PL212205B1

PL212205B1 - Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4

Info

Publication number: PL212205B1
Application number: PL389002A
Authority: PL
Inventors: Robert Cohen; Suzette Carr; David Hagerty; Jean-Claude Becker; Robert J. Peach
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2012-08-31
Also published as: KR100895552B1; HUP0301727A3; NO20026264L; CA2413190C; CY2008017I1; BR0112104A; DK1372696T3; EP1372696B1; CN1477968A; BG66454B1; ATE401909T1; US7455835B2; LT5063B; EE05378B1; PE20020772A1; CZ20024261A3; EE200300004A; MXPA02012603A; CA2413190A1; WO2002002638A3

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 wiążącej się z cząsteczką B7.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy generalnie dziedziny chorób reumatycznych. Konkretnie, wynalazek dotyczy zastosowania do leczenia chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, poprzez podawanie osobnikowi skutecznej ilości rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4.

Tło wynalazku

Nie ma obecnie sposobu na wyleczenie chorób reumatycznych. Czynniki terapeutyczne stosowane są raczej do leczenia objawów. Typowo, czynniki terapeutyczne podaje się przez dłuższy okres czasu, a wartość terapeutyczna jest często zmniejszana przez szkodliwe efekty uboczne.

Choroby reumatyczne obejmują grupę chorób, które atakują tkanki mięśniowo-szkieletowe lub tkankę łączną organizmu. Choroby te cechują się przewlekłym zapaleniem i często prowadzą do trwałego uszkodzenia tkanki, deformacji, atrofii i niepełnosprawności. Choroby reumatyczne atakują stawy, kość, tkankę miękką lub rdzeń kręgowy (Mathies, H. 1983 Rheuma) i są klasyfikowane jako ostry gościec stawowy, gościec zwyrodnieniowy, gościec pozastawowy lub choroby kolagenowe. Wiadomo, że niektóre choroby reumatyczne są chorobami autoimmunologicznymi powodowanymi przez zmienioną odpowiedź immunologiczną osobnika.

Reumatoidalne zapalenie stawów to postępująca choroba reumatyczna, dotykająca około 2% populacji dorosłych w krajach rozwiniętych (Utsinger, P. D., i wsp., 1985 Rheumatoid Arthritis, str. 140). Choroba ta cechuje się utrzymującym się zapaleniem błony maziowej, które powoduje zniszczenie chrząstki i erozję kości, prowadząc do deformacji stawów obwodowych. Objawy związane z reumatoidalnym zapaleniem stawów obejmują opuchliznę stawów, tkliwość stawów, zapalenie, sztywność poranną i ból, szczególnie przy zginaniu. Osoby w zaawansowanych stadiach zapalenia stawów cierpią z powodu uszkodzenia strukturalnego, włączając w to zniszczenie stawu i erozję kości (w „Principals of Internal Medicine”, Harrison, wydanie 13, strony 1648-1655). Ponadto, pacjenci mogą wykazywać inne objawy kliniczne różnych uszkodzeń narządów, włączając w to uszkodzenia skóry, nerek, serca, płuc, centralnego układu nerwowego i oczu na skutek zapalenia naczyń związanego z procesem autoimmunologicznym.

Inne objawy, które korelują z reumatoidalnym zapaleniem stawów obejmują zwiększoną szybkość sedymentacji erytrocytów i zwiększone poziomy białka C-reaktywnego w surowicy (CRP) i/lub rozpuszczalnego receptora IL-2 (IL- 2r). Szybkość sedymentacji erytrocytów jest zwiększona u prawie wszystkich pacjentów z aktywnym reumatoidalnym zapaleniem stawów. Poziom białka C-reaktywnego w surowicy jest również zwiększony i koreluje z aktywnością choroby i prawdopodobieństwem postępującego uszkodzenia stawów. Dodatkowo, poziom rozpuszczalnej IL-2r, produktu aktywowanych komórek T jest podwyższony w surowicy krwi i płynie maziówkowym pacjentów z aktywnym reumatoidalnym zapaleniem stawów (patrz: „Principals of Internal Medicine”, Harrison, wydanie 13, strona 1650).

