KR101863344B1

KR101863344B1 - 줄기세포의 무혈청 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 항노화용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101863344B1
Application number: KR1020160089727A
Authority: KR
Inventors: 김대용; 양민아
Original assignee: 주식회사 엔바이오텍; 김대용
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2018-06-01
Also published as: KR20180008016A

Abstract

본 발명은 피부 항노화 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 본 발명은 기본 배지와 세포활성화제를 포함하고 동물 유래의 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지 조성물을 이용하여, 저산소 조건에서 줄기세포를 배양한 후, 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 함유하는, 피부 노화의 방지 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액은 엘라스타아제의 활성과 MMP-1의 활성을 억제하는 효과가 있고, 콜라겐의 합성을 향상시키는 효과가 있는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부에 자극을 일으키지 않는 피부 탄력 및 주름 개선을 위한 기능성 화장품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포의 무혈청 배양액을 유효성분으로 함유하는 피부 항노화용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Skin Anti-aging Comprising Serum-Free Cultured Medium of Stem Cellsn as an Effective Ingredient}

본 발명은 피부 외용제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피부 항노화 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람은 나이가 들면서 피부 노화가 일어나게 되는데, 이러한 피부 노화는 그 요인에 따라 ⅰ) 환경 변화와는 무관하게 나이가 들어감에 따라 피부의 구조와 생체의 생리학적 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 내인성 노화(intrinsic aging)와 ⅱ) 자외선, 건조한 공기, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS), 스트레스 등의 외적 요인에 의해 유발되는 외인성 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있는데, 내인성 노화는 잔주름, 피부 건조증, 탄력 감소 등의 경미한 임상 특징을 나타내고, 외인성 노화는 굵고 깊은 주름과 함께 잔주름까지도 많이 발생하는 임상 특징을 나타내므로, 이러한 피부 탄력 감소나 주름(wrinkle)은 위와 같은 피부 노화의 대표적인 증상이라 할 수 있다.

위와 같이 피부 탄력이 감소하고 주름이 발생하는 대표적인 원인은 피부의 진피에서 세포외기질(extracellular martix, ECM)을 형성하는 주요 구성성분인 콜라겐(collagen)의 분해에 있다. 콜라겐은 섬유아세포(fibroblast)에서 합성되며, 피부에 높은 농도로 존재하면서, 피부의 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착, 세포 분할과 분화 유도 등의 역할을 하는데, 트립신과 같은 단백질 분해효소에는 영향을 받지 않으나, 콜라게나아제(collagenase)에 의해 분해된다.

위와 같은 콜라게나아제의 활성을 나타내는 대표적인 효소로 MMPs(matrix metalloproteinases)를 들 수 있는데, 이러한 MMPs는 피부 진피의 콜라겐을 포함한 결합 조직 성분을 분해하기 때문에, 그 활성이 높아지면 피부 조직 내의 콜라겐 함량이 저하되어 피부 탄력이 저하되고 주름이 유발된다. 주로 피부에서는 MMP-1, MMP-2, MMP-9 등이 작용을 하는데, 콜라겐의 분해와 관련하여 가장 근본적으로 작용하는 효소는 MMP-1이다. 이러한 MMPs의 활성은 자외선의 조사량이 높을수록 특히 증가하는 것으로 보고되어 있는데, 특히 자외선 B(UVB)는 피부 세포 내 ROS를 생성하여 직접 DNA의 손상을 일으켜 항산화 방어 체계의 불균형에 의한 산화적 스트레스를 유발시킬 뿐만 아니라, MMPs의 활성을 증가시켜 결합 조직 성분의 분해, 절단 및 비정상적인 교차 결합에 의하여 주름을 유발시킨다. 결국, 자외선에 의한 ROS은 MMPs를 증가시켜 콜라겐의 생성과 탄력 섬유의 합성을 감소시킴으로써 주름을 유발하는, 피부 노화의 주된 원인인 것이다. 따라서 피부 탄력이나 주름을 개선하는 방법으로는 ⅰ) 콜라겐 합성을 촉진하거나, 또는 ⅱ) 콜라게나아제의 생성 및 활성을 억제하는 방법이 이용될 수 있다. 그러나 아직까지는 보다 안전하고 우수한 피부 탄력 및 주름 개선 효과를 가지는 화장료의 개발이 더 필요한 실정이다.

