KR100926975B1 - 알지네이트로 코팅된 피브린／ｈａ 혼합체 스캐폴드를이용한 중간엽줄기세포의 분화방법 및 연골세포의 배양방법 - Google Patents

알지네이트로 코팅된 피브린／ｈａ 혼합체 스캐폴드를이용한 중간엽줄기세포의 분화방법 및 연골세포의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체내 적합성 및 내구성을 강화시킨 피브린/HA (hyaluronate) 혼합체를 이용한 중간엽 줄기세포의 분화방법, 연골세포의 배양방법 및 상기 피브린/HA (hyaluronate) 혼합체를 함유하는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 알지네이트로 코팅된 피브린/HA (hyaluronate) 혼합체 젤을 이용한 연골세포의 배양방법 및 중간엽 줄기세포로부터 연골세포의 분화방법 및 피브린분해 저해제를 함유하는 피브린/HA (hyaluronate) 혼합 지지체를 이용한 연골질환 치료용 조성물 및 디스크 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 종래 피브린/HA 혼합체가 배양 시에 단기간에 크기가 축소되고 쉽게 분해되었던 단점을 극복하여, 보다 안정적인 환경에서 새포를 배양할 수 있으며, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 뛰어난　생체 적합성 및 생분해성을 가져 효과적으로 연골질환을 치료할 수 있으며, 현재 사용되고 있는 퇴행성 추간판의 외과적인 수술 치료와는 달리, 새로운 추간판 수핵을 재생시킬 수 있어, 디스크의 근본적인 치료가 가능할 것으로 기대된다.
피브린, 히알유로네이트, 중간엽 줄기세포, 연골세포, 분화, 스캐폴드

Description

알지네이트로 코팅된 피브린／ＨＡ 혼합체 스캐폴드를 이용한 중간엽줄기세포의 분화방법 및 연골세포의 배양방법{Method For Differenciating Mesenchymal Stem Cell And Culturing Chondrocytes Using Alginate Coated Fibrin/Ha Composite Scaffold}
본 발명은 생체내 적합성 및 내구성을 강화시킨 피브린/HA (hyaluronate) 혼합체를 이용한 중간엽 줄기세포의 분화방법, 연골세포의 배양방법 및 상기 피브린/HA (hyaluronate) 혼합체를 함유하는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 알지네이트로 코팅된 피브린/HA (hyaluronate) 혼합체 젤을 이용한 연골세포의 배양방법 및 중간엽 줄기세포로부터 연골세포의 분화방법 및 피브린분해 저해제를 함유하는 피브린/HA (hyaluronate) 혼합 지지체를 이용한 연골질환 치료용 조성물 및 디스크 치료용 조성물에 관한 것이다.
조직공학 또는 세포치료제로서 연골을 제작하는 방법으로는 연골세포를 이용하는 방법과 중간엽 줄기세포를 이용하는 방법에 대한 연구가 진행 중이다. 연골세 포를 이용한 연골조직의 제작은 이미 생체 내 실험을 거친 방법들이 많이 보고되고 있으나, 중간엽 줄기세포를 이용하여 연골세포로의 분화를 유도하는 방법은 아직까지 명확히 제시되지 못하고 있다. 조직공학에서 줄기세포를 이용하여 연골을 제작하기 위해서는 조직공학의 3요소인 지지체, 세포 및 성장인자를 적절하게 응용하여 그 조건을 설정해야 하며, 이 중 지지체는 합성고분자 지지체와 천연고분자 지지체로 나뉘어 진다. 합성고분자들은 일반적으로 천연고분자에 비해 생체 적합성과 생분해성에 불리한 면이 많기 때문에, 천연고분자를 이용한 실험이 많이 행하여지고 있다.
생분해성 천연고분자 중 피브린 (fibrin)은 피브리노겐 (fibrinogen)에 트롬빈 (thrombin)을 혼합하여 고형화시킨 생분해성 천연 고분자로서, 지지체로 사용할 경우 생체 적합성, 생분해성, 연골 하골과의 접합성 등이 우수하다는 것이 보고되면서 여러 가지 용도로 사용되고 있다. 이러한 피브린은 연골재생에 있어서도 연골세포의 표현형을 유지시키면서 세포외 기질 분비에 효과적인 환경을 제공하여 연골조직 형성에 도움을 주고 결손 부위와의 결합이 용이한 장점이 있다. 그러나, 이상적인 지지체로서 사용되기 위해서는 물리적인 견고함을 가져야 한다는 문제를 안고 있으며 분해되는 속도가 빨라 세포의 분화 환경을 완벽히 지원해 주지 못한다는 단점을 지니고 있다.
HA (hyaluronate)는 글루쿠로닉 산/N-아세틸글루코사민 디사카라이드 단위가 연속하여 비황화 글루코사미노글리칸을 이루는 생체고분자로서, 지지체로 사용할 경우 연골세포의 이동과 증식을 증가시키고, 연골조직의 분해를 유도하는 싸이토카인인 IL-1β의 활성을 억제시키는 작용을 하여, 세포외 기질형성에 효과적이라고 보고되고 있다. 그러나 HA는 자연 상태에서는 완벽한 생체 적합성을 지니지만 지지체로 사용시 화학적 작용을 거치면서 생체 내에 이식되었을 때 생체 적합성이 떨어지게 된다는 문제점이 있다.
