CZ299288B6

CZ299288B6 - Izolovaná polynukleotidová molekula kódující homologní polypeptid fibroblastového rustového faktoru(FGF), zpusob jeho produkce a protilátky proti polypeptidu zFGF-5

Info

Publication number: CZ299288B6
Application number: CZ0131599A
Authority: CZ
Inventors: A. Deisher@Theresa; C. Conklin@Darrell; C. Raymond@Fenella; R. Bukowski@Thomas; D. Holderman@Susan; Hansen@Brigit; O. Sheppard@Paul
Original assignee: Zymogenetics, Inc.
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 2008-06-04
Also published as: IL129379A; PL192537B1; JP4091122B2; CA2269083C; DE69740074D1; CN1127568C; PT1632574E; ATE318906T1; ES2357215T3; EP0931148B1; DK0931148T3; ES2258788T3; CZ131599A3; NO991796L; KR100611063B1; CN1247568A; EP1632574A1; EP0931148A1; DE69735352T2; NO991796D0

Abstract

Izolovaná polynukleotidová molekula kódující homologní polypeptid fibroblastového rustového faktoru(FGF) vybraná ze skupiny zahrnující: a) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621, b) polynukleotidové molekuly kódující polypeptid, který je alespon z 80 % identický s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 207 (Ala) a c) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6od nukleotidu 82 do nukleotidu 621, pricemž polypeptid kódovaný polynukleotidem stimuluje proliferaci bunek odvozených od mezenchymálních kmenových bunek nebo jejich prekurzoru. Polypeptidy a je kódující polynukleotidy pozitivne ovlivnují proliferaci svalových bunek a mohou se použít pri remodelování kardiální tkáne a mohou zlepšit funkci srdce. Vynález také zahrnuje protilátky proti polypeptidum z FGF.

Description

Izolovaná polynukleotidové molekula kódující homologní polypeptid fibroblastového růstového faktoru (FGF), způsob jeho produkce a protilátky proti polypeptidu zFGF-5

Oblast techniky

Vynález se týká nových členů rodiny FGF. Polypeptidy a je kódující polynukleotidy pozitivně ovlivňují proliferaci svalových buněk a mohou se použít při re-modelování kardiální tkáně a mohou zlepšit funkci srdce.

Dosavadní stav techniky

Rodina fibroblastového růstového faktoru (FGF) obsahuje alespoň devět různých členů (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992 and Femig et al., Prog. Growth Factor Res. 5(4): 353-377, 1994), které působí v případě širokého spektra typů buněk jako mitogeny. Bazický FGF (je také znám jako FGF-2) je například mitogenní in vitro pro endotheliální buňky, buňky vaskulárního hladkého svalstva, fibroblasty a v případě buněk mesodermálního nebo neuroketodermálního původu, které zahrnují kardiální myocyty a myocyty skeletu (Gospodarowicz et al., J. Cell. Biol. 70: 395-405, 1976; Gospodarowicz et al. J. Cell. Biol. 89: 568-578, 1981 a Kardami, J. Mol. Cell. Biochem. 92: 124-134, 1990). Ukázalo se, že bFGF má in vivo určitou roli při vývoji srdce u ptáků (Sugi et al., Dev. Biol. 168: 567-574, 1995 a Mima et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 92: 467-471, 1995) a při indukci koronárního kolaterálního vývoje u psů (Lazarous et al., Circulation 94: 1074-1082, 1996). Rada členů rodiny FGF vykazuje nemitogenní aktivity. Jiné než proliferační aktivity asociované s kyselými nebo bazickými FGF zahrnují: uvolnění většího množství tkáňového plazminogenního aktivátoru, stimulace syntézy extracelulární matrice, chemotaxe endoteliálních buněk, indukovaná exprese fetálních kontraktilních genů v kardiomyocytech (Parker et al., J. Clin. lnvest. 85: 507-514, 1990), zvýšenou hormonální odezvu podvěsku mozkového (Baird et al., J. Cellular Physiol. 5: 101-106, 1987).

Několik členů rodiny FGF nezahrnuje signální sekvenci (jsou to aFGF, bFGF a pravděpodobně FGF-9) a proto se neočekává, že budou vylučováni. Navíc několik členů rodiny FGF má schopnost migrovat do jádra buněk (Friesel et al., FASEB 9: 919-925, 1995). Všichni členové rodiny FGF na základě strukturální podobnosti váže heparin. Strukturální homologie přechází mezi specie, což naznačuje konzervativní vztah jejich struktury a funkce (Omitz et al., J. Biol. Chem. 271 (25): 15292-15297, 1996).

Existují čtyři známé extracelulární receptory (FGFR) a všechny jsou kinázy tyrosinu. V obecném případě členové rodiny FGF se váží na všechny známé FGFR, avšak specifické FGF se váží ke specifickým receptorům na základě vysokého stupně afinity. Jinými důvody specifity v rodině FGF je prostorová a dočasná exprese ligandů a jejich receptorů během embryogeneze. Důkazy naznačují, že FGF nej pravděpodobněji působí autokrinním a/nebo parakrinním způsobem, což je způsobeno jejich vazebnou afinitou k heparinu, která omezuje jejich difúzi z místa uvolnění (Flaumenhaft et al., J. Cell. Biol. 111(4): 1651-1659, 1990). Bazickým FGF chybí signální sekvence a je proto omezený na parakrinní nebo autokrinní mód působení. Zjistilo se, že bazický FGF se ukládá uvnitř buněk a uvolňuje se po poškození tkáně. Ukázalo se, že bazický FGF má dvě oblasti vázající receptor, které se oddělují od vazebného místa pro heparin (Abraham et al., EMBO J. 5(10): 2523-2528, 1986).

Ukázalo se, že FGFR-3 má určitou úlohu při růstu kostí. U myší, které jsou FGFR-3 (-/-), vykazují postnatální abnormality skeletu (Colvin et al., Nátuře Genet. 12: 309-397, 1996 a Deng et al., Cell 84: 911-921, 1996). Mutantní fenotyp naznačuje, že u normálních myší FGFR-3 hraje úlohu při regulaci dělení buněk chrondrocytů v oblasti růstových plotének kostí (Goldfarb, Cytokine and Growth Factor Rev. 7 (4): 311-325, 1996). Ligand FGFR-3 se v kostních růstových ploténkách neidentifikoval.

- 1 CZ 299288 Β6

Ačkoli se identifikovaly čtyři FGFR, všechny vykazují funkční varianty sestřihu. Je pravděpodobné, že existují nové receptory FGF. Žádné receptory se například neidentifikovaly v případě izoformy FGF-8a (MacArthur et al., J. Virol. 69(4): 2501-2507, 1995).

FGF-8 je člen rodiny FGF, která se původně izolovala z buněk karcinomu mléčné žlázy jako mitogen indukovatelný androgenem. Mapováním lidského chromozomu 10q25-q26 se zjistilo (White et al., Genomics 30: 109-1, 1995), že FGF-8 se podílí na embryonálním vývoji údů (Vogel et al., Development 122: 1737-1750, 1996 a Tanaka et al., Current biology 5(6): 594-597, 1995). Exprese FGF-8 během embryogeneze v kardiální, urogenitální a neurální tkáni indikuje, že se může podílet na vývoji uvedených tkání (Crossley et al., Development 121: 439-451. 1995). Existuje důkaz, že akrocefalosyndaktilie, kongenitální podmínky charakterizované špičatou hlavou a prsty s plovací blanou a velkým palcem u nohy, se spojuje s bodovými mutacemi FGF-8 (White et al., Genomics 30: 109-11, 1995).

Na rozdíl od známých FGF, které zahrnují pouze tři exony, FGF-8 má pět exonů. První tři exony FGF-8 korespondují s prvním exonem ostatních FGF (MacArthur et al., Development 121: 3603-3613, 1995). Lidský gen FGF-8 kóduje čtyři izoformy, které se liší v N-terminálních oblastech: FGF izoformy a, b, e a f; na rozdíl od myšího genu, na základě kterého vzniká osm FGF-8 izoforem (Crossley et al., Development 121: 439^451, 1995). Lidský FGF-8 a FGF-8b vykazuje 100% homologií s myšími proteiny a proteiny FGF-8e a FGF-8f vykazují 98% homologií při srovnání myší a lidí (Gemel et al., Genomics 35: 253-257, 1996).

Onemocnění srdce je hlavním důvodem úmrtí ve Spojených státech amerických, tvoří 30 % všech úmrtí. Infarkt myokardu (Ml) v US způsobuje za rok 750 000 hospitalizovaných pacientů a více než 5 miliónů lidí, kteří mají diagnostikované koronární onemocnění. Mezi rizikové faktory infarktu myokardu patří diabetes mellitus, hypertenze, obezita trupu, kouření, vysoké množství lipoproteinů s nízkou hustotou v plazmě nebo genetická predispozice.

Kardiální hyperplazie je silnější při proliferaci kardiálních myocytů a ukázalo se že k ní dochází při stárnutí lidí a krys (Olivetti et al., J. Am. Coil. Cardiol. 24(1): 140-9, 1994 a Anversa et al., Circ. Res. 67: 871-85. 1990) a při kardiomyopatii krys indukovanou katecholaminem u krys (Deisher et al., Am. J. Cardiovasc. Pathol. 5(1): 79-88, 1994). Stále zůstává kontroverzní, zda to, že je kardiální hyperplazie silnější v myocytech, je způsobeno některým progenitorem nebo jde o výsledek proliferace více terminačně diferenciovaných typů buněk.

Na základě skutečnosti, že infarkt nebo jiné způsoby myokardiální nekrózy nejsou opravitelné, je zřejmé, že normální mechanizmy kardiální hyperplazie nemohou kompenzovat rozsáhlé úmrtí myocytů a jsou nutné exogenní faktory, které podporují hyperplazií a vedou k obnovení funkce srdce.

Remodelování kostí je dynamický proces, který zachovává tkáň a architekturu skeletu. Proces udržuje rovnováhu mezi resorpcí a tvořením kostí, přičemž za hlavního činitele uvedeného procesu se uvažují dva typy buněk. Těmito buňkami jsou osteoblasty a osteoklasty. Syntetizují se osteoblasty a ukládají se do matrice za vzniku nové kosti. Aktivity osteoblastů a osteoklastů se regulují řadou faktorů systémově nebo lokálně. Mezi ně patří růstové faktory.

Zatímco interakce mezi lokálními a systémovými faktory není zcela jasná, zdá se, že existuje konsenzus, že růstové faktory hrají klíčovou úlohu při regulaci a při remodelování normálního skeletu tak i při hojení fraktur. Některé z růstových faktorů, které se zjistily v kostech, zahrnují: IGF—I, IGF—II, TGF-βι, TGF-β?, bFGF, aFGF, PDGF a rodinu morfogenních proteinů kostí (Baylink et al., J. Bone Minerál Res. 8. (Supp. 2): S565-S572, 1993).

V případě, že resorpce kostí převyšuje tvoření kostí, ztráty vedou k zeslabení kostí a roste náchylnost ke zlomeninám. Snížení tvoření kostí se spojuje se stárnutím a s jistými patolo7 gickými stavy. V samotných Spojených státech amerických se zaznamenává ročně přibližně 1,5 milionu fraktur, které se spojují s osteoporézou. Dopad uvedených fraktur na kvalitu života pacienta je nezměrný. Léčebné náklady ve Spojených státech amerických se odhadují ročně na 5 až 10 miliard dolarů. Do této položky se zahrnují i náklady na dlouhodobou péči.

Mezi jiné terapeutické aplikace re-modelování kostí, které ovlivňují růstové faktory, například patří léčba poranění, jež vyžaduje pro hojení takových fraktur proliferaci osteoblastů, stejně jako stimulace proliferace mezenchymálních buněk a syntézu intramembránové kosti, což se indikuje jako aspekty hojení fraktur (Joyce et al., 36^th Annual meeting, Orthopaedic Research Society, Februery 5-8, 1990 New Orleans, LA).

Podstata vynálezu

Vynález popisuje molekulu izolovaného polynukleotidů kódující homologní polypeptid fibroblastového růstového faktoru (FGF) vybraného ze skupiny zahrnující a) molekuly polynukleotidů obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621; b) alelové varianty (a); c) molekuly polynukleotidů, které kódují polypeptid, jenž je nejméně ze 60 % identický s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) až do aminokyselinového zbytku 207 (Ala); a d) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621.

V jednom provedení vynálezu izolovaná molekula polynukleotidů obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 621 nebo nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 1 do nukleotidu 621.

V jiném provedení vynálezu izolovaná polynukleotidová molekula obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621.

Jiné provedení vynálezu popisuje expresivní vektor obsahující následující operabilně spojené elementy: transkripční promotor; segment DNA vybraný ze skupiny zahrnující a) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621; b) alelové varianty (a); polynukleotidové molekuly, které kódují polypeptid, jenž je alespoň ze 60 % identický s aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 do aminokyselinového zbytku 207 (Ala); a d) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621; a terminátor transkripce.

Dále vynález popisuje kultivovanou buňku, do které se zavádí expresivní vektor obsahující následující operabilně spojené elementy: promotor transkripce; segment DNA vybraný ze skupiny zahrnující a) molekuly polynukleotidů obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621; b) alelové varianty a); polynukleotidové molekuly, které kódují polypeptid, jenž je alespoň ze 60 % identický s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 207 (Ala); a d) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621; a terminátor transkripce, přičemž uvedená buňka exprimuje polypeptid kódovaný segmentem DNA.

Vynález dále popisuje způsob produkce homologního polypeptidu FGF, který zahrnuje: kultivaci buňky, do níž se zavedl expresivní vektor obsahující následující operabilně spojené elementy: promotor transkripce; segment DNA vybraný ze skupiny zahrnující a) molekuly polynukleotidů obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621; b) alelové varianty (a); c) polynukleotidové molekuly, které kódují polypeptid, jenž je alespoň ze 60 % identický s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminoCZ 299288 B6 kyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 207 (Ala); a d) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621; a terminátor transkripce, přičemž uvedená buňka exprimuje homologní polypeptid FGF kódovaný segmentem DNA; a izolace homologního polypeptidu FGF. Dále vynález popisuje izolovaný homologní polypeptid FGF vybraný ze skupiny obsahující a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 175 (Met); b) alelové varianty (a); c) polynukleotidové molekuly, které kódují polypeptid, jenž je alespoň ze 60 % identický s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 175 (Met).

Vynález popisuje izolovaný homologní polypeptid FGF vybraný ze skupiny obsahující a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 196 (Lys).

V jiném provedení vynálezu se popisuje izolovaný homologní polypeptid FGF vybraný ze skupiny obsahující a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 207 (Ala); b) alelové varianty (a); c) polynukleotidové molekuly, které kódují polypeptid, jenž je alespoň ze 60 % identický s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 207 (Ala).

V jiném provedení vynálezu se popisuje homologní polypeptid FGF dále obsahující signální sekvenci.

V jiném provedení vynálezu se popisuje homologní polypeptid FGF dále obsahující signální sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 1 (Met) do aminokyselinového zbytku 207 (Ala).

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici, která obsahuje izolovaný homologní polypeptid FGF v kombinaci s farmaceuticky přijatelným vehiklem.

Dále vynález popisuje protilátky, které se váží na epitop molekuly polypeptidu obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 2 od zbytku 1 (Met) do zbytku 207 (Ala).

V jiném provedení vynálezu se popisují protilátky, které se váží na molekulu polypeptidu obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 196 (Lys).

Dále vynález popisuje způsob stimulace proliferace myocytů nebo progenitorů myocytů, který zahrnuje aplikaci homologního polypeptidu FGF savci, je-li to nutné, v množství dostatečném k produkci klinicky významného zvýšení počtu myocytů nebo progenitorů myocytů.

Jiné provedení vynálezu popisuje způsob stimulace proliferace myocytů nebo progenitorů myocytů, přičemž myocyty nebo progenitory myocytů jsou kardiální myocyty nebo kardiální progenitory myocytů.

Vynález dále popisuje způsob ex vivo stimulace myocytových progenitorových buněk nebo myocytů, který zahrnuje kultivaci buněk srdeční tkáně s množstvím homologního polypeptidu FGF, které je dostatečné k produkci zvýšeného počtu myocytových progenitorových buněk nebo myocytů v buňkách srdeční tkáně kultivovaných v přítomnosti homologního polypeptidu FGF, což se porovnává s myocytovými progenitorovými buňkami srdeční tkáně nebo s myocyty kultivovanými v nepřítomnosti homologního polypeptidu FGF.

-4CZ 299288 B6

V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob ex vivo stimulace myocytových progenitorových buněk nebo myocytů, přičemž myocyty nebo progenitory myocytů jsou kardiální myocyty nebo kardiální progenitory myocytů.

V jiném provedení vynálezu se popisuje způsob zavedení selektivního činidla nebo léku k srdeční tkáni obsahující: vazbu první molekuly obsahující homologní polypeptid FGF s druhou molekulou obsahující činidlo nebo lék za vzniku chiméry; a aplikaci chiméry do srdeční tkáně.

Termín „ortolog“ označuje polypeptid nebo protein získaný zjednoho specie, který vykazuje homologii nebo analogii s polypeptidem nebo proteinem z různých specií.

Termín „paralog“ označuje polypeptid nebo protein získaný z daného specie, který vykazuje homologii s odlišným polypeptidem nebo proteinem ze stejného specie.

Termín „alelová varianta“ označuje libovolnou ze dvou nebo více alternativních forem genu, který obsazuje stejný chromozomální lokus. Alelická varianta vzniká přirozeně mutací a může v populaci způsobovat fenotypický polymorfízmus. Mutace genů mohou být tiché (nedochází ke změně kódovaného fenotypu) nebo mohou kódovat polypeptidy se změněnou aminokyselinovou sekvencí. Termín alelová varianta také označuje protein kódovaný alelovou variantou genu.

Termín „expresivní vektor“ značí lineární nebo kruhovou molekulu DNA, která obsahuje segment kódující polypeptid operabilně spojený s přídavnými segmenty, které jsou nutné pro jeho transkripci. Takové přídavné segmenty mohou zahrnovat promotorové a terminační sekvence a v optimálním případě zahrnují jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selekčních markérů, zesilovač, polyadenylační signál a podobně. Expresivní vektory se v obecném případě odvozují od plazmidové nebo virové DNA nebo mohou obsahovat elementy obou zmíněných nukleových kyselin.

Termín „izolovaný“ ve spojení s molekulou polynukleotidů označuje, že polynukleotid se odstranil ze svého přirozeného genetického prostředí a je tedy bez okolních nebo nechtěných kódujících sekvencí a existuje ve formě vhodné pro použití v geneticky manipulovaných systémech pro produkci proteinů. Takové izolované molekuly jsou ty, které se separovaly z jejich přirozeného prostředí a zahrnují cDNA a genomové klony. Izolované molekuly DNA podle vynálezu neobsahují jiné geny, se kterými jsou spojeny, ale mohou zahrnovat přirozeně se vyskytující 5' a 3' nepřekládané oblasti, jako jsou promotory a terminátory. Identifikace spojených oblastí je odborníkovi zřejmá (popisuje se například v publikaci Dynan and Tijan, Nátuře 316: 774-78, 1985). Když je termín „izolovaný“ ve spojení s proteinem, protein se nachází v podmínkách jiných než ve svém přirozeném prostředí, jako je krev nebo zvířecí tkáň.

