HU227669B1 - Use of soluble ctla4 mutants - Google Patents

Use of soluble ctla4 mutants Download PDF

Info

Publication number
HU227669B1
HU227669B1 HU0900660A HUP0900660A HU227669B1 HU 227669 B1 HU227669 B1 HU 227669B1 HU 0900660 A HU0900660 A HU 0900660A HU P0900660 A HUP0900660 A HU P0900660A HU 227669 B1 HU227669 B1 HU 227669B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ctla4
molecules
soluble
mutant
cells
Prior art date
Application number
HU0900660A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Cohen
Suzette Hopewell Carr
David Hagerty
Robert J Peach
Jean-Claude Becker
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22804919&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU227669(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of HU227669B1 publication Critical patent/HU227669B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Oldható mutáns CTLA4 molekulák alkalmazása ¢-- ? '
E leírásban temos helyen Idézünk különböző közleményeket, amelyeket itt teljes terjedelmükben referenciaként tartunk számon annak érdekében, hogy teljesebben mutathassuk he azon szakterület állását, amelyhez találmányunk is tartozik.
Találmányunk tárgyát általában a reumás megbetegedések képezik. Pontosabban, a találmány tárgyát reumás megbetegedések, Így a reumatold artritisz kezelésére szolgáló eljárások és készítmények képezik, amelyek során egy betegnek oldható mutáns CTLA4 molekulák hatásos mennyiségét adjuk be.
A reumás megbetegedéseknek jelenleg nincs gyógymódja; az alkalmazott gyógyszereket inkább a tünetek kezelésére használják. Jellemző a gyógyszerek hoszszú Időn át történő alkalmazása és a terápiás eredmény gyakori elmaradása a hátrányos mellékhatások miatt,
A reumás megbetegedések közé számos betegség tartozik, amelyek a test vázizom-rendszeréí és kötőszöveteit érintik. Ezeket a betegségeket az Idült gyulladás jellemzi, ami gyakran vezet a szövetek maradandó károsodásához, torzulásához, elsorvadásához és funkciójuk elvesztéséhez, A reumás megbetegedések az ízületeket, csontokat, lágy szöveteket vagy a gerincvelőt érintik (Mafhles: JRheuma”, 1983},, és felosztásuk gyulladásos reumára, degenerativ reumára, ízületen kívüli reumára és kollagén-betegségre történik. Néhány reumás megbetegedésről tudjuk, hogy autoimmun betegség, amit a beteg megváltozott immunválasza okoz,
A reumatoid artritisz egy folytonosan súlyosbodó reumás megbetegedés, amiben a fejlett országok lakosságának körülbelül 2 %-a szenved jUtsinger ef al, „Rheumatoid Arthritis”, p. 140 (1985)1. Ezt a betegséget az Izületi hártya állandósult gyulladása jellemzi, ami a porc és a csont eróziójához, és ezen keresztül a végtagok ízületeinek szerkezeti torzulásához vezet. A reumatoid artritisz tünetei az ízület megduzzadása, nyomásérzékenysége, gyulladása, reggeli merevsége, és fájdalmassága különösen hajiitáskor. Az előrehaladott artrltlszben szenvedő betegeknél gyakran alakulnak ki szerkezeti károsodások, köztük az ízület elpusztulása a csonterózió következtében (Kardson; „Prindpaís of Internál Medicine”, 13, kiadás, pp. 1643-1855). Ráadásul a betegeknek más szervek, Igy a bőr, vesék, szív, tüdő, központi idegrendszer és a szemek károsodására utaló tüneteik is lehetnek az autoimmun folyamat okozta érgyuíladás következményeként,
A reumatoid artritisz további tünetei közé tartozik a fokozott vérsejtsüüyedés és a C-reaktív fehérje (CRP) és/vagy az oldható IL-2 receptor (IL~2r) megemelkedett szé2 » * # » « «
X « * « * * * X * ♦* *
rumszintje, Á vérsejtsüifyedés csaknem az összes, aktív reumateld artrifiszben szenvedő beteg esetében fokozott, A szérum CRP-színtje is emelkedett, korrelál a betegség aktivitásával és az ízület károsodásának valószínőségével. Emellett az oldható ll-2r — amit az aktivált T-sejtek termelnek — szintje is megemelkedik az aktív reumatoid artritiszes betegek szérumában és ízületi folyadékában (Hamson, id, mű, p. 1650).
A reumatond artrítiszt egy T-sejt közvetitésü autoimmun betegségnek tartják, ahol nem antigén-specifikus kölcsönhatások lépnek fel T-limfooiták és antigénprezentáló sejtek között. Általában a T-sejles válaszreakció erősségét az a kostímuiácsós válasz határozza meg, amit a T-sejtek felszíni molekuláinak és íigandumaiknak a kölcsönhatása vált ki [Muelíer et a/., Anno. Rév. /mmimol. 7, 445-480 (1989)]. Kostimulácíós kulcs-szignálok a T-sejtek CO28 és CTLA4 sejtfelszíni receptorai és a liga nd urnáik, például a 87-szerű molekulák. így a CD8Ö (azaz 87-1) és a CD88 (azaz 87-2) — amelyek az antigén-prezentáló sejteken vannak jelen — közötti kölcsönhatások [Línsley és Ledbetter, Anno. Rév, /mmuno/. 11, 191-212 (1993)].
A T-sejtek aktiválása a kostimuláció hiányában gyenge válaszreakciót eredményez [Schwartz, Ce//71. 1085-1068 (1992}}, ahol az immunrendszer érzéketlen marad a stimuiálásra.
Mivel a reumatoid artrítiszt egy T-sejt közvetítési) immunrendszertartják, a betegség kezelésére szolgáló új hatóanyagok kifejlesztésének ája az olyan molekulák azonosítását célozza meg, amelyek gátolják a szignált a T-limfociták és az antigén-prezentáló sejtek között azáltal, én CD28 vagy CTLA4 és a 87 kölcsönhatását. A potenciális az oldható CTLA4 molekulák, amelyek úgy vannak módosítva, ötődjenek a B7~hez, mint a vad típusú CTLA4 (amelynek ábrán látható), vagy a CO28, és ezáltal gátolják a kostimulácíós szignál létrejöttét
nagyobb iája a 23,
A CD28 és a CTLA4 oldható formái úgy készíthetők el, hogy váíteztafhatö (V-típusú) extracelfuíáris doménjeiket immunglobulin (lg) konstans doménekkel fuzionáljuk: igy jön létre a CD281g és a CTLA4lg, A CTLAAlg nukleotíd- és amínosav-szekvenoíája a 24, ábrán látható: a fehérje metloninnal kezdődik a fel, vagy aianinnal a -1 pozícióban, és lizinnel végződik a +357 pozícióban. A CTLA4lg mind a CD80-. mind a CO85-pozitiv sejtekhez sokkal erősebben kötődik, mint a CD28ig [Línsley ef a/,., /mrmorty 1, 793-800 (1994)}, Megfigyelték, hogy a CTLA4íg~nal számos T-sejt függő immunválasz gátolható te v/teo és te wvo [Línsley ef a/., Sctence 257,792-795 (1992): Línsley et a/.. J, Hxp. Med, 178, 1595-1604 (1992); Lenschow ef a/., -Scfooce 257, * ♦
789-792 (1992); Tan ef a/, J. Βφ. Med, 177, 165-173 (1992); Turka e/a/., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 69, 11102-11105 (1992)1
Hogy megváltoztassuk a természetes ligandumokkal, például a 37-tel szembeni affinitását az oldható CTLAAlg molekulákat aminosavak mutációjával változtattuk meg a molekula CTLA4 részében. A CTLA4 területek — amelyek affinitása a mutációval megváltozik a B7 Hgandumok iránt — közé tartozik az 1. komplementer determináns terület (CDR-1) (US 6,090,914. 5,773,253, 5,844,005, US-A 80/214,085; Peach ef a/.; d. Exp, Med. 180, 2049-2058 (1994)) és a 3. komplementer determináns terület 8CDR-3-szerű), ami a CTLA4 extraceliulárls doménjének konzervatív területe (US 8,090,914, 5,773,253, 5,844,095, US-A 80/214,065: Peach ef a/., d. Exp. Med. 180, 2049-2058 (1994)). A CDR-3-szerü terület a CDR-3 területet határolja, és lefelé és/vagy felfelé néhány aminosavval túlnyúlik a CDR-3 motívumon. A CDR-3-szerö terület tartalmaz egy MYPPPY bexapeptid motívumot, amely erősen konzervatív a CD28 és CTLA4 család összes tagjában. Az alanln pásztázó mutagenezise a CTLA4 bexapeptid motívumában és a CD28lg meghatározott pontjain lecsökkenti vagy megszünteti a kötődést a CD8Ö-hoz (Peach és munkatársai, /d, .köz/.).
További módosításokat végeztek az oldható CTLA4lg molekulákon a CTLÁ4 és a CD28 homológ szakaszainak felcserélésével. Ezekben a kiméra CTLA4/CD2S homológ mutáns molekulákban a mindkét részben közös MYPPPY bexapeptid motívumot, valamint a CTLA4 rész CDR-1- és ODR-3-szerü területeinek néhány nem konzervatív szakaszát találták felelősnek a CTLA4 CO80 iránti affinitásának fokozódásáért (Peach et a/., M köz/.).
Az oldható CTLA4 molekulák, például a CTLA4íg: a mutáns CTLA4 molekulák vagy a kiméra CTLA4/CD28 homológ mutánsok (a fenti leírás szerint) egy új gyógyszercsoportot képeznek a reumás megbetegedések kezelésére.
A reumás megbetegedések, így a reumatoíd artritisz jelenlegi kezeléséhez tartozik a nem specifikus, oítotoxikus ímmunszupresszívumok, például a metotrexát ciklofoszfamid, azatioprln vagy ciklosporin-A, illetve az alfa tumomekrézis-faktor (oTNF) blokkolók vagy antagonísták alkalmazása. Ezek az immunszupresszív hatóanyagok a beteg teljes immunrendszerét elnyomják, ezért hosszú időtartamú használatuk fokozza a fertőzések veszélyét. Ráadásul ezek a hatóanyagok csak lelassítják a reumatoíd artritisz súlyosbodását, ami felgyorsul a kezelés megszüntetése után. Emellett a nem specifikus hatóanyagokkal végzett tartós kezelés toxikus mellékhatásokkal jár, amelyek közé bizonyos rosszindulatú daganatok kifejlődésének fokozott tendenciája, veseelégteX ΦΦΦ fenség, csontvelő-elégrtetenség, tüdöfíbrózis, cukorbetegség és májfunkció-zavarok tartoznak, Ugyanakkor ezek a hatóanyagok körülbelül 2-5 év alatt fokozatosan elveszítik hatásukat („Keiíey’s Textbook of Rheumatology’, 6, kiadás, pp. 1001-1022).
Más megközelítésként nem specifikus immunszupresszív és gyuíladásgátíő hatóanyagokat alkalmaznak tünetek enyhítésére. Ezek a hatóanyagok dózisfüggők és nem védik ki a betegség súlyosbodását. Ide tartoznak a szteroid vegyületek, mint amilyen a prednizon és metil-prednízöton, A szteroidok tartós szedése is toxikus mellékhatásokkal jár („KeHey's”, pp. 829-833).
így tehát a reumatoid artritisz jelenlegi kezelései korlátozott hatásúak, jelentős toxikus mellékhatásokkal járnak és nem alkalmazhatók folyamatosan, hosszú időn át.
Ennek megfelelően igény van a reumás megbetegedések, igy a reumatoid artritlsz hatásosabb és eredményes, a hagyományos eljárások és gyógyszerek hátrányaitól mentes kezelésére az autoimmunitás kórélettani mechanizmusainak megtámadásán keresztül.
Találmányunk tárgyát készítmények és eljárások képezik az immunrendszer betegségeinek kezelésére azáltal, hogy egy betegnek oldható CTLA4 molekulákat adunk be, amelyek a 87-pozitív sejteken lévő B7 molekulákhoz kötődnek, és ezáltal gátolják az endogén B7 molekulák kötődését a T-sejtek CTLA4 és/vagy CD28 molekuláihoz. A találmány szerinti eljárásokban használt, oldható CTLA4 molekulák közé tartozik a CTLA4lg és az oldható, mutáns CTLA4 molekula, az l104EA29Ylg.
Találmányunk eljárásokat is biztosit a T-sejtek funkciójának gátlására, de nem a T-sejtek számának csökkentésére emberben azáltal, hogy a 87-pozííiv sejteket az emberben egy oldható CTLA4-gyel érlntkezletjük. Az oldható GTLA4-ek közé tartozik a CTLA4lg és az oldható, mutáns CTLA4 molekula, az L104EA29Yig.
Találmányunk továbbá eljárásokat biztosít a reumás megbetegedések, például a reumatoid artritlsz kezelésére (például tüneteinek csökkentésére) azáltal, hogy a diagnosztizált reumatoid artritiszben szenvedő személynek oldható CTLÁ4 molekulákat, például CTüMIg-t és/vagy az L104EA29Ylg oldható mutáns CTLA4 molekulát adjuk he. A találmány szerinti eljárásokban való használatra előnyösek azok az L1Ö4EA29Ylg mutáns CTLA4 molekulák, amelyek metionínnal kezdődnek a *1 pozícióban vagy alaninnal a -~1 pozícióban és iízinneí végződnek a +357 pozícióban, amint az a 19, ábrán látható.
Találmányunk ugyancsak eljárásokat biztosit a reumás megbetegedésekkel járó kórélettani elváltozások, például a strukturális károsodások csökkentésére azáltal, <♦» φ* hogy a diagnosztizált reumatoíd artritiszhan szenvedő személynek oldható CTLA4 molekulákat adunk be.
Találmányunk biztosít még egy gyógyszerkészítményt is az immunrendszer megbetegedései, például a reumás betegségek kezelésére, ami egy gyógyszerészetíleg elfogadható vívőanyagot és egy biológiailag aktív hatóanyagot, például oldható CTLA4 molekulákat tartalmaz.
Az immunrendszer betegségeinek kezelésére szolgáié gyógyszerkészítményeket tartalmazó készletek is találmányunkhoz tartoznak. Az egyik megvalósításban egy készlet egy vagy több találmány szerinti, az immunrendszer betegségei, például a reumatoíd artritisz kezelésére használható gyógyszerkészítményt tartalmaz. így például a gyógyszerkészítmény oldható CTLA4 molekulák hatásos mennyiségét tartalmazhatja, amelyek a B7-pozitív sejtek B7 molekuláihoz kötődve megakadályozzák, hogy a BT molekulák megkössék a CTLA4 és/vagy CD2S molekulákat a T-sejteken. Továbbá, a készlet egy vagy több immunszupressziv hatóanyagot is tartalmazhat, amely{ek) a találmány szerinti gyógyszerkészítményekkel együtt használhatő(k). A lehetséges immunszupressziv hatóanyagok közé tartoznak a kortikoszteroidok, a nem szterold gyulladásgátló hatóanyagok (például a Cox-2 Inhibitorok), a cíklosponn, a prednizom az azatioprín, a metotrexát, az aTMF blokkolók vagy antagonísták, az inflixímah, bármely biológiai hatóanyag, amelynek célpontja egy gyulladáskeitö eííokín, a hidroxi-klorokvm, a szulfaszaJazopinn, az aranysók, az etaneroept és az anakinra; a felsorolás nem kizárólagos.
Találmányunk olyan eljárásokat is biztosít, amelyekkel a reumatoíd artritiszhez társuló vérsejtsülíyedés mérsékelhető.
Emellett találmányunk eljárásokat biztosit a vérszérum bizonyos, a reumatoíd artritiszhez kapcsolódó alkotórészei mennyiségének csökkentésére; ilyenek a C-reaktív fehérje, az oldható JCAM-1, az oldható E-szelektin és/vagy az oldható IL~2r,
Az ábrák rövid leírása
IA. ábra. A betegcsoportok demográfiai adatai; nem, bőrszín és a betegség tartama.
IB. ábra. A betegcsoportok demográfiai adatai: nem, életkor, testtömeg és a betegség aktivitása a beteg szerint.
IC. ábra. A betegcsoportok demográfiai adatai: a betegség aktivitása az orvos szerint, vérsejtsülíyedés (ESR), fizikai funkció (kikérdezés alapján) és a C-reaktív fehérje (CRP).
? 0 ·? 4 4 3 / RAS « A jge, duzID. ábra, A betegcsopodok demográfiai adatai: ízűiét íájdatom és reggeli merevség.
IE. ábra. A betegcsoportok demográfiai adatai: megelőző kezelések.
2. ábra. A kezelés megszakítása a 85. nap előtt az egyes betegcsoportokban. 3A. ábra. Az ACR-20, -50 és -70 válaszok megoszlása a betegcsoportokban a 85, napon.
Az ACR-20 válaszok aránya a 85. napon (a 95 %-os konfidenciahatárokkal).
3C, ábra. Az ACR-20 válaszok különbsége a plscébóhoz képest.
4A. ábra. A klinikai alapválaszt (20 %-os javulás) mutató betegek aránya a
85. napon: duzzadt és fájdalmas ízületek.
48, ábra. Klinikai válasz a duzzadt és fájdalmaz ízületek számának változáa 85, napon.
SA. ábra. Á betegek fájdalomérzetének változása a 85. napra (Líked-skáián mérve)..
SS. ábra. A betegség általános változása a 85. napra a betegek megítélése szerint (Likert-skáíán mérve).
5C. ábra, A betegség általános változása a 85. napra az orvos megítélése szerint (Liked-skáíán mérve).
5D. ábra. A fájdalom változása a 85. napra (Líked-skáián mérve),
5A. ábra, A betegség aktivitásának általános értékelése a betegek által.
6B, ábra. A betegség aktivitásának általános értékelése az orvos által.
7A, ábra. A C-reaktív fehérje (CRP) szintjének változása a 85. napra,
78. ábra. A CRP-színt változásának különbségei a placébóvaí kezelt cso7C. ábra. A CRP-színt átlagos változása a 85. napra,
8. ábra. Az oldható IL-2 receptor szintjének átlagos csökkenése a 85, napra. 9A. ábra, A CTLA4ig időbeni hatása a fájdalmas ízületekre: a kőzépérték eltérése az alapvonaltól.
98. ábra. A CTLA4lg időbeni hatása a fájdalmas ízületekre: az átlag eltérése az alapvonaltól.
TOA, ábra, A CTLA4lg időbeni hatása a duzzadt ízületekre: a középérték eltérése az alapvonaltól.
188. ábra. A CTLA4lg időbeni hatása a duzzadt ízületekre: az átlag eltérése
X .«
X « « « az alapvonaltól
11. ábra. A CTtA4lg időbeni hatása a fájdalomra: az átlag eltérése az alapvonaltól
12A. ábra. A CTLA4lg időbeni hatása a betegség aktivitására a betegek értékelése szerint: az átlag eltérése az alapvonaltól.
12B. ábra, A CTLA4lg időbeni hatása a betegség aktivitására az orvos értékelése szerint: az átlag eltérése az alapvonaltól,
13A. ábra. Az L104EA29Yíg időbeni hatása a fájdalmas Ízületekre; a középérték eltérése az alapvonaltól.
138. ábra. Az L1Ö4EA29Ylg időbeni hatása a fájdalmas ízületekre: az átlag eltérése az alapvonaltól
14A. ábra. Az L1Ö4EA29Ylg időbeni hatása a duzzadt ízületekre: a középérték eltérése az alapvonaltól.
14B. ábra. Az L104EA29Ylg időbeni hatása a duzzadt ízületekre; az átlag eltérése az alapvonaltól.
15, ábra. Az L1ö4EÁ29Ylg időbeni hatása a fájdalomra: az átlag eltérése az alapvonaltól.
ISA. ábra. Az L104EA29Ylg; időbeni hatása a betegség aktivitására a betegek értékelése szerint; az átlag eltérése az alapvonaltól
168, ábra, A L1 Q4EA29Ylg időbeni hatása a betegség aktivitására az orvosok értékelése szerint: az átlag eltérése az alapvonaltól.
17. ábra, A betegek mozgáskorlátozottságának %-os javulása a „Health Assessment Questíonnaíre,!(HÁQ) alapján, a 85, napon, a CTLA4íg~vei és az L1Ö4EA29Ylg~veí kezelt betegcsoportokban.
18. ábra. Az L1Ö4EIG nukleotid- és aminosav-szekvenclája.
19. ábra, A L1Ü4EA29Yig nukleotid- és aminosav-szekvenciája,
20. ábra. Az L104EA29tig nukleotid- és aminosav-szekvenfoíája.
21. ábra. Az L104EA29Tlg nukleotid- és aminosav-szekvenjoiája,
22. ábra, Az L104EÁ29Wlg nukleotid- és amínosav-szekveréciája.
23. ábra. A CTLA4 receptor nukleotid- és aminosav-szekven^clája.
24. ábra. A CTLA4lg receptor nu kléofld- és am í nosav-szekvenciája.
25. ábra. A CTLA4íg (1. sáv), az L104Elg (2. sáv) és az L104EA2SY1g (3. sáv) SOS-eiektroforézise (A.), illetve a CTLA4íg (B.) és az L104EA29Ylg (C.) méretkizáró kromatográfiája.
26. ábra. Bal kép: a CTLA4 exíraceiiuláns immunglobulin V-szerü görbületének szalagképe az oldott szerkezetből HMR-spekíroszkópiávaí meghatározva. Jobb kép: A CDR-1 szakasz (S25-R33) és az MYPPPY szakasz kinagyított képe matatja az L104 és az A29 affinitást fokozó mutációk helyét és az oidaiiánc orientációját.
27A-S. ábrák. Az L1ö4EA29Yíg, L1Ö4Elg és CTLAAlg kötődése a humán CDSO-nal vagy CD86-lal transzfektáít CHG-sejtekbez.
28A-B. ábrák, A CÖ8Ö- és CDS6-pozitív CHO sejtek szaporodásának gátlása.
29A-B. ábrák. Az L104EA29Ylg a CTLA4lg-nál sokkal hatásosabban gátolja a primer és szekunder aiíostimuiált T-sejtek szaporodását.
30A~C, ábrák. Az L104EA29Yíg a CTLA4lg-nál sokkal hatásosabban gátolja az I L-2 (A.), az fL~4 (8.) és a y-interferon (C.) citokinek termelését az allosűmufált humán T-sejtek által,
31, ábra. Az L1Ö4EA29Yíg a CTLA4lg-nái sokkal hatásosabban gátolja a íítohemagíutininneí (PHA) stimulált majom T-sejtek szaporodását.
32. ábra. Az L104EA29Ylg, az L104Elg és a vad típusú CTLA4lg egyensúlyi kötődésének vizsgálata a C086lg-hoz.
33A-B, ábrák. Az oldható ICÁM-1 és az oldható E-szelektln szintek átlagának változásai a középvonalhoz képest, a 85, napra.
