NO326459B1 - Isolert polynukleotidmolekyl, ekspresjonsvektor, dyrket celle i hvilken det er innfort en ekspresjonsvektor, fremgangsmate for fremstilling av et FGF-homolog-polypeptid, farmasoytisk preparat, antistoff, anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for stimulering av proliferasjon av myocytter eller myocyttforlopere, fremgangsmate for eks vivo-stimulering av myocyttforloperceller eller myocytter og anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for levering av et middel eller legemiddel til hjertevev. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert polynukleotidmolekyl, ekspresjonsvektor, dyrket celle i hvilken det er innført en ekspresjonsvektor, fremgangsmåte for fremstilling av et FGF-homologpolypeptid, isolert FGF-homologpolypeptid, farmasøytisk preparat, antistoff, anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for stimulering av proliferasjon av myocytter eller myocyttforløpere, fremgangsmåte for eks vivo-stimulering av myocyttforløperceller eller myocytter og anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for levering av et middel eller legemiddel til hjertevev.

Fibroblastvekstfaktor(FGF)-familien består av minst

ni atskilte medlemmer (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59, 115-165, 1992 og Fernig et al., Prog. Growth Factor Res. 5

(4), 353-377, 1994) som generelt virker som mitogener for et bredt spektrum av celletyper. F.eks. er basisk FGF (også kjent som FGF-2) mitogent in vitro for endotelceller, vaskulære glatte muskelceller, fibroblaster og generelt for celler av mesodermalt eller neuroektodermalt opphav, heriblant hjerte-

og skjelettmyocytter (Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 70:395-405, 1976; Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 89:568-578, 1981 og Kardami, J. Mol. Cell, Biochem. 92, 124-134,

1990) . In vivo har bFGF blitt vist å spille en rolle i hjerteutvikling hos fugler (Sugi et al., Dev. Biol. 168:567-574, 1995, og Mima et al., Proe. Nat'l. Acad. Sei., 92:467-

471, 1995) og å indusere koronar kollateralutvikling hos hunder (Lazarous et al., Circulation, 94: 1074-1082, 1996). I tillegg har ikke-mitogene aktiviteter blitt vist for en rekke medlemmer av FGF-fåmilien. Ikke-proliferative aktiviteter forbundet med sur og/eller basisk FGF, omfatter: forhøyet fri-gjørelse i endotel av vevsplasminogenaktivator, stimulering av syntese av ekstracellulær matriks, kjemotaksis for endotelceller, indusert ekspresjon av føtale, kontraktile gener i kardiomyocytter (Parker et al., J. Clin. Invest., 85:507-514, 1990) og forhøyet hormonell respons i hypofysen (Baird et al., J. Cellular Physiol., 5:101-106, 1987).

Flere medlemmer a.v FGF-familien mangler en signalsekvens (aFGF, bFGF og muligens FGF-9) og vil således ikke forventes og utskilles. I tillegg har flere FGF-familiemedlemmer evnen til å migrere til cellekjernen (Friesel et al., FASEB 9:919-925, 1995). Alle medlemmer" av FGF-familien binder heparin basert på strukturelle likheter. Strukturell homologi krysser artsgrensene, noe som tyder på konserverte struktur/- funksjonssammenhenger (Ornitz et al., J. Biol. Chem., 271 (25): 15292-15297, 1996.)

Det er fire kjente ekstracellulære FGF-reseptorer (FGFR) og de er alle tyrosinkinaser. Generelt bindes FGF-familiemedlemmene til alle de kjente FGFR, imidlertid bindes spesifikke FGF til spesifikke reseptorer med høyere grad av affinitet. Et annet middel for spesifisitet innen FGF-familien, er den rommelige og tidsmessige ekspresjon av ligandene og deres reseptorer under embryogenesen. Bevismateriale tyder på at FGF mest sannsynlig kun virker på autokrin og/eller para-krin måte, grunnet heparinbindingsaffiniteten som begrenser deres diffusjon fra frigjørelsessetet. (Flaumenhaft et al., J. Cell. Biol., 111 (4):1651-1659, 1990.) Basisk FGF mangler en signalsekvens og er derfor begrenset til parakrine eller autokrine virkningsmåter. Det har blitt postulert at basisk FGF lagres intracellulært og frigjøres ved vevsskader. Basisk FGF er vist å ha to reseptorbindingsområder som er separate fra heparinbindingssetet (Abraham et al., EMBO J., 5 (10):2523-2528, 1986.)

Det er vist at FGFR-3 spiller en rolle i beinvekst. Mus som er gjort homozygote null for FGFR-3 (-/-) fikk post-natale abnormaliteter i skjelettet (Colvin et al., Nature Genet. 12:309-397, 1996, og Deng et al., Cell 84:911-921, 1996). Mutantfenotypen tyder på at FGFR-3 i normale mus spiller en rolle i reguleringen av kondrocyttcelledelingen i vekstplateområdet i bein (Goldfarb, cytokine and Growth Factor Rev. 7 (4):311-325, 1996). Liganden for FGFR-3 i vekstplaten i bein er ikke identifisert.

Selv om fire FGFR er identifisert og alle disse er vist å ha funksjonelle spleisevarianter, er sannsynligheten for at foreløpig ukjente FGF-reseptorer finnes, ganske stor. F.eks. er ingen reseptor identifisert for FGF-8a-isoformen (MacArthur et al., J. Virql. ;-69 (4) :2501-2507, 1995.).

FGF-78 er et medlem av FGF-familien som opprinnelig ble isolert frå hrystka-rsinomceller som et androgeninduserbart mitogen. Genet har blitt kartlagt til humant kromosom. 10q25-q26 (White et al.., Genomics 30:109-11, 1995.) FGF-8 deltar i embryonal lemutvikling "(Vogel et al., Development 122:1737-1750,.1996 og Tanaka et al., Current Biology 5 (6):594-597, 1995.) Ekspresjon av FGF-8 under embryogenesen i hjertevev, urogenitalvev og nervevev, tyder på at faktoren kan spille en rolle under utviklingen av disse vev (Crossley et al., Development 121:439-451, 1995.) Det foreligger indikasjoner på at acrocephalosyndactylia,. en kongenital tilstand særpreget ved spisst" hode og fingre,^og tær med svømmehud, er forbundet med punktmutasjoner i FGF-8 (White et al., 1995, ibid.).

FGF-8 har fem eksoner, i motsetning til de andre kjente FGF som kun har tre eksoner. De første tre eksoner i FGF-8 tilsvarer det første ekson i de andre FGF (MacArthur et al., Development 121:3603-3613, 1995). Det humane gen for FGF-8 koder for fire isoformer som skiller seg fra hverandre i det N-terminale området: FGF-isoformene a, b, e og f, i motsetning til musegenet som gir opphav til åtte FGF-8-isoformer

(Crossley et al., 1995, ibid.). Human FGF-8a og FGF-8b viser 100 % homologi med museproteinene og FGF-8e- og FGF-8f-proteinene er 98 % homologe mellom menneske og mus (Gemel et al., Genomics 35:253-257, 1996.)

Hjertesykdom er den viktigste dødsårsak i de Forente Stater og utgjør opp til 30 % av alle dødsfall. Myokardinfarkt (MI) står for 750 000 sykehusinnleggelser pr. år i de Forente Stater, mens mer. enn 5 millioner mennesker har diagnosen koronar sykdom. Risikofaktorer for MI omfatter diabetes mellitus, hypertensjon, fedme, røyking, høyt nivå av lav-tetthetslipoprotein i plasma eller genetisk disposisjon.

Hjertehyperplasi skyldes forhøyet proliferasjon av hjertemyocytter og er vist å opptre ved normal aldring hos menneske og rotter (Olivetti et al., J. Am. Coll. Cardiol., 24 (l):140-9, 1994 og Anversa et al., Circ. Res., 67, 871-885, 1990) og i katekolaminindusert kardiomyopati hos rotter (Deisher et al., Am. J. Cardiovasc. Pathol., 5 (1) :79-88, 1994). Hvorvidt det økte antall myocytter har opphav i en eller annen forløpercelle eller er et resultat av proliferasjon av en mer terminalt differensiert celletype, er fortsatt et kontroversielt- spørsmål.

Siden infarkt og andre årsaker til myokardnekrose synes å være .ureparerbar, ser det imidlertid ut til at de normale mekanismer for hjertehyperplasi ikke kan kompensere for omfattende myocyttdød, og det foreligger et behov for eksogene faktorer som fremmer hyperplasi og til syvende og sist kan føre til fornyelse av hjertets evne til å fungere.

Beinremodulering er den dynamiske prosess ved hvilken vevsmasse og skjelettarkitektur opprettholdes. Prosessen er en balanse mellom beinresorpsjon og beindannelse hvor to celletyper antas å være hovedaktørene. Disse cellene er osteo-blasten og osteoklasten. Osteoblaster syntetiserer og deponerer matriks som skal bli nytt bein. Osteoblastenes og osteoklastenes aktiviteter reguleres av en rekke faktorer, både systemiske og lokale, heriblant vekstfaktorer.

Selv om interaksjonen mellom lokale og systemiske faktorer ikke er fullstendig utredet, synes det å være enighet om at vekstfaktorer spiller en nøkkelrolle i reguleringen av både normal skjelettremodulering og reparasjon av brudd. Noen av vekstfaktorene<;>som er identifisert i bein, omfatter: IGF-I, IGF-II, TGF-Pi, TGF-02, bFGF, a FGF, PDGF og familien av beinmorfogene proteiner (Baylink et al., J. Bone Mineral Res., 8 (Supp. 2): S565-S572, 1993).

Dersom beinresorpsjonen overskrider beindannelsen, er resultatet et nettotap av bein, noe som fører til økt ut-satthet for beinbrudd. Redusert beindannelse er forbundet med aldring og visse patologiske tilstander. Bare i de Forente Stater forekommer årlig tilnærmet 1,5 millioner brudd som til-skrives orteoporose. Virkningen av disse brudd på pasientens livskvalitet er kolossal. De kostnader dette medfører for helsesystemet i de Forente Stater, er beregnet til 5-10 milliarder dollar pr. år, uten at langtidspleie er tatt med.

Andre terapeutiske anvendelsesområder for vekstfaktorer som påvirker beinremodulering, omfatter f.eks. behandling av skader som krever proliferasjon av osteoblaster for å heles, f.eks. brudd, så vel som stimulering av mesen-chymcelleproliferasjon og syntese av intramembranbein, begge deler mulige sider ved reparasjon av brudd (Joyce et al.', 36th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, februar .5-8, 1990. New Orleans, LA).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer slike polypeptider for disse og andre anvendelser som vil være åpenbare for fagfolk ut fra beskrivelsene heri.

Oppsummering av oppfinnelsen

I én utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et isolert polynukleotidmolekyl, kjennetegnet ved at det koder for et fibroblastvekstfaktor (FGF) - homologpolypeptid som er valgt fra gruppen som består av:-a) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEKV. ID. NR. 1 fra nukleotid 82 til

nukleotid 621,

b) polynukleotidmolekyler som koder for et polypeptid som er minst 80 % identisk med aminosyresekvensen

ifølge SEKV. ID. NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala) og

c) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEKV. ID. NR. 6.fra nukleotid 82 til

nukleotid 621,

der polypeptidet som er kodet for av nevnte polynukleotid stimulerer proliferasjon av celler som er avledet fra mesenchymale stamceller eller deres forløpere.

I én utførelse omfatter det isolerte polynukleotidmolekyl en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 1 fra nukleotid 1 til nukleotid 621 eller en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 6 fra nukleotid 1 til nukleotid 621.

I en annen utførelse omfatter det isolerte polynukleotidmolekyl en nukleotidsekvens som vist i SEKV. ID NR. 1 fra nukleotid 82 til nukleotid 621.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer:

en transkripsjonspromoter,

et polynukleotidmolekyl ifølge krav 1 og en transkripsjonsterminator.

Ekspresjonsvektoren omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer: en trånskripsjonspromoter, et DNA-segment utvalgt fra gruppen som består av: a) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 1 fra nukleotid 82 til nukleotid 621; b) alleliske

varianter av (a); c) polynukleotidmolekyler som koder for et polypeptid som er minst 60 % identisk med aminosyresekvensen i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala); og d) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 6 fra nukleotid 82

-til nukleotid 621; og en transkripsjonsterminator.

I en utførelse beskrives en dyrket celle i hvilken det er innført en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at den uttrykker et polypeptid som kodes av DNA-segmentet.

I en annen utførelse beskrives en dyrket celle i hvilken en ekspresjonsvektor er innført som omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer: en trånskripsjonspromoter, et DNA-segment utvalgt fra gruppen som består av: a) polynukleotidmolekyler som,omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 1 fra nukleotid 82 til nukleotid 621; b) alleliske varianter av (a); c) polynukleotidmolekyler som koder for et polypeptid som er minst 60 % identisk med aminosyresekvensen i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala); og d) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 6 fra nukleotid 82 til nukleotid 621; og en transkripsjonsterminator, hvori cellen uttrykker et polypeptid som kodes av DNA-segmentet.

I en utførelse beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av et FGF-homologpolypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter: dyrking av en celle ifølge krav 6, hvorved nevnte celle uttrykker et FGF-homologpolypeptid som er kodet for av DNA-segmentet, og gjenvinne FGF-homologpolypeptidet.

I en annen utførelse beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av et FGF-homologpolypeptid som omfatter: dyrking av en celle i hvilken det er innført en ekspresjonsvektor som omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer: en trånskripsjonspromoter; et DNA-segment; utvalgt fra gruppen som består av: a) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 1 fra nukleotid 82 til nukleotid 621; b) alleliske varianter av (a); c) polynukleotidmolekyler som koder for et polypeptid som er minst 60 % identisk med aminosyresekvensen i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala); og d) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 6 fra nukleotid 82 til nukleotid 621; og en transkripsjonsterminator, hvori cellen uttrykker et FGF-homologpolypeptid som kodes av DNA-segmentet; og gjenvinning av FGF-homologpolypeptidet.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et isolert FGF-homologpolypeptid, kjennetegnet ved at det er utvalgt fra gruppen som består av: a) polypeptidmolekyler som omfatter en aminosyre-restsekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys); b) alleliske varianter som er minst 80 % identiske med aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys), der polypeptidet har ekvivalent biologisk aktivitet som polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys); og c) polypeptidmolekyler som er minst 90 % identiske med SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys), der polypeptidet har en ekvivalent biologisk aktivitet som polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys).

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et isolert FGF-homologpolypeptid utvalgt fra gruppen som består av: a) polypeptidmolekyler som omfatter en aminosyresekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala); b) alleliske varianter av (a); og c) polypeptidmolekyler som er minst 60 % identiske med aminosyrene i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala).

I ytterligere en utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et FGF-homologpolypeptid som videre omfatter, en signalsekvens.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et FGF-homologpolypeptid som videre omfatter en signalsekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra. aminosyrerest 1 (Met) til aminosyrerest 27 (Ala).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et farmasøytisk preparat som omfatter et renset FGF-homologpolypeptid ifølge oppfinnelsen, kombinert med et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff, kjennetegnet ved at det binder spesifikt til polypeptidmolekylet som består av en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2, fra residie 1 (Met) til residie 207 (Ala).

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et antistoff som binder et polypeptidmolekyl som omfatter en aminosyresekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys).

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for stimulering av proliferasjon av myocytter eller myocyttforløpere, der forbindelsen omfatter en mengde av et FGF-homologpolypeptid ifølge oppfinnelsen, som er tilstrekkelig til å frembringe en klinisk signifikant økning av antallet myocytter eller myocyttforløpere hos et pattedyr, der FGF-homologipolypeptidet omfatter minst et konservert motiv CXFXEX(6)Y, der X er en hvilken som helst aminosyre og X(6) er antallet X-aminosyrer større enn én, og et heparinbindende domene, til behandling av hjertesykdom, hjerteinfarkt, kongestiv hjertesvikt, hypertrofisk kardiomyopati, dilatert kardiomyopati, slag, systemisk eller pulmonal hypertensjon, bendefekter, benbrudd, periodontal sykdom, osteoporose, artritt og andre beslektede tilstander.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for stimulering av proliferasjon av myocytter eller myocyttforløpere, hvori myocyttene eller myocyttforløperne er hjertemyocytter eller hjertemyocyttfor-løpere.

I en.annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte-, for eks vivb-stimulering av myocyttforløperceller'eller myocytter, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av hjertevevscellér med en mengde av proteinet ifølge oppfinnelsen som er tilstrekkelig til å frembringe en økning i antallet myocyttforløperceller eller myocytter i hjertevevsdellene som dyrkes i nærvær av et FGF-homolpgpolypeptid, sammenlignet med myocyttforløperceller eller myocytter fra hjertevev dyrket i fravær av et FGF-homologpolypeptid.

I en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for levering av et middel eller legemiddel til hjertevev," der fremstillingen omfatter å binde et første, molekyl som omfatter et FGF-homologpolypeptid ifølge oppfinnelsen til et andre molekyl som omfatter et middel eller et legemiddel for å danne en kimer der administreringen av kimeren leverer middelet eller legemiddelet til hjertevev, der FGF-homologipolypeptidet omfatter minst et konservert motiv CXFXEX(6)Y, der X er en hvilken som helst aminosyre og X(6) er antallet X-aminosyrer større enn én, og et heparinbindende domene, til behandling av hjertesykdom, hjerteinfarkt, kongestiv hjertesvikt, hypertrofisk kardiomyopati, dilatert kardiomyopati, slag, systemisk eller pulmonal hypertensjon, bendefekter, benbrudd, periodontal sykdom, osteoporose, artritt og andre beslektede tilstander.

