SK17742002A3 - Spôsoby liečby reumatických ochorení s použitím solubilnej CTLA4 molekuly - Google Patents

Spôsoby liečby reumatických ochorení s použitím solubilnej CTLA4 molekuly Download PDF

Info

Publication number
SK17742002A3
SK17742002A3 SK1774-2002A SK17742002A SK17742002A3 SK 17742002 A3 SK17742002 A3 SK 17742002A3 SK 17742002 A SK17742002 A SK 17742002A SK 17742002 A3 SK17742002 A3 SK 17742002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
ctla4
molecule
agent
lea
soluble ctla4
Prior art date
Application number
SK1774-2002A
Other languages
English (en)
Other versions
SK287940B6 (sk
Inventor
Robert Cohen
Suzette Carr
David Hagerty
Robert J. Peach
Jean-Claude Becker
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22804919&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK17742002(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of SK17742002A3 publication Critical patent/SK17742002A3/sk
Publication of SK287940B6 publication Critical patent/SK287940B6/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Predkladaný vynález sa všeobecne týka reumatických ochorení. Konkrétne sa vynález týka spôsobov a prostriedkov na liečbu reumatických ochorení, ako je reumatoidná artritída, podávania účinného množstva solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly jedincovi.
Doterajší stav techniky
V súčasnosti neexistuje kuratívna liečba reumatických ochorení. Terapeutické činidlá sú používané na liečbu príznakov. Zvyčajne sú terapeutické činidlá podávané po dlhý čas a terapeutická hodnota týchto liekov je často znížená ich nežiaducimi účinkami.
Reumatické ochorenia sú skupinou ochorení postihujúcich muskuloskeletárny systém a spojivové tkanivo. Toto ochorenie je charakterizované chronickým zápalom, ktorý často vedie k permanentnému poškodeniu tkanív, deformáciám, atrofii a invalidite. Reumatické ochorenia postihujú kĺby, kosti, mäkké tkanivo alebo miechu (Mathies, H., 1983, Rheuma) a sú klasifikované ako zápalový reumatizmus, degeneratívny reumatizmus, extra-artikulárny reumatizmus alebo ochorenie kolagénu. O niektorých reumatických ochoreniach je dobre známe, že sú autoimunitnými ochoreniami spôsobenými chybnou imunitnou odpoveďou jedinca.
Reumatoidná artritída je progresívne reumatické ochorenie postihujúce približne 2 % dospelej populácie v rozvinutých krajinách (Utsinger, P. D., et. al., 1985 Rheumatoid Arthritis, str. 140). Toto ochorenie je charakterizované perzistentnou inflamatórnou synovitídou, ktorá spôsobuje deštrukciu chrupavky a eróziu kosti, čo vedie ku štrukturálnym deformáciám v periférnych kĺboch. Medzi príznaky spojené s reumatoidnou artritídou patria opuchy kĺbov, citlivosť kĺbov, zápal, ranná stuhnutosť a bolesť, najmä pri flexii. Jedinci s pokročilými štádiami artritídy trpia štrukturálnym postihnutím, vrátane deštrukcie kĺbu s eróziou kostí (v: Principals of Internal Medicíne, Harrison, 13. vydanie, str. 1648 - 1655). Okrem toho môžu mať pacienti iné príznaky, vrátane lézii na koži, obličkách, srdci, pľúcach, centrálnom nervovom systéme a očiach, ktoré sú spôsobené vaskulitídou súvisiacou s autoimunitným procesom.
Medzi ďalšie príznaky súvisiace s reumatoidnou artritídou patrí zvýšená sedimentácia erytrocytov a zvýšená sérová koncentrácia C-reaktívneho proteínu (CRP) a/alebo solubilného IL-2 receptora (IL-2r). Sedimentácia erytrocytov je zvýšená takmer u všetkých pacientov s aktívnou reumatoidnou artritídou. Koncentrácia C-reaktívneho proteínu v sére je tiež zvýšená a koreluje s aktivitou ochorenia a pravdepodobnosťou progresívneho postihnutia kĺbov. Ďalej, sérová koncentrácia solubilného IL-2r, produktu aktivovaných T-lymfocytov, je zvýšená v sére a synoviálnej kvapaline u pacientov s aktívnou reumatoidnou artritídou (pozri Principals of Internal Medicíne, Harrisson, 13. vydanie, strana 1650).
Reumatoidná artritída sa považuje za autoimunitné ochorenie sprostredkované T-lymfocytmi, na ktorom sa podieľajú antigén-nešpecifické intracelulárne interakcie medzi T-lymfocytmi a bunkami prezentujúcimi antigén. Všeobecne, veľkosť reakcie T-lymfocytov je určená ko-stimulačnou reakciou vyvolanou interakciou medzi povrchovými molekulami T-lymfocytov a ich ligandami (Mueller et al., 1989 Ann. Rev. Imunol. 7:445 - 480). Kľúčové kostimulačné signály sú dodávané interakciou medzi povrchovými receptormi T-lymfocytov. CD28 a CTLA4, a ich ligandami, ako sú molekuly CD80 podobné B7 (t.j. B7-1) a CD86 (t.j. B7-2). na bunkách prezentujúcich antigén (Linsley, P. a Ledhetter, J., 1993, Ann. Rev. Imunol, 11:191 -212).
Aktivácia T-lymfocytov pri absencii ko-stimulácie vedie k alergickej reakcii Tlymfocytov (Schwartz, R. H., 1992, Celí 71:1065 - 1068), pri ktorej imunitný systém prestáva reagovať na stimuláciu.
Pretože reumatoidná artritída sa považuje za autoimunitné ochorenie sprostredkované T-lymfocytmi, jednou stratégiou pri vývoji nových činidiel na liečbu reumatoidnej artritídy je snaha o identifikáciu molekúl, ktoré blokujú ko-stimulačné signály medzi T-lymfocytmi a bunkami prezentujúcimi antigén, blokovaním interakcie medzi endogénnym CD28 alebo CTLA4 a B7. Medzi potenciálne molekuly patria solubilné CTLA4 molekuly, ktoré sú modifikované tak, aby boli schopné sa viazať na B7 s vyššou aviditou ako prirodzený CTI_A4 (ktorého sekvencia je uvedená na obr. 23) alebo CD28, čím dôjde k blokovaniu kostimulačných signálov.
Solubilné formy CD28 a CTLA4 boli pripravené fúzovaním variabilných (V)like extracelulárnych domén CD28 a CTLA4 na imunoglobulínové (Ig) konštantné domény, čo vedie k vzniku CD28lg a CTI_A4lg. Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia CTLA4lg je uvedená na obr. 24 s tým, že proteín začína metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končí lyzínom v pozícii +357. CTLA4lg sa viaže na CD80-pozitívne a CD86-pozitívne bunky silnejšie ako CD28lg (Linsley, P., et al., 1994, Imunity 1:793-80). Zistilo sa, že veľa imunitných reakcií sprostredkovaných T-lymfocytmi je blokovaných CTLA4lg ako in vitro, tak aj in vivo. (Linsley, P., et al., 1991b, vyššie: Linsley, P., et al., 1992a Science 257:792 795; Linsley, P., et al., 1992b, J. Exp.
Med 176:1595 - 1604; Lenschow. D. J., et al. 1992 Science 257:789 - 792; Tan, P., et al., 1992 J. Exp. Med. 177:165 - 173; Turka, L. A., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102- 11105).
Na zmenu väzbovej afinity k prirodzeným ligandom, ako je B7, boli solubilné CTLA4lg fúzne molekuly modifikované mutáciou aminokyselín v CTLA4 časti molekuly. Regióny CTLA4, ktoré po mutácii menia väzbovú afinitu alebo aviditu pre B7 ligandy zahŕňajú komplementaritu určujúci región 1 (CDR-1, ako je opísané v U.S. patentoch 6090914, 5773253, 5844095; v súvisiacej U.S. patentovej prihláške poradové č. 60/214065: a v Peach et. al., 1994, J. Exp. Med., 180:2049 2058) a regióny podobné komplementaritu určujúcemu regiónu 3 (CDR-3)-like regióny (CDR-3 je konzervovaný región CTLA4 extracelulárnej domény, ako je opísané v U.S. patentoch 6090914, 5773253 a 5844095; v súvisiacej U.S. patentovej prihláške poradové č. 60/214065; a v Peach, R. J., et al., J. Exp Med 1994 180:2049 - 2058. CDR-3-podobný región obsahuje CDR-3 región a ďalších niekoľko aminokyselín pred a/alebo za CDR-3 motívom. CDR-3-podobný región obsahuje hexapeptidový motív MYPPPY, ktorý je vysoko konzervovaný vo všetkých členoch CD28 a CTLA4 rodiny. Alanínová skenovacia mutagenéza v hexapeptidovom motíve v CTLA4 a vo vybraných zvyškoch v CD28lg, viedla ku zníženiu alebo eliminácii väzby na CD80 (Peach, R. J., et al., J Exp Med 1994, 160:2049-2058).
Ďalšie modifikácie v solubilnej CTLA4lg molekule boli uskutočnené zámenou homológnych regiónov CTLA4 a CD28. Tieto chimérické CTLA4/CD28 homológne mutantné molekuly identifikovali MYPPPY hexapeptidový motív spoločný CTLA4 a CD28, rovnako ako niektoré nekonzervované aminokyselinové zvyšky v CDR-1 a CDR-3-podobných regiónoch CTLA4, ako regióny zodpovedné za zvýšenie väzbovej avidity CTLA4 s CD80 (Peach, R. J., et al., 1994 J. Exp Med 180:2049-2058).
Solubilné CTLA4 molekuly, ako je CTLA4lg, CTLA4 mutantné molekuly alebo chimérické CTLA4/CD28 homológne mutanty, ako boli opísané vyššie, tvoria novú skupinu terapeutických liekov na liečbu reumatických ochorení.
Súčasná liečba reumatických ochorení, ako je reumatoidná artritída, zahŕňa podávanie nešpecifických cytotoxických imunosupresívnych liekov, ako je metotrexat, cyklofosfamid, azatioprin, cyklosporín A, blokátory alebo antagonisty faktoru nekrózy nádorov alfa (TNF-alfa). Tieto imunosupresívne lieky potláčajú celú imunitnú odpoveď jedinca a dlhodobé používanie zvyšuje riziko infekcií. Okrem toho tieto lieky spomaľujú progresiu reumatoidnej artritídy, čo vedie k akcelerácii stavu potom, ako je terapia prerušená. Ďalej, dlhodobá terapia týmito nešpecifickými liekmi má toxické nežiaduce účinky, vrátane tendencie ku vzniku niektorých malignít, zlyhávaniu obličiek, supresii kostnej drene, pľúcnej fibrózy, malignít, diabetu a narušeniu pečeňových funkcií. Účinnosť týchto liekov tiež postupne počas 2 - 5 rokov vymizne (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6. vydanie, strany 1001 - 1022).
Alternatívne sú na dosiahnutie symptomatickej úľavy používané terapeutické činidlá, ktoré sú nešpecifický imunosupresívne a protizápalové. Tieto lieky sú závislé od dávky a nebránia progresii ochorenia. Medzi takéto lieky patria steroidné zlúčeniny, ako je prednizón a metylprednizolon. Steroidy majú tiež významné nežiaduce účinky pri dlhodobej terapii (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6. vydanie, strany 829 - 833).
Súčasná liečba reumatoidnej artritídy má teda obmedzenú účinnosť, významné nežiaduce účinky a nemôže byť použitá po dlhší čas.
Existuje preto potreba novej liečby, ktorá je účinná a lepšia pri liečbe reumatických ochorení, ako je reumatoidná artritída, a ktorá nemá nevýhody bežných terapií a liekov, pretože postihuje autoimunitné patofyziologické mechanizmy.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje prostriedky a spôsoby na liečbu ochorení imunitného systému, pri ktorých sú jedincom podávané solubilné CTLA4 molekuly, ktoré sa viažu na B7 molekuly na B7-pozitívnych bunkách, čím inhibujú endogénne B7 molekuly z väzby na CTLA4 a/alebo CD28 na T-lymfocytoch. Medzi solubilné CTLA4 molekuly použité v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu patria CTLA4lg a solubilná CTLA4 mutantná molekula L104EA29Ylg.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby inhibície funkcie T-lymfocytov, ale nie deplécie T-lymfocytov u človeka, pomocou kontaktovania B7-pozitívnych buniek u človeka so solubilným CTLA4. Príklady solubilných CTLA4 sú CTLA4lg a solubilná CTLA4 mutantná molekula, ako je L104EA29Ylg.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby liečby (napríklad redukciu príznakov) reumatických ochorení, ako je reumatoidná artritída, podaním solubilnej CTLA4 molekuly, ako je CTLA4lg a/alebo solubilná CTLA4 mutantná molekula L104EA29Ylg, jedincovi s reumatoidnou artritídou. CTLA4 mutantná molekula L104EA29Ylg, ktorá napríklad začína metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končí lyzínom v pozícii +357, ako je uvedené na obr. 19, je výhodná na použitie v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby redukcie patofyziologických zmien asociovaných s reumatickým ochorením, ako je štrukturálne postihnutie, podávaním solubilnej CTLA4 molekuly jedincovi s reumatoidnou artritídou.
Predkladaný vynález tiež poskytuje farmaceutické kompozície na liečbu ochorení imunitného systému, ako sú reumatické ochorenia, ktoré obsahujú farmaceutický prijateľný nosič a biologicky účinné činidlo, ako sú solubilné CTLA4 molekuly.
Kity obsahujúce terapeutické farmaceutické prostriedky na ochorenie imunitného systému sú tiež zahrnuté v predkladanom vynáleze. V jednom uskutočnení je kit obsahujúci jeden alebo viacej farmaceutických prostriedkov podľa predkladaného vynálezu použitý na liečbu ochorení imunitného systému, napr. reumatoidnej artritídy. Napríklad farmaceutická kompozícia podľa predkladaného vynálezu obsahuje účinné množstvo solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly, ktoré sa viaže na B7 molekuly na B7-pozitívnych bunkách, čím blokuje B7 molekuly od väzby CTLA4 a/alebo CD28 na T-lymfocytoch. Ďalej môže kit obsahovať jedno alebo viacej imunosupresívnych činidiel použitých súčasne s farmaceutickou kompozíciou podľa predkladaného vynálezu. Medzi potenciálne imunosupresívne činidlá patria, napríklad kortikosteroidy, nesteroidné antireumatiká (napr. Cox-2 inhibitory), cyklosporín, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlo pôsobiace na zápalový cytokín, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept a anakinra.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby na zníženie sedimentácie erytrocytov, ktorá je asociovaná s reumatoidnou artritídou.
Ďalej predkladaný vynález poskytuje spôsoby na zníženie koncentrácie niektorých zložiek krvného séra, ktoré sú asociované s reumatoidnou artritídou, vrátane C-reaktívneho proteínu, solubilného ICAM-1, solubilného E-selektínu a/alebo solubilného
IL-2r.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 A: Demografické údaje kohort pacientov. Demografické údaje zahŕňajúce pohlavie, rasu a trvanie ochorenia, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Obr. 1B: Demografické údaje kohort pacientov. Demografické údaje zahŕňajú pohlavie, vek, hmotnosť a aktivitu ochorenia, ako je hodnotená pacientom a lekárom, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Obr. 1C: Demografické údaje kohort pacientov, ako je opísané v príklad 3, ďalej. Demografické údaje zahŕňajú aktivitu ochorenia, sedimentáciu erytrocytov (ESR), fyzikálne funkcie (neschopnosť hodnotená podľa dotazníka) a C-reaktívny proteín (CRP).
Obr. 1D: Demografické údaje kohort pacientov, ako je opísané v príklade 3, ďalej. Demografické údaje zahŕňajú opuchy kĺbov, citlivosť kĺbov, rannú stuhnutosť a bolesť.
Obr. 1E: Demografické údaje kohort pacientov, ako je opísané v príklade 3. Demografické údaje zahŕňajú predchádzajúcu liečbu.
Obr. 2: Súhrn dôvodov prerušenia liečby v deň 85, podľa príkladu 3, ďalej.
Obr. 3A: ACR reakcie v deň 85, podľa príkladu 3, ďalej: ACR-20, -50 a -70 reakcie.
Obr. 3B: ACR-20 reakcie v deň 85, vrátane reakcie na placebo, podľa príkladu 3, ďalej: ACR-20 reakcia s 95 % intervalom spoľahlivosti.
Obr. 3C: ACR-20 reakcie v deň 85 podfa príkladu 3, ďalej: rozdiely v ACR-20 reakcii s 95 % intervalmi spoľahlivosti.
Obr. 4A: Základná (20 % zlepšenie) klinická odpoveď z hľadiska opuchu a citlivosti kĺbov v percentách pacientov v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej: základná klinická odpoveď. ACR-20.
Obr. 4B: Klinické odpovede (v percentách zlepšenia) u opuchnutých a citlivých kĺbov v percentách pacientov v deň 85, ako je opísané v príklade 3: ďalej zmena klinickej odpovede v percentách zlepšenia.
Obr. 5A: Reakcia z hľadiska bolesti (podľa Likertovej stupnice v priemernom počte jednotiek od základnej hodnoty) v percentách pacientov v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej: zmeny skóre bolesti od základnej hodnoty.
Obr. 5B: Celkové zmeny aktivity ochorenia hodnotené lekárom (podfa Likertovej stupnice v priemernom počte jednotiek od základnej hodnoty) v percentách pacientov v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej: zmeny celkovej aktivity ochorenia.
Obr. 5C: Celkové zmeny aktivity ochorenia hodnotené lekárom (podľa Likertovej stupnice v priemernom počte jednotiek od základnej hodnoty) v percentách pacientov v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej: zmeny celkovej aktivity ochorení.
Obr. 5D: Bolesť (podľa Likertovej stupnice v priemernom počet jednotiek od základnej hodnoty) v percentách pacientov v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej: zmeny od základnej hodnoty.
Obr. 6A: Celkové hodnotenie zmeny aktivity ochorenia od základnej hodnoty podľa pacienta po 2 jednotkách v deň 85, ako je opísané v príklade 3; zlepšenie aktivity ochorenia.
Obr. 6B: Celkové hodnotenie zmeny aktivity ochorenia od základnej hodnoty podľa lekára po 2 jednotkách v deň 85, ako je opísané v príklade 3; zlepšenie aktivity ochorenia.
Obr. 7A: Percentuálna redukcia koncentrácií C-reaktívneho proteínu (CRP) v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej: percento zníženia koncentrácie CRP vzhľadom na základnú hodnotu.
Obr. 7B: Rozdiel v znížení koncentrácií C-reaktívneho proteínu (CRP) v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej: percentuálne zníženie rozdielu v koncentráciách CRP v 95 % intervale spoľahlivosti.
Obr. 7C: Priemerné zníženie koncentrácie C-reaktívneho proteínu (CRP) v deň 85, ako je opísané v príklade 3; ďalej: priemerná zmena od základnej hodnoty.
Obr. 8: Redukcia koncentrácie solubilného IL-2 receptora, priemerná zmena od základnej hodnoty v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Obr. 9A: Efekt CTLA4lg na citlivé kĺby v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: medián rozdielu od základnej hodnoty.
Obr. 9B: Efekt CTLA4lg na citlivé kĺby v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: priemerný rozdiel od základnej hodnoty.
Obr. 10A: Efekt CTLA4lg na opuch kĺbov v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: meridián rozdielu od základnej hodnoty.
Obr. 10B: Efekt CTLA4lg na opuch kĺbov v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej priemerný rozdiel od základnej hodnoty.
ιι
Obr. 11: Efekt CTI_A4lg na bolesť podľa priemernej zmeny od základnej hodnoty za čas, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Obr. 12A: Efekt CTLA4lg na hodnotenie aktivity ochorenia pacientom podľa priemernej zmeny od základnej hodnoty za čas, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Obr. 12B: Efekt CTLA4lg na hodnotenie aktivity ochorenia pacientom podľa priemernej zmeny od základnej hodnoty za čas, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Obr. 13A: Efekt L104EA29Ylg na citlivé kĺby v čase, ako je opísané v príklad 3, ďalej: medián rozdielu od základnej hodnoty.
Obr. 13B: Efekt L104EA29Ylg na citlivé kĺby v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: priemerná zmena od základnej hodnoty.
Obr. 14A: Efekt L104EA29Ylg na opuchy kĺbov v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: medián rozdielu od základnej hodnoty.
Obr. 14B: Efekt L104EA29Ylg na opuchy kĺbov v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: priemerná zmena od základnej hodnoty.
Obr. 15: Efekt L104EA29Ylg na hodnotenie bolesti v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: priemerná zmena od základnej hodnoty za čas.
Obr. 16A: Efekt L104EA29Ylg na hodnotenie bolesti pacientom v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: priemerná zmena od základnej hodnoty za čas.
Obr. 16B: Efekt L104EA29Ylg na hodnotenie bolesti lekárom v čase, ako je opísané v príklade 3, ďalej: priemerná zmena od základnej hodnoty za čas.
Obr. 17: Percentuálne zlepšenie nespôsobilosti pacienta podľa dotazníka hodnotiaceho zdravotný stav (HAQ) v porovnaní s východiskovým stavom v deň 85 s liečbou CTLA4lg a L104EA29Ylg, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Obr. 18: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia l_104Elg, ako sú opísané v príklade 1, ďalej.
Obr. 19: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia L104EA29Ylg, ako sú opísané v príklade 1, ďalej.
Obr. 20: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia L104EA29Llg, ako sú opísané v príklade 1, ďalej.
Obr. 21: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia L104EA29Tlg, ako sú opísané v príklade 1, ďalej.
Obr. 22: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia L104EA29Wlg, ako sú opísané v príklade 1, ďalej.
Obr. 23: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia CTLA4 receptora.
Obr. 24: Nukleotidová a aminokyselinová sekvencia CTI_A4lg.
Obr. 25: SDS gél (obr. 25A) pre CTLA4lg (dráha 1), L104Elg (dráha 2), a L104EA29Ylg (dráha 3A); chromatogramy s vylučovaním podľa veľkosti pre CTLA4lg (obr. 25B) a L104EA29Ylg (obr. 25 C).
Obr. 26 (ľavý a pravý obr.): Diagram zloženého CTLA4 extracelulárneho Ig V-typu pripraveného podľa štruktúry určenej NMR spektroskopiou. Obr. 26 (pravý) ukazuje rozšírený pohľad na CDR-1 (S25-R33) región a MYPPPY región ukazujúci umiestnenie a orientáciu vedľajších reťazcov mutácií zvyšujúcich aviditu, L104 a A29.
Obr. 27A a 27B: FACS testy ukazujúce väzbu L104EA29Ylg, L104Elg a CTLA4lg na ľudské CD80- alebo CD86-transfektované CHO bunky, ako je opísané v príklade 2, ďalej.
Obr. 28A a 28B: Grafy ukazujúce inhibíciu proliferácie CD80-pozitívnych a CD86pozitívnych CHO buniek, ako je opísaná v príklade 2, ďalej.
Obr. 29A a 29B: Grafy ukazujúce, že L104EA29Ylg je účinnejší ako CTI_A4lg v inhibovaní proliferácie primárnych, sekundárnych allostimulovaných T-lymfocytov, ako je opísané v príklade 2, ďalej.
Obr. 30A - C: Grafy ilustrujúce, že L104EA29Ylg je účinnejší ako CTLA4lg v inhibovaní produkcie IL-2 (obr. 30A), IL-4 (obr. 30B) a gama-interferónu (obr. 30C) allostimulovanými ľudskými T-lymfocytmi, ako je opísané v príklade 2, ďalej.
Obr. 31: Graf ukazujúci, že L104EA29Ylg je účinnejší ako CTLA4lg v inhibovaní proliferácie fytohemaglutinínom (PHA) stimulovaných opičích T-lymfocytov, ako je opísané v príklade 2, ďalej.
Obr. 32: Graf ukazujúci analýzu väzbovej rovnováhy pre L104EA29Ylg, E104Elg a prirodzený CTLA4lg k CD86lg.
Obr. 33A a B: Redukcia koncentrácie solubilného ICAM-1 a solubilného Eselektínu ako priemerné zmeny od základnej hodnoty v deň 85, ako je opísané v príklade 3, ďalej.
Podrobný opis vynálezu
Definície
Všetky vedecké a technické termíny uvedené v tejto prihláške majú významy bežne používané v odbore, ak nie je uvedené inak. Nasledujúce výrazy alebo frázy majú nasledujúce významy.
Termín ligand označuje molekulu, ktorá špecificky rozpoznáva a viaže sa na inú molekulu, napríklad ligandom pre CTLA4 je B7 molekula.
Prirodzený CTLA4 alebo nemutovaný CTLA4” má aminokyselinovú sekvenciu prirodzeného, kompletného CTLA4, ako je uvedený na obr. 23 (tiež ako je opísaný v U.S. patentoch č. 5434131, 5844095, 5851795), alebo akejkoľvek jeho časti, ktorá rozpoznáva a viaže sa na B7 alebo interferuje s B7 tak, že blokuje väzbu na CD28 a/alebo CTLA4 (napr. endogénny CD28 a/alebo CTLA4). V konkrétnych uskutočneniach začína extracelulárna doména prirodzeného CTLA4 metionínom v pozícii +1 a končí kyselinou asparágovou v pozícii +124, alebo začína extracelulárna doména prirodzeného CTLA4 alanínom v pozícii -1 a končí kyselinou asparágovou v pozícii +124. Prirodzený CTLA4 je bunkový povrchový proteín majúci N-terminálnu extracelulárnu doménu, transmembránovú doménu a C-terminálnu cytoplazmatickú doménu. Extracelulárna doména sa viaže na cieľové molekuly, ako je B7 molekula. V bunkách je prirodzený CTLA4 proteín translatovaný ako nezrelý polypeptid, ktorý obsahuje signálny peptid na Nterminálnom konci. Nezrelý polypeptid je post-translačne spracovaný, čo zahŕňa štiepenie signálneho peptidu za získania CTLA4 štiepeného produktu majúceho nový N-terminálny koniec, ktorý sa odlišuje od N-terminálneho konca nezrelej formy. Odborníkom v odbore bude zrejmé, že môže prebehnúť ďalšie posttranslačné spracovanie, ktoré odstráni jednu alebo viacej aminokyselín z nového N-terminálneho konca CTLA4 vzniknutého štiepením. Alternatívne nemusí byť signálny peptid odstránený úplne, za získania molekuly, ktorá začína pred zvyčajný počiatočným metionínom. Tak môže zrelý CTLA4 proteín začínať metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1. Zrelá forma CTLA4 molekuly obsahuje extracelulárnu doménu alebo akúkoľvek jej časť, ktorá sa viaže na B7.
Termín ”CTLA4 mutantná molekula” označuje prirodzený CTLA4, ako je uvedený na obr. 23, alebo akúkoľvek jeho časť alebo derivát, ktorý obsahuje mutáciu alebo viacpočetné mutácie (výhodne v extracelulárnej doméne prirodzeného CTLA4). CTLA4 mutantná molekula má sekvenciu, ktorá je podobná, ale nie identická sekvencii prirodzenej CTLA4 molekuly, ale ktorá sa stále ešte viaže na B7. Mutácie môžu postihovať jeden alebo viacej aminokyselinových zvyškov, kde tieto zvyšky sú substituované aminokyselinou majúcou konzervatívnu (napr. leucín za izoleucín) alebo nekonzervatívnu (napr. glycín za tryptofán) štruktúru alebo chemické vlastnosti, a ďalej môže ísť o aminokyselinové delécie, adície, posuny čítacieho rámca alebo skrátenie. CTLA4 mutantné molekuly môžu zahŕňať non-CTLA4 molekuly naviazané na mutantné CTLA4 molekuly. Mutantné molekuly môžu byť solubilné (t.j. cirkulujúce) alebo viazané na bunkový povrch. Medzi ďalšie CTLA4 mutantné molekuly patria molekuly opísané v U.S. patentovej prihláške poradové č. 09/865321, 60/214065 a 60/287576; v U.S. patentoch č. 6090914, 5844095 a 5773243; a v Pech, R. J. et al., v J Exp Med. 180:2049 2058 (1995)). CTLA4 mutantné molekuly môžu byť pripravené synteticky alebo rekombinantne.
CTLA4lg je solubilný fúzny proteín obsahujúci extracelulárnu doménu prirodzeného CTLA4 naviazanú na Ig koncovku, alebo jej časť, ktorá sa viaže na B7. Konkrétne uskutočnenie obsahuje extracelulárnu doménu prirodzeného CTLA4 (ako je uvedené na obr. 23) začínajúcu metionínom v pozícii +1 a končiacu kyselinou asparágovou v pozícii +124; alebo začínajúcu alanínom v pozícii -1 a končiacu kyselinou asparágovou v pozícii +124; spojovaciu aminokyselinu glutamín v pozícii +125; a imunoglobulínovú časť tvorenú kyselinou glutámovou v pozícii +126 až lyzínom v pozícii +357 (DNA kódujúca CTLA4lg bola uložená 31.5.1991 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, podľa podmienok Budapeštianskej zmluvy, pod ATCC prírastkovým č. ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4lg-24, bunková línia ovariálnych buniek čínskeho škrečka (CHO) exprimujúca CTLA4lg, bola uložená 31.5.1991 pod ATCC identifikačným č. CRL-10762. Solubilné CTLA4lg molekuly použité v spôsoboch a/alebo kitoch podľa predkladaného vynálezu môžu a nemusia obsahovať signálnu (vedúcu) peptidovú sekvenciu. Zvyčajne v spôsoboch a/alebo kitoch podľa predkladaného vynálezu molekuly neobsahujú sekvenciu signálneho peptidu.
L104EA29Ylg” je fúzny proteín, ktorý je solubilnou CTLA4 mutantnou molekulou obsahujúcou extracelulárnu doménu prirodzeného CTLA4 s aminokyselinovými zmenami A29Y (tyrozín substituujúci alanín v pozícii 29) a L104E (kyselina glutámová substituujúca leucín v pozícii +104), alebo jej časť, ktorá sa viaže na B7 molekulu, naviazanú na Ig koncovku (obsiahnutú na obr. 19; DNA kódujúca L104EA29Ylg bola uložená 20. 6. 2000 s ATCC číslom PTA-2104; ako je uvedené v súvisiacich U.S. patentových prihláškach poradové č. 09/579,927, 60/287,576 a 60/214,065, ktoré sú tu uvedené ako odkazy). Solubilné L104EA29Ylg molekuly použité v spôsoboch a/alebo kitoch podľa predkladaného vynálezu môžu a nemusia obsahovať sekvenciu signálneho (vedúceho) peptidu. Zvyčajne v spôsoboch a/alebo kitoch podľa predkladaného vynálezu molekuly neobsahujú sekvenciu signálneho peptidu.
Termín solubilný”, ako je tu použitý, označuje akúkoľvek molekulu, alebo jej fragmenty a deriváty, nenaviazanú alebo nepripojenú bunku, t.j. cirkulujúcu. Napríklad CTLA4, B7 alebo CD28 sa môžu zmeniť na solubilné naviazaním imunoglobulínovej (Ig) skupiny na extracelulárnu doménu CTLA4, B7 alebo CD28, v príslušnom poradí. Alternatívne, molekula ako je CTLA4 sa môže zmeniť na solubilnú odstránením jej transmembránovej domény. Zvyčajne v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu solubilné molekuly neobsahujú sekvenciu signálneho peptidu.
Termín solubilné CTLA4 molekuly” označuje CTLA4 molekuly, alebo akúkoľvek funkčnú časť CTLA4 molekuly, neviazanú na povrch buniek (t.j. cirkulujúce), ktorá sa viaže na B7 vrátane napríklad: CTLA4lg fúznych proteínov (napr. ATCC 68629), kde je extracelulárna doména CTLA4 fúzovaná na imunoglobulínovú (Ig) skupinu, čím sa stane fúzna molekula solubilnou, alebo fragmenty a deriváty týchto proteínov s extracelulárnou doménou CTLA4 fúzovanou alebo spojenou s časťou biologicky aktívneho alebo chemicky aktívneho proteínu, ako je produkt papilomavírusového E7 génu (CTLA4-E7), antigén p97 asociovaný s melanómom (CTLA4-p97) alebo HIV env proteín (CTLA4-env gp120), alebo ich fragmenty a deriváty; hybridné (chimérické) fúzne proteíny, ako je CD28/CTI_A4lg, alebo ich fragmenty a deriváty; CTLA4 molekuly s odstránenou transmembránovou doménou na dosiahnutie solubility proteínu (Oaks, M. K., et al., 2000, Cellular Imunology 201:144 - 153), alebo ich fragmenty a deriváty. Solubilné CTLA4 molekuly tiež zahŕňajú ich fragmenty, časti a deriváty a solubilné CTLA4 mutantné molekuly majúce CTLA4 väzbovú aktivitu. Solubilné CTLA4 molekuly použité v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu môžu a nemusia obsahovať sekvenciu signálneho (vedúceho) peptidu. Zvyčajne v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu molekuly neobsahujú sekvenciu signálneho peptidu.
Termín extracelulárna doména CTLA4”, ako je tu použitý, označuje časť CTLA4, ktorá rozpoznáva a viaže sa na CTLA4 ligandy, ako sú B7 molekuly. Napríklad extracelulárna doména CTLA4 obsahuje metionín v pozícii +1 až kyselinu asparágovú v pozícii +124 (obr. 23). Alternatívne extracelulárna doména CTLA4 obsahuje alanín v pozícii -1 až kyselinu asparágovú v pozícii +124 (obr. 23). Extracelulárna doména zahŕňa fragmenty alebo deriváty CTLA4, ktoré sa viažu na B7 molekulu. Extracelulárna doména CTLA4, ako je uvedená na obr. 23, môže tiež obsahovať mutácie, ktoré menia väzbovú aviditu CTLA4 molekuly pre B7 molekulu.