V preferovaném provedení vynálezu je izolovaný protein v podstatě bez jiných proteinů, zvláště bez jiných proteinů pocházejících ze zvířat. Preferovaným je protein ve vysoce čisté formě, to znamená čistota je vyšší než 95 %, více se preferuje čistota 99 %.

Termín „operativně spojený“ ve spojení s termínem „segmenty DNA“ označuje segmenty, které jsou uspořádány tak, že fungují v souladu s jejich záměrem. Transkripce například začíná v promotoru a pokračuje přes kódující segment k terminátoru.

Termín „polynukleotid“ značí jednořetězcový nebo dvouřetězcový polymer deoxyribonukleotidových nebo ribonukleotidových bází, které se čtou od 5' do 3'konce. Polynukleotidy zahrnují RNA a DNA a mohou se izolovat z přirozených zdrojů, syntetizují se in vitro nebo se připravují kombinací přirozených a syntetických molekul.

Termín „komplementy polynukleotidových molekul“ znamená polynukleotidové molekuly, které mají komplementární sekvence bází a obrácenou orientaci ve srovnání s referenční sekvencí. Sekvence 5'ATGCACGGG 3'je komplementární se sekvencí 5'CCCGTGCAT 3'.

-5CZ 299288 B6

Termín „degenerovaná nukleotidová sekvence“ značí sekvenci nukleotidů, která zahrnuje jeden nebo více degenerovaných kodonů (srovnává se s referenční molekulou polynukleotidů, která kóduje polypeptid). Degenerované kodony obsahují odlišné triplety nukleotidů, ale kódují stejné aminokyselinové zbytky (to znamená triplety GAU a GAC kódují Asp).

Termín „promotor“ značí část gen obsahujících sekvencí, na kterou se váže RNA polymeráza a iniciuje se transkripce. Promotorové sekvence se běžně nacházejí, ale ne vždy, v nekódujících oblastech 5' konce genů.

Termín „signální sekvence sekrece“ označuje sekvenci, která kóduje polypeptid („sekreční peptid“), který jako doplněk většího polypeptidů řídí větší peptid skrz cestu sekrece buňky, ve které se syntetizuje. Větší peptid se běžně štěpí tak, aby se odstranil sekreční peptid během tranzitu skrz sekreční cesty.

Termín „receptor“ značí s buňkami asociovaný protein, který se váže na bioaktivní molekulu (to znamená ligand) a zprostředkovává účinek ligandů na buňku. Receptory vázané na membránu se charakterizují multi-doménovou oblastí, která obsahuje extracelulární doménu vázající ligand a intracelulámí efektorovou doménu, která se v typickém případě podílí na signální transdukci. Navázání ligandů na receptor vede u receptoru ke změnám konformace, což způsobuje interakci mezi efektorovou doménou a jinou molekulou(ami) v buňce. Tato interakce naopak vede ke změnám v metabolizmu buňky. Metabolické rysy, které se spojují s interakcemi receptor-ligand zahrnují transkripci genu, fosforylaci, defosforylaci, zvýšení produkce cyklického AMP, mobilizaci buněčného vápníku, mobilizace membránových lipidů, buněčnou adhezi, hydrolýzu inozitolových lipidů a hydrolýzu fosfolipidů. Většina jaderných receptorů také vykazuje multidoménovou strukturu, která zahrnuje transaktivující doménu N-konce, doménu, která váže DNA a doménu vázající ligand. V obecném případě receptory mohou být vázány na membránu, cytosolické nebo jaderné; monomerní (například receptor hormonu stimulující štítnou žlázu, betaadrenergický receptor) nebo multimemí (například receptor PDGF, receptor růstového hormonu, receptor IL—3, receptor GM-CSF, receptor G-CSF, erytropoietinový receptor a receptor IL—6).

Termín „komplement/anti-komplement“ označuje nestejné části, které tvoří za příslušných podmínek stabilní páry spojené nekovalentní vazbou. Biotin a avidin (nebo streptavidin) jsou prototypy členů párů komplement/anti-komplement. Jiné příklady párů komplement/anti-komplement zahrnuje páry receptor/ligand, protilátka/antigen (nebo hapten nebo epitop), páry sense/antisense polynukleotidy a podobně. Kde je nutná následná disociace páru komplement/anti-komplement pak pár komplement/anti-komponent má s výhodou vazebnou afinitu <10⁹ M'¹.

Vynález se s části zakládá na objevu nové sekvence DNA, která kóduje homologový peptid fibroblastového růstového faktoru (FGF), který vykazuje homologii k FGF-8. Analýza distribuce mRNA, která odpovídá uvedené nové DNA, v tkáni ukazuje, že nejsilnější exprese se dosáhlo ve fetální srdeční tkáni a srdeční tkáni dospělých. Pak následuje zjevná, ale snížená exprese ve fetální plicní tkáni, tkáni svalů skeletu, tkáni hladkého svalstva, jako se nachází v tenkém střevě, v tlustém střevě a trachee. Homologní peptid FGF se označil jako zFGF-5. Nové polypeptidy zFGF-5 podle vynálezu se identifikovaly dotazem do EST databáze na růstové faktory. Objevila se EST sekvence a zdá se, že se vztahuje k rodině FGF. Nový homologový polypeptid FGF kódovaný cDNA v plné délce, která obsahuje motiv obecného vzorce CXFXEX{6}y, kde X je aminokyselina a X{} je počet aminokyselin, kdy X je větší nezjedná. Tento motiv se objevuje u všech známých členů rodiny FGF a v těchto proteinech je jediný.

Nukleotidová sekvence cDNA z FGF-5 se popisuje v sekvenci SEQ ID NO: 1 a odvozená aminokyselinová sekvence se popisuje v sekvenci SEQ ID NO: 2. Když se porovnají aminokyselinové zbytky 28 (Glu) až aminokyselinové zbytky 181 (Gin) sekvence SEQ ID NO: 2 s odpovídající oblastí FGF-8 (zobrazeno na obrázcích č. 1 a 2) vykazují obě sekvence přibližně 56 % identity.

-6CZ 299288 B6

Nový polypeptid kódovaný zde popsaným polynukleotidem obsahuje motiv CXFXEX{6}y, který obsahují všechny členy rodiny FGF. Motiv CXFXEX{6}aby je vysoce konzervativní. Konsenzus aminokyselinové sekvence domény CXFXEX{6}y zahrnuje faktor 1 homolog lidského fibroblastového růstového faktoru (FHF-1; Smallwood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 98509857, 1996), faktor aktivující lidské myocyty (FGF-10; HSU76381, GENBANK identifier, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), faktor 4 homolog lidského fibroblastového růstového faktoru (FGF-4; Smallwood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 9850-9857, 1996) faktor 2 homolog lidského fibroblastového růstového faktoru (FHF-2; Smallwood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 9850-9857, 1996), faktor 3 homolog lidského fibroblastového růstového faktoru (FHF-3; Smallwood et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 9850-9857, 1996), lidský FHF^l (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992), lidský FGF-2 (bazický; Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992), lidský FGF-1 (kyselý; Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992), lidský keratinocytový růstový faktor 2 (KGF-2; HSU67918 GENBANK identifier, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), prekurzor lidského keratinocytového růstového faktoru (FGF-7; Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992), lidský zFGF-5, lidský FGF-8 (Gemel et al., Genomics 35: 253-257, 1996), lidský FGF-5 (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992), lidský FGF-9 (Miyamoto et al., Mol. Cell. Biol. 13: 4251 -4259, 1993) a lidský FGF-3 (Basilico et al., Adv. Cancer Res. 59: 115-165, 1992).

Analýza cDNA kódující polypeptid zFGF-5 (SEQ ID NO: 1) vykazuje otevřený čtecí rámec kódující 207 aminokyselin (SEQ ID NO: 2) obsahující zralý polypeptid se 180 aminokyselinami (zbytek 28 až 207 sekvence SEQ ID NO: 2). Porovnání zFGF-5 s jinými známými FGF vykazuje blok vysokého procenta identity odpovídající oblasti od aminokyselinového zbytku 127 (Cys) do aminokyselinového zbytku 138 (Tyr) sekvence SEQ ID NO:2 (obrázek č. 2). Několik členů rodiny FGF nemá signální sekvence.

Členové rodiny FGF se charakterizují doménami vázajícími heparin. V oblasti aminokyselinového zbytku 148 (Gly) až aminokyselinového zbytku 169 (Gin) sekvence SEQ ID NO: 2 se identifikovala putativní doména pro zFGF-5 vázající heparin. Signál zprostředkovaný receptorem se inicializuje navázáním FGF ligandu na proteoglykany heparinsulfátu na povrchu buňky. Rada členů rodiny FGF se může zařadit na základě jejich struktury a funkce do jedné nebo dvou příbuzných rodin. aFGF a bFGF obsahuje tři exony oddělené dvěma introny variabilní délky. FGF-8 zahrnuje pět exonů, první tři z nich odpovídají prvnímu exonu aFGF a bFGF. Všechny známé členy rodiny FGF jsou upraveny sestřihem za vzniku jednotlivých polypeptidů.

Sekvence SEQ ID NO: 6 je degenerovaná polynukleotidová sekvence, která zdůrazňuje všechny polynukleotidy, které mohu kódovat polypeptid zFGF sekvence SEQ ID NO: 2 (aminokyseliny 1 nebo 28 až 207). Vynález popisuje polynukleotidy kódující polypeptid zFGF-5 vyskytující se v sekvenci SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 1 nebo 82 do nukleotidu 621. Vynález také zahrnuje fragmenty a fúze, jak se popisuje shora v textu, s ohledem na sekvenci SEQ ID NO: 1, které jsou tvořeny analogovými oblastmi sekvence SEQ ID NO: 6, kde nukleotidy 82 až 621 sekvence SEQ ID NO: 6 odpovídají nukleotidům 82 až 621 sekvence SEQ ID NO: 1 kódující molekulu zFGF-5.

Symboly v sekvenci SEQ ID NO: 6 jsou shrnuty v tabulce č. 1 dále v textu.

-7 CZ 299288 B6

Tabulka č. 1

Nukleotid	Rozlišení	komplement	Rozlišení
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	c	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
S	C/G	S	C/G
C/G	A/T	W	A/T
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/T

Degenerované kodony užívané v sekvenci SEQ ID NO: 6 zahrnující všechny možné kodony dané aminokyseliny jsou uvedeny v tabulce č. 2 dále v textu.

Tabulka č. 2

aminokyselina	Znak	kodony	Degenerovaný kodon
Cys	c	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN

-8CZ 299288 B6

Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	A	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gin	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Aby	TAC TAT	TGG
Trp	W	TGG	TGG
Ter		TAA TAG TGA	TRR
Asn/Asp	B		RAY
Glu/Gln	Z		SAR
Any	X		NNN
Gap

Při stanovení degenerovaného kodonu, který reprezentuje všechny možné kodony kódující každou aminokyselinu, dochází k nejasnostem. Degenerovaný kodon pro serin (WSN) může za určitých okolností kódovat arginin (AGR) a degenerovaný kodon pro arginin (MGN) může za určitých okolností kódovat serin (AGY). Podobný vztah existuje mezi kodony kódující fenylalanin a leucin. Tak některé polynukleotidy zahrnuté do degenerativní sekvence mohou mít některé nesprávné aminokyseliny, ale odborník může jednoduše identifikovat chybné sekvence vzhledem k aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 2.

Vysoce konzervativní aminokyseliny v zFGF-5 se mohou použít jako nástroj pro identifikaci ío nových členů rodiny. Pro identifikaci nových členů rodiny v ETS databázi se může použít konzervativní motiv CXFXEX{6}y. Při jiném způsobu použití polynukleotidových sond a metod hybridizace se RNA získala z různých zdrojů tkáně a může se použít při vytvoření knihoven cDNA a tato knihovna se může testovat sondou, aby se stanovili noví členové rodiny. Za účelem amplífikace sekvencí kódujících vysoce degenerované DNA primery vytvořené ze sekvencí odpovídajících oblastí od aminokyselinového zbytku 127 (Cys) do aminokyselinového zbytku 138 (Tyr) sekvence SEQ ID NO: 2 se použily polymerázové řetězcové reakce pro reverzní transkripci (RT-PCR).

V preferovaných provedeních vynálezu polynukleotidy slouží jako sonda a hybridizují za přísných podmínek s oblastmi podobné velikosti sekvence SEQ ID NO: 1 nebo se sekvencí, která je komplementární. V obecném případě přísné podmínky se stanovují tak, aby teplota byla o 5 °C

-9CZ 299288 B6 nižší než je teplota tání (T_m) specifických sekvencí při definované iontové síle a pH. T_m je teplota (při definované iontové síle a pH), při které 50 % cílové sekvence hybridizuje se sondou. V typickém případě přísné podmínky jsou ty, při kterých koncentrace soli je alespoň okolo 0,02 M a hodnota pH je 7 a teplota je alespoň okolo 60 °C.

Jak se popisuje dříve v textu izolované polynukleotidy podle vynálezu zahrnují DNA a RNA. Způsoby izolace DNA a RNA jsou dobře známy v oboru. V obecném případě se preferuje izolace RNA z kardiální tkáně, ačkoli DNA se také může připravit použitím RNA z jiných tkání nebo se může izolovat jako genomová DNA. Celková RNA se může připravit za použití extrakce s guanidinem a HCI, pak následuje izolace centrifugací v CsCl gradientu (Chirwing et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Póly (A)⁺RNA se připravila z celkové RNA za použití metody podle Aviv a Leder (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412, 1972). Komplementární DNA (cDNA) se připravila z poly(A)⁺RNA za použití nových metod. Pak se identifikovaly a izolovaly polynukleotidy kódující polypeptidy zFGF-5 například hybridizaci nebo PCR.

Vynález dále popisuje doplněk polypeptidům a polynukleotidů z jiných specií (ortology a paralogy). Zvláštní zájem je o polypeptidy zFGF-5 z jiných savčích specií, které zahrnují myší, krysí, prasečí, ovčí, bovinní, psí, kočičí, koňské proteiny a jiné proteiny primátů. Identifikace paralogů lidské sekvence jsou zvláště zajímavé, protože zatímco se stanovilo 8 paralogů myšího FGF-8, jsou známy pouze čtyři lidské paralogy. Lidské paralogy nebo druhové homology lidských proteinů se mohou klonovat za použití informací a kompozic podle vynálezu v kombinaci s běžnými klonovacími metodami. cDNA se může například klonovat za použití mRNA získané z tkáně nebo typu buněk, které exprimují protein. Vhodné zdroje mRNA se mohou identifikovat testováním northemových blotů sondou, která se vytvořila ze zde doložených sekvencí. Knihovna se pak připraví z mRNA pozitivní tkáně nebo z buněčné linie. cDNA kódující zFGF se pak může izolovat za použití různých metod, jako je použití sond s celou nebo částečnou lidskou cDNA nebo s jednou nebo více sad degenerovaných sond, které se zakládají na zde doložených sekvencích. cDNA se také může klonovat za použití polymerázové řetězcové reakce nebo PCR (Mullis, patent US 4 683 202) za použití primerů získaných ze zde doložených sekvencí. cDNA se může použít při transformaci nebo transfekci hostitelských buněk a exprese cDNA se může detekovat protilátkami k zFGF-5. Podobné metody se mohou použít při izolaci genomových klonů.

Pro odborníka je jednoduché rozpoznat, že sekvence popsané v SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2 reprezentuje jednoduchou alelu genu lidského zFGF-5 a polypeptidu a očekává se, že se objeví alelová varianta a alternativní úprava sestřihem. Alelové varianty se mohou klonovat pomocí testování cDNA sondou nebo testováním genomových knihoven z jednotlivých jedinců podle standardního postupu. Alelové varianty sekvence DNA, která je uvedena v sekvenci SEQ ID NO: 1 a zahrnují ty sekvence obsahující tiché mutace a ty, ve kterých mutace vedou ke změnám aminokyselinové sekvence, jsou zahrnuty ve vynálezu jako proteiny, které jsou alelové varianty sekvence SEQ ID NO: 2.

Vynález také popisuje izolované polypeptidy zFGF-5, které jsou v podstatě homologní s polypeptidy se sekvencí SEQ ID NO: 2 a jejich druhové homology/ortology. Termín „v podstatě homologní“ znamená polypeptidy, jejichž sekvence vykazují 50%, s výhodou 60%, upřednostňuje se alespoň 80% identita se sekvencemi, které jsou uvedeny v SEQ ID NO. 2 nebo s jejich ortology nebo paralogy. Upřednostňuje se, aby takové polypeptidy byly alespoň z 90 % identické, nejvíce se upřednostňuje, aby byly z 95 % a více identické se sekvencí SEQ ID NO: 2 nebo sjejich ortology nebo paralogy. Procento identity sekvence se stanovilo konvenčními způsoby. Popisují se například v publikacích Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616, 1986 a Henikoff and Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 192. Dvě aminokyselinové sekvence se uspořádaly tak, aby se optimalizovalo srovnávací skóre za použití 10-ti mezer, které otevírají penalty a 1 mezery prodlužující penaltu, a skórovací matrice „blosum 62“ podle publikace Henikoff and Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992, jak je zobrazeno v tabulce č. 3 (aminokyselinové sekvence jsou definovány standardním jednopísmenným kódem). Procento identity se pak vypočítá jako:

- 10CZ 299288 B6

Tabulka

>

>1

s

11

t-

lQ

CN 1

CO

M*

i—1

PO 1

dl

Γ-

t— 1

r- 1

1

Du

VD

i

CN 1

1

«—1

S

ď)

O

CN I

<— 1

r-i 1

LQ

PO I

rH I

o

r~i 1

co i

.-3

CN 1

CN

o

CO I

CN I

rH 1

CN J

1—í

CN

CO I

C“l

o

CO I

CN 1

r^- 1

co 1

SC

00

co l

PO 1

»-1 1

CN t

T— I

CN I

t-H 1

CN 1

o

VD

CN i

1

CN 1

CO 1

m I

CN I

O

CN 1

ω

m

CN 1

o

co 1

co í

r—I

CN 1

CO I

rH f

o

r-i

PO 1

α

LO

CN

CN 1

o

PO i

CN 1

5-1

O

co i

i—1 1

o

c—i 1

CN 1

υ

σι

CO 1

l

CO 1

PO 1

1 1

«-1 I

co

1^-1 1

CN f

CO 1

«—4

r-i 1

CN i

α

VD

co 1

o

CN

r-4 1

«—{ 1

co 1

^r 1

<—1 1

co 1

PO l

t~4 t

o

1

is

VD

i—1

PO 1

o

O

rd

co 1

co

o

<N 1

co I

CN

t—i

o

vr l

οί

LO

o

CN 1

CO 1

r—1

o

CN f

o

co 1

CN 1

CN

r-*4 1

co í

CN 1

»—1 1

rU 1

co 1

,—1 1

CN 1

CN

o

n-f 1

1

O

CN l

ι-H l

i—1 l

t-H 1

1—I I

CN l

r-i 1

«—1

o

co 1

<

Q

o

Ol

ω

o

3C

64

2

bu

a

cn

E-i

s

II


t	τ—l 1
<M	co 1
CM 1	o
CM 1	CM
co 1	CM 1
co	i—1 1
1—1 1	,—I
CM 1	CM 1
<—i 1	t—1
r-l 1	CO
CM	co 1
CO I	co 1
CM 1	Ol
i—1 1	CM J
OJ 1	i-4 1
co 1	CO 1
CM 1	co 1
OJ 1	co 1
CM 1	o
s	>

12CZ 299288 B6

Celkový počet identického párování_ x 100 (délka delší sekvence plus počet mezer začleněných v delší sekvenci za účelem srovnat obě sekvence)

Identita sekvencí polynukleotidových molekul se stanovuje podobnými metodami za použití poměru uvedeného shora v textu. V podstatě homologní proteiny a polypeptidy jsou charakterizovány tak, že vykazují jednu nebo více substitucí aminokyselin, delecí nebo adic. Preferuje se, aby tyto substituce byly přirozené, které nahrazují konzervativní aminokyselinové kyseliny (popisuje se v tabulce č. 4), a dále jsou výhodné substituce, které podstatě neovlivňují balení nebo aktivitu proteinu nebo peptidu; malé delece, v typickém případě jedna až přibližně 30 aminokyselin; a malá amino- nebo karboxyl-terminální extenze, jako je metioninový zbytek na N-konci, malý linkerový peptid až do přibližně 20 až 25 zbytků nebo malá extenze, která umožňuje čištění (afinitní tag), jako je polyhistidinový trakt, protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), transferáza S glutationinu (Smith and Johnson, Gene 67: 31, 1988), protein vázající maltózu (Kellerman and Ferenci, Methods Enzymol. 90: 459-463, 1982; Guan et al., Gene 67: 21-30, 1987) nebo jiný antigenní epitop nebo vazebnou doménu (popisuje se v publikaci Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991). DNA kódující afinitní tag jsou například běžně dostupné u firem Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA).

