CN107849151B - 融合多肽及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含来自第一和第二FGF家族成员的片段的融合多肽、编码该融合多肽的核酸、含有该核酸的载体和宿主细胞，以及制备这类组合物和在FGF相关疾病、病症和状况的治疗中使用这类组合物的方法。

Description

融合多肽及使用方法
交叉引用
本申请要求2015年7月15日提交的PCT申请序列号PCT/CN2015/084133的优先权，该申请在此通过引用整体并入本文以用于所有目的。
背景技术
成纤维细胞生长因子(FGF)18，与FGF8和FGF17一起，代表FGF家族的子集。它们以硫酸肝素糖胺聚糖(HSGAG)依赖性方式结合FGFR家族的酪氨酸激酶受体并通过其传递信号(Nature reviews drug discovery.2009；vol 8:235-253)。
在体外，以及在体内在损伤的关节而不是正常的关节中，FGF18增加软骨细胞增殖并刺激细胞外基质(ECM)形成(Arthritis Rheum.2006；54:3850-3858.Gene.2008；420:82-89.)。
骨关节炎(OA)是世界上一种普遍的疾病，对当今社会具有巨大的社会经济影响。它是在老年人群中致残的首要原因(Clin Orthop Relat Res 2004:S6-S15)。这种状况的发病机理涉及软骨组织的进行性恶化。全厚度软骨缺陷，包括早期OA，具有有限的愈合潜力。正在考虑使用FGF18作为用于软骨修复和OA的潜在疗法(Osteoarthritis andCartilage 19S1(2011)S7-S52)。目前的治疗，包括生活方式的改变、止痛药和手术，均效果有限。
发明内容
因此，非常需要针对OA以及其他涉及软骨修复的疾病的新药物。本发明解决了这种需要，并且还提供了相关的优点。本发明涵盖修饰的融合多肽。本发明还提供了例如在原核系统如大肠杆菌中产生融合多肽的方法。此外，本发明提供了该融合多肽在治疗包括但不限于骨关节炎、退行性椎间盘疾病和软骨损伤的软骨缺陷中的药物用途。在一些实施方案中，本发明提供了该融合多肽在软骨修复中，例如在软骨微骨折手术中的药物用途。
在一个方面，本发明提供了一种融合多肽，其包含来自蛋白质家族的第一成员的第一片段和来自所述蛋白质家族的第二成员的第二片段，其中第一和第二片段在融合位点处融合在一起以形成连续多肽。在一些实施方案中，该融合位点包含与所述蛋白质家族的所述第一和所述第二成员中的相应序列相同的至少约6个氨基酸的序列。
所述融合多肽可具有与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相当的促进表达FGF受体的细胞生长的能力。在一些实施方案中，所述细胞表达选自FGFR3、FGFR3c、FGFR3c-1c、FGFR3b、FGFR3-IIIc、FGFR3-IIIb、FGFR1c、FGFR2c、FGFR4-1c和FGFRdelta4-1c的至少一种FGF受体。在一些实施方案中，所述至少一种FGF受体选自FGFR3c和FGFR3c-1c。在一些实施方案中，所述至少一种FGF受体为FGFR3c-1c。进一步地，所述融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平促进细胞生长的能力。在一些实施方案中，所述细胞是表达FGF受体的BaF3细胞。
在一些情况下，所述融合多肽可具有在体外促进表达FGF受体的BaF3细胞生长的能力。另外，该融合多肽可具有在体内促进表达FGF受体的BaF3细胞生长的能力。在一些实施方案中，该融合多肽在以小于约1μg/ml、100ng/ml、90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、29ng/ml、28ng/ml、27ng/ml、26ng/ml、25ng/ml、24ng/ml、23ng/ml、22ng/ml、21ng/ml、20ng/ml、19ng/ml、18ng/ml、17ng/ml、16ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、11ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、1.5ng/ml、1ng/ml、0.9ng/ml、0.8ng/ml、0.7ng/ml、0.6ng/ml、0.5ng/ml、0.4ng/ml、0.3ng/ml、0.2ng/ml或0.1ng/ml的浓度应用时显示出在体外促进表达FGF受体的BaF3细胞生长的能力。在一些实施方案中，所应用的浓度可以是0.1ng/ml至100ng/ml，例如，1ng/ml至100ng/ml、2ng/ml至100ng/ml、3ng/ml至100ng/ml、4ng/ml至100ng/ml、5ng/ml至100ng/ml、6ng/ml至100ng/ml、7ng/ml至100ng/ml、8ng/ml至100ng/ml、9ng/ml至100ng/ml、10ng/ml至100ng/ml、11ng/ml至100ng/ml、12ng/ml至100ng/ml、13ng/ml至100ng/ml、14ng/ml至100ng/ml、15ng/ml至100ng/ml、16ng/ml至100ng/ml、17ng/ml至100ng/ml、18ng/ml至100ng/ml、19ng/ml至100ng/ml、20ng/ml至100ng/ml、21ng/ml至100ng/ml、22ng/ml至100ng/ml、23ng/ml至100ng/ml、24ng/ml至100ng/ml、25ng/ml至100ng/ml、26ng/ml至100ng/ml、27ng/ml至100ng/ml、28ng/ml至100ng/ml、29ng/ml至100ng/ml、30ng/ml至100ng/ml、40ng/ml至100ng/ml、50ng/ml至100ng/ml、60ng/ml至100ng/ml、70ng/ml至100ng/ml、80ng/ml至100ng/ml或90ng/ml至100ng/ml。
在一些实施方案中，所述融合多肽具有与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQID NO:2)相当的刺激软骨细胞增殖的能力。例如，该融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平刺激软骨细胞增殖的能力。在一些实施方案中，该融合多肽具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平刺激软骨细胞增殖的能力。在进一步的情况下，该融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％的水平刺激软骨细胞增殖的能力。
在一些实施方案中，所述融合多肽具有与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQID NO:2)相当的增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。例如，该融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。在一些实施方案中，该融合多肽具有以FGF18(SEQ IDNO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。在进一步的情况下，该融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％的水平增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。
在另一方面，本发明提供一种融合多肽，其包含来自FGF家族的第一成员的第一片段和来自FGF家族的第二成员的第二片段，其中所述第一和第二片段在融合位点处融合在一起以形成连续多肽。该融合位点可包含与FGF家族的所述第一和所述第二成员的相应序列相同的至少约6个氨基酸的序列。
在一些实施方案中，所述融合多肽具有与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQID NO:2)相当的促进表达FGF受体的细胞生长、刺激软骨细胞增殖和/或增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。例如，该融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQID NO:2)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平促进表达FGF受体的细胞生长、刺激软骨细胞增殖和/或增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。
在一些实施方案中，所述融合多肽具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平促进表达FGF受体的细胞生长、刺激软骨细胞增殖和/或增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。例如，该融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％的水平促进表达FGF受体的细胞生长、刺激软骨细胞增殖和/或增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。
在一些实施方案中，所述融合多肽具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平促进表达FGFR3c-1c的BaF3细胞生长的能力。例如，该融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％的水平促进表达FGFR3c-1c的BaF3细胞生长的能力。
在一些实施方案中，所述融合多肽具有以FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平促进表达FGF受体的细胞生长、刺激软骨细胞增殖和/或增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。例如，该融合多肽可具有以FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％的水平促进表达FGF受体的细胞生长、刺激软骨细胞增殖和/或增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。
在一些实施方案中，所述融合多肽具有以FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平促进表达FGFR3c-1c的BaF3细胞生长的能力。例如，该融合多肽可具有以FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％的水平促进表达FGFR3c-1c的BaF3细胞生长的能力。
在一些实施方案中，所述融合多肽保留所述第一或所述第二成员的二级结构。
在一些实施方案中，与所述第一或所述第二成员相比，所述融合多肽缺乏任何额外的T-表位。
在一些实施方案中，与所述第一或所述第二成员相比，所述融合多肽缺乏任何额外的B-表位。
在一些实施方案中，所述蛋白质家族为FGF蛋白质家族。
在一些实施方案中，在本发明的融合多肽中，所述第一成员为FGF18或其同种型。
在一些实施方案中，在本发明的融合多肽中，所述第二成员为FGF17-1或其同种型。
在一些实施方案中，在本发明的融合多肽中，所述第一成员为FGF18或其同种型，并且所述第二成员为FGF17-1或其同种型。
在另一方面，本发明提供了一种融合多肽，其具有式(I)的结构：(S1)-(β1)-(S2)-(β2)-(S3)-(β3)-(S4)-(β4)-(S5)-(β5)-(S6)-(β6)-(S7)-(β7)-(S8)-(β8)-(S9)-(β9)-(S10)-(β10)-(S11)-(β11)-(S12)-(β12)-S13(I)
其中：
a)β2包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约I39至G43残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约V44至G48残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
b)β3包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约R45至A48残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约R50至A53残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
c)β5包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q69至K75残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约R74至A80残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
d)β6包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约F79至L81残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K84至I86残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
e)β7包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约K88至G91残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K93至G96残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
f)β8包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约V101至K105残基或FGF17-1(SEQ IDNO:2)的约V106至I110残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
g)β10包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约G121至V124残基或FGF17-1(SEQ IDNO:2)的约G126至M129残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
h)β11包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约K134至T138残基或FGF17-1(SEQ IDNO:2)的约Q139至S143残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；
S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12和S13中的每一个独立地为具有1个至约50个氨基酸残基的间隔区序列；
并且其中：
i)β1包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF17-1(SEQID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
ii)β1包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
iii)β1包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
iv)β1包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；β12包含与具有FGF18(SEQID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
v)β1包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF17-1(SEQID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
vi)β1包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF17-1(SEQID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
vii)β1包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