Termín mutácia, ako je tu použitý, označuje zmenu v nukleotidovej alebo aminokyselinovej sekvencii prirodzenej molekuly, napríklad zmenu v DNA a/alebo aminokyselinovej sekvencii prirodzenej CTLA4 extracelulárnej domény. Mutácie v DNA môže meniť kodón, čo vedie ku zmene aminokyselinovej sekvencie. Zmeny v DNA zahŕňajú substitúcie, delécie, inzercie, alternatívny zostrih a skrátenie. Zmeny v aminokyselinách môžu zahŕňať substitúcie, delécie, inzercie, adície, skrátenie alebo zmeny v modifikácii alebo štiepení proteínu. Alternatívne, mutácie v nukleotidovej sekvencii môžu spôsobovať silentné mutácie v aminokyselinovej sekvencii, ako je v odbore dobre známe. Niektoré nukleotidové kodóny kódujú rovnaké aminokyseliny. Príkladmi sú nukleotidové kodóny CGU, CGG, CGC a CGA kódujúce aminokyselinu arginín (R); alebo kodóny GAU a GAC kódujúce aminokyselinu kyselinu asparágovou (D). Tak môže byť proteín kódovaný jednou alebo viacerými molekulami nukleovej kyseliny, ktoré sa líšia v špecifickej nukleotidovej sekvencii, ale ktoré kódujú proteínové molekuly majúce identické sekvencie. Kódujúce sekvencie pre aminokyseliny sú nasledujúce:
Aminokyselina Symbol Jednopísmenný symbol Kodóny
Alanín Ala A GCU, GCC, GCA, GCG
Cysteín Cys C UGU, UGC
kyselina asparágová Asp D GAU, GAC
kyselina glutámová Glu E GAA, GAG
Fenylalanín Phe F UUU, UUC
Glycín Gly G GGU, GGC, GGA, GGG
Histidín His H CAU, CAC
Izoleucin lle I AUU, AUC, AUA
Lyží n Lys K AAA, AAG
Leucín Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
Metionín Met M AUG
Asparagín Asn N AAU, AAC
Prolín Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamín Gin Q CAA, CAG
Arginín Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Serín Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
Treonín Thr T ACU, ACC, ACA, ACG
Valí n Val V GUU, GUC, GUA, GUG
Tryptofán Trp w UGG
Tyrozín Tyr Y UAU, UAC
Mutantná molekula môže obsahovať jednu alebo viacej mutácií.
Termín non-CTLA4 proteínová sekvencia” alebo non-CTLA4 molekula”, ako je tu použitý, označuje akúkoľvek proteínovú molekulu, ktorá sa neviaže na B7 a neinterferuje s väzbou CTLA4 na cieľovú molekulu, Príkladom je imunoglobulínový (Ig) konštantný región alebo jeho časť. Výhodne je Ig konštantný región z ľudského alebo opičieho Ig, napr. ľudský C(gama)1, vrátane pantového regiónu, CH2 a CH3 regiónov. Konštantný región Ig môže byť mutovaný na redukciu jeho efektorových funkcií (U.S. patenty 5637481,
5544095 a 5434131).
Termín fragment” alebo časť” označuje akúkoľvek časť alebo segment CTLA4 molekuly, výhodne extracelulárnu doménu CTLA4 alebo jej časť alebo segment, ktorý rozpoznáva a viaže sa na cieľovú molekulu, napr. B7 molekulu.
Termín ”B7”, ako je tu použitý, označuje B7 rodinu molekúl vrátane, ale nielen, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) a B7-3, ktoré rozpoznávajú a viažu sa na CTLA4 a/alebo CD28.
Termín ”B7-pozitívne bunky”, ako je tu použitý, označuje akékoľvek bunky s jedným alebo viacerými typmi B7 molekúl exprimovanými na povrch buniek.
Termín derivát”, ako je tu použitý, označuje molekulu, ktorá vykazuje homológnu sekvenciu a aktivitu pôvodnej molekuly. Napríklad derivát CTLA4 je solubilná CTLA4 molekula majúca aminokyselinovú sekvenciu aspoň na 70 % podobnú extracelulárnej doméne prirodzeného CTLA4, a ktorá rozpoznáva a viaže sa na B7, napr. CTLA4lg alebo solubilná CTLA4 mutantná molekula L104EA29Ylg.
Termíny blokovať” alebo inhibovať” receptor, signál alebo molekulu znamenajú interferovať s aktiváciou receptora, signálu alebo molekuly, ako je detekované použitím testov známych v odbore. Napríklad blokáda bunkami sprostredkovanej imunitnej reakcie môže byť detekovaná stanovením redukcie príznakov asociovaných s reumatickým ochorením. Blokáda alebo inhibícia môže byť čiastočná alebo úplná.
Termín blokovanie B7 interakcie” znamená interferenciu s väzbou B7 na jeho ligandy, ako je CD28 a/alebo CTLA4, čím dochádza k blokáde interakcií medzi T-lymfocytmi a B7-pozitívnymi bunkami.
Príklady činidiel, ktoré blokujú B7 interakcie, sú napríklad molekuly ako je protilátka (alebo jej časť alebo derivát), ktorá rozpoznáva a viaže sa na akúkoľvek CTLA4, CD28 alebo B7 molekulu (napr. B7-1, B7-2); solubilná forma (alebo jej časť alebo derivát) molekuly, ako je solubilný CTLA4; peptidový fragment alebo iná malá molekula navrhnutá tak, aby interferovala s bunkovým signálom prostredníctvom CTLA4/CD28/B7-sprostredkovaných interakcií. Vo výhodnom uskutočnení je blokovacie činidlo solubilná CTLA4 molekula, ako je CTLA4lg (ATCC 68629) alebo L104EA29Ylg ( ATCC PTA-2104), solubilná CD28 molekula, ako je CD28lg (ATCC 68628), solubilná B7 molekula, ako je B7lg (ATCC 68627), anti-B7 monoklonálna protilátka (napr. ATCC HB253, ATCC CRL-2223, ATCC GRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 a monoklonálne protilátky opísané v Anderson et al. v U.S. patente 6113898 alebo Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128(2)823 827), anti-CTLA4 monoklonálna protilátka (napr. ATCC HB-304, monoklonálne protilátky, ako sú opísané v odkazoch 82 - 83) a/alebo anti-CD28 monoklonálna protilátka (napr. ATCC HB 11944 a mAb 9.3, ako je opísaná v Hansen (Hansen et al., 1980. Imunogenetics 10: 247 - 260) alebo Martin (Martin et al., 1984. J. Clin. Immun., 40:18 - 22 )).
Termín ochorenie imunitného systému” označuje akékoľvek ochorenie sprostredkované interakciami T-lymfocytov s B7-pozitívnymi bunkami, vrátane napríklad autoimunitných ochorení, ochorení súvisiacich s transplantátmi a imunoproliferativnych ochorení. Príkladmi ochorení imunitného systému sú reakcie štepu proti hostiteľovi (GVHD) (napr. pri transplantácii kostnej drene alebo pri indukcii tolerancie), imunologické poruchy asociované s odmietnutím transplantátu, chronické rejekcie, tkanivové alebo bunkové allo- alebo xenotransplantáty, vrátane orgánových, kožných, ostrovčekov pankreasu, svalov, hepatocytov a neurónov. Príklady imunoproliferativnych ochorení sú napríklad psoriáza, T-lymfocytárny lymfóm,
T-lymfocytárna akútna lymfoblastická leukémia, testikulárny angiocentrický Tlymfocytárny lymfóm, benígna lymfocytáma angiitída, lupus (napr. lupus erythematosus, lupusová nefritída), Hashimotova tyreoiditída, primárny myxedém, Gravesova choroba, perniciózna anémia, autoimúnna atrofická gastritída, Addisonova choroba, diabetes (napr. inzulín dependentný diabetes mellitus, diabetes mellitus typ I, diabetes mellitus typu II), Goodpasturov syndróm, myasténia gravis, pemfigus, Crohnova choroba, sympatická oftalmia, autoimúnna uveitída, roztrúsená skleróza, autoimúnna hemolytická anémia, idiopatická trombocytopénia, primárana biliárna cirhóza, chronická hepatitída, ulcerózna kolitída, Sjogrenov syndróm, reumatické ochorenia (napr. reumatoidná artritída), polymyozitída, sklerodermia a zmiešané ochorenia spojivového tkaniva.
Termín reumatické ochorenia” označuje akékoľvek ochorenia, ktoré postihujú kĺby, kosti, mäkké tkanivá alebo miechu (Mathies. H. 1983 Rheuma) a patria medzi ne zápalový reumatizmus, degeneratívny reumatizmus, extraartikulárny reumatizmus a kolagenózy. Ďalej medzi reumatické ochorenia patria, napríklad chronická polyartritida, artropatická psoriáza, ankylozujúca spondylitída, reumatoidná artritída, nodózna panarteriitída, systémový lupus erythematosus, progresívna systémová sklerodermia, periartritis humeroscapularis, uratická artritída, chondorkalcinóza, dermatomyozitída, svalový reumatizmus, myozitída a myogelóza. O niektorých reumatických ochoreniach je známe, že ide o autoimunitné ochorenia spôsobené chybnou imunitnou reakciou jedinca.
Termín génová terapia”, ako je tu použitý, označuje spôsob liečby ochorenia genetickou manipuláciou tak, že sa sekvencia nukleovej kyseliny prenesie do bunky a bunka potom exprimuje genetický produkt kódovaný nukleovou kyselinou. Napríklad ako je dobre známe odborníkom v odbore, prenos nukleovej kyseliny môže byť uskutočnený inzerciou expresného vektora obsahujúceho danú nukleovú kyselinu do buniek ex vivo alebo in vitro rôznymi spôsobmi, vrátane napríklad zrážania fosforečnanom vápenatým, dietylaminoetyldextránom, polyetylénglykolom (PEG), elektroporáciou, priamou injekciou, lipofekciou alebo vírusovou infekciou (Sambrook et al., Molecualr Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman a Go, New York, N.Y., 1993) a Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993), ktoré sú tu uvedené ako odkazy). Alternatívne, požadované sekvencie nukleovej kyseliny môžu byť prenesené do bunky in vivo v rôznych vektoroch a rôznymi spôsobmi, vrátane napríklad priameho podania nukleovej kyseliny jedincovi (Williams et al., 1991 PNAS 88: 2726 - 2730), alebo inzerciou nukleovej kyseliny do vírusového vektora a infekciou jedinca vírusom (Battleman et al., 1993 J. Neurosci 13:94 - 951; Carroll etal., 1993 J Celí Biochem. 17E: 241; Lebkowski et al., U.S. patent 5354678; Davidson a et al., Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)). Ďalšie spôsoby používané pre in vivo transfer zahŕňajú enkapsuláciu nukleovej kyseliny do lipozómov, priamy prenos lipozómov alebo lipozómov kombinovaných s hemaglutinačným Sendai vírusom jedincovi (U.S. Patent 5824655, ktorý je tu uvedený ako odkaz). Transfektované alebo infikované bunky exprimujú proteínové produkty kódované nukleovou kyselinou za zmiernenia ochorenia alebo príznakov ochorenia.
Vynález bude teraz podrobnejšie opísaný v nasledujúcom opise.
Prostriedky a spôsoby podľa predkladaného vynálezu
Predkladaný vynález poskytuje prostriedky a spôsoby na liečbu ochorení imunitného systému, ako sú reumatické ochorenia, pri ktorých sa jedincovi podáva účinné množstvo ligandu, ktorý sa viaže na B7, napríklad solubilné CTLA4 molekuly (ako je CTLA4Lg a/alebo L104EA29Ylg) a mAb, ktoré rozpoznávajú a viažu sa na B7. Účinné množstvo je definované ako množstvo solubilných CTLA4 molekúl, ktoré, po naviazaní na B7 molekuly na B7-pozitívnych bunkách, inhibuje B7 molekuly z väzby endogénnych ligandov, ako je CTLA4 a CD25.
Vo výhodnom uskutočnení je ochorenie imunitného systému reumatické ochorenie. Reumatické ochorenie je ochorenie, ktoré je charakterizované (i) zápalom alebo degeneráciou muskulo-skeletárneho systému alebo spojivového tkaniva, najmä kĺbov, ale tiež svalov, šliach, chrupaviek, synoviálneho a fibrózneho tkaniva, (ii) opuchmi kĺbov, citlivosť kĺbov, zápalom, ranným zmeravením a/alebo bolesťou, alebo narušením pohyblivosti alebo funkcie týchto štruktúr a, v niektorých prípadoch, sú tiež charakterizované (iii) serologickými dôkazmi reumatoidného faktora a iných sprievodných zápalových markerov.
Medzi reumatické ochorenia patrí napríklad reumatoidná artritída. Príznaky reumatoidnej artritídy zahŕňajú opuchy kĺbov, citlivosť kĺbov, zápal, rannú stuhnutosť a bolesť vedúcu k fyzickej neschopnosti. Jedinci s pokročilými štádiami artritídy trpia štrukturálnym poškodením a invalidizujúcou bolesťou. Autoimunitnými mechanizmami môžu byť postihnuté aj ďalšie orgány.
Prostriedky
Predkladaný vynález poskytuje prostriedky na liečbu autoimunitných ochorení, ako sú reumatické ochorenia, ktoré obsahujú solubilné CTLA4 molekuly. Ďalej predkladaný vynález poskytuje prostriedky obsahujúce biologické činidlo, ktoré inhibuje funkciu T-lymfocytov, ale nespôsobuje depléciu T-lymfocytov, u človeka tak, že kontaktuje B7-pozitívne bunky človeka so solubilnou CTLA4 molekulou. Príklady solubilných CTLA4 sú CTLA4lg a solubilná
CTLA4 mutantná molekula, napr. L104EA29Ylg.
CTLA4 molekuly, s mutantnými alebo prirodzenými sekvenciami, sa môžu previesť na solubilné pomocou deletovania CTLA4 transmembránového segmentu (Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Imunology 201: 144 - 153).
Alternatívne môžu byť solubilné CTLA4 molekuly, s mutantnými alebo prirodzenými sekvenciami, fúzne proteíny, kde CTLA4 molekuly sú fúzované na non-CTLA4 skupinu, ako je imunoglobulínová (Ig) molekula, ktorá robí CTLA4 molekulu solubilnou. Napríklad, CTLA4 fúzny protein môže obsahovať extracelulárnu doménu CTLA4 fúzovanú na konštantnú doménu imunoglobulínu, čo vedie k získaniu CTLA4lg molekuly (obr. 24) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1:793 - 80).
Pri klinickom použití je výhodné, aby imunoglobulínový región nevyvolával škodlivú imunitnú reakciu u jedinca. Výhodnou skupinou je konštantný región imunoglobulínu, vrátane ľudských alebo opičích imunoglobulínových konštantných regiónov. Jedným príkladom vhodného imunoglobulínového regiónu je ľudský Cgammal, vrátane pantového, CH2 a CH3 regiónu, ktorý môže vykonávať efektorové funkcie, ako je väzba na Fc receptory, sprostredkovanie cytotoxicity závislej od komplementu (CDC), alebo sprostredkovanie bunkovej cytotoxicity závislej od protilátok (ADCC). Imunoglobulínová skupina môže mať jednu alebo viacej mutácií (napr. v CH2 doméne, na redukciu efektorových funkcií, ako je CDC alebo ADCC), kde mutácia moduluje väzbovú schopnosť imunoglobulínu na jeho ligand tým, že zvyšuje alebo znižuje väzbovú schopnosť imunoglobulínu na Fc receptory. Napríklad mutácie v imunoglobulíne môžu zahŕňať zmeny vo všetkých alebo niektorých cysteínových zvyškoch v pantovej doméne, napríklad cysteín v pozíciách +130, +136 a +139, ktoré sú substituované serínom (obr. 24). Imunoglobulínová molekula môže tiež obsahovať prolín v pozícii 148 substituovaný serínom, ako je znázornené na obr. 24. Ďalej, mutácie v imunoglobulínovej skupine môžu byť leucín v pozícii +144 substituovaný fenylalanínom, leucín v pozícii +145 substituovaný kyselinou glutámovou alebo glycín v pozícii 147 substituovaný alanínom.
Ďalšími non-CTLA4 skupinami použitými v solubilných CTLA4 molekulách alebo solubilných CTLA4 mutantných molekulách sú napríklad p97 molekula, env gp120 molekula, E7 molekula a ova molekula (Dash, B. et al. 1994, J Gen. Viral. 75 (Pt 6):1389 - 97; Ikeda, I., et al. 1994 Gene 138(1 - 2):193-6; Falk, K., et al. 1993 Celí. J. Immunol. 150(2):447 - 52; Fujisaka. K. et al. 1994 Virology 204(2):789 - 93). Použiteľné sú aj ďalšie molekuly (Gerard, C. et al., 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R. et al. 1989 63(10):4370; Smith, D. et al. 1987 Science 238:1704; Lásky, L. 1996 Science 233:209).
Solubilná CTLA4 molekula podľa predkladaného vynálezu môže obsahovať signálnu peptidovú sekvenciu naviazanú na N-terminálny koniec extracelulárnej domény CTLA4 časti molekuly. Signálny peptid môže byť akákoľvek sekvencia, ktorá umožňuje sekréciu molekuly, vrátane signálneho peptidu z onkostatínu M (Malik, et al., (1989) Molec. Celí. Biol. 9:2847 - 2853), alebo CD 5 (Jones, N. H. et al., (1986) Náture 323:346 - 349), alebo signálneho peptidu z akéhokoľvek extracelulárneho proteínu.
Solubilná CTLA4 molekula podľa predkladaného vynálezu môže obsahovať signálny peptid onkostatínu M naviazaný na N-terminálny koniec extracelulárnej domény CTLA4, a ľudskú imunoglobulínovú molekulu (napr. pantový región, CH2 a CH3) naviazanú na C-terminálny koniec extracelulárnej domény (prirodzenej alebo mutovanej) CTLA4. Táto molekula obsahuje signálny peptid onkostatínu M majúci aminokyselinovú sekvenciu majúcu metionín v pozícii -26 až alanín v pozícii -1, CTLA4 časť tvorenú aminokyselinovou sekvenciou od metionínu v pozícii +1 do kyseliny asparágovej v pozícii +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamín v pozícii +125, a imunoglobulínovú časť tvorenú aminokyselinovou sekvenciou od kyseliny glutámovej v pozícii +126 do lyzínu v pozícii +357.
Konkrétne, solubilné CTLA4 mutantné molekuly podľa predkladaného vynálezu, obsahujúce mutované CTLA4 sekvencie opísané ďalej, sú fúzne molekuly obsahujúce ľudské IgCgamal skupiny fúzované na mutované CTLA4 fragmenty.
V jednom uskutočnení obsahujú solubilné CTLA4 mutantné molekuly IgCgamal fúzovanú na CTLA4 fragment obsahujúci jedinú bodovú mutáciu v extracelulárnej doméne Extracelulárna doména CTLA4 obsahuje metionín v pozícii +1 až kyselinu asparágovú v pozícii +124 (napr. obr. 23). Extracelulárna časť CTLA4 môže byť tvorená alanínom v pozícii -1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124 (napr. obr. 23). Príklady bodových mutácií sú mutácie, keď je leucín v pozícii +104 zmenený na akúkoľvek aminokyselinu:
Mutanty s jednou mutáciou
L104Elg
L104Slg
L104Tlg
L104Alg
L104Wlg
L104Qlg
L104Klg
L104Rlg
L104Glg
Zmena kodónu kyselina glutámová GAG Serin AGT Treonín ACG Alanín GCG Tryptofán TGG Glutamín CAG Lyží n AAG Arginín CGG Glycín GGG
Ďalej vynález poskytuje mutantná molekuly majúce extracelulárnu doménu CTLA4 s dvoma mutáciami, fúzovanú na IgCgamal skupinu. Príklady sú nasledujúce molekuly, v ktorých je leucín v pozícii -104 zmenený na inú aminokyselinu (napr. kyselinu glutámovú) a glycín v pozícii +105, serín v pozícii +25, treonín v pozícii +30 alebo alanín v pozícii +29 zmenený na akúkoľvek inú aminokyselinu:
Mutanty s dvoma mutáciami Zmena kodónu
L104EG105Flg Fenylalanín TTC
L104EG105Wlg Tryptofán TGG
L104EG105Llg Leucín CTT
L104ES25Rlg Arginín CGG
L104ET30Clg Glycín GGG
L104ET30Nlg Asparagín AAT
L104EA29Ylg Tyrozín TAT
L104EA29Llg Leucín TTG
L104EA29Tlg Treonín ACT
L104EA29Wlg Tryptofán TGG
Ďalej vynález poskytuje mutantné molekuly majúce extracelulárnu doménu CTLA4 obsahujúcu tri mutácie, fúzovanú na IgCgamal skupinu. Príklady sú nasledujúce molekuly, kde je leucín v pozícii +104 zmenený na inú aminokyselinu (napr. kyselinu glutámovú), alanín v pozícii +29 je zmenený na inú aminokyselinu (napr. tyrozín) a serín v pozícii +25 je zmenený na inú aminokyselinu:
Zmena kodónu
Lyží n AAA Lyží n AAG Asparagín AAC Arginín CGG
Mutanty s tromi mutáciami
L104EA29YS25Klg
L104EA29YS25Klg
L104EA29YS25Nlg
L104EA29YS25Rlg
Solubilné CTLA4 mutantné molekuly môžu obsahovať spojovací aminokyselinový zvyšok, ktorý je umiestnený medzi CTLA4 časťou a Ig časťou molekuly. Spojovacou aminokyselinou môže byť akákoľvek aminokyselina, vrátane glutamínu. Spojovacia aminokyselina môže byť vložená akýmikoľvek molekulárnymi alebo chemickými spôsobmi známymi v odbore.
Predkladaný vynález poskytuje CTLA4 mutantné molekuly obsahujúce signálnu peptidovú sekvenciu naviazanú na N-terminálny koniec extracelulárnej domény CTLA4 časti mutantnej molekuly. Signálnym peptidom môže byť akákoľvek sekvencia, ktorá umožňuje sekréciu mutantnej molekuly, vrátane signálneho peptidu z onkostatínu M (Malik, et al., 1989 Molec. Celí. Biol. 9: 2847 2853), alebo CD5 (Jones, N. H. et al., 1986 Náture 323:346 - 349), alebo signálneho peptidu z akéhokoľvek extracelulárneho proteínu.
Vynález poskytuje solubilné CTLA4 mutantné molekuly obsahujúce bodové mutácie v extracelulárnej doméne CTLA4, ako je L104Elg (ako je uvedené na obr. 18) alebo L104Slg, kde L104Elg a L104Slg majú mutácie ich CTLA4 sekvencií, pri ktorých je leucín v pozícii +104 substituovaný kyselinou glutámovou alebo serínom, v príslušnom poradí. Medzi mutantné molekuly s bodovou mutáciou ďalej patria CTLA4 časti obsahujúce metionín v pozícii +1 až kyselinu asparágovú v pozícii +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamín v pozícii +125, a imunoglobulínovú časť obsahujúcu kyselinu glutámovú v pozícii 126 až lyzín v pozícii +357. Imunoglobulínová časť mutantnej molekuly môže byť tiež mutovaná tak, že cysteíny v pozíciách +130, +136 a +139 sú substituované serínom, a prolín v pozícii +148 je substituovaný serínom. Alternatívne, solubilná CTLA4 mutantné molekula s bodovou mutáciou môže obsahovať CTLA4 časť obsahujúca alanín v pozícii -1 až kyselinu asparágovú v pozícii +124.
Vynález poskytuje solubilné CTLA4 mutantné molekuly obsahujúce dvojbodové mutácie v extracelulárnej doméne CTLA4, ako je L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg alebo L104EA29Wlg, v ktorých je leucín v pozícii +104 substituovaný kyselinou glutámovou a alanín v pozícii +29 je zmenený na tyrozín, leucín, treonín a tryptofán, v príslušnom poradí. Sekvencie pre L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg a L104EA29Wlg, začínajúce metionínom v pozícii +1 a končiace lyzínom v pozícii +357, plus signálna (vedúca) peptidová sekvencia, sú ukázané na obr. 19 - 22, v príslušnom poradí. Mutantné molekuly s dvojitými mutáciami ďalej zahŕňajú CTLA4 časti obsahujúce metionín v pozícii +1 až kyselinu asparágovú v pozícii +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamín v pozícii +125, a imunoglobulínovú časť obsahujúcu kyselinu glutámovú v pozícii +126 až lyzín v pozícii +357. Imunoglobulínová časť mutantnej molekuly môže byť tiež mutovaná tak, že cysteíny v pozíciách +130, +136 a +139 sú substituované serínom a prolín v pozícii +148 je substituovaný serínom. Alternatívne, tieto mutantné molekuly môžu obsahovať CTLA4 časť obsahujúcu alanín v pozícii -1 až kyselinu asparágovú v pozícii +124.
Vynález poskytuje solubilné CTLA4 mutantné molekuly obsahujúce dve bodové mutácie v extracelulárnej doméne CTI_A4, ako je L104EG105Flg, L104EG105Wlg a L104EG105Llg, kde leucín v pozícii +104 je substituovaný kyselinou glutámovou a glycín v pozícii +105 je substituovaný fenylalanínom, tryptofánom a leucínom, v príslušnom poradí. Medzi mutantné molekuly s dvoma mutáciami ďalej patria CTLA4 časti tvorené metionínom v pozícii +1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124, spojovacia aminokyselina glutamín v pozícii +125, a imunoglobulínová časť tvorená kyselinou glutámovou v pozícii +126 až lyzínom v pozícii +357. Imunoglobulínová časť môže byť tiež mutovaná tak, že cysteíny v pozíciách +130, +136 a +139 sú substituované serínom, a prolín v pozícii +148 je substituovaný serínom. Alternatívne, tieto mutantné molekuly môžu mať CTLA4 časť tvorenú alanínom v pozícii -1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124.
Vynález poskytuje L104ES25Rlg, čo je mutantné molekula s dvoma bodovými mutáciami obsahujúcimi CTLA4 časť tvorenú metionínom v pozícii +1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124, a spojovaciu aminokyselinu glutamín v pozícii +125, a imunoglobulínovú časť tvorenú kyselinou glutámovou v pozícii +126 až lyzínom v pozícii +357. Časť majúca extracelulárnu doménu CTLA4 je mutovaná tak, že serín v pozícii +25 je substituovaný arginínom a leucín v pozícii +104 je substituovaný kyselinou glutámovou. Alternatívne, L104ES25Rlg môže mať CTI.A4 časť tvorenú alanínom v pozícii -1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124.
Vynález poskytuje solubilné CTLA4 mutantné molekuly obsahujúce dve bodové mutácie v extracelulárnej doméne CTLA4, ako je L104ET30Glg a L104ET30Nlg, kde je leucín v pozícii +104 substituovaný kyselinou glutámovou a treonín v pozícii +30 je substituovaný glycínom a asparaginom, v príslušnom poradí. Mutantné molekuly s dvoma bodovými mutáciami ďalej obsahujú CTLA4 časti tvorené metionínom v pozícii +1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124, spojovaciu aminokyselinu glutamín v pozícii +125, a imunoglobulínovú časť tvorenú kyselinou glutámovou v pozícii +126 až lyzínom v pozícii +357. Imunoglobulínová časť mutantnej molekuly môže byť tiež mutovaná tak, že cysteíny v pozíciách +130, +136 a +139 sú substituované serínom, a prolin v pozícii +148 je substituovaný serínom. Alternatívne, tieto mutantné molekuly môžu mať CTI.A4 časť tvorenú alanínom v pozícii -1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124.
Vynález poskytuje solubilné CTLA4 mutantné molekuly obsahujúce tri mutácie v extracelulárnej doméne CTLA4, ako je L104EA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg, L104EA29YS25Rlg, v ktorých je leucín v pozícii +104 substituovaný kyselinou glutámovou, alanín v pozícii +29 je zmenený na tyrozín a serín v pozícii +25 je zmenený na lyzín, asparagín a arginín, v príslušnom poradí. Mutantné molekuly s tromi mutáciami ďalej obsahujú CTLA4 časti tvorené metionínom v pozícii +1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124, spojovací aminokyselinový zvyšok glutamín v pozícii +125, a imunoglobulínovú časť tvorenú kyselinou glutámovou v pozícii +126 až lyzínom v pozícii +357. Imunoglobulínová časť mutantnej molekuly môže byť tiež mutovaná tak, že cysteíny v pozíciách +130, +136 a +139 sú substituované serínom a prolín v pozícii +148 je substituovaný serínom. Alternatívne môžu tieto mutantné molekuly mať CTLA4 časť tvorenú alanínom v pozícii -1 až kyselinou asparágovou v pozícii +124.
Ďalšími vyhotoveniami solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly sú chimérické CTLA4/CD28 homológ mutantné molekuly, ktoré sa viažu na B7 (Peach, R. J., et al., 1994 J Exp Med 180:2049 - 2058). Príklady týchto chimérických CTLA4/CD28 mutantných molekúl sú HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 a HS14 (U.S. patent č. 5773253).
Výhodnými uskutočneniami predkladaného vynálezu sú solubilné CTLA4 molekuly, ako je CTLA4lg (ako je ukázané na obr. 24, začínajúce metionínom v pozícii +1 a končiace lyzínom v pozícii +357) a solubilný CTLA4 mutant L104EA29Ylg (ako je znázornené na obr. 19, začínajúci metionínom v pozícii +1 a končiaci lyzínom v pozícii +357). Vynález ďalej poskytuje molekuly nukleovej kyseliny obsahujúcej nukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinové sekvencie zodpovedajúce solubilnej CTLA4 molekule podľa predkladaného vynálezu. V jednom uskutočnení je molekulou nukleovej kyseliny DNA (napr. cDNA) alebo jej hybrid. DNA kódujúca CTLA4lg (obr. 24) bola uložená 31.5.1991 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 - 2209, pod ATCC prírastkovým č. ATCC 68629. DNA kódujúca L104EA29Ylg (sekvencia uvedená na obr. 19) bola uložená 19.6.2000 v ATCC pod ATCC prírastkovým č. PTA-2104. Alternatívne je molekulou nukleovej kyseliny RNA alebo jej hybrid.
Ďalej vynález poskytuje vektor, ktorý obsahuje nukleotidové sekvencie podľa predkladaného vynálezu. Príklady expresných vektorov sú vektory pre cicavčie hostiteľské bunky (napr. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); PIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc Vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovírusové vektory (napr. pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) alebo ich modifikované formy, adenovírusové vektory; adeno-asociované vírusové vektory, baculovírusové vektory, kvasinkové vektory (napr. pESC vektory (Stratagene)).
Vynález tiež poskytuje systémy vektor-hostiteľ. Systém vektor-hostiteľ obsahuje vektor podľa predkladaného vynálezu vo vhodnej hostiteľskej bunke. Príklady vhodných hostiteľských buniek sú napríklad prokaryotické a eukaryotické bunky. V uskutočnení podľa predkladaného vynálezu sú eukaryotické bunky tiež vhodnými bunkami. Príklady eukaryotických buniek sú všetky živočíšne bunky, primárne alebo imortalizované, kvasinky (napr. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, a Pichia pastoris) a rastlinné bunky. Myelómové, COS a CHO bunky sú príklady živočíšnych buniek, ktoré môžu byť použité ako hostiteľské bunky. Medzi konkrétne CHO bunky patria napríklad DG44 (Chasm. et al., 1986 Som. Celí. Molec. Genet. 12:555 - 556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901 - 10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-On bunková línia (Clontech), CHO označené ako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO kloň 13 (GEIMG, Génová, IT), CHO kloň B (GEIMG, Génová, IT), CHOK1/SF označené ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) a RR-CHOKI označené ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Príklady rastlinných buniek sú bunky tabaku (celých rastlín, kultúry alebo kalu), kukurice, sóje a ryže. Tiež prijateľné sú bunky semien kukurice, sóje a ryže.
CTLA4 mutantné molekuly podľa predkladaného vynálezu môžu byť izolované ako prirodzené polypeptidy, alebo z akéhokoľvek iného zdroja, či už prírodného, syntetického, semi-syntetického alebo rekombinantného. Tak môžu byť CTLA4 mutantné polypeptidové molekuly izolované ako prirodzené proteíny z akéhokoľvek druhu, najmä od cicavcov, konkrétne od dobytka, oviec, prasiat, myší, koní a najlepšie od človeka. Alternatívne môžu byť CTLA4 mutantné polypeptidové molekuly izolované ako rekombinantné polypeptidy, ktoré sú exprimované v prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke, alebo ktoré sú izolované ako chemicky syntetizovaný polypeptid.
Odborník v odbore ľahko použije štandardné spôsoby izolácie na získanie izolovaných CTLA4 mutantných molekúl. Charakter a stupeň izolovania bude závisieť od zdroja a zamýšľaného použitia izolovanej molekuly.
CTLA4 mutantné molekuly a ich fragmenty alebo deriváty môžu byť pripravené rekombinantnými spôsobmi. Tak môžu byť izolované nukleotidové sekvencie kódujúce prirodzené CTLA4 molekuly upravené tak, aby obsahovali mutácie, ktoré vedú k získaniu nukleotidových sekvencií, ktoré kódujú CTLA4 mutantné polypeptidové molekuly. Napríklad môžu byť nukleotidové sekvencie kódujúce CTLA4 mutantné molekuly pripravené spôsobmi miestne cielenej mutagenézy s použitím primérov a PCR amplifikácie. Priméry môžu obsahovať špecifické sekvencie navrhnuté tak, aby vkladali do sekvencie požadované mutácie. Alternatívne môžu byť priméry navrhnuté tak, aby obsahovali randomizované alebo semi-randomizované sekvencie na vkladanie náhodných mutácií. Štandardné rekombinantné spôsoby (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. vydanie, Sambrook, Frítch, a Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press) a PCR technológie (U.S. patent č. 4603102) môžu byť použité na prípravu a izolovanie CTLA4 mutantných polynukleotidov kódujúcich CTLA4 mutantné polypeptidy.
Vynález ďalej zahŕňa farmaceutické prostriedky použité pri liečbe ochorení imunitného systému obsahujúce farmaceutický účinné množstvo solubilnej CTLA4 molekuly. V niektorých uskutočneniach sú ochorenia imunitného systému sprostredkované CD28/CTLA4/B7 interakciami. Solubilné CTLA4 molekuly sú výhodne solubilné CTLA4 molekuly s prirodzenou sekvenciou a/alebo solubilné CTLA4 molekuly majúce jednu alebo viacej mutácií v extracelulárnej doméne CTLA4. Farmaceutické prostriedky môžu obsahovať solubilné CTLA4 proteínové molekuly a/alebo molekuly nukleovej kyseliny a/alebo vektory kódujúce molekuly. Vo výhodných uskutočneniach majú solubilné CTLA4 molekuly aminokyselinovú sekvenciu extracelulárnej domény CTLA4, ako je znázornené na obr. 24 alebo 19 (CTLA4lg alebo L104EA29Y, v príslušnom poradí). Ešte lepšie je solubilnou CTLA4 mutantnou molekulou L104EA29Ylg, ako je tu opísaná. Prostriedky môžu ďalej obsahovať iné terapeutické činidlá, vrátane toxínov, enzýmov, protilátok alebo konjugátov.