Az ezen leírásban használt összes tudományos és technikai kifejezést az általánosan használt értelemben alkalmazzuk, hacsak mást nem állítunk. A kővetkező szavak és kifejezések jelentését az alábbiakban adjuk meg,
A „ligandum” szó egy olyan molekulát jelent, amely specifikusan felismer egy másik molekulát és kötődik ahhoz; így például a CTLA4 liganduma egy 87 molekula.
A „vad típusú CTLA4” vagy „nem mutált CTLA4” kifejezések a természetben előforduló aminosav-szekvenciájú, teljes hosszúságú CTLA4 molekulát (amint az a 23. ábrán látható, illetve megtalálható az US 5,434,131, 5,844,095 és 5,851,795 szabadalmi iratokban), vagy annak bármely olyan részét vagy származékát jelentik, amely felismer és megköt egy 87 molekulát, vagy interferál egy 87 molekulával úgy, hogy gátolja annak kötődését a CD28-hoz és/vagy a CTLA4-hez (például endogén CD28hoz és/vagy CTLA4-hez). Egyes megvalósításokban a vad típusú CTLA4 exfraceíluláris doménje metioninnal kezdődik a +1 pozícióban és aszparagínsawaí végződik a * 124 pozícióban. A vad típusú CTLA4 egy sejtfelszíni fehérje, aminek egy N-termlnálís extraceíluíáns doménje, egy transzmembrán doménje és egy C-termínáiís intracellulárls doménje van. Az extraceíluíáns dómén kapcsolódik a céimoiekulákhoz, például egy B7 molekulához. Egy sejtben a természetben előforduló, vad típusú CTLA4 fehérje egy éretlen poiipeptidként keletkezik, amely egy szlgnálpeptidét hordoz az N-terminálísán, Az éretlen polípeptid egy poszt-transzíációs átalakuláson megy át, amelynek során lehasad róla a szignáípeptid és egy CTLA4 hasítási termék keletkezik egy új N-termlnálissal, ami különbözik az éretlen forma N-termínálisátót A szakemberek tudják, hogy járulékos poszt-transzlációs átalakulások is felléphetnek, amelyek egy vagy több amlnosavat távolítanak el az új N-terminálisról. Másrészt előfordulhat, hogy a szignáípeptid nem egészében hasad le, és igy olyan molekulák keletkeznek, amelyek előrébb kezdődnek, mint a rendes kezdő aminosav, a metionín. így tehát az érett CTLA4 fehérje egy metíonlnnal kezdődhet a +1 pozícióban vagy egy aianlnnal a -1 pozícióban. A CTLA4 molekula magában foglalja az extracelluláns domént vagy annak bármely részét, amely megköti a B7-et,
A „mutáns CTLA4 molekula” kifejezés egy olyan vad típusú CTLA4~et (ami a 23, ábrán látható) vagy annak bármely olyan részét vagy származékát jelenti, amelyben egy vagy több mutáció van (előnyösen a vad típusú CTLA4 extracelluláns doménjében) A mutáns CTLA4 molekula szekvenciája hasonlít a vad típusú CTLA4 molekuláéhoz, de nem azonos azzal, viszont még mindig megköti a B7-et A mutációk közé tartozik egy vagy több aminosav konzervatív cseréje (például egy leucint ízoleuclnra) vagy nem konzervatív cseréje (például egy gllclnt triptofánra), kihagyása, hozzáadása, eltolása vagy a molekula csonkítása. A mutáns CTLA4 molekulákhoz tartozik egy nem CTLA4 molekula beillesztése vagy hozzácsatolása, A mutáns molekula lehet oldható (például a vérkeringésben) vagy a sejt felszínéhez kötött További mutáns CTLA4 molekulák vannak leírva az ÜS-A 09/865,321, 60/214,085 és 60/287,576, az US 6,090914, 5,844,095 és 5,773,253 számú szabadalmi iratokban valamint Peach és munkatársai közleményében (d, Exp. Med. 160, 2048-2058 (1994}j. A mutáns CTLA4 molekulák létrehozhatók szintetikus úton vagy rekombinációval,
A ,,CTLA4lg egy oldható fúziós fehérje, amely egy vad típusú CTLA4 extrsceflu-iáns doménjét vagy annak egy 87-kötő részét tartalmazza egy immunglobulin (lg) farokhoz kapcsolva. Egy adott megvalósításban a vad típusú CTLA4 extracelluláns doménje (amint az a 23, ábrán látható) metíonlnnal kezdődik a +1 pozícióban és aszparaginsawal végződik a +124 pozícióban; vagy aianlnnal kezdődik a ~~1 pozícióban és aszparaginsawal végződik a +124 pozícióban; egy összekötő glutamín van a +125 pozícióban; és egy immunglobulin rész csatlakozik hozzá, amit egy glutaminsav (+126) és egy lízin (+357) határol. A CTLA4lg-t kódoló DNS-t a Budapesti
Egyezménynek megfelelően, 1991 május 31-én letétbe helyeztük az American Type Culture Colíectlon-néí, ahol az ATCC 88629 nyilvántartási számot kapta íLlnsiey et et, /mmun/fy 1, 793-780 (1994)}, A CTLA4lg-24 egy aranyhörcsög ovárium sejtvonal (Chinese Hamster Ovary, CHö), ami a CTLA4lg~t fejezi ki (letétbe helyezve az ATCC-nél 1991. május 31-én, nyilvántartási száma CRL-10762). A találmány szerinti eljárásokban és/vagy készletekben használt, oldható CTLA4ig molekulákon lehet egy szignál (vezető) peptid-szekvencia. A találmány szerinti eljárásokban és/vagy készletekben alkalmazott molekulák tipikusan nem tartalmaznak egy szignál peptid-szekvenciát.
Az „L1ö4EA29Ylg egy fúziós fehérje, ami ált egy oldható, mutáns CTLA4 molekulából — ami egy vad típusú CTLA4 extraceiluláris doménjét tartalmazza két aminosav-cserévef: A29Y (egy tirozin lép az alanin helyére a +29 pozícióban) és L104E (egy glutaminsav lép a leucin helyére a +104 pozícióban), vagy annak egy olyan részét, ami megköt egy 87 molekulát —, és egy lg farokhoz van kapcsolva (18. ábra). Az L104£A29Ylg~t kódoló DNS-t 2000 június 20-án helyeztük letétbe az ATCC-nél, ahol nyilvántartási száma PTA-2104; leírását lásd még az US-A 09/879,927, 80/287,578 és 60/214,085 számú szabadalmi iratokban, amelyeket referenciaként tartunk számon. A találmány szerinti eljárásokban és/vagy készletekben használt oldható U04EA29Y1g molekulákon lehet egy szignál (vezető) peptid-szekvencia. A találmány szerinti eljárásokban és/vagy készletekben alkalmazott molekulák tipikusan nem tartalmaznak egy szignál peptid-szekvenoiát.
Az „oldható” szó bármely olyan molekulára, annak fragmentumára vagy származékára vonatkozik, amely nem kötött vagy csatlakozik egy sejthez, azaz részt vesz a vérkeringésben. így például a CTLA4, a S7 vagy a CD28 oldhatóvá tehető, ha az extraceiluláris doménjükhöz egy Immunglobulin (lg) csoport kapcsolódik. Más megoldásként egy molekula, így a CTLA4 oldhatóvá tehető, ha eltávolítjuk a transzmembrán doménjét. A találmány szerinti eljárásokban használt, oldható molekulák tipikusan nem tartalmaznak egy szignál (vagy vezető) szekvenciát.
Az „oldható CTLA4 molekulák” kifejezés a sejtfelszínhez nem kötött (azaz keringő) CTLA4 molekulákat vagy azok bármely funkcióképes részét jelenti, amelyek megkötik a 87-et. Ide tartoznak (nem kizárólag) a CTLA4lg fúziós fehérjék (például az ATCC 88829), amelyekben a CTLA4 extraceiluláris doménje egy immunglobulinhoz van kapcsolva, ami oldhatóvá teszi a fúziós molekulát, vagy ezek fragmentumai és származékai; az olyan fehérjék, amelyekben a CTLA4 extraceiluláris doménje egy biológiailag vagy kémiailag aktív fehérjével, például a papiilomavírus E7 génjének termé11 ·*♦ *** kéve; (CTLA4-E7), vagy a p97 melanőma-asszocfált antigénnel (CTLA4-p97), vagy a HÍV env fehérjéjével (CTLA4-env-gp12Ö) van fuzionálva vagy összekapcsolva, vagy ezek fragmentumai és származékai; a hibrid (kíméra) fúziós fehérjék, mint amilyen a CD28/CTLA4íg, vagy ennek fragmentumai és származékai; a CTLA4 molekulák, amelyek a transzmembrán dómén eltávolításával lettek oldhatóvá téve [Osks e/ a/., Ce/fe/ar /mmono/ogy 201, 144-153 (2000)], vagy ezek fragmentumai és származékai. Az „oldható CTLA4 molekulák közé tartoznak azok fragmentumai, részei vagy származékai is, valamint azok az oldható, mutáns CTLA4 molekulák, amelyeknek B7 kötő aktivitásuk van. A találmány szerinti eljárásokban használt, oldható CTLA4 molekulákon lehet egy szignál (vezető peptid-szekvencsa is, de tipikusan nem tartalmaznak ilyen szekvenciát.
A „CTLA4 extraceilulárls doménje” az a része a molekulának, amely felismeri és megköti a CTLA4 iigandumait, így a B7 molekulákat. így például a CTLA4 egy extracelluláris doménje metíonint tartalmaz a +1 pozícióban és a + 124 pozícióban lévő aszparaginsavig tart (23, ábra). A CTLA4 egy másféle extraoelíulárís doménje aíanint tartalmaz a -1 pozícióban és szintén a +124 pozícióban lévő aszparaginsavig terjed (23. ábra). Az extraceilulárls dómén foglalja magában a CTLA4 olyan fragmentumait vagy származékait, amelyek megkötnek egy 87 molekulát. A CTLA4 extraceilulárls doménje amint az a 23. ábrán látható — mutációkat is tartalmazhat, amelyek megváltoztatják a CTLA4 molekula affinitását a 87 molekula Iránt.
A „mutáció” szó egy változást jelent egy nukleotid- vagy aminosav-szekvenolában egy vad típusú molekulához képest, így például egy változást a vad típusú CTLA4 extraceiíulárís doménjének DNS- és/vagy aminosav-szekvencíájában. Egy mutáció a DNS-ben megváltoztathat egy kodon!, ami egy változást eredményez az amk nosav-szekvenciában. A DNS megváltozása lehet csere, kihagyás, leszerelő, alternatív hasítás vagy csonkolás. Egy amínosav megváltozása történhet cserével, kihagyással, inszerciőval, hozzáadással, csonkítással, vagy a fehérje „kikészítése'' vagy hasítása során fellépő hibákkal. Másrészt a nukieolid-szekvencla egy néma mutációt is eredményezhet az aminosav-szekvenciában; ez jól ismert a szakterületen. Ennek oka az, hogy több nukleotid kodon is ugyanazt az aminosavat kódolja Példaként írjuk, hogy a GGU, CGG, CGC és CGA kodonok mind az arginint (R) kódolják, amint a GAU és GAC az aszparaginsavst (D). így tehát egy fehérjét egy vagy több, különböző szekvenciája nuklelnsav molekula kódolhat. Az aminosavak kódoló szekvenciái az alábbiak:
7G4443/Í’A2
Aminosav Szimbólum Egybetűs szimbólum Kodonok
Alanin Alá A GCU, GCC, GCA, GCG
Cisztein Gys C UGU, UGC
Aszparaginsav Asp D GAU, GAC .
Giufaminsav Glu E GAA, GAG
Feníí-alanin Phe F uuu, uuc
Glioín Gly G GGU, GGC, GGA, GGG
Hisztidin His H CAU, CAC
Izöieucin He i AUU, AUC, AUA
Lizin Lys K AAA, AAG
Leucin Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CÖA, CUG
Metionln Met M AUG
Aszparagin Asn N AAU, AAC
Prolin Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamln Gin Q CAA, CAG
Arginin Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Szerin Ser S UC-U, UCC. UCA, UCG, AGU, AGG
Treonin Tbr 1 ACU, ACC, ACA, ACG
Valin Val V GUU, GUC, GUA, GUG
Triptofán Trp w UGG
Tlrozin Tyr Y UAU, UAC
A mutáns molekulákban egy vagy több mutáció tehet.
A „nem-CTLA4 fehége-szekvenda” vagy nem-CTLA4-molekula:' kifejezések bármely olyan fehérjemolekulát jelentenek, amely nem köt 8?-et, és nem zavarja meg a CTLA4 kötődését a célmolekulájához. Eme nem kizárólagos példaként említjük egy immunglobulin (lg) állandó részét vagy annak egy részét. Az lg állandó része előnyösen egy humán vagy majom lg állandó terület, például egy humán Cy1, benne a csukló, a CH2 és GK3 terű letekkel, Az lg állandó terület effektor funkciói mutációval csökkenthetők (US 5,367,481, 5,844.095 és 5,434,131 számú szabadalmi iratok).
Egy „fragmentum vagy „rész” egy CTLA4 molekula bármely része vagy szegmentuma lehet, előnyösen az extracelluláns dómén vagy annak egy része vagy szegmentuma, amely még felismer és megköt egy 87 molekulát.
A „87 megjelölés egy molekuíacsaládot jelent, amelybe — többek között — a
87-1 (CD-80), a 87-2 (CD88) és a 87-3 tartozik, amelyek felismerik és megkötik a
CTLA4-SÍ és/vagy a CD28-at.
A. BB7-pozitív sejtek” kifejezésen bármely olyan sejtet értünk, amely egy vagy több B7~molekuláf fejez ki a felszínén.
A „származék kifejezés egy olyan molekulát jelent, amely anyamoiekulájával homológ és aktivitása is azonos azzal. így például a CTLA4 származékai közé tartoznak az oldható CTLA4 molekulák, amelyek aminosav-szekvencíája legalább 70 %-ban homológ a vad típusú CTLA4 extracelluláris doménjének szekvenciájával, és még felismerik és megkötik a B7-et; ilyenek például a CTLA4íg vagy az oldható, mutáns CTLA4 molekula, az L1Ö4EA29YIg,
A „blokkolni” vagy „gátolni” egy receptort, szignált vagy molekulát azt jelenti, hogy megzavarjuk a receptor, szignál vagy molekula aktiválását, ami a szakterületen jól ismert módon mutatható ki. így például egy sejtközvetltésü Immunválasz gátlása úgy is kimutatható, hogy meghatározzuk a reumás megbetegedés tüneteinek csökkenését. A blokkolás vagy gátlás lehet részleges vagy teljes,
A „87 kölcsönhatás gátlása” kifejezésen a 87 és ligandumai, például a CD28 és/vagy CTLA4 összekapcsolódásának megzavarását értjük, aminek következtében zavart szenved a T-sejtek és a B7-pozitsv sejtek kölcsönhatása. A 87 kölcsönhatást gátló hatóanyagokra nem korlátozó példaként említjük az olyan antitesteket (vagy azok részét vagy származékát), amelyek felismernek és megkötnek bármely CTLA4. CD28 vagy 87 (például 87-1, 87-2) molekulát; az ilyen molekulák oldható formáit (vagy azok részét vagy származékát), ilyen egy oldható CTLA4 molekula; vagy egy peptid-frag-mentumot vagy másféle kis molekulát, ami arra lett tervezve, hogy megzavarja a sejtek közötti jelátvitelt a CTtA4/CD2S/S7 közvetitésű reakcióban. Egy előnyős megvalósításban a blokkoló hatóanyag egy oldható CTLA4 molekula, például a CTLA4lg (ATCC 68629) vagy az L1Ö4EA29Yig (ATCC-PTA-2104); egy oldható CO28 molekula, például a CD281g (ATCC 68628), egy oldható B7 molekula, például a 87lg (ATCC 68627); egy antí-87 monoklonális antitest (például az ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC H8-301 és ATCC-HB11341) és azok a monoklönáiís antitestek, amelyek az US 6,113,898 számú szabadalmi Iratban vagy Yokachi és munkatársai közleményében [X immunot. 128,823-827 (1982)] vannak leírva; egy antiCTLA4 monoklonális antitest (például az ATCC H8-304); és/vagy egy anti~CD28 monoklonális antitest, például az ATCC HB-11S44 és az mAb9.3 [Hansen ef at, /mmunogeneí/os lö, 247-260 (1980); Martin e/aZ, d. C//n. immunot. 4,18-22 (1984)].
Az „immunrendszer megbetegedései” kifejezés alatt bármely olyan betegséget ?SM443/?A« κ» < *<· * ·< ♦ «* β * * *« » * *»<Χ *Χ ♦ « « * * a> * »»*“ **ο *** *♦ *»« értünk; amelyben, közvetítő szerepet játszik a T-sejtek kölcsön hatása B7-pozitív sejtekkel: Ilyenek — nem kizárólag — az autoimmun betegségek, a szőveíátüíteíéssel kapcsolatos betegségek és az immunproíiíeraíív betegségek. Az immunrendszer betegségeire példák a „gratt versus bőst” betegségek (GVHD, például azok, amelyek csontvelőátültetés vagy tolerancia indukálása következtében lépnek fel), az átültetett szövetek kilökődésével kapcsolatos immunbetegségek, és a krónikus kilökődés, ami allo- vagy xenograftok (teljes szervek, bőr, szövetszigetek, izmok, máj- és idegsejtek) esetében lép fel. Az ímmunproíiferatív betegségekre nem kizárólagos példák a pszoriázis, a T-sejtes iimfóma. a T~sejtes akut limfoblasztos leukémia, a tesztíkuláris aoglocenfrikus T-sejtes iimfóma, a rosszindulatú íimfocitás érgyulfadás, a lupus (topos eíytoemstosos, l nephritís), a Hashimoto-szindrőma, a primer mixödéma, a Graves-betegség, a vészes vérszegénység, az autoimmun aírőfiás gyomorhonut, az Addison-kór, a cukorbetegség (például az inzulinfüggő, az I. és II. típusú diabétesz), a miaszfénia gravísz, a pempb/gus, a Crobn-befegség, a szimpátiás szemgyulladás, az autoimmun uveagyuíladás, a „Good Pasture's szindróma” (gyors lefolyású glomerulonefritísz), a szklerózis multiplex, az autoimmun hemoiitikus anémia, az idiopátiás trombooitopénia, a primer bináris clrrózís, a krónikus májgyulladás, a fekélyes vastagbélgyulladás, a Sjögren-színdróma, a reumás megbetegedések (például a reumatoid artrítisz), a többszörös izomgyulladás, a szkíéroderma és a vegyes kötőszövet betegségek.
A „reumás megbetegedések” kifejezés bármilyen, az ízületeket, csontokat, lágy szöveteket vagy gerincvelőt (Maíhies: „Rheuma”, 1983) érintő betegséget jelenthet, amelyek közé tartoznak a gyulladásos, a degeneratív és az extraartikuláris reumatizmosok, valamint a kollagén-betegségek. Ezek mellett a reumás betegségekhez soroljuk a krónikus poliartritiszt, a pson'as/s a/thropafh/ca-t, a spondy/tos anky/opoeáca-t a reumatold artrítiszt, a panartenös nodosa-t a szisztémás topos e/ytoemafosus-t, a sc/emderma o'/átosa-t a pedarfPdó's bumeroscapu/ads-í a köszvényt, a oboádracafctonos/s-t, a dermatomyostos-t, az izmok reumáját, az izomgyulladást és izomesomósodást. Néhány reumás megbetegedésről ismert, hogy autoimmun betegség, amit a beteg megváltozott immunválasza okoz,
A „génterápia” kifejezés egy eljárást jelent, aminek során genetikai beavatkozással kezelnek egy betegséget úgy, hogy egy nukíelnsav-szekvenciát juttatnak egy sejtbe és a sejt kifejezi a nukieinsav által kódolt genetikai terméket. így például — amint azt jól tudják a szakemberek — a nukieinsav bejuttatása úgy oldható meg, hogy egy, a nukteínsavat tartalmazó expressziós vektort juttatunk a sejtekbe ex wo vagy in vitro különböző módszerekkel, mint amilyen a kaicium-foszfátos precípítácíő, a dietll-amino-etii-dextrán vagy a pollefilénglikol (PEG) használata, az elektroporáció, a közvetlen injektálás, a lipofekció vagy a vitális transzfekció (Sambrook et a/, „Moíecular Cioníng: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kriegler, „Gene Transfer and Expressíon: A Laboratory Manual, Freeman & Co.f New York, 1993; Wu, „Methods in Enzymology”, AeacL Press, New York, 1993; mindhárom művet referenciaként tartjuk számon), Más megoldásként a szóban forgó nukleínsav-szekvenoiák ín vivő is bejuttathatok egy sejtbe számos vektorral és módon, mint amilyen például a nukleinsav közvetlen beadása egy betegnek {Williams ef a/.., Proc. A/aft Acad. Ser USA 88, 2728-2730 (1991)], vagy a nukleinsav beépítése egy vektor vírusba és a beteg fertőzése a vírussal {Battleman et a/., J. Neurascí. 13, 940-951 (1993); Carroll et eí., J. Ce//, Bíoehem. 17E, 241 (1993); US 5,354,878; Davison és Elliott, „Moíecular Virology: a Praotiacai Approach*, ÍRL Press, New York, 1993]. Az ín vívó bejuttatás további módszerei közé tartozik a nukleinsav bekapszulázása líposzómákba, majd a Siposzómák közvetlen vagy egy hemagglutináló Sendai vírussal kombinált beadása a betegnek (US 5,824,855 számú szabadalmi irat, amit referenciaként: tartunk számon). A íranszfektált vagy fertőzött sejtek fogják kifejezni a nukleinsav által kódolt fehérje-termékeket annak érdekében, hogy megszüntessünk egy betegséget, vagy egy betegség egy tünetét.
Találmányunkat a teljes érthetőség érdekében az alábbiakban írjuk le.
Találmányunk készítményeket és eljárásokat biztosít az immunrendszer megbetegedései, így a reumás betegségek kezelésére, amelyek során egy B7~ei kötő ligándum, például oldható CTLA4 molekulák (CTLAPg és/vagy L104EA29Yíg) és monoklonáíis antitestek hatásos mennyiségeit adjuk be egy személynek. A hatásos mennyiséget úgy definiáljuk, mint az oldható CTLA4 molekulák azon mennyiségét, amely ~~~ ha a 87 molekulákhoz kötődik a B7~pozitlv sejtek felszínén — meggátolja a B7 molekulák kötődését az endogén iigaodumaíhoz, például a CTLA4-hez és a CÖ28-hoz.