본 발명은 생체에 부작용이 없으면서 피부 노화의 방지 또는 개선 효과가 우수한 새로운 유효성분과, 이러한 유효성분의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 노화의 방지 또는 개선에 우수한 효과를 갖는 피부 외용제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기본 배지와 세포활성화제를 포함하고 동물 유래의 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지 조성물을 이용하여, 저산소 조건에서 줄기세포를 배양한 후, 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 함유하는, 피부 노화의 방지 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 상기 세포활성화제는 비타민(Vitamin), L-오르니틴(L-ornithine), 트랜스페린(transferrin), 셀레늄(selenium), 에탄올아민(ethanolamine), 하이드로코르티손(Hydrocortison), 에피네프린(eponephrine), BSA(Bovien Serum Albumin), 덱사메타손디나트륨인산염(Dexamethasone Disodium Phosphate), 푸트레신중염산염(Putrescine dihydrochloride), bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 인슐린(insulin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다.

또한, 상기 동물은 소이고, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 특히 지방 유래 성체 줄기세포이다.

또한, 상기 피부 노화는 피부 주름 발생 또는 피부 탄력 감소이다.

본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액은 엘라스타아제의 활성과 MMP-1의 활성을 억제하는 효과가 있고, 콜라겐의 합성을 향상시키는 효과가 있는바, 이를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 피부에 자극을 일으키지 않는 피부 탄력 및 주름 개선을 위한 기능성 화장품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과들은 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 아니한 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 세균 배지{TSA(A)} 및 진균(SCA) 배지에 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액을 도말하여 배양하고, 콜로니 생성 여부를 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 2는 표준 농도에 따라 희석된 CSE(Control Standard Endo-toxin)의 농도별 반응 속도 측정값의 그래프이다.
도 3은 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액의 세포 독성을 확인한 결과로서, (A)는 시간별로 각 군의 OD 값을, (B)는 군별로 각 시간에서의 OD 값을 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 도 7은 각각 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액의 엘라스타아제 활성 억제 효과(도 4), MMP-1 활성 억제 효과(도 5), 콜라겐 합성 촉진 효과(도 6) 및 UV-A에 의해 손상된 섬유아세포의 재생 효과(도 7)을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 피부 노화의 방지 또는 개선을 위한 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 기본 배지; 및 세포활성화제;를 포함하고 동물 유래의 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지 조성물을 이용하여, 저산소 조건에서 줄기세포를 배양한 후, 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 함유한다.

상기 기본 배지는 동물 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 공지의 배지들로서, 예컨대 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium MesemCult-XF Medium 등일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 아니한다.

상기 세포활성화제는 비타민(Vitamin), L-오르니틴(L-ornithine), 트랜스페린(transferrin), 셀레늄(selenium), 에탄올아민(ethanolamine), 하이드로코르티손(Hydrocortison), 에피네프린(eponephrine), BSA(Bovien Serum Albumin), 덱사메타손디나트륨인산염(Dexamethasone Disodium Phosphate), 푸트레신중염산염(Putrescine dihydrochloride), bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 인슐린(insulin) 중 적어도 하나일 수 있다.

상기 비타민은 비타민 B1, 비타민 B12, 비타민 C 및 비타민 E로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 상기 비타민이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 비타민은 상기 배지 조성물에 대하여 1 ㎍/㎖ 내지 7 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 L-오르니틴이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 L-오르니틴은 상기 배지 조성물에 대하여 5 ng/㎖ 내지 20 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 트랜스페린이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 트랜스페린은 상기 배지 조성물에 대하여 5 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 셀레늄이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 셀레늄은 상기 배지 조성물에 대하여 0.5 ng/㎖ 내지 5 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 에탄올아민이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 에탄올아민은 상기 배지 조성물에 대하여 0.01 ㎎/㎖ 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 하이드로코르티손이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 하이드로코르티손은 상기 배지 조성물에 대하여 0.05 ㎍/㎖ 내지 1.0 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 에피네프린이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 에피네프린은 상기 배지 조성물에 대하여 1 ㎍/㎖ 내지 15 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 BSA가 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 BSA는 상기 배지 조성물에 대하여 1 ㎎/㎖ 내지 50 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 덱사메타손디나트륨인산염이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 덱사메타손디나트륨인산염은 상기 배지 조성물에 대하여 10 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 푸트레신중염산염이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 푸트레신중염산염은 상기 배지 조성물에 대하여 1 ㎍/㎖ 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 bFGF가 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 bFGF는 상기 배지 조성물에 대하여 1 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 EGF가 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 EGF는 상기 배지 조성물에 대하여 0.05 ng/㎖ 내지 5 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 상기 인슐린이 세포활성화제의 일 성분으로 이용되는 경우, 상기 인슐린은 상기 배지 조성물에 대하여 1 ng/㎖ 내지 50 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 줄기세포 배양용 배지 조성물은 동물 유래의 혈청 및 그의 유사물을 실질적으로 포함하지 아니한다. 상기 혈청이 유래하는 동물은 소, 말, 돼지, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 양, 염소 또는 닭일 수 있고, 특히 소, 개 또는 말 등일 수 있다. 아울러, 상기 동물 유래 혈청의 유사물로는 대표적으로 BPE(Bovine Pituitary Extract)를 들 수 있다. 또한, 상기 동물 유래의 혈청을 '실질적'으로 포함하지 않는다는 것은 상기 동물 유래의 혈청을 5%(v/v) 이하의 농도로 포함하거나, 바람직하게는 3%(v/v) 이하의 농도로, 더욱 바람직하게는 1%(v/v) 이하의 농도로 포함하는 것을 의미하거나, 가장 바람직하게는 상기 동물 유래의 혈청을 전혀 포함하지 않는 것을 의미한다.

