DE69735352T2

DE69735352T2 - Fibroblasten-wachstumsfaktoren homologe

Info

Publication number: DE69735352T2
Application number: DE69735352T
Authority: DE
Inventors: A. Theresa Seattle DEISHER; C. Darrell Seattle CONKLIN; C. Fenella Seattle RAYMOND; R. Thomas Seattle BUKOWSKI; D. Susan Kirkland HOLDERMAN; Brigit Seattle HANSEN; O. Paul Redmond SHEPPARD
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2017-10-17
Also published as: DK0931148T3; BR9712348A; CZ299288B6; US7247608B2; ATE318906T1; EP1632574A1; BRPI9712348C8; EP0931148B1; EP1632574B1; ES2258788T3; IL129379A; PL192537B1; WO1998016644A1; JP2001502178A; UA75316C2; BR9712348B1; US20040096936A1; DE69735352D1; HK1089206A1; EP0931148A1

Description

VERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung bezieht sich auf die vorläufige Anmeldung („Provisional Application") 60/028,646, eingereicht am 16. Oktober 1996. Diese Anmeldung nimmt nach 35 U.S.C. § 119 (e) (1) die Rechte aus der vorläufigen Anmeldung („Provisional Application") in Anspruch.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Familie der Fibroblast-Wachstumsfaktoren („fibroblast growth factors", FGF) besteht aus mindestens neun verschiedenen Mitgliedern (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115–165, 1992, und Fernig et al., Prog. Growth Factor Res. 5(4): 353–377, 1994), welche im Allgemeinen für ein breites Spektrum an Zellarten als Mitogene wirken. Zum Beispiel ist der basische FGF (ebenfalls als FGF-2 bekannt) in vitro mitogen für Endothel-Zellen, glatte Gefäßmuskelzellen, Fibroblasten und im Allgemeinen für Zellen mesodermen oder Neuroektodermen Ursprungs, einschließlich Kardio- und Skelettmyozyten, (Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 70: 395–405, 1976, Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 89: 568–578, 1981, und Kardami, J. Mol. Cell. Biochem. 92: 124–134, 1990). Für bFGF wurde in vivo gezeigt, dass er bei der kardialen Entwicklung des Vogels eine Rolle spielt (Sugi et al., Dev. Biol. 168: 567–574, 1995, und Mima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 467–471, 1995) und die koronar kollaterale Entwicklung in Hunden induziert (Lazarous et al., Circulation 94: 1074–1082, 1996). Zusätzlich wurden für verschiedene Mitglieder der FGF-Familie nicht-mitogene Aktivitäten gezeigt. Nicht-proliferative Aktivitäten, die mit dem sauren und/oder basischen FGF assoziiert sind, beinhalten: die erhöhte endotheliale Freisetzung des plasminogenen Aktivators des Gewebes, die Stimulation der Synthese der extrazellulären Matrix, die Chemotaxis für Endothel-Zellen, die induzierte Expression der fötalen Kontraktionsgene in Kardiomyozyten (Parker et al., J. Clin. Invest. 85: 507–514, 1990) und die erhöhte Empfindlichkeit auf Hormone der Hypophyse (Baird et al., J. Cellular Physiol. 5: 101–106, 1987).
Verschiedene Mitglieder der FGF-Familie haben keine Signalsequenz (aFGF, bFGF und möglicherweise FGF-9) und deshalb wird nicht angenommen, dass sie sekretiert werden. Zusätzlich weisen verschiedene Mitglieder der FGF-Familie die Fähigkeit auf, zum Zellkern zu wandern (Friesel et al., FASEB 9: 919–925, 1995). Alle Mitglieder der FGF-Familie binden aufgrund struktureller Ähnlichkeiten Heparin. Eine strukturelle Homologie durchzieht die Arten, was auf eine Konservierung ihrer Struktur-/Funktions-Beziehung hinweist (Ornitz et al., J. Biol. Chem. 271(25): 15292–15297, 1996).
Es gibt vier bekannte extrazelluläre FGF-Rezeptoren (FGFRs) und alle sind Tyrosin-Kinasen. Im Allgemeinen binden die Mitglieder der FGF-Familie an alle bekannten FGFRs, dennoch binden spezifische FGFs an spezifische Rezeptoren mit höheren Graden an Affinität. Ein anderes (Unterscheidungs-) Mittel für die Spezifität innerhalb der FGF-Familie ist die räumliche und zeitliche Expression der Liganden und ihrer Rezeptoren während der Embryogenese. Es gibt Hinweise dafür, dass die FGFs aufgrund ihrer Bindungsaffinität zu Heparin, die ihre Diffusion von der Freisetzungsstelle beschränkt (Flaumenhaft et al., J. Cell. Biol. 111(4): 1651–1659, 1990), mit höchster Wahrscheinlichkeit nur auf autokriner und/oder parakriner Weise wirken. Dem basischen FGF fehlt eine Signalsequenz und er ist deshalb auf parakrine oder autokrine Funktionsweisen beschränkt. Es wurde postuliert, dass der basische FGF intrazellulär gespeichert wird und nach Gewebebeschädigung freigesetzt wird. Für den basischen FGF wurde gezeigt, dass er zwei Rezeptor-Bindebereiche aufweist, die sich von der Haparin-Bindestelle unterscheiden (Abraham et al., EMBO J. 5(10): 2523–2528, 1986).
Es wurde gezeigt, dass FGFR-3 im Knochenwachstum eine Rolle spielt. Mäuse, die für den FGFR-3 homozygot null gemacht wurden (-/-), führten zu postnatalen Skelett-Abnormitäten (Colvin et al., Nature Genet. 12: 309–397, 1996, und Deng et al., Cell 84: 911–921, 1996). Der mutante Phänotyp weist darauf hin, dass FGFR-3 in normalen Mäusen bei der Regulation der Zellteilung von Chrondrozyten in der Wachstumsplatten-Region des Knochens eine Rolle spielt (Goldfarb, Cytokine and Growth Factor Rev. 7(4): 311–325, 1996). Der Ligand für FGFR-3 in der Knochen-Wachstumsplatte wurde nicht identifiziert.
Obwohl vier FGFRs identifiziert wurden, wobei für alle gezeigt wurde, dass sie funktionelle „Spleiß"-Varianten aufweisen, ist durchaus die Möglichkeit gegeben, dass neue FGF-Rezeptoren existieren. Zum Beispiel wurde kein Rezeptor für die FGF-8a-Isoform identifiziert (MacArthur et al., J. Virol. 69(4): 2501–2507, 1995).
FGF-8 ist ein Mitglied der FGF-Familie, die ursprünglich aus Brustkarzinom-Zellen als Androgeninduzierbares Mitogen isoliert wurde. Er wurde als zum humanen Chromosom 10q25-q26 gehörend kartiert (White et al., Genomics 30: 109–11, 1995). FGF-8 ist in der embryonalen Entwicklung der Gliedmaßen involviert (Vogel et al., Development 122: 1737–1750, 1996, und Tanaka et al., Current Biology 5(6): 594–597, 1995). Die Expression von FGF-8 während der Embryogenese im kardialen, urogenitalen und neuralen Gewebe deutet an, dass er bei der Entwicklung dieser Gewebe möglicherweise eine Rolle spielt (Crossley et al., Development 121: 439–451, 1995). Es gibt einige Hinweise dafür, dass die Akrozephalosyndaktylie, ein kongenitaler Zustand, gekennzeichnet durch den spitzen Kopf und schwimmhäutige Finger und Zehen, mit FGF-8-Punktmutationen assoziiert ist (White et al., 1995, ebd.).
Im Gegensatz zu den anderen bekannten FGFs, die nur drei Exons aufweisen, weist FGF-8 fünf Exons auf. Die ersten drei Exons von FGF-8 entsprechen dem ersten Exon der anderen FGFs (MacArthur et al., Development 121: 3603–3613, 1995.) Das humane Gen für FGF-8 kodiert vier Isoformen, welche sich in ihren N-terminalen Regionen unterscheiden: die FGF-Isoformen a, b, e und f; im Gegensatz zu dem Gen der Maus, welches zu acht FGF-8-Isoformen führt (Crossley et al., 1995, ebd.). Humanes FGF-8a und FGF-8b weisen 100% Homologie zu den Proteinen der Maus auf und die FGF-8e- und FGF-8f-Proteine sind zwischen Mensch und Maus zu 98% homolog (Gemel et al., Genomics 35: 253–257, 1996).
Herzerkrankung ist die Haupt-Todesursache in den Vereinigten Staaten, der bis zu 30% aller Todesfälle zuzurechnen sind. Der Herzinfarkt (Myokardinfarkt, MI) ist in den Vereinigten Staaten für 750.000 Krankenhaus-Aufnahmen pro Jahr verantwortlich, wobei bei mehr als 5 Millionen Menschen eine Koronar-Erkrankung diagnostiziert wird. Die Risikofaktoren für MI beinhalten Diabetes Mellitus, Hypertonie, d.h. Bluthochdruck, Rumpf-Fettleibigkeit, Rauchen, hohe Werte an Lipoprotein niedriger Dichte im Plasma oder genetische Prädisposition.
Die kardiale Hyperplasie ist eine Zunahme der Kardiomyozyten-Proliferation und es wurde gezeigt, dass diese mit dem normalen Altern des Menschen und der Ratte (Olivetti et al., J. Am. Coll. Cardiol. 24(1): 140–9, 1994, und Anversa et al., Circ. Res. 67: 871–885, 1990) und bei Katecholamin-induzierter Kardiomyopathie in Ratten (Deisher et al., Am. J. Cardiovasc. Pathol. 5(1): 79–88, 1994) auftritt. Ob die Zunahme an Myozyten von irgendeinem Vorläufer ausgeht oder Ergebnis der Proliferation einer stärker ausdifferenzierten Zellart ist, bleibt kontrovers.
Weil der Infarkt und andere Ursachen der myokardialen Nekrose jedoch irreparabel zu sein scheinen, scheint es, dass der normale Mechanismus der kardialen Hyperplasie das großflächige Absterben der Myozyten nicht kompensieren kann, und es bleibt ein Bedarf an exogenen Faktoren, die die Hyperplasie fördern und letztendlich zur Erneuerung der Funktionsfähigkeit des Herzens führen.
Der Knochenumbau ist ein dynamischer Prozess, bei welchem die Gewebemasse und die Skelettarchitektur erhalten bleiben. Der Prozess ist ein Gleichgewicht zwischen der Knochenresorption und der Knochenbildung, wobei für zwei Zellarten angenommen wird, dass sie dabei die wesentliche Rolle übernehmen. Diese Zellen sind der Osteoblast und der Osteoclast. Die Osteoblasten synthetisieren und deponieren die Matrix zum Bilden neuer Knochen. Die Aktivitäten von Osteoblasten und Osteoclasten werden durch viele systemische und lokale Faktoren, einschließlich Wachstumsfaktoren, reguliert.
Während die Interaktion zwischen lokalen und systemischen Faktoren nicht völlig aufgeklärt wurde, scheint Übereinstimmung dahingehend zu herrschen, dass die Wachstumsfaktoren bei der Regulation sowohl des normalen Skelettumbaus als auch der Reparatur von Brüchen eine Schlüsselrolle spielen. Ei nige der Wachstumsfaktoren, die im Knochen identifiziert wurden, beinhalten: IGF-I, IGF-II, TGF-β₁, TGF-β₂, bFGF, aFGF, PDGF und die Familie der morphogenen Proteine des Knochens (Baylink et al., J. Bone Mineral Res. 8(Supp.2): S565–S572, 1993).
Wenn die Knochenresorption die Knochenbildung übersteigt, führt dies zu einem Netto-Verlust an Knochen und die Neigung zu Frakturen wird erhöht. Eine verringerte Knochenbildung ist mit dem Altern und bestimmten pathologischen Zuständen assoziiert. Alleine in den Vereinigten Staaten kommen jährlich ungefähr 1,5 Millionen Frakturen vor, die auf Osteoporose zurückzuführen sind. Der Einfluss dieser Frakturen auf die Lebensqualität des Patienten ist immens. Die damit verbundenen Kosten für das Gesundheits-Versorgungssystem, ausgenommen die Langzeit-Versorgungskosten, wird in den Vereinigten Staaten auf 5–10 Milliarden Dollar jährlich geschätzt.
Andere therapeutische Anwendungen für Wachstumsfaktoren, die den Knochenumbau beeinflussen, beinhalten beispielsweise die Behandlung von Verletzungen, welche die Proliferation von Osteoblasten zum Heilen benötigen, wie z.B. Frakturen, genauso wie die Stimulation der Proliferation mesenchymaler Zellen und die Synthese des intramembranen Knochens, welche als Aspekte der Reparatur einer Fraktur angegeben wurden (Joyce et al., 36th Annual Meeting, Orthopaedic Research Society, 5.–8. Februar 1990, New Orleans, LA).
Die vorliegende Erfindung stellt solche Polypeptide für diese und andere Anwendungen bereit, die für den Fachmann aus den hier gezeigten Lehren ersichtlich sein sollten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotidmolekül bereit, das ein Fibroblast-Wachstumsfaktor(FGF)-homologes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen; b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das zu mindestens 60% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 207 (Ala) ist; und c) Polynukleotidmolekülen die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen, wobei das Polypeptid, das durch das Polynukleotid kodiert wird, die Proliferation von Zellen stimuliert, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind.
In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Polynukleotidmolekül eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 ab dem Nukleotid 1 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, oder eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 ab dem Nukleotid 1 bis zum Nukleotid 621 gezeigt.
In einer anderen Ausfürungsform umfasst das isolierte Polynukleotidmolekül eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit, der die folgenden operabel verknüpften Elemente umfasst: einen Transkriptions-Promotor; ein DNA-Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen; b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das zu mindestens 60% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 207 (Ala) ist; und c) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen; und einem Transkriptions-Terminator, wobei das Polypeptid, das durch das Polynukleotid kodiert wird, die Proliferation von Zellen stimuliert, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine kultivierte Zelle bereit, in die ein Expressionsvektor eingeführt wurde, der die folgenden operabel verknüpften Elemente umfasst: einen Transkriptions-Promotor; ein DNA-Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen; b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das zu mindestens 60% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 207 (Ala) ist; und c) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen; und einem Transkriptions-Terminator, wobei die Zelle ein Polypeptid exprimiert, das durch das DNA-Segment kodiert wird.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines FGF-homologen Polypeptids bereit, umfassend (die Schritte): Kultivieren einer Zelle, in welche ein Expressionsvektor eingeführt wurde, der die folgenden operabel verknüpften Elemente umfasst: einen Transkriptions-Promotor; ein DNA-Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen; b) Polynukleotidmolekülen, die ein Polypeptid kodieren, das zu mindestens 60% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 207 (Ala) ist; und c) Polynukleotidmolekülen, die eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 ab dem Nukleotid 82 bis zum Nukleotid 621 gezeigt, umfassen; und einen Transkriptions-Terminator, wobei die Zelle ein FGF-homologes Polypeptid exprimiert, das durch das DNA-Segment kodiert wird; und Gewinnen des FGF-homologen Polypeptids.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes FGF-homologes Polypeptid bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, die eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 ab dem Rest 28 (Glu) bis zum Rest 175 (Met) gezeigt, umfassen; und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 60% identisch mit SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 175 (Met) sind, wobei das Polypeptid, die Proliferation von Zellen stimuliert, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes FGF-homologes Polypeptid bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, die eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 ab dem Rest 28 (Glu) bis zum Rest 196 (Lys) gezeigt, umfassen; und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 60% identisch mit SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 196 (Lys) sind, wobei das Polypeptid, die Proliferation von Zellen stimuliert, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes FGF-homologes Polypeptid bereit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, die eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 ab dem Rest 28 (Glu) bis zum Rest 207 (Ala) gezeigt, umfassen; und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 60% identisch mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 207 (Ala) sind, wobei das Polypeptid, die Proliferation von Zellen stimuliert, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind.
In einer zusätzlichen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein FGF-homologes Polypeptid bereit, das weiterhin eine Signalsequenz umfasst.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein FGF-homologes Polypeptid bereit, das weiterhin eine Signalsequenz, wie in SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 1 (Met) bis zum Aminosäurerest 27 (Ala) gezeigt, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein aufgereinigtes FGF-homologes Polypeptid in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper bereit, der spezifisch an ein Epitop eines Polypeptidmoleküls bindet, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 ab dem Rest 1 (Met) bis zum Rest 207 (Ala) gezeigt, umfasst.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper bereit, der an ein Polypeptidmolekül bindet, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 ab dem Rest 28 (Glu) bis zum Rest 196 (Lys) gezeigt, umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines FGF-homologen Polypeptids in einer Menge, die ausreichend ist, eine klinisch signifikante Zunahme in der Anzahl der Myozyten oder der Myozyten-Vorläufer in dem Säugetier herzustellen, für die Erzeugung eines Medikaments zum Stimulieren der Proliferation von Myozyten oder Myozyten-Vorläufern in einem Säugetier bereit.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Stimulieren der Proliferation von Myozyten oder Myozyten-Vorläufern bereit, wobei die Myozyten oder die Myozyten-Vorläufer Kardiomyozyten oder Kardiomyozyten-Vorläufer sind.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur ex vivo Stimulation von Myozyten-Vorläuferzellen oder Myozyten bereit, das das Kultivieren von Herzgewebezellen mit einer Menge eines FGF-homologen Polypeptids umfasst, die ausreichend ist, eine Zunahme in der Anzahl der Myozyten-Vorläuferzellen oder der Myozyten in den Herzgewebezellen herzustellen, die in der Gegenwart eines FGF-homologen Polypeptids kultiviert werden, im Vergleich zu Myozyten-Vorläuferzellen oder Myozyten des Herzgewebes, die in der Abwesenheit eines FGF-homologen Polypeptids kultiviert werden.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur ex vivo Stimulation von Myozyten-Vorläuferzellen oder Myozyten bereit, worin die Myozyten oder die Myozyten-Vorläufer Kardiomyozyten oder Kardiomyozyten-Vorläufer sind.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines ersten Moleküls bereit, das ein FGF-homologes Polypeptid umfasst, das mit einem zweiten Molekül verknüpft ist, das ein Agens oder einen Wirkstoff umfasst, zum Bilden einer Chimäre zur Erzeugung eines Medikaments zur Behand lung einer Herzerkrankung oder der Förderung der kardialen Hyperplasie, wobei das Agens oder der Wirkstoff selektiv in das Herzgewebe gebracht wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 und 2 veranschaulichen eine Mehrfach-Anordnung („multiple alignment") des humanen Fibroblast-Wachstumsfaktor-homologen Faktors 1 (FHF-1), des humanen Myozyten-Aktivierungsfaktors (FGF-10), des humanen Fibroblast-Wachstumsfaktor-homologen Faktors 4 (FHF-4), des humanen Fibroblast-Wachstumsfaktor-homologen Faktors 2 (FHF-2), des humanen Fibroblast-Wachstumsfaktorhomologen Faktors 3 (FHF-3), des humanen FGF-4, des humanen FGF-6, des humanen FGF-2 (basisch), des humanen FGF-1 (sauer), des humanen Keratinozyt-Wachstumsfaktors 2 (KGF-2), des humanen Keratinozyt-Wachstumsfaktor-Vorläufers (FGF-7), des humanen zFGF-5, des humanen FGF-8, des humanen FGF-5, des humanen FGF-9 und des humanen FGF-3. „*" kennzeichnet konservierte Aminosäuren; „:" kennzeichnet konservierte Aminosäure-Substitutionen und „." kennzeichnet weniger streng konservierte Aminosäure-Substitutionen.
3 ist eine Ähnlichkeitsmatrix zwischen den Familien, die den Prozentsatz der Identität zwischen dem humanen FGF-5, dem humanen FGF-6, dem humanen FGF-7, dem humanen FGF-8, dem humanen FGF-9, dem humanen zFGF-5, dem humanen FGF-10, dem humanen FGF-1, dem humanen FHF-1, dem humanen FGF-2, dem humanen FHF-2, dem humanen FHF-4, dem humanen FGF-3, dem humanen KGF-2, dem humanen FHF-3 und dem humanen FGF-4 darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINGUNG
Der Begriff „Ortholog" (oder „Artenhomolog") bezeichnet ein aus einer Art erhaltenes Polypeptid oder Protein, das Homologie zu einem anologen Polypeptid oder Protein aus einer anderen Art aufweist.
Der Begriff „Paralog" bezeichnet ein aus einer gegebenen Art erhaltenes Polypeptid oder Protein, das Homologie zu einem verschiedenen Polypeptid oder Protein aus der gleichen Art aufweist.
Der Begriff „allelische Variante" bezeichnet jede beliebige aus zwei oder mehreren alternativen Formen eines Gens, die den gleichen chromosomalen Locus belegen. Allelische Varianten entstehen natürlich durch Mutation und können zum phänotypischen Polymorphismus innerhalb der Populationen führen. Genmutationen können still sein (keine Änderung in dem kodierten Polypeptid) oder können Polypeptide kodieren, die eine geänderte Aminosäuresequenz aufweisen. Der Begriff allelische Variante wird hierin ebenfalls verwendet, um ein Protein zu bezeichnen, das durch eine allelische Variante eines Gens kodiert wird.
Der Begriff „Expressionsvektor" bezeichnet ein lineares oder zirkuläres DNA-Molekül, das ein Segment umfasst, welches ein Polypeptid von Interesse kodiert, das mit zusätzlichen Segmenten operabel verknüpft ist, die dessen Transkription ermöglichen. Solche zusätzlichen Segmente können Promotor- und Terminator-Sequenzen beinhalten und können wahlweise einen oder mehrere Replikations-Ursprünge („origins of replication"), einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Verstärker („enhancer"), ein Polyadenylierungs-Signal und Ähnliches beinhalten. Die Expressionsvektoren sind im Allgemeinen von der Plasmid- oder der viralen DNA abgeleitet oder können Elemente von beiden enthalten.
Der Begriff „isoliert" gibt an, sofern dieser auf ein Polynukleotidmolekül angewendet wird, dass das Polynukleotid aus dessem natürlichen genetischen Milieu entfernt wurde und somit frei von anderen fremden oder unerwünschten kodierenden Sequenzen ist und in einer für die Verwendung in genetisch konstruierten Proteinherstellungs-Systemen geeigneten Form vorliegt. Solche isolierten Moleküle wurden von ihrer natürlichen Umgebung abgetrennt und beinhalten cDNA und genomische Klone. Die isolierten DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind frei von anderen Genen, mit welchen sie gewöhnlich assoziiert sind, sie können aber natürlich vorkommende 5'- und 3'-nicht-translatierte Regionen, wie z.B. Promotoren oder Terminatoren beinhalten. Die Identifikation der assoziierten Regionen wird für einen Durchschnittsfachmann offensichtlich sein (siehe zum Beispiel Dynan und Tijan, Nature 316: 774–78, 1985). Sofern auf ein Protein angewendet, deutet der Begriff „isoliert" an, dass das Protein in einem anderen Zustand als in seiner natürlichen Umgebung gefunden wird, wie z.B. außerhalb des Blutes oder des tierischen Gewebes. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere von anderen Proteinen tierischen Ursprungs. Es wird bevorzugt, ein Protein in einer hoch aufgereinigten Form bereitzustellen, d.h. zu mehr als 95% rein, stärker bevorzugt zu mehr als 99% rein.
Der Begriff „operabel verknüpft" bezeichnet, sofern dieser auf DNA-Segmente bezogen wird, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie für ihre beabsichtigten Zwecke zusammenwirken, z.B. die Transkription im Promotor initiiert und (dies) verläuft weiter durch die kodierenden Segmente bis zum Terminator.
Der Begriff "Polynukleotid" bezeichnet ein einfach- oder doppelsträngiges Polymer aus Desoxyribonukleotid- oder Ribonukleotid-Basen, gelesen vom 5'- zum 3'-Ende. Die Polynukleotide beinhalten RNA und DNA und sie können aus natürlichen Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination aus natürlichen und synthetischen Molekülen hergestellt werden.
Der Begriff „Komplemente der Polynukleotidmoleküle" bezeichnet Polynukleotidmoleküle, die eine komplementäre Basensequenz und eine umgekehrte Orientierung, im Vergleich zu einer Referenzsequenz, aufweisen. Zum Beispiel ist die Sequenz 5' ATGCACGGG 3' komplementär zu 5' CCCGTGCAT 3'.
Der Begriff „degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, die einen oder mehrere degenerierte Kodons (im Vergleich zu einem Referenz-Polynukleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert) beinhaltet. Degenerierte Kodons enthalten unterschiedliche Tripletts von Nukleotiden, kodieren aber den gleichen Aminosäurerest (d.h. die Tripletts GAU und GAC kodieren jeweils Asp).
Der Begriff „Promotor" beschreibt einen Genteil, der die DNA-Sequenzen enthält, die für die Bindung der RNA-Polymerase und die Initiation der Transkription verantwortlich sind. Die Promotor-Sequenzen werden gewöhnlich, aber nicht immer, in den 5'-nicht-kodierenden Genregionen gefunden.
Der Begriff „Sekretions-Signalsequenz" beschreibt eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid (ein „Sekretions-Peptid") kodiert, das als eine Komponente eines größeren Polypeptids das größere Polypeptid über einen Sekretions-Pfad einer Zelle, in der es synthetisiert wird, steuert. Das größere Peptid wird gewöhnlich abgespalten, um das Sekretions-Peptid während des Durchgangs durch den Sekretions-Pfad zu entfernen.
Der Begriff „Rezeptor" beschreibt ein Zell-assoziiertes Protein, das an ein bioaktives Molekül (d.h. einen Liganden) bindet und die Wirkung des Liganden auf die Zelle vermittelt. Membran-gebundene Rezeptoren sind durch eine Multidomänen-Struktur gekennzeichnet, die eine extrazelluläre Ligand-Bindedomäne und eine intrazelluläre Effektor-Domäne umfasst, die typischerweise in die Signaltransduktion involviert ist. Die Bindung des Liganden an den Rezeptor führt zu einer Konformationsänderung in dem Rezeptor, die eine Interaktion zwischen der Effektor-Domäne und einem anderem/anderen Molekül(en) in der Zelle verursacht. Diese Interaktion führt wiederum zu einer Änderung des Metabolismus der Zelle. Metabolische Ereignisse, die mit Rezeptor-Ligand-Interaktionen verknüpft sind, beinhalten die Gentranskription, die Phosphorylierung, die Dephosphorylierung, die Zunahmen der Produktion des zyklischen AMP, die Mobilisierung zellulären Calciums, die Mobilisierung von Membranlipiden, die Zelladhäsion, die Hydrolyse von Inositol-Lipiden und die Hydrolyse von Phospholipiden. Die meisten Kernrezeptoren weisen ebenfalls eine Multidomänen-Struktur, einschließlich einer Amino-terminalen Transaktivierungs-Domäne, einer DNA-Bindedomäne und einer Liganden-Bindedomäne, auf. Im Allgemeinen können die Rezeptoren Membran-gebunden, zytosolisch oder Kern-ständig; monomer (z.B. Thyroid-Stimulierungs-Hormonrezeptor, beta-adrenerger Rezeptor) oder multimer (z.B. PDGF-Rezeptor, Wachstumshormonrezeptor, IL-3-Rezeptor, GM-CSF-Rezeptor, G-CSF-Rezeptor, Erythropoietin-Rezeptor und IL-6-Rezeptor) sein.
Der Begriff „Komplement-/Anti-Komplement-Paar" bezeichnet nicht-identische Reste, die unter geeigneten Bedingungen ein nicht-kovalent assoziiertes, stabiles Paar bilden. Zum Beispiel sind Biotin und Avidin (oder Streptavidin) prototypische Mitglieder eines Komplement-/Anti-Komplement-Paares. Andere beispielhafte Komplement-/Anti-Komplement-Paare beinhalten Rezeptor-/Ligand-Paare, Antikörper/Antigen-(oder Hapten oder Epitop)Paare, „sense"-/„antisense"-Polynukleotid-Paare und Ähnliches. Sofern nachfolgende Dissoziation des Komplement-/Anti-Komplement-Paares gewünscht ist, weist das Komplement-/Anti-Komplement-Paar vorzugsweise eine Bindeaffinität von <10⁹ M^–1 auf.
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung einer neuen DNA-Sequenz, die ein Fibroblast-Wachstumsfaktor(FGF)-homologes Polypeptid kodiert, das Homologie zum FGF-8 aufweist. Die Analyse der Gewebeverteilung der mRNA, die dieser neuen DNA entspricht, zeigte, dass die Expression im fötalen Herzgewebe und im adulten Herzgewebe am stärksten war, gefolgt von sichtbaren aber erniedrigten Expressions-Leveln in der fötalen Lunge, im Skelettmuskel, in den glatten Muskelgeweben, wie z.B. dem Dünndarm, dem Dickdarm und der Luftröhre. Das FGF-homologe Polypeptid wurde als zFGF-5 bezeichnet.
Die neuen zFGF-5-Polypeptide der vorliegenden Erfindung wurden anfänglich beim Durchsuchen einer EST-Datenbank nach Wachstumsfaktoren identifiziert. Eine einzelne EST-Sequenz wurde entdeckt und für diese wurde vorhergesagt, dass sie mit der FGF-Familie verwandt ist. Das neue FGF-homologe Polypeptid, das durch die Volllängen-cDNA kodiert wird, enthielt ein Motiv der Formel: CXFXEX{6}Y, wobei X jede beliebige Aminosäure ist und X{} die Anzahl von X Aminosäuren ist, die größer als eins ist. Dieses Motiv kommt in allen bekannten Mitgliedern der FGF-Familie vor und. ist in diesen Proteinen einzigartig.
Die Nukleotidsequenz der zFGF-5-cDNA wird in SEQ ID NO. 1 beschrieben und deren abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO. 2 beschrieben. Wenn der Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 181 (Gln) von SEQ ID NO: 2 mit der entsprechenden Region des FGF-8 verglichen wird (siehe 1 und 2), weist die einem Alignment unterworfene und abgeleitete Aminosäuresequenz ungefähr 56% Identität auf.
Das neue Polypeptid, das durch das hierin beschriebene Polynukleotid kodiert wird, enthält das CXFXE{6}Y-Motiv, das in allen Mitgliedern der FGF-Familie vorhanden ist. Die CXFXE{6}Y-Motive sind hoch konserviert. Eine Konsensus-Aminosäuresequenz der CXFXEX{6}Y-Domäne beinhaltet den humanen Fibroblast-Wachstumsfaktor-homologen Faktor 1 (FHF-1, Smallwood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9850–9857, 1996), den humanen Myozyten-Aktivierungsfaktor (FGF-10; HSU76381, GENBANK Identifikator, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, den humanen Fibroblast-Wachstumsfaktorhomologen Faktor 4 (FHF-4, Smallwood et al., 1996, ebd.), den humanen Fibroblast-Wachstumsfaktorhomologen Faktor 2 (FHF-2, Smallwood et al., 1996, ebd.), den humanen Fibroblast-Wachstumsfaktorhomologen Faktor 3 (FHF-3, Smallwood et al., 1996 ebd.), den humanen FGF-4 (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115–165, 1992), den humanen FGF-6 (Basilico et al., 1992, ebd.), den humanen FGF-2 (basisch; Basilico et al., 1992, ebd.), den humanen FGF-1 (sauer; Basilico et al., 1992, ebd.), den humanen Keratinozyten-Wachstumsfaktor 2 (KGF-2; GENBANK Identifikator, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), den humanen Keratinozyten-Wachstumsfaktor-Vorläufer (FGF-7; Basilico et al., 1992, ebd.), den humanen zFGF-5, den humanen FGF-8 (Gemel et al., Genomics 35: 253–257; 1996), den humanen FGF-5 (Basilico et al., 1992, ebd.), den humanen FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell. Biol. 13: 4251–4259, 1993) und den humanen FGF-3 (Basilico et al., 1992, ebd.).
Die Analyse der cDNA, die ein zFGF-5-Polypeptid kodiert (SEQ ID NO: 1), zeigte einen offenen Leserahmen, der für 207 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2) kodiert, die ein reifes Polypeptid von 180 Aminosäuren (Rest 28 bis Rest 207 von SEQ ID NO: 2) umfassen. Ein mehrfaches Alignmentvon zFGF-5 mit anderen bekannten FGFs zeigte einen Bereich („Block") mit hohem Prozentsatz an Identität, der mit dem Aminosäurerest 127 (Cys) bis zum Aminosäurerest 138 (Tyr) von SEQ ID NO: 2 korrespondiert, und in der Figur gezeigt ist. Verschiedene Mitglieder der FGF-Familie weisen keine Signal-Sequenzen auf.
Die Mitglieder der FGF-Familie sind durch Heparin-Bindedomänen gekennzeichnet. Eine mutmaßliche Heparin-Bindedomäne wurde für zFGF-5 in der Region von Aminosäurerest 148 (Gly) bis Aminosäurerest 169 (Gln) von SEQ ID NO: 2 identifiziert. Es wurde postuliert, dass die Rezeptor-vermittelte Signalübertragung durch Binden des mit Heparin-Sulfat-Proteoglykanen der Zelloberfläche komplexierten FGF-Liganden initiiert wird. Viele Mitglieder der FGF-Familie können aufgrund ihrer Strukturen und Funktionen einer der zwei Familien zugeordnet werden. aFGF und bFGF bestehen aus drei Exons, die durch zwei Introns variabler Länge getrennt werden. FGF-8 besteht aus fünf Exons, von welchen die ersten drei dem ersten Exon von aFGF und bFGF entsprechen. Alle der bekannten Mitglieder der FGF-Familie werden „gespleißt", um einzelne Polypeptide zu bilden.
SEQ ID NO: 6 ist eine degenerierte Polynukleotidsequenz, die alle Polynukleotide umfasst, die die zFGF-5-Polypeptide von SEQ ID NO: 2 (Aminosäuren 1 oder 28 bis 207) kodieren könnten. Somit werden die zFGF-5-Polypeptid-kodierenden Polynukleotide, die in einem Bereich von Nukleotid 1 oder 82 bis zum Nukleotid 621 von SEQ ID NO: 6 liegen, durch die vorliegende Erfindung erfaßt. Durch die vorliegende Erfindung werden ebenfalls die Fragmente und Fusionen zum Kodieren eines reifen zFGF-5-Moleküls umfaßt, wie oben mit Bezug auf SEQ ID NO: 1 beschrieben, welche aus analogen Regionen von SEQ ID NO: 6 gebildet werden, wobei die Nukleotide 82 bis 621 von SEQ ID NO: 6 den Nukleotiden 82 bis 621 von SEQ ID NO: 1 entsprechen.
Die Symbole in SEQ ID NO: 6 sind unten in der Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1
Die degenerierten Kodons, die in SEQ ID NO: 6 verwendet werden, die alle möglichen Kodons für eine gegebene Aminosäure umfassen, werden unten in der Tabelle 2 dargelegt.
Tabelle 2
Ein Durchschnittsfachmann wird verstehen, dass bei der Bestimmung eines degenerierten Kodons, das alle möglichen Kodons repräsentiert, die für jede einzelne Aminosäure kodieren, eine gewisse Mehrdeutigkeit eingeführt wird. Zum Beispiel kann das degenerierte Kodon für Serin (WSN) unter manchen Umständen Arginin (AGR) kodieren und das degenerierte Kodon für Arginin (MGN) kann unter manchen Umständen Serin (AGY) kodieren. Eine ähnliche Beziehung besteht zwischen Kodons, die Phenylalanin und Leucin kodieren. Deshalb können manche Polynukleotide, die von der degenerierten Sequenz umfasst werden, einige falsche Aminosäuren aufweisen. Ein Durchschnittsfachmann kann aber die fehlerhaften Sequenzen über den Bezug zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 leicht identifizieren.
Die hoch konservierten Aminosäuren in zFGF-5 können als Werkzeug zum Identifizieren neuer Familienmitglieder verwendet werden. Um neue Familienmitglieder in EST-Datenbanken zu identifizieren, kann das konservierte CXFXEX{6}Y-Motiv verwendet werden. In einem anderen Verfahren kann die RNA, die aus einer Vielzahl an Gewebe-Quellen erhalten wird, unter Verwendung von Polynukleotid-Sonden und Hybridisierungs-Verfahren verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken zu erzeugen und die Bibliotheken auf neue Familienmitglieder zu sondieren. Insbesondere kann die reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion („reverse transcription-polymerase chain reaction", RT-PCR) verwendet werden, um Sequenzen zu amplifizieren, die hoch degenerierte DNA-Primer, konstruiert aus den Sequenzen, die dem Aminosäurerest 127 (Cys) bis zum Aminosäurerest 138 (Tyr) von SEQ ID NO: 2 entsprechen, kodieren.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die isolierten Polynukleotide als eine Sonde dienen und an ähnlich große Regionen von SEQ ID NO: 1 oder eine hierzu komplementäre Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie bei einer definierten Ionenstärke und pH etwa 5°C unter dem themischen Schmelzpunkt (T_m) der spezifischen Sequenz liegen. Der T_m ist die Temperatur (unter einer definierten Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Zielsequenz zu einer perfekt passenden Sonde hybridisieren. Typische stringente Bedingungen sind solche, in welchen die Salzkonzentration bei pH 7 bei mindestens etwa 0,02 M liegt und die Temperatur bei mindestens etwa 60°C liegt.
Wie zuvor vermerkt, beinhalten die isolierten Polynukleotide der vorliegenden Erfindung DNA und RNA. Verfahren zum Isolieren von DNA und RNA sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Es wird im Allgemeinen bevorzugt, RNA aus dem kardialen Gewebe zu isolieren, obgleich DNA ebenfalls unter Verwendung von RNA aus anderen Geweben präpariert werden oder als genomische DNA isoliert werden kann. Die gesamte RNA kann unter Verwendung der Guanidin-HCl-Extraktion, gefolgt von der Isolation durch Zentrifugation in einem CsCl-Gradienten (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52–94, 1979), präpariert werden. Poly(A)⁺-RNA wird aus der gesamten RNA unter Verwendung des Verfahren von Aviv und Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408–1412, 1972) präpariert. Die komplementäre DNA (cDNA) wird aus der Poly(A)⁺-RNA unter Verwendung bekannter Verfahren präpariert. Polynukleotide, die die zFGF-5-Polypeptide kodieren, werden danach beispielsweise durch Hybridisierung oder PCR identifiziert und isoliert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin entsprechende („counterpart") Polypeptide und Polynukleotide aus anderen Arten (Orthologe oder Paraloge) bereit. Von besonderem Interesse sind zFGF-5-Polypeptide aus anderen Säugetierarten, einschließlich der Maus-, Ratten-, Schweine-, Schafs-, Rinder-, Hunde-, Kat zen-, Pferde- und anderer Primaten-Proteine. Die Identifizierung von Paralogen der humanen Sequenz ist besonders interessant, weil, während acht Paraloge von Maus-FGF-8 identifiziert wurden, nur vier humane Paraloge bekannt sind. Die humanen Paraloge oder Artenhomologe der humanen Proteine können unter Verwendung der Information und der Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, in Kombination mit konventionellen Klonierungs-Techniken, kloniert werden. Zum Beispiel kann eine cDNA unter Verwendung von mRNA kloniert werden, die aus einer Gewebe- oder Zellart erhalten wird, die das Protein exprimiert. Geeignete Quellen für die mRNA können durch Sondieren von Nothern Blots mit Sonden identifiziert werden, die aus den hierin offenbarten Sequenzen konstruiert werden. Danach wird eine Bibliothek aus der mRNA einer positiven Gewebe- oder Zelllinie erzeugt. Eine zFGF-5-kodierende cDNA kann danach durch eine Vielfalt an Verfahren isoliert werden, wie z.B. durch Sondieren mit einer vollständigen humanen cDNA eoder einem Teil davon oder mit einem oder mehreren Sets degenerierter Sonden, die auf den offenbarten Sequenzen basieren. Eine cDNA kann ebenfalls unter Verwendung der Polymerase-Kettenrektion („polymerase chain reaction"), oder PCR (Mullis, U.S.-Patent 4,683,202) unter Verwendung von Primern kloniert werden, die aus der hierin offenbarten Sequenzen konstruiert werden. In einem zusätzlichen Verfahren kann die cDNA-Bibliothek verwendet werden, um Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren, und die Expression der cDNA von Interesse kann mit einem Antikörper gegen zFGF-5 detektiert werden. Ähnliche Techniken können ebenfalls zur Isolation genomischer Klone angewendet werden.
Ein Fachmann wird erkennen, dass die in SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 offenbarten Sequenzen ein einzelnes Allel des humanen zFGF-5-Gens und -Polypeptids repräsentieren und dass erwartet wird, dass allelische Varianten und alternatives „Spleißen" auftreten. Allelische Varianten können durch Sondieren der cDNA oder der genomischen Bibliotheken aus verschiedenen Individuen gemäß den Standardverfahren kloniert werden. Allelische Varianten der DNA-Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, einschließlich solcher, die stille Mutationen enthalten, und solcher, in welchen die Mutationen zu Änderungen der Aminosäuresequenz führen, liegen, genauso wie Proteine, die allelische Varianten von SEQ ID NO: 2 darstellen, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls isolierte zFGF-5-Polypeptide bereit, die im Wesentlichen homolog zu den Polypeptiden von SEQ ID NO: 2 und deren Artenhomologen/-orthologen sind. Der Begriff „im Wesentlichen homolog" wird hierin verwendet, um Polypeptide zu bezeichnen, die 50%, vorzugsweise 60%, stärker bevorzugt mindestens 80% Sequenzidentität mit den in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenzen oder deren Orthologen oder Paralogen aufweisen. Solche Polypeptide werden stärker bevorzugt mindestens 90% identisch und am stärksten bevorzugt 95% oder mehr identisch mit SEQ ID NO: 2 oder deren Orthologen oder Paralogen sein. Der Prozentsatz der Sequenzidentität wird durch konventionelle Verfah ren bestimmt. Siehe beispielsweise Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603–616, 1986, und Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915–10919, 1992. Zusammengefasst, werden zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung einer Strafe für das Einfügen von Lücken („Gap opening penalty") von 10, einer Strafe für das Erweitern von Lücken („Gap extension penalty") von 1 und der „Blosum 62"-Punktematrix von Henikoff und Henikoff (ebd.), um das Alignment-Ergebnis zu optimieren, wie in Tabelle 3 gezeigt (die Aminosäuren sind durch standardmäßige Ein-Buchstaben-Kodes angegeben), angeordnet.
Tabelle 3
Der Prozentsatz der Identität wird danach berechnet als:
Die Sequenzidentität von Polynukleotidmolekülen wird durch ähnliche Verfahren unter Verwendung eines wie oben offenbarten Verhältnisses bestimmt.

