CZ303959B6 - Solubilní CTLA4 fúzní molekula, farmaceutický prostredek s jejím obsahem a její pouzití - Google Patents

Solubilní CTLA4 fúzní molekula, farmaceutický prostredek s jejím obsahem a její pouzití Download PDF

Info

Publication number
CZ303959B6
CZ303959B6 CZ20024261A CZ20024261A CZ303959B6 CZ 303959 B6 CZ303959 B6 CZ 303959B6 CZ 20024261 A CZ20024261 A CZ 20024261A CZ 20024261 A CZ20024261 A CZ 20024261A CZ 303959 B6 CZ303959 B6 CZ 303959B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ctla4
molecule
soluble
ctla4ig
extracellular domain
Prior art date
Application number
CZ20024261A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20024261A3 (cs
Inventor
Cohen@Robert
Carr@Suzette
Hagerty@David
J. Peach@Robert
Becker@Jean-Claude
Original Assignee
Bristol-Myers Squibb Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22804919&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ303959(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol-Myers Squibb Company filed Critical Bristol-Myers Squibb Company
Publication of CZ20024261A3 publication Critical patent/CZ20024261A3/cs
Publication of CZ303959B6 publication Critical patent/CZ303959B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Jsou popsány solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulární doménu CTLA4 molekuly a jejich pouzití, poprípade v kombinaci s druhým cinidlem vybraným ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánetlivá cinidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, a jejich pouzití, stejne jako farmaceutické prostredky s obsahem uvedené kombinace. Pouzití smeruje do oblasti lécení revmatických onemocnení, ceho se dosahuje podáním solubilních CTLA4 molekul, které blokují endogenní B7 molekuly od vazby na jejich ligandy.

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly a jejího použití, popřípadě v kombinaci s druhým činidlem vybraným ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá činidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, a jejich použití, stejně jako farmaceutického prostředku s obsahem uvedené kombinace. Použití směřuje do oblasti léčení revmatických onemocnění.
Dosavadní stav techniky
V této přihlášce jsou odkazy na různé publikace. Popis těchto publikací v jejich celku je tímto zahrnut formou odkazů do této přihlášky za účelem plnějšího popisu dosavadního stavu techniky, ke kterému tento vynález přísluší.
V současnosti neexistuje kurativní léčba pro revmatická onemocnění. Terapeutická činidla jsou používána pro léčbu příznaků. Obvykle jsou terapeutická činidla podávána po dlouhou dobu a terapeutická hodnota těchto léků je často snížena jejich nežádoucími účinky.
Revmatická onemocnění jsou skupinou onemocnění postihujících muskulo-skeletální systém a pojivovou tkáň.
Tato onemocnění jsou charakterizována chronickým zánětem, který často vede k permanentnímu poškození tkání, deformitám, atrofii a invaliditě. Revmatická onemocnění postihují klouby, kosti, měkké tkáně nebo míchu (Mathies, H., 1983, Rheuma) a jsou klasifikována jako zánětlivý revmatizmus, degenerativní revmatizmus, extra-artikulámí revmatizmus nebo onemocnění kolagenu. O některých revmatických onemocněních je známo, že jsou autoimunitními onemocněními způsobenými chybnou imunitní odpovědí jedince.
Revmatoidní artritida je progresivní revmatické onemocnění postihující přibližně 2 % dospělé populace v rozvinutých zemích (Utsinger. P. D., et al., 1985 Rheumatoid Arthritis, str. 140). Toto onemocnění je charakterizováno persistentní inflamatomí synovitidou, která způsobuje destrukci chrupavky a erozi kosti, což vede ke strukturálním deformitám v periferních kloubech. Mezi příznaky spojené s revmatoidní artritidou patří otoky kloubů, citlivost kloubů, zánět, ranní ztuhlost a bolest, zejména při flexi. Jedinci s pokročilými stadii artritidy trpí strukturálním postižením, včetně destrukce kloubu s erozí kosti (v: „Principals of Intemal Medicine, Harrison, 13. vydání, str. 1648-1655). Kromě toho mohou mít pacienti jiné příznaky, včetně lézí na kůži, ledvinách, srdci, plících, centrálním nervovém systému a očích, které jsou způsobené vaskulitidou související s autoimunitním procesem.
Mezi další příznaky související s revmatoidní artritidou patří zvýšená sedimentace erytrocytů a zvýšená sérová koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) a/nebo solubilního IL-2 receptorů (IL-2r). Sedimentace erytrocytů je zvýšena téměř u všech pacientů s aktivní revmatoidní artritidou. Koncentrace C-reaktivního proteinu v séru je také zvýšená a koreluje s aktivitou onemocnění a pravděpodobností progresivního postižení kloubů. Dále, sérová koncentrace solubilního IL-2r, produktu aktivovaných T-lymfocytů, je zvýšena v séru a synoviální kapalině u pacientů s aktivní revmatoidní artritidou (viz „Principals of Intemal Medicine, Harrison, 13. vydání, strana 1650).
Revmatoidní artritis se považuje za autoimunitní onemocnění zprostředkované T-lymfocyty, na kterém se podílí antigen-nespecifické intercelulámí interakce mezi T-lymfocyty a buňkami pre- 1 CZ 303959 B6 zentujícími antigen. Obecně, velikost reakce T-lymfocytů je určena ko-stimulační reakcí vyvolanou interakcí mezi povrchovými molekulami T-lymfocytů a jejich ligandy (Mueller et al., 1989 Ann. Rev. Imunol. 7:445-480). Klíčové kostimulační signály jsou dodávány interakcí mezi povrchovými receptory T-lymfocytů, CD28 a CTLA4, a jejich ligandy, jako jsou molekuly CD80 podobné B7 (tj.. B7-1) a CD86 (tj. B7-2), na buňkách prezentujících antigen (Linslev, P. a Ledhetter, J., 1993 Ann. Rev. Imunol. 11:191-212).
Aktivace T-lymfocytů za absence ko-stimulace vede k alergické reakci T-lymfocytů (Schwartz, R. H., 1992 Cell 71:1065-1068), při které imunitní systém přestává reagovat na stimulaci.
Protože se revmatoidní artritida považuje za autoimunitní onemocnění zprostředkované T-lymfocyty, je jednou strategií pro vývoj nových činidel pro léčbu revmatoidní artritidy snaha o identifikaci molekul, které blokují ko-stimulační signály mezi T-lymfocyty a buňkami prezentujícími antigen, blokováním interakce mezi endogenním CD28 nebo CTLA4 a B7. Mezi potenciální molekuly patří solubilní CTLA4 molekuly, které jsou modifikovány tak, aby byly schopny se vázat na B7 s vyšší aviditou než přirozený CTLA4 (jehož sekvence je uvedena na Obr. 23) nebo CD28, čímž dojde k blokování ko-stimulačních signálů.
Solubilní formy CD25 a CTLA4 byly připraveny fúzováním variabilních (V)—like extracelulárních domén CD28 a CTLA4 na imunoglobulinové (Ig) konstantní domény, což vede ke vzniku CD28Ig a CTLA4Ig. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTLA4Ig je uvedena na Obr. 24 stím, že protein začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici-1 a končí lysinem v pozici +357. CTLA4Ig se váže na CD80-pozitivní a CD86-pozitivní buňky silněji než CD28Ig (Linsley, P., et al., 1994, Immunity 1:793-80). Bylo zjištěno, že mnoho imunitních reakcí zprostředkovaných T-lymfocyty je blokováno CTLA4Ig jak in vitro, tak in vivo. (Linsley, P., et al., 1991b, výše: Linslay, P., et al., 1992a Science 257:792-795; Linsley, P., et al. 1992b J. Exp. Med 176:1595-1604; Lenschow. D. J., et at. 1992 Science 257:789-792; Tan, P., et al., 1992, J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L. A., 1992 Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105).
Pro pozměnění vazebné afinity k přirozeným ligandům, jako je B7, byly solubilní CTLA4Ig fúzní molekuly modifikovány mutací aminokyselin v CTLA4 částí molekuly. Regiony CTLA4, které po mutaci mění vazebnou afinitu nebo aviditu pro B7 ligandy zahrnují komplementaritu určující region 1 (CDR-1, jak je popsán v U.S. Patentech 6090914, 5773253, 5844095; v související U.S. Patentové přihlášce 60/214065: a v Peach et al., 1994, J. Exp. Med., 180: 2049-2058) a regiony podobné komplementaritu určujícímu regionu 3 (CDR-3-like regiony (CDR-3 je konzervovaný region CTLA4 extracelulámí domény, jak je popsáno v U.S. Patentech 6090914, 5773253 a 5844095; v související US patentové přihlášce 60/214065; a v Peach, R. J., et al., J. Exp. Med. 1994 180:2049-2058. CDR-3-podobný region obsahuje CDR-3 region a dalších několik aminokyselin před a/nebo za CDR-3 motivem. CDR-3-podobný region obsahuje hexapeptidový motiv MYPPPY, který je vysoce konzervován ve všech členech CD25 a CTLA4 rodiny. Alaninová skenovací mutagenese v hexapeptidovém motivu v CTLA4, a ve vybraných zbytcích v CD28Ig, vedla ke snížení nebo eliminaci vazby na CD80 (Peach, R. J., et al., J. Exp. Med. 1994, 160:2049-2058).
Další modifikace v solubilní CTLA4Ig molekule byly provedeny záměnou homologních regionů CTLA4 a CD28. Tyto chimérické CTLA4/CD28 homologní mutantní molekuly identifikovaly MYPPPY hexapeptidový motiv společný CTLA4 a CD28, stejně jako některé nekonzervované aminokyselinové zbytky v CDR-1 a CDR-3-podobných regionech CTLA4, jako regiony odpovědné za zvýšení vazebné avidity CTLA4 s CD80 (Peach, R. J., et al., 1994 J Exp Med 180:2049-2058).
Solubilní CTLA4 molekuly, jako je CTLA4Ig, CTLA4 mutantní molekuly nebo chimérické CTLA4/CD28 homologní mutanty, jak byly popsány výše, tvoří novou skupinu terapeutických léků pro léčbu revmatických onemocnění.
- 2 CZ 303959 B6
Současná léčba revmatických onemocnění, jako je revmatoidní artritis, zahrnuje podávání nespecifických cytotoxických imunosupresivních léků, jako je methotrexat, cyklofosfamid, azathioprim, cyklosporin A, blokátory nebo antagonisté faktoru nekrosy nádorů alfa (TNF-alfa). Tyto imunosupresivní léky potlačují celou imunitní odpověď jedince a dlouhodobé používání zvyšuje riziko infekcí. Kromě toho tyto léky pouze zpomalují progresi revmatoidní artritidy, což vede k akceleraci stavu poté, co je terapie přerušena. Dále dlouhodobá terapie těmito nespecifickými léky má toxické nežádoucí účinky, včetně tendence ke vzniku některých malignit, selhávání ledvin, suprese kostní dřeně, plicní fibrosy, malignit, diabetů a narušení jatemích funkcí. Účinnost těchto léků také postupně během 2 až 5 let vymizí (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6. vydání, strany 1001-1022).
Alternativně jsou k dosažení symptomatické úlevy používána terapeutická činidla, která jsou nespecificky imunosupresivní a protizánětlivá. Tyto léky jsou závislé na dávce a nebrání progresi onemocnění. Mezi takové léky patří steroidní sloučeniny, jako je prednison a methylprednisolon. Steroidy mají také významné nežádoucí účinky při dlouhodobé terapii (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6. vydání, strany 829-833).
Tak má současná léčba revmatoidní artritidy omezenou účinnost, významné nežádoucí účinky a nemůže být použita po dlouhou dobu.
Proto existuje potřeba nové léčby, která je účinná a lepší pro léčbu revmatických onemocnění, jako je revmatoidní artritida, a která nemá nevýhody běžných terapií a léků, neboť postihuje autoimunitní patofyziologické mechanismy.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je použití solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu jedince majícího revmatoidní artritidu, kde jedinec má za sebou selhání alespoň jednoho antirevmatika modifikujícího onemocnění (DMARD).
Předmětem tohoto vynálezu také jsou solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro použití pro léčení jedince majícího revmatoidní artritidu, kde jedinec má za sebou selhání alespoň jednoho antirevmatika modifikujícího onemocnění (DMARD).
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž použití solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulární doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro výrobu farmaceutického prostředku pro redukci nebo prevenci strukturálního poškození jedince majícího revmatické onemocnění.
Předmětem tohoto vynálezu je dále solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro použití pro redukci nebo prevenci strukturálního poškození jedince majícího revmatické onemocnění.
-3 CZ 303959 B6
Předmětem tohoto vynálezu je taktéž použití prvního činidla a druhého činidla, kde
a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici + 124, jak je znázorněno na obr. 19, a
b) druhé činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá činidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu revmatického onemocnění.
Předmětem tohoto vynálezu je také první činidlo a druhé činidlo, kde
a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici + 124, jak je znázorněno na obr. 19, a
b) druhé činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá činidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro použití pro léčení revmatického onemocnění.
Předmětem tohoto vynálezu je konečně farmaceutický prostředek obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a účinné množství prvního činidla a druhého činidla, kde
a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 19, a
b) druhé činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá činidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 A: Demografická data kohort pacientů. Demografická data zahrnují pohlaví, rasu a trvání onemocnění, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 1B: Demografická data kohort pacientů. Demografická data zahrnují pohlaví, věk, hmotnost a aktivitu onemocnění, jak je hodnocena pacientem a lékařem, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 1C: Demografická data kohort pacientů, jak je popsáno v příkladu 3, dále. Demografická data zahrnují aktivitu onemocnění, sedimentaci erytrocytů (ESR), fyzikální funkce (neschopnost hodnocená podle dotazníku) a C-reaktivní protein (CRP).
Obr. ID: Demografická data kohort pacientů, jak je popsáno v příkladu 3, dále. Demografická data zahrnují otoky kloubů, citlivost kloubů, ranní ztuhlost a bolest.
- 4 .
Obr. 1E: Demografická data kohort pacientů, jak je popsáno v příkladu 3. Demografická data zahrnují předchozí léčbu.
Obr. 2: Souhrn důvodů přerušení léčby v den 85, podle příkladu 3, dále.
Obr. 3A: ACR reakce v den 85, podle příkladu 3, dále: ACR-20, -50 a-70 reakce.
Obr. 3B: ACR-20 reakce v den 85, včetně reakce na placebo, podle příkladu 3, dále: ACR-20 reakce s 95% intervalem spolehlivosti.
Obr. 3C: ACR-20 reakce v den 85 podle příkladu 3, dále: Rozdíly v ACR-20 reakci s 95% intervaly spolehlivosti.
Obr. 4A: Základní (20% zlepšení) klinická odpověď z hlediska otoku a citlivosti kloubů v procentu pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: základní klinická odpověď. ACR-20.
Obr. 4B: Klinické odpovědi (v procentech zlepšení) u oteklých a citlivých kloubů v procentu pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změna klinické odpovědi v procentu zlepšení.
Obr. 5A: Reakce z hlediska bolesti (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny skóre bolesti od základní hodnoty.
Obr. 5B: Celkové změny aktivity onemocnění hodnocené lékařem (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny celkové aktivity onemocnění.
Obr. 5C: Celkové změny aktivity onemocnění hodnocené lékařem (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny celkové aktivity onemocnění.
Obr. 5D: Bolest (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny od základní hodnoty.
Obr. 6A: Celkové hodnocení změny aktivity onemocnění od základní hodnoty podle pacienta po 2 jednotkách v den 85, jak je popsáno v příkladu 3; zlepšení aktivity onemocnění.
Obr. 6B: Celkové hodnocení změny aktivity onemocnění od základní hodnoty podle lékaře po 2 jednotkách v den 85, jak je popsáno v příkladu 3; zlepšení aktivity onemocnění.
Obr. 7A: Procentuální redukce koncentrací C-reaktivního proteinu (CRP) v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále; procento snížení koncentrace CRP vzhledem k základní hodnotě.
Obr. 7B: Rozdíl ve snížení koncentrací C-reaktivního proteinu (CRP) v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: procentuální snížení rozdílu v koncentracích CRP v 95% intervalu spolehlivosti.
Obr. 7C: Průměrné snížení koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty.
Obr. 8: Redukce koncentrace solubilního IL-2 receptoru, průměrná změna od základní hodnoty v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
-5CZ 303959 B6
Obr. 9A: Efekt CTLA41g na citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 9B: Efekt CTLA4Ig na citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrný rozdíl od základní hodnoty.
Obr. 10A: Efekt CTLA4Ig na otok kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 10B: Efekt CTLA4Ig na otok kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrný rozdíl od základní hodnoty.
Obr. 11: Efekt CTLA4Ig na bolest podle průměrné změny od základní hodnoty za čas, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 12A: Efekt CTLA4Ig na hodnocení aktivity onemocnění pacientem podle průměrné změny od základní hodnoty za čas, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 12B: Efekt CTLA4Ig na hodnocení aktivity onemocnění pacientem podle průměrné změny od základní hodnoty za čas, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 13A: Efekt L104EA29YIg citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 13B: Efekt L104EA29YIg na citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty.
Obr. 14A: Efekt L104EA29YIg na otoky kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 14B: Efekt L104EA29YIg na otoky kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty.
Obr. 15: Efekt L104EA29YIg na hodnocení bolesti v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty za čas.
Obr. 16A: Efekt L104EA29YIg na hodnocení bolesti pacientem v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty za čas.
Obr. 16B: Efekt L104EA29YIg na hodnocení středního rozdílu chorobné aktivity od základní hodnoty za čas lékařem, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 17: Procentuální zlepšení nezpůsobilosti pacienta podle dotazníku hodnotícího zdravotní stav (HAQ) ve srovnání s výchozím stavem v den 85 s léčbou CTLA4Ig a L104EA29YIg, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 18: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EIg (SEQ ID NO: 6 a 7), jak je popsána v příkladu 1, dále.
Obr. 19: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29YIg (SEQ ID NO: 8 a 9), jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
Obr. 20: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29LIg (SEQ ID NO: 10 a 11), jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
-6CZ 303959 B6
Obr. 21: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29Tlg (SEQ ID NO: 12 a 13), jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
Obr. 22: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29WIg (SEQ ID NO: 14 a 15), jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
Obr. 23: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTLA4 receptoru (SEQ ID NO: 16 a 17).
Obr. 24: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTLA4Ig (SEQ ID NO: 18a 19).
Obr. 25: SDS gel (obr. 25A) pro CTLA4Ig (dráha 1), L104EIg (dráha 2), a L104EA29YIg (dráha 3A); chromatrogramy s vylučováním podle velikosti pro CTLA4Ig (obr. 25B) a L104EA29YIg (Obr. 25C).
Obr. 26 (levý a pravý obr.): Diagram složeného CTLA4 extracelulámího Ig V-typu připraveného podle struktury určené NMR spektroskopií. Obr. 26 (pravý) ukazuje rozšířený pohled na CDR-1 (S25-R33) region a MYPPPY region ukazující umístění a orientaci vedlejších řetězců mutací zvyšujících aviditu, LI04 a A29.
Obr. 27A a 27B: FACS testy ukazující vazbu L104EA29YIg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské CD80- nebo CD86-transfektované CHO buňky, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 28A a 28B: Grafy ukazující inhibici proliferace CD80-pozitivních a CD86-pozitivních CHO buněk, jak je popsána v příkladu 2, dále.
Obr. 29A a 29B: Grafy ukazující že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v inhibování proliferace primárních sekundárních allostimulovaných T-lymfocytů, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 30A-C: Grafy ilustrující, že LI04EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v inhibování produkce IL-2 (obr. 30A), IL^t (obr. 30B) a gamma-interferonu (FIG. 30C) allostimulovanými lidskými T-lymfocyty, jak je popsáno v příkladu 2, dále
Obr. 31: Graf ukazující, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v inhibování proliferace fytohemaglutininem (PHA) stimulovaných opičích T-lymfocytů, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 32: Graf ukazující analýzu vazebné rovnováhy pro L104EA29YIg, E104EIg a přirozený CTLA4Ig k CD86Ig.