Egy előnyös megvalósításban az immunrendszer megbetegedése egy reumás betegség. A reumás betegségek közé soroljuk mindazon megbetegedéseket, amelyekre jellemző (i) a test vázizom-rendszerének vagy kötőszövetes szerkezeteinek, különösen az ízületeknek — Ide értve az izmokat, szalagokat, porcot, ízületi folyadékot és kötőszövetí részeket gyulladása vagy degenerációja; (fi) az ízület megduzzadása, fájdalmassága, gyulladása, reggeli merevsége és/vagy fájdalma, vagy károsodott a
704448/8^.2.
szerkezei mozgása vagy működése; és egyes esetekben (itt) a reumatoki faktor és más, feltételezett gyulladásjelző faktorok szexológiai jelenléte.
A reumás betegségek közé tartozik — nem kizárólag — a reumatoid artritísz. A reumatoki artritísz tünetei az ízületek megduzzadása, fájdalmassága, gyulladása, reggeli merevsége és fizikai akadályozotísággal járó fájdalma. Az artritisz: előrehaladott stádiumaiban szenvedő betegek a szerkezeti károsodás és elgyengítő fájdalom tüneteit mutatják. Az autoimmun folyamat más szerveket is érinthet.
Találmányunk készítményeket biztosít ímmunbetegségek, például reumás betegségek kezelésére, amely készítmények oldható CTLA4 molekulákat tartalmaznak. Továbbá, találmányunk egy olyan biológiai hatóanyagot tartalmazó készítményeket biztosít, amely gátolja a T-sejtek működését — de nem csökkenti a T-sejtek számát — azáltal, hogy a 87-pozitív sejteket egy oldható CTLA4-gyel érintkezteti egy emberben. Az oldható CTLA4-ek közé tartozik a CTLA4lg és az oldható, mutáns CTLA4 molekulák, például az L1Ö4EA29Ylg,
A CTLA4 molekulák — akár mutáns, akár vad típusú szekvenciával — ügy tehetők oldhatóvá, hogy ekével ltjuk belőlük a transzmembrán szegmentumot [Öaks ef a/., Ce//. /mmurtof 201,144-153 (2Ő00}j,
Másrészt az oldható CTLÁ4 molekulák — akár mutáns, akár vad típusú szekvenciával — fúziós fehérjék is lehetnek, amelyekben a CTLA4 molekulák nem~CTLA4 alkotórészekkel, például immunglobulin molekulákkal vannak egyesítve. így például egy CTLA4 fúziós fehérje tartalmazhatja a CTLA4 extraoelluláris doménjét egy immunglobulin konstans doménjével fuzíonáltatva, aminek eredménye a CTLÁ41g molekula [24. ábra; Linsléy et a/,. /mmun/fy 1, 793-8ÖÖ (1994}j.
A klinikai alkalmazás szempontjából előnyös, ha az immunglobulin alkotórész nem ébreszt káros immunválaszt a betegben. Az előnyös alkotórész az immunglobulin konstans területe, ide értve a humán vagy majom immunglobulin konstans területeket. Az alkalmas immunglobulin alkotórészekre példa a humán Cy1, benne a csukló, a CH2 és CHS területekkel, ami effektor-funkciőkat közvetíthet például az Fc-receptorokhoz való kötődéssel, illetve komplement-függő oítotoxioitást (CDC) vagy antitestfüggő, sejt-közvetítésű oítotoxioitást (ADCC) közvetíthet. Az immunglobulin alkotórészben lehet egy vagy több mutáció (például a CH2 doménben, hogy csökkentsük az effektor funkciókat, mint amilyen a CDC vagy ADCC), ahol a mutációk módosítják az immunglobulin kötődési képességét a iignadumához, illetve fokozzák vagy csökkentik a kötődési képességét az Fc-receptorokhoz. így például az immunglobulin mutációi «« κ ♦ « * *« < ♦ » meg változtathatják a csukló-dómén bármely vagy összes ciszteinjét; eszerint a +130, +136 és +139 pozíciókban lévő ciszteinek szedőre cserélhetők (24. ábra). Az immunglobulin molekulában a +148 pozíciójú prolin is lehet szerionét helyettesítve a 24. ábrán látható módon. Továbbá, az immunglobulin alkotórész mutációi érinthetik a +144 pozíciójú leucint (feníl-alaninnal helyettesítve), a +145 pozíciójú leucint (gíutaminsawal helyettesítve), vagy a +147 pozíciójú gllcint (alaninnal helyettesítve).
Az oldható CTLA4 vagy mutáns CTLA4 molekulákban használható további nem~CTLA4 alkotórészek közé tartozik — nem kizárólag — a p97, az env gp120, az £7 és az óva molekula [Dash ef a/. , J. Geo, V/ro/. 75, 1389-1397 (1994); Ikeda ef a/. , Gene 138, 193-196 (1994); Fáik ef a/,, Ceti. Immunoi, 160, 447-452 (1993); Fujisaka et a/,, Víroiogy 204, 789-793 (1994)]. Lehetséges másféle molekulák használata is [Gerard ef a/., Afeurasc/ence 82, 721 (1994); Smith et al, Gc/ence 238, 1704 (1987); Lasky, Science 233, 209 (1996)].
A találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák tartalmazhatnak egy szignálpeptíd szekvenciát is a molekula CTLA4-részének extracelluláris dornénje N-terminális végéhez kapcsolva. Á szignálpeptid bármilyen szekvencia lehet, amely lehetővé teszí a molekula szekrécióját, ide értve az onkosztatin-M szignálpeptidjét [Malik ef a/,, Mól Ceti. Bioi. 9, 2847-2853 (1989)1, a GD5 szignálpeptidjét [Jones ef a/.;, /Vafure 323. 348349 (1988)], vagy bármely extracelluláris fehérje szignálpeptidjét
A találmány szerinti, oldható CTLA4 molekula tartalmazhatja az onkosztatín-M szignálpeptidjét a CTLA4 extracelluláris doménjének N-terminálisához kapcsolva, és a humán immunglobulin molekulát (csukló, CH2, CH3) az (vad típusú vagy mutáns) extracelluláris dómén C-terminálisához kapcsolva. A molekulában az onkosztatln-M szigná'lpeptldje a -28 pozíciójú metionintól a ™1 pozíciójú alarmig tart, a CTLA4 rész a +1 pozíciójú metionintól a +124 pozíciójú aszparagínsavig tart, egy összekötő glutamin van a +125 pozícióban, és az Immunglobulin rész amínosav-szekvencíája a +126 pozíciójú glutaminsavtól a +357 pozíciójú llzinig terjed.
Pontosan meghatározva a találmány szerinti, oldható CTLA4 mutáns molekulák az alább leírt, mutáns CTLA4 szekvenciákat tartalmazó fúziós molekulák, amelyekben humán IgCy 1 alkotórész van a mutáns CTLA4 fragmentumokhoz fuzíonáltatva.
Egy megvalósításban az oldható CTLA4 mutáns molekulák IgCyl-et tartalmaznak egy CTLA4 fragmentummal fuzionálva, amely egy mutációt tartalmaz az extracelluláris doménban. A CTLA4 extracelluláris dornénje metionint tartalmaz a +1, és aszparaginsavat a +124 pozícióban (23. ábra). A CTLA4 extracelluláris része «»Κ <· aíaniní tartalmazhat a -1, és aszparaginsavat a +124 pozícióban. Az egy helyen végrehajtott mutációkra — ahol a +104 pozíciójú teucín van kicserélve más aminosavakra - az alábbi példákat mutatjuk be.
Egyszeres mutáns: Kodon változása;
L194Elg Gíutaminsav GAG
L104Síg Szerin AGT
L1ö4Tlg Treonin ACG
L104Alg Aianin GCG
L104W1g Thpíofan TGG
L104Glg Glutamín CAG
L104Klg Lizin AAG
L104Rlg Arginín CGG
L104Glg Gllcín GGG
Továbbá, találmányunk olyan mutáns molekulákat biztosit, amelyekben az extracellolárís doménben két mutációt hordozó CTLA4 van fuzionáltatva egy IgCyl alkotórésszel. Erre olyan példákat mutatunk be, amelyekben a +104 pozíciójú leucin egy másik amlnosavra (például gíutamínsavra} van kicserélve, és másodikként a +105 pozíciójú gllcín, a +25 pozíciójú íreonin, a +30 pozíciójú treonin, vagy a +29 pozíciójú aianin van kicserélve bármely más amlnosavra.
Kétszeres mutáns: Kodon változása;
l104EG105Fíg FenO-aianin TTC
L1Ö4EG1Ö5Wfg Tripfofán TGG
L104EG195Ug Leucin CTT
L104ES25Rlg Arginin CGG
L1ö4ET3öGlg Giícin GGG
L104ET3GNIg Aszparagin AAT
L104EA29Ylg Tirozin TAT
L1G4EA29Líg Leucin TGG
L104EA29Tlg Treonin ACT
L1G4EA29Wlg Trlptofán TGG
Még továbbá, találmányunk olyan mutáns molekulákat biztosit, amelyekben az extracelluláris doménben három mutációt hordozó CTLA4 van fuzionáltatva egy IgCy 1
7Ö444878A3 alkotórésszel. Erre olyan példákat mutatunk be, amelyekben a +104 pozíciójú íeucin például gíutaminsavra, a +29 pozíciójú aíanín például tirozinra, és a +25 pozíciójú szerin bármely más amínosavra van kicserélve.
Háromszoros mutáns: j Kodon változása:
L1G4EA29YS25Klg ΐ Lizín AAA
LT04EA29YS25KIg i Lizin AAG
L104EA29YS25Nlg | Aszparagin AAG
L1ö4EA29YS25Rlg jArgínin CGG
Az oldható CTLA4 mutáns molekulákban lehet egy összekötő aminosav is a CTLA4 és az lg alkotórészek között. Az összekötő aminosav bármilyen aminosav, így glutamin is lehet. Az összekötő aminosav ismert moíekuíárbíolőgíaí vagy szintetikus kémiai módszerekkel építhető be.
Találmányunk olyan CTLA4 mutáns molekulákat is biztosít, amelyeken egy szígnálpeptid szekvencia kapcsolódik a mutáns molekula CTLA4 része extracelíuláns doménjének M-termínálísához, A szígnálpeptid bármely szekvencia lehet, ami lehetővé teszi a mutáns molekula szekrécióját, így lehet az onkosztatín-M szignáípeptidje [Malik et aí, Moí. Ce//. B/oí 9, 2847-2853 (1989)}, a CDS szignáípeptidje [Jones et al, Natúré 323, 346-349 (1986)}, vagy bármely extracelluláris fehérje szignáípeptidje.
Találmányunk olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat is biztosít, amelyekben a CTLA4 extracelluláris doménje egyetlen mutációt tartalmaz; Ilyen az L1ö4Elg (18. ábra) vagy az LíO4Síg, ahol a +104 pozíciójú íeucin rendre gíutaminsawaí vagy szerinnei van helyettesítve. Az egyetlen mutációt hordozó, mutáns molekulák tartalmaznak egy CTLA4 részt, ami a +1 pozíciójú metíonintói a +124 pozíciójú aszparag insavig tart, egy összekötő glutamint a +125 pozícióban, és egy immunglobulin részt, ami a +128 pozíciójú glutaminsavtól a +357 pozíciójú íízinig tart. A mutáns molekula immunglobulin része is mutáltatva lehet úgy, hegy a +130, +138 és +139 pozíciójú ciszteinek szerinnei, míg a +148 pozíciójú prolin szerinnei lehet helyettesítve. Másrészt az ilyen mutáns molekulák CTLA4 alkotórésze terjedhet a -1 pozíciójú alanintól a +124 pozíciójú aszparag ínsavig.
Találmányunk olyan oldható mutáns molekulákat is biztosít, amelyekben a
CTLA4 extracelluláris doménje két mutációt tartalmaz: ilyen az L104EA29Ylg, az
L1ö4EA29Líg, az L1ö4EA29Ttg vagy az L104EA29Wlg, ahol a +104 pozíciójú íeucin gíutaminsawaí, és a +29 pozíciójú alanin rendre tírozinnaí, leucinnal, treoninnal vagy
704 448/SRB.2 thptofánnal van helyettesítve. A +1 pozíciójú metionínnal kezdődő és a +357 pozíciójú Iízinneí végződő L104EA29Ylg, L104EA29Llg, L104EA29Tlg és L104EA29Wíg szekvenciák egy szígnáipepfid szekvenciával együtt láthatók rendre a 19-22, ábrákon. A két mutációt hordozó, mutáns molekulák tartalmaznak egy CTLA4 részt, ami a +1 pozíciójú metionintól a +124 pozíciójú aszparaginsavíg tart, egy összekötő gíuiamínt a +125 pozícióban, és egy immunglobulin részt, ami a +126 pozíciójú glutaminsavtól a +357 pozíciójú lízinig tart. A mutáns molekula immunglobulin része is mutáítatva lehet úgy, hogy a +130, +136 és +139 pozíciójú ciszteinek szerionét míg a +148 pozíciójú prolin szerinnel lehet helyettesítve. Másrészt az ilyen mutáns molekulák CTLA4 alkotórésze terjedhet a -1 pozíciójú aianintól a +124 pozíciójú aszparaginsavíg.
Találmányunk olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat is biztosit, amelyekben a CTEA4 extracelíulárís doménje két mutációt tartalmaz: ilyen az L104EG105Flg, L104EG105Wlg és az L104EG105Ug, ahol a +104 pozíciójú leucín glutamínsavval, és a +105 pozíciójú glicín rendre tenil-alanlnoal, triptofánnai vagy íeucinnaí van helyettesítve. A két mutációt hordozó mutáns molekulák tartalmaznak egy CTLA4 részt, ami a +1 pozíciójú metionintól a +124 pozíciójú aszparaginsavig tart, egy összekötő glutamlnt a +125 pozícióban, és egy immunglobulin részt, ami a +125 pozíciójú glutaminsavtoi a +357 pozíciójú lizínig tart, A mutáns molekula immunglobulin része is mutáltatva lehet úgy, hogy a +130, +136 és +139 pozíciójú ciszteinek szerinnel, míg a +148 pozíciójú prolin szerinnel lehet helyettesítve. Másrészt az ilyen mutáns molekulák CTLA4 alkotórésze terjedhet a -1 pozíciójú aianintól a +124 pozíciójú aszparaginsavíg.
Találmányunk biztosítja az L104ES25Ríg kettős mutáns molekulát is, amelyben a +1Ö4 pozíciójú leucín glutamínsavval, és a +25 pozíciójú szerín argininnal van helyettesítve. Az L1Ö4ES25Rlg mutáns molekula tartalmaz egy CTLA4 részt, ami a +1 pozíciójú metionintól a +124 pozíciójú aszparaginsavig tart, egy összekötő gluíamint a +125 pozícióban, és egy immunglobulin részt, ami a +126 pozíciójú glutaminsavtól a +357 pozíciójú lizínig tart. A mutáns molekula immunglobulin része is mutáítatva lehet úgy, hogy a +130, +136 és +139 pozíciójú ciszteinek szerinnel, míg a +148 pozíciójú prolin szerinnel lehet helyettesítve. Másrészt az ilyen mutáns molekula CTLA4 alkotórésze terjedhet a ~1 pozíciójú aianintól a +124 pozíciójú aszparaginsavíg.
Találmányunk olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat is biztosít, amelyekben a CTLA4 extraoeííulárís doménje két mutációt tartalmaz: ilyen az LíÖ4ET3ÖGIg és az
L104ET30Nlg, ahol a +104 pozíciójú leucín glutamínsavval, és a +30 pozíciójú treonin rendre gllcinnel vagy aszparaginnal van helyettesítve, A két mutációt hordozó mutáns
704446 * 0 0 molekulák tartalmaznak egy CTLA4 részt, ami a +1 pozíciójú metionintői a +124 pozíciójú aszparagínsavig tart, egy összekötő giutamint a +125 pozícióban, és egy immunglobulin részt, ami a +126 pozíciójú glutamlosavtói a +357 pozíciójú lizinig tart. A mutáns molekula immunglobulin része ís mutáltatva lehet úgy, hogy a +130, +136 és +139 pozíciójú ciszteínek szerlnnel, míg a +148 pozíciójú prolin szerionéi lehet helyettesítve. Másrészt az ilyen mutáns molekulák CTLA4 alkotórésze terjedhet a -1 pozíciójú alanintól a +124 pozíciójú aszparagínsavig.
Találmányunk olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat is biztosit, amelyekben a CTLA4 extraeelluiáris doménje három mutációt tartalmaz: ilyen az t104EA29YS25Klg, az L1ö4EA29YS25Nlg és az L104EA29YS25Rig, ahol a +104 pozíciójú leucin glutamínsavval, a +29 pozíciójú alanin tirozinnal, és a +25 pozíciójú szerín rendre lizinnel, aszparaginnaí vagy argininnal van helyettesítve, A három mutációt hordozó mutáns molekulák tartalmaznak egy CTLA4 részt, ami a +1 pozíciójú metloníntól a +124 pozíciójú aszparagínsavig tart, egy összekötő giutamint a +125 pozícióban, és egy immunglobulin részt, ami a +126 pozíciójú glutam insa vtól a +35? pozíciójú lizinig tart. A mutáns molekula immunglobulin része is mutáftatva lehet úgy, hogy a +130, +136 és +139 pozíciójú ciszteínek szerinnei, míg a +148 pozíciójú proíín szerínneí lehet helyettesítve. Másrészt az ilyen mutáns molekulák CTLA4 alkotórésze terjedhet a -1 pozíciójú alanintól a +124 pozíciójú aszparagínsavig.
Az oldható CTLA4 mutáns molekulák további megvalósításai közé tartoznak a kiméra CTLA4/CD28 homológ mutáns molekulák, amelyek megkötnek egy 87~et (Peach et af., J, Exp, Med. ISO, 2049-2058 (1994)]. Az Ilyen kiméra CTLA4/CD2S molekulák közé tartozik a HS1, H32, HS3, HS4, HS5, HS8, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, H811, HS12, HS13 és HS14 (US 5,773,253 számú szabadalmi irat).
Találmányunk előnyös megvalósításai az oldható CTLA4 molekulák, például a CTLA4íg (ahogy a 24, ábrán látható, a +1 pozíciójú metíoninnal kezdődik és a +357 pozíciójú lizinnel végződik), vagy az L104EA29Ylg (ahogy a 19. ábrán látható, a +1 pozíciójú metíoninnal kezdődik és a +357 pozíciójú lizinnel végződik). Találmányunk biztosítja továbbá azokat a nukleinsav molekulákat, amelyek a találmány szerinti, oldható CTLA4 molekuláknak megfelelő aminosav-szekvenclákat kódoló nukleinsavszekvenciákat tartalmazzák. Az egyik megvalósításban a nukleinsav molekula egy DNS (például egy eDNS), vagy annak egy hibridje. A CTLA4lg-t kódoló DNS-t (24. ábra) 1991.05.31-én helyeztük lététbe az American Type Cultur© Collection-ben, ahol az ATCC 88629 nyilvántartási számot kapta. Az L1 Ö4EA29Yíg-t kódoló DNS~t (19, ábra) '70 4 44 8 /SAS í
♦jt w * * X * ♦ ♦ <· * *♦> *
2000.08.19-én helyeztük letétbe; nyilvántartási száma ΡΤΑ-21Ό4. Más megoldásként a nukieinsav molekula lehet egy RNS vagy annak egy hibridje is,
Másrészt találmányunk egy vektort is biztosít amely a találmány szerinti nukíeotíd-szekvenciáí tartalmazza. Az ilyen expresszíós vektorokra nem korlátozó példaként említjük az emlős gazdasejteket (például BPV-t pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatís); pIRES (Cíontech); pRc/CMV2, pRC/RSV, pSVF1 (Life Technologies); pVPakc, pCMV és pSG5 vektorok (Stratagene)), a retrovírus vektorokat (például pFB vektorok (Strafagene); pCDNA-3 (Invítrogen)j, vagy ezek módosított formáit, az adenovirus vektorokat, az adeno-asszociált vírus vektorokat, a baculovírus vektorokat, az élesztő vektorokat (például pESC vektorok (Stratagene)j.
Biztosítunk egy gazda/vektor rendszert is. A gazda/vektor rendszer egy találmány szerinti vektort tartalmaz egy alkalmas gazdasejtben, Az alkalmas gazdasejtek közé prokarióta és eukaríóta sejtek tartoznak, Találmányunk gyakorlata szempontjából az eukaríóta sejtek az alkalmas gazdasejtek. Az eukariőta sejtek közé tartozik bármely állati sejt (akár primer, akár immortallzált), élesztők (például Saccbaromyoes cerews/ae, Soő/zoseooóaremyoes pombe vagy P/oó/a pastods), és növényi sejtek. A gazdaként használható állati sejtekre példák a mielóma, a COS és a CHÖ sejtek. Különösen alkalmas CHO sejtek (nem kizárólag) a kővetkezők: DG44 (Chasin ef a/.; Som, Ce//, Mo/ec. Génét 12, 555-556 (1986); Kőikékor, S/ocőemsW M 10901-10909 (1997)), CHO-K1 (ATCC CCL-61), CHO-K1 Tet-ön sejtvonal (Cíontech), CHÖ ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wilíshíre, ÜK), CHÖ klón 13 (GEIMG, Genova, Olaszország), CHÖ klón B (GEIMG), CHÖ-K1/SF ECACC 93061607 (CAMR), és RR-CHOK1 ECACC 92052129 (CAMR), Példaszerű növényi sejtek a dohány (egész növény, sejttenyészet vagy kallusz), kukorica, szója és rizs sejtjei. Elfogadhatók a kukorica, szója és rizs magvar is.
A találmány szerinti CTLA4 mutáns molekulák izolálhatók természetben előforduló poiipeptidekként vagy bármilyen más — természetes, szintetikus, féíszíntetíkus vagy rekombináns — forrásból. Ennek megfelelően a CTLA4 mutáns poiipeptid molekulák a természetben előforduló fehérjékként izolálhatok bármely fajból, különösen emlősből, Így birkából, szarvasmarhából, sertésből, rágcsálókból, lóból és előnyösen emberből. Más megoldásként a CTLA4 mutáns poiipeptid molekulák rekombináns poiipeptidekként is izolálhatók, ha prokarióta vagy eukaríóta gazdasejtekben fejeződnek ki, vagy izolálhatók kémiai úton szintetizált poiipeptidekként is.
Szakember könnyen alkalmazhatja a standard izoláló eljárásokat a CTLA4
O-3 4WiíAi5 mo23 lekulák izolálásához. Az izolálás módja és mértéke a forrástól és az izolált molekula szándékolt felhasználásától függ.
