KR101934793B1

KR101934793B1 - 고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101934793B1
Application number: KR1020170065136A
Authority: KR
Inventors: 조병옥; 조완구; 장선일
Original assignee: 주식회사 아토큐앤에이
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2019-01-03
Also published as: KR20180129310A

Abstract

본 발명은 고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 고욤나무 잎 추출물은 UV에 대한 세포 보호 효과를 가지고, UV 조사에 의해 감소된 콜라겐 함량을 회복시키며, 증가한 MMP-1의 발현을 저해할 뿐만 아니라 티로시나아제 저해 활성, 수분 보유능, 자외선 차단지수 및 차단등급을 상승시키는 효과가 우수하므로 피부 광노화에 대한 기능성 화장품 또는 피부 외용제로 사용할 수 있다.

Description

고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 조성물{Composition for preventing or improving skin photoaging comprising extract of Diospyros lotus leaf as effective component}

본 발명은 고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

생활수준의 향상으로 인해 아름답고 건강한 피부를 유지하려는 욕구가 증대되고 야외활동이 증가하면서 태양광선 노출로부터 야기되는 피부손상을 방지하기 위한 관심이 증가함과 동시에 피부노화 억제에 관한 연구가 진행되고 있다. 태양광선의 자외선(UVR, ultraviolet radiation)에 반복적이거나 장기간 노출시 피부의 탄력 및 수분이 감소되고 주름이 형성되는 등 피부손상이 일어나는 현상을 광노화(photoaging)라고 부른다.

자외선(UVR)은 파장에 따라 UVA(ultraviolet A, 320∼400nm), UVB(ultraviolet B, 280∼320nm), UVC(ultraviolet C, 200∼280nm)로 분류된다. 그 중 UVB는 매우 유해한 광선으로 표피손상에 관여하거나 건조, 피부홍반, 색소침착, 표피비후 등을 일으킨다. 또 항산화 기전의 불균형을 유발하여 피부를 구성하는 지질, 단백질, 효소 등을 손상시킴으로써 염증반응과 피부암, 광노화를 심화시킨다. 반면, UVA는 UVB에 비해 단기간의 위력은 미미하지만 파장이 길어서 피부 깊숙이 침투해 피부의 진피를 손상시켜서 피부를 검게 하고 피부노화를 촉진시킨다. 따라서 UVA 및 UVB를 저해할 수 있는 소재 및 제품의 효능기준이 자외선 차단지수로 이용된다.

UVB 노출에 의해 생성이 유도되는 ROS(reactive oxygen species)는 광노화의 원인 중 하나로 세포내 신호전달체계를 자극하여 DNA, 지질 및 단백질 등 생체분자에 산화적 스트레스 유발을 통한 피부조직 손상을 일으킨다. ROS는 표피 각질세포와 진피 섬유아세포의 자극으로 Ap-1(activator protein-1) 및 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activator B cells)의 전사인자를 활성화하고 염증관련 사이토카인(cytokine)을 분비하도록 하여 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현을 증가시키고 피부조직을 구성하는 교원질과 탄력섬유의 분해를 촉진하여 주름을 형성시킨다. 생체에는 이러한 ROS 자극으로부터 생성 및 활성되는 지질과산화물과 산화효소로부터 방어하고자 CAT(catalase), SOD(superoxide dismutase) 및 GST(glutathione-s-transferase) 등 항산화효소가 작용을 하며, 체외에서는 비타민 C, E 및 폴리페놀류와 플라보노이드 등 생리활성물질의 도움을 통해 생성된 ROS에 의한 손상을 방어한다. 또한, 피부 광노화에 따른 피부손상 및 주름개선을 위해 장기간 사용시에도 부작용 없이 효능을 나타낼 수 있는 천연 기능성 소재 및 제품을 개발하기 위한 연구가 활발히 일어나는 실정이다.

한편, 고욤나무(Diospyros lotus L.)는 우리나라와 중국을 비롯한 아시아에서 자연적으로 자생하는 낙엽성 식물로, 전통의약분야에서는 성숙한 과일인 '고욤'을 진정, 진통, 수렴 및 변비치료에 사용해 왔다. 고욤나무의 생화학적 성분은 지방산, 당, 플라보노이드 및 비휘발성 물질이 보고되었고, 최근에는 혈액의 항응고, 뇌세포 보호 작용, 항산화 및 항암 효과에 대해 보고된 바 있다.