viii)β1包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
ix)β1包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；β12包含与具有FGF18(SEQID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
x)β1包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF17-1(SEQID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
xi)β1包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF18(SEQ IDNO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
xii)β1包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；β12包含与具有FGF18(SEQID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
xiii)β1包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF17-1(SEQID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；或
xiv)β1包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β4包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β9包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列；并且β12包含与具有FGF18(SEQID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少90％同源性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，β1与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段相同。
在一些实施方案中，β1与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段相同。
在一些实施方案中，β4与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段相同。
在一些实施方案中，β4与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约T68残基的片段相同。
在一些实施方案中，β9与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段相同。
在一些实施方案中，β9与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段相同。
在一些实施方案中，β12与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段相同。
在一些实施方案中，β12与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段相同。
在一些实施方案中，所述融合多肽进一步在与FGF18(SEQ ID NO:1)中的氨基酸残基相对应的氨基酸残基中包含至少一个修饰，其中所述至少一个修饰选自Y151L、P152Y、K153Q、156aL、156bP、156cF、156dP、156eN、156fH、P156A、L158K、P161Q、K163E、Y164F、165aV、165bG、165cS、165dA、165eP、T166R、V167R、S171T、I174P、R175Q、T177L、H178T、desP179和des A180。
在一些实施方案中，所述融合多肽进一步在与FGF17-1(SEQ ID NO:2)中的氨基酸残基相对应的氨基酸残基中包含至少一个修饰，其中所述至少一个修饰选自I30L、E32L、L156Y、Y157P、Q158K、des L161、des P162、des F163、des P164、des N165、des H166、A167P、K169L、Q172P、E174K、F175Y、des V176、des G177、des S178、des A179、des P180、R182T、R183V、T187S、P190I、Q191R、L193T、T194H、195aP和195bA。
在一些实施方案中，所述融合多肽进一步包含融合位点，该融合位点包含与FGF18(SEQ ID NO:1)和FGF17-1(SEQ ID NO:2)中的相应序列相同的至少约6个氨基酸的序列。在一些实施方案中，该融合位点包含与FGF18(SEQ ID NO:1)和FGF17-1(SEQ ID NO:2)中的相应序列相同的至少约8个氨基酸的序列。在一些实施方案中，该融合位点包含与FGF18(SEQID NO:1)和FGF17-1(SEQ ID NO:2)中的相应序列相同的约6-25个氨基酸的序列。
在一些实施方案中，所述融合多肽保留FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ IDNO:2)的二级结构。
在一些实施方案中，所述融合多肽与FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比缺乏任何额外的T-表位。
在一些实施方案中，所述融合多肽与FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比缺乏任何额外的B-表位。
在一些实施方案中，所述融合多肽与FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ ID NO:2)展现出小于约90％的序列同源性。
在一些实施方案中，所述融合多肽与FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ ID NO:2)展现出小于约95％的序列同源性。
在一些实施方案中，所述融合多肽的N-末端进一步被聚乙二醇(PEG)修饰。在一些实施方案中，该聚乙二醇为单甲氧基PEG丙醛。在一些实施方案中，该聚乙二醇的分子量为约12Kd至40Kd。
在一些实施方案中，与FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽展现出延长的体内半衰期。
在一些实施方案中，与FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽展现出增强的化学稳定性。
在一些实施方案中，所述融合多肽包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了表达本发明的融合多肽的宿主细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是原核细胞。
在进一步的方面，本发明提供了治疗有需要的哺乳动物中的软骨缺陷的方法，其包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本发明所述的融合多肽或其聚乙二醇化衍生物。在一些实施方案中，该软骨缺陷选自骨关节炎、退行性椎间盘疾病和软骨损伤。在一些实施方案中，所述治疗软骨缺陷为软骨修复，例如，软骨微骨折手术。
在另一方面，本发明提供了本发明所述的融合多肽或其聚乙二醇化衍生物在制备用于治疗有需要的哺乳动物中的软骨缺陷的组合物中的用途。在一些实施方案中，该软骨缺陷选自骨关节炎、退行性椎间盘疾病和软骨损伤。在一些实施方案中，所述治疗软骨缺陷为软骨修复，例如，软骨微骨折手术。在一些实施方案中，所述组合物为药物组合物。在一些实施方案中，所述组合物被配制为药物。
在又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种本发明的融合多肽或其聚乙二醇化衍生物，以及药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种本发明的融合多肽或其聚乙二醇化衍生物，以及第二治疗剂。
在另一方面，本发明提供了一种载体，其包含编码本发明的融合多肽的多核苷酸。在进一步的方面，本发明提供了一种产生本发明的融合多肽的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下在细胞中表达该载体，从而产生该融合多肽。
通过下列详细描述，本公开内容的其他方面和优点对本领域技术人员而言将会变得显而易见，详细描述中仅示出和描述了本发明的说明性实施方案。如将会意识到的，本发明能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和说明书本质上将被视为说明性的而不是限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及其附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1示出了在使用本发明的方法进行融合多肽及其参考多肽(SEQ ID NO:1、2、4、11和15)的蛋白质表达后，对溶解的包涵体的SDS-PAGE分析。
图2示出了在使用本发明的方法进行融合多肽及其参考多肽(SEQ ID NO:1、2、4、11和15)的重折叠和纯化后的SDS-PAGE分析。
图3示出了用阳性对照(FGF1)、参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)处理后96小时，BaF3/FGFR1b细胞的剂量依赖性增殖。
图4示出了用阳性对照(FGF1)、参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)处理后96小时，BaF3/FGFR1c细胞的剂量依赖性增殖。
图5示出了用阳性对照(FGF1)、参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)处理后96小时，BaF3/FGFR2c细胞的剂量依赖性增殖。
图6示出了用阳性对照(FGF1)、参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)处理后96小时，BaF3/FGFR3b细胞的剂量依赖性增殖。
图7示出了用阳性对照(FGF1)、参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)处理后96小时，BaF3/FGFR3c-1c细胞的剂量依赖性增殖。
图8示出了用阳性对照(FGF1)、参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)处理后96小时，BaF3/FGFR4-1c细胞的剂量依赖性增殖。
图9示出了用阳性对照(FGF1)、参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)处理后96小时，BaF3/FGFRdelta4-1c细胞的剂量依赖性增殖。
图10示出了用参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)对软骨细胞增殖的刺激。
图11示出了如通过番红(Safranin)O染色所示，参考多肽(SEQ ID NO:1和2)和融合多肽(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)对产生蛋白聚糖的影响。
具体实施方式
在描述本发明的实施方案之前，应当理解，这些实施方案仅通过举例给出，并且本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下将会想到许多变化、改变和替换。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员普遍理解的相同。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但下文仍描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并非旨在进行限制。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下将会想到许多变化、改变和替换。
如在本说明书和权利要求书中所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性的或分支的，它可以包括修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸打断。该术语还涵盖已通过例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作(例如与标记组分的缀合)而修饰的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括但不限于D或L旋光异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。标准的单字母或三字母代码用来指称氨基酸。
术语“天然的L-氨基酸”意指甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的L旋光异构体形式。
用于序列并在本文中使用的术语“非天然存在的”意指与在哺乳动物中发现的野生型或天然存在的序列不具有对应物、不互补或者不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，当适当比对时，与天然序列相比，非天然存在的多肽或片段可享有低于99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更低的氨基酸序列同一性。或者，当适当比对时，与天然序列相比，非天然存在的多肽或片段可享有超过99％、98％、95％、90％、80％、70％、60％、50％或甚至更高的氨基酸序列同一性。
术语“亲水性”和“疏水性”是指物质所具有的与水的亲和性程度。亲水性物质对水具有强亲和性，倾向于在水中溶解、与水混合或被水润湿，而疏水性物质基本上缺乏对水的亲和性，倾向于排斥及不吸收水并倾向于不在水中溶解或不与水混合或不被水润湿。氨基酸可以根据它们的疏水性来表征。已经开发了多个标度(scale)。一个实例是在Hopp,TP等,Proc Natl Acad Sci U S A(1981)78:3824中列出的、由Levitt,M等,J Mol Biol(1976)104:59开发的标度。“亲水性氨基酸”的实例为精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特别感兴趣的是亲水性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸和丝氨酸以及甘氨酸。“疏水性氨基酸”的实例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。
“片段”当用于蛋白质时为天然生物活性蛋白质的截短形式，其可能保留或可能不保留一部分治疗性和/或生物活性。“变体”当用于蛋白质时为与天然生物活性蛋白质具有序列同源性的蛋白质，其保留该生物活性蛋白质的至少一部分治疗性和/或生物活性。例如，与参考生物活性蛋白质相比，变体蛋白质可以享有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。如本文所用，术语“生物活性蛋白质部分”包括例如通过定点诱变、编码基因的合成、插入而有意修饰的或通过突变而偶然修饰的蛋白质。
“缀合的”、“连接的”、“融合的”和“融合”在本文中可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组手段在内的任何手段将两个或更多个化学元件、序列或组分连接在一起。例如，如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列有效连接。通常，“有效连接的”意指所连接的DNA序列是连续的并且在阅读相内或符合读框。“符合读框的融合”是指两个或更多个开放阅读框(ORF)以保持原始ORF的正确阅读框的方式连接，以形成连续的更长的ORF。因此，所得到的“融合多肽”是含有与由原始ORF(这些区段在自然界中通常不如此连接)编码的多肽相对应的两个或更多个片段的单一蛋白质。“融合位点”是指其中两个或更多个片段连接在一起的序列。在一些情况下，融合位点可以是与所连接的两个或更多个片段中的序列相同的序列。例如，融合位点可包含与所连接的片段中的序列相同的约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸的序列。在一些实施方案中，融合位点可包含与所连接的片段中的序列相同的约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸的序列。例如，融合位点可包含与所连接的片段中的序列相同的约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个氨基酸的序列。在一些情况下，融合位点可进一步包含与所连接的两个或更多个片段中的任一个序列不同的缺口区段。该缺口区段可见于融合位点的氨基酸序列内。此外，该缺口区段可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。例如，融合位点可包含各自与两个片段中的一个或两个相同的8个氨基酸，以及与所连接的两个或更多个片段的任一个序列不同的8个氨基酸序列内的2个氨基酸的缺口区段。
