KR20080075564A - 가용성 ｃｔｌａ4 분자를 사용한 류마티스성 질환의 치료법 - Google Patents

가용성 ｃｔｌａ4 분자를 사용한 류마티스성 질환의 치료법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내인성 B7 분자와 그의 리간드의 결합을 차단하는 가용성 CTLA4 분자를 대상체에게 투여하여 류마티스성 질환을 치료하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 류마티스성 질환, 면역계 장애

Description

가용성 ＣＴＬＡ4 분자를 사용한 류마티스성 질환의 치료법 {Methods for Treating Rheumatic Diseases Using a Soluble CTLA4 Molecule}
본 출원에서는 각종 문헌이 참조되었다. 본 발명이 속한 기술분야의 수준을 보다 충분히 기재하고자 이 문헌의 전체 내용을 본 출원에 참고문헌으로 인용하였다.
본 발명은 일반적으로 류마티스성 질환 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 유효량을 대상체에게 투여하여 류마티스성 관절염과 같은 류마티스성 질환을 치료하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
현재 류마티스성 질환의 치유 방법은 없다. 오히려, 치료제는 증상을 치료하기 위해 사용된다. 전형적으로, 치료제는 장기간에 걸쳐 투여되고 흔히 치료적 가치는 부작용에 의해 축소된다.
류마티스성 질환은 신체의 근골격 및 결합 조직에 영향을 주는 질환의 군을 포함한다. 상기 질환은 종종 영구적인 조직 손상, 기형, 퇴화 및 장애를 일으키는 만성 염증을 특징으로 한다. 류마티스성 질환은 관절, 뼈, 연조직 또는 척수에 영향을 주고 [Mathies, H. 1983 Rheuma], 염증성 류마티즘, 퇴행성 류마티즘, 관절외 류마티즘 또는 콜라겐 질환으로 분류된다. 일부 류마티스성 질환은 환자의 변화된 면역 반응에 의해 야기된 자가면역 질환으로 알려져 있다.
류마티스성 관절염은 선진국 성인 인구의 약 2 ％ 정도가 걸린 진행성 류마티스성 질환이다 [Utsinger, P. D., et al., 1985 Rheumatoid Arthritis, p. 140]. 상기 질환은 주변 관절의 구조적 기형을 일으키는, 연골 파괴 및 골침식을 야기하는 지속적인 염증성 활막염을 특징으로 한다. 류마티스성 관절염과 관련된 증상에는 관절 부종, 관절 압통, 염증, 조조 경직 및 특히 관절을 구부릴 때의 동통이 포함된다. 관절염이 진행된 단계에 있는 대상체는 골침식과 함께 관절 파괴를 비롯한 구조적 손상을 겪는다 ["Principals of Internal Medicine, Harrison, 13th edition, pages 1648-1655]. 추가로, 환자는 자가면역 과정과 관련된 맥관염에 기인한 피부, 신장, 심장, 폐, 중추 신경계 및 눈의 손상을 비롯한 각종 장기의 손상같은 다른 임상적 증상이 있을 수 있다.
류마티스성 관절염과 관련된 다른 증상에는 적혈구 침강 속도의 증가 및 혈청 C-반응성 단백질 (CRP) 및(또는) 가용성 IL-2 수용체 (IL-2r) 농도의 증가가 포함된다. 적혈구 침강 속도는 활성 류마티스성 관절염에 걸린 거의 모든 환자에서 증가된다. 혈청 C-반응성 단백질의 농도 역시 증가되고 이는 질환 활성도 및 진행성 관절 손상의 가능성과 관련있다. 추가로, 활성 류마티스성 관절염에 걸린 환자의 혈청 및 활액에서 T-세포 활성화의 산물인 가용성 IL-2r의 농도도 증가된다 (문헌 ["Principals of Internal Medicine, Harrison, 13th edition, page 1650]을 참 조).
류마티스성 관절염은 T-림프구와 항원 제시 세포사이의 항원-비특이성 세포간 상호작용과 관련된 T-세포-매개의 자가면역 질환이라 생각된다. 일반적으로, T-세포 반응의 크기는 T-세포 표면 분자와 그의 리간드 사이의 상호작용에 의해 유도된 동시자극 반응에 의해 결정된다 [Mueller, et al., 1989 Ann. Rev. Immunol. 7: 445-480]. 주된 동시자극 신호는 T-세포 표면 수용체인 CD28 및 CTLA4와 그의 리간드, 예를 들어 항원 제시 세포 상의 B7-관련 분자 CD80 (즉, B7-1) 및 CD86 (즉, B7-2) 사이의 상호작용에 의해 제공된다 [Linsley, P. and Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212].
동시자극이 없을 때의 T-세포 활성화는 면역 시스템이 자극에 대해 반응하지 않는 무력성 (anergic) T-세포 반응을 초래한다 [Schwartz, R. H., 1992 Cell 71: 1065-1068].
류마티스성 관절염이 T-세포-매개의 면역 시스템 질환으로 여겨지기 때문에, 류마티스성 관절염을 치료하기 위한 신규 물질을 개발하는 한가지 전략은 내인성 CD28 또는 CTLA4와 B7 사이의 상호작용을 차단함으로써 T-림프구와 항원 제시 세포 사이의 동시자극 신호를 차단하는 분자를 확인하는 것이다. 가능성 있는 분자에는 야생형 CTLA4 (도 23에 나타낸 서열) 또는 CD28보다 더 큰 결합성으로 B7과 결합하고 동시자극 신호를 차단하도록 변형된 가용성 CTLA4 분자가 포함된다.
CD28 및 CTLA4의 가용성 형태를, 면역글로불린 (Ig) 불변 도메인과 CD28 및 CTLA4의 가변 (V)-유사 세포외 도메인을 융합시켜 CD28Ig 및 CTLA4Ig를 생성함으로 써 구성하였다. CTLA4Ig의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 도 24에 나타냈으며 +1 위치의 메티오닌 또는 -1 위치의 알라닌에서 시작하여 +357 위치의 리신으로 종결하는 단백질이다. CTLA4Ig는 CD28Ig보다 더 강하게 CD80-양성 및 CD86-양성 세포 둘 다와 결합한다 [Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1: 793-80]. 다수의 T-세포-의존성 면역 반응이 시험관내 및 생체내 둘 다에서 CTLA4Ig에 의해 차단되는 것으로 밝혀졌다 ([Linsley, P., et al., 1991b, supra]; [Linsley, P., et al., 1992a Science 257: 792-795]; [Linsley, P., et al., 1992b J. Exp. Med. 176: 1595-1604]; [Lenschow, D. J., et al. 1992 Science 257: 789-792]; [Tan, P., et al., 1992 J. Exp. Med. 177: 165-173]; [Turka, L. A., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105]).
B7과 같은 천연 리간드에 대한 결합 친화도를 변화시키기 위해, 가용성 CTLA4Ig 융합 단백질을 분자의 CTLA4 부분에서 아미노산을 돌연변이시켜 변형시킨다. 돌연변이시키는 경우, B7 리간드에 대한 결합 친화도 또는 결합도가 변화하는 CTLA4의 영역에는 상보성 결정 영역 1 (미국 특허 제6,090,914호, 제5,773,253호, 제5,844,095호; 동시 계류중인 미국 특허 출원 제60/214,065호; 및 피치 (Peach) 등의 문헌 [1994. J. Exp. Med., 180: 2049-2058]에 개시된 CDR-1) 및 상보성 결정 영역 3 (CDR-3)-유사 영역 (CDR-3은 미국 특허 제6,090,914호, 제5,773,253호 및 제5,844,095호; 동시 계류중인 미국 특허 출원 제60/214,065호; 및 피치 (Peach R. J.) 등의 문헌 [J Exp Med 1994 180: 2049-2058]에 개시된 CTLA4 세포외 도메인의 보존 영역이다)이 포함된다. CDR-3-유사 영역은 CDR-3 영역 및 CDR-3 모티프의 상 류 및(또는) 하류에 있는 몇몇 아미노산의 연장 영역을 포함한다. CDR-3-유사 영역은 모든 CD28 및 CTLA4 군의 구성원들 중에 고도로 보존되는 헥사펩티드 모티프 MYPPPY를 포함한다. CTLA4의 헥사펩티드 모티프 및 CD28Ig의 선택된 잔기에서의 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 CD80과의 결합을 감소시키거나 차단한다 [Peach, R. J., et al J Exp Med 1994 180: 2049-2058].
CTLA4 및 CD28의 상동 영역을 상호교환하여 가용성 CTLA4Ig 분자를 추가로 변형하였다. 이들 키메라 CTLA4/CD28 상동 돌연변이 분자를 CTLA4 및 CD28에 대한 공통의 MYPPPY 헥사펩티드 모티프뿐만 아니라 CD80과 CTLA4의 결합성을 증가시킬 수 있는 영역인 CTLA4의 CDR-1-유사 및 CDR-3-유사 영역의 특정 비보존된 아미노산 잔기를 나타내었다 [Peach, R. J., et al., 1994 J Exp Med 180: 2049-2058].
상게서에 개시된 CTLA4Ig, CTLA4 돌연변이 분자 또는 키메라 CTLA4/CD28 상동 돌연변이체와 같은 가용성 CTLA4 분자가 류마티스성 질환을 치료하기 위한 치료 약물의 신규 군으로 포함된다.
류마티스성 관절염과 같은 류마티스성 질환을 위한 본 치료법은 비특이성 세포독성 면역 억제성 약물, 예를 들어 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 아자티오프린, 시클로스포린 A 및 종양 괴사 인자-알파 (TNFα) 차단제 또는 길항제를 투여하는 것을 포함한다. 이들 면역 억제성 약물은 대상체의 전체 면역 시스템을 억제 (supress)하고, 장기간 사용은 감염의 위험을 증가시킨다. 추가로, 이들 약물은 단지 류마티스성 관절염의 진행을 느리게 할뿐인데, 치료를 그만둔 후에는 속도를 가속시킨다. 추가로, 이들 비특이성 약물로의 장기간 치료법은 특정 악성종양, 신 부전, 골수 억제, 폐섬유증, 악성종양, 당뇨병 및 간 기능 장애를 발전시키는 경향을 포함하는 독성 부작용을 유발한다. 이들 약물은 또한 약 2 내지 5 년 후에는 점차 약효가 들지 않는다 [Kelley's Textbook of Rheumatology, 6th Edition, pages 1001-1022].
별법으로, 비특이적 면역 억제성 및 항 염증성 약물인 치료제를 사용하여 증상을 경감시켰다. 이들 약물은 투여량에 의존하고 질환 진행을 예방하지 않는다. 이들 약물에는 스테로이드 화합물, 예를 들어 프레드니손 및 메틸프레드니손이 포함된다. 스테로이드는 또한 장기간 사용에 따른 상당한 독성 부작용이 있다 [Kelley's Textbook of Rheumatology, 6th Edition, pages 829-833].
따라서, 류마티스성 관절염의 현재 치료법은 효능에 제한이 있고, 상당한 독성 부작용을 수반하며, 장기간 동안 연속해서 사용할 수 없다.
따라서, 류마티스성 관절염과 같은 류마티스성 질환을 치료하는데 효과적이고 더 효능이 있으며, 통상적인 방법 및 약물의 단점을 피하며 자가면역증의 병리생리학적 메카니즘을 표적으로 하는 치료법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 B7-양성 세포의 B7 분자와 결합하는 가용성 CTLA4 분자를 대상체에게 투여하여, 내인성 B7 분자의 T-세포의 CTLA4 및(또는) CD28과의 결합을 저해함으로써, 면역 시스템 질환을 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 사용하는 가용성 CTLA4 분자에는 CTLA4Ig 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg가 포함된다.
본 발명은 또한 가용성 CTLA4와 인간의 B7-양성 세포의 접촉에 의해 T-세포 기능을 저해하지만 인간의 T-세포를 고갈시키지는 않는 방법을 제공한다. 가용성 CTLA4의 예로는 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg와 같은 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 있다.
본 발명은 또한 CTLA4Ig 및(또는) 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg와 같은 가용성 CTLA4 분자를 진단된 대상체에게 투여하여 류마티스성 관절염과 같 은 류마티스성 질환을 치료하는 (예를 들어, 증상을 감소시키는) 방법을 제공한다. +1 위치의 메티오닌 또는 -1 위치의 알라닌에서 시작하여 +357 위치의 리신으로 종결하는 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg를 본 발명의 방법에 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 류마티스성 관절염으로 진단된 대상체에게 가용성 CTLA4 분자를 투여하여 구조적 손상과 같은 류마티스성 질환과 관련된 병리생리학적 변화를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 제약상 허용가능한 담체 및 가용성 CTLA4 분자와 같은 생물학적으로 효과적인 물질을 포함하는, 류마티스성 질환과 같은 면역 시스템 질환을 치료하기 위한 제약 조성물을 제공한다.
면역 시스템 질환에 대한 치료용 제약 조성물을 포함하는 킷트가 또한 본 발명에 포함된다. 한가지 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 제약 조성물을 포함하는 킷트를 사용하여 면역 시스템 질환, 예를 들어 류마티스성 관절염을 치료한다. 예를 들어, 제약 조성물은 B7-양성 세포의 B7 분자와 결합하여 B7 분자가 T-세포의 CTLA4 및(또는) CD28과 결합하는 것을 차단하는 유효량의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 포함한다. 추가로, 상기 킷트는 본 발명의 제약 조성물과 함께 사용하는 하나 이상의 면역 억제제를 함유할 수 있다. 효능있는 면역 억제제에는 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 소염 진통제 (예를 들어, Cox-2 저해제), 시클로스포린 프레드니손, 아자티오프린, 메토트렉세이트, TNFα 차단제 또는 길항제, 인플릭시맵, 염증성 사이토카인을 표적으로 하는 임의의 생물 제제, 히드록시클로 로퀸, 술파살라조프린, 금 염, 에타너셉트 및 아나킨라가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 류마티스성 관절염과 관련된 적혈구 침강 속도를 감소시키는 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 C-활성 단백질, 가용성 ICAM-1, 가용성 E-셀렉틴 및(또는) 가용성 IL-2r을 포함하는, 류마티스성 관절염과 관련된 혈청의 특정 성분의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
정의
본 출원에 사용한 모든 과학 용어 및 기술 용어는 다른 언급이 없는 한 당업계에서 일반적으로 사용되는 의미를 갖는다. 본 출원에 사용한 하기 단어 또는 어구는 상술된 그 의미를 갖는다.
본원에 사용한 "리간드"는 다른 분자를 특이적으로 인지하여 결합하는 분자를 나타내는데, 예를 들어 CTLA4에 대한 리간드는 B7 분자이다.
본원에 사용한 "야생형 CTLA4" 또는 "돌연변이 되지 않은 CTLA4"는 자연적으로 발생하고, B7을 인지하여 결합하거나 B7을 방해하여 CD28 및(또는) CTLA4 (예를 들어, 내인성 CD28 및(또는) CTLA4)과 결합하는 것을 차단하는 도 23에 나타낸 전체 길이 CTLA4의 아미노산 서열 (또한 미국 특허 제5,434,131호, 제5,844,095호, 제5,851,795호에 기재된 바와 같음) 또는 그의 임의의 부분 또는 유도체의 아미노산을 갖는다. 특정 실시양태에서, 야생형 CTLA4의 세포외 도메인은 +1 위치의 메 티오닌에서 시작하여 +124 위치의 아스파르트산으로 종결하거나, 야생형 CTLA4의 세포외 도메인은 -1 위치의 알라닌에서 시작하여 +124 위치의 아스파르트산으로 종결한다. 야생형 CTLA4는 N-말단 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 C-말단 세포질 도메인을 갖는 세포 표면 단백질이다. 세포외 도메인은 B7 분자와 같은 표적 단백질과 결합한다. 세포에서, 자연적으로 발생하는 야생형 CTLA4 단백질은 N-말단에 신호 펩티드를 포함하는 미성숙 폴리펩티드로 번역된다. 미성숙 폴리펩티드는 신호 펩티드의 절단 및 제거를 포함하는 번역 후 프로세싱을 거쳐 미성숙 형태의 N-말단과 다른 신규 생성된 N-말단을 갖는 CTLA4 절단 생성물을 생성한다. 당업자는 CTLA4 절단 생성물의 신규 생성된 N-말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 추가의 번역후 프로세싱이 발생할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 별법으로, 신호 펩티드를 완전히 제거하지 않고, 일반적인 개시 아미노산 메티오닌 앞에서 시작하는 분자를 생성할 수 있다. 따라서, 성숙 CTLA4 단백질은 +1 위치의 메티오닌 또는 -1 위치의 알라닌에서 시작할 수 있다. CTLA4 분자의 성숙 형태는 B7과 결합하는 세포외 도메인 또는 그의 임의의 부분을 포함한다.
본원에 사용한 "CTLA4 돌연변이 분자"는 (바람직하게는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인에) 하나의 돌연변이 또는 다중 돌연변이를 갖는 도 23에 나타낸 야생형 CTLA4 또는 그의 임의의 부분 또는 유도체를 의미한다. CTLA4 돌연변이 분자는 야생형 CTLA4 분자의 서열과 유사하되 동일하지는 않으나, 여전히 B7과 결합하는 서열을 갖는다. 돌연변이는 보존 (예를 들어, 루이신을 이소루이신으로 치환) 또는 비보존 (예를 들어, 글리신을 트립토판으로 치환) 구조 또는 화학적 특징을 갖는 아미노산으로 치환된 하나 이상의 아미노산 잔기, 아미노산 결실, 첨가, 프레임시프트 또는 절단을 포함할 수 있다. CTLA4 돌연변이 분자는 분자 안에 있거나 또는 그에 결합된 비-CTLA4 분자를 포함할 수 있다. 돌연변이 분자는 가용성 (즉, 순환하는)이거나 또는 세포 표면에 결합될 수 있다. 추가의 CTLA4 돌연변이 분자는 미국 특허 출원 제09/865,321호, 제60/214,065호 및 제60/287,576호; 미국 특허 제6,090,914호, 제5,844,095호 및 제5,773,253호; 및 피치 (Peach, R. J.) 등의 문헌 [J Exp Med 180: 2049-2058 (1994))]에 개시된 돌연변이 분자를 포함한다. CTLA4 돌연변이 분자는 합성으로 또는 재조합으로 제조할 수 있다.
"CTLA4Ig"는 Ig 테일과 접합된 야생형 CTLA4의 세포외 도메인 또는 B7과 결합하는 그의 부분을 포함하는 가용성 융합 단백질이다. 특정 실시양태는 +1 위치의 메티오닌에서 시작하여 +124 위치의 아스파르트산으로 종결하거나 -1 위치의 알라닌에서 시작하여 +124 위치의 아스파르트산으로 종결하는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인 (도 23에 나타냄); +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민; 및 +126 위치의 글루탐산에서 +357 위치의 리신을 포함하는 면역 글로불린 부분을 포함한다 (CTLA4Ig를 코딩하는 DNA는 부타페스트 조약 (Budapest Treaty)의 조항에 따라 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 1991년 5월 31일 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 ATCC 제68629호를 부여받았다; [Linsley, P., et al., 1994 Immunit 793-80]). CTLA4Ig를 발현하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주인 CTLA4Ig-24를 ATCC 등록 번호 CRL-10762로 1991년 5월 31일 기탁하였다. 본 방법 및(또는) 킷트에 사용한 가용 성 CTLA4Ig 분자는 신호 (리더) 펩티드 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법 및(또는) 킷트에서, 분자는 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다.