이러한 고욤나무의 생리활성 효과는 주로 고욤나무 과실 및 종자를 대상으로 하고 있으며, 고욤나무 잎에 대한 생리활성 효과의 평가는 미비한 실정이다. 또한, 고욤나무의 과실은 감에 비해서 작을 뿐만 아니라 종자가 많고, 주로 늦가을에 채취가 가능하여 산업적으로 활용하기에 용이하지 않을 뿐만 아니라 대량으로 소재를 조달하는데 한계가 있다. 그러므로 고욤나무 잎의 생리활성을 규명하여 활용한다면, 고욤나무 과일과 종자의 활용에 대한 한계성을 극복하여 산업화를 이루는데 매우 용이할 것으로 사료된다.

한편, 한국등록특허 제1531484호에는 고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0086310호에는 고욤나무 잎 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 조성물에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 고욤나무 잎 추출물을 제공하고, 상기 유효성분이 UV에 대한 세포 보호 효과를 가지고, UV 조사에 의해 감소된 콜라겐 함량을 회복시키며, 증가한 MMP-1의 발현을 저해할 뿐만 아니라 티로시나아제 저해 활성, 수분 보유능, 자외선 차단지수 및 차단등급을 상승시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고욤나무(Diospyros lotus) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 포함하는 자외선 차단제를 제공한다.

또한, 본 발명은 고욤나무(Diospyros lotus) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명은 고욤나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 고욤나무 잎 추출물은 UV에 대한 세포 보호 효과를 가지고, UV 조사에 의해 감소된 콜라겐 함량을 회복시키며, 증가한 MMP-1의 발현을 저해할 뿐만 아니라 티로시나아제 저해 활성, 수분 보유능, 자외선 차단지수 및 차단등급을 상승시키는 효과가 우수하므로, 이를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 광노화에 대한 기능성 화장품 또는 피부 외용제의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 고욤나무 잎 에탄올 및 열수 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성(A), ABTS 라디칼 소거활성(B) 및 환원력(C)을 통하여 항산화 활성을 확인한 결과이다. Et-OH는 고욤나무 잎 에탄올 추출물이고, Hot Water는 고욤나무 잎 열수 추출물이다.
도 2는 버섯 티로시나아제를 이용하여 고욤나무 잎 에탄올 및 열수 추출물의 미백효과를 확인한 결과이다. Et-OH는 고욤나무 잎 에탄올 추출물이고, Hot Water는 고욤나무 잎 열수 추출물이며 Arbutin(알부틴)은 양성대조군으로 사용하였다. ** 및 ***은 고욤나무 잎 에탄올 추출물 처리군에 비해 열수 추출물 및 알부틴 처리군의 버섯 티로시나아제 억제능이 통계적으로 유의미하게 감소함을 나타내며, **은 p<0.05, ***은 p<0.001을 의미한다.
도 3은 세포내 티로시나아제 활성(A) 및 멜라닌 함량(B)을 나타낸 결과이다. Et-OH는 고욤나무 잎 에탄올 추출물이고, Hot Water는 고욤나무 잎 열수 추출물이며 Arbutin(알부틴)은 양성대조군으로 사용하였다. ***은 고욤나무 잎 에탄올 추출물 처리군에 비해 열수 추출물 및 알부틴 처리군의 티로시나아제 활성 및 멜라닌 함량이 통계적으로 유의미하게 증가함을 나타내며, p<0.001을 의미한다.
도 4는 UV 처리 시 고욤나무 잎 에탄올 추출물의 산화스트레스에 대한 세포 보호 효과를 확인한 결과이다. Et-OH extract는 고욤나무 잎 에탄올 추출물이다. #은 UV를 조사하지 않은 세포에 비해 UV를 조사한 경우 세포생존율이 통계적으로 유의미하게 감소함을 의미하며, p<0.001이다. ***은 UV를 조사한 군에 비해 고욤나무 잎 에탄올 추출물을 함께 처리하였을 경우 세포생존율이 유의미하게 증가함을 나타내며, p<0.001을 의미한다.
도 5는 고욤나무 잎 추출물이 UV 조사에 따른 제1형 콜라겐 함량 변화에 미치는 효과를 확인한 결과이다. Et-OH는 고욤나무 잎 에탄올 추출물이고, Hot Water는 고욤나무 잎 열수 추출물이다. ***은 고욤나무 잎 에탄올 추출물 처리군에 비해 고욤나무 잎 열수 추출물 처리군의 제1형 콜라겐 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001을 의미한다.
도 6은 고욤나무 잎 추출물이 UV 조사에 따른 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과이다. Et-OH는 고욤나무 잎 에탄올 추출물이고, Hot Water는 고욤나무 잎 열수 추출물이다. ***은 고욤나무 잎 에탄올 추출물 처리군에 비해 고욤나무 잎 열수 추출물 처리군의 MMP-1 발현이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.001을 의미한다.