Det beskrives også en fremgangsmåte for tilførsel av et middel eller et medikament selektivt til hjertevev som omfatter: kobling av et FGF-homologpolypeptid til et annet molekyl som omfatter et middel eller medikament slik at det dannes en kimær, og tilførsel av kimæren til hjertevev.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 og figur 2 viser en flersekvensoppstilling bestående av human fibroblastvekstfaktorhomologfaktor 1 (FHF-1), human myocyttaktiverende faktor (FGF-10), human fibroblastvekstfaktorhomologfaktor 4 (FHF-4), human fibroblast-vekstf aktorhomologf aktor 2 (FHF-2), human fibroblastvekstfaktorhomologfaktor 3.(FHF-3), human FGF-4, human FGF-6, human FGF-2 (basisk), human FGF-1 (sur), human keratinocytt-vekstfaktor 2 (KGF-2), human keratinocyttvekstfaktorforløper

(FGF-7), human zFGF-5, human FGF-8, human FGF-5, human FGF-9 og human FGF-3. "<*>" betegner konserverte aminosyrer; ":" betegner konserverte aminosyresubstitusjoner; og "." betegner mindre stringent konserverte aminosyresubstitusjoner. ;Fig. 3 er en interfamiliær likhetstabell som viser prosent identitet mellom human FGF-5, human FGF-6, human FGF-7, human FGF-8, human FGF-9, human zFGF-5, human FGF-10, human FGF-1, human FHF-1, human FGF-2, human FHF-2, human FHF-4, human FGF-3, human KGF-2, human FHF-3 og human FGF-4. ;Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen ;Begrepet "ortolog" (eller "artshomolog") betegner et polypeptid eller protein erholdt fra én art som viser homologi méd et analogt polypeptid eller protein fra en forskjellig art.- ;Begrepet "paralog" betegner et polypeptid eller protein erholdt fra en gitt art som viser homologi med et atskilt polypeptid eller protein fra samme art. ;Begrepet "allelisk variant" betegner enhver av to eller flere alternative former av et gen som besitter samme kromosomlokus. Allelisk variasjon oppstår naturlig ved mutasjon og kan føre til fenotypisk polymorfisme innen popula-sjoner. Genmutasjoner kan være tause (ingen endring i det kodede polypeptid) eller de kan kode for polypeptider med endret aminosyresekvens. Begrepet allelisk variant benyttes også heri for å betegne et protein som kodes av en allelisk variant av et gen. ;Begrepet "ekspresjonsvektor" betegner et DNA-molekyl, lineært eller sirkulært, som omfatter et segment som koder for et polypeptid av interesse, operativt koblet til ytterligere segmenter som sørger for dets transkripsjon. Slike tilleggssegmenter kan omfatte promoter- og terminator-sekvenser og kan om ønskelig omfatte ett eller flere replika-sjonsorigi, én eller flere seleksjonsmarkører, en enhancer, et polyadenyleringssignal og lignende. Ekspresjonsvektorer er generelt avledet fra plasmid-DNA eller virus-DNA eller de. kan omfatte elementer fra begge. ;Begrepet "isolert", anvendt på et polynukleotidmolekyl, betegner at polynukleotidet er fjernet fra sitt naturlige genetiske miljø og således er fritt for andre over- ' flødige eller uønskede kodende sekvenser og at det foreligger i en form som er egnet for anvendelse innen produksjons-systemer for genetisk endrede proteiner. Slike isolerte molekyler er molekyler som er fjernet fra sitt naturlige miljø og omfatter cDNA-kloner og genomiske kloner. Isolerte DNA-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er fri for andre gener med hvilke de vanligvis er forbundet, men kan omfatte naturlig forekommende 5'- og 3<1->ikke-translaterte områder, f.eks. ■ promotere og terminatorer. Identifisering av forbundne områder vil være åpenbare for gjennomsnittsfagfolk (se f.eks. Dynan and Tijan, Nature, 316:774-78, 1985). Brukt på et protein viser begrepet "isolert" til at proteinet foreligger i en tilstand som er forskjellig fra dets native miljø, f.eks. fjernet fra blod og dyrevev. I en foretrukket form er det isolerte protein i det vesentlige fritt for andre proteiner, særlig andre proteiner fra dyr. Det foretrekkes at proteinet tilveiebringes i høyt renset tilstand, dvs. mer enn 95 % rent, mer foretrukket mer enn 99 % rent. ;Begrepet "operativt sammenkoblet", benyttet på DNA-segmenter, betyr 'at segmentene er arrangert slik at de fun-gerer sammen for sine påtenkte formål, f.eks. innledes transkripsjon i promoteren og forløper gjennom det kodende segment til terminatoren. ;Begrepet "polynukleotid" betegner en enkelt- eller dobbelttrådet polymer av deoksyribonukleotidbaser eller ribo-nukleotidbaser lest fra 5'- til 3'-enden, polynukleotider omfatter RNA og DNA og kan være isolert fra naturlige kilder, syntetisert in vitro eller fremstilt ved en kombinasjon av naturlige og syntetiske molekyler. ;Begrepet "komplementer av polynukleotidmolekyler" betegner polynukleotidmolekyler med en komplementær base-sekvens og revers orientering, sammenlignet med en referanse-sekvens. F.eks. er sekvensen 5 '„ ATGCACGGG 3' komplementær til 5<1> CCCGTGCAT 3 * .

Begrepet "degenerert nukleotidsekvens" betegner en nukleotidsekvens som omfatter ett eller flere degenererte kodoner (sammenlignet med et referansepolynukleotidmolekyl som koder for et polypeptid). Degenererte kodoner inneholder forskjellige nukleotidtripletter, men koder for samme aminosyrerest (f.eks. koder triplettene GAU og GAC begge for Asp).

Begrepet "promoter" viser til en del av et gen som inneholder DNA-sekvenser som tilveiebringer binding av RNA-polymerase og initiering av transkripsjon. Promotersekvenser finnes vanligvis, men ikke alltid, i geners 5'-ikke-kodende områder.

Begrepet "sekresjonssignalsekvens" betegner en DNA-sekvens som koder for et polypeptid (et "sekretorisk peptid") som, som en bestanddel av et større polypeptid, styrer det større polypeptid gjennom en sekretorisk vei i en celle i hvilken det syntetiseres. Det større peptid kløyves vanligvis slik at det sekretoriske peptid fjernes mens peptidet tran-sporteres gjennom den sekretoriske vei.

Begrepet "reseptor" betegner et celleassosiert protein som bindes til et bioaktivt molekyl (dvs. en ligand) og formidler ligandens virkning på cellen. Membranbundne reseptorer særpreges ved en flerdomene struktur som omfatter et ekstracellulært, ligandbindende domene og et intracellulært effektordomene som typisk deltar i signaloverføring. Binding av ligand til res<;>eptoren fører til en konformasjonsendring i reseptoren som forårsaker en interaksjon mellom effektor-domenet og ett eller flere andre molekyler i cellen. Denne interaksjon fører i sin tur til endret cellemetabolisme. Metabolske begivenheter som er koblet til reseptor-ligand-interaksjoner omfatter gentranskripsjon, fosforylering, de-fosforylering, økt produksjon av syklisk AMP, mobilisering av cellulært kalsium, mobilisering av membranlipider, celle-adhesjon, hydrolyse av inositollipider og hydrolyse av fosfo-lipider. De fleste kjernereseptorer har også en flerdomene-struktur som omfatter et aminoterminalt, transaktiverende domene, et DNA-bindende domene og et ligandbindende domene. Generelt kan reseptorer være membranbundne, cytosoliske eller nukleære; monomere (f.eks. tyroidstimulerende hormonreseptor, beta-adrenerg reseptor) eller multimere (f.eks. PDGF-reseptor, veksthormonreseptor, IL-3-reseptor, GM-CSF-reseptor, G-CSF-reseptor, erytropoietinreseptor og IL-6-reseptor).

Begrepet "komplement/anti-komplement par" betegner ikke-identiske grupper som danner et ikke-kovalent forbundet, stabilt par under egnede betingelser. F.eks. er bibtin og

avidin (eller streptavidin) prototypiske medlemmer av et komplement /anti-komplement par. Andre eksempler på komplement/- anti-komplement par omfatter reseptor/ligandpar, antistoff/- antigen (eller hapten eller epitop)-par, "senseVantisense"-polynukleotidpar og lignende. Dersom påfølgende dissosiasjon av komplement/antikomplementparet er ønskelig, har komplement /antikomplementparet fortrinnsvis en bindingsaffinitet på

<10<9> M'<1>.

Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på opp-dagelsen av en ny DNA-sekvens som koder for et fibroblastvekstfaktor(FGF)homologpolypeptid med homologi til FGF-8. Analyse av vevsdistribusjonen for mRNA som tilsvarer dette nye DNA, viste at ekspresjonen var høyest i føtalt hjertevev og voksent hjertevev, fulgt av åpenbart, men redusert, ekspresjonsnivå i føtal lunge, skjelettmuskel, glatte muskelvev som tynntarm, colon og luftrør. FGF-homologpeptidet betegnes zFGF-5.

De nye zFGF-5-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse ble opprinnelig identifisert ved å gjennomsøke en EST-database for 'vekstfaktorer. En enkelt EST-sekvens ble funnet og vist å være beslektet med FGF-familien. Det nye FGF-homologpolypeptid som kodes av fullengde-cDNA, inneholdt et motiv med formelen: CXFXEX{6}Y, hvori X er enhver aminosyre og X{} er et antall X-aminosyrer større enn én. Dette motiv forekommer i alle kjente medlemmer av FGF-familien og finnes kun i disse proteiner.

Nukleotidsekvensen til zFGF-5-cDNA er beskrevet i SEKV.ID. NR. 1 og den utledede aminosyresekvens er beskrevet i SEKV.ID. NR. 2. Dersom aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 181 (Gin) i SEKV.ID. NR. 2 sammenlignes med det tilsvarende området i FGF-8 (se figurene 1 og 2) viser de opp-stilte og utledede aminosyresekvenser tilnærmet 56 % identitet.

Det nye polypeptid som kodes av polynukleotidet som beskrives heri, inneholder CXFXE{6}Y-motivet som foreligger i alle medlemmer av FGF-familien. CXFXE{6}Y-motivene er høyt konserverte. En konsensus-aminosyresekvens for CXFXEX{6}Y-doménet.. omfatter human f ibroblastvekstf aktorhomologf aktor 1 .(FHF-1; Smallwood et ål.-, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93:9850-9857, 1996), human myocyttaktiverende faktor (FGF-i.0; HSU76381: GENBANK-identifikasjon, http://www.ncbi.nlm.nih-.-gov/), human fibroblastvekstfaktorhomologfaktor 4 (FHF-4; Smallwood et al., 1996,' ibid.), human fibroblastvekstfaktor-homologf aktor 2 (FHF-2; Smallwood et al., 1996, ibid.), human fibroblastvekstfaktorhomologfaktor 3 (FHF-3; Smallwood et al., 1996, ibid.), human FGF-4 (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59:115-165, 1992), human FGF-6 (Basilico et al., 1992, ibid.), human FGF-2 (basisk; Basilico et al., 1992, ibid.), human FGF-1 (sur; Basilico et al., 1992, ibid.), human kera-tinooyttvékstfaktor 2 .(KGF-2; HSU67918: GENBANK-identifikasjon http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), human keratinocyttvekst-fåktorforløper (FGF-7; Basilico et al., 1992, ibid.), human zFGF-5,. human FGF-8 (Gemel et al., Genomics 35:253-257, 1996), human FGF-5 (Basilico et al., 1992, ibid.), human FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell. Biol., 13:4251-4259, 1993), og human FGF-3 (Basilico et al., 1992, ibid.).

Analyse av cDNA som koder for et zFGF-5-polypeptid (SEKV.ID. NR. 1) viste en åpen leseramme som koder for 207 aminosyrer (SEKV/ID. NR. 2) og som omfatter et modent polypeptid på 180 aminosyrer (aminosyrerest 28 til aminosyrerest 207 i SEKV.ID. NR. 2). En flersekvensoppstilling av zFGF-5 med andre kjente FGF viste en blokk med høy prosent av identitet som tilsvarte aminosyrerest 127 (Cys) til aminosyrerest 138 (Tyr) i SEKV.ID. NR. 2 og som er vist i figuren. Flere medlemmer av FGF-familien har ingen signalsekvens.

Medlemmer av FGF-familien særpreges ved heparinbindende domener. Et mulig heparinbindende domene i zFGF-5 er identifisert i området mellom aminosyrerest 14 8 (Gly) og aminosyrerest 169 (Gin) i SEKV.ID. NR. 2. Det postuleres at reseptorformidlet signalisering innledes ved binding av FGF-ligand i kompleks med heparinsulfat-proteoglykaner på celle-overflaten. Mange FGF-familiernedlemmer kan plasseres i én av to beslektede familier basert på struktur og funksjon, aFGF og bFGF består a<y> tre eksoner atskilt av to introner med variabel lengde. FGF-8 består av fem eksoner, hvorav de før-ste tre tilsvarer det første ekson i aFGF og bFGF. Alle kjente FGF-familiernedlemmer spleises slik at det dannes et

enkelt polypeptid.

SEKV.ID. NR. 6 er en degenerert polynukleotid-sekvens som omfatter alle polynukleotider som kan kode for zFGF-5-polypeptidet ifølge SEKV.ID. NR. 2 (aminosyrene 1 eller 28 til 207). Således omfattes zFGF-5-polypeptidkodende polynukleotider som går fra nukleotid 1 eller 82 til nukleotid 621 i SEKV.ID. NR. 6, av foreliggende oppfinnelse. Også omfattet av foreliggende oppfinnelse er fragmenter og fus-jonsprodukter som beskrevet ovenfor når det gjelder SEKV.ID. NR. 1, som er dannet fra analoge områder i SEKV.ID. NR. 6, hvori nukleotidene 82 til 621 i SEKV.ID. NR. 6 tilsvarer nukleotidene 82 til 621 i SEKV.ID. NR. 1, for koding av et modent zFGF-5-molekyl.

Symbolene i SEKV.ID. NR. 6 er oppsummert i tabell 1 nedenfor.

De genererte kodoner som benyttes i SEKV.ID. NR. 6 og som omfatter alle mulige kodoner for en gitt aminosyre, er beskrevet i tabell 2 nedenfor.

Én gjennomsnittsfagmann vil forstå at en viss ambiguitet innføres ved beskrivelse av et degenerert kodon som er representativt for alle mulige kodoner som koder for hver aminosyre. F.eks. kan det degenererte kodon for serin (WSN) under visse omstendigheter kode for arginin (AGR) og det degenererte kodon for arginin (MGN) kan under visse omstendigheter kode for serin (AGY). Et tilsvarende forhold foreligger mellom kodoner som koder for fenylalanin og leu-

ein. Således kan visse polypeptider som omfattes av den degenererte sekvens, ha noen ukorrekte aminosyrer, men en gjennomsnittsfagmann kan lett identifisere slike feilaktige sekvenser ved henvisning til aminosyresekvensen i SEKV.ID. NR. 2.

De høyt konserverte aminosyrer i zFGF-5 kan benyttes som middel for å identifisere nye familiemedlemmer. For å identifisere nye familiemedlemmer i EST-databaser, kan det konserverte CXFXEX{6}Y-motiv benyttes. I en annen fremgangs-- måte som benytter polynukleotidprober og hybridiseringsmetod-er, kan RNA erholdt fra en rekke vev benyttes for fremskaf-felse av cDNA-biblioteker som gjennomsøkes for nye familiemedlemmer. Nærmere bestemt kan revers transkripsjons-polymerasekjedereaksjonen (RT-PCR) benyttes for amplifisering av sekvenser med benyttelse av høyt degenererte DNA-primere utformet fra sekvensene tilsvarende aminosyrerest 127 (Cys) til aminosyrerest 138 (Tyr) i SEKV.ID. NR. 2.

Innenfor foretrukne utførelser av oppfinnelsen vil de isolerte polynukleotider benyttes som probe og hybridisere til områder av tilsvarende størrelse i SEKV.ID. NR. 1 eller en sekvens som er: komplementær til denne under stringente betingelser. Generelt utvelges stringente betingelser slik at de er tilnærmet 5 °C lavere enn smeltepunktet (Tm) for den spesifikke sekvens ved en definert ionestyrke og pH. Tm er den temperatur (under definert ionestyrke og pH) ved hvilken 50 % av målsekvensen hybridiserer til en perfekt tilpasset probe. Typiske stringente betingelser er betingelser hvor saltkonsentrasjonen er minst tilnærmet 0,02 M ved pH 7 og temperaturen er minst tilnærmet 60 °C.