"L104EA29YIg"는 아미노산 변화 A29Y (29 위치의 알라닌을 치환한 티로신 아미노산 잔기) 및 L104E (+104 위치의 루이신을 치환한 글루탐산 아미노산 잔기)를 갖는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인 또는 B7과 결합하는 Ig 테일과 접합한 그의 부분 (도 19에 포함됨; L104EA29YIg를 코딩하는 DNA를 ATCC 번호 PTA-2104로 2000년 6월 20일 기탁하였다; 본원에 참고문헌으로 인용된 동시 계류중인 미국 특허 출원 제09/579,927호, 제60/287,576호 및 제60/214,065호에 포함됨)을 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자인 융합 단백질이다. 본 방법 및(또는) 킷트에 사용한 가용성 L104EA29YIg 분자는 신호 (리더) 펩티드 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법 및(또는) 킷트에서, 분자는 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용한 "가용성"은 세포에 결합하거나 부착하지 않은, 즉 순환하는 임의의 분자 또는 그의 단편 및 유도체를 나타낸다. 예를 들어, CTLA4, B7 또는 CD28은 면역글로불린 (Ig) 잔기를 CTLA4, B7 또는 CD28의 세포외 도메인에 각각 부착하여 가용성으로 만들 수 있다. 별법으로, CTLA4와 같은 분자는 그의 막횡단 도메인을 제거하여 가용성이 되게 할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용한 가용성 분자는 신호 (또는 리더) 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용한 "가용성 CTLA4 분자"는 비-세포-표면-결합된 (즉, 순환하는) CTLA4 분자 또는 B7과 결합하는 CTLA4 분자의 임의의 기능적 부분을 의미하고, 가용성 CTLA4 분자에는 CTLA4의 세포외 도메인을 융합 분자를 가용성이 되게 하는 면역글로불린 (Ig) 잔기 또는 그의 단편 및 유도체와 융합시킨 CTLA4Ig 융합 단백질 (예를 들어, ATCC 제68629호); 생물학적으로 활성 또는 화학적으로 활성인 단백질 (예를 들어, 파필로마바이러스 E7 유전자 생성물 (CTLA4-E7), 멜라노마-관련 항원 p97 (CTLA4-p97) 또는 HIV env 단백질 (CTLA4-env gp120))과 융합되거나 접합된 CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 단백질 또는 그의 단편 및 유도체; CD28/CTLA4Ig와 같은 하이브리드 (키메라) 융합 단백질 또는 그의 단편 및 유도체; 막횡단 도메인을 제거하여 단백질을 가용성이 되게 한 CTLA4 분자 [Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201: 144-153] 또는 그의 단편 및 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. "가용성 CTLA4 분자"는 또한 그의 단편, 부분 또는 유도체 및 CTLA4 결합 활성도를 갖는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용한 가용성 CTLA4 분자는 신호 (리더) 펩티드 서열을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서 상기 분자는 신호 펩티드 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용한 "CTLA4의 세포외 도메인"은 B7 분자와 같은 CTLA4 리간드를 인지하고 결합하는 CTLA4의 부분이다. 예를 들어, CTLA4의 세포외 도메인은 +1 위치의 메티오닌에서 +124 위치의 아스파르트산을 포함한다 (도 23). 별법으로, CTLA4의 세포외 도메인은 -1 위치의 알라닌에서 +124 위치의 아스파르트산을 포함한다 (도 23). 세포외 도메인은 B7 분자와 결합하는 CTLA4의 단편 또는 유도체를 포함한다. 도 23에 나타낸 CTLA4의 세포외 도메인은 또한 B7 분자에 대한 CTLA4 분자의 결합성을 변화시키는 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에 사용한 용어 "돌연변이"는 야생형 분자의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서 변화, 예를 들어, 야생형 CTLA4 세포외 도메인의 DNA 및(또는) 아미노산 서열에서 변화를 의미한다. DNA에서 돌연변이는 코돈을 변화시켜 아미노산 서열을 변화시킬 수 있다. DNA 변화는 치환, 결실, 삽입, 별법의 스플라이싱 또는 절단을 포함할 수 있다. 아미노산 변화는 치환, 결실, 삽입, 첨가, 절단 또는 단백질의 프로세싱 또는 절단 실수를 포함할 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열의 돌연변이는 당업계에 잘 공지된 아미노산 서열의 잠재성 돌연변이를 초래할 수 있다. 이와 관련하여, 특정 뉴클레오티드 코돈은 동일한 아미노산을 코딩한다. 예로는 아미노산, 아르기닌 (R)을 코딩하는 뉴클레오티드 코돈 CGU, CGG, CGC 및 CGA; 또는 아미노산, 아스파르트산 (D)을 코딩하는 코돈 GAU 및 GAC가 있다. 따라서, 단백질은 구체적인 뉴클레오티드 서열이 다르지만, 동일한 서열을 갖는 단백질 분자를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. 아미노산 코딩 서열은 하기와 같다:
Figure 112008055668619-PAT00001
돌연변이 분자는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다.
본원에 사용한 "비-CTLA4 단백질 서열" 또는 "비-CTLA4 분자"는 B7과 결합하지 않고 그의 표적과 CTLA4의 결합을 방해하지 않는 임의의 단백질 분자를 의미한다. 예로는 면역글로불린 (Ig) 불변 영역 또는 그의 부분이 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, Ig 불변 영역은 힌지 (hinge), CH2 및 CH3 영역을 포함하는 인간 또는 원숭이 Ig 불변 영역, 예를 들어 인간 C (감마) 1이다. Ig 불변 영역을 돌연변이시켜 그의 이펙터 (effector) 기능을 감소시킬 수 있다 (미국 특허 제 5,637,481호, 제5,844,095호 및 제5,434,131호).
본원에 사용한 "단편" 또는 "부분"은 CTLA4 분자의 임의의 부분 또는 세그먼트, 바람직하게는 B7 분자와 같은 그의 표적을 인지하고 결합하는 CTLA4의 세포외 도메인 또는 그의 일부분 또는 세그먼트이다.
본원에 사용한 "B7"은 CTLA4 및(또는) CD28을 인지하고 결합할 수 있는 B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) 및 B7-3을 포함하나 이에 제한되지 않는 분자의 B7 집단을 나타낸다.
본원에 사용한 "B7-양성 세포"는 세포 표면에 발현된 하나 이상 유형의 B7 분자를 갖는 임의의 세포이다.
본원에 사용한 "유도체"는 모 분자의 서열 상동성 및 활성도를 공유하는 분자이다. 예를 들어, CTLA4의 유도체는 B7을 인지하고 결합하는 야생형 CTLA4의 세포외 도메인, 예를 들어 CTLA4Ig 또는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg와 70 ％ 이상 유사한 아미노산 서열을 갖는 가용성 CTLA4 분자를 포함한다.
본원에 사용한 수용체, 신호 또는 분자의 "차단" 또는 "저해"란 당업계에 인지된 시험에 의해 검출하여 수용체, 신호 또는 분자의 활성을 방해하는 것을 의미한다. 예를 들어, 세포 매개 면역 반응의 차단은 류마티스성 질환 관련 증상의 감소를 결정하여 검출할 수 있다. 차단 또는 저해는 부분적 또는 전체적일 수 있다.
본원에 사용한 "B7 상호작용을 차단"은 그의 리간드, 예를 들어 CD28 및(또는) CTLA4와 B7의 결합을 방해하여, T-세포 및 B7-양성 세포 상호작용을 차단하는 것을 의미한다. B7 상호작용을 차단하는 물질의 예로는 임의의 CTLA4, CD28 또는 B7 분자 (예를 들어, B7-1, B7-2)를 인지하고 결합하는 항체 (또는 그의 부분 또는 유도체)와 같은 분자; 가용성 CTLA4와 같은 분자의 가용성 형태 (또는 그의 부분 또는 유도체); CTLA4/CD28/B7-매개의 상호작용을 통해 세포 신호를 방해하는 것으로 설계된 펩티드 단편 또는 다른 작은 분자가 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 차단제는 가용성 CTLA4 분자, 예를 들어 CTLA4Ig (ATCC 제68629호) 또는 L104EA29YIg (ATCC 제PTA-2104호), CD28Ig (ATCC 제68628호)와 같은 가용성 CD28 분자, B71g (ATCC 제68627호)와 같은 가용성 B7 분자, 항-B7 모노클로날 항체 (예를 들어, 앤더슨 (Anderson) 등의 미국 특허 제6,113,898호 또는 요코치 (Yokochi) 등의 문헌 [1982. J. Immun., 128 (2) 823-827]에 기재된 ATCC 제HB-253호, ATCC 제CRL-2223호, ATCC 제CRL-2226호, ATCC 제HB-301호, ATCC 제HB-11341호 및 모노클로날 항체), 항-CTLA4 모노클로날 항체 (예를 들어, ATCC 제HB-304호 및 참고문헌 82-83에 기재된 모노클로날 항체) 및(또는) 항-CD28 모노클로날 항체 (예를 들어, ATCC HB 11944 및 한센 (Hansen)의 문헌 [Hansen et al., 1980. Immunogenetics 10: 247-260] 또는 마틴 (Martin)의 문헌 [Martin et al., 1984. J. Clin. Immun., 4 (1): 18-22]에 기재된 mAb 9.3)이다.
본원에 사용한 "면역 시스템 질환"은 자가면역 질환, 이식 관련 장애 및 면역증식성 질환 등을 비롯한 B7-양성 세포와 T-세포 상호작용에 의해 매개된 임의의 질환을 의미한다. 면역 시스템 질환의 예로는 이식 대 숙주 질환 (GVHD) (예를 들어, 골수 이식에 기인하거나 내성을 유도), 이식 거부, 만성 거부 및 실질 기관, 피부, 소도, 근육, 간세포, 신경을 포함하는 조직 또는 세포 동종이식 또는 이종이 식과 관련된 면역 장애가 있다. 면역증식성 질환의 예로는 건선, T-세포 림프종, T-세포 급성 림프모세포성 백혈병, 고환 혈관중심성 T-세포 림프종, 양성 림프구 혈관염, 루프스 (예를 들어, 홍반성 루프스, 루프스 신염), 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 원발성 점액부종, 그레이브 (Graves) 질환, 악성 빈혈, 자가면역성 위축성 위염, 애디슨 (Addison) 질환, 당뇨병 (예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병, 유형 I 당뇨병, 유형 II 당뇨병), 굿파스튜어 증후군, 중증 근무력증, 천포창, 크론 (Crohn) 질환, 교감성 안염, 자가면역성 포도막염, 다발성 경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 결핍증, 원발성 담즙성 간경변, 만성 작용 간염, 궤양성 대장염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 류마티스성 질환 (예를 들어, 류마티스성 관절염), 다발성근염, 피부경화증 및 혼합성 결합 조직 질환이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용한 "류마티스성 질환"은 관절, 뼈, 연조직 또는 척수에 영향을 주고 [Mathies, H. 1983 Rheuma] 염증성 류마티즘, 퇴행성 류마티즘, 관절외 류마티즘 및 콜라겐 질환을 포함하는 임의의 질환을 의미한다. 추가로, 류마티스성 질환은 만성 다발성 관절염, 건선 관절병증, 강직성 척추염, 류마티스성 관절염, 결절성 동맥주위염, 전신 홍반성 루프스, 진행성 전신 경피증, 견관절 주위염, 요산성 관절염, 연골석회증, 피부근염, 근육 류마티즘, 근염 및 근경증을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 류마티스성 질환은 대상체의 변화된 면역 반응에 의해 야기된 자가면역 질환으로 공지되어 있다.
본원에 사용한 "유전자 치료"는 핵산 서열을 세포로 전달한 후, 핵산으로 코 딩된 임의의 유전자 생성물을 세포에서 발현시키도록 유전자 조작하여 질환을 치료하는 방법이다. 예를 들어, 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 생체외 또는 시험관내에서 다양한 방법, 예를 들어 인산 칼슘 침전, 디에틸아미노에틸 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 전기영동, 직접 주입, 리포펙션 (lipofection) 또는 바이러스 감염 ([Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)]; [Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman and Co, New York, N. Y., 1993)] 및 [Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993)], 각각은 본원에 참고문헌으로 인용함)에 의해 관심있는 핵산을 함유한 발현 벡터를 세포로 삽입하여 핵산 전달을 수행할 수 있다. 별법으로, 관심있는 핵산 서열을 다양한 벡터 및 다양한 방법, 예를 들어 핵산을 대상체에게 직접 투여 [Williams et al, 1991 PNAS 88: 2726 2730] 또는 핵산을 바이러스 벡터로 삽입 및 바이러스로 대상체에게 감염 ([Battleman et al, 1993 J Neurosci 13: 94-951]; [Carroll et al, 1993 J Cell Biochem 17E: 241]; 렙코브스키 (Lebkowski) 등의 미국 특허 제5,354,678호; [Davison and Elliott, Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)])에 의해 생체내에서 세포로 전달할 수 있다. 생체내 전달에 사용한 다른 방법은 리포좀으로 핵산을 캡슐화하고 리포좀을 대상체에게 직접 전달하거나 또는 혈액응고시키는 센다이 (Sendai) 바이러스와 함께 리포좀을 대상체에게 직접 전달하는 것을 포함한다 (본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,824,655호). 형질감염된 또는 감염된 세포는 핵산으로 코딩된 단백질 생성물 을 발현하여 질환 또는 질환의 증상을 개선한다.
본원에 개시된 본 발명을 더 충분히 이해할 수 있도록 하기 설명을 기재하였다.
본 발명의 조성물 및 방법
본 발명은 B7과 결합하는 리간드, 예를 들어 B7을 인지하고 결합하는 가용성 CTLA4 분자 (예를 들어 CTLA4Ig 및(또는) L104EA29YIg) 및 mAbs의 유효량을 대상체에게 투여함으로써 류마티스성 질환과 같은 면역 시스템 질환을 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. B7-양성 세포의 B7 분자와 결합된 경우, 유효량은 B7 분자와 내인성 리간드, 예를 들어 CTLA4 및 CD28의 결합을 저해하는 가용성 CTLA4 분자의 양으로 정의한다.
바람직한 실시양태에서, 면역 질환은 류마티스성 질환이다. 류마티스성 질환은 (i) 근육, 힘줄, 연골, 활액 및 섬유 조직, 특히 관절을 포함하는 신체 근골격 또는 결합 조직 구조의 염증 또는 퇴행, (ii) 관절 부종, 관절 압통, 염증, 조조 경직, 및(또는) 동통 또는 이들 구조의 운동 또는 기능 장애를 수반, (iii) 종종 류마티스성 인자의 혈청학적 증거 및 다른 염증성 대체 마커를 수반하는 특징을 나타내는 임의의 질환이다.
류마티스성 질환은 류마티스성 관절염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 류마티스성 관절염의 증상은 신체적 장애를 일으키는 관절 부종, 관절 압통, 염증, 조조 경직 및 동통을 포함한다. 관절염이 진행된 단계에 있는 대상체는 구조적 손상의 증상 및 쇠약 동통을 겪는다. 또한 자가면역 메카니즘에 의해 다른 기관이 손상될 수 있다.
조성물
본 발명은 가용성 CTLA4 분자를 포함하는, 류마티스성 질환과 같은 면역 질환을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 가용성 CTLA4와 인간의 B7-양성 세포의 접촉에 의해 T-세포 기능을 저해하지만 인간의 T-세포를 고갈시키지는 않는 조성물을 제공한다. 가용성 CTLA4의 예로는 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg와 같은 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 있다.
돌연변이 또는 야생형 서열을 갖는 CTLA4 분자는 CTLA4 막횡단 세그먼트을 결실하여 가용성이 될 수 있다 [Oaks, M. K., et al., 2000 Cellular Immunology 201: 144-153].
별법으로, 돌연변이 또는 야생형 서열을 갖는 가용성 CTLA4 분자는 CTLA4 분자를 면역글로불린 (Ig) 분자와 같은 비-CTLA4 잔기와 융합시켜 CTLA4 분자를 가용성이 되게한 융합 단백질일 수 있다. 예를 들어, CTLA4 융합 단백질은 면역글로불린 불변 영역과 융합되어 CTLA4Ig 분자를 생성시키는 CTLA4의 세포외 도메인을 포함한다 (도 24) [Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1: 793-80].
임상 프로토콜에서, 면역글로불린 영역이 대상체에서 해로운 면역 반응을 유도하지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 잔기는 인간 또는 원숭이 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역이다. 적합한 면역글로불린 영역의 한가지 예로는 Fc 수용체와의 결합, 보체-의존성 세포독성 (CDC)의 매개 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)의 매개와 같은 이펙터 기능을 매개할 수 있는 힌지, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 인간 Cγ1이 있다. 면역글로불린 잔기는 그 안에 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있는데 (예를 들어, CH2 도메인에서, CDC 또는 ADCC와 같은 이펙터 기능을 감소시킴), 이 때 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 면역글로불린의 결합 능력을 증가시키거나 감소시켜 그의 리간드에 대한 면역글로불린의 결합 능력을 조절한다. 예를 들어, 면역글로불린의 돌연변이는 힌지 도메인 내의 임의의 또는 모든 그의 시스테인 잔기의 변화를 포함할 수 있는데, 예를 들어 +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환한다 (도 24). 면역글로불린 분자는 또한 도 24에 나타낸 바와 같이 +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 면역글로불린 잔기의 돌연변이체는 +144 위치의 루이신을 페닐알라닌으로 치환, +145 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환 또는 +147 위치의 글리신을 알라닌으로 치환하는 것을 포함한다.
가용성 CTLA4 분자 또는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자에서 사용한 추가의 비-CTLA4 잔기는 p97 분자, env gp120 분자, E7 분자 및 ova 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다 ([Dash, B. et al. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6): 1389-97]; [Ikeda, T., et al. 1994 Gene 138 (1-2): 193-6]; [Falk, K., et al. 1993 Cell. Immunol. 150 (2): 447-52]; [Fujisaka, K. et al. 1994 Virology 204 (2): 789-93]). 다른 분자가 또한 가능하다 ([Gerard, C. et al. 1994 Neuroscience 62 (3): 721]; [Byrn, R. et al. 1989 63 (10): 4370]; [Smith, D. et al. 1987 Science 238: 1704]; [Lasky, L. 1996 Science 233: 209]).