Im Wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Einfügungen aufweisen. Diese Änderungen sind vorzugsweise von geringerer Bedeutung, das heißt, konservative Aminosäure-Substitutionen (siehe Tabelle 4) und andere Substitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins oder Polypeptids nicht signifikant beeinflussen; kleine Deletionen, typischerweise von einer bis etwa 30 Aminosäuren; und kleine Amino- oder Carboxyl-terminale Erweiterungen, wie z.B. ein Amino-terminaler Methionin-Rest, ein kleines „Linker"-Peptid von bis zu etwa 20–25 Resten oder eine kleine Erweiterung, die die Aufreinigung erleichtert (ein Affinitäts-„Tag"), wie z.B. als ein Polyhistidin-Bereich („tract"), Protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), Glutathion-S-Transferase (Smith und Johnson, Gene 67: 31, 1988), Maltose-Bindeprotein (Kellerman und Ferenci, Methods Enzymol. 90: 459–463, 1982; Guan et al., Gene 67: 21–30, 1987) oder andere antigene Epitope oder Bindedomänen. Siehe im Allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95–107, 1991. DNA-kodierende Affinitäts-„Tags" sind von kommerziellen Anbietern erhältlich (z.B. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA). Tabelle 4 Konservative Aminosäure-Substitutionen

Basisch:	Arginin Lysin Histidin
Sauer:	Glutaminsäure Asparginsäure
Polar:	Glutamin Asparagin
Hydrophob:	Leucin Isoleucin Valin
Aromatisch:	Phenylalanin Tryptophan Tyrosin
Klein:	Glycin Alanin Serin Threonin Methionin