Som bemerket tidligere omfatter de isolerte polynukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse DNA og RNA. Fremgangsmåter for isolering av DNA og RNA er velkjente innen faget. Det foretrekkes generelt å isolere RNA fra hjertevev, selv om DNA også kan fremstilles ved å benytte RNA fra andre vev eller isoleres som genomisk DNA. Total-RNA kan fremstilles ved å benytte guanidin-HCl-ekstraksjon, fulgt av isolering ved sentrifugering i en CsCl-gradient (Chirgwin et al., Biochemistry, 18:52-94, 1979). Poly (A)<+> RNA fremstilles fra total-RNA ved å benytte fremgangsmåtet-til Aviv og Leder

(Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69:1408-1412, 1972). Komplemen-tært DNA (cDNA) fremstilles fra poly(A)<+->RNA ved å benytte kjente fremgangsmåter. Polynukleotider som koder for zFGF-5-polypeptider kan så identifiseres og isoleres ved, f.eks., hybridisering eller PCR.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre tilsvarende polypeptider og polynukleotider fra andre arter (ortologer eller paraloger). Av spesiell interesse er zFGF-5-polypeptider fra andre pattedyrsarter, heriblant mus, rotte, svin, fugl, storfe, hund, katt, hest og andre primatprotein-er. Identifisering av paraloger av den humane sekvens er spesielt interessant, siden det er slik at mens det er identifisert 8 paraloger av muse-FGF-8 er kun fire humane paraloger kjent. Humane paraloger eller artshomologer av de humane proteiner kan klones ved å benytte informasjon og preparater som tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse, kombinert med konvensjonelle kloningsteknikker. F.eks. kan et cDNA klones ved å benytte mRNA isolert fra et vev eller en celletype som uttrykker proteinet. Egnede mRNA-kilder kan identifiseres ved å analysere Northern-blot med prober utformet fra sekvensene som beskrives heri. Et bibliotek fremstilles så fra mRNA fra et positivt vev eller en positiv cellelinje. Et CDNA som koder for zFGF-5, kan så isoleres ved en rekke fremgangsmåter, f.eks. ved analyse med et fullstendig eller ufullstendig humant cDNA eller med ett eller flere sett av degenererte prober basert på de beskrevne sekvenser. Et cDNA kan også klones ved å benytte polymerasekjedereaksjonen eller PCR (Mullis, US-patentskrift nr. 4 683 202) ved benyttelse av primere utformet fra sekvensene som beskrives heri. I nok en fremgangsmåte kan cDNA-biblioteket benyttes for transformer-ing eller transfeksjon av vertsceller og ekspresjon av det interessante cDNA kan påvises med et antistoff mot zFGF-5. Tilsvarende teknikker kan også benyttes for isolering av genomiske kloner.

Fagfolk vil forstå at sekvensene som beskrives i SEKV.ID. NR. 1 og SEKV.ID. NR. 2 representerer et enkelt allel av det humane zFGF-5-gen og -polypeptid og at allelisk variasjon og alternativ spleising kan forventes å forekomme. - Alleliske varianter kan klones ved å analysere cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer ifølge standard fremgangsmåter. Alleliske varianter av DNA— sekvensen som er vist i SEKV.ID. NR. 1, heriblant sekvenser, som inneholder tause mutasjoner og sekvenser hvor mutasjoner fører, til aminosyresekvensendringer, ligger innenfor foreliggende oppfinnelses område, likeså, proteiner som er alleliske varianter av SEKV.ID. NR. 2.

Det beskrives også isolerte zFGF-5-polypeptider som viser omfattende homologi med polypeptidene i SEKV.ID. NR. 2 og deres artshomologer/ortologer. Begrepet "omfattende homologi" benyttes heri for å betegne polypeptider med 50 %, fortrinnsvis 60 %, mer. foretrukket minst 80 % sekvensidentitet med sekvensene vist i SEKV.ID. NR. 2 eller disse ortologer eller paraloger. Slike peptider vil mer foretrukket være minst-90 % identiske og mest foretrukket 95 % identiske eller mer, med SEKV.ID.-NR. 2 eller dennes ortologer eller paraloger. Prosent sekvensidentitet bestemmes ved konvensjonelle fremgangsmåter. Se f.eks. Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 og Henikoff og Henikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:10915-10919, 1992. Kort beskrevet oppstilles to aminosyresekvenser slik at poengsummen for oppstillingen optimaliseres ved å benytte en gapåpningsstraff på 10, en gapforlengelsesstraff på 1, og "blosum 62"-substitusjonstabellen til Henikoff og Henikoff (ibid.), som vist i tabell 3 (aminosyrene er angitt ved standard énbokstavkoder). Prosent identitet beregnes så som:

Totalantall identiske par

x 100

[Lengde av den lengste sekvens pluss antall gap innført i den lengste sekvens for å oppstille de to sekvenser]

Sekvensidentitet for polynukleotidmolekyler bestemmes ved tilsvarende fremgangsmåter ved å benytte en brøk som beskrevet ovenfor.

Proteiner og polypeptider med omfattende homologi særpreges ved at de har én eller flere aminosyre-substitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner. Disse endringer er fortrinnsvis av uvesentlig type, dvs. konservative aminosyresub-stitus joner (se tabell 4) og andre substitusjoner som ikke i vesentlig grad påvirker folding eller aktivitet av proteinet eller polypeptidet; små delesjoner, typisk fra én til tilnærmet 30 aminosyrer; og små amino- eller karboksylterminale forlengelser, f.eks. en aminoterminal metioninrest, et lite linkerpeptid på opp til tilnærmet 20-25 aminosyrerester eller en liten forlengelse som forenkler rensing (en affinitetsmerkelapp), f.eks-. et polyhistidinstrekk, protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol., 198:3, 1991), glutation-S-transferase (Smith og Johnson, Gene 67:31, 1988), maltosebindende protein (Keller-man og Ferenci, Methods Enzymol., 90:459-463, 1982; Guan et al., Gene 67:21-30, 1987) eller en annen åntigenisk epitop eller et bindingsdomene. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991, som inkorporeres heri ved referanse. DNA som koder for affinitetsmerkelapper, er tilgjengelig fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly,

MA) .

Proteinene som beskrevet heri kan i tillegg til de 20 vanlige aminosyrer, også omfatte ikke-naturlig forekommende aminosyrerester. Ikke-naturlig forekommende aminosyrer omfatter, uten begrensning, trans-3-metylprolin, 2,4-metanoprolin, cis-4-hydroksyprolin, trans-4-hydroksyprolin, N-metylglysin, allo-treonin, metyltreonin, hydroksy-etylcystein, hydroksyetylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, pipekolsyre, tert.-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenyl-alanin, 4-fluorfenylalanin, 4-hydroksyprolin, 6-N-metyllysin, 2-aminoiso-smørsyre, isovalin og ot-metyl-serin. Flere fremgangsmåter er kjent innen faget for innføring av ikke-naturlig forekommende aminosyrerester i poteiner. F.eks. kan et in vitro-system benyttes, hvori "nonsens"-mutasjoner undertrykkes ved å benytte kjemisk aminoasylerte suppressor-tRNA. Fremgangsmåter for syntese av aminosyrer og aminoasylering av tRNA er kjent innen faget. Transkripsjon og translasjon av plasmider som inneholder "nonsens"-mutasjoner, utføres i et cellefritt system som omfatter et E. coli S30-ekstrakt og kommersielt tilgjengelige enzymer og andre reagenser. Proteiner renses ved kromatograf i. Se f.eks. Robertson et al., J. Am. Chem. Soc, 113:2722, 1991; Ellman et al., Meth. Enzymol. 202-301, 1991; Chung et al., Science 259:806-09, 1993; og Chung et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:10145-49, 1993). I en annen fremgangsmåte utføres translasjonen i Xenopus-oocytter ved mikroinjeksjon av mutert mRNA og kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem., 271:19991-98, 1996). I en tredje fremgangsmåte dyrkes E. coli-celler i fravær av en naturlig aminosyre som skal erstattes (f.eks. fenylalanin) og i nærvær av den eller de ønskede, ikke naturlig forekommende, aminosyrer (f.eks. 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin eller 4-fluorfenylalanin). Den ikke naturlig forekommende aminosyre innføres i proteinet i stedet for sin naturlige motpart. Se Koide et al., Biochem., 33:7470-76, 1994. Naturlig forekommende aminosyrerester kan overføres til ikke-naturlig forekommende typer ved kjemisk modifisering in vitro. Kjemisk modifisering kan kombineres med setestyrt mutagenese for ytterligere å utvide omfanget av substitusjoner (Wynn og Richards, Protein Sei., 2:395-403, 1993) .

Essensielle aminosyrer i zFGF-5-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan identifiseres ifølge fremgangsmåter kjent innen faget, f.eks. setestyrt mutagenese eller alaninscanning-mutagenese (Cunningham og Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). I denne siste teknikk innføres enkle alaninmutasjoner av hver aminosyrerest i molekylet og de resulterende muterte molekyler analyseres for biologisk aktivitet (f.eks. proliferasjon av hjertemyocytter eller fibroblaster, eller stimulering av beindannelse) for identifisering av aminosyrerester som er avgjørende for molekylets aktivitet. Se også Hilton et al., J. Biol. Chem., 271:4699-4708, 1996. Seter for ligandreseptorinteraksjon kan også bestemmes ved fysisk analyse av strukturen, bestemt ved teknikker som nukleær magnetisk resonans, krystallografi, elektrondiffrak-sjon eller fotoaffinitetsmerking, forbundet med mutasjon' av mulige aminosyrer i kontaktsetet. Se f.eks. de Vos et al., Science, 255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol., 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett., 309:59-64, 1992. Identitetene av essensielle aminosyrer kan også utledes ved analyse av homologier med beslektede FGF, og er vist i figurene 1 og 2.

Analyser av aminosyresekvensen til zFGF-5 viste et dibasisk sete i proteinets karboksyende 196-197 (Lys-Arg)).

Et C-terminalt avkortet polypeptid som omfattet en aminosyresekvens som vist i SEKV.ID. NR. 2, fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys), ble vist å ha biologisk aktivitet. Dibasiske aminosyrer, f.eks.-Arg-X-X-Arg (hvori X er hvilken som helst aminosyrerest), Arg-Arg eller Lys-Arg; kløyves av flere enzymer, heriblant, men ikke begrenset til, trombin og karboksypeptidaser. Det er derfor innenfor krav-enes område å utføre konservative endringer av dibasiske aminosyrerester, særlig de dibasiske rester i aminosyrerest 196 og 197 (Lys hhv. Arg) i SEKV.ID. NR. 2.

Basert på analyser av FGF-familien kan et C-terminalt avkortet molekyl som omfatter sekvensen fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 175 (Met) i SEKV.ID. NR. 2, være biologisk aktivt. En intramolekylær disulfidbro forventes å foreligge mellom aminosyrerest 109 (Cys) og aminosyrerest 129 (Cys) i SEKV.ID. NR. 2.

Basert på homologioppstillinger med krystallstruk-turen til FGF-1 og FGF-2 (Eriksson et al., Prot. Sei., 2:1274, 1993), tilsvarer de områder hvor sekundærstruktur-utledningene tilsier beta-platestruktur i zFGF-5-sekvensene mellom aminosyrerestene 56-59, 64-69, 73-76, 85-92, 96-102, 106-111, 115-119, 128-134, 138-144, 149-155 og 173-177 i SEKV.ID. NR. 2. Aminosyrer som er avgjørende for binding av zFGF-5 til reseptorer kan identifiseres ved setestyrt mutagenese av hele zFGF-5-polypeptidet. Nærmere bestemt kan de identifiseres ved å benytte setestyrt mutagenese av aminosyrer i zFGF-5-polypeptidet som tilsvarer aminosyrerester i sur FGF (FGF1) og basisk FGF (FGF2) som er vist å være av-gjørende for binding av disse FGF til sine reseptorer (Blaber et al., Biochem., 35:2086-2094, 1996). Disse aminosyrer omfatter Tyr33, Arg53-, AsnllO,' Tyrll2, Lysll9, Trpl23, Leul49 og Metl51 i human FGF2 og Tyr30, Arg50, Asnl07, Tyrl09, Lysll6, Trpl22', Leul48-og Leul50 i human FGF1, som vist i fig. 1 og fig. 2. De tilsvarende aminosyrer i zFGF-5, som' vist i fig. 1 og..fig. 2, vil være Tyr58, Gly'7-7', Asnl36, Tyrl38, Lysl45, Trpl49; Metl75 og Argl77. En fagmann vil inn-se at. andre medlemmer av FGF-familien helt eller delvis kan ha strukturelle eller biokjemiske likheter med zFGF-5 og disse kan substitueres ved slike analyser. Slike områder kan være viktige for molekylets biologiske funksjoner.

Multiple aminosyresubstitusjoner kan utføres og analyseres ved å benytte kjente fremgangsmåter for mutagenese og gj-ennbmsøking, f .eks."den beskrevet av Reidhaar-Olson-og Sauer (Science 241:53-57, 1988) eller Bowie og Sauer (Proe. Nati. Acad. Sei.,.USA, 86:2152-2156, 1989). Kort sagt be-skriver disse forfattere fremgangsmåter for samtidig randomi-sering av to eller flere posisjoner i et polypeptid, seleksjon av et funksjonelt polypeptid og så sekvensering av mutageniserte polypeptider for å bestemme spekteret for tillate-lige substitusjoner i hver posisjon. Andre fremgangsmåter som kan benyttes omfatter "phage display" (se f.eks. Lowman et al., Biochem. 30:1.0832-10837, 1991; Ladner et al., US-patentskrift nr. 5 223 409; Huse, WIPO-publikasjon WO 92/06204) og områdestyrt mutagenese (Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al., DNA, 7:127, 1988).

Mutagenesefremgangsmåter som beskrevet ovenfor, kan kombineres med automatiserte gjennomsøkingsfremgangsmåter med høy gjennomstrømning for påvisning av aktivitet av klonede, mutageniserte polypeptider i vertsceller. Mutageniserte DNA-molekyler som koder for aktive polypeptider (f.eks. celleproliferasjon), kan gjenvinnes fra vertscellene og hurtig sekvenseres ved å benytte moderne utstyr. Disse fremgangsmåter tillater hurtig bestemmelse av betydningen av enkeltamino-syrerester i et polypeptid av interesse og kan benyttes på polypeptider med ukjent struktur.

Ved å benytte fremgangsmåtene som diskuteres ovenfor kan en gjennomsnittsfagmann identifisere og/eller frem-stille en rekke polypeptider som viser omfattende homologi med sekvensen fra aminosyrerest 28 (Glu) til 196 (Lys) eller fra aminosyrerest 28 (Glu) til 207 (Ala) i SEKV.ID. NR. 2, alleliske varianter av disse eller biologisk aktive fragmenter av disse, og bibeholdelse av villtypeproteinets proliferative egenskaper. Slike polypeptider kan også omfatte ytterligere polypeptidsegmenter, som generelt beskrevet ovenfor.

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, heriblant full-lengdeproteiner, fragmenter av disse og fusjonsproteiner, kan fremstilles i genetisk endrede vertsceller ifølge' konvensjonelle teknikker. Egnede vertsceller er de celletyper som kan transformeres eller transfekteres med eksogent DNA og dyrkes i kultur og omfatter bakterier, soppceller og dyrkede, høyere eukaryote celler. Eukaryote celler, særlig dyrkede celler fra multicellulære organismer, foretrekkes. Teknikker for manipulering av klonede DNA-molekyler og innføring av eksogent DNA i en rekke forskjellige vertsceller, er beskrevet av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, og Ausubel et al.

(red.), Currént Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987, som inkorporeres heri ved referanse.

Generelt er en DNA-sekvens som koder for et zFGF-5-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, operativt koblet til andre genetiske elementer som kreves for dets ekspresjon, generelt omfattende en trånskripsjonspromoter og -terminator i en ekspresjonsvektor. Vektoren vil også vanligvis inneholde én eller flere seleksjonsmarkører og ett eller flere replika-sjonsorigi, selv om fagfolk vil forstå at seleksjonsmarkører i visse systemer kan tilveiebringes på separate vektorer og at replikasjon av det eksogene DNA kan oppnås ved integrasjon i vertscellegenomet. Seleksjon av promotere, terminatorer, seleksjonsmarkører, vektorer og andre elementer dreier seg om rutinemessig utforming som ligger innenfor det normale kunn-skapsnivå innen faget. Mange slike elementer er beskrevet i litteraturen og er tilgjengelige gjennom kommersielle leve-randører .

For å styre et zFGF-5-polypeptid inn i en verts-celles sekresjonsvei, tilveiebringes en sekresjonssignalsekvens (også kalt en ledersekvens, preprosekvens eller pre-sekvens) i ekspresjonsvektoren. Sekresjonssignalsekvensen kan være den native sekvens eller en kimær som omfatter en signalsekvens avledet fra et annet utskilt protein (f.eks. t-PA

og a-pre-pro-sekresjonsleder) eller syntetisert de novo. Sekresjonssignalsekvensen kobles til zFGF-5-DNA-sekvensen i den korrekte leseramme. Sekresjonssignalsekvenser er vanligvis plassert 5' for DNA-sekvensen som koder for polypeptidet av interesse, selv om visse signalsekvenser kan være plassert andre steder i DNA-sekvensen av interesse (se f.eks. Welch et al., US-patentskrift nr. 5 037 743; Holland et al., US-patentskrift nr. 5 143 830).

