JP2007524376A

JP2007524376A - 軟骨形成を誘導するｆｇｆ−１８タンパク質、標的タンパク質、およびそれぞれをコードするヌクレオチド配列の使用

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Publication number: JP2007524376A
Application number: JP2006509329A
Authority: JP
Inventors: ホイットセット，ジェフリー・アレン
Original assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Current assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Priority date: 2003-03-27
Filing date: 2004-03-26
Publication date: 2007-08-30
Also published as: WO2004087055A2; AU2004226421A1; CA2520460A1; WO2004087055A3; EP1613267A2; US20080194472A1; US20100137205A1; BRPI0408787A

Abstract

特に軟骨形成を誘導するための、特に軟骨組織の産生、修復、復元、または新規の形成のための、特定のソニックヘッジホッグ(Shh)における、線維芽細胞増殖因子(FGF)-18タンパク質、ある種のその下流の標的遺伝子、およびそれぞれの発現タンパク質、Shhタンパク質、β-カテニン、β-カテニンタンパク質、およびβ-カテニンを刺激するWntファミリーのタンパク質、ならびにこのタンパク質をコードするそれぞれのヌクレオチド配列の使用。FGF-18および標的タンパク質が有用である治療には、例えば、気管-気管支の異常、気管-咽頭または気管支のマラリアによって引き起こされるものなどの、気管、気管支、肺、および喉頭などの誘導気道における様々な組織の修復および再構築が含まれる。FGF-18および標的タンパク質が有用となるであろう他の治療には、他の軟骨組織(例えば、関節における関節炎および半月板異常によって引き起こされる関節および骨格組織のものなど)の修復および再構築が含まれる。

Description

本出願は、特に、軟骨組織の産生、修復、再構築、または新規の形成のための、線維芽細胞増殖因子(FGF)-18タンパク質、このタンパク質をコードするそれぞれのヌクレオチド配列、ある種のその下流の標的遺伝子およびそれぞれの発現タンパク質、特にソニックヘッジホッグ(Shh)、Shhタンパク質、β-カテニン、β-カテニンタンパク質、およびβ-カテニンを刺激するWntファミリーのタンパク質、ならびに軟骨形成の誘導におけるそれらの使用に関する。本出願はさらに、軟骨形成を誘導するための、FGF-18タンパク質を含有する組成物、および/またはこうした形成を誘導するためのこれらの標的タンパク質、またはこれらのタンパク質をコードするそれぞれの遺伝子の使用に関する。

軟骨は、基質に埋め込まれた細胞からなる分化した型の密性結合組織である。数種類の軟骨が存在する。膠原線維を含有する均質な基質を有する半透明の軟骨は、関節軟骨に、肋軟骨に、鼻の中隔に、喉頭に、また気管に見られる。関節軟骨が、骨の関節の表面をカバーしているガラス軟骨であるのに対して、肋軟骨は、真肋および胸骨と連結する。黄色軟骨は、喉頭蓋、外耳および耳管に主として見られる軟骨細胞を保持する弾性線維のネットワークである。2001年7月10日に発行された米国特許第6,258,778号(Rogersら)を参照のこと。

軟骨組織は、軟骨細胞の他に、主としてコラーゲン、グリコサミノグリカン、およびプロテオグリカンからなる細胞外基質から構成される。軟骨細胞は、合成されると、集合して軟骨を構築するこれらの成分を分泌する。これらの成分と、これらの有機基質成分内に取り込まれた水によって、軟骨の特有の弾性および強さが与えられる。Wozneyら、「Science」、(1988年)242:1528〜1533；Spornら、「J. Cell. Biol.」、(1987年)105:1039〜1045。また、2001年7月10日に発行された米国特許第6,258,778号(Rogersら)も参照のこと。軟骨の形態形成は、この組織の発達が、脊椎動物の内骨格の多くの形の基礎をなし、かつこれらを決定するという点で、根本的に重要である。軟骨は、初期胎児期の優勢な骨格材料であり、頭蓋顔面、耳、喉頭、肋骨、および関節の構造の不変部分になる。骨格成分間の接合部は、ほぼ完全に軟骨であり、正常な関節の発達および効率的な関節機能を確実にするのは、関節の表面の正確な形態形成である。Tickleら、「Curr. Opin. Genet. Dev.」(1995年)5:478〜84；Johnsonら、「Cell.」(1997年)90:979〜90を参照のこと。

骨格の軟骨のような、呼吸器系に関連する軟骨構造物は、胚の軟骨の初期の構造に起因する。気管は、これが、胚の内胚葉性腸管に融合された直後に、内胚葉の突出物として生じる。初期の喉頭は、気管の突出物の後方の第2および第4鰓弓から誘導される。突出物およびその一次および二次分岐の内胚葉性上皮細胞は、周囲の中胚葉に侵入し、分岐形態形成として知られているプロセスを開始する。近位の内胚葉の、周囲の中胚葉との相互作用は、軟骨形成をもたらし、一連の軟骨環構造の形成が、続いて起こる。これらの軟骨の環は、出生後、気道の維持に寄与する柔軟性のある支持を提供する。末梢の内胚葉では、軟骨の形成を誘導する信号は、消される、あるいは抑制される。したがって、発達している肺実質は、軟骨を本質的に欠いたままである。Larsen、「Human Embryology」、(Churchill Livingstone, Inc.、NY、1993年)を参照のこと。

一般に、軟骨形態形成の制御時の妨害は、骨格、喉頭、気管、耳、鼻、および他の軟骨組織の異常形態発生をもたらす可能性があり、こうした事象は通常、有害作用を有する。いくつかのこうした型の異常形態発生が、致死的である可能性があるのに対して、他のも
のは、再建手術を用いる治療が困難または不可能である壊滅的な奇形をもたらす可能性がある。軟骨の血管系が比較的に乏しいことはまた、任意の型の形成手術からの回復のために必要とされる治癒過程における深刻な障害である。さらに、軟骨の損傷は、この組織に対する深刻な病的状態を引き起こす可能性がある。軟骨組織は通常、治癒の妨げになるので、治癒のために延長期間が必要になることによって、しばしば、再発性の損傷の可能性が現れ、軟骨損傷からの回復が危うくなる。「Cartilage」第1〜3巻(B.K. Hall編、Academic Press、NY、1983年)を参照のこと。

軟骨形成および発達の異常は、いくつかの疾患における主な医学的問題である。同様に、軟骨損傷および変性は、深刻な結果の多くの臨床状態に関連する。これらの軟骨関連の障害は、全世界で年につき保健医療費におけるほぼ25億ドルを占める。現在の治療は、炎症を緩和すること、痛み処置、および関節が使用される関節可動域を増大することに重点を置いている。しかし、軟骨変性を抑制する、あるいはさらに重要なことには、軟骨の形成、増殖、および発達を増進することを対象とする治療法および処置は、依然として捉えどころがない。

関節軟骨が、全層にわたる(full-thickness)軟骨欠損の場合に、自発的な修復応答を有することが、最近実証された。Shapiroら、「J. Bone Jt. Surg.」(1993年)75-A(4)):532〜53を参照のこと。しかし、この修復応答は、形および機能に関して制限される。対照的に、軟骨自体に限定される部分層の(partial-thickness)損傷においては、有意義な修復プロセスは存在していない。Hunzikerら、「J. Bone Jt. Surg.」(1996年)78-A: 721〜33を参照のこと。過去40年にわたり、多くの修復技術が提唱されてきたが、いずれも、損傷を受けた軟骨を置き換えるための、上手く再生される持続性のガラス軟骨組織を有さない。Buckwalterら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1997年)79-A: 612〜32を参照のこと。実際、損傷を受けた軟骨を修復するための大部分の外科的介入は、臨床症状の治療(ガラス軟骨の再生ではなく、疼痛寛解、ならびに関節構造および咬合面(articulating surface)の機能的な回復など)を対象としている。Jonsonら、「Arthroscopy」(1989年)2:54〜69を参照のこと。

関節軟骨の正常な咬合面を回復させる初期の外科的試みは、Pridieの表面再建(resurfacing)技術の導入と共に行われていた。この軟骨の修復技術は、骨髄からの出血(bleeding)を誘導するために、軟骨下骨の破壊を利用することによって、軟骨欠損部位における通常の創傷治癒機構を促進させる。Pridie、(「Proceedings of the British Orthopaedic Association」、J. Bone Jt. Surg.、(1959年)41B:618〜19を参照のこと。Pridieのアブレイション(abrasion)関節形成術以来、修復される組織の治癒メカニズムを改良する試みに、いくつかの軟骨下骨破壊技術が導入された。これらには、軟骨下骨穿孔、関節鏡のアブレイション、および微小破壊技術が含まれる。Mitchellら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1976年)58A(2): 230〜33；Brownら、J. Sports Med.、(1974年)2:27〜46；Bertら、Rheum. Dis. ClinNAm.、(1993年)19:725〜39；Rodrigoら、Am. J. Knee Surg.、(1994年)7(3):109〜16を参照のこと。

全層軟骨修復に関するいくつかの実験的な動物実験はまた、軟骨下骨破壊(breaching)技術によって、軟骨欠損の領域における出血から形成されるフィブリンクロットがもたらされることを明らかにした。このクロットはその後、間葉系細胞によって浸潤され、前駆細胞の遊走のための三次元的な足場として作用する。Shapiroら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1993年)75-A(4): 532〜53を参照のこと。6週以内に、これらの細胞は、徐々に分化し、ガラス様の修復軟骨で、完全に欠損領域を満たす。しかし、この新しく合成された修復軟骨は一般的に、正常なガラス軟骨かなり少ないプロテオグリカンを含有する。Mitchellら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1976年)58A(2): 230〜33を参照のこと。この段階での修復組織はまた、隣接する正常な軟骨よりもより細胞様であり、残存する軟骨との構造的な統
合を示さない。その結果、軟骨組織には、変質(degeneration)および亀裂(fissuring)が存在することとなる。全層欠損の自発的な修復機構は、外科的修復の後最初の数週間は存在するが、これは後に、修復される組織における不適切な力学的および生化学的状態によって衰える。O'Driscollら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1988年)70-A(4): 595〜606)；Scherpingら、「American Orthopaedic Society for Sports Medicine」(Toronto、ONT、Canada、1995年)；Suhら、「Oper. Tech. Orthop.」、(1997年)7:270〜78を参照のこと。

軟骨修復に対する手法としての組織工学という概念は、1977年にGreenによって、最初に提案された。Greenら、「Clin. Orthop. Relat. Res.」、(1977年)124:237〜50を参照のこと。この手法では、生体外環境で増殖させた軟骨細胞を、軟骨欠損部に移植する。こうした組織工学手法の臨床応用は、スウェーデンのグループによって、最初に試みられた。Brittbergら、「New Engl. J. Med.」、(1994年)331(14): 889〜95を参照のこと。実験室で増殖させた細胞を利用する軟骨の修復技術は、かなり注目を集めている。Buckwalterら、「J. Bone Jt. Surg.」(1997年)79-A: 612〜32を参照のこと。近年では、組織工学概念は、関節軟骨のための細胞ベースの修復方法を開発するために導入されている。Freedら、「J. Biomed. Mater. Res.」、(1993年)27:11〜23；Vacantiら、「AJSM」、(1994年)22(4):485〜88。関節軟骨の組織工学は、関節の軟骨細胞またはそれらの前駆細胞(in vitroで増殖させ、その後、培養およびその後の関節への埋め込みのために、生物学的適合性の基質、または足場に接種することができる)の単離を必要とし、軟骨を設計するために使用される細胞の型は、長期的結果にとって重要である。実験的研究において、調査されてきた様々な細胞集団には、成熟した関節軟骨細胞、骨端軟骨細胞、間葉性幹細胞、骨髄間質細胞、および軟骨膜細胞(perichondrocyte)が含まれる。Robinsonら、「Methods in Cartilage Research」、(London:Academic Press、1990年)pp. 327〜30；Bentlyら、「Nature」、(1971年)230:385〜88；Itayら、「Clin. Orthop. Relat. Res.」、(1987年)220:284〜301；Wakitaniら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1989年)71-B:74〜80；Butnariu-Ephratら、Clin. Orthop. Relat. Res.(1996年)330:234〜43；Martinら、「J. Orthop. Res.」、(1997)16:181〜89)；Wakitaniら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1994年)76-A(4): 579〜92)；Chuら、「J. Biomed. Mater. Res.」、(1995年)29:1147〜54を参照のこと。

生体材料の選択はまた、軟骨修復におけるこうした組織工学方法の成功に重要である。生体分解性および非生体分解性の、天然に存在するおよび合成の、様々な生体材料が、軟骨修復のための潜在的な細胞輸送物質として使用された。Grandeら、「J. Biomed. Mater. Res」(1997年)34:211〜20を参照のこと。天然に存在する生体材料には、足場基質、ゲル、またはコラーゲン/アルギン酸塩複合ゲルの形の様々な形のI型およびII型コラーゲンベースの生体材料が含まれる。Speerら、「Clin. Orthop. Relat. Res.」、(1979年)144:326〜35；Samsら、「OA. Cartilage」、(1995年)3:47〜59；Frenkelら、「J. Bone Jt. Surg.」、(1997年)79-B:831〜36；Nehrerら、「J. Biomed. Mater. Res.」、(1997年)38:95〜104；Kangら、「OA. Cartilage」、(1997年)5:139〜43；Kimuraら、「Clin. Orthop. Relat. Res.」、(1984年)186:231〜39；Qiら、「J. Orthop. Res.」、(1997年)15(4): 483〜90。合成ポリマーベースの生体材料には、ポリグリコール酸(PGA)およびポリL-乳酸(PLLA)、またはそれらの複合混合物が含まれる。軟骨組織工学では、PGA、PLLA、およびPGA/PLLAコポリマーは、in vitroおよびin vivoで軟骨細胞を送達する足場としてのそれらの有効性について研究されている。Freedら、「J. Biomed. Mater. Res.」(1994年)28:891〜99、Wooら、「Plastic Reconstr. Surg.」(1994年)94(2): 233〜37；Athanasiouら、「Biomaterials」(1996年)17:93〜102を参照のこと。数人の研究者はまた、いくつかの生物分解性でないポリマー物質(例えばポリ四フッ化エチレン、ポリエチルメタクリレート、およびヒドロキシアパタイト/ダクロン・コンポジット)も、関節の表面の復元を容易にするということを発見した。Reissesら、「Transactions of the Orthopaedics Research Society」、(New Orleans、LA、1994年)；Messnerら、「Biomaterials」、(1993年)14:513〜21。理想的な細胞輸送物質は、関節軟骨基質において天然に存在する環境に最も良く似
ているものである。