Die Proteine der vorliegenden Erfindung können zusätzlich zu den 20 Standard-Aminosäuren ebenfalls nicht-natürlich vorkommende Aminosäurereste umfassen. Nicht natürlich vorkommende Aminosäuren beinhalten, ohne Beschränkung, trans-3-Methylprolin, 2,4-Methanoprolin, cis-4-Hydroxyprolin, trans-4-Hydroxyprolin, N-Methylglycin, allo-Threonin, Methylthreonin, Hydroxyethylcystein, Hydroxyethylhomocystein, Nitroglutamin, Homoglutamin, Pipecolsäure, tert-Leucin, Norvalin, 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin, 4-Fluorphenylalanin, 4-Hydroxyprolin, 6-N-Methyllysin, 2-Aminisobutansäure, Isovalin und α-Methylserin. Verschiedene Verfahren zum Einbauen nicht-natürlich vorkommender Aminosäurereste in die Proteine sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel, kann ein in vitro System eingesetzt werden, worin „nonsense"-Mutationen unter Verwendung chemisch aminoacylierter „Suppressor"-tRNAs unterdrückt wird. Verfahren zum Synthetisieren von Aminosäuren zum Aminoacylieren von tRNA sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Transkription und Translation von Plasmiden, die „nonsense"-Mutationen enthalten, werden in einem zellfreien System durchgeführt, das einen E. coli S30-Extrakt und kommerziell erhältliche Enzyme und andere Reagenzien umfasst. Die Proteine werden über Chromatographie gereinigt. Siehe beispielsweise Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Meth. Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806–09, 1993; und Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145–49, 1993). In einem zweiten Verfahren wird die Translation in Xenopus-Eizellen durch Mikroinjektion der mutierten mRNA und der chemisch aminoacylierten „Suppressor"-tRNAs durchgeführt (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991–98, 1996). In einem dritten Verfahren werden E. coli-Zellen in Abwesenheit einer natürlichen Aminosäure, die ausgetauscht werden soll (z.B. Phenylalanin), und in der Gegenwart der gewünschten nicht-natürlich vorkommenden Aminosäure(n) (z.B. 2-Azaphenylalanin, 3-Azaphenylalanin, 4-Azaphenylalanin oder 4-Fluorphenylalanin) kultiviert. Die nicht-natürlich vorkommende Aminosäure wird in das Protein anstelle von deren natürlichem Gegenstück eingeführt. Siehe Koide et al., Biochem. 33: 7470–76, 1994. Natürlich vorkommende Aminosäurereste können in vitro durch chemische Modifikationen in nicht-natürlich vorkommende Spezies umgewandelt werden. Die chemische Modifikation kann mit der ortsgerichteten Mutagenese kombiniert werden, um den Bereich der Substitutionen weiter auszudehnen (Wynn und Richards, Protein Sci. 2: 395–403, 1993).
Essentielle Aminosäuren in den zFGF-5-Polypeptiden der vorliegenden Erfindung können gemäß den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z.B. der ortsgerichteten Mutagenese oder der Alanin-Scan-Mutagenese (Cunningham und Wells, Science 244: 1081–1085, 1989) identifiziert werden. In der letztgenannten Technik werden einzelne Alanin-Mutationen an jedem Rest in dem Molekül eingeführt und die resultierenden mutierten Moleküle werden auf biologische Aktivität (z.B. Proliferation von Kardiomyozyten oder Fibroblasten oder Stimulation der Knochenbildung) getestet, um Aminosäurereste zu identifizieren, die für die Aktivität des Moleküls kritisch sind. Siehe ebenfalls Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699–4708, 1996. Die Stellen der Ligand-Rezeptor-Interaktion können ebenfalls durch physikalische Strukturanalyse bestimmt werden, wie z.B. durch solche Techniken wie Kernmagnetische Resonanz, Kristallographie, Elektronenbeugung oder Photoaffinitätsmarkierung, in Verbindung mit der Mutation von mutmaßlichen Aminosäuren der Kontaktstelle. Siehe beispielsweise de Vos et al., Science 255: 306–312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899–904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59–64, 1992. Auf die Identitäten der essentiellen Aminosäuren kann ebenfalls aus der Analyse der Homologien mit verwandten FGFs geschlossen werden. Diese sind in den 1 und 2 gezeigt.
Die Analysen der Aminosäuresequenz von zFGF-5 zeigten eine dibasische Stelle an dem C-Terminus des Polypeptids (Aminosäurerest 196–197 (Lys-Arg)). Für ein C-terminal verkürztes Polypeptid, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 ab dem Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Aminosäurerest 196 (Lys) gezeigt, umfasst, wurde gezeigt, dass es biologische Aktivität aufweist. Dibasische Aminosäuren, wie z.B. Arg-X-X-Arg (worin X jeder beliebige Aminosäurerest ist), Arg-Arg oder Lys-Arg, unterliegen der Spaltung durch verschiedene Enzyme, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Thrombin und Carboxyl-Peptidasen. Deshalb liegt es innerhalb des Rahmens der Ansprüche, konservative Änderungen an den dibasischen Aminosäureresten, insbesondere an den Aminosäureresten 196 und 197 (Lys bzw. Arg) von SEQ ID NO: 2, vorzunehmen.
Basierend auf den Analysen der FGF-Familie kann ein C-terminal verkürztes Molekül, das den Aminosäurerest 28 (Glu) bis zum Rest 175 (Met) von SEQ ID NO: 2 umfasst, biologisch aktiv sein. Es wird vorhergesagt, dass eine intramolekulare Disulfid-Bindung zwischen dem Aminosäurerest 109 (Cys) und dem Rest 129 (Cys) von SEQ ID NO: 2 vorkommt.
Basierend auf Homologie-Alignments mit FGF-1- und FGF-2-Kristallstrukturen (Eriksson et al., Prot. Sci. 2; 1274, 1993) korrelieren Sekundärstruktur-Vorhersagen für die Beta-Faltblatt-Struktur von zFGF-5 mit den Aminosäureresten 56–59, 64–69, 73–76, 85–92, 96–102, 106–111, 115–119, 128–134, 138–144, 149–155 und 173–177 von SEQ ID NO: 2. Kritische Aminosäuren für die zFGF-Bindung an Rezeptoren können durch ortsgerichtete Mutagenese des ganzen zFGF-Polypeptids identifiziert werden. Spezifischer können diese unter Verwendung der ortsgerichteten Mutagenese der Aminosäuren im zFGF-5-Polypeptid identifiziert werden, welche den Aminosäureresten in dem sauren FGF (FGF-1) und dem basischen FGF (FGF-2) entsprechen, die in Bezug auf die Bindung dieser FGFs an deren Rezeptoren als kritisch identifiziert wurden (Blaber et al., Biochem. 35: 2086–2094, 1996). Diese Aminosäuren beinhalten Tyr33, Arg53, Asn110, Tyr112, Lys119, Trp123, Leu149 und Met151 in humanem FGF-2 und Tyr30, Arg50, Asn107, Tyr109, Lys116, Trp122, Leu148 und Leu150 in humanem FGF-1, wie in 1 und 2 gezeigt. Die entsprechenden Aminosäuren in zFGF-5 wären, wie in 1 und 2 gezeigt, Tyr58, Gly77, Asn136, Tyr138, Lys145, Trp149, Met175 und Arg177. Ein Fachmann wird erkennen, dass andere Mitglieder der FGF-Familie, im Ganzen oder teilweise, strukturelle oder biochemische Ähnlichkeiten zu zFGF-5 aufweisen können und während der Analysen substituiert werden können. Solche Regionen würden für biologische Funktionen des Moleküls wichtig sein.
Mehrfache Aminosäure-Substitutionen können unter Verwendung bekannter Mutagenese- und Screening-Verfahren, wie z.B. den durch Reidhaar-Olson und Sauer (Science 241: 53–57, 1988) oder Bowie und Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152–2156, 1989) offenbarten, durchgeführt und getestet werden. Zusammengefasst, offenbaren diese Autoren Verfahren zum gleichzeitigen zufälligen Anordnen von zwei oder mehreren Positionen in einem Polypeptid, Selektieren nach einem funktionellen Polypeptid und danach Sequenzieren der mutagenisierten Polypeptide, um das Spektrum der möglichen Substitutionen an jeder einzelnen Position zu bestimmen. Andere Verfahren, die verwendet werden können, beinhalten das Phagen-Display (z.B. Lowman et al., Biochem. 30: 10832–10837, 1991; Ladner et al., U.S.-Patent Nr. 5,223,409; Huse, WIPO-Veröffentlichung WO 92/06204) und die Bereichs-gerichtete Mutagenese (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Mutagenese-Verfahren, wie oben offenbart, können mit automatisierten Hochdurchsatz-Screening-Verfahren kombiniert werden, um die Aktivität von klonierten, mutagenisierten Polypeptiden in Wirtszellen zu detektieren. Mutagenisierte DNA-Moleküle, die aktive Polypeptide (z.B. Zell-Proliferation) kodieren, können aus den Wirtszellen gewonnen werden und unter Verwendung moderner Ausrüstung schnell sequenziert werden. Diese Verfahren gestatten die schnelle Bestimmung der Wichtigkeit von individuellen Aminosäureresten in einem Polypeptid von Interesse und können auf Polypeptide mit unbekannter Struktur angewendet werden.
Unter Verwendung der oben diskutierten Verfahren kann ein Durchschnittsfachmann eine Vielfalt an Polypeptiden identifizieren und/oder präparieren, die im Wesentlichen homolog sind zu den Resten 28 (Glu) bis 196 (Lys) oder den Resten 28 (Glu) bis 207 (Ala) von SEQ ID NO: 2, allelischen Varianten hiervon oder biologisch aktiven Fragmenten hiervon, und die proliferativen Eigenschaften des Wildtyp-Proteins beibehalten. Solche Polypeptide können ebenfalls zusätzliche Polypeptid-Segmente beinhalten, wie oben im Allgemeinen offenbart.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, einschließlich der Volllängen-Proteine, der Fragmente hiervon und der Fusionsproteine, können in genetisch konstruierten Wirtszellen gemäß konventionellen Techniken hergestellt werden. Geeignete Wirtszellen sind solche Zellarten, die mit exogener DNA transformiert oder transfiziert und in Kultur gezüchtet werden können, und beinhalten Bakterien, Pilzzellen und kultivierte höhere eukaryontische Zellen. Eukaryotische Zellen, insbesondere kultivierte Zellen multizellulärer Organismen, werden bevorzugt. Die Techniken zum Manipulieren klonierter DNA-Moleküle und zum Einbringen exogener DNA in eine Vielfalt an Wirtszellen werden durch Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, und Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Bioloay, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987, offenbart.
Im Allgemeinen ist eine DNA-Sequenz, die ein zFGF-5-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, mit anderen genetischen Elementen, die für dessen Expression erforderlich sind, operabel verknüpft, im Allgemeinen einschließlich eines Transkriptions-Promotors und -Terminators innerhalb eines Expressionsvektors. Der Vektor wird gewöhnlich ebenfalls einen oder mehrere selektierbare Marker und einen oder mehrere Replikations-Ursprünge („origins of replication") enthalten, obgleich der Fachmann erkennen wird, dass selektierbare Marker in bestimmten Systemen auf getrennten Vektoren bereitgestellt werden können und die Replikation der exogenen DNA durch die Integration in das Wirtszellen-Genom bereitgestellt werden kann. Die Wahl von Promotoren, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und anderen Elementen ist eine Frage der routinemäßigen Planung innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmanns. Viele solcher Elemente werden in der Literatur beschrieben und sind von kommerziellen Anbietern erhältlich.
Um ein zFGF-5-Polypeptid in den Sekretions-Pfad einer Wirtszelle zu steuern, wird eine Sekretions-Signalsequenz (ebenfalls als Leitsequenz, Präpro-Sequenz oder Prä-Sequenz bekannt) in dem Expressionsvektor bereitgestellt. Die Sekretions-Signalsequenz kann die natürliche Sequenz oder eine Chimäre sein, die eine Signalsequenz umfasst, die aus einem anderen sekretierten Protein (z.B. t-PA und α-Prä-Pro-Sekretionsleiter („secretory leader")) abgeleitet oder de novo synthetisiert wird. Die Sekretions-Signalsequenz ist mit der zFGF-5-DNA-Sequenz in dem richtigen Leserahmen verbunden. Die Sekretions-Signalsequenzen sind gewöhnlich in 5'-Richtung zu der DNA-Sequenz positioniert, die das Polypeptid von Interesse kodiert, obgleich bestimmte Signalsequenzen an anderen Postionen in der DNA-Sequenz von Interesse lokalisiert sein können (siehe z.B. Welch et al., U.S.-Patent Nr. 5,037,743; Holland et al., U.S.-Patent Nr. 5,143,830).
Es ist ein universelles Akzeptor-Plasmid offenbart, das verwendet werden kann, um eine DNA zu klonieren, die für jedes beliebige Polypeptid von Interesse, einschließlich der Polypeptid-Fusionen, kodiert. Das Akzeptor-Plasmid ist in einem Verfahren zum Präparieren eines doppelsträngigen, zirkulären DNA-Moleküls nützlich. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) Bereitstellen eines doppelsträngigen Donor-DNA-Fragments, das ein Polypeptid von Interesse kodiert; (b) Bereitstellen eines doppelsträngigen, linearen Akzeptor-Plasmids, das stumpfe („blunt") erste und zweite Enden aufweist und einen selektierbaren Marker und eine Replikationssequenz umfasst, die in Saccharomyces cerevisiae funktionell sind, wobei das Akzeptor-Plasmid im Wesentlichen frei von der DNA ist, die das Polypeptid von Interesse kodiert; (c) Bereitstellen eines ersten doppelsträngigen DNA-„Linkers", umfassend ein erstes Segment, das in der Sequenz mit einer ersten Region des Akzeptor-Plasmids identisch ist, und ein zweites Segment, das in der Sequenz mit einer ersten Region des Donor-DNA-Fragments identisch ist, wobei jedes einzelne der ersten und zweiten Segmente des ersten „Linkers" eine Länge von mindestens 10 bp aufweist; (d) Bereitstellen eines zweiten doppelsträngigen DNA-„Linkers", umfassend ein erstes Segment, das in der Sequenz mit einer zweiten Region des Akzeptor-Plasmids identisch ist, und ein zweites Segment, das in der Sequenz mit einer zweiten Region des Donor-DNA-Fragments identisch ist, wobei jedes einzelne der ersten und zweiten Segmente des zweiten „Linkers" eine Länge von mindestens 10 bp aufweist; und (e) Kombinieren des Donor-DNA-Fragments, des Akzeptor-Plasmids, des ersten DNA-„Linkers" und des zweiten DNA-„Linkers" in einer Saccharomyces cerevisiae-Wirtszelle, wobei das Donor-DNA-Fragment mit dem Akzeptor-Plasmid durch homologe Rekombination der Donor-DNA, des Akzeptor-Plasmids und „Linkern" verbunden wird, um ein geschlossenes, zirkuläres Plasmid zu bilden. Das Akzeptor-Plasmid umfasst wei terhin einen Transkriptions-Promotor proximal zu dem ersten Ende, und das Donor-DNA-Fragment ist mit dem Transkriptions-Promotor innerhalb des geschlossenen, zirkulären Plasmids operabel verknüpft. Das Akzeptor-Plasmid umfasst weiterhin ein DNA-Segment, das für ein Leitpeptid kodiert, und/oder ein oder mehrere DNA-Segmente, die einen Peptid-„Tag" kodieren, wobei sie so positioniert werden, dass diese DNA-Segmente mit dem Donor-DNA-Fragment innerhalb des geschlossenen, zirkulären Plasmids operabel verknüpft sind. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Akzeptor-Plasmid weiterhin (a) einen Promotor, ein DNA-Segment, das ein Leitpeptid kodiert, und ein DNA-Segment, das einen ersten Peptid-„Tag" kodiert, worin das DNA-Segment, das ein Leitpeptid kodiert, zwischen dem Promotor und dem DNA-Segment, das einen ersten Peptid-„Tag" kodiert, proximal zu dem ersten Ende des Akzeptor-Plasmids positioniert ist, wobei der Promotor, das DNA-Segment, das ein Leitpeptid kodiert, und das DNA-Segment, das einen ersten Peptid-„Tag" kodiert, operabel verknüpft sind; und (b) ein DNA-Segment, das einen zweiten Peptid-„Tag" kodiert, der proximal zu dem zweiten Ende des Akzeptor-Plasmids ist.
Es ist ein Verfahren zum Präparieren eines doppelsträngigen, zirkulären DNA-Moleküls offenbart, das die Schritte umfasst (a) Bereitstellen einer Vielzahl an überlappenden, doppelsträngigen Donor-DNA-Fragmenten, welche zusammen ein Polypeptid von Interesse kodieren; (b) Bereitstellen eines doppelsträngigen, linearen Akzeptor-Plasmids, das stumpfe („blunt") erste und zweite Enden aufweist und einen selektierbaren Marker und eine Replikationssequenz umfasst, die in Saccharomyces cerevisiae funktionell sind, wobei das Akzeptor-Plasmid im Wesentlichen frei von der DNA ist, die das Polypeptid von Interesse kodiert; (c) Bereitstellen eines ersten doppelsträngigen DNA-„Linkers", umfassend ein erstes Segment, das in der Sequenz mit einer ersten Region des Akzeptor-Plasmids identisch ist, und ein zweites Segment, das in der Sequenz mit einer ersten Region eines der Donor-DNA-Fragmente identisch ist, wobei jedes einzelne der ersten und zweiten Segmente des ersten „Linkers" eine Länge von mindestens 10 bp aufweist; (d) Bereitstellen eines zweiten doppelsträngigen DNA-„Linkers", umfassend ein erstes Segment, das in der Sequenz mit einer zweiten Region des Akzeptor-Plasmids identisch ist, und ein zweites Segment, das in der Sequenz mit einer zweiten Region eines anderen der Donor-DNA-Fragmente identisch ist, wobei jedes einzelne der ersten und zweiten Segmente des zweiten „Linkers" eine Länge von mindestens 10 bp aufweist; und (e) Kombinieren der Donor-DNA-Fragmente, des Akzeptor-Plasmids, des ersten DNA-„Linkers" und des zweiten DNA-„Linkers" in einer Saccharomyces cerevisiae-Wirtszelle, wobei die Donor-DNA-Fragmente mit dem Akzeptor-Plasmid durch homologe Rekombination verbunden werden, um ein geschlossenes, zirkuläres Plasmid zu bilden, das eine Region umfasst, die das Polypeptid von Interesse kodiert. Das Akzeptor-Plasmid umfasst weiterhin einen oder mehrere Transkriptions-Promotoren, ein DNA-Segment, das ein Leitpeptid kodiert, und ein oder mehrere DNA-Segmente, die einen wie oben offenbarten Peptid-„Tag" kodieren.
Pilzzellen, einschließlich der Hefezellen und insbesondere Zellen der Gattung Saccharomyces oder Pichia, sind zum Herstellen der zFGF-5-Fragmente oder -Polypeptid-Fusionen besonders bevorzugte Zellen für Wirte.
Andere Verfahren zum Transformieren von Hefezellen mit exogener DNA und Herstellen rekombinanter Polypeptide hieraus werden beispielsweise durch Kawasaki, U.S.-Patent Nr. 4,599,311; Kawasaki et al., U.S.-Patent Nr. 4,931,373; Brake, U.S.-Patent Nr. 4,870,008; Welch et al., U.S.-Patent Nr. 5,037,743; und Murray et al., U.S.-Patent Nr. 4,845,075, offenbart. Transformierte Zellen werden über den Phänotyp selektiert, der über den selektierbaren Marker, gewöhnliche Wirkstoff-Resistenz oder die Fähigkeit, in der Abwesenheit eines bestimmten Nährstoffs (z.B. Leucin) zu wachsen, bestimmt wird. Ein alternatives bevorzugtes Vektor-System zur Verwendung in der Hefe ist das POT1-Vektor-System, das durch Kawasaki et al. (U.S.-Patent Nr. 4,931,373) offenbart wird, welches es gestattet, dass transformierte Zellen über das Wachstum in Glukose-enthaltenden Medien selektiert werden. Geeignete Promotoren und Terminatoren für die Verwendung in Hefe beinhalten solche aus Genen glykolytischer Enzyme (siehe z.B. Kawasaki, U.S.-Patent Nr. 4,599,311; Kingsman et al., U.S.-Patent Nr. 4,615,974; und Bitter, U.S.-Patent Nr. 4,977,092) und aus Alkohol-Dehydrogenase-Genen. Siehe ebenfalls U.S.-Patente Nr. 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 und 4,661,454, welche hierin durch die Referenz einbezogen sind. Transformations-Systeme für andere Hefen, einschließlich Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia guillermondii und Candida maltosa sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ein besonders bevorzugtes System verwendet Pichia methanolica (siehe PCT-Anmeldung WO 9717450). Für alternative Transformations-Systeme siehe beispielsweise Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459–3465, 1986, und Cregg, U.S.-Patent Nr. 4,882,279. Aspergillus-Zellen können gemäß den Verfahren von McKnight et al., U.S.-Patent Nr. 4,935,349, verwendet werden. Verfahren zum Transformieren von Acremonium chrysogenum werden durch Sumino et al., U.S.-Patent Nr. 5,162,228, offenbart. Verfahren zum Transformieren von Neurospora werden durch Lambowitz, U.S.-Patent Nr. 4,486,533, offenbart.
Kultivierte Säugetierzellen sind ebenfalls bevorzugte Wirte im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Verfahren zum Einbringen exogener DNA in Säugetier-Wirtszellen beinhalten die Calciumphosphatvermittelte Transfektion (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), die Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841–845, 1982), die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion (Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987) und die Liposomen-vermittelte Transfektion (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993). Die Herstellung rekombinanter Polypeptide in kultivierten Säugetierzellen wird beispielsweise durch Levinson et al., U.S.-Patent Nr. 4,713,339; Hagen et al., U.S.-Patent Nr. 4,784,950; Palmiter et al., U.S.-Patent Nr. 4,579,821; und Ringold, U.S.-Patent Nr. 4,656,134, offenbart. Bevorzugte kultivierte Säugetierzellen beinhalten die COS-1-(ATCC Nr. CRL 1650), COS-7-(ATCC Nr. CRL 1651), BHK 570-(ATCC Nr. CRL 10314), 293-(ATCC Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59–72, 1977) Zelllinien und die Zelllinien aus Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (z.B. CHO-K1; ATCC Nr. CCL 61). Zusätzliche geeignete Zelllinien sind aus dem Stand der Technik bekannt und aus öffentlichen Hinterlegungsstellen, wie dem „American Type Culture Collection", Rockville, Maryland, erhältlich. Im Allgemeinen werden starke Transkriptions-Promotoren bevorzugt, wie z.B. die Promotoren aus SV-40 oder dem Cytomegalovirus. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 4,956,288. Andere geeignete Promotoren beinhalten die aus Metallothionein-Genen (U.S.-Patent Nr. 4,579,821 und 4,601,978) und den -„major late"-Promotor aus Adenovirus.