Tabulka č. 4

Konzervativní aminokyselinové substituce

Bazické:	arginin lyzin histidin
kyselé	kyselina glutamová kyselina aspartová
polární	glutamin asparagin
hydrofobní	leucin izoleucin valin
aromatické	fenylalanin tryptofan tyrozin
malé	glycin alanin serin treonin metionin

Proteiny podle vynálezu mohou také obsahovat vedle 20 standardních aminokyselin aminokyselinové zbytky, které se přirozeně nevyskytují. Aminokyseliny, které se nevyskytují přirozeně zahrnují bez omezení trans-3-metylprolin, 2,4-metanoprolin, cis-4-hydroxyprolin, trans-4hydroxyprolin, A-metyl-glycin, allo-treonin, metyltrenonin, hydroxyetyl-cystein, hydroxyetylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, kyselina pipekolinová, terc-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenyl-alanin, 4-fIuorofenylalanin, 4-hydroxyprolin, 6-Nmetyllyzin, kyselina 2-aminoizomáselná, izoalin a α-metylserin. Je známo několik metod pro začlenění aminokyselinových zbytků, které se přirozeně nevyskytují, do proteinů. Systém in vitro se může použít tam, kde nesmyslné mutace jsou potlačeny za použití chemicky aminoacylovaného supresoru tRNA. Jsou známy metody syntézy aminokyselin a aminoacylace tRNA. Transkripce a translace plazmidů obsahující nesmyslné mutace se provedly v bezbuněčném

- 13CZ 299288 B6 systému, který obsahuje extrakt E. coli S30 a komerčně dostupné enzymy a jiné reagenty. Proteiny se čistily chromatografií (popisuje se například v publikacích Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Meth. Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al.. Science 259: 806-09, 1993; a Chung et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10145-49, 1993). Při druhé metodě se provádí translace v Xenopus oocytech mikroinjekcí mutované mRNA a chemicky aminoacylovaného supresoru tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-98, 1996). Při třetí metodě se buňky E. coli kultivují v nepřítomnosti přirozené aminokyseliny, která se má nahradit (např. fenylalanin) a v přítomnosti požadované aminokyseliny, které se přirozeně nevyskytují (např. 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin nebo 4-fluorofenylalanin). Aminokyselina, která se přirozeně nevyskytuje se začlenila do proteinu na místo její přirozené součásti (Koide et al., Biochem. 33: 7470-76, 1994). Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky se mohou převést na specie, které se přirozeně nevyskytují, způsobem chemické modifikace in vitro. Chemická modifikace se může kombinovat místně řízenou mutagenezí, aby se dále rozšířilo rozmezí substitucí (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395—403, 1993).

Podstatné aminokyseliny v polypeptidech zFGF-5 podle vynálezu se mohou identifikovat podle postupu známého v oboru, jako je místně řízená mutageneze nebo mutageneze skenující alanin (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). Při modernějších postupech se do každého zbytku v molekule zavede jedna alaninová mutace a u výsledných molekul mutantů se testuje biologická aktivita (např. proliferace kardiálních myocytů nebo fibroblastů nebo stimulace tvoření kostí), aby se identifikovaly aminokyselinové zbytky, které jsou rozhodující pro aktivitu molekuly (Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699—4708, 1996). Místo interakce ligand-receptor se může stanovit fyzikální analýzou struktury za použití takových metod, jako je nukleární magnetická rezonance, krystalografie, elektronová difrakce nebo fotoafinitní značení ve spojení s mutací putativních aminokyselin v kontaktním místě (popisuje se například v publikacích Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992). Identita podstatných aminokyselin se může také určit z analýzy homologie s příbuznými FGF. Vše je zobrazeno na obrázcích 1 a 2.

Analýza aminokyselinové sekvence zFGF-5 vykazuje dibazické místo na C-konci polypeptidu (aminokyselinové zbytky 196-197 (Lys-Arg)). Ukázalo se, že polypeptid zkrácený na C-konci obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v sekvenci SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 196 (Lys), má biologickou aktivitu. Dibazické aminokyseliny, jako je Arg-X-X-Arg (kde X je libovolný aminokyselinový zbytek) Arg-Arg nebo Lys-Arg; jsou subjektem štěpení několika enzymy, které zahrnují, ale nejsou omezeny na trombin a karboxypeptidázy. Vynález proto popisuje provedení konzervativních změn v dibazických aminokyselinových zbytcích, zvláště v aminokyselinových zbytcích 196 a 197 (Lys a Arg) sekvence SEQ ID NO: 2.

Na základě analýz rodiny FGF molekuly zkrácené na C-konci, které obsahují aminokyselinový zbytek 28 (Glu) až zbytek 175 (Met) sekvence SEQ ID NO: 2, mohou být biologicky aktivní. Předpovědělo se, že intramolekulární disulfidová vazba se objeví mezi aminokyselinovým zbytkem 109 (Cys) a zbytkem 129 (Cys) sekvence SEQ ID NO: 2.

Na základě homologního uspořádání krystalových struktur s FGF-1 a FGF-2 (Eriksson et al., Prot. Sci. 2: 1274, 1993) předpovězená sekundární struktura pro strukturu beta-řetězce zFGF-5 koreluje s aminokyselinovými zbytky 56-59, 64-69, 73-76, 85-92, 96-102, 106-111,115-119, 128-134, 138-144, 149-155 a 173-177 sekvence SEQ ID NO: 2. Aminokyseliny nezbytné pro navázání zFGF-5 na receptory se mohou stanovit místně řízenou mutagenezí celého polypeptidu zFGF-5. Mohou se identifikovat použitím místně řízené mutageneze aminokyselin v polypeptidu zFGF-5, který koresponduje s aminokyselinovými zbytky v kyselém FGF (FGF1) a bazickým FGF (FGF2), jež jsou kritické pro navázání uvedených FGF na jejich receptory (Blaber et al., Biochem. 35: 2086-2094, 1996). Tyto aminokyseliny v lidském FGF2 zahrnují Tyr33, Arg53, AsnllO, Tyrll2, Lysí 19, Trpl23, Leul49, Tyrl09, Lysí 16, Trpl22, Leul48 a Leu150, jak ukazuje obrázek č. 1 a č. 2. Odpovídající aminokyseliny v zFGF-5, jak ukazuje obrázek č. 1 a

- 14CZ 299288 Β6

č. 2 budou Tyr58, Gly77, Asnl36, Tyrl38, Lysl45, Trpl49, Metl75 a Argl77. Pro odborníka je jednoduché rozpoznat, že jiní členové, jako celek nebo část rodiny mohou vykazovat strukturální nebo biochemické podobnosti s zFGF-5 a mohou být substituovány. Takové oblasti jsou důležité pro biologické funkce molekuly.

Za použití známých metod mutageneze a testování lze provést a testovat více aminokyselinových substitucí (popisuje se v publikacích Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-57, 1988; nebo Bowie and Sauer; Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). Tito autoři popisují metody současného náhodného rozdělení dvou nebo více pozic v polypeptidu, výběr funkčního polypeptidu a sekvenování mutagenizovaných polypeptidů, za účelem stanovení spektra možných substitucí v každé pozici. U jiných metod se používají fágy (popisuje se například v publikaci Lowman et al., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner et al., patent US 5 223 409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) a oblastně řízená mutageneze (Derbyshireet al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).

Shora popsané metody mutageneze se mohou kombinovat za účelem stanovení aktivity klonovaného, mutagenizováného polypeptidu v hostitelských buňkách s automatizovanou skreeningovou metodou s vysokou propustností. Mutagenizované molekuly DNA, které kódují aktivní polypeptidy (např. proliferace buněk) se mohou izolovat z hostitelských buněk a mohou se rychle sekvenovat na moderních přístrojích. Tyto metody umožňují rychlé stanovení důležitosti jednotlivých aminokyselinových zbytků v polypeptidu a mohou se používat u polypeptidů neznámé struktury.

Za použití shora diskutovaných metod odborník může snadno identifikovat a/nebo připravit řadu polypeptidů, které jsou v podstatě homologní se zbytky 28 (Glu) až 196 (Lys) nebo se zbytky 28 (Glu) až 207 (Ala) sekvence SEQ ID NO: 2, jejich alelové varianty nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, a jež si ponechávají proliferační vlastnosti proteinu divokého typu. Takové polypeptidy mohou také zahrnovat polypeptidové segmenty, jak se popisuje shora v textu.

Polypeptidy podle vynálezu zahrnující proteiny v plné délce, jejich fragmenty a fúzní proteiny, se mohou produkovat běžným způsobem v geneticky manipulované hostitelské buňce. Vhodné hostitelské buňky jsou ty typy buněk, které se mohou transformovat nebo transfekovat exogenní DNA a mohou růst v kultuře. Zahrnují bakterie, buňky hub a kultivované buňky vyšších eukaryocytů. Preferují se eukaryontní buňky, zvláště kultivované buňky vícebuněčných organizmů. Metody manipulace klonovaných molekul DNA a metody zavedení exogenní DNA do různých hostitelských buněk se popisují v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; a Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987).

V obecném případě sekvence DNA kódující polypeptid zFGF-5 podle vynálezu je operabilně spojena s jinými genovými elementy, které jsou nutné pro expresi genu. V obecném případě v expresivním vektoru zahrnují promotor a terminátor transkripce. Vektor bude také běžně obsahovat jeden nebo více selekčních markérů a jeden nebo více počátků replikace, ačkoli v jistých systémech se selekční markéry mohou vyskytovat na oddělených vektorech a replikace exogenní DNA se může uskutečnit integrací do genomu hostitelské buňky. Selekce promotorů, terminátorů, selekčních markérů, vektorů a jiných elementů je pro odborníka rutinní prací. Řada takových elementů, které se popisují v literatuře, jsou dostupné u mnoha firem.

Aby se polypeptid zFGF-5 dostal na sekreční cestu hostitelské buňky, expresní vektor obsahuje sekvenci sekrečního signálu (tato sekvence je také známa jako vedoucí sekvence, prepro sekvence nebo pre sekvence). Sekvence sekrečního signálu může být nativní sekvencí nebo chimérou, která obsahuje signální sekvenci odvozenou od jiného sekrečního proteinu (např. t-PA a α-pre-pro vedoucí sekvence sekrece) nebo se syntetizuje de novo. Signální sekvence sekrece je spojena s DNA sekvencí zFGF-5 ve správném čtecím rámci. Signální sekvence sekrece jsou běžně umístěny na 5'konci sekvence DNA kódující polypeptid, ačkoli jisté signální sekvence se

- 15 CZ 299288 B6 mohou nacházet kdekoli v sekvenci DNA (popisuje se například v publikaci Welch et al., patent US 5 037 743; Hollandetal., patent US 5 143 830).

Popisuje se univerzální akceptorový plazmid, který se může použít ke klonování DNA kódující libovolný polypeptid a který zahrnuje polypeptidové fúze. Akceptorový plazmid se může použít při řadě metod pro přípravu dvouřetězcové, kruhové molekuly DNA. Metoda zahrnuje tyto kroky: (a) příprava fragmentu dvouřetězcové donorové DNA kódující polypeptid; (b) příprava dvouřetězcového, lineárního akceptorového plazmidu, která má oba konce tupé a obsahuje selekční markér a replikační sekvenci, která je funkční v Saccharomyces cerevisiae, kde akceptorový plazmid v podstatě neobsahuje DNA kódující polypeptid; (c) příprava prvního dvouřetězcového linkeru DNA, který obsahuje první segment v sekvenci identický s první oblastí akceptorového plazmidu a druhý segment v sekvenci identický s první oblastí fragmentu donorové DNA, kde délka prvního a druhého segmentu prvního linkeru je alespoň 10 bp; (d) příprava druhého dvouřetězcového linkeru DNA, který obsahuje první segment v sekvenci identický s druhou oblastí akceptorového plazmidu a druhý segment v sekvenci identický s druhou oblastí fragmentu donorové DNA, kde délka každého z prvních a druhých segmentů druhého linkeru je alespoň 10 bp; a (e) kombinování fragmentu donorové DNA, akceptorového plazmidu, prvního DNA linkeru a druhého DNA linkeru v hostitelské buňce Saccharomyces cerevisiae, kde fragment donorové DNA je spojen s akceptorovým plazmidem homologní rekombinací donorové DNA, akceptorového plazmidu a linkerů za vzniku uzavřeného kruhového plazmidu. Akceptorový plazmid dále obsahuje transkripční promotor proximální k prvnímu konci a fragment donorové DNA je operabilně spojen s transkripčním promotorem v uzavřeném, kruhovém plazmidu. Akceptorový plazmid dále obsahuje segment DNA kódující vedoucí peptid a/nebo jeden nebo více DNA segmentů kódujících peptid tag, který je umístěn tak, že tyto segmenty DNA jsou operabilně spojeny s fragmentem donorové DNA za vzniku uzavřeného kruhového plazmidu. V preferovaném provedení vynálezu akceptorový plazmid dále obsahuje (a) promotor, segment DNA kódující vedoucí peptid a segment DNA kódující první peptid tag, kde segment DNA kódující vedoucí peptid je v pozici mezi promotorem a segmentem DNA kódující první peptid tag proximální k prvnímu konci akceptorového plazmidu, kde promotor, segment DNA kódující vedoucí sekvenci a segment DNA kódující první peptid tag jsou operabilně spojeny; a (b) segment DNA kódující druhý peptid tag proximální ke druhému konci akceptorového plazmidu. Způsob přípravy dvouřetězcové, kruhové molekuly DNA, který zahrnuje (a) přípravu řady přesahujících se dvouřetězcových fragmentů donorové DNA, které společně kódují daný polypeptid; (b) přípravu dvouřetězcového, lineárního akceptorového plazmidu, který má první a druhý konec tupý a obsahuje selekční markér a replikační sekvenci, která je funkční v Saccharomyces cerevisiae, kde akceptorový plazmid je v podstatě bez DNA kódující daný polypeptid; (c) příprava prvního dvouřetězcového DNA linkeru, který obsahuje první segment v sekvenci identický s první oblastí akceptorového plazmidu a druhý segment v sekvenci identický s první oblastí jednoho z fragmentů donorové DNA, kde délka každého z prvních a druhých segmentů prvního linkeru je alespoň 0 bp; (d) příprava druhého dvouřetězcového DNA linkeru, který obsahuje první segment v sekvenci identický s druhou oblastí akceptorového plazmidu a druhý segment v sekvenci identický s oblastí jiného fragmentu donorové DNA, kde délka každého z prvních a druhých segmentů druhého linkeru je alespoň lObp; a (e) kombinování fragmentu donorové DNA, akceptorového plazmidu, prvního DNA linkeru a druhého DNA linkeru v hostitelské buňce Saccharomyces cerevisiae, kde fragmenty donorové DNA jsou spojeny s akceptorovým plazmidem homologní rekombinací za vzniku uzavřeného kruhového plazmidu, který obsahuje oblast kódující daný polypeptid. Akceptorový plazmid dále obsahuje jeden nebo více transkripčních promotorů, segment DNA kódující vedoucí peptid a jeden nebo více segmentů DNA kódující peptid tag, jak se popisuje shora v textu.

Buňky hub, které zahrnují buňky kvasinek a zvláště buňky rodu Saccharomyces nebo Pichia jsou výhodné jako hostitelské buňky pro produkci fragmentů z FGF-5 nebo polypeptidových fúzí.

Jiné metody transformace kvasinkových buněk exogenní DNA a produkce rekombinantních polypeptidů se popisují například v publikacích Kawasaki, patent US 4 599 311; Kawasaki et al.,

- 16CZ 299288 Β6 patent US 4 931 373; Brake, patent US 4 870 008; Welch et al., patent US 5 037 743; a Murray et al., patent US 4 845 075. Transformované buňky se vybraly stanovením fenotypu na základě selekčního markéru, v běžném případě jde o rezistenci na léky nebo schopnost růstu v nepřítomnosti nutrientu (například leucinu). Alternativním preferovaným vektorovým systémem pro případ použití v kvasinkách je vektorový systém POTÍ, který popisuje Kawasaki et al. (patent US

931 373), který umožňuje, aby se transformované buňky vybraly na základě růstu v médiu, které obsahuje glukózu. Vhodné promotory a terminátory při použití v kvasinkách zahrnují ty, které pochází z genů glykolytických enzymů (popisují se například v publikacích Kawasaki et al., patent US 4 599 311; Kingsman et al., patent US 4 615 974; a Bitter, patent US 4 977 092) a z genů dehydrogenázy alkoholu (popisuje se v publikacích US 4 990 446; US 5 063 154; US

139 936 a US 4 661454. Transformační systémy jiných kvasinek zahrnují Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia guillermondii a Candida maltosa. Zvláště preferovaný systém využívá Pichia methanolica (popisuje se v publikaci přihláška PCT WO 9717450). Alternativní transformační systémy se popisují například v publikacích Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 a Cregg, patent US 4 882 279. Buňky Aspergillus se mohou využívat podle metod popsaných v publikacích McKnight et al., patent US 4 935 349. Metody transformace Acremonium chrysogenum se popisují v publikaci Sumino et al., patent US 5 162 228. Metody transformace Neurospora se popisují v publikaci Lambowitz, patent US 4 486 533.