II型コラーゲンおよびグリコサミノグリカン(GAG)などの軟骨特有の細胞外基質成分は、in vitroおよびin vivoでの、軟骨細胞の表現型の発現の調節、ならびに軟骨形成の支持において、重要な役割を果たす可能性があることが示されている。Kosherら、「Dev. Biol.」、(1973年)35(2): 210〜20；Kosherら、「Nature」、(1975年)258:327〜30を参照のこと。そうでなければ、軟骨細胞は、退行分化を受けて、タイプIコラーゲンが豊富な質の悪い線維軟骨基質を産生する可能性がある。その後、この質の悪い基質は、ガラス軟骨を形成しないこととなる可能性がある。von Der Markら、「Nature」、(1977年)267:531〜32；Sokoloffら、「J. Rheumatol.」(1974年)1:1〜10を参照のこと。このように、軟骨組織工学において、生体材料を選択するための基準には、生物学的適合性および生体力学的強さが含まれる。これらの特徴は、欠損部位に持続性のガラス軟骨を再生するように設計された細胞に必要な、生化学的および生物力学的に適切な環境を提供できる。Langerら、「Transactions of the 44th ORS」、(New Orleans、1998年)を参照のこと。

軟骨形成を誘導する増殖因子の特定は、組織工学プロセスにとっても重要である。多くの成育因子が、軟骨発達、リモデリング、または修復を調節する役割を果たすことが判明している。例えば、内因性増殖因子TGFベータおよび様々なBMPファミリーメンバーが、新規の軟骨および骨生成を誘導することは、以前に示されている。しかし、軟骨の形成を誘導する特有の信号は、これまで分かっていなかった。

組織損傷の後の上皮組織(例えば気管の組織)の回復は、細胞外基質の沈着、組織のリモデリング、および血管形成を含めて、いくつかの重要な事象を含む、複雑なプロセスである。これらの事象は、上皮細胞の移動および増殖と協調して、上皮および/または粘膜の(すなわち、粘液を分泌する気管上皮などの上皮組織における)バリアを回復させる。これらの事象の協調は、異なるクラスの細胞間の相互作用、ならびに細胞とその細胞外基質との間の相互作用を含むと考えられている。2002年10月15日に発行された米国特許第6,465,205号(Hicks)を参照のこと。

気管の修復のための現在の方法は、傷ついた気道の切除および再吻合、合成材料による損傷を受けた部分の置換、ならびに気管欠損部の再構築のための自己由来の組織の使用を含む。Letangら、「Experimental Reconstruction of the Canine Trachea with a Free Revascularized Small Bowel Graft」、「Ann. Thorac. Surg.」、(1990)49:955〜58；Mullikenら、「The Limits of Tracheal Resection with Primary Anastomosis: Further Anatomical Studies in Man」、「J. Thorac. Cardiovasc. Surg.」、(1968年)55:418、(要約)、Nevilleら、「Prosthetic Reconstruction of the Trachea and Carina」、「J. Thorac. Cardiovasc. Surg.」、(1976年)72:525〜36を参照のこと。近年では、組織工学方法は、こうした修復(予め形成された合成の構築物に、分離した軟骨細胞を注入することによって、in vivoの気管の軟骨の足場を形成することを含む)に使用されている。Hiranoら、「Hydroxylapatite for Laryngotracheal Framework Construction」、「Ann. Otol. Rhinol. Laryngol.」、(1989年)98:713-17；Okumuraら、「Experimental Study of a New Tracheal Prosthesis Made from Collagen Grafted Mesh」、「Trans. Am. Soc. Artif. Organs.」、(1991年)37:M317〜19」；Langerら、「Tissue Engineering」、「Science」、(1993年)260:920〜26を参照のこと。

しかし、軟骨を産生するための、また、関節、目、および鼻、ならびに特に、様々な連結する(connecting)気道(気管、気管支、肺、および喉頭など)の軟骨組織を含めた様々な軟骨組織に生じる様々な異常または損傷を治療するための治療法が、依然として必要であ
る。特に、こうした軟骨組織に生じる異常または損傷に対する有効な軟骨産生、修復、および再構築技術を開発する必要性がある。

本発明は、線維芽細胞増殖因子(FGF)-18タンパク質が、軟骨形成を誘導することが可能であるという発見、ならびに、様々な軟骨組織の産生、修復、再構築、新規の形成または他の形成を含めた様々な目的のための、FGE-18タンパク質をコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)の使用に関する。特に、FGF-18の選択的な調節は、誘導気道における気管-気管支軟骨組織形成を含めて、組織の発達中の軟骨プログラミングを誘導できる。FGF-18タンパク質およびその受容体およびシグナル伝達経路を使用して、体の様々な部位(誘導気道の気管-気管支環および喉頭、ならびに角膜、鼻、耳、肋骨、胸骨、関節、および骨などの、軟骨沈着が治療的となるあるいは有益となるであろう他の部位を含む)における、新規の軟骨形成を誘導する、あるいは軟骨増殖を拡大することができる。FGF-18が有用である治療法は、例えば、先天的または病理学的な気管-気管支の異常によって引き起こされる、気管、気管支、肺、および喉頭などの誘導気道における様々な組織の修復および再構築を含む。FGF-18が有用となるであろう他の治療法は、他の軟骨組織(例えば、関節における関節炎および半月板異常によって引き起こされる関節および骨格組織のものなど)を含む。

FGF-18が、軟骨形成およびその後の軟骨の形成をもたらす間葉系細胞に、適切な誘導信号を提供することが判明している。例えば、経肺上皮細胞におけるFGF-18の異所性発現を伴うマウスは、再現可能な(reproducible)異所性軟骨形成、および肺における正常な気管支部位での軟骨の拡大を有する。肺の異所性領域におけるアルシアンブルー染色によって、また、II型コラーゲン(すなわち初期の軟骨分化および拡大のマーカー)に対する免疫組織化学的染色によって、これらの軟骨細胞は、組織学的に示されている。対照的に、FGF-7またはFGF-10の異所性発現は、FGF-18の異所性発現を伴うマウスに観察される軟骨の変化を再現(reproduce)しないので、新規の軟骨形成を誘導するあるいは軟骨増殖を拡大するための軟骨形成プロセスにおける、FGF-18シグナル伝達の特有の役割が実証される。

本発明はさらに、ある種の下流の標的遺伝子およびそのそれぞれの発現タンパク質が、単独で、あるいはFGF-18と共同で、軟骨形成を誘導するあるいは増強することができるという発見に関する。これらの下流の標的遺伝子およびそれぞれの発現タンパク質は、ソニックヘッジホッグ(Shh)、Shhタンパク質、β-カテニン、β-カテニンタンパク質、およびβ-カテニンを刺激するWntファミリーのタンパク質である。

本発明の一実施形態は、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を、軟骨形成を誘導するのに有効な量で含む医薬組成物に関する。

本発明の別の実施形態は、こうした治療を必要としている患者の患部において、軟骨形成を誘導するための方法であって、前記患部において軟骨形成を誘導するのに有効な量の、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を含有する医薬組成物を、患部に投与するステップを含む方法に関する。

本発明の別の実施形態は、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。

本発明の別の実施形態は、in vitroの細胞においてFGF-18タンパク質を発現させる方法
であって、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供するステップを含む方法に関する。

本発明の別の実施形態は、患部に、軟骨の再生、修復、再構築、新規の形成、または他の軟骨形成を必要とする患者を治療するための方法であって、細胞内に軟骨を形成するための、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、患部に導入するステップを含む方法に関する。

本発明の別の実施形態は、患部に、軟骨の再生、修復、再構築、新規の形成、または他の軟骨形成を必要とする患者を治療するための方法であって、FGF-18、Shh、β-カテニンおよびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を、軟骨の形成を誘導するのに有効な量で、患部に導入するステップを含む方法に関する。

本発明の別の実施形態は、細胞増殖を持続させることが可能な培地に入れた細胞を含む細胞培養物であって、前記細胞が、その中に、細胞内に軟骨を形成するための、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入している細胞培養物に関する。

本発明の別の実施形態は、(a)FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質の存在下で軟骨を産生することが可能な細胞;ならびに(b)軟骨の形成を誘導するための量の少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を含有する、細胞増殖を持続させることが可能な培地;を含む細胞培養物に関する。

本発明の別の実施形態は、細胞増殖を持続させることが可能な培地中の細胞において、in vitroで軟骨形成を誘導するための細胞培養株を調製するための方法であって、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、細胞に導入するステップを含む方法に関する。

本発明の別の実施形態は、(a)細胞増殖を持続させることが可能な培地中の第一グループの細胞；および(b)第一グループの細胞とタイプが異なり、第一グループの細胞と同時培養される第二グループの細胞(ただし、第二グループの細胞は、軟骨の形成を誘導するためのFGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、その中に導入されている)；を含む細胞培養物に関する:
本発明の別の実施形態は、患部に、軟骨の再生、修復、再構築、新規の形成、または他の軟骨形成を必要とする患者を治療するための方法であって、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を、前記患部において軟骨の形成を誘導するのに有効な量で、患部に投与するステップを含む方法に関する。

(配列リストの簡単な説明)
配列番号:1は、FGF-18(ハツカネズミ)のcDNAのヌクレオチド配列を示す。

配列番号:2は、FGF-18タンパク質(ハツカネズミ)のアミノ酸配列を示す。

配列番号:3は、FGF-18(ヒト)のcDNAのヌクレオチド配列を示す。

配列番号:4は、FGF-18タンパク質(ヒト)のアミノ酸配列を示す。

配列番号:5は、Shh(ハツカネズミ)のcDNAのヌクレオチド配列を示す。

配列番号:6は、Shhタンパク質(ハツカネズミ)のアミノ酸配列を示す。

配列番号:7は、β-カテニン(ハツカネズミ)のcDNAのヌクレオチド配列を示す。

配列番号:8は、β-カテニンタンパク質(ハツカネズミ)のアミノ酸配列を示す。

配列番号:9は、Wnt1(ハツカネズミ)のcDNAのヌクレオチド配列を示す。

配列番号:10は、Wnt1タンパク質(ハツカネズミ)のアミノ酸配列を示す。

配列番号:11は、Wnt6(ハツカネズミ)のcDNAのヌクレオチド配列を示す。

配列番号:12は、Wnt6タンパク質(ハツカネズミ)のアミノ酸配列を示す。

配列番号:13は、Wnt7b(ハツカネズミ)のcDNAのヌクレオチド配列を示す。

配列番号:14は、Wnt7bタンパク質(ハツカネズミ)のアミノ酸配列を示す。

1. 定義
本明細書では、用語「多能性の(pluripotent)」は、非常に様々な成熟細胞型に分化する、細胞の能力を指す。用語「多分化能(multipotent)」は、多能性の細胞よりも多様性が限定された成熟細胞型に分化する、細胞の能力を指す。

本明細書では、用語「幹細胞」は、任意の多能性の細胞型を指し、これは、胚または成体組織から誘導することができる。

本明細書では、用語「自己由来の」は、移植のための供給源としてのレシピエントまたは患者自身の、細胞または組織の使用を指す。対照的に、用語「異種の」は、別のヒトまたは種から移植される細胞または組織を指す。

本明細書では、用語「体細胞の」は、配偶子(すなわち精子および卵子)を産生する細胞である生殖細胞に起因するもの以外の細胞を指す。

本明細書では、用語「軟骨組織」は、軟骨の組織学的および組成上の特性を示す、軟骨細胞および軟骨細胞により形成される組織を指す。

本明細書では、用語「遺伝子」は、ポリペプチド(例えばタンパク質)をコードする情報を運ぶ一連の遺伝物質(例えばDNAおよびRNA)を意味する。

本明細書では、別段の指示がない限り、用語「ポリペプチド」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを意味する。

本明細書では、用語「ベクター」は、核酸配列(1つまたは複数)を細胞に導入し、細胞に核酸配列(1つまたは複数)の発現をもたらすことが可能な、DNAまたはRNA分子を含む、あるいは本質的にこれらからなる、あるいはこれらからなる作用因子を意味する。その例は、それだけには限らないが、遺伝子またはcDNAを、適切な宿主細胞に運び、そこで、コードされたポリペプチドの発現または合成を導く、改変されたプラスミドまたはウイルスが含まれる。

本明細書では、用語「FGF-18」および「FGF-18タンパク質」は、線維芽細胞増殖因子-18、すなわち軟骨の形成を誘導することが可能であるポリペプチド(FGF-18タンパク質)を指す。FGF-18タンパク質(ハツカネズミ)が、配列番号:2およびGenBank受入番号AB004639に示されるアミノ酸配列を有するのに対し、FGF-18タンパク質(ヒト)は、配列番号:4およびGenBank受入番号AB007422に示されるアミノ酸配列を有する。Ohbayashiら、「Structure and Expression of the mRNA Encoding a Novel Fibroblast Growth Factor, FGF-18」、「J. Biol. Chem.」、(1998年)273(29): 18161〜64(これを参照により組み込む)を参照のこと。配列番号:2のアミノ酸配列は、GenBankファイルAF075291の配列と同一であり、コード配列に対して5'および3'に位置する翻訳されない隣接ヌクレオチド配列を含む。Huら、「FGF-18, A Novel Member of the Fibroblast Growth Factor Family, Stimulates Hepatic and Intestinal Proliferation」、「Mol. Cell. Biol.」、(1998年)18(10): 6063〜74(これを参照により組み込む)を参照のこと。