Obr. 33A a 13: Redukce koncentrace solubilního ICAM-1 a solubilního E-selektinu jako průměrné změny od základní hodnoty v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Podrobný popis vynálezu
Dále jsou uvedeny podrobné údaje vztahující se k předmětnému vynálezu, stejně jako údaje srovnávací, jakož i údaje, které mají ukázat celou šíři nalezeného řešení.
Nalezené řešení poskytuj prostředky a způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému, při kterých jsou jedincům podány soiubilní CTLA4 molekuly, které se váží na B7 molekuly na B7-pozitivních buňkách, čímž inhibují endogenní B7 molekuly z vazby na CTLA4 a/nebo CD28 na T-lymfocytech. Mezi soiubilní CTLA4 molekuly použité ve způsobech podle nalezeného řešení patří CTLA4Ig a soiubilní CTLA4 mutantní molekula L404EA29YIg.
-7CZ 303959 B6
Nalezené řešení také poskytuje způsoby pro inhibování funkce T-lymfocytů, ale ne pro depleci T-lymfocytů u člověka, pomocí kontaktování B7-pozitivních buněk u člověka se solubilním CTLA4. Příklady solubilních CTLA4 jsou CTLA41g a solubilní CTLA4 mutantní molekula, jako je L104EA29YIg.
Nalezené řešení také poskytuje způsoby pro léčbu (například redukci příznaků) revmatických onemocnění, jako je revmatoidní artritis, podáním solubilní CTLA4 molekuly, jako je CTLA4Ig a/nebo solubilní CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg, jedinci s revmatoidní artritidou. CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg, která například začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí lysinem v pozici +357, jak je uvedeno na obr. 19, je výhodná pro použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu.
Nalezené řešení také poskytuje způsoby pro redukování patofyziologických změn asociovaných s revmatickým onemocněním, jako je strukturální postižení, podáním solubilní CTLA4 molekuly jedinci s revmatoidní artritidou.
Nalezené řešení také poskytuje farmaceutické kompozice pro léčbu onemocnění imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění, které obsahují farmaceuticky přijatelný nosič a biologicky účinné činidlo, jako jsou solubilní CTLA4 molekuly.
Kity obsahující terapeutické farmaceutické prostředky pro onemocnění imunitního systému jsou také zahrnuty v nalezeném řešení. V jednom provedení je kit obsahující jeden nebo více farmaceutických prostředků podle nalezeného řešení použit pro léčbu onemocnění imunitního systému, např. revmatoidní artritidy. Například obsahuje farmaceutická kompozice podle nalezeného řešení účinné množství solubilní CTLA4 mutantní molekuly, která se váže na B7 molekuly na B7-pozitivních buňkách, čímž blokuje B7 molekuly od vazby CTLA4 a/nebo CD28 na Tlymfocytech. Dále může kit obsahovat jedno nebo více imunosupresivních činidel použitých současně s farmaceutickou kompozicí podle nalezeného řešení. Mezi potenciální imunosupresivní činidla patří, například, kortikosteroidy, nesteroidní antirevmatika (např. Cox-2 inhibitory), cyklosporin, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisté TNF-alfa, infliximab, jakékoliv biologické činidlo působící na zánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazoprin, soli zlata, etanercept a anakinra.
Nalezené řešení také poskytuje způsoby pro snížení sedimentace erytrocytů, která je asociována s revmatoidní artritidou.
Dále nalezené řešení poskytuje způsoby pro snížení koncentrace některých složek krevního séra, které jsou asociovány s revmatoidní artritidou, včetně C-reaktivního proteinu, solubilního ICAM—1, solubilní E—selektinu a/nebo solubilního 1L—2r.
Definice
Všechny vědecké a technické termíny uvedené v tomto dokumentu mají významy běžně používané v oboru, pokud není uvedeno jinak. Následující výrazy nebo fráze mají následující významy.
Termín ligand označuje molekulu, která specificky rozpoznává a váže se na jinou molekulu, například ligandem pro CTLA4 je B7 molekula.
„Přirozený CTLA4“ nebo „nemutovaný CTLA4“ má aminokyselinovou sekvenci přirozeného, kompletního CTLA4, jak je uveden na obr. 23 (též jak je popsán v US patentech 5 434 131, 5 844 095, 5 851 795), nebo jakékoliv jeho části, která rozpoznává a váže se na B7 nebo interferuje s B7 tak, že blokuje vazbu na CD28 a/nebo CTLA4 (např., endogenní CD28 a/nebo CTLA4). V konkrétních provedeních začíná extracelulámí doména přirozeného CTLA4 methioninem v pozici +1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124, nebo začíná extracelulámí . 2 .
doména přirozeného CTLA4 alaninem v pozici -1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124. Přirozený CTLA4 je buněčný povrchový protein mající N-terminální extracelulámí doménu, transmembránovou doménu a C-terminální cytoplasmatickou doménu. Extracelulámí doména se váže na cílové molekuly, jako je B7 molekula. V buňkách je přirozený CTLA4 protein translatován jako nezralý polypeptid, který obsahuje signální peptid na N-terminálním konci. Nezralý polypeptid je post-translačně zpracováván, což zahrnuje štěpení signálního peptidu za zisku CTLA4 štěpeného produktu majícího nový N-terminální konec, který se liší od Nterminálního konce nezralé formy. Odborníkům v oboru bude jasné, že může proběhnout další post-translační zpracování, které odstraní jednu nebo více aminokyselin žňového N-terminálního konce CTLA4 vzniklého štěpením. Alternativně nemusí být signální peptid odstraněn zcela, za zisku molekuly, která začíná před obvyklým počátečním methioninem. Tak může zralý CTLA4 protein začínat methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1. Zralá forma CTLA4 molekuly obsahuje extracelulámí doménu nebo jakoukoliv její část, která se váže na B7.
Termín „CTLA4 mutantní molekula“ označuje přirozený CTLA4 jak je uveden na obr. 23 nebo jakoukoliv jeho část nebo derivát, který obsahuje mutaci nebo vícečetné mutace (výhodně v extracelulámí doméně přirozeného CTLA4). CTLA4 mutantní molekula má sekvenci, která je podobná, ale ne identická sekvenci přirozené CTLA4 molekuly, ale která se stále ještě váže na B7. Mutace mohou postihovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků, kde tyto zbytky jsou substituované aminokyselinovou mající konzervativní (např., leucin za isoleucin) nebo nekonzervativní (např. glycin za tryptofan) strukturu nebo chemické vlastnosti, a dále se může jednat o aminokyselinové delece, adice, posuny čtecího rámce nebo zkrácení. CTLA4 mutantní molekuly mohou zahrnovat non-CTLA4 molekuly navázané na mutantní CTLA4 molekuly. Mutantní molekuly mohou být solubilní (tj., cirkulující) nebo vázané na buněčný povrch. Mezi další CTLA4 mutantní molekuly patří molekuly popsané v U.S. Patentové přihlášce 09/865321, 60/214065 a 60/287576; v U.S. Patentech 6090914, 5844095 a 5773253; a v Peach, R. J. et al., vJ Exp Med 180:2049-2058 (1994)). CTLA4 mutantní molekuly mohou být připraveny synteticky nebo rekombinantně.
CTLA4Ig je solubilní fúzní protein obsahující extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 navázanou na Ig koncovku, nebo jeho část, která se váže na B7. Konkrétní provedení obsahuje extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 (jak je uvedena na obr. 23) začínající methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124; nebo začínající alaninem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124; spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125; a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357 (DNA kódující CTLA4Ig byla uložena 31.5.1991 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, podle podmínek Budapešťské smlouvy, pod ATCC přírůstkovým č. ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, buněčná linie ovariálních buněk čínského křečka (CHO) exprimující CTLA4Ig, byla uložena 31.5.1991 pod ATCC identifikačním č. CRL-10762. Solubilní CTLA4Ig molekuly použité ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat signální (vedoucí) peptidovou sekvenci. Obvykle ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují sekvenci signálního peptidu.
„L104EA29YIg“ je fúzní protein, který je solubilní CTLA4 mutantní molekulou obsahující extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 s aminokyselinovými změnami A29Y (tyrosin substitující alanin v pozici 29) a L104E (kyselina glutamová substituující leucin v pozici +104), nebojejí část, která se váže na B7 molekulu, navázanou na Ig koncovku (obsaženou na obr. 19; DNA kódující L104EA29YIg byla uložena 20.6.2000 s ATCC číslem PTA-2104; jak je uvedeno v souvisejících U.S. Patentových přihláškách pořadové č. 09/579,927, 60/287,576 a 60/214,065, které jsou zde uvedeny jako odkazy). Solubilní L104EA29YIg molekuly použité ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat sekvenci signálního (vedoucího) peptidu. Obvykle ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují sekvenci signálního peptidu.
-9CZ 303959 B6
Termín „solubilní“, jak je zde použit, označuje jakoukoliv molekulu, nebo její fragmenty a deriváty, nenavázanou nebo nepřipojenou buňku, tj., cirkulující. Například, CTLA4, B7 nebo CD28 mohou být učiněny solubilními navázáním imunoglobulinové (Ig) skupiny na extracelulární doménu CTLA4, B7 nebo CD28, v příslušném pořadí. Alternativně, molekula jako je CTLA4 může být učiněna solubilní odstraněním její transmembránové domény. Obvykle ve způsobech podle předkládaného vynálezu solubilní molekuly neobsahují sekvenci signálního peptidu.
Termín „solubilní CTLA4 molekuly“ označuje CTLA4 molekuly, nebo jakoukoliv funkční část CTLA4 molekuly, nevázanou na povrch buněk (tj. cirkulující), která se váže na B7 včetně, například: CTLA41g fúzních proteinů (např. ATCC 68629), kde je extracelulární doména CTLA4 fúzovaná na imunoglobulinovou (Ig) skupinu, čímž se stane fúzní molekula solubilní, nebo fragmenty a deriváty těchto proteinů s extracelulární doménou CTLA4 fúzovanou nebo spojenou s částí biologicky aktivního nebo chemicky aktivního proteinu, jako je produkt papilomavirového E7 genu (CTLA4-E7), antigen p97 asociovaný s melanomem (CTLA4-p97) nebo HIV env protein (CTLA4-env gp 120), nebo jejich fragmenty a deriváty; hybridní (chimérické) fúzní proteiny, jako je CD28/CTLA4Ig, nebo jejich fragmenty a deriváty; CTLA4 molekuly s odstraněnou transmembránovou doménou pro dosažení solubility proteinu (Oaks, M. K„ et al., 2000, Cellular Imunology 201:144-153), nebo jejich fragmenty a deriváty. „Solubilní CTLA4 molekuly“ také zahrnují jejich fragmenty, části a deriváty a solubilní CTLA4 mutantní molekuly mající CTLA4 vazebnou aktivitu. Solubilní CTLA4 molekuly použité ve způsobech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat sekvenci signálního (vedoucího) peptidu. Obvykle ve způsobech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují sekvence signálního peptidu.
Termín „extracelulární doména CTLA4“, jak je zde použit, označuje část CTLA4, která rozpoznává a váže se na CTLA4 ligandy, jako jsou B7 molekuly. Například, extracelulární doména CTLA4 obsahuje methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (Obr. 23). Alternativně, extracelulární doména CTLA4 obsahuje alanin v pozici -1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (Obr. 23). Extracelulární doména zahrnuje fragmenty nebo deriváty CTLA4 se váží na B7 molekulu. Extracelulární doména CTLA4, jak je uvedena na Obr. 23, může také obsahovat mutace, které mění vazebnou aviditu CTLA4 molekuly pro B7 molekulu.
Termín „mutace“, jak je zde použit, označuje změnu v nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci přirozené molekuly, například, změnu v DNA a/nebo aminokyselinové sekvenci přirozené CTLA4 extracelulární domény. Mutace v DNA může měnit kodon, což vede ke změně aminokyselinové sekvence. Změny v DNA zahrnují substituce, delece, inserce, alternativní sestřih a zkrácení. Změny v aminokyselinách mohou zahrnovat substituce, delece, inserce, adice, zkrácení nebo změny v modifikaci či štěpení proteinu. Alternativně, mutace v nukleotidové sekvenci mohou způsobovat silentní mutace v aminokyselinové sekvenci, jak je v oboru dobře známo. Některé nukleotidové kodony kódují stejné aminokyseliny. Příklady jsou nukleotidové kodony CGU, CGG, CGC a CGA kódující aminokyselinu arginin (R); nebo kodony GAU a GAC kódující aminokyselinu kyselinu asparagovou (D). Tak může být protein kódován jedno nebo více molekulami nukleové kyseliny, které se liší ve specifické nukleotidové sekvenci, ale které kódují proteinové molekuly mající identické sekvence. Kódující sekvence pro aminokyseliny jsou následující:
Symbol Jednopísmenný
Aminokyselina symbol Kodony
Alanin Ala A GCU, GCC. GCA, GCG
Cystein Cys C UGU, UGC
kyselina asparagová Asp D GAU, GAC
kyselina glutamová Glu E GAA, GAG
Fenylalanin Phe F UUU, UGC
Glycin- Gly G GGU, GGC, GGA, GGG
Histidin His H CAU. CAC
Isoleucin· Ile I ALTU, AUC, AUA
Lysin- Lys K AAA, AAG
Leucin Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
Methionin Met M AUG
Asparagin Asn N AAU, AAC
Prolin Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
Giutamin Gin Q CAA, CAG
Arginin Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Serin Ser S UCU, UCC, UCA UCG, AGU, AGC
Tlireunin Thr T ACU. ACC. ACA, ACG
Valin Val v GUU, GUC. GUA, GUG
Tryptofan Trp w UGG
Tyrosin Tyr Y UAU, UAC
Mutantní molekula může obsahovat jednu nebo více mutací.
Termín „non-CTLA4 proteinová sekvence“ nebo non-CTLA4 molekula“, jak je zde použit, 5 označuje jakoukoliv proteinovou molekulu, která se neváže na B7 a neinterferuje s vazbou
CTLA4 na cílovou molekulu. Příkladem jsou imunoglobulinový (Ig) konstantní region nebo jeho část. Výhodně je Ig konstantní region z lidského nebo opičího Ig, např., lidský C(gamma)l, včetně pantového regionu, CH2 a CH3 regionů. Konstantní region Ig může být mutován pro redukci jeho efektorových funkcí (U.S. Patenty 5637481, 5544095 a 5434131).
Termín „fragment“ nebo „část označuje jakoukoliv část nebo segment CTLA4 molekuly, výhodně extracelulámí doménu CTLA4 nebo její část nebo segment, kteiý rozpoznává a váže se na cílovou molekulu, např. B7 molekulu.
Termín „B7“, jak je zde použit, označuje B7 rodinu molekul včetně, ale nejen, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) a B7-3, které rozpoznávají a váží se na CTLA4 a/nebo CD28.
Termín „B7-pozitivní buňky“, jak je zde použit, označuje jakékoliv buňky s jedním nebo více typy B7 molekul exprimovanými na povrchu buněk.
Termín „derivát“, jak je zde použit, označuje molekulu, která vykazuje homologní sekvenci a aktivitu původní molekuly. Například, derivát CTLA4 je solubilní CTLA4 molekula mající aminokyselinovou sekvenci alespoň ze 70% podobnou extracelulámí doméně přirozeného
- 11 CZ 303959 B6
CTLA4, a která rozpoznává a váže se na B7, např. CTLA4Ig nebo solubilní CTLA4 mutantní molekula LI04EA29YIg.
Termíny „blokovat“ nebo „inhibovat“ receptor, signál nebo molekulu znamenají interferovat s aktivací receptoru, signálu nebo molekuly, jak je detekováno za použití testů známých v oboru. Například, blokáda buňkami zprostředkované imunitní reakce může být detekována stanovením redukce příznaků asociovaných s revmatickým onemocněním. Blokáda nebo inhibice může být částečná nebo úplná.
Termín „blokování B7 interakce“ znamená interferencí s vazbou B7 na jeho ligandy, jako je CD28 a/nebo CTLA4, čímž dochází k blokádě interakcí mezi T-lymfocyty a B7-pozitivními buňkami. Příklady činidel, která blokují B7 interakce, jsou, například, molekuly jako je protilátka (nebo její část nebo derivát), která rozpoznává a váže se na jakoukoliv CTLA4, CD25 nebo B7 molekulu (např. B7-1, B7-2); solubilní forma (nebo její část nebo derivát) molekuly, jako je solubilní CTLA4; peptidový fragment nebo jiná malá molekula navržená tak, aby interferovala s buněčným signálem prostřednictvím CTLA4/CD28/B7-zprostředkovaných interakcí. Ve výhodném provedení je blokovací činidlo solubilní CTLA4 molekula, jako je CTLA4Ig (ATCC 68629) nebo L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), solubilní CD28 molekula, jako je CD281g (ATCC 68628), solubilní B7 molekula, jako je B7Ig (ATCC 68627), anti-B7 monoklonální protilátka (např. ATCC HB253, ATCC CRL-2223, ATCC GRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 a monoklonální protilátky popsané v Anderson et al. v U.S. Patentu 6113898 nebo Yokochi et al., 1982. J. Immun., 128(2)823—827), anti-CTLA4 monoklonální protilátka (např. ATCC HB-304, monoklonální protilátky, jak jsou popsané v odkazech 82-83) a/nebo anti-CD28 monoklonální protilátka (např. ATGG HB 11944 a mAb 9.3, jakje popsána v Hansen (Hansen et al., 1980. Imunogenetics 10: 247-260) nebo Martin (Martin et al„ 1984. J. Clin. Immun., 40:1822)).
Termín „onemocnění imunitního systému“ označuje jakékoliv onemocnění zprostředkované interakcemi T-lymfocytů s B7-pozitivními buňkami, včetně, například autoimunitních onemocnění, onemocnění souvisejících s transplantáty a imunoproliferativních onemocnění. Příklady onemocnění imunitního systému jsou reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) (např. při transplantaci kostní dřeně nebo při indukci tolerance), imunologické poruchy asociované a odmítnutím transplantátu, chronické rejekce, tkáňové nebo buněčné allo- nebo xenotransplantázy, včetně orgánových, kožních, ostrůvků pankreatu, svalů, hepatocytů a neuronů. Příklady imunoproliferativních onemocnění jsou, například, psoriasa, T-lymfocytámí lymfom, T-lymfocytámí akutní lymfoblastická leukemie, testikulámí angiocentrický T-lymfocytámí lymfom, benigní lymfocytámí angiitis, lupus (např. lupus erythematosus, lupusová nefritis), Hashimotova thyroiditis, primární myxedem, Gravesova nemoc, pemiciosní anemie, autoimunní atrofická gastritis, Addisonova nemoc, diabetes (např. insulin dependentní diabetes mellitus, diabetes mellitus typu I, diabetes mellitus typu II), Goodpasteurův syndrom, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnova nemoc, sympathetická ophthalmia, autoimunní uveitis, roztroušená sklerosa, autoimunní hemolytická anemie, idiopatická trombocytopenie, primární biliámí cirhosa, chronická hepatitis, ulcerosní colitis, Sjogrenův syndrome, revmatická onemocnění (např. revmatoidní artritis), polymyositis, sclerodermie a smíšené onemocnění pojivové tkáně.
Termín „revmatická onemocnění“ označuje jakákoliv onemocnění, která postihují klouby, kosti, měkké tkáně nebo míchu (Mathies. H. 1983 Rheuma) a patří mezi ně zánětlivý revmatizmus, degenerativní revmatizmus, extraartikulární revmatizmus a kolagenosy. Dále mezi revmatická onemocnění patří, například, chronická polyartritis, psoriasis artropathica, ankylosující spondylitis, revmatoidní artritis, panarteriitis nodosa, systémový lupus erythematodes, progresivní systémová sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondorkalcinosis, dermatomyositis, svalový revmatizmus, myositis a myogelosis. O některých revmatických onemocněních je známo, že se jedná o autoimunitní onemocnění způsobené chybnou imunitní reakcí jedince.