Die Wirkstoff-Selektion wird im Allgemeinen verwendet, um auf kultivierte Säugetierzellen hin zu selektieren, in welche Fremd-DNA eingebaut wurde. Solche Zellen werden gewöhnlich als „Transfektanten" („transfectants") bezeichnet. Die Zellen, die in der Gegenwart selektiver Agenzien kultiviert wurden und die in der Lage sind, das Gen von Interesse deren Vermehrung zu unterziehen, werden als „stabile Transfektanten" bezeichnet. Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist ein Gen, das die Resistenz gegen das Antibiotikum Neomycin kodiert. Die Selektion wird in der Gegenwart eines Wirkstoffs von der Neomycin-Klasse, wie z.B. G-418 oder Ähnlichem, durchgeführt. Die Selektions-Systeme können ebenfalls verwendet werden, um den Expressions-Level des Gens von Interesse zu erhöhen, ein Verfahren, das als „Amplifikation" bezeichnet wird. Die Amplifikation wird durch Kultivieren der Transfektanten in der Gegenwart eines niedrigen Levels des selektiven Agens und nachfolgendes Erhöhen der Menge des selektiven Agens durchgeführt, um auf Zellen zu selektieren, die hohe Level an Produkten der eingeführten Gene herstellen. Ein bevorzugter amplifizierbarer selektierbarer Marker ist die Dihydrofolat-Reduktase, welche Resistenz gegen Methotrexat verleiht. Andere Wirkstoff-Resistenz-Gene (z.B. Hygromycin-Resistenz, Multi-Wirkstoff-Resistenz, Puromycin-Acetyltransferase) können ebenfalls verwendet werden.
Andere höhere eukaryotische Zellen können ebenfalls als Wirte verwendet werden, einschließlich der Insektenzellen, der Pflanzenzellen und der Vogelzellen. Die Transformation der Insektenzellen und die Herstellung fremder Polypeptide hierin wird durch Guarino et al., U.S.-Patent Nr. 5,162,222; Bang et al., U.S.-Patent Nr. 4,775,624; und die WIPO-Veröffentlichung WO 94/06463 offenbart. Die Verwendung von Agrobacterium rhizogenes als Vektor zum Exprimieren von Genen in Pflanzenzellen wurde durch Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47–58, 1987, zusammengefaßt.
Die transformierten oder transfizierten Zellen werden gemäß konventionellen Verfahren in einem Kulturmedium kultiviert, das Nährstoffe und andere Komponenten enthält, die für das Wachstum der ausgewählten Wirtszellen erforderlich sind. Eine Vielfalt an geeigneten Medien, einschließlich definierter Medien und komplexer Medien, ist aus dem Stand der Technik bekannt und beinhaltet im Allgemeinen eine Kohlenstoff-Quelle, eine Stickstoff-Quelle, essentielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien. Die Medien können, sofern erforderlich, ebenfalls solche Komponenten, wie z.B. Wachstumsfaktoren oder Serum, enthalten. Das Wachstumsmedium wird im Allgemeinen nach Zellen selektieren, die die exogen zugegebene DNA enthalten beispielsweise durch Wirkstoff-Selektion oder aufgrund des Mangels eines essentiellen Nährstoffs, welcher durch den selektierbaren Marker ergänzt wird, der auf dem Expressions-Vektor getragen wird oder in die Wirtszelle co-transfiziert wird.
Exprimierte rekombinante zFGF-5-Polypeptide (oder chimäre zFGF-5-Polypeptide) können unter Einsatz von Fraktionierungs- und/oder konventionellen Aufreinigungsverfahren und -Medien aufgereinigt werden. Die Ammoniumsulfat-Fällung und die Säure- oder chaotrope Extraktion können zur Fraktionierung der Proben verwendet werden. Beispielhafte Aufreinigungsschritte können Hydroxylapatit-, Größenausschluss-, FPLC- und Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie beinhalten. Geeignete Anionenaustausch-Medien beinhalten derivatisierte Dextrane, Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, spezielle Silikate und Ähnliches. PEI-, DEAE-, QAE- und Q-Derivate werden bevorzugt, wobei DEAE-Fast-Flow-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) besonders bevorzugt wird. Beispielhafte chromatographische Medien beinhalten solche Medien, die mit Phenyl-, Butyl- oder Octyl-Gruppen derivatisiert sind, wie z.B. Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl Butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) und Ähnliches; oder Polyacryl-Harze, wie z.B. Amberchrom CG 71 (Toso Haas) und Ahnliches. Geeignete feste Träger beinhalten Glaskugeln („glass beads"), Silikatische Harze, Cellulose-Harze, Agarose-Kugeln („agarose beads"), quervernetzte Agarose-Kugeln, Polystyrol-Kugeln („polystyrene beads"), quervernetzte Polyacrylamid-Harze und Ähnliches, die unter den einzusetzenden Bedingungen unlöslich sind. Diese Träger können durch reaktive Gruppen modifiziert sein, die die Anlagerung von Proteinen über Amin-Gruppen, Carboxyl-Gruppen, Sulfhydryl-Gruppen, Hydroxyl-Gruppen und/oder Kohlenhydrat-Reste gestatten. Beispiele für Kopplungs-Chemietechniken beinhalten die Cyanogenbromid-Aktivierung, N-Hydroxysuccinimid-Aktivierung, Epoxid-Aktivierung, Sulfhydryl-Aktivierung, Hydrazid-Aktivierung und Carboxyl- und Amin-Derivate für die Carbodiimid-Kopplungs-Chemietechniken. Diese und andere feste Medien sind im Stand der Technik gut bekannt und häufig eingesetzt und sind von kommerziellen Anbietern erhältlich. Die Verfahren zum Binden der Rezeptor-Polypeptide an Trägermedien sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Die Wahl eines bestimmten Verfahrens ist eine Frage der Routine und wird teilweise durch die Eigenschaften des gewählten Trägers bestimmt. Siehe beispielsweise Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1988.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ebenfalls durch Ausnutzung ihrer Heparin-Bindeeigenschaften isoliert werden. Zum Überblick, siehe Burgess et al., Ann. Rev. of Biochem. 58: 575–606, 1989. Die Mitglieder der FGF-Familie können über die Heparin-Sepharose-Affinitäts-Chromatographie (Gospodarowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6963–6967, 1984) bis zur offensichtlichen Homogenität gereinigt und unter Verwendung von linearen Stufengradienten von NaCl eluiert werden (Ron et al., J. Biol. Chem. 268(4): 2984–2988, 1993; Chromatography: Principles & Methods, Seiten 77–80, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden, 1993; in „Immobilized Affinity Ligand Techniques", Hermanson et al., Hrsg., Seiten 165–167, Academic Press, San Diego, 1992; Kjellen et al., Ann. Rev. Biochem. 60: 443–474, 1991; und Ke et al., Protein Expr. Purif. 3(6): 497–507, 1992).
Andere Aufreinigungsverfahren beinhalten die Verwendung der immobilisierten Metallionen-Adsorptions-Chromatographie (IMAC), um Histidin-reiche Proteine aufzureinigen. Zusammengefasst, wird ein Gel zuerst mit divalenten Metallionen beladen, um ein Chelat zu bilden (E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1–7, 1985). Histidin-reiche Proteine werden, abhängig von dem verwendeten Metall, mit unterschiedlichen Affinitäten an dieser Matrix adsorbiert und durch kompetitive Elution, durch Erniedrigen des pH oder unter Verwendung stark chelatisierender Agenzien eluiert. Andere Aufreinigungsverfahren beinhalten die Aufreinigung der glykosylierten Proteine über die Lecitin-Affinitäts-Chromatographie und die Ionenaustausch-Chromatographie (Methods in Enzymol., Vol. 182, „Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (Hrsg.), Acad. Press, San Diego, 1990, Seiten 529–39). Alternativ kann eine Fusion des Polypeptids von Interesse mit einem Affinitäts-„Tag" (z.B. Polyhistidin, Maltose-Bindeprotein, einer Immunoglobulin-Domäne) konstruiert werden, um die Aufreinigung zu erleichtern.
Protein-Rückfaltungs- (und gegebenenfalls Reoxidations-) Verfahren können vorteilhaft verwendet werden. Es wird bevorzugt, das Protein bis zur >80%-igen Reinheit, stärker bevorzugt bis zur >90%-igen Reinheit, noch stärker bevorzugt >95%-igen (Reinheit) aufzureinigen, und besonders bevorzugt ist ein pharmazeutisch reiner Zustand, das heißt, zu mehr als 99.9% rein in Bezug auf kontaminierende Makromoleküle, insbesondere andere Proteine und Nukleinsäuren, und frei von infektiösen und pyrogenen Agenzien. Vorzugsweise ist ein aufgereinigtes Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, insbesondere anderen Proteinen tierischen Ursprungs.
zFGF-5-Polypeptide oder Fragmente hiervon können ebenfalls durch chemische Synthese hergestellt werden. zFGF-5-Polypeptide können Monomere oder Multimere; glykosyliert oder nicht-glykosyliert; pegy liert oder nicht-pegyliert sein und können, müssen aber nicht, einen Methionin-Rest als Anfangs-Aminosäure beinhalten.
Die Aktivität der Moleküle der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung einer Vielzahl an Assays gemessen werden, die beispielsweise die Neogenese oder Hyperplasie (d.h. die Proliferation) der kardialen Zellen, basierend auf der Gewebespezifität in adultem Herz, messen. Zusätzliche Aktivitäten, die wahrscheinlich mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung assoziiert sind, beinhalten die Proliferation der Endothel-Zellen, der Kardiomyozyten, der Fibroblasten, der Skelettmyozyten, direkt oder indirekt durch andere Wachstumsfaktoren; die Funktion als ein chemotaxischer Faktor für Endothel-Zellen, Fibroblasten und/oder phagozytische Zellen; den osteogenen Faktor und den Faktor zum Expandieren mesenchymaler Stammzellen und der Vorläufer-Populationen.
Die Proliferation kann unter Verwendung von kultivierten kardialen Zellen oder in vivo durch das Verabreichen der Moleküle der beanspruchten Erfindung an das geeignete Tiermodell gemessen werden. Im Allgemeinen werden proliferative Effekte als Zunahme der Zellanzahl beobachtet und können deshalb sowohl die Inhibition der Apoptose als auch die Mitogenese beinhalten. Die kultivierten Zellen beinhalten kardiale Fibroblasten, Kardiomyozyten, Skelettmyozyten und humane Nabelvenen-Endothel-Zellen aus Primär-Kulturen. Etablierte Zelllinien beinhalten NIH 3T3-Fibroblasten (ATCC Nr. CRL-1658), CHH-1-„Chum"-Herzzellen (ATCC Nr. CRL-1680), H9c2-Rattenherz-Myoblasten (ATCC Nr. CRL-1446), „Shionogi"-Brustkarzinom-Zellen (Tanaka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 8928–8932, 1992) und LNCap.FGC-Adenokarzinom-Zellen (ATCC Nr. CRL-1740). Die Assays zum Messen der Zell-Proliferation sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Zum Beispiel beinhalten Assays zum Messen der Zell-Proliferation solche Assays, wie die Chemosensitivität auf den neutralen roten Farbstoff („neutral red dye") (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8: 347–354, 1990), den Einbau radiomarkierter Nukleotide (Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1–7, 1989, den Einbau von 5-Brom-2-deoxyuridin (BrdU) in DNA proliferierender Zellen (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82: 169–179, 1985) und die Verwendung von Tetrazolium-Salzen (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55–63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48: 589–601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5: 69–84, 1995; und Scudiero et al., Cancer Res. 48: 4827–4833, 1988).
Die Differenzierung ist ein fortschreitender und dynamischer Prozess, der mit pluripotenten Stammzellen beginnt und mit ausdifferenzierten Zellen endet. Pluripotente Stammzellen, die sich ohne Festlegung auf eine (Zell-)Linie regenerieren können, exprimieren ein Set an Differenzierungs-Markern, die verloren gehen, wenn die Festlegung auf eine Zelllinie stattgefunden hat. Die Vorläuferzellen exprimieren ein Set an Differenzierungs-Markern, das weiter exprimiert werden kann, aber nicht muss, während die Zellen entlang des Zelllinienpfades in Richtung Reifung fortschreiten. Die Differenzierungs-Marker, die ausschließlich durch reife Zellen exprimiert werden, sind gewöhnlich funktionelle Eigenschaften, wie z.B. Zellprodukte, Enzyme zur Herstellung von Zellprodukten und Rezeptoren. Das Stadium der Differenzierung einer Zellpopulation wird durch die Identifikation der in der Zellpopulation vorliegenden Marker überwacht. Für Myozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Chrondrozyten, Fibroblasten und Reticulin-Zellen wird angenommen, dass sie von einer gemeinsamen mesenchymalen Stammzelle abstammen (Owen et al., Ciba Fdn. Symp. 136: 42–46, 1988). Die Marker für mesenchymale Stammzellen wurden nicht gut identifiziert (Owen et al., J. of Cell Sci. 87: 731–738, 1987), so dass die Identifikation gewöhnlich in den Stadien der Vorläufer- und der reifen Zellen durchgeführt wird. Die Existenz von Kardiomyozyten-Vorläuferzellen im Frühstadium (oft als Kardiomyozyten-Stammzellen bezeichnet) wurde in adultem kardialem Gewebe angenommen aber nicht nachgewiesen. Die neuen Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind für die Studien zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen und Kardiomyozyten-Vorläuferzellen sowohl in vivo als auch ex vivo nützlich.
Es gibt Hinweise, anzunehmen, dass die Faktoren, die spezifische Zellarten auf einem Weg in Richtung der Ausdifferenzierung oder der Dedifferenzierung stimulieren, die gesamte Zellpopulation beeinflussen, die von einer gemeinsamen Vorläufer- oder Stammzelle stammt. Deshalb beinhaltet die vorliegende Erfindung das Stimulieren der Inhibition oder Proliferation der Myozyten, der glatten Muskelzellen, der Osteoblasten, Adipozyten, Chrondrozyten und der Endothel-Zellen. Moleküle der vorliegenden Erfindung können während des Stimulierens der Proliferation oder Differenzierung von Kardiomyozyten die Proliferation oder Differenzierung von Adipozyten aufgrund der Beeinflussung ihrer gemeinsamen Vorläufer/Stammzellen inhibieren. Deshalb finden Moleküle der vorliegenden Erfindung bei der Inhibition des Chondrosarkoms, der Arteriosklerose, der Restenose und der Fettleibigkeit Verwendung.
Assays zum Messen der Differenzierung beinhalten beispielsweise das Messen von Zelloberflächen-Markern, die mit der für das Stadium spezifischen Expression eines Gewebes assoziiert sind, der enzymatischen Aktivität, der funktionellen Aktivität oder der morphologischen Änderungen (Watt, FASEB 5: 281–284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63–75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161–171, 1989).
In vivo Assays zum Evaluieren der kardialen Neogenese oder Hyperplasie beinhalten das Behandeln neugeborener und reifer Ratten mit den Molekülen der vorliegenden Erfindung. Die kardiale Funktion der Lebewesen wird als Herzfrequenz, Blutdruck und kardiale Leistung gemessen, um die linksventrikuläre Funktion zu bestimmen. Die Obduktionsverfahren zum Beurteilen der kardialen Verbesserung beinhalten: das erhöhte kardiale Gewicht, das Kern-/Zytoplasma-Volumen, das Färben der kardialen Histologieschnit te, um die Kernantigen-Level der proliferierenden Zelle ("proliferating cell nuclear antigen", PCNA) im Vergleich zum zytoplasmatischen Actin-Level zu bestimmen (Quaini et al., Circulation Res. 75: 1050–1063, 1994, und Reiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8630–8635, 1996).
In vivo Assays zum Messen der Änderungen in den Knochenbildungsraten beinhalten das Durchführen der Knochen-Histologie (siehe Recker, R., Hrsg., Bone Histomorphometry: Techniques and Interpretation. Boca Raton: CRC Press, Inc., 1983) und die quantitative Computertomographie (QCT; Ferretti, J. Bone 17: 353S–364S, 1995; Orphanoludakis et al., Investig. Radiol. 14: 122–130, 1979; und Durand et al., Medical Physics 19: 569–573, 1992). Ein ex vivo Assay zum Messen der Änderungen in der Knochenbildung würde beispielsweise ein Calvarischer Assay sein (Gowen et al., J. Immunol. 136: 2478–2482, 1986).
Unter Bezug auf die Modulierung der Energiebilanz, insbesondere da sich dieses auf den Adipozyten-Metabolismus, die Proliferation und Differenzierung bezieht, modulieren die zFGF-Polypeptide die Auswirkungen auf metabolische Reaktionen. Solche metabolischen Reaktionen beinhalten die Adipogenese, Glukoneogenese, Glykogenolyse, Lipogenese, Glukose-Aufnahme, Proteinsynthese, Thermogenese, Sauerstoff-Verwertung und Ähnliches. Unter anderen aus dem Stand der Technik bekannten oder hierin beschriebenen Verfahren kann die Säugetier-Energiebilanz durch die Überwachung einer oder mehrerer der zuvor erwähnten metabolischen Funktionen evaluiert werden. Diese metabolischen Funktionen werden durch Techniken (Assays oder Tiermodelle) überwacht, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, wie unten ausführlicher dargelegt. Zum Beispiel werden die glukoregulierenden Effekte von Insulin vorwiegend in der Leber, dem Skelettmuskel- und im Adipose-Gewebe ausgeübt. In dem Skelettmuskel- und Adipose-Gewebe stimuliert Insulin die Aufnahme, das Speichern und die Verwertung von Glukose.
Es gibt im Stand der Technik anerkannte Verfahren zum Überwachen aller der oben rezitierten metabolischen Funktionen. Somit ist ein Durchschnittsfachmann in der Lage, die zFGF-5-Polypeptide, -Fragmente, -Fusionsproteine, -Antikörper, -Agonisten und -Antagonisten für metabolische Modulierungsfunktionen zu evaluieren. Beispielhafte Modulierungstechniken werden im Folgenden dargelegt.
Zum Beispiel kann die Insulin-stimulierte Lipogenese über das Messen des Einbaus von ¹⁴C-Acetat in das Triglycerid (Mackall et al. J. Biol. Chem. 251: 6462–6464, 1976) oder über Triglycerid-Anreicherung (Kletzien et al., Mol. Pharmacol. 41: 393–398, 1992) überwacht werden.
Die zFGF-5-stimulierte Aufnahme kann beispielsweise in einem Assay für Insulin-stimulierten Glukosetransport evaluiert werden. Primär-Adipozyten oder NIH 3T3 L1-Zellen (ATCC Nr. CCL-92.1) werden in DMEM, enthaltend 1 g/l Glukose, 0,5 oder 1,0% BSA, 20 mM Hepes und 2 mM Glutamin, eingebracht.
Nach zwei bis fünf Stunden Kultivierung wird das Medium gegen frisches, Glukose-freies DMEM, enthaltend 0,5 oder 1,0% BSA, 20 mM Hepes, 1 mM Pyruvat und 2 mM Glutamin, ausgetauscht. Geeignete Konzentrationen von zFGF-5, Insulin oder IGF-1 oder eine Verdünnungsreihe der Testsubstanz werden zugegeben und die Zellen werden für 20–30 Minuten inkubiert. ³H- oder ¹⁴C-markierte Desoxyglukose wird bis zu ≈50 1M Endkonzentration zugegeben und die Zellen werden für ungefähr 10–30 Minuten inkubiert. Die Zellen werden dann schnell mit kaltem Puffer (z.B. PBS) gespült und danach mit einem geeigneten Lyse-Agens (z.B. 1%-igem SDS oder 1 N NaOH) lysiert. Das Zelllysat wird danach durch Auszählen in einem Szintillationszähler evaluiert. Die Zell-assoziierte Radioaktivität wird nach Abzug der nicht-spezifischen Bindung, wie sie durch Inkubieren der Zellen in der Gegenwart von Cytocholasin b, einem Inhibitor des Glukosetransports, bestimmt wird, als Maßeinheit des Glukosetransports verwendet. Andere Verfahren beinhalten beispielsweise solche, die durch Manchester et al., Am. J. Physiol. 266 (Endocrinol. Metab. 29): E326–E333, 1994 (Insulin-stimulierter Glukosetransport), beschriebenen werden.
Die Proteinsynthese kann beispielsweise durch Vergleich der Fällung von ³⁵S-Methionin-markierten Proteinen nach Inkubation der Testzellen mit ³⁵S-Methionin und einem mutmaßlichen Modulator der Proteinsynthese evaluiert werden.
Die Thermogenese kann evaluiert werden, wie durch B. Stanley in The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers und C. Wahlestedt (Hrsg.), Humana Press, Ottawa, 1993, Seiten 457–509; C. Billington et al., Am. J. Physiol. 260: R321, 1991; N. Zarjevski et al., Endocrinology 133: 1753, 1993; C. Billington et al., Am. J. Physiol. 266: R1765, 1994; Heller et al., Am. J. Physiol. 252(4 Pt 2): R661–7, 1987; und Heller et al., Am. J. Physiol. 245(3): R321–8, 1983, beschrieben. Das metabolische Verhältnis, welches durch eine Vielfalt an Techniken gemessen werden kann, ist ebenfalls eine indirekte Messung der Thermogenese.
Die Sauerstoff-Verwertung kann evaluiert werden, wie durch Heller et al., Pflugers Arch 369(1): 55–9, 1977, beschrieben. Dieses Verfahren involvierte ebenfalls eine Analyse der Temperatur des Hypothalamus und die metabolische Wärmeproduktion. Die Sauerstoff-Verwertung und die Wärmeregulation wurden ebenfalls in Menschen evaluiert, wie durch Haskell et al., J. Appl. Physiol. 51(4): 948–54, 1981, beschrieben.
Die zFGF-5-Polypeptide können ebenfalls verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die spezifisch an zFGF-5-Epitope, -Peptide oder -Polypeptide binden. Die Verfahren zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sind aus dem Stand der Technik gut bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor, NY, 1989; und Hurrell, J. G. R., Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982). Wie es für einen Durchschnittsfachmann offensichtlich wäre, können polyklonale Antikörper aus einer Vielzahl an Warmblütern, wie z.B. Pferden, Kühen, Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnern, Kaninchen, Mäusen und Ratten, erzeugt werden.
