new class of membra- ne-bound chemokine with a CX3C motif." Nature 385 (6617): 640-4.

Bertolini, F., C. DeH1AgnoIa, et al. (2002). "CXCR4 neutralization, a novel therapeutic approach for non-Hodgkin's lymphoma." Cancer Res 62 (11): 3106-12.

Bleul, C. C., J. L. Schultze, et al. (1998). "B Iymphocyte chemo- taxis regulated in association with microanatomic localization, differentiation state, and B cell receptor engagement." J Exp Med 187 (5): 753-62.

Bleul, C. C., M. Farzan, et al. (1996). "The Iymphocyte chemoat-

tractant SDF-1 is a Iigand for LESTR/fusin and blocks HIV-1 entry." Nature 382 (6594): 829-33.

Brooks, H. L., Jr., S. Caballero, Jr., et al. (2004). "Vitreous leveis of vascular endothelial growth factor and stromal-derived factor 1 in patients with diabetic retinopathy and cystoid macular edema before and after intrao- cular injection of triamcinolone." Arch Ophthalmol 122 (12): 1801-7.

Buckley, C. D., N. Amft, et al. (2000). "Persistent induction of the chemokine receptor CXCR4 by TGF-beta 1 on synovial T cells contributes to their accumulation within the rheumatoid synovium." J Immunol 165 (6): 3423-9.

Burger, J. A., N. Tsukada, et al. (2000). "Blood-derived~nurse-like cells protect chronic Iymphocytic Ieukemia B cells from spontaneous apopto- sis through stromal cell-derived factor-1." Blood 96 (8): 2655-63.

Butler, J. M., S. M. Guthrie, et al. (2005). "SDF-1 is both neces- sary and sufficient to promote proliferative retinopathy." J Clin Invest 115 (1): 86-93.

Cabioglu, N., A. Sahin, et al. (2005). "Chemokine receptor CX- CR4 expression in breast cancer as a potential predictive marker of isolated tumor cells in bone marrow." Clin Exp Metastasis 22 (1): 39-46.

Corcione, A., L. Ottonello, et al. (2000). "Stromal cell-derived fac-

tor-1 as a chemoattractant for follicular center lymphoma B cells." J Natl Cancer Inst 92 (8): 628-35. Crump, M. P., J. H. Gong, et al. (1997). "Solution structure and basis for functional activity of stromal cell-derived factor-1; dissociation of CXCR4 activation from binding and inhibition of HIV-1." Embo J 16 (23): 6996-7007.

D'Apuzzo, M., A. Rolink, et al. (1997). "The chemokine SDF-1,

stromal cell-derived factor 1, attracts early stage B cell precursors via the chemokine receptor CXCR4." EurJ Immunol 27 (7): 1788-93.

De Klerck, B., L. Geboes, et al. (2005). "Pro-infIammatory proper- ties of stromal cell-derived factor-1 (CXCL12) in collagen-induced arthritis." Arthritis Res Ther 7(6): R1208-20.

Drolet DW, Nelson J, Tucker CE, Zack PM, Nixon K, Bolin R, Judkins MB, Farmer JA, Wolf JL, Gill SC, Bendele RA (2000). Pharmacoki- netics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NX1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys. Pharm. Res. 17: 1503

Eaton, B. E., L. Gold, et al. (1997). "Post-SELEX combinatorial optimization of aptamers." Bioorg Med Chem 5 (6): 1087-96.

Fedyk, E. R., D. Jones, et al. (2001). "Expression of stromal- derived factor-1 is decreased by IL-1 and TNF and in dermal wound healing." J Immunol 166 (9): 5749-54.

Fong, D. S., L. P. Aiello, et al. (2004). ''Diabetic retinopathy." Di- abetes Care 27 (10): 2540-53.

Geminder, H., O. Sagi-Assif, et al. (2001). "A possible role for CXCR4 and its ligand, the CXC chemokine stromal cell-derived factor-1, in the development of bone marrow metastases in neuroblastoma." J Immunol 167 (8): 4747-57.

Godessart, N. (2005). "Chemokine receptors: attractive targets for drug discovery." Ann N Y Acad Sci 1051: 647-57.

Grassi, F., S. Cristino, et al. (2004). "CXCL12 chemokine up- regulates bone resorption and MMP-9 release by human osteoclasts: CX- CL12 leveis are increased in synovial and bone tissue of rheumatoid arthritis patients." J Cell Physiol 199 (2): 244-51. Grunewald1 M., I. Avraham, et al. (2006). "VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells." Cell 124(1): 175-89.

Guleng, B., K. Tateishi, et al. (2005). "Blockade of the stromal cell-derived factor-1/CXCR4 axis attenuates in vivo tumor growth by inhibiting angiogenesis in a vascular endothelial growth factor-independent manner." Cancer Res 65 (13): 5864-71.

Gulino1 A. V., D. Moratto, et al. (2004). "Altered Ieukocyte res- ponse to CXCL12 in patients with warts hypogammaglobulinemia, infections, myelokathexis (WHIM) syndrome." Blood 104 (2): 444-52.

Hartmann, T. N., M. Burger, et al. (2004). "The role of adhesion molecules and chemokine receptor CXCR4 (CD184) in small cell Iung can- cer." J Biol Regul HomeostAgents 18 (2): 126-30.

Hwang, J. H., Η. K. Chung, et al. (2003). "CXC chemokine recep- tor 4 expression and function in human anaplastic thyroid cancer cells." J Clin Endocrinol Metab 88 (1): 408-16.

Jiang, W., P. Zhou, et al. (1994). "Molecular cloning of TPAR1, a gene whose expression is repressed by the tumor promoter 12-0- tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)." Exp Cell Res 215 (2): 284-93.

Jose, P. J., D. A. Griffiths-Johnson, et al. (1994). "Eotaxin: a po-

tent eosinophil chemoattractant cytokine detected in a guinea pig model of allergic airways inflammation." J Exp Med 179 (3): 881-7.

Juarez, J. and L. Bendall (2004). "SDF-1 and CXCR4 in normal and malignant hematopoiesis." Histol Histopathol 19 (1): 299-309.

Kanbe, Κ., K. Takagishi, et al. (2002). "Stimulation of matrix me-

talloprotease 3 release from human chondrocytes by the interaction of stro- mal cell-derived factor 1 and CXC chemokine receptor 4." Arthritis Rheum 46 (1): 130-7.

Kang, H., G. Watkins, et al. (2005). "Stromal cell derived factor-1: its influence on invasiveness and migration of breast cancer cells in vitro, and its association with prognosis and survival in human breast cancer." Breast Cancer Res 7 (4): R402-10. Kawai, T., U. Choi1 et al. (2005). "Enhanced function with decre- ased internalization of carboxy-terminus truncated CXCR4 responsible for WHIM syndrome." Exp Hematol 33 (4): 460-8.

Koshiba, T., R. Hosotani, et al. (2000). "Expression of stromal cell-derived factor 1 and CXCR4 Iigand receptor system in pancreatic cancer: a possible role for tumor progression." Clin Cancer Res 6 (9): 3530-5.

Krumbholz, M., D. Theil, et al. (2006). "Chemokines in multiple sclerosis: CXCL12 and CXCL13 up-regulation is differentially Iinked to CNS immune cell recruitment." Brain 129: 200-211.

Kryczek, I., A. Lange, et al. (2005). "CXCL12 and vascular endo-

thelial growth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers." Cancer Res 65 (2): 465-72.

Kucia, M., R. Reca, et al. (2005). "Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1 -CXCR4 axis." Stem Cells 23 (7): 879-94.

Kusser, W. (2000). "Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selectíons: evolving evolution." J Biotechnol 74 (1): 27-38.

Lapteva, N., A. G. Yang, et al. (2005). "CXCR4 knockdown by small interfering RNA abrogates breast tumor growth in vivo." Cancer Gene Ther 12(1): 84-9.