상기 줄기세포는 인간을 포함하는 포유동물에서 유래한 줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 성체 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 지방 조직에서 유래한 성체 줄기세포일 수 있다.

상기 저산소 조건은 산소 농도가 1~5%인 조건을 의미하고, 비록 데이터를 도시하지는 않았지만, 상기 배지 조성물의 경우 산소 농도가 20~25%인 정상 산소 조건에 비해 산소 농도가 1~5%인 저산소 조건에서 배양한 경우에 더욱 우수한 증식 효과를 얻을 수 있는 것으로 확인되었다.

상기 배양액은 상기 무혈청 배지 조성물을 이용하여, 저산소 조건에서 줄기세포를 배양한 후, 배양된 줄기세포를 제거하고 남은 배양액이다. 상기 배양액은 공지의 방법에 따라 얻어질 수 있는데, 예컨대 줄기세포를 배양한 후 세포배양액을 회수하고, 회수된 배양액을 마이크로 시린지 필터를 이용하여 여과함으로써 줄기세포가 제거된 배양액을 얻을 수 있다. 마이크로 필터의 세공 크기(pore size)는 줄기세포를 제거할 수 있는 크기 내에서 적절하게 선택할 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 10㎛이다.

상기 배양액은 엘라스타아제와 MMP-1의 활성을 억제하는 동시에, 콜라겐의 합성을 향상시키는 효과가 있다. 따라서 상기 배양액이 유효성분으로 포함된 본 발명의 피부 노화의 방지 또는 개선을 위한 화장료 조성물은 피부 주름 발생 또는 피부 탄력 감소를 방지 또는 개선하기 위한 용도로 이용될 수 있고, 특히 UV에 의한 피부 주름 발생 또는 피부 탄력 감소를 방지 또는 개선하기 위한 용도로 이용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액이 인간 섬유아세포 Hs68에서 농도의존적으로 엘라스타아제 활성 및 MMP-1 활성을 억제하였고(도 4 및 도 5 참고), 콜라겐의 합성을 향상시켰을 뿐만 아니라(도 6 참고), UVB를 조사하여 손상된 인간 섬유아세포 Hs68를 재생시키는 효과가 있음을 확인하였다(도 7 참고).

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 카수아릭틴 외에, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 예를 들면 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 등과 같은 통상적인 보조제나 담체가 통상적으로 사용되는 양으로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 상기 카수아릭틴과 반응하여 위와 같은 피부 노화 방지 또는 개선 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존),벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에칠디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조익애씨드(파바) 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등과 같이 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형으로 제조될 수 있다. 상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있고, 상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 상기 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 상기 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

인간 지방 유래 성체 줄기세포의 수득

<1-1> 지방 조직의 채취

건강한 중년여성 기증자로부터 지방 조직에 대한 연구용 목적의 사용 동의를 얻은 후 IRB 승인 절차(승인번호: P01-201510-31-001)를 거쳐 기증자의 복부에서 지방조직의 채취를 실시하였다.

구체적으로, 기증자의 복부를 소독 한 후 리도카인(Lidocaine)을 사용하여 지방을 채취할 부위에 국소 마취를 하였다. 30분간 국소 마취 후, 배꼽 부위를 약 1∼2㎜ 정도 절개한 다음, 피하 지방층에 약 100㎖의 생리식염수(Saline)를 주입하고, 주사기에 캐뉼라(Cannula)를 연결하여 피하 지방을 채취하였다. 그런 다음, 주사기에 캡(Cap)을 씌워 채취한 지방 조직을 10℃가 유지되는 보관 용기에 담아서 실험실로 운반하였다.