在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”是在多肽中的氨基酸在氨基至羧基末端方向上的顺序，其中在该序列中彼此相接的残基在多肽的一级结构中是连续的。“部分序列”是构成已知在一个或两个方向上包含额外残基的多肽一部分的线性序列。
在本发明中，术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析确定的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分打断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。
术语“基因”和“基因片段”在本文中可互换使用。它们是指包含至少一个开放阅读框的多核苷酸，其在转录和翻译后能够编码特定蛋白质。基因或基因片段可以是基因组DNA或cDNA，只要所述多核苷酸含有至少一个可覆盖整个编码区或其区段的开放阅读框。“融合基因”是由连接在一起的至少两个异源多核苷酸组成的基因。
“同源性”或“同源的”或“序列同一性”是指在两个或更多个多核苷酸序列之间或在两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换性。当使用程序(例如Emboss Needle或BestFit)确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认设置，或者可以选择适当的打分矩阵，例如blosum45或blosum80，来优化同一性、相似性或同源性得分。优选地，同源的多核苷酸是那些在如本文所定义的严格条件下杂交并且与这些序列相比具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、更优选95％、更优选97％、更优选98％并且甚至更优选99％的序列同一性的多核苷酸。当对可比长度的序列进行最佳比对时，同源的多肽优选具有至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少97％，或至少98％的序列同一性，或具有至少99％的序列同一性。
用于多核苷酸序列的术语“同一性百分比”和“％同一性”是指在使用标准化算法比对的至少两个多核苷酸序列之间的残基匹配的百分比。这样的算法可以以标准化和可再现的方式在所比较的序列中插入缺口，以便优化两个序列之间的比对，并由此实现两个序列的更有意义的比较。同一性百分比可以在整个定义的多核苷酸序列的长度上进行测量，或者可以在较短的长度上，例如在从较大的、定义的多核苷酸序列取得的片段的长度上进行测量，该片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450个连续残基的片段。这些长度只是示例性的，并且应该理解，由本文的表格、附图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度可以用来描述在其上可以测量同一性百分比的长度。
就本文所确定的多肽序列而言，“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并在必要情况下引入缺口以获得最大序列同一性百分比后，并且不把任何保守置换视为序列同一性的一部分，查询序列中与第二、参考多肽序列或其部分的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。可以以本领域技术内的各种方式，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件，来实现旨在确定氨基酸序列同一性百分比的比对。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适的参数，包括在所比较的序列的全长上获得最大比对所需的任何算法。同一性百分比可以在整个定义的多核苷酸序列的长度上进行测量，或者可以在较短的长度上，例如，在从较大的、定义的多核苷酸序列取得的片段的长度上进行测量，该片段例如是至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150个连续残基的片段。这些长度只是示例性的，并且应该理解，由本文的表格、附图或序列表中所示的序列支持的任何片段长度可以用来描述在其上可以测量同一性百分比的长度。
“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明载体的接受体的单个细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代。该后代因天然的、偶然的或有意的突变而可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在总DNA互补体的形态学上或基因组上)。宿主细胞包括在体外用本发明的载体转染的细胞。在一些情况下，宿主细胞是原核细胞。在一些实例中，该原核细胞是大肠杆菌。
“载体”是优选地在适当的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移至宿主细胞之内和/或之间。该术语包括主要起到将DNA或RNA插入至细胞内的作用的载体，主要起到DNA或RNA复制的作用的载体复制，以及起到DNA或RNA转录和/或翻译的作用的表达载体。还包括提供多于一种上述作用的载体。“表达载体”是当被引入至合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常意指包含能够用以产生所需表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指本文所述化合物足以实现下文所定义的预期应用(包括但不限于疾病治疗)的量。治疗有效量可根据预期的应用(体外或者体内)或者所治疗的受试者和疾病状况，例如受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等而不同，其可容易地由本领域普通技术人员来确定。该术语也适用于将会诱导靶细胞中的特定响应，例如靶基因诱导、增殖和/或细胞凋亡的剂量。具体剂量将根据所选择的特定化合物、将遵循的给药方案、是否与其他化合物联合施用、施用时机、施用的组织和将其携带的物理递送系统而不同。
如本文所用，“治疗”或“处理”或“减轻”或“改善”在本文中可互换使用。这些术语是指用于获得有益或期望的结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方法。所谓治疗益处意指正在治疗的潜在病症的根除或改善。另外，如下所述也获得治疗益处：一种或多种与潜在病症相关的生理学症状根除或改善，使得在受试者中观察到改善，尽管该受试者可能仍受潜在病症的折磨。对于预防益处，可以将组合物施用于具有发展成特定疾病的风险的受试者或报告了疾病的一个或多个生理症状的受试者，即使可能还没有作出该疾病的诊断。
在本文中使用时，术语“治疗效果”涵盖上文所述的治疗益处和/或预防益处。预防效果包括延迟或消除疾病或状况的出现，延迟或消除疾病或状况的症状发作，减缓、停止或逆转疾病或状况的进展，或它们的任意组合。
如本文所用，术语“共同施用”、“联合施用”及其语法等同词涵盖向动物施用两种或更多种药剂，使得药剂和/或其代谢物同时存在于受试者中。共同施用包括在分开的组合物中同时施用，在分开的组合物中在不同时间施用，或在存在两种药剂的组合物中施用。
术语“药学上可接受的盐”是指由多种本领域公知的有机和无机抗衡离子衍生的盐，并且包括，仅举例而言，当分子包含酸性官能团时，钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等的盐；和当分子包含碱性官能团时，有机或无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐(甲烷磺酸盐)、乙磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐、磷酸盐等。在具有多于一个碱性部分的化合物中，多于一个碱性部分可转化成盐形式，包括但不限于双盐或三盐。或者，具有多于一个碱性部分的化合物可仅在一个碱性部分处形成盐。
术语“拮抗剂”和“抑制剂”在本文中可互换使用，并且它们是指具有抑制靶蛋白质的生物功能的能力的化合物，无论是否通过抑制靶蛋白质的活性或表达。因此，术语“拮抗剂”和“抑制剂”在靶蛋白质的生物学作用的背景中定义。尽管本文优选的拮抗剂特异性地与靶标相互作用(例如结合)，但是通过与信号转导途径(该靶蛋白质是该途径的成员)的其他成员相互作用来抑制靶蛋白质的生物活性的化合物也特别地包含于该定义内。被拮抗剂抑制的优选生物活性与肿瘤的发展、生长或扩散相关。
如本文所用的术语“激动剂”是指具有启动或增强靶蛋白质的生物功能的能力的化合物，无论是通过抑制还是增强靶蛋白质的活性或表达。因此，术语“激动剂”在靶多肽的生物学作用的背景中定义。尽管本文优选的激动剂特异性地与靶标相互作用(例如结合)，但通过与信号转导途径(该靶多肽是该途径的成员)的其他成员相互作用来启动或增强靶多肽的生物活性的化合物也特别地包含于该定义内。
如本文所用，“药剂”或“生物活性剂”是指生物学的、药学的或化学的化合物或其他部分。非限制性实例包括简单的或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、寡核苷酸、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合物、毒素或化学治疗化合物。可以基于各种核心结构合成各种化合物，例如，小分子和寡聚体(例如寡肽和寡核苷酸)以及合成的有机化合物。另外，各种天然来源可以提供用于筛选的化合物，例如植物或动物提取物等。
“抗癌剂”、“抗肿瘤剂”或“化疗剂”是指在瘤状况的治疗中有用的任何药剂。一类抗癌剂包括化疗剂。“化疗”意指通过各种方法，包括静脉内、口服、肌内、腹膜内、膀胱内、皮下、经皮、经颊或吸入或以栓剂的形式，向癌症患者施用一种或多种化疗药物和/或其他药剂。
术语“细胞增殖”是指因分裂而改变细胞数目的现象。例如，细胞增殖可导致细胞数增加。此术语也涵盖由此使细胞生态学已经改变(例如，尺寸增加)与增殖信号一致的细胞生长。
术语“选择性抑制”或“选择性地抑制”是指生物活性剂通过与靶标的直接或间接相互作用，与脱靶信号活性相比，优先降低靶信号活性的能力。
术语“体内”是指在受试者体内发生的事件。
术语“体外”是指在受试者体外发生的事件。例如，体外试验涵盖在受试者试验之外进行的任何试验。体外试验涵盖基于细胞的试验，其中采用活细胞或死细胞。体外试验还涵盖无细胞试验，其中不采用完整的细胞。
多肽的命名法
本文中可互换地使用多肽命名法、有机化学命名法、化学式、氨基酸序列或其混合来命名多肽。例如，FGF18的类似物中的置换也可表示为“原始氨基酸-位置-置换的氨基酸”。
因此，符号“L25I FGF18”或“Leu25Ile FGF18”的意思是，当类似物与FGF18如下所述进行比对(“比对”)时，该FGF18类似物在与FGF18(SEQ ID NO:1)中的第25位氨基酸相对应的类似物氨基酸位置处包含亮氨酸至异亮氨酸的置换。多个置换可以用逗号隔开(逗号后有空格)并用括号环绕，以清楚地表明它们属于同一类似物。因此，“(L25I,L27E)FGF18”的意思是，该FGF18类似物在分别与FGF18(SEQ ID NO:1)中位置25和27处的氨基酸相对应的类似氨基酸位置处包含两个置换(分别为亮氨酸置换为异亮氨酸，以及亮氨酸置换为谷氨酸)。
FGF18的类似物中的延伸可以如下描述：参照SEQ ID NO:1，向所讨论的化合物上添加位置编号(在C-末端使用连续的正数而在N-末端使用负数)，或者更简单地，使用其正确的序列添加所讨论的延伸的氨基酸。因此，M-FGF18表示参照SEQ ID NO:1在位置-1处具有M的SEQ ID NO:1的多肽。
FGF18的类似物中的插入可描述为：“插入前的氨基酸位置编号-索引-插入的氨基酸”。插入前的氨基酸位置编号是指FGF18(SEQ ID NO:1)中恰在缺口前的氨基酸位置，该缺口在插入类似物与FGF18如下所述进行比对(“比对”)时产生。该索引是按字母顺序的小写字母，例如，“a”表示第一个插入的氨基酸，“b”表示第二个插入的氨基酸，等等。因此，“82aGFGF18”表示在FGF18(SEQ ID NO:1)中的氨基酸位置82后插入甘氨酸的FGF18的类似物。
FGF18的类似物中的缺失可描述为：“des缺失的氨基酸-缺失的氨基酸位置”或“d缺失的氨基酸-缺失的氨基酸位置”。缺失的氨基酸位置是指FGF18(SEQ ID NO:1)中在缺口处的氨基酸位置，该缺口在该类似物与FGF18如下所述进行比对(“比对”)时产生。因此，“des L25FGF18”表示在FGF18(SEQ ID NO:1)的第25位处缺失亮氨酸残基的FGF18的类似物。
如果需要的话，两个氨基酸序列的比对可以通过使用来自EMBOSS软件包的Needle程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)来进行。Needle程序执行全局比对算法(J.Mol.Biol.1970,48:443-453)。使用的取代矩阵是BLOSUM62，空位开启罚分是50且空位延伸罚分是0.5。
融合多肽、宿主细胞和载体
本发明涉及可用于治疗哺乳动物中的疾病状况的融合多肽。该融合多肽可包含来自蛋白质家族的第一成员的第一片段和来自第二成员的第二片段。在一些情况下，第一和第二成员均可以是同一蛋白质家族的成员。在其他情况下，第一和第二成员可属于不同的蛋白质家族。在某些实施方案中，第一和/或第二成员属于FGF家族。在一些实例中，该融合多肽可包含来自第一和第二FGF家族成员(或其同种型)的片段。FGF家族成员的实例包括但不限于FGF18、FGF17和FGF8，及其各种同种型。在一些实例中，第一FGF家族成员是FGF18或其同种型，包括但不限于如SEQ ID NO:1中所示的那些。在一些实例中，第二FGF家族成员是FGF17-1或其同种型，包括但不限于如SEQ ID NO:2中所示的那些。在进一步的实例中，第一FGF家族成员是FGF18或其同种型，并且第二FGF家族成员是FGF17-1或其同种型。
在一些情况下，所述片段可以在融合位点处融合在一起，从而形成连续多肽。在一些实例中，该融合位点可包含与在第一和第二家族成员中发现的相应序列相同的至少约6个氨基酸的序列。在进一步的实例中，该融合位点可包含与在第一和第二成员中发现的相应序列相同的约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸的序列。在第一和第二成员各自为FGF家族成员的情况下，融合位点可包含与在第一和第二FGF家族成员、其同种型和/或突变体中发现的相应序列相同的约8、9、10或11个氨基酸的序列。
在一些情况下，所述融合多肽可具有式I的结构：
(S1)-(β1)-(S2)-(β2)-(S3)-(β3)-(S4)-(β4)-(S5)-(β5)-(S6)-(β6)-(S7)-(β7)-(S8)-(β8)-(S9)-(β9)-(S10)-(β10)-(S11)-(β11)-(S12)-(β12)-S13
其中β1、β2、β3、β4、β5、β6、β7、β8、β9、β10、β11和β12中的每一个独立地为β-折叠，并且其中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12和S13中的每一个独立地为间隔区序列。
在一些情况下，β1可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实例中，β1可与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段相同。在其他实例中，β1可与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段相同。
在一些情况下，β4可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实例中，β4可与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段相同。在其他实例中，β4可与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段相同。