본 발명의 가용성 CTLA4 분자는 분자의 CTLA4 부분의 세포외 도메인의 N-말 단과 연결된 신호 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 온코스타틴 M [Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853] 또는 CD5 [Jones, N. H. et al., (1986) Nature 323: 346-349]로부터 신호 펩티드 또는 임의의 세포외 단백질로부터 신호 펩티드를 포함하는, 분자의 분비를 허용할 임의의 서열일 수 있다.
본 발명의 가용성 CTLA4 분자는 CTLA4의 세포외 도메인의 N-말단에 연결된 온코스타틴 M 신호 펩티드 및 CTLA4의 세포외 도메인 (야생형 또는 돌연변이된)의 C-말단에 연결된 인간 면역글로불린 분자 (예를 들어, 힌지, CH2 및 CH3)를 포함할 수 있다. 상기 분자는 -26 위치의 메티오닌 내지 -1 위치의 알라닌을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 온코스타틴 M 신호 펩티드, +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CTLA4 단백질, +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산 내지 +357 위치의 리신을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함한다.
구체적으로, 상기 기재된 돌연변이된 CTLA4 서열을 포함하는 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 돌연변이된 CTLA4 단편과 융합된 인간 IgCγ1 잔기를 포함하는 융합 분자이다.
한가지 실시양태에서, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 세포외 도메인의 단일 부위 돌연변이체를 포함하는 CTLA4 단편과 융합된 IgCγ1을 포함한다. CTLA4의 세포외 도메인은 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산 (예를 들어, 도 23)을 포함한다. CTLA4의 세포외 부분은 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스 파르트산을 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 23). 단일 부위 돌연변이의 예로는 +104 위치의 루이신을 임의의 다른 아미노산으로 변화시킨 하기 돌연변이가 있다:
Figure 112008055668619-PAT00002
추가로, 본 발명은 IgCγ1 잔기와 융합된, 2 개의 돌연변이를 갖는 CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 돌연변이 분자를 제공한다. 예로는 +104 위치의 루이신을 다른 아미노산 (예를 들어, 글루탐산)으로 변화시키고 +105 위치의 글리신, +25 위치의 세린, +30 위치의 트레오닌 또는 +29 위치의 알라닌이 임의의 다른 아미노산으로 변화시킨 하기 돌연변이 분자가 있다:
Figure 112008055668619-PAT00003
추가로 또한, 본 발명은 IgCγ1 잔기와 융합된, 3 개의 돌연변이를 포함하는 CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 돌연변이 분자를 제공한다. 예로는 +104 위치의 루이신을 다른 아미노산 (예를 들어, 글루탐산)으로 변화시키고, +29 위치의 알라닌을 다른 아미노산 (예를 들어, 티로신)으로 변화시키며 +25 위치의 세린을 다른 아미노산으로 변화시킨 하기 돌연변이 분자가 있다:
Figure 112008055668619-PAT00004
가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 분자의 CTLA4 부분과 Ig 부분 사이에 위치하는 접합 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 접합 아미노산은 글루타민을 포함하는 임의의 아미노산일 수 있다. 접합 아미노산은 당업계 공지된 분자 또는 화학적 합성법으로 도입될 수 있다.
본 발명은 돌연변이 분자의 CTLA4 부분의 세포외 도메인의 N-말단과 연결된 신호 펩티드 서열을 포함하는 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 신호 펩티드는 온코스타틴 M [Malik, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853] 또는 CD5 [Jones, N. H. et al., 1986 Nature 323: 346-349]로부터의 신호 펩티드, 또는 임의의 세포외 단백질로부터의 신호 펩티드를 포함하는, 돌연변이 분자의 분비를 허용하는 임의의 서열일 수 있다.
본 발명은 L104EIg (도 18에 포함된 바와 같음) 또는 L104SIg와 같은 CTLA4의 세포외 도메인의 단일 부위 돌연변이체를 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공하는데, 이 때 L104EIg 및 L104SIg를 그의 CTLA4 서열에서 돌연변이시켜 +104 위치의 루이신을 글루탐산 또는 세린으로 각각 치환시킨다. 단일 부위 돌연변이 분자는 추가로 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분, +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산 내지 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함한다. 돌연변이 분자의 면역글로불린 부분을 또한 돌연변이시켜 +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고 +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환할 수 있다. 별법으로, 단일 부위 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분을 가질 수 있다.
본 발명은 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환하고 +29 위치의 알라닌을 티로신, 루이신, 트레오닌 및 트립토판으로 각각 변화시킨 L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg 또는 L104EA29WIg와 같은 CTLA4의 세포외 도메인의 이중 부위 돌연변이를 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. +1 위치의 메티오닌에서 시작하여 +357 위치의 리신으로 종결하며 신호 (리더) 펩티드 서열을 추가한 L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg 및 L104EA29WIg에 대한 서열은 도 19 내지 22에 각각 나타낸 서열에 포함된다. 이중 부위 돌연변이 분자는 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분, +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산 내지 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 추가로 포함한다. 돌연변이 분자의 면역글로불린 부분을 또한 돌연변이시켜 +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고 +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환할 수 있다. 별법으로, 이들 돌연변이 분자는 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분을 가질 수 있다.
본 발명은 CTLA4의 세포외 도메인의 이중 부위 돌연변이, 예를 들어 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환하고 +105 위치의 글리신을 페닐알라닌, 트립토판 및 루이신으로 각각 치환한 L104EG105FIg, L104EG105WIg 및 L104EG105LIg를 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 이중 부위 돌연변이 분자는 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분, +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산 내지 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 추가로 포함한다. 면역글로불린 부분을 또한 돌연변이시켜 +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고 +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환할 수 있다. 별법으로, 상기 돌연변이 분자는 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분을 가질 수 있다.
본 발명은 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분, +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산 내지 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 포함하는 부분을 포함하는 이중 부위 돌연변이 분자인 L104ES25RIg를 제공한다. CTLA4의 세포외 도메인을 갖는 부분을 돌연변이시켜, +25 위치의 세린을 아르기닌으로 치환하고 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환한다. 별법으로, L104ES25RIg는 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분을 가질 수 있다.
본 발명은 CTLA4의 세포외 도메인에 이중 부위 돌연변이, 예를 들어 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환하고 +30 위치의 트레오닌을 글리신 및 아스파라긴으로 각각 치환한 L104ET30GIg 및 L104ET30NIg를 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 이중 부위 돌연변이 분자는 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분, +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산 내지 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 추가로 포함한다. 돌연변이 분자의 면역글로불린 부분을 또한 돌연변이시켜, +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고 +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환한다. 별법으로, 상기 돌연변이 분자는 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분을 가질 수 있다.
본 발명은 CTLA4의 세포외 도메인에 삼중 부위 돌연변이, 예를 들어 +104 위치의 루이신을 글루탐산으로 치환하고, +29 위치의 알라닌을 티로신을 변화시키며 +25 위치의 세린을 리신, 아스파라긴 및 아르기닌으로 각각 변화시킨 L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg를 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제공한다. 삼중 부위 돌연변이 분자는 +1 위치의 메티오닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분, +125 위치의 접합 아미노산 잔기 글루타민 및 +126 위치의 글루탐산 내지 +357 위치의 리신을 포함하는 면역글로불린 부분을 추가로 포함한다. 돌연변이 분자의 면역글로불린 부분을 또한 돌연변이시켜, +130, +136 및 +139 위치의 시스테인을 세린으로 치환하고 +148 위치의 프롤린을 세린으로 치환할 수 있다. 별법으로, 상기 돌연변이 분자는 -1 위치의 알라닌 내지 +124 위치의 아스파르트산을 포함하는 CTLA4 부분을 가질 수 있다.
가용성 CTLA4 돌연변이 분자의 추가의 실시양태는 B7과 결합하는 키메라 CTLA4/CD28 상동 돌연변이 분자를 포함한다 [Peach, R. J., et al., 1994 J Exp Med 180: 2049-2058]. 상기 키메라 CTLA4/CD28 돌연변이 분자의 예로는 HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 및 HS14가 있다 (미국 특허 제5,773,253호).
본 발명의 바람직한 실시양태는 가용성 CTLA4 분자, 예를 들어 CTLA4Ig (도 24에 나타낸 바와 같음, +1 위치의 메티오닌에서 시작하여 +357 위치의 리신에서 종결) 및 가용성 CTLA4 돌연변이 L104EA29YIg (도 19에 나타낸 바와 같음, +1 위치의 메티오닌에서 시작하여 +357 위치의 리신에서 종결)이다. 본 발명은 본 발명의 가용성 CTLA4 분자에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 추가로 제공한다. 한가지 실시양태에서, 핵산 분자는 DNA (예 를 들어, cDNA) 또는 그의 하이브리드이다. CTLA4Ig를 코딩하는 DNA (도 24)는 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 1991년 5월 31일 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 ATCC 제68629호를 부여받았았다. L104EA29YIg를 코딩하는 DNA (도 19에 포함된 서열)는 2000년 6월 19일에 ATCC에 기탁되었고 ATCC 기탁 번호 제PTA-2104호를 부여받았다. 별법으로, 핵산 분자는 RNA 또는 그의 하이브리드이다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 발현 벡터의 예로는 포유동물 숙주 세포에 대한 벡터 (예를 들어, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc 벡터, pCMV 벡터, pSG5 벡터 (Stratagene)), 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, pFB 벡터 (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) 또는 그의 변형된 형태, 아데노바이러스 벡터; 아데노 관련 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 효모 벡터 (예를 들어, pESC 벡터 (Stratagene))가 있으나 이에 제한되지 않는다.
호스트 벡터 시스템이 또한 제공된다. 호스트 벡터 시스템은 적합한 숙주 세포에서 본 발명의 벡터를 포함한다. 적합한 숙주 세포의 예로는 원핵 및 진핵 세포가 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 수행에 있어서, 진핵 세포가 또한 적합한 숙주 세포이다. 진핵 세포의 예로는 일차 또는 무한 증식인 임의의 동물 세포, 효모 (예를 들어, 사카로마이시즈 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이시즈 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris)) 및 식물세포가 있다. 골수종, COS 및 CHO 세포가 숙주로 사용될 수 있는 동물세포의 예이다. 특정 CHO 세포는 DG44 ([Chasin, et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556]; [Kolkekar 1997 Biochemistrv 36: 10901-10909]), CHO-K1 (ATCC 번호 제CCL-61호), CHO-K1 Tet-On 세포주 (Clontech), ECACC 85050302로 지칭된 CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO 클론 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO 클론 B (GEIMG, Genova, IT), ECACC 93061607로 지칭된 CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) 및 ECACC 92052129로 지칭된 RR-CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 식물 세포의 예로는 담배 (식물 전체, 세포 배양 또는 유합조직), 옥수수, 대두 및 벼 세포가 있다. 옥수수, 대두 및 벼 종자가 또한 허용된다.
본 발명의 CTLA4 돌연변이 분자를 자연적으로 발생하는 폴리펩티드로 단리할 수 있거나 또는 자연적, 합성, 반-합성 또는 재조합인지에 따라 임의의 원천으로부터 단리할 수 있다. 따라서, CTLA4 돌연변이 폴리펩티드 분자를 임의의 종, 특히 소, 양, 돼지, 쥐, 말 및 바람직하게는 인간을 포함하는 포유동물로부터 자연적으로 발생하는 단백질로 단리할 수 있다. 별법으로, CTLA4 돌연변이 폴리펩티드 분자를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현시킨 재조합 폴리펩티드로 단리할 수 있거나 또는 화학적으로 합성한 폴리펩티드로 단리할 수 있다.
당업자는 표준 단리 방법을 사용하여 단리된 CTLA4 돌연변이 분자를 용이하게 수득할 수 있다. 단리 성질 및 단리 정도는 원천 및 단리된 분자의 사용 용도에 의존할 것이다.
CTLA4 돌연변이 분자 및 그의 단편 또는 유도체를 재조합 방법으로 제조할 수 있다. 따라서, 야생형 CTLA4 분자를 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열을 조작하여 돌연변이를 도입하고 CTLA4 돌연변이 폴리펩티드 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성할 수 있다. 예를 들어, CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 프라이머 및 PCR 증폭을 사용하여 부위 특이성 돌연변이유발법으로 생성시킬 수 있다. 프라이머는 원하는 돌연변이를 도입하기 위해 설계된 특정 서열을 포함한다. 별법으로, 프라이머는 랜덤화 또는 반-랜덤화된 서열을 포함하도록 설계하여 랜덤 돌연변이를 도입할 수 있다. 표준 재조합 방법 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook, Fritch, and Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press] 및 PCR 기술 (미국 특허 제4,603,102호)을 사용하여 CTLA4 돌연변이 폴리펩티드를 코딩하는 CTLA4 돌연변이 폴리뉴클레오티드를 생성하고 단리할 수 있다.
본 발명은 가용성 CTLA4 분자의 제약상 유효량을 포함하는, 면역 시스템 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 시스템 질환은 CD28/CTLA4/B7 상호작용을 매개한다. 가용성 CTLA4 분자는 야생형 서열 및(또는) CTLA4의 세포외 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 가용성 CTLA4 분자를 갖는 가용성 CTLA4 분자가 바람직하다. 제약 조성물은 가용성 CTLA4 단백질 분자 및(또는) 상기 분자를 코딩하는 핵산 분자 및(또는) 벡터를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 가용성 CTLA4 분자는 도 24 또는 19에 나타낸 (각각 CTLA4Ig 또는 L104EA29Y) CTLA4의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 갖는다. 훨씬 더 바람직하게, 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 본원에 개시된 L104EA29YIg이다. 조성물은 약물 독소, 효소, 항체 또는 접합제를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
당업계 표준 관행에 따라, 당업자에게 공지된 허용가능한 담체 또는 보조제와 혼합된 본 발명의 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 제약 조성물은 본 발명의 분자 (예를 들어, 가용성 CTLA4 분자, 예를 들어 CTLA4Ig 또는 L104EA29Y)와 혼합되어 분자의 활성도를 유지시키고 대상체의 면역 시스템과 반응하지 않는 임의의 물질을 포함하는 적합한 담체 및 보조제를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 담체 및 보조제는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산과 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 인산염 완충 염수 용액, 물, 에멀젼 (예를 들어, 오일/물 에멀젼), 염 또는 전해질 (예를 들어 프로타민 술페이트, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이달 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스 기재 물질 및 폴리에틸렌 글리콜)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 담체는 또한 멸균 용액; 코팅된 정제 및 캡슐을 포함하는 정제를 포함할 수 있다. 전형적으로 상기 담체는 부형제, 예를 들어 전분, 우유, 당 (예를 들어, 수크로스, 글루코스, 말토스), 점토의 특정 유형, 젤라틴, 스테아르산 또는 그의 염, 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 칼슘, 활석, 식물성 지방 또는 오일, 고무, 글리콜 또는 다른 공지된 부형제를 함유한다. 상기 담체는 또한 감미료 및 착색 첨가제 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지된 통상적인 방법으로 제형화한다. 상기 조성물은 또한 리포좀과 같은 각종 지질 조성물뿐만 아니라 중합체 마이크로스피어와 같은 각종 중합 조성물 내에서 제형화할 수 있다.
방법
본 발명은 B7-양성 세포와 기능적인 CTLA4- 및 CD28-양성 세포 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다. 본 방법은 B7-양성 세포를 본 발명의 가용성 CTLA4 분자와 접촉시켜 가용성 CTLA4/B7 복합체를 형성시키는 것을 포함하는데, 상기 복합체는 B7 분자와 내인성 CTLA4 및(또는) CD28 분자의 반응을 방해한다.
본 발명은 또한 가용성 CTLA4와 인간의 B7-양성 세포의 접촉에 의해 T-세포 기능을 저해하지만 인간의 T-세포를 고갈시키지는 않는 방법을 제공한다. 가용성 CTLA4의 예로는 CTLA4Ig 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자, 예를 들어 L104EA29YIg가 있다.
본 발명은 류마티스성 질환과 같은 면역 시스템 질환을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 가용성 CTLA4 분자를 포함하는 치료용 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하여 면역 시스템 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 경감시키는 것을 포함한다. 추가로, 본 발명은 T-세포/B7-양성 세포 상호작용을 차단하여 CD28과 결합하는 B7과 같은 동시자극 신호에 의해 T-세포 자극을 차단하고 T-세포 무력성 또는 내성을 유도하는, 면역 시스템 질환에 대한 장기간 치료법을 제공할 수 있다. 면역 시스템 질환은 자가면역 질환, 면역증식성 질환 및 이식 관련 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이식 관련 질환의 예로는 이식 대 숙주 질환 (GVHD) (예를 들어, 골수 이식에 기인하거나 내성을 유도), 이식 거부, 만성 거부 및 실질 기관, 피부, 소도, 근육, 간세포, 신경을 포함하는 조직 또는 세포 동종이식 또는 이종이식과 관련된 면역 장애가 있다. 면역증식성 질환의 예로는 건선, T-세포 림프종, T-세포 급성 림프모세포성 백혈병, 고환 혈관중심성 T-세포 림프종, 양성 림프구 혈관염, 루프스 (예를 들어, 홍반성 루프스, 루프스 신염)와 같은 자가면역 질환, 하시모토 (Hashimoto) 갑상선염, 원발성 점액부종, 그레이브 (Graves) 질환, 악성 빈혈, 자가면역성 위축성 위염, 애디슨 (Addison) 질환, 당뇨병 (예를 들어, 인슐린 의존성 당뇨병, 유형 I 당뇨병, 유형 II 당뇨병), 굿파스튜어 증후군, 중증 근무력증, 천포창, 크론 (Crohn) 질환, 교감성 안염, 자가면역성 포도막염, 다발성 경화증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 결핍증, 원발성 담즙성 간경변, 만성 작용 간염, 궤양성 대장염, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 류마티스성 질환 (예를 들어, 류마티스성 관절염), 다발성근염, 피부경화증 및 혼합성 결합 조직 질환이 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 가용성 CTLA4 분자는 생체내에서 저해 특성을 보인다. T 세포와 B7-양성 세포 사이의 접촉에 의해 T-세포/B7-양성 세포 상호작용, 예를 들어 T 세포/B 세포 상호작용이 발생하는 조건하에서, B7-양성 세포, 예를 들어 B 세포와 반응하기 위해 도입된 CTLA4 분자의 결합은 면역 반응을 조절하는 T 세포/B7-양성 세포 상호작용을 방해, 즉 저해할 수 있다.