<1-2> 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 분리

상기 실시예 <1-1>에서 채취한 지방 조직을 PBS 완충용액으로 세척하여 지방 조직에 섞여 있던 혈액을 제거한 뒤, 지방 조직에 동량의 부피의 Collagenase solution(SERVA^®)을 처리하고, 37℃의 진탕배양기에서 40분 동안 지방 조직을 효소 처리하였다. 효소 처리가 끝난 후, DMEM(CELLGRO) 배양액을 넣어서 남아있는 콜라게나아제를 세척하고, 1500rpm에서 5분간 원심분리를 하여 상층액을 제거한 후, 100㎛ 구멍을 가진 필터에 불필요한 조직들을 여과하였다. 상기와 같이 여과 된 세포 분획을 다시 1500rpm에서 5분간 원심분리하여 DMEM(CELLGRO) 배양액에 넣어 세포가 잘 현탁되도록 섞어 주었다. 그 중 10㎕를 취하여 1회용 혈구계수기(C-CHIP, DIGITALBIO, KOREA) 주입구에 넣어 1분간 정치시킨 후, 지방 유래 줄기세포(Adipose-derived stem cell, 이하 ASC라고 합니다)를 계수하였다. 세포 배양용기에 DMEM(CELLGRO) 배양액을 넣고, 계수한 세포를 세포 배양용기에 넣어주었다. 37℃, 5% CO₂환경의 인큐베이터에서 1일간 세포를 배양한 후 세포 배양용기에 부착 된 세포만 남기고 세포 배양액을 제거한 다음, 다시 세포 배양용기에 DMEM(CELLGRO) 배양액을 넣고 배양을 진행하였다. 세포가 세포 배양용기 내에서 90% 정도의 밀도를 보이면, 계대배양을 진행하여 실험에 사용할 충분한 양의 세포를 만들었다. 계대배양(subculture) 시 Trypsin/EDTA(GIBCO)를 사용하여 부착된 세포를 떼어내었고, 부착된 세포가 떨어지면 세포를 모아 50㎖ 튜브에 모은 다음, 그 중 10㎕를 취하여 10㎕ Trypan blue(SIGMA)와 섞어 주었다. 이중 10㎕를 혈구계수기에 주입하여 세포 생존율과 세포 수를 측정하였다. 세포 수가 측정 되면 다시 배양용기를 선정하여 37℃ 5% CO₂환경의 인큐베이터에서 4∼5일간 배양을 진행하였다(계대 1). 이 상태의 세포가 세포 배양용기에서 90% 정도의 밀도를 보이면 다시 계대배양을 반복 진행하였고(계대 2), 이렇게 얻어진 세포를 액체질소(-196℃)에 초저온 보관을 하여 연구에 활용하였다.

인간 지방 유래 성체 줄기세포를 위한 배지의 제조 및 배양

<2-1> 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양을 위한 배지의 제조

상기 실시예 <1-2>에서 확립한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양을 위하여, DMEM(CELLGRO) 배양액에 비타민 등의 세포활성화제의 성분을 아래 표 1과 같은 함량으로 첨가하되, 소와 같은 동물 유래의 혈청은 전혀 첨가하지 않은 배지를 제조하였다.

성분	농도
L-오르니틴(L-ornithine)	10 ng/㎖
BSA(Bovien Serum Albumin)	25 ㎎/㎖
덱사메타손디나트륨인산염(Dexamethasone Disodium Phosphate)	50 ㎍/㎖
푸트레신 중염산염(Putrescine dihydrochloride)	20 ㎍/㎖
트랜스페린(transferrin)	10 ㎍/㎖
셀레늄(selenium)	2 ng/㎖
에탄올아민(ethanolamine) (1:5000)	0.1 ㎎/㎖
하이드로코르티손(Hydrocortison)	0.33 ㎍/㎖
에피네프린(eponephrine)	5 ㎍/㎖
bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)	4 ㎍/㎖
EGF(Epidermal Growth Factor)	1 ng/㎖
인슐린(insulin) (Human Recombinant, Zinc) (1:1000)	10 ng/㎖
비타민 B1(vitamin B1)	0.4 ㎍/㎖
비타민 B12(vitamin B12)	2 ㎍/㎖
비타민 C(vitamin C)	1 ㎍/㎖
비타민 E(vitamin E)	500 ng/㎖

<2-2> 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양

상기 실시예 <2-1>에서 제조한 무혈청 배지를 이용하여 37℃ 5% CO₂환경의 인큐베이터에서 저산소 조건{O₂: 1% (hypoxia)}으로 상기 실시예 <1-2>에서 수득한 인간 지방 유래 성체 줄기세포를 각각 4~5일 간 배양하였다.

본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액에 대한 안전성 확인

<3-1> 무균 테스트

상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액에서 100㎕씩 취하여 박테리아 배양용 고체 배지(Tryptone Soya Agar, YSK, KOREA)와 진균 배양용 고체 배지(Sabouraud Chloramphenicol Agar, YSK, KOREA)에 도말하였다. 박테리아용 고체 배지는 저온 인큐베이터(N-BIOTEK, KOREA)에서 32.5℃의 조건으로 7일간 배양하면서 지속적으로 고체 배지의 표면을 확인하여 박테리아 콜로니의 생성 여부를 통해 박테리아의 감염 여부를 확인하였다. 진균용 고체 배지는 저온 인큐베이터(N-BIOTEK, KOREA)에서 22.5℃의 조건으로 배양하면서 지속적으로 고체 배지의 표면을 확인하여 진균 콜로니의 생성 여부를 통해 진균의 감염 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 확인되는 바와 같이, 각 배지에서 세균 및 진균콜로니(Colony)가 형성이 되지 않은 것으로 보아 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액 내에는 세균이나 진균이 존재하지 않음을 확인하였다.