M.J. Damha, K.K. Ogilvie, Methods in Molecular Biology, Vol. 20 Protocols for oligonucleotides and analogs, ed. S. Agrawal, p. 81-114, Hu- mana Press Inc. 1993

Ma, Q., D. Jones, etal. (1998). "Impaired B-lymphopoiesis, mye- lopoiesis, and derailed cerebellar neuron migration in CXCR4- and SDF-1- deficient mice." Proc Natl Acad Sci U S A 95 (16): 9448-53.

Marechal, V., F. Arenzana-Seisdedos, et al. (1999). Opposite effects of SDF-1 on human immunodeficiency virus type 1 replication." J Virol 73 (5): 3608-15.

Matthys, P., S. Hatse, et al. (2001). "AMD3100, a potent and

specific antagonist of the stromal cell-derived factor-1 chemokine receptor CXCR4, inhibits autoimmune joint inflammation in IFN-gamma receptor- deficient mice." J Immunol 167 (8): 4686-92.

McGinnis S, Madden TL (2004). BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 (Web Ser- ver issue): W20-5.

Meleth, A. D., E. Agron, et al. (2005). "Serum inflammatory mar-

kers in diabetic retinopathy." Invest Ophthalmol Vis Sci 46 (11): 4295-301.

Menu, E., K. Asosingh, et al. (2006). "The involvement of stromal derived factor Ialpha in homing and progression of multiple myeloma in the 5TMM model." Haematologica.

Miller, M. D. and M. S. Krangel (1992). "Biology and biochemistry

of the chemokines: a family of chemotactic and inflammatory cytokines." Crit Rev Immunol 12 (1-2): 17-46.

Moser, B., M. Wolf, et al. (2004). "Chemokines: multiple leveis of Ieukocyte migration control." Trends Immunol 25 (2): 75-84.

Muller, A., B. Homey, et al. (2001). "Involvement of chemokine

receptors in breast cancer metastasis." Nature 410 (6824): 50-6.

Murdoch, C. (2000). "CXCR4: chemokine receptor extraordinai- re." Immunol Rev 177:175-84.

Murphy, P. M., M. Baggiolini, et al. (2000). "International union of pharmacology. XXII. Nomenclature for chemokine receptors." Pharmacol Rev 52 (1): 145-76.

Nagasawa, T., H. Kikutani, et al. (1994). "Molecular cloning and structure of a pre-B-cell growth-stimulating factor." Proc Natl Acad Sci U S A 91 (6): 2305-9.

Nagasawa, T., S. Hirota, et al. (1996). "Defects of B-cell Iympho-

poiesis and bone-marrow myelopoiesis in mice Iacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1." Nature 382 (6592): 635-8.

Needleman & Wunsch (1970), A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J Mol Biol. 48 (3): 443-53.

Oppenheim, J. J., C. O. Zachariae, et al. (1991). "Properties of the novel proinflammatory supergene "intercrine" cytokine family." Annu Rev Immunol 9: 617-48.

Orimo, A., P. B. Gupta, et al. (2005). "Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogene- sis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion." Cell 121 (3): 335-48.

Pearson & Lipman (1988), Improved tools for biological sequen-

ce comparison. Proc. Nat1I. Acad. Sei. USA 85: 2444

Perissinotto, E., G. Cavalloni1 et al. (2005). "Involvement of che- mokine receptor 4/stromal cell-derived factor 1 system during osteosarcoma tumor progression." Clin Cancer Res 11 (2 Pt 1): 490-7.

Phillips, R. J., M. D. Burdick, et al. (2003). "The stromal derived

factor-1/CXCL12-CXC chemokine receptor 4 biological axis in non-small cell Iung cancer metastases." Am J Respir Crit Care Med 167 (12): 1676-86.

Ponath, P. D., S. Qin1 et al. (1996). "Cloning of the human eosi- nophil chemoattractant, eotaxin. Expression, receptor binding, and functional properties suggest a mechanism for the selective recruitment of eosinophils." JCIin Invest 97 (3): 604-12.

Rubih, J. B., A. L. Kung, et al. (2003). "A small-molecule antago- nist of CXCR4 inhibits intracranial growth of primary brain tumors." Proc Natl Acad Sci U S A 100 (23): 13513-8.

Salcedo et al. (1999) Vascular endothelial growth factor and ba-

sic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothe- lial cells. In vivo neovascularization induced by stromal-derived factor-1 a. Am. J. Pathol. 154: 1125-1135.

Salcedo, R. and J. J. Oppenheim (2003). "Role of chemokines in angiogenesis: CXCL12/SDF-1 and CXCR4 interaction, a key regulator of en- dothelial cell responses." Microcirculation 10 (3-4): 359-70.

Salcedo, R., K. Wasserman, et al. (1999). "Vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor induce expression of CXCR4 on human endothelial cells: In vivo neovascularization induced by stromal- derived factor-1 alpha." Am J Pathol 154 (4): 1125-35.

Salvucci, O., L. Yao, et al. (2002). "Regulation of endothelial cell branching morphogenesis by endogenous chemokine stromal-derived factor- 1." Blood 99 (8): 2703-11.

Saur1 D., B. Seidler1 et al. (2005). "CXCR4 expression increases Iiver and Iung metastasis in a mouse model of pancreatic cancer." Gastroen- terology 129 (4): 1237-50.

Schall1 T. J. and Κ. B. Bacon (1994). "Chemokines, Ieukocyte

trafficking, and inflammation." Curr Opin Immunol 6 (6): 865-73.

Scotton, C. J., J. L. Wilson, et al. (2002). "Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer." Can- cer Res 62 (20): 5930-8.

Sengupta1 N., S. Caballero, et al. (2005). "Preventing stem cell

incorporation into choroidal neovascularization by targeting homing and atta- chment factors." Invest Ophthalmol Vis Sci 46 (1): 343-8.

Shirozu, M., T. Nakano1 et al. (1995). "Structure and chromoso- mal Iocalization of the human stromal cell-derived factor 1 (SDF1) gene." Genomics 28 (3): 495-500.

Smith & Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482

Soriano1 A., C. Martinez, et al. (2002). "Plasma stromal cell- derived factor (SDF)-I leveis, SDF1-3'A genotype, and expression of CXCR4 on T lymphocytes: their impact on resistance to human immunodeficiency virus type 1 infection and its progression." J Infect Dis 186 (7): 922-31.

Springer, T. A. (1995). "Traffic signals on endothelium for Iym- phocyte recirculation and Ieukocyte emigration." Annu Rev Physiol 57: 827- 72.

Sun1 Y. X., A. Schneider1 et al. (2005). "Skeletal Iocalization and neutralization of the SDF-1 (CXCL12)/CXCR4 axis blocks prostate cancer metastasis and growth in osseous sites in vivo." J Bone Miner Res 20 (2): 318-29.

Takenaga, M., H. Tamamura, et al. (2004). "A single treatment with microcapsules containing a CXCR4 antagonist suppresses pulmonary metastasis of murine melanoma." Biochem Biophys Res Commun 320 (1): 226-32.

Tamamura, H., M. Fujisawa, et al. (2004). "Identification of a CXCR4 antagonist, a Tl40 analog, as an anti-rheumatoid arthritis agent." FEBS Lett 569 (1-3): 99-104.

Tashiro, Κ., H. Tada, et al. (1993). "Signal sequence trap: a clo- ning strategy for secreted proteins and type I membrane proteins." Science 261 (5121): 600-3.

Venkatesan1 N., S. J. Kim1 et al. (2003). "Novel phosphoramidite building blocks in synthesis and applications toward modified oligonucleoti- des." Curr Med Chem 10 (19): 1973-91.

Wang1 J., E. Guan1 et al. (2001). "Role of tyrosine phosphorylati- on in ligand-independent sequestration of CXCR4 in human primary monocy- tes-macrophages." J Biol Chem 276 (52): 49236-43.

Wang1 N., Q. L. Wu1 et al. (2005). "Expression of chemokine re- ceptor CXCR4 in nasopharyngeal carcinoma: pattern of expression and cor- relation with clinicai outcome." J Transi Med 3: 26.