Et universelt akseptorplasmid som kan benyttes for kloning av et DNA som koder for ethvert polypeptid av interesse, heriblant polypeptidfusjoner, beskrives. Akseptorplasmidet er anvendbart i en fremgangsmåte for fremstilling av et dobbelttrådet, sirkulært DNA-molekyl. Fremgangmsåten omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av et dobbelttrådet

donor-DNA-fragment som koder for et polypeptid av interesse;

(b) tilveiebringelse av et•dobbelttrådet, lineært akseptorplasmid med to butte ender og omfattende en seleksjonsmarkør og en replikasjonssekvens som er funksjonell i Saccharomyces cerevisiae, hvori akseptorplasmidet i det vesentlige er fritt for DNA som koder for polypeptidet av interesse; (c) tilveiebringelse av en første dobbelttrådet DNA-linker som omfatter et første segment som er identisk i sekvens med et første område i akseptorplasmidet og et andre segment som er identisk i sekvens til et første område i donor-DNA-fragmentet, hvori både det første og det andre segment i den første linker er minst 10 bp langt, (d) tilveiebringelse av en andre dobbelttrådet DNA-linker som omfatter et første segment som er identisk i sekvens med et andre område i akseptorplasmidet og et andre segment som er identisk i sekvens til et andre område i donor-DNA-fragmentet, hvori både det første og det andre segment i den andre linker er minst 10 bp langt, og (e) kombinering av donor-DNA-fragmentet, akseptorplasmidet, den første DNA-linker og den andre DNA-linker i en Saccharomyces cerevisiae-vertscelle, hvorved donor-DNA-fragmentet kobles til akseptorplasmidet ved homolog rekombinasjon av donor-DNA, akseptorplasmid og linkere, slik at det dannes et lukket, sirkulært plasmid. Akseptorplasmidet-.omfatter videre en tran-

skripsjonspromoter nær den første ende, og donor-DNA-fragmentet er operativt koblet til transkripsjonspromoteren i det lukkede, sirkulære plasmid. Akseptorplasmidet omfatter videre et DNA-segment som koder for et lederpeptid og/eller ett eller flere DNA-segmenter som koder for en peptidmerkelapp, plassert slik at disse DNA-segmenter er operativt koblet til donor-DNA-fragmentet i det lukkede, sirkulære plasmid. I en foretrukket utførelse omfatter akseptorplasmidet videre (a) en promoter, det DNA-segment som koder for et lederpeptid og et DNA-segment som koder for en første peptidmerkelapp, hvori DNA-segmentet som koder for et lederpeptid, er plassert mellom promoteren og DNA-segmentet som koder for en første peptidmerkelapp nær den første ende av akseptorplasmidet, hvori promoteren, DNA-segmentet som koder for et lederpeptid og DNA-segmentet som koder for en første peptidmerkelapp, er operativt sammenkoblet, og (b) et DNA-segment som koder for en andre peptidmerkelapp nærmest den andre ende av akseptorplasmidet .

Det beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av et dobbelttrådet, sirkulært DNA-molekyl som omfatter følgende trinn: (a) tilveiebringelse av et stort antall overlappende, dobbelttrådede donor-DNA-fragmenter som sammen koder for et polypeptid av interesse; (b) tilveiebringelse av et dobbelttrådet, lineært akseptorplasmid med butt første og andre ende, og omfattende en seleksjonsmarkør og en replikasjonssekvens som er funksjonell i Saccharomyces cerevisiae, hvori akseptorplasmidet er i det vesentlige fritt for DNA som koder for polypeptidet av interesse, (c) tilveiebringelse av en første dobbelttrådet DNA-linker som omfatter et første segment som er identisk i sekvens med et første område i akseptorplasmidet og et andre segment som er identisk i sekvens med et første område i ett av donor-DNA-fragmentene, hvori både det første og det andre segment i den første linker er minst 10 bp langt, (d) tilveiebringelse av en andre dobbelttrådet DNA-linker som omfatter et første segment som er identisk i sekvens med et andre område i akseptorplasmidet og et andre segment som er identisk i sekvens med et område i et annet av donor-DNA-fragmentene, hvori både det første og det ■ andre segment i den andre linker er minst 10 bp langt, og (e) kombinering av donor-DNA—fragmentene, akseptorplasmidet, den første DNA-linker o.g den andre DNA-linker i en Saccharomyces cérevisiae-vertscelle, hvorved donor-DNA-fragmentene kobles til akseptorplasmidet ved homolog rekombinasjon slik at det dannet et lukket, sirkulært plasmid som omfatter et område som koder for polypeptidet av interesse. Akseptorplasmidet omfatter videre én eller flere av en transkripsjonspromotor, et DNA-segment som koder for et lederpeptid og ett eller flere DNA-segmenter som koder for en peptidmerkelapp som beskrevet ovenfor.

Soppceller, heriblant gjærceller, og spesielt celler fra slekten Saccharomyces eller Pichia, er spesielt foretrukne vertsceller for fremstilling av zFGF-5-fragmenter eller polypeptidfusjoner.

Andre fremgangsmåter for transformasjon av gjærceller med eksogent DNA og fremstilling av rekombinante polypeptider fra disse, er f.eks. beskrevet av Kawasaki, US-patentskrift nr. 4 599 311; Kawasaki et al., US-patentskrift nr. 4 931 373; Brake, US-patentskrift nr. 4 870 008; Welch et al., US-patentskrift nr. 5 037 743; og Murray et al., US-patentskrift nr. <4 845 075, som inkorporeres heri ved referanse. Transformerte celler selekteres ut fra fenotype bestemt av seleksjonsmarkøren, vanligvis medikamentresistens eller evnen til å vokse i fravær av et gitt næringsstoff (f.eks. leucin). Et alternativt foretrukket vektorsystem for anvendelse i gjær er POTl-vektorsystemet beskrevet av Kawasaki et al. (US-patentskrift nr. 4 931 373), som tillater seleksjon av transformerte celler ved vekst i glukoseholdig medium. Egnede promotere og terminatorer for anvendelse i gjær omfatter promotere og terminatorer fra glykolytiske enzymgener (se f.eks. Kawasaki, US-patentskrift nr.

4 599 311; Kingsman et al., US-patentskrift nr. 4 615 974; og Bitter, US-patentskrift nr. 4 977 092, som inkorporeres heri ved referanse) og alkoholdehydrogenasegener. Se også US-patentskrif ter nr. 4 990 446; 5 063 154; 5 139 936 og 4 661 454, som inkorporeres heri ved referanse. Transforma-sjonssystemer for andre.typer gjær, heriblant Hansenula poly-morpha, Schizosaccharomyces pombe, kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago.maydis, Pichia pastorls, Pichia guillermondii og Candida maltosa er kjent innen faget. Et spesielt foretrukket system benytter Pichia methanolica- (se PCT-søknad WO 9 717 450). For alternative transformasjons-systemer, se f.eks. Gle.eson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-3465, 1986 og Cregg, US-patentskrift nr. 4 882 279. Aspergillus-celler kan benyttes ifølge fremgangsmåtene til McKnight et al., US-patentskrift nr. 4 935 34 9 som inkorporeres heri ved referanse. Fremgangsmåter for transformasjon av Acremonium chrysogenum er beskrevet av Sumino et al., US-patentskrift nr. 5 162 228 som inkorporeres heri ved referanse .. Fremgangsmåter for transformasjon av Neurospora beskrives "av -Lambowi.tz, -US-patentskrift nr. 4 486 533 som,inkorporeres heri ved referanse.

Dyrkede, pattedyrceller er også foretrukne verter i foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåter for innføring av eksogent DNA i pattedyrvertsceller omfatter kalsiumfosfat-formidlet transfeksjon (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham og Van der Eb, Virology 52:456, 1973), elektroporering (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982), DEAE-dekstranfor-midlet transfeksjon (Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987), og liposomformidlet transfeksjon (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993), som inkorporeres heri ved referanse. Fremstilling av rekombinante polypeptider i dyrkede pattedyrceller beskrives f.eks. av Levinson et al., US-patentskrift nr. 4 713 339; Hagen et al., US-patentskrift nr. 4 784 950; Palmiter et al., US-patentskrift nr. 4 579'821; og Ringold, US-patentskrift nr. 4 656 134 som inkorporeres heri ved referanse. Foretrukne, dyrkede pattedyrceller omfatter cellelinjene COS-1 (ATCC-betegnelse CRL 1650), COS-7 (ATCC-betegnelse CRL 1651), BHK 570 (ATCC-betegnelse CRL 10314), 293 (ATCC-betegnelse CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) og "Chinese hamster ovary" (f.eks. CHO-K1; ATCC-betegnelse CCL 61). Ytterligere egnede cellelinjer er kjent innen faget og tilgjengelige fra allment tilgjengelige.lagringssteder, f.eks. American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Generelt foretrekkes kraftige transkripsjonspromotere, f.eks. promotere fra SV-40

eller cytomegalovirus. Se f.eks. US-patentskrift nr.

4 956 288. Andre- egnede promotere omfatter promotere fra metallotioneingener (US-patentskrift nr. 4 579 821 og 4 601 978, som inkorporeres heri ved referanse) og den sene hovedpromoter fra adenovirus.

Medikamentseleksjon benyttes generelt for seleksjon av dyrkede pattedyrceller i hvilke fremmed DNA er innsatt. Slike celler betegnes vanligvis som "transfektanter". Celler som er dyrket i nærvær av seleksjonsmidlet og som kan over-føre genet av interesse til sitt avkom, betegnes "stabile transfektanter". En foretrukket seleksjonsmarkør er et gen som koder for resistens mot antibiotikumet neomycin. Selek-sjonen utføres i nærvær av et medikament av neomycintype, f.eks. G-418 eller lignende. Seleksjonssystemer kan også benyttes for å øke ekspresjonsnivået av genet av interesse, en prosess betegnet "amplifisering". Amplifisering utføres ved å dyrke transfektanter i nærvær av et lavt nivå av seleksjonsmidlet, og deretter øke mengden seleksjonsmiddel for seleksjon av celler som produserer høye nivåer av produktene fra de innførte gener. En foretrukket amplifiserbar seleksjons-markør er dihydrofolatreduktase som overfører resistens mot metotreksat. Andre medikamentresisténsgener (f.eks. hygro-mycinresistens, multimedikamentresistens, puromycinacetyl-transferase) kan også benyttes.

Andre høyere eukaryote celler kan også benyttes som verter, heriblant insektsceller, planteceller og fugleceller. Transformasjon av insektsceller og fremstilling av fremmede polypeptider i disse, beskrives av Guarino et al., US-patentskrift nr. 5 162 222; Bang et al., US-patentskrift nr. 4 775 624; og WIPO-publikasjon WO 94/06463 som inkorporeres heri ved referanse. En oversikt over anvendelse av Agrobacterium rhizogenes som vektor for ekspresjon av gener i planteceller, gis av Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987.

Transformerte eller transfekterte vertsceller dyrkes ifølge konvensjonelle fremgangsmåter i et dyrkningsmedium som inneholder næringsstoffer og andre bestanddeler som er nødvendige for vekst av de valgte vertsceller. En rekke egnede medier, heriblant definerte medier og komplekse medier, er kjent innen faget og omfatter generelt en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer og mine-raler. Medier kan også inneholde bestanddeler som vekstfaktorer eller serum, etter behov. Vekstmediet vil generelt sel-ektere celler som inneholder det eksogent tilførte DNA, f.eks. ved medikamentseleksjon eller mangel på et essensielt næringsstoff som komplementeres av seleksjonsmarkøren som foreligger i ekspresjonsvektoren eller som kotransfekteres inn i vertscellen.

Uttrykte, rekombinante zFGF-5-polypeptider (eller kimære zFGF-5-polypeptider) kan renses ved å benytte fraksjonering og/eller konvensjonelle rensefremgangsmåter og medier. Ammoniumsulfatutfelling og sur eller kaotrop ekstraksjon kan benyttes for fraksjonering av prøver. Eksempler på rensetrinn kan omfatte hydroksyapatittkromatografi, størr-elseseksklusjonskromatografi, FPLC og reversfasehøyytelses-væskekromatografi. Egnede anionbyttermedier omfatter deri-vatiserte dekstraner, agarose, cellulose, polyakrylamid, spesielle kiselgeler og lignende. PEI-, DEAE-, QAE- og Q-derivater foretrekkes, med DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) som spesielt foretrukket. Eksempler på kromatografimedier omfatter medier som .er derivatisert med fenylgrupper, butylgrupper eller oktylgrupper, f.eks. Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) og lignende; eller polyakrylresiner som Amberchrom CG 71 (Toso Haas) og lignende. Egnede faste støttemidler omfatter glasskuler, kiselgelbaserte resiner, celluloseresiner, agarosekuler, kryssbundne agarosekuler, polystyrenkuler, kryssbundne poly-akrylamidresiner og lignende som er uløselige under de betingelser hvor de skal benyttes. Disse støttemidler kan modi-fiseres med reaktive grupper som tillater tilkobling av proteiner via aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper, hydroksylgrupper og/eller karbohydratgrupper. Eksempler på koblingskjemier omfatter cyanogenbromidaktivering, N-hydrok-sysuccinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydrylaktiver-ing, hydrazidaktivering og karboksyl- og aminoderivater for karbodiimidkobling. Disse og andre faste medier er velkjente og hyppig anvendte innen faget, og er tilgjengelige fra kommersielle leverandører. Fremgangsmåter for binding av resep-torpolypeptider til støttemedier er velkjente innen faget. Valg av en gitt fremgangsmåte dreier seg om rutinemessig utforming og bestemmes delvis av egenskapene til det valgte støttemiddel. Se f.eks. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige, 1988.

Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også isoleres ved å utnytte deres heparinbindingsegenskaper. For en oversikt se Burgess et al., Ann. Rev. of Biochem., 58:575-606, 1989. Medlemmer av FGF-familien kan renses til tilsynelatende homogenitet ved heparin-Sepharose-affinitets-kromatografi (Gospodarowicz et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 81:6963-6967, 1984) og elueres med lineære trinngradienter av NaCl (Ron et al., J. Biol. Chem., 268 (4):2984-2988, 1993; Chromatography: Principles & Methods, s. 77-80, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige, 1993; i "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Hermanson et al., red., s. 165-167, Academic Press, San Diego, 1992; Kjellen et al., Ann. Rev. Biochem. Ann. Rev. Biochem., 60:443-474, 1991; og Ke et al., Protein Expr. Purif., 3 (6):497-507, 1992.)

Andre rensemetoder omfatter anvendelse av immobilisert metallionadsorpsjonskromatografi (IMAC) for rensing av histidinrike proteiner. Kort beskrevet lades en gel først med divalente metallioner slik at det dannes et chelat (E. Sulkowski, Trends in Biochem., 3:1-7, 1985). Histidinrike proteiner vil adsorberes til dette støttemedium med forskjellig affinitet, avhengig av det benyttede metallion og vil elueres ved kompetitiv eluering, reduksjon av pH eller anvendelse av kraftige chelateringsmidler. Andre fremgangsmåter for rensing omfatter rensing av glykosylerte proteiner ved lektinaffinitetskromatografi og ionebytterkromatografi (Methods in Enzymol., bind 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (red.), Acad. Press, San Diego, 1990, s. 529-39). Alternativt kan en fusjon mellom polypeptidet av interesse og en affinitetsmerkelapp (f.eks. polyhistidin, maltosebindende protein, et immunoglobulindomene) fremstilles for å lette rensing.

Fremgangsmåter som omfatter proteinfolding (og om ønskelig reoksidasjon) kan med fordel benyttes. Det foretrekkes å rense proteinet til >80 % renhet, mer foretrukket til >90 % renhet, enda- mer foretrukket >95 % og spesielt foretrukket er en farmasøytisk ren tilstand, dvs. mer enn 99,9 % rent med hensyn til" kontaminerende makromolekyler, særlig andre proteiner og nukleinsyrer, og fritt for infektiøse og pyrogene midler. Et renset protein vil fortrinnsvis være i det vesentlige fritt for andre proteiner, særlig andre proteiner fra dyr.

zFGF-5-polypeptider eller fragmenter av disse kan også fremstilles ved kjemisk syntese. zFGF-5-polypeptider kan være monomerer eller multimerer, glykosylerte eller ikke-glykosylerte, pegylerte eller ikke-pegylerte, og de kan omfatte en n-terminal metioninrest- eller ikke gjøre det.

Aktiviteten til molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan måles ved å benytte en rekke analyser som f.eks. måler neogenese eller hyperplasi (dvs. proliferasjon) av hjerteceller, basert på vevsspesifisiteten i hjerte hos voksne. Ytterligere aktiviteter som sannsynligvis er forbundet med polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter proliferasjon av endotelceller, kardiomyocytter, fibroblaster og skjelettmyocytter, enten direkte eller indirekte via andre vekstfaktorer, virkning som kjemotaksisk faktor for endotelceller, fibroblaster og/eller fagocytterende celler, osteogen faktor og faktor for ekspansjon av mesenchymstam-celle- og forløperpopulasjoner.

Proliferasjon kan måles ved bruk av dyrkede hjerteceller eller in vivo ved tilførsel av molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse til en egnet dyremodell. Generelt observeres proliferative effekter som økt celletall, og de kan derfor omfatte inhibering av apoptose så vel som mitogenese. Dyrkede celler omfatter hjertefibroblaster, hjertemyocytter, skjelettmyocytter og humane endotelceller fra navlesnor i primærkulturer. Etablerte cellelinjer omfatter: NIH 3T3-fibroblast (ATCC-betegnelse CRL-1658), CHH-l-hjerteceller fra ketalaks (ATCC-betegnelse CRL-1680), H9c2-rottehjertemyo-blaster (ATCC-betegnelse CRL-1446), Shionogi-brystkarsinomceller (Tanaka et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 89:8928-8932, 1992) og LNCap.FGC-adenokarsinomceller (ATCC-betegnelse CRL-1740). Analyser som måler celleproliferasjon er velkjente innen faget. Analyser som måler proliferasjon omfatter f.eks. analyser som_chemosensitivitet ovenfor fargestoffet nøytral-rødt (Cavanaugh et al.., Investigationål New Drugs 8:347-354', 1990, som inkorporeres heri ved' referanse), inkorporering av radioaktive nukleotider (Cook et al., Analytical Biochem., 179:1-7, 1989, som inkorporeres heri ved referanse), inkorporering av 5-brom-2<1->deoksyuridin (BrdU) i DNA i proliferér-ende celler (Porstmann et al., J. Immunol. Methods, 82:169-179, 1985, som inkorporeres heri ved referanse) og anvendelse av tetrazoliumsalter (Mosmann, J. Immunol. Methods, 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg., 5, 69-8.4, 1995; og Scudiero et al., Cancer Res.,- 48:4827-4833, 19.88-)~ som alle inkorporeres heri ved. referanse).

