UA75316C2

UA75316C2 - Гомологи з фактором росту фібробласта

Info

Publication number: UA75316C2
Application number: UA99042170A
Authority: UA
Inventors: Тереза А. ДЕЙШЕР; Деррел К. Конклін; Фенелла К. Реймонд; Томас Р. Буковскі; Сьюзен Д. Голдерман; Бріджіт Гансен; Пол О. ШЕППАРД
Original assignee: Займодженетікс, Інк.
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 2006-04-17
Also published as: DK0931148T3; BR9712348A; CZ299288B6; US7247608B2; ATE318906T1; EP1632574A1; BRPI9712348C8; EP0931148B1; EP1632574B1; DE69735352T2; ES2258788T3; IL129379A; PL192537B1; WO1998016644A1; JP2001502178A; BR9712348B1; US20040096936A1; DE69735352D1; HK1089206A1; EP0931148A1

Abstract

Винахід належить до молекул полінуклеотидів і поліпептидів для zFGF-5, нового члена сімейства FGR (факторів росту фібробластів). Поліпептиди і полінуклеотиди, що їх кодують, сприяють розростанню клітин м’язів і можуть бути використані для відновлення серцевої тканини і поліпшення функції серця. Об'єктом винаходу є також антитіла до zFGF поліпептидів.

Description

Опис винаходу

Ця патентна заявка є спорідненою з попередньою патентною заявкою 60/028,646, поданою 16 жовтня 1996 2 року. Відповідно до розділу 35 Зводу законів США, пункт 119 (е) (1), заявка, що пропонується, є документом, згідно з яким заявляються права на переваги, що забезпечуються згаданою попередньою заявкою.

До групи ростових факторів фібробластів (ЕСЕ) належать принаймні дев'ять різних ростових факторів

ІВазіїсо еї аїЇ.,, Адм. Сапсег Кев. 59:115-165, 1992; Ретіпд еї аїЇ.,, Ргод. ОСгомій Расіог Кев. 5(4):353-377, 1994), які взагалі діють як мітогени щодо клітин різних типів, охоплюючи широкий діапазон таких клітин. 70 Наприклад, основний ростовий фактор фібробластів (відомий також як ростовий фактор ЕСЕ-2) є мітогенним, в умовах поза живими організмами, щодо ендотеліальних клітин, клітин судинних гладеньких м'язів, фібробластів і, взагалі, щодо клітин мезодермального або нейроектодермального походження, включаючи серцеві і скелетні міоцити |Созродагоміс: еї аї., 9. СеїЇ. Віоїсд. 70:395-405, 1976; Совзродагомжіс: еї аї., 9. СеїІ. Віоісд. 89: 568-578,1981; Кагааті, У. Мої. СеїІ. Віоспет. 92:124-134, 1990). Показано, що в живих організмах ростовий 12 фактор БЕСОЕ має важливе значення для розвитку серця у птахів ІЗиді еї аі., Оем. Віо!ї. 168:567-574, 1995; Міта еї аї,, Ргос. Маг. Асад. 5сі. 92:467-471, 1995), а також стимулює розвиток колатеральних коронарних судин у собак (І агагоиз еї аї., Сігсцайоп 94:1074-1082, 1996). Крім того, були продемонстровані немітогенні дії різних ростових факторів, що належать до групи ростових факторів фібробластів. До дій, що характерні для кислотного або основного ростового фактора фібробластів, але не зв'язані з ростом клітин, належать такі: підвищене виділяння, в ендотеліальних клітинах, активатора плазміногену в тканинах; стимуляція синтезу позаклітинного матеріалу; хемотаксис для ендотеліальних клітин; примусова експресія генів, що спричиняють ембріональні скорочення, у кардіоміоцитах |Рагкег ей аї., У. Сііп. Іпмеві. 85:507-514, 1990); підвищення реактивності гормонів гіпофізу ІВаїга еї аї., У. СешШаг РНузіої. 5:101-106, 1987).

У декількох членів групи ростових факторів фібробластів відсутня сигнальна послідовність (ростові фактори с агоБв, ЬЕсЕ і, можливо, ЕСР-9), внаслідок чого не можна очікувати секреції таких ростових факторів. Крім того, (3 деякі ростові фактори з групи ростових факторів фібробластів можуть мігрувати в ядра клітин (Ргіезеї еї аї.,

ЕАБЕВ 9:919-925, 19951. Всі ростові фактори з групи ростових факторів фібробластів зв'язують гепарин на основі структурної подібності. Структурна гомологія об'єднує різні зразки таким чином, щоб зберегти характерні для них структурні і функціональні взаємозв'язки (Оті ей аїЇ., 9. Віої. Спет. 271(25): ее, 15292-15297, 1996). «-

Існують чотири відомі позаклітинні рецептори ростових факторів фібробластів (рецептори РОК) і всі ці рецептори являють собою тирозинкінази. Взагалі, ростові фактори, що належать до групи ростових факторів о фібробластів, зв'язуються з усіма відомими рецепторами ростових факторів фібробластів, але специфічні ою ростові фактори фібробластів зв'язуються з специфічними рецепторами з більшою мірою спорідненості. Іншими 32 засобами забезпечення специфічності ростових факторів, що належать до групи ростових факторів в фібробластів, є просторова і часова експресія лігандів і їхніх рецепторів у процесі ембріогенезу. На підставі доказів можна стверджувати, що ростові фактори фібробластів діють, найбільш імовірно, тільки як ростові фактори з автокринною або паракринною дією, завдяки їх спорідненості при зв'язуванні гепарину, внаслідок чого « обмежується дифузія ростових факторів фібробластів від місця їх виділяння |РІаштепнай еї аї., 9. СеїІ. Віо!. З 50 111(43: 1651-1659, 1990). В основному ростовому факторі фібробластів відсутня сигнальна послідовність і тому с дія цього ростового фактора обмежена і можлива тільки як автокринна або паракринна дія. Обгрунтовано

Із» доказано, що основний ростовий фактор фібробластів зберігається всередині клітин і виділяється після пошкодження тканини. Показано, що основний ростовий фактор фібробластів має дві зони зв'язування з рецепторами, які відрізняються від зони зв'язування гепарину (Абгапат еї аІ., ЕМВО 3). 5(10):2523-2528, 19861.

Показано, що рецептор ЕОЕМК-З має важливе значення для росту кісток. У мишей, яким гомозиготно і забезпечували відсутність рецептора ЕСЕК-3 (-/-), спостерігались післяродові аномалії скелета |Соїміп еї аї., 4! Маїште Сепеї. 12:309-397, 1996; ЮОепд еї аї., Сеї! 84:911-921, 1996). На підставі мутантного фенотипу можна зробити висновок, що в нормальних мишей рецептор ЕСЕК-3 є необхідним для регуляції поділу хондроцитових о клітин у зоні ростової оболонки кістки |Соідагагь, СуюКіпе апа Сгомій Расіог Кему. 7(4): 311-325, 19961). - 20 Ліганд для рецептора ЕСЕК-3 у ростовій оболонці кістки не виявлений.

Незважаючи на те, що були виявлені тільки чотири рецептори ростових факторів фібробластів, причому всі ці с рецептори, як показано, мають функціональні варіанти, що утворюються в результаті сплайсингу, цілком імовірним є також існування нових рецепторів ростових факторів фібробластів. Наприклад, не виявлений рецептор для ізоформи ГОР -8а |МасАгтійиг еї аї., 9. Мігої. 69(4):2501-2507, 19951. 29 Ростовий фактор ЕСБЕ-8 являє собою такий ростовий фактор з групи ростових факторів фібробластів, який

ГФ) спочатку був виділений з ракових клітин молочної залози як мітоген, спричинений андрогеном. Цей ростовий фактор був приєднаний до хромосоми людини 10425-426 |(МУпісе еї а!., Сепотісв 30:109-111, 1995). Ростовий о фактор РОЕ-8 бере участь у розвитку кінцівок ембріона |Модеї! еї аіІ., Оемеіортепі 122:1737-1750, 1996; Тапака еї а. Сипепі Віоіоду 5(6):594-597, 1995). Експресія ростового фактора БОБ-8 у процесі ембріогенезу в 60 серцевих, сечостатевих і невральних тканинах показує, що цей ростовий фактор може бути необхідним для росту згаданих тканин (|Стозвіеу ей аїЇ., Оемеортепі 121:439-451, 1995)|. Існують докази того, що акроцефалосиндактилія, тобто природжена аномалія, що характеризується баштоподібним черепом і перетинчастими пальцями рук та ніг, зв'язана з точковими мутаціями ростового фактора ЕСЕ-8 |МУйпіе еї аї.,

Сепотісв 30:109-111, 1995). бо Ростовий фактор ЕОСЕ-8 має п'ять екзонів, на відміну від інших відомих ростових факторів фібробластів, які мають тільки по три екзони. Перші три екзони ростового фактора ЕСЕ-8 відповідають першому екзону інших ростових факторів фібробластів |МасАгійиг еї аІ., ОемеІюортепі 121:3603-3613, 1995). Ген людини, що відповідає ростовому фактору ЕОБЕ-8, кодує чотири ізоформи, які відрізняються своїми М-кінцевими зонами, тобто ізоформи а Б, е, 7 згаданого ростового фактора, на відміну від гена миші або пацюка, який породжує вісім ізоформ ростового фактора РОБЕ-8 І|Стозвієу еї аі., Оемеіортенпі 121:439-451, 1995). Протеїни ЕОЕ-8а і ЕСБЕ-80 людини на 10095 відповідають протеїнам мишей і пацюків, а протеїни РОЕ-8Ве і РОБ-8ї забезпечують гомологію між протеїнами людини і миші на 9895 |Сетеї! еї аіІ., Ссепотісв 35:253-257, 1996).

Серцеві хвороби є основною причиною смертності в США і кількість смертей внаслідок цих хвороб становить /0 до ЗО9о усіх смертей. У лікарнях США щороку лікуються понад 750 тисяч пацієнтів з інфарктом міокарда, при наявності більше 5 мільйонів хворих з діагнозом коронарної хвороби серця. До факторів риску у зв'язку з інфарктом міокарда належать цукровий діабет, гіпертензія, ожиріння, паління, високий рівень ліпопротеїду низької густини в плазмі крові, а також генетична схильність.

Серцева гіперплазія являє собою підвищення інтенсивності росту серцевих міоцитів. Показано, що в людей і /5 пацюків серцева гіперплазія розвивається в процесі нормального старіння організму (Оїїмені еї аї., у). Ат.

Со. СагаїоЇ. 24(1): 140-149, 1994; Апумегза еї аї., Сігс. Кес. 67:871-885, 1990), а в пацюків також у випадках кардіоміопатії, спричиненої катехоламіном |Оеізпег еї аЇ,, Ат. у. Саедіомавзс. Раїйпої. 5(1):79-88, 1994). Спірними залишаються погляди на те, що є причиною згаданого підвищення інтенсивності росту міоцитів - вплив певної клітини-попередника чи результат росту клітин, диференціація яких більшою мірою проявляється з го часом.

Однак, оскільки інфаркти та інші причини некрозу міокарда проявляються як такі порушення, наслідки яких неможливо усунути, можна зробити висновок, що нормальні процеси при серцевій гіперплазії не можуть компенсувати значну втрату міоцитів і тому необхідні екзогенні фактори, які б стимулювали гіперплазію і забезпечували, як кінцевий результат, відновлення спроможності серця правильно функціонувати. с

Реконструкція кісток являє собою динамічний процес, який забезпечує збереження маси кісткових тканин і форми скелета. Процес реконструкції забезпечує рівновагу між процесом резорбції і процесом формування і) кістки, причому вважається, що в процесі реконструкції основне значення мають клітини двох типів. Такими клітинами є остеобласти і остеокласти. Остеобласти забезпечують синтез і відкладення кісткового матеріалу для формування нової кістки. Дія остеобластів і остеокластів регулюється багатьма системними і локальними Ге зо факторами, до яких належать і ростові фактори.

Незважаючи на те, що взаємодія між локальними і системними ростовими факторами повністю невизначена, (87 існує однозначна думка щодо того, що ростові фактори мають основне значення для процесів регуляції при с нормальній реконструкції кісток скелета і при заживанні переломів кісток. До деяких ростових факторів, виявлених у кістках, належать ростові фактори ІСР-І, ІОР-ІЇ, ТОБ-Д., ТОвР-р», БЕОР, агсг, РООБР, а також група Щео,

Кісткових морфогенних протеїнів І|ВауїпК еї а!., У. Вопе Міпега! Кев. 8 (З,Урр.2):3565-5572, 1993). ї-

Якщо інтенсивність процесу резорбції кістки перевищує інтенсивність процесу формування кістки, то виникає чиста втрата маси кістки і підвищується можливість переломів кістки. Зменшення інтенсивності формування кісток пов'язане з старінням організму і певними патологічними станами. Тільки в США щороку реєструється приблизно 1,5 мільйонів переломів кісток, зумовлених остеопорозом. Вплив таких переломів на якість життя « пацієнтів дуже значний. Відповідні кошти, які витрачаються в системі охорони здоров'я в США, щороку шщ с оцінюються сумою 5-10 мільярдів доларів США, без врахування коштів на лікування хронічних хворих. й До інших випадків терапевтичного використання ростових факторів, які впливають на процес реконструкції "» кісток, належить, наприклад, використання ростових факторів при лікуванні пошкоджень кісток, для якого необхідний ріст остеобластів, наприклад пошкоджень при переломах кісток, а також для стимуляції процесів росту мезенхимних клітин і синтезу внутрішньої покривної кістки, які визнані необхідними для заживання -і переломів кісток |(Чоусе еї аї., Збій Аппциа! Мееїйіпд, Огіпораедіс Кезеагсп Зосіефу, Рергоагу 5-8, 1990, Мем

Опеапз, І А). і-й Винахід, що пропонується, забезпечує створення необхідних поліпептидів для вищезгаданих та інших

Ге) випадків використання ростових факторів, а інформація про такі поліпептиди, зрозуміла для спеціалістів у пз даній галузі, наведена нижче в описі винаходу.

Відповідно до першої характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує створення ізольованої

Ф полінукліотидної молекули, що кодує поліпептид, який є гомологом ростових факторів фібробластів (ЕОР), вибраної з групи полінукліотидних молекул, до якої належать: а) полінукліотидні молекули, що містять послідовність нукліотидів, показану в послідовності «ЕС ІЮ МО: 1

ЯК фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621; б) алельні варіанти молекул (а); (Ф, в) полінукліотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 60 95 ідентичний амінокислотній ко послідовності, показаній в послідовності ЗЕО І МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до амінокислотного залишку 207 (Аа); во г) полінукліотидні молекули, що містять послідовність нукліотидів, показану в послідовності «БЕ ІЮ МО: 6 як фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621.

Згідно з одним варіантом реалізації винаходу, ізольована полінукліотидна молекула містить послідовність нукліотидів, показану в послідовності ЗЕСО ІЮО МО: І як фрагмент від нукліотида 1 до нукліотида 621, або послідовність нукліотидів, показану в послідовності «ЕС ІЮ МО: 6 як фрагмент від нукліотида 1 до нукліотида вБ 821.

Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, ізольована полінукліотидна молекула містить послідовність нукліотидів, показану в послідовності «ЕС ІЮ МО: І як фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621.

Відповідно до другої характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує створення вектора експресії, який містить нижчезазначені елементи, сполучені між собою для можливості виконання заданих функцій: промотор транскрипції; сегмент молекули ДНК, вибраної з групи молекул, до якої належать а) полінукліотидні молекули, що містять послідовність нукліотидів, показану в послідовності ЗЕО ІЮО МО: 1 як фрагмент від нуклютида 82 до нукліотида 621; 6) алель ні варіанти молекул (а), в) полінукліотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 70 6095 ідентичний амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО ОО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІ) до амінокислотного залишку 207 (Аа), і г) полінукліотидні молекули, що містять послідовність нукліотидів, показану в послідовності «ЕС ІЮ МО: б як фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621; термінатор транскрипції.

Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує створення культивованої клітини, в яку введений вектор експресії, що містить нижчезазначені елементи, сполучені між собою для можливості виконання заданих функцій: промотор транскрипції; сегмент молекули ДНК, вибраний з групи молекул, до якої належать а) полінукліотидні молекули, що містять послідовність нукліотидів, показану в послідовності зЗЕО ІЮ МО: 1 як фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621, б) алельні варіанти молекул (а), в) полінукліотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 6095 ідентичний амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО І МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до амінокислотного залишку 207 (Аа), і г) полінуклотидш молекули, що містять послідовність нукліотидів, показану в послідовності 5БО ОО МО: б як фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621; термінатор транскрипції, сч внаслідок чого згадана культивована клітина забезпечує експресію поліпептиду, кодованого сегментом послідовності ДНК. (8)

Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує метод формування поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, згідно з яким виконуються такі процедури: створення культивованої клітини, в яку введений вектор експресії, який містить такі елементи, сполучені Ге зо Між собою для можливості виконання заданих функцій: промотор транскрипції; сегмент молекули ДНК, вибраний з групи молекул, до якої належать а) полінукліотидні молекули, що містять послідовність нукліотидів, показану -- в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 як фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621, б) алельні варіанти молекул с (а), в) полінукліотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 6095 ідентичний амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО І МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до Щео, амінокислотного залишку 207 (Аа), і г) полінукліотидні молекули, що містять послідовність нукліотидів, ї- показану в послідовності 5БО ОО МО: б як фрагмент від нукліотида 82 до нукліотида 621; термінатор транскрипції, внаслідок чого згадана культивована клітина забезпечує експресію поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, кодованого сегментом послідовності ДНК; виділяння поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів. «

Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує створення ізольованого з с поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, вибраного з групи молекул, до якої належать: а) поліпептидні молекули, що містять амінокислотну послідовність, показану в послідовності 52620) ІЮ МО: 2 ;» як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 175 (Ме); б) алельні варіанти молекул (а); в) поліпептидні молекули, що принаймні на 6095 ідентичні амінокислотній послідовності, показаній в -І послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 175 (Меб. 1 Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує створення ізольованого 2) поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, вибраного з групи молекул, до якої належать: а) поліпептидні молекули, що містять амінокислотну послідовність, показану в послідовності 52620) ІЮ МО: 2 - як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 196 (І уз);

Ф б) алельні варіанти молекул (а); в) поліпептидні молекули, що принаймні на 6095 ідентичні амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 196 дво (ув).

Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, цей винахід забезпечує створення ізольованого поліпептиду,

Ф) що є гомологом ростових факторів фібробластів, вибраного з групи молекул, до якої належать: ка а) поліпептидні молекули, що містять амінокислотну послідовність, показану в послідовності 52620) ІЮ МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 207 (Аа); во б) алельні варіанти молекул (а); в) поліпептидні молекули, що принаймні на 6095 ідентичні амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 207 (Аа).

Згідно з додатковим варіантом реалізації винаходу, цей винахід забезпечує створення поліпептиду, що є 65 Гомологом ростових факторів фібробластів, який додатково містить сигнальну послідовність.

Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, цей винахід забезпечує створення поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, який містить також сигнальну послідовність, показану в послідовності «ЕС ІЮ МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 1 (Ме) до амінокислотного залишку 27 (Аа).

Цей винахід забезпечує також створення фармацевтичного засобу, який містить очищений поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, у поєднанні з фармацевтично прийнятною речовиною-носієм.

Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує створення антитіла, що зв'язується з епітопом поліпептидної молекули, яка містить амінокислотну послідовність, показану в послідовності «БО ІЮ МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 1 (Ме) до амінокислотного залишку 207 70. Ав).

Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, цей винахід забезпечує створення антитіла, що зв'язується з поліпептидною молекулою, яка містить амінокислотну послідовність, показану в послідовності «ЕС ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СіІц) до амінокислотного залишку 196 (І уз).

Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує метод стимуляції росту міоцитів або клітин-попередників міоцитів за допомогою введення ссавцям, яким необхідна згадана стимуляція, такої кількості поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, яка достатня для клінічно значущого підвищення кількості міоцитів або клітин-попередників міоцитів у таких ссавців.

Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, цей винахід забезпечує метод стимуляції росту міоцитів або клітин-попередників міоцитів у випадку, коли міоцити або клітини-попередники міоцитів являють собою,

Відповідно, серцеві міоцити або клітини-попередники серцевих міоцитів.

Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує метод стимуляції, в умовах поза живими організмами, клітин-попередників міоцитів або міоцитів, згідно з яким культивують клітини серцевої тканини разом з такою кількістю поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, яка достатня для збільшення кількості клітин-попередників міоцитів або міоцитів у клітинах серцевої тканини, сч Культивованих у присутності поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, порівняно з кількістю клітин-попередників міоцитів або міоцитів у серцевій тканині, культивованих при відсутності поліпептиду, що є і) гомологом ростових факторів фібробластів.

Згідно з іншим варіантом реалізації винаходу, цей винахід забезпечує метод стимуляції, в умовах поза живими організмами, росту клітин-попередників міоцитів або міоцитів у випадку, коли міоцити або Ге

Зо Клітини-попередники міоцитів являють собою, відповідно, серцеві міоцити або клітини-попередники серцевих міоцитів. --

Відповідно до ще однієї характерної особливості винаходу, цей винахід забезпечує метод вибірного введення с препарату або лікарського засобу в серцеву тканину, згідно з яким виконуються такі процедури: сполучення першої молекули, яка містить поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, з о з5 другою молекулою, що являє собою препарат або лікарський засіб, з метою створення химерної сполуки; ча введення химерної сполуки в серцеву тканину.

Фіг.1 і 2 ілюструють результати взаємного порівняння структур фактора 1 (ЕНЕ-1), що є гомологом ростових факторів фібробластів людини, ростового фактора ЕСЕ-10, що активізує міоцити людини, ростового фактора 4 (ЕНЕ-4), що є гомологом ростових факторів фібробластів людини, ростового фактора 2 (ЕНЕ-2), що є гомологом « ростових факторів фібробластів людини, ростового фактора З (ЕНЕ-3), що є гомологом ростових факторів пл») с фібробластів людини, ростового фактора ЕСБЕ-4 людини, ростового фактора ЕСБЕ-6 людини, ростового фактора . ЕОБ-2 людини (основного), ростового фактора БОБ-1 людини (кислотного), ростового фактора 2 (КОБЕ-2) и?» кератиноцитів людини, попередника КОБ-7 ростового фактора кератиноцитів людини, ростового фактора 2-5 людини, ростового фактора ЕСОБЕ-8 людини, ростового фактора ЕОБ-5 людини, ростового фактора ЕОБ-9 людини і ростового фактора РОР-3 людини. Знак "є" використовується для позначення консервативних -і амінокислот, знак "" використовується для позначення замін консервативних амінокислот, а знак "л використовується для позначення замін амінокислот з менш вираженою консервативністю. іні На Фіг.3 показана таблиця подібності ростових факторів у межах групи ростових факторів, в якій наведені

Ге) дані, виражені у відсотках, які показують, наскільки ідентичними, при взаємному порівнянні, є ростові фактори 5р людини ЕСБ-5, ЕОБ-6, ЕОБ-7, ЕОБ-8, РОБ-9, 2-5, ЕОБЕ-10, ЕОБГ-1, ЕНЕ-1, ЕОБ-2, ЕНЕ-2, ЕНЕ-4, ЕОБ-3, КОГ-2, - ЕНЕ-3 і ЕОБ-4.

Ф Термін "ортолог" (або термін "гомолог щодо різних зразків") означає поліпептид або протеїн, одержаний з одного зразка, який є гомологом аналогічного поліпептиду або протеїну, одержаного з іншого зразка.

Термін "паралог" означає поліпептид або протеїн, одержаний з певного зразка, який є гомологом іншого Пполіпептиду або протеїну, одержаного з цього ж зразка.

Термін "алельний варіант" означає будь-яку з двох або більшої кількості альтернативних форм гена, іФ) розташованого в одному і тому ж локусі хромосоми. Алельні варіанти утворюються природно, завдяки мутаціям, ко і можуть бути причиною фенотипного поліморфізму в межах популяцій. Мутації генів можуть бути невираженими (зміни в кодованих поліпептидах відсутні) або можуть спричиняти кодування таких поліпептидів, які мають зміни бо в амінокислотній послідовності. Термін "алельний варіант" використовується в цьому описі винаходу також для позначення протезну, кодованого алельним варіантом гена.