Wincott F1 DiRenzo A1 Shaffer C1 Grimm S1 Tracz D1 Workman

C1 Sweedler D1 Gonzalez C1 Scaringe S1 Usman N (1995). Synthesis1 depro- tection, analysis and purification of RNA and ribozymes. Nucleic Acids Res. 23 (14): 2677-84

Yamaguchi1 J., K. F. Kusano1 et al. (2003). "Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization." Circulation 107 (9): 1322-8.

Yasumoto, Κ., K. Koizumi1 et al. (2006). "Role of the CX- CL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer." Cancer Res 66 (4): 2181-7.

Zeelenberg1 I. S., L. Ruuls-Van Stalle1 et al. (2001). "Retention of

CXCR4 in the endoplasmic reticulum blocks dissemination of a T cell hybri- doma." J Clin Invest 108 (2): 269-77.

Zeelenberg1 I. S., L. Ruuls-Van Stalle1 et al. (2003). "The chemo- kine receptor CXCR4 is required for outgrowth of colon carcinoma microme- tastases." Cancer Res 63 (13): 3833-9.

Zhou1 Y., P. H. Larsen1 et al. (2002). "CXCR4 is a major chemo- kine receptor on glioma cells and mediates their survival." J Biol Chem 277 (51): 49481-7.

Zou, Y. R., A. H. Kottmann, et al. (1998). "Function of the che- mokine receptor CXCR4 in haematopoiesis and in cerebellar development." Nature 393 (6685): 595-9.

As características da presente invenção reveladas na especifi-

cação, suas reivindicações e/ou os desenhos podem tanto separadamente quanto em qualquer combinação dos mesmos ser material para realizar a invenção em várias formas da mesma. Listagem de Seqüências

10

<110> NOXXON Pharma AG <120> Ácidos nucléicos ligando <130> N10052 PCT <160> 241 <170> PatentIn versão 3 .1 <210> 1 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg 1 5 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys He Leu Asn Thr Pro

20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln He Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45

Val Cys He Asp Pro Lys Leu Lys Trp He Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60

Ala Leu Asn Lys 65

<210> 2 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 15 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys He Leu Asn Thr Pro

20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln He Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys He Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60

Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys Met 65 70

<210> 3 <211> 68 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3

Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 15 10 15

His Ile Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60

20

25

30

Ala Leu Asn Lys 65 <210> 4 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_ .feature <222> (1) .. (71) <223> D-peptídeo <220> <221> misc_ .feature <222> (71) . . (71) <223> biotinilada <400> 4 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 15 10 15

His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30

Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45

Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys

60

50 55 Ala Leu Asn Lys Arg Phe Lys 65 70 <210> 5 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> * <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 5 gcugugaaag caacauguca augaaaggua <210> 6 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA 38 <400> 6

gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc 38

<210> 7 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)■■(38) <223> L-RNA <400> 7 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua <210> 8 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> L-RNA <222> (1)..(38) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (38) <223> L-RNA <400> 8 gcugugaaag uaacacguca augaaaggua <210> 9 <211> 38 38

38 10

15

20

25

30

<212> RNA <213> Seqüência artif <220> <223> sintética <220> <221> L-RNA <222> (I) . . (38) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 9 gcuguaaaag uaacauguca , <210> 10 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial <220> <221> L-RNA <222> (1).-(38) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 10 gcuguaaaag uaacaaguca . <210> 11 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artif; 38

38 <220> <223> sintética <220> <221> L-RNA <222> (I)·-(38) <223> <400> 11 gcugugaaag uaacaaguca augaaaggua <210> 12 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 12 gcagugaaag uaacauguca augaaaggua <210> 13 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> L-RNA <222> (1)..(38) <223> <400> 13 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua 38

38

38 10

15

20

25

30

<210> 14 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> mi s c_f ea ture <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 14 gcuaugaaag uaacauguca augaaaggua <210> 15 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> * <223> sintética <220> <221> mi s c_f eature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 15 gcugcgaaag cgacauguca augaaaggua <210> 16 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> L-RNA 38

38 <222> (I)..(38) <223> <220> <221> misc_feature <222> (I)-.(38) <223> L-RNA <400> 16 gcugugaaag caacauguca augaaaggua <210> 17 <211> 38 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 17 gcugugaaag uaacauguca augaaaggua <210> 18 <211> 39 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> L-RNA <400> 18 agcgugaaag uaacacguaa aaugaaaggu 38

38

39 <210> 19 <211> 27 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (I)..(27) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> A ou ausente <400> 19 aaagyracah gumaaaugaa agguarc <210> 20 <211> 26 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> L-RNA <400> 20 aaagyracah gumaaugaaa gguarc <210> 21 <211> 27 <212> RNA <213> Seqüência artificial 27

26 <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (I)..(27) <223> L-RMA <400> 21 aaagyracah gumaaaugaa agguarc <210> 22 <211> 26 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)-.(26) <223> L-RNA <400> 22 aaagyaacah gucaaugaaa gguarc <210> 23 <211> 6 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> L-RNA <400> 23 rshryr 27

26 <210> 24

<211> 6

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (6)

<223> L-RNA

<400> 24

yrydsy 6

<210> 25

<211> 36

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223> L-RNA

<400> 25

cugugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcag 36

<210> 26

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature <222> (1) ·. (34) <223> L-RNA <400> 26 ugugaaagca acaugucaau gaaagguagc <210> 27 <211> 32 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1).-(32) <223> L-RNA <400> 27 gugaaagcaa caugucaaug aaagguagcc <210> 28 <211> 30 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> L-RNA <400> 28 ugaaagcaac augucaauga aagguagccg <210> 29 <211> 28 <212> RNA <213> Seqüência artificial 34

32

30 <220> <223> sintética <220> <221> L-RNA <222> (1) . . (28) <223> <400> 29 gaaagcaaca ugucaaugaa agguagcc <210> 30 <211> 26 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26)' <223> L-RNA <400> 30 aaagcaacau gucaaugaaa gguagc <210> 31 <211> 36 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> L-RNA <400> 31 gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag 28

26

36 10

15

20

25

30

<210> 32 <211> 36 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)- -(36) <223> L-RNA <400> 32 gcgcgaaagc aacaugucaa ugaaagguag <210> 33 <211> 34 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 33 gcggaaagca acaugucaau gaaagguagc <210> 34 <211> 34 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature 36

34 <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 34 cgugaaagca acaugucaau gaaagguagc <210> 35 <211> 34 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 35 gcgcaaagca acaugucaau gaaagguagc <210> 36 <211> 34 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(34) <223> L-RNA <400> 36 gugcaaagca acaugucaau gaaagguagc <210> 37 <211> 34 <212> RNA <213> Seqüência artificial 34

34

34 <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223> L-RNA

<400> 37

cgcgaaagca acaugucaau gaaagguagc cgug 34

<210> 38

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (34)

<223> L-RNA

<400> 38

gggcaaagca acaugucaau gaaagguagc gccc 34

<210> 39

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (34)

<223> L-RNA

<400> 39

ggccaaagca acaugucaau gaaagguagc ggcc 34 10

15

20

25

30

<210> 40 <211> 34 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)·.(34) <223> L-RNA <400> 40 gcccaaagca acaugucaau gaaagguagc <210> 41 <211> 34 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> ’ <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)-.(34) <223> L-RNA <400> 41 ccccaaagca acaugucaau gaaagguagc <210> 42 <211> 5 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature 34

34 10

15

20

25

30

<222> (1) .· (5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> I-* <223> S ou ausente <400> 42 sbbbs <210> 43 <211> 5 <212> RNA <213> Seqüência artif: <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1) . .(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (5) . .(5) <223> s ou ausente <400> 43 sbbvs <210> 44 <211> 6 <212> RNA <213> Seqüência artif. <220> <223> sintética <22 0> <221> misc_feature <222> (3).. (3)