Ako je štandardnou praxou v odbore, sú poskytnuté farmaceutické prostriedky obsahujúce molekuly podľa predkladaného vynálezu zmiešané s prijateľným nosičom alebo adjuvans, ktoré sú známe odborníkom v odbore. Farmaceutické prostriedky výhodne obsahujú vhodné nosiče a adjuvans, ktoré môžu obsahovať akýkoľvek materiál, ktorý si pri kombinovaní s molekulou podľa predkladaného vynálezu (napr. solubilnou CTLA4 molekulou, ako je CTLA4lg alebo L104EA29Y) zachováva aktivitu molekuly a je nereaktívny s imunitným systémom jedinca. Medzi takéto nosiče a adjuvans patria, napríklad iónomeniče, kamenec, aluminum-stearát, lecitín, sérové proteíny ako je ľudský sérový albumín, pufrovacie substancie, ako sú fosfáty, glycín, kyselina sorbová, kálium-sorbát, parciálne glyceridové zmesi nasýtených rastlinných mastných kyselín, fosfátom pufrované salinické roztoky, voda, emulzie (napr. emulzia olej/voda), soli alebo elektrolyty, ako je protamín-sulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidný oxid kremičitý, kremičitan horečnatý, polyvinylpyrolidón, substancie na báze celulózy a polyetylénglykol. Medzi ďalšie nosiče patria sterilné roztoky; tablety, vrátane poťahovaných tabliet a kapsúl. Typicky takéto nosiče obsahujú prísady, ako je škrob, mlieko, cukor (napr. sacharóza, glukóza, maltóza), niektoré typy hliniek, želatína, kyselina steárová alebo jej soli, magnézium- alebo kalciumstearát, mastenec, rastlinné tuky alebo oleje, živice, glykoly, alebo iné známe prísady. Prostriedky obsahujúce takéto nosiče sú pripravené bežnými spôsobmi. Takéto prostriedky môžu byť tiež formulované s rôznymi lipidovými prípravkami, ako sú napríklad lipozómy, rovnako ako s rôznymi polymérnymi prostriedkami, ako sú polymérne mikrosféry.
Spôsoby
Vynález poskytuje spôsoby regulácie funkčných interakcií CTLA4- a CD28pozitívnych buniek s B7-pozitívnymi bunkami. Spôsoby zahŕňajú kontaktovanie B7pozitívnych buniek so solubilnou CTLA4 molekulou podľa predkladaného vynálezu tak, že je tvorený komplex solubilnej CTLA4/B7, komplex interferujúci s reakciou endogénnej CTLA4 a/alebo CD28 molekuly s B7 molekulou.
Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsoby inhibície funkcie T-lymfocytov, bez deplécie T-lymfocytov u človeka tak, že umožňuje kontaktovanie B7-pozitívnych buniek u človeka so solubilnou CTLA4. Príklady solubilnej CTLA4 sú CTLA4lg a solubilná CTLA4 mutantná molekula, napr. L104EA29Ylg. Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsoby liečby ochorení imunitného systému, ako sú reumatické ochorenia. Spôsoby zahŕňajú podanie terapeutickej kompozície obsahujúcej solubilné CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu jedincovi v množstve účinnom na zmiernenie aspoň jedného príznaku asociovaného s ochorením imunitného systému. Ďalej vynález poskytuje dlhodobú terapiu ochorenia imunitného systému, pri ktorom sú blokované interakcie T-lymfocytov/B7-pozítívnych buniek, čím sa blokuje stimulácia T-lymfocytov ko-stimulačnými signálmi, ako je väzba B7 na CD28, čo vedie k indukcii anergie alebo tolerancie T-lymfocytov. Medzi ochorenia imunitného systému patria, napríklad autoimunitné ochorenia, ochorenia súvisiace s transplantátmi a imunoproliferatívne ochorenia. Príklady ochorení imunitného systému sú reakcie štepu proti hostiteľovi (GVHD) (napr. pri transplantácii kostnej drene alebo pri indukcii tolerancie), imunologické poruchy asociované s odmietnutím transplantátu, chronické rejekcie, tkanivové alebo bunkové allo- alebo xenotransplantáty, vrátane orgánových, kožných, ostrovčekov pankreasu, svalov, hepatocytov a neurónov. Príklady imunoproliferatívnych ochorení sú napríklad psoriáza, T-lymfocytárny lymfóm, T-lymfocytárna akútna lymfoblastická leukémia, testikulárny angiocentrický T-lymfocytárny lymfóm, benígna lymfocytárna angiitída, lupus (napr. lupus erythematosus, lupusová nefritída), Hashimotova tyreoiditída, primárny myxedém, Gravesova choroba, perniciózna anémia, autoimúnna atrofická gastritída, Addisonova choroba, diabetes (napr. inzulín dependentný diabetes mellitus, diabetes mellitus typ I, diabetes mellitus typu II), Goodpasturov syndróm, myasténia gravis, pemfigus, Crohnova choroba, sympatická oftalmia, autoimúnna uveitída, roztrúsená skleróza, autoimúnna hemolytická anémia, idiopatická trombocytopénia, primárana biliárna cirhóza, chronická hepatitída, ulcerózna kolitída, Sjogrenov syndróm, reumatické ochorenia (napr. reumatoidná artritída), polymyozitída, sklerodermia a zmiešané ochorenia spojivového tkaniva.
Solubilné CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu vykazujú inhibičné vlastnosti in vivo. Za podmienok, keď sa vyskytujú interakcie Tlymfocytov/B7-pozitívnych buniek, napríklad interakcie T-lymfocyty/B bunky, ktoré sa vyskytujú v dôsledku kontaktu medzi T-lymfocytmi a B7-pozitívnymi bunkami, môže väzba podanej CTLA4 molekuly s B7-pozitívnymi bunkami, napríklad B lymfocytmi, interferovať, t.j. inhibovať interakcie T-lymfocyty/B7-pozitívne bunky, čo vedie k regulácii imunitnej reakcie.
Vynález poskytuje spôsoby inhibície imunitnej reakcie. Inhibicia imunitnej reakcie solubilnou CTLA4 molekulou podľa predkladaného vynálezu môže byť cestou pre inhibíciu alebo blokovanie už prebiehajúcej imunitnej reakcie alebo môže brániť rozvoju imunitnej reakcie. Solubilné CTI_A4 molekuly podľa predkladaného vynálezu môžu inhibovať funkcie aktivovaných T-lymfocytov, ako je proliferácia T-lymfocytov a sekrécia cytokínov tým, že potláčajú reakcie Tlymfocytov alebo indukujú špecifickú toleranciu u T-lymfocytov, alebo oboma cestami. Ďalej, solubilné CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu, interferujúce s CTLA4/CD28/B7 dráhou, môžu inhibovať proliferáciu T-lymfocytov a/alebo sekréciu cytokínov, a to vedie k zníženiu deštrukcie tkaniva a indukcii nízkej reaktivity alebo anergie T-lymfocytov.
Výhodným uskutočnením predkladaného vynálezu je použitie solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly L104EA29Ylg na reguláciu funkčných interakcií CTLA4- a CD28- pozitívnych buniek s B7-pozitívnymi bunkami s cieľom liečby ochorení imunitného systému, ako sú reumatické ochorenia a/alebo na inhibíciu imunitných reakcií. L104EA29Ylg podľa predkladaného vynálezu je solubilná CTLA4 mutantná molekula obsahujúca aspoň dve aminokyselinové zmeny, leucín (L) na kyselinu glutámovú (E) v pozícii +104 a alanín (A) na tyrozín (Y) v pozícii +29. L104EA29Ylg molekula môže okrem týchto dvoch mutácií obsahovať aj ďalšie mutácie.
Výhodnými uskutočneniami sú spôsoby liečby reumatického ochorenia, ako je reumatoidná artritída, pomocou podania účinného množstva solubílnej CTLA4 molekuly jedincovi. Podanie účinného množstva terapeutickej kompozície zmierni u jedinca aspoň jeden z príznakov asociovaný s ochorením, vrátane redukcie: opuchu kĺbov, citlivosti kĺbov, zápalu, rannej stuhnutosti, bolesti a štrukturálneho postihnutia znižujúceho fyzické schopnosti. Spôsoby podľa predkladaného vynálezu môžu byť tiež použité na zmiernenie aspoň jedného z príznakov spojeného s reumatoidnou artritídou, vrátane zníženia sedimentácie erytrocytov, sérovej koncentrácie C-reaktívneho proteínu, solubilného ICAM-1, solubilného Eselektínu a/alebo solubilného IL-2r.
Úroveň zmiernenia príznakov dosiahnutá pomocou predkladaného vynálezu môže byť meraná s použitím akýchkoľvek akceptovateľných kritérií používaných na meranie a dokumentovanie zlepšenia príznakov v klinickej praxi. Prijateľnými kritériami na meranie úľavy príznakov sú skóre na báze kritérií daných American College of Rheumatology (napr., ACR 20), na meranie zmiernenia príznakov (v; ”CDER Guideline for Clinical Evaluation of Anti-lnflammatory a Antirheumatic Drugs-FDA 1988), a Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries, I. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 5: 789 - 793). Pre všeobecný opis týchto kritérií pozri Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, a Biological Products for Treatment of Rheumatoid arthritis (RA), February 1999.
Medzi jedincov liečených spôsobmi podľa predkladaného vynálezu patria cicavce, vrátane ľudí, opíc, ľudoopov, psov, mačiek, koní, králikov, myší a krýs.
Predkladaný vynález poskytuje rôzne spôsoby, lokálne alebo systémové, na podanie solubilnej CTLA4 molekuly. Spôsoby zahŕňajú intravenózne, intramuskuláme, intraperitoneálne, orálne, inhalačné a podkožné spôsoby podania, rovnako ako použitie implantovateľných púmp, kontinuálnych infúzií, génovej terapie, lipozómov, čapíkov, lokálneho kontaktu, vezikúl, kapsúl a injekcií. Terapeutické činidlo, pripravené s nosičom, je často lyofilizované na skladovanie a je rekonštituované vodou alebo pufrovým roztokom, s neutrálnym pH (pH približne 7 - 8, napr. pH 7,5) pred podaním.
Ako je v odbore štandardnou praxou, sú prostriedky podľa predkladaného vynálezu podávané jedincovi v akejkoľvek farmaceutický prijateľnej forme.
Podľa predkladaného vynálezu spôsoby zahŕňajú podanie solubilnej CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu jedincovi na reguláciu interakcií CD28a/alebo CTLA4-pozitívnych buniek s B7-pozitívnymi bunkami. B7-pozitívne bunky sú kontaktované s účinným množstvom solubilnej CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu, alebo jej fragmentmi a derivátmi, takže dôjde k tvorbe komplexov solubilnej CTLA4/B7. Komplexy interferujú s interakciami medzí endogénnou CTLA4 a CD28 molekulou a B7 rodinou molekúl.
Dávka terapeutického činidla je závislá od mnohých faktorov
Solubilné CTLA4 molekuly môžu byť podávané jedincovi v množstvách a čas (napr. počas a/alebo opakovane) dostatočne dlhý na blokovanie väzby endogénnej B7 molekuly na jej ligandy u jedinca. Blokáda väzby endogénny
B7/ligand inhibuje interakciu medzi B7-pozitívnymi bunkami a CD28- a/alebo
CTI_A4-pozitívnymi bunkami.
vrátane typu postihnutého tkaniva, typu liečeného autoimunitného ochorenia, závažnosti ochorenia a reakcie jedinca na liečbu činidlom. Dávky činidla sú teda rôzne u každého jedinca a spôsobu podania. Solubilné CTLA4 molekuly môžu byť podané v dávke medzi 0,1 a 20,0 mg/kg hmotnosti a deň, lepšie medzi 0,5 a 10,0 mg/kg/deň.
Vynález tiež zahŕňa použitie prostriedkov podľa predkladaného vynálezu spoločne s inými farmaceutickými činidlami na liečbu ochorení imunitného systému. Napríklad reumatické ochorenia môžu byť liečené molekulami podľa predkladaného vynálezu spoločne s napríklad imunosupresívami, ako sú kortikosteroidy, cyklosporín (Mathiesen, 1989, Cancer Lett. 44(2): 151 - 156), prednizón, azatioprin, metotrexat (R. Handschumacher, v: Drugs Used for Imunosuppression” str. 1264 - 1276), TNF-alfa blokátory alebo antagonisty (New England Journal of Medicíne, vol. 340: 253 - 259, 1999; Lancet vol. 354:1932 - 39, 1999, Annals of Internal Medicíne, vol. 130: 478 - 486), alebo akékoľvek iné biologické činidlá ovplyvňujúce akýkoľvek zápalový cytokín, nesteroidné antireumatiká/Cox-2 inhibítory, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, infliximab, rapamycín, mykofenolátmofetil, azatioprin, tacrolizmus, basiliximab, cytoxan, interferón beta-1a, interferón beta-1b, glatiramer acetát, mitoxantron hydrochlorid, anakinra a/alebo iné biologické činidlá.
Solubilné CTLA4 molekuly (výhodne L104EA29Ylg) môžu byť tiež použité v kombinácii s jedným alebo viacerými nasledujúcimi činidlami na reguláciu imunitnej reakcie. Medzi takéto činidlá patria: solubilný gp39 (tiež známy ako CD40 ligand (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), solubilný CD29, solubilný CD40, solubilný CD80 (napr. ATCC 68627), solubilný CD56, solubilný CD28 (napr. 68628), solubilný CD56, solubilné Thy-1, solubilný CD3, solubilný TCR, solubilný
VLA-4, solubilný VCAM-1, solubilný LECAM-1, solubilný ELAM-1, solubilný CD44, protilátky reaktívne s gp39 (napr. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 a ATCC HB12056), protilátky reaktívne s CD40 (napr. ATCC HB-9110), protilátky reaktívne s B7 (napr. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB11341, etc), protilátky reaktívne s CD28 (napr. ATCC HB-11944 alebo mAb 9.3, ako je opísané v Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1): 18 - 22, 1980), protilátky reaktívne s LFA-1 (napr. ATCC HB-9579 a ATCC HB-213), protilátky reaktívne s LFA-2, protilátky reaktívne s IL-2, protilátky reaktívne s IL-12, protilátky reaktívne s IFN-gama, protilátky reaktívne s CD2, protilátky reaktívne s CD48, protilátky reaktívne s akoukoľvek ICAM (napr. ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 a ICAM-3), protilátky reaktívne s CTLA4 (napr. ATCC HB-304), protilátky reaktívne s Thy-1, protilátky reaktívne s CD56, protilátky reaktívne s CD3, protilátky reaktívne s CD29, protilátky reaktívne s TCR, protilátky reaktívne s VLA-4, protilátky reaktívne s VCAM-1, protilátky reaktívne s LECAM-1, protilátky reaktívne s ELAM-1, protilátky reaktívne s CD44. V niektorých uskutočneniach sú výhodné monoklonálne protilátky. V iných uskutočneniach sú výhodné protilátkové fragmenty. Ako bude odborníkom v odbore zrejmé, môže kombinácia obsahovať solubilné CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu a jedno ďalšie imunosupresívne činidlo, solubilné CTLA4 molekuly s dvoma ďalšími imunosupresívnymi činidlami, solubilné CTLA4 molekuly s tromi ďalšími imunosupresívnymi činidlami atď. Určenie optimálnej kombinácie a dávky môže byť uskutočnené s použitím optimalizačných spôsobov dobre známych v odbore.
Medzi niektoré konkrétne kombinácie patria nasledujúce: L104EA29Ylg a
CD80 monoklonálna protilátka (mAbs); L104EA29Ylg a CD86 mAbs;
L104EA29Ylg, CD80 mAbs a CD86 mAbs; L104EA29Ylg a gp39 mAbs;
L104EA29Ylg a CD40 mAbs; L104EA29Ylg a CD28 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 a
CD86 mAbs, a gp39 mAbs; L104EA29Ylg, CD80 a CD86 mAbs a CD40 mAbs; a L104EA29Ylg, anti-LFA1 mAb, a anti-gp39 mAb. Konkrétnym príkladom gp39 mAb je MR1. Iné kombinácie budú zrejmé odborníkom v odbore.
Solubilné CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu, napríklad L104EA29Ylg, môžu byť podávané ako jediná aktívna zložka alebo spolu s ďalšími liekmi v imunomodulačných režimoch alebo s inými protizápalovými činidlami, napr. na liečbu alebo prevenciu akútnej alebo chronickej rejekcie allo- alebo xenotransplantátu, alebo zápalových alebo autoimunitných ochorení, alebo na indukciu tolerancie. Napríklad môžu byť tieto molekuly použité v kombinácii s kalcineurínovým inhibítorom, napr. cyklosporínom A alebo FK506; imunosupresívnym makrolidom, napr. rapamycínom alebo jeho derivátom, napr. 40-O-(2-hydroxy)etyl-rapamycínom, činidlom spôsobujúcim homing lymfocytov, napr. FTY720 alebo jeho analógom, kortikosteroidmi; cyklofosfamidom; azatioprénom; metotrexatom; leflunomidom alebo jeho analógom; mizoribinom; kyselinou mykofenolovou; mykofenolát-mofetilom; 15-deoxyspergualinom alebo jeho analógom; imunosupresívnou monoklonálnou protilátkou, napr. monoklonálnou protilátkou k leukocytárnym receptorom, napr. MHC, CD2, CD3, CD4, CD1la/CDI8, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLÁM), 0X40, 4-IBB alebo ich ligandmi; alebo inými imunomodulačnými zlúčeninami, napr. CTLA4/CD28-lg, alebo inými inhibítormi adhéznych molekúl, napr. mAb alebo inhibítormi s nízkou molekulovou hmotnosťou, vrátane LFA-1 antagonistov, antagonistov selektínu a VLA-4 antagonistov. Zlúčeniny sú najmä použiteľné v kombinácii so zlúčeninami, ktoré interferujú s CD40 a jeho ligandmi, ako sú napr. protilátky k CD40 a protilátky k CD40-L.
Keď sú solubilné CTLA4 mutantné molekuly podľa predkladaného vynálezu podávané spoločne s inými imunosupresívnymi/imunomodulačnými alebo protizápalovými liekmi, ako bolo napr. uvedené vyššie, potom sú dávky súčasne podávaných imunosupresívnych, imunomoduiačných alebo protizápalových molekúl rôzne podľa typu použitého lieku, napríklad podľa toho, či ide o steroid alebo cyklosporín, podľa konkrétneho použitého lieku, podľa liečeného ochorenia a tak ďalej.
Preto v ďalšom aspekte predkladaný vynález poskytuje v ešte ďalšom aspekte spôsoby definované vyššie zahŕňajúce súčasné podanie, napríklad konkomitantné alebo sekvenčné, terapeuticky účinného množstva solubilnej CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu, napr. CTLA4lg a/alebo L104EA29Ylg, vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, a druhého liečiva, kde uvedené druhé liečivo je imunosupresívne, imunomodulačné alebo protizápalové liečivo, ako bolo uvedené vyššie. Ďalej vynález poskytuje terapeutické kombinácie, napr. kity, napr. na použitie v akomkoľvek spôsobe definovanom vyššie, obsahujúce solubilnú CTLA4 molekulu, vo voľnej forme alebo vo forme farmaceutický prijateľnej soli, ktorá má byť použitá súčasne alebo sekvenčne s aspoň jednou farmaceutickou kompozíciou obsahujúcou imunosupresívne, imunomodulačné alebo protizápalové liečivo. Kit môže obsahovať návod na podanie.
Vynález tiež poskytuje spôsoby na prípravu solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly podľa predkladaného vynálezu. Expresia solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly môže byť uskutočnená v prokaryotickej bunke alebo eukaryotickej bunke.
Prokaryoty sú najčastejšie reprezentované rôznymi kmeňmi baktérií. Baktérie môžu byť gram-pozitívne alebo gram-negatívne. Zvyčajne sú výhodné gram-negatívne baktérie, ako je E. coli. Môžu byť použité tiež iné mikrobiálne kmene. Sekvencie kódujúce solubilné CTLA4 mutantné molekuly môžu byť inzertované do vektora navrhnutého na exprimovanie cudzorodých sekvencii v prokaryotických bunkách, ako je E. coli. Tieto vektory môžu obsahovať bežne používané prokaryotické kontrolné sekvencie, ktoré obsahujú promótory na iniciáciu transkripcie, voliteľne s operátorom, spoločne s ribozomálnymi väzbovými sekvenciami, vrátane bežne používaných promótorov, ako je beta-laktamázový (penicilinázový) a laktózový (lac) promótorový systém (Chang, et al., (1977) Náture 198:1056), tryptofánový (trp) promótorový systém (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) a PL promótor a N-génové ribozomálne väzbové miesto z lambda promótora (Shimatake, et al., (1981) Náture 292:128).
Takéto expresné vektory tiež obsahujú sekvencie rozpoznávajúce počiatok replikácie a selektovatefné markery, ako je beta-laktamázový alebo neomycínfosfotransferázový gén udeľujúci rezistenciu na antibiotiká, takže sa vektory môžu replikovať v baktériách a bunky nesúce plazmidy môžu byť selektované pri kultivácii v prítomnosti antibiotík, ako je ampicilín alebo kanamycín.
Expresný plazmid môže byť vložený do prokaryotických buniek rôznymi spôsobmi, vrátane CaC12-šoku (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, a Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Press (1989)) a elektroporácie.
Pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu sú eukaryotické bunky tiež vhodnými hostiteľskými bunkami. Príklady eukaryotických buniek sú živočíšne bunky, tak primárne, ako aj imortalizované, kvasinky (napr. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, a Pichia pastoris), a rastlinné bunky. Myelómové, COS a CHO bunky sú príklady živočíšnych buniek, ktoré môžu byť použité ako hostiteľské bunky. Medzi konkrétne CHO bunky patria napríklad DG44 (Chasm, et al., 1986 Som. Celí. Molec. Genet. 12:555 - 556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-KI (ATCC č.
CCL-61), CHO-K1 Tet-On bunková línia (Clontech), CHO označená ECAC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO kloň 13 (GEIMG, Génová, IT), CHO kloň B (GEIMG, Génová, IT), CHO-K1/SF označená ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), a RR-CHOK1 označená ECAC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Príklady rastlinných buniek sú bunky tabaku (celých rastlín, kultúry alebo kalu), kukurice, sóje a ryže. Tiež prijateľné sú bunky semien kukurice, sóje a ryže.
Sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce CTLA4 mutantné molekuly môžu byť tiež inzertované do vektora navrhnutého na expresiu cudzorodých sekvencií v eukaryotickom hostiteľovi. Regulačné elementy vektora môžu byť rôzne podľa konkrétneho eukaryotického hostiteľa.
Medzi bežne používané eukaryotické kontrolné sekvencie na použitie v expresných vektoroch patria promótory a kontrolné sekvencie kompatibilné s cicavčími bunkami, ako je napríklad CMV promótor (CDM8 vektor) a vírus vtáčieho sarkómu (ASV) (πΙ_Ν vektor). Medzi ďalšie bežne používané promótory patrí skorý a neskorý promótor Opičieho vírusu 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Náture 273:1 13), alebo iné vírusové promótory, ako sú promótory odvodené od polyomavírusu, adenovírusu 2 a bovinného papilloma vírusu. Tiež môže byť použitý indukovateľný promótor, ako je hMTII (Karin, et al., (1982) Náture 299:797 - 802).
Vektory na expresiu CTĽA4 mutantnej molekuly v eukaryotoch môžu tiež obsahovať sekvencie označované ako zosilňovače transkripcie. Tieto sekvencie sú dôležité na optimalizáciu génovej expresie a vyskytujú sa bud pred alebo za promótorom.
Príklady expresných vektorov pre eukaryotické hostiteľské bunky sú napríklad vektory cicavčej hostiteľskej bunky (napr. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVI (Life Technologies); pVPakc vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovírusové vektory (napr. pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) alebo ich modifikované formy, adenovírusové vektory; adenoasociované vírusové vektory, baculovírusové vektory, kvasinkové vektory (napr. pESC vektory (Stratagene)).
Sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce CTLA4 mutantné molekuly sa môžu integrovať do génomu eukaryotickej hostiteľskej bunky a môžu sa replikovať s replikáciou genómu hostiteľskej bunky. Alternatívne môžu vektory nesúce CTLA4 mutantné molekuly obsahovať sekvencie rozpoznávajúce počiatok replikácie umožňujúce extrachromozomálnu replikáciu.
Na expresiu sekvencií nukleovej kyseliny v Saccharomyces cerevisiae môže byť použitá sekvencia rozpoznávajúca počiatok replikácie z endogénneho kvasinkového plazmidu, 2u circle. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternatívne môžu byť použité sekvencie z kvasinkového genómu schopné vyvolať autonómnu replikáciu (pozri napríklad Stinchcomb et al., (1979) Náture 282:391; Tschemper et al., (1980) Gene 10:157; a Čiarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300).
Transkripčné kontrolné sekvencie pre kvasinkové vektory sú napríklad promótory na syntetizovanie glykolytických enzýmov (Hess et al. (1968) J. Adv. Enzýme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900). Medzi ďalšie promótory známe v odbore patrí CMV promótor poskytnutý v CDM8 vektore (Toyama a Okayama, (1990) FEBS 268:217 - 221); promótor pre 3-fosfoglycerátkinázu (Hitzman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) a promótory pre iné glykolytické enzýmy.
Iné promótory sú indukovateľné, pretože môžu byť regulované stimulmi z prostredia alebo rastovým médiom. Medzi tieto indukovateľné promótory patria promótory z génov pre proteíny tepelného šoku, alkohol-dehydrogenázu 2, izocytochróm C, kyslú fosfatázu, enzýmy asociované s katabolizmom dusíka a enzýmy zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy.
Regulačné sekvencie môžu byť tiež umiestnené na 3' koniec kódujúcich sekvencií. Tieto sekvencie môžu stabilizovať mRNA. Takéto terminátory sa vyskytujú v 3' netranslatovanom regióne po kódujúcich sekvenciách v niekoľkých cicavčích a kvasinkových génoch.
Medzi vektory vhodné pre rastliny a rastlinné bunky patria, napríklad Agrobacteriové T-plazmidy, vírus karfíolovej mozaiky (CaMV) a vírus zlatej mozaiky rajčín (TGMV).
Všeobecné aspekty transformácie cicavčích hostiteľských buniek sú opísané v Axel (U.S. patent č. 4399216, udelený 16. 8. 1983). Bunky cicavcov môžu byť transformované, napríklad transfekciou za prítomnosti fosforečnanu vápenatého, mikroinjekcií, elektroporácií alebo via transdukcií vírusovými vektormi.
Spôsoby na vkladanie cudzorodých DNA sekvencií do rastlinných a kvasinkových genómov zahŕňajú (1) mechanické spôsoby, ako je mikroinjekcia DNA do jednej bunky alebo protoplastov, vortexovanie buniek so sklenými korálkami za prítomnosti DNA alebo vstreľovanie DNA-potiahnutej na volfrámové alebo zlaté zrnká do buniek alebo protoplastov; (2) vkladanie DNA pomocou zvýšenej priepustnosti bunkovej membrány pre makromolekuly použitím spracovania polyetylénglykolom alebo pomocou elektrických impulzov s vysokým napätím (elektroporácia); alebo (3) použite lipozómov (obsahujúcich cDNA), ktoré fúzujú s bunkovými membránami.
Po exprimovaní CTLA4 mutantných molekúl podľa predkladaného vynálezu môžu byť tieto molekuly získané spôsobmi dobre známymi v odbore, ako je lyžovanie buniek (napr. sonikáciou, lyzozínom a/alebo detergentmi) a proteín sa potom získa s použitím štandardných spôsobov na prečistenie proteínov, napr. afinitnou chromatografiou alebo iónomeničovou chromatografiou, za získania významne prečisteného produktu (R. Scopes v: Proteín Purification, Principles a Practice”, 3. vydanie, Springer-Verlag (1994); Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Expresia CTLA4 mutantnej molekuly môže byť detekovaná spôsobmi známymi v odbore. Napríklad mutantné molekuly môžu byť detekované pomocou Coomassie farbených SDS-PAGE gélov a imunoblotingu s použitím protilátok, ktoré sa viažu na CTLA4.
Nasledujúce príklady sú uvedené na dokreslenie predkladaného vynálezu a aby pomohli odborníkom v odbore pri uskutočňovaní predkladaného vynálezu. Príklady neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Tento príklad poskytuje opis spôsobov použitých na prípravu nukleotidových sekvencii kódujúcich CTLA4 molekuly podľa predkladaného vynálezu.
Najskôr sa pripraví CTLA4lg kódujúci plazmid a overí sa, či exprimuje
CTLA4lg molekuly, ako je opísané v U.S. patentoch č. 5434131, 5885579 a
5851795. Následne sa mutantné molekuly obsahujúce jednu mutáciu (napr.
L104Elg) pripravia z CTLA4lg kódujúcej sekvencie, exprimujú sa a testujú sa na väzbové kinetiky pre rôzne
Β7 molekuly. L104Elg nukleotidová sekvencia (ako je uvedená na obr. 18) sa použije ako templát na generovanie CTLA4 mutantných sekvencií s dvoma mutáciami (ako sú uvedené na obr. 19 - 22), ktoré sa exprimujú ako proteíny a testujú sa na kinetiky väzby. Medzi CTLA4 mutantné sekvencie s dvoma mutáciami patria: L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg, a L104EA29Wlg. Tiež sa pripravia mutanty s tromi mutáciami.
Konštrukcia CTLA4lg
Genetický konštrukt kódujúci CTLA4lg obsahujúci extracelulárnu doménu CTLA4 a IgCgamal doménu sa pripraví spôsobom opísaným v U.S. patentoch 5434131, 5844095 a 5851795, ktorých obsahy sú tu uvedené ako odkazy. Gén pre extracelulárnu doménu CTLA4 sa klonuje PCR s použitím syntetických oligonukleotidov zodpovedajúcich publikovanej sekvencii (Dariavach et al., Eur. Journ. Immunol. 18:1901 - 1905 (1988)).
Pretože signálny peptid pre CTLA4 nebol v CTLA4 géne identifikovaný, je N-koniec predpokladanej sekvencie CTLA4 fúzovaný na signálny peptid onkostatínu M (Malik et al., Mol. a Celí. Biol. 9:2847 (1989)) v dvoch krokoch s použitím presahujúcich oligonukleotidov. Pre prvý krok sa oligonukleotid CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGC CGTGGCCCAGCC (ktorý kóduje C terminálnych 15 aminokyselín zo signálneho peptidu onkostatínu M fúzovaných na N-terminálnych 7 aminokyselín CTLA4) použije ako kódujúci primér, a TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (kódujúci aminokyselinové zvyšky 119 - 125 aminokyselinovej sekvencie CTLA4 receptora a obsahujúceho Bc1-1 reštrikčné miesto) sa použije ako reverzný primér. Templátom pre tento krok je cDNA syntetizovaná z 1 pg celkovej RNA z H38 buniek (HTLV II infikovaná bunková línia T-lymfocytárnej leukémie získaná od Dr. Salahudin a Gallo, NCI, Bethesda, MD). Časť PCR produktu z prvého stupňa sa reamplifikuje s použitím prekrývajúceho sa kódujúceho priméru kódujúceho N terminálnu časť signálneho peptidu onkostatínu M a obsahujúceho Hind III reštrikčné miesto,
CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGT CAGTCTGGTCCTTGCACTC a rovnakého reverzného priméru. Produkt PCR reakcie sa spracúva Hind III a Bc1 I a liguje sa s Bc1 l/Nba I štiepeným cDNA fragmentom kódujúcim aminokyselinové sekvencie zodpovedajúce pantovému, CH2 a CH3 regiónu lgC(gama)1 do Hind lll/Nba I štiepeného expresného vektora, CDM8 alebo Hind lll/Nba I štiepeného expresného vektora piLN (ktorý je tiež známy ako πΙ_Ν).
DNA kódujúca aminokyselinové sekvencie zodpovedajúce CTLA4lg bola uložená v ATCC podľa Budapeštianskej zmluvy 31.5.1991 pod ATCC prírastkovým č. 68629.
CTI_A4lg mutagenéza na báze kodónov:
Mutagénna a skríningová stratégia bola vyvinutá na identifikáciu mutantnej CTLA4lg molekuly, ktorá má pomalšiu disociáciu (off” rýchlosť) z CD80 a/alebo CD86 molekuly, t.j. má lepšiu väzbovú schopnosť. V tomto uskutočnení boli mutácie uskutočnené v a/alebo približne v zvyškoch CDR-1, CDR-2 (tiež známom ako C'reťazec) a/alebo CDR-3 regióne extracelulárnej domény CTLA4 (ako je opísané v U.S. patentoch 6090914, 5773253 a 5844095; v súvisiacej U.S. patentovej prihláške poradové č. 60/214065; a v Peach, R. J., et al,, J Exp Med 1994 180:2049 - 2058. CDR-like región zahŕňa každý CDR región a je dlhší o niekoľko aminokyselín pred a/alebo za CDR motívom). Tieto miesta boli vybrané podľa pokusov na chimérických CD28/CTLA4 fúznych proteínoch (Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180:2049 - 2058), a podľa modelovania určujúceho, ktoré vedľajšie reťazce aminokyselín budú vystavené pôsobeniu rozpúšťadla, a podľa chýbajúcej identity alebo homológie niektorých aminokyselinových zvyškov v niektorých pozíciách medzi CD28 a CTI.A4.
Ďalej, akýkoľvek zvyšok, ktorý je v tesnej blízkosti (5 - 20 Angstrômov) k identifikovaným zvyškom je považovaný za súčasť predkladaného vynálezu.