本明細書では、用語「FGF-18をコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」または「FGF-18タンパク質をコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」は、生理活性のあるFGF-18タンパク質のポリペプチドアミノ酸配列をコードするFGF-18遺伝子の一部を指す。FGF-18(ハツカネズミ)のcDNAが、配列番号:1に示されるヌクレオチド配列を有し、GenBank受入番号NM_008005およびAF075291を有するのに対し、FGF-18(ヒト)のcDNAは、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列を有し、GenBank受入番号NM_033649、NM_003862、およびAF075292を有する。Ohbayashiら、「Structure and Expression of the mRNA Encoding
a Novel Fibroblast Growth Factor, FGF-18」、「J. Biol. Chem.」、(1998年)273(29): 18161〜64(これを参照により組み込む)を参照のこと。GenBank配列ファイルNM_008005は、AB004639と同一であるFGF-18のコード配列、ならびに5'および3'隣接配列を含む。Huら、「FGF-18, A Novel Member of the Fibroblast Growth Factor Family, Stimulates Hepatic and Intestinal Proliferation」、「Mol. Cell. Biol.」、(1998年)18(10): 6063〜74(これを参照により組み込む)を参照のこと。

本明細書では、用語「Shh」および「Shhタンパク質」はソニックヘッジホッグ(Shh)タンパク質、すなわち、正常な気管-気管支の軟骨形成に必要であると判明している、呼吸上皮により分泌されるポリペプチドを指す。Shhタンパク質(ハツカネズミ)は、配列番号:6およびGenBank受入番号NM_009170に示されるアミノ酸配列を有する。

本明細書では、用語「Shhをコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」または「Shhタンパク質をコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」は、生理活性のあるShhタンパク質のポリペプチドアミノ酸配列をコードするShh遺伝子の一部を指す。Shh(ハツカネズミ)のcDNAは、配列番号:5に示されるヌクレオチド配列を有し、GenBank受入番号NM_009170を有する。

本明細書では、用語「β-カテニン」および「β-カテニンタンパク質」は、(それが、Wntファミリーのポリペプチドの分泌されたタンパク質に反応して遺伝子発現を調節する場所で)標的細胞の核に転位置する、細胞のタンパク質を指す。β-カテニンタンパク質(ハツカネズミ)は、配列番号:8およびGenBank受入番号NM_007614に示されるアミノ酸配列を有する。

本明細書では、用語「β-カテニンをコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」または「β-カテニンタンパク質をコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」は、生理活性のあるβ-カテニンタンパク質のポリペプチドアミノ酸配列をコードするβ-カテニン遺伝子の一部を指す。β-カテニン(ハツカネズミ)のcDNAは、配列番号:7に示されるヌクレオチド配列を有し、GenBank受入番号NM_007614を有する。

本明細書では、用語「Wnt」および「Wntタンパク質」は、呼吸上皮細胞に発現されるβ-カテニンを介して、呼吸上皮細胞(これは、相互的に、潜在的な気管-気管支前駆体における軟骨形成およびパターン形成を誘導する)において信号の産生を誘導するポリペプチドのファミリーを指す。Wntタンパク質の代表例には、Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt5、Wnt6、およびWnt7bが含まれる。Wnt1、Wnt6、およびWnt7bタンパク質(ハツカネズミ)は、それぞれ、配列番号:10、配列番号:12、および配列番号:14、ならびにそれぞれGenBank受入番号NM_021279、NM_009526、およびNM_009528に示されるアミノ酸配列を有する。

本明細書では、用語「Wntをコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」または「Wntタンパク質をコードするヌクレオチド配列(1つまたは複数)」は、生理活性Wntタンパク質のポリペプチドアミノ酸配列をコードするWnt遺伝子の一部を指す。Wnt1、Wnt6、およびWnt7b(ハツカネズミ)のcDNAは、それぞれ、配列番号:9、配列番号:11、および配列番号:13、ならびにそれぞれGenBank受入番号NM_021279、NM_009526、およびNM_009528に示されるヌクレオチド配列を有する。

本明細書では、用語「遺伝子プロモーター」は、特定の遺伝子による発現を調節、制御、または変調する(例えば、刺激するあるいは抑制する)遺伝子のヌクレオチド配列の一部を指す。例えば、遺伝子プロモーターは、遺伝子の転写および/または翻訳を増強し、それによって、その遺伝子から転写されるmRNAレベルを増大できる。

本明細書では、用語「調節エレメント」は、導入遺伝子または他の哺乳類の遺伝子から転写されるmRNAのプロセッシングに必要とされる配列を指す。こうしたエレメントは、当業者にはよく知られており、それだけには限らないが、エンハンサー、イントロン、およびポリA配列が含まれる。

本明細書では、用語「遺伝子発現」は、遺伝子のポリペプチド生成物の生成をもたらすDNA分子のレベルでのステップを指す。したがって、遺伝子発現は、本明細書では、発現されると、遺伝子によってコードされるポリペプチドの生成がもたらされることと理解されるべきである。

本明細書では、用語「哺乳類」は、霊長類(例えばヒト、サル、ヒヒ、マカク)、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、スナネズミ、ハムスター、マウス、ウマ、ウシ、ヤギ、および一般に哺乳類として知られている他の種を含めた、ヒトおよびヒト以外の哺乳類を指す。

本明細書では、用語「意図されるレシピエント」は、軟骨または軟骨組織(1種または複数)の治療的回復または産生を必要とする患者または個人を含むものである。

本明細書では、用語「患者の患部」は、軟骨形成を誘導するための治療を必要としている患者の部分(例えば、関節、鼻、耳、目、気管など)、または、本発明に従って治療される場合に、軟骨形成を誘導することが可能な、それに近接する部分を意味する
本明細書では、用語「含む」は、様々な薬剤、組成物、化合物、遺伝子、ポリペプチド、成分、ステップなどが、本発明において、共同で使用できることを意味する。したがって、用語「含む」は、より限定的な用語「本質的に〜からなる」および「〜からなる」を
包含する。

本明細書では、用語「治療薬」、「医薬品」、および「薬物」は、in vitroまたはin vivoで軟骨形成を誘導するために細胞または組織に投与するのに有用なものを含めて、薬理学的な組成物、調合物、または化合物を指すために、同義的に使用される。

本明細書では、用語「医薬的に許容される塩」は、通常、適切な有機または無機塩基と遊離酸とを反応させることにより調製される化合物の、非毒性の塩を意味し、それだけには限らないが、以下が含まれる：酢酸塩、ベンゼンスルホナート、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、カルシウム、カンシラート、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、ジヒドロクロリド、エデト酸塩、エジシラート、エストレート、エシラート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコナート、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、ムケイト(mucate)、ナプシル酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、パルミタート、パントテン酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、ポリガラクツロ酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシラート、トリエチオダイドおよび吉草酸塩、ならびにこれらの塩の混合物。

本明細書では、用語「E0.5」は、妊娠期間の胎生日齢0.5を指す。同様に、用語「E18.5」は、妊娠期間の胎生日齢18.5を指し、胚発生中のすべての時点は、同様に言及される。

本明細書では、用語「免疫染色される」は、タンパク質が、当該のタンパク質に結合する標識された抗体を使用して、組織切片の細胞内で視覚化される技術を指す。

以下の遺伝子名について、以下の省略形を本明細書において使用する:SHH-N(ソニックヘッジホッグの生物学的に活性なN末端フラグメント)、CCSP(クララ細胞分泌タンパク)、Vegf4(脈管内皮増殖因子-4)、PECAM(血小板内皮細胞接着分子)、CRE(Creレコンビナーゼ)、FOXJ1(フォークヘッドボックス転写因子-J1)、α-SMA(α-平滑筋ミオシン)、TTF1(甲状腺転写因子-1)、CGRP(カルシトニン遺伝子関連ペプチド)、αPH3(α-ホスホヒストンH3)、Hhip(ヘッジホッグ相互作用性タンパク質1)、Ptch(Patched-1)、Tnc(テネイシンC)、Myh11(ミオシン重鎖11)、Srfpc(血清応答因子コファクタータンパク質)、Cnn1(カルポニン1)、Gli(GLI-KruppelファミリーメンバーGli 1)、およびTrpc2(ミオシン軽ポリペプチド9)。

本明細書で用いる量、部、比およびパーセントはすべて、特に明記しない限り、重量による。

2. 軟骨形成を誘導または刺激するための方法
本発明の一態様は、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質(特にFGF-18タンパク質)からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を、単独で、あるいは、軟骨形成の誘導または刺激を増強するためのShh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の標的遺伝子タンパク質と組み合わせて使用することを介して、軟骨形成を誘導または刺激するための方法である。これらの方法では、軟骨形成誘導タンパク質(例えば、FGF-18)は、こうした治療法を必要としている患者において、治療的に有用な軟骨産生細胞および/または軟骨の形成を誘導または促進するために、in vivoで投与できる。あるいは、こうした治療法を必要としている患者の患部(例えば、関節、鼻、耳、目、気管など)に形成される軟骨または軟骨産生細胞の、(
例えば、埋め込み、移植、または他の移入方法による)その後の導入と共に、こうした軟骨形成をin vitroで誘導するために細胞または組織に投与できる。あるいは、導入された軟骨のその後の形成のためにこうした治療法を必要としている患者の患部(例えば関節、鼻、耳、目、気管など)への、in situでの誘導細胞または組織の、(例えば、埋め込み、移植、または他の移入方法による)その後の導入と共に、こうした軟骨形成を誘導することが可能な細胞または組織に、in vitroで投与できる。

この方法の様々な実施形態を実施する際、軟骨形成誘導タンパク質は、軟骨細胞の運命をゆだねることが可能な細胞に投与される。この型の適切な細胞には、それだけには限らないが、未成熟または成熟した軟骨細胞、間葉系細胞、神経幹細胞および骨髄間質細胞などの成人幹細胞、胚幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞および他の多能性または多分化能の細胞型が含まれる。多分化能の細胞型に脱分化するように誘導できる他の体細胞も、使用できる。これらの細胞型への軟骨形成誘導タンパク質の投与は、軟骨細胞の表現型の分化および成熟を促進する。このように形成された軟骨細胞は、コラーゲン基質タンパク質を合成および分泌することができ、in vitroまたはin vivoで軟骨構造物を形成できる。

この方法の一実施例では、in vitroでの軟骨の形成は、培養された未成熟のまたは成熟した軟骨細胞、間葉系細胞、神経幹細胞および骨髄間質細胞などの成人幹細胞、胚幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、ならびに他の多能性または多分化能の細胞型への、軟骨形成誘導タンパク質の投与によって得られる。所望の形状またはサイズの軟骨構造物の形成を促進するために、足場または基質材料を使用できる。天然の足場または基質は、意図されるレシピエントまたは患者における供与部位から、あるいは他のヒト供与者を含めた異種の供与源から、あるいは動物源(例えばブタ、イヌ、げっ歯類または他の適切な哺乳類の種)から切除される軟骨によって提供できる。足場または基質材料の人工供給源には、それだけには限らないが、ポリグリコール酸(PGA)およびポリL-乳酸(PLLA)またはそれらの複合混合物、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチルメタクリレート、またはヒドロキシアパタイト/ダクロン複合体などの生体分解性および非生体分解性の合成ポリマーベースの生体材料が含まれる。Suhら、「Application of Chitosan-based Polysaccharide Biomaterials in Cartilage Tissue Engineering: A Review」、「Biomaterials」、(2000)21:2589〜98；Freedら、「J. Biomed. Mater. Res.」、(1994年)28:891〜99；Wooら、「Plastic. Reconstr. Surg.」、(1994年)94(2): 233〜37、Athanasiouら、「Biomaterials」、(1996)17:93〜102；Reissesら、Transactions of the Orthopaedics Research Society、(New Orleans、LA、1994年)；Messnerら、「Biomaterials」、(1993年)14:513〜21(これらを参照により組み込む)を参照のこと。足場または基質材料は、軟骨細胞に分化するように誘導できる細胞を含有する培養容器に入れることができる。

軟骨形成誘導タンパク質は、培地に加えられる溶液に入れて、in vivoで細胞に投与することができる。あるいは、足場または基質材料に、含浸または結合させる、あるいは、足場または基質材料内またはその上の、培養容器に入れることができるビーズまたは他の粒子に付着させることができる。あるいは、軟骨形成誘導タンパク質は、それぞれの(例えば、FGF-18)遺伝子の内因性発現を介して、または、遺伝子導入から得られるそれぞれの遺伝子の、培養細胞への感染によって、培養株中の細胞によって産生できる。遺伝子導入は、それだけには限らないが、哺乳動物細胞を形質導入することが可能なレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連、または他のウイルス配列を含めて、ウイルスベクター内に含有されるプロモーターおよび調節エレメントおよび軟骨形成誘導タンパク質コードする配列を含む機能的な導入遺伝子の導入によって達成できる。遺伝子導入はまた、リポソームまたは他のキャリアまたは力学的な送達システムによって、仲介させることもできる。

この方法の別の実施例では、細胞を、足場または基質材料上ではなく、シートに増殖させる。同様の様式の軟骨形成誘導タンパク質投与を、培養された未成熟または成熟した軟骨細胞、間葉系細胞、神経幹細胞および骨髄間質細胞などの成人幹細胞、胚幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞に提供することができ、他の多能性または多分化能の細胞型も、成熟した軟骨細胞の分化を促進することとなる。これらの細胞は、軟骨産生細胞の融合シート(confluent sheet)において増殖および分化させることができる。このように産生された分化細胞のシートを、その後採取し、意図されるレシピエントにおいて、軟骨形成が所望される患部に導入できる。軟骨形成誘導タンパク質の投与はまた、移植された細胞の軟骨細胞の表現型を維持するための治療法の一部として含まれる可能性もある。局所的な投与は、軟骨形成誘導タンパク質でコートまたは含浸されたビーズまたは他の粒子を使用して、あるいは、ビーズまたは粒子と共有結合的または別の方法で機能的に結合または連結された軟骨形成誘導タンパク質を用いて、達成することができる。これらのビーズまたは粒子は、PGA、PLLA、またはそれらの複合混合物、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチルメタクリレート、またはヒドロキシアパタイト/ダクロン複合体を含めた合成ポリマーベースの生体材料を含めて、生体分解性のまたは非生体分解性の材料で作ることができる。それだけには限らないがステンレス鋼または貴金属(それだけには限らないが金を含む)を含めて、非腐食性の金属もまた、軟骨形成誘導タンパク質が、共有結合的にまたは別の方法で結合または連結されたビーズまたは他の粒子として使用されることができる。軟骨形成誘導タンパク質の定量投与はまた、ミニポンプの埋め込みによって管理することができ、その結果、その流出により、軟骨形成が所望される領域へのFGF-18タンパク質の適用が可能になる。