Termín „genová terapie“, jak je zde použit, označuje způsob léčby onemocnění genetickou manipulací tak, že se sekvence nukleové kyseliny přenese do buňky a buňka potom exprimuje genetický produkt kódovaný nukleovou kyselinou. Například, jak je dobře známo odborníkům v oboru, přenos nukleové kyseliny může být proveden insercí expresního vektoru obsahujícího danou nukleovou kyselinu do buněk ex vivo nebo in vitro různými způsoby, včetně, například, srážení fosforečnanem vápenatým, diethylaminoethyldextranem, polyethylenglykolem (PEG), elektroporací, přímou injekcí, lipofekcí nebo virovou infekcí (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman a Go, New York, N.Y., 1993) a Wu, Methods in Enzymology (Academie Press, New York, 1993), které jsou zde uvedeny jako odkazy). Alternativně, požadované sekvence nukleové kyseliny mohou být přeneseny do buňky in vivo v různých vektorech a různými způsoby, včetně, například, přímého podání nukleové kyseliny jedinci (Williams et al., 1991 PNAS 88:2726-2730), nebo insercí nukleové kyseliny do virového vektoru a infekcí jedince virem (Battleman et al., 1993 J. Neurosci 13:94-951; Carroll et al., 1993 J. Cell Biochem. 17E:241; Lebkowski et al., U.S. Patent 5354678; Davison a et al., Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)). Další způsoby používané pro in vivo transfer zahrnují enkapsulaci nukleové kyseliny do liposomů, přímý přenos liposomů nebo liposomů kombinovaných s hemaglutinačním Sendai virem jedinci (U.S. Patent 5824655, který je zde uveden jako odkaz). Transfektované nebo infikované buňky exprimují proteinové produkty kódované nukleovou kyselinou za zmírnění onemocnění nebo příznaků onemocnění.
Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujícím popisu.
Prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje prostředky a způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění, při kterých je jedinci podáno účinné množství ligandu, který se váže na B7, například, solubilní CTLA4 molekuly (jako je CTLA4Lg a/nebo L104EA29YIg) a mAb, které rozpoznávají a váží se na B7. Účinné množství je definováno jako množství solubilních CTLA4 molekul, které, po navázání na B7 molekuly na B7-pozitivních buňkách, inhibuje B7 molekuly z vazby endogenních ligandů, jako je CTLA4 a CD25.
Ve výhodném provedení je onemocněním imunitního systému revmatické onemocnění. Revmatická onemocnění jsou onemocnění, která jsou charakterizována (i) zánětem nebo degenerací muskulo-skeletálního systému nebo pojivové tkáně, zejména kloubů, ale také svalů, šlach, chrupavek, synoviální a fibrosní tkáně, (ii) otoky kloubů, citlivost kloubů, zánětem, ranní ztuhlostí a/nebo bolestí, nebo narušením pohyblivosti nebo funkce těchto struktur a, v některých případech, jsou také charakterizována (iii) serologickými důkazy revmatoidního faktoru a jiných doprovodných zánětlivých markérů.
Mezi revmatická onemocnění patří, například, revmatoidní artritis. Příznaky revmatoidní artritis zahrnují otoky kloubů, citlivost kloubů, zánět, ranní ztuhlost a bolest vedoucí k fyzické neschopnosti. Jedinci s pokročilými stadii artritis trpí strukturálním poškozením a invalidizující bolestí. Autoimunitními mechanismy mohou být postiženy i další orgány.
Prostředky
Předkládaný vynález poskytuje prostředky pro léčbu autoimunitních onemocnění, jako jsou revmatická onemocnění, které obsahují solubilní CTLA4 molekuly. Dále předkládaný vynález poskytuje prostředky obsahující biologické činidlo, které inhibuje funkci T-lymfocytů, ale nezpůsobuje depleci T-lymfocytů, u člověka tak, že kontaktuje B7-pozitivní buňky člověka se solubilní CTLA4 molekulou. Příklady solubilní CTLA4 jsou CTLA4Ig a solubilní CTLA4 mutantní molekula, např. L104EA29YJg.
- 13 CZ 303959 B6
CTLA4 molekuly, s mutantními nebo přirozenými sekvencemi, mohou být učiněny solubilními pomocí deletování CTLA4 transmembránového segmentu (Oaks, Μ. K., et al., 2000 Cellular Imunology 201:144-153).
Alternativně mohou být solubilní CTLA4 molekuly, s mutantními nebo přirozenými sekvencemi, fúzní proteiny, kde CTLA4 molekuly jsou fúzované na non-CTLA4 skupinu, jako je imunoglobulinová (Ig) molekula, která činí CTLA4 molekulu solubilní. Například, CTLA4 fúzní protein může obsahovat extracelulární doménu CTLA4 fúzovanou na konstantní doménu imunoglobulinu, což vede k zisku CTLA4Ig molekuly (Obr. 24) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1:793-80).
Pro klinické použití je výhodné, aby imunoglobulinový region nevyvolával škodlivou imunitní reakci u jedince. Výhodnou skupinou je konstantní region imunoglobulinu, včetně lidských nebo opičích imunoglobulinových konstantních regionů. Jedním příkladem vhodného imunoglobulinového regionu je lidský Cgammal, včetně pantového, CH2 a CH3 regionu, který může provádět efektorové funkce, jako je vazba na Fc receptory, zprostředkování cytotoxicity závislé na komplementu (CDC), nebo zprostředkování buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC). Imunoglobulinová skupina může mít jednu nebo více mutací, (např. v CH2 doméně, pro redukci efektorových funkcí, jako je CDC nebo ADCC), kde mutace moduluje vazebnou schopnost imunoglobulinu na jeho ligand tím, že zvyšuje nebo snižuje vazebnou schopnost imunoglobulinu na Fc receptory. Například, mutace v imunoglobulinu mohou zahrnovat změny ve všech nebo některých cysteinových zbytcích v pantové doméně, například, cysteinech v pozicích +130, +136 a +139, které jsou substituované serinem (Obr. 24). Imunoglobulinová molekula může také obsahovat prolin v pozici 148 substituovaný serinem, jak je ukázáno na obr. 24. Dále, mutace v imunoglobulinové skupině mohou být leucin v pozici +144 substituovaný fenylalaninem, leucin v pozici +145 substituovaný kyselinou glutamovou nebo glycin v pozici 147 substituovaný alaninem.
Dalšími non-CTLA4 skupinami pro použití v solubilních CTLA4 molekulách nebo solubilních CTLA4 mutantních molekulách jsou, například, p97 molekula, env gpl20 molekula, E7 molekula a ova molekula (Dash, B. et al. 1994, J Gen. Viral. 75 (Pt 6): 1389-97; Ikeda, I., et al. 1994 Gene 138(1-2): 193-6; Falk, K.., et al. 1993 Cell. J. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka. K. et al. 1994 Virology 204(2):789-93). Použitelné jsou i další molekuly (Gerard, C. et al., 1994 Neuroscience 62(3):721; Bym, R. et al. 1989 63(10):4370; Smith, D. et al, 1987 Science 238:1704; Lásky, L. 1996 Science 233:209).
Solubilní CTLA4 molekula podle předkládaného vynálezu může obsahovat signální peptidovou sekvenci navázanou na N-terminální konec extracelulární domény CTLA4 části molekuly. Signální peptid může být jakákoliv sekvence, která umožňuje sekreci molekuly, včetně signálního peptidu z oncostatinu M (Malík, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), nebo CD5 (Jones, N. H. et al., (1986) Nátuře 323:346-349), nebo signálního peptidu zjakéhokoliv extracelulámího proteinu.
Solubilní CTLA4 molekula podle předkládaného vynálezu může obsahovat signální peptid oncostatinu M navázaný na N-terminální konec extracelulární domény CTLA4, a lidskou imunoglobulinovou molekulu (např. pantový region, CH2 a CH3) navázaný na C-terminální konec extracelulární domény (přirozené nebo mutované) CTLA4. Tato molekula obsahuje signální peptid oncostatinu M mající aminokyselinovou sekvenci mající methionin v pozici -26 až alanin v pozici -1, CTLA4 část tvořenou aminokyselinovou sekvencí od methioninu v pozici +1 do kyseliny asparagové v pozici +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125, a imunoglobulinu část tvořenou aminokyselinovou sekvencí od kyseliny glutamové v pozici 126 do lysinu v pozici +357.
- 14 CZ 303959 B6
Konkrétně, solubilní CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu, obsahující mutované CTLA4 sekvence popsané dále, jsou fúzní molekuly obsahující lidské IgCgammal skupiny fúzované na mutované CTLA4 fragmenty.
V jednom provedení obsahují solubilní CTLA4 mutantní molekuly IgCgammal fúzovanou na CTLA4 fragment obsahující jedinou bodovou mutaci v extracelulámí doméně. Extracelulámí doména CTLA4 obsahuje methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (např. obr. 23). Extracelulámí část CTLA4 může být tvořena alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124 (např. obr. 23). Příklady bodových mutací jsou mutace, kdy je leucin ío v pozici +104 změněn na jakoukoli jinou aminokyselinu:
Mutanti s jednou mutací Změna kodonu
L104EIg kyselina glutamová GAG
LiCMSIg Senní AGT
L104TIg Threonin ACG j
L104Aig Alanin GCG , _
L104WIg Tryptophan TGG
L104QIg Glutamin CAG
L104Klg Lysin AAG
L104RIg Arginin CGG
LiOAGlg Glycin< GGG
Dále vynález poskytuje mutantní molekuly mající extracelulámí doménu CTLA4 se dvěmi mutacemi, fúzovanou na IgCgammal skupinu. Příklady jsou následující molekuly, ve kterých je leucin v pozici -104 změněn na jinou aminokyselinu (např. kyselinu glutamovou) a glycin v pozici +105, serin v pozici +25, threonin v pozici 30 nebo alanin v pozici +29 změněn na jakoukoli jinou aminokyselinu:
Mutanti se dvěma mutacemi Změna kodonu
L104EG105FIg ΤΤΓ fenylalanin
LlO4EGlO5Wlg Tryptophan TGG
L104EGl05LIg Leucin. CTT
L104ES25RIg Arginin' CGG
L104ET30Gíg Glycin GGG J
iL104ET30NIg Asparagini AAT
LI04EA29YIg Tyrosin. TAT
L104EA29LIg Leucin. TTG
L104EA29TIg Threonin· ACT
L104EA29WIg Tryptophan TGG
Dále vynález poskytuje mutantní molekuly mající extracelulámí doménu CTLA4 obsahující tři mutace, fúzovanou na IgCgammal skupinu. Příklady jsou následující molekuly, kde je leucin v pozici +104 změněn na jinou aminokyselinu (např. kyselinu glutamovou), alanin v pozici +29
- 15 CZ 303959 B6 je změněn na jinou aminokyselinu (např. tyrosin) a serin v pozici 25 je změněn na jinou aminokyselinu:
i Mutanti se třemi mutacemi i Změna kodonu
pLlO4EA29YS25Klg Lysin AAA
f L104EA29YS25Kíg 1 Lysin- AAG
I L104EA29ÝS25Níg Asparagin. AAC
j U04EA29YS25RIg Arginin CGG
Solubilní CTLA4 mutantní molekuly mohou obsahovat spojovací aminokyselinový zbytek, který je umístěn mezi CTLA4 částí a Ig částí molekuly. Spojovací aminokyselinou může být jakákoliv aminokyselina, včetně glutaminu. Spojovací aminokyselina může být vložena jakýmikoliv molekulárními nebo chemickými způsoby známými v oboru.
Předkládaný vynález poskytuje CTLA4 mutantní molekuly obsahující signální peptidovou sekvenci navázanou na N-terminální konec extracelulámí domény CTLA4 části mutantní molekuly. Signálním peptidem může být jakékoliv sekvence, která umožňuje sekreci mutantní molekuly, včetně signálního peptidů z oncostatinu M (Malik, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), nebo CD5 (Jones, N. H. et al., 1986 Nátuře 323:346-349), nebo signálního peptidů z jakéhokoliv extracelulámího proteinu.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující bodové mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104EIg (jak je uveden na Obr. 18) nebo L104SIg, kde L104EIg a L104SLg mají mutace jejich CTLA4 sekvencí, při kterých je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou nebo serinem, v příslušném pořadí. Mezi mutantní molekuly s bodovou mutací dále patří CTLA4 části obsahující methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici + 124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminem v pozici +125, a imunoglobulinovou část obsahující kyselinu glutamovou v pozici 126 až lysin v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutována tak, že cysteiny v pozicích +130, +136, a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, solubilní CTLA4 mutantní molekula s bodovou mutací může obsahovat CTLA4 část obsahující alanin v pozici -1 až kyselinu asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující dvoubodové mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg nebo L104EA29WIg, ve kterých je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou a alanin v pozici +29 je změněn na tyrosin, leucin, threonin a tryptofan, v příslušném pořadí. Sekvence pro L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg a L104EA29WIg, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357, plus signální (vedoucí) peptidovou sekvenci, jsou ukázány na Obr. 19-22, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly s dvojitými mutacemi dále zahrnují CTLA4 části obsahující methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125, a imunoglobulinovou část obsahující kyselinu glutamovou v pozici +126 až lysin v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou obsahovat CTLA4 část obsahující alanin v pozici -1 až kyselinu asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující dvě bodové mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104EG105FIg, L104EG105WIg a L104EG105LIg, kde leucin v pozici +104 je substituovaný kyselinou glutamovou a glycin v pozici +105 je sub- 16 CZ 303959 B6 stituovaný fenylalaninem, tryptofanem a leucinem, v příslušném pořadí. Mezi mutantní molekuly se dvěma mutacemi dále patří CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125, a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a+139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou mít CTLA4 část tvořenou alanínem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje L104ES25RIg, což je mutantní molekula se dvěma bodovými mutacemi obsahující CTLA4 část tvořenou methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, a spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125, a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Část mající extracelulámí doménu CTLA4 je mutována tak, že serin v pozici +25 je substituovaný argininem a leucin v pozici +104 je substituovaný kyselinou glutamovou. Alternativně, L104ES25RIg může mít CTLA4 část tvořenou alanínem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující dvě bodové mutace v extracelulámí doméně CTLA4, jako je L104ET3OGIg a L104ET3ONIg, kde je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou a threonin v pozici +30 je substituovaný glycinem a asparaginem, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly se dvěma bodovými mutacemi dále obsahují CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125, a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou mít CTLA4 část tvořenou alanínem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující tři mutace v extracelulámí doméně CTLA4, jako je L104EA29YS25Klg, L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg, ve kterých je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou, alanin v pozici +29 je změněn na tyrosin a serin v pozici +25 je změněn na lysin, asparagin a arginin, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly se třemi mutacemi dále obsahují CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125, a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně mohou tyto mutantní molekuly mít CTLA4 část tvořenou alanínem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Dalšími provedeními solubilní CTLA4 mutantní molekuly jsou chimérické CTLA4/CD28 homolog mutantní molekuly, které se váží na B7 (Peach, R. J., et al., 1994 J. Exp Med 180: 20492058). Příklady těchto chimérických CTLA4/CD28 mutantních molekul jsou HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 a HS14 (U.S. patent 57723253).
Výhodnými provedeními předkládaného vynálezu jsou solubilní CTLA4 molekuly, jako je CTLA4Ig (jak je ukázán na Obr. 24, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357) a solubilní CTLA4 mutant L104EA29YIg (jak je ukázán na Obr. 19, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357). Vynález dále poskytuje molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence odpovídající solubilní CTLA4 molekule podle předkládaného vynálezu. V jednom provedení je molekulou nukleové kyseliny DNA (např. cDNA) nebo její hybrid. DNA kódující CTLA4Ig (Obr. 24) byla uložena 31.5.1991 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, pod ATCC přírůstkovým č. ATCC 68629. DNA
- 17CZ 303959 B6 kódující L104EA29YIg (sekvence uvedená na Obr. 19) byla uložena 19.6.2000 v ATCC pod ATCC přírůstkovým č. PTA-2104. Alternativně je molekulou nukleové kyseliny RNA nebo její hybrid.
Dále vynález poskytuje vektor, který obsahuje nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu. Příklady expresních vektorů jsou vektory pro savčí hostitelské buňky (např., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc Vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovirové vektory (např., pFB vektor (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) nebo jejich modifikované formy, adenovirové vektory; adeno-asociované virové vektory, baculovirové vektory, kvasinkové vektory (např., pESC vektory (Stratagene)).
Vynález také poskytuje systémy vektor-hostitel. Systém vektor-hostitel obsahuje vektor podle předkládaného vynálezu ve vhodné hostitelské buňce. Příklady vhodných hostitelských buněk jsou, například, prokaryotické a eukaryotické buňky. V provádění předkládaného vynálezu jsou eukaryotické buňky také vhodnými buňkami. Příklady eukaryotických buněk jsou všechny živočišné buňky, primární nebo imortalizované, kvasinky (např., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, a Pichia pastoris) a rostlinné buňky. Myelomové, COS a CHO buňky jsou příklady živočišných buněk, které mohou být použity jako hostitelské buňky. Mezi konkrétní CHO buňky patří, například, DG44 (Chasm. et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-Kl Tet-On buněčná linie (Clontech), CHO označené jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genová IT), CHO klon B (GEIMG, Genová, 1T), CHO-K1/SF označené ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) a RP-CHOKI označené ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Příklady rostlinných buněkjsou buňky tabáku (celých rostlin, kultury nebo kalu), kukuřice sóji a rýže. Také přijatelné jsou buňky semen kukuřice, sóji a rýže.
CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být izolované jako přirozené polypeptidy, nebo zjakéhokoliv jiného zdroje, ať přírodního, syntetického, semi-syntetického nebo rekombinantního. Tak mohou být CTLA4 mutantní polypeptidové molekuly izolovány jako přirozené proteiny zjakéhokoliv druhu, zejména od savců, konkrétně od skotu, ovcí, prasat, myší, koní a nejlépe od člověka. Alternativně mohou být CTLA4 mutantní polypeptidové molekuly izolovány jako rekombinantní polypeptidy, které jsou exprimovány v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce, nebo které jsou izolovány jako chemicky syntetizovaný polypeptid.
Odborník v oboru snadno použije standardní způsoby izolace pro získání izolovaných CTLA4 mutantní molekul. Charakter a stupeň izolování bude záviset na zdroji a zamýšleném použití izolované molekuly.
CTLA4 mutantní molekuly a jejich fragmenty nebo deriváty mohou být připraveny rekombinantními způsoby. Tak mohou být izolované nukleotidové sekvence kódující přirozené CTLA4 molekuly upraveny tak, aby obsahovaly mutace, které vedou k zisku nukleotidových sekvencí, které kódují CTLA4 mutantní polypeptidové molekuly. Například mohou být nukleotidové sekvence kódující CTLA4 mutantní molekuly připraveny způsoby místně cílené mutagenese, za použití primerů a PCR amplifikace. Primery mohou obsahovat specifické sekvence navržené tak, aby vkládaly do sekvence požadované mutace. Alternativně mohou být primery navrženy tak, aby obsahovaly randomizované nebo semi-randomizované sekvence pro vkládání náhodných mutací. Standardní rekombinantní způsoby (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. vydání, Sambrook, Fritch, a Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press) a PCR technologie (U. S. Patent 4603102) mohou být použity pro přípravu a izolování CTLA4 mutantních polynukleotidů kódujících CTLA4 mutantní polypeptidy.
- 18 CZ 303959 B6
Vynález dále zahrnuje farmaceutické prostředky pro použití v léčbě onemocnění imunitního systému obsahující farmaceuticky účinné množství solubilní CTLA4 molekuly. V některých provedeních jsou onemocnění imunitního systému zprostředkované CD28/CTLA4/B7 interakcemi. Solubilní CTLA4 molekuly jsou výhodně solubilní CTLA4 molekuly s přirozenou sekvencí a/nebo solubilní CTLA4 molekuly mající jednu nebo více mutací v extracelulámí doméně CTLA4. Farmaceutické prostředky mohou obsahovat solubilní CTLA4 proteinové molekuly a/nebo molekuly nukleové kyseliny, a/nebo vektory kódující molekuly. Ve výhodných provedeních mají solubilní CTLA4 molekuly aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény CTLA4, jak je ukázána na Obr. 24 nebo 19 (CTLA4Ig nebo L104EA29Y, v příslušném pořadí). Ještě lépe je solubilní CTLA4 mutantní molekulou L104EA29YIg, jak je zde popsána. Prostředky mohou dále obsahovat jiná terapeutická činidla, včetně toxinů, enzymů, protilátek nebo konjugátů.