<223> nucleotídeo = a, g, c <220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> nucleotídeo = a, g, c <220>

<221> misc_feature

<222> (1). . (6)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> R ou ausente

<220>

<221> misc_feature

<222> (2).. (2)

<223> s ou ausente

<400> 44 rsnnbv

<210> 45

<211> 6

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1).. (6)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

ou u

6 <222> (2).. (2)

<223> nucleotídeo = a, g, c ou u <220>

<221> misc_feature

<222> (4).. (4)

<223> nucleotídeo = a, g, c ou u <220>

<221> misc_feature

<222> (5).. (5)

<223> R ou ausente <220>

<221> misc_feature

<222> (6).. (6)

<223> y ou ausente

<400> 45

bnbnry 6

<210> 46

<211> 47

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (47)

<223> L-RNA

<400> 46

agcguggugu gaucuagaug uaguggcuga uccuagucag guacgcu 47

<210> 47

<211> 47

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (47)

<223> L-RNA

<400> 47

agcguggugu gaucuagaug uauuggcuga uccuagucag guacgcu

<210> 48 <211> 47 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(47) ‘ <223> L-RNA <400> 48 agcguggugu gaucuagaug uaauggcuga uccuagucag gugcgcu

<210> 49 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 49 gcgaggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg uacgc <210> 50 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1).-(45) <223> L-RNA <400> 50 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau <210> 51 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 51 gcauggugug aucuagaugu aguggcugau <210> 52 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature 45

45 <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 52 gcguggugug aucuagaugu aauggcugau <210> 53 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1) . .(45) <223> L-RNA <400> 53 gcguggugug aucuagaugu agaggcugau <210> 54 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 54 gcguggugug aucuagaugu aaaggcugau <210> 55 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial 45

45

45 10

15

20

25

30

<220> <223> sintética <220> <221> L-RNA <222> (1)..(45) <223> <220> <221> misc_feature <222> (I)..(45) <223> L-RNA <400> 55 gcguggugug aucuagaugu aguggcuguu <210> 56 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1).-(45) <223> L-RNA <400> 56 gcguggugug aucuagaugu aguggcugau <210> 57 <211> 35 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature 45

45 10

15

20

25

30

<222> (1)..(35) <223> L-RNA <400> 57 gugugaucua gauguadwgg cugwuccuag <210> 58 <211> 35 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)-.(35) <223> L-RNA <400> 58 gugugaucua gauguadugg cugauccuag <210> 59 <211> 6 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)··(6) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> A ou ausente <400> 59 agcrwg 35

35 <210> 60

<211> 6

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1).. (6)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (6).. (6)

<223> U ou ausente

<400> 60

kryscu 6

<210> 61

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> L-RNA

<400> 61

gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg uacgc 45

<210> 62

<211> 43

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (I)..(43) <223> L-RNA <400> 62 cgugguguga ucuagaugua guggcugauc <210> 63 <211> 41 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) ' <223> L-RNA <400> 63 guggugugau cuagauguag uggcugaucc <210> 64 <211> 39 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> L-RNA <222> (1).-(39) <223> <220> <221> misc_feature 43

41 <222> (1)..(39) <223> L-RNA <400> 64 uggugugauc uagauguagu ggcugauccu <210> 65 <211> 37 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)·-(37) <223> L-RNA <400> 65 ggugugaucu agauguagug gcugauccua <210> 66 <211> 35 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(35) <223> L-RNA <400> 66 gugugaucua gauguagugg cugauccuag <210> 67 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial 39

37

35 <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> L-RNA <400> 67 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau <210> 68 <211> 45 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) ' <223> L-RNA <400> 68 gcgcggugug aucuagaugu auuggcugau <210> 69 <211> 43 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(43) <223> L-RNA <400> 69 gcgcguguga ucuagaugua uuggcugauc 45

45

43 10

15

20

25

30

<210> 70 <211> 43 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1) . . (43) <223> L-RNA <400> 70 gggcguguga ucuagaugua uuggcugauc <210> 71 <211> 43 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1) . . (43) <223> L-RNA <400> 71 ggccguguga ucuagaugua uuggcugauc <210> 72 <211> 43 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature 43

43 10

15

20

25

30

<222> (I).. (43)

<223> L-RNA <400> 72

gcccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ggc 43

<210> 73 <211> 5 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1) . -(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (I)--(I) <223> G ou ausente <400> 73 gssbs <210> 74 <211> 5 <212> RNA <213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> L-RNA <220> <221> misc_feature <222> (5).. (5)

<223> C ou ausente

<400> 74

bvssc

<210> 75

<211> 6

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1). . (6)

<223> L-RNA

<220>

<221> misc_f eature

<222> (1)..(1)

<223> A ou ausente

<400> 75 agcgug

<210> 76

<211> 6

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature <222> (6).. (6)

<223> U ou ausente

<400> 76 uacgcu

<210> 77

<211> 6

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(6)

<223> L-RNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1) '

<223> A ou ausente <220>

<221> misc_feature

<222> (2).. (2)

<223> G ou ausente <220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> nucleotídeo = a, g, c ou u

<400> 77 agsvns

<210> 78

<211> 6

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) ..(6)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (5).. (5)

<223> C ou ausente <220>

<221> misc_feature

<222> (6).. (6)

<223> U ou ausente

<400> 78 bvbscu

<210> 79

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (39)

<223> L-RNA

<400> 79

gugcugcggg gguuagggcu agaagucggc cugcagcac

<210> 80

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (39)

<223> L-KNA

<400> 80

agcguggcga gguuagggcu agaagucggu cgacacgcu

<210> 81

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223> L-RNA

<400> 81

guguugcgga gguuagggcu agaagucggu cagcagcac

<210> 82

<211> 48

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> L-RNA

<222> (1)..(48) <223>

<400> 82

cgugcgcuug agauaggggu uagggcuuaa agucggcuga uucucacg <210> 83

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (39)

<223> L-RNA

<400> 83

agcgugaagg gguuagggcu cgaagucggc ugacacgcu

<210> 84

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> L-RNA

<222> (1)..(39) <223>

<400> 84

gugcugcggg gguuagggcu cgaagucggc ccgcagcac

<210> 85

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature <222> (X)..<39)

<223> L-RNA

<400> 85

guguucccgg gguuagggcu ugaagucggc cggcagcac

<210> 86

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223> L-RNA

<400> 86

guguugcagg gguuagggcu ugaagucggc cugcagcac

<210> 87

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(39)

<223> L-RNA

<400> 87

gugcugcggg gguuagggcu caaagucggc cugcagcac

<210> 88

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1).. (38)

<223> L-RNA

<400> 88

gugcugccgg gguuagggcu aaagucggcc gacagcac

<210> 89

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1).. (39)'

<223> L-RNA

<400> 89

gugcuguggg ggucagggcu agaagucggc cugcagcac

<210> 90

<211> 19

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature <222> (13).. (13) <223> A ou ausente <220>

<221> misc_feature

<222> (13) . . (13)

<223> A ou ausente

<400> 90

gguyagggcu hraagucgg

<210> 91

<211> 19

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> L-RNA

<400> 91

gguyagggcu hraagucgg

<210> 92

<211> 18

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (18)

<223> L-RNA

<400> 92

gguyagggcu hragucgg <210> 93

<211> 19

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1).. (19)

<223> L-RNA

<400> 93

gguuagggcu hgaagucgg

<210> 94

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> L-RNA

<400> 94

ugagauaggg guuagggcuu aaagucggcu gauucuca

<210> 95

<211> 36

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature <222> (1) .. (36)

<223> L-RNA

<400> 95

gagauagggg uuagggcuua aagucggcug auucuc

<210> 96

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> L-RNA

<400> 96

gggguuaggg cuuaaagucg gcugauucu

<210> 97

<211> 37

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223> L-RNA

<400> 97

gcguggcgag guuagggcua gaagucgguc gacacgc

<210> 98

<211> 35

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(35)