Na syntetizovanie a testovanie solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly s pozmenenou afinitou k B7 molekule (napr. CD80, CD86), sa použila dvojstupňová stratégia. Pokusy zahŕňali najskôr generovanie knižnice mutácií v špecifickom kodóne extracelulárnej časti CTLA4 a potom testovanie týchto knižníc s použitím BIAcore analýzy na identifikáciu mutantov s pozmenenou reaktivitou k B7. BIAcore testovací systém (Pharmacia, Piscataway, N.J.) využíva senzor na báze povrchovej plazmonovej rezonancie, ktorý využíva kovalentnú väzbu CD80lg alebo CD86lg na dextránom-potiahnutý senzorový čip, ktorý je umiestnený v detektore. Testovaná molekula môže byť potom injikovaná do komôrky obsahujúcej senzorový čip a množstvo komplementárneho proteínu, ktorý sa naviaže, môže byť hodnotené podľa zmeny molekulovej hmotnosti, ktorá je fyzikálne asociovaná s dextránom potiahnutou stranou senzorového čipu; zmena v molekulovej hmotnosti môže byť meraná detektorovým systémom.
Konkrétne, pripravili sa mutantné nukleotidové sekvencie obsahujúce jednu mutáciu s použitím nemutovanej (napr. prirodzenej) DNA kódujúcej CTLA4lg (U.S. patent č.: 5434131, 5844095; 5851795; a 5885796; ATCC prírastkové č. 68629) ako templátu. Mutagénne oligonukleotidové PCR priméry sa navrhli pre náhodnú mutagenézu špecifických kodónov tak, že sa povolili akékoľvek bázy v pozíciách 1 a 2 kodónu, ale iba guanín alebo tymín v pozícii 3 (XXG/T alebo tiež písané ako NNG/T). Týmto spôsobom môže byť špecifický kodón kódujúci aminokyselinu náhodne mutovaný tak, aby kódoval akúkoľvek z 20 aminokyselín. Tak vedie XXG/T mutagenéza k zisku 32 potenciálnych kodónov kódujúcich každú z 20 aminokyselín. PCR produkty kódujúce mutácie v tesnej blízkosti CDR3-like slučky CTLA4lg (MYPPPY) sa spracovávali Sacl/Xbal a subklonovali sa do podobne spracovávaného CTLA4lg (ako je uvedené na obr. 24) rtLN expresného vektora. Tento spôsob sa použil na prípravu CTLA4 mutantnej molekuly obsahujúcej jednu mutáciu L104Elg (ako je uvedená na obr. 18).
Pre mutagenézu v blízkosti CDR-1-like slučky CTLA4lg sa najskôr silentné Nhel reštrikčné miesto vložilo 5' do tejto slučky, s použitím PCR primérom riadenej mutagenézy. PCR produkty sa spracovali Nhel/Xbal a subklonovali sa do podobne spracovaných CTLA4lg alebo L104Elg expresných vektorov. Tento spôsob sa použil na generovanie CTLA4 mutantnej molekuly L104EA29Ylg obsahujúcej dve mutácie (ako je uvedené na obr. 19). Konkrétne, nukleová kyselina kódujúca CTLA4 mutantnú molekulu s jednou mutáciou, L104Elg, sa použila ako templát na generovanie CTLA4 mutantnej molekuly obsahujúcej dve mutácie, L104EA29Ylg.
Mutantné nukleotidové sekvencie kódujúce CTLA4 mutantné molekuly, ako je L104EA29Ylg (uložené 19.6.2000 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 - 2209, pod ATCC prírastkovým č. PTA-2104), sa pripravili opakovaním mutagenézy opísanej vyššie, s použitím L104Elg ako templátu. Tento spôsob sa použil na generovanie mnohých mutantných nukleotidových sekvencií s dvoma mutáciami, ako sú sekvencie kódujúce CTLA4 molekuly L104EA29Ylg (ako je uvedená na obr. 19), L104EA29Llg (ako je uvedená na obr. 20), L104EA29Tlg (ako je uvedená na obr. 21) a L104EA29Wlg (ako je uvedená na obr. 22). Tiež sa pripravili mutanty s tromi mutáciami, ako sú sekvencie kódujúce L104EA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg a L104EA29YS25Rlg.
Solubilné CTLA4 molekuly sa exprimovali z nukleotidových sekvencií a použili sa v klinických štúdiách fázy II, ktoré sú opísané v príklade 3 ďalej.
Ako je odborníkom v odbore známe, replikácia sekvencií nukleovej kyseliny, najmä PCR amplifikácia, ľahko vkladá zmeny báz do DNA reťazcov. Avšak, nukleotidové zmeny nie sú nutne translatované do aminokyselinových zmien, pretože niektoré kodóny kódujú rovnaké aminokyseliny. Akékoľvek zmeny nukleotidov v pôvodnej alebo prirodzenej sekvencií, silentné (t.j. nespôsobujúce zmenu v translatovanej aminokyseline) alebo iné, spadajú, aj keď to nie je výslovne uvedené, do rozsahu predkladaného vynálezu.
Príklad 2
Nasledujúci príklad opisuje skríningové metódy použité na identifikáciu mutantných CTLA polypeptidov s jednou alebo dvoma mutáciami, exprimovaných z konštruktov opísaných v príklade 1, ktoré majú vyššiu väzbovú aviditu pre B7 molekuly, v porovnaní s nemutovanými CTLA4lg molekulami.
Súčasné pokusy in vitro a in vivo ukazujú, že CTLA4lg samotný nie je schopný úplne blokovať aktiváciu špecifickým antigénom aktivovaných Tlymfocytov. Pokusy in vitro s CTLA4lg a buď monoklonálnou protilátkou špecifickou pre CD80 alebo CD86, merajúce inhibíciu proliferácie T-lymfocytov ukázali, že anti-CD80 monoklonálna protilátka nezvyšuje CTLA4lg inhibíciu. Avšak, anti-CD86 monoklonálna protilátka zvyšovala inhibíciu, čo naznačuje, že CTLA4lg nie je tak účinný v blokovaní CD86 interakcie. Tieto údaje podporujú skoršie zistenia Linsley et. al. (Immunity, (1994), 1:793 - 801) ukazujúce, že inhibícia CD80-sprostredkovanej bunkovej reakcie vyžaduje približne 100 krát nižšie koncentrácie CTI_A4lg ako inhibícia CD86-sprostredkovanej reakcie. Podľa týchto zistení sa predpokladá, že solubilné CTLA4 mutantné molekuly majúce vyššiu aviditu pre CD86 ako prirodzená CTLA4 molekula, by mohli lepšie blokovať priming” antigén-špecifických aktivovaných buniek ako CTLA4lg.
Preto boli solubilné CTLA4 mutantné molekuly opísané v príklade 1 testované s použitím novej skríningovej procedúry s cieľom identifikácie niekoľkých mutácií v extraceluárnej doméne CTLA4, ktoré zlepšujú väzbovú aviditu pre CD80 a CD86. Táto skríningová stratégia poskytuje účinný spôsob na priamu identifikáciu mutantov s významne pomalšou disociáciou bez potreby prečistenia lebo kvantifikácie proteínu, pretože určenie ”off rate” je nezávislé od koncentrácie (O'Shannessy et al., (1993) Anál. Biochem., 212:457 - 468).
COS bunky sa transfektovali jednotlivými plazmidovými DNA prečistenými na minprep a propagovali sa počas niekoľkých dní. Tri dni kondiciované kultivačné médium sa aplikovalo na BIAcore biosenzorové čipy (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) potiahnuté solubilným CD80lg alebo CD86lg. Špecifická väzba a disociácia mutantných proteínov sa merala povrchovou plazmovou rezonanciou (O'Shannessy, D. J., et al., 1997 Anál. Biochem. 212:457 - 468). Všetky pokusy boli uskutočnené na BIAcore™ alebo BIAcore™ 2000 biosenzoroch pri 25 °C. Ligandy boli imobilizované na NCM5 senzorových čipoch (Pharmacia) s použitím štandardnej N-etyl-N'-(dimetylaminopropyl)-karbodiimid-N-hydroxysukcínimidovej kondenzácie (Johnsson, B., et al. (1991) Anál. Biochem. 198: 268 - 277; Khilko, S. N., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:5425 - 15434).
Skríningový spôsob
COS bunky kultivované v 24-jamkových tkanivových kultivačných platniach sa dočasne transfektovali mutantným CTLA4lg. Kultivačné médium obsahujúce secernovaný solubilný mutantný CTLA4lg sa odoberalo o 3 dni neskôr.
Kondiciované kultivačné médium COS buniek sa nechalo pretekať cez BIAcore biosenzor čipy derivatizované CD86lg alebo CD80lg (ako je opísané v Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271: 26762 - 26771) a identifikovali sa mutantné molekuly s off-rates pomalšou ako je táto hodnota pre prirodzený CTLA4lg. DNA zodpovedajúce vybraným vzorkám média sa sekvencovali a pripravilo sa viacej DNA na uskutočnenie dočasnej transfekcie COS buniek vo väčšom meradle, z ktorých môže byť CTLA4lg mutantný proteín pripravený po prečistení kultivačného média na proteíne A.
BIAcore analýza a analýza dát väzbovej rovnováhy sa uskutočnili spôsobom opísaným v J. Greene et al. 1996, J. Biol. Chem. 271:26762 - 26771 a v U.S. patentovej prihláške poradové č. 09/579927 a 60/214065, ktoré sú tu uvedené ako odkazy.
Analýza BIAcore dát
Základné senosorgramy sa pred analýzou normalizovali na odozvu nula jednotiek (RU). Vzorky sa nechali prejsť falošne derivatizovanou prietokovou kyvetou na určenie RU hodnôt pozadia z dôvodu veľkých rozdielov v indexe lomu medzi roztokmi. Rovnovážne disociačné konštanty (Kd) sa vyrátali z grafov Req verzus C, kde Req je rovnovážna odpoveď mínus odpoveď na falošne derivatizovanom čipe a C je normálna koncentrácia analytu. Väzbové krivky sa analyzovali s použitím komerčného softvéru na hodnotenie nelineárnych kriviek (Prism, GrafPAD Software).
Experimentálne údaje sa najskôr upravili pre model väzby jedného ligandu na jeden receptor (1-miestnym odel, t.j. jednoduchý langmuir systém, A+B«-+ AB) a rovnovážne asociačné/konštanty (Kd=[A].[B]/[AB]) sa vyrátali z rovnice R=RmaxC/(Kd+C). Potom sa údaje upravili pre najjednoduchší model väzby ligandu na dve miesta (t.j. pre receptor majúci dve neinteragujúce/nezávislé väzbové miesta, ako je opísané rovnicou R=Rmaxi C/(Kdi+C)+Rmax2.C/(Kd2+C).
Priliehavosť týchto dvoch modelov sa analyzovala vizuálne porovnávaním s experimentálnymi údajmi a štatisticky s použitím F testu súčtu štvorcov. Jednoduchší jednocestný model bol vybraný ako lepší, pokiaľ nevyhovoval dvojmiestny model významne lepšie (p<0,1).
Asociačné a disociačné analýzy sa uskutočnili s použitím BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Asociačné rýchlostné konštanty Kon sa vyrátali dvoma spôsobmi, za predpokladu homogénnej interakcie na jednom mieste a paralelnej interakcie na dvoch miestach. Pre interakcie na jednom mieste sa hodnoty kon vyrátali podľa rovnice Rt=Req(1-exp'ks(‘'t0)), kde Rt je odpoveď za daný čas t; Req je rovnovážna odpoveď; t0 je čas na počiatku injekcie; a ks=dR/dt=kori.Ckoff; kde C je koncentrácia analytu vypočítaná v zmysle monomérnych väzbových miest. Pre interakcie na dvoch miestach sa hodnoty vypočítali podľa rovnice
Rt=Reqi(1-exp-ks1(t-to))+Req2(1-exp-ks2(t-to)). Pre každý model sa hodnoty kon určili pre vypočítaný sklon (približne do 70 % maximálne asociácie) grafu ks verzus C.
Disociačné údaje sa analyzovali s použitím jednomiestneho (AB=A+B) a dvojmiestneho modelu (AiBj=Ai+Bj) a rýchlostné konštanty (koff) sa vypočítali z najlepšie zodpovedajúcich kriviek. Použil sa model väzbového miesta, pokiaľ neboli rezídua väčšie ako základné hodnoty prístroja (2-10 RU podľa prístroja), keď sa použil model dvoch väzbových miest. Polčasy obsadenia receptora sa vypočítali podľa vzťahu Ti/2=0,693/koff.
Prietoková cytometria
Myšie mAb L307.4 (anti-CD80) sa zakúpila od Becton Dickinson (San Jose, California) a IT2.2 (anti-B7-0 [tiež CD86]), od
Pharmingen (San Diego, California). Pre imunofarbenie sa CD80-pozitívne a/alebo CD86-pozitívne CHO bunky odstránili z kultivačných nádob inkubáciou v fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) obsahujúcim 10 mM EDTA. CHO bunky (110 x 105) sa najskôr inkubovali s mAB alebo imunoglobulínovými fúznymi proteínmi v DMEM obsahujúcom 10 % fetálne bovinné sérum (FBS), potom sa premyli a inkubovali sa s kozím anti-myším alebo anti-ľudským imunoglobulínom konjugovaným s fluoresceín izotiokyanátom ako činidlom druhého stupňa (Tágo, Burlingame, California). Bunky sa premyli a analyzovali sa na FACScan (Becton Dickinson).
SDS-PAGE a chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti
SDS-PAGE sa uskutočnila na Tris/glycínových 4-20 % akrylamidových géloch (Novex, San Diego, CA). Analytické gély sa farbili Coomassie Blue a obrazy vlhkých gélov sa získali digitálnym skenovaním. CTLA4lg (25 pg) a L104EA29Ylg (25 pg) sa analyzovali chromatografiou s vylučovaním podľa veľkosti s použitím TSK-GEL G300 SWXL kolóny (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) uvedené do rovnováhy vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku obsahujúcom 0,02 % NAN3 pri prietoku 1,0 ml/min.
CTI_A4XYCi2os a L1O4EA29XYCi2os
Jednoreťazcová CTLA4Xci2os sa pripravila spôsobom opísaným skoršie (Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417 - 15424). Stručne, expresný plazmid pre onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4) sa použil ako templát, kódujúci primér, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG, bol vybraný tak, aby zodpovedal sekvenciám vo vektore; a reverzný primér, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC, zodpovedal posledným siedmim aminokyselinám (t.j. aminokyselinám 118 - 124) v extracelulárnej doméne CTLA4 a obsahoval miesto pre reštrikčný enzým a stop kodón (TGA). Reverzný primér určoval C120S (cysteín na serín v pozícii 120) mutáciu. Konkrétne, nukleotidová sekvencia GCA (nukleotidy 34 - 36) reverzného priméru uvedeného vyššie sa nahradila jednou z nasledujúcich nukleotidových sekvencií: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT alebo GCT. Ako bude odborníkom v odbore zrejmé, nukleotidová sekvencia GCA je revertovaná komplementárnou sekvenciou kodónu TGC pre cysteín. Podobne, nukleotidové sekvencie AGA, GGA, TGA, CGA, ACT alebo GCT sú revertované komplementárne sekvencie kodónov pre serín. Produkty polymerázovej reťazovej reakcie sa spracovali Hindlll/Xbal a priamo sa subklonovali do expresného vektora kLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, N J). L1O4EA29YXci2os sa pripravil podobným spôsobom. Každý konštrukt sa overil DNA sekvencovaním.
Identifikácia a biochemická charakterizácia mutantov s vysokou aviditou aminokyselín sa vybralo pre mutagenézu a vzniknutých asi 2300 mutantných proteinov sa testovalo na CD86lg väzbu pomocou povrchovej plazmovej rezonancie (SPR; ako je opísané vyššie). Predominantné efekty mutagenézy v každom mieste sú zhrnuté v tabuľke II, ďalej. Náhodná mutagenéza niektorých aminokyselín v CDR-1 regióne (S25 - R33) jasne nemenila väzbu na ligand. Mutagenéza E31 a R33 a zvyškov M97-Y102 viedla k zníženiu väzby ligandu. Mutagenéza zvyškov S25, A29 a T30, K93, L96, Y103, L104 a G105 viedla k vzniku proteinov pomalou asociáciou” a/alebo pomalou disociáciou”. Tieto výsledky potvrdzujú skoršie zistenie, že zvyšky v CDR-1 (S25 - R33) regióne a zvyšky v alebo blízko M97 - Y102, ovplyvňujú väzbu ligandu (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).
Mutagenéza miest S25, T30, K93, L96, Y103 a G105 viedla k identifikácii niektorých mutagénnych proteinov, ktoré majú pomalšiu disociáciu z CD86lg. Avšak, v týchto prípadoch bola pomalšia disociácia spojená s pomalou asociáciou, čo viedlo k získaniu mutantných proteínov, ktorých celková avidita pre CD86lg bola podobná ako pri prirodzenom CTLA4lg. Ďalej, mutagenéza K93 viedla k významnej agregácii, ktorá môže byť zodpovedná za pozorované zmeny kinetiky.
Náhodná mutagenéza L104 nasledovaná transfekciou COS buniek a testovaním vzoriek kultivačného média na imobilizovanom CD86lg pomocou SPR viedla k získaniu šiestich vzoriek média obsahujúcich mutantné proteíny s približne 2 krát pomalšou disociáciou ako má prirodzený CTLA4lg. Keď sa sekvencovali príslušné cDNA týchto mutantov, bolo u každého zabezpečené, že kóduje leucín na kyselinu glutámovú mutáciou (L104E). Je zrejmé, že substitúcia leucínu 104 na kyselinu asparágovú (L104D) neovplyvňuje väzbu CD86lg.
Mutagenéza sa potom opakovala pre každé miesto uvedené v tabuľke II, tentoraz s použitím L104E ako PCR templátu namiesto prirodzeného CTLA4lg, ako bolo opísané vyššie. SPR analýza, znovu s použitím imobilizovaného CD86lg, identifikovala šesť vzoriek kultivačného média z mutagenézy alanínu 29 s proteínmi majúcimi približne 4 krát pomalšiu disociáciu ako prirodzený CTLA4lg. Dva najpomalšie mali substitúciu tyrozinu (L104EA29Y), dva leucínu (L104EA29L), jeden tryptofánu (L104EA29W) a jeden treonínu (L104EA29T). Neboli identifikované žiadne mutanty s pomalou disociáciou, keď bol mutovaný iba alanin 29 v prirodzenom CTLA4lg.
Relatívna molekulová hmotnosť a stav agregácie prečisteného L104E a L104EA29Ylg sa hodnotili SDS-PAGE a chromatografiou s vylučovaním podľa veľkosti. L104EA29Ylg (1 pg; dráha 3) a L104Elg (1 pg; dráha 2) mali rovnakú elektroforetickú mobilitu ako CTLA4lg (1 pg; dráha 1) za redukujúcich (50 kDa; +βΜΕ; plus 2-merkaptoetanol) a neredukujúcich (100 kDa, -βΜΕ) podmienok (obr. 25A). Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti ukázala, že L104EA29Ylg (obr. 25C) má rovnakú mobilitu ako dimémy CTLA4lg (obr. 25B). Hlavné piky predstavujú proteínový dimér, zatiaľ čo rýchlejšie eluovaný menší pík na obr. 25B predstavuje agregáty s vyššou molekulovou hmotnosťou. Približne 5,0 % CTLA4lg bolo prítomných vo forme agregátov s vyššou molekulovou hmotnosťou, ale nebolí pozorované dôkazy agregácie L104EA29Ylg alebo L104Elg. Preto nemôže byť silnejšia väzba na CD86lg pozorovaná u L104Elg a L104EA29Ylg prisúdená agregácii indukovanej mutagenézou.
Analýza rovnováhy a kinetiky väzby
Analýza rovnováhy a kinetiky väzby sa uskutočnila na proteínom A prečistených CTLA4lg, L104Elg a L104EA29Ylg s použitím povrchovej plazmovej rezonancie (SPR). Výsledky sú uvedené v tabuľke I, ďalej. Pozorované rovnovážne disociačné konštanty (Kd; tabuľka I) boli vypočítané z kriviek väzby získaných s použitím rôznych koncentrácií (5,0 - 200 nM). L104EA29Ylg sa viaže silnejšie na CD86lg ako L104Elg alebo CTLA4lg. Nižšie Kd pre L104EA29Ylg (3,21 nM) ako L104Elg (6,06 nM) alebo CTLA4lg (13,9 nM) ukazuje na vyššiu väzbovú aviditu L104EA29Ylg k CD86lg. Nižšie Kd pre L104EA29Ylg (3,66 nM) ako L104Elg (4,47 nM) alebo CTI_A4lg (6,51 nM) ukazuje na vyššiu väzbovú aviditu L104EA29Ylg k CD80lg.
Analýza kinetiky väzby ukázala, že rýchlosti asociácie CTLA4lg, L104Elg a L104EA29Ylg na CD80 boli podobné, rovnako ako rýchlosti asociácie pre CD86lg (Tabuľka I). Avšak, rýchlosti disociácie pre tieto molekuly neboli ekvivalentné (Tabuľka I). V porovnaní s CTLA4lg mal L104EA29Ylg približne 2 krát nižšiu rýchlosť disociácie z CD80lg a približne 4 krát nižšiu rýchlosť disociácie z CD86lg, L104E má rýchlosť disociácie medzi L104EA29Ylg a CTI_A4lg. Pretože vkladanie týchto mutácií neovplyvňuje významne rýchlosti asociácie, je za zvýšenie avidity pre CD80lg a CD86lg u L104EA29Ylg primárne zodpovedné zníženie rýchlosti disociácie.
Na určenie toho, či zvýšenie avidity L104EA29Ylg pre CD86lg a CD80lg je spôsobené mutáciami postihujúcimi spôsob asociácie monomérov na dimér, alebo štrukturálnymi zmenami zosilňujúcimi aviditu v každom monoméri, sa pripravili jednoreťazcové konštrukty CTLA4 a L104EA29Y extracelulárne domény po mutagenéze cysteínu 120 na serin, ako je opísané vyššie a v Linsley et al., 1(995) J. Biol. Chem., 270.Ί5417 - 15424 (84). Prečistené proteíny CTLA4Xci2os a L1O4EA29YXci2os sa analyzovali ako monomérne, podľa gélovej permeačnej chromatografie (Linsley et al., (1995), vyššie), pred tým, ako boli ich väzbové vlastnosti analyzované SPR. Výsledky ukázali, že väzbová afinita oboch monomérnych proteínov pre CD86lg bola približne 35 - 80 krát nižšia ako pre príslušné diméry (Tabuľka I). Toto podporuje skoršie publikované údaje uvádzajúce, že dimerizácia CTLA4 je nutná pre vysokú aviditu väzby ligandu (Greene et. al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762 - 26771).
L1O4EA29YXci2os sa viaže s približne 2 krát vyššou afinitou než CTLA4Xci2os ako na CD80lg, tak aj na CD86lg. Vyššia afinita je spôsobená približne 3 krát nižšou rýchlosťou disociácie z oboch ligandov. Preto je silnejšia väzba ligandu L104EA29Y s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobená štrukturálnymi zmenami ovplyvňujúcimi aviditu, ktoré boli vložené do každého monomérneho reťazca a nie alteráciami dimerizácie molekuly.
Analýza pozície a štruktúry mutácií zvyšujúcich aviditu
Štruktúra extracelulárnej IgV-like domény CTLA4 bola nedávno určená NMR spektroskopiou (Metzler et al., (1997) Náture Struct. Biol, 4: 527 - 531). To umožnilo presné určenie leucínu 104 a alanínu 29 v trojrozmernom zložení (obr. 26, pravý a ľavý obrázok). Leucín 104 je situovaný blízko vysoko konzervovanej MYPPPY aminokyselinovej sekvencie. Alanín 29 je situovaný blízko Cterminálneho konca CDR-1 (S25-R33) regiónu, ktorý priestorovo susedí s MYPPPY regiónom. Zatiaľ čo je jednoznačná interakcia medzi zvyškami v báze týchto dvoch regiónov, nie je prítomná interakcia medzi L104 a A29, aj keď sú oba súčasťou hydrofóbneho jadra proteínu. Štrukturálne následky dvoch mutácií zvyšujúcich aviditu boli hodnotené modelovaním. A29Y mutácia môže byť ľahko vložené do medzery medzi CDR-1 (S25 - R33) región a MYPPPY región a môže slúžiť na stabilizáciu MYPPPY regiónu. V prirodzenom CTLA4 tvorí L104 extenzívne hydrofilné interakcie s L96 a V94 blízko MYPPPY regiónu. Je veľmi nepravdepodobné, že by mutácie kyseliny glutámovej spôsobovali konformáciu podobnú ako L104, a to z dvoch dôvodov. Za prvé, nie je dostatok priestoru pre ďalší vedľajší reťazec kyseliny glutámovej v štruktúre bez významného narušenia CDR-1 (S25 - R33 región). Za druhé, energetické nároky na negatívny náboj vedľajšieho reťazca kyseliny glutámovej v hydrofóbnom regióne sú značné. Miesto tohto modelovania predpovedá, že vedľajší reťazec kyseliny glutámovej vyčnieva na povrch, kde môže byť jeho náboj stabilizovaný solvatáciou. Takáto zmena konformácie môže byť ľahko upravená G105, s minimálnym narušením ďalších zvyškov v regiónoch.
Väzba mutantov s vysokou aviditou na CHO bunky exprimujúce CD80 alebo CD86
FACS analýza (obr. 27) CTI_A4lg a analýza väzby mutantnej molekuly na stabilne transferované CD80+ a CD86+ CHO bunky sa uskutočnila nasledujúcim spôsobom. CD80-pozitívne a CD86-pozitívne CHO bunky sa inkubovali so stúpajúcimi koncentráciami CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo L104Elg a následne sa premyli. Naviazaný imunoglobulínový fúzny proteín sa detekoval s použitím kozieho anti-Fudského imunoglobulínu naviazaného na fluoresceín izotiokyanát.
Ako je ukázané na obr. 27, CD80-pozitívne alebo CD86-pozitívne CHO bunky (1,5 x 106) sa inkubovali s uvedenými koncentráciami
CTLA4lg (plné štvorčeky), L104EA29Ylg (krúžky) alebo L104Elg (trojuholníky) počas 2 hodín pri 23 °C, premyli sa a inkubovali sa s kozín anti-ľudským imunoglobulínom naviazaným na fluoresceín izotiokyanát. Väzba na celkom 5000 živých buniek sa analyzovala (jedno meranie) s použitím FACScan a priemerná intenzita fluorescencie (MFI) sa určila z histogramov s použitím PC-LYSYS. Údaje sa korigovali na fluorescenciu pozadia meranú na bunkách inkubovaných iba s činidlom druhého kroku (MET 7). Kontrolné L6 mAb (80 pg/ml) mali MFI < 30. Tieto výsledky sú reprezentatívne výsledky zo štyroch nezávislých pokusov.
Väzba L104EA29Ylg, L104Elg a CTl_A4lg na ľudské CD80-transfektované CHO bunky je približne ekvivalentná (obr. 27A). L104EA29Ylg a L104Elg sa viažu silnejšie na CHO bunky stabilne transfektované ľudským CD86 ako CTLA4lg (obr. 27B).
Funkčné testy
Ľudské CD4-pozitívne T-lymfocyty sa izolovali imunomagnetickou negatívnou selekciou (Linsley et al., (1992), J. Exp. Med. 176: 1595 - 1604). Izolované CD4-pozitívne T-lymfocyty sa stimulovali forbolmyristátacetátom (PMA) plus CD80-pozitívnymi alebo CD86-pozitívnymi CHO bunkami v prítomnosti titračných koncentrácií inhibítora. CD4-pozitívne T-lymfocyty (8 - 10 x 104/jamku) sa kultivovali v prítomnosti 1 nM PMA s alebo bez ožiarených stimulačných buniek CHO. Proliferatívne reakcie sa merali pridaním 1 pCi/jamka [3H]tymidínu počas posledných 7 hodín 72 hodinovej kultivácie. Uskutočnila sa inhibicia PMA plus CD80-pozitívnymi CHO, alebo CD86-pozitívnymi CHO, stimulovaných Tlymfocytov s použitím L104EA29Ylg a CTLA4lg. Výsledky sú uvedené na obr. 28. L104EA29Ylg inhibuje proliferáciu CD80-pozitívnych PMA ošetrených CHO buniek viacej ako CTLA4lg (obr. 28A). L104EA29Ylg je tiež účinnejší ako CTLA4lg v inhibovaní proliferácie CD86-pozitívnych
PMA ošetrených CHO buniek (obr. 28B). Preto je L104EA29Ylg účinnejší inhibítor CD80- aj CD86-sprostredkovanej kostimulácie T-lymfocytov.
Obr. 29 ukazuje inhibiciu allostimulovaných ľudských T-lymfocytov L104EA29Ylg a CTLA4lg a kde tieto T-lymfocyty boli ďalej allostimulované ľudskou B lymfoblastoidnou bunkovou líniou (LCL) označovanou ako PM, ktorá exprimuje CD80 a CD86 (T-lymfocyty v koncentrácii 3,0 x 104/jamka a PM pri koncentrácii 8,0 x 103/jamka). Primárna allostimulácia prebiehala počas 6 dní a potom sa bunky pulzovali 3H-tymidínom počas 7 hodín pred tým, ako sa určovala inkorporácia rádioaktívneho markeru.
Druhá allostimulácia sa uskutočnila nasledujúcim spôsobom. Sedem dní primárne allostimulované T-lymfocyty sa odoberali cez lymfocytárne separačné médium (LSM) (JCN, Aurora, OH) a nechali sa v pokoji počas 24 hodín. Tlymfocyty sa následne restimulovali (sekundárne), v prítomnosti titračného množstva CTU\4lg alebo L104EA29Ylg, pridaním PM v rovnakom pomere ako vyššie. Stimulácia prebiehala počas 3 dní a potom sa bunky pulzovali rádioaktívnym markerom a odobrali sa spôsobom uvedeným vyššie. Efekt Ľ104EA29Ylg na primárne allostimulované T-lymfocyty je uvedený na obr. 29A. Efekt L104EA29Ylg na sekundárne allostimulované T-lymfocyty je uvedený na obr. 29B. L104EA29Ylg inhibuje tak primárne, ako aj sekundárne proliferatívne reakcie T-lymfocytov lepšie ako CTI_A4lg.
Na meranie produkcie cytokínov (obr. 30) sa uskutočnili dvojité sekundárne allostimulácie. Po troch dňoch sa kultivačné médium testovalo s použitím ELISA kitov (Biosource, Camarillo, CA) s použitím podmienok odporúčaných výrobcom. Zistilo sa, že L104EA29Ylg je účinnejšie ako CTLA4lg v blokovaní produkcie IL-2, IL-4 a gama-IFN cytokínu T-lymfocytov po sekundárnom allogennom podnete (obr. 30A - C).
Efekty L104EA29Ylg a CTLA4lg na reakciu zmesi opičích lymfocytov (MLR) sú uvedené na obr. 31. Mononukleárne bunky periférnej krvi (PBMC; 3,5 x 105 buniek/jamka od každej opice) od dvoch opíc sa prečistili cez lymfocytárne separačné médium (LSM) a zmiešali sa s 2 pg/ml fytohemaglutinínu (PHA). Bunky sa stimulovali 3 dni a potom sa pulzovali rádioaktívnym markerom počas 16 hodín pred tým, ako sa odobrali. L104EA29Ylg inhiboval proliferáciu opičích T-lymfocytov lepšie ako CTLA4lg.
Tabuľka I:
Nasledujúca tabuľka ukazuje rovnovážne a kinetické konštanty (hodnoty sú priemery štandardná odchýlka z troch rôznych pokusov).
Imobilizovaný proteín Analyt kon (x 10s) M'1 S'1 kOff (x10’J) S'1 Kd nM
CD80lg CTLA4lg 3,44 ±0,29 2,21 ±0,18 6,51 ± 1,08
CD80lg L104Elg 3,02 ±0,05 1,35 ±0,08 4,47 ±0,36
CD80lg L104EA29Ylg 2,96 ± 0,20 1,08 ±0,05 3,66 ±0,41
CD80lg CTLA4Xci20S 12,0 ± 1,0 230 ± 10 195 ±25
CD80lg L1O4EA29YXCi2os 8,3 ± 0,26 71 ±5 85,0 ±2,5
CD86lg CTLA4lg 5,95 ± 0,57 8,16 ±0,52 13,9 ±2,27
CD86lg L104Elg 7,03 ±0,22 4,26 ± 0,11 6,06 ± 0,05
CD86lg L104EA29Ylg 6,42 ± 0,40 2,06 ±0,03 3,21 ±0,23
CD86lg CTLA4Xci2os 16,5 ±0,5 840 ± 55 511 ± 17
CD86lg L1O4EA29YXCi2os 11,4 ± 1,6 300 ± 10 267 ± 29
Tabuľka II
Efekt mutagenézy CTLA4lg v uvedených miestach na väzbu na CD86lg určený SPR, ako je opísaná vyššie. Prevládajúci účinok je označený
Miesto mutagenézy Efekt mutagenézy
Bez efektu Jasné spomalenie asociácie/ spomalenie disociácie Redukovaná väzba ligandu
S25 +
P26 +
G27 +
K28 +
A29 +
T30 +
E31 +
R33 +
K93 +
L96 +
M97 +
Y98 +
P99 +
P100 +
P101 +
Y102 +
Y103 +
L104 +
G105 +
1106 +
G107 +
Q111 +
Y113 +
1115 +
Y113 +
1115 +
Príklad 3
Nasledujúci príklad opisuje klinické štúdie fázy II na pacientoch, ktorým bola podávaná solubilná CTLA4 mutantná molekula L104EA29Ylg (tiež označovaná ako LEA29Y alebo LEA) alebo CTLA4lg, na zmiernenie aspoň jedného príznaku asociovaného s reumatoidnou artritídou, vrátane redukcie: opuchu kĺbov, citlivosti kĺbov, zápalu, ranného zmeravenia a bolesti. Použitá CTLA4lg molekula začína metionínom v pozícii +1 (alebo alternatívne alanínom v pozícii -1) a končí lyzínom v pozícii +357, ako je ukázané na obr. 24. DNA kódujúca vyhotovenie CTLA4lg molekuly bola uložená pod ATCC 68629. Použitá ĽI04EA29Ylg molekula začína metionínom v pozícii +1 (alebo alternatívne alanínom v pozícii -1) a končí lyzínom v pozícii +357, ako je ukázané na obr. 19. DNA kódujúca vyhotovenie L104EA29Ylg molekuly bola uložená pod ATCC PTA 2104.
Ďalej tento príklad opisuje pacientov, ktorým bol podaný L104EA29Ylg alebo CTLA4lg na zmiernenie aspoň jedného biologického markeru asociovaného s reumatoidnou artritídou, vrátane zníženia sedimentácie erytrocytov, sérovej koncentrácie C-reaktívneho proteínu a/alebo IL-2 receptora.
Kohorty pacientov
Na štúdii participovalo celkom 214 pacientov, 54 mužov a 160 žien (obr. 1A, 1B). Pacienti mali na začiatku priemerné trvanie ochorenia 3,4 (+2,0) roka a mali za sebou zlyhanie aspoň jedného antireumatika modifikujúceho ochorenie (DMARD). Bolo povolené súčasné užívanie nesteroidných protizápalových liekov (NSAIDS) alebo steroidov (<10 mg/deň) a súčasné podávanie DMARDS bolo zakázané. Pacienti boli randomizovaní do skupín po 25 až 32 pacientov na skupinu. 32 pacientov dostávalo placebo, 92 dostávalo L104EA29Ylg a 90 dostávalo CTLA4lg. Pacienti, ktorých liečba prebiehala podľa protokolu a neprerušili liečbu do dňa 57 dostali celkom 4 intravenózne infúzie, vždy jednu infúziu v deň 1, 15, 29 a 57. Všetci pacienti boli hodnotení v deň 1,15, 29, 43, 57, 71 a 85. Podané dávky boli 0,5, 2,0 alebo 10,0 mg/kg L104EA29Ylg (označené ako LEA.5, LEA2 a LEA10, v príslušnom poradí na obr. 1A - 1E) alebo CTLA4lg (označené ako CTLA.5, CTLA2 a CTLA10, v príslušnom poradí na obr. 1A-1E).
Všetci jedinci boli sledovaní na peri-infúzne nežiaduce účinky s použitím otázok a dotazníka na potenciálne nežiaduce účinky. Pacientov sa pýtali na potenciálne nežiaduce účinky, ktoré sa môžu vyskytnúť počas 24 hodín po infúzií. Ďalej boli pacienti vyzvaní, aby spontánne udávali akékoľvek nežiaduce účinky, ktoré pociťovali. Lekári rutinne monitorovali laboratórne vzorky od pacientov na abnormality v biochémii a hematológii, napr. hodnotili koncentrácie mediátorov zápalu, ako sú cytokíny (TNF, IL-6), tryptáza a komplement. Primárnym cieľom bol podiel pacientov spĺňajúcich ACR 20 kritéria v deň 85.
Skladovanie testovacích materiálov
CTLA4lg a L104EA29Ylg boli dodané v sklených liekovkach na jedno použitie obsahujúcich 200 mg/liekovka CTLA4lg alebo 100 mg/liekovka L104EA29Ylg, v príslušnom poradí. Pred infúziou sa CTLA4lg a L104EA29Ylg nariedili na konečnú koncentráciu 25 mg/ml sterilnou vodou pre injekcie (SWFI).
Protokol pre aplikáciu
Všetky infúzie boli podané intravenózne počas 1 hodiny (obr. 1 až 17).
Všetci jedinci dostávali aspoň jednu infúziu študovanej medikácie.