Jak je standardní praxí v oboru, jsou poskytnuty farmaceutické prostředky obsahující molekuly podle předkládaného vynálezu smísené s přijatelným nosičem nebo adjuvans, která jsou známá odborníkům v oboru. Farmaceutické prostředky výhodně obsahují vhodné nosiče a adjuvans, které mohou obsahovat jakýkoliv materiál, který si při kombinování s molekulou podle předkládaného vynálezu (např., solubilní CTLA4 molekulou, jako je, CTLA4Ig nebo L104EA29Y) zachovává aktivitu molekuly a je nereaktivní s imunitním systémem jedince. Mezi takové nosiče a adjuvans patří, například, iontoměniče, kamenec, aluminum-stearát, lecitin, sérové proteiny, jako je lidský sérový albumin, pufrovací substance, jako jsou fosfáty, glycin, kyselina sorbová, kalium-sorbát, parciální glyceridové směsi nasycených rostlinných mastných kyselin, fosfátem pufrované salinické roztoky, voda, emulze (např. emulze olej/voda), soli nebo elektrolyty, jako je protamin-sulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidní oxid křemičitý, křemičitan hořečnatý, polyvinylpyrrolidon, substance na bázi celulosy a polyethylenglykol. Mezi další nosiče patří sterilní roztoky; tablety, včetně potahovaných tablet a kapslí. Typicky takové nosiče obsahují přísady, jako je škrob, mléko, cukr (např. sacharosa, glukosa, maltosa), některé typy hlinek, želatina, kyselina stearová nebo její soli, magnesium- nebo kalcium- stearát, talek, rostlinné tuky nebo oleje, klovatiny, glykoly, nebo jiné známé přísady. Mezi takové nosiče patří též chuťová korigens a barviva a jiné přísady. Prostředky obsahující takové nosiče jsou připraveny běžnými způsoby .Takové prostředky mohou být také formulovány s různými lipidovými přípravky, jako jsou, například, liposomy, stejně jako s různými polymemími prostředky, jako jsou polymerické mikrosféry.
Způsoby
Vynález poskytuje způsoby pro regulování funkčních interakcí CTLA4- a CD28- pozitivních buněk s B7-pozitivními buňkami. Způsoby zahrnují kontaktování B7-pozitivních buněk se solubilní CTLA4 molekulou podle předkládaného vynálezu tak, že je tvořen komplex solubilní CTLA4/B7, komplex interferující s reakcí endogenní CTLA4 a/nebo CD28 molekuly s B7 molekulou.
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro inhibování funkce T-lymfocytů bez deplece T-lymfocytů u člověka tak, že umožňuje kontaktování B7-pozitivních buněk u člověka s solubilní CTLA4. Příklady solubilní CTLA4 jsou CTLA4Ig a solubilní CTLA4 mutantní molekula, např. L104EA29YIg. Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění. Způsoby zahrnují podání terapeutické kompozice obsahující solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu jedinci v množství účinném pro zmírnění alespoň jednoho příznaku asociovaného s onemocněním imunitního systému. Dále vynález poskytuje dlouhodobou terapii onemocnění imunitního systému, při které jsou blokovány interakce T-lymfocytů/B7 pozitivních buněk, čímž se blokuje stimulace Tlymfocytů ko-stimulačními signály, jako je vazba B7 na CD28, což vede k indukci anergie nebo tolerance T-lymfocytů. Mezi onemocnění imunitního systému patří například autoimunitní onemocnění, onemocnění souvisejících s transplantáty a imunoproliferativních onemocnění. Příklady onemocnění imunitního systému jsou reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) (např. při transplantaci kostní dřeně nebo při indukci tolerance), imunologické poruchy asociované a odmítnutím
- 19CZ 303959 B6 transplantátu, chronické rejekce, tkáňové nebo buněčné allo— nebo xenotransplantáty, včetně orgánových, kožních, ostrůvků pankreatu, svalů, hepatocytů a neuronů. Příklady imunoproliferativních onemocnění jsou, například, psoriasa, T-lymfocytámí lymfom, T-lymfocytámí akutní lymfoblastické leukemie, testikulámí angiocentrický T-lymfocytámí lymfom, benigní lymfocytární angiitis, lupus (např. lupus erythematosus, lupusová nefřitis), Hashimotova thyroiditis, primární myxedem, Gravesova nemocí, pemiciosní anemie, autoimunní atrofická gastritis, Addisonova nemoc, diabetes (např. insulin dependentní diabetes mellitus, diabetes mellitus typu I, diabetes mellitus typu II), Goodpasteurův syndrom, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnova nemoc, sympathetická ophthalmia, autoimunní uveitis, roztroušená sklerosa, autoimunní hemolytická anemie, idiopatická trombocytopenie, primární biliámí cirhosa, chronická hepatitis, ulcerosní colitis, Sjogrenův syndrome, revmatická onemocnění (např. revmatoidní artritis), polymyositis, sclerodermie a smíšené onemocnění pojivové tkáně.
Solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu vykazují inhibiční vlastnosti in vivo. Za podmínek, kdy se vyskytují interakce T-lymfocytů/B7-pozitivních buněk, například interakce T-lymfocyty/B buňky, které se vyskytují v důsledku kontaktu mezi T-lymfocyty a B7-pozitivními buňkami, může vazba podané CTLA4 molekuly s B7-pozitivními buňkami, například B lymfocyty, interferovat, tj., inhibovat, interakce T-lymfocyty/B7-pozitivní buňky, což vede k regulaci imunitní reakce.
Vynález poskytuje způsoby pro inhibici imunitní reakce. Inhibice imunitní reakce solubilní CTLA4 molekulou podle předkládaného vynálezu může být cestou pro inhibování nebo blokování již probíhající imunitní reakce nebo může bránit rozvoji imunitní reakce. Solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu mohou inhibovat funkce aktivovaných T-lymfocytů, jako je proliferace T lymfocytů a sekrece cytokinů, tím, že potlačují reakce T-lymfocytů nebo indukují specifickou toleranci u T-lymfocytů, nebo oběma cestami. Dále, solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, interferující s CTLA4/CD28/B7 dráhou, mohou inhibovat proliferaci T-lymfocytů a/nebo sekreci cytokinů, a to vede ke snížení destrukce tkáně a indukci nízké reaktivity nebo anergie T-lymfocytů.
Výhodným provedením předkládaného vynálezu je použití solubilní CTLA4 mutantní molekuly L104EA29YIg pro regulaci funkčních interakcí CTLA4- a CD28- pozitivních buněk s B7-pozitivními buňkami za účelem léčby onemocnění imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění a/nebo pro inhibici imunitních reakcí. L104EA29YIg podle předkládaného vynálezu je solubilní CTLA4 mutantní molekula obsahující alespoň dvě aminokyselinové změny, leucin (L) na kyselinu glutamovou (E) v pozici + 104 a alanin (A) na tyrosin (Y) v pozici +29. L104EA29YIg molekula může kromě těchto dvou mutací obsahovat i další mutace.
Výhodnými provedeními jsou způsoby pro léčbu revmatického onemocnění, jako je revmatoidní artritis, pomocí podání účinného množství solubilní CTLA4 molekuly jedinci. Podání účinného množství terapeutická kompozice zmírní u jedince alespoň jeden z příznaků asociovaný s onemocněním, včetně redukce: otoku kloubů, citlivost kloubů, zánětu, ranní ztuhlosti, bolesti a strukturálního postižení snižujícího fyzické schopnosti. Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro zmírnění alespoň jednoho z příznaků spojeného s revmatoidní artritis, včetně snížení sedimentace erytrocytů, sérové koncentrace C-reaktivního proteinu, solubilního ICAM-1, solubilního E-selektinu a/nebo solubilního IL-2r.
Úroveň zmírnění příznaků dosažené pomocí předkládaného vynálezu může být měřena za použití jakýchkoliv akceptovatelných kriterií používaných pro měření a dokumentování zlepšení příznaků v klinické praxi. Přijatelnými kriterii pro měření úlevy příznaků jsou skóre na bázi kriterií daných American College of Rheumatology (např., ACR 20), pro měření zmírnění příznaků (v: „CDER Guideline for Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory a Antirheumatic Drugs-FDA 1988) a Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries, I. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 5: 789-793). Pro obecný popis těchto kriterií viz „Guidance for Industry: Clinical Development . 90 .
Programs for Drugs, Devices, a Biological products for Treatment of Rheumatoid arthritis (RA)“, February 1999.
Mezi jedince léčené způsoby podle předkládaného vynálezu patří savci, včetně lidí, opic, lidoopů., psů, koček, koní, králíků, myší a krys.
Předkládaný vynález poskytuje různé způsoby, lokální nebo systémové, pro podání solubilní CTLA4 molekuly. Způsoby zahrnují intravenosní, intramuskulámí, intraperitoneální, orální, inhalační a podkožní způsoby podání, stejně jako použití implantovatelných pump, kontinuálních infúzní, genové terapie, liposomů, čípků, lokálního kontaktu, vesikulí, kapslí a injekcí. Terapeutické činidlo, připravené s nosičem, je často lyofilizováno pro skladování a je rekonstituováno vodou nebo pufřovaným roztokem, s neutrálním pH (pH přibližně 7 až 8, např., pH 7,5) před podáním.
Jak je v oboru standardní praxí, jsou prostředky podle předkládaného vynálezu podávány jedinci v jakékoliv farmaceuticky přijatelné formě.
Podle předkládaného vynálezu způsoby zahrnují podání solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu jedinci pro regulaci interakcí CD28- a/nebo CTLA4-pozitivních buněk s B7-pozitivními buňkami. B7-pozitivní buňky jsou kontaktovány s účinným množstvím solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, nebo jejími fragmenty nebo deriváty, takže dojde ke tvorbě komplexů solubilní CTLA4/B7. Komplexy interferují s interakcemi mezi endogenní CTLA4 a CD28 molekulou a B7 rodinou molekul.
Solubilní CTLA4 molekuly mohou být podávány jedinci v množství a po dobu (např. po dobu a/nebo opakovaně) dostatečnou pro blokování vazby endogenní B7 molekuly na její ligandy u jedince. Blokáda vazby endogenní B7/ligand inhibuje interakce mezi B7-pozitivními buňkami a CD28-a/nebo CTLA4-pozitivními buňkami.
Dávka terapeutického činidla je závislá na mnoha faktorech, včetně typu postižené tkáně, typu léčeného autoimunitního onemocnění, závažnosti onemocnění, a reakce jedince na léčbu činidlem. dávky činidla jsou tedy různé u každého jedince a způsoby podání. Solubilní CTLA4 molekuly mohou být podány v dávce mezi 0,1 a 20,0 mg/kg hmotnosti a den, lépe mezi 0,5 a 10,0 mg/kg/den.
Vynález také zahrnuje použití prostředků podle předkládaného vynálezu společně sjinými farmaceutickými činidly pro léčbu onemocnění imunitního systému. Například, revmatická onemocnění mohou být léčena molekulami podle předkládaného vynálezu společně s, například, imunosupresivy, jako jsou kortikosteroidy, cyklosporin (Mathiesen, 1989, Cancer Lett. 44(2):151-156), prednison, azathioprin, methotrexat (R. Handschumacher, v: „Drugs Ušed for Imunosuppression“ str. 1264-1276), TNF-alfa blokátory nebo antagonisty (New England Journal of Medicine, vol. 340: 253-259, 1999; Lancet vol. 354: 1932-39, 1999, Annals of Intemal Medicine, vol. 130: 478-486), nebo jakákoliv jiná biologická činidla ovlivňující jakýkoliv zánětlivý cytokin, nesteroidní antirevmatika/Cox-2 inhibitory, hydroxychlorochin, sulfasalazoprym, soli zlata, etanercept, infliximab, rapamycin, mykofenolatmofetil, azathioprin, tacroiismus, basiliximab, cytoxan, interferon beta-la, interferon beta-lb, glatiramer acetát, mitoxantron hydrochlorid, anakinra a/nebo jiná biologická činidla.
Solubilní CTLA4 molekuly (výhodně L104EA29YIg) mohou být také použita v kombinaci s jedním nebo více následujícími činidly pro regulaci imunitní reakce. Mezi taková činidla patří: solubilní gp39 (též známý jako CD40 ligand (CD4OL), CD154, T-BAM, TRAP), solubilní CD29, solubilní CD40, solubilní CD80 (ATCC 68627), solubilní CD56, solubilní CD28 (např. 68628), solubilní CD56, solubilní Thy-1, solubilní CD3, solubilní TCR, solubilní VLA^t, solubilní VCAM-1, solubilní LECAM-1, solubilní ELAM-1, solubilní CD44, protilátky reaktivní s gp39 (např. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 a ATCC HB-12056), protilátky reaktivní
-21 CZ 303959 B6 s CD40 (např. ATCC HB-9110), protilátky reaktivní s B7 (např. ÁTCC HB-253, ATCC CRL2223, ATCC CRL-2226. ATCC HB-301, ATCC HB11341, etc), protilátky reaktivní s CD28 (např. ATCC HB-11944 neb o mAb 9.3, jak je popsána v Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1): 18— 22, 1980), protilátky reaktivní s LFA-1 (např. ATCC HB-9579 a ATCC HB-213), protilátky reaktivní s LFA-2, protilátky reaktivní s IL—2, protilátky reaktivní s 1L-12, protilátky reaktivní s IFN-gamma, protilátky reaktivní s CD2, protilátky reaktivní s CD48, protilátky reaktivní sjakoukoliv ICAM (např., ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 a ICAM-3), protilátky reaktivní s CTLA4 (např. ATCC HB-304), protilátky reaktivní sThy-1, protilátky reaktivní s CD56, protilátky reaktivní s CD3, protilátky reaktivní s CD29, protilátky reaktivní s TCR, protilátky reaktivní s VLA-4, protilátky reaktivní s VCAM-1, protilátky reaktivní s LECAM-1, protilátky reaktivní sELAM-1, protilátky reaktivní sCD44. V některých provedeních jsou výhodné monoklonální protilátky. V jiných provedeních jsou výhodné protilátkové fragmenty. Jak bude odborníkům v oboru jasné, může kombinace obsahovat soiubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu a jedno další imunosupresivní činidlo, soiubilní CTLA4 molekuly s dvěma dalšími imunosupresivními činidly, soiubilní CTLA4 molekuly třemi dalšími imunosupresivního činidly atd. Určení optimální kombinace a dávky může být provedeno za použití optimalizačních způsobů dobře známých v oboru.
Mezi některé konkrétní kombinace patří následující: L104EA29YIg a CD80 monoklonální protilátka (mAbs); L104EA29YIg a CD86 mAbs; L104EA29YIg, CD80 mAbs a CD86 mAbs; L104EA29YIg a gp39 mAbs; L104EA29YIg a CD40 mAbs; L104EA29YIg a CD28 mAbs; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAbs, a gp39 mAbs; L104EA29YIg, CD80 a CD86 mAbs aCD40 mAbs; a L104EA29YIg, anti-LFAl mAb, a anti-gp39 mAb. Konkrétním příkladem gp39 mAb je MRI. Jiné kombinace budou zřejmé odborníkům v oboru.
Soiubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, například L104EA29YIg, mohou být podány jako jediná aktivní složka nebo dohromady s dalšími léky v imunomodulačních režimech nebo s jinými protizánětlivými činidly, např. pro léčbu nebo prevenci akutní nebo chronické rejekce allo- nebo xenotransplantátu, nebo zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění, nebo pro indukci tolerance. Například mohou být tyto molekuly použity v kombinaci s kalcineurinovým inhibitorem, např. cyklosporinem A nebo FK506; imunosupresivním makrolidem, např. rapamycinem nebo jeho derivátem, např. 40-O-(2-hydroxy)ethyl-rapamycinem, činidlem způsobujícím „homing“ Iymfocytů, např. FTY720 nebo jeho analogem, kortikosteroidy; cyklofosfamidem; azathioprenem; methotrexatem; leflunomidem nebo jeho analogem; mizoribinem; kyselinou mykofenolovou; mykofenolát-mofetilem; 15-deoxyspergualinem nebo jeho analogem; imunosupresivní monoklonální protilátkou, např., monoklonální protilátkou k leukocytámím receptorům. např., MHC, CD2, CD3, CD4, CDlIa/CDI8, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), 0X40, 4-IBB nebo jejich ligandy; nebo jinými imunomodulačními sloučeninami, např. CTLA4/CD28—Ig, nebo jinými inhibitory adhesních molekul, např. mAb nebo inhibitory s nízkou molekulovou hmotností, včetně LFA-1 antagonistů, antagonistů selektinu a VLA-4 antagonistů. Sloučeniny jsou zejména použitelné v kombinaci se sloučeninami, které interferují s CD40 ajeho ligandy, jako jsou např. protilátky k CD40 a protilátky k CD40-L.
Když jsou soiubilní CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu podávány společně sjinými imunosupresivními/imunomodulačními nebo protizánětlivými léky, jak bylo např. uvedeno výše, tak jsou dávky současně podávaných imunosupresivních, imunomodulačních nebo protizánětlivých molekul různé podle typu použitého léku, například podle toho, zda se jedná o steroid nebo cyklosporin, podle konkrétního použitého léku, podle léčeného onemocnění a tak dále.
Proto v dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje v ještě dalším aspektu způsoby definované výše zahrnující současné podání, například konkomitantní nebo sekvenční, terapeuticky účinného množství soiubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, např. CTLA4Ig a/nebo L104EA29YIg, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, a druhého léčiva,
- 77 CZ 303959 B6 kde uvedené druhé léčivo je imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo, jak bylo uvedeno výše. Dále vynález poskytuje terapeutické kombinace, např. kity, např. pro použití v jakémkoliv způsobu definovaném výše, obsahující solubilní CTLA4 molekulu, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, která má být použita současně nebo sekvenčně s alespoň jednou farmaceutickou kompozicí obsahující imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo. Kit může obsahovat návod pro podání.
Vynález také poskytuje způsoby pro přípravu solubilní CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu. Exprese solubilní CTLA4 mutantní molekuly může být provedena v prokaryotické buňce nebo eukaryotické buňce.
Prokaryota jsou nejčastěji reprezentována různými kmeny bakterií. Bakteria mohou být grampozitivní nebo gram-negativní. Obvykle jsou výhodné gram-negativní bakterie, jako je E. coli. Mohou být použity také jiné mikrobiální kmeny. Sekvence kódující solubilní CTLA4 mutantní molekuly mohou být insertovány do vektoru navrženého pro exprimování cizorodých sekvencí v prokaiyotických buňkách, jako je E. coli. Tyto vektory mohou obsahovat běžně používané prokaryotické kontrolní sekvence, které obsahují promotory pro iniciaci transkripce, volitelně s operátorem, společně s ribosomálními vazebnými sekvencemi, včetně běžně používaných promotorů, jako je beta-laktamasový (penicillinasový) a laktosový (lac) promotorový systém (Chang, et al., (1977) Nátuře 198:1056), tryptofanový (trp) promotorový systém (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) a PL promotor a N-genové ribosomální vazebné místo z lambda promotoru (Shimatake, et al., (1981) Nátuře 292:128).
Takové expresní vektory také obsahují sekvence rozpoznávající počátek replikace a selektovatelné markéry, jako je beta-laktamasový nebo neomycin-fosfotransferasový gen udělující resistenci na antibiotika, takže se vektory mohou replikovat v bakteriích buňky nesoucí plasmidy mohou být selektovány při kultivaci za přítomnosti antibiotik, jako je ampicilin nebo kanamycin.
Expresní plasmid může být vložen do prokaryotických buněk různými způsoby, včetně CaC12-šoku (Cohen, (1972) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:2110, a Sambrook et al. (ed.), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“, 2. vydání. Cold Spring Harbor Press, (1989)) a elektroporace.
Při provádění předkládaného vynálezu jsou eukaryotické buňky také vhodnými hostitelskými buňkami. Příklady eukaryotických buněk jsou živočišné buňky, ať primární, nebo imortalizované, kvasinky (např., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, a Pichia pastoris), a rostlinné buňky. Myelomové, COS a CHO buňky jsou příklady živočišných buněk, které mohou být použity jako hostitelské buňky. Mezi konkrétní CHO buňky patří, například, DG44 (Chasm, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC č. CCL-61), CHO-K1 Tet-On buněčná linie (Clontech), CHO označená ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genová, 1T), CHO klon B (GEIMG, Genová, IT). CHO-L1/SF označená ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), a RP-CHOK1 označená ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Příklady rostlinných buněk jsou buňky tabáku (celých rostlin, kultury nebo kalu), kukuřice, sóji a rýže. Také přijatelné jsou buňky semen kukuřice, sóji a rýže.