A CTLA4 mutáns molekulák, fragmentumaik és származékaik rekombináns eljárásokkal is előállithatók, Ennek érdekében egy izolált nukleotid-szekvenciát, ami vad típusú CTLA4 molekulákat kódol, mutációk bevitelével úgy módosíthatunk, hogy egy, a mutáns CTLA4 polipeptid molekulákat kódoló nukleotid-szekvenciát kapjunk. így például a mutáns CTLA4 molekulákat kódoló nukieotíd-szekvenciák helyre irányított mutagenezissel állíthatók elő, amihez primereket és POR sokszorozást alkalmazunk. A primerek specifikus szekvenciák úgy megtervezve, hogy a kívánt mutációt eredményezzék. Más megoldásként olyan primerek is használhatók, amelyekkel véletlenszerű mutációk hozhatók létre. A CTLA4 mutáns polípeptideket kódoló, mutáns polinukleotid elkészítésére és izolálására standard rekombináns módszerek (Sambrook, Fitch és Maniatis; „Molecular Cloning: A taboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, 1989) és PCR technológia (US 4,803,182 számú szabadalmi irat) alkalmazható.
Találmányunkhoz tartoznak az immunrendszer megbetegedéseinek kezelésére használható gyógyszerkészítmények is, amelyek oldható CTLA4 molekulák gyógyászatilag hatásos mennyiségeit tartalmazzák. Bizonyos megvalósításokban az immunrendszer megbetegedéseit a CD28/CTLA4/B7 kölcsönhatások közvetítik. Az oldható CTLA4 molekulák előnyösen vad típusú szekvenciával rendelkező, oldható CTLA4 molekulák és/vagy olyan CTLA4 molekulák, amelyekben a CTLA4 extraceiluláris doménje egy vagy több mutációt tartalmaz. A gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak oldható CTLA4 fehérjemolekulákat és/vagy nukleinsav molekulákat és/vagy a molekulákat kódoló vektorokat. Előnyős megvalósításokban az oldható CTLA4 molekulák amínosav-szekvenciája megegyezik a CTLÁ4 extraceiluláris doménjének aminosav-szekvenoiájával, amint az a 24. és 19. ábrákon látható (rendre a CTLA4lg és az L1Ö4EA29Ylg). Még előnyösebben az oldható CTLA4 molekula a találmány szerinti L104EA29Ylg. A készítmények adott esetben más hatóanyagokat, Igy gyógyszertoxinokat, enzimeket, antitesteket vagy konjugátumokat is tartalmazhatnak; a felsorolás nem kizáró jellegű.
A szakterület bevett gyakorlata szerint a gyógyszerkészítmények a molekulákat egy elfogadható vivőanyaggal vagy adjuvánssal összekeverve tartalmazhatják. A gyógyszerkészítmények előnyösen olyan vivöanyagokat és adiuvánsokat tartalmaznak, amelyek a találmány szerinti molekulákkal (például egy oldható CTLA4 molekulával, így CTLA4lg-nal vagy L1Ö4EA29Ylg-naí) összekeverve megőrzik a molekulák akW 44$ /M3 tivítását és nem lépnek reakcióba a beteg immunrendszerével· Az ilyen vivőanyagok és adjuvánsok közé tartoznak — nem kizárólag — ioncserélők, aíumlnium-oxid, aíuminíum-szteaFát iecitin, szérumfehérjék (például humán szérumalbumin), pufferek (például foszfátok), glícin, szorbinsav, kállum-szorbát, telített növényi zsírsavak részleges gíiceridjeinek keverékei, foszfát-pufferes fiziológiás nátrium-kloríd-oldaf, víz, emulziók (például olaj/viz emulziók), sók vagy elektrolitok (például protamin-szulfát, dlnátrlum-hídrogén-foszfát, kálium-dlhidrogén-foszfát, náfrium-klond, cinksők), kolloid kovasav, magnézium-friszíííkát, polifvíníl-pírrolidon), cellulóz-alapú vegyüietek és poíietíléngíikol. Hordozók lehetnek steril oldatok vagy tabletták, így drazsék és kapszuIák is. Az Ilyen hordozók segédanyagként tipikusan keményítőt, tejet, cukrokat (például szacharózt, glükózt, maltózt), bizonyos agyagféleségeket, zselatint, szíearinsavat vagy sóit (magnézium- vagy kaíeium-sztearátot), talkumot, növényi zsírokat vagy olajokat, mézgákat, glíkolokat és más ismert segédanyagokat közé tartozhatnak aromák és színezékek, vagy más adalékok. Az It tartalmazó hordozók jól ismert módszerekkel formálhatók. Az ilyen készítmények különböző lipid kompozíciókban, például íiposzómákban valamint különböző polimerkompozíciókban, például polimer mikrogomhökben is elkészíthetők.
Találmányunk eljárásokat biztosit a CTLA4- és CD28-pozítív sejtek és a B7-pozitiv sejtek közötti funkcionális kölcsönhatások szabályozásához. Az eljárások magukban foglalják a B7-pozitív sejtek érintkeztefését egy találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulával úgy, hogy oldható CTLA4/B7 komplexek keletkezzenek, amelyek megzavarják egy endogén CTLA4 és/vagy CD28 molekula reakcióját egy B7 molekulával.
Találmányunk eljárásokat biztosít a T-sejtek funkciójának gátlására, —de nem a T-sejtek számának csökkentésére — emberben azáltal, hogy a 37-pozitív sejteket a betegben egy oldható CTLA4 molekulával érintkezteíjük. Az oldható CTLA4 molekulák közé tartozik a CTLA4lg és az oldható, mutáns CTLA4 molekula, az L104EA29Ylg.
Továbbá; találmányunk eljárásokat biztosít az Immunrendszer megbetegedései, így a reumás betegségek kezelésére. Az eljárások magukban foglalják egy gyógyszer— amely a találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulákat tartalmazza — egy személynek azzal a céllal, hogy immunrendszere megbetegedésének legalább egy tünetét enyhítse. Emellett találmányunk hosszú időtartamú terápiát is biztosít az immunrendszer megbetegedéseinek kezelésére azáltal, hogy gátoljuk a T-sejtek és a B7-pozitív sejtek kölcsönhatását, miáltal gátoljuk a T-sejtek például a B7 és
CD28 kötődése általi kostímuláciöját, ami a T-sejtek energiájához vagy toleranciájához vezet. Az immunrendszer megbetegedései közé tartoznak — nem kizárólag — az autoimmun betegségek, az ímmunpmliferati'v betegségek és a szövetátültetéssel kapcsolatos betegségek. A szövetátültetéssel kapcsolatos betegségek közé tartozik a „graft vsrsus hőst” betegség (GVHD, például ami csontvelő-átültetés vagy tolerancia Indukálása következtében lép fel), az átültetett szövetek kilökődésével kapcsolatos immunbetegség és a krónikus kilökődés, ami allé- vagy xenograftok (teljes szervek, bőr, szövetszígetek, Izmok, máj- és idegsejtek} esetében lép fel. Az ímmunprolifératív betegségekre nem kizárólagos példák a pszoriázis, a T-sejtes Ilmfóma, a T-sejtes akut limfoblasztos leukémia, a tesztikuíáns angiocentrikus T-sejtes Ilmfóma, a rosszindulatú límfocitás érgyulladás. a lupus (/opus erythemafosus, /. nepboás), a Hashímoto-szindróma, a primer míxödéma, a Graves-betegség, a vészes vérszegénység, az autoimmun atrófiás gyomorhurut, az Addison-kőr, a cukorbetegség (például az inzulinfüggő, az I, és II. típusú diabétesz), a miaszténia gravisz, a pemph/gus, a Crohn-betegség, a szemgyuöadás, az autoimmun uveagyulladás, a „Good Fasture’s szindróma az autoimmun » lefolyású glomeruionefrltisz}, a szklerózis anémia, az idiopátlás trombocitopéníu, a primer bílláris cirrőzis, a krónikus is, a fekélyes vastagbélgyulladás, a Sjögren-szindróma, a reumás megbetegedések (például a reumatoid artriiísz), a többszörös Izomgyulladás, a szkleroderma és a vegyes kötőszövet-betegségek.
A találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák gátló tulajdonságokat mutatnak /n vtm, Olyan körülmények között, ahol T-sejt/BT-pozitiv sejt kölcsönhatások, például ík és S7~pozitív
T-sejt/B-sejt kölcsönhatások lépnék fel T-s következményeként, a bevitt CTLA4 molekulák kötődéssel reagálnak a B?-pozítív sejtekkel, például a B-sejtekkei, és ezáltal megzavarják, azaz gátolják a T-sejt/BT-pozitív sejt kölcsönhatást, aminek eredménye az immunválasz szabályozása.
Találmányunk eljárásokat biztosít az immunválasz fékezésére („leszabályozás). Az Immunválasz leszabályozása úgy valósulhat meg, hogy a találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák gátolják vagy blokkolják a már működésben lévő immunválaszt vagy megelőzik az immunválasz kiváltását, A találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák gátolhatják az aktivált T-sejtek, például a T-íimíocilák szaporodását és dokinéciőját. elnyomhatják a T-sejtek vá
toleranciát índukálhatnak a T-sejtekben, vagy mindkettő bekövetkezik. Továbbá, a találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák megzavarják a CTLA4/CD2S/B7 reakciómat, és ezáltal gátolják a T-sejtek szaporodását és/vagy ciickín-szekrécíóját, aminek eredménye a szöveti károsodás csökkenése és a T-sejfek índukáihatatlansága vagy energiája.
Találmányunk egy előnyös megvalósításában az L104EA29Ylg oldható, mutáns CTLA4 molekulát használjuk a CTLA4- és CD2S~pozitív sejtek és a 87-pozitiv sejtek közötti funkcionális kölcsönhatás szabályozására, hogy ezzel kezeljük az immunrendszer megbetegedéseit, például a reumás betegségeket, és/vagy leszabályozzuk az immunválaszt, A találmány szerinti LTÖ4EA29Ylg egy oldható, mutáns CTLA4 molekula, amiben legalább két aminosav van kicserélve· a +104 pozíciójú ieucín (L) glutaminsavra (E) és a +29 pozíciójú alanín (A) tirozinra (Y). Az L104EA29Ylg molekula az előbbi kettő mellett további mutációkat is tartalmazhat.
Egy előnyös megvalósítás magában foglalja egy reumás betegség, például a reumatoíd artrítisz kezelésének eljárását, aminek során egy oldható CTLA4 molekula hatásos mennyiségét adjuk be egy betegnek, A gyógyszerkészítmény hatásos mennyiségének beadásával a betegséghez társuló tünetek — például az ízület megduzzadása, fájdalmassága, gyulladása, reggeli merevsége és fájdalma, valamint a szerkezeti károsodás következtében fellépő fizikai akadályozottsága — közül legalább egyet enyhíteni lehet. A találmány szerinti eljárások alkalmasak a reumatoíd artritlszhez társuló olyan tünetek legalább egyikének enyhítésére is, mint a fokozott vérsejtsúllyedés, vagy a C-reaktív fehérje, az oldható 1CAM-1, az oldható E-szelektln és/vagy az oldható IL-2r magas szérumszintje.
A tünetek találmányunk szerint biztosított enyhülése jól mérhető bármely elfogadott kritérium-rendszerrel, amely tünetek mérésére és dokumentálására szolgál egy klinikai vizsgálatban. Az elfogadott kritérium-rendszerek közé tartozik az American College of Rheumatology rendszere (például az ACR-20), a tünet enyhülésének négy mérőszáma (in; CDER Guideline fór the Clinioal Evaluatlon of Anti-lnflammatory and Antirheumatic Drugs — PDA 1988K), és a Health Assessment Guestionnaire [HÁG; Fries ef at d. Rheumst. 9, 789-793 (1982)j. A fenti kritériumok általános leírását a Guldance fór Industry: Clinical Deveiopment Programs fór Drugs, Devices, and Biologíoal Products fór the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA), (1999) című segédletben találjuk meg.
A találmány szerinti kezelésben részesülő alanyok közé emlősök, igy ember, majmok, csimpánz, kutya, macska, szarvasmarha, lő, nyúl. egér és patkány tartozhat.
Találmányunk különböző — lokális vagy szisztemlkus---eljárásokat biztosít az oldható CTLA4 molekulák alkalmazására. Az eljárások közé tartozik az intravénás, intramuszkuláris, intraperitoneálís, orális, iohaláclós és szubkután beadás, valamint a
704H8/M2
ΦΧ * «*** ,χ χ *φ Φ * * φ Φ ΦΦΦ ♦* φ * * * *
ΦΦΜ* **» *** X* φφ beültethető adagoló·, a folytonos infúzió, a génterápia, a liposzőmák, kúpok, helyi érintkeztetés, vezíkulumok, kapszulák és injekciós módszerek alkalmazása. A hatóanyagot — egy vivőanyaggal együtt — rendesen liofilízálva tároljuk, majd vízzel vagy egy semleges pH-jú (körülbelül 7-8, például 7,5) pufferoldattal rekonstruáljuk a beadás előtt.
A szakterület szokásos gyakorlata szerint a találmány szerinti készítmények bármilyen győgyszerészetileg elfogadható formában beadhatók egy személynek.
Találmányunk gyakorlata szerint az eljárások magukban foglalják a találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák beadását egy alanynak, hogy szabályozzuk a CD28- és/vagy CTLA4-pozitív sejtek kölcsönhatásait a B7-pozitív sejtekkel A 87-pozitlv sejteket a találmány szerinti CTLA4 molekulákkal, fragmentumaikkal vagy származékaikkal érintkeztél] Ük, hogy oldható CTLA4/B7 komplexek keletkezzenek. A komplexek megzavarják az endogén CTLA4 és CD28 molekulák kölcsönhatását a B7 család molekuláival.
Az oldható CTLA4 molekulák olyan mennyiségben és Ideig (azaz időtartamon át és/vagy több időpontban) adhatók be egy alanynak, amely elegendő annak megakadályozásához, hogy a B7 molekulák a megfelelő lígandumaikhoz kötődjenek az alanyban. Az endogén B7/ligandum kapcsolat gátlása fogja meggátolni a kölcsönhatásokat a 87-pözitlv sejtek és a CO28- és/vagy CTLÁ4-poziíiv sejtek között.
Egy hatóanyag adagolása számos tényezőtől függ, igy — nem kizárólag — az érintett szövet típusától, 3 kezelt autoimmun betegség típusától, a betegség súlyosságától, a személy általános egészségi állapotától és a hatóanyagra adott válaszreakciójától Ennek megfelelően a hatóanyag dózisai személyenként és a beadás módjától függően változhatnak. Az oldható CTLA4 molekulák 0,1-20,0 mg/kg testtömeg/nap, előnyösen 0,5-10,0 mg/kg/nap mennyiségben alkalmazhatók.
Találmányunk magában foglalja a találmány szerinti készítmények más gyógyszerekkel való együttes alkalmazását is az immunrendszer megbetegedéseinek kezelésére, így például a reumás betegségek kezelhetők a találmány szerinti molekulákhoz társított ímmunszupresszánsokkal, például kodskoszteroídokkal, ciklosponnnal (Mathiesen, Cancer L&ft. 44, 151-156 (1989)], prednizonnal, azatlopnnnel, rnetotrexáttal (Handschumacher, in: „Drog üsed fór Immunosuppression”, pp. 1264-1276), a TNFa blokkolóival vagy adagon istáival {/Vetv Eng/and J, Á4ed, 340, 253-259 (1999): táncét 354., 1932-1939 (1999); Ann. totóm. MM, 130, 478-486], vagy bármilyen más biológiai hatóanyaggal, amelynek hatása bármely, gyulladással kapcsolatos citokínre Irányul, mint amilyenek a nem-szteroid gyulíadásgátió hatóanyagok és/vagy Cox-2 inhibitorok, * * XX X * * χ * ** χ * * * * χκχχ *** **· ♦♦a hidroxí-kiorokvin, szulfaszalazopídn, aranysők, etanercepf, ínfixlmab, rapamicin, mikofenolát-mofetít baziliximab, citoxán, β-la interferon, β-íb interferon, glatiramer-aceíát, mitexanfron-hidrökíörid, anakinra és/vagy más biologikumok.
Az oldható CTLA4 molekulák (előnyösen az L104EA29Ylg) az alábbi hatóanyagok közül eggyel vagy többel kombinálva is használhatók az Immunválasz szabályozására: oldható gp39 [ismert még mint CO404igandum (CD40L), CD154, T-8AM vagy TRAP}, oldható CD29, oldható CD40, oldható CD80 (például az ATCC 88827), oldható CD86, oldható CD28 (például az ATCC 88828), oldható CD58, oldható Thy-1, oldható CDS, oldható TCR, oldható VLA-4, oldható VCAM-1, oldható LECAM-1, oldható ELAM-1, oldható CD44, a gp39-cel reagáló antitestek (például az ATCC H8-1Q918, H8-12Ö55 vagy HB-12056}, a CD4Ö-nef reagáló antitestek (például az ATCC HB-9110), a B7-fel reagáló antitestek (például az ATCC H8-253, CRL-2223, CRL-2228, HB-301, H8-11341, és a többi), a CD28-cal reagáló antitestek [például az ATCC HB-1194 vagy az mAb 9,3, amit Martin ef a/., V C/te. immun. 4, 18-22 (1980) írtak le), az ÍFA-1-gyei reagáló antitestek (például ATCC HB-9579 vagy T18-213), az LFA-2-vel reagáló antitestek, az IL-2-vel reagáló antitestek, az IL-12-vel reagáló antitestek, a γ-interferonnal reagáló antitestek, a CD2-vel reagáló antitestek, a CD48-cal reagáló antitestek, az ICAM-mal reagáló antitestek [például az tCAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 vagy ICAM-3], a CTLA4~gyel reagáló antitestek (például az ATCC H8-304), a Thy-t-gyel reagáló antitestek, a CD58-tal reagáló antitestek, a CD3~mal reagáló antitestek, a CD29-cel reagáló antitestek, a TCR-rel reagáló antitestek, a VLA-4-gyei reagáló antitestek, a VCAM-1-gyel reagáló antitestek, a LECAM-1~gyel reagáló antitestek, az ELAMI-gyel reagáló antitestek és a CD44-gyei reagáló antitestek. Bizonyos megvalósításokban előnyösek a monoklonális antitestek. Más megvalósításokban antitest fragmentumok az előnyösek. Egy szakember könnyen megérti, hogy a kombináció magában foglalhatja a találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulákat és egy másik immunszupressziv hatóanyagot, az oldható CTLA4 molekulákat és két másik immunszupressziv hatóanyagot, az oldható CTLA4 molekulákat és három másik immunszupreszszív hatóanyagot, és a többi. Az optimális kombinációk és adagolásuk módja jól ismert módszerekkel határozhatók meg és optimalizálhatok.
Specifikus kombinációk a kővetkezők: L104EA29Ylg és CD88 monoklonális antitestek (mAbs); L104EA29Ylg és CO88 mAbs: L104EA29Ylg, CDSO mAbs és CD 86 mAbs; L104EA29Ylg és gp39 mAbs; L104EA29Yíg és CD40 mAbs; L104EA29Ylg és
CD28 mAbs; L1G4EA29Yfg, CD80 és CD88 mAbs, és gp39 mAbs; L104EA29Y!g,
7iM«3/a&Z * X ♦* * * .*·»*· «♦
CD80 és CD86 mAbs, és CD40 mAbs: és LlO4EA29Yíg, anti~LFA1 mAbs és antigp39 mAbs. A gp39 mAbs~re speciális példa az MR1, A szakemberek számára további kombinációk is könnyen elfogadhatók.
A találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák, így például az L104EA29Ylg alkalmazható egyedüli hatóanyagként, vagy más hatóanyagokkal együtt az immunmodulátorok vagy gyuiíadásgátlók közül például allo- vagy xenograftok akut vagy krónikus kilökődése, gyulladások vagy autoimmun betegségek kezelésére vagy megelőzésére, vagy tolerancia índukálására használhatók. így például kombinálhatók egy kalcineurin inhibitorral (például clklosporin-A-vai vagy FK506~tal), egy immunszupresszív makroliddal (például rapamicinnel vagy egy származékával, mint amilyen a 4Ö~O-C2~hidroxí~etll)-rapamloin], egy límfocitára irányuló hatóanyaggal (például az FTY72Ö vagy egy analógja), kortikoszteroidokkal, ciklofoszfamiddal, azatiophnnel, metotrexáttal, leflunomiddaí vagy egy analógjával, mizoribinnel, mikofenolsawal, mlkofenolát-mofetíllel, 15-dezoxi-spergualinnal vagy egy analógjával, immunszupresszív monoklonális antitestekkel (például a íeukocita-receptorok antitesteivel, mint amilyen az MHC, CD2, CD3, CD4, CD1la/CD18, CD?, CD25, CD27, 87, CD4Ö, CD45, CD58, CDI37, ICOS, CD159 (SLAtvl), 0X40, 4-1 BS vagy ligandumaík), vagy más immunmodulátor vegyületekkel (például a C4/CD28~íg), vagy más adhézíó-ínhíbítorokkaí (például monoklonális antitestek vagy kis moiekuiatömegű inhibitorok, köztük LFA-1 antagonisfák), szelekbe vagy VLA-4 antagooistákkal A vegyület különösen jót
Iható egy olyan vegyüíettel kombinálva, amely a Cö4Ö~nel és lígandumaival inierferál, mint amilyenek például a CD40 és a CD4Ö-L antitestei.
Ha a találmány szerinti, oldható CTLA4 mutáns molekulákat más immunszupressziv-immunmoduláns vagy gyuiladáselienes terápiával együtt alkalmazzuk például a fent leírt módokon, akkor az együttesen alkalmazott ímmunszupresszáns, immunmodu ίο!
tói (például egy cíklosporín-e az, vagy egy szteroid), a kezelt állapottól, és a többi, fog függent
Ez előzőekben leírtaknak megfelelően találmányunk még további eljárásokat biztosit, amelyek magukban foglalják a találmány szerinti, oldható CTLA4 molekulák, például a €TLA4ig és/vagy L104EA29YÍg szabad formában vagy gyógyszerészetileg elfogadható só formájában történő együttes — egyszerre vagy egymás utáni — alkalmazását egy második hatóanyaggal, ahol az említett második hatóanyag egy imunszupresszáns, immunmodulátor vagy gyuliadásgátló hatóanyag lehet a fent emií30
99
99 tettek közül. Biztosítunk továbbá terápiás kombinációkat, például egy készletet, például a fent leírt eljárások bármelyikében való használatra, amely készlet egy oldható CTLA4 molekulát tartalmaz szabad formában vagy gyógyszerészetlteg elfogadható só formájában, ami egyszerre vagy egymás után adható be legalább egy másik gyógyszerkészítménnyel, amely egy immunszupresszáns, immunmodulátor vagy gyulladásgátló hatóanyagot tartalmaz. A készlet használati utasítást is tartalmazhat
Találmányunk eljárásokat is biztosít a találmány szerinti, oldható CTLA4 mutáns molekulák előállításához is. Az oldható CTLA4 mutáns molekulák prokarióta vagy eukarióta sejtekben is kiíejezteíhetök.