Die Immunogenität eines zFGF-5-Polypeptids kann durch die Verwendung eines Adjuvans, wie z.B. des Alaun (Aluminiumhydroxid) oder des vollständigen oder unvollständigen Freundschen Adjuvans, erhöht werden. Die Polypeptide, die zur Immunisierung nützlich sind, beinhalten ebenfalls Fusionspolypeptide, wie z.B. die Fusionen des zFGF-5 oder eines Teils hiervon mit einem Immunoglobulin-Polypeptid oder mit dem Maltose-Bindeprotein. Das Polypeptid-Immunogen kann ein Volllängen-Protein oder ein Teil hiervon sein. Sofern der Polypeptidteil „Hapten-artig" ist, kann ein solcher Teil zur Immunisierung vorteilhaft mit einem makromolekularen Träger (wie z.B. Schlüssellochschnecken-Hämocyanin („keyhole limpet hemocyanin", KLH), Rinderserum-Albumin (BSA) oder Tetanus-Toxoid) verbunden oder verknüpft werden.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „Antikörper" polyklonale Antikörper, Affinitäts-gereinigte polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und Antigen-bindende Fragmente, wie z.B. F(ab')₂- und Fab-proteolytische Fragmente. Sowohl genetisch konstruierte intakte Antikörper oder Fragmente, wie z.B. chimäre Antikörper, Fv-Fragmente, einzelkettige Antikörper und Ähnliches, als auch synthetische Antigen-bindende Peptide und Polypeptide sind ebenfalls eingeschlossen. Nicht-humane Antikörper können durch Einbau ausschließlich nicht-humaner CDRs in das humane Gerüst und die konstanten Regionen oder durch das Einbauen der gesamten nicht-humanen variablen Domänen (gegebenenfalls „verhüllen" der Domänen mit einer human-artigen Oberfläche durch Austausch der exponierten Reste, wobei ein „furnierter" Antikörper entsteht) „humanisiert" werden. In einigen Beispielen können die humanisierten Antikörper nicht-humane Reste innerhalb des Gerüsts der Domänen der humanen variablen Region erhalten, um die geeigneten Bindungscharakteristika zu verstärken. Durch das Humanisieren der Antikörper kann die biologische Halbwertszeit erhöht werden und das Potential für adverse Immunreaktionen nach der Verabreichung an Menschen wird reduziert. Alternative Techniken zum Erzeugen oder Selektieren der hierin nützlichen Antikörper beinhalten die in vitro Exposition der Lymphozyten für das zFGF-5-Protein oder -Peptid und die Selektion der Antikörper-Display-Bibliotheken in Phagen- oder ähnlichen Vektoren (zum Beispiel durch Verwendung von immobilisiertem oder markiertem zFGF-5-Protein oder -Peptid).
Antikörper werden als spezifisch bindend definiert, sofern sie mit einer Bindeaffinität (K_a) von 10⁶ M^–1 oder größer, vorzugsweise 10⁷ M^–1 oder größer, stärker bevorzugt 10⁸ M^–1 oder größer und am stärksten bevorzugt 10⁹ M^–1 oder größer, an ein zFGF-5-Polypeptid binden. Die Bindeaffinität eines Antikörpers kann leicht durch einen Durchschnittsfachmann bestimmt werden (zum Beispiel durch die Scatchard-Analyse).
Eine Vielfalt an Assays, die dem Fachmann bekannt sind, kann verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, welche spezifisch an zFGF-5-Proteine oder -Peptide binden. Beispielhafte Assays werden in Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, detailliert beschrieben. Repräsentative Beispiele solcher Assays beinhalten: die gleichzeitige Immun-Elektrophorese, den Radioimmun-Assay, die Radioimmun-Präzipitation, den Enzym-verknüpften Immunsorptions-Assays (ELISA), den Dot-Blot- oder Western-Blot-Versuch, den Inhibitions- oder Kompetitions-Assay und den Sandwich-Assay. Zusätzlich können Antikörper auf die Bindung an Wildtyp- gegenüber mutantem zFGF-5-Protein oder -Peptid gescreent werden.
Die Antikörper gegen zFGF-5 können ebenfalls verwendet werden: zum Markieren von Zellen, die zFGF-5 exprimieren; um ein anderes Protein, ein kleines Molekül oder eine Chemikalie zum Herzgewebe zu bringen; zum Isolieren von zFGF-5 über Affinitäts-Aufreinigung; für diagnostische Assay zum Bestimmen der zirkulierenden Level der zFGF-5-Polypeptide; zum Detektieren oder Quantifizieren von löslichem zFGF-5 als Marker der vorliegenden Pathologie oder Erkrankung; in analytischen Verfahren, die FACS einsetzen; zum Screenen von Expressions-Bibliotheken; zum Erzeugen anti-idiotypischer Antikörper und als neutralisierende Antikörper oder als Antagonisten zum Blockieren der zFGF-5-vermittelten Proliferation in vitro und in vivo. Geeignete direkte „Tags" oder Marker beinhalten Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszente Marker, chemilumineszente Marker, magnetische Partikel und Ahnliches; indirekte „Tags" oder Marker können die Verwendung von Biotin-Avidin oder anderer Komplement-/Anti-Komplement-Paare als Intermediate aufweisen. Die hier offenbarten Antikörper können ebenfalls direkt oder indirekt an Wirkstoffe, Toxine, Radionuklide und Ähnliches konjugiert werden und diese Konjugate können für diagnostische oder therapeutische Anwendungen in vivo eingesetzt werden.
Die Moleküle der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um isolierte Rezeptoren zu identifizieren und zu isolieren, die in die kardiale Myokard-Proliferation involviert sind. Zum Beispiel können die Proteine und Peptide der vorliegenden Erfindung auf einer Säule immobilisiert werden und eine Membran-Präparation kann über die Säule gegeben werden (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, CA, 1992, Seiten 195–202). Die Proteine und Peptide können ebenfalls radiomarkiert (Methods in Enzymol., vol. 182, „Guide to Protein Purification", M. Deutscher, Hrsg., Acad. Press, San Diego, 1990, 721–737) oder Photoaffinitäts-markiert (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 483–514, 1993; und Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33: 1167–1180, 1984) sein und spezifische Zelloberflächen-Proteine können identifiziert werden.
Antagonisten werden zum Inhibieren der proliferativen Aktivitäten der zFGF-Moleküle in Zellarten, wie z.B. kardialen Zellen, einschließlich Myozyten, Fibroblasten und Endothel-Zellen; Osteoblasten und Chrondrozyten, nützlich sein. Die Gene, die die Bindedomänen des zFGF-Polypeptids kodieren, können durch das Screenen zufälliger Peptid-Bibliotheken, dargestellt an Phagen (Phagen-Display) oder an Bakterien, wie z.B. E. coli, erhalten werden. Die Nukleotidsequenzen, die die Polypeptide kodieren, können auf viele Weisen erhalten werden, wie z.B. durch Zufalls-Mutagenese und zufällige Polynukleotid-Synthese. Diese zufälligen Peptid-Display-Bibliotheken können verwendet werden, um nach Peptiden zu screenen, welche mit einem bekannten Target interagieren, welches ein Protein oder Polypeptid, wie z.B. ein Ligand oder ein Rezeptor, ein biologisches oder synthetisches Makromolekül oder organische oder anorganische Substanzen, sein kann. Techniken zum Erzeugen und Screenen solcher zufälligen Peptid-Display-Bibliotheken sind aus dem Stand der Technik bekannt (Ladner et al., U.S.-Patent Nr. 5,223,409; Ladner et al., U.S.-Patent Nr. 4,946,778; Ladner et al., U.S.-Patent Nr. 5,403,484; und Ladner et al., U.S.-Patent Nr. 5,571,698) und die zufälligen Peptid-Display-Bibliotheken und „Kits" zum Screenen solcher Bibliotheken sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel von Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) und Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Die zufälligen Peptid-Display-Bibliotheken können unter Verwendung der hier offenbarten zFGF-5-Sequenzen gescreent werden, um Proteine zu identifizieren, welche an zFGF-5 binden. Diese „Bindeproteine", welche mit den zFGF-5-Polypeptiden interagieren, können verwendet werden: zum Markieren von Zellen; zum Isolieren homologer Polypeptide über die Affinitäts-Aufreinigung; sie können direkt oder indirekt an Wirkstoffe, Toxine, Radionuklide und Ähnliches konjugiert werden. Diese Bindeproteine können ebenfalls in analytischen Verfahren, wie z.B. zum Screenen von Expressions-Bibliotheken und neutralisierender Aktivität, verwendet werden. Die Bindeproteine können ebenfalls für diagnostische Assays zum Bestimmen der zirkulierenden Level an Polypeptiden; zum Detektieren oder Quantifizieren löslicher Polypeptide als Marker der vorliegenden Pathologie oder Erkrankung verwendet werden. Diese Bindeproteine können ebenfalls als zFGF-5-„Antagonisten" zum Blockieren der zFGF-5-Bindung und der Signal-Transduktion in vitro und in vivo wirken. Diese anti-zFGF-5-Bindeproteine wären zum Inhibieren der Expression der Gene, welche zur Proliferation oder Differenzierung führen, einzetzbar. Solche anti-zFGF-5-Bindeproteine können beispielsweise zum Behandeln von Rhabdomyosarkom, kardialem Myxom, Knochenkrebsarten mit Osteoblasten-Ursprung, und Zwergwuchs, bei Artritis, der Ligament- und Knorpel-Reparatur, alleine oder in Kombination mit anderen Therapien, verwendet werden.
Die Moleküle der vorliegenden Erfindung werden zur Proliferation von kardialen Gewebezellen, wie z.B. Kardiomyozyten oder Myoblasten; Skelettmyozyten oder Myoblasten und glatten Muskelzellen; Chrondrozyten; Endothel-Zellen; Adipozyten und Osteoblasten in vitro verwendbar sein. Zum Beispiel sind die Moleküle der vorliegenden Erfindung als Komponenten definierter Zellkultur-Medien verwendbar und können alleine oder in der Kombination mit anderen Zytokinen und Hormonen verwendet werden, um das Serum, das gewöhnlich in Zellkulturen verwendet wird, zu ersetzen. Die Moleküle der vorliegenden Erfindung sind insbesondere zur spezifischen Verbesserung des Myozyten-Wachstums und/oder der -Entwicklung in Kultur verwendbar und können sich ebenfalls in der Studie von Kardiomyozyten-Hyperplasie und -Regeneration als nützlich erweisen.
Die Polypeptide, die Nukleinsäure und/oder die Antikörper der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung von Störungen, die mit dem Myokardinfarkt, dem kongestiven Herzversagen, der hypertrophen Kardiomyopathie und der dilativen Kardiomyopathie assoziiert sind, verwendet werden. Die Moleküle der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zum Beschränken der Infarktgröße nach einem Herzinfarkt, zum Verbessern der Angiogenese und der Wundheilung nach der Angioplastie oder der Endarterektomie, zum Entwickeln der koronaren kollateralen Zirkulation, zur Revaskularisierung im Auge, bei Komplikationen, die mit schwachem Kreislauf verbunden sind, wie z.B. diabetischen Fussgeschwüren, für Schlaganfall nach koronarer Reperfusion unter Verwendung pharmalogischer Verfahren und anderer Indikationen, bei denen die Angiogenese von Vorteil ist, verwendet werden. Die Moleküle der vorliegenden Erfindung können ebenfalls zum Verbessern der Herzfunktion, entweder durch das Induzieren der Kardiomyozyten-Neogenese und/oder der -Hyperplasie, durch das Induzieren der kardialen Kollateralbildung oder das Induzieren der Umbildung der nekrotischen Myokardregion nützlich sein. Andere therapeutische Verwendungen für die vorliegende Erfindung beinhalten die Induktion von Skelettmuskel-Neogenese und/oder -Hyperplasie, die Nieren-Regeneration und/oder die Behandlung der systemischen und pulmonalen Hypertonie.
Die durch zFGF-5-induzierte koronare Kollateral-Entwicklung wird in Kaninchen, Hunden oder Schweinen unter Verwendung der Modelle für den chronischen koronaren Verschluss (Landau et al., Amer. Heart J. 29: 924–931, 1995; Sellke et al., Surgery 120(2): 182–188, 1996; und Lazarous et al., 1996, ebd.) gemessen. Die Vorteile von zFGF-5 für die Behandlung von Schlaganfall werden unter Verwendung des bilateralen Halsschlagader-Verschlusses und durch Messen sowohl der histologischen Änderungen als auch der Labyrinth-Performance (Gage et al., Neurobiol. Aging 9: 645–655, 1988) in vivo in Ratten getestet. Die zFGF-5-Wirksamkeit bei Hypertonie wird für systemische Hypertonie unter Verwendung spontan hypertonischer Ratten (SHR) in vivo getestet (Marche et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 1: S114–116, 1995).
Die Moleküle der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um den Transport der Agenzien oder Wirkstoffe zum Herz zu erzielen. Zum Beispiel werden die Moleküle der vorliegenden Erfindung aufgrund der Gewebe-spezifischen Expression, die durch den zFGF-5-Promotor gesteuert wird, dahingehend nützlich sein, die Expression auf das Herz zu beschränken. Zum Beispiel kann die Herz-spezifische Expression unter Verwendung eines zFGF-5-adenoviralen discistronischen Konstrukts (Rothmann et al., Gene Therapy 3: 919–926, 1996) erreicht werden. Zusätzlich können die zFGF-Polypeptide, durch Verknüpfen der zFGF-Polypeptide mit einem anderen Protein (Franz et al., Circ. Res. 73: 629–638, 1993) durch Verknüpfen eines ersten Moleküls, das von einem zFGF-homologen Polypeptid umfasst wird, mit einem zweiten Agens oder Wirkstoff zur Bildung einer Chimäre, dazu verwendet werden, andere Agenzien oder Wirkstoffe auf das Herzgewebe zu beschränken. Die Proteine, zum Beispiel Antikörper, können verwendet werden, um mit den zFGF-5-Molekülen der vorliegenden Erfindung Chimären zu bilden (Narula et al., J. Nucl. Cardiol. 2: 26–34, 1995). Beispiele für Agenzien oder Wirkstoffe beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, bioaktive Polypeptide, Gene, Toxine, Radionuklide, niedermolekulare Pharmazeutika und Ähnliches. Die Verknüpfung kann direkt oder indirekt erfolgen (z.B. Liposomen) und kann durch rekombinante Mittel, chemische Verknüpfung, starke nicht-kovalente Interaktionen und Ähnliches erfolgen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die das zFGF-Protein umfasst, als ein therapeutisches Agens zum Verstärken der durch Osteoblasten-vermittelten Knochenbildung verwendet. Die Zusammensetzungen und die Verfahren, die die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwenden, können angewendet werden, um die Reparatur von Knochendefekten und -mangelerscheinungen, wie z.B. solcher, die in geschlossenen, offenen und nicht-einheitlichen Frakturen auftreten, zu fördern; um die Knochenheilung in der plastischen Chirurgie zu fördern; um das Einwachsen in nicht-zementierte protesische Gelenke und Zahnimplantate zu fördern; bei der Behandlung der Paradontalerkrankung und -defekten; um die Knochenbildung während der Distraktionsosteogenese zu verstärken und in der Behandlung anderer Skelettstörungen, die durch die Stimulation der osteoblastischen Aktivität, wie z.B. Osteoporose und Artritis, behandelt werden können. Die de novo Knochenbildung, die durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, wird bei der Reparatur der kongenitalen, Trauma-induzierten, onkologischen Resektion der Knochen oder im Heilen der Knochen nach Strahlung-sinduzierter Osteonekrose (Hart et al., Cancer 37: 2580–2585, 1976) Verwendung finden. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können ebenfalls bei der plastischen Chirurgie Verwendung finden.
Für pharmazeutische Zwecke sind die Proteine der vorliegenden Erfindung für die parenterale, insbesondere intravenöse oder subkutane, Verabreichung gemäß den konventionellen Verfahren formuliert. Die intravenöse Verabreichung wird durch eine Bolus-Injektion oder -Infusion über eine typische Dauer von einer oder einigen Stunden sein. Im Allgemeinen wird die pharmazeutische Formulierung ein zFGF-5-Protein in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel, wie z.B. Salzlösung, gepufferter Salzlösung, 5% Dextrose in Wasser oder Ähnlichem, beinhalten. Die Formulierungen können weiterhin einen oder mehrere Hilfsstoffe, Konservierungsstoffe, Lösungsmittel („solubilizers"), Puffermittel, Albumin, um dem Proteinverlust auf Ampullen(„vial")-Oberflächen vorzubeugen, etc. beinhalten. Die Verfahren für die Formulierung sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Hrsg., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, offenbart. Therapeutische Dosen werden im Allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 100 μg/kg Patientengewicht pro Tag, vorzugsweise 0,5–20 μg/kg pro Tag, betragen, wobei die exakte Dosis durch das Klinikpersonal gemäß den geltenden Standards unter Berücksichtigung der Natur und des Schweregrades des zu behandelnden Zustands, der Patienteneigenschaften, etc. bestimmt wird. Die Bestimmung der Dosis liegt im Bereich des Könnens des Durchschnittsfachmanns. Die Proteine können zur akuten Behandlung über eine Woche oder weniger, oft über eine Dauer von einem bis drei Tagen, verabreicht werden oder können zur chronischen Behandlung über einige Monate oder Jahre verwendet werden. Im Allgemeinen ist eine therapeutisch wirksame Menge von zFGF-5 eine Menge, die zum Herstellen einer klinisch signifikanten Änderung in der Myozyten-Proliferation, der Herzfunktion, der Knochenbildung oder für Zunahmen in spezifischen Zellarten, die mit den mesenchymalen Stammzellen und den Vorläufern für Myozyten, Osteoblasten und Chrondrozyten assoziiert sind, ausreichend ist. Insbesondere kann eine klinisch signifikante Zunahme der Anzahl der Myozyten oder der Myozyten-Vorläuferzellen durch Messen der linksventrikulären Auswurffraktion vor und nach der Verabreichung von zFGF-5-Molekülen, und Bestimmung einer Zunahme von mindestens 5%, vorzugsweise 10% oder mehr, in der gesamten Auswurffraktion bestimmt werden. Die Tests zum Bestimmen der Auswurffraktion, welche als pro Herzschlag ausgeworfenes Blut gemessen wird, sind einem Durchschnittsfachmann gut bekannt.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele dargestellt.
BEISPIELE
Beisipel 1
Erweiterung der EST-Sequenz
Das Scannen einer translatierten DNA-Datenbank unter Verwendung einer Suchanfrage für die Wachstumsfaktoren führte zur Identifikation einer Sequenz mit einem exprimierten Sequenz-„Tag" („expressed sequence tag", EST), welche sich als neues Mitglied der FGF-Familie herausgestellt hat und als zFGF-5 bezeichnet wurde.
Die Oligonukleotid-Primer ZC11,676 (SEQ ID NO: 3) und ZC11,677 (SEQ ID NO: 4) wurden aus der Sequenz eines exprimierten Sequenz-„Tags" (EST) konstruiert. Die Primer wurden verwendet, um innerhalb des EST intern zu „primen" und als Vorlage in der Polymerase-Kettenreaktion, sofern die PCR unter Verwendung der MARATHON READY cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) ausgehend von adultem Herzgewebe („polymerase chain reaction", PCR) durchgeführt wurde.
Die für die PCR verwendeten Bedingungen waren: 1 Zyklus bei 94°C für 90 Sekunden, 35 Zyklen bei 94°C für 15 Sekunden; 68°C für 1 Minute; gefolgt von 1 Zyklus für 10 Minuten bei 72°C und der Inkubationsdauer bei 4°C. Die PCR-Reaktion erzeugte 160 bp der EST-Sequenz und bestätigte, dass die EST-Sequenz richtig war.
Andere Bibliotheken, die mit den Oligonukleotid-Primern amplifiziert werden konnten beinhalteten den Skelettmuskel, die Lunge, den Magen, den Dünndarm und die Schilddrüse.
Beispiel 2
Gewebeverteilung
Es wurden Northern-Blots unter Verwendung der „Human Multiple Tissue Blots" von Clontech (Palo Alto, CA) durchgeführt. Das in Beispiel 1 beschriebene 160-bp-DNA-Fragmente wurde auf einem 1%igen Agarose-Gel einer Elektrophorese unterworfen, die Fragmente wurden elektroeluiert und danach unter Verwendung des zufällig „primenden" MEGAPRIME DNA-Markierungssystems (Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Angaben des Herstellers radioaktiv markiert. Die Sonde wurde unter Verwendung einer NUCTRAP-Drucksäule (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) aufgereinigt. Die EXPRESSHYB-Lösung (Clontech, Palo Alto, CA) wurde zur Vorhybridisierung und als eine Hybridisierungs(„hydrizing")-Lösung für die Northern Blots verwendet. Die Hybridisierung fand über Nacht bei 68°C statt und die Blots wurden danach in 2 × SSC und 0,05% SDS bei RT gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt in 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 50°C. Bei ungefähr 2,0 kb wurde eine einzelne Bande beobachtet. Die Signalintensität war für das adulte Herz am größten mit verhältnismäßig weniger starken Signalen im Skelettmuskel und im Magen.
Beispiel 3
Versuche zur in vitro Aktivität von zFGF-5
A.
Die mitogene Aktivität des zFGF-5 wird unter Verwendung von Zelllinien und Zellen aus einer Primärkultur untersucht. Das konditionierte Medium aus Zellen, die das rekombinante Protein exprimieren, und/oder das gereinigte Protein wird zu den Kulturen der folgenden Zelllinien zugegeben: NIH 3T3-Fibroblast (ATCC Nr. CRL-1658), CHH-1-Chum-Herzzellen (ATCC Nr. CRL-1680), H9c2-Rattenherz-Myoblasten (ATCC Nr. CRL-1446), Shionogi-Brustkarzinom-Zellen (Tanaka et al., 1992, ebd.) und LNCaP.FGC-Adenokarzinom-Zellen. Die frisch isolierten Zellen, die zum Testen der proliferativen Aktivität des zFGF-5 nützlich sind, beinhalten: kardiale Fibroblasten, Kardiomyozyten, Skelettmyozyten und humane Nabelvenen-Endothel-Zellen.
Die mitogene Aktivität wird durch die Messung des ³H-Thymidin-Einbaus, basierend auf dem Verfahren von Raines und Ross (Meth. Enzvmology 109: 749–773, 1985), untersucht. Zusammengefasst, sind ruhende Zellen plattierte Zellen bei einer Dichte von 3 × 10⁴ Zellen/ml in einem geeigneten Medium. Ein typisches Wachstumsmedium ist das Wachstumsmedium von Dulbecco („Dulbecco's Growth Medium", GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), enthaltend 10% fötales Kälberserum („fetal calf serum", FCS). Die Zellen werden in 96-Kammer-Platten kultiviert und für 3–4 Tage gezüchtet. Das Wachstumsmedium wird entfernt und 180 μl DFC (Tabelle 5), enthaltend 0,1% FCS, werden pro Kammer zugegeben. Die Hälfte der Kammern weist zugegebenes zFGF-5-Protein auf und die andere Hälfte ist eine Negativkontrolle ohne zFGF-5. Die Zellen werden bis zu 3 Tage bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert und das Medium wird entfernt. Ein Hundertstel Mikroliter DFC, enthaltend 0,1% FCS und 2 pCi/ml ³H-Thymidin, wird in jede Kammer zugegeben und die Platten werden zusätzliche 1–24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wird abgesaugt und 150 μl Trypsin werden in jede Kammer zugegeben. Die Platten werden bei 37°C inkubiert, bis die Zellen abgetrennt sind (mindestens 10 Minuten). Die abgetrennten Zellen werden unter Verwendung eines LKB Wallac 1295-001-Zellernters (LKB Wallac, Pharmacia, Gaithersburg, MD) auf Filtern geerntet. Die Filter werden durch Erwärmen in einer Mikrowelle für 10 Minuten getrocknet und in einem LKB Betaplate 1250-Szintillationszähler (LKB Wallac), wie durch den Anbieter beschrieben, ausgezählt.
Tabelle 5