Uważa się, że reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą autoimmunologiczną, w której pośredniczą komórki T, obejmującą niespecyficzne wobec antygenu międzykomórkowe oddziaływania między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Generalnie, wielkość odpowiedzi komórek T jest zdeterminowana przez odpowiedź kostymulującą wzbudzaną przez oddziaływanie pomiędzy powierzchniowymi cząsteczkami komórek T i ich ligandami (Mueller i wsp., 1989 Ann. Rev. Immunol. 7: 445-480). Kluczowe kostymulujące sygnały są przekazywane przez oddziaływanie pomiędzy powierzchniowymi receptorami komórek T, CD28 i CTLA4, i ich ligandami, takimi jak cząsteczki związane z B7, CD80 (tj. B7-1) i CD86 (tj., B7-2), na komórkach prezentujących antygen (Linsley, P. i Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212).

Aktywacja komórek T w nieobecności kostymulacji prowadzi do anergicznej odpowiedzi komórek T (Schwartz, R. H., 1992 Cell 71: 1065-1068), kiedy układ immunologiczny przestaje odpowiadać na stymulację.

Ponieważ sądzi się, że reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą autoimmunologiczną, w której pośredniczą komórki T, jedną ze strategii rozwoju nowych czynników do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów jest identyfikacja cząsteczek, które blokują sygnały kostymulacyjne pomiędzy limfocytami T i komórkami prezentującymi antygen, poprzez blokowanie oddziaływań pomiędzy

PL 212 205 B1 endogennym CD28 lub CTLA4 a B7. Potencjalne cząsteczki obejmują rozpuszczalne cząsteczki CTLA4, które są tak zmodyfikowane, aby wiązać B7 z wyższą zachłannością (ang. avidity) niż CTLA4 typu dzikiego (sekwencja którego jest pokazana na Fig. 23) lub CD28, blokując w ten sposób sygnały kostymulujące.

Skonstruowano rozpuszczalne postaci CD28 i CTLA4 poprzez połączenie zewnątrzkomórkowych domen typu zmiennego (V-podobnych) CD28 i CTLA4 z domenami stałymi immunoglobuliny (Ig) otrzymując CD28Ig i CTLA4Ig. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa CTLA4lg jest pokazana na Fig. 24, przy czym białko zaczyna się od metioniny w pozycji +1 lub od alaniny w pozycji -1 a kończy lizyną w pozycji +357. CTLA4Ig wiąże się zarówno z komórkami CD80-dodatnimi jak i CD86-dodatnimi silniej niż CD28Ig (Linsley, P., i wsp., 1994 Immunity 1: 793-80). Stwierdzono, że wiele zależnych od komórek T odpowiedzi immunologicznych jest blokowanych przez CTLA4Ig zarówno in vitro jak i in vivo. (Linsley, P., i wsp., 1991b, jak wyżej; Linsley, P., i wsp., 1992a Science 257: 792 -795; Linsley, P., i wsp., 1992b J. Exp. Med. 176: 1595-1604; Lenschow, D. J., i wsp. 1992 Science 257: 789-792; Tan, P., i wsp., 1992 J. Exp. Med. 177: 165-173; Turka, L. A., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105).