この方法の他の実施形態は、こうした治療法または治療を必要とする患者内の所望の患部におけるin situでの、あるいは、その後望ましい部位に導入される(例えば、移植される)意図されるレシピエント内の異所性部位における、あるいはヒトまたはヒト以外の宿主/供与者における、軟骨または軟骨組織のin vivoでの形成を含む。軟骨のin vivoでの形成は、軟骨を形成するコラーゲン基質材料を産生することが可能な細胞に軟骨形成誘導タンパク質を送達することによる軟骨増殖が所望される場所で、in situ誘導できる。内因性細胞が、コラーゲン基質材料を産生することが可能である場合に、軟骨形成誘導タンパク質を、軟骨形成が所望される場所に投与できる。局所的な投与は、軟骨形成誘導タンパク質で、または上で述べた通りの、ビーズまたは粒子に共有結合的にまたは別の方法で機能的に結合または連結された軟骨形成誘導タンパク質で、コートまたは含浸されたビーズまたは他の粒子を使用して達成することができる。足場または支持基質が、軟骨構造物の形成を導くために所望される別の実施例では、軟骨形成誘導タンパク質は、足場または基質の上または中にコートまたは含浸させる、あるいは、共有結合的にまたは別の方法で足場または基質に結合または連結させることができる。あるいは、軟骨形成誘導タンパク質は、足場または基質埋め込みの領域の周囲の内因性細胞への遺伝子導入(前述した通り)によって得られるそれぞれの遺伝子の発現を介して投与できる。

内因性細胞が、コラーゲン基質材料を産生できない場所でのこの方法の別の実施例では、軟骨形成誘導タンパク質の投与は、軟骨形成が望まれる部位への、未成熟または成熟した軟骨細胞、間葉系細胞、神経幹細胞および骨髄間質細胞などの成人幹細胞、胚幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、あるいは他の多能性または多分化能の細胞型の移植を伴う可能性がある。これらの細胞は、自己由来の供与物として、意図されるレシピエントまたは患者から得ることができる、あるいは、他のヒト供与者、培養細胞(未成熟のまたは成熟した軟骨細胞、間葉系細胞、神経幹細胞および骨髄間質細胞などの成人幹細胞、胚幹細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、および他の多能性または多分化能の細胞型など)を含めた異種の供与源から、あるいは動物源(ブタ、イヌ、げっ歯類、または他の適切な哺乳類の種など)から得ることができる。

この方法のさらに別の実施形態では、軟骨形成誘導タンパク質は、遺伝子導入(移植の前に遺伝子導入(前述した通り)を行う)を介する細胞によって得られるそれぞれの導入遺伝子の発現を介して投与できる。軟骨形成誘導タンパク質遺伝子を含有するベクターを用いて形質導入された細胞を、選択的に培養し、軟骨形成が所望される部位に移植する。適切な細胞には、形質導入可能な形質転換されていない哺乳類の任意の細胞型が含まれるが、意図されるレシピエントまたは患者から採取された一次細胞が、好ましい。形質導入可能な細胞型には、それだけには限らないが、繊維芽細胞、骨芽細胞、骨髄間質細胞、神経幹細胞、または筋芽細胞などの細胞が含まれる。異種の供与者からの同様の細胞型もまた、使用できる。

軟骨のin vivoでの形成を、in situ誘導することができない場合、あるいは、軟骨の新規の増殖が所望される場所では、軟骨組織または構造物は、異所性領域で増殖させることができ、望ましい部位(1つまたは複数)に移植できる。こうした異所性領域は、意図されるレシピエントまたは患者の内部に位置する可能性があり、内因性軟骨の領域である見込みが最も高い。こうした領域の例には、それだけには限らないが、胸骨、肋骨、骨盤、耳、および鼻の軟骨の領域が含まれる。足場または基質材料は、天然に存在する軟骨の適切な領域に埋め込むことができ、軟骨形成誘導タンパク質は、望ましい形状またはサイズの軟骨構造物を産生するために、局所的な軟骨細胞を補充するために投与される。天然の足場または基質材料は、意図されるレシピエントまたは患者における異所性供与部位から、または他のヒト供与者を含めた異種の供与源から、または動物源(ブタ、イヌ、げっ歯類、または他の適切な哺乳類の種など)から切除された軟骨によって提供できる。足場または基質材料のための人工供給源は、前述した通りの、所望のサイズおよび形状の軟骨または軟骨の構造物の形成を誘導するための、足場または基質材料でコート、含浸された、あるいはそれに共有結合的にまたは別の方法で結合または連結させた軟骨形成誘導タンパク質と共に、それだけには限らないが、上で述べた生体分解性および非生体分解性の合成ポリマーベースの生体材料を含むことができる。軟骨形成誘導タンパク質の定量投与はまた、前述した通りのミニポンプの埋め込みによって、あるいは、前述したように通りの遺伝子導入によって得られるそれぞれの遺伝子の発現を介して管理することができる。このように形成された軟骨または軟骨の構造物を、外科的に切除し、その後、意図されるレシピエントまたは患者における所望の部位に埋め込みまたは移植することができる。あるいは、これらの軟骨または軟骨の構造物は、他のヒト、または動物(ブタ、イヌ、げっ歯類、または他の適切な哺乳類の種など)を含めて、意図されるレシピエントまたは患者以外の宿主/供与者にも、同様の方式で産生させることができる。このように形成された軟骨または軟骨の構造物を、その後外科的に切除し、意図されるレシピエントまたは患者における所望の部位に移植することもできる。

この方法の実施形態は、こうした組織が通常形成されず、かつ軟骨の治癒において適用される状況(例えば、患者(ヒトまたはその他)の患部における関節軟骨の断裂、奇形、および他の軟骨欠損)下で、軟骨組織または他の組織形成を誘導するために、軟骨形成誘導タンパク質を使用できる。軟骨形成誘導タンパク質は、軟骨組織への損傷を予防する際の予防的使用のために、また、骨または他の組織への軟骨の改良された固定に、また、軟骨組織に対する修復欠損に使用するために使用できる。新規の軟骨組織形成は、先天的な軟骨欠損、あるいは外傷によって引き起こされる軟骨欠損、あるいは他の軟骨欠損の修復のための軟骨形成誘導タンパク質によって誘導することができ、これはまた、軟骨の付着または修復のための手術にも有用である。軟骨形成誘導タンパク質はまた、関節炎治療および他の軟骨疾患、ならびに軟骨組織を回復または再生させることが望ましい他の徴候にも有用である可能性がある。こうした徴候としては、関節軟骨(例えば膝、足関節、肩または肘などの、関節の軟骨)の損傷の再生または修復が挙げられるが、これに限定されるものではない。

軟骨形成誘導タンパク質は、関節軟骨に加えて、肋軟骨(例えば、肋骨と胸骨を連結する軟骨)、鼻の中隔、特に誘導気道(気管、気管支、肺、および喉頭など)に関する軟骨組織形成など、他の半透明の軟骨の治療に適している可能性がある。例えば、軟骨形成誘導タンパク質は、新規の軟骨形成を誘導する、あるいは、誘導気道の気管-気管支の環ならびに喉頭における軟骨増殖を拡大するために使用できる。軟骨形成誘導タンパク質はまた、耳および角膜などの患者の他の患部における問題の治療にも有用である可能性がある。

軟骨形成誘導タンパク質は、軟骨形成を刺激または誘導するのに有効な任意のレベルまたは量で、例えば、約0.1ηg/mlから約10μg/mlの範囲で使用できる。

3. 医薬組成物および梱包薬(Packaged Drug)
軟骨形成誘導タンパク質(例えば、FGF-18)は、先に述べた方法で使用するための医薬組成物または梱包薬として処方できる。医薬組成物は、治療有効量の軟骨形成誘導タンパク質と、場合によっては、医薬的に許容される担体を含む。梱包された薬物は、軟骨形成誘導タンパク質、場合によっては、医薬的に許容される担体、および薬物を投与または使用するための説明書を含む。一連の説明書は、紙に書かれていても印刷されていてもよいし、梱包薬に付随させて梱包してもよいし、(直接、あるいは例えばLAN、WAN、またはインターネットを介して、例えば遠隔サイトからダウンロードすることによって)ロードまたはインストールが可能な電子メディアまたはソフトウェア(例えばフロッピー（登録商標）ディスクまたはCD-ROMディスク)の形であってもよいし、コンピュータ、携帯情報端末(PDA)、または他の電子装置によって、読み込まれるものであってもよいし、被検者を治療するために、薬物を投与する方法に関する説明書を提供するための他のいかなる適切な方法であってもよい。

軟骨形成誘導タンパク質は、単独で投与されることもできるが、医薬調合物の一部として投与されることが好ましい。こうした調合物は、当業者に知られている医薬的に許容される担体、ならびに他の治療薬を含むことができる。本発明の調合物を、様々な医薬的に許容される形で、例えば、医薬的に許容される塩として投与できることも理解されたい。

本発明に従って投与される軟骨形成誘導タンパク質の適切な投薬量は、軟骨の形成の所望の場所および必要とされる軟骨の量に依存し、また、患者によって変わり得る。許容される量または最適の投薬量を決定することは、通常、本発明の用量および治療の、いずれかのリスクまたは有害な副作用に対する治療的利益のレベルを釣り合わせることを含むこととなる。「治療的に有効」である用量では、所望の効果が与えられる(すなわち、所望の場所に軟骨または軟骨組織の形成または拡大が誘導される)べきである。

本発明の医薬調合物はまた、軟骨形成誘導タンパク質に加えて、軟骨細胞の分化および/または軟骨形成の誘導にも役立つこととなるさらなる化合物および/または組成物を含むことができる。軟骨形成誘導タンパク質の、任意の追加の化合物に対する比は、個々の化合物それぞれの所望される用量に依存することとなる。好ましくは、該組成物は、医薬調合物が以下を含むような医薬的に許容される水溶液として投与される：(1)約0.001%から約10% 軟骨形成誘導タンパク質;(2)約10%から約99%の医薬的に許容される担体;および(3)約0.001%から約10%の任意の追加の化合物(1種または複数)。

軟骨形成誘導タンパク質の投与は、医薬的に許容される担体(1種または複数)および/または追加の化合物(1種または複数)の有無にかかわらず、所望のサイズおよび形状の軟骨または軟骨の構造物の形成を誘導するための、足場または基質材料でコートする、含浸する、あるいは共有結合または別の方法でこれに結合または連結させることを含めて、任意の適切な経路によるものであり得る。軟骨形成誘導タンパク質の定量投与はまた、前述した通りのミニポンプの埋め込みによって、あるいは、前述した通りの遺伝子導入によって
得られるそれぞれの遺伝子の発現を介して管理することができる。ミニポンプ投与に適した調合物には、水性および非水性の無菌の注射溶液(抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および調合物を意図されるレシピエントの体液と等張にする溶質を含有可能)、ならびに、水性および非水性の無菌の懸濁液(懸濁剤および増粘剤を含むことができる)が含まれる。該調合物は、単位投与または複数回投与用容器(例えば密閉されたアンプルおよびバイアル)に入れることができ、使用直前に注射用蒸留水などの滅菌液体担体を加えさえすればよいように、凍結乾燥できる。即時注射溶液および懸濁液は、先に述べた種類の、無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製できる。

4. BMPおよびTGFを使用することによって、軟骨増殖およびパターニングを増強すること
本発明の別の態様は、FGF-18などの軟骨形成誘導タンパク質によって、誘導または刺激される軟骨増殖およびパターン形成を増強するための、BMP-2およびBMP-4などの骨形成タンパク質(「BMP」)、TGF-β1、TGF-β2、およびTGF-β3などのトランスフォーミング増殖因子(「TGF」)またはそれらの組み合わせの使用に関する。1997年12月23日に発行された米国特許第5,700,774号(Hattersleyら)、および1999年5月11日に発行された米国特許第5,902,785号(Hattersleyら)(参照により本明細書に組み込む)を参照のこと。これらは、本明細書で使用するのに適したBMPおよびTGFを開示している。軟骨形成誘導タンパク質によって誘導または刺激された軟骨パターン形成および増殖は、同時または別々の用量のBMPおよび/またはTGFを、有効な量で、例えば、約0.1ηg/mlから約10μg/mlの範囲で投与することによって達成できる。

以下の例は、誘導気道において軟骨形成を誘導するための、FGF-18の能力を例示する。

A. 実験手順
1. トランスジェニックマウス
SP-C-rtTA導入遺伝子を持つパーマネント(permanent)トランスジェニックマウス系統を、5'をrtTA遺伝子構築物に配置させた、3.7kbのヒトSPCプロモーターからなるプラスミド構築物の卵母細胞注射の後、FVB/Nバックグラウンドで確立する。Clarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280: L705〜15；Tichelaarら、「J. Biol. Chem.」、(2000年)275:11858〜64；およびGlasserら、「Am. J. Physiol.」、(1991年)261: L349〜56を参照のこと。マウスFGF-18のcDNAを、(teto)₇CMVプロモーターとウシ成長ホルモン遺伝子の3'非翻訳領域の間に挿入させる。Clarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280: L705-15を参照のこと。rtTAおよび(teto)₇構築物は、Herman Bujard博士、ZMBH-Heidelbergによって提供される。Gossenら、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA」、(1992年)89:5547〜51を参照のこと。すべての創始細胞の子孫を、サザンブロットまたはPCR分析によってスクリーニングする。(teto)₇CMV-FGF-18導入遺伝子を伝染させたマウスを飼育して、SP-C-rtTAマウスにする。使用されるトランスジェニックSP-C-rtTA「活性化」系統は、飼育ケース中で3年を超える間安定である。異種接合および同型接合的(teto)₇CMV-FGF-18マウスは、生育可能であり、観察可能な異常は無い。SP-C-rtTA活性化マウスへの飼育に対して、(teto)₇CMV-FGF-18導入遺伝子(系統AおよびB)を持つ2つの別々の標的系統を選択する。両方の導入遺伝子の伝達は、代表的なメンデルの(Mendelian)遺伝パターンに従っていた。マウスはすべて、病原を含まない飼育ケースに維持される。ドキシサイクリン(0.5mg/ml)を、記載された時間、飲料水または固形飼料(25mg/g、Harlen Teklar、マディソン(Madison)、WI)に入れて投与する。ドキシサイクリンを含有する飲用液を、1週間につき3回交換したのに対して、固形飼料においては、ドキシサイクリンの活性は、安定である。Perlら、「Transgenic Res.」(2002年)11:21〜29を参照のこと。