在一些情况下，β9可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实例中，β9可与具有FGF18(SEQ IDNO:1)的约Y111至A117残基的片段相同。在其他实例中，β9可与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段相同。
在一些情况下，β12可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。在一些实例中，β12可与具有FGF18(SEQ IDNO:1)的约H146至R150残基的片段相同。在其他实例中，β12可与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段相同。
在一些情况下，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12和S13中的每一个可独立地具有1至约5、1至约10、1至约15、1至约20、1至约30、1至约40、1至约50、1至约60、1至约70、1至约80、1至约90或1至约100个氨基酸残基。
在一些实施方案中，β1可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。例如，β1可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF17-1(SEQ IDNO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，β1可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。例如，β1可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF18(SEQID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列。
在另外其他实施方案中，β1可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。例如，β1可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，β1可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。例如，β1可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列。
在另外其他实施方案中，β1可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。例如，β1可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q24至Y31残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Q58至T63残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约Y111至A117残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约H151至R155残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列。
在其他实施方案中，β1可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少约80％、90％、95％、99％或100％同源性的氨基酸序列。例如，β1可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Q29至Y36残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β4可包含与具有FGF17-1(SEQ IDNO:2)的约K63至T68残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，β9可包含与具有FGF17-1(SEQ ID NO:2)的约Y116至A122残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列，并且β12可包含与具有FGF18(SEQ ID NO:1)的约H146至R150残基的片段展现出至少95％同源性的氨基酸序列。
在一些情况下，所述融合多肽可保留第一和/或第二成员的二级结构。成员的二级结构可由包括但不限于α-螺旋和β-折叠在内的二级单元的数目和/或顺序来定义。在一些实例中，该融合多肽可包含与第一和/或第二成员相同的二级单元的数目和顺序。在第一和第二成员各自是FGF家族成员的情况下，该融合多肽可保留FGF18(SEQ ID NO:1)或FGF17-1(SEQ ID NO:2)的二级结构。
在一些情况下，该融合多肽可基本上不含被人T细胞识别的表位。先前已经公开了旨在产生免疫原性较低的蛋白质的此类表位的消除；参见例如通过引用并入本文的WO 98/52976、WO 02/079232和WO 00/3317。对人T细胞表位的测定已经进行了描述(Stickler,M.等(2003)J Immunol Methods,281:95-108)。特别感兴趣的是可以被寡聚化而不产生T细胞表位或非人序列的肽序列。这通过以下步骤来实现：检测这些序列的直接重复中T细胞表位的存在和6至15-聚体的出现，特别是非人的9-聚体序列的出现，然后改变XTEN序列的设计以消除或破坏该表位序列。随着能够与MHC受体结合的表位数目的减少，存在T细胞激活以及T细胞辅助功能的潜力的伴随降低、降低的B细胞激活或上调和减少的抗体产生。预测的T细胞表位的低程度可通过表位预测算法，例如TEPITOPE(Sturniolo,T.等(1999)NatBiotechnol,17:555-61)来确定。
在一些情况下，与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽可缺乏任何额外的T-表位。在进一步的情况下，与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽可具有较少的T-表位。
在一些情况下，与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽可缺乏任何额外的B-表位。在进一步的情况下，与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽可具有较少的B-表位。
在各种情况下，所述融合多肽可进一步在对应于FGF18(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基中包含至少一个修饰，其中所述至少一个修饰选自Y151L、P152Y、K153Q、156aL、156bP、156cF、156dP、156eN、156fH、P156A、L158K、P161Q、K163E、Y164F、165aV、165bG、165cS、165dA、165eP、T166R、V167R、S171T、I174P、R175Q、T177L、H178T、des P179和des A180。
在各种情况下，所述融合多肽可进一步在对应于FGF17-1(SEQ ID NO:2)的氨基酸残基中包含至少一个修饰，其中所述至少一个修饰选自L156Y、Y157P、Q158K、des L161、desP162、des F163、des P164、des N165、des H166、A167P、K169L、Q172P、E174K、F175Y、desV176、des G177、des S178、des A179、des P180、R182T、R183V、T187S、P190I、Q191R、L193T、T194H、195aP和195bA。
在一些情况下，所述融合多肽可进一步包含融合位点，该融合位点包含与FGF18(SEQ ID NO:1)和FGF17-1(SEQ ID NO:2)中的相应序列相同的约2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的序列。在其他情况下，该融合位点可包含与FGF18(SEQ ID NO:1)和FGF17-1(SEQID NO:2)中的相应序列相同的约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸的序列。
在一些情况下，所述融合位点可包含至少与FGF18(SEQ ID NO:1)和FGF17-1(SEQID NO:2)同种型的相应序列相同的约2至23、约3至20、约4至15、约5至10、约6至9个氨基酸的序列。
在一些情况下，所述融合多肽可展现出与FGF18(SEQ ID NO:1)的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。例如，所述融合多肽可展现出与FGF18(SEQ ID NO:1)的至少约90％的序列同源性。此外，所述融合多肽可展现出与FGF18(SEQ ID NO:1)的至少约95％的序列同源性。
在一些情况下，所述融合多肽可展现出与FGF18(SEQ ID NO:1)的小于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列同源性。例如，所述融合多肽可展现出与FGF18(SEQ ID NO:1)的小于约80％的序列同源性。此外，所述融合多肽可展现出与FGF18(SEQ ID NO:1)的小于约50％的序列同源性。
在一些情况下，所述融合多肽可展现出与FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。例如，所述融合多肽可展现出与FGF17-1(SEQ IDNO:2)的至少约90％的序列同源性。此外，所述融合多肽可展现出与FGF17-1(SEQ ID NO:2)的至少约95％的序列同源性。
在一些情况下，所述融合多肽可展现出与FGF17-1(SEQ ID NO:2)的小于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列同源性。例如，所述融合多肽可展现出与FGF17-1(SEQ ID NO:2)的小于约90％的序列同源性。进一步地，所述融合多肽可展现出与FGF17-1(SEQ ID NO:2)的小于约50％的序列同源性。
在一些情况下，可以进一步修饰所述融合多肽。该修饰可以在N-末端、C-末端或在任意反应性氨基酸侧链处发生。
在一些实施方案中，所述融合多肽可以进一步用聚乙二醇(PEG)修饰。聚乙二醇的实例包括但不限于单甲氧基PEG马来酰亚胺、单甲氧基PEG碘乙酰胺或单甲氧基PEG丙醛。另外，聚乙二醇的分子量可为约1Kd至200Kd、约5Kd至200Kd、约5Kd至150Kd、约8Kd至150Kd、约8Kd至100Kd、约10Kd至100Kd、约10Kd至50Kd、约12Kd至50Kd或约12Kd至40Kd。
在一些情况下，与蛋白质家族的第一和/或第二成员相比，聚乙二醇化的融合多肽可展现出延长的体外半衰期。例如，与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽可展现出延长的体外半衰期。
在一些情况下，与蛋白质家族的第一和/或第二成员相比，所述融合多肽可展现出增强的化学稳定性。例如，与FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF17-1(SEQ ID NO:2)相比，所述融合多肽可展现出增强的化学稳定性。
所述融合多肽可包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述融合多肽包含如SEQ ID NO:4、11或15所示的氨基酸序列。
本发明的融合多肽可具有促进表达FGF受体(FGFR)的细胞生长的能力。例如，本发明的融合多肽可对表达FGFR的细胞具有促有丝分裂作用。在一些情况下，该融合多肽促进表达FGF受体的细胞生长的能力与FGF 18(SEQ ID NO:1)和/或FGF 17-1(SEQ ID NO:2)的能力相当。在一些实施方案中，该融合多肽对表达FGFR的细胞的促有丝分裂作用与FGF 18(SEQ ID NO:1)和/或FGF 17-1(SEQ ID NO:2)的作用相当。在一些实施方案中，该融合多肽对表达FGFR的细胞的促有丝分裂作用为FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF 17-1(SEQ ID NO:2)的作用的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平。例如，本发明的融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平促进表达FGFR3c-1c的细胞(例如，BaF3细胞)生长的能力。
表达FGFR的细胞可以是表达选自FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、其同种型、突变体或组合的FGFR的细胞或细胞系。例如，由该细胞或细胞系表达的FGFR可以是FGFR1b、FGFR1c、FGFR2b、FGFR2c、FGFR3b、FGFR3c、FGFRdelt4和/或其剪接变体(例如，FGFR1-IIIb、FGFR1-IIIc、FGFR2-IIIb、FGFR2-IIIc、FGFR3-IIIb、FGFR3-IIIc等)。在一些实施方案中，由该细胞或细胞系表达的FGFR可以是包含第一FGFR或其同种型的一个或多个域和第二FGFR或其同种型的一个或多个域的嵌合受体。例如，由该细胞或细胞系表达的FGFR可以是选自FGFR3b-1c(包含与FGFR1c的跨膜和胞质域融合的FGFR3b的胞外域)、FGFR3c-1c(包含与FGFR1c的跨膜和胞质域融合的FGFR3c的胞外域)、FGFR4-1c(包含与FGFR1c的跨膜和胞质域融合的FGFR4的胞外域)和FGFRdelta4-1c(包含与FGFR1c的跨膜和胞质域融合的FGFRdelta4的胞外域)的嵌合受体。在一些实施方案中，该FGFR可以是人FGFR。
所述融合多肽促进细胞生长的能力或所述融合多肽对表达FGFR的细胞的促有丝分裂作用可以基于该细胞表达的特定一个或多个FGFR是选择性的。例如，所述融合多肽可以仅对表达FGFR3、FGFR3c、FGFR3c-1c、FGFR3b、FGFR3-IIIc、FGFR3-IIIb、FGFR1c、FGFR2c、FGFR4-1c或FGFRdelta4-1c的细胞具有这样的能力或作用。在一些情况下，当以低浓度施用时(例如，当在体外应用于细胞，例如BaF3细胞或其他哺乳动物细胞或细胞系时)，本发明的融合多肽可对表达选自FGFR3、FGFR3c、FGFR3c-1c、FGFR3b、FGFR3-IIIc、FGFR3-IIIb、FGFR1c、FGFR2c、FGFR4-1c或FGFRdelta4-1c的一个或多个FGFR的细胞显示有效的促有丝分裂作用。本文使用的低浓度可以是小于约1μg/ml、100ng/ml、90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、29ng/ml、28ng/ml、27ng/ml、26ng/ml、25ng/ml、24ng/ml、23ng/ml、22ng/ml、21ng/ml、20ng/ml、19ng/ml、18ng/ml、17ng/ml、16ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、11ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml、2ng/ml、1.5ng/ml、1ng/ml、0.9ng/ml、0.8ng/ml、0.7ng/ml、0.6ng/ml、0.5ng/ml、0.4ng/ml、0.3ng/ml、0.2ng/ml或0.1ng/ml的融合多肽浓度。在一些实施方案中，本文使用的低浓度可以是小于约100ng/ml、90ng/ml、80ng/ml、70ng/ml、60ng/ml、50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、29ng/ml、28ng/ml、27ng/ml、26ng/ml、25ng/ml、24ng/ml、23ng/ml、22ng/ml、21ng/ml、20ng/ml、19ng/ml、18ng/ml、17ng/ml、16ng/ml、15ng/ml、14ng/ml、13ng/ml、12ng/ml、11ng/ml、10ng/ml、9ng/ml、8ng/ml、7ng/ml、6ng/ml、5ng/ml、4ng/ml、3ng/ml或2ng/ml的融合多肽浓度。在一些实施方案中，本文使用的低浓度可以是约0.1ng/ml至100ng/ml，例如，1ng/ml至100ng/ml、2ng/ml至100ng/ml、3ng/ml至100ng/ml、4ng/ml至100ng/ml、5ng/ml至100ng/ml、6ng/ml至100ng/ml、7ng/ml至100ng/ml、8ng/ml至100ng/ml、9ng/ml至100ng/ml、10ng/ml至100ng/ml、11ng/ml至100ng/ml、12ng/ml至100ng/ml、13ng/ml至100ng/ml、14ng/ml至100ng/ml、15ng/ml至100ng/ml、16ng/ml至100ng/ml、17ng/ml至100ng/ml、18ng/ml至100ng/ml、19ng/ml至100ng/ml、20ng/ml至100ng/ml、21ng/ml至100ng/ml、22ng/ml至100ng/ml、23ng/ml至100ng/ml、24ng/ml至100ng/ml、25ng/ml至100ng/ml、26ng/ml至100ng/ml、27ng/ml至100ng/ml、28ng/ml至100ng/ml、29ng/ml至100ng/ml、30ng/ml至100ng/ml、40ng/ml至100ng/ml、50ng/ml至100ng/ml、60ng/ml至100ng/ml、70ng/ml至100ng/ml、80ng/ml至100ng/ml或90ng/ml至100ng/ml的融合多肽浓度。