Термін "вектор експресії" означає молекулу ДНК, лінійну або кільцеву, яка містить сегмент, що кодує необхідний поліпептид, який сполучений, для можливості виконання заданих функцій, з додатковими сегментами, які забезпечують транскрипцію, тобто зчитування генетичного коду, заданого згаданим кодувальним б5 сегментом. Згадані додаткові сегменти можуть містити послідовності промотора і термінатора, а також можуть містити, додатково, одну або декілька зон початку реплікації один або декілька вибіркових маркерів,

послідовність, що підсилює реплікацію, сигналізатор поліаденілування і тому подібні елементи. Як правило, вектори експресії формують з плазмідних або вірусних ДНК, а іноді вектор експресії містить елементи як плазмідної, так і вірусної ДНК.

Термін "ізольована", якщо він стосується полінукліотидної молекули, означає, що полінукліотидна молекула переміщена із свого природного генного середовища, так що в цій полінукліотидній молекулі відсутні інші зовнішні або небажані кодувальні послідовності, і має форму, яка забезпечує можливість використання такої полінукліотидної молекули в системах виробництва протеїнів методами генної інженерії. Такими ізольованими молекулами є молекули, які відокремлені від свого природного генного середовища, і до цих молекул належать 7/0 Комплементарні ДНК і геномні клони. В ізольованих молекулах ДНК, які розглядаються в цьому винаході, відсутні інші гени, які характерні для цих молекул у природному стані, але можуть бути присутні природні 5'-кінцеві і

З'-кінцеві нетрансльовані зони, наприклад зони промотора і термінатора. Ідентифікація зон, зв'язаних з ізольованою молекулою, є очевидною для звичайних спеціалістів у даній галузі (див., наприклад, працю (Оупап апа Тідап, Майшге 316:774-778, 19851). Термін "ізольований" щодо протеїну означає, що протеїн виявлений в /5 бередовищі, відмінному від середовища, природного для цього протеїну, наприклад не в крові або тканині тваринного походження. У переважній формі ізольований протеїн значною мірою вільний від домішок інших протеїнів, зокрема від домішок інших протеїнів тваринного походження. Переважно, необхідно використовувати дуже чистий протеїн, тобто з чистотою більше 9595, а більш переважно - з чистотою більше 9995.

Термін "сполучені для можливості виконання заданих функцій", якщо він стосується сегментів ДНК, означає, що сегменти сполучені таким чином, що в стані після сполучення стає можливим здійснення реакцій відповідно до заданих цілей, наприклад, реакція транскрипції починається в зоні промотора і продовжуються вздовж послідовності кодувального сегмента до досягнення термінатора.

Термін "полінукліотид" означає однонитковий або двонитковий полімер, що складається з гетероциклічних основ дезоксирибонуклеїнової або рибонуклеїнової кислоти, послідовність яких зчитується в напрямі від 5-кінця сч ов до З-кінця. Полінуклоотидами є ДНК ї РНК; полінукліотиди можуть бути ізольовані від свого природного середовища, синтезовані в умовах поза живими організмами або сформовані в результаті об'єднання природних і) ії синтетичних молекул.

Термін "комплементи полінукліотидних молекул" означає полінукліотидні молекули у вигляді послідовності комплементарних гетероциклічних основ, яка має зворотну орієнтацію порівняно з орієнтацією, характерною для (о зо первинної послідовності. Наприклад, послідовність 5 АТОСАСОосОо 3 є комплементарною щодо послідовності 5'

СССОТОСАТ 3. -

Термін "дегенеративна нукліотидна послідовність" означає послідовність нукліотидів, яка містить один або с декілька дегенеративних кодонів (порівняно з первинною полінукліотидною молекулою, що кодує поліпептид).

Дегенеративні кодони містять різні триплети нукліотидів, але кодують один і той же амінокислотний залишок Щео, (наприклад, кожний з триплетів САШ і (ЗАС кодує амінокислотний залишок Азгр). ї-

Термін "промотор" означає секцію гена, що містить послідовності ДНК, які забезпечують зв'язування

РНК-полімерази та ініці«ацію процесу транскрипції. Як правило, але не завжди, послідовності промотора розташовані в 5-кінцевих, некодувальних зонах генів.

Термін "секреторна сигнальна послідовність" означає послідовність ДНК, що кодує поліпептид ("секреторний « пептид"), який, як компонент більшого поліпептиду, спрямовує більший поліпептид на здійснення секреторних з с реакцій обміну в клітині, в якій він синтезується. Як правило, більший поліпептид розщеплюється для того, щоб видаляти секреторний пептид у процесі здійснення секреторних реакцій обміну. ;» Термін "рецептор" означає протеїн, присутній в клітині, який зв'язується з біологічно активною молекулою (тобто лігандом) і передає дію ліганду на клітину. Для рецепторів, зв'язаних з клітинною оболонкою, характерна багатозонна структура з двома зонами, якими є позаклітинна зона, що забезпечує зв'язування з -І лігандом, і внутрішньоклітинна зона ефектора, яка, як правило, забезпечує передачу сигналу. Зв'язування ліганду з рецептором спричиняє зміну структури рецептора, внаслідок чого зона ефектора починає взаємодіяти з о другими молекулами клітини. У свою Чергу, внаслідок такої взаємодії виникають зміни метаболізму в клітині. До 2) метаболічних реакцій, які виникають у зв'язку з процесами взаємодії між рецептором і лігандом, належать такі: 5р транскрипція гена, фосфорилування, дефосфорилування, збільшення кількості аденозинионофосфату при його - циклічному синтезі, мобілізація клітинного кальцію, мобілізація ліпідів клітинної оболонки, з'єднання клітин,

Ф гідроліз ліпідів інозиту і гідроліз фосфоліпідів. У більшості випадків ядерні рецептори також мають багатозонну структуру і містять аміно-кінцеву зону, зону трансактивації, зону зв'язування з ДНК і зону зв'язування з лігандом. Взагалі, можливі такі рецептори: рецептори, зв'язані з клітинною оболонкою,

Б цИТтОозольні або ядерні; мономерні рецептори (наприклад рецептор гормону, що стимулює щитовидну залозу, бета-адренорецептор) або полімерні рецептори (наприклад рецептор РОСЕ, рецептор гормону росту, рецептор

Ф) І-3, рецептор ЗОМ-С5Е, рецептор О-С5Е, рецептор еригропоетину, рецептор І! -6). ка Термін "пара комплемент-антикомплемент" означає неідентичні елементи, які у відповідних умовах утворюють стабільну пару з нековалентними зв'язками. Наприклад, біотин і авідин (або стрептавідин) є бо елементами-прототипами пари "комплемент-антикомплемент". Як приклади інших пар "комплемент-антикомплемент", можна назвати пари "рецептор-ліганд"', пари "антитіло-антиген (гаптен або епітоп)", пари, що складаються із значущого і незначущого полінукліотидів і тому подібні пари. Якщо бажаною є подальша дисоціація пари "комплемент-антикомплемент", то показник спорідненості пари "комплемент-антикомплемент" при утворенні сполук повинен, переважно, не перевищувати значення 109М7. 65 Винахід, що пропонується, частково зроблений на основі відкриття нової послідовності ДНК, що кодує поліпептид, який є гомологом ростових факторів фібробластів і являє собою гомолог ростового фактора ЕСБ-8.

Аналіз поширення матричної РНК, яка відповідає цій новій послідовності ДНК, у тканинах показав, що найбільша експресія спостерігається в серцевих тканинах ембріонів і серцевих тканинах дорослих організмів, а потім рівень експреси поступово зменшується, залишаючись помітним, у такому порядку: легеневі тканини ембріонів,

Тканини скелетних м'язів і тканини гладеньких м'язів, наприклад м'язів тонкої кишки, товстої кишки і трахеї.

Поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, був позначений як 2ЕОБ-5.

Нові поліпептиди 2ЕОБЕ-5, що розглядаються в цьому винаході, спочатку були виявлені в результаті аналізу бази даних ЕЗТ (набір послідовностей, що являють собою продукти експресії генів), здійснюваного з метою пошуку ростових факторів. У наборі ЕТ була виявлена одна послідовність, яка, за результатами прогнозування, 7/0 є спорідненою з послідовностями, що належать до групи ростових факторів фібробластів. Новий поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, кюддований первинною, непроцесованою комплементарною ДНК, має символічну формулу СХЕХЕХІб6)УУ, де Х - амінокислота, а Хі ) - кількість амінокислот, що перевищує одиницю. Ця символічна формула характерна для всіх відомих ростових факторів, що належать до групи ростових факторів фібробластів, і є єдиною для цих протонів.

Нукліотидна послідовність комплементарної ДНК поліпептиду 2ЕОЕ-5 показана в послідовності зЕО ІЮ МО: 1, а відповідна похідна амінокислотна послідовність показана в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2. Якщо в послідовності

ЗЕО ІЮ МО: 2 порівняти фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Сім) до амінокислотного залишку 181 (Сіп) з відповідним фрагментом ростового фактора ЕОСЕ-8 (див. Фіг.1 і 2), то видно, що вихідна і похідна амінокислотні послідовності ідентичні приблизно на 56905.

Новий поліпептид, що кодується полінукліотидом, який розглядається в цьому описі винаходу, має фрагмент з символічною формулою СХЕХЕ6У, який присутній у всіх ростових факторах, що належать до групи ростових факторів фібробластів. Фрагменти з символічною формулою СХЕХЕ6УУ є дуже консервативними. Узагальнюючу типову амінокислотну послідовність, що відповідає фрагменту з символічною формулою СХЕХЕХ6УУ, мають ростовий фактор 1 (ЕНЕ-1), що є гомологом ростових факторів фібробластів людини |(ЗтаїМмооса еї аї., Ргос. сч ов Ман. Асай. Зсі. ОА 93:9850-9857, 19961, ростовий фактор ЕСЕ-10, що активізує міоцити людини ІНЗО7б6З81, ідентифікатор у системі банку даних СЗЕМВАМК -пПЕр:/ЛлЛимлиу. побрі.піт.пій.дом/Л, ростовий фактор 4 (ЕНЕ-4), що є і) гомологом ростових факторів фібробластів людини (ЗтаїМм/оодй еї аї., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 93:9850-9857, 1996), ростовий фактор 2 (ЕНЕ-2), що є гомологом ростових факторів фібробластів людини |(ЗтаїМмооса еї аї.,

Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 93:9850-9857, 1996), ростовий фактор З (ЕНЕ-3), що є гомологом ростових факторів Ге зо фібробластів людини (ЗтаїМмооса еї а!., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 93:9850-9857, 1996), ростовий фактор людини

ЕСЕ-4 |Вазгіїїсо еї а!.,, Адм. Сапсег Кев. 59:115-165, 1992), ростовий фактор ЕСЕ-6 людини |Вавіїсо ейоаї., (7

Аду. Сапсег Кевз. 59:115-165, 1992), ростовий фактор ЕОБ-2 людини (основний) |Вазвіїїсо еї аїЇ.,, Адм. Сапсег с

Кев. 59:115-165, 1992), ростовий фактор БОБ-1 (кислотний) |Вазіїїсо еї аЇ,, Адм. Сапсег Кев. 59:115-165, 1992), ростовий фактор 2 (КОБЕ-2) кератиноцитів людини ІНЗОИбЄ7918, ідентифікатор у системі банку даних о

СЕМВАМК - пер:/Лумлиу. пері. піт.пій.домЛ), попередник КОЕ-7 ростового фактора кератиноцитів людини |Вавіїїсо еї ї- аІ., Аду. Сапсег Кез. 59:115-165, 19921, ростовий фактор 2ЕОБЕ-5 людини, ростовий фактор ЕСЕ-8 людини |Сетеї еї аЇ, Сепотісв 35:253-257, 1996), ростовий фактор БОБ-5 людини |Вавіїсо еї аЇ.,, Адм. Сапсег Кев. 59:115-165, 1992), ростовий фактор БОБ-9 людини |Міуатоїо еї аЇ., Мої. СеїІ. ВіоЇ. 13:4251-4259, 1993) і ростовий фактор ЕСЕ-3 людини |Вазвіїсо еї а!., Аду. Сапсег Кез. 59:115-165, 19921. «

Аналіз комплементарної ДНК, що кодує поліпептид 2ЕОБ-5, (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1) виявив наявність з с відкритої рамки зчитування нукліотидної послідовності яка забезпечує кодування 207 амінокислот . (послідовність 5ЕО ІО МО: 2) і яка містить остаточно сформований поліпептид, що складається з 180 и?» амінокислот (послідовність 5ЕО ІЮ МО: 2; фрагмент від амінокислотного залишку 28 до амінокислотного залишку 207). Результати взаємного порівняння поліпептиду 2ЕОБ-5 з іншими відомими ростовими факторами фібробластів показали наявність фрагмента послідовності, який має високу ідентичність, у відсотках, з -І фрагментом послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 від амінокислотного залишку 127 (Сув) до амінокислотного залишку 138 (Туг), як показано на рисунку. У декількох ростових факторів з групи ростових факторів фібробластів відсутні 1 сигнальні послідовності. 2) Для ростових факторів з групи ростових факторів фібробластів характерна наявність зон зв'язування з 5р гепарином. Передбачувана зона зв'язування з гепарином для поліпептиду 2РОБ-5 виявлена у фрагменті - послідовності ЗЕО І МО: 2 від амінокислотного залишку 148 (Оіу) до амінокислотного залишку 169 (Сп).

Ф Вважається, що передача сигналів Через рецептори починається після зв'язування з лігандом ростового фактора фібробластів у комплексі з сульфатними глікопротеїдами гепарину в поверхневій частині клітини.

Багато ростових факторів з групи ростових факторів фібробластів можна об'єднати в одну або дві групи в споріднених ростових факторів на основі подібності структури і функцій цих ростових факторів. Кожний з ростових факторів агсг і БЕОЕ містить три екзони, розділені двома інтронами змінної довжини. Ростовий

Ф) фактор РОБ-8 містить п'ять екзонів, з яких три відповідають першому екзону ростових факторів агсЕ і БЕОБ. Всі ка відомі ростові фактори з групи ростових факторів фібробластів модифіковані, згідно з процедурою сплайсингу, для того, щоб забезпечити можливість формування однакових поліпептидів. во Послідовність 5ЕО ОО МО: б являє собою дегенеративну полінукліотидну послідовність, що охоплює всі полінукліотиди, які можуть кодувати поліпептид 2ЕОБЕ-5 відповідно до послідовності ЗЕБЕО ЕО МО: 2 (амінокислотні залишки від 1 або 28 до 207). Таким чином, у цьому винаході розглядаються полінукліотиди, що кодують поліпептид 2ЕСЕ-5, які розташовані в діапазоні, показаному в послідовності БЗЕО ІЮО МО: 6 як фрагмент від нукліотида 1 або 82 до нукліотида 621. Крім того, у цьому винаході розглядаються фрагменти і злиті 65 протеїни, описані вище стосовно послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, які формуються з аналогічних секцій послідовності

ЗЕО ІЮ МО: 6, причому нукліотиди від 82 до 621 послідовності «ЕС ІЮ МО: 6 відповідають нукліотидам від 82 до

621 послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1, і які призначені для кодування остаточної молекули поліпептиду 2ЕОБ-5.

Позначення елементів послідовності ЗЕО ІЮ МО: 6 показані нижче в таблиці 1. й о

Ся яв хг

Уа кл ів но олаті бло в ов. м лов

М | лев| в | сот о лют | но | Ают

Дегенеративні кодони, що використовуються в послідовності ЗЕО ІЮО МО: б, і всі можливі кодони для заданих амінокислот показані нижче в табл. 2. с й о

Ф зо

Ре бслсссссвсст 00 ос - со в зв дк0060000 вості ву м ве вс 000000000я111 « ле 000000 доаловсоасоссосостмем 2 не с . Ле 01010000 АТААТСАТ 000ОДАТНО і їе сл

НИНІ НИМ Ів: ЗИМИ ст УНН о дб 801000 з я вий 21 вк

Ах в вав

Навіть для звичайного спеціаліста в даній галузі очевидною є деяка неоднозначність при визначенні 2о дегенеративного кодона, який відповідає всім можливим колонам, що кодують кожну амінокислоту. Наприклад, о дегенеративний кодон М/У5М для серину може, при певних умовах, кодувати аргінін АКС, а дегенеративний кодон

МОМ для аргініну може, при певних умовах, кодувати серин АСУ. Подібний взаємозв'язок існує і між колонами, ю що кодують фенілаланін і лейцин. Таким чином, деяким полінукліотидам, що охоплюються дегенеративною послідовністю, можуть відповідати неправильні амінокислоти, але навіть звичайний спеціаліст у даній галузі 60 може достатньо просто виявити неправильні послідовності, порівнюючи конкретні послідовності з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 2.

Дуже консервативні амінокислоти, що входять до складу поліпептиду 2ЕОБ-5, можна використовувати як засіб для ідентифікації нових продуктів, що належать до однієї групи. Для ідентифікації нових продуктів, що належать до однієї групи, у базах даних ЕТ можна використовувати символічну формулу СХЕХЕХІ6УХ для 65 консервативної послідовності. Згідно з іншим методом, який передбачає використання полінукліотидних проб і процедур гібридизації, послідовність РНК, одержану з різних зразкових тканин, можна використовувати для формування бібліотек комплементарних ДНК, а потім аналізувати ці бібліотеки для виявлення нових продуктів, що належать до однієї групи. Зокрема, ланцюгову полімеразну реакцію із зворотною транскрипцією (КТ-РСК) можна використовувати для розмноження послідовностей, що кодують дуже дегенеративні ДНК-праймери, які формуються з послідовностей, що відповідають фрагменту послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 від амінокислотного залишку 127 (Сув) до амінокислотного залишку 138 (Туг).

У діапазоні переважних варіантів реалізації винаходу, що пропонується, ізольовані полінукліотиди виконують функції проби і забезпечують гібридизацію з подібними за розмірами секціями послідовності ЗЕО ІЮ

МО: 1 або послідовності, комплементарної щодо послідовності ЗЕО ІО МО: 1, при оптимальних умовах 7/0 експерименту. Взагалі, оптимальні умови експерименту вибирають таким чином, щоб температура при реакції була на 59С нижче температури плавлення (Т у), визначеної для конкретної послідовності при відомих значеннях концентрації іонів і показника рН. Температура Т п являє собою температуру (при визначених значеннях концентрації іонів і показника рН), при якій забезпечується гібридизація 5095 матричної послідовності з абсолютно узгодженою пробою. Типовими оптимальними умовами є умови, в яких концентрація 7/5 Солі становить принаймні приблизно 0,02М при рн-7, а температура становить приблизно принаймні 602.

Як зазначено вище, до ізольованих полінукліотидів згідно з винаходом, що пропонується, належать послідовності ДНК і РНК. Методи ізоляції послідовностей ДНК і РНК добре відомі спеціалістам у даній галузі.

Як правило, послідовності РНК переважно ізолюють із серцевих тканин, хоч послідовності ДНК можна також створювати, використовуючи послідовності РНК, одержані з інших тканин, або ізолювати як геномні послідовності ДНК. Всю послідовність РИК можна сформувати, використовуючи метод екстракції гуанідину соляною кислотою (НСІ) з подальшою Ізоляцією за допомогою центрифугування в умовах градієнту С8СїІ

ІСпігомиіп еї а!., Віоспетівігу 18:52-94, 1979). Послідовність РНК рої(А)" формують з повної послідовності РНК за допомогою методу, описаного в праці (Амім апа Іедег, Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 69:1408-1412, 1972)

Послідовність комплементарної ДНК (КДНК) формують з послідовності РНК роїу(А)", використовуючи відомі СМ методи. Потім полінукліотиди, що кодують поліпептиди 2ЕСЕ-5, ідентифікують і ізолюють, використовуючи для о цього, наприклад, гібридизацію або ланцюгову полімеразну реакцію.

Винахід, що пропонується, забезпечує також створення дублікатів поліпептидів і полінукліотидів (ортологів або паралогів), одержаних з інших зразків. Об'єктом особливого інтересу є поліпептиди 2-5 з протеїнів, одержаних з тканин інших ссавців, включаючи протеїни мишей, пацюків, свиней, овець, биків, собак, кішок, (Се) коней та інших приматів. Особливий інтерес викликає ідентифікація паралогів послідовності, характерної для «- людини, тому що для пацюків і мишей виявлено 8 паралогів ростового фактора ЕСЕ-8, тоді як для людини відомі тільки 4 паралоги. Паралоги людського походження або гомологи щодо різних зразків протеїнів людини можна о клонувати, використовуючи інформацію і сполуки, одержані згідно з цим винаходом, у поєднанні із звичайними ю методами клонування. Наприклад, комплементарну ДНК можна клонувати, використовуючи матричну РНК, одержану з таких тканин або клітин, які забезпечують експресію протеїну. Придатні джерела одержання в. матричної РНК можна визначити за допомогою нозерн-блоттингу, використовуючи проби, створені з послідовностей, що розглядаються в цьому описі винаходу. Потім можна сформувати бібліотеку матричних РНК для групи тканин або клітин з позитивною реакцією. Після цього комплементарну ДНК, що кодує поліпептид « 2ЕОБЕ-5, можна ізолювати, використовуючи для цього різні методи, наприклад, збуджуючи реакцію за допомогою повної або часткової комплементарної послідовності ДНК людини або за допомогою одного або декількох - с наборів дегенеративних проб, одержаних на основі послідовностей, що розглядаються в цьому описі винаходу. "» Клонування комплементарної ДНК можливе також за допомогою ланцюгової полімеразної реакції (РСК) (МиїІів, " 5 Раїепі 4,683,2021, при використанні праймерів, одержаних з послідовностей, що розглядаються в цьому описі винаходу. Згідно з додатковим методом, бібліотеку комплементарних послідовностей ДНК можна використовувати для перетворення або трансфекції клітин-хазяїнів, а експресію необхідної комплементарної - послідовності ДНК можна виявити за допомогою антитіла до поліпептиду 2ЕОБЕ-5. Подібні методи можна сл використовувати і для ізоляції геномних клонів.

Для спеціалістів у даній галузі очевидно, що послідовностям, які охоплюються послідовностями ЗЕО ІЮ МО: 1 о і 5ЕО ІЮО МО: 2, відповідає тільки однин алель гена і поліпептиду 2ЕОБ-5 людини і що можна очікувати появи -л 70 алельних варіантів і альтернативних, варіантів внаслідок сплайсингу. Алельні варіанти можна клонувати, збуджуючи реакції з комплементарними ДНК або геномними послідовностями, що містяться в бібліотеках, 4» одержаними з різних живих організмів, використовуючи для цього стандартні процедури. Алельні варіанти послідовності ДНК, що відповідає послідовності БЗЕО ІЮО МО: 1, включаючи алельні варіанти з невираженими мутаціями і алельні варіанти, в яких мутації спричиняють зміни в амінокислотній послідовності, охоплюються 2о винаходом, що пропонується, як і протеїни, які являють собою алельні варіанти відповідно до послідовності ЗЕО

Ге! ІО МО. 2.