Skupina 1: 32 pacientov, placebo zodpovedajúce CTLA4lg alebo L104EA29Ylg.
Skupina 2: 26 pacientov; dávka 0,5 mg/kg CTLA4lg.
Skupina 3: 32 pacientov; dávka 2,0 mg/kg CTl_A4lg.
Skupina 4: 32 pacientov; dávka 10,0 mg/kg CTLA4lg.
Skupina 5: 32 pacientov; dávka 0,5 mg/kg L104EA29Ylg.
Skupina 6: 29 pacientov; dávka 2,0 mg/kg L104EA29Ylg.
Skupina 7: 31 pacientov; dávka 10,0 mg/kg L104EA29Ylg.
Klinické sledovanie
Pacienti boli hodnotení na východiskové hodnoty aktivity ochorenia pred tým, ako im bola podaná akákoľvek infúzia. Základné hodnotenie zahŕňalo: opuch kĺbov, citlivosť kĺbov, zápal, rannú stuhnutosť, aktivitu ochorenia hodnotenú pacientom a lekárom, rovnako ako obmedzenie pohyblivosti hodnotené podľa Health Questionnaire Assessment (HAQ) (uvedené ako skóre funkcií podľa lekára na obr. 1C) a bolesti (obr. 1A až 1D). Ďalej medzi základné vyšetrenie patrila sedimentácia erytrocytov (ESR) a sérová koncentrácia C-reaktívneho proteínu (CRP) a solubilného IL-2 receptora (IL-2r) (obr. 1C a 1 D).
Klinická odpoveď v štúdii bola hodnotená podľa kritérií daných American College of Rheumatology (ACR). Jedinec spĺňal ACR-20 kritérium, ak došlo k 20 % zlepšeniu v citlivosti a opuchu kĺbu a k 20 % zlepšeniu v troch z piatich ostávajúcich meraných príznakov, ako sú celkové zmeny ochorenia, bolesť, neschopnosť a reaktanty akútnej fázy (Felson, D. T., et al., 1993 Arthritis a Rheumatism 36: 729 - 740; Felson, D. T., et al., 1995 Arthritis a Rheumatism 38: 1 - 9).
Biologické markery
Hodnotené boli tiež potenciálne biomarkery aktivity ochorenia (reumatoidný faktor, CRP, ESR, solubilné IL-2r, solubilný ICAM-1, solubilný E-selektín a MMP3). Zavedené imunotesty (EIA) boli použité na stanovenie sérových koncentrácií IL-2sRa, slCAM-1, sE-selektínu a MMP-3. TNF-α a IL-6 boli hodnotené pred infúziou a 2 hodiny po infúzii, ak to bolo nutné.
IL-2sRa, slCAM-1 a sE-selektín sa merali s použitím komerčne dostupných kolorimetrických EIA kitov od R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Dolné a horné limity merania boli 312 - 20 000 pg/ml, 40 - 907 ng/ml a 10 - 206 ng/ml, v príslušnom poradí. Koeficient variácie medzi testami bol v rozmedzí od 4,48 - 8,4 %, 3,8 - 5,0 % a 5,5 - 9,0 %, v príslušnom poradí. Podľa výrobcu kitu sú normálne sérové koncentrácie v rozmedzí 676 - 2132 pg/ml, v príslušnom poradí.
MMP-3 sa merala s použitím komerčne dostupného kolorimetrického EIA kitu od Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Dolné a horné limity merania boli 30 - 7680 ng/ml. Koeficient variácie medzi testami bol v rozmedzí od 6,3 - 10,6. Podľa výrobcu kitu sú normálne sérové koncentrácie v rozmedzí 28 - 99 ng/ml.
IL-6 a TNFa sa merali s použitím komerčne dostupných chemiluminiscenčných EIA kitov od R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Dolné a horné limity merania boli 0,3 - 3000 pg/ml a 0,7 - 7000 pg/ml, v príslušnom poradí. Koeficient variácie medzi testami bol v rozmedzí od 3,1 - 5,7 % a 6,4 - 20,7 %, v príslušnom poradí. Podľa výrobcu kitu sú normálne sérové koncentrácie v rozmedzí 0,3 - 12 pg/ml a 0,7 - 7,5 pg/ml, v príslušnom poradí.
Testovanie protilátok
Vzorky séra sa odobrali na hodnotenie protilátok špecifických pre liek pred aplikáciou v deň 1 a približne v dňoch 15, 29, 57, 86 a 169. Vzhľadom na vysoké, preexistujúce titre namierené proti imunoglobulínovej (Ig) časti molekuly sa tiež hodnotila špecifická protilátka proti CTLA4lg a LEA29Y bez Ig konštantných regiónov.
97-jamkové Immulon II ELISA platne (Dynex, Chantilly, Virginia) sa potiahli CTLA4lg, CTLA4lg bez Ig konštantných regiónov, LEA29Y alebo LEA29Y bez Ig konštantných regiónov v koncentrácii 2, 4, 2 alebo 1 pg/ml vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS), v príslušnom poradí a uskutočnila sa inkubácia cez noc pri 2 - 8 °C. Platne sa premyli PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 a blokovali sa počas 1 hodiny pri 37 °C PBS obsahujúcom 1 % bovinný sérový albumín (BSA). Platne sa potom premyli a sériové riedenia testovaného séra alebo kontrolného (QC) séra sa pridali do vhodných jamiek a uskutočnila sa inkubácia počas 2 hodín pri 37 °C. Sérum sa nariedilo tri krát v PBS s 0,25 % BSA a 0,05 % Tween 20, od riedenia 1:10. Platne sa premyli a pridala sa zmes kozích protilátok proti ľudským kappa a lambda reťazcom konjugovaných s alkalickou-fosfatázou (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). Po 1 hodine inkubácie pri 37 °C sa platne premyli a 1 mg/ml para-nitrofenyl-fosfát v dietanolamínovom pufri sa pridal do každej jamky. Po 30 minútach pri 25 °C sa reakcia ukončila 3N NaOH a zmerala sa absorbancia (dve vlnové dĺžky: 405 nm a 550 nm). Výsledky boli vyjadrené ako konečný titer (EPT), ktorý je definovaný ako prevrátená hodnota najvyššieho riedenia, ktoré viedlo k absorbancii päť krát vyššej ako je základná absorbancia. Základná absorbancia platne sa určila ako absorbancia v neprítomnosti séra.
Hodnoty sa považovali za pozitívne na serokonverziu vtedy, keď boli aspoň o dve sériové riedenia (9-krát) alebo viackrát vyššie ako hodnoty EPT pred aplikáciou dávky. QC vzorky séra pozitívne na CTLA4lg- alebo LEA29Y-špecifickú protilátku sa pripravili od imunizovaných opíc. Podiely vhodných QC vzoriek sa testovali počas každého analytického merania. Analytické merania sa akceptovali iba vtedy, keď boli QC vzorky v prijateľných hraniciach.
Výsledky
CTLA4lg a L104EA29Ylg boli pri nízkych dávkach dobre tolerované. Periinfúzne nežiaduce účinky boli podobné vo všetkých skupinách, s výnimkou bolesti hlavy. Bolesť hlavy sa u pacientov v deň 85 zvyšovala v závislosti od dávky, 23 %, 44 % a 53 % u CTLA4lg-liečených pacientov a 34 %, 45 % a 61 % u Ľ104EA29Ylg-liečených pacientov, pri dávke 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v príslušnom poradí. Naopak, 31 % pacientov, ktorým bolo podávané placebo, udávalo bolesť hlavy.
Percento pacientov, ktorí boli vyradení z klinickej štúdie v dôsledku zhoršenia artritídy, je zhrnuté na obr. 2. Oveľa vyššie percento pacientov na placebe prerušilo liečbu v dôsledku zhoršenia artritídy. Pacienti liečení CTLA4lg prerušovali liečbu menej so stúpajúcou dávkou. Veľmi málo pacientov liečených L104EA29Ylg prerušilo liečbu. Tieto výsledky ukazujú na dobrú inverznú závislosť odpovede od dávky pre CTLA4lg a lepšiu terapeutickú odpoveď na terapiu L104EA29Ylg.
ACR-20, -50 a -70 odpovede pacientov liečených CTl_A4lg, L104EA29Ylg alebo placebom v deň 85 sú zhrnuté na obr. 3A. Podobne, obr. 3B a C opisujú
ACR-20 reakcie s 95 % intervalom spoľahlivosti. Odpovede sa zdajú byť závislé od dávky s jasnou signifikantnou reakciou pri 10 mg/kg telesnej hmotnosti pacienta.
Percento pacientov s redukciou opuchu a citlivosti kĺbu v porovnaní s pacientmi nemajúcimi žiadnu odozvu na liečbu CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo placebom, je uvedené na obr. 4A a B. Terapeutická odpoveď sa zdá byť závislá od dávky. Väčšie percento pacientov vykazuje zlepšenie o 20, 50, 70 a dokonca aj 100 % pri 2 a 10 mg/kg oboch produktov.
Percento pacientov s redukovanou bolesťou, aktivitou ochorenia podľa pacienta a skóre podľa lekára pri liečbe CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo placebom, je uvedené na obr. 5A, B, C a D. Terapeutické odpovede, monitorované podľa Likertovho skóre, sa zdajú byť závislé od dávky a sú lepšie pre skupiny s aktívnou liečbou ako skupiny s placebom v deň 85. Likertovo skóre je zavedené verbálne skóre na hodnotenie príznakov (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6): 729 - 740).
Zmeny hodnotenia aktivity ochorenia pacientom a lekárom o aspoň dve jednotky od východiskovej hodnoty pri liečbe CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo placebom, sú uvedené na obr. 6A a B. Odpovede sa zdajú byť závislé od dávky s výraznejším zlepšením pri vyšších dávkach aktívnych liekov.
Percentuálne zníženie koncentrácií C-reaktívneho proteínu (CRP) u pacientov liečených CTI_A4lg, L104EA29Ylg alebo placebom, sú uvedené na obr. 7A a B. Odpovede sa zdajú byť závislé od dávky s jasným znížením pre skupiny liečené 2 a 10 mg/kg aktívneho lieku. Ďalej, obr. 7B ukazuje, že rozdiel je dosť signifikantný v porovnaní s placebom v 95 % intervaloch spoľahlivosti. Obr. 7C ukazuje zmeny sérových koncentrácií v porovnaní s východiskovou hodnotou v deň 85.
Sérové koncentrácie solubilného IL-2 receptora u pacientov liečených CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo placebom, sú uvedené na obr. 8. Zníženie koncentrácie solubilného IL-2 receptora sa zdá byť závislé od dávky.
Sérové koncentrácie solubilného ICAM-1 a solubilného E-selektínu u pacientov liečených CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo placebom, sú uvedené na obr. 33. Zníženie koncentrácií solubilného ICAM-1 a solubilného E-selektínu sa zdá byť závislé od dávky.
Medián a priemer počtu citlivých kĺbov u pacientov liečených CTLA4lg alebo placebom za čas sú uvedené na obr. 9A a B. Zmeny od základnej hodnoty (napr. redukcia citlivých kĺbov) sa zdajú byť významnejšie v skupinách liečených 2 a 10 mg/kg ako v skupinách liečených placebom alebo 0,5 mg/kg.
Medián a priemer počtu opuchnutých kĺbov u pacientov liečených CTLA4lg alebo placebom za čas sú uvedené na obr. 10A a B. Zmeny od základnej hodnoty (napr. redukcia počtu opuchnutých kĺbov) sa zdajú byť významnejšie v skupinách liečených 2 a 10 mg/kg ako v skupinách liečených placebom alebo 0,5 mg/kg.
Priemerné skóre hodnotenia bolesti u pacientov liečených CTLA4lg alebo placebom sú uvedené na obr. 11. Zmeny od základnej hodnoty (napr. redukcia bolesti) sa zdajú byť významnejšie v skupinách liečených 2 a 10 mg/kg ako v skupinách liečených placebom alebo 0,5 mg/kg.
Priemerné skóre aktivity ochorenia podľa lekára a pacienta u pacientov liečených CTLA4lg alebo placebom za čas sú uvedené na obr. 12A a B. Zmeny od základnej hodnoty (napr. zníženie aktivity ochorenia) sa zdajú byť významnejšie v skupinách liečených 2 a 10 mg/kg ako v skupinách liečených placebom alebo 0,5 mg/kg.
Medián a priemer počtu citlivých kĺbov u pacientov liečených L104EA29Ylg (označeného na obr. ako LEA) alebo placebom za čas sú uvedené na obr. 13A a B. Zmeny od základnej hodnoty (napr. redukcia počtu citlivých kĺbov) sa zdajú byť závislé od dávky.
Medián a priemer počtu opuchnutých kĺbov u pacientov liečených L104EA29Ylg (označeného na obr. ako LEA) alebo placebom za čas sú uvedené na obr. 14A a B. Zmeny od základnej hodnoty (napr. redukcia počtu opuchnutých kĺbov) sa zdajú byť významnejšie v skupinách liečených 2 a 10 mg/kg ako v skupinách liečených placebom alebo 0,5 mg/kg.
Priemerné skóre bolesti u pacientov liečených L104EA29Ylg (označeného na obr. ako LEA) alebo placebom za čas sú uvedené na obr. 15. Zmeny od základnej hodnoty (napr. redukcia bolesti) sa zdajú byť závislé od dávky.
Priemerné skóre aktivity ochorenia podľa lekára alebo pacienta u pacientov liečených L104EA29Ylg (označeného na obr. ako LEA) alebo placebom za čas sú uvedené na obr. 16A a B. Zmeny od základnej hodnoty (napr. redukcia aktivity ochorenia) sa zdajú byť závislé od dávky.
Percentuálne zlepšenie fyzickej nespôsobilosti podľa HAQ v deň 85 pre pacientov liečených CTLA4lg, L104EA29Ylg alebo placebom je uvedené na obr. 17 (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 9: 789 - 793). Je zrejme jasná závislosť tohto zlepšenia od dávky.
Zmeny v koncentrácii solubilného lL-2r a C-reaktívneho proteínu vzhľadom na východiskovú hodnotu boli závislé od dávky v oboch liečených skupinách. Po liečbe boli koncentrácie solubilného IL-2r -2 %, -10 % a -22 % pre CTLA4lg a -4 %, -18 % a -32 % pre L104EA29Ylg, pri dávke 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v príslušnom poradí, v porovnaní s +30 % pre placebo. Koncentrácie Creaktívneho proteínu boli -12 %, -15 % a -32 % pre CTLA4lg a +47 %, -33 % a -47 % pre L104EA29Ylg pri dávke 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v príslušnom poradí, v porovnaní s +20 % pre placebo (obr. 7A).
Žiadne klinicky významné zistenia s ohľadom na bežné hematologické parametre, biochemické laboratórne nálezy (s výnimkou mierneho zníženia koncentrácií IgA a IgG pri vyšších dávkach), alebo s ohľadom na vitálne funkcie neboli pozorované. Dôležité je, že žiadna medikácia neindukovala protilátky špecifické pre liek.
Príklad 4
Nasledujúci príklad opisuje klinické štúdie fázy II uskutočnené na ľudských pacientoch, ktorým bol podávaný L104EA29Ylg s cieľom redukcie alebo prevencie štrukturálneho poškodenia, vrátane erózie kosti alebo kĺbu, pri hodnotení s použitím zavedených rádiografických stupníc. Toto zlepšenie v redukcii alebo prevencia štrukturálneho poškodenia je paralelné ku klinickému zlepšeniu meranému podľa klinických parametrov.
Stav štruktúry kosti sa sledoval u niektorých pacientov pred liečbou CTLA4lg alebo L104EA29Ylg. Týmto pacientom sa chronicky podávalo medzi 0,5 a 20 mg/kg CTLA4lg alebo L104EA29Ylg každých dva až dvanásť týždňov (samostatne alebo v kombinácii s inými liekmi) na udržanie terapeutického zlepšenia po dlhší čas. Rôntgenové snímky rúk a nôh pacientov sa uskutočňovali vo vopred určených intervaloch: 6 mesiacov a potom raz ročne, ako je odporúčané vo FDA guidelines. Títo pacienti boli sledovaní dlhodobo počas 6 a 12 mesiacoch na určenie toho, či liečba CTLA4lg alebo L104EA29Ylg redukuje progresiu kostného postihnutia, a potom sa pacienti sledovali raz za rok. Pacienti sa sledovali s použitím rádiografických metód, vrátane rôntgenového vyšetrenia a/alebo vyšetrenia magnetickou rezonanciou (MRI), štandardnými spôsobmi (Larsen, A. K. a M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18: 481 - 491; Sharp, I. T., et al., 1985 Arthritis a Rheumatism 28:1326 - 1335). Výsledky týchto vyšetrení sú hodnotené z hľadiska prevencie štrukturálneho poškodenia, vrátane spomalenia erózie kostí a poškodenia chrupaviek, zúženia kĺbových štrbín a/alebo prevencie nových erózií.
Zoznam sekvencií <110> Cohen, Róbert Carr, Suzette Hagertv, Dávid Peach, Róbert J Eecker, Jean-Claude Bristol-Myers Squibb Company <12Q> Spôsoby na liečbu reumatických ochorení s použitím solubilnej CTLA4 molekuly <130> D003QPCT;30436.55WOU1 <l<ä0> PCľ/US01/21204 <141> 2001-07-02 <150> 60/215,913 <151> 2000-07-03 <16O> 19 <170> Patsntln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: CTLA4 fúzovaná k onkostaínu M, pôvodný primér <400> 1 ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc 60 cagcc 65 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213 __ Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie: CTLA4 fúzovaná k onkostaínu M, reverzný p <400> 2 tttgggctcc tgatcagaat ctgggcacgg ttg 33 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <21-> Umelá sekvencia <22C>
«υ <223> Opis umelej sekvencie: CTLA4 s onkostatínom M a Hind III <400> 3 ctagccactg aagcttcacc aatgggtgta ctgctcacac agaggacgct actcagtctg 60 gtccttgcac tc -J2 <210> 4 <2il> 41 <212> DNA <213>
<220>
<223>
<4 00> 6 gaggtgataa <210> 5 <211> 42 <212> DNA <2 13>
<220>
<223>
<400> 5 gtggtgtatt <210> 6 <211> 1152 <212> DNA
Umelá sekvencia
Opis umelej sekvencie : onkostatín M CTLA4 (OMCTLA4), pôvodný primér agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41
Umelá sekvencia
Opis umelej sekvencie: onkostatín M CTLA4 (OMCTLA4), reverzný primér ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42 <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104Elg <400> 6 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tgctactggc cagcagccga 120 ggcatcacta gctttgtgtg tcagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc gccaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tgcaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cctccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcctcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaaaaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtcgaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggagaag cagtacaaca gcacgtaccg tgtcgtcagc 720 gtcctcaccg tcctccacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc ttccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg ggaacaacta caagaccacg cctcccgtac tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgrga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagaacct ctccctgtct ccgggtaaat ga
900
960
1020
1080
1140
1152 <210> 7 <211> 383 <212> PRT <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104Elg <400> 7
Met 1 Gly Val Leu Leu 5 Thr Gin Arg Thr Leu Leu 10 Ser Leu Val Leu 15 Al a
Leu Lsu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly íle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser íle Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95·
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr íle Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr íle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly íle Gly Asn Gly Thr Gin íle Tyr Val íle Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 2CS
Val Lvs Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala lys
210 215 220
Thr Lys 225 Pro Arg Glu Glu 230 Gin Tyr Asn Ser Thr 235 Tyr Arg Val Val Ser 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr íle
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
230 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 3 65
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro GLy Lys
370 375 380 <210> 3 <211> 1152 <212> CNA <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104EA29Ylg <400> 8 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatgacaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aatatactga ggtccgggtg 180 acagtgcrtc ggcaggctaa cagccaggtg actgaagtct gtacggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacag gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acaaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aarggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagaacct ctccctgtct ccgggcaaat ga
960
1020
1080
1140
1152 <210> 9 <211> 333 <212> PRT <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104EA29Ylg <400> 9
Met Gly T Val Leu Leu 5 Thr Gin Arg Thr Leu Leu 10 Ser Leu Val Leu 15 Ala
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Sér Arg Gly íle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Mer
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser íle Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr íle Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr íle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly íle Gly Asn Gly Thr Gin íle Tyr Val íle Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Giy Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys 225 Pro Arg Glu Glu 230 Gin Tyr Asn Ser Thr 235 Tyr Arg Val Val Ser 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr íle
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg .Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 350 365
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 10 <211> 1152 <212> DNA <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104EA29Llg <400> 10 atgggtgtac agcatggcga ggcatcgcta acagtgottc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attaatccag acatccccac ccaaaaccca gacctgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ct gacctgcc tgctcacaca gcstggcaat gctttgtgtg gccaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc cgtccccagc aagacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaaag gaggacgctg gcacgtggcc tcagtatgca cagccaggtg agatgattcc actgagggcc atactacgag acattctgat acctgaactc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc crtctatccc ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgaagtct atctgcacgg atggacacgg ggcataggca caggagccca ctggggggat cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg tccttgcact tggtactggc aattgactga gtgcggcaac gcacctccag gactctacat acggaaccca aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg agtacaagtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca -gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga
1020
1080
1140
1152 <210> 11 <211> 383 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> opis umelej sekvencie: L104EA29Llg <400> 11
Met 1 Gly Val Leu Leu 5 Thr Gin Arg Thr Leu 10 Leu Ser Leu Val Leu Ala 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly íle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Leu Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser íle Cys Thr Gly Thr Ser
8 5 90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr íle Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr íle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly íle Gly Asn Gly Thr Gin íle Tyr Val íle Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys 225 Pro A.rg Glu Glu 2 30 Gin Tyr Asn Ser Thr 235 Tyr Arg Val Val Ser 240
Val Leu Thr Val Leu 245 His Gin Asp Trp Leu 250 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 255
Cys Lys Val Ser 260 Asn Lys Ala Leu Pro 265 Ala Pro íle Glu Lys 270 Thr íle
Ser Lys Ala 275 Lys Gly Gin Pro Arg 280 Glu Pro Gin Val Tyr 285 Thr Leu Pro
Pro Ser 290 Arg Asp Glu Leu Thr 295 Lys Asn Gin Val Ser 300 Leu Thr Cys Leu
Val Lys 305 Gly Phe Tyr Pro 310 Ser Asp íle Ala Val 315 Glu Trp Glu Ser Asn 320
Gly Gin Pro Glu Asn 325 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Val Leu .Asp Ser 335
Asp Gly Ser Phe 34 0 Phe Leu Tyr Ser Lys 34 5 Leu Thr Val Asp Lys 350 Ser A.rg
Trp Gin Gin 355 Gly Asn Val Phe Ser 360 Cys Ser Val Met His 365 Glu Ala Leu
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 12 <211> 1152 <212> DNA <213>
Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104EA29Tlg <400> 12 atgggtctac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aaactactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc. ggcagactga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcapgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatcoag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatccca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaacccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccga agaacaacta caacaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca ocaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga
1080
1140
1152 <210> 13 <211> 383 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> °P*s umelej sekvencie: L104EA29Tlg <400> 13
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly íle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Thr Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Al s Asp Ssr Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser íle Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly As n Gin Val Asn Leu Thr íle Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr íle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly íle Gly Asn Gly Thr Gin íle Tyr Val íle Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225
230
235
240
Val Leu Thr Val Leu 2 45 His Gin Asp Trp Leu 250 Asn Gly Lys Glu Tyr 255 Lys
Cys Lys Val Ser 260 Asn Lys Ala Leu Pro 265 Ala Pro íle Glu Lys 270 Thr íle
Ser Lys Ala 275 Lys Gly Gin Pro Arg 280 Glu Pro Gin Val Tyr 285 Thr Leu Pro
Pro Ser 290 Arg Asp Glu Leu Thr Lys 295 Asn Gin Val Ser 300 Leu Thr Cys Leu
Val 305 Lys Gly Phe Tyr Pro 310 Ser Asp íle Ala Val 315 Glu Trp Glu Ser A.s n 320
Gly Gin Pro Glu Asn 325 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Val Leu Asp 335 Ser
Asp Gly Ser Phe 340 Phe Leu Tyr Ser Lys 345 Leu Thr Val Asp Lys 350 Ser Arg
Trp C-ln Gin 355 Gly Asn Val Phe Ser 360 Cys Ser Val Met His 355 Glu Ala Leu
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 <210> 14 <211> 1152 <212> DNA < > Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104EA29Wlg <400> 14 atgagtgtac agcat ggcca ggcatcgcta acagtgcttc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attgatccag acatccccac ccaaaaccca gacgtcagcc cataatacca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcaaccgg ttcctctaca tgctcacaca gcatggcaat gctttgtgtg ggcaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc cgtccccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tagtcaaagg agaacaacta gcaagctcac gaggacgctg gcacgtggcc tgagtatgca cagccaggtg agatgattcc actgagggcc atactacgag agattctgat acctgaactc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgaagtct atctgcacag atggacacgg ggcataggca caggagccca ctggggggat cggacccctg ttcaactagt cagtacaaca aatggcaaag accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc tccttgcact tagtactggc aatggactga gtgcggcaac gcacctccag gactctacat acggaaccca aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg agtacaagtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggagaa cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtgcaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcaaccccga ccaggtcagc ggaaagcaat cggctccttc cgtcttctca
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga
1140
1152 <210> 15 <211> 383 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: L104EA29Wlg <40O> 15
Met 1 Gly Val Leu Leu 5 Thr Gin Arg Thr Leu 10 Leu Ser Leu Val Leu 15 Ala
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly íle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Trp Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser íle Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr íle Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr íle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Glu Gly íle Gly Asn Gly Thr Gin íle Tyr Val íle Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 17 0 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
24 5 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro íle Glu Lys Thr íle
260 265 270
Ser Lys Al a Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 280 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 330
<210> 16 <211> 636 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16
atgggrgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60
agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120
ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga cgtccgggtg 180
acagtccttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct ctgcggcaac ctacatgatg 240
gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300
gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360
gagctcstgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420
attgatccag aaccgtgccc agattctgac ttcctcctct ggatccttgc agcacctagt 480
tcggggttgt ttttttatag ctttctcctc acagctgttt ctttgagcaa aatgctaaag 540
aaaagaagcc ctcttacaac aggggtctat gtgaaaatgc ccccaacaga gccagaatgt 600
gaaaagcaat ttcagcctta ttttattccc atcaat 636
<210> 17
<211> 212
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met G1 y Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu .Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro 20 Ser Met Ala Ser Met 25 Al a Met His Val Ala 30 Gin Pro
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly íle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 75 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser íle Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr íle Gin Gly Leu A.rg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr íle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Leu Gly íle Gly Asn Gly Thr Gin íle Tyr Val íle Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp íle Leu Ala Ala Val Ser
145 150 155 160
Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser
165 170 175
Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys
180 185 190
Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe
195 200 205 íle Pro íle Asn 210 <210> 18 <211> 1152 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: CTLA4lg <400> 18 atgggtgtac tgcrcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga acagtacttc ggcaggctga cagccagatg actgaagtct gtgcggcaac gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgc gcacctccag gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga cctgtttcca SO cagcagccga 120 ggtccgggtg 180 ctacatgatg 240 tggaaatcaa 300 ctgcaaggtg 360 gatttatgta 420 caaaactcac 480 acčtccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcítcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggaccg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaocg ggtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccggataaat ga 1152 <210> 19 <21L> 383 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>
<223> Opis umelej sekvencie: CTLA4lg <400> 19
Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Al a
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gin Pro
20 25 30
Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly íle Ala Ser Phe Val Cys Glu
35 40 45
Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg
50 55 60
Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met
65 70 7 5 80
Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser íle Cys Thr Gly Thr Ser
85 90 95
Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr íle Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp
100 105 110
Thr Gly Leu Tyr íle Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr
115 120 125
Tyr Leu Gly íle Gly Asn Gly Thr Gin íle Tyr Val íle Asp Pro Glu
130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His
145 150 155 160
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val
165 170 175
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met íle Ser Arg Thr
180 185 190
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu
195 200 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
210 215 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 230 235 240
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
245 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ue Glu Lys Thr íle
260 265 270
Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro
275 250 285
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu
290 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp íle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
340 345 350
Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
355 360 365
His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375 380 k výmeru zo dňa 26.11.03