W celu zmiany powinowactwa wiązania z naturalnymi ligandami, takimi jak B7, fuzyjne rozpuszczalne cząsteczki CTLA4lg modyfikuje się poprzez mutacje aminokwasów w części CTLA4 cząsteczki. Regiony CTLA4, które po zmutowaniu zmieniają powinowactwo albo zachłanność wiązania ligandów B7 obejmują region determinujący dopasowanie 1 (CDR-1), jak opisano w patentach USA 6090914, 5773253, 5844095; w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA numer seryjny 60/214065; i w Peach i wsp., 1994. J. Exp. Med., 180: 2049-2058) oraz regiony podobne do regionu determinującego dopasowanie 3 (CDR-3) (CDR-3 to konserwatywny region zewnątrzkomórkowej domeny CTLA4, jak opisano w patentach USA 6090914, 5773253 i 5844095; w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA numer seryjny 60/214,065; i w Peach, R. J., i wsp. J Exp. Med. 1994 180: 2049-2058. Region CDR-3-podobny obejmuje region CDR-3 i rozciąga się na kilka aminokwasów przed i/lub za motywem CDR-3. Region CDR-3- podobny zawiera heksapeptydowy motyw MYPPPY, który jest wysoce konserwatywny u wszystkich członków rodziny CD28 i CTLA4. Skaningowa mutageneza alaninowa na obszarze motywu heksapeptydowego w CTLA4 i w wybranych resztach w CD28Ig zmniejszała albo znosiła wiązanie z CD80 (Peach, R. J., i wsp. J. Exp. Med. 1994 180: 2049-2058).

Dokonano dalszych modyfikacji w rozpuszczalnych cząsteczkach CTLA4Ig poprzez wymianę homologicznych regionów CTLA4 i CD28. Te chimerowe homologiczne zmutowane cząsteczki CTLA4/CD28 zidentyfikowały heksapeptydowy motyw MYPPPY wspólny dla CTLA4 i CD28, jak również pewne niekonserwatywne reszty aminokwasowe w CDR-1- i CDR-3-podobnych regionach CTLA4, jako regiony odpowiedzialne za zwiększenie zachłanności wiązania CTLA4 z CD80 (Peach, R. J., i wsp., 1994 J. Exp. Med. 180: 2049-2058).

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4, takie jak CTLA4Ig, zmutowane cząsteczki CTLA4 lub chimerowe homologiczne mutanty CTLA4/CD28 jak opisano powyżej, wprowadzają nową grupę leków terapeutycznych do leczenia chorób reumatycznych.

Obecnie stosowane leczenie chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, obejmuje podawanie niespecyficznych cytotoksycznych leków immunosupresyjnych, takich jak metotreksat, cyklofosfamid, azatiopryna, cyklosporyna A oraz blokerów lub antagonistów czynnika martwicy nowotworów-alfa (TNFa). Te leki immunosupresyjne przyhamowują cały układ immunologiczny osobnika, a długoterminowe stosowanie zwiększa ryzyko infekcji. Ponadto, leki te jedynie spowalniają rozwój reumatoidalnego zapalenia stawów, co powoduje jego przyspieszenie po przerwaniu leczenia. Dodatkowo, przedłużające się leczenie tymi niespecyficznymi lekami daje toksyczne efekty uboczne, włączając w to tendencję do rozwoju pewnych nowotworów, niewydolności nerek, supresji szpiku kostnego, zwłóknienia płuc, nowotworów, cukrzycy i zaburzeń wątroby. Leki te ponadto przestają być stopniowo skuteczne po 2-5 latach (Kelley's Textbook of Rheumatology, wydanie 6, strony

1001-1022).

Alternatywnie, czynniki terapeutyczne, które są niespecyficznymi lekami immunosupresyjnymi i przeciwzapalnymi były stosowane do uzyskania złagodzenia objawów. Leki te są zależne od dawki i nie chronią przed postępami choroby. Leki te obejmują związki steroidowe, takie jak prednizon i metyloprednizolon. Steroidy powodują również znaczące toksyczne efekty uboczne związane z ich długoterminowym stosowaniem (Kelley's Textbook of Rheumatology, wyd. 6, strony 829-833).

PL 212 205 B1

A zatem obecne leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów ma ograniczoną skuteczność, daje znaczące toksyczne efekty uboczne i nie może być stosowane stale przez dłuższe okresy czasu.