Винахід, що пропонується, забезпечує також можливість одержання ізольованих поліпептидів 2-5, які є ю суттєво гомологічними щодо поліпептидів послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 і їхніх гомологів щодо різних зразків або ортологів. Термін "суттєво гомологічний" використовується в цьому описі винаходу для визначення поліпептидів, 60 послідовності яких на 5095, переважно на 6095, а найбільш переважно принаймні на 8095, ідентичні послідовностям поліпептидів, що відповідають послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2, або ортологам чи паралогам цих поліпептидів. Найбільш переважно, необхідно використовувати такі поліпептиди, які принаймні на 9095, а краще всього на 95595 і більше, ідентичні поліпетидам, що відповідають послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2, або ортологам чи паралогам цих поліпептидів. Ідентичність послідовностей, у відсотках, визначають за допомогою звичайних б5 методів. Див., наприклад, праці (Айеспц! еї аї., Ви. Май. Віо. 48:603-616, 1986; Непікої апа Непікої,

Рос. Май. Асад. 5Зсі. ОБА 89:10915-10919, 1992). Суть цих методів полягає в тому, що дві амінокислотні послідовності порівнюють для того, щоб оптимізувати їхні показники порівняння, використовуючи штрафні коефіцієнти (поява проміжку - 10 балів, розширення проміжку - 1 бал) і матрицю оцінки "Біозит 62" |Непікоїї апа Непікої, Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 89:10915-10919, 19921), як показано в таблиці З (для амінокислот

Використовуються стандартні однолітерні позначення). 00000001 Теблицяз)

А(АІМ р со вісн ум ев т му

А то ви маю 1 рве сова 1111 анлоові 11

Ето яв 1111 сіро вав |. 1 7 111111 ніго тивів 111111 прив ви 1 рання 11111 клголзилаиза 1111 морзі ві 111 трвізізіз|зізіз злою зов. вилізли азалія ви пврівюолазоріля 1. сч поло ли залив о мізіз яра зв зр яз реа все о віг ( 3 зо і2 т

Мо рвав в и ера свв м а 1 Де» о в я (Се)

Після цього обчислюють показник ідентичності, у відсотках, таким чином: й загальнакількістідентичних елементів -

Ідентичність, сю -З0ГС-- - - 2 2 2 2 6 6 « - - 5 -- « - 6 - 5- - 6 2. 6 -- - Л йїихх ІФ4 оя

Довжина довшої послідовності плюс кількістепроміжків, со введениху довшу послідовність з метою узгодження ю двох послідовностей і -

Ідентичність послідовностей полінукліотидних молекул визначають за допомогою подібних методів, використовуючи відношення, наведене вище.

Суттєво гомологічні протеїни і поліпептиди характеризуються тим, що вони мають один або декілька елементів у вигляді замін, пропусків або доповнень амінокислот. Такі елементи, що характеризують зміну « 70 структури, є, як правило, другорядними і до них належать: заміни консервативних амінокислот (див. табл.4) та 73 с інші заміни, які незначною мірою впливають на упорядкування або активність протеїну або поліпептиду; невеликі пропуски амінокислот, як правило від 1 до приблизно З30 амінокислот; незначні аміно-кінцеві або :з» карбоксильно-кінцеві подовження, наприклад аміно-кінцеві метионінові залишки, невеликі лінкерні пептиди, що містять 20-25 амінокислотних залишків, або невеликі подовження, що полегшують очищення (маркери спорідненості), наприклад полігістидинова група, протеїн А |Міївзоп еї аі., ЕМВО 3. 4:1075, 1985; Миїввоп еї -І аі., Ме(йодз Епгутої. 198:3, 1991), глютадіон-5-трансфераза |(Зтійй апа удопйпзоп, Сепе 67:31, 1988), протеїн для зв'язування мальтози |КеПегптап ап Регепсі, Ме(йодз Епгутої. 90:459-463, 1982; Сцап еї аїЇ.,, Сепе о 67:21-30, 1987), а також інші антигенні епітопи або зони зв'язування. Відповідна загальна інформація наведена со в праці (Рога еї аї., Ргоївіп Ехргеззіоп апа Ригіїісайоп 2:95-107, 1991), яка включена в цей опис винаходу 5у за допомогою посилання. Препарати з послідовностями ДНК, що забезпечують кодування маркерів - спорідненості, поставляються комерційними постачальниками (наприклад фірмами Рнагптасіа Віоїеснй,

Ф Різсагажау, МУ; Мем Епдіапа Віоїарв, Вемегіу, МА). 10001010 теблицям о я юю опетидин////// во 1 операпноваююлотя,

С пава

Гідрофобні: Лейшно пиши вв Св

Ароматичні: |Фенілаланін

С яювано

С вн нини ти ни пиши оМелонно 70 Додатково до 20 стандартних амінокислот, протеїни згідно з цим винаходом можуть також містити неприродні амінокислотні залишки. До неприродних амінокислотних залишків належать, але без обмеження, транс-3-метилпролін, 2,4-метанопролін, цис-4-гідроксипролін, транс-4-гідроксипролін, М-метил-гліцин, аллотреонін, метилтреонін, гідроксиетилцистеїн, гідроксиетилгомоцистеїн, нітроглютамін, гомоглютамін, піпеколінова кислота, трет-лейцин, норвалін, 2-азафенілаланін, З-азафенілаланін, 4-азафенілаланін, 75 4-фторфенілаланін, 4-гідпроксипролін, 6-М-метил-лізин, 2-аміноїзомасляна кислота, ізовалін і о-метил-серин.

Спеціалістам у даній галузі відомі декілька методів введення неприродних амінокислотних залишків у протеїни.

Наприклад, можна використовувати систему, в умовах поза живими організмами, в якій незначущі мутації заглушуються за допомогою аміноацилованих супресорних транспортних РНК. Відомі також методи синтезу амінокислот і амінсацилування транспортних РНК. Реакції транскрипції і трансляції плазмід, в яких присутні 2о незначущі мутації, здійснюються в безклітинній системі, яка містить екстракт ЗЗО кишкової палички Е.соїї і ферменти та інші реагенти, що комерційно поставляються. Протеїни очищають за допомогою хроматографії.

Див., наприклад, праці (Кобегізоп еї аіЇ., 9). Ат. Спет. ос. 113:2722, 1991; ЕПтап еї аїЇ., Ме(й. Епгутої. 202:301, 1991; Спипд еї аїЇ., 5сіепсе 259:806-809, 1993; Спипд еї аі, Ргос. Май). Асай. сі. ОЮБА 90:10145-49, 1993). Згідно з другим методом, трансляцію здійснюють в овоцитах Хепориз за допомогою мікроін'єкції мутованої с ов матричної РИК ї хімічно аміносацилованих супресорних транспортних РНК |Тигсаші еї аї., у. Віої. Спет. 271:19991-98, 1996). Згідно з третім методом, клітини кишкової палички Е.соїї культивують при відсутності і) природної амінокислоти, яка повинна бути замінена, (наприклад при відсутності фенілаланіну) але в присутності бажаних неприродних амінокислот (наприклад 2-азафенілаланіну, З-азафенілаланіну, 4-азафенілаланіну або 4-фторфенілаланіну). Неприродну амінокислоту вводять у протеїн замість її природного двійника. Див. працю «я зо ІКоїде еї аї., Віоснет. 23:7470-76, 1994). Природні амінокислотні залишки можна перетворювати в неприродні зразки за допомогою хімічної модифікації в умовах поза живими організмами. Хімічну модифікацію можна ("7 поєднувати з сайт-специфічним мутагенезом для того, щоб додатково розширити діапазон замін амінокислот (се (Мупп апа Кіснагав, Ргоїеїп Зсі. 2:395-403, 1993).

Суттєві амінокислоти в поліпептидах 2ЕОБ-5, що охоплюються цим винаходом, можна ідентифікувати за що)

Зв допомогою процедур, відомих спеціалістам у даній галузі наприклад за допомогою сайт-специфічного р. мутагенезу або мутагенезу з спрямованим аналізом аланіну |Сиппіпоайат апа УУеїз, Зсіепсе 244:1081-1085, 1989). Згідно з останнім методом, у кожному амінокислотному залишку молекули формують окремі мутації аланіну, після чого одержані мутантні молекули перевіряють на біологічну активність (наприклад, перевіряють активність щодо росту серцевих міоцитів або фібробластів, або щодо стимуляції формування кісток) для « визначення таких амінокислотних залишків, які мають важливе значення для активності молекули. Див. також з с працю (Нійоп еї аї., 9. Віої. Спет. 271:4699-4708, 1996). Місця взаємодії лігандів з рецепторами можна визначати також за допомогою методів фізичного аналізу структури, використовуючи, наприклад, методи ;» ядерного магнітного резонансу, кристалографії, дифракції електронів або ковалентної фіксації мічених субстратів під дією світла, поєднуючи ці методи з мутацією амінокислот у місцях очікуваного контакту. Див., наприклад, праці (де Моз еї аїЇ.,, Зсіепсе 255:306-312, 1992; тій еї аїЇ., 9. Мої. Віої. 224:899-904, 1992; -і УМіодамег еї аім,, РЕВ5 Їей. 309:59-64, 19921. Показники ідентичності суттєвих амінокислот можна також визначити за результатами аналізу гомології щодо споріднених ростових факторів фібробластів, як показано на і-й Фіглі2.

Га Результати аналізу амінокислотних послідовностей поліпептиду 2ЕОБЕ-5 показали наявність двохосновної бо секції в С-кінцевій частині поліпептиду (амінокислотні залишки 196-197 (Гувз-Аго)). Показано, що поліпептид, - укорочений в С-кінцевій частиш, який містить амінокислотну послідовність, показану в послідовності ЗЕО ІЮ МО:

Ф 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІш) до амінокислотного залишку 196 (Гуз), є біологічно активним. Двохосновні амінокислоти, наприклад Аго-Х-Х-Ага (де Х - будь-який амінокислотний залишок), Ага-Ага або І уг-Агу, можуть розщеплюватися під дією декількох ферментів, до яких належать, але без обмеження, дв тромбін і карбоксипептидази. Тому в пунктах формули винаходу врахована можливість консервативних змін у двохосновних амінокислотних залишках, зокрема в двохосновних амінокислотних залишках 196 (І ув) і 197 (Ага)

Ф) послідовності зЕО ІЮ МО: 2. ка На підставі результатів аналізу групи ростових факторів встановлено, що укорочена в С-кінцевій частині молекула, яка містить фрагмент послідовності ЗЕБЕО ІО МО: 2 від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до бо амінокислотного залишку 175 (Ме), може бути біологічно активною. Передбачається, що внутршшьомолекулярний дисульфідний зв'язок створюватиметься в секції між амінокислотними залишками 109 (Суз) і 129 (Суз) послідовності ЗЕО ІО МО: 2.

Одержані на основі гомологічних порівнянь з кристалічними структурами ростових факторів ЕОБ-1 і ЕОБ-2, прогнозовані дані вторинної структури, тобто ниткової бета-структури поліпептиду 2ЕОБ-5, відповідають б5 амінокислотним залишкам 56-59, 64-69, 73-76, 85-92. 96-102, 106-111, 115-119, 128-134, 138-144, І49-155 і 173-177 послідовності БЕО ІЮ МО: 2. Амінокислоти, які мають важливе значення для зв'язування поліпептиду

2ЕОБ-5 з рецепторами, можна ідентифікувати за допомогою сайт-специфічного мутагенезу всієї молекули поліпептиду 2ЕОЕ-5. Більш конкретно, ці амінокислоти можна ідентифікувати за допомогою сайт-специфічного мутагенезу тих амінокислот у поліпептиді 2-5, які відповідають амінокислотним залишкам у кислотному

Востовому факторі РОБ-1 і основному ростовому факторі ЕСБЕ-2, визначеним як такі, що мають важливе значення для зв'язування цих ростових факторів з їхніми рецепторами |Віабег еї аї!., Віоспет 35:2086-2094, 1996). До цих амінокислот належать амінокислоти Туг33, Агд53, Азп110, Туг112, І уг119, Тгр123, І ем149 і Мен 51 у ростовому факторі людини ЕОР-2, а також амінокислоти Туг3о, Агд50, Азп107, Тутоо, І уг116, Тгр122, І еш148 і

Ї ен150 у ростовому факторі людини ЕСЕ-1, як показано на Фіг.1 і 2. Відповідними амінокислотами в поліпептиді 70 2ЕОБ-5 є амінокислоти Туго8, СІу77, Авзп136, Туг138, І уг145, Тгр149, Мей75 і Аг9177, як показано на Фіг.1 і 2. Для спеціалістів у даній галузі очевидно, що інші ростові фактори з групи ростових факторів фібробластів можуть бути, повністю або частково, структурно або біохімічно подібними до поліпептиду 2ЕОБ-5 і що ожлива заміна цих ростових факторів за допомогою згаданого аналізу. Описані фрагменти мають важливе значення для біологічних функцій молекули.

Різноманітні заміни амінокислот можна здійснювати і перевіряти, використовуючи відомі методи мутагенезу і аналізу з відбором, наприклад методи, описані в праці (Кеїдпааг-ОїІзоп апа Зацег, Зсіепсе 241:53-57, 1988) або

ІВомуле апа Зацег, Ргос. Май). Асад. Зсі. ОЮОБА 86:2152-2156, 1989). Суть методів, запропонованих авторами цих праць, полягає в тому, що здійснюють одночасну рандомізацію двох або більшої кількості позицій елементів у поліпептиді, вибирають функціональний поліпептид, а потім розшифровують послідовності мутагенізованих поліпептидів для того, щоб визначити діапазон допустимих замін на кожній позиції. До інших методів, які можна використовувати, належать метод проявлення фатів, наприклад метод, розкритий в джерелах | ом/тап еї аї.,

Віоспет 30:10832-10837, 1991; І адпег еї аіІ., 05 Раїепі Мо. 5,223,409; Ниве, МІРО Рибіїсайоп МО 92/06204), і метод фрагмент-специфічного мутагенезу, описаний в працях |Оегрузпіге еї аїЇ.,, бепе 46:145, 1986; Мег еї аї.,

ОМА 7:127, 19881). с

Методи мутагенезу, розглянуті вище, можна поєднувати з високопродуктивними, автоматизованими о процедурами аналізу, призначеними для виявлення активності клонованих, мутагенізованих поліпептидів у клітинах-хазяїнах. Мутагенізовані молекули ДНК, які кодують активні поліпептиди (наприклад поліпептиди, що забезпечують ріст клітин), можна виділяти з клітин-хазяїнів і швидко розшифровувати, використовуючи сучасне обладнання. Згадані методи дозволяють швидко оцінювати важливість окремих амінокислотних залишків у «о зо певному поліпептиді і їх можна використовувати для аналізу поліпептидів з невідомою структурою.

За допомогою методів, розглянутих вище, звичайний спеціаліст у даній галузі може ідентифікувати або -- формувати різноманітні поліпептиди, які є суттєво гомологічними щодо послідовності, показаної в послідовності с

ЗЕБО ІО МО: 2 як фрагмент між амінокислотними залишками 28 (СІШ) і 196 (Гуз) або фрагмент між амінокислотними залишками 28 (Си) і 207 (Аа), а також алельні варіанти або біологічно активні фрагменти о зв ЗГгаданих поліпептидів, і забезпечувати збереження таких властивостей природного протеїну, які важливі для ї- росту клітин. Згадані поліпептиди можуть також містити додаткові поліпептидні сегменти, загальна інформація про які наведена вище.

Поліпептиди згідно з цим винаходом, включаючи первинні, непроцесовані протеїни, фрагменти цих протеїнів і злиті протеїни, можна формувати в клітинах-хазяїнах за допомогою процесів генетичної інженерії, «

Використовуючи відомі методи. До придатних клітин-хазяїнів належать такі клітини, які можна трансформувати з с або трансфектувати за допомогою екзогенної ДНК і вирощувати у відповідній культурі, наприклад клітини бактерій, грибкові клітини і культивовані клітини вищих евкаріотів. Переважно, необхідно використовувати ;» клітини евкаріотів, зокрема культивовані клітини багатоклітинних організмів. Методи обробки клонованих молекул ДНК і введення екзогенної ДНК у різноманітні югітини-хазяїни описані в працях |Затргоок еї аї., Моїесшаг Сіопіпд: А Гарогаюгу Мапмиаї, 2па ейд., Соїй Зргіпу Нагрог Іарогаїгу Ргевзв, Соїй Зргіпу Нагрог, МУ, -І 1989; А!йзибреї еї аїЇ. (едв.), Ситепі Ргоїосоіїв іп МоїІесшіаг Віоіоду, допп УМШеу апа Зопв, Іпс., ММ, 1987), які включені в цей опис винаходу за допомогою посилання. 1 Взагалі, послідовність ДНК, що кодує поліпептид 2ЕОР-5 згідно з цим винаходом, сполучена, для можливості 2) виконання заданих функцій, з іншими генетичними елементами, необхідними для експресії цієї послідовності, до 5р яких, взагалі, належать промотор і термінатор транскрипції у складі вектора експресії. Як правило, вектор - може містити також один або декілька вибіркових маркерів і одну або декілька зон початку реплікації, хоч для

Ф спеціалістів у даній галузі очевидно, що в певних системах вибіркові маркери можуть бути розташовані в окремих векторах, а реплікацію екзогенної ДНК можна забезпечити, вставляючи Її в геном клітини-хазяїна. Вибір промоторів, термінаторів, вибіркових маркерів, векторів та інших елементів здійснюється за допомогою відомих ов процедур генетичної інженерії, які доступні звичайним спеціалістам у даній галузі. Такі різноманітні елементи описані в літературі і доступні через комерційних постачальників.

Ф) Для спрямування поліпептиду 2ЕОЕ-5 на процес здійснення секреторних реакцій в клітині-хязяїні, вектор ка експресії містить секреторну сигнальну послідовність (відому також як лідерна послідовність, вихідна послідовність або початкова послідовність). Секреторна сигнальна послідовність може бути природною во послідовністю або химерною послідовністю, яка містить сигнальну послідовність, одержану з іншого секретованого протеїну (наприклад лідерну послідовність о-рге-рго з протеїну ІЇ-РА), або може бути синтезована як нова послідовність. Секреторна сигнальна послідовність сполучається з послідовністю ДНК поліпептиду 2ЕОБЕ-5 у правильно заданій рамці зчитування. Як правило, секреторні сигнальні послідовності розташовуються в 5'-кінцевій частині послідовності ДНК, яка кодує заданий поліпептид, хоч окремі сигнальні 65 послідовності можуть бути розташовані в будь-якій частиш даної послідовності ДНК (див., наприклад, описи до патентів (М/еїЇсй еї аіІ., О5 Раїепі Мо. 5,037,743; НоїІапа еї аІ., О5 Раїепі Мо. 5,143,8301).

Далі розглядається універсальна акцепторна плазміда, яка може бути використана для клонування ДНК, що кодує будь-який заданий поліпептид, включаючи злиті поліпептиди. Акцепторна плазміда корисна при використанні методу формування двониткової кільцевої молекули ДНК. Згідно з цим методом виконуються такі процедури: а) створення фрагмента двониткової донорної ДНК, що кодує заданий поліпептид; б) створення двониткової лінійної акцепторної плазміди, що має перший і другий тупі кінці і містить вибірковий маркер і послідовність реплікації, які виконують свої функції в середовищі Засспаготусез сегемізіде, причому акцепторна плазміда суттєво вільна від ДНК, що кодує заданий поліпептид; 70 в) створення першого лінкера двониткової ДНК, який містить перший сегмент, послідовність якого ідентична послідовності в першій зоні акцепторної плазміди, і другий сегмент, послідовність якого ідентична послідовності в першій зоні фрагмента донорної ДНК, причому кожний сегмент, як перший, так і другий, першого лінкера має довжину принаймні 10 пар комплементарних, пар гетероциклічних, основ; г) створення другого лінкера двониткової ДНК, який містить перший сегмент, послідовність якого ідентична послідовності в другій зоні акцепторної плазміди, і другий сегмент, послідовність якого ідентична послідовності в другій зоні фрагмента донорної ДНК, причому кожний сегмент, як перший, так і другий, другого лінкера має довжину принаймні 10 пар комплементарних пар гетероциклічних основ; д) об'єднання фрагмента донорної ДНК, акцепторної плазміди, першого лінкера ДНК і другого лінкера ДНК у клітині-хазяїні Засспаготусевз сегемізіае, внаслідок чого фрагмент донорної ДНК з'єднується з акцепторною го плазмідою за рахунок гомологічної рекомбінації донорної ДНК, акцепторної плазміди і лінкерів, утворюючи замкнуту кільцеву плазміду.

Акцепторна плазміда містить також промотор транскрипції, розташований ближче до першого кінця, а фрагмент донорної ДНК сполучений, для можливості виконання заданих функцій, з промотором транскрипції в замкнутій кільцевій плазміді. Крім того, акцепторна плазміда містить сегмент ДНК, що кодує лідерний пептид, і сч рб ОДИН або декілька сегментів ДНК, що кодують пептидну маркерну групу, розташовані таким чином, що ці сегменти ДНК сполучені, для можливості виконання заданих функцій, з фрагментом донорної ДНК у замкнутій і) кільцевій плазміді.

Згідно з переважним варіантом реалізації цього винаходу, акцепторна плазміда містить також: а) промотор, сегмент ДНК, що кодує перший лідерний пептид, і сегмент ДНК, що кодує першу пептидну Ге зо маркерну групу, причому сегмент ДНК, що кодує лідерний пептид, розташований між промотором і сегментом

ДНК, що кодує першу пептидну маркерну групу, розташовану ближче до першого кінця акцепторної плазміди, а 87 промотор, сегмент ДНК, що кодує лідерний пептид, і сегмент ДНК, що кодує першу пептидну маркерну групу, с сполучені для можливості виконання заданих функцій; б) сегмент ДНК, що кодує другу пептидну маркерну групу, розташовану ближче до другого кінця акцепторної о плазміди. ї-

Розглядається метод формування двониткової кільцевої молекули ДНК, згідно з яким виконуються такі процедури: а) створення декількох: фрагментів двониткової донорної ДНК, що перекриваються, які разом кодують заданий поліпептид; « б) створення двониткової лінійної акцепторної плазміди, що має перший і другий тупі кінці і містить з с вибірковий маркер і послідовність реплікації, які виконують свої функції в середовищі Засспаготусез . сегемізіде, причому акцепторна плазміда суттєво вільна від ДНК, що кодує заданий поліпептид; и? в) створення першого лінкера двониткової ДНК, який містить перший сегмент, послідовність якого ідентична послідовності в першій зоні акцепторної плазміди, і другий сегмент, послідовність якого ідентична послідовності в першій зоні одного з фрагментів донорної ДНК, причому кожний сегмент, як перший, так і -І другий, першого лінкера має довжину принаймні 10 пар комплементарних пар гетероциклічних основ; г) створення другого лінкера двониткової ДНК, який містить перший сегмент, послідовність якого ідентична 1 послідовності в другій зоні акцепторної плазміди, і другий сегмент, послідовність якого ідентична 2) послідовності в зоні іншого фрагмента донорної ДНК, причому кожний сегмент, як перший, так і другий, другого Ллінкера має довжину принаймні 10 пар комплементарних пар гетероциклічних основ; - д) об'єднання фрагментів донорної ДНК, акцепторної плазміди, першого лінкера ДНК і другого лінкера ДНК у

Ф клітині-хазяїні Засспаготусевз сегемізіае, внаслідок чого фрагменти донорної ДНК з'єднуються з акцепторною плазмідою за рахунок гомологічної рекомбінації, утворюючи замкнуту кільцеву плазміду, яка містить зону, що кодує заданий поліпептид.

Акцепторна плазміда містить також один або декілька промоторів транскрипції, фрагмент донорної ДНК, що кодує лідерний пептид, і один або декілька сегментів ДНК, що кодують пептидну маркерну групу, як описано (Ф, вище. ка Грибкові клітини, включаючи дріжджові клітини, зокрема клітини виду Засспаготусез або Ріскіа, є переважними для використання їх як клітин-хаїнів при формуванні фрагментів поліпептиду 2РОБ-5 або продуктів бо Злиття поліпептидів.