本发明的融合多肽可具有在体内和/或体外刺激软骨细胞增殖的能力，在一些情况下，这样的能力与FGF18(例如，人FGF18)和/或FGF17(例如，人FGF17)的能力相当。该软骨细胞可以是人关节软骨细胞。在一些实施方案中，所述融合多肽刺激软骨细胞增殖的能力处于FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF 17-1(SEQ ID NO:2)的能力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平。例如，本发明的融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平刺激软骨细胞增殖的能力。
本发明的融合多肽可具有在体内和/或增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力(例如，通过番红O染色所揭示的)。在一些情况下，这样的能力与FGF18(例如，人FGF18)和/或FGF17(例如，人FGF17)的能力相当。该软骨细胞可以是人关节软骨细胞。在一些实施方案中，所述融合多肽增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力处于FGF18(SEQ ID NO:1)和/或FGF 17-1(SEQ ID NO:2)的能力的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平。例如，本发明的融合多肽可具有以FGF18(SEQ ID NO:1)的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％或500％的水平增加软骨细胞中的蛋白聚糖合成的能力。
本发明还提供表达本文公开的融合蛋白的宿主细胞。宿主细胞包括单个细胞、细胞培养物或细胞系。宿主细胞包括单一宿主细胞的后代。宿主细胞可以用包括本发明的载体的异源序列转染。宿主细胞可以是原核的或真核的，例如细菌细胞、真菌细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。细菌宿主细胞的实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)等的微生物。例如，细菌宿主细胞可以包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue、XL2-Blue、DH1、MC1000、KY3276、W1485、JM109、HB101、No.49、i W3110、NY49、G1698、BL21或TB1。其他细菌宿主细胞可以包括但不限于无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、Brevibacteriumimmariophilum ATCC 14068、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13869、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)D-0110等。
酵母宿主细胞可以包括属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)等的微生物，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母属(Schwanniomyces alluvius)、产朊假丝酵母(Candida utilis)等的微生物。
真核细胞的实例包括动物细胞，如哺乳动物细胞。例如，宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或猴细胞，例如COS细胞、HepG2细胞、A549细胞，和可通过ATCC或其他保藏机构获得的任何细胞。
本发明的宿主细胞可以在培养物中以及在可以用来使培养物生长的任何设备(包括发酵罐)中生长。它们可以生长为单层或贴附至表面。或者，宿主细胞可以悬浮生长。细胞可以在不含血清的培养基中生长。该培养基可以是商业可得的培养基，例如但不限于用谷氨酰胺如8mM L-谷氨酰胺补充的Opti-CHO(Invitrogen，目录号12681)；用10％小牛血清、10.5ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺补充的RPMI 1640培养基；或5％FCS培养基。
本发明的宿主细胞可以包含异源序列以实现本发明融合多肽的表达。该异源序列可以包含载体，该载体是优选地自我复制的核酸分子，其将所插入的核酸分子转移到宿主细胞之内和/或之间。载体可以包括主要起到将DNA或RNA插入至细胞内的作用的载体，主要起到DNA或RNA复制的作用的载体复制，以及起到DNA或RNA转录和/或翻译的作用的表达载体。还包括提供多于一种上述作用的载体。表达载体是当被引入到合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。
编码本发明的融合蛋白的异源序列可以由单种或多种载体表达。核酸序列可以在单个操纵子中或在置于一种或多种载体中的单独的操纵子中以任何顺序布置。当需要时，可以利用2种或更多种表达载体，其各自包含在单个操纵子中有效连接的一个或多个异源序列。连接的是指通过包括化学缀合或重组手段在内的任何手段将两个或更多个化学元件或组分连接在一起。有效连接的是指并置，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子序列驱动编码序列的转录，则该启动子序列连接或有效连接至该编码序列。本发明载体可以是可附加型复制的，或作为宿主细胞基因组的组成部分。
本发明的异源序列可以处于单个调节元件的控制下。在一些情况下，异源核酸序列由单个启动子调节。在其他情况下，异源核酸序列被置于单个操纵子内。在又一些情况下，异源核酸序列被置于单个阅读框内。
本发明核酸的制备可以通过多种常规重组技术和合成程序进行。标准的重组DNA和分子克隆技术在本领域中是公知的，并由Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,(1989)(Maniatis)和T.J.Silhavy,M.L.Bennan,and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.(1984)和Ausubel,F.M.等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述。简言之，本发明核酸可以被制备为基因组DNA片段、cDNA和RNA，其全部可以从细胞中直接提取或通过包括但不限于PCR和rtPCR的多种扩增方法重组地产生。
核酸的直接化学合成通常涉及3’-封端的和5’-封端的核苷酸单体向生长的核苷酸聚合物链的末端5’-羟基上的顺序添加，其中各个添加通过生长链的末端5’-羟基对添加的单体的3’-位的亲核攻击而实现，该添加的单体通常是磷衍生物，例如磷酸三酯、亚磷酰胺等。此方法是本领域普通技术人员已知的并描述在相关文本和文献中(例如，Matteuci等,Tet.Lett.521:719(1980)；授予Caruthers等的美国专利4,500,707；和授予Southern等的美国专利5,436,327和5,700,637)。
调节元件包括例如启动子和操纵基因，其还可以被工程化以增加编码糖蛋白的一个或多个异源序列的表达。启动子是启动和控制通过RNA聚合酶的核酸序列转录的核苷酸序列。操纵基因是与启动子相邻的起到控制所需核酸序列的转录的作用的核苷酸序列。操纵基因包含蛋白质结合域，在其中可以结合特定的阻抑蛋白。在缺少合适的阻抑蛋白的情况下，转录通过启动子启动。在存在合适的阻抑蛋白的情况下，阻抑蛋白结合至操纵基因并由此抑制自启动子的转录。
在本发明的一些实施方案中，表达载体中所用的启动子是诱导型的。在其他一些实施方案中，表达载体中所用的启动子是组成型的。在一些实施方案中，一个或多个核酸序列有效连接至诱导型启动子，而一个或多个其他核酸序列有效连接至组成型启动子。用于真核宿主细胞的合适启动子的非限制实例包括但不限于CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期或晚期SV40启动子、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。
表达载体中的基因通常也将编码核糖体结合位点以引导任何编码的mRNA基因产物的翻译(即，合成)。可以在表达载体中使用的其他调节元件包括转录增强子元件和转录终止子。参见，例如Bitter等,Methods in Enzymology,153:516-544(1987)。
表达载体可以适用于特定类型的宿主细胞而非其他宿主细胞。但是，本领域普通技术人员可以通过常规的试验容易地确定特定的表达载体是否适用于给定的宿主细胞。例如，可以将表达载体引入到宿主生物体中，随后监测其存活性和在载体中包含的任何基因的表达。
表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，该选择性标记基因经表达，赋予对于选择或以其他方式鉴别携带该表达载体的宿主细胞有用的一种或多种表型性状。用于真核细胞的合适的选择性标记的非限制性实例包括二氢叶酸还原酶和新霉素抗性。
可以通过多种已建立的技术将本发明的载体稳定地或暂时地引入宿主细胞中。例如，一种方法涉及氯化钙处理，其中通过钙沉淀引入表达载体。其他盐，例如磷酸钙，也可以依循相似的程序使用。此外，可以使用电穿孔(即，施加电流以提高细胞对核酸的通透性)。其他转化方法可包括显微注射、DEAE葡聚糖介导的转化和在乙酸锂存在下的热激。脂质复合物、脂质体和树状聚体也可以用于转染宿主细胞。
在异源序列引入宿主细胞中后，可以实施多种方法来鉴别已经引入本发明载体的宿主细胞。一种示例性选择方法涉及传代培养单个细胞以形成单个群落，接着检测所需蛋白质产物的表达。另一种方法需要基于通过包含在表达载体中的选择性标记基因的表达而赋予的表型性状来选择包含异源序列的宿主细胞。普通技术人员可以使用这些或本领域中可得的其他方法鉴别遗传修饰的宿主细胞。
例如，本发明的多种异源序列向宿主细胞中的引入可以通过诸如PCR、Southern印迹法或Northern印迹法等方法来证实。例如，核酸可以由所得宿主细胞制备，且感兴趣的特定序列可以通过使用对感兴趣的序列具有特异性的引物的PCR来扩增。扩增的产物经历琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，接着用溴化乙锭、SYBR Green溶液等染色，或用UV检测来检测DNA。或者，可以在杂交反应中使用对所感兴趣的序列具有特异性的核酸探针。可以通过经由逆转录耦合的PCR、Northern印迹杂交而检测相应的mRNA，或者通过使用对编码的基因产物具有反应性的抗体进行免疫测定，来确定特定基因序列的表达。示例性免疫测定包括但不限于ELISA、放射免疫测定和夹心免疫测定。
此外，本发明的多种异源序列向宿主细胞中的引入可以通过异源序列所编码的酶的酶活性来证实。该酶可以通过本领域中已知的多种方法测定。通常，酶活性可以通过所研究的酶反应的产物的形成或底物的转化来确定。该反应可以在体外或在体内发生。
在另一个方面，本发明提供了产生融合多肽以实现所需药代动力学、药理学或药学性质的方法。在一些情况下，该融合多肽可以通过在适合蛋白质表达的条件下在细胞中表达载体而产生。
用于蛋白质表达的合适的条件，包括但不限于诸如温育时间、温度和培养基等因素，可以取决于细胞类型并且将由本领域普通技术人员容易地确定。
治疗方法
在一个方面，本发明提供了使用本发明的融合多肽治疗哺乳动物的疾病状况的方法，该疾病状况包括但不限于与FGF受体(例如，FGFR1、FGFR2、FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)和/或FGFR4)功能障碍有关的状况。
本发明还提供了本发明的融合多肽在制造/制备用于治疗哺乳动物的疾病状况的药物组合物中的用途，该疾病状况包括但不限于与FGF受体(例如，FGFR1、FGFR2、FGFR3(例如，FGFR3b和/或FGFR3c)和/或FGFR4)功能障碍有关的状况。例如，该疾病状况可以是软骨缺陷。在一些情况下，该软骨缺陷可以是骨关节炎或退行性椎间盘疾病。在其他实例中，该软骨缺陷可以是软骨损伤。在一些实施方案中，所述治疗疾病状况是软骨修复，例如，软骨微骨折手术。
在一些情况下，本发明提供了治疗有需要的哺乳动物中的软骨缺陷的方法，其包括向该哺乳动物施用治疗有效量的本发明的融合多肽。在一些实例中，该软骨缺陷可以是骨关节炎或退行性椎间盘疾病。在其他实例中，该软骨缺陷可以是软骨损伤。在一些实施方案中，所述治疗软骨缺陷是软骨修复，例如，软骨微骨折手术。
在一些情况下，所述哺乳动物是人。在其他情况下，所述哺乳动物可以是小鼠、大鼠、猫、狗、兔、绵羊、马、牛、山羊、沙鼠、仓鼠、豚鼠、猴或任何其他哺乳动物。许多这样的哺乳动物可以是本领域已知作为针对某些疾病或病症的临床前模型的受试者，所述疾病或病症包括实体肿瘤和/或其他癌症(例如，Talmadge等,2007 Am.J.Pathol.170:793；Kerbel,2003 Canc.Biol.Therap.2(4 Suppl 1):S134；Man等,2007 Canc.Met.Rev.26:737；Cespedes等,2006 Clin.TransL Oncol.8:318)。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的融合多肽治疗哺乳动物的疾病状况的方法，其中该融合多肽可以与第二药剂一起配制或施用。在一些情况下，第二药剂可以是透明质酸。在其他情况下，第二药剂可以是用来缓解状况如骨关节炎、退行性椎间盘疾病和本文描述的其他疾病的症状的药剂。这些药剂可包括非甾体抗炎药(NSAID)，例如乙酰水杨酸、布洛芬、萘普生、吲哚美辛、萘丁美酮、托美汀等。皮质类固醇用于减轻炎症和抑制免疫系统的活性。最常开出的这一类型的药物是泼尼松。对乙酰氨基酚对于某些骨关节炎患者也可能有效。抗凝血剂可以用来阻止血液快速凝固。它们的范围包括阻止血小板粘附的极低剂量的阿司匹林到肝素/香豆素。
药物组合物
本发明的药物组合物一般包含本发明的活性成分(例如，融合多肽、PEG修饰的融合多肽)或其药学上可接受的盐和/或配位复合物，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体，其包括但不限于惰性固体稀释剂和填充剂、稀释剂、无菌水溶液和多种有机溶剂、渗透促进剂、增溶剂和助剂。下面描述了非限制示例性药物组合物及其制备方法。
本发明的药物组合物可以例如是适于作为片剂、胶囊、丸剂、粉末、持续释放制剂、溶液、悬浮液口服，适于作为无菌溶液、悬浮液或乳液肠胃外注射，适于作为软膏或乳膏局部给药，或适于作为栓剂直肠给药的形式。该药物组合物可以是适于单次施用精确剂量的单位剂型。该药物组合物可以进一步包含根据本发明的融合多肽和/或PEG修饰的融合肽作为活性成分，且可以包含常规药物载体或赋形剂。此外，其可以包含其他药用或药物剂、载体、助剂等。
示例性的肠胃外给药形式包括但不限于活性多肽和/或PEG修饰的多肽在无菌水溶液如丙二醇水溶液或右旋糖溶液中的溶液或悬浮液。如果需要的话，这样的剂型可以用盐如组氨酸和/或磷酸盐适当地缓冲。
在一些情况下，本发明提供了用于注射的药物组合物，其含有本发明的多肽或PEG修饰的多肽和适于注射的药物赋形剂。组合物中的组分和药剂量如本文所述。
可以掺入本发明的新型组合物以供注射给药的形式包括水性或油性悬浮液或乳液，其具有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂、甘露醇、右旋糖或无菌水溶液以及类似的药物媒介物。
在盐水中的水性溶液也常规用于注射。也可以采用乙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。适当的流动性可以如下维持：例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。可以用各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来阻止微生物的作用。