본 발명은 면역 반응을 하향조절하는 방법을 제공한다. 본 발명의 가용성 CTLA4 분자에 의한 면역 반응의 하향 조절은 이미 진행된 면역 반응을 저해하거나 차단하는 방법일 수 있거나 또는 면역 반응의 유도를 예방하는 것과 관련될 수 있다. 본 발명의 가용성 CTLA4 분자는 활성화된 T 세포의 기능, 예를 들어 T 림프구 증식 및 사이토카인 분비를 T 세포 반응의 억제에 의해 또는 T 세포의 특정 내성의 유도에 의해 또는 둘 다에 의해 저해할 수 있다. 추가로, CTLA4/CD28/B7 경로를 방해하는 본 발명의 가용성 CTLA4 분자는 T-세포 증식 및(또는) 사이토카인 분비를 저해하고, 따라서 조직 파괴 및 T-세포 비반응성 또는 무력성의 유도를 초래할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg를 사용하여 B7-양성 세포와 기능적 CTLA4- 및 CD28-양성 세포 상호작용을 조절하고, 류마티스성 질환과 같은 면역 시스템 질환을 치료하고(거나) 면역 반응을 하향조절하는 것을 포함한다. 본 발명의 L104EA29YIg는 2 개 이상의 아미노산 변화, +104 위치의 루이신 (L)을 글루탐산 (E)으로 변화 및 +29 위치의 알라닌 (A)을 티로신 (Y)으로 변화를 포함하는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자이다. L104EA29YIg 분자는 본원에 열거된 2 개 이외의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태는 가용성 CTLA4 분자의 유효량을 대상체에게 투여하여 류마티스성 관절염과 같은 류마티스성 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 치료용 조성물의 유효량을 투여하여, 관절 부종, 관절 압통, 염증, 조조 경직 및 동통 및 구조적 손상을 감소시키는 것을 포함하는, 질환과 관련된 대상체의 하나 이상의 증상을 경감시키고 후속적으로 신체 장애를 감소시킨다. 본 발명의 방법을 사용하여 적혈구 침강 속도, C-반응성 단백질의 혈청 농도, 가용성 ICAM-1, 가용성 E-셀렉틴 및(또는) 가용성 IL-2r을 감소시키는 것을 포함하는, 류마티스성 관절염과 관련된 하나 이상의 증상을 또한 감소시킬 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 증상 경감의 양은 임상 조절에서 증상 완화를 측정하고 기록하기 위해 확립한 임의의 허용된 기준을 사용하여 측정할 수 있다. 증상 경감의 측정에 허용가능한 기준은 미국 류마티즘 학회 (American College of Rheumatology) (예를 들어, ACR 20), 증상 경감의 4 가지 측정 ["CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA 1988] 및 건강상태 평가 설문지 (Health Assessment Questionnaire) (HAQ) [Fries, J. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 9: 789-793]에 의해 확립된 기준에 기초한 점수를 포함할 수 있다. 이들 기준의 일반적인 설명을 위해, ["Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA)", February 1999]를 참조.
본 발명에 의해 치료된 대상체는 인간, 원숭이, 유인원, 개, 고양이, 암소, 말, 토끼, 마우스 및 랫트를 포함하는 포유동물 대상체를 포함한다.
본 발명은 가용성 CTLA4 분자를 투여하기 위한 각종 국소적 또는 전신적 방법을 제공한다. 본 방법은 정맥내, 근육내, 복강내, 경구, 흡입 및 피하 방법뿐만 아니라 매몰식 펌프, 연속 주입, 유전자 치료, 리포좀, 좌약, 국소 접촉, 비히클, 캡슐 및 주사 방법을 포함한다. 담체와 배합된 치료제는 일반적으로 저장하기 위 해 동결건조시키고 투여 전에 물 또는 중성 pH (약 pH 7 내지 8, 예를 들어, pH 7.5)인 완충 용액으로 다시 용해시킬 수 있다.
당업계 표준 관행에 따라, 본 발명의 조성물을 임의의 제약상 허용가능한 형태로 대상체에게 투여할 수 있다.
본 발명의 수행에 있어서, 본 방법은 본 발명의 가용성 CTLA4 분자를 대상체에게 투여하여 B7-양성 세포와 CD28-및(또는) CTLA4-양성 세포 상호작용을 조절하는 것을 포함한다. B7-양성 세포는 본 발명의 가용성 CTLA4 분자 또는 그의 단편 또는 유도체의 유효량과 접촉하여 가용성 CTLA4/B7 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 B7 집단 분자와 내인성 CTLA4와 CD28 분자 사이의 상호작용을 방해한다.
가용성 CTLA4 분자를 대상체에서 내인성 B7 분자가 그들의 각각의 리간드와 결합하는 것을 차단하기에 충분한 양 및 충분한 시간 (예를 들어, 시간 길이 및(또는) 여러 회)으로 대상체에게 투여할 수 있다. 내인성 B7/리간드 결합을 차단하여 CD28- 및(또는) CTLA4-양성 세포와 B7-양성 세포 사이의 상호작용을 저해한다.
치료제의 투여량은 병에 걸린 조직의 유형, 치료하는 자가면역 질환의 유형, 질환의 중증도, 대상체의 건강상태 및 약물 치료에 대한 반응도를 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 인자에 의존한다. 따라서, 약물의 투여량은 각각의 대상체 및 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 가용성 CTLA4 분자를 하루에 환자 체중 1 kg 당 1일 약 0.5 내지 100 mg, 예를 들어 0.1 내지 20.0 mg, 바람직하게는 하루에 환자 체중 1 kg 당 0.5 내지 10.0 mg의 양으로 투여할 수 있다.
본 발명은 또한 다른 제약상 약물과 함께 본 발명의 조성물을 사용하여 면역 시스템 질환을 치료하는 것을 포함한다. 예를 들어, 류마티스성 질환은 코르티코스테로이드, 시클로스포린 [Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44 (2): 151-156], 프레드니손, 아자티오프린, 메토트렉세이트 [R. Handschumacher, in: "Drugs Used for Immunosuppression" pages 1264-1276], TNFα 차단제 또는 길항제 ([New England Journal of Medicine, vol. 340: 253-259, 1999]; [The Lancet vol. 354: 1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130: 478-486]) 또는 임의의 염증성 사이토카인을 표적으로 하는 임의의 다른 생물 제제, 비스테로이드성 소염 진통제/Cox-2 저해제, 히드록시클로로퀸, 술파살라조프린, 금 염, 에타너셉트, 인플릭시맵, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 타크로리스머스, 바실릭시맵, 시톡산, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 글라티라머 아세테이트, 미톡산트론 염화물, 아나킨라 및(또는) 다른 생물제제와 같은 면역 억제제와 함께 본 발명의 분자로 치료할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
가용성 CTLA4 분자 (바람직하게는, L104EA29YIg)를 또한 하나 이상의 하기 약물과 함께 사용하여 면역 반응을 조절할 수 있다: 가용성 gp39 (CD40 리간드 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP로 또한 공지됨), 가용성 CD29, 가용성 CD40, 가용성 CD80 (예를 들어, ATCC 제68627호), 가용성 CD86, 가용성 CD28 (예를 들어, 제68628호), 가용성 CD56, 가용성 Thy-1, 가용성 CD3, 가용성 TCR, 가용성 VLA-4, 가용성 VCAM-1, 가용성 LECAM-1, 가용성 ELAM-1, 가용성 CD44, gp39와 반응하는 항체 (예를 들어, ATCC 제HB-10916호, ATCC 제HB-12055호 및 ATCC 제HB-12056호), CD40과 반응하는 항체 (예를 들어, ATCC 제HB-9110호), B7과 반응하는 항체 (예를 들 어, ATCC 제HB-253호, ATCC 제CRL-2223호, ATCC 제CRL-2226호, ATCC 제HB-301호, ATCC 제HB-11341호 등), CD28과 반응하는 항체 (예를 들어, 마틴 (Martin) 등의 문헌 [J. Clin. Immun. 4 (1): 18-22,1980]에 기재된 바와 같은 ATCC 제HB-11944호 또는 mAb 9.3 ), LFA-1과 반응하는 항체 (예를 들어, ATCC 제HB-9579호 및 ATCC 제TIB-213호), LFA-2와 반응하는 항체, IL-2와 반응하는 항체, IL-12와 반응하는 항체, IFN-감마와 반응하는 항체, CD2와 반응하는 항체, CD48과 반응하는 항체, 임의의 ICAM과 반응하는 항체 (예를 들어, ICAM-1 (ATCC 제CRL-2252호), ICAM-2 및 ICAM-3), CTLA4와 반응하는 항체 (예를 들어, ATCC 제HB-304호), Thy-1과 반응하는 항체, CD56과 반응하는 항체, CD3과 반응하는 항체, CD29와 반응하는 항체, TCR과 반응하는 항체, VLA-4와 반응하는 항체, VCAM-1과 반응하는 항체, LECAM-1과 반응하는 항체, ELAM-1과 반응하는 항체, CD44와 반응하는 항체. 특정 실시양태에서, 모노클로날 항체가 바람직하다. 다른 실시양태에서, 항체 단편이 바람직하다. 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 병용은 본 발명의 가용성 CTLA4 분자 및 한가지 다른 면역 억제제, 2 가지 다른 면역 억제제와 가용성 CTLA4 분자, 3 가지 다른 면역 억제제와 가용성 CTLA4 분자 등을 포함할 수 있다. 최적 조합 및 투여량은 당업계 잘 공지된 방법을 사용하여 결정하고 최적화할 수 있다.
몇몇 구체적인 조합은 하기를 포함한다: L104EA29YIg와 CD80 모노클로날 항체 (mAb); L104EA29YIg와 CD86 mAb; L104EA29YIg, CD80 mAb와 CD86 mAb; L104EA29YIg와 gp39 mAb; L104EA29YIg와 CD40 mAb; L104EA29YIg와 CD28 mAb; L104EA29YIg, CD80 및 CD86 mAb와 gp39 mAb; L104EA29YIg, CD80 및 CD86 mAb와 CD40 mAb; 및 L104EA29YIg, 항-LFA1 mAb와 항-gp39 mAb. gp39 mAb의 구체적인 예는 MR1이다. 다른 조합을 당업자는 쉽게 인지하고 이해할 것이다.
본 발명의 가용성 CTLA4 분자, 예를 들어 L104EA29YIg를 면역 조절 섭생 또는 다른 항-염증성 작용제에서 활성 성분 단독으로 또는 다른 약물과 함께 투여하여 예를 들어 동종이식 또는 이종이식 급성 또는 만성 거부 또는 염증성 또는 자가면역성 장애를 치료 또는 예방하거나 내성을 유도할 수 있다. 예를 들어, 가용성 CTLA4 분자는 칼시뉴린 저해제, 예를 들어 시클로스포린 A 또는 FK506; 면역 억제성 매크롤리드, 예를 들어 라파마이신 또는 그의 유도체 (예를 들어, 40-0-(2-히드록시)에틸-라파마이신), 림프구 호밍 (homing) 작용제 (예를 들어, FTY720 또는 그의 유사체); 코르티코스테로이드; 시클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노미드 또는 그의 유사체; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-디옥시스페르구알린 또는 그의 유사체; 면역 억제성 모노클로날 항체, 예를 들어, 백혈구 수용체에 대한 모노클로날 항체 (예를 들어, MHC, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB 또는 그의 리간드); 또는 다른 면역 조절 화합물, 예를 들어 CTLA4/CD28-Ig 또는 다른 흡착 분자 저해제 (예를 들어, mAb 또는 LFA-1 길항제, 셀렉틴 길항제 및 VLA-4 길항제를 포함하는 저분자량 저해제)와 함께 사용할 수 있다. 상기 화합물은 CD40 및 그의 리간드, 예를 들어 CD40에 대한 항체 및 CD40-L에 대한 항체를 방해하는 화합물과 병용하는 것이 특히 유용하다.
예를 들어, 상기 열거한 바와 같이 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 다른 면역 억제성/면역 조절성 또는 항-염증성 치료제와 함께 투여하는 경우, 동시투여되는 면역 억제성, 면역 조절성 또는 항-염증성 화합물의 투여량은 물론 사용하는 동시-약물의 유형에 따라 (예를 들어, 동시-약물이 스테로이드 또는 시클로스포린인지에 따라), 사용하는 구체적인 약물, 치료 조건 등에 따라 달라질 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 본 발명의 가용성 CTLA4 분자 (예를 들어, CTLA4Ig 및(또는) L104EA29YIg) 및 상기 지시된 상기 면역 억제성, 면역 조절성 또는 항-염증성 약물인 제2 약물 물질의 치료 유효량의 동시-투여 (예를 들어, 동시 또는 차례로)를 포함하는 상기 정의한 추가의 양태 방법을 제공한다. 추가로 제공된 병용 치료의 예로는 면역 억제성, 면역 조절성 또는 항-염증성 약물을 포함하는 하나 이상의 제약 조성물을 동시 또는 차례로 사용하기 위한 유리 형태 또는 제약상 허용가능한 염 형태의 가용성 CTLA4 분자를 포함하는, 상기 정의된 임의의 방법에서 사용하기 위한 킷트가 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 가용성 CTLA4 돌연변이 분자는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 발현시킬 수 있다.
가장 흔히 원핵 생물을 박테리아의 각종 균주로 나타낸다. 박테리아는 그램 양성 또는 그램 음성일 수 있다. 전형적으로, 대장균 (E. coli)과 같은 그램 음성 박테리아가 바람직하다. 다른 미생물 균주가 또한 사용될 수 있다. 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 서열을 대장균과 같은 원핵 세포에서 이종 서열을 발현시키기 위해 설계된 벡터로 삽입할 수 있다. 상기 벡터는 일반적으로 리보좀 결합 부위 서열 및 임의의 오퍼레이터와 함께 전사 개시를 위한 프로모터를 포함하고, 베타-락타마제 (페니실리나제) 및 락토오스 (lac) 프로모터 시스템 [Chang, et al., (1977) Nature 198: 1056], 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057] 및 람다 유도된 PL 프로모터 및 N-유전자 리보좀 결합 부위 [Shimatake, et al., (1981) Nature 292: 128]와 같은 일반적으로 사용되는 프로모터를 포함하는 것으로 본원에 정의된 사용된 원핵 조절 서열을 포함할 수 있다.
상기 발현 벡터는 또한 복제 원점 및 항생제에 대한 내성을 부여하는 선별가능한 마커, 예를 들어 베타-락타마제 또는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함할 것이고, 따라서 상기 벡터는 플라스미드를 운반하는 박테리아 및 세포에서 복제할 수 있고 항생제, 예를 들어 암피실린 또는 카나마이신 존재하에 성장시키는 경우 선별할 수 있다.
발현 플라스미드를 CaCl2-쇼크 ([Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110] 및 [Sambrook et al. (eds.),"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)]) 및 전기영동을 포함하나 이에 제한되지 않는 각종 표준 방법을 통해 원핵 세포로 도입할 수 있다.
본 발명의 수행에 있어서, 진핵 세포가 또한 적합한 숙주 세포일 수 있다. 진핵 세포의 예로는 일차 또는 무한 증식인 임의의 동물 세포, 효모 (예를 들어, 사카로마이시즈 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이시즈 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 및 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris)), 및 식물 세포가 있다. 골수종, COS 및 CHO 세포는 숙주로 사용될 수 있는 동물 세포의 예이다. 특정 CHO 세포는 DG44 ([Chasin, et a;., 1986 Som. 세포. Molec. Genet. 12: 555-556]; [Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909]), CHO-K1 (ATCC 제CCL-61호), CHO-K1 Tet-On 세포주 (Clontech), ECACC 85050302라 지칭된 CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO 클론 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO 클론 B (GEIMG, Genova, IT), ECACC 93061607라 지칭된 CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) 및 ECACC 92052129라 지칭된 RR-CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대표적인 식물 세포는 담배 (식물 전체, 세포배양 또는 유합조직), 옥수수, 대두 및 벼 세포를 포함한다. 옥수수, 대두 및 벼 종자가 또한 사용가능하다.
CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 핵산 서열을 또한 진핵 숙주에 이종 서열을 발현하기 위해 설계된 벡터로 삽입할 수 있다. 벡터의 조절 인자는 특정 진핵 숙주에 따라 달라질 수 있다.
발현 벡터에서 사용하기 위한 일반적으로 사용된 진핵 조절 서열은 포유동물 세포와 상용가능한 프로모터 및 조절 서열, 예를 들어 CMV 프로모터 (CDM8 벡터) 및 조류 육아종 바이러스 (ASV) (πLN 벡터)를 포함한다. 다른 일반적으로 사용된 프로모터는 원숭이 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40) [Fiers, et al., (1973) Nature 273: 113]의 초기 및 후기 프로모터 또는 폴리오마, 아데노바이러스 2 및 소 유두종 바이러스로부터 유도된 다른 바이러스 프로모터를 포함한다. 유도가능 한 프로모터, 예를 들어 hMTII [Karin, et al., (1982) Nature 299: 797-802]가 또한 사용될 수 있다.
진핵 세포에서 CTLA4 돌연변이 분자를 발현하기 위한 벡터는 또한 인핸서 영역이라 불리는 서열을 운반할 수 있다. 이는 유전자 발현을 최적화하는데 중요하고 프로모터 영역의 상류 또는 하류에서 발견된다.
진핵 숙주 세포를 위한 발현 벡터의 예로는 포유동물 숙주 세포에 대한 벡터 (예를 들어, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc 벡터, pCMV 벡터, pSG5 벡터 (Stratagene)), 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, pFB 벡터 (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) 또는 그의 변형된 형태, 아데노바이러스 벡터; 아데노-관련 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 효모 벡터 (예를 들어, pESC 벡터 (Stratagene))가 있으나 이에 제한되지 않는다.
CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 핵산 서열은 진핵 숙주 세포의 게놈으로 합치될 수 있고 숙주 게놈 복제와 같이 복제할 수 있다. 별법으로, CTLA4 돌연변이 분자를 운반하는 벡터는 염색체외 복제를 허용하는 복제 원점을 함유할 수 있다.
사카로마이시즈 세레비제에서 핵산 서열을 발현시키기 위해, 내인성 효모 플라스미드의 복제 원점, 2 μ 고리가 사용될 수 있다 [Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307]. 별법으로, 자동 복제를 촉진할 수 있는 효모 게놈으로부터의 서열을 사용할 수 있다 (예를 들어, [Stinchcomb et al., (1979) Nature 282: 39)]; [Tschemper et al., (1980) Gene 10: 157]; 및 [Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101: 300] 참조).
효모 벡터에서 전사 조절 서열은 해당 효소의 합성을 위한 프로모터를 포함한다 ([Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149]; [Holland. et al., (1978) Biochemist 17: 4900]). 당업계 공지되 추가의 프로모터는 CDM8 벡터에서 제공된 CMV 프로모터 [Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268: 217221]; 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터 [Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073] 및 다른 해당 효소에 대한 프로모터를 포함한다.
프로모터가 환경적 자극 또는 세포 성장 배지에 의해 조절될 수 있기 때문에, 다른 프로모터가 유도가능하다. 이들 유도가능한 프로모터는 열 충격 단백질, 알콜 탈수소효소 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사 관련 효소 및 말토스 및 갈락토스 이용에 관련된 효소에 대한 유전자로부터 프로모터를 포함한다.