<223> L-RNA

<400> 98

cguggcgagg uuagggcuag aagucggucg acacg

<210> 99

<211> 33

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(33)'

<223> L-RNA

<400> 99

cgggcgaggu uagggcuaga agucggucga ccg

<210> 100

<211> 32

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223> L-RNA

<400> 100

gggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc cg <210> 101 <211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(31)

<223> L-RNA

<400> 101

cggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc

<210> 102

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> L-RNA

<400> 102

cgggagguua gggcuagaag ucggucccg

<210> 103

<211> 27

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature <222> (1) . . (27) <223> L-RNA

<400> 103

gggagguuag ggcuagaagu cgguccc

<210> 104

<211> 27

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (27)

<223> L-RNA

<400> 104

ccgcgguuag ggcuagaagu cgggcgg

<210> 105

<211> 27

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (27)

<223> L-RNA

<400> 105

cccggguuag ggcuagaagu cggcggg

<210> 106

<211> 27

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0> <223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (27)

<223> L-RNA

<400> 106

ggcggguuag ggcuagaagu cggcgcc

<210> 107

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (29)

<223> L-RNA

<400> 107

cccgcgguua gggcuagaag ucgggcggg

<210> 108

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (29)

<223> L-RNA

<400> 108

gccgcgguua gggcuagaag ucgggcggc <210> 109 <211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> L-RNA

<400> 109

ccccggguua gggcuagaag ucggcgggg

<210> 110

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (29)

<223> L-RNA

<400> 110

cggcggguua gggcuagaag ucggcgccg

<210> 111

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature <222> (1) . . (29)

<223> L-RNA

<400> 111

gggcggguua gggcuagaag ucggcgccc

<210> 112

<211> 37

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223> L-RNA

<400> 112

ugcugcgggg guuagggcua gaagucggcc ugcagca

<210> 113

<211> 35

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (35)

<223> L-RNA

<400> 113

gcugcggggg uuagggcuag aagucggccu gcagc

<210> 114

<211> 33

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0> <223> sintética <22 0>

<221> misc_feature <222> (1)..(33)

<223> L-KNA

<400> 114

cugcgggggu uagggcuaga agucggccug

<210> 115

<211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1)..(31)

<22 3> L-RNA

<400> 115

ugcggggguu agggcuagaa gucggccugc

<210> 116

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> L-RNA

<222> (1)..(29) <223>

<400> 116

gcggggguua gggcuagaag ucggccugc <210> 117 <211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1)..(29)

<223> L-RNA

<400> 117

gccgggguua gggcuagaag ucggccggc

<210> 118

<211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (31)

<223> L-RNA

<400> 118

ggccgggguu agggcuagaa gucggccggc

<210> 119

<211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(31) <223> L-RNA

<400> 119

cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc

<210> 120

<211> 10

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (10)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (7) . . (7)

<223> nucleotídeo = a, g, c ou u

<400> 120

rksbusnvgr

<210> 121

<211> 10

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (10)

<223> L-RNA <22 0>

<221> misc_feature <222> (3).. (3) <223> η é qualquer nucleotídeo <22 0>

<221> misc_feature

<222> (3).. (3)

<223> nucleotídeo = a, g, c ou

<400> 121 yynrcassmy

<210> 122

<211> 10

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (10)

<223> L-RNA

<400> 122 rksbugsvgr

<210> 123

<211> 10

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (10)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature <222> (3) . . (3) <223> η é qualquer nucleotídeo <22 0>

<221> misc_feature

<222> (3).. (3)

<223> nucleotídeo = a, g, c ou

<400> 123

ycnrcassmy

<210> 124

<211> 5

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (5)

<223> L-RNA <220>

<221> S ou ausente

<222> (1)..(1) <223> <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> S ou ausente

<400> 124 ssssv

<210> 125

<211> 5

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220> <223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> S ou ausente

<400> 125 bssss

<210> 126

<211> 5

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc feature

<222> (1) . . (5)

<223> L-RNA

<400> 126 sggsv

<210> 127

<211> 5

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature <222> (1)..(5)

<223> L-RNA

<400> 127 ysccs

<210> 128

<211> 5

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> L-RNA

<400> 128

gcsgg

<210> 129

<211> 5

<212> RNA

<213> Artificial <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (5)

<223> L-RNA

<400> 129 cckgc

<210> 130

<211> 5

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220> <221> misc_feature

<222> (1) . . (5)

<223> L-RNA

<400> 130 ssssr

<210> 131

<211> 5

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> L-RNA

<400> 131 ysbss

<210> 132

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (45)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (1)

<223> 40 kDa-PEG <400> 132

gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg

<210> 133

<211> 36

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (36)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (1)

<223> 40 kDa-PEG

<400> 133

gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc

<210> 134

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (29)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (1)

<223> 40 kDa-PEG <400> 134 cgggagguua gggcuagaag ucggucccg

<210> 135

<211> 29

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (29)

<223> L-RNA <22 0>

<221> 40 kDa-PEG

<222> (1) .. (1) <223> <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 40 kDa-PEG

<400> 135

gccgggguua gggcuagaag ucggccggc

<210> 136

<211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> L-RNA

<222> (1) . . (31) <223> <220>

<221> 40 kDa-PEG <222> (1) .. (1)

<223>

<22 0>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 40 kDa-PEG

<400> 136

cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g

<210> 137

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> L-RNA <22 0>

<221> 40 kDa-PEG-

<222> (1)..(1) <22 3> <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (1)

<223> 40 kDa-PEG-

<400> 137

gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc

<210> 138

<211> 40

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> L-RNA

<400> 138

uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu

<210> 139

<211> 38

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> L-RNA <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (1)

<223> 30 kDa-PEG

<400> 139

gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc

<210> 140

<211> 38

<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (38)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(1)

<223> 100 kDa-HES

<400> 140

gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 38

<210> 141

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223> L-RNA

<22 0>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 130 kDa-HES

<400> 141

gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc 3 8

<210> 142

<211> 48

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (48)

<223> L-RNA

<400> 142

cgugguccgu ugugucaggu cuauucgccc cggugcaggg cauccgcg 48 <210> 143

<211> 49

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(49)

<223> L-RNA

<400> 143

gcagugugac gcggacguga uaggacagag cugaucccgc ucaggugag

<210> 144

<211> 49

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (49)

<223> L-RNA

<400> 144

caacagcagu gugacgcgga cgugauagga cagagcugau cccgcucag

<210> 145

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 145

gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccgcagc <210> 146

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 146

gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc

<210> 147

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 147

gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accgcagc

<210> 148

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 148

gcugugaaag uaacacguca augaaaggua accacagc

<210> 149

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 149

gcuguaaaag uaacauguca augaaaggua acuacagc <210> 150 <211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 150