2. RT-PCR
組織を、Tri-Zol(Life Technologies)でホモジナイズし、RNAを、製造者の仕様書に従って単離する。RNAを、cDNA合成の前に、DNA分解酵素で処理する。5μgのRNAを逆転写させ、次いで、ネズミのFGF-18、ならびに導入遺伝子特異的なFGF-18およびβ-アクチンmRNAについて、PCRによって分析する。マウスFGF-18に対する導入遺伝子特異的なプライマーを、(teto)₇CMV-FGF-18転写産物に対して設計し、増幅のために使用する。プライマーAは、CMV最小プロモーター(5'から3')AGA CGC CAT CCA CGC TGT TTTGに位置し、プライマーBは、FGF-18 cDNA(5'から3')CAG GAC TTG AAT GTG CTT CCC ACTGに位置する。FGF-18 mRNAを、β-アクチンについて、増幅されたものと比較する。FGF-18 mRNAはまた、PCR産物のスタンダードゲル分析を使用し、FGF-18コード配列内を増幅するように設計されたプライマーを使用して推定される。FGF-18、FGF-10、SHH、BMP-4、およびSprouty-2 mRNAはまた、プライマーおよび条件の最適化の後、肺cDNAのリアルタイムPCRによって決定される。種雌は、妊娠期間を通してドキシサイクリンを受け、E15で屠殺し、各子犬の肺からRNAを抽出する。cDNAを、逆転写によって調製し、プライマーを使用してSmart Cycler(登録商標)で分析し、β-アクチン、FGF-18、BMP-4、Sprouty-2、およびFGF-10を同定する。すべての結果を、β-アクチンに対して規準化する。

3. 組織学、免疫組織化学、および電子顕微鏡法
胎児の肺組織を得るために、種雌へのペントバルビタールの致死量の注射の後、子宮切開術によって、胎児を摘出する。胎児の胸部を切開し、組織を、4℃の4%パラホルムアルデヒドで固定する。出産後の動物から得られた肺を、同じ固定液を用いる気管カニューレを介して、25cmの水圧で膨張固定する。組織を、一晩固定し、PBSで洗浄し、アルコール系列で脱水し、パラフィンに包埋する。組織切片を、Clarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280:L705〜15およびTichelaarら、「J. Biol. Chem.」、(2000年)275:11858〜64に記載される方法を使用して、SPB、proSP-B、TTF-1、proSP-C、CCSP(クララ細胞分泌タンパク)、PECAM(末梢内皮細胞接着分子)、α-平滑筋アクチン、FOXJ1、およびプロコラーゲンIIに対して染色する。軟骨を、アルシアンブルーで染色し、残りの組織を、写真撮影の前にKOHに溶解した。電子顕微鏡法については、組織を、前述した通りに固定し、調製し、評価する。Clarkら、「Am. J. Physiol.」(2001年)280: L705〜15)を参照のこと。

4. in situハイブリダイゼーション
マウスFGF-18のmRNAの発現を、胎児および成体の肺(後者は、25cmの水圧の膨張固定の後)について、35S標識されたリボプローブを使用して、in situハイブリダイゼーションによって評価する。Clarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280: L705〜15を参照のこと。センスおよびアンチセンスFGF-18 RNAプローブを、PGEM32中で産生させる。組織を、50℃で一晩ハイブリッド形成させる。スライドは、Kodak NTB2エマルジョンでコートし、7〜14日間暴露させ、Kodak D19で現像する。マウスFGF-18、FGF-10、SHH、BMP-4、およびSprouty-2に対する全載in situハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン標識されたcDNAアンチセンスおよびセンスプローブによって実施する。全載in situハイブリダイゼーションは、その種雌が妊娠全体を通してドキシサイクリンを受けていた胎児の12日胚の肺に関して実施される。アンチセンスおよびセンスプローブは、標識としてジゴキシゲニン-UTPを用いて、転写ベクターから作られる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、アルカリホスファターゼに連結された抗ジゴキシゲニン抗体は、吸着される。生成物を、BM
purpleアルカリホスファターゼ基質を使用して顕色させる。

5. (teto)₇CMV-FGF-18マウス由来の肺組織のRNA分析
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびその後のデータ分析を、(teto)₇CMV-FGF-18マウスおよび対照の同腹仔由来の全肺RNAを使用して実施する。23RNAは、>50%(2.2から31.42倍)増大する(下の表1を参照のこと)。47RNAは、有意に減少する(下の表2を参照のこと)。これらの遺伝子は、FGF-18シグナル伝達経路の構成要素であり、FGF-18発現によって調節される。したがって、これらのリスト中の遺伝子(特に発現が増大されるもの)は
、軟骨の産生を調節できる遺伝子である。平均および標準誤差は、4つの独立したハイブリダイゼーションから算出される:

B. 結果
1. SP-C-rtTAおよび(teto)₇CMV-FGF-18トランスジェニックマウスの産生
ドキシサイクリンの非存在下で、ダブルトランスジェニックSP-C-rtTAおよび(teto)₇CMV-FGF-18マウス(各導入遺伝子に対する異種接合体)は、生育可能である。胎児のおよび出産後のシングルトランスジェニックマウスは、メンデルの(Mendelian)遺伝により予測される比で産生される。肺の形態は、ドキシサイクリンの非存在下での、シングルトランスジェニックマウスとダブルトランスジェニックマウスとのどちらも正常である。SP-C-CATおよびSP-C-rtTAマウス由来の肺の従来のin situハイブリダイゼーションおよびリポータ遺伝子分析により、トランスジェニックmRNAが、胎児および成体のマウスの肺における末梢呼吸上皮細胞に選択的に発現されることが証明される。SP-C-rtTAシステムを用いるホタルルシフェラーゼの発現は、in vivoで、E10という早い時期に観察される。Perl他、「Transgenic Res.」、(2002年)11:21〜29を参照のこと。成体のSP-C-rtTAマウスでは、rtTA mRNAは、末梢の誘導気道およびII型上皮細胞に選択的に発現される。Tichelaar他、「J. Biol. Chem.」、(2000年)275:11858〜64、およびPerl他、「Transgenic Res.」(2002年)11:21〜29を参照のこと。(teto)₇CMV-FGF-18標的マウスの2つの独立した系統(系統AおよびB)を産生し、SP-C-rtTAマウスと交尾させる。ドキシサイクリンへの暴露後の、独立した(teto)₇CMV-FGF-18系統の肺では、同様の形態的表現型が観察される。その後の研究では、(teto)₇CMV-FGF-18系統「A」を利用した。

2. FGF-18 mRNAの条件付き発現
飲料水に0.5mg/mlのドキシサイクリンを加えた、および加えなかった、若い成体のマウスの肺において、導入遺伝子特異的なFGF-18のmRNAを、RT-PCRによって評価する。成体のダブルトランスジェニックSP-C-rtTA x(teto)₇CMV-FGF-18マウスでは、FGF-18 mRNAは、ドキシサイクリンの非存在下では、低レベルで検出可能であり、ドキシサイクリンの非存在下で、いくつかの「リーク(leak)」を表すが、これは、SP-C-rtTAマウスを用いた経口ドキシサイクリンの後で誘導される。Clarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280: L705〜15およびTichelaarら、「J. Biol. Chem.」(2000年)275:11858〜64を参照のこと。成体のダブルトランスジェニックマウスをドキシサイクリンに暴露しても、肺の形態は変化しなかった。ドキシサイクリンで処理された種雌から得られる子犬では、FGF-18 mRNAは、胎児のSP-C-rtTA x(teto)₇CMV-FGF-18のダブルトランスジェニックマウスには検出されるが、シングルトランスジェニック動物には容易に検出されない。図1中のノーザンブロット画像の、レーンA(野生型)、レーンB(シングルトランスジェニック(teto)₇-FGF-18)、レーンC〜E(ダブルトランスジェニック)、およびレーンF(RTを用いないダブルトランスジェニック)を参照のこと。トランスジェニックFGF-18 mRNAは、ダブルトランスジェニックマウスの肝臓、脾臓、腎臓および脳を含めて、SPCプロモーター因子の特異性を象徴する他の主な器官では検出されず、これは通常、肺における呼吸上皮細胞のみで活性である。Glasserら、「Am. J. Physiol.」、(1991年)261: L349〜56を参照のこと。外因性FGF-18 mRNAは、肺のそれと比較すると極めて低レベルであるが、ドキシサイクリンを受けたダブルトランスジェニックマウスの精巣に検出される。

3. 胎児の肺に対するFGF-18の効果
種雌がE6でドキシサイクリンに暴露され、妊娠中にドキシサイクリンが維持される場合、子孫の生存率は、ダブルトランスジェニックマウスにおいて予想されるメンデル数(Mendelian number)の50%に低下し、これは、導入遺伝子の致死率と一貫性があった。ダブルトランスジェニックSP-C-rtTA x(teto)₇CMV-FGF-18の子孫からの肺の構造を、E16〜19で評価する。図2を参照のこと。この図では、FGF-18発現マウスでは、誘導気道および肺実質に、著しい異常が示されるのに対し、野生型の胚は、影響を受けていない。矢印は、正常な肺の、より近位の領域に典型的な特徴をもつ、大きな直径の異常な末梢の気道を示す。ドキシサイクリン無しの場合、ダブルトランスジェニックマウスの肺組織構造は通常、正常なものと区別できない。ドキシサイクリンの存在下では、E16〜19のダブルトランスジェニックマウス由来の肺において、劇的な組織学的異常が観察される。分岐形態形成は
、中断されている。誘導気道の長さおよび直径の著しい増加が観察される。末梢の肺胞嚢の著しい減少と共に、末梢気道の枝分れの減少が、一貫して示される。異常な組織構造は、E12.5では観察されないが、E16およびその後は、容易に明らかである。異常に大きな気道および嚢胞は、肺末梢の直接の視覚化によって、FGF-18発現マウスにおいて、容易に明らかである。解剖顕微鏡下で撮影されたものとしての、E6からドキシサイクリンに暴露した後の、ダブルトランスジェニックおよび対照の子犬から切断された肺(E17)を示す図3を参照のこと(矢印は拡張した肺胞嚢を示す)。

妊娠期間後半、E18〜19の段階に特有の、小嚢末梢腺房(peripheral acinar bud)および肺胞の原基は、FGF-18発現マウスに欠如している。図2を参照のこと。直径に異常が起きた細長い誘導気道は、肺末梢に伸びている。細気管支および末梢の細気管支-細葉(acinar)の細管の異型の枝分れが観察され、正常な細葉管および肺胞(alveoli)は、著しく減少している、あるいは無い。肺の間充織は厚くなり、細葉の細管をほとんど含まない。肺の血管は、異常に大きな内腔を伴って目立っており、肺胞毛細血管が欠如している。残存する末梢の気道肺胞嚢は拡張されず、新生児の肺の正常な胞状構造は欠如している。異常な大きな気管支様の細管が、肺の全体にわたって観察され、多くは、胸膜の表面に伸びている。同様の異常が、FGF-18を発現する胎児のマウスにも観察されるが、この程度の組織学的異常の変動は、同じ同腹仔由来のダブルトランスジェニックマウスであっても観察され、導入遺伝子発現のタイミング、程度、またはレベルが、表現型の厳密性に影響を与える可能性があることが示唆される。同様の肺異常は、A(teto)₇FGF-18系統とB(teto)₇FGF-18系統の両方において、CMV-FGF-18導入遺伝子の1つのコピーまたは2つのコピーを用いて子孫を産生することが可能な同腹仔から観察される。

4. 肺の細管に沿って並ぶ上皮細胞の異常な形態および分化
E16〜19でのFGF-18発現マウスにおける末梢の誘導気道細管に沿って、比較的に均質の集団の円柱および立方体様の繊毛上皮細胞が並ぶ。TTF-1に対して強くかつ均一に染色されたこれらの異常な気道上皮細胞は、終末分化の欠如を反映し、E16〜19および新生児では末梢に扁平細胞(I型)を形成しなかった。図4を参照のこと。ProSP-CおよびSPBは、異常な上皮の全体にわたって比較的に低レベルで検出され、E16および19でのII型および鱗片状のI型細胞分化の欠如と一貫性があった。サーファクタントプロテインの典型的ではない染色は、細胞の基底および先端の領域に観察されるのに対し、正常な肺では、染色は、II型細胞の先端の領域に検出される。CCSP(クララ細胞分泌タンパク)に対する細胞染色の異常な集中は、細長い拡張した呼吸細気管支に観察される。しかし、正常な肺の肺胞の領域でそうであるように、CCSPは、E16および19で、肺細管の最も末梢の領域から排除される(図4を参照のこと)。肺細管に沿って並ぶ異型性細胞は、Foxj1、すなわち正常な誘導気道における繊毛細胞のマーカーを発現しなかった(データは示さない)。

5. FGF-18は、肺の間充織の分化および形態を変化させた
FGF-18発現マウスの肺の間充織におけるPECAM染色の異常性により示される通り、肺血管の発達は混乱させられる。図5を参照のこと。比較的に小さいまばらな細葉の細管を囲む異常な間充織では、広範囲な血管成長が示される。末梢における異型の肺の血管の内腔直径は、しばしば著しく拡大していた。図5を参照のこと。近位の誘導気道に通常豊富な、肺胞の領域からは排除されているα-平滑筋アクチン(α-SMA)染色は、肺末梢において、異常な気道を囲んでいるのが見られ、対照の同腹仔において、通常α-SMA染色が欠如している部位で検出される。図5を参照のこと。