Sekvence nukleové kyseliny kódující CTLA4 mutantní molekuly mohou být také insertovány do vektoru navrženého pro expresi cizorodých sekvencí v eukaryotickém hostiteli. Regulační elementy vektoru mohou být různé podle konkrétního eukaryotického hostitele.
Mezi běžně používané eukaryotické kontrolní sekvence pro použití v expresních vektorech patří promotory a kontrolní sekvence kompatibilní se savčími buňkami, jako je, například, CMV promotor (CDM8 vektor) a virus ptačího sarkomu (ASV) (píLN vektor). Mezi další běžně používané promotory patří časný a pozdní promotor Opičího Viru 40 (SV40) (Fiers, et al„ (1973) Nátuře 273:1 13), nebo jiné virové promotory, jako jsou promotory odvozeny od polyomaviru,
-23 CZ 303959 B6 adenoviru 2 a hovězí papilloma virus. Také může být použit indukovatelný promotor, jako je hMTII (Karin, et al., (1982) Nátuře 299:797-802).
Vektory pro expresi CTLA4 mutantní molekuly v eukaryotech mohou také obsahovat sekvence označované jako zesilovače transkripce. Tyto sekvence jsou důležité pro optimalizaci genové exprese a vyskytují se buď před, nebo za promotorem.
Příklady expresních vektorů pro eukaryotické hostitelské buňky jsou, například, vektory savčí hostitelské buňky (např., BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVI (Life technologies); pVPakc vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovirové vektory (např., pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) nebo jejich modifikované formy, adenovirové vektory; adeno-asociované virové vektory, baculovirové vektory, kvasinkové vektory (např., pESC vektory (Stratagene)).
Sekvence nukleové kyseliny kódující CTLA4 mutantní molekuly se mohou integrovat do genomu eukaryotické hostitelské buňky a mohou se replikovat s replikací genomu hostitelské buňky. Alternativně mohou vektory nesoucí CTLA4 mutantní molekuly obsahovat sekvence rozpoznávající počátek replikace umožňující extrachromosomální replikaci.
Pro expresi sekvencí nukleové kyseliny v Saccharomyces cerevisiae může být použita sekvence rozpoznávající počátek replikace z endogenního kvasinkového plasmidu, 2u circle. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternativně mohou být použity sekvence z kvasinkového genomu schopné vyvolat autonomní replikaci (viz., například, Stinchcomb et al.. (1979) Nátuře 282:391; Tschemper et al., (1980) Gene 10:157; a Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300).
Transkripční kontrolní sekvence pro kvasinkové vektory jsou, například, promotory pro syntetizování glykolytických enzymů (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900). Mezi další promotory známé v oboru patří CMV promotor poskytnutí v CDM8 vektoru (Toyama a Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promotor pro 3-fosfoglycerát-kinasu (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) a promotory pro jiné glykolytické enzymy.
Jiné promotory jsou indukovatelné, protože mohou být regulovány stimuly z prostředí nebo růstovým mediem. Mezi tyto indukovatelné promotory patří promotory z genů pro proteiny tepelného šoku, alkohol-dehydrogenasu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatasu, enzymy asociované s katabolismem dusíku a enzymy odpovědné za využití maltosy a galaktosy.
Regulační sekvence mohou být také umístěny na 3' konec kódujících sekvencí. Tyto sekvence mohou stabilizovat mRNA. Takové terminátory se vyskytují v 3' netranslatovaném regionu po kódujících sekvencích v několika savčích a kvasinkových genech.
Mezi vektory vhodné pro rostliny a rostlinné buňky patří, například, Agrobacteriové T-plazmidy, virus květákové mozaiky (CaMV) a virus zlaté mozaiky rajčat (TGMV).
Obecné aspekty transformace savčích hostitelských buněk jsou popsány v Axel (U.S. Patent 4399216, udělený 16.8.1983). Savčí buňky mohou být transformovány například transfekci za přítomnosti fosforečnanu vápenatého, mikroinjekcí, elektroporací nebo via transdukcí virovými vektory.
Způsoby pro vkládání cizorodých DNA sekvencí do rostlinných a kvasinkových genomů zahrnují (1) mechanické způsoby, jako je mikroinjekce DNA do jedné buňky nebo protoplastů, vortexování buněk se skleněnými korálky za přítomnosti DNA, nebo vstřelování DNA-potažené na wolframová nebo zlatá zrna do buněk nebo protoplastů; (2) vkládání DNA pomocí zvýšení propustnosti buněčné membrány pro makromolekuly za použití zpracování polyethylenglykolem . ~>Λ .
nebo pomocí elektrických pulsů s vysokým napětím (elektroporace); nebo (3) použití liposomů (obsahujících cDNA), které fúzují s buněčnými membránami.
Po exprimování CTLA4 mutantních molekul podle předkládaného vynálezu mohou být tyto molekuly získány způsoby dobře známými v oboru, jako je lyžování buněk (např. sonikací, lysozymem a/nebo detergenty) a protein se potom získá za použití standardních způsobů pro přečištění proteinů, např. afinitní chromatografíí nebo iontoměničovou chromatografíí, za zisku významně přečištěného produktu (R. Scopes v: „Protein Purification, Principles a Practice“, 3. vydání, Sprínger-Verlag (1994); Sambrook et al. (eds.), „Molecular Cloning“ A Laboratory Manual“, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Exprese CTLA4 mutantní molekuly může být detekována způsoby známými v oboru. Například, mutantní molekuly mohou být detekovány pomocí Coomassie barvených SDS-PAGE gelů a imunoblottingu za použití protilátek, které se váží na CTLA4.
Následující příklady jsou uvedeny pro dokreslení předkládaného vynálezu a aby napomohly odborníkům v oboru při provádění předkládaného vynálezu. Příklady nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad poskytuje popis způsobů použitých pro přípravu nukleotidových sekvencí kódujících CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu.
Nejprve se připraví CTLA4Ig kódující plazmid a ověří se, že exprimuje CTLA41g molekuly, jak je popsáno v U.S. Patentech 5434131, 5885579 a 5851795. Potom se mutantní molekuly obsahující jednu mutaci (např., L104EIg) připraví z CTLA4Ig kódující sekvence, exprimují se atestují se na vazebné kinetiky pro různé B7 molekuly. L104EIg nukleotidová sekvence (jak je uvedena na obr. 18) se použije jako templát pro generování CTLA4 mutantních sekvencí s dvěma mutacemi (jak jsou uvedené na Obr. 19 až 22), které se exprimují jako proteiny a testují se na kinetiky vazby. Mezi CTLA4 mutantní sekvence se dvěma mutacemi patří: L104EA29YJg, L104EA29Llg. L104EA29TIg, a L104EA29WIg. Také se připraví mutanti s třemi mutacemi. Konstrukce CTLA4Ig
Genetický konstrukt kódující CTLA4Ig, obsahující extracelulární doménu CTLA4 a IgCgammal doménu, se připraví způsobem popsaným v U.S. patentech 5 434 131,5 844 095 a 5 851 795, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako odkazy. Gen pro extracelulární doménu CTLA4 se klonuje PCR za použití syntetických oligonukleotidů odpovídajících publikované sekvenci (Dariavach et al., Eur. Joum. Immunol. 18:1901-1905 (1988)).
Protože signální peptid pro CTLA4 nebyl v CTLA4 genu identifikován, je N-konec předpokládané sekvence CTLA4 fúzován na signální peptid oncostatinu M (Malik et al., Mol. A Cell. Biol. 9:2847 (1989)) ve dvou krocích za použití přesahujících oligonukleotidů. Pro první krok se oligonukleotid CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCCGTGGCCCAGCC (SEQ ID NO:1) (který kóduje C-terminálních 15 aminokyselin ze signálního peptidu onkostatinu M fúzovaných na N-terminálních 7 aminokyselin CTLA4) použije jako kódující primer, a TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEQ ID NO: 2) (kódující aminokyselinové zbytky 119-125 aminokyselinové sekvence kódujícího CTLA4 receptorů a obsahující Bel I restrikční místo) se použije jako reverzní primer. Tempiátem pro tento krok je cDNA syntetizovaná z 1 pg celkové RNA z H38 buněk (HTLV II infikovaná buněčná linie T-lymfocytámí leukemie získaná od Dr. Salahudin a Gallo, NCI, Bethesda, MD).
-25CZ 303959 B6
Část PCR produktu z prvního stupně se reamplifikuje za použití překrývajícího se kódujícího primeru kódujícího N-terminální část signálního peptidu onkostatinu M a obsahující Hind III restrikčn í m ísto, CTAGCC ACTG A AGCTTC ACC A ATGGGTGTACTGCTC ACAC AGAGGACGCTGTCAGTCTGGTCCTTGCACTC a stejného reverzního primeru. Produkt PCR reakce se tráví Hind III a Bel I a liguje se s Bel I/Nba I štěpeným cDNA fragmentem kódujícím aminokyselinové sekvence odpovídající pantovému, CH2 a CH3 regionu IgC (gamma)l do Hind III/Nba I štěpeného expresního vektoru. CDM8 nebo Hind ΙΠ/Nba I štěpeného expresního vektoru piLN (který je též známý jako píLN).
DNA kódující aminokyselinový sekvence odpovídající CTLA4Ig byla uložena v ATCC podle Budapešťské smlouvy dne. 31.5.1991 pod ATCC přírůstkovým č. 68629.
CTLA4Ig mutagenese na bázi kodonů
Mutagenní a skríningová strategie byla vyvinuta pro identifikaci mutantní CTLA4Ig molekuly, která má pomalejší disociaci („off‘ rychlost) zCD80 a/nebo CD86 molekuly, tj. má lepší vazebnou schopnost. V tomto provedení byly mutace provedeny v a/nebo přibližně v zbytcích vCDR-1, CDR-2 (též známém jako C' řetězec) a/nebo CDR-3 regionu extracelulámí domény CTLA4 (jak je popsáno v U.S. Patentech 6090914, 5773253 a 5844095; v související U.S. Patentové přihlášce 60/214065; a v Peach, R. J., et al., J. Exp. Med. 1994, 180:2049-2058. CDR-like region zahrnuje každý CDR region a je delší o několik aminokyselin před a/nebo za CDR motivem). Tato místa byla vybrána podle pokusů na chimérických CD28/CTLA4 fúzních proteinech (Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058), a podle modelování určujícího, které vedlejší řetězce aminokyselin budou vystaveny působení rozpouštědla, a podle chybění identity nebo homologie některých aminokyselinových zbytků v některých pozicích mezi CD28 a CTLA4. Dále, jakýkoliv zbytek, který je v těsné blízkosti (5 až 20 Angstromů) k identifikovaným zbytkům je považován za součást předkládaného vynálezu.
Pro syntetizování a testování solubilní CTLA4 mutantní molekuly s pozměněnou afinitou k B7 molekule (např. CD80, CD56), se použila dvoustupňová strategie. Pokusy zahrnovaly nejprve generování knihovny mutací ve specifickém kodonu extracelulámí části CTLA4 a potom testování těchto knihoven za použití BIAcore analýzy pro identifikaci mutantů s pozměněnou reaktivitou k B7. Biacore testovací systém (Pharmacia, Piscataway, N.J.) využívá senzoru na bázi povrchové plasmonové rezonance, který využívá kovalentní vazby CD80Ig nebo CD86Ig na dextranem-potažený senzorový čip, který je umístěn v detektoru. Testovaná molekula může být potom injikována do komůrky obsahující senzorový čip a množství komplementárního proteinu, který se naváže, může být hodnoceno podle změny molekulové hmotnosti, která je fyzikálně asociovaná s dextranem potaženou stranou senzorového čipu; změna v molekulové hmotnosti může být měřena detektorovým systémem.
Konkrétně, připravily se mutantní nukleotidové sekvence obsahující jednu mutaci za použití nemutované (např., přirozené) DNA kódující CTLA4Ig (U.S. Patent: 5434131, 5844095; 5851795; a 5885796; ATCC přírůstkové 68629) jako templátu. Mutagenní oligonukleotidové PCR primery se navrhly pro náhodnou mutagenesi specifických kodonů tak, že se povolily jakékoliv baze v pozicích 1 a 2 kodonu, ale pouze guanin nebo thymin v pozici 3 (XXG/T nebo také psáno jako NNG/T). Tímto způsobem může být specifický kodon kódující aminokyselinu náhodně mutován tak, aby kodoval jakoukoliv ze 20 aminokyselin. Tak vede XXG/T mutagenese k zisku 32 potenciálních kodonů kódujících každou ze 20 aminokyselin. PCR produkty kódující mutace v těsné blízkosti CDR3-like smyčky CTLA4íg (MYPPPY) se trávily Sacl/Xbal a subklonovaly se do podobně tráveného CTLA4Ig (jak je uvedeno na Obr. 24) rtLN expresního vektoru. Tento způsob se použil pro přípravu CTLA4 mutantní molekula obsahující jednu mutaci L104EIg (jak je uvedena na Obr. 18).
Pro mutagenesi v blízkosti CDR-l-like smyčky CTLA4Ig se nejprve silentní Nhel restrikční místo vložilo 5' do této smyčky, za použití PCR primerem řízené mutagenese. PCR produkty se
trávily Nhel/Xbal a subklonovaly se do podobně trávených CTLA4Ig nebo L104EIg expresních vektorů. Tento způsob se použil pro generování CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg obsahující dvě mutace (jak je uvedeno na obr. 19). Konkrétně, nukleová kyselina kódující CTLA4 mutantní molekula s jednou mutací, L104EIg, se použila jako templát pro generování CTLA4 mutantní molekula obsahující dvě mutace, L104EA29YIg.
Mutantní nukleotidové sekvence kódující CTLA4 mutantní molekuly, jako je L104EA29YIg (uložená 19.6.2000 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University BIvd., Manassas, VA 20110-2209, pod ATCC přírůstkovým č. PTA-2104), se připravily opakováním mutagenese popsané výše, za použití L104EIg jako templátu. Tento způsob se použil pro generování mnoha mutantních nukleotidových sekvencí se dvěma mutacemi, jako jsou sekvence kódující CTLA4 molekuly L104EA29YIg (jak je uvedena na Obr. 19), L104EA29LIg (jak je uvedena na Obr. 20), L104EA29TIg (jak je uvedena na Obr. 21) a L104EA29WIg (jak je uvedena na Obr. 22). Také se připravily mutanty se třemi mutacemi, jako jsou sekvence kódující L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg a L104EA29YS25RIg.
Solubilní CTLA4 molekuly se exprimovaly z nukleotidových sekvencí a použily se v klinických studiích fáze II, které jsou popsány v příkladu 3, dále.
Jak je odborníkům v oboru známo, replikace sekvencí nukleové kyseliny, zejména PCR amplifikace, snadno vkládá změny baží do DNA řetězců. Nicméně, nukleotidové změny nejsou nutně translatovány do aminokyselinových změn, protože některé kodony kódují stejné aminokyseliny. Jakékoliv změny nukleotidů v původní nebo přirozené sekvenci, silentní (tj. nezpůsobující změnu v translatované aminokyselině) nebo jiné, spadají, ač to není výslovně uvedeno, do rozsahu předkládaného vynálezu.
Příklad 2
Následující příklad popisuje skríningové metody použité pro identifikaci mutantních CTLA polypeptidů s jednou nebo dvěmi mutacemi, exprimovaných z konstruktů popsaných v příkladu 1, které mají vyšší vazebnou aviditu pro B7 molekuly, ve srovnání s nemutovanými CTLA4Ig molekulami.
Současné pokusy in vitro a in vivo ukazují, že CTLA4Ig sám není schopen zcela blokovat aktivaci specifickým antigenem aktivovaných T-lymfocytů. Pokusy in vitro s CTLA4Ig a buď monoklonální protilátkou specifickou pro CD80, nebo CD86, měřící inhibici proliferace T-lymfocytů ukázaly, že anti-CD80 monoklonální protilátka nezvyšuje CTLA4Ig inhibici. Nicméně, antiCD86 monoklonální protilátka zvyšovala inhibici, což naznačuje, že CTLA41g není tak účinný v blokování CD86 interakce. Tato data podporují dřívější zjištění Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793-801) ukazující, že inhibice CD80-zprostředkované buněčné reakce vyžaduje přibližně lOOkrát nižší koncentrace CTLA4Ig než inhibice CD86-zprostředkované reakce. Podle těchto zjištění se předpokládá, že solubilní CTLA4 mutantní molekuly mající vyšší aviditu pro CD86 než přirozená CTLA4 molekula by mohly lépe blokovat „priming“ antigen-specifických aktivovaných buněk než CTLA4Ig.
Proto byly solubilní CTLA4 mutantní molekuly popsané v příkladu 1 testovány za použití nové skríningové procedury za účelem identifikace několika mutací v extracelulámí doméně CTLA4, které zlepšují vazebnou aviditu pro CD80 a CD86. Tato skríningová strategie poskytuje účinný způsob pro přímou identifikaci mutantů s významně pomalejší disociací bez potřeby přečištění nebo kvantifikace proteinu, protože určení „off‘ rate je nezávislá na koncentraci (O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457^168).
COS buňky se transfektovaly jednotlivými plazmidovými DNA přečištěnými na miniprep a propagovaly se po dobu několika dnů. Tři dny kondicionované kultivační medium s aplikováno na
-27CZ 303959 B6
BIAcore biosenzorové čipy (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) potažené solubilním CD80Ig nebo CD86Ig. Specifická vazba a disociace mutantních proteinů se měřila povrchovou plasmonovou resonancí (O'Shannessy, D. J., et al., 1997 Anal. Biochem. 212:457—468). Všechny pokusy byly provedeny na BIAcoreTM nebo BIAcoreTM 2000 biosenzorech při 25 °C. Ligandy byly imobilizované na NCM5 senzorových čipech (Pharmacia) za použití standardního N-ethylN'-(dimethylaminopropyl)-karbodiimid-N-hydroxysukcinimidové kondenzace (Johnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko, S. N., et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 542515434).
Skríningový způsob
COS buňky kultivované ve 24jamkových tkáňových kultivačních plotnách se dočasně transfektovaly mutantním CTLA4Ig. Kultivační medium obsahující secemovaný solubilní mutantní CTLA41g se odebíralo o 3 dny později.
Kondicionované kultivační medium COS buněk se nechalo protékat skrz BIAcore biosenzor čipy derivatizované CD86Ig nebo CD80Ig (jak je popsáno v Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-2677 1), a identifikovaly se mutantní molekuly s off-rates pomalejším než je tato hodnota pro přirozený CTLA4Ig. DNA odpovídající vybraným vzorkům media se sekvencovaly a připravilo se více DNA pro provedení dočasné transfekce COS buněk ve větším měřítku, ze kterých může být CTLA4Ig mutantní protein připraven po přečištění kultivačního media na proteinu A.
BIAcore analýza a analýza dat vazebné rovnováhy se provedly způsobem popsaným v J. Greene et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26761 a v U.S. Patentové přihlášce pořadové 09/579927, a 60/214065, kteréjsou zde uvedeny jako odkazy.
Analýza BIAcore dat
Základní senosorgramy se před analýzou normalizovaly na odezvu nula jednotek (RU). Vzorky se nechaly projít falešně derivatizovanou průtokovou kyvetou pro určení RU hodnot pozadí z důvodu velkých rozdílů v indexu lomu mezi roztoky. Rovnovážné disociační konstanty (Kd) se vypočetly z grafů Req versus C, kde Req je rovnovážná odpověď minus odpověď na falešně derivatizovaném čipu, a C je molámí koncentrace analytu. Vazebné křivky se analyzovaly za použití komerčního softwaru pro hodnocení nelineárních křivek (Prism, GrafPAD Software).
Experimentální data se nejprve upravila pro model vazby jednoho ligandu na jeden receptor (1-místný model, tj., jednoduchý langmuir systém, A+B-AB), a rovnovážné asociační /konstanty (Kd=[A].B] [AB]) se vypočetly z rovnice R=RmaxC/(Kd+C). Potom se data upravila pro nejjednodušší model vazby ligandu na dvě místa (tj., pro receptor mající dvě neinteragující/nezávislá vazebná místa, jak je popsán rovnicí R=Rmaxl.C(Kdi+C)+Rmax2.C(Kd2+C).