따라서, 피브린에 HA를 첨가하면 피브린의 구조를 안정화시킬 수 있고, 조직이 상처를 입었을 때 회복과정에서 가장 먼저 농도가 높아지면서 회복 기전에 중요하게 작용하는 물질이 피브린과 HA라는 점을 볼 때, 이 두 물질의 혼합물은 이상적인 천연고분자 물질로서 세포지지체에 사용될 수 있을 것이다. 이에, 본 발명자들은 피브린과 HA의 혼합체를 제조하여 중간엽 줄기세포의 분화에 사용한 결과 성장인자의 첨가 없이도, 중간엽 줄기세포가 연골세포로 분화되는 것을 확인하였다 (대한민국 등록특허 제 684940호). 그러나, 상기 피브린/HA 혼합체 스캐폴드는 생체 내에서 시간이 지남에 따라 부피가 감소하여 연골세포로의 분화가 저해되는 단점이 있었다.
현재까지 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 3차원 배양방법으로는 펠렛 (pellet) 배양과 알지네이트 비드 및 알지네이트 층 배양이 주로 이용되고 있다. 펠렛 배양은 연골세포의 표현형을 유지시키는데 효과적이라는 것이 보편적으로 알려져 있으며, 원심분리를 통해 쉽게 세포를 응집하여 세포와 세포간의 접합 효과를 유도하여 초기 연골 조직 생성과 비슷한 세포외 환경을 제공할 수 있다. 그러나 원심분리를 통한 응집만으로 줄기세포의 충분한 연골화 분화를 조건을 제공하지 못 하므로, 주로 TGF-β와 같은 성장인자를 첨가하여 연골세포로의 분화 (연골화)를 유도하고 있다.
또한, 알지네이트를 이용하여 연골화를 유도하는 방법은 세포를 알지네이트 비드에 인캡슐레이션 (encapsulation)시켜 세포주위에 생리적으로 적합한 환경을 제공하고, 쉽게 다룰 수 있을 정도의 기계적 강도를 제공하여 이식에 효과적인 방법으로 인식되고 있다. 그러나 실험실에서의 알지네이트 배양을 통한 줄기세포 분화를 유도할 때에는 성장인자를 첨가하지 않으면 연골화가 충분히 이루어지지 않고 생체 내 실험에서도 만족할만한 결과가 아직까지 보고되고 있지 않다.
3차원 배양에 주로 사용되는 TGF-β (transforming growth factor-β)는 생체 내에서 뼈와 연골의 발달에 있어서, 중요한 역할을 하는 물질로 알려져 있으며 마우스, 인간 및 토끼의 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 데에 효과적이라는 실험결과들이 많이 보고 되어있다.
척추 운동 부위에 영향을 주는 질병, 상해 또는 기형, 특히 원반 조직에 영향을 주는 경우를 치료하는데 있어서 손상, 파열 또는 쇠약해진 추간판의 일부 또는 전부를 제거하는 방법이 오랫동안 알려져 왔다. 척추 운동 부위로부터 제거되거나 또는 결핍된 추간판 조직을 포함하는 경우에, 제거된 추간판 조직에 의해 제거 이전에 분리되었던 척추골의 적절한 간격유지를 보장하기 위해 종래에는 외과적인 교정 수단을 삽입하였다.
그러나,　척추간 유합의 신체 역학적 엄격성이 인접한 척추 운동 부위에 영향을 주어 급격히 상태를 악화시킬 수도 있다는 우려가 의료계에 야기되어 왔다. 보 다 구체적으로, 천연의 추간판과는 달리, 척추 유합은 유합된 척추가 서로에 대하여 축회전 또는 회전하는 것을 방지한다. 그러한 운동성의 결여는 인접한 척추운동 부위에 스트레스를 증가시키는 경향이 있다. 뿐만 아니라, 인접한 척추 운동 부위에 디스크 변성, 추간판 탈출, 불안정, 척추 협착, 굳음증 및 후관절의 관절염을 포함하는 몇 가지 증상을 유발할 수도 있다.
그러므로, 외과적인 방법이 아닌 생물학적 방법으로 추간판을 재생시키는 방법의 개발이 절실한 실정이다.　
이에, 본 발명자들은 연골세포 및 중간엽 줄기세포의 3차원 배양에 있어서, 생체적합성과 내구성이 강화된 피브린/HA 혼합체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 및 지지체 분해 억제 인자들이 (어프로티닌, EACA 또는 엘라스타티날) 첨가된 피브린/HA 혼합체를 조직공학적 지지체 또는 세포전달체로 사용하였을 때, 종래 피브린/HA 혼합체 젤에서 관찰되었던 크기 축소나, 분해가 일어나지 않아 안정적으로 연골세포 배양 및 중간엽 줄기세포 분화를 촉진할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 생체내 적합성 및 내구성이 강화된 피브린/HA 혼합 지지체 젤을 이용한 연골세포의 배양방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생체내 적합성 및 내구성이 강화된 코팅된 피브린/HA 혼합 지지체를 이용한 중간엽 줄기세포의 분화방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 생체내 적합성 및 내구성이 강화된 피브린/HA 혼합 지지체를 함유하는 연골치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 생체내 적합성 및 내구성이 강화된 피브린/HA 혼합 지지체를 함유하는 디스크치료용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 고정된 피 브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지 체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; ((b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용 액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 종래 피브린/HA 혼합체가 배양 시에 단기간에 크기가 축소되고 쉽게 분해되었던 단점을 극복하여, 보다 안정적인 환경에서 새포를 배양할 수 있으며, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 뛰어난　생체 적합성 및 생분해성을 가져 효과적으로 연골질환을 치료할 수 있으며, 현재 사용되고 있는 퇴행성 추간판의 외과적인 수술 치료와는 달리, 새로운 추간판 수핵을 재생시킬 수 있어, 디스크의 근본적인 치료가 가능할 것으로 기대된다.
일 관점에서, 본 발명은 (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법에 관한 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상 기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 HA는 정상적인 연골기질의 필수적인 구성성분으로서 작용하며, 연골세포의 수 및 기질 합성을 증가시키며, HA의 분자량이 클수록 연골세포 분화에서 더 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다 (Goodstone, N. J. et al., Tissue Eng., 10:621, 2004).