Інші методи трансформації дріжджових клітин за допомогою екзогенної ДНК і формування рекомбінантних поліпептидів з таких клітин розглядаються, наприклад, в описах до патентів (Камжмазакі, О5 Раїепі Мо. 4,599,311; КамазакКі еї аі,, ОБ Раїепі Мо. 4,931,373; Вгаке, О5 Раїепі Мо. 4,870,008; УУеЇспй еї аіІ,, 05 Раїепі

Мо. 5,037,743; Мигтау еї аі., ОБ Раїепі Мо. 4,845,075), які включені в цей опис винаходу за допомогою 65 посилання. Трансформовані клітини вибирають за фенотипом, визначеним за допомогою вибіркового маркера, як правило за стійкістю до лікарських засобів або за спроможністю росту при відсутності певного живильного елемента (наприклад лейцину). Альтернативною переважною векторною системою для використання в дріжджових клітинах є векторна система РОТ 1, що розглядається в описі до патенту (Каугазакі еї аіІ., О5 Раїепі

Мо. 4,931,373), яка дозволяє вибирати трансформовані клітини за показниками росту в середовищі, що містить глюкозу. До промоторів і термінаторів, придатних для використання в дріжджових клітинах, належать промотори і термінатори, одержані з гонів гліколітичного ферменту (див., наприклад, описи до патентів (Камжмазакі еї аї.,

ОБ Раїепі Мо. 4,599,311; Кіпдзтапп еї аі, ОБ Раїепі Мо. 4,615,974; Війег, 05 Раїепі Мо. 4,977,0921, які включені в цей опис винаходу за допомогою посилання) і генів алкогольдегідрогенази. Див. також описи до патентів США МоМо 4990446, 5063154, 5139936 і 4661454, які включені в цей опис винаходу за допомогою 7/0 посилання. Системи трансформації, призначені для інших дріжджових клітин, включаючи клітини Напзепіда роїутогрпа, Зспігозасспаготусез ротбре, Кісумеготусевз Іасіїв, Кісумеготусевз Ігадійїв, Ові(Шадо тауаїв, Рісніа разіогіз, Ріспіа диШептопаїй і клітини Сапаїа таза, також відомі спеціалістам у даній галузі В особливо переважній системі використовуються клітини Ріспіа тейпагоїїса (див. опис до патентної заявки УУО 9717450).

Альтернативні системи трансформації описані, наприклад, у працях |СіІеезоп еї аї., У. Сеп. Місгобіо!. 132:3459-3465, 1986; Стедо, О5 Раїепі Мо. 4,882,279). Можна використовувати клітини Авзрегойив, згідно з методами, що розглядаються в описі до патенту |МеКпідні еї аІ., О5 Раїепі Мо. 4,935,349), який включений в цей опис винаходу за допомогою посилання. Методи трансформації клітин Асгетопішт спгузодепит розглядаються в описі до патенту (Зитіпо еї аіІ., 05 Раїепі Мо. 5,162,228), який включений в цей опис винаходу за допомогою посилання. Методи трансформації клітин Мейгозрога розглядаються в описі до патенту (Сатромї»., 05 Раїепі Мо. 4,486,533), який включений в цей опис винаходу за допомогою посилання.

Культивовані клітини, одержані з тканин ссавців, є також переважними для використання, як клітини-хазяїни, згідно з цим винаходом. До методів введення екзогенної ДНК у клітини-хазяїни з тканин ссавців належать методи трансфекції через посередництво фосфату кальцію ГМУідіІег еї аї., СеїЇ 14:725, 1987;

Соіваго апа Реагзоп, Ботаїййс Сеї| Сепеїісв 7603, 1981; Сгайат апа Мап дег ЕБ, Мігоіоду 52:456, 1973), сч ов електропорації |Мештапп еї аі., ЕМВО У. 1:841-845, 1982), трансфекції через посередництво ОЕАЕ -декстрану (АХизибеї! еї аї., ейв., Сипепі Ргоїосоіїв іп Моіесціаг Віоіоду, доп УУШеу апа Бопв, Іпс., ММ, 1987) і (8) трансфекції через посередництво ліпосоми ІНаумлЛеу-Меївоп еї аїЇ.,, Босивз 15:73, 1993; Сіссагопе еї аї., Босив 15:80, 1993), причому згадані праці включені в цей опис винаходу за допомогою посилання. Формування рекомбінантних поліпептидів у культивованих клітинах тканин ссавців розглядається, наприклад, в описах до «о зо патентів (еміпвоп еї аі., 05 Раїепі Мо. 4,713,339; Надеп еї аі., О5 Раїепі Мо. 4,784,950; Раїтйег еї аї., 5 Раїепі Мо. 4,579,821; Кіпдоїда, О5 Раїепі Мо. 4,656,134), які включені в цей опис винаходу за допомогою - посилання. До переважно використовуваних культивованих клітин з тканин ссавців належать клітини СО5-1 с

ІАТОСС Мо. СІ 16501, 205-7 |АТСС Мо. СІ. 1651), ВНК 570 (АТС Мо. СК. 10314), 293 (АТС Мо. СК. 1573;

Сгапат еї аї., уУ. Сеп. МігоІї. 36:59-72, 1977| і група клітин з яєчників китайського хом'ячка (наприклад о клітини СНО-КІ ІАТСС Мо. ССІ 611). Спеціалістам у даній галузі відомі додаткові придатні клітини, які ї- поставляються такими комерційними постачальниками, як АТСС (Американська колекція типів культур), Роквіл, штат Меріленд. Взагалі, переважно необхідно використовувати сильні промотори транскрипції, наприклад промотори, одержані з вірусу 5М-40 або цитомегаловірусу. Див., наприклад, опис до патенту США Мо4956288. До інших придатних промоторів належать промотори, одержані з генів металотіонешу (див. описи до патентів США «

МоМо 4579821 і 4601978, які включені в цей опис винаходу за допомогою посилання), і промотор, одержаний з шщ с аденовірусу.

Відбір за стійкістю до лікарських засобів використовується, як правило, для селекції культивованих клітин з з тканин ссавців, в які введена чужорідна ДНК. Такі клітини відомі під загальною назвою "трансфектанти".

Клітини, які культивуються в присутності агента для селекції і які забезпечують передачу заданого гена потомству цих клітин, відомі як "стабільні трансфектанти". Переважним вибірковим маркером є ген, що кодує -І стійкість до антибіотичного неоміціну. Селекцію здійснюють у присутності лікарського засобу типу "неоміцин", наприклад 0-418, або іншого подібного лікарського засобу. Системи селекції можна також використовувати для 1 підвищення рівня експресії заданого гена (відповідний процес відомий як "підсилення"). Підсилення 2) здійснюється при культивуванні трансфектантів у присутності, на невеликому рівні, агента дня селекції, з 5р наступним підвищенням кількості агента для селекції таким чином, щоб вибрати клітини, які забезпечують - інтенсивне формування продуктів, синтезованих введеними генами. Переважно використовуваним вибірковим

Ф маркером, що може бути підсилений, є диїдрофолатредуктаза, яка забезпечує стійкість до метотрексату. Можна використовувати також інші гени, що забезпечують стійкість до лікарських засобів (наприклад стійкість до гідроміцину, стійкість до декількох лікарських засобів, стійкість до пуроміцин-ацетилтгрансферази).

До інших клітин вищих евкаріотів, які також можна використовувати як клітини-хазяїни, належать клітини з організмів комах, рослин і птахів. Трансформація клітин з організмів комах і формування чужорідних

Ф) поліпептидних протеїнів у цих клітинах розглядаються в описах до патентів |Сцагіпо еї аіІ.,, О5 Раїепі Мо. ка 5,162,222; Вапад еї аІ., 05 Раїепі Мо. 4,775,624) і описі до патентної заявки, публікація МІРО УУ/О 94/06463, які включені в цей опис винаходу за допомогою посилання. Використання культури Адгобрасіегімп гпігодепез як бо Вектора для експресії генів у рослинних клітинах описано в праці (ЗіпКаг еї аї., у. Віовсі. (Вапоаоге) 11:47-58, 1987).

Трансформовані або трансфектовані клітини-хазяїни культивують відповідно до звичайних процедур, У середовищі для культивації, яке містить поживні речовини та інші компоненти, необхідні для росту вибраних клітин-хазяїв. Спеціалістам у даній галузі відомі різні середовища для культивації клітин, придатні для 65 Використання, включаючи спеціальні і комплексні середовища, і кожне таке середовище містить, як правило, джерело вуглецю, джерело азоту, суттєво необхідні амінокислоти, вітаміни і мінерали. Середовище для культивації клітин може також містити такі елементи, як ростові фактори або сироватку, залежно від необхідності. Як правило, вибирають таке середовище для вирощування клітин, яке придатне для клітин з екзогенно введеною ДНК, використовуючи, наприклад, відбір за стійкістю до лікарських засобів або відбір за можливістю росту при відсутності суттєво необхідної живильної речовини, у поєднанні з вибірковим маркером, який присутній у векторі експресії або трансфектований в клітині-хазяїні.

Рекомбінантні поліпептиди 2-5 (або химерні поліпептиди 2ЕОЕ-5), одержані в результаті експресії, можна очищати, використовуючи метод фракціонування або звичайні методи очищення і звичайні середовища. Для фракціонування зразків можна використовувати осаджування сульфатом амонію, а також екстрагування 7/0 Кислотою або лугом. Як приклади, можна назвати такі процедури, які можна використовувати в процесі очищення: обробка гідроксиапатитом, сортування за розмірами, рідинна експрес-хроматографія протеїнів і обернено-фазова рідинна хроматографія з високою вирізняльною спроможністю. Придатними середовищами для аніонного обміну є похідні декстрану, агароза, целюлоза, поліакриламід, спеціальні зразки кремнезему і тому подібні речовини. Переважно, необхідно використовувати похідні РЕІ, ОЕАЕ, ОАЕ і О, а особливо /5 переважно - сефарозу малої густини ОВАЄЕ (РНаптасіа, Різсагамлму, МУ). Прикладами середовищ для хроматографії є середовища, що містять фенілові, бутилові або октилові групи, наприклад феніл-сефароза ЕЕ (Рпагтасіа), бутил Тоуореагі 650 (Тозо Нааз, МопідотегумПе, РА), октил-сефароза (РНагтасіа) і тому подібні, або поліакрилати, наприклад Атрегспгот Со 71 (Тозо Нааз) і тому подібні. Як придатні тверді підкладки, використовують скляні гранули, силіконові смоли, целюлозні смоли, агарозні гранули, гранули агарози з 2о перехресними зв'язками, полістирольні гранули, поліакриламідні смоли з перехресними зв'язками і тому подібні матеріали, які є нерозчинними в умовах використання. Згадані підкладки можна модифікувати за допомогою реактивних груп, які забезпечують можливість зчеплення протеїнів з підкладками за допомогою амінових груп, карбоксильних груп, сульфогідрильних груп, гідроксильних груп або вуглеводних сполук. Прикладами хімічних процесів, що забезпечують зчеплення з підкладками, є активація бромідом, активація М-гідроксисукцинімідом, сч об активація епоксидом, активація сульфогідрилом, активація гідразидом, а також активація карбоксильними і о аміловими похідними у випадку хімічних процесів для зчеплення з підкладками, в яких використовується ціанамід. Згадані та інші тверді підкладки відомі спеціалістам у даній галузі, широко використовуються і поставляються комерційними постачальниками. Методи, що забезпечують зчеплення рецепторних поліпептидів з твердими підкладками, також відомі спеціалістам у даній галузі. Вибір конкретного методу здійснюється Ге зо відповідно до звичайних процедур і частково залежить від характеристик вибраної підкладки. Див., наприклад, працю (Айіпйу Спготаїйоагарну: Ргіпсірієв апа Меййподз, Ріагтасіа І КВ Віоїесппоіоду, Оррзаїа, Зм/едеп, 19881. --

Поліпептиди, що охоплюються цим винаходом, можна також ізолювати, використовуючи їхні властивості с щодо зв'язування з гепарином. Необхідна інформація наведена в праці (Вигдезз еї еї., Апп. Кеу. ої Віоспет. 58:575-606, 1989). Ростові фактори, що належать до групи ростових факторів фібробластів, можна очищати, для о

З5 Досягнення очевидної гомогенності, використовуючи афінну хроматографію за спорідненістю до гепарину і ї- сефарози |Созродагоміс» еї аїЇ., Ргос. Май. Асайд. сі. 81:6963-6967, 1984)Ї, і елюювати в умовах лінійних: ступінчастих градієнтів Масі |Коп еї аї., У. Віої. Спет. 268(4):2984-2988, 1993; Спготаїйодгарпу: Ргіпсіріев апа Меїйподз, рр.77-80, Рпаптасіа ЇКОВ Віоїесппоіоду, Оррзаїа, Змедеп, 1993; "Ітторбіїйгей АНЙіпйу Гідапа

Тесппідцев", Нептапзоп еї аї., едв., 1655-167, Асадетіс Ргез5, Зап Оіедо, 1992; Кіейеп еї аїЇ., Апп. Кеу. «

Віоспет. 60:443-474, 1991; Ке еї а!., Ргоїеіп Ехрг. Ригії. 3(6):497-507, 19921. з с До інших методів очищення належить метод хроматографії з адсорбцією імобілізованих іонів металів (ІМАС),

Й призначений для очищення протеїнів, збагачених гістидином. Суть цього методу полягає в тому, що гель и?» спочатку заряджають іонами двовалентного металу для утворення хелатної сполуки (Е. ЗцйцІКомузкі, Тгепаз іп

Віоспет. 3:1-7, 1985). Протеїни, збагачені гістидином, адсорбуються цим матеріалом з різними мірами спорідненості, залежно від використовуваних іонів металу, і можуть бути елюйовані за допомогою процесу -І протилежно спрямованого елюювання, внаслідок якого зменшується показник рН, або за допомогою сильних агентів для формування хелатних сполук. До інших методів очищення належать метод очищення глікозилованих о протеїнів за допомогою афінної хроматографії за спорідненістю до лектину і хроматографії з обміном іонів 2) ІМеїйподв іп Еплгутої., МоЇ. 182, "Сціде Юю Ргоївіп Ригіїйсайоп", М. Оецівзспег, (ед.), Асад. Ргезз, Зап Оіедо, 1990, рр.529-539). Як альтернативний метод, для полегшення очищення можна використовувати продукт злиття - заданого поліпептиду і маркера спорідненості (наприклад групи полігистидину, протеїну, що зв'язує мальтозу,

Ф або імуноглобіну).

Певні переваги забезпечуються при використанні процедур повторного упорядкування протеїну (а також процедур додаткового повторного окислення). Переважно, необхідно використовувати протеїн з чистотою більше 8095, більш переважно - з чистотою більше 9095, а найбільш переважно - з чистотою більше 9590; краще всього використовувати фармацевтично чистий протеїн, тобто протеїн з чистотою більше 99,995 щодо

Ф) забруднювальних макромолекул, домішок інших протеїнів і нуклеїнових кислот, вільний від інфекційних та ка пірогенних компонентів. Переважно, в очищеному протеїні суттєво відсутні інші протеїни, зокрема інші протеїни тваринного походження. во Поліпептиди 2ЕОБ-5 або фрагменти цих поліпептидів можна також формувати за допомогою хімічного синтезу. Поліпептиди 2ЕОБ-5 можуть бути мономерами або полімерами, глікозилованими або неглікозилованими, пегілованими або непегілованими і можуть або не можуть містити початковий метіониновий амінокислотний залишок.

Активність молекул, що охоплюються цим винаходом, можна оцінювати за допомогою різних методів аналізу, 65 наприклад, оцінюючи регенерацію або гіперплазію (тобто ріст) серцевих клітин на основі специфічності серцевих тканин дорослих організмів. До додаткових показників активності, використання яких є імовірним щодо поліпептидів згідно з цим винаходом, належать: ріст ендотеліальних клітин, кардіоміцитів, фібробластів, скелетних міоцитів, посередньо або безпосередньо під дією інших ростових факторів; дія як фактора хемотаксису щодо ендотеліальних клітин, фібробластів або фагоцитів; дія як остеогенного фактора; дія як фактора розширення мезенхимних початкових клітин і популяцій-попереднків.

Показники росту можна оцінювати, використовуючи культивовані клітини серцевих тканин, або, у живих організмах, за допомогою введення молекул, одержаних згідно з винаходом, що пропонується, в організм відповідної піддослідної тварини. Взагалі, вплив на ріст клітин оцінюється за збільшенням кількості клітин і тому така оцінка може враховувати гальмування процесу втрати клітин, а також мітогенез. До культивованих 7/0 Клітин належать серцеві фібробласти, серцеві міоцити, скелетні міоцити і ендотеліальні клітини пупкової вени людини, одержані з первинних культур. До ряду визначених клітин належать фібробласт МІН ЗТЗ (АТСС Мо.

СКІ-1658), серцеві клітини СНН-1ї кети (АТС Мо. СКІ-1680), серцеві міобласти НОс2 пацюка (АТСС Мо.

СІ -1446), ракові клітини Зпіоподі молочної залози |Тапака еї аї., Ргос. Май). Асад. Зсі. 89:8928-8932, 19911 і клітини І МСар.гООо аденокарциноми (АТС Мо. СКІ-1740). Методи аналізу для оцінки росту клітин достатньо відомі спеціалістам у даній галузі. Наприклад, до цих методів аналізу належать такі методи, як метод аналізу чутливості до хімічних подразників, зокрема до нейтрального червоного барвника, (див. працю |Самапацой еї аІ., Іпмезіїдайопа! Мем ЮОгиде 8:347-354, 1990), включену в цей опис винаходу за допомогою посилання), метод аналізу з введенням нукліотидів з радіоактивними мітками (див. працю |СооК еї аї., Апайїуїса! Віоспет. 179:1-7, 1989), включену в цей опис винаходу за допомогою посилання), метод аналізу з введенням 5-бром-2'-дезокюийурідину (Вга)) в ДНК клітин, що розростаються (див. працю |Рогзітапп еї аї.,.). Іттипо).

Меїйодз 82:169-179, 1985), включену в цей опис винаходу за допомогою посилання) і метод аналізу з використанням: тетразольних солей (див. праці |Мозтапп, у. Іттипої. Меїйподз 65:55-63, 1983; АйПеу еї аї.,

Сапсег Кевз. 48:589-601, 1988; МагенпаїЇ еф аїЇ., Сгомій Кед. 5:69-84, 1995; Зсцадіего еї аїЇ., Сапсег Кезв. 48:4827-4833, 1988), які всі включені в цей опис винаходу за допомогою посилання). сч

Диференціювання клітин являє собою динамічний процес, що розвивається, і починається з плюрипотентних початкових клітин, а закінчується формуванням повністю диференційованих клітин. Плюрипотентні початкові і) клітини, повна регенерація яких можлива без підтримання послідовності клітинних поколінь, виділяють набір маркерів диференціації, які втрачаються у випадку, коли підтримується послідовність клітинних поколінь.

Недиференційовані клітини-попередники виділяють набір маркерів диференціації, експресія яких може Ге зо продовжуватися або не продовжуватися в процесі розвитку клітин, згідно з послідовністю клітинних поколінь, до дозрівання. Маркери диференціації, експресія яких здійснюється виключно зрілими клітинами, характеризують, -- як правило, функціональні властивості клітини, наприклад клітинні продукти, ферменти для утворення цих с клітинних продуктів і рецептори. Етап диференціації популяції клітин контролюють за допомогою ідентифікації маркерів, присутніх у популяції клітин. Вважається, що міоцити, остеобласти, адіпоцити, хондроцити, о фібробласти і клітини сітківки ока походять з спільної мезенхимної початкової клітини |Омеп еї аї., Сіра Еап. ї-

Зутр. 136:42-46, 1988). Маркери для мезенхимних початкових клітин не ідентифіковані достатньою мірою |Ожмеп ей а, 9. ої СеїЇ Зсі. 87:731-738, 1987), тому ідентифікацію здійснюють на етапах, що відповідають клітині-попереднику і зрілій клітині. Наявність на ранньому етапі початкових клітин, що є клітинами-попередниками серцевих міоцитів (на які часто посилаються як на початкові клітини для серцевих «

Міоцитів), передбачається, але не продемонстрована, у серцевих тканинах дорослих організмів. Нові з с поліпептиди згідно з цим винаходом можуть виявитися корисними при дослідженнях з метою відокремлення мезенхимних початкових клітин і клітин, що є клітинами-попередниками серцевих міоцитів, як у живих ;» організмах, так і умовах поза живими організмами.

Існують докази, які дозволяють стверджувати, що фактори, які стимулюють розвиток процесів у специфічних Клітинах для досягнення повної диференціації або дедиференціації, впливають на всю популяцію клітин, яка -І походить від спільної клітини-попередника або початкової клітини. Таким чином, цей винахід охоплює стимуляцію процесів гальмування росту або процесів росту міоцитів, клітин гладеньких м'язів, остеобластів, 1 адіпоцитів, хондроцитів і ендотеліальних клітин. Молекули, створені згідно з цим винаходом, можуть, 2) стимулюючи ріст або диференціацію серцевих міоцитів, одночасно гальмувати ріст або диференціацію адіпоцитів завдяки впливу на початкові клітини або клітини-попередники, що є спільними для адіпоцитів. Таким - чином, молекули згідно з цим винаходом, можна використовувати для припинення розвитку хондросаркоми,

Ф атеросклерозу, рестенозу і ожиріння.

До методів аналізу диференціації належать, наприклад, методи оцінки тих маркерів у поверхневих частинах клітин, які пов'язані з експресією тканин, специфічною щодо етапу диференціації, активністю ферментів, ов функціональною активністю або морфологічними змінами (див. праці (М/ай, РАЗЕВ 5:281-284, 1991; Егапвієв,

Оіїйегепііайоп 57:63-75, 1994; Каевз, Айм. Апіт. Сеї/| ВіоЇ. ТесппоїЇ. Віоргосеззе5з, 161-171, 1989), які всі (Ф, включені в цей опис винаходу за допомогою посилання). ка Згідно з процедурами аналізу в живих організмах, призначеними для оцінки відновлення серцевих клітин або гіперплазії, молекули, одержані за цим винаходом, вводять новонародженим або дорослим пацюкам. Серцеву бо діяльність у тварин оцінюють, вимірюючи частоту серцевих скорочень, кров'яний тиск і хвилинний об'єм серця для того, щоб оцінити роботу лівого шлуночка серця. Процедури аналізу, призначені для оцінки поліпшення серцевої діяльності, які використовуються після смерті тварини, передбачають оцінку збільшення маси серця, об'єму ядер і цитоплазми, а також контрастне фарбування серцевих гістологічних зон для виявлення ядерного антигену в клітинах, що розростаються, залежно від рівня актину в цитоплазмі (Оицаїпі еї аї!., Сігсшаєноп Кез. 65 75:1050-1063, 1994; Кеївз еї аі., Ргос. Май). Асад. зсі. 93:8630-8635, 1996).

Процедури аналізу, у живих організмах, призначені для оцінки змін інтенсивності формування кісток,

передбачають аналіз гістології кісток (див., наприклад, працю (|КесКег, К.., еавз., Вопе Нізвіотогрпотегсгу:

Тесппідцчез апа Іпіегргейайоп, Воса Каїоп: СКС Ргевзв, Іпс., 1983)) і комп'ютерну томографію з оцінкою кількісних показників (ОСТ; Реїтейці, 9. Вопе 17:3535-3645, 1995; Огрпапоїшдаків еї аї., Іпмевід. Кавфдіо|. 14:122-130, 1979; Юигапа еї аї., Медіса! Рпузісв 19:569-573, 1992). Як метод аналізу, в умовах поза живими організмами, для оцінки змін у формуванні кісток може бути використаний, наприклад, метод калаваріального аналізу |Сомеп еї аї., 9. Іттітої! 136:2478-2482, 19861.

Щодо балансу енергії модуляції, зокрема з точки зору зв'язку енергії модуляції з метаболізмом, ростом і диференціацією адипоцитів, то поліпептиди 2ЕОБ-5 модулюють вплив на метаболічні реакції. До таких 70 метаболічних реакцій належать реакції адіпогенезу, глюконеогенезу, глікогенолізу, ліпогенезу, споживання глюкози, синтезу протеїну, термогенезу, використання кисню і тому подібні реакції. Поряд з іншими методами, які відомі спеціалістам у даній галузі або розглядаються в цьому описі винаходу, для оцінки енергетичного балансу у ссавців можна контролювати одну або декілька вищезгаданих метаболічних функцій. Ці метаболічні функції контролюють за допомогою методів (методів лабораторного аналізу або аналізу на піддослідних /5 тваринах), які відомі звичайним спеціалістам у даній галузі і які докладніше будуть розглянуті нижче.

Наприклад, дія інсуліну як регулятора вмісту глюкози в крові виявляється, переважно, у печінці, скелетних м'язах і жирових тканинах. У скелетних м'язах і жирових тканинах інсулін стимулює споживання, зберігання і використання глюкози.

Існують методи, визнані в даній галузі, які призначені для контролю всіх метаболічних функцій, 2о розглянутих вище. Таким чином, звичайний спеціаліст у даній галузі зможе оцінювати поліпептиди 2ЕСБ-5, фрагменти цих поліпептидів, злиті протеїни, антитіла, агоністи і антагоністи стосовно функцій, що модулюють метаболізм. Приклади, що ілюструють методи модуляції, наведені нижче.