250 ml Dulbeccosches Modifiziertes Eaglesches Medium ("Dulbecco's Modified Eagle's Medium")(DMEM, Gibco-BRL)
250 ml Hamsches („Ham's") F12 medium (Gibco-BRL)
0,29 mg/ml L-Glutamin (Sigma, St. Louis, MO)
1 mM Natriumpyruvat (Sigma, St. Louis, MO)
25 mM Hepes (Sigma, St. Louis, MO)
10 μg/ml Fetuin (Aldrich, Milwaukee, WI)
50 μg/ml Insulin (Gibco-BRL)
3 ng/ml Selen (Aldrich, Milwaukee, WI)
20 μg/ml Transferrin (JRH, Lenexa, KS)

B.
Die Herzen wurden aus einen Tag alten neugeborenen Mäusen isoliert und danach durch wiederholten Kollagenase-Verdau nach dem Protokoll von Brand et al., (J. Biol. Chem. 268: 11500–11503, 1993) zerkleinert. Einzelne Myozyten wurden über einen Percoll-Gradienten isoliert und 2 ml wurden in Gewebekultur-Schalen mit 6-Kammern bei (einer Konzentration von) 0,5 × 10⁶ Zellen/ml plattiert. Drei Tage später wurden die Kammern 3-mal mit PBS ohne Calcium oder Magnesium gewaschen und mit 1 ml Serumfreiem Medium (Tabelle 6) wieder befüllt. Die Kammern wurden mit 10¹¹ Partikeln AdCMV-zFGF5 pro Kammer oder AdCMV-GFP (Grün-fluoreszierendes Protein, „green fluorescent protein") als Kontrolle inokuliert und bei 37°C für 8 Stunden inkubiert. Die Kammern wurden danach wieder 3-mal mit PBS ohne Calcium oder Magnesium gewaschen und danach mit 2 ml Serum-freien Medien gefüllt.
Innerhalb von 48 Stunden nach Inokulation mit dem AdCMV-zFGF5 haben die kultivierten Myozyten aufgehört zu schlagen („beat") und haben eine morphologische Änderung durchgemacht, während die Kammern, die mit dem AdCMV-GFP inokuliert wurden, fortfuhren zu schlagen („beat") und durch die Inokulation morphologisch nicht beeinflusst sind. Die mit dem AdCMV-zFGF5 inokulierten Kammern enthielten nach 48 Stunden ebenfalls eine konfluente Schicht aus lebenden nicht-haftenden Zellen, ohne jeglichen Verlust in der Konfluenz der haftenden Myozyten-Schichten, was die proliferative Aktivität des adCMV-zFGF5 auf die kultivierten Myozyten der Maus andeutet.
Tabelle 6

DMEM
Hamsche Nährstoffmischung F12 („Ham's Nutrient Mixture F12")(Gibco-BRL; 1:1-Mischung mit DMEM)
17 mM NaHCO₃ (Sigma)
2 mM L-Glutamin (Sigma)
1% PSN (Sigma)
1 μg/ml Insulin
5 μg/ml Transferrin
1 nM LiCl (Sigma)
1 nM Selen
25 μg/ml Ascorbinsäure (Sigma)
1 nM Thyroxin (Sigma)