그러므로, 본 발명에 있어서, 상기 HA의 분자량은 500~10,000kD인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 상기 (c) 단계의 코팅은 상기 피브린/HA 혼합 지지체를 소듐알지네이트 용액에 침적시켜 수행하고, 상기 코팅은 2~10회 반복하여 수행하여 적절한 두께의 알지네이트 코팅층이 형성된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하여 사용하였다.
본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 분화방법은 TGF-β 등의 성장인자를 첨가하지 않아도 중간엽 줄기세포를 고효율로 연골세포로 분화시킬 수 있으나, 성장인자를 첨가하여 사용하여도 무방하며, 성장인자를 첨가할 경우에는 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산을 첨가하는 것이 바람직히다.
본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직 또는 골수 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 및 골절로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 디스크 치료용 조성물은 척추동물의 손상된 수핵부분의 대체제로 외과적 수술을 통하여 삽입하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 본 발명의 일 양태에서는 상기 (c) 단계의 코팅은 상기 피브린/HA 혼합 지지체를 소듐알지네이트 용액에 침적시켜 수행하고, 상기 코팅은 2~10회 반복하여 수행하여 적절한 두께의 알지네이트 코팅층이 형성된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하였다.
본 발명에 따른 알지네이트 코팅층이 형성된 피브린/HA 혼합 지지체는 생체 내에서 연골세포 및 중간엽 줄기세포에 대하여 적합성이 뛰어난 기질을 제공하며, 자연성분으로, 생분해될 수 있는 장점이 있다.
알지네이트 코팅은 세포가 포함되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤에서는 사이즈의 변화가 없었으며 (무혈청 배지 및 10%FBS DMEM에서), 강도에 있어서는 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤이 코팅되지 않은 젤보다 강도가 센 것으로 확인되었다.
또한, 배양기간 중 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤보다 코팅되지 않은 젤에서 단백질 분비가 증가하는 것으로 나타나 알지네이트 코팅이 생체 내의 피브린/HA 혼합체 젤의 분해를 억제한다는 것을 알 수 있다.
조직학적 분석, 면역화학적 분석 및 화학적 분석의 결과, 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤이 코팅되지 않은 젤보다 연골화가 우수하게 진행되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 타입II 콜라겐 발현은 알지네이트 2중 코팅 및 4중 코팅 그룹에서 뚜렷하게 증가하는 양상을 나타내었다.
기계적 강도 또한 동일한 이식 기간을 가진 그룹 중에서 알지네이트 코팅된 그룹이 높은 기계적 강도를 가지는 것으로 확인되었다.
본 발명의 알지네이트 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤이 배양된 배지에서 더 많은 양의 글루코오스가 소비된 것으로 나타났으며, 이는 관절 연골의 산소 소비가 글루코오스에 의해 저해되며, 산소 농도가 저해될 때 연골세포에 의하여 글루코오스가 연골세포에 의하여 소비되기 때문이다. 그러므로, 글루코오스 소비가 증가하는 것은 연골세포가 활성상태라는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 그룹에서 NO 합성이 매우 저해되는 것으로 나타났다. NO 합성 저해제가 연골에서의 세포외기질 분해를 저해하기 때문에, NO 합성의 저해는 세포외기질(ECM)의 유지에 있어서 매우 중요한 인자이다. 그러므로, 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤에 의해서 NO 합성이 저해된다는 것은 상기 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤이 연골세포에 의한 연골형성에 적합한 환경을 제공한다는 것을 의미한다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법에 관한 것이다.
또다른 관점에서, 본 발명은 (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 피브린 분해억제제는 엘라스타티날인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 피브린 분해억제제는 EACA (epsilon aminocaproic acid) 또는 아프로티닌(aprotinin)을 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일양태에서 피브린/HA 복합체에 상기 피브린 분해억제제를 첨가하면, 배양시간에 따른 이식체 크기의 감소를 방지할 수 있으며, 물리적인 강도가 향상되고, 보다 효율적으로 연골세포로 분화되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 상기 EACA는 0.1mg/ml~ 10mg/ml의 농도로 첨가되는 것이 바람직하며, 아프로티닌은 1μg/ml~100μg/ml의 농도로 첨가되는 것이 바람직하고, 엘러스타티날은 1μg/ml~1mg/ml의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다. 상기 농도보다 낮은 농도로 첨가되면 피브린 분해억제능이 상실되며 상기 농도보다 높은 농도로 첨가되면 세포독성을 나타낼 우려가 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및 (d) 상기 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간 엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실험예에서는 본 발명에 따른 디스크 재생 방법으로 피브린/HA 혼합체를 사용한 방법에 관해서만 기술하고 있으나, 알지네이트로 코팅된 피브린/HA를 이용하여 디스크 재생 시술을 수행할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다.
실시예 1: 연골세포의 분리
토끼의 관절 연골로부터 다음과 같이 연골세포를 분리하였다.
수컷 토끼 (체중 250g)에 넴부탈 (Nembutal)을 과량의 주사하여 안락사 시키고, 무균상태에서 무릎 관절을 분리하였다. 분리된 관절을 세절한 후, PBS (phosphate buffered saline)로 세척하고, 0.2% 콜라게나아제 (Worthington Biochemical, USA)가 용해된 PBS 용액으로 37℃에서 5시간 동안 처리하였다. 처리 가 끝난 세포를 함유한 용액은 70μm 나일론 필터 (Falcon, USA)를 사용하여 여과한 후, 여과액을 1200rpm에서 10분간 원심분리하여 세포펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 PBS로 2회 세척한 후, 10% FBS (fetal bovine serum, Gibco BRL, USA), 100U/ml 페니실린 G (Gibco BRL, USA) 및 100μg/ml의 스트렙토마이신 (Gibco BRL, USA)이 함유된 DMEM (Dulbecco's modified eagles medium, Gibco BRL, USA)에 현탁시켰다.