Vynález také preferuje použití kultivovaných savčích buněk. Metody zavedení exogenní DNA do savčích hostitelských buněk zahrnují transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým (Wigler et al.. Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporaci (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982), transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem (Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987) a transfekci zprostředkovanou lipozomy (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993). Produkce rekombinantních polypeptidů v kultivovaných savčích buňkách se popisuje například v publikaci Levinson et al., patent US 4 713 339; Hagen et al., patent US 4 784 950; Palmiter et al., patent US 4 579 821; a Ringold, patent US 4 656 134. Preferované kultivované savčí buňky zahrnují buňky COS-1 (ATCC č. CRL 1650), COS-7 (ATCC ě. CRL1651), BHK 570 (ATTC č. CRL 10314), 293 (ATCC č. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) a buněčné linie zvaječníků čínských křečků (například CHO-K1; ATCC č. CCL 61). V oboru jsou známy vhodné buněčné linie a jsou dostupné ve veřejných sbírkách, jako je American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Preferují se silné transkripční promotory, jako jsou promotory pocházející z SV—40 nebo cytomegalovirů (popisují se například v publikacích patent US 4 956 288). Jiné vhodné promotory zahrnují ty, které pocházejí z genů pro metallothionein (US 4 579 821 a US 4 601 978) a hlavní pozdní promotor adenovirů.

Výběr podle rezistence na určitý lék se obecně používá při selekci kultivovaných savčích buněk, do kterých se zavedla cizorodá DNA. Takové buňky se běžně nazývají transfektanty. Buňky, které se kultivují v přítomnosti selekčního činidla a jsou schopny přenést daný gen do svého potomstva, se nazývají „stabilní transfektanty“. Preferovaným selekčním markérem je gen kódující rezistenci na antibiotikum neomycin. Selekce probíhá v přítomnosti léku typu neomycinu, jako je G^U8 nebo podobného typu. Selekční systémy se mohou také použít, aby došlo k zesílení exprese daného genu, tento proces se nazývá „amplifíkace“. Amplifíkace se provádí kultivací transfektantů v přítomnosti malého množství selekčního činidla, pak se množství selekčního činidla zvyšuje a dochází k selekci buněk, které produkují velké množství produktů zavedeného genu. Preferovaný amplifikovatelný selekční markér je dihydrofolátová reduktáza, která nese rezistenci na mototrexát. Mohou se použít i jiné geny kódující rezistenci na lék (jsou to například rezistence na hygromycin, rezistence na více léků, acetyltransferáza puromycinu).

Jako hostitelé se mohou používat další buňky vyšších eukaryocytů, patří sem hmyzí buňky, rostlinné buňky a ptačí buňky. Transformace hmyzích buněk a produkce cizorodých peptidů se

- 17CZ 299288 B6 popisuje v publikacích Gaurino et al., patent US 5 162 222; Bang et al., patent US 4 775 624; a přihláška WIPO WO 94/06463. Použití organizmu Agrobacterium rhizogenes jako expresivního vektoru v rostlinných buňkách se popisuje v publikaci Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987).

Transformované nebo transfekované hostitelské buňky se kultivují běžnými postupy v kultivačním médiu, které obsahuje nutrienty a jiné komponenty nutné pro růst vybraných hostitelských buněk. V oboru je známa řada vhodných médií, kam patří definovaná média a komplexní média, která zahrnují zdroj uhlíku, dusíku, základních aminokyselin, vitaminů a minerálů. Médium může také obsahovat takové komponenty, jako jsou růstové faktory nebo sérum, podle toho, co je nutné. Růstové médium bude selektovat buňky obsahující exogenně přidanou DNA na základě rezistence na lék nebo nedostatečnosti podstatného nutrientu, což se doplňuje selekčním markérem, který nese expresivní vektor neboje ko-transfekován do hostitelské buňky.

Exprimované rekombinantní polypeptidy zFGF-5 (nebo chimémí polypeptidy zFGF-5) se mohou čistit za použití dělení a/nebo běžných metod čištění a pomocí média. Pro dělení vzorků se může použít precipitace sulfátem amonným a kyselá nebo chaotropní extrakce. Příklady kroků čištění zahrnují hydroxyapatit, dělení na základě velikosti, FPLC a vysokotlakou kapalinovou chromatografií s obrácenými fázemi. Vhodná média pro výměnu aniontů zahrnují derivatizované dextrany, agarózu, celulózu, polyakrylamid, oxid křemičitý a podobně. Preferují se deriváty PEI, DEAE, QAE a Q, zvláště se preferuje systém DEAE Fast-FLOW Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Příklady chromatografických médií zahrnují ta média, která se derivatizovala fenylovou, butylovou nebo oktylovou skupinou, jako je fenyl-sefaróza FF (Pharmacia), Toyopearlbutyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) a podobně; nebo polyakrylové pryskyřice, jako je Amberchrom CG 71 (Toso Haas) a podobně. Vhodné pevné nosiče zahrnují skleněné částice, pryskyřice na bázi oxidu křemičitého, pryskyřice na bázi celulózy, částice agarózy, zesíťované částice agarózy, polystyrénové částice, zesíťované polyakrylamidové pryskyřice a podobně. Tyto nosiče jsou nerozpustné za podmínek, při kterých se používají. Tyto nosiče se mohou modifikovat reaktivními skupinami, které umožňují navázání proteinů na aminoskupiny, karboxylové skupiny, sulfylhydrylové skupiny, hydroxylové skupiny a/nebo sacharidové části. Příklady kondenzační chemie zahrnují bromkyanovou aktivaci, N-hydroxysukcinimidovou aktivaci, epoxidovou aktivaci, sulfhydrylovou aktivaci, hydrazidovou aktivaci a karboxylové a aminoderiváty v případě karbodiimidové kondenzační chemie. Tato a jiná pevná média se široce používají v oboru a jsou běžně dostupná u firem. V oboru jsou dobře známy metody navázání receptorových polypeptidů na podpůrná média. Volba určité metody je věc rutinní práce a je částečně určena vybraným nosičem (popisuje se například v publikaci Affinity Chromatography: Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.

Polypeptidy podle vynálezu se mohou izolovat využitím jejich schopností vázat heparin (popisuje se například v publikacích Burgess et al., Ann. Rev. Of Biochem. 58: 575-606, 1989). Členové rodiny FGF se mohou čistit do dosažení zjevné homogenity heparin-sefarózovou afinitní chromatografií (Gospodarowicz et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 81: 6063-6967, 1984) aeluovaly se lineárním postupným gradientem NaCl (Ron et al., J. Biol. Chem. 268(4): 2984-2988, 1993; Chromatography: Principles and Medthods, pp. 77-80, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1993; v „Immobilized Affinity Ligand Techniques,“ Hermanson et al., eds., pp. 165-167, Academie Press, San Diego, 1992; Kjellen et al., Ann. Rev. Biochem. 60: 443-474, 1991; a Ke et al., Protein Expr. Purif. 3(6): 497-507, 1992).

Jiné metody čištění zahrnují použití chromatografie založené na adsorpci na imobilizovaném iontu kovu (IMAC) pro čištění proteinů bohatých na histidin. Gel je nejdříve nabit divalentními kovovými ionty za vzniku chelátu (popisuje se v publikaci E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 17, 1985). Proteiny bohaté na histidin se budou adsorbovat na tuto matrici různou afinitou, v závislosti na použitém kovovém iontu budou se eluovat kompetitivní eluci, snížením pH nebo použitím silných chelatacních činidel. Jiné metody čištění zahrnují čištění glykosylováných

-18CZ 299288 B6 proteinů lektinovou afinitní chromatografií a chromatografií s výměnou iontů (popisuje se v publikaci Methods in Enzymol., Vol. 182, „Guide to Protein Purification,“ M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp 529-39). V jiném případě se může provést fúze daného polypeptidu a afinitního tag (například polyhistidin, protein vázající maltózu, oblast imunoglobulinu), což také umožňuje čištění.

S výhodou se také mohou použít postupy znovu zabalení proteinu (a také re-oxidace). Preferuje se čištění proteinu až do dosažení čistoty >80%, více se preferuje >90%, nejvíce se preferuje >95%, zvláště se preferuje farmaceuticky čistá látka, kde čistota s ohledem na kontaminující makromolekuly, zvláště na jiné proteiny a nukleové kyseliny je vyšší než 99,9% a neobsahuje infekční a pyrogenní činidla. Upřednostňuje se, aby izolovaný protein neobsahoval jiné proteiny, zvláště proteiny, které pocházejí ze zvířat. Polypeptidy zFGF-5 nebo jejich fragmenty se také mohou připravit chemickou syntézou. Polypeptidy zFGF-5 mohou být monomery nebo multimery; mohou být glykosylované nebo neglykosylované; pegylované nebo nepegylované a mohou nebo nemusí zahrnovat iniciační aminokyselinový zbytek metioninu.

Aktivita molekul podle vynálezu se může měřit použitím různých testů, které například měří neogenezi nebo hyperplazii (to znamená proliferaci) kardiálních buněk založených na tkáňové specifitě srdce dospělých jedinců. Další aktivity, které jsou pravděpodobně spojeny s polypeptidy podle vynálezu, zahrnují proliferaci endoteliálních buněk, kardiomyocytů, fibroblastů, myocytů skeletu a to buď přímo nebo nepřímo prostřednictvím jiných růstových faktorů; působení faktoru chemotaxe endoteliálních buněk, fibroblastů a/nebo fagocytů; osteogenní faktor; a faktor rozšiřování mesenchymálních kmenových buněk a prekurzorových populací.

Proliferaci je možno změřit za použití kultivovaných kardiálních buněk nebo in vivo aplikací molekul podle vynálezu do vhodného zvířecího modelu. Proliferační účinky je možné vidět, jako zvýšený počet buněk a proto mohou zahrnovat inhibici apoptózy, stejně jako mitogenezi. Kultivované buňky zahrnují kardiální fibroblasty, kardiální myocyty, myocyty skeletu, lidské endoteliální buňky umbilikální žíly z primárních kultur. Vytvořené buněčné linie zahrnují: fibroblasty NIH 3T3 (ATCC No. CRL-1658), srdeční buňky CHH-1 (ATCC No. CRL-1680), myoblasty srdce krys H9c2 (ATCC No. CRL-1446), buňky karcinomu prsní žlázy Shinogi (popisují se v publikaci Tanaka et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 89: 8928-8932, 1992) a buňky adenokarcinomu LNCap.FGC (ATCC No. CRL-1740). Testy měření proliferace buněk jsou dobře známy v oboru. Uvedené testy zahrnují například chemosenzitivitu k barvivu, kterým je neutrální červeň, popisuje se v publikaci Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990), začlenění radioaktivně značených nukleotidů (popisuje se v publikaci Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989), začleněním 5-bromo-2'-deoxyuridinu (BrdU) do DNA proliferujících buněk (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82: 169-79, 1985) a použití tetrazoliových solí (popisuje se v publikaci Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall et al., Growth Req. 5: 69-84, 1995; a Scudiero et al., Cancer Res. 48: 4827 4833, 1988).

Diferenciace je progresivní a dynamický proces, který začíná u pluripotentních kmenových buněk a končí terminálně diferenciovanými buňkami. Pluripotentní kmenové buňky, které se mohou regenerovat, aniž zůstanou věrné expresi sady diferenciačních markérů linie, které ztrácí, jsou-li diferenciovány do jiné buněčné linie. Progenitorové buňky exprimují sadu diferenciačních markérů, které mohou nebo nemusí být dále exprimovány, jak buňky procházejí cestou zrání buněk určité buněčné linie. Diferenciační markéry, které exprimují pouze zralé buňky, jsou obvykle funkčními vlastnostmi, jako jsou buněčné produkty, enzymy nutné pro produkci buněčných produktů a receptory. Stadium diferenciace buněčné populace se monitoruje identifikací markérů přítomných v buněčné populaci. Věří se, že myocyty, osteoblasty, adipocyty, chrondrocyty, fibroblasty a retikulámí buňky pochází z běžných mezenchymálních kmenových buněk (popisuje se v publikaci Owen et al., Ciba Fdn. Symp. 136: 42^16, 1988). Markéry mezenchymálních kmenových buněk nejsou dobře identifikovány (Owen et al., J. of Cel Sci. 87: 731-738, 1987), proto se identifikace obvykle provádí ve fázi progenitorové buňky nebo ve fázi

- 19CZ 299288 B6 zralé buňky. Spekuluje se o existenci ranného stadia kardiálních myocytových progenitorových buněk (často jsou nazývány kardiální myocytové kmenové buňky), ale nikdy nebyla dokázána jejich přítomnost v srdeční tkáni dospělých jedinců. Nové polypeptidy podle vynálezu se mohou použít při studiu izolace mezenchymálních kmenových buněk a kardiálních myocytových progenitorových buněk, jak in vivo tak ex vivo.

Existuje důkaz, který naznačuje faktory které stimulují specifické buněčné typy při průchodu cestou směrem k terminální diferenciaci nebo k dediferenciaci ovlivňují celou buněčnou populaci pocházející z běžných prekurzorových a kmenových buněk. Vynález tak popisuje stimulaci inhibice nebo proliferace myocytů, buněk hladkého svalstva, osteoblastů, adipocytů, chrondrocytů a endoteliálních buněk. Molekuly podle vynálezu mohou, zatímco stimulují proliferaci nebo diferenciaci kardiálních myocytů, inhibovat proliferaci nebo diferenciaci adipocytů prostřednictvím účinku na jejich běžné prekurzorové/kmenové buňky. Takové molekuly podle vynálezu se mohou použít při inhibici chondrosarkomů, aterosklerózy, restenózy a obezity.

Testy stanovení diferenciace zahrnují například měření povrchových buněčných markérů spojených s expresí tkáně, která je specifická pro stadium vývoje buňky, dále měření enzymatické aktivity, funkční aktivity nebo morfologických změn (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Res, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989).

Testy in vivo pro vyhodnocení kardiální neogeneze nebo hyperplazie zahrnuje léčbu neonatálních a dospělých krys, kterým se aplikují molekuly podle vynálezu. Kardiální funkce zvířete se měří podle velikosti srdce, krevního tlaku a kardiálního výstupu za účelem stanovit zbývající ventrikulární funkci. Metody pro stanovení zlepšení funkce srdce po usmrcení zahrnují: zvýšení hmotnosti srdce, objem jádra/cytoplazmy, barvení kardiálních histologických vzorků za účelem stanovení jaderného antigenu proliferujících buněk. (PCNA) versus množství cytoplazmatického aktinu (Quaini et al., Circulation Res. 75: 1050-1063, 1994 a Reiss et all., Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 8630-8635, 1996).

Testy in vivo pro měření změn v rychlosti tvoření kostí zahrnují provedení histologie kostí (popisuje se v publikaci Recker, R., eds. Bone Histomorphometíy: Techniques and Interpretation. Boča Raton: CRC Press, lne., 1983) a kvantitativní tomografii (QCT; popisuje se v publikaci Ferretti, J., Bone 17: 353S-364S, 1995; Orphanoludakis et al., Investiq. Radiol. 14: 122-130, 1979 a Durand et al., Medical Physics 19: 569-573, 1992). Test ex vivo pro měření změn ve tvoření kostí je například kalavariální test (Gowen et al., J. Immunol. 136: 2478-2482, 1986).

S ohledem na rovnováhu modulační energie, zvláště jestli se vztahuje k metabolizmu, proliferaci a diferenciaci adipocytů, polypeptidy zFGF-5 modulují účinky metabolických reakcí. Takové metabolické reakce zahrnují adipogenezi, glukoneogenezi, glykogenolyzi, lipogenezi, příjem glukózy, syntézu proteinů, termogenezi, využití kyslíku a podobně. Mezi jinými metodami známými v oboru nebo popsanými zde v textu se rovnováha energie u savců může hodnotit monitorováním jedné nebo více dříve uvedených metabolických funkcí. Tyto metabolické funkce se monitorují metodami (testy nebo zvířecí modely), které jsou v oboru dobře známy a popisují se dále v textu. Glukoregu lační účinky inzulínu se například převážně uplatňují v játrech, ve svalech skeletu a při adipóze tkáně, přičemž inzulín ovlivňuje stimulaci příjmu, ukládání a využití glukózy.

V oboru jsou známy metody pro monitorování všech shora uvedených metabolických funkcí. Odborník je tedy schopný zhodnotit metabolické modulační funkce polypeptidů zFGF-5, fragmentů, fúzních proteinů, protilátek, agonistů a antagonistů. Příklady modulačních metod jsou uvedeny dále v textu.

Inzulínem stimulovaná lipogeneze může například monitorovat měření inkorporace ¹⁴C-acetátu do triglyceridu (Mačkal et al. J. Biol. Chem. 251: 6462-6464, 1976) nebo akumulaci triglyceridu (Kleitzien et al., Mol. Pharmacol. 41: 393-398, 1992).

-20CZ 299288 B6

Příjem stimulovaný zFGF-5 se může vyhodnotit například testem transportu glukózy stimulovaným inzulínem. Primární adipocyty nebo buňky NIH 3T3 LI (ATCC No. CCL-92.1) se umístily do DMEM, které obsahuje 1 g/1 glukózy, 0,5 nebo 1,0 % BSA, 20 mM Hepes a 2 mM glutamin. Po dvou až pěti hodinách kultivace se médium nahradilo čerstvým DMEM, které neobsahuje glukózu, ale obsahuje 0,5 nebo 1,0 % BSA, 20 mM Hepes, 1 mM pyruvát a 2 mM glutamin. Přidaly se vhodné koncentrace zFGF-5, inzulínu nebo IGF—I nebo série ředění testovací substance a buňky se inkubovaly dalších 20 až 30 minut. Přidala se deoxyglukóza značená Ή nebo ^l4C, aby konečná koncentrace byla 1M a buňky se inkubovaly přibližně 10 až 30 minut. Buňky se pak rychle promyly chlazeným pufrem (např. PBS), pak se lyžovaly vhodným lyzačním činidlem (např. 1% SDS nebo 1 N NaOH). Buněčný lyzát se pak vyhodnotil na scintilačním počítači. Radioaktivita spojená s buňkami je míra transportu glukózy po odečtení nespecifického navázání, jak se stanovilo inkubací buněk v přítomnosti cytocholasinu B, který je inhibitor transportu glukózy. Jiné metody zahrnují ty, které se popisují například v publikacích Manchester st al., Am. J. Physiol. 266 (Endokrínol. Metab. 29): E326-E333, 1994 (transport glukózy stimulovaný inzulínem).

Syntéza proteinu se může zhodnotit například porovnáním precipitace proteinů značených ’⁵S-methiononem, která následuje po inkubaci testovaných buněk s ^>5S-methiononem a ³⁵S-methiononem a putativním modulátorem syntézy proteinu.