无菌注射溶液可通过下列步骤制备：将本发明的多肽或PEG修饰的多肽以所需的量掺入至根据需要具有以上列举的各种其他成分的适当溶剂中，然后过滤灭菌。一般而言，通过将各种灭菌的活性成分掺入至包含基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，某些期望的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何额外所需成分的粉末。
在一些情况下，本发明提供了用于口服给药的药物组合物，其含有本发明的融合多肽或PEG修饰的融合多肽以及适于口服给药的药物赋形剂。
在一些情况下，本发明提供了用于口服给药的固体药物组合物，其含有：(i)有效量的本发明的多肽或PEG修饰的多肽；任选的(ii)有效量的第二药剂；以及(iii)适于口服给药的药物赋形剂。在一些实施方案中，该组合物进一步含有：(iv)有效量的第三药剂。
在一些情况下，所述药物组合物可以是适合于口服的液体药物组合物。适于口服给药的本发明的药物组合物可以呈现为离散的剂型，例如胶囊、扁囊剂或片剂，或各自含有预定量的活性成分的液体或气溶胶喷雾剂，作为粉末或为颗粒，溶液，或在水性或非水性液体中的悬浮液，水包油型乳液，或油包水型液体乳液。这样的剂型可通过任何药学方法制备，但所有方法都包括将活性成分与构成一种或多种必需成分的载体相组合的步骤。一般而言，该组合物如下制备：均匀地和紧密地将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者混合，然后，如果需要的话，将产物成形为所需的呈现形式。
本发明进一步包括包含活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进一些多肽的降解。例如，在药学领域中可以加入水(例如，5％)作为模拟长期贮存的手段，以确定诸如制剂的贮存期限或随时间的稳定性等特性。本发明的无水药物组合物和剂型可以使用无水或含有低水分的成分和低水分或低湿度条件来制备。如果预计在制造、包装和/或贮存期间与水分和/或湿气发生实质性接触，则含有乳糖的本发明的药物组合物和剂型可制成无水的。无水药物组合物可以这样制备和贮存，以使其无水性质得到保持。因此，无水组合物可以使用已知防止暴露于水的材料进行包装，使得它们可以包含于合适的制剂用药盒(formularykit)中。合适的包装的实例包括但不限于气密封的箔、塑料等，单位剂量容器、泡罩包装和条带包装。
可以按照常规药物配混技术，将融合多肽与药物载体紧密混合地合并。该载体可根据给药所期望的制剂形式而采取多种形式。在制备用于口服剂型的组合物时，任何常用的药物介质都可用作载体，例如在口服液体制剂(如悬浮液、溶液和酏剂)或气溶胶的情况下的水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等；或者在口服固体制剂的情况下可使用诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂等载体，在一些实施方案中不使用乳糖。例如，在固体口服制剂中，合适的载体包括粉末、胶囊和片剂。如果需要的话，片剂可以通过标准水性或非水性技术进行包衣。
适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉，明胶，天然和合成的树胶如阿拉伯胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、粉状西黄蓍胶、瓜尔胶，纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)，聚乙烯吡咯烷酮，甲基纤维素，预胶化淀粉，羟丙基甲基纤维素，微晶纤维素，以及它们的混合物。
用于本文公开的药物组合物和剂型中的合适的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、葡萄糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨醇、淀粉、预胶化淀粉以及它们的混合物。
崩解剂可在本发明的组合物中使用，以提供当暴露于水性环境时崩解的片剂。过多的崩解剂可产生在瓶中即可崩解的片剂。过少则可能不足以发生崩解并因此可以改变活性成分从剂型中的释放速率和程度。因此，可以使用既不过少也不过多从而不会有害地改变活性成分的释放的足量的崩解剂来形成本文公开的化合物的剂型。使用的崩解剂的量可以根据制剂的类型和给药方式而不同，并且本领域普通技术人员可以很容易地辨别。约0.5至约15重量％的崩解剂或约1至约5重量％的崩解剂可以在药物组合物中使用。可用于形成本发明的药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、聚克立林钾、羟乙酸淀粉钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预胶化淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、树胶或其混合物。
可用于形成本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂或它们的混合物。其他的润滑剂包括，例如syloid硅胶、合成二氧化硅的凝聚型气溶胶或其混合物。可任选地以低于药物组合物的约1重量％的量加入润滑剂。
当需要水性悬浮液和/或酏剂供口服给药时，其内的活性成分可与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料以及(如果需要的话)乳化剂和/或悬浮剂，连同诸如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各种组合的稀释剂一起组合。
片剂可以是未包衣的，或通过已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供在较长时期内的持续作用。例如，可采用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。口服使用的制剂还可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者呈现为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
可用于形成本发明的药物组合物和剂型的表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂以及它们的混合物。即，可采用亲水性表面活性剂的混合物，可采用亲脂性表面活性剂的混合物，或者可采用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲脂性表面活性剂的混合物。
具有较低HLB值的表面活性剂是更亲脂性或疏水性的，并且在油中具有较高的溶解度，而具有较高HLB值的表面活性剂是更亲水性的，并且在水溶液中具有更高的溶解度。亲水性表面活性剂通常被认为是HLB值大于约10的那些化合物以及HLB标度通常不适用的阴离子、阳离子或两性离子化合物。类似地，亲脂性(即疏水性)表面活性剂是HLB值等于或小于约10的化合物。然而，表面活性剂的HLB值仅仅是粗略的指导，通常用来支持工业、药物和化妆品乳液的配制。
亲水性表面活性剂可以是离子型的或非离子型的。合适的离子型表面活性剂包括但不限于，烷基铵盐；夫西地酸盐；氨基酸、寡肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂及其衍生物；溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸酯的盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单甘油酯和二甘油酯的单乙酰化酒石酸酯和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；和它们的混合物。
在上述组中，离子型表面活性剂包括，例如：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂及其衍生物；肉碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸酯的盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸酯；单甘油酯和二甘油酯的单乙酰化酒石酸酯和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化的单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；和它们的混合物。
离子型表面活性剂可以是卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸的乳酰酯、硬脂酰-2-乳酸酯、硬脂酰乳酸酯、琥珀酰化单甘油酯、单/二甘油酯的单/二乙酰化的酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、胆酰肌氨酸(cholylsarcosine)、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、油酸酯、蓖麻油酸酯、亚油酸酯、亚麻酸酯、硬脂酸酯、月桂基硫酸酯、四鲸蜡基硫酸酯(teracecyl sulfate)、多库酯、月桂酰肉碱、棕榈酰肉碱、肉豆蔻酰肉碱及其盐和混合物的离子化形式。
亲水性非离子型表面活性剂可以包括但不限于，烷基糖苷；烷基麦芽糖苷；烷基硫代糖苷；月桂基聚乙二醇甘油酯；聚氧化烯烷基醚如聚乙二醇烷基醚；聚氧化烯烷基酚如聚乙二醇烷基酚；聚氧化烯烷基酚脂肪酸酯如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧化烯脱水山梨醇脂肪酸酯如聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇组成的组的至少一个成员的亲水性酯交换产物；聚氧乙烯甾醇及其衍生物和类似物；聚氧乙烯化维生素及其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；和它们的混合物；聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯以及多元醇与由甘油三酯、植物油和氢化植物油组成的组的至少一个成员的亲水性酯交换产物。该多元醇可以是甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨醇、丙二醇、季戊四醇或糖类。
其他亲水性非离子型表面活性剂包括但不限于PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-25三油酸甘油酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20月桂酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-20硬脂酸甘油酯、PEG-20油酸甘油酯、PEG-30油酸甘油酯、PEG-30月桂酸甘油酯、PEG-40月桂酸甘油酯、PEG-40棕榈仁油、PEG-50氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸酯/辛酸酯甘油酯、PEG-8癸酸酯/辛酸酯甘油酯、聚甘油基-10月桂酸酯、PEG-30胆固醇、PEG-25植物甾醇、PEG-30大豆甾醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40脱水山梨醇油酸酯、PEG-80脱水山梨醇月桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、POE-9十二烷基醚、POE-23十二烷基醚、POE-10油基醚、POE-20油基醚、POE-20硬脂基醚、生育酚PEG-100琥珀酸酯、PEG-24胆固醇、聚甘油基-10油酸酯、吐温40、吐温60、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、PEG10-100壬基酚系列、PEG15-100辛基酚系列和泊洛沙姆(poloxamers)。
合适的亲脂性表面活性剂包括，仅举例而言：脂肪醇；甘油脂肪酸酯；乙酰化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；脱水山梨醇脂肪酸酯；聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯；甾醇和甾醇衍生物；聚氧乙烯化甾醇和甾醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；单甘油酯和二甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和甾醇组成的组中的至少一个成员的疏水性酯交换产物；油溶性维生素/维生素衍生物；及其混合物。在这一组中，优选的亲脂性表面活性剂包括甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯和它们的混合物，或者是多元醇与由植物油、氢化植物油和甘油三酯组成的组中的至少一个成员的疏水性酯交换产物。
在一个实施方案中，所述组合物可包含增溶剂，以确保本发明的化合物的良好的溶解和/或溶出，并最小化本发明的化合物的沉淀。这对于非口服使用的组合物(例如，注射用组合物)可能尤其重要。也可加入增溶剂来增加亲水性药物和/或其他组分如表面活性剂的溶解度，或者维持组合物作为稳定或均一的溶液或分散体。
合适的增溶剂的实例包括但不限于以下物质：醇和多元醇，如乙醇、异丙醇、丁醇、苄醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山梨醇、甘露醇、还氧二元醇(transcutol)、二甲基异山梨醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素和其他纤维素衍生物、环糊精和环糊精衍生物；具有约200至约6000平均分子量的聚乙二醇的醚，如四氢糠醇PEG醚(四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol))或甲氧基PEG醚；酰胺和其他含氮化合物，如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、ε-己内酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟基烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己内酰胺、二甲基乙酰胺和聚乙烯吡咯烷酮；酯，如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、三醋精、丙二醇单乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、ε-己内酯及其异构体、δ-戊内酯及其异构体、β-丁内酯及其异构体；以及本领域中已知的其他增溶剂，如二甲基乙酰胺、二甲基异山梨醇、N-甲基吡咯烷酮、单辛精、二乙二醇单乙醚和水。
也可使用增溶剂的混合物。实例包括但不限于三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、聚乙二醇200-100、四氢呋喃聚乙二醇醚(glycofurol)、还氧二元醇、丙二醇和二甲基异山梨醇。特别优选的增溶剂包括山梨醇、甘油、三醋精、乙醇、PEG-400、四氢呋喃聚乙二醇醚和丙二醇。
可包含的增溶剂的量没有特别的限制。给定的增溶剂的量可以限制为生物可接受的量，其可以由本领域技术人员很容易地确定。在一些情况下，可能有利的是：包含远远超过生物可接受量的增溶剂的量，例如，以最大化药物的浓度，在将该组合物提供给受试者之前使用常规技术如蒸馏或蒸发移除过量的增溶剂。因此，如果存在的话，增溶剂以药物和其他赋形剂的合并重量计可以是10％、25％、50％、100％或高达约200％(重量)的重量比。如果需要的话，也可以使用极少量的增溶剂，例如5％、2％、1％或甚至更少。通常，增溶剂可以以大约1％至大约100％，更典型地约5％至约25％(重量)的量存在。
该组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的添加剂和赋形剂。这样的添加剂和赋形剂包括但不限于，防粘剂、消泡剂、缓冲剂、聚合物、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度调节剂(viscomodulators)、张力调节剂(tonicifiers)、调味剂、着色剂、添味剂、遮光剂、悬浮剂、粘合剂、填充剂、增塑剂、润滑剂和它们的混合物。