세포수와 생존성은 트립판블루 테스트에 의하여 확인하였으며, 세포는 1.5x105 세포/cm2의 밀도로 평판배지에 분주하였고, 37℃의 5%CO2 배양기에서 배양하였다. 배양배지는 매일 교환하였으며, 일차 연골세포는 두번 계대배양하여 실험에 사용하였다.
실시예 2: 알지네이트로 코팅된 피브린/ HA 혼합체 젤의 준비
피브린/HA 혼합체 젤을 제조하기 위하여, 실시예 1에서 준비한 세포를 원심분리하여 펠렛형태로 만들고, 9~18mg/ml의 피브리노겐 (녹십자, 한국) 및 3000kDa의 HA(hyaluronate;LGCI, 한국) 10mg/ml 이 함유된 용액에 현탁시켰다. 5x106 세포/ml 농도의 연골세포 현탁액을 아프로티닌 (aprotinin; 녹십자, 한국), 60U/ml 트롬빈 (1000U/mg: Sigma, USA), 피브린 안정화인자 XII (fibrin stabilizaing factor XIII; 녹십자, 한국) 및 50mM CaCl2을 포함하는 용액으로 균질화시켰다.
상기 피브린/HA 혼합 용액 250μl를 페트리디쉬에 떨어뜨려 젤 형태를 만들고, 알지네이트로 코팅하기 위하여, 상기 젤 덩어리를 멸균된 100mM CaCl2 용액 1ml에 10분간 담근 후, 소듐알지네이트 (Sigma, 2.4% in 0.15M NaCl) 용액에 침적시켰으며, 그 결과, 0.5mm 두께의 고체 알지네이트 코팅층이 형성되었다. 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤은 0.15M NaCl로 세척하고, 최종적으로 CDM (chondrogenic defined medium, 표 1)으로 헹구어 주었다. 각각의 젤은 6 웰 배양접시에 이송하여, CDM 배지에서 배양하였다 (in vitro 배양 실험).
배양실험 그룹은 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤 그룹(F/H), 알지네이트 1중 코팅 젤 그룹(F/H+1AC), 알지네이트 2중 코팅 젤 그룹(F/H+2AC), 알지네이트 4중 코팅젤 그룹(F/H+4AC)로 나누어 실험하였다.
CDM 배지의 조성
성분 농도
High glucose DMEM (Gibco BRL, USA) Base
Antibiotic-antimycotic (Gibco BRL, USA) 1%
insulin 1.0mg /mL
selenious acid 0.5mg/mL
transferin 0.55mg/mL
ascorbic acid 50μg/mL
dexamethasone 100mM
proline 40μg /mL
BSA(bovine serum albumin) 1.25mg/mL
Sodium pyruvate 100μg/mL
실시예 3: 누드 마우스로의 이식
알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤과 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤은 누드 마우스로 이식하기 전에, 2시간 동안 배양배지에 침적시켰다. 무균상태에서 상기 두 그룹의 피브린/HA 혼합체 젤을 각 그룹당 15마리의 누드 마우스의 등쪽 피하에 동시에 이식하였다. 이식 후 1주, 2주 및 4주에 5마리씩의 마우스를 희생시키고, 추출한 피브린/HA 혼합체 젤의 무게를 재어, 수분함량을 측정하였다.
실시예 4: 피브린/ HA 혼합체 젤의 특징 분석
4-1. 크기변화
In vitro에서는 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 그룹들은 크기에서 뚜렷한 차이가 관찰되지 않았으나, 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤 그룹에서는 1 주일 째에 기존의 크기에 비하여 약 35% 정도 현저히 감소하였다. In vivo 이식 실험에서는 1 주일째 까지는 코팅된 그룹과 코팅되지 않은 그룹사이에 큰 차이가 없었으며, 시간이 지남에 따라 크기 차이가 났으며, 특히, 2중 및 4중 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤은 다른 그룹보다 1.5배 정도 컸다 (도 1).
4-2. 조직학적 및 면역조직화학적 분석
광학현미경으로 관찰후, 조직은 4% 포르말린 고정액에서 24시간동안 고정하였다. 알지네이트로 코팅된 조직시료는 2% sodium citrate를 이용하여 알지네이트를 제거한 후 고정하였다. 그 후, 시료를 파라핀으로 포매하고 4μm 두께로 섹션하였다. 시리얼 섹션들은 황산화 프로테오글리칸을 확인하기 위하여 사프라닌-O 및 alcian blue로 염색하였다.
모든 그룹의 피브린/HA 혼합체 젤에 함유된 세포는 세포기질에서 균질되게 분포하고 있었다. 사프라닌-O 염색으로 관찰한 결과, 혼합체 젤 내에서, 연골세포 특이적 라큐네 (lacunae)가 뚜렷하고 넓게 형성되어 있었다.
Alcian blue 염색결과에서도, 같은 그룹에서 축적된 황산화 프로테오글리칸이 관찰되었다. 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 그룹에서의 in vitro 배양된 조직에서는 어떠한 음성적 영향도 관찰되지 않았다 (도 2).
In vivo 이식에서는 모든 그룹의 피브린/HA 혼합체 젤에서 연골 특이적 ECM에 대하여 양성을 나타내었다. 사프라닌-O 염색에서 F/H 그룹의 페리페랄 (peripheral) 부위에서는 프로테오글리칸 축적이 약하게 관찰되었으나, 알지네이트 코팅 그룹에서는 같은 부위에서 진한 색깔의 양성염색이 확인되었다. 피브린/HA 혼합체 젤의 연골세포는 알지네이트 코팅에 의한 영향이 없었다. 세포들은 양호하게 연골을 형성하고 있었다 (도 2).