Termogeneze se může vyhodnotit tak, jak se popisuje v publikaci B. Stanley in The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers and C. Wahlestedt (eds.), Human Press. Ottawa, 1993, pp. 457-509; C. Billington et al., Am. J. Physiol. 260: R321, 1991; N. Zarjevski et al., Endocrinology 133: 1753, 1993; C. Billington et al., Am. J. Physiol. 266: R1765, 1994; Heller et al., Am. J. Physiol. 252 (2 Pt 2): R661-7, 1987; a Heller et al., Am. J. Physiol. 245(3): R321-8, 1983). Také rychlost metabolizmu, kterou je možné měřit různými způsoby, je možné považovat za nepřímé měření termogeneze.

Využití kyslíku se může vyhodnotit způsobem, který se popisuje v publikaci Heller et al., Pflugers Arch 369(1): 55-9, 1977. Tato metoda také zahrnuje analýzu hypotalmické teploty a produkci metabolického tepla. Využití kyslíku a termoregulace se také hodnotilo u lidí, jak se popisuje v publikaci Haskell et al., J. Appl. Physiol. 51(4): 948-54, 1981.

Polypeptidy zFGF-5 se také mohly použít pro přípravu protilátek, které se specificky váží na epitopy zFGF-5, peptidy nebo polypeptidy. Metody přípravy polyklonálních a monoklonálních protilátek jsou dobře známy v oboru (popisují se například v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; a Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, lne., Boča Raton, FL, 1982. Pro odborníka je zřejmé, že polyklonální protilátky se mohou generovat z různých teplokrevných zvířat, jako jsou koně, krávy, kozy, ovce, psi, kuřata, králíci, myši a krysy.

Imunogenicita polypeptidu zFGF-5 se může zvýšit použitím adjuvans, jako je hydroxid hliníku nebo Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans. Polypeptidy použitelné při imunizaci také zahrnují fúzní polypeptidy, jako jsou fúze zFGF-5 nebo jeho část s polypeptidem imunoglobulinu nebo s proteinem vázající maltózu. Imunogen polypeptidu je molekula v plné délce nebo její část. Jestliže část polypeptidu je podobná haptenu, taková část může být s výhodou za účelem imunizace připojena na makromolekulámí nosič (takový jako je „keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovinní sérový albumin (BSA) nebo toxoid tetanu).

Termín „protilátky“ zahrnuje polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a fragmenty vázající protilátky, jako jsou proteolytické fragmenty F(ab')₂ a Fab. Geneticky manipulované intaktní protilátky nebo fragmenty, jako jsou chimérické protilátky, Fv fragmenty, jednořetězcové protilátky, stejně jako syntetické peptidy nebo polypeptidy vázající antigen. Ne-lidské protilátky

-21 CZ 299288 B6 se mohou „polidštit“ přenesením pouze zvířecího CDR do lidského frameworku a konstantních oblastí nebo začleněním celých zvířecích variabilních domén („zamaskovat“ je povrchem, který je podobný lidskému tím, že se nahradí exponované zbytky, výsledkem jsou „maskované“ protilátky). V některých případech si polidštěné protilátky mohou zachovat nelidské zbytky v lidských variabilních oblastech frameworkových domén, aby se zesílily vhodné vazebné charakteristiky. Prostřednictvím polidštěných protilátek se může zvýšit biologický poločas rozpadu a může se redukovat potenciál pro nepříznivé imunitní reakce při aplikaci na lidech. Alternativní metody generace nebo selekce protilátek podle vynálezu zahrnují in vitro expozici lymfocytů k proteinu zFGF-5 nebo peptidu a selekci fágových knihoven, které nesou protilátky ío nebo podobné vektory (například prostřednictvím použití imobilizovaného nebo značeného zFGF-5 proteinu nebo peptidu).

Protilátky se definují, jako specificky se vázající, jestliže se váží na zFGF-5 polypeptid s vazebnou afinitou (hodnota K_a je 10⁶ M ¹ nebo větší, upřednostňuje se hodnota 1Ό⁷ M^_l, více se upřednostňuje hodnota 10⁸ M ¹ nebo větší a nejvýhodnější je hodnota 10⁹ M¹ nebo větší. Odborník může snadno stanovit vazebnou afinitu protilátek (například Scatchardovou analýzou).

Při detekci protilátek, které se specificky váží na proteiny zFGF-5 nebo peptidy, se může využít řada testů známých v oboru. Příklady uvedených testů se popisují detailněji v publikaci

Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lané (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentativní vzorky takových testů zahrnují: konkurenční imunoelektroforézu, radioimunotest, radioimunoprecipitaci, test ELISA, dot blot nebo westemův přenos, inhibiční nebo kompetiční test a sendvičový test. Navíc se u protilátek může testovat schopnost navázání na divoký typ versus mutantní zFGF-5 protein nebo peptid.

Protilátky proti zFGF-5 se mohou použít při definování buněk, které exprimují zFGF-5; při cíleném vnesení jiného proteinu, malé molekuly nebo chemikálie do srdeční tkáně; při izolaci zFGF-5 afínitním čištěním; při diagnostických testech pro stanovení cirkulujícího množství polypeptidů zFGF-5; při detekci nebo kvantifikaci rozpustného zFGF-5, jako markéru patologického jevu nebo onemocnění; při analytických metodách, které používají FACS; při testování expresivních knihoven; při tvoření anti-idiotypických protilátek; a jako neutralizující protilátky nebo jako antagonisty při zablokování proliferace in vivo nebo in vitro zprostředkované zFGF-5. Vhodné přímé tag nebo značkovací činidla zahrnují radionuklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemiluminiscenční markéry, magnetické partikule a podobně;

nepřímé tag nebo značkovací činidla mohou být biotin-avidin nebo jinp páry komplement/antikomplement. Protilátky se také mohou přímo nebo nepřímo spojovat s léky, toxiny, radionuklidy a podobně a tyto konjugáty se mohou použít při in vivo diagnostických nebo terapeutických aplikacích.

Molekuly podle vynálezu se mohou použít při identifikaci a izolaci receptorů, které se podílejí na kardiální myokardiální proliferací. Proteiny a peptidy podle vynálezu se mohou imobilizovat na koloně a membránové přípravky se ženou přes kolonu (popisuje se například v publikaci Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al., eds., Academoc Press, San Diego, CA, 1992, pp. 195-202). Proteiny a peptidy se mohou také radioaktivně značit (popisuje se v publikaci Methods in enzymol., vol. 182, „Guide to Protein Purification“, M. Deutscher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737) nebo na základě fotoafinity (popisuje se v publikaci Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993 a Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33: 1167-1180, 1984) a mohou se identifikovat specifické buněčné povrchové proteiny.

Antagonisté se mohou použít při inhibicí proliferačních aktivit molekul zFGF-5 v typech buněk, jako jsou kardiální buňky, které zahrnují myocyty, fibroblasty a endoteliální buňky; osteoblasty a chondrocyty. Gen, který kóduje vazebnou oblast polypeptidů zFGF-5, lze získat testováním náhodných knihoven peptidu vytvořených prostřednictvím fága nebo v bakteriích, jak jsou E. coli. Nukleotidové sekvence kódující polypeptidy se mohou získat mnoha způsoby, jako například prostřednictvím náhodné mutageneze a náhodné syntézy polynukleotidů. Tyto náhodné

- 22 CZ 299288 Β6 knihovny vykazující peptidy se mohou použít pro testování peptidů, které interagují s cílem, který může být protein nebo polypeptid nebo syntetická makromolekula nebo organické nebo anorganické látky. Metody tvoření a testování takových náhodných knihoven vykazující peptidy jsou dobře známy v oboru (popisuje se například v publikaci (Lander et al., patent US 5 223 409; Ladner et al., patent US 4 946 778; Ladner et al., patent US 5 403 484 a Ladner et al., patent US 5 571 698) a náhodné knihovny vykazující peptidy a kity pro testování takových knihoven jsou běžně dostupné. Je možné je získat například od firmy Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen lne., (San Diego, CA) New England Biolabs, lne. (Beverly, MA) a Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ). Za účelem identifikace proteinů, které se váží na zFGF-5, se náhodné knihovny mohou testovat za použití zde popsaných sekvencí zFGF-5. Tyto „vazebné proteiny“, které interagují s polypeptidy zFGF-5 se mohou použít pro testování buněk, zda nesou inzert; pro izolaci homologních polypeptidů afinitním čištěním; mohou se přímo nebo nepřímo navázat na léky, toxiny, radionuklidy a podobně. Tyto vazebné proteiny se také mohou použít při analytických metodách, jako je testování expresivních knihoven a neutralizační aktivity. Vazebné proteiny se mohou také použít při diagnostických testech při stanovení množství cirkulujících polypeptidů; pro detekci a kvantifikaci rozpustných polypeptidů, jako markéru existujícího patologického stavu nebo onemocnění. Tyto vazebné proteiny mohou také působit jako antagonisté zFGF-5 k zablokování zFGF-5 vazebné a transdukce in vitro a in vivo. Uvedené antizFGF-5 vazebné proteiny se mohou použít pro inhibici exprese genů, které vedou k proliferaci nebo diferenciaci. Takové anti-zFGF-5 vazebné proteiny se mohou použít pro samotnou léčbu například rabdomyosarkomu, kardiálního myxomu, rakoviny kostí pocházející z osteoblastů a nanismu, artritidy, léčby vazu a chrupavek, nebo v kombinaci s jinou léčbou.

Molekuly podle vynálezu se mohou použít při proliferaci buněk kardiální tkáně, jako jsou kardiální myocyty nebo myoblasty; myocyty skeletu nebo myoblasty a buňky hladkého svalstva; chrondrocyty; endoteliální buňky; adipocyty a osteoblasty in vitro. Molekuly podle vynálezu se mohou například použít jako komponenty definovaného média pro kultivaci buněk a mohou se použít samotné nebo v kombinaci s jinými cytokiny a hormony, aby se nahradilo sérum, které se běžně používá při kultivaci buněk. Molekuly podle vynálezu se mohou zvláště použít při specifické podpoře růstu a/nebo vývoje myocytů v kultuře a mohou se také použít při studiu hyperplazie a regeneraci kardiálních myocytů.

Polypeptidy, nukleové kyseliny a/nebo protilátky podle vynálezu se mohou použít při léčbě onemocnění spojených s infarktem myokardu, městnavé srdeční selhání, hypertrofní kardiomyopatie a rozšířená kardiomyopatie. Molekuly podle vynálezu se mohou použít při omezování síly infarktu, který následuje po srdečním záchvatu, podporu angiogeneze a hojení ran po angioplastice nebo endarterektomii, za vzniku koronární kolaterální cirkulace, při revaskularizaci v očích, při komplikacích spojených se slabou cirkulací, jako jsou diabetické vředy na nohou, při mozkové příhodě, následující koronární reperfúzí za použití farmakologických metod a při jiných indikacích, kde je výhodná angiogeneze. Molekuly podle vynálezu se mohou použít za účelem zlepšení kardiální funkce, ať už jde o neogenezi kardiálních myocytů a/nebo hyperplazii tím, že se indikuje koronární kolaterální formace nebo indukcí remodelování nekrotické myokardiální oblasti. Jiné terapeutické použití podle vynálezu zahrnuje indukci neogeneze svalů skeletu a/nebo hyperplazii, regeneraci ledvin a/nebo léčbu systémové a pulmonámí hypertenze.

U králíků, psů a prasat za použití modelů chronické koronární okluze (Fandau et al., Amr. Heart. J. 29: 924-931, 1995; Sellke et al., Surgery 120(2): 182-188, 1996 a Fazarous et al., et al., Circulation 94: 1074-1082, 1996) se měřil koronární kolaterální vývoj indukovaný polypeptidem zFGF-5. Zdaje výhodné použít zFGF-5 pro léčbu mozkové mrtvice se testovalo in vivo u krys za využití bilaterální karotidové arteriámí okluze a měření histologických změn (popisuje se v publikaci Gage et al., Neurobiol. Aging 9: 645-655, 1988). Účinnost zFGF-5 při hypertenzi se testovala in vivo využitím krys s vysokým tlakem (SHR) (popisuje se v publikaci (Marche et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 1: Sl 14-116, 1995).

-23CZ 299288 B6

Molekuly podle vynálezu se mohou použít při cílovém zavedení činidel nebo léků do srdce. Například molekuly podle vynálezu se mohou použít pro omezení exprese do srdce prostřednictvím tkáňové specifické exprese řízené promotorem zFGF-5. Pro srdce specifické exprese se může dosáhnout použitím zFGF-5-adenovirové discitronické konstrukce (Rothmann et al., Gene Therapy 3: 919-926, 1996). Navíc polypeptidy zFGF-5 se mohou použít pro omezení působení dalších činidel nebo léků na srdeční tkáň spojením polypeptidů zFGF-5 s jiným proteinem (Franz et al., Circ. Res. 73: 629-638, 1993). První molekula, která obsahuje homolog polypeptidů zFGF-5, se spojí s druhým činidlem nebo lékem za vzniku chiméry. Ke vzniku chimér obsahujících molekuly zFGF-5 podle vynálezu se mohou použít proteiny například protilátky (Narula et al., J. Nucl.. Cardiol. 2: 26-34, 1995). Příklady činidel a léků zahrnují, ale nejsou omezeny na bioaktivní polypeptidy, geny, toxiny, radionuklidy, farmaceutika s malými molekulami a podobně. Spojení může být přímé nebo nepřímé (např. lipozomy) a může kněmu dojít rekombinací, chemickou cestou, silnou nekovalentní interakcí a podobně.

V jednom provedení vynálezu se používá kompozice obsahující protein zFGF-5 jako terapeutické činidlo, za účelem zesílení tvorby kostí zprostředkované osteoblasty. Kompozice a metody za použití kompozic podle vynálezu se mohou aplikovat za účelem podpory hojení defektů kostí, jako jsou uzavřené a otevřené fraktury; podpory hojení kostí při plastické chirurgii; při stimulaci vrůstání kostí do necementovaných prostetických kloubů a dentálních implantátů; při léčbě periodontálního onemocnění a defektů; k zesílení tvorby kostí během distrakce osteogeneze; a při léčbě poruch stavby skeletu, při které se může stimulovat aktivita osteoblastů, jako je osteoporéza a artritida. Tvoření kostí de novo, které probíhá za použití metod podle vynálezu, se může použít při terapii kongenitálních, onkologických resekcí kostí nebo při léčbě osteonekrózy kostí, kteráje indukována radiací (Hart et al., Cancer 37: 2580-2585, 1976). Metody podle vynálezu se také mohou uplatnit v plastické chirurgii.

Při použití proteinů jako farmaceutických činidel jsou proteiny podle vynálezu vhodné pro parenterální, zvláště intravenózní nebo podkožní aplikaci v souladu s běžnými metodami. Intravenózní aplikace se provádí injekcí velké dávky nebo infuzí po dobu jedné až několika hodin.

V obecném případě farmaceutické kompozice budou zahrnovat protein zFGF-5 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem, jako je fyziologický roztok, 5% dextróza ve vodě nebo podobně. Aby se předcházelo ztrátě proteinů na povrchu zkumavek, může formulace dále zahrnovat jeden nebo více excipientů, konzervační činidla, rozpouštědla, pufrovací činidla, albumin, atd. Metody přípravy formulací jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci RemingtoďsPharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990. Terapeutické dávky se budou pohybovat v rozmezí 0,1 až 100 pg/kg tělesné hmotnosti pacienta za den, upřednostňuje se 0,5 až 20 pg/kg tělesné hmotnosti pacienta za den. Přesnou dávku určuje lékař podle přijatých standardů, přičemž zohledňuje podstatu a hloubku stavu, který je léčen, povahu pacienta atd. Stanovení dávky je v souladu se standardními dovednostmi v oboru. Proteiny se mohou aplikovat při akutní léčbě po dobu jednoho týdne nebo méně, často po dobu jednoho až tří dní nebo se mohou použít při léčbě chronických onemocnění po dobu několika měsíců nebo let. V obecném případě terapeuticky účinné množství polypeptidů zFGF-5 je množství dostatečné k produkci klinicky podstatných změn při proliferaci myocytů, funkce srdce, při tvorbě kostí nebo při zvýšení počtu specifických typů buněk spojených s mezenchymálními kmenovými buňkami a progenitory myocytů, osteoblastů a chondrocytů. Klinicky podstatné zvýšení počtu myocytů nebo progenitorových buněk myocytů se může stanovit měřením zbylé ventrikulámí ejekční frakce před a po aplikaci molekul zFGF-5. Při aplikaci celé ejekční frakce by mělo dojít alespoň k 5%, s výhodou k 10% a vyššímu zvýšení. Testy pro stanovení ejekční frakce jsou dobře známy v oboru.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 a č. 2 zobrazuje uspořádání faktoru 1, který je homologem lidského fibroblastového růstového faktoru (FHF-1), faktoru aktivující lidské myocyty (FGF-10), faktor 4, který je

-24CZ 299288 B6 homologem lidského fibroblastového růstového faktoru (FHF-4), faktor 2, který je homologem lidského fibroblastového růstového faktoru (FHF-2), faktor 3, který je homologem lidského fibroblastového růstového faktoru (FHF-3), lidský FGF-4, lidský FGF-6, lidský FGF-2 (bazický), lidský FGF-1 (kyselý), lidský keratinocytový růstový faktor 2 (FGF-2), prekurzor lidského keratinocytového růstového faktoru 2 (FGF-7), lidský zFGF-5, lidský FGF-8, lidský FGF-5, lidský FGF-9 a lidský FGF-3. „*“ označuje konzervativní aminokyseliny: označuje konzervativní aminokyselinové substituce: a označuje méně přísně konzervativní aminokyselinové substituce. Obrázek č. 3 zobrazuje matrici podobnosti uvnitř rodiny ukazující procenta identity mezi lidským FGF-5, lidským FGF-6, lidským FGF-7, lidským FGF-8, lidským FGF-9, lidským zFGF-5, lidským FGF-10, lidským FGF-1, lidským FHF-1, lidským FGF-2, lidským FHF-2, lidským FHF-4, lidským FGF-3, lidským K.GF-2, lidským FHF-3 a lidským FGF-4.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Extenze sekvence EST

Vyhledávání v databázi překládaných DNA za použití dotazu na růstové faktory vedlo k identifikaci exprimované sekvence tag (EST), což je sekvence, o které se zjistilo, že je novým členem rodiny FGF a označila se zFGF-5.

Oligonukleotidové primery ZC11,676 (SEQ ID NO: 3) a ZC11,677 (SEQ ID NO: 4) se odvodily od exprimované sekvence tag (EST). Primery se použily uvnitř sekvence EST, proběhlo PCR, kde se jako templát použila MARATHON READY cDNA (Clontech, Palo Alto, CA) ze srdeční tkáně dospělého jedince.

Podmínky používané při PCR byly: 1 cyklus při teplotě 94 °C po dobu 90 vteřin, 35 cyklů při teplotě 94 °C po dobu 15 vteřin; při teplotě 68 °C po dobu l minuty; pak následuje 1 cyklus po dobu 10 minut při teplotě 72 °C a při teplotě 4 °C. Při reakci PCR vzniklo úsek 160 bp sekvence EST a potvrdilo se, že sekvence EST byla správná.