Přiléhavost těchto dvou modelů se analyzovala vizuálně srovnáním s experimentálními daty a statisticky za použití F testu součtu čtverců. Jednodušší jednocestný model byl vybrán jako lepší, pokud nevyhovoval dvou-místný model významně lépe (p<0.1).
Asociační a disociační analýzy se provedly za použití BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Asociační rychlostní konstanty kon se vypočítaly dvěma způsoby, za předpokladu homogenní interakce na jednom místu a paralelní interakce na dvou místech. Pro interakce na jednom místě se hodnoty kon vypočetly podle rovnice Rt=Req(l-exp-ks(Wo), kde R, je odpověď za daný čas, t; Rcq je rovnovážná odpověď; t0 je čas na začátku injekce; a ks/dR/dt=k0n.Ck0ff; kde C je koncentrace analytu vypočtená ve smyslu monomerních vazebných míst. Pro interakce na dvou místech se hodnoty kon vypočetly podle rovnice R,=Reql(l-exp-k_ks(t'to)+Req2(l-exp_ks(,’to)). Pro každý model se hodnoty kon určily pro vypočtený sklon (přibližně do 70% maximální asociace) grafu ks versus C.
. 98 .
Disociační data se analyzovala za použití jednomístného (AB=A+B) a dvoumístného modelu (AiBj=Ai+Bj), a rychlostní konstanty (kot) se vypočetly z nejlépe odpovídajících křivek. Použil se model vazebného místa, pokud nebyla residua větší než základní hodnoty přístroje (2-10 RU podle přístroje), kdy se použil model dvou vazebných míst. Poločasy obsazení receptoru se vypočetly podle vztahu ^/2=0,693¼^.
Průtoková cytometrie
Myší mAb L307.4 (anti-CD80) se zakoupila od Becton Dickinson (San Jose, Califomia) a IT2.2 (anti-B7-0 [též CD86]), od Pharmingen (San Diego, Kalifornie). Pro imunobarvení se CD80-pozitivní a/nebo CD86-pozitivní CHO buňky odstranily z kultivačních nádob inkubací v fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) obsahujícím 10 mM EDTA. CHO buňky (1-10 x 105) se nejprve inkubovaly s mAb nebo imunoglobulinovými fúzními proteiny v DMEM obsahujícím 10% fetální hovězí sérum (FBS), potom se promyly a inkubovaly se s kozím anti-myším nebo anti-lidským imunoglobulinem konjugovaným s fluoresceinem isothiokyanátem jako činidlem druhého stupně (Tágo, Burlingame, Kalifornie). Získané buňky se promyly a analyzovaly se na FACScan (Becton Dickinson).
SDS-PAGE a chromatografie s vylučováním podle velikosti
SDS-PAGE se provedla na Tris/glycinových 4 až 20% akrylamidových gelech (Novex, San Diego, Kalifornie). Analytické gely se barvily Coomassie Blue, a obrazy vlhkých gelů se dostaly digitálním skenováním. CTLA4Ig (25 pg) a L104EA29YIg (25 pg) se analyzovaly chromatografií s vylučováním podle velikosti za použití TSK-GEL G300 SWXL kolony (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) uvedené do rovnováhy ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku obsahujícím 0,02% NAN3 při rychlosti průtoku 1,0 ml/min.
CTLA4XCi2os a LlO4EA29YXCi2os
Jednořetězcová CTLA4XCi2os se připravila způsobem popsaným dříve (Litisiey et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). Stručně, expresní plazmid pro onkostatin M CTLA4 (OMCTLA4) se použil jako templát, původní primer, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEQ ID NO: 4), byl vybrán tak, aby odpovídal sekvencím ve vektoru; a reversní primer, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEQ ID NO: 5), odpovídal posledním sedmi aminokyselinám (tj. aminokyselinám 118-124) v extracelulámí doméně CTLA4, a obsahoval místo pro restrikční enzym a stop kodon (TGA). Reversní primer určoval C120S (cystein na serin v pozici 120) mutaci. Konkrétně, nukleotidová sekvence GCA (nukleotidy 34-36) reversního primeru uvedeného výše se nahradila jednou z následujících nukleotidových sekvencí: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, nebo GCT. Jak bude odborníkům v oboru jasné, nukleotidová sekvence GCA je revertovaná komplementární sekvence kodonu TGC pro cystein. Podobně, nukleotidové sekvence AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, nebo GCT jsou revertované komplementární sekvence kodonů pro serin. Produkty polymerázové řetězové reakce se trávily HindlII/Xbal a přímo se subklonovaly do expresního vektoru píLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YCc'os was prepared in an identical manner. Každý konstrukt se ověřil DNA sekvenováním.
Identifikace a biochemická charakterizace mutantů s vysokou aviditou aminokyselin se vybralo pro mutagenesi a vzniklých asi 2300 mutantních proteinů se testovalo na CD86Ig vazbu pomocí povrchové plasmonové resonance (SPR; jak je popsána výše). Predominantní efekty mutagenese v každém místě jsou shrnuty v tabulce II, dále. Náhodná mutagenese některých aminokyselin v CDR-1 regionu (S25-R33) jasně neměnila vazbu na ligand. Mutagenese E31 a R33 a zbytků M97-Y102 vedla ke snížení vazby ligandu. Mutagenese zbytků S25, A29, a T30, K93, L96, Y103, LI04 a G105 vedla ke vzniku proteinů pomalou
-29CZ 303959 B6 „asociací“ a/nebo pomalou „disociaci“. Tyto výsledky potvrzují dřívější zjištění, že zbytky vCDR-1 (S25-R33) regionu, a zbytky v nebo poblíž M97-Y102, ovlivňují vazbu ligandů (Peach etal., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).
Mutagenese míst S25, T30, K93, L96, Y103 a G105 vedla k identifikaci některých mutantních proteinů, které mají pomalejší disociaci zCD86Ig. Nicméně, v těchto případech byla pomalejší disociace spojena s pomalou asociací, což vedlo k zisku mutantních proteinů, jejichž celková avidita pro CD861g byla podobná jako u přirozeného CTLA4Ig. Dále, mutagenese K93 vedla k významné agregaci, která může být odpovědná za pozorované změny kinetiky.
Náhodná mutagenese L104 následovaná transfekcí COS buněk a testováním vzorků kultivačního media na imobilizovaném CD86Ig pomocí SPR vedly k zisku šesti vzorků media obsahujících mutantní proteiny s přibližně 2-krát pomalejší disociaci než má přirozený CTLA4Ig. Když se sekvencovaly příslušné cDNA těchto mutantů, bylo u každého zjištěno, že kóduje leucin na kyselinu glutamovou mutaci (L104E). Je zřejmé, že substituce leucinu 104 na kyselinu asparagovou (L104D) neovlivňuje vazbu CD86Ig.
Mutagenese se potom opakovala pro každé místo uvedené v tabulce II, tentokrát za použití L104E jako PCR templátu místo přirozeného CTLA41g, jak bylo popsáno výše. SPR analýza, opět za použití imobilizovaného CD86Ig, identifikovala šest vzorků kultivačního media z mutagenese alaninu 29 s proteiny majícími přibližně 4-krát pomalejší disociaci než přirozený CTLA4Ig. Dva nejpomalejší měly substituce tyrosinu (L104EA29Y), dva leucinu (L104EA29L), jeden tryptofanu (L104EA29W), a jeden threoninu (L104EA29T). Nebyly identifikovány žádné mutanty s pomalou disociaci, když byl mutován pouze alanin 29 v přirozeném CTLA4Ig.
Relativní molekulová hmotnost a stav agregace přečištěného L104E a L104EA29YIg se hodnotily SDS-PAGE a chromatografií s vylučováním podle velikosti. L104EA29YIg (1 pg; dráha 3) a L104EIg (1 pg; dráha 2) měly stejnou elektroforetickou mobilitu jako CTLA4Ig (1 pg; dráha 1) za redukujících (50 kDa; +betaME; plus 2-merkaptoethanol) a neredukujících (100 kDa; betaME) podmínek (obr. 25A). Chromatografie s vylučováním podle velikosti ukázala, že L104EA29YIg (obr. 25C) má stejnou mobilitu jako dimemí CTLA4Ig (obr. 25B). Hlavní píky představují proteinový dimer, zatímco rychleji eluovaný menší pík na obr. 25B představuje agregáty s vyšší molekulovou hmotností. Přibližně 5,0% CTLA4Ig bylo přítomno ve formě agregátů s vyšší molekulovou hmotností, ale nebyly pozorovány důkazy agregace L104EA29YIg nebo L104Elg. Proto nemůže být silnější vazba na CD86Ig pozorovaná u L104Elg a L104EA29Yíg přisouzena agregaci indukované mutagenesí.
Analýza rovnováhy a kinetiky vazby
Analýza rovnováhy a kinetiky vazby se provedla na proteinem A přečištěných CTLA4Ig, L104EIg, a L104EA29YIg za použití povrchové plasmonové resonance (SPR). Výsledky jsou uvedeny v tabulce I, dále. Pozorované rovnovážné disociační konstanty (Kd; Tabulka I) byly vypočteny z křivek vazby získaných za použití různých koncentrací (5,0-200 nM). L104EA29YIg se váže silněji na CD86Ig než L104EIg nebo CTLA4Ig. Nižší Kd pro L104EA29YIg (3,21 nM) než L104EIg (6,06 nM) nebo CTLA4Ig (13,9 nM) ukazuje na vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg k CD86Ig. Nižší Kd pro L104EA29YIg (3,66 nM) než L104EIg (4,47 nM) nebo CTLA4Ig (6,51 nM) ukazuje na vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg k CD80Ig.
Analýza kinetiky vazby ukázala, že rychlosti asociace CTLA4Ig, L104EIg a L104EA29YIg na CD80 byly podobné, stejně jako rychlosti asociace pro CD861g (Tabulka I). Nicméně, rychlosti disociace pro tyto molekuly nebyly ekvivalentní (Tabulka I). Ve srovnání s CTLA4Ig měl L104EA29YIg přibližně 2-krát nižší rychlost disociace zCD801g, a přibližně 4krát nižší rychlost disociace zCD86Jg. L10E má rychlost disociace mezi L104EA29YIg a CTLA4Ig.
Protože vkládání těchto mutací neovlivňuje významně rychlosti asociace, je za zvýšení avidity pro CD80Ig a CD86Ig u L104EA29Ylg primárně odpovědné snížení rychlosti disociace.
Pro určení toho, zda zvýšení avidity L104EA29YIg pro CD86Ig a CD80Ig je způsobeno mutacemi postihujícími způsob asociace monomerů v dimer, nebo strukturálními změnami zesilujícími aviditu v každém monomeru, se připravily jednořetězcové konstrukty CTLA4 a L104EA29Y extracelulámí domény po mutagenesi cysteinu 120 na serin, jak je popsáno výše a v Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424 (84). Přečištěné proteiny CTLAA4Xc1295 a L104EA29YXcl205 se analyzovaly jako monomem!, podle gelové permeační chromatografie (Linsley et al., (1995), výše), před tím, než byly jejich vazebné vlastnosti analyzované SPR. Výsledky ukázaly, že vazebná afinita obou monomemích proteinů pro CD86Ig byla přibližně 35-80-krát nižší než pro příslušné dimery (Tabulka CTLA4 je nutná pro vysokou aviditu vazby Iigandu (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762-26771).
L104EA29YXcl205 se váže s přibližně 2krát vyšší afinitou než CTLA4Xcl205 jak na CD80Ig, tak na CD86Ig. Vyšší afinita je způsobena přibližně 3-krát nižší rychlostí disociace z obou ligandů. Proto je silnější vazba Iigandu L104EA29Y s největší pravděpodobností způsobena strukturálními změnami ovlivňujícími aviditu, které byly vloženy do každého monomerního řetězce, a ne alteracemi dimerizace molekuly.
Analýza pozice a struktury mutací zvyšujících aviditu
Struktura extracelulámí IgV-like domény CTLA4 byla nedávno určena NMR spektroskopií (Metzler et al., (1997) Nátuře Stmět. Biol., 4:527-531). Toto umožnilo přesné určení leucinu 104 a alaninu 29 ve trojrozměrném složení (obr. 26, pravý a levý obrázek). Leucin 104 je situován poblíž vysoce konzervované MYPPPY aminokyselinové sekvence. Alanin 29 je situován poblíž C-terminálního konce CDR-1 (S25-R33) regionu, který prostorově sousedí s MYPPPY regionem. Zatímco je jednoznačná interakce mezi zbytky v bázi těchto dvou regionů, není přítomná interakce mezi LI04 a A29, ačkoliv jsou oba součástí hydrofobního jádra proteinu. Strukturální následky dvou mutací zvyšujících aviditu byly hodnoceny modelováním. A29Y mutace může být snadno vložena do mezery mezi CDR-1 (S25-R33) region a MYPPPY region, a může sloužit pro stabilizaci N4YPPPY regionu. V přirozeném CTLA4 tvoří L104 extensivní hydrofobní interakce s L96 a V94 poblíž MYPPPY regionu. Je značně nepravděpodobné, že by mutace kyseliny glutamové způsobovaly konformaci podobnou jako LI04, a to ze dvou důvodů. Za prvé, není dostatek prostoru pro delší vedlejší řetězec kyseliny glutamové ve struktuře bez významného narušení CDR—1 (S25—R33 regionu). Za druhé, energetické nároky na negativní náboj vedlejšího řetězce kyseliny glutamové v hydrofobním regionu jsou značné. Místo toho modelování předpovídá, že vedlejší řetězec kyseliny glutamové vyčnívá na povrch, kde může být jeho náboj stabilizován solvatací. Taková změna konformace může být snadno upravena G105, s minimálním narušením dalších zbytků v regionech.
Vazba mutantů s vysokou aviditou na CHO Buňky exprimující CD80 nebo CD86
FACS analýza (obr. 27) CTLA4Ig a analýza vazby mutantní molekuly na stabilně transfekované CD80+ a CD86+ CHO buňky se provedla následujícím způsobem. CD80-pozitivní a CD86pozitivní CHO buňky se inkubovaly se stoupajícími koncentracemi CTLA4Ig, L104EA29YIg, nebo L104EIg, a potom se promyly. Navázaný imunoglobulinový fúzní protein se detekoval za použití kozího anti-lidského imunoglobulinu navázaného na fluorescein isothiokyanát.
Jak je ukázáno na obr. 27, CD80-pozitivní nebo CD86-pozitivní CHO buňky (1,5x106) se inkubovaly s uvedenými koncentracemi CTLA41g (plné čtverečky), L104EA29YIg (kroužky), nebo L104EIg (trojúhelníčky) po dobu 2 hodin při 230C, promyly se a inkubovaly se s kozím anti-lidským imunoglobulinem navázaným na fluorescein isothiokyanát. Vazba na celkem 5000 živých buněk se analyzovala (jedno měření) za použití FACScan, a průměrná intenzita fluorescence (MFI) se určila z histogramů za použití PC-LYSYS. Data se korigovala na
-31 CZ 303959 B6 fluorescenci pozadí měřenou na buňkách inkubovaných pouze s činidlem druhého kroku (MET 7). Kontrolní L6 mAb (80 pg/ml) měla MFI < 30. Tyto výsledky jsou reprezentativní výsledky ze čtyř nezávislých pokusů.
Vazba L104EA29YIg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské CD80-transfektované CHO buňky je přibližně ekvivalentní (Obr. 27A). L104EA29YIg a L104EIg se váží silněji na CHO buňky stabilně transfektované lidským CD86 než CTLA4Ig (obr. 27B).
Funkční testy
Lidské CD4-pozitivní T-lymfocyty se izolovaly imunomagnetickou negativní selekcí (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Izolované CD4-pozitivní T-lymfocyty se stimulovaly forbolmyristátacetátem (PMA) plus CD80-pozitivními nebo CD86-pozitivními CHO buňkami za přítomnosti titračních koncentrací inhibitoru. CD4-pozitivní T-lymfocyty (8-10 x 104/jamku) se kultivovaly za přítomnosti 1 nM PMA s nebo bez ozářených stimulačních CHO buněk. Proliferativní reakce se měřily přidáním luCi/jamku [3H]thymidinu během posledních 7 hodin 72 hodinové kultivace. Provedla se inhibice PMA plus CD80-pozitivními CHO, nebo CD86pozitivními CHO, stimulovaných T-lymfocytů za použití L104EA29YIg a CTLA4Ig. Výsledky jsou uvedeny na obr. 28. L104EA29YIg inhibuje proliferaci CD80-pozitivních PMA ošetřených CHO buněk více než CTLA4Ig (obr. 28A). L104EA29YJg je také účinnější než CTLA4Ig v inhibování proliferace CD86-pozitivních PMA ošetřených CHO buněk (obr. 28B). Proto je L104EA29YIg účinnější inhibitor CD80- i CD86-zprostředkované kostimulace T-lymfocytů.
Obr. 29 ukazuje inhibici allostimulovaných lidských T-lymfocytů L104EA29YIg a CTLA4Ig, a kde tyto T-lymfocyty byly dále allostimulované lidskou B lymfoblastoidní buněčnou linií (LCL) označovanou jako PM, která exprimuje CD80 a CD86 (T-lymfocyty v koncentraci 3,0xl0/jamku a PM při koncentraci 8,0x103/jamku). Primární allostimulace probíhala po dobu 6 dnů a potom se buňky pulsovaly 3H-thymidinem po dobu 7 hodin před tím, než se určovala inkorporace radioaktivního markéru.
Druhá allostimulace se provedla následujícím způsobem. Sedm dnů primárně allostimulované T-lymfocyty se odebíraly přes lymfocytámí separační medium (LSM) (JCN, Aurora, OH) a nechaly se v klidu po dob u 24 hodin. T-lymfocyty se potom restimulovaly (sekundárně), za přítomnosti titračních množství CTLA4Ig nebo L104EA29YTg, přidáním PM ve stejném poměru jako výše. Stimulace probíhala po dobu 3 dnů a potom se buňky pulsovaly radioaktivním markérem a odebraly se způsobem uvedeným výše. Efekt L104EA29YIg na primárně allostimulované T-lymfocyty je uveden na obr. 29A. Efekt L104EA29YIg na sekundárně allostimulované T-lymfocyty je uveden na obr. 29B. L104EA29YIg inhibuje jak primární, tak sekundární proliferativní reakce T— lymfocytů lépe než CTLA4Ig.
Pro měření produkce cytokinů (Obr. 30) se provedly dvojité sekundární allostimulace. Po třech dnech se kultivační medium testovalo za použití ELISA kitů (Biosource, Camarillo, CA) za použití podmínek doporučovaných výrobcem. Bylo zjištěno, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v blokování produkce IL-2, 1L—4 a gamma-IFN cytokinů T-lymfocyty po sekundárním allogením podnětu (Obr. 30A-C).
Efekty L104EA29YIg a CTLA4Ig ona reakci směsi opičích lymfocytů (MLR) jsou uvedeny na Obr. 31. Monoklonální buňky periferní krve (PBMC; 3,5x104 buněk/jamku od každé opice) od dvou opic se přečistily přes lymfocytámí separační medium (LSM) a smísily se s 2 pg/ml fytohemaglutininu (PHA). Buňky se stimulovaly 3 dny a potom se pulsovaly radioaktivním markérem po dobu 16 hodin před tím, než se odebraly. L104EA29YIg inhiboval proliferaci opičích T-lymfocytů lépe než CTLA4Ig.