A zatem istnieje zapotrzebowanie na leczenie, które jest skuteczne i silniejsze w leczeniu chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, i pozbawione jest konwencjonalnych wad sposobów i czynników, a którego celem jest patofizjologiczny mechanizm autoimmunologiczny.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4, która wiąże się z cząsteczką B7, i która to rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 zawiera pierwszą mutację w pozycji +104 CTLA4, przy czym leucyna w pozycji +104 jak pokazano na Fig. 23 jest podstawiona kwasem glutaminowym oraz drugą mutację w pozycji +29 CTLA4, przy czym alanina w pozycji +29 jak pokazano na Fig. 23 jest podstawiona tyrozyną, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby reumatycznej.

Korzystnie rozpuszczalną zmutowaną cząsteczkę CTLA4 stanowi L104EA29YIg.

Korzystniej L104EA29YIg rozpoczyna się metioniną w pozycji +1 a kończy się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 19.

Korzystniej L104EA29YIg rozpoczyna się alaniną w pozycji -1 a kończy się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 19.

Korzystniej L104EA29YIg kodowana jest przez sekwencję DNA oznaczoną numerem ATCC PTA-2104.

Korzystnie chorobę reumatyczną stanowi reumatoidalne zapalenie stawów.

Korzystnie kompozycja jest użyteczna do łagodzenia objawu związanego z chorobą reumatyczną wybranego z grupy składającej się z opuchnięcia stawu, bólu, tkliwości, sztywności porannej, uszkodzenia strukturalnego, podwyższonego poziomu białka C-reaktywnego w surowicy, podwyższonego poziomu rozpuszczalnej IL-2r, podwyższonego poziomu rozpuszczalnej ICAM-1, podwyższonego poziomu rozpuszczalnej E-selektyny i podwyższonej szybkości sedymentacji erytrocytów.

Korzystnie przeznaczona jest do miejscowego lub układowego podawania tych środków.

Korzystniej podawanie wybrane jest z grupy składającej się z podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, wszczepialnej pompy, wlewu ciągłego, terapii genowej oraz podawania z użyciem liposomów i podawania doustnego.

Korzystnie przeznaczone jest do podawania rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości pomiędzy około 0,5 a 100 mg/kg masy ciała podmiotu.

Korzystniej przeznaczone jest do podawania podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości 0,5 mg/kg masy ciała podmiotu.

Korzystniej przeznaczone jest do podawania podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości 2 mg/kg masy ciała podmiotu.

Korzystniej przeznaczone jest do podawania podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości 10 mg/kg masy ciała podmiotu.

Korzystnie przeznaczone jest do leczenia podmiotu wybranego z grupy składającej się z człowieka, małpy, małpy człekokształtnej, psa, kota, krowy, konia, królika, myszy i szczura.

Korzystnie przeznaczone jest do indukowania zmiany patofizjologicznej związanej z chorobą reumatyczną.

Korzystniej zmianę patofizjologiczną związaną z chorobą reumatyczną stanowi zmniejszone uszkodzenie strukturalne.

Korzystnie obejmuje ponadto drugi środek wybrany z grupy składającej się z kortykosteroidów, niesteroidowych leków przeciwzapalnych, cyklosporyny, prednizonu, azatiopryny, metotreksatu, blokerów lub antagonistów TNFa, infliksimabu, dowolnego środka biologicznego, którego celem jest cytokina zapalna, hydroksychlorochiny, sulfasalazopiryny, soli złota, etanerceptu i anakinry.

Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje i zastosowania w sposobach leczenia chorób układu immunologicznego poprzez podawanie osobnikowi rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, które wiążą się z cząsteczkami B7 na komórkach B7-dodatnich, przez co hamowane jest wiązanie się endogennych cząsteczek B7 z CTLA4 i/lub CD28 na komórkach T. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 stosowane w sposobach tu opisanych obejmują CTLA4Ig i rozpuszczalną zmutowaną cząsteczkę CTLA4, L104EA29YIg.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposoby hamowania funkcji komórek T, bez zmniejszania liczby komórek T u ludzi poprzez doprowadzenie do kontaktu komórek B7-dodatnich

PL 212 205 B1 z rozpuszczalną CTLA4. Przykłady rozpuszczalnej CTLA4 obejmują CTLA4Ig i rozpuszczalną zmutowaną cząsteczkę CTLA4 taką jak L104EA29YIg.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również zastosowania w sposobach leczenia (np. zmniejszania objawów) chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, poprzez podawanie osobnikowi z rozpoznanym reumatoidalnym zapaleniem stawów, rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, takich jak CTLA4Ig, i/lub L104EA29YIg. Zmutowana cząsteczka CTLA4, L104EA29YIg np. zaczynająca się od metioniny w pozycji +1 lub od alaniny w pozycji -1 a kończąca się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 19 jest zalecana do zastosowania w opisanych tu sposobach.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposób zmniejszania zmian patofizjologicznych związanych z chorobą reumatyczną, takich jak uszkodzenia strukturalne, poprzez podawanie osobnikowi z rozpoznanym reumatoidalnym zapaleniem stawów, rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również kompozycje farmaceutyczne do leczenia chorób układu immunologicznego, takich jak choroby reumatyczne, zawierających dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i skuteczny biologicznie czynnik, taki jak rozpuszczalne cząsteczki CTLA4.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również zestawy zawierające kompozycje farmaceutyczne do leczenia choroby układu immunologicznego. W jednym z wykonań, zestaw zawierający jedną albo więcej kompozycji farmaceutycznych tu opisanych można stosować do leczenia choroby układu immunologicznego, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów. Przykładowo, kompozycja farmaceutyczna zawiera skuteczną ilość rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4, które wiążą się z cząsteczkami B7 na komórkach B7-dodatnich, hamując w ten sposób wiązanie się endogennych cząsteczek B7 z CTLA4 i/lub CD28 na komórkach T. Ponadto, zestaw może zawierać jeden albo więcej czynników immunosupresyjnych zastosowanych w połączeniu z kompozycjami farmaceutycznymi tu opisanymi. Potencjalne czynniki immunosupresyjne obejmują między innymi kortykosteroidy, niesteroidowe leki przeciwzapalne (np. inhibitory Cox-2), cyklosporynę prednizon, azatioprynę, metotreksat, blokery lub antagonistów TNFa, infliksimab, dowolny czynnik biologiczny, którego celem jest cytokina zapalna, hydroksychlorochina, sulfasalazopiryna, sole złota, etanercept i anakinra.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposoby zmniejszania szybkości sedymentacji erytrocytów, która jest związana z reumatoidalnym zapaleniem stawów.

Dodatkowo, zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby zmniejszania poziomów pewnych składników surowicy, które są związane z reumatoidalnym zapaleniem stawów, w tym białka C-reaktywnego, rozpuszczalnej ICAM-1, rozpuszczalnej E-selektynę i/lub rozpuszczalnego IL-2r.

Krótki opis figur

Fig. 1A: Dane demograficzne grup pacjentów. Dane demograficzne obejmujące płeć, rasę i czas trwania choroby jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 1B: Dane demograficzne grup pacjentów. Dane demograficzne obejmujące płeć, wiek, masę i aktywność choroby ocenione przez pacjenta i przez lekarza jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 1C: Dane demograficzne grup pacjentów jak tu opisano w Przykładzie 3. Dane demograficzne obejmujące aktywność choroby, szybkości sedymentacji erytrocytów (ESR), funkcje fizyczne (niepełnosprawność oceniana przy użyciu kwestionariusza zdrowia) i białko C-reaktywne (CRP).

Fig. 1D : Dane demograficzne grup pacjentów jak tu opisano w Przykładzie 3. Dane demograficzne obejmujące opuchliznę stawów, tkliwość (wrażliwość) stawów, sztywność poranną i ból.