주요 ECM 단백질 및 저산소상태 마커로서, 타입 II 콜라겐 및 HIF-1α의 발현을 면역조직화학분석으로 확인하였다. 섹션은 70% 에탄올과 PBS로 순차적으로 세척한 다음, 3% H2O2/PBS로 처리하고, 0,15% Triton X-100을 첨가하였다. 1% BSA로 블러킹한 후, mouse anti-human type II collagen (1:500, Chemicon, USA)으로 1시간동안 반응시키고, 추가로 biotnylated secondary antibody로 반응시켰다. 최종적으로 horseradish peroxidase-conjugated avidin system (Vector Laboratories, USA)을 이용하여 단백질을 검출하였다. 면역염색된 섹션은 Mayer's hematoxylin(Sigma, USA)으로 카운터염색하여 현미경으로 관찰하였다 (Nikon E600, Japan).
4주째 샘플에서 타입 II 콜라겐은 모든 그룹에서 관찰되었으며, in vitro 배양의 2중 코팅 및 4중 코팅 그룹에서 더욱 뚜렷한 발현경향을 나타내었다 (도 3a). 한편, in vitro 및 in vivo에 관계없이 모든 그룹에서 HIF-1α는 차이를 보이지 않았다 (도 3b).
4-3: GAG 및 Hydroxyproline 함량 분석
샘플은 파파인 분해 용액 (125μg/ml 파파인, 5mM L-cystein, 100mM Na2HPO4, 5mM EDTA, pH 6.2)으로 60℃에서 16시간동안 분해하였다. 전체 GAG 농도는 DMB (1, 9-dimethylmethylene blue) 어세이 기술을 사용하여 분석하였다. 각각의 샘플을 DMB 용액과 혼합한 다음 225nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플의 전체 GAG는 0~5μg/ml 농도의 상어 condroitin sulfate (Sigma, USA)를 이용한 표준곡선을 사용하여 추정하였다.
Hydroxyproline 함량은 Stegemann 및 Stalder의 방법으로 측정하였다 (stegemann, H and Stalder, K, Clin . Chim . Acta, 18:267, 1967).
먼저, 동결건조한 샘플을 호모게나이저를 이용하여 증류수 (파파인 프로테아제 첨가)에 균질화시키고, 표준 hydroxyproline (0~50μg) 용액을 준비하였다. 샘플은 전체 50μl가 되도록 sodium hydroxide (최종농도 2N)와 혼합하였다. 120℃에서 20분간 가수분해 시킨후, 450μl의 chloramines-T를 첨가한 다음 25분동안 실온에서 산화시켰다. 그 후, 각 샘플에 500μl의 Enrlich's aldehyde 시약을 첨가하고, 65℃에서 20분간 반응시켜 chromophore 발색시켰다. 최종적으로, 550nm에서 ELISA READER를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
데이터는 각 시간대 별로 평균±표준편차로 나타내었다. 대조그룹과 실험그룹과의 비교는 GraphPad Instat program (GraphPad software Inc, USA)을 이용하여 one-way analysis (ANOVA)로 계산하였다.
모든 그룹에서 GAG 및 hydroxyproline의 총함량은 in vitro 및 in vivo 배양 동안 시간에 따라 모두 증가하였다. In vitro 배양에서, 평균 ECM 농도는 4주째에서 F/H 그룹은 927.8±27.5(μg/mg 건조중량) GAG이고, F/H+1AC 그룹은 1202.47±17.65(μg/mg 건조중량) GAG이었다 (도 4a).
Hydroxyproline 함량은 4주째 F/H 그룹에서 73.2±2.7(μg/mg 건조중량)이었고, F/H+2AC 그룹에서 89.1±5.95(μg/mg 건조중량)이었다 (도 4b). 상기 결과에서 F/H+2AC 그룹이 다른 그룹과 비교하여 통계학적으로 유의하게 차이를 나타내었으며, in vivo 이식에서도 in vitro 배양과 유사한 양상을 나타내었다.
특히, F/H 그룹보다 알지네이트 코팅된 그룹에서 1 주때 GAG 합성에 있어서 더욱 큰 양성적 효과가 나타났다. In vivo에서 hydroxyproline 함량은 F/H+2AC 그룹에서 가장 높은 레벨 (92.53±5.6)을 나타내는 것으로 측정되었다. GAG의 경우는 p<0.001을 통계학적으로 유의하다고 보았으며, hydroxyproline의 경우는 p<0.01을 통계학적으로 유의하다고 보았다.
4-4: 배지분석
각 젤에서의 교환 배지를 수집하여 연골세포의 대사 분석에 사용되는 글루코오스와 아질산염 함량을 측정하였으며, 또한, ELISA READER (BIO-TEK, Instruments, INC., USA)을 이용하여 피브린분해 효소의 농도를 측정하였다.
글루코오스 함량은 헥소키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로게나아제 및 NAD+를 포함하는 글루코오스 어세이 시약 (Sigma, USA)을 이용하여 측정하였다. 상기 시약 240μl를 12μl의 각 배지 샘플 또는 표준시약 (0~1.2g/L 글루코오스)에 첨가하고, 37℃에서 3분간 반응시킨 후, 340nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 알지네이트 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 그룹보다 코팅되지 않은 젤 그룹에서 높은 글루코오스 농도가 관찰되었다 (도 5a).