C.
zFGF-5, der, wie in Beispiel 9A beschrieben, an ein Maltose-Bindeprotein (MBP) fusioniert und, wie in Beispiel 10 beschrieben, aufgereinigt wurde, wurde bei einer Konzentration von 0,1 ng/ml zu den Myozyten (Beispiel 3B) zugegeben. Für MBP-zFGF5 wurde gezeigt, dass er die Proliferation der Myozyten ebenfalls stimuliert.
Beispiel 4
Versuche zur ex vivo Aktivität von zFGF-5
Die kardiale Mutagenese wird ex vivo durch das Entfernen der ganzen Herzen aus neugeborenen oder 8 Wochen alten Mäusen oder Ratten gemessen. Das herausgeschnittene Herz wird in Jokliksches ("Joklik's")(Sigma, St. Louis, MO) oder Dulbeccosches („Dulbecco's") Medium bei 37°C, 5% CO₂ für 4–24 Stunden gegeben. Während der Inkubationsdauer wird das zFGF-5-Polypeptid in einem Konzentrationsbereich von 1 pg/ml bis 100 pg/ml zugegeben. Die Negativkontrollen verwenden nur den Puffer. Das zugegeben und die Proben werden für 1–4 Stunden inkubiert, wonach das Herz sektioniert wird und die Mutagenese durch die Autoradiographie bestimmt wird. Die Sektionen werden für die Histomorphometrie verwendet, um das Kern-/Zytoplasma-Volumen zu bestimmen (McLaughlin, Am. J. Physiol. 271: R122–R129, 1996).
Alternativ wurde das Herz lyophilisiert und in 1 ml 0,1 N NaOH resuspendiert. Die DNA wurde unter Verwendung eiskalter 10%-iger Trichloressigsäure (TCA) präzipitiert. Der Überstand wurde zu 9 ml des Szintillationsflüssigkeit zugegeben, um den nicht-spezifischen ³H-Thymidin-Einbau zu messen. Das resultierende Pellet wurde in 1 ml BTS-450 Gewebe-Lösungsmittel („tissue solubilizer")(Beckmann, Fuller ton, CA) resuspendiert und zu 9 ml der Szintillationsflüssigkeit zugegeben, um den spezifischen ³H-Thymidin-Einbau in die DNA zu messen.
Linke und rechte Ventrikel wurden aus einen Tag alten CD-1-Mäusen isoliert (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) und für 4 Stunden mit 3 ng/ml zFGF5-Hep2 (n = 13; siehe Beispiel 10) oder der Kontrolle (n = 10) inkubiert. Das ³H-Thymidin wurde für 1 Stunde zugegeben. Die Ventrikel wurden einige Male gewaschen und danach in 1 ml Joklikschen („Joklik's") Medium homogenisiert. Das resultierende Homogenat wurde zu 9 ml des Szintillations-Cocktails zugegeben und auf die Gesamt ³H-Thymidin-Aufnahme und den DNAhin-Einbau analysiert.
zFGF5-Hep2 erhöhte die ³H-Thymidin-Aufnahme und den Einbau in DNA 2,068 ± 0–489-fach gegenüber der Kontrolle, was andeutet, dass zFGF-5 auf eine kardiale Zelle mitogen wirkt.
Beispiel 5
Versuch zur in vivo Aktivität von zFGF-5
Die proliferativen Effekte von zFGF-5 werden in vivo unter Verwendung zwei Wochen alter neugeborener Ratten oder zwei Monate alter adulter Ratten untersucht. In die Ratten wird entweder akut oder chronisch intraperikardial injiziert.
A.
Neugeborene Ratten werden mit zFGF-5 für 1 bis 14 Tage über einen Dosis-Bereich von 50 ng/Tag bis 100 μg/Tag behandelt. Nach der Behandlung werden die Effekte auf zFGF-5 gegenüber den scheinbehandelten Lebewesen durch Messen des erhöhten kardialen Gewichts, der verbesserten linksventrikulären Funktion in vivo und ex vivo und durch erhöhte kardiale Kernvolumen-Fraktionen gegenüber kardialen Zytosolvolumen-Fraktionen, die histomorphometrisch bestimmt werden, evaluiert.
B.
Ratten mit Kardiomyopathie, die durch chronische Katecholamin-Infusion, durch koronare Ligation induziert wurde, oder Kardiomyopathie-Modelle, wie z.B. der Syrische Kardiomyopathische Hamster („Syrian Cardiomyopathic Hamster") (Sole et al., Amer. J. Cardiol. 62(11): 20G–24G, 1988) wurden ebenfalls verwendet, um die Effekte von zFGF-5 auf die kardiale Funktion und das Gewebe zu evaluieren.
Um die Kardiomyopathie unter Verwendung von Katecholamins zu induzieren, werden 7–8 Wochen alte Ratten 2 Wochen lang kontinuierlich mit Epinephrin über osmotische Minipumpen infudiert, die zwischen ihre Schulterblätter subkutan implantiert werden. Die Epinephrin-Infusion führt zu einer Zunahme des Wertes der linksventrikulären fibrotischen Läsion von 0,005 ± 0,005 bis 2,11. ± 0,18, (Skala von 0–3); zu einer erhöhten linksventrikulären Myozyten-Zellbreite von 17,36 ± 0,46 µm bis 23,05 ± 0,62 µm und zu geringfügigen linksventrikulären Papillarmuskel-Kontraktionsantworten auf Isoproterenol (0,2 gegen 1,1 Gramm Spannung, im Vergleich zu Ratten, die mit einer Salzlösung-infudiert wurden. Nach der zweiwöchigen Behandlungsdauer wird den Ratten entweder ein Träger, zFGF-5, bFGF, IGF-I oder IGF-II täglich für bis zu 14 Tage intraperiokardial injiziert. Die Ratten werden getötet und es wird eine Histomorphometrie und eine Histocytochemie durchgeführt.
Die, wie oben beschrieben, behandelten Ratten werden ebenfalls am Ende der Behandlung mit Katecholamin und erneut nach Behandlung mit Wachstumsfaktor evaluiert, wobei die kardiale Regeneration als erniedrigte Erte der linksventrikulären fibrotischen Läsion, als reduzierte Myozyten-Zellbreite und als erhöhte linksventrikuläre Papillarmuskel-Kontraktionsantworten auf Isoproterenol gemessen werden.
Beispiel 6
Chromosomale Kartierung ("Mapping") von zFGF-5
zFGF-5 wurde unter Verwendung der kommerziell zugänglichen Version „GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panell" des Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL) als zum Chromosom 5 gehörend kartiert. Das „GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" enthält die DNAs, die für die PCR-Verwendung jedes einzelnen der 93 Strahlungshybrid(„radiation hybrid")-Klone geeignet ist, plus zwei Kontroll-DNAs (den HFL-Donor und den A23-Rezipienten). Ein öffentlich zugänglicher WWW-Server (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) gestattet die Kartierung in Bezug zur Strahlungshybrid(„radiation hybrid")-Karte des humanen Genoms des Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research (die „WICGR"-Strahlungshybrid-Karte), welche mit dem „GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel" konstruiert wurde.
Für die Kartierung von zFGF-5 mit dem "GeneBridge 4 RH Panel" wurden 25-μl-Reaktionen in einer 96-Kammer-Mikrotiterplatte (Stratagene, La Jolla, CA) angesetzt und in einem „RoboCycler Gradient 96"-Thermocycler (Stratagene) für die PCR verwendet. Jede der 95 PCR-Reaktionen bestand aus 2,5 μl 50 × „Advantage KlenTaq Polymerase Mix" (Clontech), 2 μl dNTPs-Mix (jeweils 2,5 mM; Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1,25 μl „sense"-Primer, ZC11,677 (SEQ ID NO: 4), 1,25 μl „antisense"-Primer, ZC12,053 (SEQ ID NO: 5).
2,5 µl „RediLoad" (Research Genetics, Inc.), 0,5 µl „Advantage KlenTaq Polymerase Mix" (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng DNA aus einem einzelnen Hybrid-Klon oder der Kontrolle und ddH₂O auf ein Gesamtvolumen von 25 µl. Die Reaktionen wurden mit einer gleichen Menge an Mineralöl überschichtet und abgedichtet. Die Bedingungen für den PCR-Cycler waren, wie folgt: ein Anfangs-(1)-Zyklus von 4 Minuten bei 94°C, 35 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1,5 Minuten „Annealing" bei 66°C und 1,5 Minuten Verlängerung bei 72°C, gefolgt von einer abschließenden 1 Zyklus währenden Verlängerung von 7 Minuten bei 72°C. Die Reaktionen wurden über die Elektrophorese auf einem 3%-igen NuSieve GTG-Agarose-Gel (FMC Bioproducts, Rockland, ME) aufgetrennt.
Die Ergebnisse zeigten, dass zFGF-5 (der Region) 541,12 cR ab dem oberen Ende der humanen Chromosom-5-Verknüpfung auf der WICGR-Strahlungshybrid(„radiation hybrid")-Karte zugeordnet werden kann. In Bezug auf das Zentrosom war sein nächster proximaler Marker WI-16922 und sein nächster distaler Marker WI-14692. Die Verwendung der umgebenden CHLC-Karten-Marker half ebenfalls, zFGF-5 in der 5q34-q35-Region auf der Karte des CHLC-Chromosoms der 5 Version v8c7 mit integrierten Markern (The Cooperative Human Linkage Center, WWW-Server: http://www.chlc.org/ChlcIntegratedMaps.html) zu positionieren.
Beispiel 7
Effekte von zFGF-5 auf Knochen
A.
Ein Adenovirus-Vektor, der die cDNA für zFGF-5 enthält, wurde unter Verwendung der durch Becker et al. (Methods in Cell Biology 43: 161–189, 1994) beschriebenen Verfahren konstruiert. Zusammengefasst, wurde die cDNA für zFGF-5 (wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt) als XbaI-SalI-Fragment in pACCMV kloniert (Gluzman et al., In Eucaryotic Viral Vectors, Gluzman (Hrsg.) Seiten 187–192, Cold Spring Harbor Press, Cold Springs Harbor NY, 1982). Der pACCMV-Vektor enthält einen Teil des Adenovirus-5-Genoms, den CMV-Promotor und eine SV40-Terminator-Sequenz. Das Plasmid, das den Vektor und das cDNA-Insert enthielt, wurde mit einem Plasmid, das das Adenovirus-5-Genom enthielt und als pJM17 bezeichnet wurde, (McGroroy et al., Virology 163: 614–617, 1988) in die 293-Zellen (ATCC Nr. CRL-1573; American Type Culture Collection, Rockville, MD) co-transfiziert, was zu einem rekombinanten Ereignis und der Herstellung eines rekombinanten Adenovirus führte, das zFGF-5 enthielt und als AdCMV-zFGF5 bezeichnet wurde. Die Gegenwart von zFGF-5-cDNA wurde durch PCR bestätigt.
Der Adenovirus-Vektor AdCMV-zFGF5 wurde für den Gentransfer in vivo durch die intravenöse Injektion von (einem Bereich) zwischen 1 × 10¹¹ und 5 × 10¹¹ Partikeln/Maus verwendet. Es wurde gezeigt, dass die Mehrheit der Viren nach der intravenösen Injektion in die Leber gelangt und sehr wirksam die Hepatozyten transduziert (Herz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2812–2816, 1993). Es wurde gezeigt, dass die Zellen das durch die cDNA kodierte Protein herstellen und, im Falle der sekretierten Proteine, diese in den Kreislauf sekretieren. Es wurden hohe Level an Expression und an physiologischen Effekten gezeigt (Ohwada et al., Blood 88: 768–774, 1996; Stevenson et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 15: 479–484, 1995; Setoguchi et al., Blood 84: 2946–2953, 1994; und Sakamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 12368–12372, 1994).
Sechs Wochen alte CD-1-Mäuse (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) wurden mit dem Adenovirus, der kein cDNA-Insert (AdCMV-Null) oder AdCMV-zFGF5 enthielt, entweder intravenös (IV) über die Schwanzvene oder intraperikardial (IPC) behandelt. Eine Gesamtmenge von 5 × 10¹¹ viralen Partikeln/100 µl/Maus wurden verabreicht. 14 Tage nach der Injektion wurden die Lebewesen getötet und die Schienbeine und Oberschenkelknochen wurden entfernt, ohne dass sie getrennt wurden, um jede potentielle Entzündungsantwort zu untersuchen. Die Knochen wurden in 10%-igem neutral gepuffertem Formalin fixiert und prozessiert. Sie wurden in 5%-iger Ameisensäure mit 10% Natriumcitrat entkalkt, in Wasser gewaschen, in einer Reihe aus 70%–100%-igem Ethanol entwässert, in Xylol geklärt und in Paraffin eingebettet. Die Proben wurden in Längsrichtung durch sowohl Metaphysen von Schienbein- als auch Oberschenkelknochen geschnitten und mit Hemotoxylin und Eosin zur Identifikation der Knochenzellen gefärbt. Die Osteoblasten wurden durch den zentralen negativen Golgi-Bereich und den exzentrischen Kern identifiziert, während die Osteoclasten durch die Vielkernigkeit („multinucleation"), die nicht-einheitliche Form und die Howshipschen Lakunen („Howship's lacunae") identifiziert wurden, die mit diesen resorbierenden Zellen assoziiert sind.
Für die Knochen-Histomorphometrie wurden die Oberschenkelknochen-Proben gewählt. Das Spongiosa-Volumen wurde aufgrund der Variation der Probenentnahmestelle (d.h. die Oberschenkelknochen-Proben wurden nicht exakt in der gleichen Ebene geschnitten) nicht gemessen. Drei Knochen-Parameter wurden für die histomorphometrischen Änderungen evaluiert.

1. Die Anzahl der endostealen Osteoblasten: gemessen entlang der endostealen Oberfläche der Spongiosa bei 180-facher Vergrößerung in einem Bereich 1,22 mm proximal zu der Wachstumsplatte.
2. Die Anzahl der endostealen Osteoclasten: gemessen entlang der endostealen Oberfläche der Spongiosa bei 180-facher Vergrößerung in einem Bereich 1,22 mm proximal zu der Wachstumsplatte.
3. Die Breite der Wachstumsplatte: gemessen alle 72 µm bei 90-facher Vergrößerung entlang der gesamten Wachstumsplatte, mit Ausnahme der periphären Enden, um die Aktivität der Wachstumsplatte zu bestimmen.

Die Analysen der Daten (Mittel ± SA, n = 4–7/Gruppe) zeigen das Folgende:

1. Es schien keine detektierbare Entzündungsantwort am Gelenk zwischen Schienbein und Oberschenkelknochen vorzukommen.
2. AdCMV-zFGF5, der Mäusen IV oder IPC verabreicht wurde, erhöhte signifikant die osteogene Aktivität in der Metaphyse der distalen Oberschenkelknochen, sofern nach 2 Wochen untersucht. Diese Stimulation der osteogenen Aktivität wurde angezeigt durch: a) signifikante Zunahmen der Anzahl der endostealen Osteoblasten in der Spongiosa der distalen Oberschenkelknochen nach der IV-Infusion oder IPC-Injektion von AdCMVz-FGF5, 530% bzw. 263%, im Vergleich zu den relativen Kontrollen, die nur deren Vektor enthielten; und b) die Beobachtung der erhöhten osteogenen Gewebe auf der Knochenoberfläche, die auf die erhöhte Differenzierung der Knochenmarks-Bindegewebe-Zellen („bone marrow stromal cells") in Richtung der Osteoblasten-Linie hinweist.
3. Die Anzahl der endostealen Osteoclasten wurde durch die IV- oder IPC-Verabreichung von AdCMV-zFGF5 nicht signifikant beeinflusst, im Vergleich zu den relativen Kontrollen, die nur deren Vektor enthielten.
4. Die Breite der Wachstumsplatte wurde durch die IV-Infusion, nicht aber durch die IPC-Injektion, des AdCMV-zFGF5 signifikant erniedrigt, was auf eine unterdrückte Aktivität der Wachstumsplatte nach der IV-Infusion hinweist. Die unterschiedlichen Effekte der AdCMVz-FGF5-Verabreichungen wurden nicht erläutert.