Ліпогенез, стимульований інсуліном, можна контролювати, наприклад, вимірюючи включення ""С-ацетату в тригліцерид (МаскКаїй! еї аї., 9. Віої. Спет. 251:6462-6464, 1976| або накопичення тригліцериду (|Кіеїліеп еї Га а, Мої. Рнагтасої. 41:393-398, 19921.

Споживання глюкози, стимульоване поліпептидом 2ЕОБЕ-5, можна оцінювати, наприклад, використовуючи о метод аналізу процесу перенесення глюкози, стимульованого інсуліном. Первинні адіпоцити або клітини МІН ЗТЗ3

Ї1 ІАТСС Мо. ССІ-92.1), поміщають у середовище ЮОМЕМ (середовище Ігла, модифіковане за способом

Дульбеко), яке містить 1г/л глюкози, 0,595 або 1,095 альбуміну В5А (альбумін бичачої сироватки), 20ММ кислоти «о НЕРЕЗ (М-2-гідроксиетилпеперазин-М'-2-етаносульронова кислота) і 2ММ глютаміну. Після культивування, протягом 2-5 годин, середовище заміняють свіжим, вільним від глюкози середовищем ЮОМЕМ, що містить 0,590 -- або 1,095 альбуміну ВБА, 20ММ кислоти НЕРЕ5, 1ММ пірувату і 2мМ глютаміну. Потім додають поліпептид со 2ЕОЕ-5, інсулін або інсуліноподібний ростовий фактор ІСЕ-5, або розчин досліджуваної речовини і забезпечують інкубацію клітин протягом 20-30 хвилин. Після цього додають дезоксиглюкозу, мічену ізотопом ЗН або 71С, до о досягнення остаточної концентрації приблизно БОМ, і забезпечують інкубацію клітин протягом 10-30 хвилин. ї-

Потім клітини швидко промивають холодним буферним розчином, наприклад розчином РВЗ (фізіологічний розчин з фосфатним буфером), а потім лізують, використовуючи придатний агент для лізування, наприклад розчин ОЗ (додецилсульфат натрію) з концентрацією 195 або розчин 1М Маон. Після цього оцінюють вміст « клітинного лізату, використовуючи сцинтиляційний лічильник. Радіоактивність, пов'язану з клітинами, вимірюють як показник, що характеризує перенесення глюкози, після усунення неспецифічного зв'язування, визначеного - с при інкубації клітин у присутності цитохапазину Б, який є інгібітором перенесення глюкози. До інших методів а належать методи, описані, наприклад, у працях |Мапспевіег еї аЇ.,, Ат. 9. РПїзіої. 266 (Епдосгіпої. Мегаб. "» 29): ЕЗ326-ЕЗ3З3З, 19941 (перенесення глюкози, стимульоване інсуліном).

Синтез протеїнів можна оцінювати, наприклад, порівнюючи осадження протеїнів, мічених 355-метіонином, після інкубації досліджуваних клітин у присутності З9-метіонину, а потім у присутності З98-метіонину і - передбачуваного модулятора синтезу протеїнів. с Термогенез можна оцінювати за допомогою методу, описаного в працях ІВ. (апівеу, Віоіоду ої Меигорерііде У апа Кеїаїей Реріїдез, МУ. СоІтеге апа С. УУайіевівді (еаз.), Нитапа Ргезз, ОНама, 1993, рр.457-569; С. і ВіПіпдіоп ей аїЇ, Ат. 4). РНпувіої. 260:К321, 1991; М. 7агіемеКкі еї аїЇ., Епаосгіпорду 133:1753, 1993; С. -оУу 70 ВіШпдюп о еї аї, Ат. У. РНувіої. 266:К1765, 1994; НейПег еї аЇ,, Ат. 9. РНувіої. 254(4 РІ 2): К661-7, 1987;

Неїег еї а, Ат. 9. РІувзіоЇї. 245(3):К321-8, 1983)|. Крім того, непрямим показником термогенезу є рівень 0 метаболізму, який можна вимірювати за допомогою різних методів.

Використання кисню можна оцінювати за допомогою методу, описаного в праці ІНепПег еї. а, РПидеге Агсп 369(1):55-59, 1977). Цей метод передбачає також аналіз температури гіпоталамуса і виділяння тепла в 22 метаболічних процесах. Використання кисню і терморегуляція були оцінені також в організмі людини, як описано

ГФ) в праці ІНазкеї! еї. а/!., У. Аррі. Ріпузіої. 51(4):948-954, 19811.

Поліпептиди 2ЕОБ-5 можна також використовувати для створення антитіл, які специфічно зв'язуються з о епітопами поліпептиду 2ЕОБЕ-5, пептидами або поліпептидами. Методи створення поліклональних і моноклональних антитіл достатньо відомі спеціалістам у даній галузі (див., наприклад, праці (Затрбгоок еї аї., 60 Моіесціаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиа!Ї, Зесопіа Еайіоп, Со бргіпд Нагрог, МУ, 1989; НиїттеїІЇ, 9У. с. К., Еа.,

Мопосіопа! Нубгідота Апііродіев: Тесппідоез апа Арріїсайопе, СКС Ргевзв, Іпс., Воса Каїоп, РІ, 19821, які включені в цей опис винаходу за допомогою посилання). Як очевидно для звичайного спеціаліста в даній галузі, поліклональні антитіла можна формувати з клітин, одержаних з різних теплокровних тварин, наприклад коней, корів, кіз, овець, собак, курчат, кроликів, мишей і пацюків. бо Імуногенність поліпептиду 2ЕОБ-5 можна підвищити, використовуючи ад'ювант (стимулятор), наприклад галун (гідроксид алюмінію), а також повний або неповний ад'ювант Фройнда (Егешпа). До поліпептидів, придатних для імунізації, належать також злиті поліпептиди, наприклад продукти злиття поліпептиду 2ЕОБЕ-5 або частини поліпептиду 2ЕОБ-5 з поліпептидом імуноглобуліну або протеїном, що зв'язує мальтозу. Поліпептидним імуногеном може бути первинна, непроцесована молекула або частка цієї молекули. Якщо частка поліпептиду є гаптеноподібною, то таку частку можна приєднати до макромолекулярного носія або сполучити з макромолекулярним носієм (наприклад з молекулою блюдечкового гемоціаніну (КІМ), альбуміну бичачої сироватки (ВЗА) або токсоїду тетанусу) для імунізації.

Термін "антитіло", що використовується в цьому описі винаходу, поширюється на поліклональні антитіла, 7/0 поліклональні антитіла, очищені за допомогою афінного очищення, моноклональні антитіла і фрагменти, що зв'язують антигени, наприклад протеолітичні фрагменти Е(ар)2 і Раф. Цей термін поширюються також на непошкоджені антитіла або фрагменти, створені за допомогою методів генетичної інженерії, наприклад химерні антитіла, фрагменти Ем, окремі ланцюгові антитіла та інші подібні антитіла, а також на синтетичні пептиди і поліпептиди, що зв'язують антигени. Антитіла, що не відповідають людському походженню, можна /5 перетворювати в антитіла людського походження, пересаджуючи тільки комплементзалежні залишки в каркасні і константні зони людського походження або вставляючи повні варіабельні секції, що не відповідають людському походженню (покриваючи їх, за вибором, поверхнею, що відповідає молекулі людського походження, за допомогою заміни відкритих залишків, внаслідок чого формується так зване антитіло з поверхневим покриттям).

У деяких випадках антитіла, перетворені в антитіла людського походження, можуть зберігати у варіабельних 2о секціях каркасних зон людського походження залишки, що не відповідають людському походженню, які необхідні для поліпшення відповідних характеристик зв'язування. Завдяки перетворенню антитіл в антитіла людського походження, можна збільшити період біологічного нашвжиття антитіл і зменшити потенціальну можливість виникнення несприятливих імунних реакцій після введення антитіл в організм людини. До альтернативних методів формування або вибору антитіл, придатних для використання в цьому винаході, належать метод с ов експозиції, в умовах поза живими організмами, лімфоцитів до протеїну або пептиду 2ЕОБ-5 і метод вибору для створення бібліотек виражених антитіл у фагах та в інших подібних векторах (використовуючи, наприклад, і) імобілізований або мічений протеїн або пептид 2-5).

Антитіла визначаються як такі, що специфічно зв'язуються, якщо вони зв'язуються з поліпептидом 2-5 із спорідненістю при зв'язуванні (Ка), що становить 109М7 або більше, переважно 10/М або більше, а найбільш «о переважно -109М'! або більше. Спорідненість антитіла при зв'язуванні може легко визначити звичайний спеціаліст у даній галузі, використовуючи, наприклад, метод аналізу, запропонований Скетчардом (Зсаїснага). --

Для виявлення антитіл, що специфічно зв'язуються з протеїнами або пептидами 2ЕОБЕ-5, можна со використовувати різні процедури аналізу, відомі спеціалістам у даній галузі. Приклада таких методів докладно описані в праці (Апіїбодіев: А Іарогаїгу Мапиа!Ї, Нагіожх апа Іапе (Едв.), Соїй Зргіпд Нагброг Іарогагу й Ргезв, 1988). До типових прикладів таких процедур аналізу належать: узгоджений імуноелектрофорез, че радіоїмуноаналіз, радіоїмунопреципітація, твердофазний імуноферментннй аналіз (ЕЇІЗА), аналіз з використанням дот-блоттингу або вестфн-блоттингу, аналіз з гальмуванням зв'язування або конкурентним зв'язуванням, а також аналіз з використанням імуносендвічів. Крім того, антитіла можна поділяти за « спроможністю зв'язуватися з природними або мутантними протеїнами або пептидами 2-5.

Антитіла до поліпептиду 2ЕОБ-5 можна використовувати для мічення клітин, які забезпечують експресію - с поліпептиду 2ЕОБЕ-5, для спрямування іншого протеїну, невеликої молекули або хімічної сполуки в серцеву а тканину, для ізоляції поліпептиду 2ЕОБ-5 за допомогою афінного очищення, у процедурах, діагностичного "» аналізу для визначення рівнів циркуляції поліпептидів 2-5, для виявлення або визначення кількості розчинного поліпептиду 2ЕСБЕ-5 як індикатора основного патологічного відхилення або захворювання, у процедурах аналізу, в яких використовується клітинний фільтр із збудженням флуоресценції (РГАС5), для -і перевірки бібліотек експресії, для формування антитіл проти ідіотизму, а також як нейтралізуючі антитіла або сл як антагоністи для гальмування росту клітин, здійснюваного через посередництво поліпептиду 2-5, у живих організмах і поза живими організмами. До придатних безпосередніх міток або маркерів належать радіонукліди, (95) ферменти, субстрати, кофактори, інгібітори, флуоресцентні маркери, хемілюмінесцентні маркери, магнітні частки шу 20 і тому подібні засоби. У випадку непрямих маркерів або міток можуть використовуватися, як посередники, пари "біотин-авідин" або інші пари "комппемент-антикомгоіемент". Антитіла, що використовуються в цьому винаході, 4) можна безпосередньо або посередньо сполучати з лікарськими засобами, токсинами, радіонуклідами і тому подібними речовинами і використовувати одержані сполуки для діагностичного аналізу в живих організмах або як терапевтичні засоби.

Молекули згідно з цим винаходом можна використовувати для ідентифікації та ізоляції рецепторів, які справляють вплив на розвиток інфаркту міокарда. Наприклад, можливі імобігпзація протеїнів і пептидів, що о пропонуються згідно з цим винаходом, на колонці і пропускання препаратів, приготованих на мембранах, через іме) колонку (Ітторбіїїгей Айіпйу Гідапа Тесппідцев, Негтапзоп еї аї., едв., Асадетіс Ргезв, Зап Оіедо, СА, 1992, рр.195-202). Протеїни і пептиди можна також мітити, використовуючи мічення радіоізотопами |Меїйноаз іп 60 Еплутої., моЇ. 182, "Оціде (о Ргоївіп Ригіїсайоп", М. Оецівспег, ей., Асад. Ргез5, Зап Оіедо, СА, 1990, 721-737) або фотоафінне мічення |Вгиппег еї. аІ., Апп. Кем. Віоспет. 62:483-514, 1993; Редап еї аї., Віоснет.

Рпагтасої. 33:1167-1180, 19841, і ідентифікувати специфічні протеїни на поверхневих частинах клітин.

Антагоністи можуть бути корисними для гальмування активності молекул 2ЕОЕ-5, пов'язаної з ростом, у таких клітинах, як серцеві клітини, включаючи міоцити, фібробласти і ендотеліальні клітини, а також в остеобластах 65 і хондроцитах. Гени, що кодують зони зв'язування в поліпептиді 2ЕОЕ-5, можна одержати, аналізуючи бібліотеки невпорядкованих пептидів, які проявляються у фатах (фагове вираження) або в бактеріях, наприклад у кишковій паличці Е. соїї. Нукліотидні послідовності, що кодують поліпептиди, можна створювати за допомогою різних методів, наприклад за допомогою методів невпорядкованого мутагенезу і синтезу невпорядкованих полінукліотидів. Такі бібліотеки виражених невпорядкованих пептидів можна використовувати для виявлення поліпептидів, які взаємодіють з відомою мішенню, якою може бути протеїн або поліпептид, наприклад ліганд або рецептор, біологічна або синтетична макромолекула, органічна або неорганічна речовина. Методи, призначені для створення і аналізу таких бібліотек виражених невпорядкованих пептидів, відомі спеціалістам у даній галузі (адпег еї аі, О5 Раїепі Мо. 5,223,409; І адпег еї аі,, О5 Раїепі Мо. 4,946,778; І аапег еї а. 05

Раїепі Мо. 5,403,484; І адпег еї аі., 05 Раїепі Мо. 5,571,698), а бібліотеки виражених невпорядкованих /о пептидів і комплекти для аналізу таких бібліотек поставляються комерційними постачальниками, наприклад фірмами Сіопіесп (Раю Ай, СА), Іпмйгодеп, Іпс. (Зап Оіедо, СА), Мем/ Епдіапа Віоїіарв, Іпс. (Вемепу, МА),

РПпагтасіа КВ Віобгесппоіоду, Іпс. (Різсаїажау, МУ). Бібліотеки виражених невпорядкованих пептидів можна аналізувати, використовуючи послідовності поліпептиду 2ЕОБ-5, що розглядаються в цьому описі винаходу, для ідентифікації протеїнів, які зв'язуються з поліпептидом 2ЕОБЕ-5. Ці протеїни, що зв'язуються, які взаємодіють 75. 3 поліпептидами 2ЕОБЕ-5, можна використовувати для мічення клітин, для ізоляції гомологічних поліпептидів за допомогою афінного очищення, а також безпосередньо або посередньо сполучати з лікарськими засобами, токсинами, радіонуклідами і тому подібними речовинами. Згадані протеїни, що зв'язуються, можна використовувати в процедурах аналізу, призначених для аналізу бібліотек експресії і оцінки нейтралізуючої активності. Протеїни, що зв'язуються, можна також використовувати в процедурах діагностичного аналізу для 2о визначення рівнів циркуляції поліпептидів, для виявлення або кількісного аналізу розчинних поліпептидів як індикаторів основного патологічного відхилення або захворювання. Згадані протеїни, що зв'язуються, можуть діяти як антагоністи поліпептиду 2ЕОБЕ-5, блокуючи зв'язування з поліпептидом 2ЕОЕ-5 і передачу сигналів в умовах поза живими організмами і в живих організмах. Такі протеїни, що зв'язуються, які діють як антагоністи поліпептиду 2ЕОБЕ-5, виявляються корисними для гальмування експресії генів, яка спричиняє ріст або сч ов диференціювання клітин. Протеїни, що зв'язуються, які діють як антагоністи поліпептиду 2ЕОЕ-5, можна використовувати для лікування, наприклад для лікування рабдоміосаркоми, міксоми серця, раку кістки, який і) пов'язаний з остеобластами, а також карликовості, артриту, для заживання зв'язок і хрящів, як окремо, такі в поєднанні з іншими терапевтичними засобами.

Молекули згідно з цим винаходом можуть бути корисними для росту клітин серцевих тканин, наприклад «о зо міоцитів або міобластів, скелетних міоцитів або міобластів і клітин гладеньких м'язів, хондроцитів, ендотеліальних клітин, адіпоцитів і остеобластів, в умовах поза живими організмами. Наприклад, молекули - згідно з цим винаходом, корисні як компоненти певних середовищ для вирощування клітин і їх можна со використовувати окремо або в поєднанні з іншими цитокінами і гормонами для заміни сироватки, яка широко використовується при культивуванні клітин. Молекули згідно з цим винаходом особливо корисні дня специфічної о стимуляції росту і розвитку міоцитів у клітинних культурах і можуть також виявитися корисними при ї- дослідженнях гіперплазії і регенерації серцевих міоцитів.

Поліпептиди, нуклеїнові кислоти і антитіла, що пропонуються згідно з цим винаходом, можна використовувати при лікуванні порушень, пов'язаних з інфарктом міокарда, застійною серцевою недостатністю, гіпертрофічною кардіоміопатією і розширеною кардіоміопатією. Молекули згідно з цим винаходом можуть також « виявитися корисними для обмеження розмірів інфаркту після серцевого приступу, для стимуляції розвитку з с кровоносних судин і заживання ран після пластичних операцій на судинах або після ендартеректомії, для

Й поліпшення коронарного колатерального кровообігу, для реваскуляризації в очних тканинах, для лікування а ускладнень, пов'язаних з недостатньою циркуляцією крові, наприклад при діабетичних виразках на ногах, для усунення наслідків приступу після коронарної реперфузії з використанням фармакологічних засобів, а також в інших випадках, в яких розвиток кровоносних судин забезпечує певні переваги. Молекули згідно з цим -І винаходом можуть виявитися корисними для поліпшення серцевої діяльності, збуджуючи регенерацію або гіперплазію міоцитів, колатеральне формування коронарних судин або реконструкцію некротичних ділянок о міокарда. Іншими прикладами терапевтичного використання цього винаходу є стимуляція регенерації або 2) гіперплазії скелетних м'язів, регенерація нирок і лікування системної і легеневої гіпертензій.

Розвиток колатеральних серцевих судин, стимульований поліпептидом 2ЕСБ-5, оцінюють у кроликів, собак - або свиней, використовуючи для цього моделі хронічної оклюзії коронарної артерії (І апааи еї аї!., Атег. Неагі

Ф У. 29:924-931, 1995; ЗеїїКе еї аїЇ., Зигдегу 120(2): 182-188, 1996; І агагоиз еї аї., Сігсцайоп 94:1074-1082, 1996). Переваги поліпептиду 2ЕОБ-5 при лікуванні приступів у пацюків оцінюють, у живих організмах, використовуючи білатеральну оклюзію сонної артерії і оцінюючи гістологічні зміни, а також функціонування лабіринту |Саде еї аї., Меийгобіої. Адіпуд 9:645-655, 1988). Ефективність поліпептиду 2ЕОБЕ-5 при лікуванні гіпертензії оцінюють, у живих організмах, використовуючи, у випадку аналізу системної гіпертензії, пацюків із

Ф) спонтанною гіпертензією (ЗНЕ) |Магене еї а/!., Сііп. Ехр. Рпаптасої. Рпузіої. З,иррі. І. 5І 14-116, 1995). ка Молекули згідно з цим винаходом можна використовувати для контролю проходження введених препаратів або лікарських засобів до серця. Наприклад, молекули згідно з цим винаходом можуть виявитися корисними для во обмеження дії лікарських засобів на серце завдяки експресії, специфічної для тканин, яку спрямовує промотор поліпептиду 2ЕОБЕ-5. Наприклад, специфічну для серцевих тканин експресію можна забезпечити, використовуючи дисцистронний комплекс, що складається з аденовірусу і поліпептиду 2ЕОЕ-5 |Коїптапнп еї аї.,

Сепе Тпегару 3:919-926, 19961). Крім того, поліпептиди 2ЕОБ-5 можна використовувати для обмеження проходження інших препаратів або лікарських засобів до серця, сполучаючи поліпептиди 2-5 з іншим 65 протеїном (Егап: еї аї., Сігс Кев. 73:629-638, 1993) таким чином, що перша молекула, яка містить поліпептид, що є гомологом поліпептиду 2-5, сполучається з другою молекулою препарату або лікарського засобу,

внаслідок чого утворюється химерна сполука. Протеїни, наприклад антитіла, можна використовувати для формування химерних сполук з молекулами поліпептиду 2ЕОЕ-5, створеними згідно з цим винаходом |Мапіїа еї аІ.,, У. Мисі. Сага! 2:26-34, 1995) Як приклади компонентів препаратів або лікарських засобів, можна назвати, без будь-якого обмеження, біологічно активні поліпептиди, гени, токсини, радіонукліди, фармацевтичні засоби з невеликими молекулами | тому подібні компоненти. Сполучення може бути прямим або непрямим (наприклад у випадку ліпосом) і може здійснюватися за допомогою засобів рекомбінації, хімічних зв'язків, сильної нековалентної взаємодії і тому подібних засобів.

Згідно з одним із варіантів реалізації цього винаходу, препарат, що містить протеїн 2-5, 7/0 Використовується як терапевтичний засіб для підвищення інтенсивності процесу формування кісток через посередництво остеобластів. Препарати і методи використання препаратів згідно з цим винаходом можна використовувати як засоби для стимуляції заживання кісток після пошкоджень і усунення дефектів кісток, наприклад пошкоджень при закритих, відкритих і несуглобних переломах кісток, для стимуляції заживання кісток після операцій пластичної хірургії, для стимуляції вростання кісток у нецементні протезні з'єднання і зубні імплантати, для лікування періодонтальних захворювань і усунення періодонтальних дефектів, для поліпшення процесу формування кісток при дистракційному остеогенезі, а також для лікування інших захворювань, пов'язаних з скелетною системою, лікування яких можливе за допомогою стимуляції активності остеобластів, наприклад для лікування остеопорозу і артриту. Процес формування нового кісткового матеріалу, який забезпечують методи, що пропонуються згідно з цим винаходом, може бути використаний для усунення 2о наслідків природжених, травматичних або онкологічних резекцій кісток, або для лікування кісток після остеонекрозу, спричиненого дією радіації ІНагі еї аЇ,, Сапсег 37:2580-2585, 1976). Методи згідно з цим винаходом можна також використовувати в пластичній хірургії. Якщо протеїни згідно з цим винаходом призначені для фармацевтичного використання, то фармацевтичні засоби мають склад, який забезпечує парентеральне, зокрема внутрішньовенне або підшкірне, введення протеїнів за допомогою звичайних методів. Внутрішньовенне сч ов введення можна здійснювати за допомогою ін'єкції або вливання ударної дози фармацевтичного засобу на період часу від однієї до кількох годин. Взагалі, фармацевтичні засоби містять протеїн 2-5 разом з і) фармацевтично прийнятним носієм, наприклад саліном, буферованим саліном, розчином 595 декстрози у воді або іншим подібним носієм. Фармацевтичні засоби можуть також містити один або декілька наповнювачів, консервантів, розчинників, буферних агентів, альбумін для відвернення втрати протеїну на стінках ампул і тому Ге зо подібні засоби. Методи технології приготування фармацевтичних засобів достатньо відомі спеціалістам у даній галузі і описані, наприклад, у праці (Кетіпдіоп'є Рнпагтасеціїса! Зсіепсез, Сеппаго, ед., Маск Рибіїзпіпу Со., (7

Еазіоп, РА, 1990), яка включена в цей опис винаходу за допомогою посилання. Як правило, використовують с терапевтичні дози в діапазоні від О,1мкг до 1О0Омкг на їкг маси пацієнта на добу, а переважно - від О,5мкг/кг до 20Омкг/кг на добу, причому точну дозу визначає лікар відповідно до прийнятих стандартних процедур о лікування, враховуючи стан пацієнта, історію хвороби та іншу подібну інформацію. Кваліфікація звичайного ї- спеціаліста в даній галузі цілком достатня для визначення дози. Протеїни можна призначати для невідкладного лікування, часто протягом періоду від одного до трьох днів, або використовувати для лікування хронічних захворювань протягом декількох місяців або років. Взагалі, терапевтично ефективна кількість поліпептиду 2ЕСЕ-5 являє собою таку кількість, яка достатня для досягнення клінічно значущих змін щодо росту міоцитів, « берцевої діяльності, формування кісток або для збільшення кількості специфічних клітин, зв'язаних з з с мезенхимними початковими клітинами і клітинами-попередниками для міоцитів, остеобластів і хондроцитів.