본 발명은 고욤나무(Diospyros lotus) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 고욤나무 잎 추출물은 C₁~C₄의 저급 알코올, 물 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출한 것이고, 바람직하게는 에탄올, 물 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출한 것이며, 가장 바람직하게는 에탄올을 이용하여 추출한 것이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화장료 조성물은 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)의 발현을 억제하고, 제1형 콜라겐(Type 1 collagen)의 발현을 증가시키는 것이나, 이에 한정하지 않는다.

본 명세서에 사용되는 용어 '광노화'는 태양광선의 자외선에 반복적이거나 장기간 노출시 피부손상, 색소침착, 주름생성 또는 피부의 탄력이 저하되는 현상을 말한다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있고, 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 자외선 차단제, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 자외선 차단제의 형태로 제조될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 성분이나, 효과를 증강하는 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 예컨대, 당업계에 공지된 피부 노화방지 및 주름개선 성분으로서, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가된 성분은 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.0001 내지 10 중량부로 포함될 수 있을 것이며, 상기 함량 범위는 콜라겐 합성 촉진 활성, 피부 안전성, 제형화 시의 용이성 등의 요건에 따라 조절될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 고욤나무(Diospyros lotus) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 피부 외용제는 본 발명의 조성물을 다양한 방식 또는 형태로 인체에 적용될 수 있으나, 바람직하게는 피부에 국소적으로 도포되어 적용 가능한 피부 외용제의 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 파우더, 연고제, 겔제, 크림제, 리니멘트제, 로션제, 액제, 또는 에어로졸제 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 피부 외용제로 제제화할 경우, 본 발명의 조성물 외에 첨가물 등을 적절하게 배합하여 제조할 수 있다. 상기 첨가물은 당 업계에서 통상적으로 이용되는 것으로, 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

제조예 1. 고욤나무 잎 추출물의 제조

1) 고욤나무 잎 에탄올 추출물의 제조

고욤나무 잎은 전라북도 진안군 부귀면 수항리 신기마을에서 채취한 후, 우석대학교 한의과대학 방제학교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 동정한 표본은 전주대학교 벤처창업관 (주)아토큐앤에이 부설연구소 표본 보관실에 보관하였다. 상기 준비한 고욤나무 잎은 잘게 자른 후 40℃에서 16시간 동안 건조하였다. 건조된 고욤나무 잎 100g을 분쇄하고 50%(v/v) 에탄올 2000㎖을 첨가하여 3일 동안 추출하고, 추출액은 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 동결건조하여 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

2) 고욤나무 잎 열수 추출물의 제조

상기와 동일한 방법으로 채취한 고욤나무 잎은 즉시 증류수로 세척한 후 5분 동안 증기찜을 가하고, 실온에서 선풍기를 활용하여 건조하였으며, 40℃ 건조기에서 12시간 동안 건조하였다. 건조된 고욤나무 잎 200g에 증류수 2000㎖을 첨가하고 5분 동안 끓여 추출한 후, 0.45㎛ 필터를 사용하여 여과하고 동결건조하여 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

제조예 2. 고욤나무 잎 추출물을 첨가한 크림의 제조

하기 표 1의 조성 비율로 상기 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 실험예 1 및 실험예 2, 고욤나무 잎 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 실험예 3 및 고욤나무 잎 추출물을 함유하지 않는 비교예 1 및 비교예 2의 크림을 제조하였다.