A prokartötákat leggyakrabban különböző baktériumtörzsek képviselik. A baktériumok lehetnek Gram-pozitívok vagy Gram-negatsvok. Tipikusan a Gram-negatív baktériumok — például az £ oo/Z — az előnyösek. Más mikroorganizmus-törzsek Is használhatók. Az oldható CTLA4 mutáns molekulákat kódoló szekvenciák egy vektorba inszsrtálhatók, ami úgy van megszerkesztve, hogy idegen szekvenciákat fejeztessen ki prokarióta sejtekben, például £ coféban. Ezek a vektorok magukban foglalhatnak közönségesen használt prokarióta szabályozó szekvenciákat, köztük promoíerokat a transzkripció megindításához, adott esetben egy operátorral és riboszóma-kötöhelyekkel együtt, így olyan, általánosan használt promoterokat, mint a β-laktamáz (penioillináz) és a iaktáz (lac) promoter-rendszerek (Chang et aZ, Aíafore 198, 1056 (1977)1, a tnptofán (trp) promoter-rendszer (Goeddei ef at /VucZ. Ac/ds Rés. 8, 4057 (1989)},: vagy a lambda-fág eredetű P(_ promoter és az N-gén nboszóma-kőtőhely (Shimatake ef a/., /Vetőre 292, 128 (1981)].
Az ilyen expresszíós vektorok replikácíós kezdőpontokat és szelektálható markergéneket is tartalmazhatnak, mint amilyen a β-laktamáz vagy neomicin-foszfoíranszferáz gén, amelyek antibiotikum-rezisztenciát biztosítanak. Az ilyen vektorok replikálódní képesek baktériumokban és a plazmidot hordozó sejtek kiválaszthatók, ha a tenyésztés egy antibiotikum, például ampícillin vagy kanamicin jelenlétében történik.
Az expresszíós plazmid különböző standard módszerekkel juttatható be a prokarióta sejtbe; ilyen például a kaioium-klortd-sokk (Cohen, Proc. ZVatZ. Aoad. ScZ. t/SA 69, 2110 (1972): Sambrook et a/. , Zd műj, vagy az elektroporáció.
Találmányunk gyakorlatának megfelelően eukarióta sejtek is alkalmas gazdasejtek lehetnek. Az eukarióta sejtek közé tartozik bármely állati sejt, akár primer, akár ímmortalízált; élesztősejtek (például Gacoóaromyces cerews/ae, Sert/zosaceősfömyces pornóé és P/ert/a pas/ons), és növényi sejtek. A gazdasejtként használható állati sej31 lekre példák a mlelóma, a COS és CHO sejtek, A különösen alkalmas OHÖ sejtek közé tartoznak — nem kizárólag — a DG44 (Chasin et al, Som, Ce//. ófo/ec. Génét 12, 555-556 (1986); Kolkekar, S/ochem/sby 36, 10901-10909 (1997)1 a CHO-K1 (ATCC CCL-61), a CHO-K1 Tet-On (Clontech), az ECACC 85050302 jelzésű CHO (CAMR), a CHO klón 13 (GEIMG), a CHO klón B (GEIMG) az ECACC 93081607 jelzésű CBÖ-K1/SF (CAMR), és az ECACC 92052129 jelzésű RR-CHO KI (CAMR) sejtvonalak. Példaszerű növényt sejtek a dohány (egész nővény, sejttenyészet vagy kalSusz), a kukorica, a szója és a rizs sejtjei. Elfogadhatók a kukorica-, szója- és rizsmagvak is,
A CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleinsav-szekvenciák is illeszthetők a vektorokba, amelyek ügy vannak megszerkesztve, hogy idegen szekvenciákat fejezzenek ki egy eukarióta gazdában. A vektor szabályozó elemei az adott eukarióta gazdától függően változhatnak.
Az expressziós vektorokban széles körben használt szabályozó szekvenciák közé promoterok és olyan szabályozó szekvenciák tartoznak, amelyek kompatíbilisak az emlős sejtekkel; ilyen például a CMV promoter (CDM8 vektor) és a majomszarkóma vírus (ASV, nLN vektor). További, általánosan használt promoterek a simian vírus 40 (SV40) korai és késői promoterai [Fiers et al, Natúré 273, 113 (1973)], vagy más vlrus-promoíerok például a poílőma, az adenovirus-2 vagy a marhapapillőma vírusból. Egy indukálható promoter, például a hMTil (Karín et al, A/a/ure 299, 798-802 (1982)] is használható.
A CTLA4 mutáns molekulákat eukariótákban ciáit is tartalmazhatják. Ezek a génkifejeződés optimalizálásához fontosak és a promoter-szakasz alatt vagy fölött találhatók meg.
Az eukarióta gazdasejtekben használható vektorok közé tartoznak — nem kizárólag — az emlős gazdasejtekben használható vektorok, például a BPV-1, pHyg, pTK2 (Maniatís), pfRES (Clontech), pRc/CMV2, pRo/RSV, pSFVi (Life 5), a pVPakc vektrokok, pCMV vektorok, pSG5 vektorok (Straíageoe), a refrovlrus-vektorok (például a pFB vektorok, Strafagene), a pCDNA-3 (invitrogen) vagy módosított változatai, az adenovírus-vektorok, az adeno-asszociáit vírus vektorok, a L Strafagene).
baculovírus-vektorok és az élesztő-vektorok (például a
A CTL.A4 mutáns molekulákat kódoló nukleinsav-szekvenciák az eukarióta gazdasejt genomjába és azzal együtt replikélődbaínak. Más a CTLA4 mutáns molekulákat hordozó vektor replikációs kezdőhelyet is tártál
7O4448.ZP.
ZZ ♦ «««« ♦:» ♦' # * « X 4 »4 * ♦·♦ X « fc 0 ♦ * ♦ 44 X 4 4 449 mazhat. amely lehetővé teszi az extrakromoszomáiís repíikációt
A nukleinsav-szekvenciák Sacchanjmyces cerev/s/ae-ben történő kifejeztetéséhez az endogén élesztő-piazmíd, a 2μ kör reptíkációs kezdőhelyét használhatjuk {Broach, M&íh, Enzymef. 101, 307 (1983)]. Más megoldásként használhatjuk az élesztő-genom olyan szekvenciáit is, amelyek elősegítik a független repíikációt (Stinchcomb ef a/,, Afafure 282, 38 (1978); Tschemper ef a/., Gene 10, 157 (1980); Clarké &f at, Mefh. Enzymoí. 101, 300 (1983)1
Az élesztő-vektorok számára megfelelő transzkripciós szabályozó szekvenciák közé tartoznak a glíkolitikus enzimek szintézisének promoteraí (Hess ef af., J. Áóv, Eozyme Reg, 7, 149 (1968); Holland et a/,, Bloch&mist/y 17- 4900 (1978)}. A szakterületen ismert további promoterok közé tartozik a CMV promoter (a CDM8 vektorban; Toyama és Okayarna, FESS 268, 217-221 (1990)), a 3-foszfo-glicerinsav-kináz promofere (Hitzeman ef a/,, J. B/oí Chem. 255, 2073 (1980)}, és más gíikolltikus enzimek promoteraí,
Más promoterok viszont indukálhatok, azaz működésüket környezeti hatások vagy a sejtek tápközege szabályozza. Az ilyen promoterok közé a hősokk-fehérjék, az aikohol-dehidrogenáz-2, az ízocitokróm-C, a savas íoszíatáz, a nitrogén-katabolizmus enziméi, illetve a maltóz- és galakfőz-fethasznáíás enzimei génjeinek promoteraí tartoznak, A kódoló szekvenciák 3!~végénél szabályozó szekvenciák is elhelyezkedhetnek. Ezek a szekvenciák a mRNS-t stabilizálhatják. Ilyen terminátorok találhatók számos élesztő és emlős gén 3' le nem fordított területén, ami a kódoló szekvenciát követi.
A növények és növényi sejtek számára példaszerű vektorok közé tartoznak — nem kizárólag — az Agmbaofebum Ti píazmídok, a karfiolmozaik vírus (CaMV) és a paradicsom aranymozaik vírus (TGMV).
Áz emlős gazdasejt-rendszer transzformációjának általános vonatkozásai az US 4,389,216 számú szabadalmi iratban vannak leírva, Áz emlős sejtek olyan eljárásokkal transzformálhatok, mint a kalcium-foszfát jelenlétében végzett transzfekciö, a mikroínjektálás, az elektroporáciő vagy a virális vektorokkal végzett transzdukció.
Az Idegen DNS-szekvenciákat növények vagy élesztők genomjába juttató eljárások közé tartoznak (1) mechanikai eljárások, például a DNS míkrclnjektálása egyes sejtekbe vagy protoplaszfokba, a sejtek keverése üveggyöngyökkel a DNS jelenlétében, vagy DNS-sel bevont wolfram- vagy aranyszemcsék belövése a sejtekbe vagy protoplaszfokba; (2) a DNS bejuttatása a sejthártya makromolekulák számára átjárhatóvá tételével például políetiiénglikolos kezeléssel vagy nagy feszültségű elektromos
704448/ 77 7 * Λ
impulzusokkal (elektroporáció); vagy (3) a DNS-i tartalmazó liposzómák használata, amelyek fuzionálnak a sejtbártyával.
Miután a találmány szerinti CTLA4 mutáns molekulák kifejeződtek, a szakterületen jól ismert módszerekkel izolálhatok. Ilyen módszer a sejtek „feloldása” (például ultrahanggal, iizozimmal és/vagy detergensekkel), majd a kinyert fehérje megtisztítása standard fehérjefisztító eljárásokkal, például affinitás- vagy ioncserélő kromaíográfiávai, hogy megkapjuk a lényegében tiszta terméket (Scopes, in. „Protein Purifiatíon: Principles and Praetioe, 3. kiadás, Springer Verlag, 1994: Sambrook eí a/., id. mű). A CTLA4 mutáns molekulák expresszíója a szakterületen ismert módszerekkel mutathatók ki, igy például Coomassie-kékkel megfestve SOS-PAGE lemezeken vagy ímmunblot-módszerekkei, a CTLA4~hez kötődő antitestek használatával.
Az alábbi példákat találmányunk bemutatására és azért közöljük, hogy segítsük a hozzáértőket megvalósításában és alkalmazásában, de semmiképp sem az a szándékunk, hogy korlátozzuk velük találmányunk oltalmi körét.
t. példa:
A találmány szerinti CTLA4 molekulákat kódoló nukleotld-szekvenclák elkészítésére szolgáló eljárások
Először elkészítjük a CTLA4ig-t kódoló plazmidot és kifejeztetjük a CTLA4lg molekulát az US 5,434,131, 5,885,579 és az 5,851,795 számú szabadalmi iratokban leírt módon. Ezután egyszeres mutáns molekulákat (például L1Ö4Elg) készítünk a CTLA4lg-t kódoló szekvenciából, kifejeztetjük és megvizsgáljuk a kötődési kinetikáját különböző 87 molekulákhoz. Az L104Eíg nukleofíd-szekvenciát (amit a 18. ábrán látható szekvencia foglal magában) használjuk terápiáiként a kétszeres mutáns CTLA4 szekvenciák elkészítéséhez (amelyeket a 19-22, ábrákon látható szekvenciák foglalnak magukban), amiket fehérjeként kifejeztetünk és megvizsgáljuk a kötődési kinetikájukat. A kétszeres mutáns CTLA4 molekulák közé tartozik az L104EA29Ylg, L1Ö4EA29Llg, L104EA29Tlg és L104EA2SWIg. Készítünk három mutációt hordozó molekulákat is.
A C7LA4Tp szerkezei
Egy genetikai szerkezetet, ami a CTLA4lg-t kódolja és a CTLA4 extracelluláris doménje mellett egy IgCyl domént tartalmaz, készítünk az US 5,434.131, 5,844,095 és 5,851,795 számú szabadalmi iratok leírásai szerint, amelyeket találmányunkban referenciaként tekintünk. A CTLA4 gén extracelluláris doménjét PCR-vaí klónozzuk a
04448/HAS «χ««
X »<
publikált szekvenciának (Danavaeh of a/,, Ear. J. Immunoi. 18, 1901-1905 (1988)] megfelelő szintetikus oligonukleotldokat használva.
Mivel a CTLA4 génben nem azonosítottak egy szignál-pepiidet a CTLA4 számára, a CTLA4 prediktált szekvenciájának N-fermináilsáboz az onkosztatin-M szígnáípeptidjét (Malik aíaí, Mof Ce//. B/o/, 9, 2847 (1989)1 kapcsoljuk két lépésben, átfedő eíigonukíectídokai használva. Az első lépésben a
CGTGGCCCAGCC oligonukleotídot (amely az onkosztatin-M szígnálpeptid 15 C-termlnális amínosavát tartalmazza a CTLA4 7 N~termináOs aminosaváhcz kapcsolva) használjuk „előre” primerként és a
TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG oligonukleotídot (amely a CTLA4 receptor 119-125 pozíció amlnosavalt kódolja és egy Bell restrikciós helyet tartalmaz) használjuk „fordított primőrként. Ezek a terápiátok cDNS-ek, amelyeket 1 pg összes RNS-en szintetizálunk (az RNS H38 sejtekből származik, ami egy HTLVII vírussal fertőzött, leukémiás T-sejt vonal; Salahudin és Gallo, NO, Bethesda, Md,). Az első lépés PCR-termékének egy részét újra sokszorozzuk egy átfedő „előre primőrrel, ami az okosztatin-M szignál-peptidjének N-terminálls részét kódolja és egy Hindlll restrikciós endonukleáz hasítási helyet tartalmaz és egy ugyanolyan fordított primőrrel. A PCR termékét Hindlll és Bell endonukleáxokkal emésztjük és a Bcll/Xbal enzimekkel elhasított oDNS fragmentummal — ami az IgCyl csukló, CH2 és CHS régióinak megfelelő amlnosav-szekvenclát kódolja — együtt íigáíjuk a Hlndlll/Xbal helyeken felnyitott CDM8 vagy piLN (πΙΝ) expressziós vektorok egyikébe.
A CTLA4lg-nek megfelelő aminosav-szekvenciát kódoló DNS-t a Budapesti Egyezmény értelmében letétbe helyeztük az ATCC-náí, ahol nyilvántartási száma ATCC 58629.
A CTLA4fg kodon-a/apú motálfatása
Kifejlesztettünk egy mutáltatásí és szűrővizsgálat-stratégiát az olyan mutáns
CTLA4lg molekulák azonosítása érdekében, amelyek dlsszocíácíós sebessége kisebb a CD8Ö és/vagy CD86 komplexekben, azaz nagyobb a köfőképességük. Ebben a megvalósításban a mutáltatást a CTLA4 exíraceííuíárís doménjének CDR-1, COR-2
Λ Λ, Λ «««« 9 β 6 X* ♦ 9 9 ** * < ».*♦ *♦ ♦ * * » » * * J*«X »*» «*« ** **» (amit 0' szálnak is neveznek) és/vagy CD-3 régióban és/vagy mellettük végezzük [US 6,090,914, 5,773,253, 5,844,095, US-A 80/214,065, Peach et a/., J. Exp. Med. 180, 2049-2058 (1994)]. Egy CDR-szerü szakasz határol minden GDP régiót és nyúlik túl néhány aminosavvai felfelé és/vagy lefelé a COR-motívumon, Ezeket a helyeket a klméra CD26/CTLA4 fúziós fehérjék vizsgálata alapján választottuk ki (Peach et a/., /d.
köz/.), és egy modellen elemeztük, hogy melyik aminosav oldailánea érintkezhetne az oldószerrel, illetve mely pozíciókban hiányzik az aminosav-oldallánook azonossága vagy homológíája a CD28 és láncot, amely az azonosított oldal lül) van, találmányunk részének Egy kétlépéses stratégiát a CD80 és CD88) megváltozott iák szintetizálásához és mutáció-könyvtárat a CTLA4 majd „SlAcore” módszerrel szí eme között. így tehát bármely olyan aminosav-oldatánc szoros közelségében (0,5-2 pm távolságon be-
a B7 molekulákkal szemben (például a rendelkező, oldható C7LA4 mutáns moleku»z. A kísérlet során először létrehozunk egy részének egy meghatározott kodonjában, atot végzünk azon mutánsok azonosítására, mutatnak a B7~tel szemben. A BIAcore mérő rendszer (Pharmacia, Plscataway, 1MJ.) lényegében egy felszíni plazmon-rezonancia detektor rendszer, amelyben CDSOig vagy CDSSIg van kovalens kötéssel egy dextránnal bevont érzékelő csiphez kötve, A vizsgálandó molekulát az érzékelő csipet tartalmazó kamrába injektáljuk, és a komplementer fehérje megkötött mennyiségét az érzékelő csip dextránnal bevont felszínén létrejött molekula tömeg növekedésből határozzuk meg.
Pontosan megadva, egyszeres mutáns nukleotíd-szekveneíákaf hozunk létre nem mutáns (azaz vad típusú), a CTLA4lg~t kódoló DNS-böl (US 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795 és 5,885,798 számú szabadalmi íratok: ATCC 88829), mint templáfből. A mutagén oligonukleotid PCR-prímereket ügy tervezzük meg, hogy egy meghatározott kodon randám mufáltatásáf tegyék lehetővé úgy, hogy a kodon 1. és 2. bázisa bármilyen lehet, mig a 3. bázis csak guanin vagy timin (az ilyen kodon jelölése XXG/T vagy NNG/T). Ezen a módon egy aminosavat kódoló, meghatározott kodon véletlenszerűen úgy mutáltatható, hogy a 20 aminosav bármelyikét kódolhatja, mivel az XXG/T mutagenezís 32 potenciális ködont eredményez. Azokat a POR termékeket, amelyek mutációkat kódolnak a CTLA4lg CDR-3-szerű hurokjának (MYPPPY) szoros szomszédságában, Saol/ Xbal endonukleázokkal emésztjük és szubklónozzuk az ugyanígy felnyitott xLN expressziós vektorba. Ezzel az eljárással állítjuk elő az L104Eig mutáns CTLA4 molekulát (18, ábra).
«* # * '9 *
9« * * « * * »«9 ♦** *« »« «
»
Ahhoz, hogy a CTLA4lg CDR-1-szerű hurokjának szomszédságában hozzunk létre mutációkat, először egy néma Nhei restrikciós helyet építünk be a huroktól 5’ Irányba, primerreí irányított PCR mutagenezissel. A PCR termékeit Nhel/Xbal enzimekkel emésztjük és szubklőnozzuk az ugyanígy felnyitott CTLAéíg vagy L104Eíg expressziós vektorokba. Ezt az eljárást használjuk a kettős mutáns CTLA4 molekula, az L104EA29Yig (19. ábra) létrehozásához. Pontosabban az egyszeres mutáns CTLA4 molekulát (L104Eíg) használjuk tempíátkéní a kettős mutáns CTLÁ4 molekula, az L104EA29Ylg elkészítéséhez.
A CTLA4 mutáns molekulákat, így az L104EA29Ylg-t (amit 2000.06.19.-én helyeztünk letétbe az American Type Culture Colfectíon-ben, ahol a PTA-2104 nyilvántartási számot kapta) kódoló kettős mutáns nukleotid-szekvenciákat az L104Elg, mint templát, ismételt mutáitatásávai állítjuk elő. Ezt az eljárást használjuk számos kettős mutáns nukleotid-szekvencia előállításához, így az olyan GTLA4 molekulákat kódolókhoz, mint az t1Ö4EA29Yíg (19. ábra), az LW4EA29Líg (20. ábra), az L104EA29Tlg (21. ábra) és az L104EA29Wíg (22. ábra). Előállítunk hármas mutánsokat is, amilyen az L1ö4EA29YS25Klg, L104EA29YS25Nlg és L104EA29YS25Rig.
Az oldható CTLA4 molekulákat a nukleotíd-szekvencíákből fejeztetjük ki és a 3. példában leírt II. fázisú klinikai vizsgálatban használjuk.
A szakemberek tudják, hogy a nukieinsav-szekvencíák másolása, különösen a PCR sokszorozás, könnyen okoz bázisváltozásokat a DNS-szálakban, Ezek a nukieotid-váítozásök azonban nem szükségszerűen okoznak aminosav-váítozásokat, mivel több kodon redundáns módon kódolja ugyanazt az amínosavaf. így tehát az eredeti vagy vad típusú szekvencia néma (azaz aminosev-váitozást nem okozó) vagy bármilyen más, itt konkrétan le nem irt megváltozásai találmányunk oltalmi köréhez tartoznak.
2. példa:
Vizsgálati módszerek
Ebben a példában az egyszeres és kettős mutáns CTLA4 poiipeptidek azonosítására szolgáló szűrővizsgálati eljárásokat írjuk le, amelyekkel az 1. példában leírt szerkezetekből kifejeztetett poiipeptidek közül kiválasztjuk azokat, amelyek nagyobb fokú kötődési affinitással rendelkeznek a 87 molekulák iránt, mint a nem mutáns CYLA4 molekulák.
Az eddigi to w'fro és to vívó vizsgálatok azt jelzik, hogy a CTL.A4ig önmagában nem képes teljesen megakadályozni az antigén-specifikus T-sejtek aktiválódását. A ***«
CTLA4íg-naí és CD80~ra vagy CD86~ra specifikus monokionáiis antitestekkel végzett ín vítro vizsgálatokban megmérve a T-sejtek szaporodását, kiderült, hogy az anti-CDSQ monokionáiis antitest nem fokozza a CTLA4lg gátió hatását. Az anti-CD38 monokionáiis antitest azonban igen, ami arra utal, hogy a CTLA4lg kevésbé hatásosan gátolja a CD86-kölcsőnhafást. Ezek az adatok megerősítik Linsley és munkatársai {ímmunííy 1, 793-801 (1994)] korábbi eredményeit, amelyek szerint a CDSO-közvetitésü sejtes válaszok gátlásához körülbelül 100-szor kisebb CTL.A4íg-koncenfráció szükséges, mint a CD88~közvetitésö válaszok gátlásához. Az előbbi eredmények alapján feltételezhető, hogy az oldható CTLA4 mutáns molekulák nagyobb affinitással rendelkeznek a CD85 Iránt, mint a vad típusú CTLA4, és jobban fogják gátolni az antigén-specifikus sejtek aktiválódását, mint a CTLAAlg.
E cél érdekében az 1, példában leirí, oldható CTLA4 mutáns molekulákat egy új szűrővizsgálati eljárással vizsgáljuk, hogy azonosítsuk azokat a mutációkat a CTLA4 extracelluláris doménjében, amelyek javítják a kötődési affinitását a CD8Ö és CD86 molekulákhoz. Ez a szűrővizsgálati stratégia hatásos eljárást biztosít a mutánsok közvetlen azonosítására a látszólag lassabb „off (elbomlási) sebesség alapján, ami nem igényli a fehérje tisztítását vagy mennységének megmérését, mert az elbomlási sebesség koncentráció-független [Ö’Shannessy ef aí, Anaí Síochem, 212, 457-488 (1987)].