Зокрема, клінічно значуще збільшення кількості міоцитів або клітин-попередників міоцитів можна визначати, ;» вимірюючи об'єм фракції у викиді крові з лівого шлуночка серця до введення і після введення молекул поліпептиду 2ЕСБЕ-5, і, таким чином, оцінювати, що рівень такого збільшення становить принаймні 595, а переважно 1096 або більше, від загального об'єму фракції. Методи аналізу, призначені для визначення об'єму -І фракції при викиді крові за одне скорочення серця, достатньо відомі навіть звичайним спеціалістам у даній галузі

Нижче наведені приклади, не пов'язані з будь-якими обмеженнями, які докладніше ілюструють винахід, що о пропонується. 2) Приклади

Приклад 1. Розширення послідовності з набору Е5Т - За результатами аналізу бази даних для трансльованих ДНК, здійснюваного з метою пошуку ростових

Ф факторів, була виявлена послідовність з набору послідовностей, що являють собою продукти експресії генів (Е5Т), яка, за результатами прогнозування, являє собою нову послідовність, що належить до групи ростових факторів фібробластів, і цю послідовність позначили як 2ЕОБ-5. 5Б Олігонукліотидні праймери 2С11,676 (послідовність ЗЕО ІЮО МО: 3) ії 2С11,677 (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 4) були сформовані з послідовності, яка належить до набору послідовностей, що являють собою продукти експресії

Ф) генів (ЕТ). Ці праймери були використані для ініціації біосинтезу нуклеїнових кислот, у межах набору Е5Т, ка після здійснення ланцюгової полімеразної реакції (РСК), з використанням комплементарної ДНК МАКАТНОМ

КЕАОУ (Сіопіесі, Раїо А, СА), одержаної з тканини дорослого організму, яка використовувалась як матриця в бо процесі ланцюгової полімеразної реакції.

Умови для ланцюгової полімеразної реакції були такими: 1 цикл при температурі 942С протягом 90 секунд, 35 циклів при 942С протягом 15 секунд і при 682С протягом 1 хвилини, потім 1 цикл протягом 10 хвилин при 722С і період інкубації при 4С. Ланцюгова полімеразна реакція забезпечила рекреацію 160 пар гетероциклічних основ послідовності з набору Е5Т і підтвердила, що послідовність з набору Е5Т вибрана правильно. 65 До інших бібліотек послідовностей, розмноження яких можливе за допомогою олігонуклюїидних праймерів, належать бібліотеки послідовностей для скелетних м'язів, легень, шлунку, тонкої кишки і щитовидної залози.

Приклад 2. Поширення в тканинах

Аналіз за допомогою нозерн-блотгангу був проведений при використанні набору багатоелементних відбитків тканин людини (Нитап Мийіріе Тіззце Віоїв), що поставляється фірмою Сіопіесі (Раїо АЮ, СА). Фрагмент ДНК довжиною 160 пар гетероциклічних основ, описаний в прикладі 1, піддавали електрофорезу в гелі з 195 агарози, потім фрагмент електроелюювали і мітили радіоактивним ізотопом, використовуючи систему МЕОАРКІМЕ ОМА (Атегапйат, Агіпдіоп Неїднізх, І), призначену для мічення при невпорядкованій ініціації біосинтезу нуклеїнових кислот на праймері, відповідно до технічних умов виготовлювача. Пробу очищали, використовуючи всувну колонку МОСТКАР (5ігаїадепе Сіопіпд Зузіетв, І а доПа, СА). Розчин ЕХРКЕБЗЗНУВ (Сіопіесй, Раїо А, 7/0 СА) використовували як розчин для попередньої гібридизації і як розчин для гідризації в процесі нозерн-блоттингу. Гібридизацію здійснювали ввечері, при температурі 682С, потім відбитки промивали спочатку в розчині 2Х хлориду і цитрату натрію (5С) і 0,0596 додецилсульфату натрію (505) при температурі реакції, а потім у розчині 01Х ЗБС і 0,195 505 при температурі 502С. Одну смугу спектра можна було спостерігати приблизно при довжині 2,0 тисяч пар нуклгіотидів. Інтенсивність сигналу була найбільшою для серця дорослого 75 організму, а сигнали з відносно меншою інтенсивністю характерні дам скелетних м'язів і шлунку.

Приклад 3. Аналіз поліпептиду 2ЕОЕ-5 в умовах поза живими організмами

А.

Мітогенну активність поліпептиду 2-5 аналізують, використовуючи групи клітин і клітини, одержані з первинної культури. Кондиційоване середовище, що складається з клітин, які забезпечують експресію 20 рекомбінантного і очищеного протеїну, додають до культур, яким відповідають такі клітини: фібробласт МІН ЗТЗ

ІАТСС Мо. СКІ -1658), серцеві клітини СНН-1 кети (АТСС Мо. СКІ -1680), серцеві міобласти НОс2 пацюка ((АТСС

Мо. СКІ-1446), ракові клітини Зпіоподі молочних залоз ссавців |ГапаКа еї аїЇ.,, Ргос. Май. Асай. збі. 89:8928-8932, 19921 і клітини І МСар.гОО аденокарциноми. До свіжих: ізольованих клітин, придатних для аналізу активності поліпептиду 2-5 як стимулятора росту, належать: серцеві фібробласти, серцеві міоцити, скелетні Га 2; Мміоцити і ендотеліальні клітини пупкової вени людини. о

Мітогенну активність оцінюють, вимірюючи рівень включення ЗН-тимідину за допомогою методу, запропонованого авторами праці (Каїпезз апа Козв, Ме. Епгутоіоду 109:749-773, 1985). Суть цього методу полягає в тому, що використовують клітини в стані спокою, які являють собою клітини, висіяні на планшети для клітинних культур, з густиною Зх107 клітин на їмл, у відповідному середовищі. Як типове середовище для іс), 30 вирощування клітин використовують середовище Ігла, модифіковане за способом Дульбеко (БІВСО-ВКІ, «-

Сайнпегзриго, МО), яке містить 10956 сироватки ембріона теляти (ЕС5). Клітини культивують на планшетах, що містять по 96 ямок, і дозволяють клітинам рости протягом 3-4 діб. Потім середовище для вирощування о видаляють і додають на кожну ямку по 180мкл суміші ОЕРС (див. табл. 5), яка містить 0,195 сироватки ембріона ю теляти (ЕС5). Половину ямок заповнюють поліпептидом 2ЕОЕ-5, а другу половину ямок, без поліпептиду 2-5, 35 використовують для негативного контролю. Потім забезпечують інкубацію клітин протягом З діб, при температурі ї- 372С, у присутності 595 СО», і середовище видаляють. На кожну ямку додають по 100мкл суміші ОЕС (див. табл. 5), яка містить 0,195 сироватки ембріона теляти (ЕС5) і ЗН-тимідин з радіоактивністю 2 мікрокюрі на мл, після чого забезпечують додаткову інкубацію планшетів протягом 1-24 годин при температурі 37 «С, середовище « відсмоктують і на кожну ямку додають по 150мкл трипсину. Потім забезпечують інкубацію планшетів, при З7З температурі 372С, до відокремлення клітин (протягом принаймні 10 хвилин). Відокремлені клітини збирають і с переносять на фільтри, використовуючи засіб для збирання клітин І КВ У/аПас 1295-001 (І КВ У/аІас, Рпагтасіа, :з» Сайнегериго, МО). Фільтри висушують у мікрохвильовій печі, протягом 10 хвилин, потім вимірюють інтенсивність сигналів за допомогою сцинтиляційного лічильника Веїйаріаїе 1250 (ІК УМайас), згідно з інструкцією постачальника лічильника. в. сл о -5 и щі

Ф) кю Б.

Серця були ізольовані в новонароджених мишей віком від одного дня, а потім оброблені за допомогою декількох циклів реакції з колагеназою згідно з процедурою, описаною в праці ІВгапа еї аї, 9. Віої. Спет. 60 268:11500-11503, 1993). Окремі міоцити були ізольовані за показником перевищення градієнта Перколя (Регосої)), після чого 2мл клітин висівали на чашки для тканинних культур, по б ямок, з густиною 0,5 х109 клітин на мл.

Через З доби ямки промивали три рази, використовуючи фізіологічний розчин з фосфатним буфером (РВ5) без домішки кальцію або магнію, і знову заповнювали середовищем, вільним від сироватки, об'ємом мл (табл.б). 65 Потім ямки засівали частками протеїну ДАСММ-2ЕСБ-5, по 107! часток на кожну ямку, або частками протеїну

АаЙсмм-СЕР (зелений флуоресцентний протеїн) в контрольних ямках, і забезпечували інкубацію при температурі

372С протягом 8 годин. Після цього ямки знову промивали три рази, використовуючи фізіологічний розчин з фосфатним буфером (РВ5) без домішки кальцію або магнію, і знову заповнювали середовищем, вільним від сироватки, об'ємом 2мл.

Протягом 48 годин після засівання протеїном ДЯАСММ-2ЕОЕ-5 пульсації культивованих міоцитів припинились і були виявлені морфологічні зміни цих міоцитів, тоді як в ямках, заповнених протеїном АЯаСММ-СЕР, довільні пульсації продовжувалися, а морфологічні зміни після засівання протеїном АЯСММ-СЕР були відсутніми. В ямках з внесеним протеїном АасСмММ-21ЕОБЕ-5 через 48 годин був також виявлений суцільний шар життєздатних, неклейких клітин, при збереженні злиття шарів клейких міоцитів, що свідчить про активність протеїну 7/0 Масму-2гоБ-5 щодо росту культивованих міоцитів мишей і пацюків.

Середовище гла, модифіковане за способом Дульбеюо (ОМЕМІ С живильна суміш Нат 12 (віро ВНІ) відношення обєму суміші до обєму середовища ОМЕМ Я я с

В. о

Поліпептид 2ЕОБ-5, злигай з протеїном МВР (протеїн, що зв'язує мальтозу), як описано в прикладі 9А, і очищений так, як описано в прикладі 10, додавали до міоцитів (приклад ЗБ) при концентрації О,Тнг/мл. Як було показано, злитий протеїн МВР-2ЕОСЕ-5 також стимулює ріст міоцитів.

Приклад 4. Аналіз активності поліпептиду 2ЕОЕ-5 в умовах поза живими організмами (Те)

Серцевий мітогенез оцінюють у живих організмах, видаляючи повністю серця в новонароджених або 8-тижневих мишей або пацюків. Видалене серце поміщають у середовище ЧокіїкК (Зідта, 5. І оціз, МО) або -- середовище ЮОцірессо при температурі 372С, 595 СО», на період 4-24 години. Протягом періоду інкубації со додають поліпептид 2-5 при концентрації в діапазоні від пг/мл до 100мкг/мл. Для негативного контролю використовують тільки буферний розчин. Потім додають ЗН-тимідин і забезпечують інкубацію зразків протягом ю 1-4 годин, після чого роблять зрізи серця і оцінюють мітогенез за допомогою авторадіографії. Зрізи серця - використовують для гістоморфометрії з метою визначення об'ємів ядер і цитоплазми (|Мсі ацдйійп, Ат. ..

РНузіої. 271:К122-К129, 19961).

Згідно з альтернативним методом, забезпечували ліофілізацію серця, після чого повторно створювали « суспензію в іїмл 0,1М МаоОН. Для осаджування ДНК використовували трихлороцтову кислоту (ТСА) з концентрацією 1095, при температурі 09С. Для оцінки включення неспецифічного ЗН-тимідину додавали о) с надосадову рідину до Умл сцинтиляційної рідини. Для того, щоб оцінити включення ЗН-тимідину, специфічне до з» ДНК, повторно створювали суспензію одержаного осаду в 1мл стабілізатора тканин ВТ5-450 (ВесКтап, ЕшПегіоп,

СА), потім додавали суспензію до 9мл сцинтиляційної рідини.

Лівий і правий шлуночки серця ізолювали з серця, видаленого в одноденної миші СО-1 (Часкгоп І абз, Ваг Нарок, МЕ), і забезпечували інкубацію протягом 4 годин, у присутності Знг/мл матеріалу 2ЕОБ5-Нер2 (п-13; ї див. приклад 10) або контрольного матеріалу (п-10). Потім додавали ЗН-тимідин протягом однієї години. с Шлуночки промивали декілька разів, потім гомогенізували в їмл середовища оКіїК. Одержаний гомогенат сю додавали до Омл сцинтиляційної суміші і аналізували для визначення сумарного споживання /ЗН-тимідину і рівня включення в ДНК. - Матеріал 2ЕСЕ5-Нер2 підвищував споживання ЗН-тимідину і рівень включення в ДНК у 2,068 0,489 разів

Ф порівняно з контрольним матеріалом, що свідчить про мітогенність поліпептиду 2ЕОБЕ-5 щодо серцевих клітин.

Приклад 5. Аналіз активності поліпептиду 2-5 у живих організмах

Вплив поліпептиду 2ЕОБЕ-5 на ріст клітин оцінюють, у живих організмах, використовуючи двотижневих дв Новонароджених мишей або двохмісячних дорослих пацюків. Пацюкам роблять одноразові ін'єкції в серце або ін'єкції протягом тривалого часу. іФ) А. ка Новонародженим пацюкам вводять поліпептид 2ЕОБ-5 протягом 1-14 днів, дозами в діапазоні від 5Онг до 10Омкг на добу. Після введення поліпептиду 2ЕОБ-5 оцінюють вплив цього поліпептиду, використовуючи для бо порівняння тварин, яким тільки імітували введення, для чого оцінюють збільшення маси серця, поліпшення діяльності лівого шлуночка серця в живих організмах і в умовах поза живими організмами, а також збільшення відношення об'ємів ядерної і цитозольної серцевих фракцій, яке визначають за допомогою гістоморфометрії.

Б.

Пацюки з кардіоміопатією, спричиненою довгостроковим введенням катехоламіну або перев'язуванням б5 серцевих судин, або з кардюміопатією, характерною для сирійського хом'ячка (Зоїе еї аі., Атег. У. Сагаїої. 62(1):200-240, 1988), також використовуються для оцінки впливу поліпептиду 2ЕОБЕ-5 на діяльність серця і серцеві тканини.

Для збудження кардіоміопатії за допомогою катехоламіну, пацюкам віком 7-8 тижнів постійно вводять епінефрин протягом двох тижнів, використовуючи для цього осмотичні мініатюрні шприці, підшкірно імплантовані між плечовими пластинками тварин. Введення епінефрину спричиняє збільшення показника фібротичного ураження лівого шлуночка серця в межах від 0,005 -0,005 до 2,11--0,18 (шкала 0-3), збільшення ширини клітин міоцитів лівого шлуночка в межах від 17,36-0,4бмкм до 23,05-0,62мкм, а також незначну скорочувальну реакцію папілярного м'яза лівого шлуночка на дію ізопроторенолу (зусилля натягу 0,2г порівняно з зусиллям 1,1г у пацюків, яким вводили салін). Через двотижневий період введення епінефрину пацюкам щоденно вводять, 70 внутрішньоперикардіально, кожний з препаратів 2-5, БЕСБЕ, ІСЕ-Ї або ІСЕ-ІЇ протягом періоду до 14 днів.

Потім пацюків умертвляють і виконують процедури гістоморфометрії і гістоцитохімічного аналізу.

Стан пацюків, яким робили вищезгадані процедури, оцінюють також наприкінці періоду введення катехоламіну, а потім знову після введення ростових факторів, причому відновлення серцевої діяльності визначають за показниками, що характеризують зменшення фібротичного ураження лівого шлуночка серця, 75 Збільшення ширини клітин міоцитів лівого шлуночка серця і посилення скорочувальної реакції папілярного м'яза лівого шлуночка на дію ізопроторенолу.

Приклад 6. Приєднання поліпептиду 2ЕОБЕ-5 до хромосоми

Поліпептид 2-5 був приєднаний до хромосоми 5 за допомогою набору СспеВгідде 4 Кадіанйоп Нубгіа

Рапеї, який розроблений Інститутом Уайтхеда (У/піепеад) і Центром досліджень геному при Масачусетському го технологічному інституті і комерційно поставляється (Кезеагсп Сепеїйїсв, Іпс., НипізуШе, А). Набір

СепеВгідде 4 Кадіаноп Нубргій Рапе! містить ДНК, придатні для використання при ланцюгових полімеразних реакціях, вибрані з кожного з 93 радіоактивних гібридних клонів, а також дві контрольні ДНК (донорна ДНК НЕЇ. і реципієнт А23). Доступна для широкого використання обслуговуюча програма УЛ (пер/лмлим-депоте мі. тії еди/сді-рБіп/сопіїд/гптаррег.рі) забезпечує можливість приєднання до хромосом при Га об використанні карти радіаційних гібридів для геному людини, розробленої Інститутом Уайтхеда і Центром досліджень геному при Масачусетському технологічному інституті (карта радіаційних гібридів УМІСОК), яка була і) створена за допомогою набору СепевВгідде 4 Кадіайоп НуБбгіа Рапеї!.

Для приєднання поліпептиду 2ЕОЕ-5 за допомогою набору СепевВ'гідде 4 Кадіайоп Нубгіа Рапеї, реагенти, по 25мкл, наносили на титраційний мікроплашпет з 96 ямками (Зігаїадепе, Іа доМПа, СА) і використовували для Ге) ланцюгової полімеразної реакції в апараті для циклічних термальних реакцій КороСусіег Сгадіепі 96 (Зігаїадепе). Кожний з 96 реагентів для ланцюгової полімеразної реакції містить 2,5мкл суміші ОХ Адмапіаде --

КіепТтад Роїутегазе Міх (Сіопіесі), 2мкл суміші дезоксинукліозидтрифосфатів (аМТР) (з концентрацією 2,5ММ со кожного компонента суміші; Регкіп-ЕІтег, Ровіег Сйу, СА), 1,25мкл праймера 2С11,677 для сприйнятливості (послідовність ЗЕО ІЮ МО. 4), 1,25мкп праймера 2С12,053 проти сприйнятливості (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 5), юю 2,омМКкл суміші КеаіїЇ ода (гезеагс! Сепеїйісв, Іпс.), О,бмкл суміші Адмапіаде КіепТад Роїутегазе Міх (Сіопіесй зч-

Іарогайогіев, Іпс.), 25нг ДНК з окремого гібридного клону або контрольної ДНК, а також розчин данг0 в об'ємі, необхідному для досягнення сумарного об'єму 25мкл. Реагенти були покриті однаковою кількістю мінерального масла і герметизовані. Умови для ланцюгової полімеразної реакції а апараті для циклічних реакцій були такими: « один початковий цикл протягом 4 хвилин при температурі 942С, потім відпал протягом 1,5 хвилини при 662С, розширення реакції протягом 1,5 хвилини при 72 2С і остаточно - цикл розширення реакції протягом 7 хвилин - с при 7220. Для розділення продуктів реакції використовували електрофорез в агарозному гелі З9о Мизіеме СТО ч (РМС Віоргодисів, КосКіапа, МЕ). » Результати показали, що поліпептид 2ЕСБЕ-5 приєднується до хромосоми 541,12 ск у верхній частині зв'язувальної групи хромосоми 5 людини відповідно до карти радіаційних гібридів УЛОСК. Щодо центромери, то її найближчим до місця приєднання маркером був маркер УУІ-16922, а найдальшим від місця приєднання - маркером - маркер УМІ-14692. Використання оточуючих маркерів згідно з картою СНІС допомагає також с розташовувати поліпептид 2ЕОБЕ-5 у секції 5434-4835 варіанта мв8с7 хромосоми 5 людини згідно з картою СНІ С включених маркерів (Об'єднаний центр дослідження геномних зв'язків людини; обслуговуюча програма УУМЛМУ: о (пЕр://Ммлалми.спіс.ого/СПісІпіедгаїеаМарз. пі ті). -оУу 70 Приклад 7. Вплив поліпептиду 2ЕОЕ-5 на кістки А.

Аденовірусний вектор, що містить комплементарну ДНК для поліпептиду 2-5, був створений за

І) допомогою методів, описаних у праці (ВесКег еї аіЇ., Ме(йодз іп Сеї/! Віоїоду 43:161-189, 1994). Суть цих методів полягає в тому, що комплементарну ДНК для поліпептиду 2-5 (як показано в послідовності БЕО ІЮ

МО: І) клонують як фрагмент Хва І-5аІ | вектора РАССММ |СіІйг2тап еї аї., п Еисагуоіїс Міга! Месіогв, СІ2тап 22 (едз.), рр.187-192, Соїй Зргіпд Нагрог Ргезв, Соїд бргіпд Нагрог МУ, 1982). Вектор рАССММ містить частину

Ге! геному аденовірусу 5, промотор СММ і послідовність термінатора 5М40. Потім забезпечували сумісну трансфекцію плазміди, що містить вектор і ДНК-вставку, з плазмідою, що містить геном аденовірусу 5, де позначеною як р.ОМ17 |МсОгогу еї аї., Мігоюду 163:614-617, 1988)|, у 293 клітинах (АТСС Мо. СКІ-1573;

Американська колекція типових культур, КоскміШе, МО), завдяки чому створювалися умови для рекомбінації і 60 формування рекомбінантного аденовірусу, що містить поліпептид 2ЕОБЕ-5, позначеного як АЯАСММ-2ЕОЕ5.

Присутність комплементарної ДНК для поліпептиду 2ЕОБЕ-5 була підтверджена ланцюговою полімеразною реакцією.

Аденовірусний вектор ААЯСММ-2ЕОЕ5 був використаний для передачі гена, в живому організмі, при введенні мишам, за допомогою внутрішньовенної ін'єкції, доз у діапазоні від 1х1071 до 5Х1011 часток на одну мишу. Було бо показано, що після внутрішньовенної ін'єкції більша частина вірусу досягає печінки і забезпечує дуже ефективну трансдукцію печінкових клітин (Негл еї аї., Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 90:2812-2816, 1993). Було продемонстровано, що клітини виробляють протеїн, кодований комплементарною ДНК, і у випадку секретованих протеїнів виділяють ці протеїни в контур циркуляції. Були продемонстровані високі рівні експресії і фізіологічної дії (Опжадаєї аї., Віоод 88:768-774, 1996; Біемепзоп еї аї., Апегіозсіеговіз, Тпготровів апа

Мазсціаг Віоосду 15:479-484, 1995; Зейфдиспі еї аї., Віоо4 84:2946-2953, 1994; ЗаКкатою еї аїЇ., Ргос. Май.

Асаай. Зсі. ОБА 91:12368-12372, 1994).

Шеститижневим мишам СО-1 (Часквоп Іарз, Ваг Нагрог, МЕ) вводили аденовірус без ДНК-вставки (дасмм-пиї!) або аденовірус дасмм-2ЕОЕ5 внутрішньовенно, через хвостову вену, або 70 внутрішньоперикардіально. Сумарна кількість вірусних часток становила Бх10!1! або 100мкл на одну мишу.

Через 14 днів після ін'єкції мишей умертвляли, видаляли великогомілкові і стегнові кістки для того, щоб визначити можливу запальну реакцію. Кістки поміщали в 10-відсотковий нейтральний розчин формаліну і піддавали обробці. З кісток видаляли кальцій за допомогою суміші 5-відсоткової мурашиної кислоти і 10-відсоткового цитрату натрію, потім кістки промивали водою, збезводнювали у середовищі 75 70-100-відсоткового етанолу, очищали в ксилолі і покривали парафіном. Зразки розрізали, у поздовжньому напрямі, у місцях метафізів великогомілкової і стегнової кісток і мітили гемотоксиліном і еозином для ідентифікації кісткових клітин. Остеобласти виявляли за показниками центральної зони негативного контролю

Соіїді і показниками ексцентричності ядер, а остеокласт - за показниками багатоядерності, неоднорідної форми і за наявністю лакун Ном/сПір, зв'язаних, із згаданими клітинами, що забезпечують поглинання.