此外，为了方便处理、增强稳定性或为了其他原因，可以向组合物中掺入酸或碱。药学上可接受的碱的实例包括氨基酸、氨基酸酯、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁、硅酸镁铝、合成硅酸铝、合成二水方解石(hydrocalcite)、氢氧化镁铝、二异丙基乙胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、三乙胺、三异丙醇胺、三甲胺、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)等。同样合适的是作为药学上可接受酸的盐的碱，所述酸例如是乙酸、丙烯酸、己二酸、藻酸、链烷磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸、尿酸等。也可以使用多元酸的盐，例如磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。当所述碱为盐时，阳离子可以是任何适宜的和药学上可接受的阳离子，例如铵、碱金属、碱土金属等。实例可以包括但不限于钠、钾、锂、镁、钙和铵。
合适的酸为药学上可接受的有机或无机酸。合适的无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、硼酸、磷酸等。合适的有机酸的实例包括乙酸、丙烯酸、己二酸、藻酸、链烷磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、巯基乙酸、甲苯磺酸、尿酸等。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但是这些实施方案仅作为实例提供对本领域技术人员来说是显而易见的。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下将会想到许多变化、改变和替换。但是应当理解，本文描述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。其意图在于用下列权利要求限定本发明的范围并从而覆盖这些权利要求的范围内的方法和结构及其等同物。
实施例
下文提供的实施例和制备进一步说明和例证了本发明的融合多肽及其使用和制备方法。应当理解，本发明的范围绝不受以下实施例和制备的范围的限制。
实施例1：FGF18/FGF17-1融合多肽的克隆和表达
在大肠杆菌中设计和表达了SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16的多肽和融合多肽。简言之，将编码该融合多肽的基因插入至表达载体pET11a的Nde1和BamH1限制酶切位点之间，并且在噬菌体T7启动子的控制下进行表达。将该载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。细胞在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中生长至OD450为0.4-0.6。通过加入1mM IPTG来诱导表达，在37℃下12小时。通过离心收获细胞，悬浮于PBS中，并进行超声处理。离心分离细胞匀浆。进行SDS-PAGE分析，以证明融合多肽，例如SEQ ID NO:1、2、4、11和15，在不溶性包涵体级分中成功地表达(图1)。
实施例2：FGF18/FGF17-1融合多肽的重折叠和纯化
SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16的多肽和融合多肽如下进行重折叠和纯化。表达后，通过离心机收获细胞，将其重悬于PBS中并均质化。随后在4℃下以4000rpm离心匀浆20分钟。在丢弃上清液之后获得含有多肽和融合多肽的沉淀物。随后将包涵体在含有2M脲的PBS中洗涤，在4℃下以4000rpm离心20分钟。将洗涤后的包涵体以1/10的v/v比溶解在50mM Tris，6M盐酸胍，10mM DTT pH8.0中。溶解在室温下进行3-4小时。随后通过离心使溶解的样品澄清。随后将盐酸胍/多肽(或融合多肽)溶液以1/20的v/v比逐滴稀释到含有50mM Tris-HCl、4mM半胱氨酸、2mM DTT、2M脲、120mM NaCl的重折叠缓冲液pH8.0中并在4℃下搅拌过夜。通过过滤使重折叠的样品澄清，随后在pH8.0下在阳离子交换柱例如SP.BB(GE Healthcare)上捕获，并且采用20mM PB，pH8.0中0至1M氯化钠的逐渐升高的线性梯度洗脱结合的(融合)多肽。随后将洗脱的合并物超滤至小体积。随后采用Superdex-75(GE healthcare)来纯化所需的多肽。该柱装有PBS或20mM Hepes，140mMNaCl，pH7.0。在凝胶过滤柱上加载的样品体积小于3％柱体积。合并含有所需多肽的洗脱峰，并加入甘油至最终浓度为10％(如图2所示)。随后将样品在-20℃下储存。
实施例3：FGFR表达载体的构建
如下生成FGFR1b、FGFR1c、FGFR2b和FGFR2c表达载体pcDNA3-FGFR1-IIIb、pcDNA3-FGFR1-IIIc、pcDNA3-FGFR2-IIIb和pcDNA3-FGFR2-IIIc。合成全长人FGFR1-IIIb(FJ809917.1)、FGFR1-IIIc(NM_023110.2)、FGFR2-IIIb(NM_022970.3)和FGFR2-IIIc(NM_000141.4)基因，随后将其克隆至来自Taihe Biotechnology Co.,LTD(中国，北京)的pcDNA3载体的BamHI/NotI限制位点。载体pcDNA3-FGFR3-IIIb/R1c表达携带与人FGFR1c的跨膜和胞质域融合的人FGFR3b的胞外域的嵌合受体。载体pcDNA3-FGFR3-IIIc/R1c表达携带与人FGFR1c的跨膜和胞质域融合的人FGFR3c的胞外域的嵌合受体。载体pcDNA3-FGFR4/R1c表达携带与人FGFR1c的跨膜和胞质域融合的人FGFR4的胞外域的嵌合受体。载体pcDNA3-FGFRΔ4/R1C表达携带与人FGFR1c的跨膜和胞质域融合的人FGFRΔ4(人FGFR4的截短形式)的胞外域的嵌合受体。
实施例4：DNA转染和细胞选择
BaF3细胞在补充有10％小牛血清、10.5ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000UF，220V)用实施例3中构建的多种FGFR表达载体转染，并用G418(600μg/ml)加上mIL-3条件培养基进行选择，从而获得表达FGFR的细胞。
实施例5：增殖测定
BaF3细胞用FGFR表达载体(如实施例4中获得的)转染，用G418选择10天，随后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。将细胞(每孔5x 104个)接种在96孔板(Corning LifeSciences,MA)中。在200μl的总体积中加入浓度逐渐增加的本发明的融合多肽、参考多肽和/或对照多肽以及2μg/ml肝素。96小时后，向所有孔中加入100μl萤光素酶检测试剂Celltiter glo(Promega Corporation,Madison,WI USA)，并在室温下温育5min。随后在多板阅读器上读取。用prism5计算EC50。
实施例6：促有丝分裂测定
从Lonza Walkersville,Inc.(Walkersville,MD)获得人关节软骨细胞，并根据制造商的说明书进行培养。将人关节软骨细胞在5％FCS培养基中以每96孔10,000个细胞的密度接种在96孔板中，并在37℃ 5％CO2下温育过夜。随后用无血清培养基替代该培养基。4天后，将培养基更换为含0.1％BSA的无血清培养基。在培养另外48小时后，向孔中加入本发明的融合多肽、参考多肽和/或对照多肽。直到培养另外4天后，才用Cell titer glo试剂评估细胞数。
实施例7：具有软骨细胞的微团培养物
从人关节软骨细胞建立微团培养物。在存在或不存在1μg/ml的本发明融合多肽、参考多肽和/或对照多肽的情况下，这些培养物在具有5％FCS的CBM中生长。4天后，将培养物固定并用番红染色。
实施例8：FGF18/FGF17-1融合多肽引起的用FGFR1b转染的BaF3细胞的增殖
在BaF3/FGFR1b增殖测定中评估FGF18/FGF17-1融合多肽的活性。具体地，BaF3细胞在补充有10％小牛血清、2ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000UF，140V)用pcDNA3-FGFR1-IIIb转染，并在不存在IL-3的情况下用G418(600μg/ml)和FGF1加上肝素(50μg/ml)进行选择。该程序产生了表达FGFR1b的BaF3细胞集落。
将BaF3/FGFR1b细胞用PBS洗涤3次。将细胞(每孔5x 104个)接种在96孔板中。在200μl的总体积中加入合适的FGF和本发明的融合多肽以及肝素。在96小时后向96孔板中加入100μl Cell Titer-Glo(Promega)，并在室温下温育10min。用多板阅读器synergyII(Bioteck)监测发光。将来自没有任何生长因子的孔中的背景信号从在其存在下获得的值中减去。所有处理均一式三份地进行(图3)。FGF1用作阳性对照。如图3中可见，FGF 1在FGFR1b转染的BaF3细胞中显示了有效的促有丝分裂作用，而FGF18、FGF17b和融合多肽显示非常小的该活性(如果有的话)。
实施例9：FGF18/FGF17-1融合多肽引起的用FGFR1c转染的BaF3细胞的增殖
在BaF3/FGFR1c增殖测定中评估FGF18/FGF17-1融合多肽的活性。具体地，BaF3细胞在补充有10％小牛血清、2ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000UF，140V)用pcDNA3-FGFR1-IIIc转染，并在不存在IL-3的情况下用G418(600μg/ml)和FGF1加上肝素(50μg/ml)进行选择。该程序产生了表达FGFR1c的BaF3细胞集落。
将BaF3/FGFR1c细胞用PBS洗涤3次。将细胞(每孔5x 104个)接种在96孔板中。在200μl的总体积中加入合适的FGF和本发明的融合多肽以及肝素。在96小时后向96孔板中加入100μl Cell Titer-Glo(Promega)，并在室温下温育10min。用多板阅读器synergyII(Bioteck)监测发光。将来自没有任何生长因子的孔中的背景信号从在其存在下获得的值中减去。所有处理均一式三份地进行(图4)。FGF1用作阳性对照。如图4中可见，FGF 1在FGFR1c转染的BaF3细胞中显示了有效的促有丝分裂作用，而FGF18、FGF17b和融合多肽仅在高浓度下显示了一定的促有丝分裂活性。
实施例10：FGF18/FGF17-1融合多肽引起的用FGFR2c转染的BaF3细胞的增殖
在BaF3/FGFR2c增殖测定中评估FGF18/FGF17-1融合多肽的活性。具体地，BaF3细胞在补充有10％小牛血清、2ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000UF，140V)用pcDNA3-FGFR2-IIIc转染，并在不存在IL-3的情况下用G418(600μg/ml)和FGF1加上肝素(50μg/ml)进行选择。该程序产生了表达FGFR2c的BaF3细胞集落。
将BaF3/FGFR2c细胞用PBS洗涤3次。将细胞(每孔5x 104个)接种在96孔板中。在200μl的总体积中加入合适的FGF和本发明的融合多肽以及肝素。在96小时后向96孔板中加入100μl Cell Titer-Glo(Promega)，并在室温下温育10min。用多板阅读器synergyII(Bioteck)监测发光。将来自没有任何生长因子的孔中的背景信号从在其存在下获得的值中减去。所有处理均一式三份地进行(图5)。FGF1用作阳性对照。如图5中可见，FGF 1在FGFR2c转染的BaF3细胞中显示了有效的促有丝分裂作用，而FGF18、FGF17b和融合多肽仅在高浓度下显示了一定的促有丝分裂活性。
实施例11：FGF18/FGF17-1融合多肽引起的用FGFR3b转染的BaF3细胞的增殖
在BaF3/FGFR3b增殖测定中评估FGF18/FGF17-1融合多肽的活性。具体地，BaF3细胞在补充有10％小牛血清、2ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000 UF，140V)用pcDNA3-FGFR3-IIIb转染，并在不存在IL-3的情况下用G418(600μg/ml)和FGF1加上肝素(50μg/ml)进行选择。该程序产生了表达FGFR3b的BaF3细胞集落。
将BaF3/FGFR3b细胞用PBS洗涤3次。将细胞(每孔5x 104个)接种在96孔板中。在200μl的总体积中加入合适的FGF和本发明的融合多肽以及肝素。在96小时后向96孔板中加入100μl Cell Titer-Glo(Promega)，并在室温下温育10min。用多板阅读器synergyII(Bioteck)监测发光。将来自没有任何生长因子的孔中的背景信号从在其存在下获得的值中减去。所有处理均一式三份地进行(图6)。FGF1用作阳性对照。如图6中可见，FGF 1在FGFR3b转染的BaF3细胞中显示了有效的促有丝分裂作用，而FGF18、FGF17b和融合多肽仅在高浓度下显示了一定的促有丝分裂活性。
实施例12：FGF18/FGF17-1融合多肽引起的用FGFR3c-1c转染的BaF3细胞的增殖
在BaF3/FGFR3c-1c增殖测定中评估FGF18/FGF17-1融合多肽的活性。具体地，BaF3细胞在补充有10％小牛血清、2ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000 UF，140V)用pcDNA3-FGFR3-IIIc/R1c转染，并在不存在IL-3的情况下用G418(600μg/ml)和FGF1加上肝素(50μg/ml)进行选择。该程序产生了表达FGFR3c-1c的BaF3细胞集落。
将BaF3/FGFR3c-1c细胞用PBS洗涤3次。将细胞(每孔5x 104个)接种在96孔板中。在200μl的总体积中加入合适的FGF和本发明的融合多肽以及肝素。在96小时后向96孔板中加入100μl Cell Titer-Glo(Promega)，并在室温下温育10min。用多板阅读器synergyII(Bioteck)监测发光。将来自没有任何生长因子的孔中的背景信号从在其存在下获得的值中减去。所有处理均一式三份地进行(图7)。FGF1用作阳性对照。如图7中可见，FGF 1、FGF18、FGF17b和融合多肽均在FGFR3c-1c转染的BaF3中显示了有效的促有丝分裂作用。
实施例13：FGF18/FGF17-1融合多肽引起的用FGFR4-1c转染的BaF3细胞的增殖
在BaF3/FGFR4-1c增殖测定中评估FGF18/FGF17-1融合多肽的活性。具体地，BaF3细胞在补充有10％小牛血清、2ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000UF，140V)用pcDNA3-FGFR4/R1c转染，并在不存在IL-3的情况下用G418(600μg/ml)和FGF1加上肝素(50μg/ml)进行选择。该程序产生了表达FGFR4-1c的BaF3细胞集落。
将BaF3/FGFR4-1c细胞用PBS洗涤3次。将细胞(每孔5x 104个)接种在96孔板中。在200μl的总体积中加入合适的FGF和本发明的融合多肽以及肝素。在96小时后向96孔板中加入100μl Cell Titer-Glo(Promega)，并在室温下温育10min。用多板阅读器synergyII(Bioteck)监测发光。将来自没有任何生长因子的孔中的背景信号从在其存在下获得的值中减去。所有处理均一式三份地进行(图8)。FGF1用作阳性对照。如图8中可见，FGF 1在FGFR4-1c转染的BaF3细胞中显示了有效的促有丝分裂作用，而FGF18、FGF17b和融合多肽仅在高浓度下显示了一定的促有丝分裂活性。
实施例14：FGF18/FGF17-1融合多肽引起的用FGFRdelta4-1c转染的BaF3细胞的增殖
在BaF3/FGFRdelta4-1c增殖测定中评估FGF18/FGF17-1融合多肽的活性。具体地，BaF3细胞在补充有10％小牛血清、2ng/ml mIL-3和L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。这些细胞通过电穿孔(1000 UF，140V)用pcDNA3-FGFRΔ4/R1c转染，并在不存在IL-3的情况下用G418(600μg/ml)和FGF1加上肝素(50μg/ml)进行选择。该程序产生了表达FGFRdelta4-1c的BaF3细胞集落。
将BaF3/FGFRdelta4-1c细胞用PBS洗涤3次。将细胞(每孔5x104个)接种在96孔板中。在200μl的总体积中加入合适的FGF和本发明的融合多肽以及肝素。在96小时后向96孔板中加入100μl Cell Titer-Glo(Promega)，并在室温下温育10min。用多板阅读器synergyII(Bioteck)监测发光。将来自没有任何生长因子的孔中的背景信号从在其存在下获得的值中减去。所有处理均一式三份地进行(图9)。FGF1用作阳性对照。如图9中可见，FGF1在FGFRdelta4-1c转染的BaF3细胞中显示了有效的促有丝分裂作用，而FGF18、FGF17b和融合多肽仅在高浓度下显示了一定的促有丝分裂活性。