6. FGF-18発現マウスから得られる胎児の肺の超微細構造
E16および18での、FGF-18発現マウスから得られる肺組織の超微細分析は、光学顕微鏡的レベルでの所見と合致する。異常に大きな末梢気道に沿って、異型の円柱上皮が並ぶ。比較的に均質の集団の未成熟の上皮細胞が、末梢細管において観察される。大部分の末端
空間に沿って、立方体様または円柱の細胞が並び、鱗片状の(I型)細胞は、ほとんど観察されない。上皮細胞は、グリコーゲンが豊富であり、しばしば微小絨毛が欠如しており、ほとんど脂質含有物を含有していない。図6を参照のこと。気管のミエリンは、気道には観察されない。いくつかの異型細胞は、基底小体(気管-気管支の繊毛細胞の発達を象徴する)を含有していた。対照の同腹仔由来の肺では、発現しているII型前駆細胞は、立方体様であり、推定の層板小体を含有していた。管状のミエリンは、時折観察される。対照の子犬では、E18で、鱗片状のI型細胞が、最も末梢の肺胞嚢に沿って並んだ。FGF-18発現マウスでは、異常な肺間充織が、不十分に組織化され、突出した(prominent)平滑筋細胞によって囲まれる異常な血管を含んでいた。肺の間充織における間質細胞の間には、異常なスペースが観察される。

7. FGF-18は、気管-気管支の軟骨を混乱させた
FGF-18を発現するマウスでは、気管および気管支の軟骨における一貫した異常性が観察される。気管-気管支の軟骨環のサイズおよび形状の異常、ならびに気管支-軟骨の著しい拡大が、一貫して観察される。図7を参照のこと。組織学的分析およびプロコラーゲンII免疫染色により、E15〜16.5という早い時期に容易に検出可能であるが、E12.5では検出されない異常な気管支軟骨が示される。図8を参照のこと
8. FGF-10、BMP-4、および、Sprouty-2 mRNAに対するFGF-18の効果
E12胚由来の肺に関する全載in situハイブリダイゼーションでは、FGF-10、Sprouty-2、およびBMP-4 mRNAの分布および強度は、FGF-18発現マウスでは、変化しない。BMP-4、Sprouty-2、およびFGF-10 mRNAに対するLight cycler(登録商標)分析により、これらのmRNAに対してFGF-18の効果がないことが確認された。

9. 内因性FGF-18 mRNAに対するin situハイブリダイゼーション
放射標識されたマウスFGF-18のアンチセンスRNAを用いるin situハイブリダイゼーションでは、FGF-18 mRNAが、気管-気管支の軟骨環を囲む間質細胞で、喉頭軟骨を囲む組織で、また、E12.5〜18から得られる正常な胎児の肺の間充織で、高濃度で発現されることが示された。図9を参照のこと。

C. 考察
FGF-18 mRNAは、胎児および出生後のマウスの肺の呼吸上皮細胞に、条件つきで発現される。FGF-18は、出生後の肺に対する効果をほとんど持たない。しかし、胎児の肺では、肺形態形成は、FGF-18の発現によって混乱させられる。FGF-18は、末梢誘導気道の長さ、直径、および枝分れの中断)、ならびに気管支様の肺細管に沿って並んだ上皮細胞の異常な細胞分化を増大し、妊娠後期における小嚢形成および肺胞形成(alveolarization)を遮断し、肺間充織の組織を混乱させ、脈管構造の程度およびサイズを増大し、並んでいる上皮の毛細血管の浸潤を抑制し、主要な気管支の末梢に軟骨を誘導する。まとめると、FGF-18は、肺の近位-末梢のプログラミングの様々な面に影響を与え、誘導気道の構成要素を増強し、肺末端部のそれを抑制する。

1. 肺構造に対するFGF-18の効果
FGF-18は、正常な末梢細管に特徴的な特徴が欠如している均質の立方体様-円柱上皮を産生する。異型の円柱上皮細胞は、グリコーゲンが豊富であり、II型細胞に典型的な他の特徴を欠いていた。扁平細胞の分化は、抑制される。一方、近位の上皮細胞分化のいくつかの様相は、異常な上皮細胞では、見ることができない。繊毛、Foxj1、CCSP染色はいずれも、FGF-18によって誘導された末梢損傷における大部分の異型の上皮細胞には観察されない。同様に、FGF-18は、FGF-10、BMP-4、およびSprouty-2 mRNAの発現のレベルまたは部位を変化させず、これは、肺形態に対するFGF-18の効果が、これらの経路を介して仲介されないことを示唆する。

FGF-18の異所性発現の部位およびレベルは、FGF-18導入遺伝子の観察される形態学的効果に影響を与える可能性がある。野生型マウスでそうであるように、FGF-18は、上皮細胞に発現され、間葉系細胞では発現されないので、リガンドの生体利用効率またはFGF受容体へのリガンドの接触性は、トランスジェニックマウスにおいて、異なる可能性がある。内因性FGF-18 mRNAに対するin situハイブリダイゼーションにより、肺の間充織におけるその発現が確認され、気管および気管支内での、形成する軟骨環を囲むその分布が示される。発現のこの部位は、軟骨形成におけるFGF-18の潜在的な役割と一貫性がある。

2. 軟骨形成の増大
FGF-18の発現は、気管における軟骨環の形態を混乱させ、主要な気管支の末梢領域における軟骨組織を拡大させる。発達している気管において、正常な軟骨環を囲んでいる内因性FGF-18 mRNAの存在はまた、気管-気管支の軟骨形態形成における、FGF-18およびFGF-Rシグナル伝達の役割と一貫性がある。異所性軟骨は、E12.5では見られず、E16では容易に明らかである。FGF-18が出生後に発現される場合、軟骨における異常性は観察されない。軟骨環の形状および近接(contiguity)は、気管-気管支の軟骨形成の正常な部位で混乱させられるが、FGF-18発現マウスの末梢の気管支には、大量の軟骨が形成される。これらの発見は、FGF-18が、形態形成中の重要な時点で、軟骨細胞または軟骨前駆細胞(prechondrocyte)の増殖を変化させたという概念を裏づける。異常な軟骨組織は、コラーゲンII型、すなわち軟骨分化の初期のマーカーに対して、強く染色される。

FGF-18トランスジェニックマウスの誘導気道に沿って並んでいる上皮細胞の分化における異常は、異型の円柱の形態、すなわち肺胞嚢(saccular)-肺胞の分化の欠如を含んでおり、I型およびII型上皮細胞分化の著しい抑制に関連する。末梢細管の鱗片状のI型細胞および毛細血管の浸潤は、欠如している。末梢上皮細胞におけるTTF-1、proSP-C、およびSPBに対する均質の染色、および超微細レベルで見られるI型細胞の分化の抑制は、末梢の肺実質が終末分化しなかったことと一貫性がある。しかし、異常な上皮細胞の特性は、近位の上皮細胞型への末梢細胞の形質転換と一貫性がない。これらの異常な細胞は、肺の近位の領域における繊毛細胞に通常関連する、基底小体を含有していたが、最も近位の損傷における異型細胞は、CCSPを発現しておらず、多数の繊毛(正常なマウス誘導気道のマーカー)も含有していなかった。Wertら、「Dev. Biol.」、(1993年)156:426〜43、およびTichelaarら、「J. Histochem. Cytochem.」、(1999年)47:823〜31)を参照のこと。SPBおよびproSP-Cは、細胞の基部と先端の両方の領域における異型の円柱細胞内で局所化され、正常な肺胞のII型細胞では、これらのタンパク質が、通常頂端膜に濃縮されるというパターンは見られない。すなわち、上皮の分化の変化は、末梢呼吸上皮の完全な近位化(proximalization)、すなわち、未成熟の近位と末梢の呼吸上皮細胞の特徴を共有する異常な細胞を示さない。

D. 結論
この実験および得られた発見は、FGF-18の発現増加が、誘導気道の長さおよび直径を著しく増大し、胎児の肺の末梢領域における気管支紋理の分岐を変化させることを実証する。立方体様の鱗片状の上皮細胞が通常それに沿って並ぶ、細葉および肺胞の要素の形成は、FGF-18によって抑制される。末梢の肺の血管直径の増大および肺胞毛細血管の欠如は、近位の肺構造物の特徴の増強および肺胞形成の抑制と一貫性がある。FGF-18は、異所性軟骨を誘導し、血管形成を変化させ、α-平滑筋アクチンを誘導し、これは、肺の末梢領域ではなく近位の発達の増強と一貫性があった。FGF-18の効果は、胎児の肺に限定され、導入遺伝子が出生後に活性化される場合には観察されず、これは、FGF-18が、形態形成の初期に、細胞の増殖、分化、または移動に影響を与えるという概念を裏づけている。FGF-18は、肺形成に対する特有の効果を有し、血管、軟骨、および気道のいくつかの発達および形態形成プログラムを、近位のプログラムの方へ優先的にシフトさせる。

以下の例は、軟骨の形成における、ソニックヘッジホッグ(Shh)(すなわちFGF-18発現により調節される標的遺伝子)の関与を例示する:
A. 実験手順
1. 動物の使用およびドキシサイクリン投与
動物を、企業の方針に従って、病原を含まない飼育ケースに収容する。膣栓の検出、および子犬重量を相関させることによって、在胎齢を決定する。ドキシサイクリンを、妊娠期間中の様々な時点で、食品(625mg/kg、Harlan Teklad、Madison、WI)に入れて種雌に投与し、胎児の子犬を処置するために、胎盤関門を横断させる。

2. トランスジェニックマウスの産生
この実施例で使用されるマウスについての省略形を、下の表3に示す。マウスについての飼育戦略を、下の表4に示す。すべての導入遺伝子の伝達は、典型的なメンデルの(Mendelian)遺伝パターンを呈する:

a. Shh^flx/flxまたはShh^flx/-およびShh^Δ/ΔまたはShh^Δ/-マウス
図10は、ヒトの3.7kb SPCプロモーターを使用して、肺の末梢上皮細胞にリバーステトラサイクリントランス活性化タンパク質(rtTA)の発現を導くトランス活性化構築物(垂直矢印の上の、上の地図)；Cre-レコンビナーゼ(CRE)に対する遺伝子が(tetO)7CMVプロモーターに連結される発現構築物(垂直矢印の上の、真ん中の地図);および、全く同じに配向された2つのloxP部位が、Shh遺伝子のエキソン2の両側に挿入されたターゲッティング構築物(垂直矢印の上の、下の地図)の線状地図を示す。これらの構築物を使用して、複合変異マウスを産生するために交尾させる場合、ドキシサイクリンの投与後にShhエキソン2座で、肺特有の遺伝子組換えを受けるような初代マウスを産生する(生成物、矢印の下)。

Shh遺伝子(Shh^flx/flx)のエキソン2に隣接するloxP部位を持つトランスジェニックマウスは、A.P. McMahonにより提供される(Pepicelliら、「Curr. Biol」、(1998年)8:1083〜1086を参照のこと)。Shh^flx/flxを、飼育してShh^+/-マウスとし、その後、ヒトSPCプロモーターの制御下でrtTA遺伝子を発現するSP-C-rtTAマウスと交尾させる(Tichelaarら、「J. Biol. Chem.」、(2000年)275:11858〜64を参照のこと)。前核注入によって産生されたトランスジェニック(tetO)₇CMV-Creレコンビナーゼマウス(Perlら、「Transgenic Res.」、(2002年)11:21〜29)を参照のこと)を、SP-C-rtTA、Shh^flx/flx、またはShh^flx/-マウスと交雑させて、ダブルトランスジェニックマウスを産生する。トリプルトランスジェニックマウスは、SP-C-rtTA^tg;Shh^flx/flxと(tetO)₇CMV-Cre^tg/tg.;Shh^flx/-の交配からもた
らされる。SP-C-rtTA遺伝子、(tetO)₇CMV-Creレコンビナーゼ遺伝子、およびホモ接合性のフロックス(flox)されたアレル(Shh^flx/flx)または1つのフロックスされたアレルおよび1つのヌルアレル(Shh^flx/-)を持つトランスジェニック動物を、ドキシサイクリンで処置すると、Shh^Δ/ΔまたはShh^Δ/-になる。

正常な、フロックスされた、および、ヌルアレルの検出のために使用されるプライマーを、図10中のAおよびBで示す。図11に示す通り、妊娠期間全体を通してドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/-マウスから摘出された心臓(レーンA)および肺(レーンB)から抽出されるmRNAに対して、プライマーAおよびBを使用して、PCR分析を実施する。ドキシサイクリンで処置されないShh^flx/-マウスの肺(レーンC)から抽出されたmRNAもまた、比較のために分析する。

b. SP-C-rtTA^tg;(tetO)₇CMV-rShh^tgマウス
ラットShh cDNAを、Tichelaarら、「J. Biol. Chem.」、(2000年)275:11858〜64およびClarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280: L705〜15により記載されている通りに、ウシ成長ホルモン(bGHpolyA)遺伝子の(tetO)₇CMVプロモーターと3 Luntranslated領域の間に挿入する。この構築物を、FVB/Nマウス由来の卵母細胞に注入し、サザンブロッティングを使用して、初代を同定する。子孫を、サザンブロットおよびPCR分析によってスクリーニングする。Tichelaarら、「J. Biol. Chem.」、(2000年)275:11858〜64およびClarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280: L705〜15に記載されている通りに、(tetO)₇CMV-rShh_tg導入遺伝子を伝達させたマウスを飼育して、SP-C-rtTA FVB/Nトランスジェニックマウスにし、SP-C-rtTA^tg;(tetO)₇CMV-rShh^tg複合変異マウスを産生する。

c. Shh^rescueマウス
図12は、(tetO)₇CMVプロモーターとbGHpolyAの間に挿入されるラットShh cDNAの線状地図である(上)。この構築物を、SP-C-rtTA;(tetO)₇CMV-rShh構築物(下)を持つマウスと交尾させた場合にShh-/-マウスの肺にSHHを恒常的に発現させるために使用する。ドキシサイクリンでの処置は、Shh^-/-マウスの末梢呼吸上皮細胞におけるShhの発現をもたらす。