Claims (7)

PATENTOVÉ NÁROKY
1 1
ACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGTGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC +4 62
T—s—P--P--S —P—A~~P~~E~~L~~L~~G~~G-~S—S—V—F-~L-~F—P— +154
CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG +522 p—k—p—k—D—T—L—M—I — S—R—T—P—E—V— T—C—V—V—V— +174
GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG +582
D—V—S—H—E— D--P—E—V—K—F—N—W— Y—V— D--G--V—E—V— +194
CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTÄCCGGGTGGTCAGC +642
H—N—A—K—T—K— P—R—E—E—Q—Y—N—S—T—Y—R—V—V—S— +214
GTCCTCACČGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC +702
V—L—T—v—l—H—Q—D--W—L—N—G—K—E—Y—K— C—K—V— S— +234
AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAÄGCCAAAGGGCAGCCCCGA +762
N—k—A—L--P—A—p—1—e—K—T—I—S—K—A—K—G—Q—P—R— +254
GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCÄAGAACCAGGTCAGC +822 E—p—q—V—v—T--L—P—P—S—R— D—E—L—T—K—K—Q—V—S— +274
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT +882
L~~T—C—L—V—K—G~~F~~Y—P—S—D—I—A—V—E—W--E—S~~N~~ +294
GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC +942 G—γ--Κ-~Τ-~Τ-~Ρ—P—V—L—D—S—D—G—S—F— +314
TTCCTOTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA +1002
F—L—Y—S—K—L~~ T—V— D—K—S—R—W—Q—Q—G—N—V--F—S— +334
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT +1062
O_S„V—M--H—E—A--L—H~~N—H—.Y—T—Q—K—S—L—S —L—S-- ' +354
CCGGGTAAATGA P~~G—K—*
Obr. 2 4
M 1 23 12 3M
Obr.
1-1-1-!-1-1-i-1-1-r rH rH rH rH rH
Aioupoq íeAOisipoqoÄA po npipzou ueuieud
1/ Z / Z
ZZ2 ľZZZJ
Placebo CTLA.5 CTLA2 CTLA10 LEA.5 LEA 2 LEA 10 “ΤΟ “ΤΟ so
Aoiueioed % /g/52
Percentuálne zníženie koncentrácií CRP v deň 85 v porovnaní s východiskovou hodnotou
50 Ί
25% zníženia
-25-50
Liečebné skupiny
Obr. 7A /7/ft
Rozdiely v redukcii CRP vzhľadom na placebo (95% intervaly spoľahlivosti v deň 85) ra l-SF (SI-1 ra ra ra
E
CM ra m
rS § 8 ° θ 8 3
V *7 ip>|npej λ npipzoj %
1. Použitie prvého činidla alebo druhého činidla, pričom
a) prvým činidlom je solubilné CTLA4 molekula obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 molekuly, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách, a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept a anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, na výrobu farmaceutickej kompozície na konkomitantné alebo sekvenčné podávanie prvého činidla s druhým činidlom na blokovanie B7 interakcií s CTLA4 a/alebo s CTLA4 a/alebo CD28.
.2 o
£
O >><
>
TJ o
O
Δ '3 v>
o >
deň kontroly obr· 9 A
23/si
Ä}oupoq íeAo^sipoqoÁA po n|dipzoj ueipaui deň kontroly
3br. 9B
Ájoupoq ίθΛοηειροηολΛ po npipzoj ueipeiu deň kontroly
Obr, 10A
CTLA — opuch kĺbov — medián rozdielu od východiskovej hodnoty kontroly
Ápupoq foAOjSipoqoÄA po npipzoj ueipeui λ J2 — .2 r* tú 73 Z3 Pt o w u
Bil
CTLA — hodnotenie bolesti — priemer rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly
7/52.
CTLA - hodnotenie aktivity ochorenia pacientom - priemer rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly
Äjoupoq feAoijsipoqoÄA po nieipzoj jeuiaud
Z &/S2CTLA - hodnotenie aktivity ochorenia lekárom - priemer od východiskovej hodnoty deň kontroly
I-1--T-1-1-ľ— r cm oo xo Φ cm o d ó d d
Ä}oupoL| feAO^sipoqoÄA po ηιθιρζοι jauieud o
X
S j2 « o CS Ή
Λ CS ω v
Bil
LEA — citlivosť kĺbov - medián rozdielu hodnoty deň kontroly
LEA - citlivosť kĺbov - medián rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly
-2°/s2.
priemerná zmena od východiskovej hodnoty placebo ctia .5 ctia 2 ctia 10 lea .5 lea 2 lea 10
Obr.. 7C ip/3tn .2/ /$2.
priemerná zmena od východiskovej hodnoty placebo ctia .5 ctia 2 ctia 10 lea .5 Iea 2 Iea 10 Obr. P jui/Sad
2Z/CZ.
jg ¢3 Oj Λ r“ -vj T3 P=! u o ϋ
ΙΦΗ >>
O c
TJ o
o >
o
x.
-2./52.
Placebo CTLA.5 CTLA 2 CTLA 10 LEA .5 LEA 2 LEA 10 Celkom N-32 N==26 N=32 N=32 N=32 N=29 N=31 N=214 vn cs,
S un sP ox en
CS en
Ch •X eh
OO cs
OS o^ »—< m \»y
O sp ©x
CS x»z
ON
Vh
S'f eh
OS
T·^ »sZ
Ό
Q) >
ra x:
o
Q.
S vo u~> rv® rrv-z
S
CS x
ch
Os
SO <_>
O cs x
ch cs h~, m
CS x®
Os
VO
X-Z
CS
CS
CS t-en es s:
m oo s_^
CS
CS 'x ch so cs r-l · OO -šf m *2 ° <s M3
T .—I r~ oo cs _ —m ι/S oš o —i m
Ch
CO tn os OS r—* r- oo o o CS vo <s od CS en un r··· 4 vo r—t OS
os so oo cs rh O cs n °® t- ό cn oo cs s©
CS m
vn <r>
rf VO cs vo ď T m so rh cs so ττ «—1
Os CS ___.
2 ’T CN en
CN vo tn _ CN _ —· cn · O · cn rácn
OV x?
oOO
CN x-x
Os en en o
s© ©N oo es o
Os v?
©^
0Ί x© ď*
Os r—»
X-Z
Ό >N a
s φ
>
ro x:
o
0.
x» θ'Os
VO
O
CN x° θ'CN rm <N x?
θ'Ov
VO
CN
CN v©
OO >?
en o
Ν' cn cn £
s=r oo 2/ žrn -r i- ° os —: cn m
CO in
CN
O N
NO rx?
crOs
-»-x.
Os
CN x?
cien x° θ'vo
-~x
CN
CN t''; en m
CN
Γ vo o in x?
onOS o
en x° <sx en x?
Qen
CN vien ρτη
CN en
S
x° o- CN x? en •si z—X x© ©^ . n x? ο- Λ X° ~ X—, ^s s? ?„ Ό 5? OXí In 2 o tn Os O Ό s_^- X-Z es s^/ w-h en CN o cn o CN M o
£ st··· G' x—» x° n cs- m oo oo 00 o tfs CN g; “t £ Ss . -<J- ľt oo S^z x-z X—Z p-*. ^,S—'53 v-' es es en es O en in ~ oo N Z^s x~s x-s _ xp «** X© ©*· z-x x© £ Ss i? í? F*^ o“- ©x οΰ N g o° en,^,2 ° 00 Os Ό O X^Z X—z X-z -_x vo O es o cn vo ° es en
nl tí
Φ >co es 00 cn en r-í ô \o
Ό CN CN en <N rt 04 o (n
CN <N en m
CN en θ
tn
ro ro c i_ Λ! 0 W > -. o ° n 9£ 2 2 r- k- Φ E Φ Φ -ro CN «? h; ω ,. ’u. CQ >O JZ V Ν«ί A Z Q.
tí >5 (0
Cfi (0
Cŕ ro
Φ c Φ ra C ro l_ O ω c Φ H Jtí o o c ro č u. O JZ o H o
>s o
2. Použitie prvého činidla alebo druhého činidla, pričom
a) prvým činidlom je solubilné CTLA4 molekula obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 molekuly, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách, a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho, kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, /’/· M /M náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03 blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, na výrobu farmaceutickej kompozície na konkomitantné alebo sekvenčné podávanie prvého činidla s druhým činidlom na liečenie ochorenia imunitného systému.
3>7 /á!.
ATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCA Μ—G~“V~~L~~L-'-T~~Q--~R~rT—L—L-'-S--L—V~~L—A'-L'-L—F—P~~
AGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGA S—-M—A—M—H—V—A—Q—P—A—V~~V—L~~A~~S—S~~R— + 1
GGCATCGCTAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTG G— I— a—S-~F~-V-~C~~E—Y~~A~~S—-P—G-~K~~A~-T-~E~~V—R—V-ACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATG T—V—-L~~R—Q-~A--D~-S-~Q~~V-— T—E~~V~~C~~A— A—T~~Y—
GGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAA G_~N,^E^~L~~T—F—L~-D~~D-~s~~i—c~~t~~g--~t~s~~s~-g~~n~~q~~
GTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTG V--N--L—T~~I—Q—G—L—R—A—M— D-~T~~G~-L~~Y——V-GAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACGAGGGCATAGGCAACGGAÄCCCAGATTTATGTA E—L—M—Y—P—P—P—Y—Y—E—G—I~~G~~N—G—T—Q—I--Y—V—
ATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAÄCTCAC I~_D__p-~E~-P--C~-P—D—S—D—Q~~E~~P~-K~~S—S—D~~K~~T-~H-~
ACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC T—g—p—p—s—P—A—P—E—L—L—G—G—S—S—V—F—L—F~~P—
CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG P—K—P—K—D—T—L—M--I—S—R—T—P~~E~~V—T--C—V—V--V—
GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG D~~V—s—H—E—D—P—E~~V—K—F—N—W~~Y-~V~~D—G—V—E—V—
CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGGAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC H—N—A—K--T—K—P—R—E—E—Q—Y—N—S—T—Y—R- -V—V—S—
GTCCTCÁCCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC V—-L—T—V'-~L~~H—Q—D—W—L—N—G—K-~E~~Y-~K~-C~~K~~V~~S—
AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA N—K—A—L—P—A—P—I— E-~K—T—I—S—K—A—K—G—Q—P—R—
GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGC E—P—Q—V—Y—T—L—p~~p~~S—R—D—E—L—T—K—N—Q—V—3—
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAČATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT C~^L^V—K—G—F—Y—P—S—D—I—A—V—E—W—E—S—N—
GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC G~~Q—P—E—Ň—N—Y-—K—T—T·—P—P—V—L·—D—S—D—G—S—F—
TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA p—L—Y—s-~K—L—T—V—D—K—S—R—W—Q—Q—G—N—V—F—S—
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT C»S»V—M—H—E—A—L—H—N—H—Y—T—Q—K—S—L—S—L—S— +42 +14 +102 +34 + 162 + 54 +222 + 74 +282 +94 +342 +114 +402 +134 +4 62 +154 +522 + 174 +582 +194 + 642 +214 +702 +234 +762 +254 +822 +274 +882 +294 +942 +314 + 1002 +334 +1062 +354
CCGGGTAAATGA P—G—K—*
Obr. Ig
ATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTČAGTCTGGTCCTTGČACTCCTGTTTCCA -19
Q—R~~T~~ L->L~~S—L—V-~L~~A-~L—L—-F—P—- -7
AGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGA +42
S—m~-a~~M-~H~~V~~A~~Q~~P~~ A—V—V~~L~~A~~S—-S—R— -+14 + 1
GGCATCGCTAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAATATACTGAGGTCCGGGTG +102
G—I—A—S — f~~V~C~E~~Y-~ A~~S~-P~-G-~K~-Y—t—E—V—R—V~~ +34 acagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctaCatgatg +162 t—E~~V—C— a—a—t—y—M—M~~ +54 gggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaa +222 G-.~N~~E~~I,—T—F—L—D—D—S—I—C—T—G—T—S—S—G—N—Q— +74
GTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTG +282
V—N—L—T— I—Q—G—L—R—A—M—D—T—G—L—Y—I—C—K—V— +94
GAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACGAGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTA +342 y~~p—ρ—ρ—γ—γ—Ε—G—I—G—N—G—T—Q—I—Y—V— +114
ATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCAC +4 02
I —D—p~~E-~p~-C~~P~~D~~S—D—Q—E—P—K—S—S—D—K—T—H— +134
ACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC +4 62
T~-S—P—P—S —P—A—P—E—L—L—G—G—S—S—V—F—L—F—P— +154
CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG +522
P —K—P—K—D—T—L--M—I — S—R—T—P—E—V—T—C—V—V—V— +174
GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG +582
D——P-.-E—v—K—F—N—W—Y—V—D—G—V—E—V— +194
CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC +64 2
H—n—A—K—T—K—P~~R~~E~~E—Q-~Y~-N~-S~~T-~Y—R—V-~V~~S~- +214
GTCCTCACCGTCCTGCÄGCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC +702
V—L—T—V—L—H—Q—D—W—L—N—G—K—E—Y—K—C—K—V—S— +234
AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA +762
N—K—A—L—P—A—P—I—E—K—T—I—S—K—A—K—G—Q—P—R— +254
GAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTČAGC +822
E—p—q—V—Y—T—L—P—P—S—R—D~~E—L—T—K—N—Q—V—Š— +274
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT +882 v—K—G—F—Y—P—S~D—I®--A—V—E—W—E—S—N— +294
GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTC +942
G—Q— P—E—N—N—Y—K—-T—T—P—P—V— L—D—S—D—G—S—F— +314
TTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC A +1002
F—L—Y—S—K—L—T—V—D—K—S—R~~W—Q—Q—G—N—V—F—S— +334
TGČTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT +1062 C-~S—V—M—H—E—A—L—H—N—H—Y—T—Q—K—S—L—S—L—S— +354
CCGGGTAAATGA p~~G—K—*
Obr. “j Q y? /rz
ATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGC'PGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTQTTTCCA Η“0—VL·· Ii“T‘0R'”T'L·''L'-'S-'-L^-Ar L'-A“-L'-Ij ?-?·AGCATQGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGC'I'GTGG'TÁCTGGCCAGCAGCCGA
SM*-A““S“M,'A“'K'‘'K-’V‘'AťQ-P-”A’*VV“Ľ“A‘'“S““S'-'R-GGCATCQCŤAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAGGCAAATTGACTQAGGTCCGGGTG
G“-I_A‘”B‘-'F'V'C'E'y'AS''-p-Q-KĽT'S-'’VR--VACAGTGCTTCGGGAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACArGATG T—v—b-.-R—Q”A-'D-S—Q—V— T-'E““V“-C'“A'’“A-“T-Y-H--'M-gggaatgagttgacct^gtagaťgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaa
G· N'“2b· T’“?--L-D—D’8'“I'C''T”~GT'S''’S”'G’M”O·'gtgaäcctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctqcaaggtg
V—N“ “b“'T I'Q-G - “L-“R“ “A“M-“D-“T“'G“ “b* Y“ “ I C ~'X* “V ·
GAGCTCATGTACCCAČCGCCATACTACGAGGGCATAGGCAACGGAAČCCAGATTTATGTA Bb'M· -γ.—p—p—p—γATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATČTTCTGACAAAACTCAC X—D—p—p—C“-p—D“-'e-“D-Q““E“-p“'K--S“-S””D--X--TH
ACATCCCCÁCCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGQGGGGÁTCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC
T-“S--p--p*S““P“''A-“P,'Bb-b-G”G'“’S''“S’*V''F”b’-F--p-CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG p-,.K-,p--K—D--T—ίι--Μ--Ι--3--Λ--τ--ρ-»Β—V--/£>--c“-V-V--V-GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG D— y--S“-K““E’“D‘'PE““V'“K“F“'N“-W'“Y’V'“D““GV-EV'-CATAATGCCAAQACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCQTGTQQTCAGC H--N--A“K“”T-'X''P-“R””E--B--Q-Y-“N—Β·τ--γ’-Κ“-ν—V'-S'GTCCTCACCGTCCTQCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTtC V-bTV—b’H--Q--D-“W-L-N“O--X-E''-Y-’K-C-’K--V--S-AACAAAGCCCTCCCAGCCCČCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA N’K’“AIi'P’A?I'E--X--r—I--S~K”A—K-’G-“Q--P-’R”
GAACCACAGGTGTACACČCTGCCCCCATCCCGGGATaAGCTGACCAAQAACCAGGTCAGC E--p—Q—v“YTb’-p“p-’8“R—D—E'-L'-T'-K -N'-QVS“CTGACCTGCrtGGTCAAAGGCTŕCTATCCCAGCGACÄTCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT b— T“ C—b”“V--K—G— P“' Y--P’-S“-D-’I--A“-V‘-E--W--E“-S--X-GGGCAGCCGGAGAACAACÍACAAGAČCACGCCTCCCGTGCTGGAGTCCGACGGCTCCTTC
G—Q”P’B'”N“N-YXT'T”P','P““V“Ľ“D''S'D”G’S’-r-TTCCTCTACAGCAAGéTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA F--L--Y--S—K’'b—r“-V—D—K'-S-’R-’W-'Q—Q-'G--N-VP” S '’ TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC?
CCGGGTAÁATGA p--G—K--* —-
Obr.. 20
ATGGGTG7ACTGCTCACACAÍ3ACGACGCTGC7CAG7CTGG7CC77GCACTCCTG77TCCA MG“~Vb“L TQ R_“TL-LS—L“ “Y “L—A—L—L—r“'p_
AGCArGGCGAGCArGGCAATGCACGTGGCCCAGCC7GC7G7GQ7ACTGGCCAGCAGCCGA □GCATCGCTAGCTTTGTGTGTQAQTATGCATCTCCAGGCAAAACTACTOAQGTCCGGGTG
GXA”SF''V*C”2‘'“Y*-AS''P-G-K”T-'’T_BV''R—V-ACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGrGCGGCAACCTACATGATG TV’b'R-.'Q’A’''D'‘S‘'Q'“V“T''B''V—C'’A‘A_T’'Y_*M“M'
GGGAATGAG77GACCTTCC7AGATGATTCCATCTGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAA G--N-~B~L~T~F~L“L -D“-S—Ι“Ό'-Τ—G-T—S-'S-'G-K-Q
GTGAACCTCAC7ATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACQQQACTCTACATCTGCAAGOTG γ--Ν--1<—7--I““Q-G-L--R--A~M~D--T~-G~L“-Y~ I“C''X'V“·
GAGC7CATG7ACCCACCGCCATAC7ACGAGGGCA7AGGCAACGGAACCCAGA7T7AŤGTA E--L--M—y--p““p—P“'Y““Y“-E—C—ľG-lí-a—T’Q--I‘Y—V ATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAÁTCrrCTGACAAAACTCAC p--D—s--d--q—g--p--K—S--S--D--K--T—H-ACATCCCCACCGTCCČCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC T--S-“PP“S—P— A--P“~B-L--L--G--GS’-S-”V--F“L-Í--PCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTČCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG7GGTGGTG P-K—PK--Ď—7—L—MI—S“'R—T—P--E—VT-'C—V’-V”Vgacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg
D--V--S—H--E--D—P-E--V--K--P—Jí-”W—Y”V”’D-G—V-'E”V-CATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG7ACCGTGTGGTCAGC H-N-A-K--T--K—P--RB”B--0Y--N—STYR-V”VS-GTCCTCACCGTCC7GCACCÄGGACTGGCTGAÄ7GGCAAGGAC7ACAAGTGCAAGGTCTCC V'L T—V -L-H-“QD--W“-I/--NG--K--E--Y--K''C--K-V--S-AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAÄCCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA N--K—A—I.--P—A—P--I—B--K—T—IS—K—A—KG—Q--p—R-QÁAČCACAGGTGTACACCCTGGCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGQTCAGC E-p--Q—VY—T“ Ij-’P--P”“S--R“-D—B--L”TK--N-Q--V--S“ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat LT-“C—L—V--K—G--F—Y—p—5—D—í—AV'BWSS--N” gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc G—Q--p—L'D“-SDG'-S'F'ttcctctacagcaagctcaccgtggací-agagcaggtggcagcaggggaacgtcttctca jr--t,--Y--fi“K~ L—T-'V-D-'K S--R—W--Q--Q--G--N—Vp-'S tgctccgtgatgcatqaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct c-.s.-v--m-_h--e—A—l--H--K-'HY—T--Q--K“-S--L--£L--S
CCGGG7AAATGA...................... ................— P-GK—.......................................-...........
Obr. 2 1
ATtxsrrOTACTacTCAČACAaAGaAcacTOcicAczivic<7iOTiTaau7iccTOnTrccx M”G—V-Ii”!,—7-Q—R““7—1,—r,--S“L--V“-D—A—L—ϋ““ρ—p — ÁGCÁTGGCGAGCATGGCAA7GCACGTGGCČCAGCC7GCTGTGG7ACTGGCCAQCAGCCGA
GGCATCGCTAGCTTTGTGTGTGAGTATGCATCTCCAQaCAAÄ'IGGACTGAGGTCCGGGTG G““I’A“S”F—Y“”C'-'B—ľ-“A“S“-P““Q—X““W“”T--?—ν”^“?—
ACAGTGC7TGGGCAGGCTGACAGCCAGG7GAC7GAAG7CTGTGCGGCAACCTACATGATG 7V—L““H“-O“-A-“D—S-“Q--*V-“T—B—V“”CA~“A’“T“ V MM
GGGAATGAGT7GÁCCTTCCTAGATGA7TC0ATC7GCACGGGCACC7CCAG7GGAAATCAA a—N—B—L““T—D—S^'I-“C—T—G—T—S—S--0N0
GTGAACCTCACTATCCAAGOACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTG ν--Ν--ι--φ--Ι—0”O—L—R--A—M““D—T“σ”-Ι,--γ—I””C’“K—V’ GAGCTCATGTACCCACCGCCKTAC7ACGAGGGCA7AGGCAACGQAACCCAGATTTATGTA j, —P-Y—Y—g—a —i~-Q--N-0—T-Q-,r—γ—yATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTGAČ p._C--j,--D--s—D--Q-“s—p--K--S--S—D“K—-T’-H'”
ACATGCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGATCGTCAGTCTrCCTCTTCCCC t—s'-p'-p—s-“í“A—ρ--Β--ι,’-η-α'-α-5—S'-v—p--G--p--p-*
CCAAAACCČAAGGAČACCCTCATGATCTCCCOGACCCCTGAGOTCACATGCOTGGTGGTG P.—X p-X-'-D''T''ťM--I 'S--R“T'-p”-B-“V”T“-C~V-”V—V
GACOTGA0CCACGAAGACCCTGAGQ7CAAGTTCAAC7GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTG D'“V—S-“H-V““K “P“ “K“ ”W—Y—V’“D—G-’V“ B—VCATAATCCCAAGACAAAGCCGCGCGAGGAGCAGTACAACAOCACGTACCGTaTGGŤCAGC H'“Ň-’A—XT‘X'''PRB“B“-Q“'Y-“N-’S,7'-Ý—R'-V“V'-e·GTCCTCACCGTČC7GCACCAGGAC7GGC7GAA7GGCAAG3AGTACAAGTGCAÄGGTC7CC V— L* T 0 -Í> W“ “L N“ G ~ ’X2“ Y-X'C* K” “V— S
AACAAAGCCCTÚCCAGCCCCCATCaAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGA Ν--κ-~λ—ι,'-ρ--Α·—Ρ'Ί—2“Κ—K““A—XG-’Q’-P—R gaaccacaggtgtacaccctgčccccatcccgggatgagctoaccaaqaaccaggtcagc y—T —J,—p—S—R —JJ—S—
CTGACCTGCCTGa'KlAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGGCGTGGAGTGaaAGÄGCÄÄÍ
GGGCAGCCGQAGÁACAACTACAÄGACCACGCCTCCCGTGCTQGACTCCGACGGCTCCTTC ¢- Q—p—g—r'UY’K'T'T,-P-Pr-V—L—D“'S',D*'GSr
TTCCrCTACAGCAAQCTČACCGTOGACAAGAGČAGGŤGGCAGCAGGGGAACGTC'TTCTCA ?—1,—y—S”X’'I/—T—V—D—Xg—R—W'“Q—Q—Q—UV?—5—
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTCTCT C—s—y—M—U—2—A—h—H—y—7—Q—X—S—L—S—L--SCCGGGTAAATGA..............................-........-........
P“'G—X—*”“'.................,...........-................
Obr. 2 2 /2./52.
signálny peptid onkostatínu M
M G V L L T Q R T L L S L V L ATG GGT GTA CTG CTC ACA CAG AGG ACG CTG CTC AGT CTG GTC CTT . 45 -i I +í A L L F P. S M A S M. A1 M H V A GCA CTC CTG TTT CCA AGC ATG GCG AG C ATG GCA ATG CAC GTG GCC 90 Q P A v V L A S S R G Ϊ A S F CAG CCT GCT GTG GTA CTG GCC AGC A^GC CGA GGC ATC GCC AGC TTT 135 V C E Y A S P G K A T E V R v GTG TGT GAG TAT GCA TCT CCA GGC AAA GCC ACT GAG GTC CGG GTG 180 T V I» R Q A D S Q V T E V C A ACA GTG CTT CGG CAG GCT GAC AGC CAG GTG ACT GAA GTC TGT GCG 225 A T Y M H G N E L T F L D D S GCA ACC TAC ATG ATG GGG AAT GAG TTG ACC TTC CTA GAT GAT TCC 270 I C T G T 5 S G N Q V N L T r ATC TGC ACG GGC ACC TCC AGT GGA AAT CAA. GTG AAC CTC ACT ATC 315 Q G L R A M . D T G D Y I G. K V CAA GGA CTG AGG GCC· ATG GAC ACG GGA CTC TAC ATC TGC AAG GTG 360
GLYCOSYLATION SITE
B L M Y P P P Y Y L G I g In G GAG —4—, CTC ATG TAC CCA CCG CCA TAC TAC CTG GGC ATA GGC AAC GGA 405 n Q I Y V I D P E ? C P D S D ACC CAG ATT TAT GTA ATT GAT CCA GAA CCG TGC CCA GAT TCT GAC 450 F L L W I' L A A V 5 S G L F F TTC CTC CTC TGG ATC CTT GCA GCA GTT AGT TCG GGG TTG .TTT TTT 495 Y .5 F L L T A V S L S K. M L K ŤAT AGC TTT CTC. CTC ACA GCT GTT TCT TTG AGC AAA ATG CŤA AAG 540 X R s P L t· T G Y Y V . K M P P AAA AGA AGC CCT CTT ACA ACA GGG GTC TAT GTG AAA ATG CCC CCA 585 T E P. E c E K Q F Q .P Y F I P ACA GAG CCA GAA TGT GAA AAG CAA TTT CAG CCT TAT TTT ATT CCG 63 0
I H ATC AAT
638
Obr. 23
V 3/^2.
ATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCA -19 M~~ G~~ V——1** 1(--7-- Q— -R-—T——L——E——S——jj——V——li-—A——L—— L— — F——p——
AGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTGGCCAGCAGCCGA +42
S—M--A—S—M—A—M—H--V—A—Q-~P~~A~-V—V—L—A--S—S--R— +14 +1
GGCATCGCTAGCTTTGTGTGTGÁGTäTGCATCTCCAGGCAAAGCCACTGAGGTCCGGGTG +102
G—I—Ä—S—F—y~_c-~E~~Y~·-A—S—P—G—K—A—T—e—v—r—V— +34
ACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGGTGACTGAAGTCTGTGCGGCAACCTACATGATG +162
T— V—L—R—Q— A—- D—S— Q— v—T—E—V—C—A—A—T—Y— M—M— +54
GGGAATGAGTTGACCTTCCTAGATGATTCCATCrGCACGGGCACCTCCAGTGGAAATCAA +222
G—N—E--L—T—F—L—D—D—S—1—C—T—G—T—S—S—G—N—Q— +74 'GTGAACCTCACTATCCAAGGACTGAGGGCCATGGACACGGGACTCTACATCTGCAAGGTG +282
V— Q--G—L--R—A—M--D--T—G--L--Y—I--C--K—V— +94
GAGCTCATGTACCCACCGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCAGATTTATGTA +342
E—L—M—Y—P— P— P~~ Y~~Y—L~~ G— I—G—N—G—T—-Q—+114
ATTGATCCAGAACCGTGCCCAGATTCTGATCAGGAGCCCAAArCTTCTGACAAAACTCAC +4 02 j__D„p~_E—P~~C~~P~~ D—s — D—Q—E— P—K— S — S — D—K—T —H— +134
3^/3-2.
LEA - hodnotenie aktivity ochorenia lekárom — priemer rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly
Äjoupoq (eAO^sipoqoÄA po AOiaipzoj jauiaud
Percentuálne zlepšenie v HAQ v deň 85 v porovnaní s východiskovou hodnotou
Liečebné skupiny
Obr.. -J7
3/Az.
LEA -opuch kĺbov - medián rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly br· 14A [—-1 i i : i I I T
TfdOOOOTfriO
W W
Äjoupoq íäACDjsipoqoÄA po npipzoj ueipetu
3Λ/^2LEA - opuch kĺbov - medián rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly
Äioupoq íeAO>|S!poqoÄA po npipzoj jeiueud
33/5-2.
LEA - hodnotenie bolesti - priemer rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly
Äioupoq feAo^sipoqoÁA po npipzoj jeiueud
0) 1-t « JS J3 .S χ* ’C ’C Z3 £-i u u o
LEA hodnotenie aktivity ochorenia pacientom - priemer rozdielu od východiskovej hodnoty deň kontroly >r· 16A
'3 liečebné skupiny
7/sz o o o rs m t~ Č
-< <5
Q 0 □
ACR odpoveď v deň 85 ipaAodpo o)U93jad
3A
ACR odpoveď v deň 85 s 95% intervalmi spoľahlivosti liečebné skupiny
Obr. 3B
Rozdiel v ACR odpovedi v deň 85 (95% intervaly spoľahlivosti) ffi ffi .Srngŕkg 2mc/kg 10mc/kg .5mg/kg 2mg/kg 10mg/kg
8 8 Š S ° 5? ?
ipaAodpo oiuaojad /o/$i
Základná (20%) klinická odpoveď v počte opuchnutých a citlivých kĺbov
SP ď*· >5 o CS o CS Λ v ω TJ c φ φ > >w o Q. Q- Φ o N O S □
Aojueioed % ///5-2.
Klinická odpoveď v deň 85
Placebo ctia .5 ctia 2 ctia 10 lea .5 lea 2 /2-/5Z zmeny skóre bolesti od východiskovej hodnoty o
φ· o
m
Placebo CTLA.5 CTLA2 CTLA10 LEA .5 LEA 2 LEA 10
Aoiueioed % /3/5-2.
c o
L.
O x
o c
Φ
E
N 'Φ
Φ o c -+-» o c T3 Q. O 3 x ** ôľ M ’$* N Ό > O 0 x t o Φ > X T3 □ O .x ω .2 u_ Ό 'X o ω c Ό >» c © Q) n E c N
Aojuaioed %
Placebo CTLA.5 CTLA2 CTLA 10 LEA .5 LEA 2 LEA 10 re zmeny skóre od východiskovej hodnoty
Aojuoioed %
Placébo CTLA.5 CTLA2 CTLA10 LEA.5 LEA2 LEA 10
7C/S2Bolesť (zmeny od východiskovej hodnoty)
AOiueped %
Placebo CTLA.5 CTLA 2 CTLA 10 LEA .5 LEA 2 LEA 10 /6/^2.
. CM _ cm V λ ,5í co 22 <d >ω c ίω ;ô5