구체적으로는 하기 표 1의 조성 비율로 고욤나무잎 에탄올 추출물, 부틸렌글리콜, 1,2-헥산디올, 하이알루로닉산, 알부틴, 징크옥사이드, 잔탄검, 카보머 및 디소듐이디티에이를 혼합한 수상베이스와 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트, 소르비탄모노올레이트, 칸데릴라 왁스, 향료, 옥토크릴렌, 부틸메톡시디벤조일메탄, 에틸헥실메톡시신나메이트, 비스-에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 사이클로메티콘, 이소세틸미리스테이트, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 글리세릴스테아레이트 & 피이지-100스테아레이트, 글리세릴스테아레이트, 세테아릴알코올, 폴리글리세릴-3메틸글루코오스디스테아레이트, C12-20알킬글루코사이드 & C14-22알코올(Montanov L), 소르비탄스테아레이트, 디메티콘 및 토코페릴아세테이트를 혼합하여 80℃까지 가열하여 용해시킨 유상성분이 준비되면 물 중탕에서 온도가 유지되도록 준비한 다음 수상성분을 유상성분에 서서히 첨가하면서 상전이 일어나도록 열자석교반기로 교반한 후, 실온으로 냉각시켜 나노에멀젼 크림을 제조하였다.

	원료명	실험예 1	실험예 2	실험예 3	비교예 1	비교예 2 (v/v)%
수상 베이스	고욤나무잎 에탄올 추출물	3.0	1.0	-	-	-
	고욤나무잎 열수 추출물	-	-	3.0	-	-
	부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
	1,2-헥산디올	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
	하이알루로닉산	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	알부틴	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	징크옥사이드	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	잔탄검	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
	카보머	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
	디소듐이디티에이	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
	정제수	50.1	52.1	50.1	53.1	61
유상 베이스	폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트	3.4	3.4	3.4	3.4	-
	소르비탄모노올레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	-
	칸데릴라 왁스	4.0	4.0	4.0	4.0	-
	향료	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
	옥토크릴렌	3	3	3	3	3
	부틸메톡시디벤조일메탄	4	4	4	4	4
	에틸헥실메톡시신나메이트	3	3	3	3	3
	비스-에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진	2	2	2	2	2
	사이클로메티콘	2	2	2	2	2
	이소세틸미리스테이트	2	2	2	2	2
	카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	2	2	2	2	2
	글리세릴스테아레이트 & 피이지-100스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
	세테아릴알코올	1.3	1.3	1.3	1.3	1.3
	폴리글리세릴-3메틸글루코오스디스테아레이트	1	1	1	1	1
	C12-20알킬글루코사이드 & C14-22알코올(Montanov L)	1	1	1	1	1
	소르비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
	디메티콘	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
	토코페릴아세테이트	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1

실시예 1. 고욤나무 잎 추출물의 항산화 활성

1) DPPH 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거 활성은 Blois(Blois MS. Nature 181: 1199-1200 (1958))의 방법으로 측정하였다. 제조예 1의 에탄올 및 열수 추출물을 메탄올로 녹여 최종 농도가 20, 40, 60, 80, 및 100㎍/㎖가 되도록 정량하여, 100㎕의 각 시료를 96 웰 플레이트에 주입하고, 동시에 0.3mM DPPH 100㎕를 넣어 총량이 200㎕가 되도록 하였다. 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더(Tecan Group Ltd., Mannedorf, Swizerland)로 540㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 하기 식 1을 이용하여 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

[식 1]

DPPH 라디칼 소거능(%)={1-(첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)}×100

그 결과, 도 1A 및 표 2에 나타난 바와 같이 고욤나무 잎 추출물의 농도가 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능도 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 고욤나무 잎 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 더 우수하였다.

2) ABTS 라디칼 소거능

ABTS 라디칼 소거능은 Re(Re et al., Free Rad Biol Med. 1999 ; 26 : 12317.) 등의 방법에 의하여 7.4mM의 ABTS 및 2.6mM의 과황화칼륨(potassium persulfate)을 혼합한 후, 실온 암소에서 24시간 동안 방치하여 라디칼(radical)을 형성하고, 그 후 ABTS 용액을 실험 직전에 732nm에서 흡광도가 0.70±0.03(mean±SD)이 되도록 메탄올로 희석하여 사용하였다. 메탄올로 녹여 최종 농도가 50, 100, 150, 200 및 300㎍/㎖가 되도록 정량한 50㎕의 제조예 1의 에탄올 및 열수 추출물에 950㎕의 준비된 ABTS 용액을 첨가하여 암소에서 30분 동안 반응시킨 후, ELISA 리더(Tecan Group Ltd., Mannedorf, Swizerland)로 732nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능은 하기 식 2의 공식을 이용하여 시료 용액의 첨가군과 무첨가군 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

[식 2]

ABTS 라디칼 소거능(%)={1-(첨가군 흡광도/무첨가군 흡광도)}×100

그 결과, 도 1B 및 표 2에 나타난 바와 같이 고욤나무 잎 추출물의 농도가 증가할수록 ABTS 라디칼 소거능도 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 고욤나무 잎 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능이 더 우수하였다.