Shhヌル変異体(Shh^-/-)マウスは、A.P. McMahonによって提供される(Pepicelliら、「Curr. Biol.」、(1998年)8:1083〜1086を参照のこと)。Shh^+/+およびShh^+/-マウスは、観察可能な異常を示さない。Shh^-/-マウスにおけるラットShh cDNAの発現は、Shh^+/-バックグラウンドでトランスジェニックマウスを産生するための、Shh^+/-マウスのSP-C-rtTA^tg;(tetO)₇CMV-rShh^tg/tg複合変異マウスとの交尾に起因し、その後、これを交雑させてShh^+/-;(tetO)₇CMV-rShh^tg/tg複合変異マウスにし、Shh-/-バックグラウンドで、ダブルトランスジェニック「rescue」マウス(本明細書ではShh^rescueと呼ぶ)を産生する。

d. patched-1/^LacZ/+マウス
β-ガラクトシダーゼがPtch1プロモーターの制御下で発現されるヘテロ接合性のPtch1^LacZ/+マウスは、Jackson Labsから得られる(Goodrichら、「Dev. Biol.」、(1997年)211:323〜34および「Science」、(1999年)277:1109〜13を参照のこと)。β-ガラクトシダーゼ活性は、E11.5、13.5、および15.5で、Ptch1^LacZ/+マウスから取り出される肺および気管において示される。肺および気管を、その後パラフィンに包埋し、顕微鏡観察のために切断する。

3. 組織構造、免疫組織化学、in situハイブリダイゼーション、および電子顕微鏡法
胎児は、種雌を、0.25mlの麻酔薬(ケタミン、キシラジン、アセプロマジン)を用いる致死量の注射によって殺した後、子宮摘出術によって摘出する。胎児を計量し、その胸部を切開し、肺を摘出する。肺を、4℃の4%パラホルムアルデヒドに入れ、翌日計量する。肺を、全体的な異常について視覚的に評価した後、気管を摘出し、軟骨の全載アルシアンブ
ルー染色のために、95%エタノールに入れる。残りの肺を、上昇系列のアルコールで脱水し、パラフィンに浸潤させ、包埋させる。肺と付着する気管および心臓も、包埋させる。組織切片を、Tichelaarら「J. Biol. Chem.」、(2000年)275:11858〜64；Clarkら、「Am.
J. Physiol.」、(2001年)280: L705〜15)；Watkinsら、「Nature」、(2003年)422:313〜17;およびUngerら、「Am J Path」、(2003年)162:547〜55に記載される通りに、サーファクタントプロテイン-Cプロペプチド(proSP-C;Chemicon)、クララ細胞分泌タンパク(CCSP)、FOXJ1、β-チューブリンIV(Biogenix、マウスモノクローナル、クローン# ONS1A6)、血小板内皮細胞接着分子(PECAM;Pharmagen、ラットモノクローナル、クローン#CD31)、α-平滑筋アクチン(α-SMA;Sigma、マウスモノクローナル、cクローン# NA4)、カルシトニン遺伝子関連タンパク質(CGRP;Sigma-Aldrich)、T1-a(University of Iowa Hybridoma Bank、マウスモノクローナル、クローン# 8.1.1)、SHH-N(Santa Cruz)、および甲状腺転写因子-1(TTF-1)に対して免疫染色する。増殖を、E13.5およびE18.5で、α-燐酸ヒストンH3(αPH3;US Biological)、すなわち有糸分裂細胞マーカーに対して、対照およびトランスジェニック肺からの切片を免疫染色することによって評価する。電子顕微鏡観察については、Clarkら、「Am. J. Physiol.」、(2001年)280: L705〜15に記載される通りに、組織を固定し、処理し、評価する。VegfAおよびPtch1 mRNAに対するin situハイブリダイゼーションを、Wertら、「Dev. Biol.」、(1993年)156:426〜43、およびGreenbergら、「Dev. Dyn.」、(2002年)224:144〜53に記載される通りに、35S-UTP標識されたリボプローブを使用して実施する。Fgf10 mRNAに対する全載in situハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニン標識されたリボプローブを使用して、E12.5-13.5で実施する。Wilkinson、「In Situ Hybridization: A Practical Approach」(1998年)(ニューヨーク(New York):Oxford University Press)を参照のこと。

4. RNA単離、調製、およびAffymetrix分析を使用する分析
E13.5でのShh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウスおよび対照の同腹仔(Shh^flx/flx、Shh^flx/-)由来の肺の全RNAを、Mouse Expression Set 430AgeneChip (Affymetrix, Inc)を使用するマイクロアレイハイブリダイゼーションのために収集する。4対の計画実験からの8つのチップを使用する。Affymetrix MicroArray Suite バージョン5.0、JAM4(SAS Institute, Inc.)、およびGeneSpring 5.0(Silicon Genetics, Inc.)を、データ分析のために使用する。ハイブリダイゼーションデータは、deFeliceら、「J. Biol. Chem.」、(2003年)278:35574〜83に記載される通りに、正規化、変換、フィルタリング、および機能的な分類を順次受ける。Shh^Δ/-と対照マウス(Shh^flx/-)との間で差別的に発現される遺伝子を、P値<0.05およびfold change 1.5で、Student t検定によって同定する。データの整合性および再現性を評価するために、重複測定の間の変動係数を、50%のカットオフライン(cutoff line)を用いて算出する。さらに、Shh^Δ/-と対照との間の比較の、すべての可能な組み合わせ(16の組み合わせ)に対する、Affymetrix Change Callアルゴリズムを使用する数および割合の分析を、16の組み合わせのうちの14としての最小カットオフラインを用いて追加のフィルターとして使用する。

5. 統計分析
Shh^Δ/-および対照(Shh^flx/-)マウスからの肺の切片を、αPH3に対して免疫染色し、有糸分裂の核の数を、Metamorph Imaging software (Universal Imaging Corporation)を使用して、上皮細胞(cells/mm長さ)と、間葉性細胞(細胞/mm²)との両方のコンパートメントについて評価する。上皮に対する測定は、ノンパラメトリックな分布を示すので、Mann-Whitney Rank Sum検定を実施する。データは、正規分布を示したので、間葉性細胞の測定のために、t検定分析を実施する。この分析についての統計はすべて、SigmaStatソフトウェア(SPSS Inc.)を使用して実施する。

各子犬について、体に対する肺の重量比を算出し、ブロッキング・ファクターとして処置された各同腹仔内の子犬を用いる2-Way ANOVAを使用して、有意性について試験する。
子犬から摘出された肺の全体の外観を、小葉形成、肺形成不全、嚢胞の存在、末梢細管拡張、および気管の異常などの様々な特性について視覚的に評価し、複合スコアを割り当てる。統計的有意差は、Kruskall-ウォリス手順(SASソフトウェア、NPAR1WAY;SAS Institute, Inc.)を使用して決定される。

B. 結果
1.ドキシサイクリンでの処置後の、トランスジェニック子犬の表現型、肺、形態、および組織構造の比較
図13に示す通り(各遺伝子型についてn>5、スケールバー=A、E、I、およびMについて1.2cm、B、F、G、J、およびNについて1mm、C、G、H、K、L、O、およびPについて200mm、Dについて100mm)、同腹仔対照Shh^flx/flxマウス(Aを参照のこと)とShh^Δ/-子犬(Eを参照のこと)が、E18.5では、識別不可能であるのに対して、Shh^-/-(Iを参照のこと)およびShh^rescue(Mを参照のこと)の子犬は、甚だしく異常である。Shh^Δ/-(Fを参照のこと)子犬由来の肺は、流体で満たされた嚢胞を伴って形成不全であり、末梢細管が拡張されていた。Shh^-/-(Jを参照のこと)およびShh^rescue(Nを参照のこと)の子犬由来の肺は、対照の同腹仔(Bを参照のこと)と比較して、高度に形成不全であるが、Shh^rescue(N)子犬由来の肺では、末梢肺組織の有意な回復が観察される。肺の切片を、ヘマトキシリン‐エオジン(C、G、K、およびO)で染色する、あるいはSHH-N(D、H、L、およびP)に対して免疫染色する。Shh^flx/flxマウス(C)由来の肺は、組織学的に正常であり、SHH-N免疫染色は、呼吸上皮と誘導気道上皮(Dを参照のこと)の両方で検出される。Shh^Δ/-マウス由来の肺の末梢細管の拡張(Gにおける「*」を参照のこと)は、SHH-N免疫染色(Hにおける矢印を参照のこと)が減少した、あるいは無い領域と相関するが、誘導気道気道上皮(Hにおける矢印を参照のこと)には、SHH-Nに対する免疫染色が、依然として検出される。SHH-Nは、Shh^-/-マウス(L)由来の肺の周縁領域に検出され、これは、切断された変異体SHHペプチドの検出を示す。Shh^rescueマウス(O)では、SHH-N(P)に対する免疫染色に関連する分岐形態形成は回復する。SHHブロッキングペプチドを用いる競合結合実験は、Shh^-/-マウスにおけるSHHに対する免疫染色は、SHHペプチドを用いる前吸収(preabsorption)により除去されることを示す。

2. 肺の形態、組織構造、および増殖
種雌は、E0.5〜13.5でドキシサイクリンで処置し、肺を、E13.5で採取する。図14に示す通り(各遺伝子型についてn>5、スケールバー=AおよびBについて1μm、C〜Hについて100μm)、Shh^flx/flx対照同腹仔(A)と比較した場合、Shh^Δ/-マウス(B)由来の肺は、末梢細管の拡張(Dにおける「*」を参照のこと)によって示される通り、分岐形態形成の低下を伴い、形成不全である。SHH-N免疫染色は、近位尿細管上皮(D中の矢印を参照のこと)には検出されず、対照(C中の矢印を参照のこと)と比較すると、異常に拡張された末梢細管の上皮が減少している、あるいは無い。肺のサイズは、Shh^Δ/-マウスでは低下するが、α-ホスホヒストン H3(αPH3)免疫染色は、変化しない(EおよびFを参照のこと)。in situハイブリダイゼーションは、対照(Gを参照のこと)と比較して、Shh^Δ/-マウス(Hを参照のこと)におけるPtch1 mRNAのレベルの低下を示す。

3. 上皮細胞マーカーに対する免疫染色
図15に示す通り(n=各マーカーの遺伝子型について3超、スケールバー=A、E〜F、I〜K、およびM〜Nについて200μm、Bについて100μm、C、GおよびOについて50μm、D、H、L、およびPについて100μm)、E18.5でのShh^flx/flx(A〜Dを参照のこと)、Shh^Δ/-、Shh^-/-(E〜Hを参照のこと)(I〜Lを参照のこと)、およびShh^rescue(MPを参照のこと)マウス由来の肺を、CCSP、proSPC、FOXJ1、およびCGRPに対して免疫染色する。上皮の分化選択的マーカーは、試験されるマウス由来の肺すべてにおいて検出される。

4. 肺血管性形態形成に対するShh効果
図16に示す通り(n=各マーカーの遺伝子型について3超、スケールバー=A〜B、D〜E、G〜
H、およびJ〜Kについて100μm、C、F、I、およびLについて200μm)、E18.5でのShh^flx/flx(A〜Cを参照のこと)、Shh^Δ/-(D〜Fを参照のこと)、Shh^-/-(GIを参照のこと)、およびShh^rescue(J-Lを参照のこと)マウス由来の肺を、α-SMAまたはPECAMに対して免疫染色する、あるいは、VegfA mRNAに対して放射標識されたリボプローブを用いてハイブリッドを形成する。α-SMA染色は、Shh^Δ/-の肺(Dを参照のこと)では低下するが、Shh^-/-の肺(Gを参照のこと)では存在せず、これは、肺の平滑筋前駆体の分化または残存が、SHHに依存していることを示す。PECAM染色は、Shh^Δ/-(Eを参照のこと)およびShh^-/-マウス(Hを参照のこと)由来の末梢の肺では、著しく低下する。VegfA mRNAは、Shh^-/-マウス(Iを参照のこと)の末梢呼吸上皮では減少するが、Shh^Δ/-マウス(Fを参照のこと)では、可変的に検出される。

5. Shh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウス由来の肺組織のRNA分析
E13.5での、Shh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウス、ならびにそれらのShh^flx/flxおよびShh^flx/-対照同腹仔の肺の全RNAを使用して、マイクロアレイハイブリダイゼーションおよびその後のデータ分析を実施する。20RNAは、50%(1.5倍)減少する(図17および表5を参照のこと)。Shh^Δ/-マウスでは、Ptch1、Gli1、およびHip1を含めて、SHH経路における遺伝子によってコードされるRNAは、有意に減少する(下の図17および表5を参照のこと)。これらの遺伝子は、SHHシグナル伝達経路の構成要素であり、SHHにより調節されることが分かっている。平滑筋細胞に選択的に発現される多くの遺伝子から得られるRNA(Tnc、Myh11、Cnn1、SrfcpおよびTrpc2)もまた、減少し(下の図17および表5を参照のこと)、これは、α-SMA免疫染色の減少と一貫性があり、かつ、これらのマウスに観察される脈管および気管支の平滑筋の減少を裏づける。Shh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウス由来の肺を、対照動物と比較したときに、発現パターンの増大が示された追加の遺伝子を、下の表4に列挙する。図17中の棒グラフは、そのShh^flx/flおよびShh^flx/-対照同腹仔に対する、Shh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウスにおける、選択的な肺mRNAレベルの平均低下倍数(fold decrease)(±SEM)を示す。平均および標準誤差は、4つの独立したハイブリダイゼーションから算出される。

6. 気管-気管支の軟骨の異常なパターン形成
奇形の気管-気管支の軟骨の環は、Shh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウスに観察される。不完全な気管の環(環1〜4)は、腹側の正中線に沿って観察される。他の異常は、気管-気管支の軟骨環の数の減少、不完全またはきちんと並んでいない気管の環、および気管の直径の局所性の狭窄からなる。Shh^-/-マウスでは、気管-気管支の軟骨は、形成に失敗しており、アルシアンブルー染色された軟骨細胞の小さいクラスターだけが、推定的な気管-食道の管の中央で検出される。Shh^rescueマウスにおけるSHHの発現は、気管-気管支の軟骨環形成またはパターン形成を回復させず、これは、誘導気道におけるSHHの局所的な必要性を
示す。