COS sejteket íranszfekfáíunk egyedileg elkészített, tisztított plazmid-DNS-sel és tenyésztünk néhány napon át Három nap múlva a tápfolyadékot BIAoore bíoszenzor csípre visszük (Pharmacia Biotech AB, üppsala, Svédország), ami oldható CD80lg-nal vagy CO86íg-nal van bevonva, A mutáns fehérje kötődését és disszociációját a felszíni piazmon-rezonancia megváltozásán keresztül mérjük (Ö’Shannessy ef a/., íd, köz/.), Az összes vizsgálatot BIAoore™ vagy BIAoore™ 2000 bioszenzorokon, 25 °C~on végezzük. A ligandumokat „research grade” szenzor csípeken (Pharmacia) Immobllízáljuk a szokványos, N-etíl-N’-(dimetil~amíno-propíl)-karbodiímid-N-hídroxí-szukcínimides rögzítéssel {Johnsson ef aí, ,4na/, S/oc.hem. 188, 288-277 (1891); Khilko ef al, J. Bioi Chem. 268, 6425-5434 (1993)}.
A szúróV/zsgáfaf módszere
A COS sejteket 24 lyukas szöveítenyészto lemezekben tenyésztjük és átmenetileg transzfektáljuk mutáns CTLA4lg-naL A szekretált, oldható, mutáns CTLA4lg-t tartalmazó tápfolyadékot három nap múlva gyűjtjük össze,
A COS sejtek összetett tápfolyadékát átfolyatjuk a BIAscore bioszenzor csip fölött, amit CO86lg~nal vagy CD8Öig~nal derivatizáítunk [Greene ef af„ J. Bfof. Chem.
271, 26762-26771 (1996) leírása szerint], és a mutáns molekulákat a vad típusú CTLAAlg-nál lassabb disszociáciös sebességük alapján azonosítjuk. A kiválasztott tápfolyadék-míntáknak megfeleld DNS-eket szekvenáíjuk és többet készítünk belőlük, hogy nagyobb léptékben transzfektálhassunk COS sejteket, amelyekből a CTLA4lg mutáns fehérjét állítjuk elő a tápfolyadék tisztításával.
A BIAcore-anallzís körülményei és az egyensúlyi kötődés adatainak analízise Greene és munkatársai idézett közleményében |éa-ae-US-A-ŰW^í027^s^Wí47665^ számú~szafeadeim«fatokbarf vannak leírva, amelyeket itt referenciaként tartunk számon.
A S/Aoore-adafok «maMzfse
A szenzorogrammok alapvonalait zéró „válaszegység”-re (response unit, RU) normalizáljuk az analízis előtt. A mintákat először ál-derívatizált cellákon áramoltatjuk át, hogy meghatározzuk a háttér RU-értékeket, amire az oldatok törésmutatói közötti jelentős különbségek miatt van szükség. Az egyensúlyi disszociáciös állandót (Κ^) az Req verses C függvényből számítjuk ki, ahol Req az állandósult válasz és egy áldehvatizáit csíp válaszának különbsége, míg C az analizált anyag moláris koncentrációja. A kötődési görbéket közönséges függvényíllesztő programmal (Prísm, GraphPAD Software) vizsgáljunk,
A kísérleti adatokat először egy olyan modellhez illesztjük, amely egyetlen Iigandum egyetlen receptorhoz való kötődését írja le (egyoldalú modell, egyszerű Langmuír-rendszer, Á+8<—>AB). és az egyensúlyi asszociációs állandót (Ko ! ~ (Aj · (Bj/jABj) az R ~ Rmax^'C^d^) egyenletből számítjuk ki. Ezután az adatokat a Íigandumhoz kötődés legegyszerűbb kétoldalú modelljéhez illesztjük, amelyben a receptornak két, egymással nem kölcsönható kötőhelyét tételezzük fel az R ~ Rmaxí *C/(Kai+C) + Rmax2*c0<d2*C} egyenlet szerint.
A két modell illesztésének jóságát vizuálisan, a kísérleti adatok összehasonlításával és statisztikusan, az eitérésnégyzet-összegek F-próbájával ellenőrizzük. Az egyszerűbb, egyoldalú modellt találtuk a legjobban illeszkedőnek, bár a kétoldalú modell illeszkedése szignifikánsan jobb volt (p<0,1).
Az asszociáció és disszociáció elemzését a BIA 2.1 kiértékelő szoftverrel (Pharmacia) végezzük. Az asszociációs sebességi állandót (kon) két módon, homogén egypontos kölcsönhatás és párhuzamos kétpontos kölcsönhatás feltételezésével is kiszámítjuk. Az egypontos kölcsönhatás esetében a Kon értéket az
Κ4 = Κθς(Ί-βχρ-*ΜΜ0}) egyenlettel számítjuk ki, ahol a t időben kapott válasz, Req az egyensúlyi válasz, tg * ♦ * « ♦ *« * X ♦ φ Φ * Φ **ν «φφ ΦΦ Φφ az injektálás megkezdésének időpontja és ks - dR/dt ~ kon’Ckc,ff, ahol, ahol C a vizsgáit anyag koncentrációja monomer kötőhelyre számolva. A kétpontos kölcsönhatás esetében kon értékét az
Rt = Reqlíl-exp-te+’-V) + Req2Í1-e*Pte2W) egyenlettel számítjuk ki. Mindkét modellhez kon értékét a ks versus C függvény számított meredekségéből (körülbelül 70 %-os maximális illeszkedésig) határozzuk meg.
A dísszociációs adatokat az egypontos (AB = A+B) vagy a kétpontos (AjBj Aj+Bj) modelleknek megfelelően analizáljuk és a sebességi állandót (kof$ a legjobban illeszkedő görbékből számítjuk ki. Az egypontos modellt használjuk, kivéve azokat az eseteket, ahol a maradványérték meghaladja a műszer háttér-értékeit (műszertől függően 2-10 RU-val), amikor a kétpontos modellt alkalmazzuk. A receptor elfoglaltságának félértékét a í-j/2 ~ 0,693/koff egyenlettel számítjuk kí.
Áfáram/ásos c/íomeír/a
Az egér L307.4 monokionáüs antitestet (anfi-CDSÖ) a Beofen Díoklnson-től (San Jose, Ca,), az IT2.2 antitestet (anti-B7-0, más néven anti-CD88) a Pharmingen-tÖl (San Diego, Ca.) szereztük be. Az ímmunfestéshez a CD8ö-pozifív és/vagy CD88pozitív CHO sejteket a tenyészetből 10 mM EDTA-t tartalmazó, foszfátpufferes, fiziológiás nátrium-kloríd-oldatba (PBS) visszük át. A CHO sejteket (1-10x10^) először az antitestekkel vagy immunglobulin fúziós fehérjékkel Inkubáliuk 10 % magzati borjüszérumot (FOS) tartalmazó DMEM-ban, majd mossuk és ííuoreszceín-ízotloeíanáííaí konjugált kecske anfi-egér vagy anfi-humán immunglobulin reagenssel (Tago, Burlingame, Ca.) Ínkubáíjuk. Ezután a sejteket még egyszer mossuk, és egy FACScan készülékkel (Becton Dickinson) analizáljuk.
SDS«PAGB és méretkNárá Rromaíegráfía
Az SDS-PAGE-t (nátrium-dodeeiíszuífátos poíiakrifamid géíefektroforézís) Trís/gficin 4-20 %-os akrílamid géleken (Novex, San Diego, Ca.) végezzük. Az analitikai géleket Ooomassie-kékkeí festjük, majd a nedves gélekről digitális szkennerrel készítünk képeket. A CTLA4lg~f (28 pg) és az L104EA29Ylg-t (25 pg) méretkizáró kromaíográfiával analizáljuk egy TSK-GEL G300 SWxt oszlopon (7,8x300 mm, Tosohaas, Montgomeryviíle, Pa.), 0,02 % náthum-azidot tartalmazó PBS-tal, 1,0 ml/perc átfolyási sebességgel.
Cn.A4XCÍ205 í 2ÖS
Az egyláncú CTtA4XQ420S^ blnsley és munkatársai leírása szerint [J. S/o/,
Chem. 270, 15417-15424 (1995)} állítjuk elő. Röviden, egy onkosztatín-M (OMCTLA4) '5S44 45Í/SAS:
* X expressziős plazmídot használunk terápiáiként, az „előre” primer a
GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG, amely a vektor szekvenciáihoz illeszkedik, míg a „fordított” primer a
GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAÁTCTGGGCACGGTTC, a CTLA4 extraceiluláris dómén utolsó 7 amlnosavának (a 118-124. amlnosavak) felel meg, és egy restrikciós hasítási helyet és egy stop··kodont (IGA) tartalmaz. A fordított primer egy C120S mutációt (ciszteín helyett szerin a 120 pozícióban) határoz meg. Pontosabban, a fordított primer GCA nukieotid-szekvenciáját (a 34-38. nukíeotidok) a következő nukieotíd-szekvenciák egyikével helyettesítjük: AGA, GGA, IGA, CGA, ACT vagy GCT. A szakemberek tudják, hogy a GGA nukleotid-szekvencla a cisztáin TGC kodonjának fordított komplementer szekvenciája. Hasonlóan, az AGA, GGA, TGA, CGA, ACT vagy GCT nukieotíd-szekvenciák a szerin kodonjainak fordított komplementer szekvenciái. A PCR termékeit Hindii!/ Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, és irányítottan szubkíőnozzuk a LN expresszlós vektorba (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ.), Az L1ő4EA29YlgXot2ÖS'í hasonló módon készítjük el. A szerkezeteket DNS-szekvenálássaí ellenőrizzük.
A nagy afimftá&ú mutánsok azonosítása és biokémiai/eifemzése
Huszonnégy aminosavat választottunk ki mutáítatásra és a kapott, körülbelül 2300 mutáns fehérjét megvizsgáltuk a CD38lg~hoz kötődésre felszíni plazmon-rezonancía (SPR, fent leírva) módszerrel Az egyes helyek mutációjának főbb hatásait a 2. táblázatban foglaljuk össze. Néhány aminosav (S25-R33) random mutageneziss a CDR-1 területben látszólag nem változtatja meg a íigandumhoz kötődést Az £31 és R33, valamint az M97-Y1Ö2 amlnosavak muíagenszise látszólag gyengíti a Ugandámhoz kötődést. Az S25, A29 és T30, K93, 198, Y103, L104 és G105 amlnosavak mutációja olyan fehérjéket eredményez, amelyeknek az „on” és/vagy „off sebessége kicsi. Ezek az eredmények megerősítik azokat a korábbi megfigyeléseket miszerint a CDR-1 S25-R33 területe, valamint az M29-Y102 terület befolyásolja a íigandumhoz kötődést [Peaoh eí aí, J. Exp. Med. ISO, 2049-2053 (1994)).
Az 825, T30, K93, L96, Y103 és G105 helyek mutációja néhány olyan mutáns fehérjét eredményezett, amelyeknek kisebb az „off sebessége a CD36lg-ról, Ezekben az esetekben azonban a kisebb „off” sebesség kisebb „on” sebességgel jár együtt, aminek következtében a mutáns fehérjék általános affinitása a CDSSIg-hoz látszólag azonos a vad típusú CTLA4 affinitásával Ráadásul a K93 mutációja jelentős fokú aggregáciöt eredményez, ami felelős lehet a megfigyelt kinetikai változásokért.
« » ♦ Φ
Az L1Ö4 random mutáltatása, a COS sejtek transzfektálása és a tápfolyadékmlnták SPR-szúrövizsgáíata Immobíllzáit CD86íg-on hat olyan mintát eredményezett, amelyekben a mutáns fehérjék „off sebessége körülbelül kétszer lassabb, mint a vad típusú CTLA4íg~é. Amikor az ilyen mutánsok cDNS~ét szekvenáituk, minden esetben egy leucinról giutamínsavra váltó mutációt (L104E) találtunk. A 104 pozíciójú leucin aszparaginsavval való kicserélése (L1040) látszólag nem változtatta meg a CD88lg-hoz való kötődést.
Ezután az L1Ö4E mutánst terápiáiként használva megismételtük a mutáltatást a II. táblázatban felsorolt pontokon. Az SPR analízissel — újólag Immohííizált CD88lg~f használva — hat olyan tápfolyadék-míntát találtunk, amelyekben a 29 pozíciójú alanin mutációját hordozó fehérjék „off” sebessége körüibelüí négyszer kisebb, mint a vad típusú CTLA4íg~é. A két leglassabb a tírozin-csere volt (L104EA29Ylg), kettő leucin (L104EA28L), egy triptofán (L1Ö4EA29W) és egy freonln-csere (L104EA29T) volt. Ha a 28 pozíciójú aíanint csak önmagában, véletlenszerűen mutáitatjuk, nem kapunk a vad típusú CTLA4ig~nél lassabb „off sebességű mutánsokat.
A tisztított L1Ö4E és L1Ö4£A29Ylg relatív molekulatömegét és aggregációs állapotát SDS-PAGE-sel és méretkizáró kmmatográííával határozzuk meg. Az L104£A29Ylg (körüíbeiül 1 pg: 3. sáv) és az L104Elg (körülbelül 1 pg; 2. sáv) elektroforetlkus mobilitása látszólag azonos a CTLÁ4ig~ével (körülbelül 1 pg, 1. sáv) redukáló (körülbelül 50 kDa; *βΜΕ: *2-merkaptö~etanol} és nem redukáló (körüibelüí 100 köa: -βΜΕ) körülmények között (25A. ábra). A méretkizáró kromatográfia kimutatta, hogy az LíG4EA29Ylg mozgékonysága (25C. ábra) láthatólag azonos a dímer CTLA4lg mozgékonyságával (258, ábra). A nagyobb csúcsok a febérje-dimert képviselik, míg a gyorsabban eluáíódó kis csúcs a 258. ábrán nagyobb molekulatömegO aggregátumokat jelent. A CTLA4lg körülbelül 5,0 %-a van jelen nagyobb molekulatömegO aggregátumok alakjában, de nincs jele annak, hogy az L104EA29Yíg vagy az L104Elg aggretehát az L1ö4Elg és az L104EA29Yíg erősebb kötődése a CDSOÍg-boz nem tulajdonítható egy mutáció kiváltotta aggregácíónak.
Egyensú/y/ és ffőfődéaf vfesgá/af
Az egyensúlyi és kinetikus kötődési analízist proteín-A tisztított CTLA4lg-nal,
L104Elg-nai és L104EA29Yig-nal végezzük SPR módszerrel Az eredményeket az 1.
táblázatban mutatjuk be. A megfigyelt egyensúlyi disszociácíós állandókat (Κςρ 1. táblázat) a különböző koncentrációkon (5,0-200 nM) felvett kötődési görbékből számítjuk ki.
Az L104EA29Ylg erősebben kötődik a CO88lg~hoz, mint az LtOAEíg vagy a CTLA4íg,
Az L1Ö4EA29Ylg Kg-értéke (3,21 nM) alacsonyabb, mint az L104Elg-é (8,06 nM) vagy a CTLA4íg-é (13,9 nM), ami azt jelzi, hogy az L1ö4EA29Ylg kötődési affinitása erősebb a CD861g-boz. A CD8Ölg~hoz való kötődése is erősebb, mivel a megfelelő K^-értékek rendre 3,66,4,47 és 8,51 nM.
A kinetikus kötődési vizsgálat feltárta, hogy a CTLA4lg, L1C4Elg és az L104EA29Ylg kötődésének Con”) sebessége mind a CDSOíg-hoz, mind a GD861g-hoz hasonló (1. táblázat), „off sebességük azonban nem egyforma. A C7LA4lg-hoz képest az L1Ö4EA29Ylg „off” sebessége körülbelül kétszer lassabb a CO80lg-ről; és körülbelül négyszer lassúbb a CD86lg~rói. Az L104Elg „off sebessége körülbelül az L104EA29Ylg~é és a CTLÁ4lg-é között van. Mivel ezek a mutációk nem változtatják meg lényegesen az „on” sebességet, az L104EA29Ylg fokozott affinitása a CDSOig és a CD86lg iránt elsősorban az „off sebesség csökkenésének tudható be.
Azt eldöntendő, hogy az L1Ü4EA29Y!g fokozott affinitását a cDSSIg és a CDSOig iránt az okozza-e, hogy a mutáció a monomerek dimerré asszociálódásának módját változtatja meg, vagy az affinitást növelő szerkezeti változások minden monomerben megjelennek, elkészítjük a CTLA4 és az L104EA29Y extracelluláns dóménak egyláncos változatát úgy, hogy a 120 pozíciójú císzteint szennre cseréljük ki (Linsley ef a/., fd közi.). A tisztított CTDWXc^ÖS ®s t104EA29YlgXci20S fehérjék monomer voltáról gélpermeáoiós kromatográfiával győződünk meg, mielőtt ligandum-kőtő tulajdonságaikat SFR módszerrel megvizsgálnánk. Az eredmények azt mutatják, hogy mindkét monomer fehérje körülbelül 35-80-szor gyengébben kötődött a CD86lg-hoz, mint a megfelelő dimerek (1, táblázat). Ez alátámasztja a korábban közölt eredményeket, amelyek szerint a CTLA4-nek dimerizálódnia keli a nagy affinitásü ligandumköiés-hez [Greene eí < J. 8/o/„ Cbern. 271, 26762-26771 (1996)].
Az L1Ö4EA29YXoi2ÖS körülbelül kétszer nagyobb affinitással kötődik mind a CD89lg-hoz, mind a CD88lg-hoz, mint a CTLÁ4Xqiggg. A fokozott affinitás a körülbelöf háromszor lassabb disszodáciös sebesség következménye mindkét ligandum esetében. ügy tehát az L104EA29Y erősebb kötődése valószínűleg az egyes monomer láncokban fellépett, affinítás-fokozó szerkezeti változások következménye, mint a molekula dimerizálódásának megváltozásáé.
Az affírtftáaf fokozó mtóácrók ke/yzefdnek és szerkezetének vfzsgá/afe
A CTLA4 exíracelíuíárís, IgV-szerű dóménjének oldatban! szerkezetét a közelmúltban határozták meg NMR-spektroszkőpiával [Meízler ef a/f Akkura Srucf. 3M 4,
527-531 (1997)]. Ez lehetővé tette a 104 pozíciójú Ieucín és a 29. pozíciójú alanín heis lyének pontos meghatározását a háromdimenziós gombolyagon (26. ábra). A ieuoin104 az erősen konzervatív MYPPPY amlnosav-szekvencia mellett helyezkedik el. Az alanin-29 a CDR-1 (S25-R33) terület C-termínálls vége közelében helyezkedik el, ami térben szomszédos az MYPPPY területtel. Bár jelentős kölcsönhatások vannak a két terület amínosav-ofdalláncai között, látszólag nincs közvetlen kölcsönhatás az L104 és az A29 között, bár mindkettő részét képezi a fehérje egyik folytonos, hidrofób magjának. A két: affinitást fokozó mutáció szerkezeti következményeit modellezéssel határozzuk meg. Az A29Y mutáció könnyen beilleszkedik a CDR-1 (S25-R33) szakasz és az MYPPPY szakasz közötti résbe, és síabííizátorként szolgálhat az MYPPPY terület számára. A vad típusú CTLA4-ben az 1104 kiterjedt hidrofób kölcsönhatásban áll az L96 és V94 aminosavakkal az MYPPPY szakasz szomszédságában. Az két okból is erősen valószí nőtlen, hogy a giutaminsav mutációja egy, az Líü4-éhez hasonló konformációt eredményezzen. Az egyik, hogy kevés a hely ahhoz, hogy a CDR-1 szerkezete komoly torzulás nélkül alkalmazkodhasson a giutaminsav hosszabb oldaltáncához. A másik az, hogy a giutaminsav negatív töltése elfedésének nagy lenne az energetikai igénye a hidrofób területben. Ehelyett a modellezési vizsgálatok azt a megoldást kínálják, hogy a giutaminsav oldallánca kifordul a felszínre, ahol töltését a szólvatácíó stabilizálja. Egy Ilyen konformáció-változás már könnyen összeegyeztethető a G105-tel, és csak minimálisan torzítja el a terület többi amínosav-maradékát.
A nagy aff/n/fású mutánsok kötődése CDÖÖ-af vagy CD8ő-of kffe/ező CHÖ sejtekhez
A stabilan transzfektált, CD8CH- és 0088+- CHÖ sejtek és a mutáns CTLA4Ig molekulák kötődését FACS analízissel vizsgáljuk (27. ábra) A CD8Ő+ és CD38+ CHO sejteket a CTLA4lg, L104EA29Yig vagy L1ö4Elg növekvő koncentrációival inkubáljuk, majd mossuk. A megkötött immunglobulin fúziós fehérjét fluoreszceín-ízotíocianáttal konjugált kecske anti-humán immunglobulinnal mutatjuk ki.
Amint az a 27. ábrán látható, CD8ö~pozitlv vagy CD8S-pozlflv CHÖ sejteket (1,5x1Ö5) inkubálufík a CTLA4lg (négyzetek), az L1Ö4EÁ29Ylg (körök) vagy az L104Elg (háromszögek) jelzett koncentrációival 2 órán át, 23 °C-on, majd mossuk és fluoreszcein-izotiöcianáftal konjugáit kecske anti-humán immunglobulin antitesttel Inkubáljuk. Összesen 5ÖÖÖ éíö sejtet vizsgálunk (egy mérés) egy FACScan berendezésben és meghatározzuk a fluoreszcencia átlagos intenzitását (MFI) az adatok bisztogrammjábói a PC-LYSYS programmal. Az adatokat a csak második reagenssel inkubált sejteken mért háttér-fluoreszcenciával (MFI-7) korrigáljuk. A kontroll L6 « ♦ * 4 mono-klonális antitest (80 pg/ml) esetében MFI<30 értéket kaptunk. Ezek az eredmények négy, egymástól független kísérletet képviselnek.
Az L104EA29Ylg, L194Elg és CTLA4lg körülbelül azonos mértékben kötődnek a humán CDSO-nai transzferált CHÖ sejtekhez (27A. ábra). A humán CD86~tal stabilan transzferált CHO sejtekhez az L1G4EA2SYlg és az L1G4Eíg erősebben kötődik, mint a CTLA41g (27B. ábra).