Q.
Q)
Celkové hodnotenie pacientom - zmeny aktivity ochorenia od východiskovej hodnoty ω
Aojuoioed %
Placebo CILA .5 CTLA2 CTLA10 LEA .5 LEA 2 LEA 10
Celkové hodnotenie lekárom - zmeny aktivity ochorenia od východiskovej hodnoty
r~^~7~ / s / i P ZV 'Z' 7 '7Ύ S 7 ÍZl \~7 7 V 7^'7 JZy r > fXľ^š ZJ nrz <7 ΕΛ/^Ζ
ry Ζ7 ///? £/ +
3/5~2,
Placebo CTLA .5 CTLA 2 CTLA 10 LEA .5 LEA 2 LEA 10 Celkom 't ΙΛ)
CN cn O _ *n so cn o os 'T oo <N tn O
CN 't cn rn o
CM en m
Ol vn oo n ó so tct vo CN rn Ô
CN m m o
CN W-j cn <n
CN «n
CN vn
CM
CM cn in
CN in cn r“<
CN o
cn
Os
CN
CN cn
CM cn
CM cn vo
CN
CN m
oô vd m cN m
o\ cn
Os
O xt vo tr cn CN
VO
CN
O
CN o
O Ό ·—· cn ·—‘ oo CN oš ·η· CN CN cn vo m
Os c<
CM
VO. Tŕ c—í C**.* Tľ CM
CN vn cn cn cn xť
M
Os oo
Os
Os cn cn oo tŕ _ ~ oo m S td
Os
CN cn vd
OO
N
CN cn oo
CM cn oo ~ ™ tn cn <o <d oo
CN cn m
o
CN r-t O
Ó 90 d n- xjcn cn cn
Cts
OO oo
O
CN vo
CN xt
CN oo
CM
VO
CM _ CN m m r~~ in cn m cn cn —·
OO
CN
OO
Xt
Xľ vo m
cn cn _ ’l t o m oo Os cn o
CN cn
CN cn
VO rn cn oo xf vo
M cn
CM oo rn c2
XT cn oo os >n cn cn
N
O
Os
VO
CN oo cn
CN xí- >o cd cn — CN —1
CN cn co vd 'T tn oo
CN cn vo tn
CN xr
CN
1_ <D U. ω CD Φ . £ „ * ω _ -S e .92 .S S ω .S g -9> 5 Š q; oo S S ŽÍ w SS ZíSSS Z Q- S 2 2
ro >
'C j>e <
ro c
φ >_ o
-C u
o ‘CS
Φ (Λ 'S .s >5 ‘O ω
O i-l
CN ' OJ X o Ž
N T R Td °' cn CN m <—i oo
SO tJ- °s l-< —M tS
O O OO --i —< in ir, oo rs ρί c
K) o
i-l »H
H
3. Použitie solubilnej CTLA4 molekuly, kde solubilná CTLA4 molekula obsahuje extra celulárnu doménu CTLA4 molekuly, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách, na výrobu farmaceutickej kompozície na podávanie jedincovi solubilnú CTLA4 v množstve približne od 0,5 do 100 mg/kg hmotnosti jedinca, 0,5 mg/kg hmotnosti jedinca, 2 mg/kg hmotnosti jedinca, 10 mg/Kg hmotnosti jedinca, približne od 0,5 do 10 mg/kg hmotnosti jedinca alebo približne od 0,1 do 20 mg/kg hmotnosti jedinca, na blokovanie B7 interakcie s CTLA4 a/alebo CD28.
4-βΜΕ -βΜΕ
Obr.
O
CM
Obr.
čas (min.)
Priemerná intenzita fluorescencie Priemerná intenzita fluorescencie
Obr. 27 A
Fúzny proteín (pg/ml) <*>*.. 27B /7/.S7.
Inkorporácia Ή tymidínu (cpm) Inkorporácia 3H tymidínu (cpm)
CD86 CHO + PMA kostimulácie obr- 28 A
CD80 CHO + PMA kostimulácie
-o- L104EA29YIg CTLA4Ig
-Δ- kontrola
Fúzny proteín (pg/ml) obr . 28B /8/5-2.
Inkorporácia 3H tymidínu (cpm) Inkorporácia 3H tymidínu (cpm)
29A
Qbr. 29B
-IFN (pg/ml) IL-4 (pg/ml) IL-2 (pg/ml) ¥7 λ.
L104EA29Ylg
CTLA4íg kontrola
Obr .i 30 A
Obr. 30B
800
600
400
200
4. Použitie solubilnej CTĽA4 molekuly, kde solubilná CTLA4 molekula obsahuje extracelulárnu doménu CTLA4 molekuly, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách, na výrobu farmaceutickej kompozície na podávanie jedincovi solubilnú CTLA4 v množstve približne od 0,5 do 100 mg/kg hmotnosti jedinca, 0,5 mg/kg hmotnosti jedinca, 2 mg/kg hmotnosti jedinca, 10 mg/kg hmotnosti jedinca, približne od 0,5 do 10 mg/kg hmotnosti jedinca alebo približne od 0,1 do 20 mg/kg hmotnosti jedinca, na liečenie ochorenia imunitného systému.
<5 , · _; m srq so CS cs so
ΤΓ w—1 ch rCS U · cs SO m *2 -- cs so rf ·—·
Í2 V5 oo ΓΊ ch O _ sn o; h rh d
CS u-.
CS vs
CS l/-) oo oo
CS · · oo V->
cn <Js cs ττ os
VO W—í fsj 0Ί OO en O cS «ΖΊ cs m
<xj VO OS m rn o es un
Γ-. Tlcs X o £ m cs ττ m ch t— .—I
N Ch m m O cs Uh
SO cs
Ό h ‘Ώ —* vri i—í
O Q *-4 ° os vn cs íh cs’ ch sd oo r~ -- s- ch >s o
e
ra ω u. ω c E .s cä E Q) >N z * CL •o CO s s Q)
rs os ch rh O
CS Ch ζέ (U >
Ό
CZ)
w o ro ro ’c Φ tí ,gj C z—\ Μ-» u. ’u í O E Ď£ e ’> M—· Jíí O -C o tí x < o
5. Použitie podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, kde solubilnou CTLA4 molekulou je CTLA4 fúzna molekula obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 molekuly, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách pripojených k non-CTl_A4 molekuly, ktorá obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá mení solublitu alebo afinitu solubilnej CTLA4 molekuly.
6=1 Ž •J co os £ £ sj cn -4
CN Os —< cn
Ol oš ,_ cn :> n ch ó m v» cn cn o
O t< oô Ό m· m τφ sn i-< n-—i cn —* os
C w X ·—! z _ en _
On ' rM cn f\J o ΓΠ r—' kQ
ΓΠ *“*
OS v> o o (X 00 — No cn oo CN ch O cN cn cn m
25 o cn o S
NO ir,
CN < 7 w 'Z h-) Ä
Ό
CN J- CN CN --. cn £ - -4 CO 'Ώ co o so
OO ff*)
CN Ό. n °® (s.
£ £ ol «n cn m O
O\ ·—I n 6 h c S cn so m cn g
Demografický opis - ochorenie <1
U
B*
U
CN cn
CN <
Ί-J
H
U
CN tn o
jacN
S á ž
Cn n- co
CN ľ· / CN OO m Os Tt- so
CN —1 t~~ t~~ n DL· o » <n CN CN ,-, m
CN 1—1 cn •n r^oš ch cn n- n- m
CN · »Λ n N — cn oo so _, Os ct _ CN -O -<·, Ό »—« <
(N cn
VY cn cn so <n rh o
CN cn
CN —4 _ £j *n cn wn cí cn ij- o
CO ^ °°· Nrs N N — SO cn ——'
S 7 3 S2 3
ΓΌ t .S ŽŠ so
Ό 2; «η o cn CN 22 Ό ' cn
CN 5 O O i-c cn <^ί ·—1 *-· vr
CM ”2 1 CO .s ä s s so N CN rh
SO cn «n cn so Oho CN -m OCN <n o
<=5
CN m cn m o *Ω _ o \O v-ι X <n w-> cm cn >Q »3 _. .S S fc “ U n C. CZ) nZ xS .3 _, .S 3 3.SSS
+» (Λ _ O Φ 0 ? 3 3 Ό w T «φ > 3 O Ω.Π -X _Φ >o c +4 Λ JĽ Ο'Ξ £ 0 2 ». o ω 42. c re Q£
φ c
Φ >
φ
E
N .3
B
o JSeí Tf rH CN z-s s® ©s O, O II O z O
rs í?
g S CS
CS VO ^ŕ sp
O''
OO i/-j m
S ° o o r· *“*. s*-<z as
CN
CN co ςς — 00.
£s m ry < II W £ >J s° ox
O rn s“ oX
O o
x= os
O os, oo
CN s® θ'O λ—s m
s?
ox m
CN
Os ccx m
CN
NCN x?
ox t>
rwn
CN m
CN
OS < 7 h A j z
Os o rs o rs roo rs rs oo s® ©v m
oo ^ŕ rs rcn oo rs ©'S m
x cr
VO
OO vo rs sp ós *4 CN
7P
Demografický opis - predchádzajúce liečenie ◄
j
H
U
CN m
II
OS (S
C l-l
H
U
CN m
II
Z,
N o>
O
x© 5S s® X—“N N= rs m ŽS o o m o'’* tn rs^ so oo ©s ΠΊ o^· tT ss tT rs OO 00 CN ^3 r- rs x—\ xO S? Z-\ xO S? rs ΠΊ žs O o wn r*· s«z ©s tn rs. *—* oo ©v. Os ©^ oo Tt rs oo vo CS VO r**· CS
x® o'
SO <»»« tn s® ox vo vn 'x
P!
m o x
qs oo so
CN x® ox
Os so sp ox r«M vo
CS ©s
Os
Os
CS
X—\ s© s“ X^X S' oo o^· S® ©S ©s •*ší- r» rs Λ\.ί as 2^ 2ľc 'n—'' Cn s»_z tn r>«. □s m o rs k rs m
OS
SO
CN
V) «4
J
H
U
so Z*S \P X—s >® s® £s χ—·X O' X**S l θ'** O O Ό CN ©s tn 2 °°: o rs wn t—C <-Z 00 00 m fS rs »~«c m
s® ζρ
O o CN O x> do rΓΧ, o
CN sp
CT“
Os
S-x*
VO sP oS
OS
X □s m
CN,
Ό β
Λ CN
g) **s s'»’
- z
CL,
x*\ iS e o £< o cn o tfs OJ tx rn CN z—s x ox oo CN s_^ Os z~\ ©V* t **s OO OO rs oS* m θ'* r** m m í? m s—✓ ox N oo tx CN o c < Φ z O C '< <D Z o c < Φ 2 O c < Φ O C -<
Šb
VS <D
Z
Áno 30(94%) 22 (85%) 29(91%) 30(94%) 31(97%) 29 29(94%) 200 (100%) (93%)
Nie 2(6%) 4(15%) 3(9%) 2(6%) 1(3%) 0(0%) 2(6%) 14(7%)
CL v
u h
« ň
a tí
NU
X ω
L.
+J
O ♦J o
.φ c
>
o ó
k w
ó
V3 ň
CO
Z s® c
< OĹ LU Φ < c Φ >w _J u. o -J -C < N □ 0 □
W
Ημν,κ ίθΛΟΗΙθο ojuaojad %
Ύ>.
% « % %>.
<ä Λ. % \Λ <3.
'-» O %. % Λ
Ύλ x:
6. Použitie podľa nároku 5, kde aminokyselinová sekvencia, ktorá mení solubilitu alebo afinitu, obsahuje imunoglobulinovú časť.
náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03
7. použitie podľa nároku 6, kde imunoglobulinovou časťou je imunoglobulinový konštantný región alebo jeho časť.
8. Použitie podľa nároku 7, kde imunoglobulinový konštantný región alebo jeho časť je mutovaná na redukciu efektorových funkcií.
9. Použitie podľa nároku 6, kde imunoglobulinová časť obsahuje jednu alebo viacej mutácií na redukciu efektorových funkcií.
10. Použitie podľa nároku 7, kde imunoglobulinový konštantný región obsahuje pantové, CH2 a CH3 regióny imunoglobulinovej molekuly.
11. Použitie podľa nároku 5, kde CTLA4 fúznou molekulou je CTLA4lg.
12. Použitie podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, kde solubilnou CTLA4 molekulou je solubilné CTLA4 mutantná molekula, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách a zahŕňa mutáciu v extracelulárnej doméne CTLA4 molekuly.
13. Použitie solubilnej CTLA4 alebo druhého činidla , pričom
a) solubilné CTLA4 je CTLA4lg začínajúca metionínom v pozícii+1 alebo alanínom v pozícii -1 a končiaci lyzínom v pozícii +357, ako je ukázané na obr. 24 a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03 na výrobu farmaceutickej kompozície na konkomitantné alebo sekvenčné podávanie tohto solubilného CTLA4 s druhým činidlom na liečenie ochorení imunitného systému.
14. Použitie solubilnej CTLA4 alebo druhého činidla, pričom
a) solubilná CTLA4 obsahuje extracelulárnu doménu CTLA4 molekuly, ako je znázornené na obr. 23, začínajúcu metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končiaci asparágovou kyselinou v pozícii+124 a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, na výrobu farmaceutickej kompozície na konkomitantné alebo sekvenčné podávanie tohto solubilného CTLA4 s druhým činidlom na liečenie ochorenia imunitného systému.
15. Použitie solubilnej CTLA4 alebo druhého činidla, pričom
a) solubilná CTLA4 je CTLA4 mutantná molekula, ktorá sa viaže na B7 molekulu, obsahujúcu mutáciu v pozícii +104 CTLA4, kde lecitín v pozícii +104, ako je znázornené na obr. 23, je substituovaný kyselinou glutámovou a mutáciu v pozícii +29 CTl_A4, kde alanín v pozícii +29, ako je znázornené na obr. 23, je substituovaný tyrozínom, a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03 hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, na výrobu farmaceutickej kompozície na konkomitantné alebo sekvenčné podávanie tohoto solubilného CTLA4 s druhým činidlom na liečenie ochorenia imunitného systému.
16. Použitie solubilného CTLA4 alebo druhého činidla, pričom
a) solubilné CTLA4 je L104EA29Ylg začínajúca metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končiacu lyzínom v pozícii +357, ako je ukázané na obr. 19 a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, na výrobu farmaceutickej kompozície konkomitantného alebo sekvenčného podávania tohto solubilného CTLA4 s druhým činidlom na liečenie ochorenia imunitného systému.
17. Použitie podľa nároku 2, 4, 13, 14, 15 alebo 16, kde ochorením imunitného systému je ochorenie reumatické.
18. Použitie podľa nároku 17, kde reumatickým ochorením je reumatická artritída.
19. Použitie podľa nároku 2, 4, 13, 14, 15 alebo 16, kde ochorenie imunitného systému je vybrané z autoimunitných ochorení, imunitných ochorení súvisiacich s reakciou štepu pri transplantácii, psoriázy, T-lymfocytárneho lymfómu, Tlymfocytárnej akútnej lymfoblasickej leukémie, testikulárneho angiocentrického Tlymfocytárneho lymfómu, benígnej lymfocytárnej angiitídy, lupus erytematosus, náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03
Hashimotovej tyroiditídy, primárneho myxedému, Gravesovej choroby, perniciosnej anémie, autoimúnnej atrofickej gastritídy, Addisonovej choroby, inzulín dependentného diabetes mellitus, Goodpasteurovho syndrómu, myasténia gravis, pempigus, Crohnovej choroby, sympatetickej optalmie, autoimúnneho uveitis, roztrúsenej sklerózy, autoimúnnej hemolytickej anémie, idiopatickej trombocytopénie, primárnej biliárnej cirhózy, chronickej hepatitídy, ulceróznej colitídy, Sjogrenovho syndrómu, reumatického ochorenia, reumatoidnej artritídy, polymyozitídy, sclerodermie, zmiešaného ochorenia spojivového tkaniva, zápalového reumatizmu, degeneratívneho reumatizmu, extraartikulámeho reumatizmu, kolagenózy, chronickej polyartritidy, psoriazis artropatica, ankylosujúce spondylitídy, juventilné reumatoidné artritídy, panarteriitis nodóza, systémového lupus erytematodes, progresívnej systémovej sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondrokalcinosis, dermatomyozitídy, svalového reumatizmu, myozitídy a myogelozis.
20. Použitie podľa nároku 1, 2, 13, 14, 15 alebo 16 na podávanie jedincovi solubilnej CTLA4 v množstve medzi približne 0,5 a 100 mg/kg hmotnosti jedinca.
21. Použitie podľa nároku 1, 2, 13, 14, 15 alebo 16 na podávanie jedincovi solubilnej CTLA4 v množstve 0,5 mg/kg hmotnosti jedinca.
22. Použitie podľa nároku 1, 2, 13, 14, 15 alebo 16 na podávanie jedincovi solubilnej CTLA4 v množstve 2 mg/kg hmotnosti jedinca.
23. Použitie podľa nároku 1, 2, 13, 14, 15 alebo 16 na podávanie jedincovi solubilnej CTLA4 v množstve 10 mg/kg hmotnosti jedinca.
24. Použitie podľa nároku 1, 2, 13, 14, 15 alebo 16 na podávanie jedincovi solubilnej CTI_A4 v množstve medzi približne 0,5 a 10 mg/kg hmotnosti jedinca.
25. Použitie podľa nároku 1, 2, 13, 14, 15 alebo 16 na podávanie jedincovi solubilnej CTLA4 v množstve medzi približne 0,1 a 20 mg/kg hmotnosti jedinca.
100 náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03
26. Použitie solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly obsahujúcej sekvenciu znázornenú na obr. 19, počínajúci metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii 1 a končiaci kyselinou asparágovou v pozícii +124, na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie ochorenia, ktoré je vybrané z autoimunitných ochorení, imunitných ochorení súvisiacich s reakciou štepu pri transplantácii, psoriázy, Tlymfocytárneho lymfómu, T-lymfocytárnej akútnej lymfoblastickej leukémie, testikulárneho angiocentrického T-lymfocytárneho lymfómu, benígnej lymfocytárnej angiitídy, lupus erytematosus, Hashimotovej tyroiditídy, primárneho myxedému, Gravesovej choroby, perniciosnej anémie, autoimúnnej atrofickej gastritídy, Addisonovej choroby, inzulín dependentného diabetes mellitus, Goodpasteurovho syndrómu, myasténia gravis, pempigus, Crohnovej choroby, sympatetickej optalmie, autoimúnneho uveitis, roztrúsenej sklerózy, autoimúnnej hemolytickej anémie, idiopatickej trombocytopénie, primárnej biliárnej cirhózy, chronickej hepatitídy, ulceróznej colitídy, Sjogrenovho syndrómu, reumatického ochorenia, reumatoidnej artritídy, polymyozitídy, sclerodermie, zmiešaného ochorenia spojivového tkaniva, zápalového reumatizmu, degeneratívneho reumatizmu, extraartikulárneho reumatizmu, kolagenózy, chronickej polyartritídy, psoriazis artropatica, ankylosujúcej spondylitídy, juventilnej reumatoidnej artritídy, panarteriitis nodóza, systémového lupus erytematodes, progresívnej systémovej sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondrokalcinosis, dermatomyozitídy, svalového reumatizmu, myozitídy a myogelozis.
27. Použitie solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly L104EA29Ylg, obsahujúcej sekvenciu znázornenú na obr. 19, počínajúc metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končiac kyselinou asparágovou v pozícii +357, na výrobu farmaceutického prostriedku na liečenie ochorenia , ktoré je zvolené z autoimunitných ochorení, imunitných ochorení súvisiacich s reakciou štepu pri transplantácii, psoriázy, T-lymfocytárneho lymfómu, T-lymfocytárnej akútnej lymfoblastickej leukémie, testikulárneho angiocentrického T-lymfocytárneho lymfómu, benígnej lymfocytárnej angiitídy, lupus erytematosus, Hashimotovej tyroiditídy, primárneho myxedému, Gravesovej choroby, perniciosnej anémie, autoimúnnej atrofickej gastritídy, Addisonovej choroby, inzulín dependentného diabetes mellitus, Goodpasteurovho syndrómu, myasténia gravis, pempigus, Crohnovej choroby,
101 náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03 sympatetickej optalmie, autoimúnneho uveitis, roztrúsenej sklerózy, autoimúnnej hemolytickej anémie, idiopatickej trombocytopénie, primárnej biliárnej cirhózy, chronickej hepatitídy, ulceróznej colitídy, Sjogrenovho syndrómu, reumatického ochorenia, reumatoidnej artritídy, polymyozitídy, sclerodermie, zmiešaného ochorenie spojivového tkaniva, zápalového reumatizmu, degeneratívneho reumatizmu, extraartikulárneho reumatizmu, kolagenózy, chronickej polyartritídy, psoriazis artropatica, ankylosujúce spondylitídy, juventilné reumatoidné artritídy, panarteriitis nodóza, systémového lupus erytematodes, progresívnej systémovej sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondrokalcinosis, dermatomyozitídy, svalového reumatizmu, myozitídy a myogelozis.
28. Použitie podľa nároku 26 alebo 27, na liečenie reumatického ochorenia.
29. použitie podľa nároku 26 alebo 27 na podávanie jedincovi solubilnej CTLA4 mutantnej molekuly v množstve medzi približne 0,5 a 100 mg/kg hmotnosti jedinca, 0,5 mg/kg hmotnosti jedinca, 2 mg/kg hmotnosti jedinca, 10 mg/kg hmotnosti jedinca, medzi približne 0,5 a 10 mg/kg hmotnosti jedinca alebo medzi približne 0,1 a 20 mg/kg hmotnosti jedinca.
30. Použitie podľa nároku 11 alebo 13, kde CTLA4lg je kódovaný molekulou nukleovej kyseliny s označením ATCC č. 68629.
31. Použitie podľa nároku 16 alebo 27, kde L104EA29Ylg je kódovaný DNA sekvenciou s označením ATCC PTA-2104.
32. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým , že obsahuje farmaceutický prijateľný nosič a účinné množstvo prvého činidla a druhého činidla, pričom
a) prvým činidlom je solubilná CTLA4 molekula obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 molekuly, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách, a
b) druhé činidlo je zvolené zo súboru obsahujúceho kortíkosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón,
102 náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03 azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, inflixímab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxichlorochin, sulfasalazopryín, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid.
33. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že solubilné CTLA4 je CTLA4 fúzna molekula obsahujúca extracelulárnu doménu CTLA4 molekuly, ktorá sa viaže na B7 antigén exprimovaný na aktivovaných B bunkách pripojených k non-CTLA4 molekuly.
34. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že solubilná CTLA4 obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá mení solubilitu alebo afinitu CTLA4 molekuly, pričom aminokyselinová sekvencia, ktorá mení solubilitu alebo afinitu, obsahuje imunoglobulinovú časť.
35. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 35 (doslovná citácia), vyznačujúca sa tým, že imunoglobulinovou časťou je imunoglobulinový konštantný región alebo jeho časť mutovaný na redukciu efektorových funkcií.
36. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že solubilná CTLA4 zahŕňa extracelulárnu doménu CTLA4, ktorá začína metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končí kyselinou asparágovou v pozícii +124, ako je ukázané na obr. 24.
37. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že solubilná CTLA4 molekula je CTI_A4lg začínajúca metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končiaca lysínom v pozícii +357, ako je ukázané na obr. 24.
38. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že solubilná CTLA4 je solubilná CTLA4 mutantná molekula začínajúca metionínom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končiaca kyselinou asparágovou v pozícii +124, ako je ukázané na obr. 19.
103 náhradná strana k výmeru zo dňa 26.11.03
39. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 32, vyznačujúca sa tým, že solubilná CTLA4 je solubilná CTLA4 mutantná molekulou L104EA29Ylg, začínajúca metioninom v pozícii +1 alebo alanínom v pozícii -1 a končiaca lyzínom v pozícii +357, ako je ukázané na obr. 19.
40. Farmaceutický kit na blokovanie B7 interakciou s CTI.A4 a/alebo CD28, ktorý obsahuje účinné množstvo činidla vybraného zo súboru obsahujúceho prvé činidlo, druhé činidlo a ich kombinácie, na konkomitantné alebo sekvenčné podávanie tohoto prvého činidla s druhým činidlom, vyznačujúci sa tým, že
a) prvým činidlom je solubilnáCTLA4 molekula a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxichlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid.
41. Farmaceutický kit na liečenie ochorení imunitného systému, ktorý obsahuje účinné množstvo činidla vybraného zo súboru obsahujúceho prvé činidlo, druhé činidlo a ich kombinácie, na konkomitantné alebo sekvenčné podávanie tohto prvého činidla s druhým činidlom, vyznačujúci sa tým, že
a) prvým činidlom je solubilná CTĽA4 molekula a
b) druhé činidlo je vybrané zo súboru obsahujúceho kortikosteroidy, nesteroidné protizápalové lieky, prednizón, azatioprin, metotrexat, blokátory alebo antagonisty TNF-alfa, infliximab, akékoľvek biologické činidlá ovplyvňujúce protizápalový cytokín, hydroxichlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid.
//52Placebo CTLA.5 CTLA 2 CTLA10 LEA .5 LEA 2 LEA 10 Celkom
X© tn O ζ—\ x© «X /-x xp rt\ ©^ z“x x$ θ'* CS 0Ί 1—4 «X <S SO ín OS 2L V> x—z en S“ tN en n- vn r-H r- x_z os x^ OS ' r-1 X-Z X-Z CO Ό Ό C\ 'S Ν' VD N- s© Z*—s x? en z—x x? ď* x© z—V z-x XP X© ©X ©s Cp ©^ en CS, fn tn Γ- ΟΟ so so »n os m en k? m s—/ x—z X—Z fS xJz r- N CN r- <s es es i—* es t*·* r-
7-IFN
-o- L104EA29YIg CTLA4Ig
-£t- kontrola .1 I nilllj LLLUlllj t I Uliilj I ι i .[
0.0001 0.001 0.01 0.1 1 Fúzny proteín (pg/ml)
L104EA29Y]g
CTLA4Ig kontrola obr- 30C
Inhibícia proliferácie opičích T- lymfocytov indukovanej PHA
Inkorporácia 3H tymidínu (cpm)
Rovnováha väzby na CD86lg
O)
CM
CO (na) .peAOdpo :·:···~ ->.' -γ·..: :<*/' · >7 ··<·
s.· rs·.? . ι· · ΐ ; ··.; ·;: Ť;'·'·:-;/.·;·::····;'·
-'t '
ΎΊ'ΤΤ
). .'•' •ί··
-ď....
•L.:/ ýľV'r '-// '.·· ; ?i:w·?’ «·*^χ?··.:·:'.> :.·'· .:.·., ·*:
ymyϊ.'·'Λ'.·>·>:...· ;·Γ··.η -·.<
. .. . ··.·. ... '.. -* li* . *”.·-· ’·.· ľ ·*'·’)·.·'·* << Pi,./·'·>'.·'.· .· -.ž*··.··? . ľ·?·.';.’·.' · %
r. . ' v .·’ ·:* ·; ··:? <:'··'· ·4. ·;
ΤΛΤΑ,· << -.y/((ί.
**·*: ·.* .Z; ·« -r <.:·· ··.··’.·«·· ^ ·.'
ΆΗ'Η'::· - : V' Vy
'.v.· „ · Á' .·. '.í;
••.f'i·*'-· í. .··'·· · . ·.···.' '·. '*··': .· ·. · -.·♦
XÁw & --:-·;·· ν·'ϋ·:’-'iL-uZíA' ' '-s*· *;· * .·-·' r * ··'···· · -. <· · h-v i μ·..ϊ7 ‘ Z-b-'s. · .< ’ ·*'ί,ϊ·' ·*<Λ'* .*
X
0}
Φ <n
I
UJ
DhBE b to co «r N c βψρω
OL
P>(/flwz
Βψβιο
SO
Btypui
Βχ/OUJZ βχ/βω
TO oqaaaicj
D>
’·. <·· .‘i.·· ·.·’. ·.'·:
' * ··' ·:·.· ···.· ú:.;ÝV/T:; · i ··.-z λ- . ,· · “·.-.v'·/'*'ΐ mVyyy··/('(i:·-T ' (|lu/6u) Äioupoq teAOžjsipoipÁA po euauiz euieuieud
-··: * -· .· ' ' - - ·- · .· (|ui/Bu) Äjoupoq ľaAO>fsipoqoÄA po eueiuz eujeuieud
SK1774-2002A 2000-07-03 2001-07-02 Soluble CTLA4 fusion molecule, pharmaceutical composition comprising thereof and its use SK287940B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21591300P 2000-07-03 2000-07-03
PCT/US2001/021204 WO2002002638A2 (en) 2000-07-03 2001-07-02 Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK17742002A3 true SK17742002A3 (sk) 2004-11-03
SK287940B6 SK287940B6 (sk) 2012-05-03