Tabulka I:
Následující tabulka ukazuje rovnovážné a kinetické konstanty (hodnoty jsou průměry standardní odchylka ze tří různých pokusů):
Imobilizovaný protein Analyt Řon (x 105) AOff (x UT3) Ka
N1 nM
CD80Ig CTLA4Ig 3.44 ± 0.29 2.21 ±0.18 6.51 ± 1.08
CD80Ig L104EIg 3.02 ± 0.05 1.35 ±0.08 4.47 ± 0.36
CD80Ig L104EA29YIg 2.96 ± 0.20 1.08 ±0.05 3.66 ±0.41
CD80Ig CTLA4Xci2os 12.0 ± 1.0 230 ±10 195 ±25
CDSOIg L1O4EA29YXc[2os 8.3 ± 0.26 71 ±5 85.0 ±2.5
CD86Ig CTLA4Ig 5.95 ± 0.57 8.16 ±0.52 13.9 ± 2.27
CD86lg L104EIg 7.03 ± 0.22 4.26 ±0.11 6.06 ± 0.05
CD86Ig L104EA29YIg 6.42 ± 0.40 2.06 ±0.03 3.21 ±0.23
CD86lg CTLA4Xct2os 16.5 ±0.5 840 ± 55 511 ± 17
CD86Ig L1O4EA29YXCi2os 11.4 ± 1.6 300 ± 10 267 ± 29
-33 CZ 303959 B6
Tabulka II
Efekt mutagenese CTLA4Ig v uvedených místech na vazbu na CD86Ig určený SPR, jak je popsána výše převládající účinek je označen
Místo mutagenese Efekt mutagenese
Bez efektu Jasné zpomalení asociace/ zpomalení disociace Redukovaná vazba ligandu
S25 +
P26 +
G27 +
K28 -r
A29 1
T30 4
E31 +
R33 +
K93 4-
L96 +
M97 +
Y98 Ί-
P99 Α
P100 +
mm
f 1VI -r
Y102 +·
YI03 4
LI 04 _L
G105
1106 -ř
G107
QH1 +
Y113 +
nis
Příklad 3
Následující příklad popisuje klinické studie fáze II na pacientech, kterým byla podávána solubilní CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg (též označovaná jako LEA29Y nebo LEA) nebo
Λ
CTLA4Ig, pro zmírnění alespoň jednoho příznaku asociovaného s revmatoidní artritis, včetně redukce: otoku kloubů, citlivost kloubů, zánětu, ranní ztuhlosti a bolesti. Použitá CTLA4Ig molekula začíná methioninem v pozici +1 (nebo alternativně alaninem v pozici -1) a končí lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na Obr. 24. DNA kódující provedení CTLA4Ig molekuly byla uložena pod ATCC 68629. Použitá L104EA29YIg molekula začíná methioninem v pozici + 1 (nebo alternativně alaninem v pozici -1) a končí lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na Obr. 19. DNA kódující provedení L104EA29YIg molekuly byla uložena pod ATCC PTA 2104.
Dále tento příklad popisuje pacienty, kterým byl podán L104EA29YIg nebo CTLA4Ig pro zmírnění alespoň jednoho biologického markéru asociovaného s revmatoidní artritis, včetně snížení sedimentace erytrocytů, sérové koncentrace C-reaktivního proteinu a/nebo IL2 receptoru.
Kohorty pacientů
Na studii participovalo celkem 214 pacientů, 54 mužů a 160 žen (Obr. ΙΑ, IB). Pacienti měly na začátku průměrné trvání onemocnění 3,4 (2,0) roku a měly za sebou selhání alespoň jednoho antirevmatika modifikujícího onemocnění (DMARD). Bylo povoleno současné užívání nesteroidních protizánětlivých léků (NSAIDS) nebo steroidů (10 mg/den) a současné podávání DMARDS bylo zakázáno. Pacienti byli randomizováni do skupin po 25 až 32 pacientech na skupinu. 32 pacientů dostávalo placebo, 92 dostávalo L104EA29YIg a 90 dostávalo CTLA4Ig. Pacienti, jejichž léčba probíhala podle protokolu a nepřerušily léčbu do dne 57 dostaly celkem 4 intravenosní infúze, vždy jednu infusi v den 1, 15, 29 a 57. Všichni pacienti byly hodnoceni v den 1, 15, 29, 43, 57, 71 a 85. Podané dávky byly 0,5, 2,0 nebo 10,0mg/kg L104EA29YIg (označeno jako LEA.5, LEA2 a LEA10, v příslušném pořadí na Obr. 1A-1E) nebo CTLA4Ig (označeno jako CTLA.5, CTLA2 a CTLA10, v příslušném pořadí na obr. 1A-1E).
Všichni jedinci byly sledováni na peri-infúzní nežádoucí účinky za použití otázek a dotazníku na potenciální nežádoucí účinky. Pacienti byli dotazováni na potenciální nežádoucí účinky, které se mohou vyskytovat během 24 hodin po infusi. Dále byli pacienti vyzváni, aby spontánně udávali jakékoliv nežádoucí účinky, které pociťovali. Lékaři rutině monitorovaly laboratorní vzorky od pacientů na abnormality v biochemii a hematologii, např. hodnotili koncentrace mediátorů zánětu, jako jsou cytokiny (TNF, IL-6), tryptasa a komplement. Primárním cílem byl podíl pacientů splňujících ACR 20 kriteria v den 85.
Skladování testovacích materiálů
CTLA4Ig a L104EA29YIg byly dodány ve skleněných lékovkách pro jedno použití obsahujících 200 mg/lékovku CTLA4Ig nebo 100 mg/lékovku L104EA29YIg, v příslušném pořadí. Před infusi se CTLA4Ig a L104EA29YIg naředily na konečnou koncentraci 25 mg/ml sterilní vodu pro injekce (SWFI).
Protokol pro aplikaci
Všechny infúze byly podány intravenosně během 1 hodiny (Obr. 1 až 17). Všichni jedinci dostávaly alespoň jednu infúzi studované medikace.
Skupina 1: 32 pacientů, placebo odpovídající CTLA4Ig nebo L104EA29YIg.
Skupina 2: 26 pacientů; dávka 0,5 mg/kg CTLA4lg.
Skupina 3: 32 pacientů; dávka 2,0 mg/kg CTLA4Ig.
Skupina 4: 32 pacientů; dávka 10,0 mg/kg CTLA4Ig.
Skupina 5: 32 pacientů; dávka 0,5 mg/kg L104EA29YIg.
-35CZ 303959 B6
Skupina 6: 29 pacientů; dávka 2,0 mg/kg L104EA29YIg. Skupina 7: 31 pacientů; dávka 10,0 mg/kg L104EA29YIg.
Klinické sledování
Pacienti byli hodnoceni na výchozí hodnoty aktivity onemocnění před tím, než jim byla podána jakákoliv infuse. Základní hodnocení zahrnovalo: otok kloubů, citlivost kloubů, zánět, ranní ztuhlost, aktivitu onemocnění hodnocenou pacientem a lékařem, stejně jako omezení pohyblivosti hodnocené podle Health Questionnaire Assessment (HAQ) (uvedeno jako skóre funkcí podle lékaře na Obr. 1C), a bolesti (Obr. 1A až ID). Dále mezi základní vyšetření patřila sedimentace erytrocytů (ESR) a sérová koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) a solubilního IL-2 receptorů (IL—2r) (Obr. 1C a ID).
Klinická odpověď ve studii byla hodnocena podle kriterií daných Americal College of Rheumatology (ACR). Jedinec splňoval ACR20 kriterium, pokud došlo ke 20% zlepšení v citlivosti a otoku kloubu a ke 20% zlepšení ve třech z pěti zbývajících měřených příznaků, jako jsou celkové změny onemocnění, bolest, neschopnost a reaktanty akutní fáze (Felson, D. T., et al., 1993 Artritis a Rheumatism 36:729-740; Felson, D. T., et al., 1995 Artritis a Rheumatism 38:1-9).
Biologické markéry
Hodnoceny byly také potenciální biomarkery aktivity onemocnění (revmatoidní faktor, CRP, ESR, solubilní IL-2R, solubilní ICAM-1, solubilní E-selektinu a MMP-3). zavedené imunotesty (EIA) byly použity pro stanovení sérových koncentrací IL2sRalfa, sICAM-1, sE-selektinu a MMP-3. TNFalfa a IL6 byly hodnoceny před infusí a 2 hodiny po infusi, pokud to bylo nutné.
IL-2sRalfa, sICAM-1 a sE-selektin se měřily za použití komerčně dostupných kolorimetrických EIA kitů od R&D Systems, lne. (Minneapolis, MN). Dolní a horní limity měření byly 312 až 20000 pg/ml, 40 až 907 ng/ml a 10 až 206 ng/ml, v příslušném pořadí. Koeficient variace mezi testy byl v rozmezí od 4,48 až 8,4 %, 3,8 až 5,0% a 5,5 až 9,0%, v příslušném pořadí. Podle výrobce kitu jsou normální sérové koncentrace v rozmezí 676 až 2132 pg/ml, v příslušném pořadí.
MMP-3 se měřila za použití komerčně dostupného kolorimetrického EIA kitu od Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Dolní a horní limity měření byly 30 až 7680 ng/ml. Koeficient variace mezi testy byl v rozmezí od 6,3 až 10,6. Podle výrobce kitu jsou normální sérové koncentrace v rozmezí 28 až 99 ng/ml.
IL—6 a TNFalfa se měřily za použití komerčně dostupných chemiluminscentních EIA kitů od R&D Systems, lne. (Minneapolis, MN). Dolní a horní limity měření byly 0,3 až 3000 pg/ml a 0,7 až 7000 pg/ml, v příslušném pořadí. Koeficient variace mezi testy byl v rozmezí od 3,1 až 5,7% a 6,4 až 20,7%, v příslušném pořadí. Podle výrobce kitu jsou normální sérové koncentrace v rozmezí 0,-12 pg/ml a 0,7 až 7,5 pg/ml, v příslušném pořadí.
Testování protilátek
Vzorky séra se odebraly pro hodnocení protilátek specifických pro lék před aplikací v den 1 a přibližně ve dny 15, 29, 57, 85 a 169. Vzhledem k vysokým, preexistujícím titrům namířeným proti imunoglobulinové (Ig) části molekuly se také hodnotila specifická protilátka proti CTLA4Ig a LEA29Y bez Ig konstantních regionů.
96jamkové Immulon II ELISA plotny (Dynex, Chantilly, Virginía) se potáhly CTLA4Ig, CTLA4Ig bez Ig konstantních regionů, LEA29Y, nebo LEA29Y bez Ig konstantních regionů v koncentraci 2, 4, 2 nebo pg/ml ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS), v příslušném pořadí, a provedla se inkubace přes noc při 2 až 8 °C. Plotny se promyly PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 a blokovaly se po dobu 1 hodiny při 37 °C PBS obsahujícím 1% hovězí sérový albumin (BSA). Plotny se potom promyly a sériová ředěním testovaného séra nebo kontrolního (QC) séra se přidaly do vhodných jamek a provedla se inkubace po dobu 2 hodin při 37 °C. Sérum se naředilo třikrát v PBS s 0,25% BSA a 0,05% Tween 20, od ředění 1:10. Plotny se promyly a přidala se směs kozích protilátek proti lidským kappa a lambda řetězcům konjugovaných s alkalickou-fosfatasou (Sothem Biotechnology Associates, lne., Birmingham, Alabama). Po 1 hodině inkubace při 37 °C se plotny promyly a 1 mg/ml para-nitrofenyl-fosfát v diethanolaminovém pufru se přidal do každé. Po 30 minutách při 25 °C se reakce ukončila 3N NaOH a změřila se absorbance (dvě vlnové délky: 405 nm a 550 nm). Výsledky byly vyjádřeny jako konečný titr (EPT), který je definován jako převrácená hodnota nejvyššího ředění, které vedlo k absorbanci pětkrát vyšší než je základní absorbance. Základní absorbance plotny se určila jako absorbance za nepřítomnosti séra. Hodnoty se považovaly za pozitivní na serokonverzi tehdy, pokud byly alespoň o dvě sériová ředění (9krát) nebo vícekrát vyšší než hodnoty EPT před aplikací dávky. QC vzorky séra pozitivní na CTLA4Ig- nebo LEA29Y-specifickou protilátku se připravily od imunizovaných opic. Podíly vhodných QC vzorků se testovaly během každého analytického měření. Analytická měření se akceptovala pouze tehdy, když byly QC vzorky v přijatelných hranicích.
Výsledky
CTLA4Ig a L104EA29YIg byly při nízkých dávkách dobře tolerovány. Peri-infusní nežádoucí účinky byly podobné ve všech skupinách, s výjimkou bolestí hlavy. Bolest hlavy se u pacientů v den 85 zvyšovala v závislosti na dávce, 23 %, 44 % a 53 % u CTLA4Ig-léčených pacientů, a 34%, 45 % a 61 % u L104EA99YIg-léčených pacientů, při dávce 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v příslušném pořadí. Naopak, 31 % pacientů, kterým bylo podáváno placebo, udávalo bolest hlavy.
Procento pacientů, kteří byli vyřazeni z klinické studie v důsledku zhoršení artritidy, je shrnuto na Obr. 2. Mnohem vyšší procento pacientů na placebu přerušilo léčbu v důsledku zhoršení artritidy. Pacienti léčení CTLA4Ig přerušovali léčbu méně se stoupající dávkou. Velmi málo pacientů léčených L104EA29YIg přerušilo léčbu. Tyto výsledky ukazují na dobrou inverzní závisí ost odpovědi na dávce pro CTLA4Ig, a lepší terapeutickou odpověď na terapii L104EA29YIg.
ACR-20, -50 a-70 odpovědi pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg, nebo placebem v den 85 jsou shrnuty na Obr. 3A. Obdobně, obr. 3B a C popisují ACR-20 reakce s 95% intervalem spolehlivosti. Odpovědi se zdají být závislé na dávce s jasnou signifikantní reakcí při 10 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.
Procento pacientů s redukcí otoku a citlivosti kloubu ve srovnání s pacienty nemajícími žádnou odezvu na léčbu CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, je uvedeno na obr. 4A a B. Terapeutická odpověď se zdá být závislá na dávce. Větší procento pacientů vykazuje zlepšení o 20, 50, 70 a dokonce i 100 % při 2 a 10 mg/kg obou produktů.
Procento pacientů s redukovanou bolestí, aktivitou onemocnění podle pacienta a skóre dle lékaře při léčbě CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, je uvedeno na obr. 5A, B, C a D. Terapeutické odpovědi, monitorované podle Likertova skóre, se zdají být závislé na dávce a jsou lepší pro skupiny s aktivní léčbou než skupiny s placebem v den 85. Likertovo skóre je zavedené verbální skóre pro hodnocení příznaků (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Artritis and Rheumatism, June 1993, 36(6): 729-740).
- 37 CZ 303959 B6
Změny hodnocení aktivity onemocnění pacientem a lékařem o alespoň dvě jednotky od výchozí hodnoty při léčbě CTLA41g, L104EA29YIg nebo placebem, jsou uvedeny na obr. 6A a B. Odpovědi se zdají být závislé na dávce s výraznějším zlepšením při vyšších dávkách aktivních léků.
Procentuální snížení koncentrací C-reaktivního proteinu (CRP) u pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, jsou uvedeny na obr. 7A a B. Odpovědi se zdají být závislé na dávce s jasným snížením pro skupiny léčené 2 a 10 mg/kg aktivního léku. Dále, obr. 7B ukazuje, že rozdíl je dosti signifikantní ve srovnání s placebem v 95% intervalech spolehlivosti. Obr. 7C ukazuje změny sérových koncentrací ve srovnání s výchozí hodnotou v den 85.
Sérové koncentrace solubilního IL-2 receptoru u pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, jsou uvedeny na obr. 8. Snížení koncentrace solubilního IL-2 receptoru se zdá být závislé na dávce.
Sérové koncentrace solubilního ICAM-1 a solubilního E-selektinu u pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem jsou uvedeny na obr. 33. Snížení koncentrací solubilního ICAM-1 a solubilního E-selektinu se zdá být závislé na dávce.
Medián a průměr počtu citlivých kloubů u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 9A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce citlivých kloubů) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Medián a průměr počtu oteklých kloubů u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 10A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce počtu oteklých kloubů) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Průměrná skóre hodnocení bolesti u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem jsou uvedena na obr. 11. Změny od základní hodnoty (např. redukce bolesti) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Průměrná skóre aktivity onemocnění podle lékaře a pacienta u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 12A a B. Změny od základní hodnoty (např. snížení aktivity onemocnění) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Medián a průměr počtu citlivých kloubů u pacientů léčených L104EA29YIg (označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 13A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce počtu citlivých kloubů) se zdají být závislé na dávce.
Medián a průměr počtu oteklých kloubů u pacientů léčených L104EA29YIg (označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 14A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce počtu oteklých kloubů) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Průměrná skóre bolesti u pacientů léčených L104EA29YIg (označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 15. Změny od základní hodnoty (např. redukce bolesti) se zdají být závislé na dávce.
Průměrná skóre aktivity onemocnění podle lékaře nebo pacienta u pacientů léčených L104EA29YIg (označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 16A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce aktivity onemocnění) se zdají být závislé na dávce.
o
Procentuální zlepšení fyzické nezpůsobilosti podle HAQ v den 85 pro pacienty léčené CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem je uvedeno na obr. 17 (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 9:789-793). Je patrná jasná závislost tohoto zlepšení na dávce.
Změny v koncentraci solubilního IL-2r a C-reaktivního proteinu vzhledem k výchozí hodnotě byly závislé na dávce v obou léčených skupinách. Po léčbě byly koncentrace solubilního IL-2r-2%, -10% a-22% pro CTLA4Ig a-4%, -18% a-32% pro L104EA29YIg, při dávce 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v příslušném pořadí, ve srovnání s +30% pro placebo. Koncentrace C-reaktivního proteinu byly -12%, -15% a -32% pro CTLA4Ig a +47%, -33% a -47% pro L104EA29YIg při dávce placebo (Obr. 7A).
Žádné klinicky významné zjištění s ohledem na běžné hematologické parametry, biochemické laboratorní nálezy (s výjimkou mírného snížení koncentrací IgA a IgG při vyšších dávkách), nebo s ohledem na vitální funkce nebyly pozorovány. Důležité je, že žádná medikace neindukovala protilátky specifické pro lék.
Příklad 4
Následující příklad popisuje klinické studie fáze II provedené na lidských pacientech, kterým byl podáván L104EA29YIg za účelem redukce nebo prevence strukturálního poškození, včetně eroze kosti nebo kloubu, při hodnocení za použití zavedených radiografických stupnic. Toto zlepšení v redukci nebo prevenci strukturálního poškození je paralelní ke klinickému zlepšení měřenému podle klinických parametrů.
Stav struktury kosti se sledoval u některých pacientů před léčbou CTLA4Ig nebo L104EA29YIg. Těmto pacientům se chronicky podávalo mezi 0,5 a 20 mg/kg CTLA4Ig nebo L104EA29YIg každé dva až dvanáct týdnů (samostatně nebo v kombinaci s jinými léky) pro udržení terapeutického zlepšení po delší dobu. Rentgenové snímky rukou a nohou pacientů se prováděly v předem určených intervalech: 6 měsíců a potom jednou ročně, jak je doporučováno v FDA guidelines. Tito pacienti byly sledováni dlouhodobě po 6 a 12 měsících pro určení toho, zda léčba CTLA4Ig nebo L104EA29YIg redukuje progresi kostního postižení, a potom se pacienti sledovali jednou za rok. Pacienti se sledovali za použití radiografických metod, včetně rentgenového vyšetření a/nebo vyšetření magnetickou rezonancí (MRI), standardními způsoby (Larsen, A. K. a M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481-491; Sharp, I. T., et al., 1985 Arthritis a Rheumatism 28: 1326-1335). Výsledky těchto vyšetření jsou hodnoceny z hlediska prevence strukturálního poškození, včetně zpomalení eroze kosti a poškození chrupavek, zúžení kloubních štěrbin a/nebo prevence nových erozí.

Claims (26)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulární doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulární doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu jedince majícího revmatoidní artritidu, kde jedinec má za sebou selhání alespoň jednoho antirevmatika modifikujícího onemocnění (DMARD).
    -39CZ 303959 B6
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde DMARD je methotrexat, cyklofosfonamid, azathioprin, cyklosporin A, blokátor nebo antagonista faktoru nekrosy nádorů alfa (TNF-alfa).
  3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, pro redukci příznaků revmatoidní artritidy.
  4. 4. Použití podle nároku 3, kde příznaky jsou vybrány ze skupiny zahrnující otoky kloubů, citlivost kloubů, zánět, ranní ztuhlost a bolest.
  5. 5. Použití podle jakéhokoli z nároků 1 až 4, kde farmaceutický prostředek je pro podávání solubilní CTLA4 fúzní molekuly v množství 10 mg/kg hmotnosti jedince.