조절 서열은 또한 코딩 서열의 3'말단에 위치할 수 있다. 이 서열은 전령 RNA를 안정화시키는데 작용할 수 있다. 상기 터미네이터는 몇몇 효모-유도된 유전자 및 포유동물 유전자에서 코딩 서열 뒤의 3' 비번역 영역에서 발견된다.
식물 및 식물 세포를 위한 벡터의 예로는 아그로박테리움 (Agrobacterium) Ti 플라스미드, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 및 토마토 골든 모자이크 바이러스 (TGMV)가 있으나 이에 제한되지 않는다.
포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 액셀 (Axel) (1983년 8월 16일 출원된 미국 특허 제4,399,216호)에 기재되어 있다. 포유동물 세포는 인산 칼슘의 존재, 미량주입, 전기영동 또는 바이러스 벡터를 사용한 형질도입을 포함하나 이에 제한되지 않는 방법으로 형질전환시킬 수 있다.
식물 및 효모 게놈으로 이종 DNA 서열을 도입하는 방법은 (1) 기계적 방법, 예를 들어 단일 세포 또는 프로토플라스트로 DNA를 미량주입, DNA 존재하에 유리 비드로 세포를 보텍싱 또는 DNA-코팅된 텅스텐 또는 금 스피어를 세포 또는 프로토플라스트로 슛팅; (2) 폴리에틸렌 글리콜 처리 또는 높은 전압 전기 펄스로 정복하여 (전기영동) 거대분자가 침투할 수 있는 세포막을 만들어 DNA를 도입; 또는 (3) 세포막과 융합된 리포좀 (cDNA 함유)의 사용을 포함한다.
본 발명의 CTLA4 돌연변이 분자를 발현시킨 후, 이들을 세포 용해 (예를 들어, 초음파 분해, 리소자임 및(또는) 세척제) 및 표준 단백질 정제 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피 또는 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 수행한 단백질 회수와 같은 당업계에 잘 공지된 방법으로 수확하고, 실질적으로 순수한 생성물을 수득할 수 있다 ([R. Scopes in: "Protein Purification, Principles and Practice", Third Edition, Springer-Verlag (1994)]; [Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)]). CTLA4 돌연변이 분자의 발현은 당업계 공지된 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 분자를 쿠마시 스테이닝 (Coomassie staining) SDS-PAGE 겔 및 CTLA4와 결합하는 항체를 사용한 면역블롯팅으로 측정할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하고, 동일물을 제조하고 사용하는 정규 기술 중 하나를 돕기 위해 제공한다. 실시예는 임의의 방법으로 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 발명은 B7-양성 세포의 B7 분자와 결합하는 가용성 CTLA4 분자를 대상체에게 투여하여, 내인성 B7 분자의 T-세포의 CTLA4 및(또는) CD28과의 결합을 저해함으로써, 면역 시스템 질환을 치료하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 사용하는 가용성 CTLA4 분자에는 CTLA4Ig 및 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg가 포함된다.
실시예 1
하기는 본 발명의 CTLA4 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 생성하기 위해 사용한 방법의 설명을 제공한다.
먼저 CTLA4Ig를 코딩하는 플라스미드를 구성하였고, 미국 특허 제5,434,131호, 제5,885,579호 및 제5,851,795호에 기재된 CTLA4Ig 분자를 발현시켰다. 이어서 단일 부위 돌연변이 분자 (예를 들어, L104EIg)를 CTLA4Ig를 코딩하는 서열로부터 생성하고, 발현시키며, 각종 B7 분자에 대한 결합 역학을 시험하였다. L104EIg 뉴클레오티드 서열 (도 18에 나타낸 서열에 포함됨)을 주형으로 사용하여 이중 부위 CTLA4 돌연변이 서열 (도 19 내지 22에 나타낸 서열에 포함됨)을 생성하여 단백질로 발현시키고 결합 역학에 대해 시험하였다. 이중 부위 CTLA4 돌연변이 서열은 L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg 및 L104EA29WIg를 포함한다. 삼중 부위 돌연변이를 또한 생성하였다.
CTLA4Ig 구조물
그 내용이 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제5,434,131호, 제5,844,095호 및 제5,851,795호에 기재된 바와 같이 CTLA4의 세포외 도메인 및 IgC감마1 도메인을 포함하는 CTLA4Ig를 코딩하는 유전자 구조물을 구성하였다. CTLA4 유전자의 세포외 도메인을 공개된 서열 [Dariavach et al., Eur. Journ. Immunol. 18: 1901-1905 (1988)]에 상응하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR에 의해 클로닝하였다.
CTLA4에 대한 신호 펩티드가 CTLA4 유전자에서 확인되지 않았기 때문에, CTLA4의 예상된 서열의 N 말단을 중복된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 2 단계로 온코스타틴 M [Malik et al., Mol. and Cell. Biol. 9: 2847 (1989)]의 신호 펩티드와 융합시켰다. 제1 단계에서, 올리고뉴클레오티드, CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCT GTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (서열 1) (CTLA4의 N 말단 7 개 아미노산과 융합된 온코스타틴 M 신호 펩티드로부터 C 말단 15 개 아미노산을 코딩)를 전방향 프라이머로 사용하였고, TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (서열 2) (CTLA4 수용체를 코딩하고 Bcl I 제한 효소 부위를 함유하는 아미노산 서열의 119 내지 125 아미노산 잔기를 코딩)를 역방향 프라이머로 사용하였다. 이 단계에서 주형은 H38 세포 (살라후딘 (Salahudin) 및 갈로 (Gallo) 박사 (NCI, Bethesda, MD)가 제공한 HTLV II 감염된 T-세포 백혈병 세포주)의 전체 RNA 1 ㎍으로 합성한 cDNA였다. 제1 단계의 PCR 생성물의 일부를 온코스타틴 M 신호 펩티드의 N 말단 부분을 코딩하고 Hind III 제한 효소 부위를 함유하는 중복 전방향 프라이머, CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC (서 열 3) 및 동일한 역방향 프라이머를 사용하여 재증폭시켰다. PCR 반응의 생성물을 Hind III 및 Bcl I으로 분해시키고, Bcl I/Xba I과 함께 IgC(감마)1의 힌지, CH2 및 CH3 영역에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 절단된 cDNA 단편을 Hind III/Xba I 절단된 발현 벡터, CDM8 또는 Hind III/Xba I 절단된 발현 벡터 piLN (πLN으로 또한 공지됨)으로 라이게이션하였다.
CTLA4Ig에 상응하는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는 부다페스트 조약에 의해 1991년 5월 31일 ATCC에 기탁되었고 ATCC 기탁 번호 제68629호를 부여받았다.
CTLA4Ig 코돈에 기초한 돌연변이유발법:
돌연변이유발 및 스크리닝 방법을 개발하여 CD80 및(또는) CD86 분자로부터 더 느린 해리 속도 ("off" 속도), 즉 개선된 결합성을 갖는 돌연변이 CTLA4Ig 분자를 확인하였다. 이 실시양태에서, CTLA4의 세포외 도메인 (미국 특허 제6,090,914호, 제5,773,253호 및 제5,844,095호; 동시 계류중인 미국 특허 출원 제60/214,065호; 및 [Peach, R. J., et al J Exp Med 1994 180: 2049-2058]에 기재됨. CDR-유사 영역은 각각의 CDR 영역 및 CDR 모티프의 몇몇 아미노산, 상류 및(또는) 하류에 의해 확장을 포함한다)의 CDR-1, CDR-2 (C 가닥으로 또한 공지됨) 및(또는) CDR-3 영역에서 잔기 내에서 및(또는) 주위에서 돌연변이를 수행하였다. 이들 부위는 키메라 CD28/CTLA4 융합 단백질 [Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180: 2049-2058]의 연구 및 아미노산 잔기 측쇄가 용매에 노출되는 지를 예견하는 모델 및 아미노산 잔기 동일성 또는 CD28과 CTLA4 사이의 특정 위치에서 상동성의 결핍을 기준으로 선택하였다. 또한, 확인된 잔기에 대해 공간적으로 매우 근접한 (5 내지 20 옹스트롬 단위) 임의의 잔기는 본 발명의 고려된 부분이다.
B7 분자 (예를 들어, CD80, CD86)에 대한 친화성과 관련하여 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 합성하고 스크리닝하기 위해, 2 단계 방법을 적용하였다. 실험은 먼저 CTLA4 세포외 부분의 특정 코돈에서 돌연변이체 라이브러리를 생성한 후 BIAcore 분석법에 의해 라이브러리를 스크리닝하여 B7에 대한 반응성과 관련있는 돌연변이체를 확인하여 수행하였다. BIAcore 분석 시스템 (Pharmacia, Piscataway, N. J.)은 검출기에 위치한 덱스트란-코팅 센서 칩과 CD80Ig 또는 CD86Ig의 공유 결합과 본질적으로 연관된 표면 플라즈몬 공명 검출기 시스템을 사용한다. 이어서 시험 분자는 센서 칩을 함유하고 있는 챔버로 주입될 수 있고 결합하는 상보적 단백질의 양은 센서 칩의 덱스트란-코팅 측면과 물리적으로 관련된 분자량의 변화 및 검출기 시스템에 의해 측정할 수 있는 분자량의 변화에 기초하여 평가될 수 있다.
구체적으로, 단일 부위 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 주형으로서 돌연변이 되지 않은 (예를 들어, 야생형) CTLA4Ig를 코딩하는 DNA (미국 특허 제5,434,131호, 제5,844,095호, 제5,851,795호 및 제5,885,796호; ATCC 기탁번호 제68629호)를 사용하여 생성하였다. 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드 PCR 프라이머를 코돈의 1 및 2 위치에 임의의 염기를 허용하지만, 3 위치에 구아닌 또는 티아민만을 허용하는 (XXG/T; 또는 NNG/T로 또한 나타냄) 특정 코돈의 랜덤 돌연변이유발로 설계하였다. 상기 방법에서, 아미노산을 코딩하는 특정 코돈은 랜덤하게 돌연변이되어 각각의 20 개 아미노산을 코딩할 수 있다. 이와 관련하여, XXG/T 돌연변 이유발은 각각의 20 개 아미노산을 코딩하는 32 개의 가능한 코돈을 수득한다. CTLA4Ig의 CDR3-유사 루프 (MYPPPY)에 매우 근접한 돌연변이체를 코딩하는 PCR 생성물은 SacI/XbaI으로 분해되고 유사하게 잘린 CTLA4Ig(도 24에 포함됨) πLN 발현 벡터로 서브클로닝되었다. 상기 방법을 사용하여 단일-부위 CTLA4 돌연변이 분자 L104EIg를 생성하였다 (도 18에 포함됨).
CTLA4Ig의 CDR-1-유사 루프에 근접한 돌연변이유발에서, 먼저 잠재성 NheI 제한 부위를 PCR 프라이머-특이 돌연변이유발로 상기 루프의 5'에 도입하였다. PCR 생성물을 NheI/XbaI로 분해시키고 유사하게 잘린 CTLA4Ig 또는 L104EIg 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 상기 방법을 사용하여 이중-부위 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg를 생성하였다 (도 19에 포함됨). 특히, 단일-부위 CTLA4 돌연변이 분자, L104EIg를 코딩하는 핵산 분자를 주형으로 사용하여 이중-부위 CTLA4 돌연변이 분자, L104EA29YIg를 생성하였다.
CTLA4 돌연변이 분자를 코딩하는 이중 부위 돌연변이체 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 L104EA29YIg (미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 블러버드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2000년 6월 19일 기탁되었고, ATCC 기탁 번호 ATCC 제PTA-2104호를 부여받았음)를 주형으로 L104EIg를 사용하는 상기 기재한 돌연변이유발법을 반복하여 생성하였다. 상기 방법을 사용하여 CTLA4 분자 L104EA29YIg (도 19에 나타낸 서열에 포함됨), L104EA29LIg (도 20에 나타낸 서열에 포함됨), L104EA29TIg (도 21에 나타낸 서열에 포함됨) 및 L104EA29WIg (도 22에 나타낸 서열에 포함됨)를 코딩하는 다수의 이중 부위 돌연변 이체 뉴클레오티드 서열을 생성하였다. L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg 및 L104EA29YS25RIg를 코딩하는 삼중 부위 돌연변이체를 또한 생성하였다.
가용성 CTLA4 분자를 뉴클레오티드 서열로부터 발현시키고 하기 실시예 3에 개시된 단계 II 임상 연구에 사용하였다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 특히 PCR 증폭에 의한 핵산 서열의 복제는 염기 변화를 DNA 가닥으로 용이하게 도입한다. 그러나, 일부 코돈이 동일한 아미노산을 중복하여 코딩하기 때문에 뉴클레오티드 변화가 반드시 아미노산 변화로 번역되는 것은 아니다. 본원에 명백히 기재되어 있지 않는 한, 고유의 또는 야생형 서열, 잠재성 (즉, 번역된 아미노산의 변화를 일으키지 않는) 또는 그 반대의 뉴클레오티드의 임의의 변화는 본 발명의 범위내에 포함된다.
실시예 2
하기 실시예는 B7 분자에 대한 결합성이 돌연변이 되지 않은 CTLA4Ig 분자에 비해 더 높으며 실시예 1에 기재한 구조물로부터 발현된 단일 및 이중-부위 돌연변이체 CTLA4 폴리펩티드의 확인에 사용된 스크리닝 방법을 설명한다.
현행 시험관내 및 생체내 연구는 CTLA4Ig 자체는 항원 특이적 활성화된 T 세포의 프라이밍을 완전히 차단할 수 없음을 지시한다. CTLA4Ig 및 T 세포 증식의 저해를 측정하는 CD80 또는 CD86에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 시험관내 연구는 항-CD80 모노클로날 항체가 CTLA4Ig 저해를 증대시키지 않는다는 것을 지시한다. 그러나, 항-CD86 모노클로날 항체는 저해를 증대시키는데, 이는 CTLA4Ig가 CD86 상호작용을 차단하는데 효과적이지 않다는 것을 지시한다. 이러한 데이타는 CD80-매개 세포간 반응의 저해에 CTLA4Ig 농도가 CD86-매개 반응보다 약 100 배 낮음을 보여준 린슬리 (Linsley) 등의 문헌 [Immunity, (1994), 1: 793-801]에 의한 초기 발견을 지지한다. 이러한 발견을 토대로, 야생형 CTLA4보다 CD86에 대한 결합성이 더 높은 가용성 CTLA4 돌연변이 분자가 CTLA4Ig보다 항원 특이적 활성화된 세포의 프라이밍을 더 잘 차단할 수 있다는 것이 짐작된다.
이러한 목적을 위해서, 신규 스크리닝 방법을 사용하여 상기 실시예 1에 기재된 가용성 CTLA4 돌연변이 분자를 스크리닝하여 CTLA4의 세포외 도메인에서 CD80 및 CD86에 대한 결합성이 개선된 여러가지 돌연변이체를 확인하였다. "off" 속도가 농도에 따라 다르게 결정되는 것이 아니기 때문에, 이러한 스크리닝 전략은 "off" 속도가 분명히 느려진 돌연변이체를 단백질을 정제하거나 정량할 필요없이 직접적으로 확인할 수 있는 효과적인 방법이다 [O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212: 457-468].
COS 세포를 각각의 미니프렙 정제된 플라스미드 DNA로 형질감염시키고 수일동안 증식시켰다. 3 일 동안 조건화시킨 배양 배지를 가용성 CD80Ig 또는 CD86Ig로 코팅된 BIAcore 바이오센서 칩 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에 적용하였다. 돌연변이체 단백질의 특이적 결합 및 해리를 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다 [O'Shannessy, D. J., et al., (1993) Anal. Biochem. 212: 457-468]. 모든 실험은 25 ℃의 BIAcore (등록상표) 또는 BIAcore 2000 (등록상표) 바이오센서에서 수행하였다. 리간드를 표준 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 N-히드록시숙신이미드 커플링을 사용하여 연구 등급 NCM5 센서 칩 (Pharmacia)으로 고정시켰다 ([Johnsson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]; [Khilko, S. N., et al. (1993) J. Biol. Chem 268: 5425-15434]).
스크리닝 방법
24 웰 조직 배양 플레이트에서 성장시킨 COS 세포를 돌연변이체 CTLA4Ig로 일시적으로 형질감염시켰다. 3 일 후에, 분비된 가용성 돌연변이체 CTLA4Ig를 함유하는 배양 배지를 수집하였다.
조건화된 COS 세포 배양 배지를 CD86Ig 또는 CD80Ig로 유도된 BIAcore 바이오센서 칩에 흐르게 하고 (그린 (Greene) 등의 문헌 [1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771]에 기재된 바에 따름), "off" 속도가 야생형 CTLA4Ig의 경우에 관찰된 속도보다 더 느려진 돌연변이 분자를 확인하였다. 선택된 배지 샘플에 상응하는 DNA를 서열분석하고, DNA를 제조하여 대규모의 일시적인 COS 세포 형질감염을 수행하고, 배양 배지의 단백질 A를 정제한 후 CTLA4Ig 돌연변이체 단백질을 제조하였다.
BIAcore 분석 조건 및 평형 결합 데이타 분석을 본원에 참고문헌으로 인용된 제이. 그린 (J. Greene) 등의 문헌 [1996 J. Biol. Chem. 271: 26762-26771] 및 미국 특허 출원 제09/579,927호 및 제60/214,065호에 기재된 바와 같이 수행하였다.
BIAcore 데이타 분석
분석전에, 센서그램 (sensorgram) 기준선을 0 반응 단위로 정규화하였다. 샘플을 모의 (mock)-유도된 유동 셀에 흐르게 하여 용액들 사이의 굴절률 차이를 크게하는 백그라운드 RU 값을 결정하였다. Req 대 C의 플롯으로부터 평형 해리 상수 (Kd)를 계산하였는데, 이 때 Req는 정상 상태 반응에서 모의-유도된 칩의 반응을 뺀 것이고, C는 분석물질의 몰농도이다. 결합 곡선은 상업적인 비선형 곡선-작도 소프트웨어 (Prism, GraphPAD Software)를 사용하여 분석하였다.
우선 실험 데이타를 단일 수용체와 결합한 단일 리간드에 대한 모델 (1-부위 모델, 즉 단순한 랭뮈어 시스템, A + B ↔AB)로 작도하였고, 평형 결합 상수 (Kd = [A] ·[B] / [AB])를 방정식 R = Rmax ·C / (Kd + C)로부터 계산하였다. 이어서, 데이타를 가장 간단한 리간드 결합의 2-부위 모델 (즉, 방정식 R = Rmax1 ·C / (Kd1 + C) + Rmax2 ·C / (Kd2 + C)에 기재된 2 개의 상호작용하지 않는 독립된 결합 부위를 갖는 수용체에 대해)로 작도하였다.
이러한 2가지 모델의 적합도 (goodness-of-fits)를 실험 데이타와 시각적으로 비교하여 분석하고 제곱합의 F 검증을 통해 통계적으로 분석하였다. 2-부위 모델도 충분히 양호하게 적합하지만 (p < 0. 1), 더 단순한 1-부위 모델을 최적의 작도법으로 선택하였다.