<3-2> 마이코플라즈마 테스트

Mycoalert plus detection Kit(LONZA, USA)를 이용하여, 원시 미생물인 마이코플라즈마의 감염 여부 및 감염 정도를 측정하기 위한 테스트를 진행하였다. 샘플 준비 및 Assay protocol은 Mycoalert plus detection Kit의 Insert에서 명시한 방법에 충실하게 따랐다.

2개의 5㎖ 튜브(SARSTEDT, GERMANY)에, Mycoalert Assay control(LONZA, USA) 100㎕와 Mycoalert plus detection Kit의 Negative control 100㎕를 각각 넣고, 상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액에서 100㎕를 취하여 첨가한 다음, Mycoalert plus detection Kit의 시약을 100㎕씩 첨가하여, 상온에서 5분간 반응시켰다. 5분 후, 발광광도 측정기인 FB12 luminometer(Berthold Detection Systems, GERMANY)와 분석 소프트웨어 (Berthold Detection Systems, GERMANY)를 이용하여 1차 발광정도를 측정하였다. 1차 측정 이후 Mycoalert plus detection Kit의 기질을 100㎕씩 취하여 각각의 튜브에 첨가하고, 10분간 상온에서 반응시켰다. 10분 뒤 모든 튜브는 1차 측정과 동일한 기기와 프로그램으로 2차 발광정도를 측정하였고, 각각의 튜브의 발광 정도를 수치화하여 그 결과를 확인하였다.

마이코플라즈마 테스트의 실험 결과에 대한 유효 기준은 아래 표 2와 같고, 각 대조군의 테스트 수치가 음성 대조군은 0.9 미만으로 측정되고, 양성 대조군은 1.2보다 높게 측정된 경우에 그 테스트가 유효하다고 판단할 수 있는바, 상기 실시예 <2-2>에서 배양한 배양액을 테스트한 실험군의 경우 0.9 미만으로 결과 값이 나와야 유효하다.

음성 대조군(Negative control)	양성 대조군(Positive control)
< 0.9	> 1.2

그 결과, 하기 표 3에서와 같이, 음성 대조군 및 양성 대조군 모두 기준치에 포함되었고, 실험에 이용된 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액은 기준값에 해당하는 0.37로 마이크플라즈마에 감염되지 않았음을 확인하였다.

샘플	시험기준	시험결과
음성 대조군	<0.9	(0.33) 통과
양성 대조군	>1.2	(157.37) 통과
줄기세포 배양액	<0.9	(0.37) 통과

<3-3> 엔도톡신 테스트

발열성 물질인 엔도톡신의 검출을 확인하기 위하여 Kinetic Limulus Amebo-cyte Lysate(LAL) Assay(LONZA, USA)를 사용하였다. Control Standard Endo-toxin(CSE for Kinetic-QCL, LONZA, USA)을 이용해 0.005EU/㎖∼5EU/㎖까지 10배수 단위로 표준물(standard)을 준비하여 96웰 배양 플레이트(COSTAR, USA)에 100㎕씩 넣은 다음, 상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액을 LAL water(LONZA USA)에 희석하여 100㎕씩 첨가하였다. 모든 웰에 Lysate(LONZA, USA)를 100㎕씩 첨가한 뒤, 바로 흡광도 측정기인 ELISA Reader(ELX808LBS, BIOTEK, USA)와 winKQCL4(LONZA, USA) 프로그램을 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

엔도톡신 테스트가 유효하고 안전하다고 판단되는 기준은 아래 표 4와 같고, 상관계수(correlation coefficient)가 표준물(standard)의 기울기를 측정하여 기준 범위 이내에서 측정된 경우에 테스트의 유효성을 인정하였다. 변동계수(coefficient of variation)는 이중 실험 간의 오차 값을 측정하여 각각의 웰당 측정한 엔도톡신 수치가 유효한지 판단하는 값이며, PPC recovery(Positive Product Control recovery)는 확인하고자 하는 샘플 내의 엔도톡신 활성을 저해하거나 증가시키는 간섭인자의 영향을 확인하는 방법으로서, 측정된 PPC recovery 수치가 50% 이하인 경우에는 엔도톡신의 활성을 저해하는 간섭인자가 많아서, 그리고 PPC recovery 수치가 200% 이상인 경우에는 엔도톡신 활성을 촉진하는 간섭인자가 많아서 샘플의 측정된 엔도톡신 수치의 유효성이 낮다고 판단하였다. 또한, 엔도톡신 값은 확인하고자 하는 테스트 샘플 웰에 5EU/㎖ 농도의 표준물을 샘플 웰 부피의 10% 비율로 첨가하여 표준물 0.5EU/㎖와의 엔도톡신 측정치를 비교한 값으로서 최종적으로 엔도톡신의 농도를 수치화하여 나타내는데, 현재 미국FDA에 의해 정해진 엔도톡신의 제한 기준은 심혈관계나 림프계와 직/간접적으로 접촉하는 의료기기의 경우 0.5EU/㎖ 이하를 제한 기준으로 적용하며, 주사제의 경우 정맥 내 투여 시 5.0EU/kg/hr 이하를 제한 기준을 적용하는 등 기준은 항목 별로 다양하다.