  6. 6. Solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici + 1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro použití při způsobu léčby jedince majícího revmatoidní artritidu, kde jedinec má za sebou selhání alespoň jednoho antirevmatika modifikujícího onemocnění (DMARD).
  7. 7. Použití solubilní CTLA4 fúzní molekuly obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro výrobu farmaceutického prostředku pro redukci nebo prevenci strukturálního poškození jedince majícího revmatické onemocnění.
  8. 8. Použití podle nároku 7, kde strukturálním poškozením je eroze kosti nebo kloubu.
  9. 9. Použití podle nároku 7 nebo 8, kde farmaceutický prostředek je pro podávání solubilní CTLA4 fúzní molekuly v množství mezi 0,5 a 20 mg/kg hmotnosti jedince.
  10. 10. Solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obrázku 19, pro použití při způsobu pro redukci nebo prevenci strukturálního poškození jedince majícího revmatické onemocnění.
  11. 11. Použití prvního činidla a druhého činidla, kde
    a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici + 124, jak je znázorněno na obr. 19, a
    b) druhé činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá činidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu revmatického onemocnění.
  12. 12. Použití podle nároku 11, kde blokátorem nebo antagonistou TNF-alfa je infliximab nebo etanercept.
  13. 13. Použití podle nároku 11 nebo 12, kde farmaceutický prostředek je pro sekvenční nebo konkomitantní podávání prvního a druhého činidla.
  14. 14. Použití podle nároku 7 nebo 11, kde revmatické onemocnění je vybráno z revmatoidní artritidy, polymyositis, sclerodermie, smíšeného onemocnění pojivové tkáně, zánětlivého revmatizmu, degenerativního revmatizmu, extra-artikulámího revmatizmu, onemocnění kolagenu, chronické polyartritidy, psoriasis artropathica, ankylosující spondylitidy, juvenilní revmatoidní artritidy, panarteriitis nodosy, systémového lupus erythematosus, progresivní systémová sklerodermie, periartritis, humeroscapularis, artritis uratica, chondorkalcinosís, dermatomyositis, svalového revmatizmu, myositis a myogelosis.
  15. 15. Použití podle nároku 7 nebo 11, kde revmatickým onemocněním je revmatoidní artritida.
  16. 16. Použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahuje imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část.
  17. 17. Použití podle nároku 16, kde solubilní CTLA4 fúzní molekulou je CTLA41g.
  18. 18. Použití podle nároku 17, kde solubilní CTLA4 fúzní molekulou je CTLA4Ig, začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící lysinem v pozici +357, jak je znázorněno na obrázku 20.
  19. 19. Použití podle nároku 17, kde solubilní CTLA4 fúzní molekulou je CTLA4Ig, kteráje kódovaná molekulou nukleové kyseliny označené ATCC č. 68629.
  20. 20. První činidlo a druhé činidlo, kde
    a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 19, a
    b) druhé činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá činidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro použití pro léčení revmatického onemocnění.
  21. 21. Farmaceutický prostředek obsahující farmaceuticky přijatelný nosič a účinné množství prvního činidla a druhého činidla, kde
    a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahující extracelulámí doménu CTLA4 molekuly, kde extracelulámí doména CTLA4 molekuly obsahuje aminokyseliny začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124, jak je znázorněno na obr. 19, a
    b) druhé činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivá činidla, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory nebo antagonisty TNF-alfa, hydroxychlorochin, sulfasalazin, soli zlata, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid.
  22. 22. Farmaceutický prostředek podle nároku 21, kde blokátorem nebo antagonistou TNF-alfa je infliximab nebo etanercept.
  23. 23. Farmaceutický prostředek podle nároku 21 nebo 22, kde solubilní CTLA4 fúzní molekula obsahuje imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část.
  24. 24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23, kde solubilní CTLA4 fúzní molekulou je CTLA4Ig.
    -41 CZ 303959 B6
  25. 25. Farmaceutický prostředek podle nároku 24, kde solubilní CTLA4 fúzní molekulou je CTLA4Ig, začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící lysinem v pozici +357, jak je znázorněno na obrázku 20.
  26. 26. Farmaceutický prostředek podle nároku 24, kde solubilní CTLA4 fúzní molekulou je CTLA4Ig, která je kódovaná molekulou nukleové kyseliny označené ATCC č. 68629.
CZ20024261A 2000-07-03 2001-07-02 Solubilní CTLA4 fúzní molekula, farmaceutický prostredek s jejím obsahem a její pouzití CZ303959B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21591300P 2000-07-03 2000-07-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20024261A3 CZ20024261A3 (cs) 2004-08-18
CZ303959B6 true CZ303959B6 (cs) 2013-07-17

Family

ID=22804919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20024261A CZ303959B6 (cs) 2000-07-03 2001-07-02 Solubilní CTLA4 fúzní molekula, farmaceutický prostredek s jejím obsahem a její pouzití

Country Status (39)

Country Link
US (1) US7455835B2 (cs)
EP (4) EP3384924A1 (cs)
JP (1) JP2004517806A (cs)
KR (3) KR20030017606A (cs)
CN (1) CN1318086C (cs)
AR (2) AR035037A1 (cs)
AT (1) ATE401909T1 (cs)
AU (2) AU2001273174B2 (cs)
BG (2) BG66024B1 (cs)
BR (1) BR0112104A (cs)
CA (2) CA2630062C (cs)
CY (3) CY1109786T1 (cs)
CZ (1) CZ303959B6 (cs)
DE (1) DE60135029D1 (cs)
DK (2) DK1372696T3 (cs)
EE (1) EE05378B1 (cs)
ES (2) ES2310557T3 (cs)
HK (1) HK1058486A1 (cs)
HR (1) HRP20030071B1 (cs)
HU (3) HU226847B1 (cs)
IL (2) IL153593A0 (cs)
IS (1) IS2834B (cs)
LT (2) LT1935427T (cs)
LV (1) LV12993B (cs)
MX (1) MXPA02012603A (cs)
MY (1) MY137552A (cs)
NO (3) NO20026264L (cs)
PE (1) PE20020772A1 (cs)
PL (2) PL207534B1 (cs)
PT (2) PT1372696E (cs)
RS (1) RS50811B (cs)
RU (1) RU2287340C2 (cs)
SI (3) SI1372696T1 (cs)
SK (1) SK287940B6 (cs)
TR (1) TR201807700T4 (cs)
TW (2) TWI322153B (cs)
UY (1) UY26815A1 (cs)
WO (1) WO2002002638A2 (cs)
ZA (1) ZA200210058B (cs)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6887471B1 (en) * 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
DK0892643T4 (da) * 1996-03-20 2009-12-14 Bristol Myers Squibb Co Fremgangsmåder til inhibering af et immunrespons ved blokering af GP39/CD40- og CTLA4/CD28/B7-banerne og præparater til anvendelse derved
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
AR031699A1 (es) * 2000-05-26 2003-10-01 Bristol Myers Squibb Co Molecula mutante de ctla4 soluble que se enlaza a cd80 y/o cd86, molecula de acido nucleico que la codifica, vector y sistema vector que comprende a esta ultima, celula huesped que lo posee, metodo para producir una proteina mutante y dicha proteina, uso de la molecula mutante para preparar un medic
EP1294391B1 (en) * 2000-06-09 2012-08-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of agents for inhibiting transplant rejection
CN1318086C (zh) 2000-07-03 2007-05-30 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗风湿性疾病的药物组合物中的用途
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
MXPA03006699A (es) * 2001-01-26 2004-05-31 Univ Emory Metodos de induccion de tolerancia al trasplante de organos y correccion de hemoglobinopatias.
MXPA03010568A (es) 2001-05-23 2005-03-07 Squibb Bristol Myers Co Metodos para proteger trasplantes alogenicos de celulas de isletas usando moleculas mutantes ctla4 solubles.
EP1496931A4 (en) * 2002-04-19 2009-07-01 Bristol Myers Squibb Co METHODS OF TREATING AUTOIMMUNE DISEASE USING SOLUBLE CTLA4 MOLECULE AND ARMM OR NSAID
MXPA05006523A (es) * 2002-12-23 2005-08-26 Squibb Bristol Myers Co Procesos de cultivo de celulas de mamiferos para la produccion de proteinas.
CN100402660C (zh) * 2002-12-23 2008-07-16 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 用于蛋白质生产的哺乳动物细胞培养方法中产物质量提高
WO2004060911A2 (en) 2002-12-30 2004-07-22 Amgen Inc. Combination therapy with co-stimulatory factors
SG144925A1 (en) 2003-08-04 2008-08-28 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating cardiovascular disease using a soluble ctla4 molecule
AU2004287431B2 (en) 2003-10-27 2010-03-11 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
US7815765B2 (en) * 2004-04-01 2010-10-19 Swei Mu Wang Method for forming laminated synthetic leather
US9309316B2 (en) 2005-12-20 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof
AR058567A1 (es) * 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de proteinas estables
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
EP1969007B1 (en) * 2005-12-20 2013-08-28 Bristol-Myers Squibb Company Compositions and methods for producing a composition
US7528111B2 (en) * 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
GB0620934D0 (en) 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
RU2506275C2 (ru) * 2007-11-01 2014-02-10 Астеллас Фарма Инк. Иммуносупрессорные полипептиды и нуклеиновые кислоты
AU2014250683B2 (en) * 2007-11-01 2015-11-26 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
AU2012202324B2 (en) * 2007-11-01 2014-08-28 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
AU2009293019A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care Inc. Solute concentration measurement device and related methods
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
EP2365823B1 (en) * 2008-10-30 2016-11-30 Yeda Research And Development Company Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
US8758323B2 (en) 2009-07-30 2014-06-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CN102030828B (zh) * 2009-09-25 2014-10-29 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体
SI2536745T1 (sl) * 2010-02-19 2016-10-28 Xencor Inc. Novi imunoadhezini CTLA4-Ig
CN102822198B (zh) * 2010-03-12 2016-08-31 艾伯维生物医疗股份有限公司 Ctla4蛋白和其用途
US9527912B2 (en) 2010-05-17 2016-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
BR112013005756A2 (pt) 2010-09-08 2018-12-26 Yeda Research And Development Co. Ltd use of anti third party central memory t cells for anti-leukemia/lymphoma treatment
EP2614083A2 (en) 2010-09-08 2013-07-17 Yeda Research and Development Co. Ltd An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
WO2013010537A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
WO2013035099A1 (en) 2011-09-08 2013-03-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
JP2015522026A (ja) 2012-06-27 2015-08-03 オルバン バイオテック エルエルシー 糖尿病を処置するためのｃｔｌａ４融合タンパク質
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2014151230A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating granulomatosis with polyangiitis
CN104740608A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 上海中信国健药业股份有限公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗类风湿性关节炎药物的用途
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
WO2015164595A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Bristol-Myers Squibb Company Use of ctla4 compound for achieving drug-free remission in subjects with early ra
US11319359B2 (en) 2015-04-17 2022-05-03 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
WO2017009852A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Use of anti third party central memory t cells
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
KR20190006495A (ko) 2016-04-15 2019-01-18 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Cd80 변이체 면역조절 단백질 및 그의 용도
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
EP3571295A1 (en) 2017-01-18 2019-11-27 Yeda Research and Development Co. Ltd Genetically modified veto cells and use of same in immunotherapy
KR20230020022A (ko) 2017-10-10 2023-02-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
KR20200085777A (ko) 2017-10-18 2020-07-15 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 변이체 icos 리간드 면역조절 단백질 및 관련 조성물 및 방법
EP3765053A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3765064A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3765065A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3911670A1 (en) 2019-01-15 2021-11-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mutated interleukin-34 (il-34) polypeptides and uses thereof in therapy
WO2023112992A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 レグセル株式会社 免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5844095A (en) * 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5968510A (en) * 1991-06-27 1999-10-19 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 receptor and uses thereof

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644792A (en) * 1899-09-14 1900-03-06 Stanhope Boal Heater.
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3424893A1 (de) 1984-07-06 1986-02-06 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen Photographisches silberhalogenidaufzeichnungsmaterial
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US6905680B2 (en) * 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
CA2003455C (en) * 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5580756A (en) * 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US7070776B1 (en) * 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
AU661854B2 (en) * 1991-06-27 1995-08-10 Bristol-Myers Squibb Company CTL4A receptor, fusion proteins containing it and uses thereof
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5770197A (en) 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5624823A (en) * 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection
EP0637963B1 (en) 1992-04-07 2004-08-04 The Regents of the University of Michigan Cd28 pathway immunoregulation
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
EP1553168A3 (en) 1993-06-04 2011-04-06 The United States of America as represented by The Secretary of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
WO1994028912A1 (en) 1993-06-10 1994-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Cd28 pathway immunosuppression
EP0721469B1 (en) 1993-09-02 2000-01-05 Trustees of Dartmouth College Anti-gp39 antibodies and uses therefor
CN1142765A (zh) * 1993-12-01 1997-02-12 三共株式会社 以聚戊二烯基衍生物作为有效成分的炎症性细胞素产生抑制剂
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
WO1995033823A1 (en) 1994-06-03 1995-12-14 The United States Of America, Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
EP0784482A2 (en) 1994-06-07 1997-07-23 The Regents Of The University Of Minnesota Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
US5634055A (en) * 1994-09-27 1997-05-27 Bidplus, Inc. Method for selecting assignments
WO1996014865A1 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Repligen Corporation Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5824655A (en) 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US5993800A (en) * 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
DK0892643T4 (da) * 1996-03-20 2009-12-14 Bristol Myers Squibb Co Fremgangsmåder til inhibering af et immunrespons ved blokering af GP39/CD40- og CTLA4/CD28/B7-banerne og præparater til anvendelse derved
JPH1067653A (ja) * 1996-06-17 1998-03-10 Eisai Co Ltd 関節疾患治療剤
US6495579B1 (en) * 1996-12-02 2002-12-17 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Method for treating multiple sclerosis
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
AU748533B2 (en) 1997-06-11 2002-06-06 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy, The Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive T lymphocyte mediated immune responses
EP0947524A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
AU2999199A (en) * 1998-04-03 1999-10-25 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells as immunosuppressants
EP1082124A1 (en) * 1998-06-05 2001-03-14 Supergen, Inc. Compositions comprising methotrexate and pentostatin for treating rheumatoid arthritis
JP2000086519A (ja) * 1998-09-17 2000-03-28 Mitsui Chemicals Inc 抗リウマチ薬効果増強剤
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
US6040292A (en) * 1999-06-04 2000-03-21 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating diabetes
US7034121B2 (en) 2000-01-27 2006-04-25 Genetics Institue, Llc Antibodies against CTLA4
AU2001264936A1 (en) 2000-05-23 2001-12-03 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
AR031699A1 (es) 2000-05-26 2003-10-01 Bristol Myers Squibb Co Molecula mutante de ctla4 soluble que se enlaza a cd80 y/o cd86, molecula de acido nucleico que la codifica, vector y sistema vector que comprende a esta ultima, celula huesped que lo posee, metodo para producir una proteina mutante y dicha proteina, uso de la molecula mutante para preparar un medic
US7094874B2 (en) * 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
EP1294391B1 (en) * 2000-06-09 2012-08-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of agents for inhibiting transplant rejection
CN1318086C (zh) * 2000-07-03 2007-05-30 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗风湿性疾病的药物组合物中的用途
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
MXPA03006699A (es) * 2001-01-26 2004-05-31 Univ Emory Metodos de induccion de tolerancia al trasplante de organos y correccion de hemoglobinopatias.
MXPA03010568A (es) * 2001-05-23 2005-03-07 Squibb Bristol Myers Co Metodos para proteger trasplantes alogenicos de celulas de isletas usando moleculas mutantes ctla4 solubles.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5844095A (en) * 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5968510A (en) * 1991-06-27 1999-10-19 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 receptor and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Morton P. et al.: "Differential effects of CTLA-4 substitutions on the binding of human CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2)", J. Immunol., Vol. 156(3), 1047-1054, 1996 *

Also Published As

Publication number Publication date
CY2008017I1 (el) 2009-11-04
PL212205B1 (pl) 2012-08-31
TWI311564B (en) 2009-07-01
IS6667A (is) 2003-01-02
DE60135029D1 (de) 2008-09-04
JP2004517806A (ja) 2004-06-17
PL207534B1 (pl) 2010-12-31
BG107362A (bg) 2003-09-30
AU2001273174C1 (en) 2002-01-14
HUP0301727A3 (en) 2008-08-28
CZ20024261A3 (cs) 2004-08-18
AU2001273174B2 (en) 2006-05-18
CA2413190A1 (en) 2002-01-10
YU101102A (sh) 2006-01-16
BG66024B1 (bg) 2010-11-30
DK1935427T3 (en) 2018-06-06
KR100895552B1 (ko) 2009-04-29
NO20026264D0 (no) 2002-12-27
HU226847B1 (en) 2009-12-28
TWI322153B (en) 2010-03-21
IL153593A (en) 2009-09-01
WO2002002638A2 (en) 2002-01-10
SI21078A (sl) 2003-06-30
WO2002002638A3 (en) 2003-10-30
DK1372696T3 (da) 2008-11-03
EP1935427A2 (en) 2008-06-25
TW200902546A (en) 2009-01-16
NO20100580L (no) 2003-02-19
ZA200210058B (en) 2005-02-23
SK17742002A3 (sk) 2004-11-03
AR035037A1 (es) 2004-04-14
CY1120577T1 (el) 2019-07-10
BR0112104A (pt) 2004-07-20
SI1935427T1 (en) 2018-05-31
AR066511A2 (es) 2009-08-26
KR20030017606A (ko) 2003-03-03
SK287940B6 (sk) 2012-05-03
LT5063B (lt) 2003-11-25
PT1372696E (pt) 2008-10-24
CA2630062C (en) 2014-10-14
UY26815A1 (es) 2002-01-31
ATE401909T1 (de) 2008-08-15
IS2834B (is) 2013-05-15
KR100864120B1 (ko) 2008-10-16
CN1318086C (zh) 2007-05-30
MXPA02012603A (es) 2003-05-14
NO20100579L (no) 2003-02-19
AU7317401A (en) 2002-01-14
KR20080075564A (ko) 2008-08-18
LT1935427T (lt) 2018-05-10
CN1477968A (zh) 2004-02-25
US20030083246A1 (en) 2003-05-01
NO20026264L (no) 2003-02-19
CA2413190C (en) 2009-04-07
CA2630062A1 (en) 2002-01-10
CY1109786T1 (el) 2011-04-06
HUS1000008I1 (hu) 2019-06-28
EP2281568A3 (en) 2013-04-24
TR201807700T4 (tr) 2018-06-21
PT1935427T (pt) 2018-05-16
LT2003002A (en) 2003-07-25
EP1372696B1 (en) 2008-07-23
HRP20030071B1 (hr) 2014-01-03
CY2008017I2 (el) 2016-08-31
EP1935427B1 (en) 2018-03-07
HU227669B1 (en) 2011-11-28
EP1372696A2 (en) 2004-01-02
BG110611A (bg) 2010-05-31
ES2310557T3 (es) 2009-01-16
EP1935427A3 (en) 2011-05-25
RU2287340C2 (ru) 2006-11-20
EP3384924A1 (en) 2018-10-10
US7455835B2 (en) 2008-11-25
EE200300004A (et) 2004-10-15
SI1372696T1 (sl) 2008-12-31
RS50811B (sr) 2010-08-31
HUP0301727A2 (hu) 2003-09-29
HK1058486A1 (en) 2004-05-21
IL153593A0 (en) 2003-07-06
KR20080025216A (ko) 2008-03-19
PE20020772A1 (es) 2002-09-06
EP2281568A2 (en) 2011-02-09
HRP20030071A2 (en) 2005-02-28
MY137552A (en) 2009-02-27
EE05378B1 (et) 2011-02-15
PL365942A1 (en) 2005-01-24
BG66454B1 (bg) 2014-10-31
LV12993B (en) 2003-10-20
ES2667203T3 (es) 2018-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2001273174C1 (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule
US9296808B2 (en) Methods for treating scleroderma by administering a soluble CTLA4 molecule
AU2001263466C1 (en) Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7439230B2 (en) Methods of treatment using CTLA4 mutant molecules
AU2001273174A1 (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20221123