Family

ID=22804919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1774-2002A SK287940B6 (sk) 2000-07-03 2001-07-02 Soluble CTLA4 fusion molecule, pharmaceutical composition comprising thereof and its use

Country Status (39)

Country Link
US (1) US7455835B2 (sk)
EP (4) EP1372696B1 (sk)
JP (1) JP2004517806A (sk)
KR (3) KR20030017606A (sk)
CN (1) CN1318086C (sk)
AR (2) AR035037A1 (sk)
AT (1) ATE401909T1 (sk)
AU (2) AU2001273174B2 (sk)
BG (2) BG66024B1 (sk)
BR (1) BR0112104A (sk)
CA (2) CA2413190C (sk)
CY (3) CY1109786T1 (sk)
CZ (1) CZ303959B6 (sk)
DE (1) DE60135029D1 (sk)
DK (2) DK1935427T3 (sk)
EE (1) EE05378B1 (sk)
ES (2) ES2667203T3 (sk)
HK (1) HK1058486A1 (sk)
HR (1) HRP20030071B1 (sk)
HU (3) HU227669B1 (sk)
IL (2) IL153593A0 (sk)
IS (1) IS2834B (sk)
LT (2) LT1935427T (sk)
LV (1) LV12993B (sk)
MX (1) MXPA02012603A (sk)
MY (1) MY137552A (sk)
NO (3) NO20026264L (sk)
PE (1) PE20020772A1 (sk)
PL (2) PL212205B1 (sk)
PT (2) PT1372696E (sk)
RS (1) RS50811B (sk)
RU (1) RU2287340C2 (sk)
SI (3) SI1935427T1 (sk)
SK (1) SK287940B6 (sk)
TR (1) TR201807700T4 (sk)
TW (2) TWI322153B (sk)
UY (1) UY26815A1 (sk)
WO (1) WO2002002638A2 (sk)
ZA (1) ZA200210058B (sk)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
EP0892643B2 (en) * 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
UY26723A1 (es) * 2000-05-26 2001-12-28 Bristol Myers Squibb Co Moléculas mutantes de ctla4 solubles y usos de las mismas
KR20030007899A (ko) * 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
TWI322153B (en) * 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PL204899B1 (pl) 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4
WO2003088991A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating an autoimmune disease using a soluble ctla4 molecule and a dmard or nsaid
WO2004058800A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
ES2354610T5 (es) * 2002-12-23 2020-09-14 Bristol Myers Squibb Co Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
BRPI0413326A (pt) * 2003-08-04 2006-10-10 Bristol Myers Squibb Co métodos para tratar doença cardiovasculares empregando-se uma molécula ctla4 solúvel
AU2004287431B2 (en) 2003-10-27 2010-03-11 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
US7815765B2 (en) * 2004-04-01 2010-10-19 Swei Mu Wang Method for forming laminated synthetic leather
US9309316B2 (en) 2005-12-20 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
PL2253644T3 (pl) * 2005-12-20 2014-04-30 Bristol Myers Squibb Co Kompozycje i sposoby wytwarzania kompozycji
CN101822820A (zh) * 2005-12-20 2010-09-08 布里斯托尔—迈尔斯斯奎布公司 稳定蛋白质制剂
US7528111B2 (en) * 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
GB0620934D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
AU2014250683B2 (en) * 2007-11-01 2015-11-26 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
EP2612868B1 (en) * 2007-11-01 2018-08-15 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
AU2012202324B2 (en) * 2007-11-01 2014-08-28 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) * 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
US8475790B2 (en) 2008-10-06 2013-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of CD137 antibody and CTLA-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
EP2365823B1 (en) * 2008-10-30 2016-11-30 Yeda Research And Development Company Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
EP2459251B1 (en) 2009-07-30 2014-03-12 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CN102030828B (zh) * 2009-09-25 2014-10-29 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体
CN103038251B (zh) * 2010-02-19 2016-08-17 Xencor公司 新颖ctla4-ig免疫粘附素
KR20130049775A (ko) 2010-03-12 2013-05-14 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. Ｃｔｌａ４ 단백질 및 이의 용도
US9527912B2 (en) 2010-05-17 2016-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
CA2810631A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
CN103282047B (zh) 2010-09-08 2016-08-24 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
WO2013010537A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
CN103930130B (zh) 2011-09-08 2016-07-06 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
MX2015000237A (es) 2012-06-27 2015-08-14 Orban Biotech Llc Proteinas de fusion ctla4 para el tratamiento de la diabetes.
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2014151230A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating granulomatosis with polyangiitis
CN104740608A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 上海中信国健药业股份有限公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗类风湿性关节炎药物的用途
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
AU2015249656A1 (en) * 2014-04-25 2016-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Use of CTLA4 compound for achieving drug-free remission in subjects with early RA
KR20240046641A (ko) 2015-04-17 2024-04-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 조율가능한 친화성을 갖는 면역조절 단백질
CA2991690A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory t cells and use of same in immunotherapy
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
MA43552A (fr) 2016-04-15 2018-11-07 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices à variants de cd80 et leurs utilisations
CN110392736A (zh) 2017-01-18 2019-10-29 耶达研究及发展有限公司 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
MA50360A (fr) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices de variants de ctla-4 et leurs utilisations
KR20200085777A (ko) 2017-10-18 2020-07-15 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 변이체 icos 리간드 면역조절 단백질 및 관련 조성물 및 방법
EP3765065A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
WO2019175384A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3765064A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
AU2020208909A1 (en) 2019-01-15 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mutated interleukin-34 (IL-34) polypeptides and uses thereof in therapy
WO2023112992A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 レグセル株式会社 免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644792A (en) * 1899-09-14 1900-03-06 Stanhope Boal Heater.
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3424893A1 (de) 1984-07-06 1986-02-06 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen Photographisches silberhalogenidaufzeichnungsmaterial
US6905680B2 (en) * 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
CA2003455C (en) * 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US7070776B1 (en) * 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5580756A (en) * 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
DE122007000078I2 (de) 1991-06-27 2011-01-13 Bristol Myers Squibb Co CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5770197A (en) * 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5624823A (en) * 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection
JPH07508711A (ja) 1992-04-07 1995-09-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン Ｃｄ２８経路免疫調節
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
ATE293686T1 (de) 1993-06-04 2005-05-15 Us Navy Verfahren zur selektiven stimulierung der t- zellproliferation.
AU7107794A (en) 1993-06-10 1995-01-03 Regents Of The University Of Michigan, The Cd28 pathway immunosuppression
WO1995006481A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Trustees Of Dartmouth College Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance
RU2141318C1 (ru) * 1993-12-01 1999-11-20 Санкио Компани Лимитед Ингибитор образования воспалительного цитокина, средство для профилактики и лечения воспалительных заболеваний пищеварительного тракта и синдрома бехчета, способ профилактики и лечения воспалительных заболеваний и язвенного колита
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
AU1333195A (en) 1994-06-03 1996-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
AU2701895A (en) 1994-06-07 1996-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
US5634055A (en) * 1994-09-27 1997-05-27 Bidplus, Inc. Method for selecting assignments
WO1996014865A1 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Repligen Corporation Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5824655A (en) 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US5993800A (en) * 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
EP0892643B2 (en) * 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
JPH1067653A (ja) * 1996-06-17 1998-03-10 Eisai Co Ltd 関節疾患治療剤
US6495579B1 (en) * 1996-12-02 2002-12-17 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Method for treating multiple sclerosis
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
ZA98533B (en) 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
CA2291338A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive t lymphocyte mediated immune responses
EP0947524A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
PT1066060E (pt) * 1998-04-03 2003-12-31 Osiris Therapeutics Inc Celulas estaminais mesenquimais como imunossupressores
CA2333726A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-09 Supergen, Inc. Compositions comprising methotrexate and pentostatin for treating rheumatoid arthritis
JP2000086519A (ja) * 1998-09-17 2000-03-28 Mitsui Chemicals Inc 抗リウマチ薬効果増強剤
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
US6040292A (en) * 1999-06-04 2000-03-21 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating diabetes
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
AU2001264936A1 (en) 2000-05-23 2001-12-03 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
UY26723A1 (es) * 2000-05-26 2001-12-28 Bristol Myers Squibb Co Moléculas mutantes de ctla4 solubles y usos de las mismas
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
KR20030007899A (ko) * 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
TWI322153B (en) * 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PL204899B1 (pl) * 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4

Also Published As

Publication number Publication date
EP1372696B1 (en) 2008-07-23
HRP20030071A2 (en) 2005-02-28
CY2008017I1 (el) 2009-11-04
YU101102A (sh) 2006-01-16
HUS1000008I1 (hu) 2019-06-28
RU2287340C2 (ru) 2006-11-20
EP1935427A2 (en) 2008-06-25
HRP20030071B1 (hr) 2014-01-03
EP1935427A3 (en) 2011-05-25
CY1120577T1 (el) 2019-07-10
US7455835B2 (en) 2008-11-25
IL153593A0 (en) 2003-07-06
WO2002002638A3 (en) 2003-10-30
KR20080075564A (ko) 2008-08-18
LT2003002A (en) 2003-07-25
SK287940B6 (sk) 2012-05-03
ATE401909T1 (de) 2008-08-15
BR0112104A (pt) 2004-07-20
KR100895552B1 (ko) 2009-04-29
TW200902546A (en) 2009-01-16
CZ303959B6 (cs) 2013-07-17
EP3384924A1 (en) 2018-10-10
CN1477968A (zh) 2004-02-25
HUP0301727A2 (hu) 2003-09-29
TWI311564B (en) 2009-07-01
DK1372696T3 (da) 2008-11-03
KR100864120B1 (ko) 2008-10-16
SI1935427T1 (en) 2018-05-31
HK1058486A1 (en) 2004-05-21
AU2001273174C1 (en) 2002-01-14
PT1372696E (pt) 2008-10-24
BG66454B1 (bg) 2014-10-31
CZ20024261A3 (cs) 2004-08-18
LT1935427T (lt) 2018-05-10
SI1372696T1 (sl) 2008-12-31
EP2281568A2 (en) 2011-02-09
KR20080025216A (ko) 2008-03-19
SI21078A (sl) 2003-06-30
EE05378B1 (et) 2011-02-15
ES2310557T3 (es) 2009-01-16
CA2413190A1 (en) 2002-01-10
NO20100579L (no) 2003-02-19
AR035037A1 (es) 2004-04-14
PE20020772A1 (es) 2002-09-06
US20030083246A1 (en) 2003-05-01
NO20100580L (no) 2003-02-19
LT5063B (lt) 2003-11-25
EP1372696A2 (en) 2004-01-02
KR20030017606A (ko) 2003-03-03
DK1935427T3 (en) 2018-06-06
PT1935427T (pt) 2018-05-16
CY1109786T1 (el) 2011-04-06
WO2002002638A2 (en) 2002-01-10
DE60135029D1 (de) 2008-09-04
IS2834B (is) 2013-05-15
TR201807700T4 (tr) 2018-06-21
CN1318086C (zh) 2007-05-30
AU7317401A (en) 2002-01-14
LV12993B (en) 2003-10-20
MXPA02012603A (es) 2003-05-14
CY2008017I2 (el) 2016-08-31
EP1935427B1 (en) 2018-03-07
JP2004517806A (ja) 2004-06-17
PL207534B1 (pl) 2010-12-31
AU2001273174B2 (en) 2006-05-18
HUP0301727A3 (en) 2008-08-28
IL153593A (en) 2009-09-01
BG107362A (bg) 2003-09-30
MY137552A (en) 2009-02-27
CA2413190C (en) 2009-04-07
CA2630062A1 (en) 2002-01-10
BG66024B1 (bg) 2010-11-30
EE200300004A (et) 2004-10-15
ZA200210058B (en) 2005-02-23
HU227669B1 (en) 2011-11-28
CA2630062C (en) 2014-10-14
RS50811B (sr) 2010-08-31
IS6667A (is) 2003-01-02
TWI322153B (en) 2010-03-21
ES2667203T3 (es) 2018-05-10
PL365942A1 (en) 2005-01-24
HU226847B1 (en) 2009-12-28
EP2281568A3 (en) 2013-04-24
NO20026264L (no) 2003-02-19
PL212205B1 (pl) 2012-08-31
BG110611A (bg) 2010-05-31
NO20026264D0 (no) 2002-12-27
UY26815A1 (es) 2002-01-31
AR066511A2 (es) 2009-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2413190C (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
JP4328525B2 (ja) 可溶性ｃｔｌａ４突然変異体分子およびその用途
CA2447921C (en) Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble ctla4 mutant molecules
AU2001273174A1 (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule
KR20070119728A (ko) 가용성 ｃｔｌａ4 돌연변이체 분자를 이용하여 이식편이식과 연관된 면역 장애를 치료하는 방법
DK1536234T3 (en) SOLUBLE MUTANT CTLA4 MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF

Legal Events

Date Code Title Description
SPCF Filing of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: ABATACEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/07/389/001 - EU/1/07/389/003 20070521

Spc suppl protection certif: 5019-2012

Filing date: 20120913

SPCY Application to extend an spc

Free format text: PRODUCT NAME: ABATACEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/07/389/001 - EU/1/07/389/003 20070523

Spc suppl protection certif: 5019-2012

Filing date: 20160620

SPCG Grant of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: ABATACEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/07/389/001 - EU/1/07/389/003 20070523

Spc suppl protection certif: 274 5019-2012

Filing date: 20120913

Extension date: 20220523

SPCZ Extension of validity of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: ABATACEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/07/389/001 - EU/1/07/389/003 20070523

Spc suppl protection certif: 274 5019-2012

Filing date: 20160620

Extension date: 20221123

MK4A Patent expired

Expiry date: 20210702