또한, 제조예 1의 고욤나무 잎 추출물의 DPPH 및 ABTS의 IC₅₀(half maximal inhibitory concentration) 값은 하기 표 2에 나타난 바와 같이 고욤나무 에탄올 추출물이 열수 추출물에 비해 더욱 우수하다는 것을 확인하였다.

시료	DPPH(IC₅₀)	ABTS(IC₅₀)
고욤나무 잎 에탄올 추출물	50.68±1.68	182.74±2.45
고욤나무 잎 열수 추출물	86.21±1.27	238.92±3.87

3) 환원력(Reducing power)

환원력은 Oyaizu(Oyaizu M. Jpn. J. Nutr. 1986 ; 44 : 307-315)의 방법에 따라 제조예 1의 에탄올 및 열수 추출물의 농도가 62.5, 125, 250, 500 및 1000㎍/㎖가 되도록 정량하여 pH 6.6의 0.2M 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer) 250㎕ 및 1% 페리시인산화칼륨(potassium ferricyanide) 250㎕를 각각 혼합하여 50℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 250㎕의 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 첨가하였다. 위 반응액을 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상층액 500㎕에 증류수 500㎕, 0.1% 염화제2철(ferric chloride) 100㎕를 첨가하여 혼합한 흡광도 값을 700nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 1C와 같이 환원력은 고욤나무 잎 추출물의 농도가 높아질수록 증가하는 것을 확인하였고, 고욤나무 잎 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 환원력이 더욱 우수하다는 것을 확인하였다.

실시예 2. 고욤나무 잎 추출물의 미백효과

1) 버섯 티로시나아제 저해활성 측정

버섯 티로시나아제 저해활성은 200㎕의 0.1M 인산완충용액(pH 6.8)에 400㎕의 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 및 메탄올에 1mg/㎖로 희석한 제조예 1의 시료용액 200㎕를 혼합한 용액에 200㎕의 버섯 티로시나아제를 첨가하여 25℃에서 15분 동안 반응시킨 후 생성된 DOPA 크롬의 흡광도를 475nm 파장에서 측정하였다. 버섯 티로시나아제 저해활성은 하기 식 3의 공식을 이용하여 시료용액의 첨가군(실험군)과 무첨가군(대조군)의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 계산하였다.

[식 3]

티로시나아제 저해활성(%)=(AB/A)×100(A: 대조군 흡광도, B: 시료 흡광도)

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 버섯 티로시나아제 저해 활성은 양성대조군인 알부틴에 비해 더 우수하며, 고욤나무 잎 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 티로시나아제 저해활성이 더 높게 나타났다.

2) 세포내 티로시나아제 활성 및 멜라닌 함량 측정

세포내 티로시나아제 활성을 측정하기 위해 B16 마우스 멜라노마 세포주를 이용하였다. B16 마우스 멜라노마 세포는 6 웰 플레이트 각 웰당 4×10⁴cell/㎖로 접종한 후, 1μM의 α-MSH로 자극하여 16시간 동안 배양하고, 배양 후 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 및 열수 추출물 200㎍/㎖를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 인산완충액(phosphate buffered saline, pH 7.2)으로 2회 세척한 후 0.2% 트립신(trypsin)을 처리하여 수거하였다. 수거한 세포는 인산완충액을 사용하여 1500rpm으로 2회 원심세척하고, 100㎕의 NP-40 lysis buffer(St. Louis, MO, 미국)를 처리하고, 4℃에서 30분 동안 방치한 후, 12000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 브래드퍼드 방법(Bradford method)으로 단백질을 정량하였고, 각각의 세포용해액은 각 웰당 100㎕씩 96 웰 플레이트에 주입한 후, 0.1% L-DOPA(L-dihydroxy phenylalanine)이 혼합된 인산완충액(pH 6.8) 100㎕를 추가하여 37℃에서 60분 동안 방치한 후, 405nm ELISA reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