Для цілей гістоморфометрії кісток були вибрані зразки стегнової кістки. Об'єм губчастої речовини кістки не визначали у зв'язку з тим, що місця взяття проб були різними (наприклад, зразки стегнової кістки не були розрізані точно в одній площині). Щодо гістоморфометричних змін оцінювали три параметри кістки. 1. Кількість ендостеальних остеобластів. Цей параметр визначали вздовж ендостеальної поверхні губчастої речовини кістки, при збільшенні в 180 разів, у зоні розміром 1,22мм, розташованій ближче до ростової оболонки су

Кістки. 2. Кількість ендостеальних остеокластів. Цей параметр визначали вздовж ендостеальної поверхні губчастої і9) речовини кістки, при збільшенні в 180 разів, у зоні розміром 1,22мм, розташованій ближче до ростової оболонки кістки. 3. Ширина ростової оболонки кістки. Цей параметр визначали через кожні 72мкм, при збільшенні в 90 разів, «о по всій ростовій оболонці, за винятком периферійних кінцевих частин, для оцінки активності ростової оболонки кістки. -

Аналіз даних (середнє значення - середньоквадратичне відхилення, п-4-7 на 1 групу) показав такі со результати. 1. Як видно, відсутні помітні ознаки запалювальної реакції в суглобі між великогомілковою і стегновою о

Ккістками. че 2. Як показали результати перевірки через 2 тижні, у мишей аденовірусний вектор ААЯСММ-2ЕОЕ5, введений внутрішньовенно або внутрішньоперикардіяльно, значно підвищує остеогенну активність у зоні віддаленого метафізу стегнової кістки. Стимуляцію остеогенної активності підтверджують такі показники: « а) значне збільшення кількості ендостеальних остеобластів у губчастій речовині віддаленої стегнової кістки після внутрішньовенного або внутрішньоперикардіального введення аденовірусу ДасмМмМ-2ЕОЕ5 у - с кількості яка становить, відповідно 53095 (при внутрішньовенному введенні) і 26395 (при ц внутрішньоперикардіальному введенні) від кількості контрольного вектора, порівняно з кістками при введенні "» тільки відповідного контрольного вектора; б) помітне збільшення об'єму остеогенних тканин на поверхнях кісток, яке дозволяє зробити висновок про підвищення рівня диференціації стромальних клітин кліткового мозку в напрямі формування остеобластів. - І З. Відсутній суттєвий вплив аденовірусного вектора АдасммМ-2ЕОЕ5, при внутрішньовенному або с внутрішньоперикардіальному введенні, на кількість ендостеальних остеобластів порівняно з впливом, який справляють тільки відповідні контрольні вектори при внутрішньовенному або внутрішньоперикардіальному (9) введенні. шу 20 4. Ширина ростової оболонки кістки значно зменшується при внутрішньовенному, але не при внутрішньоперикардіальному, введенні аденовірусного вектора АЯСММ-2ЕОЕ5, що дозволяє зробити висновок 4) про зниження активності ростової оболонки кістки після внутрішньовенного введення. Вплив способу введення аденовірусного вектора ЛЯСММ-2ЕСЕ5 на диференціацію клітин не оцінювали.

Вгаценаведені результати показують, що поліпептид 2-5 є ефективним иітогеном для стимуляції росту остеобластів і що поліпептид 2ЕОЕ-5 може збуджувати формування нових кісток.

Б.

ІФ) Використовуючи по суті такі ж процедури, як і описані в прикладі 7 А, був проведений кількісний аналіз ко мишей-самок СО-1 (Часквоп І арв), яким вводили 1 х10!! часток аденовірусу АЯДСММ-2ЕСЕ5 на одну мишу.

Мишей умертвляли через 30 днів після ін'єкцій і було визначено, що відношення довжини серця до довжини 60 великогомілкової кості в мишей збільшилось порівняно з контрольними тваринами, яким вводили аденовірус без

ДНК або салін. Відсутні відмінності між групами залежно від довжини великогомілкової кості, а також відмінності серед груп залежно від маси будь-яких інших органів. Таким чином, одержані результати кількісного аналізу показують, що поліпептид 2-5 вибірно збільшує сумарну густину, густину губчастої речовини і товщину ростової оболонки стегнової кістки. 65 Приклад 8. Вплив поліпептиду 2ЕОГЕ-5 на серце

Як описано в прикладі 7Б, мишам СО-1 вводили, внутрішньовенно, по одній дозі аденовірусу ААСММ-2ЕОЕ5,

потім мишей умертвляли через чотири тижні. Було визначено, що відношення довжини серця до довжини великогомілкової кості в мишей збільшилось порівняно з мишами, яким вводили аденовірус без ДНК або салін.

Результати показали відсутність відмінностей між групами залежно від довжини великогомілкової кості, які б

Могли бути пов'язані із згаданою зміною, а також відмінностей серед груп залежно від маси будь-яких інших органів. Таким чином, одержані результати якісного аналізу показують, що поліпептид 2-5, при внутрішньовенному введенні у вигляді аденовірусного комплексу, вибірно стимулює ріст серця.

Приклад 9. Експресія поліпептиду 2ЕОБ-5

А. Формування плазмід, що кодують поліпептид 2ЕОБ-5 70 Експресія поліпептиду 2ЕОБ-5, який є гомологом ростових факторів фібробластів, була здійснена в кишковій паличці Е. соїї за допомогою сполучної системи, створеної на основі протеїну МВР (протеїн що зв'язує мальтозу), яка поставляється фірмою Мем Епдіапа Віоїарз (МЕВ, Вемепу, МА). У цій системі комплементарна

ДНК для поліпептиду 2ЕОБЕ-5 приєднується до 3-кінця гена таіЕ, створюючи злитий протеїн МВР-2ЕСЕ5.

Експресія злитого протеїну починається з кінцевого промотора і тільки після ініціації промотора за допомогою /5 додавання 1мМ ізопропіл-р-тіогалактозилпіранозиду (РТ). Були створені три варіанти комплексу згаданого злитого протеїну, які відрізняються між собою тільки зоною розщеплення для виділення поліпептиду 2-5 з протеїну МВР. Перший комплекс містить зону розщеплення тромбіном, розташовану між зонами протеїну МВР і поліпептиду 2-5. Другий комплекс містить зону розщеплення фактором Ха, замість зони розщеплення тромбіном. Третій комплекс містить зону розщеплення ентеропептидазою, замість зони розщеплення тромбіном.

Комплекси були сформовані як продукти внутрішньорамочного злиття з протеїном МВР (протеїн, що зв'язує мальтозу), відповідно до зони багатократного клонування (МОС5) вектора рМАЇ -с2 (МЕВ) і згідно з технічними вимогами виготовлювача. Розмноження поліпептиду 2ЕОЕ-5 забезпечувалось завдяки ланцюговій полімеразній реакції, при використанні праймерів, які ініціювали необхідні зони клонування, а також необхідні зони розщеплення, причому використовувалися такі олігонуклютидні праймери: 1) у комплексі для тромбіну -2с12,652 сч об (послідовність ЗЕС ІЮО МО: 7) і 2с12,631 (послідовність БЕО ІЮ МО: 8); 2) у комплексі для фактора Ха - 2с215,290 (послідовність ЗЕО ІО МО: 9) і 2с12,631 (послідовність 5ЕО ІО МО: 8), 3) у комплексі дай (8) ентеропептидази - 2с15,270 (послідовність 5ЕО ІЮ МО: 10) і 2с12,631 (послідовність ЗЕО ІЮО МО: 8). У кожному випадку розмноження природної сигнальної послідовності поліпептиду 2ЕОБ-5 відсутнє; поліпептид 2-5, одержаний в результаті експресії, починається з амінокислотного залишку 26 послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 Ге зо (амінокислотний залишок Ма! замінений на амінокислотний залишок Аа) Комплекс для тромбіну був сформований за допомогою введення фрагмента Хба І-ЗаІ | поліпептиду 2ЕОБ-5 у зони Хба І-За| І вектора -- рМАЇГ-с2. Комплекс для фактора Ха був сформований за допомогою введення фрагмента Бішипі-заї| І у секції Хтп с

І-За| І зони багатократного клонування МО5. Комплекс для ентеропептидази був сформований за допомогою введення фрагмента Хба І-За! І у зони Хра-за! | вектора рМАЇ -с2. Після формування комплексів вони були о трансформовані в різноманітні штами-хазяїни кишкової палички Е.соїі і проаналізовані для виявлення високого ї- рівня експресії. Комплекс для тромбіну (позначений як р5ОНОО) був трансфектований в клітини ЮОНІТОВ (СІВСО-ВТІ), а комплекс для фактора Ха (позначений як рЗОНІт17,3) і комплекс для ентеропептидази (позначений як р2ЮрнН1І16,3) були трансфектовані в клітини ТОР10 (Іпуийгодеп, Зап Оіедо, СА). Всі три продукти злиття з протеїном МВР мають чистоту приблизно бЗкДа (43кДа в зоні протеїну МВР і приблизно 20кДа в зоні « Пполіпептиду 2-5). з с Б. Гомологічна рекомбінація при експресії поліпептиду 2ЕОБ-5

Для експресії вектора 2БЕОБ-5 у клітинах Ріспіа те(папоїїса використовується система для експресії, що з розглядається в описі до одночасно поданої патентної заявки РСТ УМО 9717450, який включений в цей опис винаходу за допомогою посилання. Плазміду для експресії, яка містить, повністю або частково, полінукліотид,

ЩО кодує поліпептид 2-5, формують за допомогою гомологічної рекомбінації. Вектор експресії формують з -І послідовності рС2К204, яка містить промотор АШОСТ1, після якого розташована лідерна послідовність оЕрр, а потім розташовані аміно-кінцевий пептидннії маркер, зона рестрикції Зтаї з тупим кінцем, карбоксильно-кінцевий іні пептидний маркер, кодон припинення трансляції, після якого розташований термінатор АОС, вибірковий маркер

Ге) АР0Е2, і остаточно - 3'-кінцева зона АОСТІ, що не транслюється. Крім того, цей вектор містить послідовності МКАЗ і СЕМ-АКЗ, необхідні для вибору і реплікації в середовищі 5. сегемізівіає, а також послідовності початку що реплікації Атр" і соїЕ!ї, необхідні для селекції і реплікації в клітинах Е. соїї. Послідовність 2ЕСБ-5, 4) вставлена в цей вектор, починається з амінокислотного залишку 27 (Аа) амінокислотної послідовності 2-5.

Для формування комплексу рРЗ2ОННЯ, що являє собою плазміду для експресії поліпептиду 2ЕОБ-5 у клітинах

Р.теїпапоїїса, нижчеперелічені фрагменти ДНК були трансформовані в середовище 5.сегемівізіае: 1ООнг акцепторного вектора рС2МК204, який був засвоєний за допомогою зони Зтаї!; їмкг фрагмента рестрикції

Хбраї-ЗаїІ, який виділений з комплексу раЮНоОО.5 і містить послідовність, що кодує поліпептид 2-5; 1мкг

ІФ) синтетичного, двониткового лінкерного сегмента, одержаного в результаті ланцюгової полімеразної реакції, який ко перекриває 70 пар гетероциклічних основ кодувальної послідовності аЕрр з одного кінця і приєднує їх до 70 пар гетероциклічних основ аміно-кінцевої кодувальної послідовності, що міститься в закінченій послідовності 60 поліпептиду 2ЕОБ-5, з другого кінця, і який сформований з чотирьох олігояукліотидів, а саме олігонукліотидів 72с13,497 (послідовність БЕО ІЮ МО:11), 2с15,131 (послідовність зЗЕО ІЮО МО: 12), 2с15,132 (послідовність ЗЕО ІЮ

МО: 18), 2с15,134 (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 13), а відповідна значуща нитка двониткової послідовності якого показана в послідовності ЗЕО ІЮО МО: 19 (5-кінцева лінкерна послідовність (абрр -» М-кінець поліпептиду 2ЕОБ-5)); Тмкг синтетичного, одержаного в результаті ланцюгової полімеразної реакції, двониткового лінкерного 65 сегмента, який перекриває 70 пар гетероциклічних основ карбоксильно-кінцевої кодувальної послідовності, що міститься в послідовності поліпептиду 2ЕОБЕ-5, з одного кінця і приєднує їх до 70 пар гетероциклічних основ послідовності термінатора АШСТІ, і який сформований з чотирьох олігонукліотидів, а саме 2с13,529 (послідовність 5ЕО ІЮ МО:14), 2с13,525 (послідовність зЕО ІЮ МО: 15), 2с13,526 (послідовність зЕО ІЮ МО: 16), 72с13,528 (послідовність 5620 ІЮ МО: 17), а відповідна значуща нитка двониткової послідовності якого показана в послідовності 5ЕО ІЮ МО: 20 (3-кінцева лінкерна послідовність (С-кінець поліпептиду 2ЕОБЕ-5 -» термінатор

АЦМСТІ)). Були вибрані колонії Ога", а ДНК з остаточно сформованих дріязджових колоній була екстрагована і трансформована в клітини Е.соїї. Окремі клони, що перешкоджали створенню структури для правильної експресії, були ідентифіковані за допомогою аналізу, з використанням ланцюгової полімеразної реакції з олігунукліотидами 2с13,497 (послідовність ЗЕ ІЮ МО: 11) ії 2с13,528 (послідовність 5ЕО ІЮ МО: 12), з 70 подальшим засвоєнням через рестрикцію, необхідним для перевірки наявності вставки поліпептиду 2ЕОБ-5, і розшифровуванням послідовності ДНК для того, щоб підтвердити сполучення необхідних послідовностей ДНК одна з одною. Плазмідна ДНК, одержана в більшому обсязі, була виділена для одного з правильних клонів, після чого була забезпечена реакція засвоєння ДНК, за допомогою зони б5Іії І, для виділення комплексу Ріспіа-2ЕОЕ5, що є результатом експресії, з структури вектора. Потім послідовність ДНК, розрізана за допомогою зони б85ІЇ |, 75 була трансформована в клітину-хазяїна Рісспіа те(Напоїїса для експресії, позначену як РМАОТ6, і висіяна на планшети АОЕ О для селекції. Виявлення і вибір різноманітних клонів здійснювали за допомогою процедури вестерн-блоттингу, що забезпечує високий рівень експресії поліпептиду 2-5.

Більш детально, у випадку невеликого обсягу виробництва протеїну (наприклад на планшетах або в колбах з перемішуванням) трансформация Р.птеїПапоїїса, які несуть комплекс для експресії, що містить промотор, регульований метанолом, (наприклад промотор АОО1) вирощуються в присутності метанолу і при відсутності інших шкідливих домішок, що є джерелами вуглецю (наприклад при відсутності глюкози). Для експериментів у невеликому обсязі, включаючи експерименти для попередньої оцінки рівнів експресії, трансформанти можна вирощувати, при температурі 309С, на твердих носіях, які містять, наприклад, 20Ог/л агару Васіо-адаг (Оїїсо), б,7г/л азотовмісної дріжджової основи без амінокислот (Оїсо), 1Ог/л метанолу, О,4мг/л біотину і се 0,56бг/л порошкоподібної суміші аденіну, треоніну і триптофану (Аде-Тиг-Тгр). Оскільки метанол є джерелом (5) леткого вуглецю, то він легко втрачається при довгостроковій інкубації. Для безперервного поповнення метанолу можна помістити водний 50-відсотковий розчин метанолу в кришки перевернених планшетів, завдяки чому метанол надходить до вирощуваних клітин внаслідок перенесення при випаровуванні. Взагалі, використовують не більше їмл метанолу на один планшет розміром 100мм. Трохи більш масштабні експерименти можна «(о здійснювати, використовуючи культури, вирощувані в колбах з перемішуванням. Згідно з типовою процедурою, - клітини культивують протягом двох діб на планшетах з мінімальною кількістю метанолу, як описано вище, при температурі З02С, потім колонії використовують для висівання на невелику кількість живильного середовища з Ге) мінімальним вмістом метанолу (6,7г/л азотовмісної дріжджової основи без амінокислот, 10г/л метанолу, 0,4мг/п ю біотину), при густині клітин приблизно 1х109 клітин на 1мл. Клітини вирощують при температурі 302С. Клітини, що вирощуються в середовищі з метанолом, споживають більше кисню, тому при культивації клітин необхідно - забезпечити інтенсивне перемішування. Метанол поповнюють щодоби (типова норма - 1/100 об'єму 50-відсоткового метанолу на добу).

У випадку культивування на виробничому рівні, свіжі культури високопродуктивних клонів формують у « колбах, з перемішуванням. Одержані культури використовують для висівання на живильне середовище у ферментері. У типових умовах, 500мл культури в середовищі ХЕРО, вирощеної при температурі 302С протягом но) с 1-2 діб, при інтенсивному перемішуванні, використовуються для внесення в ферментер місткістю бл. Клітини з» вирощують у придатному середовищі, що містить солі, глюкозу, біотин і елементи для мічення, при температурі 2820, рН-5,0 і вмісті розчиненого кисню більше 3095. Після закінчення споживання початкового заряду глюкози (показником такого закінчення є зменшення споживання кисню) у посудину вносять живильну суміш із глюкози і 395 метанолу для того, щоб забезпечити виробництво необхідного протеїну. Оскільки широкомасштабна ї ферментація здійснюється в умовах обмеження кількості вуглецю, то присутність глюкози в живильній суміші не 1 спричиняє гальмування промотора, збуджуваного метанолом.

Приклад 10. Очищення поліпептиду 2ЕОБ-5 о Середовище для ферментації клітин Е.соїї було одержане з штаму, що забезпечує експресію поліпептиду - 0 ЗЕОр-5 у вигляді продукту злиття з протеїном МВР (протеїн, що зв'язує мальтозу), (описаного вище як продукт з позначенням рЗОНОО.5). Злитий протеїн МВР-2ЕСОЕ5 був перетворений в розчин, за допомогою обробки

Фо ультразвуком або обробки згідно з процедурою Егепсі для роздрібнення під тиском, при використанні буферного розчину, що містить 20ММ кислоти НЕРЕЗ (М-2-гідроксиетилпеперазин-М'-2-етаносульфонова кислота), 04М масі, 0,01МмМ етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕЮОТА) і 10ММ дифенілтрихлоретану (00), при рн-/,4. 59 Буферний розчин для екстрагування містить також по 5мг/мл пепстатину (Рерзіайп), лейпептину (І ейреріїп),

ГФ) апротиніну (Аргоїіпіп) і бістатину (Вевіацп). Для досягнення остаточної концентрації О0,5ММ був також доданий т фенілметилсульфонілфторид (РМ5БЕ).

Екстракт був оброблений на центрифузі, з прискоренням 180009, протягом 30 хвилин, при температурі 4 2С.

Одержана надосадова рідина була оброблена амілозою (Рпагтасіа КВ Віоїесппоіоду, Різсаіїамжау, МУ), яка бо зв'язує зону протеїну МВР у злитому протеїні. Після промивання колонки, зв'язаний злитий протеїн МВР-2ЕОЕ5 елюювали в тому ж буферному розчині, який використовувався для екстракції, без етшіендіамінтетраоцтової кислоти та інгібіторів протеїнази, але при наявності 10ММ мальтози.

Накопичений після елюювання протеїн МВР-2РОЕ5 обробляли за допомогою тромбіну Воміпе (відношення мас - 1:100), активного щодо злитого протеїну МВР-2ЕОЕ5. Реакція розщеплення проходила протягом 6-8 годин 65 при кімнатній температурі і після її закінчення реакції суміш продуктів реакції пропускали над шаром сефарози

Вепгатіадіпе (Ріагтасіа І КВ Віоїесппоіоду, Різсаїажау, МО), щоб видалити тромбін, використовуючи буферний розчин для елюювання, описаний вище у зв'язку з афінною хроматографією за спорідненістю до амілози.

Готову фракцію, що містить розщеплений продукт 2ЕОБЕ-5 і зону вільного протеїну МВР, наносили на матрицю Тозо Наагз Нерагіп, призначену для оцінки спорідненості до гепарину (Тозо Нааз, МопідотегуміПе, РА), відкалібровану в розчині, що містить 0,5М Масі, 20мМ кислоти НЕРЕ5, 0,01М етилендаамінтетраоцтової кислоти (ЕОТА), при рН-7,4. У таких умовах протеїни МВР і 2ЕОБ-5 зв'язуються з гепарином. Зв'язані протеїни елюювали в умовах об'ємного градієнту, що забезпечується в 2-3 колонках, який утворюється між 0,5М Масі і 2,0М масі у буферному розчині колонок. 70 Протеїн МБР вимивається на ранньому етапі, при концентрації масі приблизно 0,7М, а розщеплений продукт 2ЕОБ-5 вимивається при концентрації МасСі приблизно 1,3М. Накопичені фракції продукту 2ЕОБ-5 знову пропускали через етап обробки амілозою для того, щоб видалити будь-які залишки злитого протеїну

МВР-2ЕСЕ5, які спричиняють другорядну забрудненість. Очищений матеріал був позначений як 2ЕОР5-Нер? і окремі зразки цього матеріалу мають високу чистоту, на рівні приблизно 20кДа, за результатами аналізу на /5 Основі електрофорезу в поліакриламідному гелі, призначеного для визначення зменшення вмісту додецилсульфату натрію.

Розшифровування М-кінцевої амінокислотної послідовності показало наявність природної М-кінцевої послідовності, але дані мас-спектрофотометрії виявили наявність молекулярних сполук, які показують, що

С-кінець необхідно укорочувати на позиції, що відповідає амінокислотному залишкові 196 (І ув) у послідовності

ЗЕФ ЛО МО: 2, для якої характерна двохосновна група.

Протеїн 2ЕОБЕ-5 має високу стабільність у середовищі 1,3М Масі. Після діалізу в фізіологічному розчині з фосфатним буфером протеїн 2ЕОБ-5 густіє і залишає рідку фазу. Таким чином, сполуки, що містять гепарин та інші поліаніони, можна використовувати для запобігання згущенню чистого протеїну 2ЕОБЕ-5.

Приклад 11. Формування антитіл сч

Антитіла для поліпептиду 2ЕОБ-5 були сформовані за допомогою стандартних методів, відомих спеціалістам у даній галузі і описаних раніше, імунізуючи морських свинок, кроликів і мишей пептидами і)

ОТКАКОСУБККОЇ КІ МС (послідовність 5ЕБЕО 10 МО: 2, фрагмент від амінокислотного залишку 40 до амінокислотного залишку 56, з додатковим амінокислотним залишком Суз на С-кінці), позначеними як 2ЕО-1, пептидами МІТМТККЗАКІКРТНКАС (послідовність ЗЕО ІЮ МО: 2, фрагмент від амінокислотного залишку 191 до Ге зо амінокислотного залишку 207, з додатковим амінокислотним залишком Суз на С-кінці), позначеними як 2ЕОБ-5, або первинними, непроцесованими поліпептидами 2ЕСЕ5, як показано в послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2, злитими з - протеїном МВР (протеїн, що зв'язує мальтозу), позначеними як МВР-РЕОЕ5. Пептиди були об'єднані, через с амінокислотні залишки Суз, за допомогою продукту КІ Н, активованого малеїмідом (Маїеїтіде) (Ріегсе Спетісаї!

Со., Коскога, І). о

У таблиці 7 наведені дані про піддослідних тварин, рівні імунізації і способи відділення антитіл. ї- протеїн « 2ЕОЕ8-1 Морські Початковий - БОмкг на одну тварину Повторний - 25мкгна |Афінне очищення фракціонування є 2

ЕТО ЕЕНН ч одну тварину імуноглобуліну С свинки одну тварину імуноглобуліну С в -І одну тварину імуноглобуліну С

МВР-РСБЕ5 |Миші Початковий - 20мкг на одну тварину Повторний - 1Омкг на 1 Афінне очищення фракціонування о ПИ ев кни

Кролики (Початковий - 200Омкг на 1 тварину Повторний - 100мкг на 1 |(Афінне очищення с ШІ ес сов - 50

Приклад 12. Вплив поліпептиду 2ЕОЕ-5 на мишей з ожирінням 4) Вплив поліпептиду 2ЕОБЕ-5 на адиюцити і жировий обмін досліджували, використовуючи мишей-самок з ожирінням (С57В81/6), даскгоп І арз, Ваг Нагрог, МЕ). Миші відзначались ожирінням, стійкістю до інсуліну і мали так звані "жирові кістки". Після зважування, причому при зважуванні всі миші мали однакову вагу, мишам 2о вводили, внутрішньовенно, препарат ДАСММ2ЕСБ-5, по 1011 часток на 1 мишу, а контрольним мишам вводили о салін або препарат АЗДБСММ-СЕР, як описано в прикладі 7. Через 17 днів після ін'єкцій визначили, що в мишей, яким вводили препарат ДААЗСММ-ОРЕР, маса тіла збільшилась на 5,342 -0,5г порівняно з масою на день початку о ін'єкцій, а в мишей, яким вводили препарат ААСММ2ЕСОБЕ-5, маса тіла зменшилась на 3,183--0,743Г.