gcuguaaaag uaacaaguca augaaaggua acuacagc

<210> 151

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 151

gcugugaaag uaacaaguca augaaaggua accacagc

<210> 152

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 152

gcagugaaag uaacauguca augaaaggua accacagc

<210> 153

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 153

gcugugaaag uaacauguca augaaaggua accacugc <210> 154

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 154

gcuaugaaag uaacauguca augaaaggua accauagc

<210> 155

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 155

gcugcgaaag cgacauguca augaaaggua gccgcagc

<210> 156

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 156

gcugugaaag caacauguca augaaaggua gccacagc

<210> 157

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <220>

<221> sintética <222> (1)..(38) <223>

<400> 157

gcugugaaag uaacauguca augaaaggua gccgcagc

<210> 158

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 158

agcgugaaag uaacacguaa aaugaaaggu aaccacgcu

<210> 159

<211> 36

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 159

cugugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcag

<210> 160

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 160

ugugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgca

<210> 161

<211> 32

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220> <223> sintética

<400> 161

gugaaagcaa caugucaaug aaagguagcc

<210> 162

<211> 30

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 162

ugaaagcaac augucaauga aagguagccg

<210> 163

<211> 28

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 163

gaaagcaaca ugucaaugaa agguagcc

<210> 164

<211> 26

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 164

aaagcaacau gucaaugaaa gguagc

<210> 165

<211> 36

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 165

gcgugaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc

<210> 166

<211> 36

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 166

gcgcgaaagc aacaugucaa ugaaagguag ccgcgc

<210> 167

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 167

gcggaaagca acaugucaau gaaagguagc ccgc

<210> 168

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 168

cgugaaagca acaugucaau gaaagguagc cgcg

<210> 169

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 169

gcgcaaagca acaugucaau gaaagguagc gugc

<210> 170

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 170

gugcaaagca acaugucaau gaaagguagc gcgc

<210> 171

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 171

cgcgaaagca acaugucaau gaaagguagc cgug

<210> 172

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 172

gggcaaagca acaugucaau gaaagguagc gccc

<210> 173

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 173

ggccaaagca acaugucaau gaaagguagc ggcc 34

<210> 174

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 174

gcccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggc 34

<210> 175

<211> 34

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 175

ccccaaagca acaugucaau gaaagguagc gggg 34

<210> 176

<211> 47

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> sintética

<400> 176

agcguggugu gaucuagaug uaguggcuga uccuagucag guacgcu 47

<210> 177

<211> 47

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 177

agcguggugu gaucuagaug uauuggcuga uccuagucag guacgcu

<210> 178

<211> 47

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 178

agcguggugu gaucuagaug uaauggcuga uccuagucag gugcgcu

<210> 179

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 179

gcgaggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc

<210> 180

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <400> 180

gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugcgc

210> 181

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 181

gcauggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg ugccc

<210> 182

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 182

gcguggugug aucuagaugu aauggcugau ccuagucagg gacgc

<210> 183

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 183

gcguggugug aucuagaugu agaggcugau ccuagucagg uacgc

<210> 184

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 184

gcguggugug aucuagaugu aaaggcugau ccuagucagg uacgc

<210> 185

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 185

gcguggugug aucuagaugu aguggcuguu ccuagucagg uaugc

<210> 186

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 186

gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuaguuagg uacgc

<210> 187

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 187

gcguggugug aucuagaugu aguggcugau ccuagucagg uacgc

<210> 188

<211> 43

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 188

cgugguguga ucuagaugua guggcugauc cuagucaggu acg

<210> 189

<211> 41

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 189

guggugugau cuagauguag uggcugaucc uagucaggua

<210> 190

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 190

uggugugauc uagauguagu ggcugauccu agucaggua

<210> 191

<211> 37

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 191

ggugugaucu agauguagug gcugauccua gucaggu

<210> 192

<211> 35

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 192

gugugaucua gauguagugg cugauccuag ucagg

<210> 193

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 193

gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc

<210> 194

<211> 45

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 194

gcgcggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg cgcgc

<210> 195

<211> 43

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 195

gcgcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg cgc

<210> 196

<211> 43

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 196

gggcguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ccc

<210> 197

<211> 43

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 197

ggccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg gcc

<210> 198

<211> 43

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 198

gcccguguga ucuagaugua uuggcugauc cuagucaggg ggc

<210> 199

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 199

gugcugcggg gguuagggcu agaagucggc cugcagcac

<210> 200

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 200

agcguggcga gguuagggcu agaagucggu cgacacgcu

<210> 201

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 201

guguugcgga gguuagggcu agaagucggu cagcagcac

<210> 202

<211> 48

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 202

cgugcgcuug agauaggggu uagggcuuaa agucggcuga uucucacg

<210> 203

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 203

agcgugaagg gguuagggcu cgaagucggc ugacacgcu

<210> 204

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 204

gugcugcggg gguuagggcu cgaagucggc ccgcagcac

<210> 205

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 205

guguucccgg gguuagggcu ugaagucggc cggcagcac

<210> 206

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 206

guguugcagg gguuagggcu ugaagucggc cugcagcac

<210> 207

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 207

gugcugcggg gguuagggcu caaagucggc cugcagcac

<210> 208

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> sintética

<400> 208

gugcugccgg gguuagggcu aaagucggcc gacagcac

<210> 209

<211> 39

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 209

gugcuguggg ggucagggcu agaagucggc cugcagcac

<210> 210

<211> 38

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 210

ugagauaggg guuagggcuu aaagucggcu gauucuca

<210> 211

<211> 36

<212> FUSIA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 211

gagauagggg uuagggcuua aagucggcug auucuc

<210> 212

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 212

gggguuaggg cuuaaagucg gcugauucu

<210> 213

<211> 37

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 213

gcguggcgag guuagggcua gaagucgguc gacacgc

<210> 214

<211> 35

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 214

cguggcgagg uuagggcuag aagucggucg acacg

<210> 215

<211> 33

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 215

cgggcgaggu uagggcuaga agucggucga ccg

<210> 216

<211> 33

<212> RNA

<213> Seqüência artificial

<22 0>

<223> sintética

<400> 216

cgggcgaggu uagggcuaga agucggucgc ccg

<210> 217

<211> 31

<212> RNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 217

cggcgagguu agggcuagaa gucggucgcc

<210> 218

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<4 00> 218

cgggagguua gggcuagaag ucggucccg

<210> 219

<211> 27

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 219

gggagguuag ggcuagaagu cgguccc

<210> 220

<211> 27

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<4 00> 220

ccgcgguuag ggcuagaagu cgggcgg

<210> 221

<211> 27

<212> RNA <213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 221

cccggguuag ggcuagaagu cggcggg

<210> 222

<211> 27

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 222

ggcggguuag ggcuagaagu cggcgcc

<210> 223

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 223

cccgcgguua gggcuagaag ucgggcggg

<210> 224

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 224

gccgcgguua gggcuagaag ucgggcggc

<210> 225

<211> 29

<212> RNA <213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 225

ccccggguua gggcuagaag ucggcgggg

<210> 226

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 226

cggcggguua gggcuagaag ucggcgccg

<210> 227

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 227

gggcggguua gggcuagaag ucggcgccc

<210> 228

<211> 37

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 228

ugcugcgggg guuagggcua gaagucggcc ugcagca

<210> 229

<211> 35

<212> RNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 229

gcugcggggg uuagggcuag aagucggccu gcagc

<210> 230

<211> 33

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 230

cugcgggggu uagggcuaga agucggccug cag

<210> 231

<211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 231

ugcggggguu agggcuagaa gucggccugc a

<210> 232

<211> 29

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 232

gcggggguua gggcuagaag ucggccugc

<210> 233

<211> 29

<212> RNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 233

gccgggguua gggcuagaag ucggccggc 2 9

<210> 234

<211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 234

ggccgggguu agggcuagaa gucggccggc c 31

<210> 235

<211> 31

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 235

cgccgggguu agggcuagaa gucggccggc g 31

<210> 236

<211> 48

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 236

cgugguccgu ugugucaggu cuauucgccc cggugcaggg cauccgcg 48

<210> 237

<211> 49

<212> RNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética

<400> 237

gcagugugac gcggacguga uaggacagag cugaucccgc ucaggugag

<210> 238

<211> 49

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética

<400> 238

caacagcagu gugacgcgga cgugauagga cagagcugau cccgcucag

<210> 239

<211> 40

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (40)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> peguilada

<400> 239

uaaggaaacu cggucugaug cgguagcgcu gugcagagcu

<210> 240

<211> 13

<212> RNA <213> Seqüência artificial <22 0>

<223> sintética <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (13)

<223> L-RNA <22 0>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> u representa uma t <220>

<221> misc_feature

<222> (13) . . (13)

<223> anexada a - (C18-PEG-espaçador)-(C18-PEG-espaçador)-1-NH2

<400> 240

gaucacacca cgc

<210> 241

<211> 11

<212> RNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> sintética <22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (11)

<223> L-RNA <220>

<221> misc_feature

<222> (1) . . (1)

<223> anexada a 5'-NH2-(C18-PEG-espaçador)-(C18-PEG-espaçador)-

<400> 241 gcguaccuga c

Claims

1. Uma molécula de ácido nucléico, preferencialmente ligando a SDF-1, selecionada entre o grupo compreendendo moléculas de ácido nu- cléico tipo A, moléculas de ácido nucléico tipo B, moléculas de ácido nucléi- co tipo C e moléculas de ácido nucléico tendo uma seqüência de ácido nu- cléico de acordo com qualquer de SEQ. ID. No. 142, SEQ. ID. No. 143 e SEQ. ID. No. 144.

2. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação1, por meio da qual as moléculas de ácido nucléico tipo A compreendem a seguinte seqüência de nucleotídeos de núcleo:5' AAAGYRACAHGUMAAXaUGAAAGGUARC 3' (SEQ.ID. 19) por meio da qual Xa ou está ausente ou é A.

3. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação2, por meio da qual as moléculas de ácido nucléico tipo A compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo selecionada entre o grupo com- preendendo 5' AAAGYRACAHGUMAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. No.20),5' AAAGYRACAHGUMAAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. No. 21), e 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. No. 22), preferencialmente a seqüência de nucleotídeos de núcleo compreende 5' AAAGYAACAHGUCAAUGAAAGGUARC 3' (SEQ. ID. No. 22).

4. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2 e 3, por meio da qual a molécula de ácido nucléico compre- ende na direção 5'->3' um primeiro trecho de nucleotídeos, a seqüência de nucleotídeos de núcleo, e um segundo trecho de nucleotídeos.

5. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2 e 3, por meio da qual a molécula de ácido nucléico compre- ende na direção 5'->3' um segundo trecho de nucleotídeos, a seqüência de nucleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos.

6. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 4 e 5, por meio da qual a molécula de ácido nucléico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e o referido primeiro e o referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio do qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

7. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 6, por meio da qual a estrutura de filamento duplo consis- te de quatro a seis pares de bases, preferencialmente cinco pares de bases.

8. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 7, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5'XiX2NNBV 3' (SEQ. ID. No. 44) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' BNBNX3X4 3' (SEQ. ID. No. 45) por meio da qual X1 ou está ausente ou R, X2 é S, X3 é S e X4 ou está ausente ou Y; ou Xi está ausente, X2 ou está ausente ou é S, X3 ou está ausente ou é S e X4 está ausente.

9. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 8, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' RSHRYR 3' (SEQ. ID. No. 23) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' YRYDSY 3'(SEQ. ID. No. 24), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5' GCUGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CGCAGC 3'.

10. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 8, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' X2BBBS 3' (SEQ. ID. No. 42) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nu- cleotídeos de 5' SBBVX3 3' (SEQ. ID. No. 43), por meio da qual X2 ou está ausente ou é S e X3 ou está ausente ou é S; preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5' CUGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CGCAG 3'; ou o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüên- cia de nucleotídeos de 5' GCGUG e o segundo trecho de nucleotídeos com- preende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CGCGC 3'.

11. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 2 a 10, por meio da qual a molécula de ácido nucléico tem uma seqüência de ácido nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 5 a 18, 25 a 41, 133, 137, 139 a 141.

12. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1, por meio da qual as moléculas de ácido nucléico tipo B compreendem a seguinte seqüência de nucleotídeos de núcleo: 5' GUGUGAUCUAGAUGUADWGGCUGWUCCUAGUYAGG 3' (SEQ. ID. No. 57).

13. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 12, por meio da qual as moléculas de ácido nucléico tipo B compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo de GUGUGAUCUAGAUGUA- DUGGCUGAUCCUAGUCAGG (SEQ. ID. No. 58):

14. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 12 e 13, por meio da qual a molécula de ácido nucléico com- preende na direção 5'->3' um primeiro trecho de nucleotídeos, a seqüência de nucleotídeos de núcleo, e um segundo trecho de nucleotídeos.

15. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 12 e 13, por meio da qual a molécula de ácido nucléico com- preende na direção 5'->3' um segundo trecho de nucleotídeos, a seqüência de nucleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos.

16. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 14 e 15, por meio da qual a molécula de ácido nucléico com- preende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e o referido primeiro e o referido segundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

17. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a 16, por meio da qual a estrutura de filamento duplo con- siste de quatro a seis pares de bases, preferencialmente cinco pares de ba- ses.

18. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a 17, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' XiX2SVNS 3' (SEQ. ID. No. 77) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' BVBSX3X4 3' (SEQ. ID. No. 78), por meio da qual X1 ou está ausente ou é A, X2 é G, X3 é C e X4 ou está ausente ou é U; ou X1 está ausente, X2 ou está ausente ou é G, X3 ou está ausente ou é C e X4 está ausente.

19. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a 18, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' X1GCRWG 3' (SEQ. ID. No. 59) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' KRYSCX4 3'(SEQ. ID. No. 60), por meio da qual X-i ou está ausente ou é A, e X4 ou está ausente ou é U.

20. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a 19, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' X-iGCGUG 3' (SEQ. ID. No. 75) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' UACGCX4 3' (SEQ. ID. No. 76), por meio da qual Xi ou está ausente ou é A, e X4 ou está ausen- te ou é U, preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5' AGCGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de .5' UACGCU 3'.

21. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 14 a 18, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' X2SSBS 3' (SEQ. ID. No. 73) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nu- cleotídeos de 5' BVSSX3 3' (SEQ. ID. No. 74), por meio da qual X2 ou está ausente ou G, e X3 ou está ausente ou C, preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5' GCGUG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' UACGC 3'.

22. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 12 a 21, por meio da qual a molécula de ácido nucléico tem uma seqüência de ácido nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 46 a 56, 61 a 72, e 132.

23. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação1, por meio da qual as moléculas de ácido nucléico tipo C compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo de GGUYAGGGCUHRXaA- GUCGG (SEQ. ID. No. 90), por meio da qual Xa ou está ausente ou é A.

24. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação23, por meio da qual as moléculas de ácido nucléico tipo C compreendem uma seqüência de nucleotídeos de núcleo selecionada entre o grupo com- preendendo 5' GGUYAGGGCUHRAAGUCGG 3' (SEQ. ID. No. 91),5' GGUYAGGGCUHRAGUCGG 3' (SEQ. ID. No. 92), e 5' GGUUAGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ. ID. No. 93), prefe- rencialmente a seqüência de nucleotídeos de núcleo compreende 5' GGUU- AGGGCUHGAAGUCGG 3' (SEQ. ID. No. 93).

25. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 23 e 24, por meio da qual a molécula de ácido nucléico com- preende na direção 5'->3' um primeiro trecho de nucleotídeos, a seqüência de nucleotídeos de núcleo, e um segundo trecho de nucleotídeos.

26. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 23 e 24, por meio da qual a molécula de ácido nucléico com- preende na direção 5'->3' um segundo trecho de nucleotídeos, a seqüência de nucleotídeos de núcleo, e um primeiro trecho de nucleotídeos.

27. A molécula de ácido nucléico de acordo com as reivindica- ções 25 e 26, por meio da qual a molécula de ácido nucléico compreende o primeiro e o segundo trecho de nucleotídeos e por meio da qual no mínimo uma parte do referido primeiro trecho e no mínimo uma parte do referido se- gundo trecho de nucleotídeos opcionalmente hibridizam um com o outro, por meio da qual na hibridização se forma uma estrutura de filamento duplo.

28. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 27, por meio da qual a extensão do primeiro trecho e a extensão do segundo trecho é individualmente e independentemente 0 a 17 nucleotídeos, preferencialmente 4 a 10 nucleotídeos e mais preferencialmen- te 4 a 6 nucleotídeos.

29. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 27 e 28, por meio da qual a estrutura de filamento duplo com- preende 4 a 10 pares de bases, preferencialmente 4 a 6 pares de bases, mais preferencialmente 5 pares de bases.

30. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 29, por meio da qual a estrutura de filamento duplo compreende 4 a 10 pa- res de bases consecutivos, preferencialmente 4 a 6 pares de bases conse- cutivos, mais preferencialmente 5 pares de bases consecutivos.

31. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 30, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' RKSBUSNVGR 3' (SEQ. ID. No. 120) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüên- cia de nucleotídeos de 5' YYNRCASSMY 3' (SEQ. ID. No. 121), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5' RKSBUGSVGR 3' (SEQ. ID. No. 122) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' YCNRCASSMY 3' (SEQ. ID. No. 123).

32. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 30, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' XsSSSV 3' (SEQ. ID. No. 124) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' BSSSXs 3' (SEQ. ID. No. 125), por meio da qual Xs ou está ausente ou é S.

33. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 30 e 32, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotí- deos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' SSSSR 3' (SEQ. ID. No. 130) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' YSBSS 3' (SEQ. ID. No. 131), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5' SGGSR 3' (SEQ. ID. No. 126) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotí- deos de 5' YSCCS 3' (SEQ. ID. No. 127).

34. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 30, 32, e 33 por meio da qual o primeiro trecho de nucle- otídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' GCSGG 3' (SEQ. ID. No. 128) e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüên- cia de nucleotídeos de 5' CCKGC 3' (SEQ. ID. No. 129), preferencialmente o primeiro trecho de nucleotídeos compreen- de uma seqüência de nucleotídeos de 5' GCCGG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CCGGC 3'.

35. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 30, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CGUGCGCUUGAGAU- AGG 3' e o segundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CUGAUUCUCACG 3'.

36. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 30, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' UGAGAUAGG 3' e o se- gundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CUGAUUCUCA 3'.

37. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 25 a 30, por meio da qual o primeiro trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' GAGAUAGG 3' e o se- gundo trecho de nucleotídeos compreende uma seqüência de nucleotídeos de 5' CUGAUUCUC 3'.

38. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 23 a 37, por meio da qual a molécula de ácido nucléico tem uma seqüência de ácido nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 79 a 89, 94 a 119, e 134 a 136.

39. A molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação1, por meio da qual a molécula de ácido nucléico tem uma seqüência de áci- do nucléico de acordo com quaisquer das SEQ. ID. Nos. 142 a 144.

40. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 39, por meio da qual a molécula de ácido nucléico é um antagonista para SDF-1.

41. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 39, por meio da qual a molécula de ácido nucléico é um antagonista do sistema receptor de SDF-1, por meio da qual preferencial- mente o receptor de SDF-1 do sistema receptor de SDF-1 é o CXCR4 recep- tor.

42. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 ou 41, por meio da qual o SDF-1 é um SDF-1 humano e/ou o receptor de SDF-1 do sistema receptor de SDF-1 é um receptor de SDF-1 humano.

43. A molécula de ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 42, por meio da qual SDF-1 compreende uma seqüência de aminoácido de acordo com a SEQ ID No. 1.

44. O ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindica- ções 1 a 43, em que o ácido nucléico compreende uma modificação.

45. O ácido nucléico de acordo com a reivindicação 44, por meio da qual a modificação é selecionada entre o grupo compreendendo uma porção HES e uma porção PEG.

46. O ácido nucléico de acordo com a reivindicação 45, por meio da qual a modificação é uma porção PEG consistindo de um PEG reto ou ramificado, por meio da qual o peso molecular da porção PEG tem preferen- cialmente a partir de cerca de 2 até 180 kD, mais preferencialmente a partir de cerca de 60 até 140 kD e o mais preferencialmente cerca de 40 kD.

47. O ácido nucléico de acordo com a reivindicação 45, por meio da qual a modificação é uma porção HES1 por meio da qual preferencialmen- te o peso molecular da porção HES tem a partir de cerca de 10 até 130 kD, mais preferencialmente a partir de cerca de 30 até 130 kD e o mais prefe- rencialmente cerca de 100 kD.

48. O ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindica- ções 1 a 47, por meio da qual os nucleotídeos do ácido nucléico são L- nucleotídeos, preferencialmente os nucleotídeos das seqüências de acordo com quaisquer das SEQ. ID. No. 19, 20, 21, 22, 57, 58, 90, 91, 92, e 93.

49. Uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 48 e opcionalmen- te um constituinte adicional, por meio da qual o constituinte adicional é sele- cionado entre o grupo compreendendo excipientes farmaceuticamente acei- táveis e agentes farmaceuticamente ativos.

50. Uso de um ácido nucléico de acordo com quaisquer das rei- vindicações 1 a 48 para a fabricação de um medicamento.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, por meio da qual o medicamento é para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou distúr- bio, por meio da qual semelhante doença ou distúrbio é mediado por SDF-1, preferencialmente semelhante doença ou distúrbio é selecionado entre o grupo compreendendo doenças do fundo de olho como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pâncreas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteos- sarcoma; melanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; síndromes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflamação; esclerose múltipla; artrite reumatóide / osteoartrite e nefrite.

52. Uso de acordo com a reivindicação 50, por meio da qual o medicamento é para inibir angiogênese, neovascularização, inflamação e metástase.

53. Uso de um ácido nucléico de acordo com quaisquer das rei- vindicações 1 a 48 para a fabricação de um meio diagnóstico.

54. Uso de acordo com a reivindicação 53, por meio da qual o meio diagnóstico é para o diagnóstico de uma doença, por meio do qual a doença, por meio do qual semelhante doença é mediada por SDF-1, prefe- rencialmente semelhante doença é selecionada entre o grupo compreen- dendo doenças do fundo de olho como retinopatia diabética e degeneração macular relacionada com a idade; câncer de mama, ovários, próstata, pân- creas, tiróide, nasofaringe, cólon, pulmão, e estômago; osteossarcoma; me- lanoma; glioma; medulo- e neuroblastoma; leucemia; síndrome WHIM; sín- dromes de deficiência imunológica; neovascularização patológica; inflama- ção; esclerose múltipla; artrite reumatóide / osteoartrite e nefrite.

55. Uso de acordo com a reivindicação 53, por meio da qual o meio diagnóstico é para diagnosticar angiogênese, neovascularização, in- flamação e/ou metástase.

56. Um complexo compreendendo SDF-1 e um ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 48, por meio das quais pre- ferencialmente o complexo é um complexo cristalino.

57. Uso de um ácido nucléico de acordo com quaisquer das rei- vindicações 1 a 48 para a detecção de SDF-1.

58. Um método para a triagem de um antagonista de SDF-1 ou um SDF-1 agonista compreendendo as seguintes etapas: - proporcionar um antagonista de SDF-1 candidato e/ou um SDF-1 agonista candidato, - proporcionar um ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 48, - proporcionar um sistema de teste o qual proporciona um sinal na presença de um antagonista de SDF-1 e/ou um SDF-1 agonista, e - determinar se o antagonista de SDF-1 candidato é um antago- nista de SDF-1 e/ou se o SDF-1 agonista candidato é um SDF-1 agonista.

59. Um método para a triagem de um SDF-1 agonista e/ou um antagonista de SDF-1 compreendendo as seguintes etapas: - proporcionar SDF-1 imobilizado para uma fase, preferencial- mente uma fase sólida, - proporcionar um ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 48, preferencialmente um ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 48 o qual é marcado, - adicionar um SDF-1 agonista candidato e/ou um antagonista de SDF-1 candidato, e - determinar se o SDF-1 agonista candidato é um SDF-1 agonis- ta e/ou se o antagonista de SDF-1 candidato é um antagonista de SDF-1.

60. O método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado em que a determinação é realizada de tal modo que é avaliado se o ácido nucléico é substituído pelo SDF-1 agonista candidato ou por um antagonista de SDF-1 candidato.

61. Um kit para a detecção de SDF-1, compreendendo um ácido nucléico de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 48.

62. Um antagonista de SDF-1 obtenível pelo método de acordo com quaisquer das reivindicações 58 a 60.