상관계수	변동계수	PPC Recovery(%)	엔도톡신(EU/㎖)
≥0.98	<10 %	50% 내지 200 %	<0.3

먼저, 엔도톡신시험 값의 유효성을 인정하기 위하여 CSE를 이용한 농도별(EU/㎖) Standard기울기 값을 확인하였다. 도 2에서 확인되는 바와 같이 표준물 농도에 이용한 희석된 CSE의 농도별 측정값은 모두 CV(%)가 10% 내외로 신뢰할 수 있었으며, 그래프에서처럼 기울기가 선형의 형태로 나타나 LONZA사에서 명시한 기울기 패턴과 일치하여, 기울기 값을 신뢰할 수 있다고 판단되었다. 또한, 표준물은 상관계수가 0.997로 측정되어 신뢰할 수 있음이 확인되었다.

또한, 엔도톡신 테스트 결과, 하기 표 5에서와 같이, 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액은 PPC recovery 값이 162%으로 줄기세포 배양액 내의 엔도톡신 수치를 확인하기 전 간섭요인이 없음을 확인할 수 있었고, 줄기세포 배양액의 엔도톡신 수치가 <0.0250EU/㎖로 기준 범위 <0.3EU/㎖ 내에 들었으므로 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액의 엔도톡신 수치는 안전하다고 판단되었다.

항목	수치	상태
PPC Recovery*	162%	통과
엔도톡신	<0.0250 EU/㎖	통과

본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액에 대한 독성 확인

상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액이 섬유아세포 배양 시 독성물질로 작용하여 섬유아세포의 성장을 저해시키는지 확인하기 위해 CCK-8 Kit(DOJINDO, USA)를 이용하여 독성 확인 실험을 진행하였다.

인간 섬유아세포 Hs68(ATCC^®)을 해동한 뒤, 96 웰 플레이트(COSTAR)에 웰당 2000개씩 넣고, 상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액을 아래 표 6과 같은 농도로 각각 처리한 다음, 인큐베이터(NB-203, N-BIOTEK, KOREA)에서 37℃, 자연 가습 상태를 유지하는 환경으로 배양하였다. 또한, 일정한 pH를 유지하기 위해 5% CO₂조건을 유지시켜 주었다. 세포를 배양하기 시작한 이후 24시간, 48시간, 72시간의 시점에 CCK-8 Kit Solution을 웰당 10㎕씩 첨가하고, 3시간 반응시킨 뒤 ELISA Reader(BIOTEK, USA)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 그룹마다 4회 반복 측정하였다.

군	농도
대조군(Control)	DMEM 100% + 실시예 <2-2>에서의 줄기세포 배양액 0%
실험군 1(Group 1)	DMEM 75% + 실시예 <2-2>에서의 줄기세포 배양액 25%
실험군 2(Group 2)	DMEM 50% + 실시예 <2-2>에서의 줄기세포 배양액 50%
실험군 3(Group 3)	DMEM 25% + 실시예 <2-2>에서의 줄기세포 배양액 75%
실험군 4(Group 4)	DMEM 0% + 실시예 <2-2>에서의 줄기세포 배양액 100%

그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 각 군은 시간이 지남에 따라, 그리고 농도 의존적으로 유의한 차이를 보이며 O.D 값이 증가(세포수가 증가)하였는바, 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액은 세포 독성이 없음을 알 수 있다.

본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액의 효과 확인

<5-1> 인간 섬유아세포의 배양

상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액을Spin-X^® UF 튜브(CORNING)를 이용하여 5:1로 농축하였고, 농축된 배양액을 상기 표 6에서와 같은 농도로 DMEM에 희석한 후, 이를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 인간 섬유아세포 Hs68(ATCC^®)을 24시간 동안 배양하였고, 그런 다음 배양액을 취하여 하기의 MMP-1 저해 활성 측정 및 콜라겐 합성량 측정 실험에 이용하였다.