Diese Ergebnisse deuten an, dass zFGF-5 ein starkes Mitogen zur Stimulation der Osteoblasten-Proliferation ist und dass zFGF-5 die Kapazität zum Induzieren neuer Knochenbildung aufweist.
B.
Unter Verwendung der im Wesentlichen gleichen Verfahren, wie oben in 7.A. beschrieben, wurde eine QCT an weiblichen CD-1 (Jackson Labs) durchgeführt, denen 1 × 10¹¹ Partikel AdCMV-zFGF5 pro Maus injiziert wurden. Die Mäuse wurden 30 Tage nach der Injektion getötet und die Verhältnisse von Herz/Schienbeinlängen waren, im Vergleich zu den Kontrollen (denen leerer Adenovirus oder Salzlösung injiziert wurde) erhöht. Es gab weder Unterschiede in den Scheinbeinlängen zwischen den Gruppen, die zu einer Änderung beitragen würden, noch gab es zwischen diesen Gruppen Unterschiede in irgendwelchen anderen Organgewichten. Somit gibt es den Hinweis dafür, dass der zFGF-5-Adenovirus selektiv die Gesamtknochendichte, die trabekuläre Knochendichte und die Kortikaldicke im Oberschenkelknochen erhöht, wie durch QCT gemessen wurde.
Beispiel 8
Effekte des zFGF-5 auf das Herz
Wie in 7.B. beschrieben wurde, wurde den CD-1-Mäusen eine einzelne IV-Injektion von AdCMV-zFGF5 verabreicht, die Mäuse wurden nach vier Wochen getötet und bei den Verhältnissen von Herz/Schienbeinlängen wurde festgestellt, dass diese im Vergleich zu denen von mit leeren Adenovirus oder Salzlösung behandelten Mäusen erhöht waren. Die Ergebnisse zeigten, dass es weder Unterschiede in den Scheinbeinlängen zwischen den Gruppen gab, die zu einer Änderung beitragen würden, noch gab es zwischen diesen Gruppen Unterschiede in irgendwelchen anderen Organgewichten. Dieses Ergebnis deutet an, dass AdCMV-zFGF5 das Herzwachstum selektiv erhöht, wenn er als IV-adenovirales Konstrukt verabreicht wird.
Beispiel 9
Expression von zFGF-5
A.
Konstruktion von zFGF-5-kodierenden Plasmide
zFGF-5, ein Homolog des Fibroblast-Wachstumsfaktors, wurde unter Verwendung des MBP(Maltose-Bindeprotein)-Fusionssystems von New England Biolabs (NEB; Beverly, MA) in E. coli exprimiert. In diesem System wurde die zFGF-5-cDNA an das 3'-Ende des malE-Gens angehängt, um ein MBP-zFGF-5-Fusionsprotein zu bilden. Die Expression des Fusionsproteins wurde durch den Tac-Promotor gesteuert; die Expression ist „ausgeschaltet", bis der Promotor durch die Zugabe von 1 mmol IPTG (Isopropyl-β-thiogalaktosylpyranosid) induziert wird. Drei Variationen dieses Fusionsproteins wurden hergestellt, die sich nur in ihrer Schnittstelle zum Freisetzen des zFGF-5 vom MBP unterschieden. Ein Konstrukt wies eine Thrombin-Schnittstelle auf, die zwischen die MBP- und die zFGF-5-Domänen konstruiert wurde. Das zweite Konstrukt wies anstatt der Thrombin-Schnittstelle eine Faktor Xa-Schnittstelle auf. Das dritte Konstrukt wies anstatt der Thrombin-Schnittstelle eine Enterokinase-Schnittstelle auf.
Die Konstrukte wurde als „in-frame"-Fusionen mit dem MBP in Übereinstimmung mit der Vielfach-Klonierungsstelle („Multiple Cloning Site", MCS) des pMAL-c2-Vektors (NEB) und gemäß den Herstellerbeschreibungen erzeugt. zFGF-5 wurde über PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, welche sowohl geeignete Klonierungsstellen als auch Schnittstellen unter Verwendung der folgenden Oligonukleotid-Primer einführten: 1) für das Thrombin-Konstrukt: zc12,652 (SEQ ID NO: 7) und zc12,631 (SEQ ID NO: 8); 2) für das Faktor Xa-Konstrukt: zc15,290 (SEQ ID NO: 9) und zc12,631 (SEQ ID NO: 8) und 3) für das Enterokinase-Konstrukt: zc15,270 (SEQ ID NO: 10) und zc12,631 (SEQ ID NO: 8). In jedem Fall wurde nicht die native zFGF-5-Signalsequenz amplifiziert; der zFGF-5 beginnt, so wie er exprimiert wird, beim Aminosäurerest 26 der SEQ ID NO: 2 (Val wurde zu einem Ala geändert). Das Thrombin-Konstrukt wurde durch Einfügen eines XbaI-SalI-zFGF-5-Fragments in die XbaI-SalI-Schnittstelle von pMAL-c2 erzeugt. Das Faktor Xa-Konstrukt wurde durch Einfügen eines stumpfen („blunt") SalI-Fragments in die XmnI-SalI-Schnittstelle von MCS erzeugt. Das Enterokinase-Konstrukt wurde durch Einfügen eines XbaI-SalI-Fragments in die Xba-SalI-Schnittstelle von pMAL-c2 erzeugt. Nachdem die Konstrukte erzeugt waren, wurden sie in eine Vielzahl an E. coli-Wirtsstämmen transformiert und auf die Hoch-Level-Expression hin analysiert. Das Thrombin-Konstrukt (bezeichnet als pSDH90.5) wurde in die DH10B-Zellen (GIBCO-BRL) transfiziert, während sowohl das Faktor Xa-Konstrukt (bezeichnet als pSDH117.3) als auch das Enterokinase-Konstrukt (bezeichnet als pSDH116.3) in TOP10-Zellen (Invitrogen, San Diego, CA) transfiziert wurden. Alle drei MBP-Fusionen betragen etwa 63 kD (43 kD in der MBP-Domäne und ungefähr 20 kD in der zFGF-5-Domäne).
B.
Homologe Rekombination/zFGF-5
Die Expression des zFGF-5 in Pichia methanolica verwendet das Expressionssystem, das in der ebenfalls angemeldeten PCT WO 9717450 beschrieben wird. Ein Expressionsplasmid, das das ganze oder den Teil eines zFGF-5 kodierenden Polynukleotids enthält, wird über homologe Rekombination konstruiert. Der Expressionsvektor wird aus pCZR204 erzeugt, welches den AUG1-Promotor enthält, gefolgt von der αFpp-Leitsequenz, gefolgt von einem Amino-terminalen Peptid-„Tag", einer stumpf („blunt") endenden SmaI-Restriktionsschnittstelle, einem Carboxyl-terminalen Peptid-„Tag", einem translationalen STOP-Kodon, gefolgt von dem AUG1-Terminator, dem ADE2-selektierbaren Marker und schließlich dem AUG1-3'-nicht-translatierten Bereich. In diesem Vektor sind die URA3- und CEN-ARS-Sequenzen ebenfalls enthalten, die für die Selektion und Replikation in S. cerevisiae erforderlich sind, und die Amp^R- und colE1 ori-Sequenzen, die für die Selektion und Replikation in E. coli erforderlich sind. Die in diesen Vektor eingefügte zFGF-5-Sequenz beginnt beim Rest 27 (Ala) der zFGF-Aminosäuresequenz.
Um pSDH114, ein Plasmid für die Expression von zFGF-5 in P. methanolica, zu konstruieren, wurden die folgenden DNA-Fragmente in S. cerevisiae transformiert: 100 ng des „Akzeptor-Vektors" pCZR204, der mit SmaI verdaut wurde; 1 µg eines XbaI-SalI-Restriktionsfragments, das aus pSDH90.5 freigegesetzt wurde und das die zFGF-5-kodierende Sequenz umfasst; 1 µg eines synthetischen, PCR-erzeugten, doppelsträngigen „Linker"-Segments, das 70 Basenpaare der aFpp-kodierenden Sequenz an einem Ende umspannt und es mit den 70 Basenpaaren der den Amino-Terminus kodierenden Sequenz aus der reifen zFGF-5-Sequenz am anderen Ende verbindet, wurde aus den vier Oligonukleotiden zc13,497 (SEQ ID NO: 11); zc15,131 (SEQ ID NO: 12); zc15,132 (SEQ ID NO: 18); zc15,134 (SEQ ID NO: 13) erzeugt, von welchen der „sense"-Strang der doppelsträngigen Sequenz in SEQ ID NO: 19 (5'-„Linker"-Sequenz (aFpp → zFGF-5-N-Terminus)) gezeigt ist, und 1 µg eines synthetischen, PCR-erzeugten, doppelsträngigen „Linker"-Segments, das 70 Basenpaare der den Carboxyl-Terminus kodierenden Sequenz aus zFGF-5 an einem Ende mit 70 Basenpaaren der AUG1-Terminator-Sequenz umspannt, wurde aus den vier Oligonukleotiden 13,529 (SEQ ID NO: 14); zc13,525 (SEQ ID NO: 15); zc13,526 (SEQ ID NO: 16); zc13,528 (SEQ ID NO: 17) erzeugt, von welchen der „sense"-Strang einer doppelsträngigen (Sequenz) in SEQ ID NO: 20 (3'-„Linker"-Sequenz (C-Terminus von zFGF-5 → AUG1-Terminator)) gezeigt ist. Die Ura⁺-Kolonien wurden selektiert und die DNA aus den resultierten Hefe-Kolonien wurde extrahiert und in E. coli transformiert. Einzelne Klone, die das richtige Expressionskonstrukt beherbergten, wurden über PCR-Screening mit den Oligonukleotiden zc13,497 (SEQ ID NO: 11) und zc13,528 (SEQ ID NO: 12) gescreent, gefolgt von einem Restriktionsverdau zum Verifizieren der Gegenwart des zFGF-5-Inserts und einer DNA-Sequenzierung zum Bestätigen, dass die gewünschten DNA-Sequenzen miteinander verbunden wurden. Große Mengen der Plasmid-DNA werden für einen der richtigen Klone isoliert und die DNA wird mit SfiI verdaut, um die Pichia-zFGF-5-Expressionskassette aus dem Vektor-Rückgrat freizusetzen. Die SfiI-geschnittene DNA wird danach in einen Pichia methanolica-Expressionswirt, bezeichnet als PMAD16, transformiert, und auf ADE D-Platten zur Selektion plattiert. Eine Vielzahl an Klonen wird gepickt und über Western Blot auf Hoch-Level-zFGF-5-Expression gescreent.
Insbesondere für die Proteinherstellung in kleinen Mengen (z.B. Platten- oder Schüttelflaschen-Herstellung) werden P. methanolica-Transformanten, enthaltend eine Expressionskassette, die einen Methanol-regulierten Promotor (wie den AUG1-Promotor) umfaßt, in der Gegenwart von Methanol und der Abwesenheit von störenden Mengen anderer Kohlenstoff-Quellen (z.B. Glukose) gezüchtet. Für Experi mente mit kleinen Mengen, einschließlich des vorläufigen Screenings der Expressions-Level, können die Transformanten bei 30°C auf festen Medien, enthaltend beispielsweise 20 g/l Bacto-Agar (Difco), 6,7 g/l Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren (Difco), 10 g/l Methanol, 0,4 mg/l Biotin und 0,56 g/l eines -Ade-Thr-Trp-Pulvers, gezüchtet werden. Weil Methanol eine flüchtige Kohlenstoff-Quelle ist, geht es durch eine verlängerte Inkubation leicht verloren. Eine kontinuierliche Bereitstellung von Methanol kann durch das Platzieren einer Lösung von 50% Methanol in Wasser in den Deckeln der umgedrehten Platten bereitgestellt werden, wobei das Methanol zu den wachsenden Zellen durch Verdampfungstransfer transferiert wird. Im Allgemeinen wird nicht mehr als 1 ml Methanol pro 100-mm-Platte verwendet. Experimente mit etwas größeren Mengen können unter Verwendung von Kulturen durchgeführt werden, die in Schüttelkolben gezüchtet werden. In einem typischen Verfahren werden die Zellen für zwei Tage auf Minimal-Methanol-Platten, wie oben offenbart, bei 30°C kultiviert, danach werden die Kulturen verwendet, um ein kleines Volumen der Minimal-Methanol-Medien (6,7 g/l Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren, 10 g/l Methanol, 0,4 mg/l Biotin) bei einer Zelldichte von etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml zu inokulieren. Die Zellen werden bei 30°C gezüchtet. Die Zellen, die auf Methanol wachsen, haben einen erhöhten Sauerstoffbedarf was ein kräftiges Schütteln während der Kultivierung notwendig macht. Das Methanol wird täglich nachgefüllt (typischerweise 1/100 Volumen an 50%-igem Methanol pro Tag).
Für die Kultivierung in Produktionsmaßstäben („production scale") werden frische Kulturen von hoch produzierenden Klonen in Schüttelkolben hergestellt. Die resultierenden Kulturen werden danach zum Inokulieren des Kulturmediums in einem Fermenter verwendet. Typischerweise wird eine 500-ml-Kultur in YEPD, die bei 30°C für 1–2 Tage unter starkem Schütteln gezüchtet wird, zum Inokulieren eines 5-Liter-Fermenters verwendet. Die Zellen werden in einem geeigneten Medium, das Salze, Glukose, Biotin und Spurenelemente enthält, bei 28°C, pH 5.0 und >30% gelösten O₂ gezüchtet. Nachdem die anfängliche Bestückung mit Glukose aufgebraucht ist (wie durch eine Verringerung des Sauerstoffverbrauchs angezeigt), wird eine Glukose/Methanol-Einspeisung in das Gefäß eingebracht, um die Herstellung des Proteins von Interesse zu induzieren. Weil die Fermentation in großen Mengen unter limitierenden Kohlenstoff-Bedingungen ausgeführt wird, unterdrückt die Anwesenheit von Glukose bei der Einspeisung nicht den Methanol-induzierbaren Promotor.
Beispiel 10
Aufreinigung von zFGF-5
Das E.coli-Fermentationsmedium wurde aus einem Stamm erhalten, der zFGF-5 als Maltose-Bindeprotein-Fusion (pSDH90.5, wie oben beschrieben) exprimiert. Die MBPzFGF5-Fusion wurde während der Ultraschallbehandlung oder des Aufschlusses mit der Französischen Presse („French press ruptu re") unter Verwendung eines Puffers, enthaltend 20 mM Hepes, 0,4 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM DTT, bei pH 7,4 solubilisiert. Der Extraktionspuffer enthielt ebenfalls 5-µg/ml Mengen an Pepstatin, Leupeptin, Aprotinin, Bestatin. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) war ebenfalls in einer Endkonzentration von 0,5 mM enthalten.
Der Extrakt wurde bei 18,000 × g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde auf einem Amylose-Harz (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) prozessiert, welcher die MBP-Domäne der Fusion bindet. Nach dem Waschen der Säule wurde die gebundene MBPzFGF-5-Fusion in dem gleichen Puffer wie der Extraktionspuffer ohne DTT und der Protease-Inhibitoren, aber enthaltend 10 mM Maltose, eluiert.
Der eluierte Pool von MBPzFGF-5 wurde mit 1:100 (Gew./Gew.) Rinder-Thrombin zur MBPzFGF5-Fusion behandelt. Man ließ die Spaltungsreaktion für 6 bis 8 Stunden bei Raumtemperatur fortschreiten, wonach die Reaktionsmischung über ein Bett aus Benzamidin-Sepharose (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ) gegeben wurde, um das Thrombin unter Verwendung des gleichen Elutionspuffers, wie für die Amylose-Affinitäts-Chromatographie beschrieben, zu entfernen.
Die passierten Fraktionen, die das geschnittene Produkt zFGF-5 und die freie MBP-Domäne enthielten, wurden auf eine Toso Haas Heparin-Affinitäts-Matrix (Toso Haas, Montgomeryville, PA), equilibriert in 0,5 M NaCl, 20 mM Hepes, 0,01 M EDTA, bei pH 7,4 aufgetragen. MBP und zFGF-5 banden unter diesen Bedingungen beide an Heparin. Die gebundenen Proteine wurden mit einem Gradienten aus 2 bis 3 Säulenvolumen, gebildet zwischen 0,5 M NaCl und 2,0 M NaCl in dem Säulenpuffer, eluiert.
Das MBP eluierte früh, bei etwa 0,7 M NaCl, und das geschnittene zFGF-5 eluierte bei etwa 1,3 M NaCl. Die gesammelten zFGF-5-Fraktionen passierten den Amylose-Schritt noch einmal, um jedes verbliebene MBPzFGF-5, das eine geringe Kontaminante ist, zu entfernen. Das aufgereinigte Material wurde als zFGF5-Hep2 bezeichnet und zeigt auf der reduzierenden SDS-PAGE-Analyse eine einzelne hochreine Art („species") bei 20 kDa.
Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab die natürliche N-terminale Sequenz, aber die Massenspektrophotometrie-Daten zeigten Molekularmassen, die andeuten, dass der C-Terminus bei dem Rest 196 (Lys) von SEQ ID NO: 2 dort verkürzt sein muss, wo eine „dibasische Stelle" vorhanden ist.
Das zFGF-5-Protein war in 1,3 M NaCl sehr stabil. Nach der Dialyse in PBS aggregierte zFGF-5 und verließ die lösliche Phase. Deshalb können Formulierungen, die Heparin oder andere „Polyanionen" beinhalten, verwendet werden, um der Aggregation von reinem zFGF-5 vorzubeugen.
Beispiel 11
Herstellung der Antikörper
Antikörper gegen zFGF-5 wurden unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten und zuvor beschriebenen Standard-Techniken hergestellt, durch Immunisieren von Meerschweinchen, Kaninchen und Mäusen mit den Peptiden QTRARDDVSRKQLRLYC (SEQ ID NO: 2 Aminosäurerest 40 bis Rest 56), bezeichnet als zFGF-1; YTTVTKRSRRIRPTHRAC (SEQ ID NO: 2 Aminosäurerest 191 bis Rest 207, mit einem zusätzlichen Cys am C-Terminus), bezeichnet als zFGF-5 oder dem Volllängen-zFGF-5-Polypeptid, wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, plus dem MPB-Fusionsprotein und als MBP-FGF-5 bezeichnet. Die Peptide wurden über Cys-Reste unter Verwendung von Maleimid-aktiviertem KLH (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) konjugiert.
Die Tabelle 7 ist eine Beschreibung der Lebewesen, der Immunisierungs-Level und der Antikörper-Trennungen.
Tabelle 7
Beispiel 12
Effekte von zFGF-5 auf ob/ob-Mäuse
Die Effekte von zFGF-5 auf Adipozyten und den Fettmetabolismus wurden unter Verwendung weiblicher ob/ob-Mäuse (C57B1/6J, Jackson Labs, Bar Harbor, ME) untersucht. Die Mäuse sind fettleibig, Insulin-resistent und weisen „fette Knochen" auf. Die Mäuse wurden gewogen und es wurde festgestellt, dass alle das gleiche Gewicht hatten, und diesen wurden 10¹¹ Partikel des AdCMVzFGF-5 pro Maus oder entweder die Salzlösung oder das Ad5CMV-GFP für Kontrollen, wie in Beispiel 7 beschrieben, IV injiziert. 17 Tage nach der Injektion haben die Kontroll-Mäuse, denen das Ad5CMV-GFP injiziert wurde, im Vergleich zum Tag der Injektion, 5,342 ± 0,5 Gramm an Körpergewicht zugenommen, während die AdCMVzFGF-5-behandelten Mäuse 3,183 ± 0,743 Gramm an Körpergewicht abnahmen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Polynukleotidmolekül, das für ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-homologes Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polynukleotidmolekülen, umfassend eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 82 bis Nukleotid 621 dargestellt; b) Polynukleotidmolekülen, die für ein Polypeptid kodieren, das zu min destens 80% identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 207 (Ala) ist; und c) Polynukleotidmolekülen, umfassend eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 von Nukleotid 82 bis Nukleotid 621 dargestellt, wobei das Polypeptid, das durch dieses Polynukleotid kodiert wird, die Proliferation von Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind, stimuliert.
Isoliertes Polynukleotidmolekül nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotidmolekül eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 1 bis Nukleotid 621 dargestellt, oder eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 von Nukleotid 1 bis Nukleotid 621 dargestellt, umfasst.
Isoliertes Polynukleotidmolekül nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotidmolekül eine Nukleotidsequenz umfasst, wie in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 82 bis Nukleotid 621 dargestellt.
Isoliertes Polynukleotidmolekül nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Expressionsvektor, umfassend die folgenden operabel miteinander verbundenen Elemente: einen Transkriptionspromotor; ein DNA-Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polynukleotidmolekülen, umfassend eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 von Nukleotid 82 bis Nukleotid 621 dargestellt; b) Polynukleotidmolekülen, die für ein Polypeptid kodieren, das zu mindestens 80% identisch mit der Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 207 (Ala) ist; und c) Polynukleotidmolekülen, umfassend eine Nukleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 6 von Nukleotid 82 bis Nukleotid 621 dargestellt; und einen Transkriptionsterminator; wobei das Polypeptid, das durch das Polynukleotid kodiert wird, die Proliferation von Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind, stimuliert.
Kultivierte Zelle, in welche ein Expressionsvektor nach Anspruch 5 eingeführt wurde, wobei diese Zelle ein Polypeptid, das durch das DNA-Segment kodiert wird, exprimiert.
Verfahren zur Herstellung eines FGF-homologen Polypeptids, umfassend: Kultivieren einer Zelle, in welche ein Expressionsvektor nach Anspruch 5 eingeführt wurde, wobei die Zelle ein FGF-homologes Polypeptid, das durch das DNA-Segment kodiert wird, exprimiert; und Gewinnen des FGF-homologen Polypeptids.
Isoliertes FGF-homologes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 28 (Glu) bis Rest 175 (Met) dargestellt; und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 80% identisch mit der SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 175 (Met) sind, wobei das Polypeptid die Proliferation von Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind, stimuliert.
Isoliertes FGF-homologes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 28 (Glu) bis Rest 196 (Lys) dargestellt und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 80% identisch mit der SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 196 (Lys) sind, wobei das Polypeptid die Proliferation von Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind, stimuliert.
Isoliertes FGF-homologes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 28 (Glu) bis Rest 207 (Ala) dargestellt; und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 80% identisch mit den Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 207 (Ala) sind, wobei das Polypeptid die Proliferation von Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen und deren Vorläufern abgeleitet sind, stimuliert.
FGF-homologes Polypeptid nach Anspruch 8, weiter umfassend eine Signalsequenz.
FGF-homologes Polypeptid nach Anspruch 8, weiter umfassend eine Signalsequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 1 (Met) bis Aminosäurerest 27 (Ala) dargestellt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein aufgereinigtes FGF-homologes Polypeptid nach Anspruch 8 in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel.
Antikörper, der spezifisch an ein Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 1 (Met) bis Rest 207 (Ala) dargestellt, bindet.
Antikörper nach Anspruch 14, der ein Polypeptidmolekül, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 28 (Glu) bis Rest 196 (Lys) dargestellt, bindet.
Verwendung eines FGF-homologen Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 28 (Glu) bis Rest 175 (Met) dargestellt; und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 80% identisch mit SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 175 (Met), wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, sind; in einer Menge, die ausreicht, um eine klinisch signifikante Zunahme der Anzahl an Myozyten oder Myozyten-Vorläufern in einem Säugetier hervorzurufen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herzinfarkt (Myocardinfarkt), kongestivem Herzversagen, hypertropher Kardiomyopathie, dilatierter Kardiomyopathie, Herzerkrankung, Schlaganfall, systemischer oder pulmonarer Hypertonie, Knochendefekten, Knochenfrakturen, Paradontalerkrankung, Osteoporose oder Arthritis, durch Stimulieren der Proliferation von Myozyten oder Myozyten-Vorläufern in einem Säugetier.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Myozyten oder Myozyten-Vorläufer Kardiomyozyten oder Kardiomyozyten-Vorläufer sind.
Verfahren zur ex vivo Stimulation von Myozyten-Vorläuferzellen oder Myozyten, umfassend das Kultivieren von Herzgewebezellen mit einer Menge von FGF-homologem Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 28 (Glu) bis Rest 175 (Met) dargestellt; und b) Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 80% identisch mit SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 175 (Met), wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, sind; in einer Menge, die ausreicht, um eine Zunahme der Anzahl der Myozyten-Vorläuferzellen oder Myozyten in den in Gegenwart des FGF-homologen Polypeptids kultivierten Herzgewebezellen hervorzurufen, verglichen mit den Herzgewebe-Myozyten-Vorläuferzellen oder Myozyten, die in Abwesenheit des FGF-homologen Polypeptids kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Myozyten oder die Myozyten-Vorläufer Herz-Myozyten oder Herz-Myozyten-Vorläufer sind.
Verwendung eines ersten Moleküls, umfassend ein FGF-Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a. Polypeptidmolekülen, umfassend eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 2 von Rest 28 (Glu) bis Rest 175 (Met) dargestellt; und b. Polypeptidmolekülen, die zu mindestens 80% identisch mit der SEQ ID NO: 2 von Aminosäurerest 28 (Glu) bis Aminosäurerest 175 (Met), wie in SEQ ID NO: 2 dargestellt, sind, wobei das Polypeptid die Proliferation von Zellen, die aus mesenchymalen Stammzellen oder deren Vorläufern abgeleitet sind, stimuliert; verbunden mit einem zweiten Molekül, das ein Agens oder einen Wirkstoff zur Bildung einer Chimäre umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Herzerkrankungen oder der Förderung von kardialer Hyperplasie, wobei das Agens oder der Wirkstoff selektiv an das Herzgewebe abgegeben wird.