아질산염 (NO2-)은 질산 (NO)가 분해되면서 발생하는 것으로, Griess 시약 시스템(Invitrogen, USA)을 사용하여, 측정하였다. 우선, 50μl의 샘플 배지를 각 웰에 분주하고, 50μl의 sulfanilamide 용액을 첨가한 다음, 10분간 실온에서 정치한 후, 50μl의 NED 용액을 첨가하고 10분간 암소에 정치하였다. 최종적으로 30분 안에 520~550nm에서 흡광도를 측정하였다. 샘플의 아질산염 농도는 아질산염 표준용액 (0~100μM)으로 측정한 표준곡선으로 추정하였다.
그 결과, 알지네이트 코팅 그룹에서 코팅되지 않은 그룹에 비하여 유의하게 배지 내의 아질산염 레벨이 저해되었다. 특히, F/H+2AC 그룹의 질소 생산 레벨은 모든 그룹 중 가장 낮았다 (도 5b).
4-5: 분해속도 측정을 위한 젤 크기관찰 및 단백질 분비분석
모든 그룹을 무혈청 배지에서 2주동안 배양하였을 때, 젤의 크기에서 특별한 변화는 관찰되지 않았다. 그러나, F/H+2AC 그룹 및 F/H+4AC 그룹이 더욱 단단하고 견고 하였다 (도 6a).
분비된 단백질의 양은 ELISA(enzymelinked immunosorbent assay)를 이용하여 48 시간동안 측정하였다. 먼저, 희석된 알부민(BSA) 표준용액을 샘플버퍼와 유사하게 제조하였다. 100μl의 각 표준용액과 배양배지를 96웰 플레이트로 옮기고, 100μl의 working시약을 각 웰에 첨가하고, 플레이트 쉐이커로 30초 동안 섞어준 후, 37℃에서 30분간 반응시켰다. 562nm에서 표준용액과 샘플의 흡광도를 측정하였다.
F/H 그룹 및 F/H+2AC 그룹에서 분비된 단백질양은 배양시간에 따라 큰 차이를 보였으며, F/H 그룹이 보다 많은 양의 단백질을 분비하였다 (도 6b).
4-6: 피브리노라이틱 자이모그래피
배지의 피브리노라이틱 자이모그래피는 활성 분해효소의 존재하에서 측정하였다. 배지 샘플을 0.75mm 두께의 0.12%의 피브린을 첨가하여 공중합시킨 125 SDS-PAGE 젤을 이용하여, 10mA로 전기영동시켰다. 전기영동이 끝난 겔은 2.5% Triton X를 함유한 50mM Tris 버퍼 (pH 7.4)로 세척하여 SDS를 제거하고, 증류수로 30분간 세척하였다. 세척이 끝난 후, 젤은 200mM NaCl, 10mM CaCl2 및 0.02% NaN3를 함유하는 30mM Tris 버퍼 (pH 7.4)에서 37℃, 16시간동안 반응시켰다. 반응이 끝안 젤은 30% 메탄올로 1시간 동안 고정시킨 후, 코마시 블루 염색으로 피브린 젤을 염색하였다. 단백질의 이동은 low molecular range marker와 비교하여 확인하였다.
그 결과, 피브린 분해효소의 활성은 모든 그룹에서 차이가 없었으며. 28일간 배양한 배지에서도 알지네이트로 코팅된 그룹과 코팅되지 않은 그룹과의 분해효소 활성이 비슷한 양상을 보였다.
4-7: 기계적 강도 분석
In vivo 이식 실험에서 회수된 시료를 가지고, Universal Testing Machine (Model H5K-T, H. T. E., England)를 이용한 unconfined compression 시험을 실시하였다. 기계의 바닥 압반 (platen)에 놓인 각 샘플은 1mm/min으로 압착되었으며, 정상 압판과 바닥 압반 사이의 프로그램된 길이로 움직인 후 자동적으로 멈추었다. Load-displacement 곡선으로부터 피크로드가 얻어지면, 개개의 압착력을 수집하여, 통계적으로 분석하였다.
그 결과, 코팅되지 않은 그룹보다 알지네이트 코팅된 그룹이 더 강한 견고성을 나타내으며, 알지네이트로 코팅된 그룹들 사이에서는 압착력에 있어서 차이가 나타나지 않았다 (도 7).
실시예 5: 피브린 분해억제제를 첨가한 피브린/ HA 혼합체 젤의 제조
실시예 1에서 준비한 세포를 원심분리하여 펠렛형태로 만들고, 9~18mg/ml의 피브리노겐 (녹십자, 한국) 및 3000kDa의 HA(hyaluronate;LGCI, 한국) 10mg/ml 이 함유된 용액에 현탁시켰다. 5x106 세포/ml 농도의 연골세포 현탁액을 아프로티닌(aprotinin; 녹십자, 한국), 60U/ml 트롬빈(1000U/mg: Sigma, USA), 피브린 안정화인자 XII(fibrin stabilizaing factor XIII; 녹십자, 한국) 및 50mM CaCl2을 포함하는 용액으로 균질화시켰다.
상기 피브린/HA 혼합 용액 250μl를 페트리디쉬에 떨어뜨려 젤 형태를 만들고, 피브린 분해 억제제인 EACA (epsilon aminocaproic acid), 아프로티닌 (aprotinin), 엘라스타티날(elastatinal)을 표 2에 나타낸 실험군으로 나누어 첨가하였다.
피브린 분해 억제제 첨가군의 조성
F F/A F/D F/E F/A+D F/A+E F/D+E F/A+D+E
Aprotinin (20μg/ml) X O X X O O X O
Elastinal (50 μg /ml) X X O X O X O O
EACA(2mg/ml) X X X O X O O O
상기 각 실험군의 피브린/HA 혼합체 젤은 DMEM(10%NCS)이 담긴12웰 플레이트에서 2주간 배양한 후, 크기 및 물성의 변화를 측정하였다.