<5-2> 엘라스타아제(elastase) 저해 활성 측정

피부의 진피 조직 속에 있는 엘라스틴(elastin)은 피부탄력성과 관련된 단백질인데, 이러한 엘라스틴 단백질이 엘라스타아제(elastase)에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 생기게 되므로, Feinstein et al.(1973)의 문헌에 제시된 방법에 따라, 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액에 엘라스타아제를 저해하는 활성이 있는지 여부를 확인하였다.

엘라스타아제(SIGMA)를 Tris-HCl 완충용액(pH8.5)에 녹여 0.25U/㎖이 되도록 제조하였고, 기질인 N-숙시닐-(Ala)3-ρ-니트로아닐라이드는 Tris-HCl(pH8.5) 완충용액에 녹여 0.5㎎/㎖이 되도록 하였다.

본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포 배양액의 엘라스타아제 저해 활성을 농도별로 비교하기 위하여, 상기 실시예 <5-1>에서 수득한 농도별 섬유아세포 배양액과 양성 대조군인 아스코르브산 10㎍/㎖ 및 100㎍/㎖를 각각 96월 플레이트에 넣고, 엘라스타아제와 N-숙시닐-(Ala)3-ρ-니트로아닐라이드를 첨가하여 25℃에서 13분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 405nm에서 흡광도를 측정하고, 각 조건에서의 엘라스타아제 저해율을 하기 식 1과 같이 계산하였다. 아래 식 1에서 무첨가군은 대조군(Control)이다. 상기 실험의 결과 값은 SAS^®9.4를 이용하여 One-way ANOVA 분석을 실시 한 후 a=0.05 수준에서 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정될 경우 Duncan's Multiple Range Test를 실행하여 통계학적 유의성을 검정하였다(p<0.05).

[식 1]

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 엘라스타아제 활성은 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액에 대하여 농도 의존적으로 저해되었으며, 특히 실험군 4의 경우에는 양성 대조군으로 이용된 아스코르브산과 비교해도 통계적으로 유의한 차이가 없을 정도로 우수한 엘라스타아제 저해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

<5-3> MMP-1 저해 활성 측정

Wunsch 등(1963)의 문헌에 제시된 방법에 따라, 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액이 가지는 MMP-1 저해 활성을 측정하였다.

먼저, 용매인 0.1 M Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에 CaCl₂(SIGMA)가 4mM이 되도록 한 다음, 4-페닐아조벤질옥시카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3mg/㎖)(SIGMA)를 녹인 기질액 0.25㎖과 상기 실시예 <5-1>에서 수득한 농도별 섬유아세포 배양액 0.1㎖을 혼합한 혼합액에 0.1㎎/㎖의 콜라게나아제(collagenase)를 0.15㎖ 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 다음, 6% 시트르산(SIGMA) 0.5㎖을 넣어 반응을 정지시키고, 에틸아세테이트(SIGMA) 1.5㎖를 첨가하여 상등액을 취하여 340㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

또한, 양성 대조군으로 녹차 추출물 유래의 단일물질인 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 1㎎/㎖, 100㎍/㎖ 농도로 실험에 사용하였고(양성 대조군(Positive control) 1 및 2), 콜라게나아제 제해율은 상기 식 1의 공식으로 계산하였다. 상기 실험의 결과 값은 SAS^®9.4를 이용하여 One-way ANOVA 분석을 실시 한 후 a=0.05 수준에서 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정될 경우 Duncan's Multiple Range Test를 실행하여 통계학적 유의성을 검정하였다(p<0.05).

그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 비록 양성 대조군으로 이용된 EGCG에 미치지는 못하지만, MMP-1의 활성은 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액에 대하여 농도 의존적으로 저해되는 것으로 확인되었다.

<5-4> 콜라겐 합성 촉진 활성 측정

Procollagen Type I C-peptide EIA Kit (TAKARA Bio Inc.)를 이용하여, 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액이 가지는 콜라겐 합성 촉진 활성을 측정하였다.

먼저, 샘플 희석액을 이용하여 상기 실시예 <5-1>에서 수득한 농도별 섬유아세포 배양액을 1/2로 희석한 뒤 볼텍싱하여 섞어주었다. Antibody-POD Conjugate는 증류수 11㎖에 녹였고, 표준물(standard)은 증류수 1㎖와 혼합하여 640ng PIP(Collagen TypeⅠ C-Peptide)/㎖의 농도를 만들었고, 아래 표 7과 같이 희석을 하여 단계별 PIP 농도를 만들었다.