BIA 평가 2.1 소프트웨어 (Pharmacia)를 사용하여 결합 및 해리 분석을 수행하였다. 결합 속도 상수 kon을 균일한 단일-부위 상호작용 및 평행한 2-부위 상호작용 모두를 가정할 수 있는 2 가지 방법으로 계산하였다. 단일-부위 상호작용의 경우에는, kon 값을 방정식 Rt = Req (1 - exp- ks (t- t0 ))에 따라 계산하였는데, 이 때 Rt는 주어진 시간 t에서의 반응이고; Req는 정상 상태에서의 반응이고; to는 주입 시작시의 시간이며; ks = dR/dt = kon ·Ckoff이고 이 때 C는 단량체 결합 부위의 항으로 계산한 분석물질의 농도이다. 2-부위 상호작용의 경우에는, 방정식 Rt = Req1 (1 - exp- ksl (t- t0 ) + Req2 (1 - expks2 (t- t0 ))에 따라 kon 값을 계산하였다. 각각의 모델에서, kon 값을 ks 대 C 플롯의 기울기에 대한 계산치 (약 70 ％ 최대 결합으로)로부터 결정하였다.
해리 데이타를 한 부위 (AB = A + B) 또는 두 부위 (AiBj= Ai + Bj) 모델에 따라 분석하고, 가장 우수한 작도 곡선으로부터 속도 상수 (koff)를 계산하였다. 2-결합 부위 모델을 사용한 경우, 잔류물이 기기의 백그라운드 (기기에 따라 2 내지 10 RU) 보다 큰 경우를 제외하고는 결합 부위 모델을 사용하였다. 수용체 점유 시간의 절반을 t1 /2 = 0.693/koff의 식을 사용하여 계산하였다.
유동 세포계측법:
뮤린 mAb L307.4 (항-CD80)를 벡튼 디킨슨 (Becton Dickinson) (San Jose, California)사로부터 구입하고 IT2.2 (항-B7-0 [또한 CD86으로 공지됨])를 파밍겐 (Pharmingen) (San Diego, California)사로부터 구입하였다. 면역 염색을 위해, 1O mM EDTA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 인큐베이션하여 CD80-양성 및(또는) CD86-양성 CHO 세포를 배양 용기로부터 제거하였다. 우선 CHO 세포 (1-10 x 105)를 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 DMEM 중에서 mAb 또는 면역글로불린 융합 단백질을 인큐베이션한 후, 세척하고 플루오레신 이소시아네이트-접합된 염소 항-마우스 또는 항-인간 면역글로불린 제2단계 시약 (Tago, Burlingame, California)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 최종적으로 세척하고 FACScan (Becton Dickinson)에서 분석하였다.
SDS - Page 및 크기 배제 크로마토그래피
트리스/글리신 4 내지 20 ％ 아크릴아미드 겔 (Novex, San Diego, CA)에서 SDS-Page를 수행하였다. 분석용 겔을 쿠마시 블루 (Coomassie Blue)로 염색하고, 디지털 스캐닝하여 젖은 겔의 화상을 수득하였다. CTLA4Ig (25 ㎍) 및 L104EA29YIg (25 ㎍)을 1.0 ml/분의 유동 속도의 0.02 ％ NAN3를 함유하는 인산염 완충 염수 중에서 평형된 TSK-GEL G300 SWXL 컬럼 (7.8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA)을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다.
CTLA4X C120S 및 L104EA29YX C120S
단쇄 CTLA4XC120S를 상기에서 기재한 바와 같이 제조하였다 [Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424]. 간단히, 온코스타틴 M CTLA4 (OMCTLA4) 발현 플라스미드를 주형으로 사용하였고, 전방향 프라이머, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (서열 4)를 선택하여 벡터의 서열과 매치시키며; 역방향 프라이머, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (서열 5)를 사용하여 CTLA4의 세포외 도메인의 마지막 7 개 아미노산 (즉, 아미노산 118 내지 124)에 상응하고 제한 효소 부위 및 종결 코돈 (TGA)을 함유하도록 하였다. 역방향 프라이머는 C120S (120 위치에서 시스테인을 세린으로) 돌연변이체를 지정하였다. 특히, 상기 나타낸 역방향 프라이머의 뉴클레오티드 서열 GCA (뉴클레오티드 34 내지 36)는 하기 뉴클레오티드 서열 중의 하나로 치환된다: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT 또는 GCT. 당업자가 이해하는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열 GCA는 시스테인에 대한 코돈 TGC의 역방향 상보 서열이다. 유사하게, 뉴클레오티드 서열 AGA, GGA, TGA, CGA, ACT 또는 GCT는 세린에 대한 코돈의 역방향 상보 서열이다. 중합효소 연쇄 반응 생성물을 HindIII/XbaI으로 분해하고 발현 벡터 πLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ)으로 직접적으로 서브클로닝하였다. L104EA29YXC120S를 동일한 방법으로 제조하였다. 각각의 구조물을 DNA 서열분석으로 확인하였다.
결합성이 큰 돌연변이체의 확인 및 생화학적 특성화
돌연변이유발법을 위해 24 개의 아미노산을 선택하였고, 생성된 2300 개 돌연변이 단백질을 표면 플라즈몬 공명 (SPR; 상기에 기재)에 의해 CD86Ig 결합에 대해 분석하였다. 각각의 부위에서 돌연변이유발의 두드러진 효과를 하기 표 II에 요약하였다. CDR-1 영역 (S25 내지 R33)에서 몇몇 아미노산의 랜덤 돌연변이유발은 리간드 결합을 명백하게 변화시키지 않았다. E31 및 R33 및 잔기 M97 내지 Y102의 돌연변이유발은 리간드 결합을 명백하게 감소시켰다. 잔기 S25, A29 및 T30, K93, L96, Y103, L104 및 G105의 돌연변이유발은 "on" 및(또는) "off" 속도를 느려지게 하였다. 이 결과는 CDR-1 (S25 내지 R33) 영역의 잔기 및 M97 내지 Y102 내부 또는 근처의 잔기가 리간드 결합에 영향을 준다는 이전의 발견을 사실을 확인시킨다 [Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 2049-2058].
S25, T30, K93, L96, Y103 및 G105 부위를 돌연변이유발하여 몇몇 돌연변이 단백질이 CD86Ig로부터의 "off" 속도가 느려지는 것을 확인하였다. 그러나, 이런 경우에, 느린 "off" 속도는 느린 "on" 속도에 의해 절충되어 전체 결합성이 야생형 CTLA4Ig에서 나타나는 것과 명백하게 유사한 돌연변이 단백질이 생성된다. 추가로, K93의 돌연변이유발은 충분한 응집을 유발시켜 역학적 변화를 일으킨다.
L104의 랜덤 돌연변이유발 후 COS 세포 형질감염 및 CD86Ig를 고정화된 배양 배지 샘플의 SPR에 의해 스크리닝하여 "off" 속도가 야생형 CTLA4Ig보다 약 2 배 느린 돌연변이 단백질을 함유하는 6 개의 배지 샘플을 수득하였다. 상기 돌연변이체에 상응하는 cDNA를 서열분석하여, 각각이 루이신에서 글루탐산으로의 돌연변이 (L104E)를 코딩한다는 것이 밝혀졌다. 명백하게, 루이신 104를 아스파르트산로의 치환 (L104D)은 CD86Ig 결합에 영향을 미치지 않았다.
이어서 표 2에 열거된 각각의 부위에서, PCR 주형으로 야생형 CTLA4Ig 대신에 L104E를 사용하여 상기 기재한 바와 같이 돌연변이유발법을 반복하였다. 다시 고정된 CD86Ig를 사용한 SPR 분석을 통해 알라닌 29의 돌연변이유발로 인해 "off" 속도가 야생형 CTLA4Ig보다 약 4 배 느린 단백질을 함유하는 6 개의 배양 배지 샘 플을 확인하였다. 가장 느린 2 개는 티로신 치환체 (L104EA29Y)였고, 2 개는 루이신 (L104EA29L)였고, 1 개는 트립토판 (L104EA29W)였으며 1 개는 트레오닌 (L104EA29T)였다. 명백하게, 야생형 CTLA4Ig에서 알라닌 29 단독으로 랜덤하게 돌연변이 하는 경우 느린 "off" 속도 돌연변이체가 확인되지 않았다.
정제된 L104E 및 L104EA29YIg의 상대적인 분자량 및 응집 상태를 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피로 평가하였다. L104EA29YIg (~1 ㎍; 레인 3) 및 L104EIg (~1 ㎍; 레인 2)는 환원 조건하에서 (~50 kDa; +βME; 2-머캡토에탄올 추가) 및 비환원 조건하에서(~1OO kDa; -βME) CTLA4Ig (~1 ㎍; 레인 1)와 같이 분명히 동일한 전기영동 이동도를 갖는다 (도 25a). 크기 배제 크로마토그래피는 이량체 CTLA4Ig (도 25b)와 같이 L104EA29YIg (도 25c)가 분명히 동일한 이동도를 갖는다는 것을 입증하였다. 도 25b에서 더 빨리 용출되는 부피크가 분자량이 큰 응집체를 나타내는 반면 주피크는 단백질 이량체를 나타낸다. CTLA4Ig의 약 5 ％가 더 큰 분자량 응집체로서 존재하지만 L104EA29YIg 또는 L104EIg의 응집의 증거는 없다. 따라서, L104EIg 및 L104EA29YIg를 사용하여 보여진 CD86Ig에 대한 강한 결합은 돌연변이체에 의해 유도된 응집에 기여할 수 없다.
평형 및 역학 결합 분석
평형 및 역학 결합 분석을 단백질 A 정제된 CTLA4Ig, L104EIg 및 L104EA29YIg에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 수행하였다. 결과를 하기 표 I에 나타냈다. 농도 범위 (5.0 내지 200 nM)에 걸쳐 생성된 결합 곡선으로부터 관찰된 평형 해리 상수 (Kd; 표 I)를 계산하였다. L104EA29YIg는 L104EIg 또는 CTLA4Ig보다 CD86Ig에 더 강하게 결합한다. L104EIg (6.06 nM) 또는 CTLA4Ig (13.9 nM)보다 낮은 L104EA29YIg의 Kd (3.21 nM)는 CD86Ig에 대한 L104EA29YIg의 결합성이 더 높다는 것을 지시한다. L104EA29YIg (3.66 nM)의 Kd가 L104EIg (4.47 nM) 또는 CTLA4Ig (6.51 nM)보다 더 낮다는 것은 CD80Ig에 대한 L104EA29YIg의 결합성이 더 높다는 것을 지시한다.
역학 결합 분석은 CD80에 결합하는 CTLA4Ig, L104EIg 및 L104EA29YIg의 상대적인 "on" 속도가 CD86Ig에 대한 "on" 속도와 유사하다는 것을 밝혀냈다 (표 I). 그러나, 이들 분자에 대한 "off" 속도는 동등하지 않았다 (표 I). CTLA4Ig과 비교하여, L104EA29YIg는 CD80Ig로부터 약 2 배 느린 "off" 속도 및 CD86Ig로부터 약 4 배 낮은 "off" 속도를 갖는다. L104E의 "off" 속도는 L104EA29YIg와 CTLA4Ig 사이의 중간치였다. 상기 돌연변이체의 도입이 "on" 속도에 유의하게 영향을 미치지 않기 때문에, L104EA29YIg로 관찰한 CD80Ig 및 CD86Ig에 대한 결합성 증가는 주로 "off" 속도의 감소에 기인하는 것으로 여겨진다.
CD86Ig 및 CD80Ig에 대한 L104EA29YIg의 결합성의 증가가 이량체와 관련된 각각의 단량체 방법에 영향을 주는 돌연변이체 때문인지 또는 각각의 단량체에 도입된 구조적 변화가 결합성을 증가시키는지를 결정하기 위해, CTLA4 및 L104EA29Y 세포외 도메인의 단쇄 구조물을 상기 기재한 바 및 린슬리 (Linsley) 등의 문헌 [(1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424]과 같이 시스테인 120을 세린으로 돌연 변이유발하여 제조하였다. 정제된 단백질 CTLA4XC120S 및 L104EA29YXC120S를 겔 투과 크로마토그래피 [Linsley et al., (1995), 상기 문헌]에 의해 단량체임을 확인한 후, 그 리간드 결합 특성을 SPR에 의해 분석하였다. CD86Ig에 대한 둘 다의 단량체 단백질의 결합 친화성이 각각의 이량체에서 보여진 것의 약 35 내지 80 배라는 결과를 얻었다 (표 I). 이는 사전에 개시된 CTLA4의 이량체가 강한 리간드 결합성을 필요함을 확인한 데이타를 입증한다 [Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762-26771].
L104EA29YXC120S는 CD80Ig 및 CD86Ig 둘다에 대해 CTLA4XC120S보다 약 2 배 더 큰 친화성으로 결합하였다. 이러한 친화성 증가는 둘다의 리간드로부터 해리 속도가 약 3 배 느리기 때문이었다. 따라서, L104EA29Y에 의한 강한 리간드 결합은 이량체화된 분자에서의 구조적 변화 때문이 아니라, 각각의 단량체 쇄로 도입되는 구조적 변화가 결합성을 증가시키기 때문이었다.
결합성을 증가시키는 돌연변이체의 위치 및 구조 분석
CTLA4의 세포외 IgV-유사 도메인의 용액 구조를 최근에 NMR 분광학에 의해 측정하였다 [Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4: 527-531]. 이는 3 차원 폴딩에서 루이신 104 및 알라닌 29의 정확한 위치를 제공하였다 (도 26a 좌측 및 우측 도). 루이신 104는 강하게 보존된 MYPPPY 아미노산 서열 근처에 위치한다. 알라닌 29는 MYPPPY 영역과 공간적으로 인접한 CDR-1 (S25 내지 R33) 영역의 C-말단 근처에 위치한다. 상기 두 영역 염기의 잔기 사이에 충분한 상호작용이 있 는 반면, L104 및 A29 둘 다가 단백질의 연속적인 소수성 코어의 부분을 포함하지만 L104과 A29 사이의 직접적인 상호작용이 분명하지는 않다. 결합성을 증가시키는 2 개의 돌연변이체의 구조적 결과를 모델링으로 평가하였다. A29Y 돌연변이체는 CDR-1 (S25 내지 R33) 영역과 MYPPPY 영역 사이의 틈에 용이하게 수용될 수 있고, MYPPPY 영역의 배열을 안정화시킬 수 있다. 야생형 CTLA4에서, L104는 MYPPPY 영역 근처에서 L96 및 V94와 광범위한 소수성 상호작용을 형성한다. 글루탐산 돌연변이체가 L104의 돌연변이체와 유사한 배열을 갖는 것은 2 가지 이유로 매우 불가능하다. 첫째로, CDR-1 (S25 내지 R33) 영역에 충분한 동요없이 구조내에 더 긴 글루탐산 측쇄를 수용하기에는 공간이 충분하지 않다. 둘째로, 글루탐산 측쇄의 음전하를 묻어버리는 에너지 비용이 클 수 있다. 대신에, 모델링 연구는 글루탐산 측쇄가 그의 전하를 용매화에 의해 안정화시킬 수 있는 표면으로 튀어나온다는 것을 예상한다. 상기 배열의 변화는 상기 영역의 다른 잔기를 최소로 왜곡시키면서 G105에 의해 용이하게 수용시킬 수 있다.
CD80 또는 CD86 을 발현하는 CHO 세포에 대한 높은 결합성을 갖는 돌연변이체
안정하게 형질감염된 CD80+ 및 CD86+CHO 세포와 결합하는 CTLA4Ig 및 돌연변이 분자의 FACS 분석 (도 27)을 본원에 기재한 바와 같이 수행하였다. CD80-양성 및 CD86-양성 CHO 세포를 CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 L104EIg의 농도를 증가시키면서 인큐베이션한 후 세척하였다. 결합된 면역글로불린 융합 단백질을 플루오레신 이소티오시아네이트-접합된 염소 항-인간 면역글로불린을 사용하여 검출하였다.
도 27에 나타낸 바와 같이, CD80-양성 또는CD86-양성 CHO 세포 (1.5 x 105)를 지시된 농도의 CTLA4Ig (검은 정사각형), L104EA29YIg (원) 또는 L104EIg (삼각형)로 2 시간 동안 23 ℃에서 인큐베인션하고, 세척하며 플루오레신 이소티오시아네이트-접합된 염소 항-인간 면역글로불린 항체로 인큐베이션 하였다. 총 5,000 개의 살아있는 세포의 결합을 FACScan으로 분석하고 (1 회 측정), 평균 형광 세기 (MFI)를 PC-LYSYS를 사용한 데이타 히스토그램으로부터 결정하였다. 데이타를 2 번째 단계 시약만으로 인큐베이션한 세포에서 측정된 백그라운드 형광에 대해 보정하였다 (MFI = 7). 대조군 L6 mAb (80 ㎍/ml)는 MFI < 30이었다. 이 결과는 4 개의 독립적인 실험을 나타낸다.
인간 CD80-형질감염된 CHO 세포와 L104EA29YIg, L104EIg 및 CTLA4Ig의 결합은 거의 동일하다 (도 27a). L104EA29YIg 및 L104EIg는 CTLA4Ig보다 인간 CD86으로 안정하게 형질감염된 CHO 세포와 더 강하게 결합한다 (도 27b).
기능 분석:
인간 CD4-양성 T 세포를 면역자기 음성 선택법으로 단리하였다 [Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176: 1595-1604]. 단리된 CD4-양성 T 세포를 적정한 농도의 억제제 존재하에 CD80-양성 또는 CD86-양성 CHO 세포와 함께 포볼 미리스테이트 아세테이트 (PMA)로 자극하였다. CD4-양성 T 세포 (8-10 x 104/웰)를 1 nM PMA 존재 및 조사된 CHO 세포 자극제 존재 또는 부재하에 배양하였다. 증식 반응을 72 시간 배양 중 최종 7 시간 동안 [3H] 티미딘 1 μCi/웰을 첨가하여 측정하였다. CD80-양성 CHO 또는 CD86-양성 CHO, L104EA29YIg 및 CTLA4Ig에 의해 자극된 T 세포와 함께 PMA의 억제를 수행하였다. 상기 결과를 도 28에 나타냈다. L104EA29YIg는 CTLA4Ig보다 CD80-양성 PMA 처리된 CHO 세포의 증식을 더 많이 억제한다 (도 28a). L104EA29YIg는 또한 CD86-양성 PMA 처리된 CHO 세포의 증식을 억제하는데 CTLA4Ig보다 더 효과적이다 (도 28b). 그러므로, L104EA29YIg는 T 세포의 CD80- 및 CD86-매개 동시자극에 더 효능있는 억제제이다.