그 결과, 대조군의 피브린/HA 혼합체 젤이 다른 피브린 분해억제제가 첨가된 피브린/HA 혼합체 젤 군보다 크기가 줄어들었으며, 크기 축소는 배양 1주째부터 일어났다. 2주 째에는 아프로티닌과 EACA가 첨가된 군의 크기가 가장 작았으며, 모든 실험군이 1주째에 비하여 더 윤기가 흘렀다 (도 8).
실시예 6: 피브린 분해억제제를 첨가한 피브린/ HA 혼합체 젤의 누드마우스로의 이식
실시예 5에서 제작된 피브린 분해억제제를 첨가한 피브린/HA 혼합체 젤 실험군을 18마리의 누드마우스의 등에 피하이식하였다. 이식된 마우스는 1주, 2주 및 4주째에 희생시켜, 이식체를 회수하였다.
이식체의 부피 측정 결과, 크기가 가장 적게 축소된 군은 엘라스타티날을 첨가한 군 (F/D)이었으며, 이러한 경향은 이식 4주째에 두드러지게 확인되었다. 그러나, F/A+D군은 엘라스타티날을 첨가하였슴에도 불구하고 크기가 매우 축소되었다 (도 9).
실시예 7: 피브린 분해억제제를 첨가한 피브린/ HA 혼합체 젤의 특징 분석
피브린 분해억제제를 첨가한 피브린/HA 혼합체 젤에 대하여, 실시예 4와 동일한 방법으로 조직학적 및 생화학적 분석과 강도를 측정하였다.
그 결과, 이식 2주 째에, F/D 및 F/E 군이 다른 군과 비교하여 월등한 결과를 나타내었다. 모든 실험군은 연골과 비슷한 형태를 형성화였으며, 전체 기간동안 사프라닌-O 염색과 Alcian Blue 염색에서 양성을 나타내었다. GAG의 축적은 시간이 경과함에 따라 증가한 것으로 확인되었다.
4 주째에 90% 이상의 면적에서 분화된 연골세포의 라큐네 특성과 연골형성이 관찰되었으며, Alcian Blue 염색에서도 강한 양성 염색이 관찰되었다 (도 10의 a)
F/A와 F/D 그룹에서 보다 많은 타입 II 콜라겐이 발현되으나 (도 10의 b). F/D 그룹에서 부피변화와 연골조직 같은 metachromatic 염색 및 타입 II 콜라겐 발현이 가장 확실하게 나타났다.
기계적 강도를 확인한 결과에서는, in vitro에서 1주 및 2주 배양한 피브린/HA 혼합체 젤에서, 한 종류의 피브린 분해억제제를 첨가한 군 (F/A, F/D, F/E)에서는 압착력에 차이가 없었으나, 두종류 이상의 피브린 분해억제제를 혼합하여 첨가한 군 (F/A+D, F/A+E, F/D+E, F/A+D+E)에서는 매우 강한 견고성을 나타내었다. 또한, 누드 마우스에 이식된 기간동안 기계적 단단함은 증가하였다. 특히, 엘라스타티날이 첨가된 군 (F/D, F/A+D, F/D+E, F/A+D+E)이 대조군에 비하여 아주 강한 단단함을 나타내었다 (도 11).
실시예 8: 디스크 동물모델 제작 및 피브린/ HA 혼합 지지체의 이식
SD 계열 흰쥐 (300g)를 ketamine 마취액으로 마취시킨 후, 꼬리 부분을 베타딘 용액으로 소독하고 척추간판 부위 피부를 절개하고 척추간판 부위를 노출시켰다. 22G 주사바늘을 이용하여 추간판의 수핵 부분을 제거하고 수핵 부위에 상기 실시예 5에서 제작한 피브린 분해억제제를 함유하는 피브린/HA 혼합체 젤 (F/A+D+)을 20μl 주사한 후, 피부는 4-0 나일론 실로 봉합하고 8주간 양육하였다.
실험그룹은 3개 그룹으로 나누고, 그룹 1은 수핵 부분을 제거하고 다른 치료를 하지 않은 대조군, 그룹 2는 수핵 부분을 제거하고 fibrin/HA 혼합체만 이식한 그룹, 그룹 3은 수핵 부분을 제거하고 fibrin/HA + cells 혼합체를 이식한 그룹으로 나누었다. 이식술 후 쥐는 2, 4, 8 주에 희생시키고 분석을 진행하였다.
실시예 9: 단순 육안적 및 조직학적 검사
피브린/HA 혼합체를 이식한 그룹은 추간판의 수핵 부분이 점차적으로 재생이 되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 8주 때에는 대조군과 fibrin/HA만 이식한 군과 비교하여 현저한 재생효과를 관찰할 수 있었다 (도 12).
이식 술 후 2, 4, 8 주에 얻은 추간판 조직을 횡단면 및 종단면으로 절편하여 Safranin O/Fat green 염색을 진행하여 단백 다당의 형성을 관찰하였다 (도 13).
단순 방사선 (X-ray) 검사를 통해 추간판 높이의 변화, 추간판 주위의 골극의 형성 등을 관찰한 결과, 피브린/HA와 줄기세포를 이식한 그룹은 추간판의 높이를 어느 정도 잘 유지되는 것을 관찰 할 수 있었다 (도 14). 그러나 대조군과 피브린/HA만 이식한 그룹 간에는 현저한 차이를 발견하지 못했다.
또한 본 실시예의 결과는 피브린/HA + 줄기세포 또는 연골세포 혼합체를 추간판 질환 치료의 임상적용을 위한 전임상 실험적 근거를 제공하며 현재 사용되고 있는 퇴행성 추간판의 수술적인 치료와는 근본적으로 다른 새로운 생물학적인 세포치료 방법을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 및 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤의 배양기간에 따른 외양 변화를 나타낸 사진이다.