Jiné knihovny, které se mohly amplifikovat za použití oligonukleotidových primerů zahrnují svaly skeletu, plíce, žaludek, tenké střevo a štítnou žlázu.

Příklad 2: Distribuce tkáně

Proběhla northernova analýza za použití Human Multiple Tissue Blots od firmy Clontech (Palo Alto, CA). Fragment DNA o velikosti 160 bp popsaný v příkladu 1 se podrobil elektroforéze na 1% agarózovém gelu, fragment se získal z gelu elektroelucí a pak se značil radioaktivně za použití značícího systému MEGAPRIME DNA (Amersham, Arlington Heights, IL) podle instrukcí výrobce. Sonda se čistila za použití kolony NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Pro prehybridizaci a jako hybridizační roztok při northemově přenosu se použil roztok EXPRESSSHYB. Hybridizace proběhla přes noc při teplotě 68 °C a bloty se pak promyly roztokem 2x SSC a 0,05 % SDS při teplotě místnosti, pak následuje promytí v roztoku 0,lx SSC a 0,1 % SDS při teplotě 50 °C. Vznikl jediný pruh o velikosti přibližně 2,0 kb. Intenzita signálu byla vyšší v případě srdce dospělého jedince, relativně menší intenzity signálu se dosáhlo v případě svalů skeletu a žaludku.

Příklad 3: Test in vitro aktivity zFGF-5

A. Mitogenní aktivita zFGF-5 se testovala za použití buněčné linie a buněk z primární kultury. Upravené médium z buněk, které exprimují rekombinantní protein a/nebo čištěný protein, se

-25CZ 299288 B6 přidalo do kultivací následujících buněčných linií: fibroblasty NH 3T3 (ATCC No. CRL1658), srdeční buňky chum CHH-1 (ATCC No. CRL-1680), krysí srdeční myoblasty H9c2 (ATCC No. CRL-1446), Shionogi buňky karcinomu prsní žlázy (Tanaka et. al., Proč. Nati. Acad. Sci. 89: 8928-8932, 1992) a buňky adenokarcinomu LNCaP.FGC. Čerstvě izolované buňky, které se mohou použít pro testování proliferační aktivity zFGF-5, zahrnují: kardiální fibroblasty, kardiální myocyty, skeletové myocyty a endoteliální buňky lidských umbilikálních žil.

Mitogenní aktivita se testuje měřením aktivity začleněného ³H-thymidinu založeném na metodě Raines and Ross (Meth. Enzymology 109: 749-773, 1985). Buňky se nanesly na plotny a nechaly se růst ve vhodném médiu až do dosažení hustoty 3 x 10⁴ buněk/ml. Typickým růstovým médiem je Dulbeccovo růstové médium (G1BCO-BRL, Gaithersburg, MD), které obsahuje 10 % fetálního telecího séra (FCS). Buňky se kultivovaly na plotnách s 96 děrami a nechaly se růst po dobu 3 až 4 dnů. Růstové médium se odstranilo a do každé díry se přidalo 180 μΐ DFC (tabulka č. 5) obsahující 0,1 % FCS. Do poloviny děr se přidal protein zFGF-5 a druhá polovina sloužila jako negativní kontrola bez proteinu zFGF-5. Buňky se inkubovaly po dobu 3 dní při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % CO2 a pak se médium odstranilo. Do každé díry se přidalo jedno sto mikrolitrů DFC obsahující 0,1 % FCS a 2 pCi/ml ³H-thymidinu a plotny se inkubovaly dalších 1 až 24 hodin při teplotě 37 °C. Médium se odsálo a do každé díry se přidalo 150 μΐ trypsinu. Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C až se buňky uvolnily (alespoň 10 minut). Uvolněné buňky se sklidily zachycením na filtrech za použití LKB Wallac 1295-001 Cell Harvester (LKB Wallac, Pharmacia, Gaithersburg, MD). Filtry se sušily zahřátím v mikrovlnné troubě po dobu 10 minut a aktivita se stanovila na LKB Betaplate 1250 scintilačním počítači (LKB Wallac), jak se popisuje v manuálu výrobce.

Tabulka 5

250 ml Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM, Gibco-BRL)

250 ml Hamovo F12 médium (Gibco-BRL)

0,29 mg/ml L-glutaminu (Sigma, St. Louis, MO) mM pyruvát sodný (Sigma, St. Louis, MO) mM Hepes (Sigma, St. Louis, MO) pg/ml fetuinu (Aldrich, Milwaukee, WI) pg/ml inzulinu (Gibco-BRL) ng/ml selenu (Aldrich, Milwaukee, Wl) pg/ml transferinu (JRH, Lenexa, KS)

B. Srdce se izolovala zjeden den starých neonatálních myší a pak se rozmělnilo opakovaným trávením kolagenázou podle protokolu, který se popisuje v publikaci Brand et al., J. Biol. Chem. 268: 115000-11503, 1993. Izolovaly se jednotlivé myocyty prostřednictvím Percollova gradientu. 2 ml suspenze se nanesly do 6 děr destiček pro kultivaci tkáňových kultur v koncentraci 0,5 x 10⁶ buněk/ml. O tři dny později se díry ploten třikrát promyly PBS bez vápníku a hořčíku a přidalo se 1 ml média bez séra (tabulka č. 6). Díry se inokulovaly částicemi AdCMV-zFGF5 v koncentraci 10¹¹ partikulí na jednu díru nebo AdCMV-GFP (protein vykazující zelenou fluorescenci, používá se jako kontrola) a inkubovaly se při teplotě 37 °C po dobu 8 hodin. Díry se pak třikrát promyly PBS bez vápníku nebo hořčíku a pak se znovu naplnily 2 ml média bez séra.

hodin po inokulaci s AdCMV-zFGF-5 se kultivované myocyty přestaly dělit a došlo ke změnám morfologie, zatímco díry inokulované AdCMV-GFP se dále množily a jejich

-26CZ 299288 Β6 morfologie zůstala po inokulaci beze změn. Díry inokulované AdCMV-zFGF-5 také obsahovaly po 48 hodinách konfluentní vrstvu živých, neadherentních buněk, aniž došlo ke ztrátě konfluence adherenzní vrstvy myocytů, což indikuje proliferační aktivitu adCMV-zFGF-5 na kultivované myší myocyty.

Tabulka č. 6

Hamova směs nutrientů F12 (Gibco-BRL; 1:1 směs s DMEM) mM NaHCO₃ (Sigma) mM L-glutamin (Sigma) % PSN (Sigma) pg/ml inzulínu 5 pg/ml transferinu 1 nM LiCl (Sigma) nM selenu pl/ml kyseliny askorbové (Sigma) nM thyroxinu (Sigma)

C. K. myocytům (příklad 3B) se přidal zFGF-5 fúzovaný s vazebným proteinem maltózy (MBP), jak se popisuje v příkladu 9A, jehož izolace se popisuje v příkladu 10, v koncentraci 0,1 ng/ml. Ukázalo se, že MBP-zFGF-5 také stimuluje proliferaci myocytů.

Příklad 4: Test pro testování ex vivo aktivity zFGF-5

Kardiální mitogeneze se měří ex vivo odstraněním celých srdcí z neonatálních 8 týdnů starých myší nebo krys. Vyňatá srdce se umístila do Joklinova (Sigma, St. Louis, MO) nebo Dulbeccova média při teplotě 37 °C, v atmosféře 5 % CO2 po dobu 4 až 24 hodin. Během doby inkubace se přidal polypeptid zFGF-5 v koncentračním rozmezí 1 pg/ml až 100 pg/ml. V případě negativní kontroly se použil pouze pufr. Přidal se ³H-thymidin a vzorky se inkubovaly po dobu 1 až 4 hodin. Po této době se srdce rozdělila do sekcí a stanovila se mitogeneze autoradiografií. Sekce se použily pro histomorfometrii za účelem stanovení objemu jádra/cytoplazmy (McLaughlin, Am. J. Physiol. 271: R122-R129, 1996).

V jiném případě se srdce lyofilizovalo a resuspendovalo se v 1 ml 0,1 N NaOH. DNA se vysrážela za použití 10% kyseliny trichlóroctové chlazené na ledu (TCA). Supematant se přidal do 9 ml scintilační kapaliny a změřila se nespecifická inkorporace ³H-thymidinu. Výsledný pelet se resuspendoval v 1 ml BTS—450 tkáňovém solubilizátoru (Beckman, Fullerton, CA) a přidalo se 9 ml scintilačního roztoku, aby se zmenšila specifická inkorporace ³H-thymidinu do DNA.

Pravá a levá komora se izolovala z jednodenních myší CD (Jakson Labs, Bar Harbor, ME) a inkubovaly se po dobu 4 hodin s 3 ng/ml zFGF5Hep2 (n=13; uvádí se v příkladu 10) nebo jako kontrolní stanovení (n=l 0). ³H-thymidin se přidal na dobu jedné hodiny. Srdeční komory se několikrát promyly a pak se homogenizovaly v 1 ml Joklikova média. Výsledný homogenát se přidal do 9 ml scintilačního koktejlu a analyzoval se celkový příjem ^JH-thymidinu a jeho inkorporace do DNA.

z FGF5Hep2 zvýšil příjem ³H-thymidinu a jeho inkorporací do DNA 2,068 ± 0,489 krát ve srovnání s kontrolou, což indikuje, že zFGF5 v případě kardiálních buněk působí jako mitogen.

-27CZ 299288 B6

Příklad 5: Test in vivo aktivity zFGF-5

Testovaly se proliferační účinky zFGF-5 in vivo za použití neonatálních krys, které byly dva týdny staré, a/nebo dvouměsíčních dospělých krys. Krysám se intraperiokardiálně injekcí zavedla dávka buď v akutním módu nebo v chronickém módu.

A. Neonatálním krysám se aplikoval zFGF-5 po dobu až 14 dní. Dávka se pohybovala v rozmezí 50 ng/den až 100pg/den. Po léčbě účinky zFGF-5 ve srovnání s kontrolními zvířaty se vyhodnotily stanovením zvýšením hmotnosti srdce, zlepšené in vivo a ex vivo funkce levé komory a zvýšením poměru kardiální nukleární frakce ku cytosolickým frakcím, což se stanovilo histomorfometricky.

B. Pro vyhodnocení účinků zFGF-5 na funkce srdce a srdeční tkáň se mohou také použít krysy s kardiomyopatií indukovanou chronickou infuzí katecholaminu nebo koronární ligaci nebo modely kardiomyopatie, jako je syrský kardiomyopatický křeček (Sole et al., Amer. J. Cardiol. 62(11): 20G-24G, 1988).

Za účelem indukce kardiomyopatie použitím katecholaminu se sedm až osm týdnů starým krysám kontinuální infuzí zaváděl epinefrin po dobu dvou týdnů pomocí osmotických minipump, které se implantovaly pod kůži mezi jejich lopatky. Infuze epinefrinu vedla ke zvýšení skóre fibrotických lézí levé komory z hodnoty 0,005 ± 0,005 na hodnotu 2,11 ± 0,18 (rozmezí 0-3); ke zvětšení šířky myocytových buněk levé komory z hodnoty 17,36 ± 0,46 pm na hodnotu 23,05 ± 0,62 pm; k nepatrnému zvýšení kontrakčních odezev papilárních svalů levé komory k izoproterenolu (0,2 versus 1,1 gramů napětí) ve srovnání s krysami, kterým se infuzí zaváděl fyziologický roztok. Po uplynutí dvou týdnů léčby krysám se denně zaváděl intraperiokardiální injekcí zFGF-5, bFGF, IGF-I nebo IGF—II po dobu až 14 dní. Krysy se usmrtily a provedla se histomorfometrie a histocytochemie.

Krysy, které se ošetřovaly zde popsaným způsobem, se také hodnotily na konci aplikace katecholaminu a znova po aplikaci růstového faktoru, kde se hodnotí kardiální regenerace, jako snížení skóre fibrotických lézí levé komory, redukce šířky myocytických buněk a zvýšení papilámí kontrakční odezvy levé komory na izoproterenol.

Příklad 6: Chromozomální mapování zFGF-5

ZFGF-5 se mapoval na chromozomu 5 za použití běžně dostupné verze Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research's „GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel“ (Research Genetics, lne., Huntsville, AL). GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel obsahuje DNA z 93 radiačních hybridních klonů, která je vhodná pro PCR, plus dvě kontrolní DNA (HFL donor A23 recipient). Pro veřejnost dostupný WWW server (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) umožňuje mapování odvozené od radiační hybridní mapy lidského genomu Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research („WICGR“ radiační hybridní mapa), která se zkonstruovala pomocí GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel.

Za účelem mapování zFGF-5 s „GeneBridge 4 RH Panel“ se provedly na mikrotitraění destičce s 96 prohlubněmi reakce o objemu 25 pl (Stratagene, La Jolla, CA) a použily se pro PCR v termálním cykleru „RoboCycler Gradient 96“ (Stratagene). Každá z 95 PCR reakcí obsahovala 2,5 pl 50 x koncentrované směsi „Advantage KlenTaq Polymeraxe Mix“ (Clontech), 2 pl směsi dNTP (2,5 mM každého oligonukleotidů: Perkin-Elmer, Foster City, CA), 1,25 pl sense primeru, ZC 11,677 (SEQ ID NO: 4), 1,25 pl antisense primeru, 2C 12,053 (SEQ ID NO: 5). 2,5 pl „RediLoad“ (Research Genetics, lne), 0,5 pl „Advantage KlenTaq Polymerase Mix“ (Clontech

-28CZ 299288 Β6

Laboratories, lne.), 25 ng DNA z jednotlivých hybridních klonů nebo kontroly a ddH20 se doplnil celkový objem na 25 μΙ. Reakce s e přelily stejným množstvím minerálního oleje a zatavily se. Podmínky v cykleru pro PCR byly následující: počáteční jeden cyklus trvá 4 minuty a probíhá při teplotě 94 °C, 35 cyklů po dobu 1 minuty při teplotě 94 °C, po dobu 1,5 minuty dochází k teplotní hybridizaci při teplotě 66 °C a po dobu 1,5 minuty dochází k extenzi při teplotě 72 °C, pak následuje poslední cyklus extenze. Trvá 7 minut a probíhá při teplotě 72 °C. Vzniklé produkty reakce se oddělily elektroforézou na 3% agarózovém gelu NuSieve GTG (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

Výsledky ukazují, že zFGF-5 mapuje 54E12 cR z horní části skupiny zřetězení genů lidského chromozomu 5 na WIGR radiační hybridní mapu. Nejbližší proximální markér je WI-16922 a nejbližší distální markér je WI-14692. Použití okolních markérů CHCL mapy také napomáhá umístit zFGF-5 v oblasti 5q34-q35 na CHLC chromozomu 5 verze v8c7 integrované markerové mapě (The Cooperative Human Linkage Center, WWW server-http://www.chlc.org/ChlcIntegratedMaps.html).

Příklad 7: Účinky z FGF-5 na kosti

A. Za použití metod popsaných v publikaci Becker et al., Methods in Cell Biology 43: 161— 189, 1994 se zkonstruoval adenovirový vektor obsahující cDNA zFGF-5. CDNA zFGF-5 se klonovala (jak je zobrazeno v sekvenci SEQ ID NO: 1) jako Xbal-Sall fragment do pACCMV (Gluzman et al., In Ecaryotic Viral Vectors, Gluzman (eds.) pp. 187-192, Cold Spring Harbor Press, Cold Springs Harbor NY, 1982). Vektor pACCMV obsahuje část genomu adenoviru 5, CMV promotor a terminační sekvence SV40. Plazmid obsahující vektor a inzert cDNA se kotransfekoval s plazmidem, který obsahuje genom adenoviru 5 a který je označený pJM17 (McGrory et al., Virology 163: 615-617, 1988) do buněk 293 (ATCC No. CRL-1573; American Type Culture Collection, Rockville, MD). Proběhla rekombinace a došlo k produkci rekombinantního adenoviru označeného AdCMV-zFGF, který obsahuje zFGF-5. Přítomnost cDNA zFGF-5 se potvrdila PCR.

Adenovirový vektor AdCMV-zFGF5 se použil pro in vivo transfer genu intravenózní injekcí, přičemž dávka se pohybovala mezi 1 x 10¹¹ a 5 x 10¹¹ částic/myš. Ukázalo se, že po intravenózní injekci velká část viru směřuje do jater a transdukuje hepatocyty s velkou účinností (Herz et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2812-2816, 1993). Ukázalo se, že buňky produkují protein kódovaný cDNA a v případě sekretovaných proteinů je vylučuje do krevního oběhu. Došlo k silné expresi a vykazuje fyziologické účinky (Ohwada et al., Blood 88: 768-774, 1996; Stevenson et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15: 479-484, 1995; Setoguchi et al., Blood 84: 2946-2953, 1994; a Sakamoto et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 12368-12372, 1994).

Šest týdnů starým myším CD-I se aplikoval adenovirus, který neobsahoval žádný inzert cDNA (AdCMV-null) nebo AdCMV-zFGF-5 buď přes ocasní žílu intravenózně nebo intraperikardiálně (IPC). Celkem se aplikovalo 5 x 10 virových částic/100 μΙ/myš. 14 dní po injekci se zvířata usmrtila a vyňaly se kosti holení a stehenní, aniž se zaznamenaly libovolné potencionální zánětlivé odezvy. Kosti se fixovaly v 10% neutrálním pudrovaném formalinu a zpracovaly se. Kosti se dekalcifikovaly v 5% kyselině mravenčí s 10% citrátem sodným, promyly se ve vodě, dehydratovaly se v sérii 70 % až 100 % etanolu, čistily se v xylenu a zapustily se do parafínu. Vzorky se řezaly podélně skrz obě tibiální a femorální metalýzy a barvily se hemotoxylinem a eosinem za účelem identifikace kostních buněk. Osteoblasty se identifikovaly na základě centrální negativní Golgi oblasti a ekcentrického jádra, zatímco osteoklasty se identifikovaly na základě více jader, nejednotného tvaru a Howshipovy mezery.

Za účelem histofotometrie kostí se zvolily vzorky fumaru. Objem mřížovité kosti nebylo možno stanovit vzhledem k různým místům odběru vzorků (to znamená, že vzorky femuru

-29CZ 299288 B6 se nerozdělily na sekce skutečně ve stejné rovině). Parametry tří kostí se vyhodnotily pro stanovení histomorfometrických změn.

1. Počet endosteálních osteoblastů: měří se podle endosteálního povrchu mřížové kosti při 180-ti násobném zvětšení v oblasti 1,22 mm proximální k růstové ploténce.

2. Počet endosteálních osteoblastů: měří se podle endosteálního povrchu mřížové kosti při 180-ti násobném zvětšení v oblasti 1,22 mm proximální k růstové ploténce.

3. Šířka růstové ploténky: měřeno každých 72 pm při 90-ti násobném zvětšení skrz celou růstovou ploténku mimo periferní konce za účelem stanovení aktivity růstové ploténky.