도 29는 상기 제조되고 추가로 CD80 및 CD86 (3.0 x 1O4/웰의 T 세포및 8.O x 103/웰의 PM)을 발현시킨 PM이라 불리는 인간 B 림프아구양 세포주 (LCL)로 동종자극된 인간 T 세포의 L104EA29YIg 및 CTLA4Ig에 의한 억제를 나타낸다. 일차 동종자극을 6 일 동안 발생시킨 후, 세포를 3H-티미딘으로 7 시간 동안 처리하고, 방사선 표지의 혼입을 측정하였다.
이차 동종자극을 하기와 같이 수행하였다. 7 일 동안 일차 동종자극된 T 세포를 림프구 분리 배지 (LSM) (ICN, Aurora, OH)로 수확하고 24 시간 동안 방치하였다. 이어서 T 세포를 CTLA4Ig 또는 L104EA29YIg의 적정량 존재하에 상기와 같은 비율로 PM을 첨가하여 재자극 (이차)하였다. 3 일동안 자극한 후, 상기와 같이 세포를 방사선 표지로 처리하고 수확하였다. 일차 동종자극된 T 세포에서 L104EA29YIg의 효과를 도 29a에 나타냈다. 이차 동종자극된 T 세포에서 L104EA29YIg의 효과를 도 29b에 나타냈다. L104EA29YIg는 CTLA4Ig보다 더 크게 일차 및 이차 T 세포 증식 반응 둘 다를 억제한다.
사이토카인 생성을 측정하기 위해 (도 30), 한쌍의 이차 동종자극 플레이트를 장치하였다. 3 일 후, 배양 배지를 제조사가 추천한 조건에서 ELISA 킷트 (Biosource,Camarillo, CA)를 사용하여 분석하였다. L104EA29YIg는 이차 동종 자극 후 T 세포 IL-2, IL-4 및 γ-IFN의 사이토카인 생성을 차단하는데 CTLA4Ig보다 더 효능있는 것으로 밝혀졌다 (도 30a 내지 c).
원숭이 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 L104EA29YIg 및 CTLA4Ig 의 효과를 도 31에 나타냈다. 2 마리 원숭이로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC'S; 각각의 원숭이로부터 3.5 x 104 세포/웰)를 림프구 분리 배지 (LSM)로 정제하고 2 ㎍/ml 식물성 혈구응집소 (PHA)와 혼합하였다. 세포를 3 일동안 자극한 후 방사선 표지를 16 시간 동안 처리하고 수확하였다. L104EA29YIg는 CTLA4Ig보다 더 강하게 원숭이 T 세포 증식을 억제하였다.
평형 및 분명한 역학 상수를 하기 표에 나타낸다 (값은 3 회의 다른 실험으로부터 평균 표준 편차이다)
<표 I>
Figure 112008055668619-PAT00005
열거된 부위에서의 CTLA4Ig 돌연변이유발에 의한 CD86Ig 결합에의 효과를 상기 기재한 SPR로 측정하였다. 주된 효과를 "+" 표시로 표시하였다.
<표 II>
Figure 112008055668619-PAT00006
실시예 3
하기는 가용성 CTLA4 돌연변이 분자 L104EA29YIg (LEA29Y 또는 LEA로 또한 표시됨) 또는 CTLA4Ig를 투여하여, 관절 부종, 관절 압통, 염증, 조조 경직 및 동통을 감소시키는 것을 포함하는 류마티스성 관절염과 관련된 하나 이상의 증상을 경감시키는 인간 환자의 II 상 임상 연구에 대한 설명을 제공한다. 본원에 사용한 CTLA4Ig 분자는 도 24에 나타낸 바와 같이 +1 위치의 메티오닌에서 (또는 별법으로 -1 위치의 알라닌에서) 시작하여 +357 위치의 리신으로 종결한다. CTLA4Ig 분자의 실시양태를 코딩하는 DNA를 ATCC 제68629호로 기탁하였다. 본원에 사용한 L104EA29YIg 분자는 도 19에 나타낸 바와 같이 +1 위치의 메티오닌에서 (또는 별법으로 -1 위치의 알라닌에서) 시작하여 +357 위치의 리신으로 종결한다. L104EA29YIg 분자의 실시양태를 코딩하는 DNA를 ATCC 제PTA 2104호로 기탁하였다.
추가로, 하기는 L104EA29YIg 또는 CTLA4Ig를 투여하여 적혈구 침강 속도 및 C-반응성 단백질 및(또는) IL2 수용체의 혈청 농도를 감소시키는 것을 포함하는 류마티스성 관절염과 관련된 하나 이상의 생물학적 대체 마커를 경감시키는 인간 환자의 설명을 제공한다.
환자 지원자
54 명의 남성 및 160 명의 여성을 포함하는 총 214 명의 환자가 본 연구에 참여하였다 (도 1a, 1b). 기준의 환자는 평균 질환 지속기간이 3.4 (±2.0)년이고 하나 이상의 항류마티스 약제 (DMARD)에 대해 효과가 없었다. 안정한 비스테로이드성 소염 진통제 (NSAIDS) 또는 스테로이드 (< 10 mg/일)를 투여하고 동시에 DMARDS를 금지하였다. 상기 환자는 처리 군 당 25 내지 32 명의 환자의 군으로 랜덤화하였다. 32 명의 환자가 플라시보를 받았고, 92 명은 L104EA29YIg를 받았고 90 명은 CTLA4Ig를 받았다. 프로토콜 지침에 따르고 57 일 후에 중지한 환자는 1, 15, 29 및 57일째에 각각 하나의 주입액, 총 4 개의 정맥내 주입액을 받았다. 모든 환자를 1, 15, 29, 43, 57, 71 및 85 일째에 평가하였다. 투여된 1 회 분량은 0.5, 2.0 또는 10.0 mg/kg의 L104EA29YIg (도 1a 내지 1e에 각각 LEA.5, LEA2 및 LEA10로 나타냄) 또는 CTLA4Ig (도 1a 내지 1e에 각각 CTLA.5, CTLA2 및 CTLA10으로 나타냄)를 포함한다.
모든 대상체를 가능한 이상 반응을 열거한 설문지에 답안을 작성하게 하여 주변-주입 이상 반응 및 전반적인 안정성에 대해 모니터링하였다. 환자는 주입 후 24 시간 내에 발생할 수 있는 가능한 이상 반응에 대해 질문받았다. 추가로, 환자들이 경험한 임의의 이상 반응에 대해 자발적인 보고를 하도록 하였다. 치료자는 혈액 화학 및 혈액학에서, 예를 들어 사이토카인 (TNF, IL-6), 트립타제 및 보충물과 같은 염증성 반응 매개체의 농도 평가에서 비정상적인 환자의 실험 샘플을 정기적으로 모니터링하였다. 일차 종말점은 85일째 ACR 20 기준에 부합하는 대상체의 비율이었다.
시험 물질의 저장
CTLA4Ig 및 L104EA29YIg를 CTLA4Ig 200 mg/바이알 또는 L104EA29YIg 100 mg/바이알을 각각 함유한 일회용 유리 바이알에 공급하였다. 주입하기 전에, CTLA4Ig 및L104EA29YIg를 주사용 멸균수 (SWFI)로 최종 농도 25 mg/ml이 되게 희석하였다.
투여 프로토콜
모든 주입액을 1 시간 동안 정맥내로 투여하였다 (도 1 내지 17). 모든 대 상체는 하나 이상의 연구 의약 주입액을 받았다.
1 군: 32 명의 환자, CTLA4Ig 또는 L104EA29YIg와 매치되는 플라시보.
2 군: 26 명의 환자; 투여량 CTLA4Ig 0.5 mg/kg .
3 군: 32 명의 환자; 투여량 CTLA4Ig 2.0 mg/kg.
4 군: 32 명의 환자; 투여량 CTLA4Ig 10.0 mg/kg.
5 군: 32 명의 환자; 투여량 L104EA29YIg 0.5 mg/kg.
6 군: 29 명의 환자; 투여량 L104EA29YIg 2.0 mg/kg.
7 군: 31 명의 환자; 투여량 L104EA29YIg 10.0 mg/kg.
임상 모니터링
임의의 주입액을 받기 전, 질환 활성도의 기준 증상에 대해 환자를 평가하였다. 이들 기준 평가는 환자 및 치료자에 의해 평가된 관절 부종, 관절 압통, 염증, 조조 경직, 질환 활성도뿐만 아니라 건강상태 평가 설문지 (HAQ)에 의해 평가된 장애 (도 1c에 신체 기능 점수로 보고됨) 및 동통 (도 1a 내지 1d)을 포함한다. 추가로, 기준 평가는 적혈구 침강 속도 (ESR) 및 C-반응성 단백질 (CRP)의 혈청 농도 및 가용성 IL-2 수용체 (IL-2r)를 포함한다 (도 1c 및 1d).
임상 반응 연구는 미국 류마티즘 학회 (ACR)에 의해 확립된 기준을 기초로 하였다. 압통성 및 부종성 관절 수치에서 20 ％ 개선되고, 환자 및 치료자 전체 질환 변화, 동통, 장애 및 급성기 반응물 ([Felson, D. T., et al., 1993 Arthritis and Rheumatism 36: 729-740]; [Felson, D. T., et al., 1995 Arthritis and Rheumatism 38: 1-9])과 같은 측정된 남은 5 가지 증상 중 3 가지에서 20 ％ 개선된 경우, 대상체는 ACR20 기준을 충족하였다.
생체마커
질환 활성도의 가능한 생체마커 (류마티스성 인자, CRP, ESR, 가용성 IL-2R, 가용성 ICAM-1, 가용성 E-셀렉틴 및 MMP-3)를 또한 평가하였다. 확인된 효소 면역 분석 (EIA) 방법을 사용하여 IL-2sRα, sICAM-1, sE-셀렉틴 및 MMP-3의 혈청 농도를 측정하였다. 필요한 경우, TNFα 및 IL-6을 주입 전 및 주입 2 시간 후에 평가하였다.
IL-2sRα, sICAM-1 및 sE-셀렉틴을 알 앤드 디 시스템, 인크. (R & D Systems, Inc.) (Minneapolis, MN)사에서 구입한 상업적으로 시판되는 비색분석 EIA 킷트를 사용하여 측정하였다. 정량의 하한 및 상한값은 각각 312 내지 20,000 pg/ml, 40 내지 907 ng/ml 및 10 내지 206 ng/ml였다. 분석 간 계수의 편차는 각각 4.48 내지 8.4 ％, 3.8 내지 5.0 ％ 및 5.5 내지 9.0 ％의 범위였다. 킷트 제조사에 따라, 정상적인 혈청 값은 각각 676 내지 2,132 pg/ml의 범위였다.
MMP-3를 아머샴 파마시아 바이오텍 (Amersham Pharmacia Biotech) (Piscataway, NJ)사에서 구입한 상업적으로 시판되는 비색분석 EIA 킷트를 사용하여 측정하였다. 정량의 하한 및 상한값은 30 내지 7,680 ng/ml였다. 분석 간 계수의 편차는 6.3 내지 10.6 ％였다. 킷트 제조사에 따라, 정상적인 혈청 값은 28 내지 99 ng/ml의 범위였다.
IL-6 및 TNFα를 알 앤드 디 시스템, 인크. (Minneapolis, MN)사에서 구입한 상업적으로 시판되는 비색분석 EIA 킷트를 사용하여 측정하였다. 정량의 하한 및 상한값은 각각 0.3 내지 3,000 pg/ml 및 0.7 내지 7,000 pg/ml였다. 분석 간 계수의 편차는 각각 3.1 내지 5.7 ％ 및 6.4 내지 20.7 ％였다. 킷트 제조사에 따라, 정상적인 혈청 값은 각각 0.3 내지 12 pg/ml 미만 및 0.7 내지 7.5 pg/ml 미만의 범위였다.
항체 시험
혈청 샘플을 투여 1 일 전 및 대체로 15, 29, 57, 85 및 169 일에 약물-특이성 항체의 평가를 위해 수득하였다. 분자의 면역글로불린 (Ig) 부분에 대해 지시된 미리 존재하는 역가가 높기 때문에, Ig 불변 영역이 없는 CTLA4Ig 및 LEA29Y에 대한 특이성 항체 형성을 또한 평가하였다.
96 웰 이뮬론 (Immulon) II ELISA 플레이트 (Dynex, Chantilly, Virginia)를 인산염 완충 염수 (PBS) 중 각각 2, 4, 2 또는 1 ㎍/ml의 CTLA4Ig, Ig 불변 영역이 없는 CTLA4Ig, LEA29Y 또는 Ig 불변 영역이 없는 LEA29Y로 코팅하고 2 내지 8 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 0.05 ％ 트윈 (Tween) 20을 함유한 PBS로 세척하고 1 ％ 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유한 PBS로 37 ℃에서 1 시간 동안 차단하였다. 이어서 플레이트를 세척하고 시험 혈청 또는 품질 관리 (QC) 혈청의 연속 희석액을 적절한 웰에 첨가하여 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 혈청을 1 : 10에서 시작하여 0.25 ％ BSA 및 0.05 ％ 트윈 20과 함께 PBS로 3 배 희석하였다. 플레이트를 세척하고 알칼린-포스파타제-접합된 염소 항-인간 카파 및 람다 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama) 항체 칵테일을 첨가하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척 하고 디에탄올아민 완충용액 중 파라-니트로페닐 포스페이트 1 mg/ml을 각각의 웰에 첨가하였다. 25 ℃에서 30 분 후, 반응을 3 N NaOH로 중지시키고 흡수 (이중 파장: 405 nm 및 550 nm)를 기록하였다. 흡광도가 평균 플레이트 배경 흡광도의 5 배 초과이거나 동일한 것으로 기록된 최대 희석률의 역수로 정의된, 종말점 역가 (EPT)로 결과를 나타냈다. 플레이트 배경을 혈청 부재시 기록된 흡광도 측정으로 결정하였다. 수치가 2 회 이상의 연속 희석액 (9 배)이거나 투여 전 EPT 값에 비해 더 큰 경우, 수치는 혈청전환에 대해 양성이라 생각된다. CTLA4Ig- 또는 LEA29Y- 특이성 항체에 대해 양성인 혈청 QC 샘플을 면역이 된 원숭이로부터 생성하였다. 적절한 QC 샘플의 분액을 각각의 분석적 수행동안 분석하였다. QC 샘플이 분석 수용 기준내에 있는 경우에만 분석적 수행을 허용하였다.
결과
CTLA4Ig 및 L104EA29YIg는 일반적으로 모든 투여 농도에서 내성이 있었다. 주변-주입 이상 반응은 두통을 제외하고는 모든 투여 군에서 유사했다. 85 일째 환자의 두통 반응은 각각 0.5, 2.0 및 10.0 mg/kg으로 CTLA4Ig-처리된 환자의 23 ％, 44 ％ 및 53 ％ 및 L104EA29YIg-처리된 환자의 34 ％, 45 ％ 및 61 ％로 투여량에 의존하여 증가하였다. 반대로, 플라시보를 투여한 환자의 31 ％가 두통을 경험하였다.
관절염 발적 및 다른 이상 반응 때문에 임상 연구를 중단한 환자의 백분율을 도 2에 요약하였다. 훨씬 더 큰 백분율의 플라시보의 환자가 관절염 발적 때문에 치료를 중단하였다. CTLA4Ig 처리한 환자는 투여량의 증가에 따라 더 적게 치료를 중단하였다. L104EA29YIg로 처리한 환자는 매우 적은 수가 치료를 중단하였다. 이런 결과는 CTLA4Ig에 대해 투여량-의존성의 양호한 역전 반응이 있음을 나타내고, L104EA29YIg 치료에 대해 더 강한 치료 반응이 있음을 나타낸다.
CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보로 처리한 환자의 85 일째 ACR-20, -50 및 -70 반응을 도 3a에 요약하였다. 유사하게, 도 3b 및 c는 신뢰 한계 95 ％로 ACR-20 반응을 나타낸다. 반응은 환자 체중 1 kg 당 10 mg에서 명백히 충분한 반응을 갖는 투여량 의존성을 보인다.
CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보로 처리하였을 때 반응이 없는 환자와 비교하여 부종성 및 압통성 관절 수치가 감소된 환자의 백분율을 도 4a 및 b에 나타냈다. 치료 반응은 투여량 의존성을 보였다. 큰 백분율의 환자가 둘 다의 생성물에 대한 2 및 10 mg/kg 군에서 20, 50, 70 및 100 ％ 까지의 개선을 보였다.
CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보를 사용하여 환자 및 치료자의 평균 점수 단위에 의해 평가된, 질환 활성도인 동통이 감소된 환자 백분율을 도 5a, b, c 및 d에 나타냈다. 리커트 척도에 의해 모니터링된 치료 반응은 85 일째 플라시보와 비교한 바와 같이 활성 처리 군에 대해 투여량 의존성을 보인다. 리커트 척도는 증상을 평가하기 위해 형용사를 사용한 확인된 언어적 평가 척도이다 [The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993,36 (6): 729-740].
CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보로 처리한 결과인 2 단위 이상에 의한 기준으로부터 질환 활성도 변화에 대한 환자 및 치료자 평가를 도 6a 및 b에 나타냈다. 반응은 투여량 의존성을 보이며 더 높은 투여량의 활성 약물에서 더 두드러지게 개선된다.
CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보로 처리한 환자에서 C-반응성 단백질 (CRP) 농도의 감소 백분율을 도 7a 및 b에 나타냈다. 반응은 투여량 의존성을 보이며 2 및 10 mg/kg 활성 성분 처리 군에서 명확한 감소가 나타났다. 추가로, 도 7b는 신뢰 구간 95 ％로 플라시보와 비교하여 매우 큰 차이를 보였다. 도 7c는 85 일째 기준으로부터 혈청 농도 변화에서의 변화를 보여준다.
도 8은 CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보로 처리한 환자에서 혈청 가용성 IL-2 수용체의 양을 나타낸다. 가용성 IL-2 수용체 농도의 감소는 투여량 의존성을 보인다.
도 33은 CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보로 처리한 환자에서 혈청 가용성 ICAM-1 및 가용성 E-셀렉틴의 양을 나타낸다. 가용성 ICAM-1 및 가용성 E-셀렉틴 농도의 감소는 투여량 의존성을 보인다.
도 9a 및 b는 CTLA4Ig 또는 플라시보로 처리한 환자에서 시간에 따른 중간 및 평균 압통성 관절 수치를 나타낸다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 압통성 관절의 감소)는 플라시보 또는 0.5 mg/kg 군에 비해 2 및 10 mg/kg 처리 군에서 더 높은 것으로 보인다.
CTLA4Ig 또는 플라시보로 처리한 환자에서 시간에 따른 중간 및 평균 부종성 관절 수치를 도 10a 및 b에 나타냈다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 부종성 관절의 감소)는 플라시보 또는 0.5 mg/kg 군에 비해 2 및 10 mg/kg 처리 군에서 더 높은 것으로 보인다.