Із вищевикладеного опису можна зробити висновок такий висновок: незважаючи на те, що конкретні варіанти 60 реалізації винаходу розглянуті в цьому описі тільки з метою ілюстрації винаходу, можливі різні модифікації варіантів реалізації без відхилення від суті і діапазону використання винаходу. Відповідно, відсутні будь-які обмеження щодо винаходу, крім обмежень, які накладаються пунктами формули винаходу, що додається.

Перелік послідовностей (1) Загальна інфориація бо () Заявник

7утобепеїісв, Іпс., 1201 ЕазцЦаКке Амепие Еаві,

Зеацше, УУазпіпдіоп 98102,

Опйеа З(ас(ез ої Атегіса (ії) Назва винаходу

Нові гомологи ростових факторів фібробластів (ії) Кількість послідовностей: 20 (ім) Адреса для листування 70 (А) Адресат: 7утобепеїйсв, Іпс. (В) Вулиця: 1201 ЕазіаКе Амепце Еаві (С) Місто: ЗеашШе (0) Штат: МА (Є) Країна: ОБА (Р) Поштовий індекс: 98102 (м) Комп'ютерна форма подання інформації (А) Тип носія інформації: дискета (В) Комп'ютер: сумісний з комп'ютерами фірми ІВМ (С) Операційна система: 0О5 (Юр) Програмне забезпечення: РавізЕО) ог МУіпдом/в, Мегвіоп 2.0 (мі) Поточні дані патентної заявки (А) Номер заявки: (В) Дата реєстрації: (С) Патентна класифікація: сч (мії) Дані попередньої патентної заявки (А) Номер заявки: і) (В) Дата реєстрації: (мії) Інформація про адвоката або агента фірми (А) Прізвище та ім'я: Замжізіак, Оерога А Ге зо (В) Реєстраційний номер: 37,438 (С) Номер для посилань і документів: 96-20 -- (їх) Інформація для зв'язку с (А) Телефон: 206-442-6672 (В) Телефакс: 206-442-6678 о (С) Телекс: ї- (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 1 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 917 пар гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота « (С) Кількість ниток: дві з с (ОБ) Топологія: лінійна . (ії) Тип молекули: комплементарна ДНК и?» (їх) Характеристики (А) Назва або код: кодувальна послідовність (В) Розташування: 1...621 (ОД) Інша інформація: -І (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 сл Дт ТАТ ТОД Ясв Ссс. ОС БОС тс СТ тес сте тат ПАСТ в х Меє Тує Бев АТа Рго ба А1а бує ТА був меш СУ МБО; НІ5 Ре їй ою Ів

Ф СЯ СТ С то сАб СТА СА бто СТУ бТт бос ВАВ вАЄ; ААС БТ БАС 9

Кв бен Сув Ровобій Маї бій Маї ей мат йо блю бін дей Уві де їй 20 яв п

Ф) іме) 60 б5

ТТС СС АТС САС ВТ БО ААС САВ. АСВ СО6 ОСТ КО Де ВАТ БТІ АВС

Рне Аед 116 нів: Ма: бій вий бій Тне Або Аа Ак Аер Дер; мя. Ве в к яд 45 ст ААб САЄ СТВ бо СТБ ТАС САВ СТО ТАС АВС ОБО АБО АСТ боб вдд 190 дге УК Бл Ше ку Шви Тут Тв ем ТУР бе ме Тебе бу ув, 7 ой окро сло вто СТЕ обс соб Абе АТО АЄт вЕС ре БОС бле ВАТ БЕЄ ОС нії Те Ії Чаї ви б1у Ако Абе Пе ве Аа АРКУ СТУ бо Ар ТУ ва ШЕ 15 во з САС АД ТАК БОС СА СТ СТА БІ АБ АСА БАС. АС ТТС.БОТ АВК САА 0ОСВВ;

Ар гує Тук Аа БА Сей Сец Ма! СТИ Яйе Ар Те Ре сту БЕР бій 20 БО Сб АТС лаб бор АБ АБ АС бАА ТТЄ ТАС СТО ТОС АТБ АКСОВС ОСЗЛ6

МО Т05 це 25 МЕА ВБО МАб СТС ВТ БОБ АЛО СОС ВАТ БОС АСС АВС ААС ПАБ ТТ бТЄ ОЗНА. й.

Щує БУ мує Пеш Ме! Ту кує Бео Аюр Оу Те бег бує. Бі бує Мал о о г.

ТіЄ АІЄ бло дб СТ СТО ОАЄ ан АНО ТАС ЛОВ 000 сто ЯК Ов Ост зе Ф то Фе Це бім бує Уа Гец бід АвпоАвп ТУ Те Аа Сей Ме беє Аа - ув ТУР Зв СТУ Тер тує Мат б1у РО ТАЄ ую ув вт АС Ргб дев; ї- 145 150 155 460

АМЕ ББС СОС ЛИШ СБ Сб БАЄ ЛАЄ САЄ САбЇ ОАЄ ЯТО САТ ТТС АТО ААЄ ОБОВ « и Був б1У РЕ КУБ ТНг ду сти АвИ БТЯ Ти. Аєр Ма! Ні ббе МеБ 15 З й СОС ТАС. ССС. ДАВ ОБ СА СОбСАЄ СТІ СА; ДАЄ ССС; ТТО АВ ТАСОАЄЄ 576

Ара Тує Риб ще У ди Риб БТЕ Бей Ти ув Ре Ве ує Туб ще - 75 ве М. 50 о АСО тб АС ААБ ЛВЄ ТОб Об СБ АТС ОВ СОС АСА САС ССТ бос ТЕС 626

Фо Тве Маї Тв бує Ак беєодко дид 11езАРо Рго Те Нів Рио Дів: аю м Роо тах М

Ф САСССЮСССЯ ССБСССТОЯЄ СТООСССТОВ ССАСАЄТСАЄ АСТОССЯвАХ ААСТВСАИСХ БВ

ТАОВААТАТИ ТТТАСАТОАА ЛАДТААВСАТ ТТТАТТЄТІ. ЛСТТЕААНОС СПСВАТВАБА СО шо МАБАСТСМ: ССМАВВОАС ТЕТАСТСМАЄ ССАСАВЄТОС. ГТОІСТСТСІ СТАОБАЙСАЄ СВОЄ

АСААСТСТАЛ. АСТОВТСССЄ АОАССАВОАС ТТОААТЕАОС: АДАССААСЯС ТТТОАСАААС Вб о САААБТЕСТІ ТЕТОССАДАЄ БТТСТВАЛАА. ЛАЛАЙАЛАЛА. АААЛАСТОСА б 7 іме) 60 (2) Інформація про послідовність ЗЕО І МО: 2 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 207 амінокислот (В) Тип: амінокислотна послідовність (С) Кількість ниток: одна 65 (ОБ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: протеїн

(у) Тип фрагмента: внутрішній (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2

МБЕ Туб ЯВР Лв РГО-5еК дій бує ТИР був Гей Сув ів ніх Ре їв; 1 «В 10 ШИ:

Тер цец Су: Ре бта Ма СТЯ Меї Бей Ме! Аа б СТУ Аби; Маї Дер то Ре Ага 116 Ніє Уа1ї бі дей бій Те Ди Аза Аа Ар Ар Маї об «Ароу їув Бій ем Ар: Бен Я бій вен тус Бек одеу Так бек сту Був . дини лиш ше 5 Вів Те біт Маї Сех бту Аг Яга Ме бек АТа Аг б1У бі Авр СТУ дер сує тує АТа сій Бей мех Маї бле Те Ар Те Рнебіу ве ой 7 Уаї. АкО Ле Бу У БУЄ би те бу. РАЄ Туб сей був ВЕ. Ази Аго ух б1у бує Мем Маї біу мує Рко: Авр бІу Те бек бує бе бує Чаї

Рре іє бо їу5 МК! 1ви бі Аби Аби тує ТВ діа ек мес зви я 00 ше ншшнннши ще ВИШ

Туз їуб-зег Бім Тер отує Уві! ТУ Ріе ТР Гу бує оту Ако Рко ро; с тує Бу Ро вує Те Аг бін АБи біт: бій дер Маї Ніє Риє Ме був . 165 1 5. о иа тує РО Суб ЛУ ТЯ РФ ТИ цер ет СУБ Ре Ре ую Туб тю о

ЛГ УТ Те сує Аг бек: Аге Ага Бе Ак Ре Те Нє Рев Аа 196. 200 оо « ші с (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮО МО: З "з (Ї) Характеристики послідовності и (А) Довжина: 24 пари гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна -і (0) Топологія: лінійна

Фі (викон вв (95) (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: З шу 20 СОАСТТОАСТ АССОСААОСТОо ТСТОо (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮО МО: 4 4) (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 23 пари гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна о (мії) Безпосереднє джерело іме) (В) Клон: 7С11677 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 4 60 СТСОАТОТОА СОССОТААССА ОСТ (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮО МО: 5 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 26 пар гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота бБ (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна

(мії) Безпосереднє джерело (В) Клон: 2212053 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮО МО: 5

ССАТАСТТОТ ССССАТСОСТО сСсСсоСо (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮО МО: 6 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 621 пара гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота 70 (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 6 дТСТАХИВНО СИСЄНИОНОС МТОХАЄНТВИ УТОМУТНС ДУТИ маТояи 650 т 0 БАВБТИСАНС ТКУТНЕТНОС МОАВСАКААУ БТИБАУТТУМ ОБАТНОАМОТ МБАКААНСАК 10

ЛЕМИЄНОЮНА АВСАХАТНСА. ВОТКЕТНССЮ НОКНОМАТНИЯ ЗНОСКМЕМОЄ МОЛЯСАУЄЄМ б

БАУААНТАТЕ СКСАКУТИМТ МСТКОАЛАСЮ ВАХАСМІТУС КМБЮСАВЕТ МНОМАТНАЛЮ 900 то ЗОКААВСАНА СКСАНТТУТА, УУТИТОМАТЕ ААЖНСЮААНС МАДНУТНОТ МНОСМААНССМ 860

ВАТСОМАСНИ ЗНААКОАНТО МОХ ТУАТИ БАКААЯСТМУ ТКОАКАДЖАХ УТАСАСНОСМ 0

УТНАТЕНОНЯ СКАДЯТАТИ: НОБМТОСТАХ БУКЕТА СМАДКАЛВСВ МИСМССНМОМ ВО

ЛАВОВМОСМА АВАСКМОМОА: ВААУСАВСАВ БАУСТИСАМТ ТТАТСАДЕМО МТАУССМАЛЯ 540 беМСАРССМО АНУТКСАВАД: НССМТТМАЙН ТАХАСНАЄНЄ. ТКАСНАЛНИЯ МИОММВНМОМ 600 сч щі АтимансСнА СИСЛУССНОС М в (о) (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 7 (Ї) Характеристики послідовності «о зо (А) Довжина: 47 пар гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота - (С) Кількість ниток: одна со (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело що) (В) Клон: 2212652 їм- (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 7

ТАТТТАТСТА САСТОСТТСС ССОТОССОСС САССАСАДАСО ТОСАСТТ

(2) Інформація про посзгідовність ЗЕО ІЮ МО: 8 (Ї) Характеристики послідовності « (А) Довжина: 33 пари гетероциклічних основ -о с (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна :з» (Юр) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело (В) Клон: 2212631 -І (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 8

СТАТТТОТСО АСТСАСОСАОо соТоТоТооо ССО о (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮО МО: 9 оо (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 22 пари гетероциклічних основ - (В) Тип: нуклеїнова кислота

Ф (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело (В) Клон: 2215290 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 9 (Ф. СССОАСОСАСА АСОТОСАСТТ СС ко (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 10 (Ї) Характеристики послідовності 60 (А) Довжина: 47 пар гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело 65 (В) Клон: 2215270 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 10

ТАТТТАТСТА САСАТОАСОА ТОАСААСОСС САОСАСААСО ТОСАСТТ

(2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 11 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 41 пара гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело 70 (В) Клон: 2213497 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 11

АССАТТОСТА ДАСААСАдДОС ТОТААОСТТО САСААСАСАС А (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 12 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 63 пари гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело (В) Клон: 2215131 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 12

СОСТОТААОСТ ТОСАСААСАО АСАССАСААС СТОБАСТТСС ССАТССАСОТ САСААССАС АСО

(2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 13 (Ї) Характеристики послідовності сч (А) Довжина: 39 пар гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота і) (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело Ге зо (В) Клон: 2215134 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 13 --

ССООСТОТАо АОСТОСТАСА СССОАОСТОо СТТАСООСТ со (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 14 (Ї) Характеристики послідовності о (А) Довжина: 42 пари гетероциклічних основ ї- (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело « (В) Клон: 2213529 в с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 14

Й СТТСАСААОС ССТТСААСТА САСОАСОСТО АССААСАОСТ СС и?» (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 15 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 61 пара гетероциклічних основ -І (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна о (ОБ) Топологія: лінійна 2) (мії) Безпосереднє джерело (В) Клон: 2213525 - (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 15

Ф АСОСАСОСТОА ССААСАООСТС ССОТСОБАТС СООСССАСАС АСССТОССТА СОСОСБААТТО о (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮО МО: 16 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 61 пара гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота

Ф) (С) Кількість ниток: одна ка (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело 60 (В) Клон: 2213526 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 16

СААДАСАСОСА ССССТАСААТ АСТАСТОТСО АСТООСАОСАТ ССОАДАТТССС ССТАООСАСО о (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 17 (Ї) Характеристики послідовності 65 (А) Довжина: 44 пари гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота

(С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: комплементарна ДНК (мії) Безпосереднє джерело (В)Віоп:2С13528 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 17

СТСААДАДАТТ АТАААААТ ССАДАСАСОС АССССТАСААТАСТ

(2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 18 (Ї) Характеристики послідовності 70 (А) Довжина: 62 пари гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (мії) Безпосереднє джерело (В) Клон: 2215132 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 18

САСССОСАС ТОСТТАОСОС ТСАСАТСОСТС ССОАССССОоС СТСТООТТСТ ССАСОСТОСАТ ОС (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 19 (Ї) Характеристики послідовності (А) Довжина: 141 пара гетероциклічних основ (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: дві (ОБ) Топологія: лінійна (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 19 й с

КВОДТТОСТЄ СТААДОЛАСА АОБТЕТАНИС ТТОБАСАЖВА: СЛСАЄЗАЄАА СОТОБАЄТИЄ 60

СБСАТОСАСЯ ТОСАСААССА БАСОСОБОСТ ОбОБЛОВАТЄ ТОАОСССТАХ БСАБСТОСОЄ 0120

СТеТАССЯВС ТеТАСЛОСОВ В м зо (2) Інформація про послідовність ЗЕО ІЮ МО: 20 (Ї) Характеристики послідовності -- (А) Довжина: 144 пари гетероциклічних основ со (В) Тип: нуклеїнова кислота (С) Кількість ниток: дві іт) (ОБ) Топологія: лінійна чн (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО: 20

Claims

Формула винаходу « | | . о ш

1. Ізольована полінуклеотидна молекула, що кодує поліпептид, який є гомологом ростових факторів с фібробластів, вибрана з групи: :з» і. полінуклеотидні молекули, що містять послідовність нуклеотидів, показану в послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1 як фрагмент від нуклеотиду 82 до нуклеотиду 621;

і. природні варіанти, які принаймні на 80 95 ідентичні молекулам (Її); -1 її. полінуклеотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 80 95 ідентичний амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО І МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до 1 амінокислотного залишку 207 (Аа), сю причому поліпептид, кодований полінуклеотидом, є таким, що стимулює проліферацію клітин, які походять з мезенхимних початкових клітин і їх попередників.

-

2. Ізольована полінуклеотидна молекула за п. 1, яка відрізняється тим, що відповідає послідовності Ф нуклеотидів, показаній в послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1 як фрагмент від нуклеотиду 82 до нуклеотиду 621.

3. Ізольована полінуклеотидна молекула за п. 1, яка відрізняється тим, що полінуклеотидом є ДНК.

4. Ізольована полінуклеотидна молекула, що кодує поліпептид, який є гомологом ростових факторів фібробластів, вибрана з групи:

і. полінуклеотидні молекули, що містять послідовність нуклеотидів, показану в послідовності 560) ІЮ МО: 6 ГФ) як фрагмент від нуклеотиду 82 до нуклеотиду 621;

г і. природні варіанти, які принаймні на 80 95 ідентичні молекулам (Її);

її. полінуклеотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 80 95 ідентичний амінокислотній во послідовності, показаній в послідовності ЗЕО І МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до амінокислотного залишку 207 (Аа), причому поліпептид, кодований полінуклеотидом, є таким, що стимулює проліферацію клітин, які походять з мезенхимних початкових клітин і їх попередників.

5. Вектор експресії, що містить такі елементи, сполучені між собою для можливості виконання заданих б функцій: промотор транскрипції;

фрагмент ДНК, вибраний з групи:

і. полінуклеотидні молекули, що містять послідовність нуклеотидів, показану в послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1 як фрагмент від нуклеотиду 82 до нуклеотиду 621;

і. природні варіанти, які принаймні на 80 95 ідентичні молекулам (Її);

її. полінуклеотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 80 95 ідентичний амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО І МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до амінокислотного залишку 207 (Аа); термінатор транскрипції. 70

6. Вектор експресії, що містить такі елементи, сполучені між собою для можливості виконання заданих функцій: промотор транскрипції; сегмент ДНК, вибраний з групи:

і. полінуклеотидні молекули, що містять послідовність нуклеотидів, показану в послідовності 560) ІЮ МО: 6 7/5 як фрагмент від нуклеотиду 82 до нуклеотиду 621;

її. полінуклеотидні молекули, що кодують поліпептид, який принаймні на 80 95 ідентичний амінокислотній послідовності, показаній в послідовності ЗЕО І МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІМ) до амінокислотного залишку 207 (Аа); термінатор транскрипції, причому поліпептид, кодований полінуклеотидом, є таким, що стимулює проліферацію клітин, які походять з мезенхимних початкових клітин і їх попередників.

7. Культивована клітина, в яку введений вектор експресії за будь-яким з пп. 5-6, причому згадана клітина забезпечує експресію поліпептиду, кодованого фрагментом ДНК. сч

8. Спосіб одержання поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, згідно з яким о виконуються такі процедури: культивування клітини, в яку введений вектор експресії згідно з будь-яким з пп. 5-6, внаслідок чого згадана клітина забезпечує експресію поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, кодованого фрагментом ДНК; Ге зо виділення поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів.

9. Ізольований поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, вибраний з групи: --

і. поліпептидні молекули, що містять амінокислотну послідовність, показану в послідовності БЕО ІЮО МО: 2 с як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 175 (Ме);

і. природні варіанти, які принаймні на 80 95 ідентичні молекулам (Її); о її. поліпептидні молекули, які принаймні на 80 95 ідентичні послідовності, показаній в послідовності ЗЕО М ІО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (СІ) до амінокислотного залишку 175 (Мед), причому поліпептид, кодований полінуклеотидом, є таким, що стимулює проліферацію клітин, які походять з мезенхимних початкових клітин і їх попередників.

10. Ізольований поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, вибраний з групи: «

і. поліпептидні молекули, що містять амінокислотну послідовність, показану в послідовності БЕО ІЮО МО: 2 з с як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 196 (І уз);

і. природні варіанти, які принаймні на 80 95 ідентичні молекулам (а); з її. поліпептидні молекули, які принаймні на 80 95 ідентичні послідовності, показаній в послідовності ЗЕО ІО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 196 (І ув), причому поліпептид є таким, що стимулює проліферацію клітин, які походять з мезенхимних початкових -І клітин і їх попередників.

11. Ізольований поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, вибраний з групи:

1 і. поліпептидні молекули, що містять амінокислотну послідовність, показану в послідовності БЕО ІЮО МО: 2 2) як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 207 (Аа);

і. природні варіанти, які принаймні на 80 95 ідентичні молекулам (Її); - її. поліпептидні молекули, які принаймні на 80 95 ідентичні амінокислотній послідовності, показаній в Ф послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 207 (Аг), причому поліпептид є таким, що стимулює проліферацію клітин, які походять з мезенхимних початкових клітин і їх попередників.

12. Поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, за п. 10, який відрізняється тим, що (Ф, містить сигнальну послідовність. ка

13. Поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, за п. 10, який відрізняється тим, що містить сигнальну послідовність, показану в послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного бо залишку 1 (Ме) до амінокислотного залишку 27 (Аа).

14. Фармацевтичний засіб для стимуляції проліферації клітин, які походять з мезенхимних початкових клітин і їх попередників, який містить очищений поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, за п. 10, у поєднанні з фармацевтично прийнятною речовиною-носієм.

15. Антитіло, яке специфічно зв'язується з поліпептидною молекулою, що містить амінокислотну 65 послідовність, показану в послідовності 562) ІЮ МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 1 (Ме) до амінокислотного залишку 207 (Аа).

16. Антитіло за п. 15, яке відрізняється тим, що специфічно зв'язується з поліпептидною молекулою, що містить амінокислотну послідовність, показану в послідовності ЗЕО ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 196 (І уз).

17. Спосіб стимуляції росту міоцитів або клітин-попередників міоцитів у ссавців, яким необхідна така стимуляція, який включає:

і. введення ефективної кількості поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів, за одним з пп. 9-13;

і. вимірювання збільшення розмірів і кількості клітин-попередників міоцитів або міоцитів у ссавця 7/0 Порівняно з цими показниками у контрольних тварин.

18. Спосіб стимуляції за п. 17, який відрізняється тим, що міоцитами або клітинами-попередниками міоцитів є серцеві міоцити або клітини-попередники серцевих міоцитів.

19. Спосіб стимуляції, в умовах поза живими організмами, росту клітин-попередників міоцитів або міоцитів, який включає:

і. культивування клітин-попередників міоцитів або міоцитів разом з поліпептидом, що є гомологом ростових факторів фібробластів, за одним з пп. 9-13;

ії. вимірювання кількості клітин-попередників міоцитів або міоцитів у клітинах серцевої тканини, які культивують у культуральному середовищі із згаданим поліпептидом, і порівнювання її з кількістю клітин-попередників міоцитів або міоцитів у клітинах серцевої тканини, які культивують за відсутності згаданого поліпептиду, що є гомологом ростових факторів фібробластів.

20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що міоцити або клітини-попередники міоцитів є серцевими міоцитами або клітинами-попередниками серцевих міоцитів.

21. Спосіб одержання химерні сполуки, згідно з яким виконуються такі процедури: сполучення першої молекули, яка містить поліпептид, що є гомологом ростових факторів фібробластів, сч вибраний з групи: | | | | | | о і. поліпептидні молекули, що містять амінокислотну послідовність, показану в послідовності БЕО ІЮО МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (Си) до амінокислотного залишку 175 (Ме);

і. природні варіанти, які принаймні на 80 95 ідентичні молекулам (а);

її. поліпептидні молекули, які принаймні на 80 95 ідентичні амінокислотній послідовності, показаній в «я зо послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 як фрагмент від амінокислотного залишку 28 (См) до амінокислотного залишку 196 (Гуз), - з другою молекулою, що містить препарат або лікарський засіб, для формування химерної сполуки; с причому поліпептид є таким, що стимулює проліферацію клітин, які походять з мезенхимних початкових клітин і їх попередників. Щео, і -

- . и? -і 1 (95) - 70 4) іме) 60 б5