Analýza dat (průměr ± standardní odchylka, a=4,7/skupinu) ukazuje následující:

1. V kloubu mezi tibií a femurem se nejeví žádná detekovatelná zánětlivá odezva.

2. AdCMV-zFGF5 aplikovaný intravenózně nebo intraperikardiálně do myší podstatně zvýšil osteogenní aktivitu v distální femurální metafýze, což se testovalo ve druhém týdnu po aplikaci. Uvedená stimulace osteogenní aktivity se indikovala:

a) podstatným nárůstem počtu endoesteálních osteoblastů v mřížovaných kostech distálních femurů, které následuje po intravenózní infuzi nebo intraperikardiální injekci AdCMV-zFGF5, 530 % a 263 % s ohledem na příbuzný vektor, který slouží jako kontrola; a

b) pozorováním zvýšeného množství osteogenních tkání na povrchu kostí, což značí zesílenou diferenciaci kmenových buněk kostní dřeně směrem k linii osteoblastů.

3. Počet endosteálních osteoblastů nebyl podstatně ovlivněn intravenózní nebo intraperikardiální aplikací AdCMV-zFGF5 ve srovnání s jejich příbuznými vektory, které slouží jako kontroly.

4. Na základě intravenózní infuze AdCMV-zFGF5 se šířka růstové plotny podstatně zmenšila, nedošlo ktomu intraperokardiální injekcí, což ukazuje na sníženou aktivitu růstové ploténky, ke které dochází po intravenózní infuzi. Účinky aplikace AdCMV-zFGF5 na diferenciaci se neprokázaly.

Tyto výsledky naznačují, že zFGF5 je silný mitogen pro stimulaci proliferace osteoblastů a že zFGF-5 má kapacitu indukovat tvorbu nových kostí.

Β. V podstatě stejné postupy, jako se popisují v 7.A. QCT, se aplikovaly na samice myší CD-I (Jackons Labs), kterým se injekcí aplikovalo 1 x 10¹¹ částic AdCMV-zFGF5 na myš. Myši se usmrtily 30 dní po injekci a ve srovnání s kontrolou (aplikace prázdného adenoviru nebo fyziologického roztoku injekcí) se zvýšil poměr hmotnosti srdce a délky tibie. Ve skupině neexistují rozdíly mezi změnami délky tibií ani rozdíly ve hmotnosti orgánů mezi skupinami. Což naznačuje, že zFGF-5 adenovirus selektivně zvyšuje celkovou hustotu kostí, hustotu trabekulámích kostí a kortikální tloušťku femuru, která se stanovuje QCT.

Příklad 8: Účinky zFGF-5 na srdce

Jak se popisuje v 7.B. myším CD-I se aplikoval AdCMV-zFGF5 formou jedné injekce. Myši se usmrtily po čtyřech týdnech a zjistilo se, že poměr hmotnosti srdce a délky tibie ve srovnání s kontrolou, což jsou myši, na něž se aplikoval prázdný adenovirus nebo fyziologický roztok, vzrostl. Výsledky ukazují, že mezi skupinami neexistují rozdíly ve změnách délek tibií ani rozdíly hmotností jiných orgánů. Tyto výsledky naznačují, že AdCMV-zFGF5 selektivně zesiluje kardiální růst v případě, že se aplikuje intravenózně jako adenovirová konstrukce.

-30CZ 299288 Β6

Příklad 9: Exprese zFGF-5

A. Konstrukce plazmidů kódujících zFGF-5

ZFGF5, což je homolog fibroblastového růstového faktoru, se exprimoval v bakteriích E. coli za použití fúzního systému MBP (protein vázající maltózu) z New England Biolabs (NEB; Beverly, ΜΑ). V tomto systému se cDNA zFGF5 připojila na 3'konec genu malE za vzniku fúzního proteinu MBP-zFGF5. Exprese fúzního proteinu se řídila promotorem tac; exprese neprobíhá pokud je promotor indukován přidáním 1 mmol IPTG (izopropyl-b-thiogalaktosylpyranosidu). Připravily se tři variace tohoto fúzního proteinu, které se liší pouze místem štěpení pro uvolnění zFGF5 z MBP. Jedna konstrukce obsahuje místo štěpení, které rozeznává trombin, a nachází se mezi oblastmi MBP a zFGF5. Druhá konstrukce měla místo místa štěpení trombinem místo štěpení, které rozeznává faktor Xa. Třetí konstrukce obsahovala místo místa štěpení trombinem místo štěpení, které rozeznává enterokináza.

Konstrukce se postavily jako fúze v rámci s MBP v souladu s vícenásobným klonovacím místem (MCS) vektoru pMAL-c2 (NEB) a podle instrukcí výrobce. ZFGF se amplifikoval PCR za použití primerů, které zavádějí do DNA vhodná klonovací místa stejně jako místa štěpení. Používají se následující oligonukleotidové primery: 1) v případě trombinové konstrukce to jsou: zel2,625 (SEQ ID NO: 7) a zel2,631 (SEQ ID NO: 8); 2) v případě konstrukce faktoru Xa se používají primery zel 5,290 (SEQ ID NO: 9) a zcl2,631 (SEQ ID NO: 8); a 3) v případě enterokinázové konstrukce jsou to primery ze 15,270 (SEQ ID NO: 10) a zel2,631 (SEQ ID NO: 8). V každém případě se neamplifikovala zFGF5 signální sekvence; exprimovaný zFGF5 začíná aminokyselinovým zbytkem 26 sekvence SEQ ID NO: 2 (Val se zaměnil za Ala). Trombinová konstrukce se vytvořila začleněním fragmentu Xbal -Sal I zFGF5 do Xbal - Sal I restrikčních míst pMAL-c2. Konstrukce faktoru Xa se vytvořila začleněním fragmentu tupý konec-Sal I do restrikčních míst Xmn 1—Sal 1 MCS. Enterokinázová konstrukce vznikla začleněním fragmentu Xba I-Sall do restrikčního místa Xbal-Sall pMAL-c2.

Konstrukce se pak zavedly do různých hostitelských kmenů buněk E. coli a testovala se síla exprese. Trombinová konstrukce (označená jako pSDH90.5) se transfekovala do buněk DH10B (GIBCO-BRL), zatímco konstrukce faktoru Xa (označené pSDH117.3) a enterokinázové konstrukce (označené pSDH 116.3) se transfekovaly do buněk TOP10 (Invitrogen, San Diego, CA). Všechny tři MBP fúze mají molekulovou hmotnost přibližně 63 000 (43 000 v oblasti MBP a přibližně 20 000 v oblasti zFGF5).

B. Homologní rekombinace/zFGF5

Exprese pFGF5 v organizmu Pichia methanolica využívá expresní systém, který se popisuje v PCT WO 9717450. Expresivní plazmid obsahující celý nebo část polynukleotidu kódující zFGF5 se konstruoval prostřednictvím homologní rekombinace. Expresivní vektor vznikl zpCZR204, který obsahuje promotor AHG1, po němž následuje vedoucí sekvence aFpp, pak aminoterminální peptid tag, restrikční místo Sal I s tupým koncem, karboxy-terminální peptid tag, stop kodon translace, pak následuje terminátor AUG1, ADE2 selekční markér a nakonec AUG1 3'nepřekládaná oblast. V tomto vektoru jsou také zahrnuty sekvence URA3 a CEN-ARS, které jsou nutné pro selekci a replikaci v organizmu S. cerevisisae a sekvence Amp^R a colEl ori nutné pro selekci a replikaci v bakteriích E. coli. Sekvence zFGF5 začleněná do uvedeného vektoru začíná zbytkem 27 (Ala) aminokyselinové sekvence zFGF.

Za účelem konstrukce pSDH114 se expresivní plazmid zFGF5 v P. methanolica a fragmenty DNA transformovaly do S. cerevisisae: 100 ng akceptorového vektoru pCZR204, který se štěpil restrikčním enzymem Smál; 1 pg restrikčního fragmentu Xbal-sall uvolněného z pSDH90.5 a okolní kódující sekvence zFGF5; 1 pg syntetického dvouřetězcového linkerového segmentu generovaného PCR, který obsahuje 70 párů bází aFpp kódující sekvence na jednom konci a je

-31 CZ 299288 B6 spojen se 70 páry bází aminoterminální kódující sekvence ze sekvence zFGF5, se vytvořil ze čtyř oligonukleotidů zcl3,497 (SEQ ID NO: II); zcl5,131 (SEQ ID NO: 12); zcl5,132; (SEQ ID NO: 18); zel 5,134 (SEQ ID NO: 13), kde negativní řetězec dvouřetězcové sekvence je zobrazen v sekvenci SEQ ID NO: 19 (sekvence 5'linkeru(aFpp -> N-konec zFGF5)) a 1 pg syntetického dvouřetězcového linkerového segmentu generovaného PCR, který obsahuje 70 párů bází sekvence kódující karboxylový konec zzFGF5 na jednom konci a je spojen se 70 páry bází AUGl terminátorové sekvence se vytvořil ze čtyř oligonukleotidů zcl3,529 (SEQ ID NO: 14); zcl3,525 (SEQ ID NO: 15); zel3,526 (SEQ ID NO: 16); zel 3,528 (SEQ ID NO: 17), kde negativní řetězec dvouřetězcové sekvence je zobrazen v sekvenci SEQ ID NO: 20 (sekvence 3'linkeru(C-konec zFGF5 -> AUGl terminátor)). Vybraly se kolonie Ura⁺ a extrahovala se DNA z výsledných kolonií kvasinek a transformovala se do buněk E. coli. Jednotlivé klony, které nesou správnou expresivní konstrukci se identifikovaly PCR za použití oligonukleotidů zcl3,497 (SEQ ID NO: 11) a ZC13,528 (SEQ ID NO: 12). Pak následovalo restrikční štěpení za účelem ověření přítomnosti inzertu zFGF5. DNA se sekvenovala, aby se potvrdilo, že požadované sekvence DNA jsou spojeny s dalšími sekvencemi. Z jednoho ze správných klonů se izolovala plazmidová DNA ve velkém měřítku a DNA se štěpila restrikčním enzymem Sfi I, aby se z vektoru uvolnila expresivní kazeta PzcAza-zFGFS. DNA štěpená restrikčním enzymem Sfi I se pak transformovala do expresivního hostitele, kterým je Pichia methanolica označená PMAD16 a nanesla se na plotny s ADED za účelem selekce. Izolovaly se různé klony a testovala se u nich síla exprese zFGF5 westernovým přenosem.

Za účelem produkce proteinu v malém měřítku (například produkce na plotně nebo v kultivační lahvi) se transformanti P.methanolica, kteří nesou expresivní kazetu obsahující metanolem regulovaný promotor (jako je například AUGl promotor), kultivovaly v přítomnosti methanolu a bez interferujícího množství jiného zdroje uhlíku (například glukózy). V případě experimentů v malém měřítku, které zahrnují testování síly exprese, se transformanti kultivují při teplotě 30 °C na pevném médiu, jenž obsahuje například 20 g/1 bakto-agaru (Difco), 6,7 g/1 kvasinkové dusíkové báze bez aminokyselin (Difco), 10 g/1 methanolu, 0,4 mg/1 biotinu a 0,56 g/1 prášku -Ade -Thr -Trp. Vzhledem k tomu, že methanol je těkavý zdroj uhlíku, může během dlouhodobé inkubace vytékat. Aby se zajistila kontinuální dodávka methanolu, roztok 50% methanolu ve vodě se umístí do víčka převrácené kultivační plotny, přičemž methanol se dostává k rostoucím buňkám ve formě par. V obecném případě se nepoužívá více než 1 ml methanolu na plotnu o průměru 100 mm. Experimenty ve větším měřítku se mohou provádět za použití kultivovaných kultur v míchaných kultivačních lahvích. Při typickém postupu se buňky kultivují po dobu dvou dní na minimálních methanolových plotnách, jak se popisuje shora v textu, při teplotě 30 °C. Kolonie se pak použijí pro inokulaci malého objemu minimálního mediánového média (6,7 g/1 kvasinkové dusíkaté báze bez přítomnosti aminokyselin, 10 g/1 methanolu, 0,4 mg/1 biotinu) při koncentraci buněk 1 x 10⁶ buněk/ml. Buňky se kultivují při teplotě 30 °C. Buňky, které rostou v přítomnosti methanolu vyžadují velký přísun kyslíku, proto je nezbytné je během kultivace silně míchat. Methanol se denně doplňuje (v typickém případě 1/100 objemu 50% methanolu denně).

V případě produkce ve velkém měřítku se připraví čerství kultura silně exprimujících klonů v míchaných kultivačních lahvích. Výsledné kultury se pak používají pro inokulaci kultivačního média ve fermentoru. V typickém případě se kultivuje 500 ml kultury v YEPD při teplotě 30 °C po dobu 1 až 2 dní za silného míchání. Toto množství kultury se pak použije pro inokulaci fermentoru o objemu 5 1. Buňky se kultivují ve vhodném médiu, které obsahuje soli, glukózu, biotin a stopové prvky, při teplotě 28 °C, pH 5,0 a množství rozpuštěného kyslíku je > 30 %. Když se spotřebuje počáteční dávka glukózy (což indikuje zvýšená spotřeba kyslíku), do fermentoru se přidá dávka glukóza/methanol, což indukuje produkci proteinu. Vzhledem k tomu, že fermentace ve velkém měřítku probíhá za podmínek limitujícího uhlíku, přítomnost glukózy nepotlaěuje promotor indukovatelný methanolem.

Příklad 10: Čištění zFGF-5

Získalo se fermentační médium z kultivace bakterií E. coli kmene, který exprimuje zfGF5 ve formě maltózu vázající proteinové fúze (pSDH90.5, jak se popisuje shora v textu). Fúze MBPzFGF5 se rozpustila během sonifikace nebo francouzské tlakové ruptury za použití pufru, který obsahuje 20 mM Hepes, 0,4 M NaCl, 0,01 M EDTA, 10 mM DTT při pH 7,4. Extrakční pufr také zahrnuje 5 pg/ml Pepstatinu, Leupeptinu, Aprotinu, Bestatinu. Fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) se také zahrnuje do konečné koncentrace 0,5 mM.

Extrakt se centrifugoval při 18 000 x g po dobu 30 minut a při teplotě 4 °C. Výsledný supematant se zpracoval na amylózové pryskyřici (Pharmacia LK.B Biotechnology, Piscataway, NJ), která váže oblast MPB ve fúzi. Na promytí kolony a eluci vázané fúze MBPzFGF5 se použil stejný pufr, jako je extrakční pufr bez DTT a proteázových inhibitorů, ale obsahuje 10 mM maltózu.

K eluované fúzi MBPzFGF5 se přidal v poměru 1 : 100 (hmotnost/hmotnost) bovinní trombin. Štěpící reakce probíhala po dobu 6 až 8 hodin při teplotě místnosti. Po ní se reakční směs nanesla na podloží s benzamidinové sefarózy (Pharmacia LK.B Biotechnology, Piscataway, NJ) za účelem odstranění trombinu, fúze se eluovala stejným elučním pufrem, jako se popisuje pro amylózovou afinitní chromatografii.

Prošlá frakce obsahující štěpený produkt zFGF a volnou oblast MBP se naneslo Toso Haas heparinovou afinitní matrici (Toso Haas, Montgomeryville, PA) ekvilibrovanou 0,5 M NaCl, 20 mM Hepes, 0,01 M EDTA při hodnotě pH 7,4. MBP a zFGF5 se za těchto podmínek váží na heparin. Vázané proteiny se eluovaly 2 až 3 objemy kolony gradientu pufru vytvořeném mezi 0,5 M NaCl a 0,2 M NaCl.

Nejdříve se eluoval MBP při koncentraci pufru 0,7 M, pak vyšel štěpený zFgf5 při přibližné koncentraci 1,3 M NaCl. Sebrané frakce zFGF5 znovu prošly amylózovou afinitní chromatografií, aby se odstranil reziduální MBPzfgf5, který je jako minoritní kontaminant. Vyčištěný materiál se označil jako zFGF5-Hep2 a redukující SDS-PAGE analýza vykazuje jediné vysoce purifikované specie o přibližné molekulové hmotnosti 20 000.

Sekvenování aminokyselin N-konce ukazuje na nativní N-terminální sekvenci, kde je přítomné „dibazické místo“.

Protein z FGF5 je velmi stabilní v 1,3 M NaCl. Po dialýze do PBS se zFGF5 agregoval a zůstal ve fázi roztoku. Proto formulace obsahující heparin a jiné „polyanionty“ se mohou použít při předcházení agregace čisté formy zFGF5.

Příklad 11: Produkce protilátek

Protilátky proti zFGF5 se produkují za použití standardních metod známých v oboru a popisují se shora v textu. Morčata, králíci a myši se imunizují peptidem QTRARDDVSRKQLRLYC (SEQ ID NO: 2 aminokyselinový zbytek 40 až 56) označeným zFGF-Ι; YTTVTKRSRRIRPTHRAC (SEQ ID NO:2 aminokyselinový zbytek 191 až 207, s přidaným Cys na C-konci) označeným zFGF-5 nebo polypeptidem zFGF5 celé délky, jak zobrazuje sekvence SEQ ID NO: 2 plus MPB fúzním proteinem. Tato fúze je označena MBP-FGF5. Peptidy se spojily prostřednictvím zbytku Cys za použití KLH aktivovaným maleimidem (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

-33 CZ 299288 B6

Tabulka 7 popisuje imunizaci zvířat a separaci protilátek.

Peptid nebo protein	zvíře	Úrověň imunizace	Proces separace protilátek
ZFGF5-1	Morče	50 ug/ml	Afinitní
		počáteční dávka	čištění a
		25 ug/ml	frakci onované
		opakovaná dávka	IgG
	králík	100 ug/ml	Afinitní
		počáteční dávka	čištění a
		50 ug/ml	frakcionované
		opakovaná dávka	IgG
ZFGF5-2	Morče	50 ug/ml	Afinitní
		počáteční dávka	čištění a
		25 ug/ml	frakcionované
		opakovaná dávka	IgG
	králík	100 ug/ml	Afinitní
		počáteční dávka	čištění a
		50 ug/ml	frakcionované
		opakovaná dávka	IgG
ZFGF5-MBP	Myš	20 ug/ml	Afinitní
		počáteční dávka	čištění
		10 ug/ml
i		opakovaná dávka
	Králík	200 ug/ml
		počáteční dávka
		100 ug/ml
		opakovaná dávka

Příklad 12: Účinky zFGF-5 na ob/ob myši

Testovaly se účinky zFGF-5 na adipocyty a metabolizmus tuků na použití samic ob/ob myší (C57B1/6J, Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Myši jsou obézní, rezistentní na inzulín a mají „tučné kosti“. Myši se vážily a zjistilo se, že všechny vykazují stejnou váhu a intravenózní ío injekcí se každé myši aplikovalo 10¹¹ částic AdCMVzFGF-5 nebo jako kontrola buď fyziologický roztok nebo Ad5CMV-GFP, jak se popisuje v příkladu 7. 17 dní po injekci kontrolní myši.