CTLA4Ig 또는 플라시보로 처리한 환자에서 시간에 따른 평균 동통 평가 점수를 도 11에 나타냈다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 동통의 감소)는 플라시보 또는 0.5 mg/kg 군에 비해 2 및 10 mg/kg 처리 군에서 더 높은 것으로 보인다.
CTLA4Ig 또는 플라시보로 처리한 환자에서 환자 또는 치료자가 평가한 시간에 따른 평균 질환 활성도 평가 점수를 도 12a 및 b에 나타냈다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 질환 활성도의 감소)는 플라시보 또는 0.5 mg/kg 군에 비해 2 및 10 mg/kg 처리 군에서 더 높은 것으로 보인다.
L104EA29YIg (도면에 LEA로 나타냄) 또는 플라시보로 처리한 환자에서 시간에 따른 중간 및 평균 압통성 관절 수치를 도 13a 및 b에 나타냈다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 압통성 관절의 감소)는 투여량 의존성을 보인다.
L104EA29YIg (도면에 LEA로 나타냄) 또는 플라시보로 처리한 환자에서 시간에 따른 중간 및 평균 부종성 관절 수치를 도 14a 및 b에 나타냈다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 부종성 관절의 감소)는 플라시보 또는 0.5 mg/kg 군에 비해 2 및 10 mg/kg 처리 군에서 더 높은 것으로 보인다.
L104EA29YIg (도면에 LEA로 나타냄) 또는 플라시보로 처리한 환자에서 시간에 따른 평균 동통 평가 점수를 도 15에 나타냈다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 동통의 감소)는 투여량 의존성을 보인다.
L104EA29YIg (도면에 LEA로 나타냄) 또는 플라시보로 처리한 환자에서 시간 에 따른 평균 질환 활성도 평가 점수를 도 16a 및 b에 나타냈다. 기준으로부터의 변화 (예를 들어, 질환 활성도의 감소)는 투여량 의존성을 보인다.
CTLA4Ig, L104EA29YIg 또는 플라시보로 처리한 환자에 대해 85 일째 HAQ에 의해 평가된 신체 장애의 개선 백분율을 도 17에 나타냈다 [Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 9: 789-793]. 상기 파라미터에 있어서 명확한 투여량 의존성 개선이 있다.
가용성 IL-2r 및 C-반응성 단백질 농도에 대한 기준으로부터의 변화는 처리 군 둘 다에서 투여량 의존적이다. 처리 후, 가용성 IL-2r 농도는 플라시보에서 +3 ％인 것과 비교하여, 각각 0.5, 2.0 및 10.0 mg/kg의 CTLA4Ig에서 -2 ％, -10 ％ 및 -22 ％이고 L104EA29YIg에서 -4 ％, -18 ％ 및 -32 ％이었다. C-반응성 단백질 농도는 플라시보에서 +20 ％인 것과 비교하여 각각 0.5, 2.0 및 10.0 mg/kg의 CTLA4Ig에서 +12 ％, -15 ％ 및 -32 ％이고 L104EA29YIg에서 +47 ％, -33 ％ 및 -47 ％이었다 (도 7a).
둘 다의 약물의 더 높은 투여량에서 IgA 및 IgG 농도에 약간의 억제가 있는 것을 제외하고는 일반적인 혈액학 시험, 화학 실험 시험에 대해 임상적으로 두드러진 결과, 신체적 결과 또는 바이탈 싸인 평가가 관측되지 않았다. 특히, 의약 투여가 약물-특이성 항체도 유도하지 않았다.
실시예 4
하기 실시예는 L104EA29YIg를 투여하여 확인된 방사선 척도를 사용한 골 또는 관절 침식을 포함하는 구조적 손상을 감소 또는 예방하는 인간 환자의 II 상 연 구를 기재한다. 구조적 손상의 감소 또는 예방의 개선은 임상 파라미터에 의해 측정된 임상 개선과 유사하다.
CTLA4Ig 또는 L104EA29YIg로 처리하기 전에 일부 인간 환자에서 골 구조 상태를 모니터링한다. 이들 환자에 0.5와 20 mg/kg 사이의 CTLA4Ig 또는 L104EA29YIg를 장기간에 걸쳐 2 주 내지 12 주마다 (단독으로 또는 다른 약물과 병용하여) 투여하여 시간에 따른 치료 개선을 유지하였다. FDA 지침서에서 제시한 바와 같이 환자의 손 및 발의 방사선 사진을 미리 정한 간격, 6 개월 및 그 후 매년 촬영한다. 이들 환자를 6 개월 및 12 개월 후 및 그 이후 매년 장기간에 걸쳐 모니터링하여 CTLA4Ig 또는 L104EA29YIg로 처리가 골 쇠약의 진행을 감소시켰는지 결정한다. 환자를 당업계 표준 관행에 따라 X-레이 및(또는) 자기 공명 영상 (MRI)을 포함하는 방사선 방법으로 모니터링한다 ([Larsen, A. K. and M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18: 481-491]; [Sharp, J. T., et al., 1985 Arthritis and Rheumatism 28: 1326-1335]). 방사선 데이타의 결과를 관절 간극의 협소화 및(또는) 신규 침식의 예방과 함께 골침식 및 연골 손상의 진행이 느려지는 것을 포함하는, 구조적 손상의 예방에 대해 평가하였다.
도 1a: 환자 지원자의 통계 데이타. 하기 실시예 3에 개시된 성별, 인종 및 질환 지속 기간을 포함하는 통계 데이타.
도 1b: 환자 지원자의 통계 데이타. 하기 실시예 3에 개시된 환자 및 치료자에 의해 평가된 성별, 연령, 체중 및 질환 활성도를 포함하는 통계 데이타.
도 1c: 하기 실시예 3에 개시된 환자 지원자의 통계 데이타. 질환 활성도, 적혈구 침강 속도 (ESR), 신체 기능 (건강상태 설문지에 의해 평가된 장애) 및 C-반응성 단백질 (CRP)을 포함하는 통계 데이타.
도 1d: 하기 실시예 3에 개시된 환자 지원자의 통계 데이타. 관절 부종, 관절 압통, 조조 경직 및 동통을 포함하는 통계 데이타.
도 1e: 하기 실시예 3에 개시된 환자 지원자의 통계 데이타. 치료전을 포함하는 통계 데이타.
도 2: 하기 실시예 3에 개시된 이유로 85 일째에 중단한 환자들에 대한 요약.
도 3a: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째의 ACR 반응: ACR-20, -50 및 -70 반응.
도 3b: 플라시보 반응을 포함하는 하기 실시예 3에 개시된 85 일째의 ACR-20 반응: 신뢰 한계 95 ％의 ACR-20 반응.
도 3c: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째의 ACR-20 반응: 신뢰 구간 95 ％에서 ACR-20 반응의 차이.
도 4a: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 환자 (백분율)의 부종성 및 압통성 관절에서 기초 (20％ 개선) 임상 반응: 기초 임상 반응, ACR-20.
도 4b: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 환자 (백분율)의 부종성 및 압통성 관절에서 임상 반응 (개선 백분율): 개선 백분율의 임상 반응의 변화.
도 5a: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 환자 (백분율)의 동통 반응 (기준으로부터 평균 단위 변화에 의한 리커트 척도): 기준으로부터의 동통 크기 변화.
도 5b: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 환자 (백분율)의 환자 전체 질환 변화 (기준으로부터 평균 단위 변화에 의한 리커트 척도): 환자 전체 질환 활성도 변화.
도 5c: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 환자 (백분율)의 치료자 전체 질환 변화 (기준으로부터 평균 단위 변화에 의한 리커트 척도): 치료자 전체 질환 활성도 변화.
도 5d: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 환자 (백분율)의 동통 (기준으로부터 평균 단위 변화에 의한 리커트 척도): 기준으로부터 동통 변화
도 6a: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 2 단위 범위의 기준으로부터 질환 활성도 변화에 대한 환자 전체 평가; 질환 활성도 개선.
도 6b: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 2 단위 범위의 기준으로부터 질환 활성도 변화에 대한 치료자 전체 평가; 질환 활성도 개선.
도 7a: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 C-반응성 단백질 (CRP) 농도의 감소 백분율: 기준으로부터 CRP 농도의 감소 백분율.
도 7b: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 C-반응성 단백질 (CRP) 농도의 감소 차이: 신뢰 구간 95 ％인 CRP 농도의 감소 차이 백분율.
도 7c: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 C-반응성 단백질 (CRP) 농도의 평균 감소: 기준으로부터의 평균 변화.
도 8: 하기 실시예 3에 개시된 85 일째 기준으로부터 가용성 IL-2 수용체 농도 평균 변화의 감소.
도 9a: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 압통성 관절에서 CTLA4Ig의 효과: 기준으로부터의 중간 차이.
도 9b: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 압통성 관절에서 CTLA4Ig의 효과: 기준으로부터의 평균 차이.
도 10a: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 부종성 관절에서 CTLA4Ig의 효과: 기준으로부터의 중간 차이.
도 10b: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 부종성 관절에서 CTLA4Ig의 효과: 기준으로부터의 평균 차이.
도 11: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 기준으로부터의 동통 평가 평균 차이에서 CTLA4Ig의 효과.
도 12a: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 기준으로부터 질환 활성도 평균 차이에 대한 환자 평가에서 CTLA4Ig의 효과.
도 12b: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 기준으로부터 질환 활성도 평균 차이에 대한 치료자 평가에서 CTLA4Ig의 효과.
도 13a: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 압통성 관절에서 L104EA29YIg의 효과: 기준으로부터의 중간 차이.
도 13b: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 압통성 관절에서 L104EA29YIg의 효과: 기준으로부터의 평균 변화.
도 14a: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 부종성 관절에서 L104EA29YIg의 효과: 기준으로부터의 중간 차이.
도 14b: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 부종성 관절에서 L104EA29YIg의 효과: 기준으로부터의 평균 변화.
도 15: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 동통 평가에서 L104EA29YIg의 효과: 시간에 따른 기준으로부터의 평균 변화.
도 16a: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 기준으로부터 질환 활성도 평균 차이에 대한 환자 평가에서 L104EA29YIg의 효과.
도 16b: 하기 실시예 3에 개시된 시간 경과에 따른 기준으로부터 질환 활성도 평균 차이에 대한 치료자 평가에서 L104EA29YIg의 효과.
도 17: 하기 실시예 3에 개시된 CTLA4Ig 및 L104EA29YIg를 처리했을 때 85 일째에 기준과 비교하여 건강상태 평가 설문지 (HAQ)에서 평가된 환자 장애의 개선 백분율.
도 18: 하기 실시예 1에 개시된 L104EIg (서열 6 내지 7)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.
도 19: 하기 실시예 1에 개시된 L104EA29YIg (서열 8 내지 9)의 뉴클레오티 드 및 아미노산 서열.
도 20: 하기 실시예 1에 개시된 L104EA29LIg (서열 10 내지 11)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.
도 21: 하기 실시예 1에 개시된 L104EA29TIg (서열 12 내지 13)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.
도 22: 하기 실시예 1에 개시된 L104EA29WIg (서열 14 내지 15)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열.
도 23: CTLA4 수용체 (서열 16 내지 17)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. .
도 24: CTLA4Ig (서열 18 내지 19)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. .
도 25: CTLA4Ig (레인 1), L104EIg (레인 2) 및 L104EA29YIg (레인 3A)에 대한 SDS 겔 (도 25a); CTLA4Ig (도 25b) 및 L104EA29YIg (도 25c)의 크기 배제 크로마토그래프.
도 26 (좌측 및 우측 도면): NMR 분광법에 의해 결정된 용액 구조로부터 생성된 CTLA4 세포외 Ig V-유사 폴딩의 리본 다이어그램. 도 26 (우측 도면)은 결합성을 증가시키는 돌연변이 L104 및 A29의 위치 및 측쇄 배열을 지시하는 CDR-1 (S25 내지 33) 영역 및 MYPPPY 영역의 확장된 개관을 나타낸다.
도 27a 및 27b: 하기 실시예 2에 개시된 바와 같이 인간 CD80- 또는 CD86-형질감염된 CHO 세포와 L104EA29YIg, L104EIg 및 CTLA4Ig의 결합을 나타내는 FACS 분석.
도 28a 및 28b: 하기 실시예 2에 개시된 바와 같이 CD80-양성 및 CD86-양성 CHO 세포 증식의 저해를 나타내는 그래프.
도 29a 및 29b: 하기 실시예 2에 개시된 바와 같이 L104EA29YIg가 일차 및 이차 동시자극된 T 세포 증식의 저해에 CTLA4Ig보다 더 효과적임을 나타내는 그래프.
도 30a 내지 c: 하기 실시예 2에 개시된 바와 같이 L104EA29YIg가 동시자극된 인간 T 세포의 IL-2 (도 30a), IL-4 (도 30b) 및 감마(γ)-인터페론 (도 30c) 사이토카인 생성의 저해에 CTLA4Ig보다 더 효과적임을 설명하는 그래프.
도 31: 하기 실시예 2에 개시된 바와 같이 L104EA29YIg가 피토헤마글루틴- (PHA) 자극된 원숭이 T 세포 증식의 저해에 CTLA4Ig보다 더 효과적임을 입증하는 그래프.
도 32: CD86Ig와 L104EA29YIg, L104EIg 및 야생형 CTLA4Ig의 평형 결합 분석을 나타내는 그래프.
도 33a 및 b: 실시예 3에 개시된 바와 같이 85 일째 기준으로부터 가용성 ICAM-1 및 가용성 E-셀렉틴 농도 평균 변화의 감소.
<110> Cohen, Robert Carr, Suzette Hagerty, David Peach, Robert J Becker, Jean-Claude Bristol-Myers Squibb Company <120> METHODS FOR TREATING RHEUMATIC DISEASES USING A SOLUBLE CTLA4 MOLECULE <130> D0030PCT;30436.55WOU1 <140> PCT/US01/21204 <141> 2001-07-02 <150> 60/215,913 <151> 2000-07-03 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CTLA4 fused to Oncostatin M, forward primer <400> 1 ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc 60 cagcc 65 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CTLA4 fused to Oncostatin M, reverse primer <400> 2 tttgggctcc tgatcagaat ctgggcacgg ttg 33 <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CTLA4 with Oncostatin M and Hind III <400> 3 ctagccactg aagcttcacc aatgggtgta ctgctcacac agaggacgct gctcagtctg 60 gtccttgcac tc 72 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oncostatin M CTLA4 (OMCTLA4) Forward Primer <400> 4 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oncostatin M CTLA4 (OMCTLA4) Reverse Primer <400> 5 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42 <210> 6 <211> 1152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:L104EIg <400> 6 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 7 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:L104EIg <400> 7 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg 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acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgac ttcctcctct ggatccttgc agcagttagt 480 tcggggttgt ttttttatag ctttctcctc acagctgttt ctttgagcaa aatgctaaag 540 aaaagaagcc ctcttacaac aggggtctat gtgaaaatgc ccccaacaga gccagaatgt 600 gaaaagcaat ttcagcctta ttttattccc atcaat 636 <210> 17 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser 145 150 155 160 Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 165 170 175 Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys 180 185 190 Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe 195 200 205 Ile Pro Ile Asn 210 <210> 18 <211> 1152 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CTLA4Ig <400> 18 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 19 <211> 383 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:CTLA4Ig <400> 19 Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Val Ala Gln Pro 20 25 30 Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu 35 40 45 Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 50 55 60 Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 65 70 75 80 Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser 85 90 95 Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105 110 Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125 Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 160 Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Val 165 170 175 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 180 185 190 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 195 200 205 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 210 215 220 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 225 230 235 240 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 245 250 255 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 260 265 270 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 275 280 285 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 290 295 300 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 305 310 315 320 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 325 330 335 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 340 345 350 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 355 360 365 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 380

Claims (13)

  1. 서열 17에 나타낸 아미노산 서열에서 27번 위치의 메티오닌 또는 26번 위치의 알라닌에서 시작하여 150번 위치의 아스파르트산에서 종결하는 아미노산을 포함하는 CTLA4 분자의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 CTLA4 융합 분자를 포함하는, 류마티스성 질환에 걸린 대상체에서 골 침식 또는 관절 침식을 감소 또는 예방하기 위한 제약 제제.
  2. 제1항에 있어서, 대상체 체중 1 kg 당 0.5 내지 20 mg의 양으로 가용성 CTLA4 융합 분자를 투여하기 위한 제약 제제.
  3. 제1항에 있어서, 류마티스성 질환이 류마티스성 관절염, 다발성근염, 피부경화증, 혼합성 결합 조직 질환, 염증성 류마티즘, 퇴행성 류마티즘, 관절외 류마티즘, 콜라겐 질환, 만성 다발성 관절염, 건선 관절병증, 강직성 척추염, 연소성 류마티스성 관절염, 결절성 동맥주위염, 전신 홍반성 루프스, 진행성 전신 경피증, 견관절 주위염, 요산성 관절염, 연골석회증, 피부근염, 근육 류마티즘, 근염 및 근경증으로부터 선택되는 것인 제약 제제.
  4. 제1항에 있어서, 류마티스성 질환이 류마티스성 관절염인 제약 제제.
  5. 제1항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 것인 제약 제제.
  6. 제5항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 CTLA4-면역글로불린 융합 단백질 (CTLA4Ig)인 제약 제제.
  7. 제6항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 서열 19에 나타낸 아미노산 서열에서 27번 위치의 메티오닌 또는 26번 위치의 알라닌에서 시작하여 383번 위치의 리신에서 종결하는 CTLA4Ig인 제약 제제.
  8. 제6항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 ATCC (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션) 68629로 지정된 핵산 분자에 의해 코딩되는 CTLA4Ig인 제약 제제.
  9. a) 서열 17에 나타낸 아미노산 서열에서 27번 위치의 메티오닌 또는 26번 위치의 알라닌에서 시작하여 150번 위치의 아스파르트산에서 종결하는 아미노산을 포함하는 CTLA4 분자의 세포외 도메인을 포함하는 가용성 CTLA4 융합 분자인 제1 작용제(agent), 및
    b) 코르티코스테로이드, 비스테로이드성 소염제, 프레드니손, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 인플릭시맵, 에타너셉트, 히드록시클로로퀸, 술파살라조프린, 금 염, 아나킨라, 시클로포스파미드 및 레플루노미드로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 작용제
    를 포함하는, 골 침식 또는 관절 침식을 치료하기 위한 제약 제제.
  10. 제9항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 면역글로불린 불변 영역 또는 그의 일부를 포함하는 것인 제약 제제.
  11. 제10항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 CTLA4Ig인 제약 제제.
  12. 제11항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 서열 19에 나타낸 아미노산 서열에서 27번 위치의 메티오닌 또는 26번 위치의 알라닌에서 시작하여 383번 위치의 리신에서 종결하는 CTLA4Ig인 제약 제제.
  13. 제11항에 있어서, 가용성 CTLA4 융합 분자가 ATCC 68629로 지정된 핵산 분자에 의해 코딩되는 CTLA4Ig인 제약 제제.
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