최종 PIP 농도 (ng/㎖)	0	10	20	40	80	160	320	640
샘플 희석 용액	400㎕	393.75㎕	387.5㎕	375㎕	350㎕	300㎕	200㎕	-
표준물 용액	-	6.25㎕	12.5㎕	25㎕	50㎕	100㎕	200㎕	400㎕

그리고 Kit에 구성되어 있는 Antibody가 코팅된 96 웰 플레이트의 웰에 Antibody-POD Conjugate 용액을 100㎕씩 넣어주고, 상기 실시예 <5-1>에서 수득한 농도별 섬유아세포 배양액과 표준물 용액을 농도별로 각각 20㎕씩 넣어주었다. 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 후 플레이트에 넣어주었던 섬유아세포 배양액과 표준물 용액을 제거한 뒤 400㎕의 PBS로 웰을 4회 반복 세척하였다. 그리고 플레이트의 웰마다 기질 용액(TMBZ)을 100㎕ 씩 넣고 실온에서 15분간 반응시킨 후, 웰에 정지 용액(stop solution)을 100㎕씩 넣고, ELISA Reader를 이용하여 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 상기 실험의 결과 값은 SAS^®9.4를 이용하여 One-way ANOVA 분석을 실시 한 후 a=0.05 수준에서 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정될 경우 Duncan's Multiple Range Test를 실행하여 통계학적 유의성을 검정하였다(p<0.05).

그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 콜라겐의 합성량은 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액에 대하여 농도 의존적으로 향상되는 것으로 확인되었다.

<5-5> 광노화 개선 효과 확인

인간 섬유아세포 Hs68(ATCC^®)을 해동한 뒤, 6 웰 배양 용기(COSTAR)에 넣고 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 세포의 농도가 배양용기의 80%되었을 때 UV-A lamp(SANKYO Co. Ltd,)를 이용하여 26.57 J/㎠의 UV-A를 조사하였고, 그런 다음 상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액을 상기 표 6에서와 같은 농도로 DMEM에 희석한 것으로 섬유아세포를 다시 배양하였다. 음성 대조군으로 UV-A를 조사하지 않고 상기 실시예 <2-2>에서 배양한 인간 지방 유래 성체 줄기세포의 배양액이 포함되지 않은 DMEM만으로 섬유아세포를 배양하였다.

UV-A 조사 후 세포의 손상 정도를 광학현미경을 통해 확인하였고, 72시간 배양 후 손상 입은 섬유아세포의 재생 정도를 그룹 별로 비교하기 위하여 혈구계수기를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 상기 실험의 결과 값은 SAS^®9.4를 이용하여 One-way ANOVA 분석을 실시 한 후 a=0.05 수준에서 군간 유의성을 검정하였고, 유의성이 인정될 경우 Duncan's Multiple Range Test를 실행하여 통계학적 유의성을 검정하였다(p<0.05).

그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 실험군 1 내지 4의 경우 모두 대조군에 비해 세포 재생 정도가 향상되었고, 특히 본 발명의 무혈청 배지를 이용한 줄기세포의 배양액이 25% 및 50%의 농도로 이용된 실험군 1, 2의 경우에 매우 우수한 세포 재생 효과를 보였으며, 위와 같은 실험군 1, 2의 경우는 UV-A를 조사하지 아니한 음성 대조군의 경우와 비교해도 통계적으로 유의한 차이가 없을 정도로 우수한세포 재생 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims

기본 배지; 및 세포활성화제;를 포함하고 동물 유래의 혈청을 포함하지 않는 무혈청 배지 조성물을 이용하여, 저산소 조건에서 줄기세포를 배양한 후, 배양된 줄기세포를 제거한 배양액을 유효성분으로 함유하며,
상기 세포활성화제는, 비타민(Vitamin), L-오르니틴(L-ornithine), 트랜스페린(transferrin), 셀레늄(selenium), 에탄올아민(ethanolamine), 하이드로코르티손(Hydrocortison), 에피네프린(epinephrine), BSA(Bovien Serum Albumin), 덱사메타손디나트륨인산염(Dexamethasone Disodium Phosphate), 푸트레신중염산염(Putrescine dihydrochloride), bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor) 및 인슐린(insulin)으로 구성되는, 피부 주름 방지 또는 개선용, 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 비타민은 비타민 B1, 비타민 B12, 비타민 C 및 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 피부 주름 방지 또는 개선용, 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 기본 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium 및 Chang's Medium MesemCult-XF Medium으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 피부 주름 방지 또는 개선용, 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 줄기세포는 지방 유래 성체 줄기세포인 피부 주름 방지 또는 개선용, 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
삭제
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 조성물은 UV에 의한 피부 주름 증가 또는 탄력 저하를 개선하는 것인 피부 주름 방지 또는 개선용, 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제 및 지질 소낭으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 보조제를 추가로 포함하는 피부 주름 방지 또는 개선용, 또는 피부 탄력 개선용화장료 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3에 있어서,
상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제형으로 제조되는 피부 주름 방지 또는 개선용, 또는 피부 탄력 개선용 화장료 조성물.