Differensiering er en progressiv og dynamisk prosess som begynner med pluripotente stamceller og ender med terminalt differensierte celler. Pluripotente stamceller som kan dele seg uten "og differensieres, uttrykker et sett av differensieringsmarkører som går tapt når cellen forpliktes til differensiering. Forløperceller uttrykker et sett av dif-ferensieringsmarkører som enten vil eller ikke vil fortsette og uttrykkes etterhvert som cellene differensieres mot mod-ning. Differensieringsmarkører som kun uttrykkes på modne celler, har vanligvis funksjonelle egenskaper som celleprodukter, enzymer for fremstilling av celleprodukter og reseptorer. En cellepopulasjons grad av differensiering måles ved å identifisere markører som foreligger i cellepopulasjonen. Myocytter, osteoblaster, adipocytter, kondrocytter, fibroblaster og retikulærceller antas å stamme fra en felles mesenchymal stamcelle '(Owen et al., Ciba Fdn. Symp., 136:42-46, 1988). Markører for mesenchymale stamceller er ikke godt identifisert (Owen et al., J. of Cell Sei., 87:731-738, 1987), så identifiseringen utføres vanligvis på forløper-cellestadiet og i modne celler. Eksistensen av tidlig stadium hjertemyocyttforløperceller (ofte betegnet hjertemyocyttstam-celler) har blitt foreslått, men ikke vist, i hjertevev hos voksne. De nye polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse, er anvendbare i forsøk, på isolering av mesenchymale stamceller og hjertemyocyttforløperceller, både in vivo og eks vivo. Forsøk kan tyde på at faktorer som stimulerer spesifikke celletyper på en vei mot terminal differensiering eller dedifferensiering, påvirker hele cellepopulasjonen som har opphav i en felles forløpercelle eller stamcelle. Foreliggende oppfinnelse omfatter således stimulering av inhibering eller proliferasjon av myocytter, glatte muskelceller, osteoblaster, adipocytter, kondrocytter og endotelceller. Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan samtidig som de stimulerer proliferasjon eller differensiering av hjertemyocytter, inhibere proliferasjon eller differensiering av adipocytter, grunnet virkningen på deres felles forløperceller/- stamceller. Således har molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelse ved inhibering av kondrosarkomer, ateroskle-rose, restenose og fedme.

Analyser som måler differensiering, omfatter f.eks. måling av celleoverflatemarkører forbundet med stadiespesi-fikk ekspresjon i et vev, enzymatisk aktivitet, funksjonell aktivitet eller morfologiske endringer (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation, 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989, som alle inkorporeres, heri ved referanse.

In vivo-analyser for evaluering av hjerteneogenese eller hyperplasi omfatter behandling av neonatale og voksne rotter med molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse. Dyr-enes hjertefunksjon måles som hjertefrekvens, blodtrykk og hjerte.ytelse for å bestemme funksjonen av venstre ventrikkel. Post-mortem-fremgangsmåter for å anslå forbedret hjerteakti-vitet, omfatter: økt hjertevekt, forholdet mellom volum av kjerner og cytoplasma, farging av histologiske hjertesnitt for å bestemme forholdet mellom "proliferating cell nuclear antigen" (PCNA)-og cytoplasmatisk actin (Quaini et al., Circulation Res., 75:1050-1063, 1994 og Reiss et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 93:8630-8635, 1996).

In vivo-analyser for måling av endringer i bein-danningshastigheten, omfatter beinhistologiske undersøkelser (se Recker, R., red. Bone Histomorphometry: Techniques and Interpretation. Boca Raton: CRC Press, Inc., 1983) og kvanti-tativ datamaskintomografi (QCT; Ferretti, J. Bone 17:353S-364S, 1995; Orphanoludakis et al., Investig. Radiol. 14:122-130, 1979 og Durand et al., Medical Physics 19:569-573, 1992). En eks vivo-analyse for måling av endringer i beindannelse, kan f.eks. være en kalavarialanalyse (Gowen et al., J. Immunol., 136:2478-2482, 1986).

Når det gjelder modulering av energibalansen, særlig vedrørende adipocyttmetabolisme, -proliferasjon og -differensiering, modulerer zFGF-5-polypeptider virkninger på metabolske reaksjoner. Slike metabolske reaksjoner omfatter adipogenese, glukoneogenese, glykogenolyse, lipogenese, glu-koseopptak, proteinsyntese, termogenese, oksygenforbruk og lignende. Blant andre fremgangsmåter kjent innen faget og beskrevet heri, kan energibalansen hos pattedyr evalueres ved å måle én eller flere av de ovenfor nevnte metabolske funksjoner. Disse metabolske funksjoner følges ved teknikker (analyser eller dyremodeller) som er kjent blant gjennomsnittsfagfolk, som beskrevet i mer detalj nedenfor. F.eks. utøves de glukoregulatoriske virkninger av insulin hovedsakelig i lev-er, skjelettmuskel og fettvev. I skjelettmuskel og fettvev virker insulin ved å stimulere opptak, lagring og anvendelse av glukose.

Anerkjente fremgangsmåter foreligger for å følge alle de metabolske funksjoner som er angitt ovenfor. Således kan en gjennomsnittsfagmann evaluere zFGF-5-polypeptider, -fragmenter, -fusjonsproteiner, antistoffer, agonister og antagonister for metabolsk modulerende funksjoner. Eksempler på moduleringsteknikker er beskrevet nedenfor.

Insulinstimulerende lipogenese kan f.eks. følges

ved å måle inkorporering av <14>C-acetat i triglyserid (Mackall et al., J. Biol. Chem., 251:6462-6464, 1976) eller triglyse-ridakkumulering (Kletzien et al., Mol. Pharmacol., 41:393-398, 1992).

zFGF-5-stimulert opptak kan f.eks. evalueres i en analyse av insulinstimulert glukosetransport. Primære adipocytter eller NIH 3T3 Ll-celler (ATCC nr. CCL-92.1) plasseres i DMEM tilsatt 1 g/l glukose, 0,5 eller 1,0 % BSA, 20 mM Hepes og 2 mM glutamin. Etter to til fem timers dyrkning erstattes mediet med friskt, glukosefritt DMEM tilsatt 0,5 eller 1,0 % BSA, 20 mM Hepes, 1 mM pyruvat og 2 mM glutamin. Egnede konsentrasjoner av zFGF-5, insulin eller IGF-1 eller en fortynningsserie av analyseforbindelsen, tilsettes og

cellene inkuberes i 20-30 min. <3>H- eller <14>C-merket deoksy-glukose tilsettes til «50 uM sluttkonsentrasjon og cellene inkuberes i tilnærmet 10-30 min. Cellene vaskes så raskt med kald buffer (f.eks. PBS) og lyseres med et egnet lyserings-middel (f.eks. 1 % SDS eller 1 N NaOH). Cellelysatet analyseres så ved måling av radioaktivitet i en scintillasjonsteller. Celleassosiert radioaktivitet benyttes som mål på glukosetransport etter subtraksjon av uspesifikk binding, bestemt ved inkubering av celler i nærvær av cytocholasin b, en inhibitor av glukosetransport. Andre fremgangsmåter omfatter dem beskrevet av f.eks. Manchester et al., Am. J. Physiol., 266 (Endocrinol. Metab., 29):E326-E333, 1994 (insulinstimulert glukosetransport).

Proteinsyntese kan f.eks. evalueres ved å sammen-ligne utfelling av <35>S-metioninmerkede proteiner etter inkubering av analysecellene med <35>S-metionin, og <35>S-metionin og en mulig modulator av proteinsyntesen.

Termogenese kan evalueres som beskrevet av B. Stanley i The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers and C. Wahlestedt (red.), Humana Press, Ottawa, 1993, s. 457-509;: C. Billington et al., Am. J. Physiol., 260:R321, 1991; N. Zarjevski et al., Endocrinology, 133:1753, 1993; C. Billington et al., Am. J. Physiol., 266:R1765, 1994; Heller et al., Am. J. Physiol., 252 (4 Pt 2): R661-7, 1987; og Heller et al., Am. J. Physiol., 245 (3): R321-8, 1983. Videre er metabolsk hastighet, som kan måles ved en rekke teknikker, et indirekte mål på termogenese.

Oksygenforbruk kan måles som beskrevet av Heller et al., Pflugers Arch, 369(1): 55-9, 1977. Denne fremgangsmåte omfattet også en analyse av hypotalmisk temperatur og metabolsk varmeproduksjon. Oksygenforbruk og termoregulering har også blitt evaluert i mennesker som beskrevet av Haskell et al., J. Appl. Physiol., 51(4): 948-54, 1981.

zFGF-5-polypeptider kan også benyttes for fremstilling av antistoffer som spesifikt bindes til zFGF-5-epitoper, -peptider eller -polypeptider. Fremgangsmåter for fremstilling av polyklonale og monoklonale antistoffer er velkjente innen faget (se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, 2. utgave,- Cold. Spxi-ng Harbor, NY, 1989;

og Hurrell, J. G. R., red., Monoclonal Hybridoma Antibodies:-Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982, som inkorporeres heri ved referanse). En gjennomsnittsfagmann vil vite at polyklonale antistoffer kan fremstilles i en rekke varmblodige dyr, f.eks. hester, kuer, geiter, sauer, hunder, kylling, kaniner, mus og rotter.

Immunogenisiteten av et zFGF-5-polypeptid kan for-sterkes ved benyttelse av en adjuvans, f.eks. alum (alumin-iumhydroksid) eller Freund's komplette eller ukomplette adjuvans. Polypeptider som er anvendbare for immunisering, omfatter også fusjonspolypeptider, f.eks. fusjoner mellom zFGF-5 eller en del av dette med et immunoglobulinpolypeptid eller med maltosebindende protein. Polypeptidimmunogenet kan være et molekyl av full lengde eller en del av dette. Dersom poly-peptiddelen er "haptenlignende" kan denne del med fordel kobles eller bindes til et makromolekylært bærestoff (f.eks. "keyhole limpet"-hemocyanin (KLH), bovint serumalbumin (BSA) eller tetanus toksoid) for immunisering.

Som benyttet heri omfatter begrepet "antistoffer" polyklonale antistoffer, affinitetsrensede polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer og antigenbindende fragmenter, f.eks. de proteolytiske fragmenter F(ab<1>)2 og Fab. Genetisk endrede, intakte antistoffer eller fragmenter, f.eks. kimære antistoffer, Fv-fragmenter, enkeltkjedeantistoffer og lignende, så vel som syntetiske antigenbindende peptider og polypeptider, omfattes også. Ikke-humane antistoffer kan humaniseres ved å transplantere kun de ikke-humane CDR inn i humane rammeverksområder og konstante områder, eller ved inn-føring av intakte ikke-humane variable domener (og om ønskelig å "bekle" dem med en humanlignende overflate ved å erstatte eksponerte aminosyrerester, hvori resultatet er et "fernisert" antistoff). I noen tilfeller kan humaniserte antistoffer beholde ikke-humane aminosyrerester i de humane rammeverksdomener i variable områder for å fremme ønskede bindingsegenskaper. Ved å humanisere antistoffer kan den biologiske halveringstid forlenges, mens faren for uønskede im-munreaksjoner ved tilførsel til mennesker reduseres. Alternative teknikker for frembringelse og seleksjon av antistoffer som er anvendbare heri omfatter in vitro-behandling av lymfo-cytter med zFGF-5-prdtein eller' -peptid og seleksjon av antistoff-"display"-biblioteker i bakteribfager eller tilsvarende vektorer (f.eks. ved benyttelse av immobilisert eller merket zFGF-5-protein eller -peptid).

Antistoffer defineres til å ha spesifikk binding dersom de bindes til et zFGF-5-polypeptid med en bindingsaffinitet (Ka) på IO<6>M"<1> eller større, fortrinnsvis IO<7> M"<1 >eller høyere, mer foretrukket IO<8> M"<1> eller høyere og mest foretrukket IO<9> M"<1> eller høyere. Bindingsaffiniteten for et antistoff kan lett bestemmes av en gjennomsnittsfagmann (f.eks. ved Scatchard-analyse). -■-En rekke, analysemetoder kjent blant fagfolk, kan benyttes for å påvise antistoffer som spesifikt bindes til zFGF-5-proteiner eller -peptider. Eksempler på slike analysemetoder er beskrevet i detalj i Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow og Lane (red.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Representative eksempler på slike analysemetoder omfatter: parallell immunelektroforese, radioimmunanalyse, radioimmunutfelling, enzymkoblet immunadsorbsjonsanalyse (ELISA), "dot blot"- eller Western-blot-analyse, inhibisjons-analyse eller konkurranseanalyse og "sandwich"-analyse. I tillegg kan antistoffer gjennomsøkes for binding til villtype hhv. mutant zFGF-5-protein eller -peptid.

Antistoffer mot zFGF-5 kan benyttes for merking av celler som uttrykker zFGF-5; for målstyring av et annet protein, lite molekyl eller kjemikalium til hjertevev; for isolering av zFGF-5 ved affinitetsrensing; for diagnostiske analyser for å bestemme nivået av zFGF-5-polypeptider i sirkulasjonen; for påvisning eller kvantitering av løselig zFGF-5 som markør for underliggende patologiske tilstander eller sykdommer; i analytiske fremgangsmåter som benytter FACS; for gjennomsøking av ekspr.esjonsbiblioteker; for frembringelse av anti-idiotypiske antistoffer; og som nøytraliserende antistoffer eller som antagonister for blokkering av zFGF-5-for-midlet proliferasjon in vitro og in vivo. Egnede direkte merkelapper omfatter radioaktive isotoper, enzymer, substrat-er, kofaktorer, inhibitorer, fluorescerende markører, kjemi-luminisente markører, magnetiske partikler og lignende; indirekte merkelapper kan omfatte bruk av biotin-avidin eller andre komplement/antikomplementpar som intermediater. Antistoffer heri kan også være direkte eller indirekte konjugert til medikamenter, toksiner, radioaktive isotoper og lignende, og disse konjugater kan benyttes for in vivo-diagnostiske eller terapeutiske formål.

Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes for identifisering og isolering av reseptorer som deltar i myokardproliferasjon i hjertet. F.eks. kan proteiner og peptider ifølge foreliggende oppfinnelse immobiliseres på en kolonne, hvoretter membranpreparater kjøres gjennom kolonnen (Immobilized Affinity Ligand Technigues, Hermanson et al., red., Academic Press, San Diego, CA, 1992, s. 195-202). Proteiner og peptider kan også merkes radioaktivt (Methods in Enzymol.,-bind. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, red., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737) eller fotoaffinitetsmerkes (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem., 62:483-514, 1993, og Fedan et al., Biochem. Pharmacol., 33:1167-1180, 1984), hvoretter spesifikke celleoverflate-proteiner kan identifiseres.

Antagonister vil være anvendbare for inhibering av de proliferative aktiviteter av zFGF-5-molekyler i celletyper som hjerteceller, heriblant myocytter, fibroblaster og endotelceller; osteoblaster og kondrocytter. Gener som koder for zFGF-5-polypeptidbindende domener kan erholdes ved gjennom-søking av tilfeldige peptidbiblioteker fremvist på bakterio-fager (bakteriofag-"display") eller på bakterier, f.eks. E. coli. Nukleotidsekvenser som koder for polypeptidene kan erholdes på en rekke måter, f.eks. ved tilfeldig mutagenese og tilfeldig polynukleotidsyntese. Disse "display"-biblioteker for tilfeldige .peptider, kan benyttes for å søke etter peptider som interakterer med et kjent mål som kan være et protein eller et polypeptid, f.eks. en ligand eller en reseptor, et biologisk eller syntetisk makromolekyl eller organiske eller uorganiske forbindelser. Teknikker for fremstilling og gjennomsøking av slike "display"-biblioteker for tilfeldige peptider er kjent innen faget (Ladner et al., US-patentskrift nr. 5 223 409; Ladner et al.', US-patentskrift nr. 4 946 778; Ladner et al., US-patentskrift nr. 5 403 484 og Ladner et al., US-patentskrift nr. 5 571 698) og "display"-biblioteker for tilfeldige peptider og reagenssett for gjennomsøking av slike biblioteker er kommersielt tilgjengelige, f.eks. fra Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) og Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). "Display"-biblioteker for tilfeldige peptider kan gjennomsøkes ved å benytte zFGF-5-sekvensene som beskrives heri for identifisering av proteiner som bindes til zFGF-5. Disse "bindingsproteiner" som interakterer med zFGF-5-polypeptider kan benyttes for merking av celler, for isolering av homologe polypeptider ved affinitetsrensing, de kan direkte eller indirekte konjugeres til medikamenter, toksiner, radioaktive isotoper og lignende. Disse bindingsproteiner kan også benyttes i analytiske fremgangsmåter, f.eks. for gjennomsøking av ekspresjonsbibliotek-er og nøytraliserende aktivitet. Bindingsproteinene kan også benyttes i diagnostiske analyser for å bestemme nivået av polypeptider i sirkulasjonen, for påvisning eller kvantitering av løselige polypeptider som markører for underliggende patologiske tilstander eller sykdommer. Disse bindingsproteinene kan også fungere som zFGF-5-"antagonister" for blokkering av zFGF-5-binding og signaloverføring in vitro og in vivo. Disse anti-zFGF-5-bindingsproteiner ville være anvendbare for inhibering av ekspresjon av gener som fører til pro-lif eras jon eller differensiering, slike anti-zFGF-5-bindingsproteiner kan benyttes for behandling, f.eks. i rabdomyosar-kom, hjertemyxom, beincansere med opphav -i osteoblaster, samt dvergvekst, artritt, ligament og -bruskreparasjon, alene eller kombinert med andre former for terapi.

Molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse vil være anvendbare for proliferasjon av hjertevevsceller, f.eks. hjertemyocytter eller -myoblaster; skjelettmyocytter eller

-myoblaster og glatte muskelceller; kondrocytter; endotelceller; adipocytter og osteoblaster in vitro. F.eks. er molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbare som bestanddeler av definerte celledyrkningsmedier og de kan benyttes alene eller kombinert med andre cytokiner eller hormoner for å erstatte serum, som vanligvis benyttes ved celledyrking. Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendbare for spesifikk fremming av vekst og/eller utvikling av

myocytter. i kultur, og de kan' også vise seg anvendbare ved undersøkelser av hjertemyocytthyperplasi og -regenerering.

Polypeptidene, nukleinsyrene og/eller antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes ved behandling av forstyrrelser forbundet med myokardinfarkt, kongestiv hjertesvikt, hypertrofisk kardiomyopati og dilatert kardiomyopati. Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være anvendbare for å begrense infarktstørrelse etter et hjerteattakk, fremming av angiogenese og sårheling etter angioplasti eller endarterektomi, for etablering av koronar kollateral sirkulasjon, for revaskularisering i øyet, for komplikasjoner forbundet med dårlig sirkulasjon, f.eks. ved diabetiske fotsår, for slag, etter koronar reperfusjon ved benyttelse av farmakologiske fremgangsmåter og andre indikasjoner hvor angiogenese er fordelaktig. Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan være anvendbare for forbedring av hjertefunksjonen, enten ved å indusere hjertemyocyttneo-genese og/eller hyperplasi, ved induksjon av koronar kollate-raldannelse eller ved å indusere remodulering av nekrotiske, myokardiale områder. Andre terapeutiske anvendelser for foreliggende oppfinnelse omfatter induksjon av skjelettmuskel-• neogenese og/eller hyperplasi, nyreregenerasjon og/eller for behandling av systemisk og pulmonar hypertensjon.

zFGF-5-indusert, koronar kollateralutvikling måles

i kaniner, hunder eller griser ved benyttelse av modeller for kronisk, koronar okklusjon (Landau et al., Amer. Heart J. 29:924-931, 1995; Sellke et al., Surgery 120 (2):182-188, 1996 og Lazarous et al., 1996, ibid.) zFGF-5-fordeler ved behandling av slag analyseres in vivo i rotter ved benyttelse av bilateral halsarterieokklusjon og måling av histologiske endringer, så vel som labyrintytelse (Gage et al., Neurobiol. Aging, 9:645-655, 1988). zFGF-5-virkning ved hypertensjon analyseres in vivo ved å benytte spontant hypertensive rotter (SHR) for systemisk hypertensjon (Marche et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 1:S114-116, 1995).

Molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes for målstyring av midler eller medikamenter til hjertet. F.eks. vil molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse være anvendbare for begrensing av ekspresjon til hjertet, grunnet den spesifikke ekspresjon som styres av zFGF-5-pro-' moteren. F.eks. kan hjertespesifikk ekspresjon oppnås ved å benytte en zFGF-5-adenovirus disistronisk konstruksjon (Rothmann et al., Gene Therapy, 3:919-926, 1996). I tillegg kan zFGF-5-polypeptidene benyttes for å begrense andre midler eller medikamenter til hjertevev ved å koble zFGF-5-polypeptider til et annet protein (Franz et al., Circ. Res. 73:629-638, 1993), ved kobling av et første molekyl som består av et zFGF-5-homologpolypeptid til et annet middel eller medikament, slik at det dannes en kimær. Proteiner f.eks. antistoffer, kan benyttes for utforming av kimærer med zFGF-5-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse (Narula et al., J. Nucl. Cardiol. 2:26-34, 1995). Eksempler på midler eller medikamenter omfatter, men er ikke begrenset til, bioaktive polypeptider, gener, toksiner, radioaktive isotoper, lavmole-kylære farmasøytika og lignende. Koblingen kan være direkte eller indirekte (f.eks. liposomer) og kan oppstå ved rekombinante midler, kjemisk kobling, sterke ikke-kovalente inter-aksjoner og lignende.

I én utførelse benyttes et preparat som omfatter zFGF-5-protein som et terapeutisk middel for å fremme osteoblastformidlet beindannelse. Preparatene og fremgangsmåtene for benyttelse av preparatene ifølge oppfinnelsen, kan benyttes for å fremme reparasjon av beindefekter og -mangler, f.eks. slike som forekommer ved lukkede, åpne og ikke-forente brudd, for fremming av beinheling ved plastisk kirurgi, for stimulering av beinvekst inn i ikke-sementerte proteseledd og tannimplantasjoner ved behandling av periodontale sykdommer og defekter, for økt beindannelse under distraksjonsosteogenese, og ved behandling av andre skjelettforstyrrelser som kan behandles ved stimulering av osteoblastaktivitet, f.eks. osteoporose og artritt. De novo beindannelse tilveiebrakt ved fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, vil ha anvendelse ved reparasjon av kongenital, traumeindusert eller onkologisk beinreseksjon eller beinheling etter strålingsindusert osteonekrose (Hart et al., Cancer 37:2580-2585, 1976). Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også finne anvendelse ved plastisk kirurgi.

For farmasøytisk bruk utformes proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse for parenteral, særlig intravenøs eller subkutan, tilførsel ifølge konvensjonelle fremgangsmåter. Intravenøs tilførsel vil være ved bolusinjeksjon eller infusjon over et typisk tidsrom på fra én til flere timer. Generelt vil farmasøytiske preparater omfatte et zFGF-5-protein kombinert med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, f.eks. saltvann, buffret saltvann, 5 % dekstrose i vann eller lignende. Preparatene kan videre omfatte én eller flere eksi-pienser, ett eller flere konserveringsmidler, løsemidler, buffringsmidler, albumin for å forhindre proteintap på ampul-leoverflater og så videre. Fremgangsmåter for utformingen er velkjente innen faget og beskrives f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, red., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, som inkorporeres heri ved referanse. Terapeutiske doser vil generelt ligge i området fra 0,1 til 100 ug/kg pasientvekt pr. dag, fortrinnsvis 0,5-20 ug/kg pr. dag, hvor den nøyaktige dose bestemmes av den behandlende lege ifølge aksepterte standarder, hvor det tas hensyn til type og omfang av tilstanden som skal behandles, pasientens egenskaper og så >videre. Dosebestemmelse ligger innenfor det alminnelige kunnskapsnivået innen faget. Proteinene kan til-føres for akutt behandling over et tidsrom på én uke eller mindre, ofte over et tidsrom på fra 1 til 3 dager, eller de kan benyttes ved kronisk behandling over flere måneder eller år. Generelt er en terapeutisk effektiv mengde av zFGF-5 en mengde som er tilstrekkelig til å frembringe en klinisk signifikant endring i myocyttproliferasjonen, hjertefunksjonen, beindannelsen eller økt antall av spesifikke celletyper forbundet med mesenchymale stamceller og forløpere for myocytter, osteoblaster og kondrocytter. Nærmere bestemt kan en klinisk signifikant forhøyelse av antallet myocytter eller myocyttforløperceller bestemmes ved å måle tømmingsdelen fra venstre ventrikkel før og etter tilførsel av zFGF-5-molekyler, og bestemme minst 5 % økning, fortrinnsvis 10 % eller mer, i den totale tømmingsdel. Analyser for å bestemme tøm-mingsdelen, målt ved blod utpumpet pr. hjerteslag, er velkjente blant gjennomsnittsfagfolk.

Oppfinnelsen illustreres videre ved de påfølgende

eksempler.

Eksempler

Eksempel 1

Forlengelse av EST- sekvens

Gjennomsøking av en database over translatert DNA ved å benytte en søkesekvens for vekstfaktorer, førte til identifisering av en uttrykt sekvensmerkelapp(EST)-sekvens som ble vist å være et nytt medlem av FGF-familien og betegnet zFGF-5.

Oligonukleotidprimerene ZC11,676 (SEKV.ID. NR. 3) og ZC11/677- (SEKV. ID.-NR-. '4) ble utformet fra sekvensen-til den uttrykte sekvensmerkelapp (EST). Primerene ble benyttet for intern priming i -EST-sekvensen og ved utførelse av PCR med MARATHON READY cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) fra hjertevev fra voksne som templat i polymerasekjedereaksjonen

(PCR).

Betingelsene som ble benyttet for PCR, var 1 syklus ved 94 °C i 90 sek., 35 sykluser ved 94 °C i 15 sek, og 68 °C i 1 min, fulgt av 1 syklus i 10 min ved 72 °C, fulgt av hen-stand ved 4 °C. PCR-reaksjonen førte til dannelse av 160 bp av EST-sekvensen og bekreftet at EST-sekvensen var korrekt.

Andre biblioteker som kunne amplifiseres med oligonukleotidprimerene, omfattet skjelettmuskel, lunge, mage, tynntarm og skjoldbrukskjertel.

Eksempel 2

Vevsfordeling

Northern-analyser ble utført ved benyttelse av Human Multiple Tissue Blots fra Clontech (Palo Alto, CA). DNA-fragmentet- på 160 bp beskrevet i eksempel 1, ble fraksjonert ved elektroforese i en 1 % agarosegel, fragmentet ble elektroeluert og deretter radioaktivt merket ved benyttelse av et randomisert priming MEGAPRIME DNA-merkesystem (Amersham, Arlington Heights, IL) ifølge produsentens angivelser. Proben ble renset ved benyttelse av en NUCTRAP-stempelkolonne (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). EXPRESSHYB (Clontech, Palo Alto, CA) ble benyttet for pre-hybridisering og som hybridiseringsløsning for Northern-blottene. Hybridiseringen fant sted over natten ved 68 °C, hvoretter blottene ble vasket med 2 x SSC og 0,05 % SDS ved romtemperatur, fulgt av en vask med 0,1 X SSC og 0,1 % SDS ved 50 °C. Et enkelt bånd kunne observeres ved tilnærmet 2,0 kb. Signalintensiteten var høyest for hjertevev fra voksne, med relativt mindre intense signaler for skjelettmuskel og mage.

Eksempel 3

Analyse for in vitro- aktivitet av zFGF- 5

A. Den mitogene aktivitet av zFGF-5 analyseres ved å benytte cellelinjer og celler fra en primær kultur. Kondisjonert medium fra celler som uttrykker det rekombinante protein og/eller renset protein, tilsettes til kulturer av følgende cellelinjer: NIH 3T3 fibroblast (ATCC-betegnelse CRL-1658), CHH-l-ketalakshjerneceller (ATCC-betegnelse CRL-1680), H9c2-rottehjertemyoblaster (ATCC-betegnelse CRL-1446), Shionogi-brystkarsinomceller (Tanaka et al., 1992, ibid.) og LNCaP.FGC-adenokarsinomceller. Nyisolerte celler som er anvendbare for analyse av den proliferative aktivitet av zFGF-5 omfatter: hjertefibroblaster, hjertemyocytter, skjelettmyocytter og endotelceller fra human navlesnorvene.

Mitogen aktivitet analyseres ved måling av <3>H-tymidininkorporering basert på fremgangsmåten til Raines og Ross (Meth. Enzymology, 109:749-773, 1985). Kort beskrevet utsåes hvilende celler ved en tetthet på '3 x IO<4> celler/ml i et egnet medium. Et typisk vekstmedium er Dulbecco's vekstmedium (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) tilsatt 10 % føtalt kalveserum (FCS). Cellene dyrkes i 96-brønners plater og får vokse i 3-4 dager. Vekstmediet fjernes og 180 ul DFC (tabell 5) tilsatt 0,1 % FCS tilsettes til hver brønn. Halvparten av brønnene tilsettes zFGF-5-protein, mens den andre halvpart er negative kontroller uten zFGF-5. Cellene inkuberes i opp til 3 dager ved 37 °C i 5 % C02 og mediet fjernes. 100 ul DFC tilsatt 0,1 % FCS og 2 uCi/ml <3>H-tymidin tilsettes til hver brønn, hvoretter platene inkuberes i ytterligere 1-24 t ved 37 °C. Mediet avsuges og 150 ul trypsin tilsettes til hver brønn. Platene inkuberes ved 37 °C inntil cellene løsner (minst 10 min). De frigjorte celler høstes på filteret ved benyttelse av en LKB Wallac 1295-001 cellehøster (LKB Wallac, Pharmacia, Gaithersburg, MD). Filtrene tørkes ved oppvarming i en mikrobølgeovn i 10 min og radioaktiviteten måles i en LKB Betaplate 1250 scintillasjonsteller (LKB Wallac) som beskrevet av leverandøren.

Tabell 5

250 ml Dulbecco's modifisert Eagle's medium (DMEM, Gibco-BRL)

250 ml Ham's F12-medium (Gibco-BRL)

0,29 mg/ml L-glutamin (Sigma, St. Louis, MO)

1 mM natriumpyruvat (Sigma, St. Louis, MO)

25 mM Hepes (Sigma, St. Louis, MO)

10 ug/ml fetuin (Aldrich, Milwaukee, WI)

50 ug/ml insulin (Gibco-BRL)

3 ng/ml selen (Aldrich, Milwaukee, WI)

20 ug/ml transferrin (JRH, Lenexa, KS)

B. Hjerter ble isolert fra 1 dag gamle nyfødte mus og oppbrutt ved gjentatt kollagenasebehandling ifølge fremgangsmåten til Brand et-al., (J. Biol. Chem. 268:11500-11503, 1993) . Enkeltmyocytter ble isolert over en Percoll-gradient og 2 ml ble utsådd i 6-brønners vevskulturskåler ved 0,5 X IO<6> celler/ml. Tre dager senere ble brønnene vasket tre ganger med PBS uten kalsium eller magnesium, og deretter tilsatt 1 ml serumfritt medium (tabell 6). Brønnene ble inokulert med 10<11> partikler AdCMV-zFGF5 pr. brønn eller AdCMV-GFP (grønt fluorescerende protein) som kontroll og inkubert ved 37 °C i 8 t. Brønnene ble så igjen vasket 3 ganger med PBS uten kalsium eller magnesium og deretter tilsatt 2 ml serumfritt medium.

Innen 48 t etter inokulering med AdCMV-zFGF5 har de dyrkede myocytter sluttet å banke og har undergått en morfologisk endring, mens brønnene inokulert med AdCMV-GFP fort-satte å banke spontant og er morfologisk upåvirket av inoku-lasjonen. Brønner inokulert med AdCMV-zFGF5 inneholdt videre etter 48 t et konfluent lag av levedyktige, ikke-adherente celler, uten tap av konfluens av de adherente myocyttlag, noe som viser den proliferative aktivitet^,av adCMV-zFGF5 på dyrkede musemyocytter. C. zFGF-5 fusjonert til et maltosebindende protein (MBP), som beskrevet i eksempel 9A, og renset som beskrevet i eksempel 10, ble tilsatt til myocytter (eksempel 3B) ved en konsentrasjon på 0,1 ng/ml. MBP-zFGF5 ble vist å stimulere proliferasjon av ■myocytter også.

Eksempel 4

Analyse for eks vivo- aktivitet av zFGF- 5

Hjertemitogenese måles eks vivo ved å fjerne hele hjerter fra nyfødte eller 8 uker gamle mus eller rotter. De isolerte hjertene plasseres i Joklik's (sigma, St. Louis, MO) eller Dulbecco's medium ved 37 °C, 5 % C02 i 4-24 t. Under inkubasjonsperioden tilsettes zFGF-5-polypeptid i et konsentrasjonsområde fra 1 pk/ml til 100 ug/ml. Negative kontroller tilsettes kun buffer. <3>H-tymidin tilsettes og prøvene inkuberes i 1-4 timer, hvoretter hjertet kuttes i snitt og mitogenese bestemmes ved autoradiografi. Snitt benyttes for histomorfometri for å bestemme kjerne/cytoplasmavolumforhold-et (McLaughlin, Am. J. Physiol., 271:R122-R129, 1996).

Alternativt ble hjertet frysetørket og resuspendert i 1 ml 0,1 N NaOH. DNA ble utfelt med iskald 10 % triklor-eddiksyre (TCA). supernatanten.ble tilsatt til 9 ml scintillasjonsvæske for måling av uspesifikk 3H-tymidininkor.porér-ing. Den resulterende pellet ble resuspendert i 1 ml BTS-450 vevssolubilisator (Beckman, Fullerton, CA) og tilsatt til 9 ml scintillasjonsvæske for måling av spesifikk DNA-inkorpo-r.ering av <3>H-tymidin.