实施例15：FGF18类似物对人关节软骨细胞生长的影响
对本发明的融合多肽在软骨细胞中诱导促有丝分裂反应的能力进行测试。图10显示了对融合多肽的促有丝分裂反应的代表性实例。如图可见，测试的所有融合多肽均显示了与FGF18的能力相当的刺激软骨细胞增殖的能力。
实施例16：对产生蛋白聚糖的影响
在如实施例7所述的人关节软骨细胞的微团培养物上评估融合多肽对产生蛋白聚糖的影响。如图11所示，如通过番红O染色所揭示的，测试的融合多肽具有与FGF18的能力相当的增加蛋白聚糖合成的能力。
序列表
<110> 德益阳光生物技术（北京）有限责任公司
<120> 融合多肽及使用方法
<130> 45910-702.602
<150> PCT/CN2015/084133
<151> 2015-07-15
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 180
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
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<213> 人工序列
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<223> 融合多肽
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<223> 融合多肽
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<223> 融合多肽
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<223> 融合多肽
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<213> 人工序列
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Arg Arg Ile Ser Ala Thr Ala Glu Asp Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu
50 55 60
Ile Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala
65 70 75 80
Glu Ser Glu Lys Tyr Ile Cys Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly
85 90 95
Lys Pro Ser Gly Lys Ser Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu
100 105 110
Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Phe Gln Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe
115 120 125
Met Ala Phe Thr Arg Gln Gly Arg Pro Arg Gln Ala Ser Arg Ser Arg
130 135 140
Gln Asn Gln Arg Glu Ala His Phe Ile Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gln
145 150 155 160
Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys Arg Ser
165 170 175
Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala
180 185
<210> 12
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合多肽
<400> 12
Thr Gln Gly Glu Asn His Pro Ser Pro Asn Phe Asn Gln Tyr Val Arg
1 5 10 15
Asp Gln Gly Ala Met Thr Asp Gln Leu Ser Arg Arg Gln Ile Arg Glu
20 25 30
Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Ile Gln Val Leu Gly
35 40 45
Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gln Leu
50 55 60
Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala
65 70 75 80
Glu Ser Glu Lys Tyr Ile Cys Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly
85 90 95
Lys Pro Ser Gly Lys Ser Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu
100 105 110
Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Phe Gln Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe
115 120 125
Met Ala Phe Thr Arg Gln Gly Arg Pro Arg Gln Ala Ser Arg Ser Arg
130 135 140
Gln Asn Gln Arg Glu Ala His Phe Ile Lys Arg Leu Tyr Gln Gly Gln
145 150 155 160
Leu Pro Phe Pro Asn His Ala Glu Lys Gln Lys Gln Phe Glu Phe Val
165 170 175
Gly Ser Ala Pro Thr Arg Arg Thr Lys Arg Thr Arg Arg Pro Gln Pro
180 185 190
Leu Thr
<210> 13
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合多肽
<400> 13
Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala
1 5 10 15
Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Thr Ser Gly Lys His Val Gln Val Thr Gly Arg Arg Ile Ser Ala
35 40 45
Thr Ala Glu Asp Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp
50 55 60
Thr Phe Gly Ser Gln Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Cys Met Asn Arg Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr
85 90 95
Ser Lys Glu Cys Val Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr
100 105 110
Ala Leu Met Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys
115 120 125
Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp
130 135 140
Val His Phe Met Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys
145 150 155 160
Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro
165 170 175
Thr His Pro Ala
180
<210> 14
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合多肽
<400> 14
Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala
1 5 10 15
Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Thr Ser Gly Lys His Val Gln Val Thr Gly Arg Arg Ile Ser Ala
35 40 45
Thr Ala Glu Asp Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp
50 55 60
Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala Glu Ser Glu Lys Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly Lys Pro Ser Gly Lys
85 90 95
Ser Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr
100 105 110
Ala Phe Gln Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe Met Ala Phe Thr Arg
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Ala His Phe Ile Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys
145 150 155 160
Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro
165 170 175
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<210> 15
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合多肽
<400> 15
Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala
1 5 10 15
Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gln Ile Arg Glu Tyr Gln Leu Tyr Ser
20 25 30
Arg Thr Ser Gly Lys His Val Gln Val Thr Gly Arg Arg Ile Ser Ala
35 40 45
Thr Ala Glu Asp Gly Asn Lys Phe Ala Lys Leu Ile Val Glu Thr Asp
50 55 60
Thr Phe Gly Ser Arg Val Arg Ile Lys Gly Ala Glu Ser Glu Lys Tyr
65 70 75 80
Ile Cys Met Asn Lys Arg Gly Lys Leu Ile Gly Lys Pro Ser Gly Lys
85 90 95
Ser Lys Asp Cys Val Phe Thr Glu Ile Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr
100 105 110
Ala Phe Gln Asn Ala Arg His Glu Gly Trp Phe Met Ala Phe Thr Arg
115 120 125
Gln Gly Arg Pro Arg Gln Ala Ser Arg Ser Arg Gln Asn Gln Arg Glu
130 135 140
Ala His Phe Ile Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys
145 150 155 160
Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro
165 170 175
Thr His Pro Ala
180
<210> 16
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合多肽
<400> 16
Thr Gln Gly Glu Asn His Pro Ser Pro Asn Phe Asn Gln Tyr Val Arg
1 5 10 15
Asp Gln Gly Ala Met Thr Asp Gln Leu Ser Arg Arg Gln Ile Arg Glu
20 25 30
Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Ile Gln Val Leu Gly
35 40 45
Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gln Leu
50 55 60
Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln Val Arg Ile Lys Gly Lys
65 70 75 80
Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg Lys Gly Lys Leu Val Gly
85 90 95
Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val Phe Ile Glu Lys Val Leu
100 105 110
Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr
115 120 125
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130 135 140
Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys Arg Leu Tyr Gln Gly Gln
145 150 155 160
Leu Pro Phe Pro Asn His Ala Glu Lys Gln Lys Gln Phe Glu Phe Val
165 170 175
Gly Ser Ala Pro Thr Arg Arg Thr Lys Arg Thr Arg Arg Pro Gln Pro
180 185 190
Leu Thr

Claims (12)

1.一种融合多肽，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15。
2.如权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽的N-末端进一步被聚乙二醇(PEG)修饰。
3.如权利要求2所述的融合多肽，其中所述聚乙二醇为单甲氧基PEG丙醛。
4.如权利要求3所述的融合多肽，其中所述聚乙二醇的分子量为12Kd至40Kd。
5.表达如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽的宿主细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为原核细胞。
7.如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽在制备治疗有需要的哺乳动物中的软骨缺陷的药物中的用途。
8.如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽在制备治疗有需要的哺乳动物中的骨关节炎、退行性椎间盘疾病或软骨损伤的药物中的用途。
9.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽以及药学上可接受的赋形剂。
10.一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽以及第二治疗剂。
11.一种载体，其包含编码如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽的多核苷酸。
12.一种产生如权利要求1-4中任一项所述的融合多肽的方法，其包括在适合蛋白质表达的条件下在细胞中表达如权利要求11所述的载体，从而产生所述融合多肽。
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