또한, 멜라닌 함량을 측정하기 위해 B16 마우스 멜라노마 세포를 6 웰 플레이트 각 웰당 4×10⁴cell/㎖로 접종한 후 배양하고, 배양된 세포에 1μM의 α-MSH로 자극하여 16시간 동안 배양한 후 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 및 열수 추출물 200㎍/㎖를 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고, 1N 수산화나트륨(NaOH) 500㎕를 첨가하여 24시간 동안 세포를 녹인 후, 100℃에서 20분 동안 가열하고 450㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3A 및 도 3B에 나타난 바와 같이 α-MSH의 자극으로 유도된 티로시나아제 활성 및 멜라닌 함량의 증가는 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 및 열수 추출물 처리시 감소하였다. 또한, 고욤나무 잎 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물의 티로시나아제 활성 저해 및 멜라닌 합성 억제효과가 더 높게 나타났다.

실시예 3. UV 조사에 의한 세포 보호 효과 측정

BJ 세포주(인간 피부 섬유아세포)를 이용하여 자외선 처리시 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 추출물의 산화스트레스에 대한 세포 보호 효과를 확인하였다. BJ 세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁵cell/㎖가 되도록 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 배양된 세포에 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 추출물(25, 50, 100㎍/㎖)을 1시간 동안 전처리하고, UVB lamp(emission peak 306 nm; Sankyo Denki Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 25mJ/㎠ UVB를 조사하고 24시간 동안 배양한 후, EZ-Cytox 세포생존율 분석키트(EZ-Cytox cell viability assay kit)를 사용하여 제조사(DAEIL lab, 한국)의 방법에 따라 산화스트레스에 대한 세포 보호 효과를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 UV 처리에 의해 감소한 세포생존율은 고욤나무 잎 에탄올 추출물 처리에 의해 증가하며, 고욤나무 잎 에탄올 추출물의 처리 농도에 의존적으로 세포생존율이 증가하는 것을 확인함으로써, 고욤나무 잎 에탄올 추출물이 UV 조사에 의한 세포 손상에서 세포를 보호하는 효과가 우수하다는 것을 확인하였다.

실시예 4. UV 조사에 의한 콜라겐 변화 측정

BJ 세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁵cell/㎖가 되도록 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 배양된 세포에 100㎍/㎖의 제조예 1의 고욤나무 잎 추출물을 1시간 동안 처리하고 UVB lamp(emission peak 306 nm; Sankyo Denki Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 25mJ/㎠ UVB를 조사하고 24시간 동안 배양한 후, 인산완충액(PBS)으로 세척하고 세포를 원심분리하여 펠릿(pellet)을 회수하여 단백질을 추출하였다. 콜라겐 함량은 상업적으로 이용 가능한 Type I collagen ELISA 키트(Abcam, 미국)를 활용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 UV 조사에 의해 감소된 제1형 콜라겐(Type I collagen)의 함량이 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 및 열수 추출물 처리시 증가하는 것을 확인하였고, 고욤나무 잎 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물 처리시 증가율이 더욱 우수하다는 것을 확인하였다.

실시예 5. UV 조사에 의한 MMP -1 변화 측정

BJ 세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁵cell/㎖가 되도록 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 배양된 세포에 100㎍/㎖의 제조예 1의 고욤나무 잎 추출물을 1시간 동안 처리하고 UVB lamp(emission peak 306 nm; Sankyo Denki Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 25mJ/㎠ UVB를 조사하고 24시간 동안 배양한 후, 인산완충액(PBS)으로 세척하고 세포를 원심분리하여 펠릿(pellet)을 회수하여 단백질을 추출하였다. MMP-1 발현은 상업적으로 이용 가능한 MMP-1 ELISA 키트(Abcam, 미국)를 활용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 UV 조사에 의해 증가한 MMP-1의 함량이 제조예 1의 고욤나무 잎 에탄올 및 열수 추출물 처리시 감소하는 것을 확인하였고, 고욤나무 잎 열수 추출물에 비해 에탄올 추출물 처리시 감소율이 더욱 우수하다는 것을 확인하였다.