Funkcioeé/is vizsgálatok
Humán CD4-pozítív T-sejteket izolálunk immunmágneses negatív szelekcióval ILinsIey ef a/,, 3. Exp, kled: 178, 1595-1604 (1992)}, Az izolált sejteket forbái-mirisztát-aceláttal (PMA) és CDSO-pozitlv vagy CD88-pozitlv CHO sejtekkel stimuláljuk az inhibitor ikráié koncentrációinak jelenlétében. A CD4~pozitív T-sejteket (δ-ΙΟχΙΟ^ sejt/íyuk) 1 nM PMA jelenlétében, besugárzott CHÖ sejt-sfimulátorral vagy anélkül tenyésztjük. A szaporodási választ úgy mérjük, hogy a 72 órás tenyésztés utolsó 7 órájában 1 pCíflyuk 3H-timidÍnt adunk a tenyészethez. Megfigyeltük, hogy ez L1Ö4EA29Ylg és a CTLA4lg gátolja a stimulált T~sejtek szaporodását (28. ábra). Az L1Ö4EA29Ylg jobban gátolja mind a CD80-, mind a CD88~pozifív rendszerekben a sejiszaporodásf, mint a CTLA4lg (28A. és 288. ábrák). így tehát az L104EA29Ylg a hatásosabb inhibitora a T-sejtek CD8Ö- és CD86-közvetitésü kostímulációjának.
A 29. ábrán látható, hogyan gátolja az L1Ö4EA29Ylg és a CTLA4lg az ailostimulált humán T-sejteket, amelyeket a fenti módon készítettünk elő, valamint amelyek allostímueálását egy humán B-llmíoblaszi sejtvonallal (jelzése PM) végezzük, ami kifejezi a GD80~at és CD86~ot (3,0x10^ T-sejt és 8,0x10^ PM sejt lyukanként). Az elsődleges allostimulálást 8 napon át folytatjuk, majd a sejtekhez SH-timidint adunk 7 órával a radiojeloltség mérése előtt.
A másodlagos allostimulálást az alábbiak szerint végezzük. A hét napon át elsődlegesen allostimuláit T-sejteket limfocita-elválasztő táptalajra (LSM, ICN, Aurora, Oh.) gyűjtjük, és 24 órán át pihenni hagyjuk. Ezután a T-sejteket újra (másodlagosan) stimuláljuk a CTLA41g vagy az L104EA29Ylg fítráló mennyiségeinek jelenlétében, PM-et adva hozzájuk a fenti arányban. A stimulálást 3 napon át folytatjuk, majd a sejtek szaporodását a fenti módon mérjük. Az L104EA29Ylg hatása az elsődlegesen aliostímulált T-sejtekre a 29A, ábrán, a másodlagosan allostimuláit T-sejtekre a 298. ábrán látható. Az L1Ö4EA29Ylg mind az elsődleges, mind a másodlagos szaporodási választ jobban gátolja, mint a CTLA4lg,
A eitökih-termelés mérésére (30. ábra) két ismétlésben készítünk másodlago45 san allöstim utált lemezeket. Három nap múlva a tápfolyadékokat EUSA készletek (Biesourcs, Camahllo, Ga.) használatával analizáljuk. Azt találtuk, hogy az L104£A28Ylg hatásosabban gátolja a T-sejtek IL-2, li-4 és γ-interferon termelését egy másodlagos allogén stimuíust követően, mint a CTLA4Ig (3ÖA-C. ábrák).
Áz L104EA29Ylg és a CTLA4lg hatása majmok vegyes límfooita válaszára (MLR) a 31. ábrán látható. A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC; 3,5x10^ sejt/lyuk majmonként) két majomból vesszük, límfocita-elválasztó táptalajon megtisztítjuk és összekeverjük 2 pg/ml fitohemagglutinínnel (PHA). A sejteket 3 napon át stimuláljuk, majd radioaktív nukleotidot adunk hozzájuk 18 órával a kinyerés előtt. Az L104EA29Yig jobban gátolta a majom T-sejtek szaporodását, mint a CTLÁ4lg,
Egyensúlyi és látszólagos kinetikai állandók (az adatok három különböző kísérlet eredményeinek átlagai ± standard deviáció):
Immöbliizált Vizsgált *on<105> ftoffSxW-íj ís-η Kd (nM)
fehérje anyag
CDSOlg CTLA4lg 3,44 + 0,29 2,21 ±0,18 8,51 ± 1,06
CDSOlg L104Elg 3,02 ± 0,05 1,35 + 0,08 4,47 ± 0,36
CDSOlg L104EA29Ylg 2,96+0.20 1,06 + 0,05 3,66 ± 0,41
CDSOlg CTLA4XC120S 12,0 + 1,0 230 + 10 195 + 25
CD80ig L104EA29YXci20S 8>3 °·26 71 ±5 85,0 + 2,5
CD681g CTLA4lg 5,95 + 0,57 8,16 + 0,52 13,9 ±2,27
CD88tg L104Eig 7,03 + 0.22 4,26 ±0,11 8,06 + 0,05
CDSOlg Ll04EA29Ylg 6,42 ±0,40 2,08 ± 0,03 3,21 +0,23
CDSOlg GTLA4XC12oS 18,5 + 0,5 840 + 55 511 ±17
CD36lg L1ö4EA29YXC12os 11,4 + 1,8 300 ± 10 267 + 29
'?Í! 4 4 43 /-RA2.
i
2. táblázat
A CTLÁ4lg mutációinak hatásai a CO86ig~hez való kötődésre,
SPR-val vizsgálva (a főbb hatásokat + jellel jelezzük)
Mutáció helye A mutáció hatása csökkent kötődés
nincs hatás lassú „en/ofT
S2ö 4
P28 4*
G27 4
K28 4-
A29 4'
T30 4-
E31 4>
R33 +
K93 +
L96 4-
M97 4*
Y98 4-
P99 Ή
Pl 00 4
P101 4-
Y102 4
ΥΊ03 +
L104
G10S 4-
1106 -i-
G107 +
0.111 4*
Y113 4-
II1S 4*
w-SW/RAZ· ♦ *Xf
3. példa:
Klinikai vizsgálatok
Ebben a példában az embereken végzett. 11. fázisú klinikai vizsgálatot írjuk le, amit az L104EA29Ylg (más neveken LEA29Y vagy LEA) és a CTLA4fg oldható mutáns CTLA4 molekulákkal végeztünk. A molekulák beadásának célja a reumatold artritisz tünetei (ízületek duzzadfsága, fájdalmassága, gyulladás, reggeli merevség és fájdalom) közül legalább egynek az enyhítése. Az alkalmazott €TLA4íg molekula a +1 pozíciójú metioninnal (vagy a ~1 pozíciójú alaninnal) kezdődik és a +357 pozíciójú lizinnel végződik (24. ábra). A CTLA4lg molekula egyik megvalósítását kódoló DNS letéti száma ATCC 68629. Az itt használt L1ö4EA29Ylg molekula a +1 pozíciójú metioninnal (vagy a ~1 pozíciójú alaninnal) kezdődik és a +357 pozíciójú lizinnel végződik (19. ábra). Az L104EA29Yíg molekula egyik megvalósítását kódoló DNS letéti száma ATCC PTA 2104.
Emellett az L104EA29Ylg~í vagy a CTLA4lg-t kapó betegeknél vizsgáljuk legalább egy, feltételezetten a reumatold artritiszbez társuló biológiai paraméter, például a vérsejtsüllyedés, a C-reak-tiv fehérje és/vagy az IL-2 receptor szérumszlntje javulását is.
A vizsgálatban összesen 214 beteg, 54 férfi és 160 nő vett részt (1A és 8. ábrák). A betegek felvételekor betegségük fennállásának átlagos időtartama 3,4 + 2,0 év volt, és mindegyikük átesett legalább egy eredménytelen, „betegség-módosító reumaellenes gyógyszeráréi (Disease Modifying Antirheumatic Drug, DMARD) végzett kezelésen. A „nem-szteroid gyulladásgáfló gyógyszernek (Nonsferoidal Anti-inflammatory Drugs, NSAIDS) vagy szteroidok állandó szedését {<- Tömg/nap) megengedtük, míg az egyidejű DMARD-kezeléseket megszüntettük. A betegeket véletlenszerűen 25-32 fős kezelési csoportokba soroltuk be. Harminckét beteg piacéból kapott, 92 kapta az L1Ö4EA29Ylg-t és 90 a CTLÁ41g-t. Azok a betegek, amelyek követték az útmutatást és nem léptek kí a kísérletből az 57. nap előtt, összesen 4 intravénás infúziót kaptak az 1,« 15., 29. és 57. napon. Az összes beteg állapotát az 1., 15., 29., 43., 57., 71. és 85. napon értékeltük. Az alkalmazott dózisok 0,5, 2,0 és 10,0 mg/kg volt az LT04EA29Ylg-ból (az ábrákon a csoportok jele rendre LEA.5, LEA2 és LEA10) és a CTLA4lg-bóí (CTLA.5, CTLA2 és CTLATÖ).
Az infúziók során az összes betegen egy, a lehetséges mellékhatásokat felsoroló kérdőív kitöltetésével figyeltünk a periinfúziós mellékhatásokra és az általános biztonságra. A betegeket kikérdeztük bármely, az infúziót kővető 24 órán belül észlelt kel48 iemeíienségroí, és arra bíztattuk őket, hogy szabadon is számoljanak be minden megfigyelésükről. Az orvosok rutinszerű laboratóriumi vizsgálatokkal ellenőrizték a betegek kémiai és citológiai vérképét, így például meghatározták a gyulladási reakció mediátorai, például a cítokinek (TNF, IL-6), a tríptáz és a komplement szérumszíntjeit Az elsődleges végpont azon betegek aránya volt, akik kielégítik az ACR-20 követelményt a 85. napon.
A vizsgálati anyagok támlása
A CTLMig és az L104EA29Ylg egyszer használatos üvegampullákban voltak (200 mg CTLA41g vagy 100 mg L104EA29Ylg). Az infúzió előtt mindkettőt 25 mg/mi végkonceníráciora hígítottuk fel steril vízzel (pro inj.).
A beadás mőd/a
Az összes infúziót Intravénásán, 1 óra alatt adtuk be (1-17. ábrák). Az összes beteg legalább egy Infúziót kapott a kísérleti gyógyszerből 1 csoport: 32 beteg, a CTLA4lg~nak vagy az L1Ö4EA29Ylg-nak megfelelő placébó;
2. csoport: 28 beteg, 0,5 mg/kg CTLA4lg;
3. csoport: 32 beteg, 2,0 mg/kg CTl.A4lg;
4. csoport: 32 beteg, 10,0 mg/kg CTLA4lg;
5. csoport: 32 beteg, 0,5 mg/kg L1Ö4EA29Ylg;
6. csoport: 29 beteg, 2,0 mg/kg L104EA29Ylg;
7. csoport: 31 beteg, 10,0 mg/kg LlG4EA29Yig;
Klmlkal megfigyelés
A betegeken felvettük a betegség aktivitását jelző tüneteket az első infúzió előtt. Áz alap-felvételezéshez tartozott az ízületek duzzadtsága és fájdalmassága, a gyulladás, a reggeli merevség és a betegség aktivitásának értékelése a beteg és az orvos által, valamint a funkcionális korlátozottság értékelése a „Health Guestionnaíre Assessment (HÁG) alkalmazásával (az utóbbi eredményét „fizikai funkció értékpont’-ként mutatjuk be az 1C, ábrán), és a fájdalom értékelése (1A-D. ábrák). Az alapértékek felvételéhez tartozott még a vérsejtsüliyedés (ESR) mérése, illetve a C-reakfiv fehérje (CRP) és az oldható IL-2 receptor 0L~2r) szérumszintjének meghatározása (IC és D. ábrák),
A klinikai hatás vizsgálatát az American College of Rheumaíology (ACR) által összeállított kritériumok alapján végezzük. Egy személy akkor elégíti ki az ,ACR-20” követelményt, ha 20 %-os javulást mutat a duzzadt és fájdalmas ízületek számában, és 20 %-os javulást a fennmaradt őt tünet közöl háromban (ezek a betegég egészében vett súlyossága a beteg és az orvos szerint, a fájdalom, a korlátozottság és egy •·?δ««3/3Α2.
♦·* * ♦.*«'# * * * βχ X * * * * »+« »♦ « ♦ ♦ ♦ * * * ***x *♦« «♦* »· akut fázisú reaktáns; Felsőn et al, Arthritis and Rh&umatism 36, 729-74Ö (1993): Felsőn ef al, Ibid. 38, 1-9 (1995)].
Biomarkerofc
Mértük a betegség aktivitásának lehetséges biomarkerait (reumatcid faktor, CRP, ESR, oldható IL-2r, oldható IGAM-1, oldható E-szelektin és MMP-3) is. Hitelesített enzim-immun méréseket (EIA) használtunk az IL-2sRa, az síCAM-1, az sE-szelektin és az MMP-3 szérumkoneeniráeíójának meghatározására. A TNFa és az IL-8 szintjét az infúzió előtt és két órával utána mértük, ha szükséges volt.
Az IL-2sRa, az slCAM-1 és az sE-szetektin szintjét kereskedelemben kapható, kolorimetriás EIA készletekkel (R&D Systems, Inc,, Mínneapolis, Mn.) mérjük: az alsó és felső méréshatárok rendre 312-20,900 pg/ml, 40-907 rsg/mi és 10-206 ng/ml, a mérések belső variációs koefficiensei 4,48-8,4 %, 3,8-5,0 % és 5,5-9,0 %. A készlet gyártója szerint a normál szérumértékek 876-2132 pg/ml között vannak.
Az ΜΜΡ-3-aí egy kereskedelmi, kolorimotriás EIA készlettel mérjük (Ámersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.). A mérhetőség alsó és felső határértékei 30-7680 ng/ml, a belső variációs koefficiens 8,3-10,8 %. A gyártó szerint a normál széfémértékek 28-99 ng/ml kőzett vannak.
Az IL.-6-ot és TNFa-t kereskedelmi, kemilumineszoenciás EIA készlettel mérjük (R&D Systems, Inc., Minneapolís, Mn.). A mérhetőségek határértékei rendre 0,3-3000 pg/ml és 0,7-7000 pg/ml, a belső variációs koefficiensek 3,1-5,7 % és 6,4-20,7 %, A gyártó szerint a normál szérumértékek <0,3-12 pg/ml és <0,7-7,5 pg/ml,
Acf/tesfek v/zsgá/afa
A győgyszerspecífíkus antitestek meghatározása érdekében szérummintákat veszünk a beadás előtt az 1. napon, majd körülbelül a 15., 29,, 57., 85. és 189, napokon. Mivel eleve létező, magas literek mérhetők a molekulák immunglobulin része ellen, megvizsgáljuk a specifikus antitestek képződését a konstans immunglobulin részt nem hordozó CTLA4 és LEA29Y ellen Is.
Kilencvenhat lyukas immulön II ELISA lemezeket (Dynex, Chantilly, Vi.) bevonunk a CTLAélg, CTLA4, LEA29Ylg vagy LEA29Y rendre 2, 4, 2 vagy 1 ng/mi-es koncentrációjú PBS oldataival, A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 2-8 °G-on, majd 0,05 % Tween 20-at tartalmazó PBS-tai mossuk és 1 % BSA-t tartalmazó PBS-tal rögzítjük 37 X-on, 1 órán át. Ezután a lemezeket mossuk, majd rácsepegtetjük a vizsgált vagy a minőségellenőrző (GG) szérum sorozathigitásait és 37 öG~on inkubáljuk 2 órán át, A szérumokat háromszorosára hígítjuk 0,25 % BSA-t és 0,05 % Tween 20-at tar*♦ » #* * * * « fi * * β
V ♦ Φ«« « « « K « «««» »«* χ»φ *x * talmazó PBS-ban egy 1:10 hígításból indulva, Ezután a lemezeket mossuk és egy alkalikus foszfatázzai konjugált kecske antibumán kappa és lambda antitest-koktélt (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Al.) adunk hozzá. Újabb 1 órás, 37 cC-on végzett inkubálás után a lemezeket mossuk és 1 mg/ml p-nitro-fenií-foszfátot tartalmazó dietanol-amín puffért adunk minden lyukhoz, A lemezeket 25 CCon tartjuk, majd a reakciót 30 perc múlva 3 n nátrium-hidroxid-oidattai leállítjuk és az abszorbancíát mérjük 405 és 550 nm-nél, Az eredményeket a végpont-titerben (EPT) fejezzük ki, ami annak a legnagyobb hígításnak a recíproka, amelynek abszorbanciája ötször nagyobb, mint a lemez átlagos háttér-abszorbanoiája. A lemez háttér-értéke a szérum nélküli lyukak abszorbanciája, Az értékeket akkor tekintjük pozitívnak, ha a kezelés után vett szérum titere legalább két hígítással nagyobb (kilencszerese), mint a kezelés előtti mintáé. A CTLA4lg-ra vagy LEA29Y-ra specifikus antitesteket (QC minták) majmok immunizálásával állítjuk elő. A megfelelő QC-minták egy alikvofját minden vizsgálatban megmértük, és a vizsgálat eredményeit csak akkor fogadtuk el, ha a QCminták értékei kielégítették a mérés elfogadhatóságának feltételeit,
Eredmények
A CTLA4lg-t és az L1Ö4EA29Ylg-t a betegek minden dózisban általában jól tolerálják. A periinfuziós mellékhatások minden dózis-csoportban hasonlóak voltak, kivéve a fejfájást A 85. napon, a dózistól függően, a CTLA4íg~nal kezeit betegek 23, 44 és 53 %-a, az L1G4EA29Ylg~nai kezelt betegek 34, 45 és 61 %-a számolt be fejfájásról rendre a 0,5, 2,0 és 10,0 mg/kg dózissal kezelt csoportokban. A placébóval kezelt csoportban a betegek 31 %~a kapott fejfájást.
Azon betegek arányát, akiket az artritisz fellángolása vagy más hátrányos események miatt kizártunk a klinikai vizsgálatból, a 2. ábrán mutatjuk be. A placébóval kezelt csoportból zártuk ki legnagyobb arányban a betegeket az artritisz feliángolása miatt, A CTLA4lg~nal kezelt betegek közül az emelkedő dózissal csökkent a kizártak száma. Az L104EA29Ylg~naí kezeltek közül igen keveset kellett kizárni, Ezek az eredmények egy jó, fordított dózisfüggő választ jeleznek CTLA4ig, és egy erősebb terápiás választ az L1ö4EA29Y1g esetében.
A CTLA4lg~nal, L104EA29Yig-nal vagy placébóval kezelt betegek 85, napon felvett ACR-20, -50 és -70 válaszait a 3A. ábrán foglaljuk össze. A 38. és 3C, ábrákon az ACR-20 válaszok láthatók a 95 %-os konfidencia-határok feltüntetésével. A válasz dőzisfüggőnek látszik egy tisztán szignifikáns hatással a 10 mg/kg hatóanyaggal kezelt betegeknél.
« 444
A 4A, és 48. ábrákon látható azon betegek aránya, akiknél csökkent a duzzadt és fájdalmas ízületek száma a p’aeéhóvai kezelt, vagy a CTLA4lg-os vagy L104EÁ29Yigos kezelésre nem reagáló betegekhez képest. A terápiás válasz dózisfüggőnek tűnik. Több beteg mutatott 20, 50, 70 vagy éppen 100 %-os javulást mindkét anyag esetében, a 2 és 10 mg/kg dózissal kezeit csoportokban.
Azon betegek aránya, akiknél csökken a fájdalom vagy a betegség aktivitása a beteg és az orvos szerint, az 5A-5D, ábrákon látható. A terápiás válasz a Likert-skáián mérve dózisfüggőnek látszik, és jobb az aktív kezelést kapott csoportokban, mint a piacébóval kezelfben (85. nap). A Ukert-skála egy hitelesített, szóbeli értékelő rendszer,
amely mellékneveket használ a tünetek rangsorolására („The American College of Rheumatology Freliminary Core Set of Disease Activity Measures fór Rheumatoid Arthritis Clinicai Trials”, Arthritis anö Rőeumaősm. 36, 729-740 (1903)].
Azon betegek aránya, akiknél a betegség aktivitása az orvos és a legalább 2 egységgel javult az alapfelvételezéshez képest a CTLA4íg~nal, L nal vagy placébóvai kezeit csoportokban, a 6A. és SB. ábrákon látható. A válasz dózisfüggőnek tűnik kifejezett javulással a hatóanyagok nagyobb dózisai esetében,
A C-reaktív fehérje szérumszintjének százalékos csökkenése látható a 7A. és 73. ábrákon. A válasz dózisfüggőnek tűnik világos csökkenéssel a 2 és 19 mg/kg-os csoportokban. Emellett a 7B. ábrán látható, hogy a plaoébóhoz képesti különbség szignifikáns a 95 %-os konfidencia-határok mellett. A 7C. ábrán láthatók a szérumszint változásai az alapvonalhoz képest, a SS. napon,
A CTLA4lg-nal, L1Ö4EA29Ylg~nal vagy placébóvai kezelt betegek oldható SL-2 receptor szérumszintje a 8. ábrán látható. Az oldható IL-2 receptor szérumszintjének csökkenése dózisfüggőnek látszik.
A CTLA41g-nal, L1ö4EA20Ylg-nal vagy placébóvai kezelt betegek oldható ICAM-1 és oldható E-szelektin szérumszintje a 33. ábrán látható. Az oldható 1CAM-1 és E-szelektin szérumszintek csökkenése szintén dözísfüggést mutat.
A CTLA4lg-nal vagy placébóvai kezelt betegeknél az érzékeny ízületek számának középértékét és átlagát mutatjuk be az Idő függvényében a 9A. és OB. ábrákon. Az alapvonalhoz viszonyított változás (például az érzékeny ízületek számának csökkenése) jelentősebbnek tűnik a 2 és 10 mg/kg-os kezelési csoportokban, mint a piacébóval vagy a 0,5 mg/kg hatóanyaggal kezeitekben.
A CTLA4lg-nal vagy placébóvai kezelt betegeknél a duzzadt ízületek számának középértékét és átlagát mutatjuk be az idő függvényében a 10A. és 103. ábrákon. Az ♦Μ « «*«» ** * *: ♦: χ χ « « «« ♦ ♦ «*χ *♦ β ♦ ♦ ♦ * * χ ♦ *«« »» alapvonalhoz viszonyított változás (például a duzzadt. Ízületek számának csökkenése) jelentősebbnek tűnik a 2 és 10 mg/kg-os kezelési csoportokban, mint a placébőval vagy a 0,5 mg/kg hatóanyaggal kezeitekben.
A fájdalom értékpontjainak időbeli változásai a CTLA41g-nal vagy placébőval kezelt csoportok esetében all. ábrán láthatók. Az alapvonalhoz viszonyított változás (például a fájdalom csökkenése) jelentősebbnek tűnik a 2 és 1Q mg/kg-os kezelési csoportokban, mint a placébőval vagy a 0,5 mg/kg hatóanyaggal kezeitekben.
A betegség aktivitásának a beteg vagy az orvos által értékelt időbeli változásai a CTLA4lg-nal vagy placébőval kezelt csoportok esetében a 12A. és 12B, ábrákon láthatók. Az alapvonalhoz viszonyított változás (például a betegség aktivitása) jelentősebbnek tűnik a 2 és 10 mg/kg-os kezelési csoportokban, mint a piacébóval vagy a 0,5 mg/kg hatóanyaggal kezeitekben.