Venstre og høyre hjertekammer ble isolert fra 1 dag gamle CD-l-mus (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) og inkubert i 4 t med 3 ng/ml zFGF5Hep2 (n = 13; se eksempel 10) eller kontroll (n = 10). <3>H-tymidin ble tilsatt ilt. Hjertekamrene ble vasket flere ganger og deretter homogenisert il ml Joklik's medium. Det resulterende homogenat ble tilsatt til 9 ml scintillasjonsvæske og analysert for totalt <3>H-tymidin-opptak og DNA-inkorporering.

zFGF5-Hep2 ga økt <3>H-tymidinopptak og inkorporering i DNA 2,068 ± 0,489 ganger høyere enn kontrollen, noe som viser at zFGF5 er mitogent for en hjertecelle.

Eksempel 5

Analyse for in vivo- aktivitet av zFGF- 5

De proliferative virkninger av zFGF-5 analyseres in vivo ved å benytte to uker gamle nyfødte rotter og/eller to måneder gamle voksne rotter. Rottene injiseres intraperiokar-dialt enten akutt eller kronisk.

A. Nyfødte rotter behandles med zFGF-5 i fra 1

til 14 dager over et doseområde fra 50 ng/dag til 100 ug/dag. Etter behandlingen evalueres virkningene av zFGF-5 sammenlignet med plasebobehandlede dyr ved å måle økning i hjertevekt, forbedret funksjon av venstre hjertekammer in vivo og eks

vivo, og ved økt forhold mellom kjernevolum og cytoplasma-volum i hjertet, noe som bestemmes histomorfometrisk.

B. Rotter med kardiomyopati indusert ved kronisk katekolamininfusjon, ved koronarligering eller for modeller for kardiomyopati som "Syrian Cardiomyopathic"-hamster (Sole et al., Amer. J. Cardiol., 62(11):20G-24G, 1988), benyttes også for evaluering av virkningene av zFGF-5 på hjertefunksjonen og -vev.

For induksjon av kardiomyopati ved benyttelse av katekolamin, infuseres 7-8 uker gamle rotter kontinuerlig med epinefrin i 2 uker via osmotiske minipumper implantert sub-kiitant mellom skulderbladene-. Epinefrininfusjonen fører til en økt verdi, for fibrotiske lesjoner i venstre hjertekammer fra 0,005 ± 0,005 til-2,11 ± 0,18, skala fra 0-3), forhøyet myocyttcelle.vidde i venstre hjertekammer fra 17,36 + 0,46 pm til 23,05 ± 0,62. um, og neglisjerbare kontraktile responser av papillarmuskel i venstre hjertekammer på isoproterenol (0,2.mot 1,1 g tensjon sammenlignet med saltvannsinfusefte rotter. Etter to ukers behandling injiseres rottene intra-periokardialt daglig med enten bærerstoff, ' zFGF-5, BFGF, IGF-I eller IGF-II i opp til 14 dager. Rottene avlives og histomorfometriske og histocytokjemi.ske analyser . utføres.

Rotter behandlet som beskrevet ovenfor, evalueres også- ved avsluttet, katekolamihbehandling og igjen etter., vekstfaktorbehandling, hvor hjerteregenerering måles som reduserte fibrotiske lesjonsverdier i venstre hjertekammer redusert myocyttcellevidde og forhøyede kontraktile responser av papillarmuskel i venstre hjertekammer på isoproterenol.

Eksempel 6

Kromosomal kartlegging av zFGF- 5

zFGF-5 ble kartlagt til kromosom 5 ved å benytte den kommersielt tilgjengelige versjon av Whitehead Insti-tute/MIT Center for Genome Research's "GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel inneholder DNA egnet for PCR-benyttelse fra 93 "strålingshybridkloner, pluss to kontroll-DNA (HFL-donoren og A23-mottakeren). En allment tilgjengelig WWW-tjener (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) muliggjør kartlegging relativt til strålingshybridkårtet til Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research over det humane genom ("WICGR"-strålingshybridkartet) som ble konstruert med GeneBridge 4-strålings-hybridpanelet.

For kartlegging av zFGF-5 med "GeneBridge 4 RH Panel", ble reaksjoner på 25 ul satt opp i en 96-brønners mikrotiterplate (Stratagene, La Jolla, CA) og anvendt for PCR i en "RoboCycler.Gradient 96" programmerbar varmeblokk (Stratagene). Hver av.de 95 PCR-reaksjonene inneholdt 2,5 ul 50X "Advantage KlenTaq Polymerase Mix" (Clontech), 2 ul dNTP-blanding (2,5 mM av hvert; Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1,25 pl "sense"-primer, ZC11,677 (SEKV.ID. NR. 4) 1,25 ul "antisense"-primer, ZC12,053 (SEKV.ID. NR. 5).

2,5 ul "RediLoad" (Research Genetics, Inc.), 0,5 ul "Advantage KlenTaq Polymerase Mix" (Clontech Laboratories, Inc.), 0,25 ng DNA fra en enkelt hybridklon eller kontroll og ddH20 for et totalvolum på 25 yl. Reaksjonene ble dekket med et likt volum mineralolje og forseglet. PCR-syklusbetingels-ene var som følger: en innledende syklus på 4 min ved 94 °C, 35 sykluser på 1 min ved 94 °C, 1,5 min hybridisering ved 66 °C og 1,5 min forlengelse ved 72 °C, fulgt av en avslutt-ende syklus med primerforlengelse i 7 min ved 72 °C. Reak-sjonsblandingene ble fraksjonert ved elektroforese i en 3 % NuSieve GTG agarosegel (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

Resultatene viste at zFGF-5 kan kartlegges

541,12 cR fra toppen av koblingsgruppen for humant kromosom 5 i WICGR-strålingshybridkartet. Relativt til centromeren var den nærmeste proksimale markør WI-16922 og den nærmeste distale markør WI-14 692. Anvendelse av omliggende CHCL-kart-markører hjalp også ved plasseringen av zFGF-5 i 5q34-q35-området i det integrerte CHLC-markørkart versjon v8c7 for kromosom 5 (The Gooperative Human Linkage

Center, WWW server-http://www.chic.org/ChlcIntegratedMaps.html).

Eksempel 7

zFGF- 5- virkninger på bein

A.

En adenovirusvektor som inneholdt cDNA for zFGF-5 ble konstruert ved å benytte fremgangsmåter beskrevet av Becker et al. (Methods in Cell Biology, 43:161-189, 1994). Kort beskrevet ble cDNA for zFGF-5 (som vist i SEKV.ID. NR. 1) klonet som et Xba I-Sal I-fragment i pACCMV (Gluzman et al., In Eucaryotic Viral Vectors, Gluzman (red.), s. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Springs Harbor NY, 1982). pACCMV-vektoren inneholder deler av adenovirus 5-genomet, CMV-promoteren og en SV40-terminatorsekvens. Plasmidet som inneholdt vektoren og cDNA-innskuddet, ble kotransfektert med et plasmid som inneholdt adenovirus 5-genomet, betegnet PJM17, (McGrory et al., Virology 163:614-617, 1988) inn i 293-celler (ATCC-betegnelse CRL-1573; American Type Culture Collection, Rockville, MD), noe som førte til en rekombina-sjonshendelse og produksjon av et rekombinant adenovirus som inneholdt zFGF-5, betegnet AdCMV-zFGF5. Nærvær av zFGF-5-cDNA ble bekreftet ved PCR.

Adenovirusvektoren AdCMV-zFGF5 ble benyttet for genoverføring in vivo ved intravenøs injeksjon av mellom 1 x IO<11> og 5 x IO<11> partikler/mus. Det er vist at hovedmengden av virus etter intravenøs injeksjon når leveren hvor det meget effektivt transduserer hepatocytter (Hertz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:2812-2816, 1993). Det er vist at cellene produserer proteinet som kodes av cDNA og for ut-skilte proteiner, skiller dem ut i sirkulasjonen. Høye ekspresjonsnivåer og fysiologiske virkninger er påvist (Ohwada et al., Blood 88:768-774, 1996; Stevenson et al., Arterio-sclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15:479-484, 1995; Setoguchi et al., Blood 84:2946-2953, 1994; og Sakamoto et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 91:12368-12372, 1994).

Seks uker gamle CD-l-mus (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) ble behandlet med adenovirus uten cDNA-innskudd (AdCMV-null) eller AdCMV-zFGF5, enten intravenøst gjennom halevenen eller intraperikardialt (IPC). Totalt 5 x 10<11> viruspartikl-er/100 ul/mus ble tilført. 14 dager etter injeksjonen ble dyrene avlivet og tibia og femer ble fjernet uten å skilles fra hverandre for å undersøke eventuelle inflammatoriske responser. Beinene ble fiksert i 10 % nøytral buffret formalin og behandlet videre. De ble dekalsifisert i 5 % maursyre med 10 % natriumsitrat, vasket med vann, dehydratert i en serie med fra 70 %-100 % etanol, klarnet i xylen og innbakt i para-fin. Prøvene ble kuttet på langs gjennom både tibiale og fomorale metafyser og farget med hemotoksilin og eosin for identifisering av beinceller. Osteoblaster ble identifisert ved sentrale, negative Golgi-områder og essentrisk kjerne, mens osteoklaster ble identifisert ved flere kjerner, ikke-uniform form og Howships lakuner som er forbundet med disse resorberende celler.

For histomorfometriske analyser av veien ble femer-prøver valgt. Cancellous-beinvolum bl<;>e-ikke målt grunnet variasjon i prøvesetet (dvs. at femurprøvene ikke ble snittet nøyaktig i samme plan). Tre beinparametere ble evaluert for histomorfometriske endringer. 1. Antall endosteale osteoblaster målt langs endostealoverflaten av cancellous-bein ved 180 x forstørrelse i et område 1,22 mm proksimalt for vekstplaten. 2. Antall endosteale osteoklaster målt langs endostealoverflaten av cancellous-bein ved 180 x forstørrelse i et område 1,22 mm proksimalt for vekstplaten. 3. Vekstplatevidde målt hver 72 um ved 90 x for-størrelse over hele vekstplaten bortsett fra de perifere ender for bestemmelse av vekstplateaktiviteten.

Analyser av verdiene (middelverdi ± SD, n = 4-7/gruppe) viste følgende: 1. Det var tilsynelatende ingen påvisbar inflam-matorisk respons i leddet mellom tibia og femur. 2. AdCMV-zFGF5 gitt intravenøst eller IPC til mus ga signifikant forhøyet osteogeneseaktivitet i den distale femurale metafyse, analysert etter 2 uker. Denne stimulering av osteogen aktivitet ble antydet av: a) : signifikant forhøyet antall endosteale osteoblaster i cancellous-beinet i distale femurer etter IV-infusjon eller IPC-injeksjon av AdCMV-zFGF5, 530 % hhv.

263 %, sammenlignet med kontroller med injeksjon av kun vektor, og

b) observasjon av økt mengde osteogent vev på beinoverflaten, noe som tyder på forhøyet differensiering

av stromale celler i beinmarg mot osteoblastlinjene.

3. Antall endosteale osteoklaster var ikke signifikant påvirket ved intravenøs eller IPC-tilførsel av AdCMV-zFGF5, sammenlignet med kontroller hvor kun vektor var til-ført . 4. Vidden av vekstplaten var signifikant redusert ved intravenøs infusjon, men ikke ved IPC-injeksjon, av AdCMV-zFGF5, noe som tyder på redusert vekstplateaktivitet etter IV-infusjon. De forskjellige virkninger av forskjellige tilførselsveier for AdCMV-zFGF5 er ikke videre undersøkt.

Disse resultater tyder på at zFGF-5 er et kraftig mitogen for stimulering av osteoblastproliferasjon og at

zFGF-5 har evnen til å indusere dannelse av nytt bein.

B.

Ved å benytte i det vesentlige samme fremgangsmåter som beskrevet ovenfor i 7.A. ble QCT utført på CD-l-hunn-rotter (Jackson Labs) som ble injisert med 1 x IO<11> partikler AdCMV-zFGF5 pr. mus. Musene ble avlivet 30 dager etter injeksjonen og forholdet mellom lårbenlengde og skinnebenlengde var forhøyet sammenlignet med kontrolldyr (injisert med tomt adenovirus eller saltvann). Det var ingen forskjeller i tibialengde mellom gruppene som kunne forklare denne endring, heller ikke var der forskjeller i vekten av andre organer mellom gruppene. Resultatet tyder således på at zFGF-5-adenovirus selektivt gir forhøyet totalbeintetthet, trabecu-lar-beintetthet og kortikaltykkelse i femur, målt ved QCT.

Eksempel 8

Virkninger av zFGF- 5 på hjertet

Som beskrevet i 7.B..ble CD-l-mus gitt en enkelt intravenøs injeksjon av AdCMV-zFGF5, avlivet etter fire uker og forholdet mellom hjertelengde og tibialengde ble funnet å være forhøyet sammenlignet med forholdet hos mus behandlet med tomt adenovirus eller saltvann. Resultatene viste at det ikke forelå forskjeller i tibialengde mellom gruppene som kunne forklare denne endring, heller ikke var der forskjeller i vekten av andre organer mellom gruppene. Dette resultat tyder på at AdCMV-zFGF5 selektivt ga forhøyet hjertevekst ved tilførsel som en intravenøs adenoviruskonstruksjon.

Eksempel 9

Ekspresjon av zFGF- 5

A. Konstruksjon av zFGF5- kodende plasmider

zFGF5, en fibroblastvekstfaktorhomolog, ble uttrykt i E. coli ved benyttelse av MBP(maltosebindende protein)-fusjonssystemet fra New England Biolabs (NEB; Beverly, MA). I dette system var zFGF5-cDNA koblet til 3'-ende av malE-genet slik at det ble dannet et MBP-zFGF5-fus.jonsprotein. Fusjons-pr.oteinekspresjonen ble styrt av tac-promoteren, ekspresjonen

er "avskrudd" inntil promoteren induseres ved tilsetning av 1 mmol IPTG (isopropyl-p-tiogalaktosylpyranosid). Tre varia-sjoner av de.tte fusjonsprotein ble fremstilt, med forskjeller kun i kløyvingssettet .for å frigjøre zFGF5 fra MBP; Én konstruksjon hadde et trombinkløyvihgssete innført mellom MBP-domenet og zFGF5-domenet. Den andre konstruksjon hadde et faktor Xa-kløyvingssete i stedet for et trombinkløyvingssete. Den tredje konstruksjon hadde et enterokinasekløyvingssete i stedet for trombinkløyvingssetet.

Konstruksjonene ble fremstilt.som fusjoner med MBP med bibeholdt leseramme i samsvar med det multiple klonings-setet (MCS)r-i pMAL-c2-.ve,ktoreh (NEB) og ifølge produsentens angivelser. zFGF5 ble amplifisert ved PCR ved benyttelse av primere som innførte egnede kloningsseter, så vel som kløy-vingsseter ved benyttelse av følgende oligonukleotidprimere: 1) for trombinkonstruksjonen: zcl2,652 (SEKV.ID. NR. 7) og zcl2,631 (SEKV.ID. NR. 8); 2) for faktor Xa-konstruksjonen: zcl5,290 (SEKV.ID. NR. 9) og zcl2,631 (SEKV.ID. NR. 8); og 3) for enterokinasekonstruksjonen: zcl5,270 (SEKV.ID. NR. 10) og zcl2,631 (SEKV.ID. NR. 8). I alle tilfelle ble den native signalsekvens i zFGF5 ikke amplifisert, det uttrykte zFGF5 begynner ved aminosyrerest 26 i SEKV.ID. NR. 2 (Val ble endret til Ala). Trombinkonstruksjonen ble fremstilt ved å innsette et Xba I-Sal I-zFGF5-fragment inn i Xba I-Sal I-setene i pMAL-c2. Faktor Xa-konstruksjonen ble fremstilt ved å innsette et buttende Sal I-fragment i Xmn-I-Sal-I-setene i MCS. Enterokinasekonstruksjonen ble fremstilt ved å innsette et Xba I-Sal I-fragment i Xba-Sal I-setene i pMAL-c2. Når først konstruksjonene var fremstilt ble de transformert inn i en rekke forskjellige E. coli-vertsstammer og analysert for høyt ekspresjonsnivå. Trombinkonstruksjonen (betegnet pSDH90.5) ble transfektert inn i DHlOB-celler (GIBCO-BRL), mens både faktor Xa-konstruksjonen (betegnet pSDH117.3) og enterokinasekonstruksjonen (betegnet pSDH116.3) ble transfektert inn i TOPlO-celler (Invitrogen, San Diego, CA). Alle tre MBP-fusjoner er på tilnærmet 63 kD (43 kD i MBP-domenet og tilnærmet 20 kD i zFGF5-domenet).

B. Homolog rekombinasjon/ zFGF5

Ekspresjon av zFGF5 i Pichia methanolica benytter ekspresjonssystemet beskrevet i PCT WO 9717450, som inkorporeres heri ved referanse. Et ekspresjonsplasmid som omfatter hele eller deler av et polynukleotid som koder for zFGF5 konstrueres ved homolog rekombinasjon. Ekspresjonsvektoren er fremstilt fra pCZR204, som inneholder AUGl-prqmoteren, fulgt av aFpp-ledersekvensen, fulgt av en aminoterminalpeptidmerke-lapp, et buttendet Smal-restriksjonssete, en karboksyterminal peptidmerkelapp, et translasjonelt STOP-kodon, fulgt av AUG1-terminatoren, seleksjonsmarkøren ADE2, og endelig det 3'-ikke-translaterte området fra AUG1. Også omfattet av denne vektor er URA3-sekvensen og CEN-ARS-sekvensen som er nødven-dig for seleksjon og replikasjon i S. cerevisisiae, og Amp<R->sekvensen 'og colEl-ori-sekvensen som er påkrevd for seleksjon og replikasjon i E. coli. zFGF5-sekvensen som er innsatt i denne vektor, begynner ved aminosyrerest 27 (Ala) i zFGF-aminosyresekvensen.