따라서, 고욤나무 잎 추출물은 자외선에 의해 손상된 콜라겐의 함량을 회복시키고, 증가한 MMP-1의 함량을 감소시킴으로써 주름개선 및 탄력증진효과를 나타낼 수 있다.

실시예 6. 자외선 차단제 조성물의 자외선 차단효과

제조예 2의 각각의 크림을 이용하여 자외선 차단지수(SPF) 및 자외선 A 차단 등급(PA)을 측정하였다.

자외선 차단지수는 식약청 고시 '기능성 화장품 기준 및 시험방법' 중 '자외선 차단 기능성 시험법'에 따라 투명 플라스틱 테이프(Transpore Tape ; 3M, 미국)를 준비된 캐스트(cast)에 부착시킨 후 제조예 2의 각각의 크림을 2㎎/㎠로 도포하여 UV 측정기(SPF 290 Analyzer)로 자외선 차단 효과를 측정하였고, 자외선A 차단 등급 PA의 측정은 광원으로 300W Xenon Arc Lamp가 장착된 인공자외선 방출기 Multi-port Solar simulator 601-300W(Solar Light사, 미국)를 사용하였고, 3D UV meter(Solar Light사, 미국)를 이용하여 광세기를 측정하여 실험예 1 내지 3 및 비교예 1 및 2 조성물에 대한 자외선 차단지수 SPF 및 자외선 A 차단 등급 PA를 측정하였다.

그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이 고욤나무 잎 추출액이 함유된 실험예 1 내지 실험예 3의 자외선 차단지수가 고욤나무 잎 추출액을 포함하지 않은 비교예 1 및 2에 비해 우수하였으며, 고욤나무 잎 에탄올 추출물을 함유한 실험예 1 및 2의 자외선 차단지수가 열수 추출물을 함유한 실험예 3보다 증가되었고, 고욤나무 잎 추출물의 함량이 적은 실험예 2가 함량이 높은 실험예 3에 비해 자외선 차단지수가 높은 것으로 보아 고욤나무 잎의 자외선 차단효과는 열수 추출물보다 에탄올 추출물이 우수하다는 것을 확인하였다. 또한, 자외선 A 차단 등급은 고욤나무 에탄올 추출물을 함유한 실험예 1 및 2가 고욤나무 잎 열수 추출물 함유한 실험예 3 및 고욤나무 잎 추출액을 포함하지 않은 비교예 1 및 2에 비해 우수하였다.

	실험예 1	실험예 2	실험예 3	비교예 1	비교예 2
SPF	45.5±2.6	41.5±2.3	40.3±2.8	36.5±2.6	24.5±2.3
PA	+++	+++	++	++	++

실시예 7. 수분 보유능 측정

제조예 2의 각 크림의 수분 보유능을 알아보기 위해, 피부 부위가 건조한 성인 남·여 각 24명을 대상으로 1일 2회씩 총 3개월 동안 다음과 같은 실험을 수행하였다. 피시험자 두피의 4㎝×4㎝ 면적 부분에 제조예 2의 크림을 사용하기 전 및 크림을 사용한 후의 피부수분함량 변화를 피부수분함량 측정 장치(스킨 서피스 하이그로미처(Skin Surface Hygrometer), 모델명: SKICON-200, 일본 IBS사 제품)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 고욤나무 잎 추출물을 함유한 크림의 수분 보유능이 고욤나무 잎 추출물을 함유하지 않은 크림보다 우수함을 알 수 있었고, 동량의 고욤나무 잎 에탄올 추출물을 함유한 크림의 수분 보유능이 고욤나무 열수 추출물을 함유한 크림의 수분 보유능보다 더욱 우수하다는 것을 확인하였다.

	실험예 1	실험예 2	실험예 3	비교예 1	비교예 2 (㎲)
사용 전	2.8	2.6	2.8	3.0	2.9
사용 후	38	31	31	26	18

Claims

고욤나무(Diospyros lotus) 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하며, 피부손상, 주름생성 또는 피부탄력 저하를 포함하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1(Matrix Metalloproteinase-1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 제1형 콜라겐(Type 1 collagen)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 화장료 조성물을 포함하는 자외선 차단제.
고욤나무(Diospyros lotus) 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하며, 피부손상, 주름생성 또는 피부탄력 저하를 포함하는 피부 광노화 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물.