図18に示す通り(肺の方向は、長い矢印によって示される:RL=右の肺、LL=左の肺、スケールバー=1μm、各遺伝子型についてn=3〜4)、E18.5でのShh^flx/flx(Aを参照のこと)、Shh^Δ/-マウス(Bを参照のこと)、Shh^-/-(Cを参照のこと)、およびShh^rescue(Dを参照のこと)マウスから摘出された肺および気管を、軟骨の検出のためにアルシアンブルーで染色する。対照同腹仔Shh^flx/flxにおける気管の環は、ほぼ完全な円を形成し、線維膜に背側で付着する。アルシアンブルー染色により、Shh^Δ/-マウスにおける異常な気管-気管支の軟骨パターン形成(気管の環1〜4が、腹部に連結し損なっている)が明らかにされる。(B中の矢印を参照のこと)。気管に沿う様々な環は、不完全である、あるいはきちんと並んでいない。Shh^-/-およびShh^rescueマウスに観察される気管食道瘻は、淡青色の軟骨の細胞のクラスター(それぞれ、C、D中の矢印を参照のこと)を含有し、これは、Shh-/-マウスに観察された、気管-気管支の軟骨パターン形成の欠如が、Shh^rescueマウスでは回復されないことを示す。

7. Ptch1の時間的および空間的な発現パターン
図19に示す通り(各時点についてn=3、スケールバー=A、D、およびGについて200μm、B〜C、E〜F、およびH〜Iについて100μm)、SHHシグナル伝達の部位を評価するために、Ptch1の発現を、E11.5(A〜Cを参照のこと)、E13.5(D〜Fを参照のこと)、およびE15.5(G〜Iを参照のこと)でのPtch1^LacZ/+トランスジェニックマウス由来の肺組織において評価する。β-ガラクトシダーゼ染色は、研究されるすべての時点での気管および気管支を囲む離散的な部位の間充織に観察され、前軟骨の(precartilagenous)凝縮体(condensation)に最も豊富である(B、E、およびH中の矢印を参照のこと)。Ptch1のこの空間的に制限された発現は、SHHシグナル伝達の潜在的な部位を示す。末梢の肺では、β-ガラクトシダーゼ染色は、末梢の肺の間充織に(C、F、およびI中の矢印を参照のこと)、また、肺の血管および気管支の平滑筋形成の部位と合致する誘導気道に沿って(C、F、およびI中の矢印を参照のこと)検出される。Ptch1遺伝子発現の部位は、E13.5でのPtch1 mRNAのin situハイブリダイゼーションによって検出されるものと同様である(E〜Fを参照のこと)。

8. 肺形態形成中のSHHの時間的必要性の決定
図21に示す通り(各時点についてn>5、スケールバー=A〜Fについて1μm)、SHHの欠損は、ドキシサイクリンが、E0.5〜18.5(Bを参照のこと)、E8.5〜18.5(Dを参照のこと)、およびE8.5〜12.5(Eを参照のこと)でShh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウスに投与される場合、高度に奇形の末梢肺および誘導気道の発現を引き起こす。(ドキシサイクリン処置の時点は、図20に示される)。肺は、すべての処置についてE18.5で採取し、および形成不全、肺嚢胞症の存在、末梢細管拡張および異常な気管の環(矢印)について分析する。E13.5以降ドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウスは、観察可能な肺または肺外の異常をもたらさない(Fを参照のこと)。末梢の肺の形成は、種雌が、E0.5〜8.5(Cを参照のこと)、E6.5〜8.5、E8.5〜10.5、またはE6.5〜E10.5(図示せず)でドキシサイクリンで処置される場合、影響を受ける。気管の異常は、E8.5(ジーンターゲッティングが肺内気道のみで起こる時点)(Cを参照のこと)より前にドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/ΔおよびShh^Δ/-マウスには観察されない。(Perlら、「Transgenic Res.」、(2002年)11:21〜29)を参照のこと。遺伝子組換えが、気管および気管支幹(main stem bronchi)の上皮細胞に起こる場合、E8.5とE12.5の間での、96時間以上のドキシサイクリンの投与(Perlら、「Transgenic Res.」、(2002年)11:21〜29を参照のこと)は、気管-気管支の軟骨環に、重い奇形を引き起こす(Eを参照のこと)。したがって、誘導気道の呼吸上皮細胞におけるShhの局所的な欠損は、気管-気管支の軟骨パターン形成における異常を引き起こす。

本発明の具体的な実施形態を記述してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、これに対する様々な改変を行うことができること
は、当業者にとって明らかであろう。

E16での胎児のマウス肺で評価され、導入遺伝子の存在および欠如と相関させた、導入遺伝子特異的なマウスFGF-18、全FGF-18、およびβ-アクチンmRNAのNorthern Blot分析の画像である。 E16(A、B)およびE19(C、D)での、対照(AおよびC)およびダブルトランスジェニック子犬(B、D)からの肺組織をヘマトキシリン‐エオシン染色した後の、肺組織を混乱させているFGF-18の発現の画像(元々の倍率×4)である。 FGF-18処理されたものおよび対照の同腹仔からの胎児の肺の端の画像である。野生型(WT)子犬(A、C、E、G、I)またはFGF-18を発現するダブルトランスジェニック子犬(B、D、F、H、J)の肺に対して実施された、TTF-1、proSP-C、およびSP-B(元々の倍率×20で撮影された)、およびCCSPに対する免疫染色の後の、TTF-1、proSP-C、SP-B、およびCCSPに対するFGF-18の効果の画像(元々の倍率×10)である。 PECAM(A,B)およびα平滑筋アクチン(C,D,E,F)に対して免疫染色された、FGF-18を発現するものおよび対照の同腹仔(E19)からの肺の画像(元々の倍率×10)である。対照(A)およびFGF-18を発現する同腹仔(B)からの肺組織の画像である。 E6からドキシサイクリンで処置した罹患した(A)および対照の(B)マウスの、胎児マウスから切断してアルシアンブルーで染色した肺、およびKOHで消化した後に解剖顕微鏡下で写真撮影された組織の画像である。 E16での、野生型(A)およびFGF-18を発現するマウス(B)における、軟骨環のヘマトキシリン‐エオシン染色の画像(元々の倍率×4)である。 E18.5での野生型マウス由来の胎児のマウス組織の切片に関する、放射標識されたFGF-18アンチセンス(A,B)およびセンスプローブ(C,D)を用いて実施されるin situハイブリダイゼーションの画像(元々の倍率×4)である。ドキシサイクリンの投与後にShhエキソン2座(垂直矢印の下)での肺特異的な遺伝子組換えを生じるために使用される構築物(垂直矢印の上)の3つの線状地図の図解である。妊娠期間を通してドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/-マウスから摘出された心臓(レーンA)および肺(レーンB)から抽出されたmRNA、ならびにドキシサイクリン(レーンC)で処置されていないShh^flx/-マウスの肺から抽出されたmRNAに関するPCRブロット分析の画像である。 SP-C-rtTA(上の地図)および(tetO)₇CMV-rShh(下の地図)導入遺伝子構築物の線状地図の図解である。それぞれ、E0.5〜18.5でのドキシサイクリンでの処置後、E18.5で、ソニックヘッジホッグタンパク質(SHH-N)の生物学的に活性なN末端フラグメントに対して免疫染色された、Shh^flx/flx(A)、Shh^Δ/-(E)、Shh^-/-(I)、およびShh^rescue(M)マウス、その肺(B、F、J、およびN)、それらのヘマトキシリン‐エオジン(H&E)染色された肺切片(C、G、K、およびO)、ならびにそれらの肺切片(D、H、L、およびP)を示す画像である。それぞれ、E0.5〜13.5でのドキシサイクリンでの処置後、E13.5でのShh^flx/flxおよびShh^Δ/-マウスの、全体の肺の形態(AおよびB)、SHH-Nで免疫染色された肺切片(CおよびD)、α-ホスホヒストンH3(αPH3)で免疫染色された肺切片(EおよびF)、ならびにSHH受容体Patched-1(Ptch1)mRNAに対して放射標識されたリボプローブとin situハイブリッド形成させた肺切片を示す画像である。それぞれ、E18.5でのShh^flx/flx、Shh^Δ/-、Shh^-/-、およびShh^rescueマウスからの、肺切片におけるクララ細胞分泌タンパク(Clara Cell Secretory Protein)(CCSP)免疫染色(A、E、I、およびM)、肺切片におけるプロ-サーファクタントプロテイン-C(SPC)免疫染色(B、F、J、およびN)、肺切片におけるフォークヘッドボックス転写因子-J1(FOXJ1)免疫染色(C、G、K、およびO)、ならびに肺切片におけるカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫染色(D、H、LおよびP)を示す画像である。それぞれ、E18.5でのShh^flx/flx、Shh^Δ/-、Shh^-/-、およびShh^rescueマウスからの、α-平滑筋アクチン(α-Smooth Muscle Actin)(α-SMA)に対して免疫染色した肺切片(A、D、G、およびJ)、血小板・内皮細胞接着分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule)(PECAM)に対する肺切片(B、E、H、およびK)、ならびに脈管内皮増殖因子-A(Vascular Endothelial Growth Factor-A)(VegfA)mRNAに対して放射標識されたリボプローブとハイブリッド形成させた肺切片(C、F、I、およびL)を示す画像である。 Shh^flx/flx、Shh^flx/-対照同腹仔に対する、Shh^Δ/-における肺の遺伝子発現のfold changesを示す棒グラフである。それぞれ、E18.5でのShh^flx/flx(Shh^Δ/-)、Shh^-/-、およびShh^rescueマウスからの、アルシアンブルーで染色された肺および気管を示す画像である(A、B、CおよびD)。それぞれ、E11.5(a〜c)での、E13.5(DF)での、およびE15.5(G〜I)でのPtch1^LacZ/+マウスからの、末梢の肺および気管の切片におけるβ-ガラクトシダーゼ染色を示す画像である。 Shh^Δ/-(A)およびShh^Δ/Δ(B〜F)マウスについての、ドキシサイクリン処置(その結果は、図21に示される)の日数を示す棒グラフである。それぞれ、E0.5〜18.5でドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/-マウス(A)からの、E0.5〜18.5でドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/Δマウス(B)からの、E0.5〜8.5でドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/Δマウス(C)からの、E8.5〜18.5かでドキシサイクリンで処置されたShh^Δ/Δマウス(D)からの、E8.5〜12.5でドキシサイクリンで治療されたShh^Δ/Δマウス(E)からの、およびE13.5〜18.5でドキシサイクリンで治療されたShh^Δ/Δマウス(F)からの、E18.5での肺および気管を示す画像である。

Claims

FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を、軟骨形成を誘導するのに有効な量で含む医薬組成物。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18である請求項1に記載の組成物。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の標的遺伝子タンパク質と組み合わされるFGF-18である請求項1に記載の組成物。
こうした治療を必要としている患者の患部に軟骨形成を誘導するための方法であって、患部において軟骨形成を誘導するために有効な量の、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を含有する医薬組成物を、患部に投与するステップを含む方法。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18である請求項4に記載の方法。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の標的遺伝子タンパク質と組み合わされるFGF-18である請求項4に記載の方法。
FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18タンパク質である請求項7に記載のベクター。
in vitroでFGF-18タンパク質を細胞内で発現させる方法であって、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供するステップを含む方法。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18タンパク質である請求項9に記載の方法。
患部に軟骨形成を必要とする患者を治療するための方法であって、細胞における軟骨形成を誘導するためのFGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを患部に導入するステップを含む方法。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18タンパク質である請求項11に記載の方法。
患部が、誘導気道である請求項11に記載の方法。
誘導気道が気管、気管支、肺、および喉頭のうちの少なくとも1種である請求項13に記載の方法。
患部に軟骨形成を必要とする患者を治療するための方法であって、FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を、軟骨形成を誘導するのに有効な量で、患部に投与するステップを含む方法。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18タンパク質である請求項15に記載の方法。
患部が、誘導気道である請求項15に記載の方法。
誘導気道が、気管、気管支、肺および喉頭の少なくとも1種である請求項17の方法。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18タンパク質である請求項18に記載の方法。
少なくとも1種の骨形成タンパク質(Bone Morphogenetic Protein)またはトランスフォーミング増殖因子(Transforming Growth Factor)を、軟骨増殖およびパターン形成を増強するのに有効な量で、患者の患部に投与するさらなるステップを含む請求項15に記載の方法。
細胞増殖を持続させることが可能な培地中の細胞を含む細胞培養物であって、前記細胞が、FGF-18、Shh、β-カテニンおよびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードする少なくとも1種のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、その中に導入されている細胞培養物。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18タンパク質である請求項21に記載の方法。
(a)FGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質の存在下で、軟骨を産生することが可能な細胞；ならびに(b)細胞における軟骨形成を誘導させるために、有効量の少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質を含有する、細胞増殖を持続させることが可能な培地；を含む細胞培養物。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18である請求項23に記載の培養物。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の標的遺伝子タンパク質と組み合わされるFGF-18である請求項23の培養物。
(a)細胞増殖を持続させることが可能な培地中の第一グループの細胞；および(b)第一グループの細胞とタイプが異なり、第一グループの細胞と同時培養される第二グループの細胞(ただし、第二グループの細胞は、軟骨の形成を誘導するためのFGF-18、Shh、β-カテニン、およびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターをその中に導入されている)；を含む細胞培養物。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18である請求項26に記載の培養物。
細胞増殖を持続させることが可能な培地中のin vitroで軟骨形成を誘導することが可能な細胞を含む細胞培養物を調製するための方法であって、FGF-18、Shh、β-カテニン、お
よびWntタンパク質からなる群から選択される少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質をコードするためのコード配列を含む発現ベクターを細胞に導入するステップを含む方法。
少なくとも1種の軟骨形成誘導タンパク質が、FGF-18タンパク質である請求項28に記載の方法。