-34CZ 299288 B6 kterým se zavedl injekcí Ad5CMV-GFP, vážily o 5,342 ± 0,5 gramů více než v den injekce, zatímco myši, kterým se aplikovalo AdCMVzFGF-5 ztratily 3,183 ± 0,743 gramů tělesné váhy.

Sekvenční protokol (1) Obecné informace:

(i) Navrhovatel: ZymoGenetics, lne.

1201 Eastlake Avenue East Seattle, Washington 98102 United States of America (ii) Název vynálezu: Izolovaná polynukleotidová molekula kódující homologní polypeptid fibroblastového růstového faktoru (FGF), způsob jeho produkce a protilátky proti polypeptidu zFGF-5.

(iii) Počet sekvencí: 20 (iv) Adresa:

(A) JMÉNO: ZymoGenetics, lne.

(B) ULICE: 1201 Eastlake Avenue East (C) MĚSTO: Seattle (D) STÁT: WA (E) ZEMĚ: USA (F) ZIP: 98102 (v) Počítačem čitelná forma:

(A) TYP MÉDIA: disketa (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ pro Window verze 2.0 (ví) Data o současné přihlášce (A) PŘIHLÁŠKA: č.

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) KLASIFIKACE:

(vii) Data předchozích přihlášek (A) PŘIHLÁŠKA č.:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(viii) Informace o patentovém zástupci:

(A) JMÉNO: Sawislak, Deborah A.

(B) ČÍSLO REGISTRACE: 37,438 (C) REFERENCE: 96-20 (ix) Telekomunikační informace:

(A) TELEFON: 206-442-6672 (B) TELEFAX: 206-442-6678 (C) TELEX:

-35 CZ 299288 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 917 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA o

(ix) RYSY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: Kódující sekvence (B) POZICE: 1....621 (D) DALŠÍ INFORMACE:

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1

ATG TAT TCA GCG CCC TCC GCC TGC ACT TGC CTG TGT TTA CAC TTC CTG

Met 1

Tyr Ser Ala

Pro 5

Ser Ala

Cys

Thr Cys Leu 10

Cys

Leu

His

Phe 15

Leu

CTG

TGC

TTC

CAG

GTA

CAG

GTG

CTG

GTT

GCC

GAG

AAC

GTG

GAC

Leu

Cys

Phe

Gin

Val

Gin

Val

Leu

Val

Ala

Glu

Asn

Val

Asp

20

25

30

TTC

CGC

ATC

CAC

GTG

GAG

AAC

CAG

ACG

CGG

GCT

CGG

GAC

GAT

GTG

AGC

Phe

Arg

Ile

His

Val

Glu

Asn

Gin

Thr

Arg

Ala

Arg Asp Asp

Val

Ser

35

40

45

144

-36CZ 299288 B6

CGT AAG CAG CTG CGG CTG TAC CAG CTC TAC AGC CGG ACC AGT GGG AAA

192 240

Arg CAC His 65

Lys Gin Leu 50 ATC CAG GTC

Arg Leu Tyr Gin Leu Tyr Ser Arg Thr

Ser Gly Lys GAG GAT GGG

CTG Leu

GGC Gly 70

55 CGC AGG

60 ATC AGT GCC CGC

GGC Gly

Ile

Gin Val

Arg

Ile

Ser

Ala 75

Arg

Glu

Asp

Gly 80

GAC

AAG

TAT

GCC

CAG

CTC

CTA GTG

GAG

ACA GAC

ACC

TTC

GGT

AGT CAA

288

Asp

Lys

Tyr

Ala

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

Asp

Thr

Phe

Gly

Ser

Gin

85

90

95

GTC

CGG

ATC

AAG

GGC

AAG

GAG

ACG

GAA TTC

TAC

CTG

TGC

ATG AAC

CGC

336

Val

Arg

Ile

Lys

Gly

Lys

Glu

Thr

Glu

Phe

Tyr

Leu

Cys

Met

Asn

Arg

100

105

110

AAA

GGC

AAG

CTC

GTG

GGG AAG

CCC

GAT

GGC

ACC

AGC

AAG

GAG

1GT

GTG

384

Lys

Gly

Lys

Leu

Val

Gly

Lys

Pro Asp Gly

Thr

Ser

Lys

Glu

Cys

Val

115

120

125

TTC

ATC

GAG

AAG

GTT

CTG

GAG

AAC

TAC

ACG

GCC

CTG

ATG

TCG

GCT

432

Phe

Ile

Glu

Lys

Val

Leu

Glu

Asn

Tyr

Thr

Ala

Leu

Met

Ser

Ala

130

135

140

AAG

TAC TCC

GGC

TGG

TAC

GTG

GGC

TTC

ACC

AAG

GGG

CGG

CCG

CGG

480

Lys

Tyr Ser Gly Trp

Tyr

Val

Gly

Phe

Thr

Lys

Gly Arg

Pro Arg

145

150

155

160

AAG

GGC

CCC

AAG

ACC

CGG

GAG

AAC

CAG

GAC

GTG

CAT

TTC

ATG

AAG

528

Lys Gly

Pro

Lys

Thr

Arg

Glu

Asn

Gin

Asp

Val

His

Phe

Met

Lys

165

170

175

CGC TAC

CCC

AAG

GGG

CAG

CCG

GAG

CTT

CAG

AAG

CCC

TTC

AAG

TAC

ACG

576

Arg Tyr

Pro

Lys Gly

Gin

Pro

Glu

Leu

Gin

Lys

Pro

Phe

Lys Tyr

Thr

180

185

190

ACG GIG

ACC

AAG AGG

TCC

CGT

CGG

ATC

CGG

CCC

ACA

CAC

CCI

GCC

TAGGC

626

Thr

Val

Thr

Lys Arg

Ser

Arg Arg

Ile

Arg

Pro

Thr

IHs

Pro Ala

195 200 205

CACCCCGCCG CGGCCCTCAG GTCGCCCTGG CCACACTCAC ACTCCCAGAA AACTGCATCA 586 GAGGAATATT TTTACATGAA AAATAAGGAT TÍTATTGTTG ACTTGAAACC CCCGATGACA 746 AAAGACTCAC GCAAAGGGAC TGTAGTCAAC CCACAGGTGC TLGTCTCTCT CTAGGAACAG 806 ACAACTCTAA ACTCGTCCCC AGAGGAGGAC TTGAATGAGG AAACCAACAC TTTGAGAAAC 866 CAAAGTCC1T TTTCCCAAAG GTTCTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAACTCGA G 917 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 2:

CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

( A) DÉLKA: 207 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

-37CZ 299288 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Met

Tyr

Ser

Ala

Pro

Ser

Ala

Cys

Thr

Cys

Leu

Cys

Leu

His

Phe

Leu

1

5

10

15

Leu

Cys

Phe

Gin

Val

Gin

Val

Leu

Val

Ala

Glu

Asn

Val

Asp

20

25

30

Phe

Arg

Ile

His

Val

Glu

Asn

Gin

Thr

Arg

Ala

Arg

Asp

Val

Ser

35

40

45

Arg

Lys

Gin

Leu

Arg

Leu

Tyr

Gin

Leu

Tyr

Ser

Arg

Thr

Ser

Gly

Lys

50

55

60

His

Ile

Gin

Val

Leu

Gly

Arg

Ile

Ser

Ala

Arg

Gly

Glu

Asp

Gly

65

70

75

80

Asp

Lys

Tyr

Ala

Gin

Leu

Val

Glu

Thr

Asp

Thr

Phe

Gly

Ser

Gin

85

90

95

Val

Arg

Ile

Lys

Gly

Lys

Glu

Thr

Glu

Phe

Tyr

Leu

Cys

Met

Asn

Arg

100

105

110

Lys

Gly

tys

Leu

Val

Gly

Lys

Pro

Asp

Gly

Thr

Ser

Lys

Glu

Cys

Val

115

120

125

Phe

Ile

Glu

Lys

Val

Leu

Glu

Asn

Tyr

Thr

Ala

Leu

Met

Ser

Ala

130

135

140

Lys

Tyr

Ser

Gly

Trp

Tyr

Val

Gly

Phe

Thr

Lys

Gly

Arg

Pro

Arg

145

150

155

160

Lys

Gly

Pro

Lys

Thr

Arg

Glu

Asn

Gin

Asp

Val

His

Phe

Met

Lys

165

170

175

Arg

Tyr

Pro

Lys

Gly

Gin

Pro

Glu

Leu

Gin

Lys

Pro

Phe

Lys

Tyr

Thr

180

185

190

Thr

Val

Thr

Lys

Arg

Ser

Arg

Ile

Arg

Pro

Thr

His

Pro

Ala

195

200

205

(2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC11676 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3

GGACTTGACT ACCGAAGGTG TCTG 24

-38CZ 299288 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární ío (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC11677 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4

GTCGATGTGA GCCGTAAGCA GCT 23 (3) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC 12053 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5

GCATACTTGT CCCCATCCTC GCCGCG 26 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 621 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6

ATGTAYWSNG CNCCNWSNGC NTGYACNTGY YTNTGYYTNC AYTTYYTNYT NYTNTGYHY 60 CARGTNCARG TNYTNGTNGC NGARGARAAY GTNGAYTTYM GNATHGAYGT NGARAARCAR 120 ACNMGNGCNM GNGAYGAYGT NWSNMGNAAR CARYTNMGNY TNTAYCARYT NTAYWSNMGN 180 ACNWSNG6NA ARCAYATHCA RGTNYTNGGN MGNMGNATHW SNGCNMGNGG NGARGAYGGN 240 GAYAARTAYG CNCARYTNYT NGTNGARACN GAYACNTTYG GNWSNCARGT NMGNATHAAR 300 GGNAARGARA CNGARTTYTA YYTNTGYATG AAYMGNAARG GNAARYTNGT NGGNAARCCN 360 GAYGGNACNW SNAARGARTG YGTNTTYATH GARAARGTNY TNGARAAYAA YTAYACNGCN 420 YTNATGWSNG CNAARTAYWS NGGNTGGTAY GTNGGNTTYA CNAARAARGG NMGNCCNMGN 480 AARGGNCCNA ARACNMGNGA RAAYCARCAR GAYGTNCAYT TYATGAARMG NTAYCCNAAR 540 GGNCARCCNG ARYTNCARAA RCCNTTYAAR TAYACNACNG TNACNAARMG NWSNMGNMGN 600 ATHMGNCCNA CNCAYCCNGC N 621

- 39CZ 299288 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 47 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární ío (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC12652 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7

TATTTATCTA GACTGGTTCC GCGTGCCGCC GAGGAGAACG TGGACTT 47 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC 12631 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

GTATTTGTCG ACTCAGGCAG GGTGTGTGGG CCG 33 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC 15290 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

GCCGAGGAGA ACGTGGACTT CC 22 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 47 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina

-40CL 299288 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC15270 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

TATTTATCTA GAGATGACGA TGACAAGGCC GAGGAGAACG TGGACTT 47 ío (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 41 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC 13497 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

AGCATTGCTA AAGAAGAAGG TGTAAGCTTG GACAAGAGAG A 41 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 63 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON:ZC15131 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

GGTGTAAGCT TGGACAAGAG AGAGGAGAAC GTGGACTTCC GCA1CCACGT GGAGAACCAG 60 ACG 63 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární 45 (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC 15134

-41 CZ 299288 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ1DN0: 13:

CCGGCTGTAG AGCTGGTACA GCCGCAGCTG CTTACGGCT 39 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina ío (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC13529 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CC 42 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 61 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC13525 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

ACGACGGTGA CCAAGAGGTC CCGTCGGATC CGGCCCACAC ACCCTGCCTA GGGGGMTTC 60 G 61 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 61 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární 40 (vii) ZDROJ:

(B) KLON :ZC 13 526 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

CAAACAGGCA GCCCTAGAAT ACTAGTGTCG ACTCGAGGAT CCGAATTCCC CCTAGGCAGG 60 G 61

-42CZ 299288 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vii) ZDROJ:

(B) KLON: ZC13528 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

CTCAAAAATT ATAAAAATAT CCAAACAGGC AGCCCTAGAA TACT 4 4 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 62 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) ZDROJ:

(B) KLON:ZC15132 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

CAGCCGCAGC TGCTTAGCGC TCACATCGTC CC6AGCCCGC GTCTGGTTCT CCACGTGGAT GC 62 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 141 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: dvouřetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

AGCATTGCTG CTAAAGAAGA AGGTGTAAGC TTGGACAAGA GAGAGGAGAA CGTGGACTTC 60

CGCATCCACG TGGAGAACCA GACGCGGGCT CGGGACGATG TGAGCCGTAA GCAGCTGCGG 120 CTGTACCAGC TCTACAGCCG G 141 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 144 párů bází

-43 CZ 299288 B6 (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

CTTCAGAAGC CCTTCAAGTA CACGACGGTG ACCAAGAGGT CCCGTCGGAT CCGGCCCACA 60 CACCCTGCCT AGGGGGAATT CGGATCCTCG AGTCGACACT AGTATTCTAG GGCTGCCTGT 120 TTGGATAÍTT TTATAATTTT TGAG 144

Claims

ío PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná polynukleotidová molekula kódující homologní polypeptid fibroblastového růstového faktoru (FGF), vybraná ze skupiny zahrnující:

15 a) polynukleotidová molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621,

b) polynukleotidová molekuly kódující polypeptid, který je alespoň z 80 % identický s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:
2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 207 (Ala) a

20 c) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621, přičemž polypeptid kódovaný polynukleotidem stimuluje proliferaci buněk odvozených od mezenchymálních kmenových buněk nebo jejich prekurzorů.

25 2. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 1, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 1 do nukleotidu 621 nebo nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 1 do nukleotidu 621.
3. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 1, která obsahuje nukleotidovou sekven30 ci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621.
4. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 1, kde polynukleotid je DNA.
5. Expresní vektor obsahující následující operabilně spojené elementy:

35 - promotor transkripce segment DNA vybraný ze skupiny zahrnující:

a) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621,

b) polynukleotidové molekuly kódující polypeptid, který je alespoň z 80 % identický

40 s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 207 (Ala) a

c) polynukleotidové molekuly obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6 od nukleotidu 82 do nukleotidu 621 a terminátor transkripce,

-44CZ 299288 B6 přičemž polypeptid kódovaný polynukleotidem stimuluje proliferaci buněk odvozených od mezenchymálních kmenových buněk nebo jejich prekurzorů.
6. Kultivovaná buňka mající zaveden expresivní vektor podle nároku 5, která exprimuje polypeptid kódovaný segmentem DNA.
7. Způsob produkce homologního polypeptidu FGF, vyznačující se tím, že zahrnuje:

- kultivaci buňky, do které se zavedl expresivní vektor podle nároku 5, přičemž uvedená buňka exprimuje homologní peptid FGF kódovaný segmentem DNA a

- získání homologního polypeptidu FGF.
8. Izolovaný homologní polypeptid FGF vybraný ze skupiny, která zahrnuje:

a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 175 (Met),

b) polypeptidové molekuly, které jsou alespoň z 80 % identické se sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 175 (Met), přičemž polypeptid stimuluje proliferaci buněk odvozených od mezenchymálních kmenových buněk nebo jejich prekurzorů.
9. Izolovaný homologní polypeptid FGF vybraný ze skupiny, která zahrnuje:

a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 196 (Lys),

b) polypeptidové molekuly, které jsou alespoň z 80 % identické se sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 196 (Lys), přičemž polypeptid stimuluje proliferaci buněk odvozených od mezenchymálních kmenových buněk nebo jejich prekurzorů.
10. Izolovaný homologní polypeptid FGF vybraný ze skupiny, která zahrnuje:

a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 207 (Ala),

b) polypeptidové molekuly, které jsou alespoň z 80 % identické se sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do zbytku 207 (Ala), přičemž polypeptid stimuluje proliferaci buněk odvozených od mezenchymálních kmenových buněk nebo jejich prekurzorů.
11. Homologní polypeptid FGF podle nároku 8, který dále obsahuje signální sekvenci.
12. Homologní polypeptid FGF podle nároku 8, který dále obsahuje signální sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 1 (Met) do aminokyselinového zbytku 27 (Ala).
13. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje čištěný homologní polypeptid podle nároku 8 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným vehikulem.
14. Protilátky, které váží epitop polypeptidu obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 1 (Met) do zbytku 207 (Ala).
15. Protilátky podle nároku 14, které váží polypeptidovou molekulu obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 196 (Lys).

-45CZ 299288 B6
16. Použití homologního polypeptidů FGF vybraného ze skupiny zahrnující:

a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 175 (Met),

b) polypeptidové molekuly, které jsou alespoň z 80 % identické se sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 175 (Met), jak se uvádí v SEQ ID NO: 2, přičemž polypeptid je obsažen v množství, které je dostatečné pro produkci klinicky podstatného vzrůstu počtu myocytů nebo myocytových progenitorů v uvedeném savci, pro přípravu léčiva pro léčbu onemocnění srdce, infarktu myokardu, městnavého srdečního selhání, hypertrofní kardiomyopatie, rozšířené kardiomyopatie, mozkové příhody, systémové nebo pulmorální hypertenze, defektů kostí, fraktury kostí, periodontálního onemocnění, osteoporézy a podobných stavů.
17. Použití podle nároku 16, přičemž myocyty nebo myocytové progenitory jsou kardiální myocyty nebo progenitory kardiálních myocytů.
18. Způsob stimulace ex vivo myocytových progenitorových buněk nebo myocytů, vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci buněk srdeční tkáně s množstvím homologního polypeptidů FGF vybraného ze skupiny zahrnující:

a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 175 (Met),

b) polypeptidové molekuly, které jsou alespoň z 80 % identické se sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 175 (Met), jak se uvádí v SEQ ID NO: 2, které je dostatečné ve srovnání s myocytovými progenitorovými buňkami nebo myocyty kultivovanými bez přítomnosti homologního polypeptidů FGF k produkci zvýšeného počtu myocytových progenitorových buněk nebo myocytů v buňkách srdeční tkáně kultivovaných v přítomnosti homologního polypeptidů FGF.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že myocyty nebo myocytové progenitory jsou kardiální myocyty nebo kardiální myocytové progenitory.
20. Použití první molekuly obsahující polypeptid FGF vybraný ze skupiny zahrnující:

a) polypeptidové molekuly obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28 (Glu) do zbytku 175 (Met),

b) polypeptidové molekuly, které jsou alespoň z 80 % identické se sekvencí SEQ ID NO: 2 od aminokyselinového zbytku 28 (Glu) do aminokyselinového zbytku 175 (Met), jak se uvádí v SEQ ID NO: 2, přičemž polypeptid kódovaný polynukleotidem stimuluje proliferací buněk odvozených od mezenchymálních kmenových buněk nebo jejich prekurzorů, v kombinaci s druhou molekulou obsahující činidlo nebo lék za vzniku chiméry, pro přípravu léčiva pro léčení onemocnění srdce nebo povzbuzení srdeční hyperplazie, kde léčivo selektivně předá činidlo nebo lék do srdeční tkáně.
21. Izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 od zbytku 28(Glu) do zbytku 196(Lys) dále obsahující methioninový zbytek na aminokonci.