Az érzékeny ízületek számának változásai az idő függvényében a 13A. és 138. ábrákon láthatók az L104EA29Yig-nal (az ábrán „LEA”) vagy placébőval kezelt csoportok esetében. Az alapvonalhoz viszonyított változás (például az érzékeny Ízületek számának csökkenése) dózisfüggőnek tűnik.
A duzzadt Ízületek számának változásai az idő függvényében a 14A, és 148, ábrákon láthatók az l1Ö4£A29Ylg-nal vagy piacébóval kezelt csoportok esetében. Az alapvonalhoz viszonyított változás (például a duzzadt Ízületek számának csökkenése) jelentősebbnek tűnik a 2 és 10 mg/kg hatóanyaggal, mint a piacébóval vagy 0,5 mg/kg hatóanyaggal kezelt csoportok esetében.
A fájdalom értékpontjának időbeli változásai az L1ö4EA29Yíg-nal vagy piacébóval kezelt csoportok esetében a 15. ábrán láthatók. Az alapvonalhoz viszonyított változás (például a fájdalom csökkenése) dózisfüggőnek látszik.
A betegség aktivitásának a beteg vagy az orvos által értékelt időbeli változásai az L104EA29Ylg-naí vagy placébőval kezelt csoportok esetében a 16A. és 18B, ábrákon láthatók. Az alapvonalhoz viszonyított változás (például a betegség aktivitásának csökkenése) dőzisfüggonek látszik.
A fizikai korlátozottság százalékos javulása — a HAQ-val felmérve, a 85, napon — a CYLA4Ig-nal, L104EA29Ylg~nal vagy piacébóval kezelt csoportokban a 17. ábrán látható {HÁG = „Health Assessment Questionnairé’; Fries eía/„ J. Rb&umateí 9, 789-793 (1982)]. Ez a paraméter jól láthatóan dózisfüggő javulást mutat.
Az oldható lL-2r és CRP szérumszíntjének alapvonalhoz viszonyított változásai dózísfüggők mindkét kezelési csoportban. A kezelés után az oldható 1 L~2r szintek -2, »« Φ Μ <ί »·»♦ « > Φ «ΦΦ ·»# φφ és -22 % a CTLA4lg-nal, és -4, -18 és -32 % az L1G4EA29Ylg-nai (rendre 0,5, 2,0 és 10,0 mg/kg) kezelt csoportokban, szemben a píacébóval kezelt csoport +3 %-ával A C-reaktív fehérje szintek ugyanitt +12, -15 és -32 %, illetve +47, -33 és -47 %, szemben a piacéba +20 %-ával (7Α. ábra).
A rutin vérkép- és kémiai laboratóriumi vizsgálatok nem szolgáltak megjegyzésre érdemes eredményekkel; az egyetlen kivétel az IgA és IgG szintek enyhe csökkenése mindkét hatóanyag legnagyobb dózisainál. Ugyancsak nem találtunk fizikális vagy vitális eltéréseket, Megjegyzendő, hogy egyik kezelés sem indukált hatóanyagKtiníkal vizsgálatok
Ebben a példában betegeken végzett, II. fázisú klinikai vizsgálatot írunk le, ahol L104EA29Ylg-t adtunk be súlyos szerkezeti károsodások, így röntgenvizsgálatokkal megerősített csont és izületi eróziók csökkentésére vagy megelőzésére. A szerkezeti károsodások csökkentésében vagy megelőzésében elért javulás párhuzamos a klinikai paraméterekben mért javulással,
A csontszerkezet állapotát néhány betegnél megvizsgáltuk a CTLA41g-nal vagy az L1ö4EA29Ylg~nal végzett kezelés előtt. Ezeknek a betegeknek 0,5 és 20 mg/kg közötti dózisban CTLA4lg-t vagy L104EA29Ylg-t adtunk krónikusan, minden 2.-12. héten (önmagában vagy más hatóanyaggal kombinálva), hogy hosszabb Időn át fenntartsuk a terápiás hatást A betegek kezeiről és lábairól Rtg-felvéteíeket készítettünk előre meghatározott időpontokban: 8 hónaponként, utána évente, az FDA útmutatása szerint. Ezeket a betegeket hosszú időn át megfigyeltük a 6. és 12. hónapok után, hogy megállapíthassuk, vajon a CTLA4tg-nai vagy az t1Ö4EA29Yíg~nal végzett kezelések fékezik-e a csontpusztulás progresszióját. A betegeket szokásos módon, Rtgés/vagy mágneses rezonancia képalkotással vizsgáltuk [Larsen és Bak, Acfa Rádiói. D/ag, IS, 481-491 (1977); Sharp ei a/., Arthritis and Rheomaíism 28, 1326-1335 (1985)}. A radiográfiás adatokat a szerkezeti károsodás megelőzése, így a csonterözlő és az ízület károsodásának lelassulása, az izületi rés beszűkülése és/vagy új eróziók kialakulásának megakadályozása szempontjából értékeljük.
** φ

Claims (11)

  1. Szabadalmi Igénypontok
    1. Egy oldható CTLA4 mutáns molekula — amely oldható CTLA4 mutáns molekula
    a) a +1. pozícióban metionínnal kezdődő és a +357. pozícióban Iizínnel végződő L104EA29Llg; ahogy a 20. ábrán látható,
    b) a +1. pozícióban metionínnal kezdődő és a +357. pozícióban Iizínnel végződő L1Ö4EA29TIg, ahogy a 21. ábrán látható vagy
    o) a +1. pozícióban metionínnal kezdődő és a +357. pozícióban iizínnel végződő L104EA29Wlg, ahogy a 22. ábrán látható — alkalmazása „graft versus hőst betegség (GVHD), átültetett szövetek kilökődésével, krónikus kilökődéssel és szövet vagy sejt allo- vagy xenograftok, beleértve szervek, bőr, szövetségetek, izmok, máj- és ídegsejtek átükötetesével kapcsolatos ímmunzavarok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény gyártásában.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula
    a) alant nh ál a -1. pozícióban ^etloalneel kezdődő és a +357.
    L104EA29Llg, ahogy a 29, ábrán látható, aUnmoaC a -1. pozícióban láeáeeinft^ kezdődő és a +357 pozícióban Iizínnel végződő pozícióban iizínnel végződő
    L104EA29T.Igt ahogy a 21. ábrán látható vagy ίΐΑ·>
    c) a -1. pozícióban p^ebonbna^ kezdődő és a +357, pozícióban Iizínnel végződő UÖ4EA29Wlg, ahogy a 22, ábrán látható.
  3. 3. Az 1. vagy 2, igénypont szerinti alkalmazás a hatóanyagok lokális vagy szlsztemlkus beadására.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a beadás az intravénásán, intramuszkulánsan, szabkután, Implantáiható adagolóval, folytonos infúzióval, génterápiával, líposzómák segítségével történő és orális beadás által alkotott csoportból választott.
  5. 5. Az 1. vagy 2. Igénypont szerinti alkalmazás egy alanynak az oldható CTLA4 mutáns molekula körülbelül 0,5-100 mg/testőmeg-kg mennyiségben való beadására,
  6. 6, Az 5. Igénypont szerinti alkalmazás egy alanynak az oldható CTLA4 mutáns molekula 0,5 mg/testömeg-kg mennyiségben való beadására.
  7. 7ü44 4S,''5k.%<;
    Λ *
    7. Αζ 5, igénypont szerinti alkalmazás egy alanynak az oldható CTLA4 mutáns molekula 2 mg/testömeg-kg mennyiségben való beadására.
  8. 8. Az 5. igénypont szennti alkalmazás egy alanynak az oldható CTLA4 mutáns molekula 1 ö mg/testömeg kg mennyiségben való beadására.
  9. 9. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás egy, az ember, majom, emberszabású majom, kutya, macska, szarvasmarha, ló, nyúl, egér és patkány által alkotott csoportból választott alany kezelésére.
  10. 10. Gyógyszerkészítmény, amely egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozót és egy oldható CTLA4 mutáns molekula hatásos mennyiségét tartalmazza, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula
    a) a +1. pozícióban metioninnal kezdődó és a +357. pozícióban íizínneí végződő L1Ö4EA29lIg: ahogy a 20 ábrán látható,
    b) a + 1, pozícióban metioninnal kezdődő és a +357. pozícióban íizínneí végződő L1ö4EA29Tlg, ahogy a 21 ábrán látható vagy
    c) a +1. pozícióban^ metioninnal kezdődő és a +357, pozícióban íizínneí végződő L1Ö4EA29Wlg, ahogy a 22. ábrán látható.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a gyógyszerészetíleg elfogadható hordozó ioncserélők, alumíníum-oxid, alumínium-sztearát, íecitío, szérumfehérjék, így humán szérumaibumin, pufferanyagok, glicln, szorbinsav, kálium-szorbát, telített növényi zsírsavak részleges gllcerldjeinek keverékei, foszfát-pufterolt nátrium-kíoríd-oídat, víz, emulziók, sók vagy elektrolitok, kolloidé kovasav, magnézium-trlszilíkát, poíi(vínil-pirrölidon), cellulóz-alapú vegyületek, polletllénglikol, steril oldatok, tabletták, segédanyagok, szacharóz, glukóz, maltőz, ízesítők és színezék adalékok, lipid készítmények és polimer készítmények közül kiválasztott.
HU0900660A 2000-07-03 2001-07-02 Use of soluble ctla4 mutants HU227669B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21591300P 2000-07-03 2000-07-03
PCT/US2001/021204 WO2002002638A2 (en) 2000-07-03 2001-07-02 Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU227669B1 true HU227669B1 (en) 2011-11-28

Family

ID=22804919

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0900660A HU227669B1 (en) 2000-07-03 2001-07-02 Use of soluble ctla4 mutants
HU0301727A HU226847B1 (en) 2000-07-03 2001-07-02 Use of soluble ctla4 molecules for treating of rheumatoid arthritis
HUS1000008C HUS1000008I1 (hu) 2000-07-03 2010-04-27 Oldható CTLA4 molekulák alkalmazása reumatoid artritisz kezelésére

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0301727A HU226847B1 (en) 2000-07-03 2001-07-02 Use of soluble ctla4 molecules for treating of rheumatoid arthritis
HUS1000008C HUS1000008I1 (hu) 2000-07-03 2010-04-27 Oldható CTLA4 molekulák alkalmazása reumatoid artritisz kezelésére

Country Status (39)

Country Link
US (1) US7455835B2 (hu)
EP (4) EP1372696B1 (hu)
JP (1) JP2004517806A (hu)
KR (3) KR20030017606A (hu)
CN (1) CN1318086C (hu)
AR (2) AR035037A1 (hu)
AT (1) ATE401909T1 (hu)
AU (2) AU2001273174B2 (hu)
BG (2) BG66024B1 (hu)
BR (1) BR0112104A (hu)
CA (2) CA2413190C (hu)
CY (3) CY1109786T1 (hu)
CZ (1) CZ303959B6 (hu)
DE (1) DE60135029D1 (hu)
DK (2) DK1935427T3 (hu)
EE (1) EE05378B1 (hu)
ES (2) ES2667203T3 (hu)
HK (1) HK1058486A1 (hu)
HR (1) HRP20030071B1 (hu)
HU (3) HU227669B1 (hu)
IL (2) IL153593A0 (hu)
IS (1) IS2834B (hu)
LT (2) LT1935427T (hu)
LV (1) LV12993B (hu)
MX (1) MXPA02012603A (hu)
MY (1) MY137552A (hu)
NO (3) NO20026264L (hu)
PE (1) PE20020772A1 (hu)
PL (2) PL212205B1 (hu)
PT (2) PT1372696E (hu)
RS (1) RS50811B (hu)
RU (1) RU2287340C2 (hu)
SI (3) SI1935427T1 (hu)
SK (1) SK287940B6 (hu)
TR (1) TR201807700T4 (hu)
TW (2) TWI322153B (hu)
UY (1) UY26815A1 (hu)
WO (1) WO2002002638A2 (hu)
ZA (1) ZA200210058B (hu)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
EP0892643B2 (en) * 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
UY26723A1 (es) * 2000-05-26 2001-12-28 Bristol Myers Squibb Co Moléculas mutantes de ctla4 solubles y usos de las mismas
KR20030007899A (ko) * 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
TWI322153B (en) * 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PL204899B1 (pl) 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4
WO2003088991A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating an autoimmune disease using a soluble ctla4 molecule and a dmard or nsaid
WO2004058800A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
ES2354610T5 (es) * 2002-12-23 2020-09-14 Bristol Myers Squibb Co Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
BRPI0413326A (pt) * 2003-08-04 2006-10-10 Bristol Myers Squibb Co métodos para tratar doença cardiovasculares empregando-se uma molécula ctla4 solúvel
AU2004287431B2 (en) 2003-10-27 2010-03-11 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
US7815765B2 (en) * 2004-04-01 2010-10-19 Swei Mu Wang Method for forming laminated synthetic leather
US9309316B2 (en) 2005-12-20 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
PL2253644T3 (pl) * 2005-12-20 2014-04-30 Bristol Myers Squibb Co Kompozycje i sposoby wytwarzania kompozycji
CN101822820A (zh) * 2005-12-20 2010-09-08 布里斯托尔—迈尔斯斯奎布公司 稳定蛋白质制剂
US7528111B2 (en) * 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
GB0620934D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
AU2014250683B2 (en) * 2007-11-01 2015-11-26 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
EP2612868B1 (en) * 2007-11-01 2018-08-15 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
AU2012202324B2 (en) * 2007-11-01 2014-08-28 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) * 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
US8475790B2 (en) 2008-10-06 2013-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of CD137 antibody and CTLA-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
EP2365823B1 (en) * 2008-10-30 2016-11-30 Yeda Research And Development Company Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
EP2459251B1 (en) 2009-07-30 2014-03-12 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CN102030828B (zh) * 2009-09-25 2014-10-29 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体
CN103038251B (zh) * 2010-02-19 2016-08-17 Xencor公司 新颖ctla4-ig免疫粘附素
KR20130049775A (ko) 2010-03-12 2013-05-14 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. Ｃｔｌａ４ 단백질 및 이의 용도
US9527912B2 (en) 2010-05-17 2016-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
CA2810631A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
CN103282047B (zh) 2010-09-08 2016-08-24 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
WO2013010537A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
CN103930130B (zh) 2011-09-08 2016-07-06 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
MX2015000237A (es) 2012-06-27 2015-08-14 Orban Biotech Llc Proteinas de fusion ctla4 para el tratamiento de la diabetes.
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2014151230A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating granulomatosis with polyangiitis
CN104740608A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 上海中信国健药业股份有限公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗类风湿性关节炎药物的用途
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
AU2015249656A1 (en) * 2014-04-25 2016-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Use of CTLA4 compound for achieving drug-free remission in subjects with early RA
KR20240046641A (ko) 2015-04-17 2024-04-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 조율가능한 친화성을 갖는 면역조절 단백질
CA2991690A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory t cells and use of same in immunotherapy
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
MA43552A (fr) 2016-04-15 2018-11-07 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices à variants de cd80 et leurs utilisations
CN110392736A (zh) 2017-01-18 2019-10-29 耶达研究及发展有限公司 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
MA50360A (fr) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices de variants de ctla-4 et leurs utilisations
KR20200085777A (ko) 2017-10-18 2020-07-15 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 변이체 icos 리간드 면역조절 단백질 및 관련 조성물 및 방법
EP3765065A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
WO2019175384A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3765064A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
AU2020208909A1 (en) 2019-01-15 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mutated interleukin-34 (IL-34) polypeptides and uses thereof in therapy
WO2023112992A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 レグセル株式会社 免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644792A (en) * 1899-09-14 1900-03-06 Stanhope Boal Heater.
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3424893A1 (de) 1984-07-06 1986-02-06 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen Photographisches silberhalogenidaufzeichnungsmaterial
US6905680B2 (en) * 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
CA2003455C (en) * 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US7070776B1 (en) * 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5580756A (en) * 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
DE122007000078I2 (de) 1991-06-27 2011-01-13 Bristol Myers Squibb Co CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5770197A (en) * 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5624823A (en) * 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection
JPH07508711A (ja) 1992-04-07 1995-09-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン Ｃｄ２８経路免疫調節
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
ATE293686T1 (de) 1993-06-04 2005-05-15 Us Navy Verfahren zur selektiven stimulierung der t- zellproliferation.
AU7107794A (en) 1993-06-10 1995-01-03 Regents Of The University Of Michigan, The Cd28 pathway immunosuppression
WO1995006481A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Trustees Of Dartmouth College Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance
RU2141318C1 (ru) * 1993-12-01 1999-11-20 Санкио Компани Лимитед Ингибитор образования воспалительного цитокина, средство для профилактики и лечения воспалительных заболеваний пищеварительного тракта и синдрома бехчета, способ профилактики и лечения воспалительных заболеваний и язвенного колита
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
AU1333195A (en) 1994-06-03 1996-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
AU2701895A (en) 1994-06-07 1996-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
US5634055A (en) * 1994-09-27 1997-05-27 Bidplus, Inc. Method for selecting assignments
WO1996014865A1 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Repligen Corporation Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5824655A (en) 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US5993800A (en) * 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
EP0892643B2 (en) * 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
JPH1067653A (ja) * 1996-06-17 1998-03-10 Eisai Co Ltd 関節疾患治療剤
US6495579B1 (en) * 1996-12-02 2002-12-17 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Method for treating multiple sclerosis
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
ZA98533B (en) 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
CA2291338A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive t lymphocyte mediated immune responses
EP0947524A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
PT1066060E (pt) * 1998-04-03 2003-12-31 Osiris Therapeutics Inc Celulas estaminais mesenquimais como imunossupressores
CA2333726A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-09 Supergen, Inc. Compositions comprising methotrexate and pentostatin for treating rheumatoid arthritis
JP2000086519A (ja) * 1998-09-17 2000-03-28 Mitsui Chemicals Inc 抗リウマチ薬効果増強剤
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
US6040292A (en) * 1999-06-04 2000-03-21 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating diabetes
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
AU2001264936A1 (en) 2000-05-23 2001-12-03 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
UY26723A1 (es) * 2000-05-26 2001-12-28 Bristol Myers Squibb Co Moléculas mutantes de ctla4 solubles y usos de las mismas
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
KR20030007899A (ko) * 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
TWI322153B (en) * 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PL204899B1 (pl) * 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4

Also Published As

Publication number Publication date
EP1372696B1 (en) 2008-07-23
SK17742002A3 (sk) 2004-11-03
HRP20030071A2 (en) 2005-02-28
CY2008017I1 (el) 2009-11-04
YU101102A (sh) 2006-01-16
HUS1000008I1 (hu) 2019-06-28
RU2287340C2 (ru) 2006-11-20
EP1935427A2 (en) 2008-06-25
HRP20030071B1 (hr) 2014-01-03
EP1935427A3 (en) 2011-05-25
CY1120577T1 (el) 2019-07-10
US7455835B2 (en) 2008-11-25
IL153593A0 (en) 2003-07-06
WO2002002638A3 (en) 2003-10-30
KR20080075564A (ko) 2008-08-18
LT2003002A (en) 2003-07-25
SK287940B6 (sk) 2012-05-03
ATE401909T1 (de) 2008-08-15
BR0112104A (pt) 2004-07-20
KR100895552B1 (ko) 2009-04-29
TW200902546A (en) 2009-01-16
CZ303959B6 (cs) 2013-07-17
EP3384924A1 (en) 2018-10-10
CN1477968A (zh) 2004-02-25
HUP0301727A2 (hu) 2003-09-29
TWI311564B (en) 2009-07-01
DK1372696T3 (da) 2008-11-03
KR100864120B1 (ko) 2008-10-16
SI1935427T1 (en) 2018-05-31
HK1058486A1 (en) 2004-05-21
AU2001273174C1 (en) 2002-01-14
PT1372696E (pt) 2008-10-24
BG66454B1 (bg) 2014-10-31
CZ20024261A3 (cs) 2004-08-18
LT1935427T (lt) 2018-05-10
SI1372696T1 (sl) 2008-12-31
EP2281568A2 (en) 2011-02-09
KR20080025216A (ko) 2008-03-19
SI21078A (sl) 2003-06-30
EE05378B1 (et) 2011-02-15
ES2310557T3 (es) 2009-01-16
CA2413190A1 (en) 2002-01-10
NO20100579L (no) 2003-02-19
AR035037A1 (es) 2004-04-14
PE20020772A1 (es) 2002-09-06
US20030083246A1 (en) 2003-05-01
NO20100580L (no) 2003-02-19
LT5063B (lt) 2003-11-25
EP1372696A2 (en) 2004-01-02
KR20030017606A (ko) 2003-03-03
DK1935427T3 (en) 2018-06-06
PT1935427T (pt) 2018-05-16
CY1109786T1 (el) 2011-04-06
WO2002002638A2 (en) 2002-01-10
DE60135029D1 (de) 2008-09-04
IS2834B (is) 2013-05-15
TR201807700T4 (tr) 2018-06-21
CN1318086C (zh) 2007-05-30
AU7317401A (en) 2002-01-14
LV12993B (en) 2003-10-20
MXPA02012603A (es) 2003-05-14
CY2008017I2 (el) 2016-08-31
EP1935427B1 (en) 2018-03-07
JP2004517806A (ja) 2004-06-17
PL207534B1 (pl) 2010-12-31
AU2001273174B2 (en) 2006-05-18
HUP0301727A3 (en) 2008-08-28
IL153593A (en) 2009-09-01
BG107362A (bg) 2003-09-30
MY137552A (en) 2009-02-27
CA2413190C (en) 2009-04-07
CA2630062A1 (en) 2002-01-10
BG66024B1 (bg) 2010-11-30
EE200300004A (et) 2004-10-15
ZA200210058B (en) 2005-02-23
CA2630062C (en) 2014-10-14
RS50811B (sr) 2010-08-31
IS6667A (is) 2003-01-02
TWI322153B (en) 2010-03-21
ES2667203T3 (es) 2018-05-10
PL365942A1 (en) 2005-01-24
HU226847B1 (en) 2009-12-28
EP2281568A3 (en) 2013-04-24
NO20026264L (no) 2003-02-19
PL212205B1 (pl) 2012-08-31
BG110611A (bg) 2010-05-31
NO20026264D0 (no) 2002-12-27
UY26815A1 (es) 2002-01-31
AR066511A2 (es) 2009-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU227669B1 (en) Use of soluble ctla4 mutants
US10052360B2 (en) Methods for treating dermatomyositis or polymyositis by administering a soluble CTLA4 molecule
US8785398B2 (en) Methods of treatment using CTLA4 mutant molecules
AU2001273174A1 (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule
ZA200208944B (en) Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
AU2003243152A1 (en) Methods for treating an autoimmune disease using a soluble ctla4 molecule and a dmard or nsaid

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Erratum