For fremstilling av pSDH114, et plasmid for ekspresjon av zFGF5 i P. methanolica, ble følgende DNA-fragmenter transformert inn i S. cerevisiae: 100 ng av "akseptorvektor-en" pCZR204 som var kuttet med Smal; 1 ug av et Xbal-Sall-restriksjonsfragment frigjort fra pSDH90.5 og inneholdende zFGF5-kodende sekvens, 1 ug av et syntetisk, PCR-frembrakt, dobbelttrådet linkersegment som omfatter 7 0 basepar av den aFpp-kodende sekvens i én ende og kobler denne til 70 basepar fra den aminoendekodende sekvens fra den modne zFGF5-sekvens i den andre ende, ble dannet fra de fire oligonukleotidene zcl3,497 (SEKV.ID. NR. 11); zcl5,131 (SEKV.ID. NR. 12); zcl5,132; (SEKV.ID. NR. 18); zcl5,134 (SEKV.ID. NR. 13) og for hvilken "sense"-tråden av en dobbelttrådet sekvens er vist i SEKV.ID. NR. 19 (5'-linkersekvens (aFpp zFGF5 N-terminal)) og 1 ug av et syntetisk, PCR-frembrakt, dobbelttrådet linkersegment som omfatter 70 basepar av karboksyende-kodende sekvens fra zFGF5 i én ende koblet til 70 basepar med AUGl-terminatorsekvens, ble fremstilt fra de fire oligonukleotidene 13,529 (SEKV.ID. NR. 14), zcl3,525 (SEKV.ID. NR.

15); zcl3,526 (SEKV.ID. NR. 16), zcl3,528 (SEKV.ID. NR. 17) og for hvilket "sense"-tråden av en dobbelttrådet sekvens er vist i SEKV.ID. NR. 20 (3'-linkersekvens (zFGF5-C-terminal

AUGl-terminator)). Ura<+->kolonier ble selektert og DNA fra de resulterende gjærkolonier ble ekstrahert og transformert inn i E. coli. Enkeltkloner som omfattet den korrekte ekspre-s.jonskonstruksjon, ble identifisert ved PCR-gjennomsøking med oligonukleotidene zcl3,497 (SEKV.ID. NR. 11) og zcl3,528 (SEKV.ID. NR. 12), fulgt av restriksjonskutting for å bekrefte nærvær av zFGF5-innskuddet og DNA-sekvensering for å bekrefte at de ønskede DNA-sekvenser var blitt koblet sammen. Plasmid-DNA isoleres i større skala for én av de korrekte kloner, og DNA kuttes med Sfi I for å frigjøre Pichia-zFGF5-ekspresjonskassetten fra vektorskjelettet. Det Sfi I-kuttede DNA transformeres så inn i en Pichia methanolica-ekspresjons-vert, betegnet PMAD16, og utsåes på ADE D-skåler for seleksjon. En rekke forskjellige kloner plukkes og gjennomsøkes ved Western-blotting for ekspresjon av zFGF5 i høyt nivå.

Nærmere bestemt dyrkes for proteinfremstilling i liten skala (f.eks. skålproduksjon eller risteflaskeproduk-sjon), P. methanolica-transformanter som bærer en ekspre-sjonskassett som omfatter en metanolregulert promoter (f.eks. AUGl-promoteren) i nærvær av metanol og fravær av interferer-ende mengder av andre karbonkilder (f.eks. glukose). For eksperimenter i liten skala, heriblant innledende analyse av ekspresjonsnivåer, kan transformantene dyrkes ved 30 °C på fast medium som f.eks. inneholder 20 g/l Bacto-agar (Difco), 6,7 g/l gjærnitrogenbase uten aminosyrer (Difco), 10 g/l metanol, 0,4 mg/l biotin og 0,56 g/l -Ade'-Thr-Trp-pulver. Siden metanol er en flyktig karbonkilde går den lett tapt ved forlenget inkubasjon. En kontinuerlig tilførsel av metanol kan tilveiebringes ved å plassere en løsning med 50 % metanol i vann i lokkene på skåler som ligger opp ned, hvorved meta-nolen overføres til de voksende celler ved fordampning. Generelt benyttes ikke mer enn 1 ml metanol pr. 100 mm skål. Eksperimenter i noe større skala kan utføres ved å benytte kulturer som dyrkes i risteflasker. I en typisk fremgangsmåte dyrkes cellene i 2 dager på metanol-minimalskåler som beskrevet ovenfor ved 30 °C, deretter benyttes kolonier til å inokulere et lite volum med metanol-minimal medium (6,7 g/l gjærnitrogenbase uten aminosyrer, 10 g/l metanol, 0,4 mg/l biotin) ved en celletetthet på tilnærmet 1 x IO<6> celler/ml. Cellene dyrkes ved 30 °C. Celler som vokser på metanol, har høyt oksygenbehov, noe som nødvendiggjør kraftig omristing under dyrking. Metanol tilføres på nytt hver dag (typisk 1/100 volum 50 % metanol pr. dag) .

For dyrking i produksjonsskala fremstilles ferske kulturer av kloner med høyere produksjon i risteflasker. De resulterende kulturer benyttes så til inokulering av dyrkningsmedium i en fermentor. Typisk benyttes en 500 ml kultur i YEPD dyrket ved 30 °C i 1-2 dager under kraftig omrøring til inokulering av en 5 liter fermentor. Cellene dyrkes i et egnet medium som inneholder salter, glukose, biotin og spor-elementer ved 28 °C, pH 5,0 og >30 % oppløst 02. Etter at den første tilførsel av glukose er forbrukt (vist ved redusert oksygenforbruk), innføres et glukose/metanolfor i karet for induksjon av.produksjon av proteinet av interesse. Siden fer-mentering i stor skala utføres under betingelser med begrens-ende karbon, undertrykker nærvær av glukose i foret ikke den metanolinduserbare promoter.

Eksempel 10

Rensing av zFGF- 5

E. coli-fermenteringsmedium ble erholdt fra en stamme som uttrykker zFGF5 som fusjon med maltosebindende protein (pSDH90.5, som beskrevet ovenfor). MBPzFGF5-fusjonen ble brakt i løsning under sonikering eller desintegrering i en "French press" ved benyttelse av en buffer som inneholdt 20 mM Hepes, 0,4 M Nacl, 0,01 M EDTA, 10 mM DTT ved pH 7,4. Ekstraksjonsbufferen omfattet også 5 ug/ml mengder av Pep-statin, Leupeptin, Aprotinin, Bestatin. Fenylmetylsulfonyl-fluorid (PMSF) ble også tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mM.

Ekstraktet ble sentrifugert ved 18 000 x g i 30 min ved 4 °C. Den resulterende supernatant ble applisert på en Amyloseresin (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) som binder MBP-domenet i fusjonsproteinet. Etter vask av søy-len ble det bundne MBPzFGF5-fusjonsprotein eluert med samme buffer som Ekstraksjonsbufferen uten DTT og proteaseinhibi-torer, men tilsatt 10 mM maltose.

Den eluerte porsjon med MBPzFGF5 ble behandlet med 1:100 (vekt/vekt) -storfetrombin til MBPzFGF5-fusjon. Kløy-vingsreaksjonen fikk forløpe i 6 til 8 timer ved romtemperatur, hvoretter reaksjonsblandingen ble applisert på en søyle med Benzamidin-sefarose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) for fjerning av trombin, ved benyttelse av samme elueringsbuffer som beskrevet ovenfor for amylose-affinitetskromatografi.

Den eluerte fraksjon som inneholdt det avkløyvde produkt zFGF5 og fritt MBP-domene, ble påsatt en Toso Haas Heparin-affinitetsgel (Toso Haas, Montgomeryville, PA) ekvi-librert med 0,5 M NaCl, 20 mM Hepes, 0,01 M EDTA ved pH 7,4. MBP og zFGF5 ble begge bundet til heparin under disse betingelser. De bundne proteiner ble eluert med en 2 til 3 søyle-volumers gradient dannet mellom 0,5 M NaCl og 2,0 M NaCl i kolonnebuffer.

MBP ble eluert tidlig, ved tilnærmet 0,7 M NaCl og det avkløyvde zFgf5 ble eluert ved tilnærmet 1,3 M NaCl. De sammenslåtte zFGF5-fraksjoner ble på ny endt gjennom amylose-trinnet for å fjerne eventuelle rester av MBPzfgf5 som er en mindre forurensing. Det rensede materialet ble betegnet zFGF-5-Hep2 og viser en enkelt, svært ren molekyltype ved ~20 kDa ved reduserende SDS-FAGE-analyse.

N-terminal aminosyresekvensering ga den native N-terminale sekvens, men massespektrometriske verdier viste molekylmasser som tydet på at C-terminalen må være avkortet ved aminosyrerest 196 (Lys) i SEKV.ID. NR. 2, hvor et "dibasisk sete" foreligger.

zFGF5-protein var svært stabilt i 1,3 M NaCl. Ved dialyse mot PBS aggregerte zFGF5 og gikk ut av løsning. Følg-elig kan preparater som omfatter heparin og andre polyanion-er, benyttes for å hindre aggregering av rent zFGF5.

Eksempel 11

Fremstilling av antistoffer

Antistoffer mot ZFGF5 ble fremstilt ved å benytte standardteknikker som er kjent innen faget og beskrevet tidligere, ved immunisering av marsvin, kaniner og mus med peptidene QTRARDD.VSRKQLRLYC (SEKV.ID. NR. 2 aminosyrerest 40'til aminosyrerest 56), betegnet,-zFGF-1; YTTVTKRSRRIRPTHRAC

(SEKV.ID. NR. 2, aminosyrerest 191 til aminosyrerest 207, med en ekstra Cys " i karboksylenden) betegnet zFGF-5 eller.full-lengde zFGF5.-polypeptid 'som. vist -i SEKV.ID. NR. 2, pluss MBP-fusjonsproteinet og betegnet MBP-FGF5. Peptidene ble konjugert via Cys-rester ved benyttelse av maleimidaktivert KLH (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

Tabell 7 er en beskrivelse av dyrene, immuniser-ingsnivåene og antistoffrensingen.

Eksempel 12

Virkninger av zFGF- 5 på ob/ ob- mus

Virkningene av zFGF-5 på adipocytter og fettmeta-bolisme ble undersøkt ved benyttelse av ob/ob-hunnmus (C57B1/6J, Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Musene ble fete, insulinresistente og har "fatty bone". Musene ble veid og alle .ble funnet å ha samme vekt og ble injisert intravenøst med IO<11> partikler pr. mus av AdCMVzFGF-5 eller enten saltvann eller Ad5CMV-GFP som kontroll, som beskrevet i eksempel 7. 17 dager etter injeksjonen hadde kontrollmusene som var injisert med Ad5CMV-GFP økt 5,342 ± 0,5 g i kroppsvekt sammenlignet med injeksjonsdagen, mens de AdCMVzFGF-5-behandlede mus tapte 3,183 ± 0,743 g kroppsvekt.

Claims (21)

1. Isolert polynukleotidmolekyl, karakterisert ved at det koder for et fibroblastvekstfaktor (FGF) -homologpolypeptid som er valgt fra gruppen som består av: a) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEKV. ID. NR. 1 fra nukleotid 82 til nukleotid 621, b) polynukleotidmolekyler som koder for et polypeptid som er minst 80 % identisk med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala) og c) polynukleotidmolekyler som omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEKV. ID. NR. 6 fra nukleotid 82 til nukleotid 621, der polypeptidet som er kodet for av nevnte polynukleotid stimulerer proliferasjon av celler som er avledet fra mesenchymale stamceller eller deres forløpere.

2. Isolert polynukleotidmolekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at polynukleotidmolekylet omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 1 fra nukleotid 1 til nukleotid 621 eller en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 6 fra nukleotid 1 til nukleotid 621.

3. Isolert polynukleotidmolekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID NR. 1 fra nukleotid 82 til nukleotid 621.

4. Isolert polynukleotidmolekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er DNA.

5. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer: en trånskripsjonspromoter, et polynukleotidmolekyl ifølge krav 1 og en transkripsjonsterminator.

6. Dyrket celle i hvilken det er innført en ekspresjonsvektor ifølge krav 5, karakterisert ved at den uttrykker et polypeptid som kodes av DNA-segmentet.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av et FGF-homologpolypeptid, karakterisert ved at den omfatter: dyrking av en celle ifølge krav 6, hvorved nevnte celle uttrykker et FGF-homologpolypeptid som er kodet for av DNA-segmentet, og gjenvinne FGF-homologpolypeptidet.

8. Isolert FGF-homologpolypeptid, karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen som består av: a) polypeptidmolekyler som omfatter en aminosyre-restsekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys); b) alleliske varianter som er minst 80 % identiske med aminosyresekvensen ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys), der polypeptidet har ekvivalent biologisk aktivitet som polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys); og c) polypeptidmolekyler som er minst 90 % identiske med SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys), der polypeptidet har en ekvivalent biologisk aktivitet som polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys).

9. Isolert FGF-homologpolypeptid, karakterisert ved at det er utvalgt fra gruppen som består av: a) polypeptidmolekyler som omfatter en aminosyresekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala); b) alleliske varianter som er minst 80 % identiske med sekvensen ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala), der polypeptidet har ekvivalent biologisk aktivitet som polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala),-og c) polypeptidmolekyler som er minst 90 % identiske med aminosyrene i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala), der polypeptidet har en ekvivalent biologisk aktivitet som polypeptidet ifølge SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 207 (Ala).

10. FGF-homologpolypeptid ifølge krav 8, karakterisert ved at det videre omfatter en signalsekvens.

11. FGF-homologpolypeptid ifølge krav 8, karakterisert ved at det videre omfatter en signalsekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 1 (Met) til aminosyrerest 27 (Ala).

12. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et renset FGF-homologpolypeptid ifølge krav 8, kombinert med et farma-søytisk aksepterbart bærerstoff.

13. Antistoff, karakterisert ved at det binder spesifikt til polypeptidmolekylet som består av en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID. NR. 2, fra residie 1 (Met) til residie 207 (Ala).

14. Antistoff ifølge krav 13, karakterisert ved at det bindes til et polypeptidmolekyl som består av en aminosyresekvens som vist i SEKV.ID NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys).

15. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for stimulering av proliferasjon av myocytter eller myocyttforløpere, der forbindelsen omfatter en mengde av et FGF-homologpolypeptid. ifølge krav 8 eller 9, som er tilstrekkelig til å frembringe en klinisk signifikant økning av antallet myocytter eller myocyttforløpere hos et pattedyr, der FGF-homologipolypeptidet omfatter minst et konservert motiv CXFXEX(6)Y, der X er en hvilken som helst aminosyre og X(6) er antallet X-aminosyrer større enn én, og et heparinbindende domene, til behandling av hjertesykdom, hjerteinfarkt, kongestiv hjertesvikt, hypertrofisk kardiomyopati, dilatert kardiomyopati, slag, systemisk eller pulmonal hypertensjon, bendefekter, benbrudd, periodontai sykdom, osteoporose, artritt og andre beslektede tilstander.

16. Anvendelse ifølge krav 15,der myocyttene eller myocyttforløperne er hjertemyocytter eller hjertemyocytt-forløpere.

17. Fremgangsmåte for eks vivo-stimulering av myocyttforløperceller eller myocytter, karakter i! sert ved at den omfatter dyrking av hjertevevsceller med en mengde av proteinet ifølge krav 8 eller 9 som er tilstrekkelig til å frembringe en økning i antallet myocyttforløperceller eller myocytter i hjertevevscellene som dyrkes i nærvær av et FGF-homologpolypeptid, sammenlignet med myocyttforløperceller eller myocytter fra hjertevev dyrket i fravær av et FGF-homologpolypeptid.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at myocyttene eller myo-cyttf orløperne er hjertemyocytter eller hjertemyocytt-forløpere.

19. Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av et medikament for levering av et middel eller legemiddel til hjertevev, der fremstillingen omfatter å binde et første molekyl som -omfatter et FGF-homologpolypeptid ifølge krav 8 eller 9 til et andre molekyl som omfatter et middel eller et legemiddel for å danne en kimer der administreringen av kimeren leverer middelet eller legemiddelet til hjertevev, der FGF-homologipolypeptidet omfatter minst et konservert motiv CXFXEX'(6)Y, der X er en hvilken som helst aminosyre og X(6) er antallet X-aminosyrer større enn én, og et heparinbindende domene, til behandling av hjertesykdom, hjerteinfarkt, kongestiv hjertesvikt, hypertrofisk kardiomyopati, dilatert kardiomyopati, slag, systemisk eller pulmonal hypertensjon, bendefekter, benbrudd, periodontal sykdom, osteoporose, artritt og andre beslektede tilstander.

20. Isolert FGF-homologpolypeptid ifølge krav 8, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen som består av: a) polypeptidmolekyler som består av aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys), b) naturlig forekommende varianter som er minst 80 % identiske med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 2 fra aminosyrerest 28 :(Glu) til aminosyrerest 196 (Lys) og c) polypeptidmolekyler som er minst 80 % identiske med aminosyresekvensen ifølge SEKV. ID. NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys).

21. Isolert FGF-homologpolypeptid ifølge krav 8, karakterisert ved at det består av en aminosyresekvens ifølge SEKV. ID. NR. 2 fra aminosyrerest 28 (Glu) til aminosyrerest 196 (Lys), som ytterligere omfatter en aminoterminal metioninrest.