도 2는 in vitro 및 in vivo에서의 본 발명에 따른 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 및 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤의 사프라닌-O 염색(x200, x40) 및 alcian blue(x40) 염색 결과를 나타낸 조직학적 분석 사진이다.
도 3은 in vitro에서 본 발명에 따른 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 및 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤의 타입 II 콜라겐 및 HIF-1α 발현을 면역조직화학적으로 확인한 사진이다 (x200).
도 4는 in vitro 및 in vivo에서의 본 발명에 따른 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 및 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤의 GAG 및 hydroxyproline의 총 함량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 in vitro에서 본 발명에 따른 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 및 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤의 배양배지에서 글루코오스(a) 및 아질산염(b)의 농도를 나타낸 것이다.
도 6은 in vitro에서 세포를 첨가하지 않은 F/H 그룹의 전체 모양(a)과 단백질 분비 결과(b) 및 피브리노라이틱 자이모그래피의 결과(c)를 나타낸 것이다.
도 7은 in vivo 이식에서 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합체 젤 및 코팅되지 않은 피브린/HA 혼합체 젤의 기계적 강도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 in vitro에서 배양된 피브린 분해억제제가 첨가된 피브린/HA 혼합체 젤의 사진 및 부피변화 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 in vivo에 이식된 피브린 분해억제제가 첨가된 피브린/HA 혼합체 젤의 사진 및 부피변화 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 피브린 분해억제제가 첨가된 피브린/HA 혼합체 젤의 조직학적 및 생화학적 분석결과를 나타낸 것이다.
도 11은 피브린 분해억제제가 첨가된 피브린/HA 혼합체 젤의 기계적 강도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따른 피브린/HA 혼합체 젤이 이식된 추간판 수핵의 재생정도를 육안으로 나타낸 사진이다.
도 13은 본 발명에 따른 피브린/HA 혼합체 젤이 이식된 추간판 수핵의 재생정도를 Safranin O/Fat green 염색을 통해 조직학적으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는은 본 발명에 따른 피브린/HA 혼합체 젤이 이식된 추간판 수핵의 재생정도를 단순 방사선(X-ray) 검사를 통해 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

Claims (56)

  1. 다음 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법:
    (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및
    (d) 상기 알지네이트로 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HA의 분자량은 500~10,000kD인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 코팅은 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 소듐알지네이트 용액에 침적시켜 수행하는 것을 특징으로 하고, 상 기 코팅은 2~10회 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, (b) 또는 (d) 단계에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 다음 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법:
    (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및
    (d) 상기 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계.
  6. 제5항에 있어서, 상기 HA의 분자량은 500~10,000kD인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 (c) 단계의 코팅은 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 소듐알지네이트 용액에 침적시켜 수행하는 것을 특징으로 하고, 상기 코팅은 2~10회 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제5항에 있어서, (b) 또는 (d) 단계에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용 액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (c) 단계의 코팅은 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 소듐알지네이트 용액에 침적시켜 수행하는 것을 특징으로 하고, 상기 코팅은 2~10회 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 및 골절로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제10항에 있어서, (b) 또는 (d)단계 에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 다음 단계를 포함하는 연골세포의 배양방법:
    (a) 일차 배양된 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및
    (d) 상기 알지네이트로 고정된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정되어 있는 연골세포를 배양하는 단계.
  37. 제36항에 있어서, 상기 HA의 분자량은 500~10,000kD인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 피브린 분해억제제는 엘라스타티날 (elastatinal) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 피브린 분해 억제제는 EACA (epsilon aminocaproic acid) 또는 아프로티닌 (aprotinin)을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제36항에 있어서, (b) 또는 (d) 단계에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 다음 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법:
    (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA 5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계;
    (b) 상기 혼합용액에 CaCl2, 팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하고, 피브린 분해억제제를 첨가하여 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 중간엽 줄기세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅시키는 단계; 및
    (d) 상기 알지네이트로 코팅된 피브린/HA 혼합 지지체에 고정된 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계.
  42. 제41항에 있어서, 상기 피브린 분해억제제는 엘라스타티날 (elastatinal) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 피브린 분해 억제제는 EACA (epsilon aminocaproic acid) 또는 아프로티닌 (aprotinin)을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제41항에 있어서, (b) 또는 (d) 단계에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 HA의 분자량은 500~10,000kD인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제41에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 배아, 성체조직 또는 골수 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하고, 피브린 분해억제제를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 연골질환 치료용 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 피브린 분해억제제는 엘라스타티날 (elastatinal) 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 피브린 분해 억제제는 EACA (epsilon aminocaproic acid) 또는 아프로티닌 (aprotinin)을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제47항에 있어서, (b) 또는 (d) 단계에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제47항에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 및 골절로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. (a) 일차 배양된 중간엽 줄기세포 또는 연골세포와 피브리노겐 50~95중량%와 HA　5~50중량%로 구성된 피브리노겐/HA 용액을 혼합하는 단계; (b) 상기 혼합용액에 CaCl2,　팩터 VIII 및 트롬빈을 첨가하여 피브린/HA 혼합 지지체를 제조하고, 피브린 분해억제제를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 알지네이트로 코팅하는 단계를 거쳐 제조된, 중간엽 줄기세포 또는 연골세포가 고정된 피브린/HA 혼합 지지체를 유효성분으로 함유하는 디스크 치료용 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 피브린 분해억제제는 엘라스타티날 (elastatinal) 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 피브린 분해 억제제는 EACA (epsilon aminocaproic acid) 또는 아프로티닌 (aprotinin)을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제52항에 있어서, (b) 또는 (d) 단계에서 TGF-β1, IGF-1, BMP-2 및 아스코르브산으로 구성되는 군에서 선택되는 성장인자를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  56. 제52항에 있어서, 상기 연골질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염 및 골절로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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