Fig. 1E : Dane demograficzne grup pacjentów jak tu opisano w Przykładzie 3. Dane demograficzne obejmujące wcześniejsze leczenie.

Fig. 2: Zestawienie przerwania w 85 dniu z powodów opisanych tu w Przykładzie 3.

Fig. 3A: Odpowiedzi ACR w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: odpowiedzi ACR-20, -50, i -70.

Fig. 3B: Odpowiedzi ACR-20 w dniu 85, włączając w to odpowiedź placebo, jak tu opisano w Przykładzie 3: odpowiedź ACR-20 z 95% przedziałem (granicami) ufności.

Fig. 3C: Odpowiedzi ACR-20 w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: różnice w odpowiedzi ACR-20 w odniesieniu do 95% przedziałów ufności.

Fig. 4A: Podstawowe odpowiedzi kliniczne (20% poprawa) pod względem opuchlizny stawów i tkliwości stawów u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: podstawowa odpowiedź kliniczna, ACR-20.

Fig. 4B: Odpowiedzi kliniczne (odsetek poprawy) pod względem opuchlizny stawów i tkliwości stawów u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: zmiana w odpowiedzi klinicznej jako odsetek poprawy.

PL 212 205 B1

Fig. 5A: Odpowiedź bólowa (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3 : zmiana oceny punktowej bólu w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 5B: Ogólne zmiany choroby w opinii pacjenta (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: ogólne zmiany aktywności choroby w opinii pacjenta.

Fig. 5C: Ogólne zmiany w chorobie w opinii lekarza (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: ogólne zmiany aktywności choroby w opinii lekarza.

Fig. 5D: Ból (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: zmiany bólu w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 6A: Ogólna ocena przez pacjenta zmiany aktywności choroby w stosunku do linii odniesienia w zakresie 2 jednostek w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: zwiększenie aktywności choroby.

Fig. 6B: Ogólna ocena przez lekarza zmiany aktywności choroby w stosunku do linii odniesienia w zakresie 2 jednostek w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: zwiększenie aktywności choroby.

Fig. 7A: Procentowa redukcja poziomów białka C-reaktywnego (CRP) w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: procent redukcji poziomów CRP w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 7B: Różnice w redukcji poziomów białka C-reaktywnego (CRP) w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: procent redukcji poziomów CRP z 95% przedziałem ufności.

Fig. 7C: Średnie obniżenie poziomów białka C-reaktywnego (CRP) w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3: średnia zmiana względem linii odniesienia.

Fig. 8: Obniżenie poziomów rozpuszczalnego receptora IL-2, średnia zmiana względem linii odniesienia w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 9A: Wpływ CTLA4Ig na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 9B: Wpływ CTLA4Ig na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 10A : Wpływ CTLA4Ig na opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 10B : Wpływ CTLA4Ig na opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 11 : Wpływ CTLA4Ig na ocenę bólu, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 12A: Wpływ CTLA4Ig na ocenę aktywności choroby przez pacjenta, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 12B: Wpływ CTLA4Ig na ocenę aktywności choroby przez lekarza, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 13A: Wpływ L104EA29YIg na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 13B: Wpływ L104EA29YIg na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 14A : Wpływ L104EA29YIg na opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 14B : Wpływ L104EA29YIg na opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 15 : Wpływ L104EA29YIg na ocenę bólu w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 16A: Wpływ L104EA29YIg na ocenę aktywności choroby przez pacjenta, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 16B: Wpływ L104EA29YIg na ocenę aktywności choroby przez lekarza, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 3.

Fig. 17: Procent poprawy niepełnosprawności pacjenta oceniony przy pomocy kwestionariusza Health Assessment Questionnaire (HAQ) w porównaniu do linii odniesienia w dniu 85 dla leczenia CTLA4Ig i L104EA29YIg jak tu opisano w Przykładzie 3.

PL 212 205 B1

Fig. 18: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa L104EIg (SEK ID NR: 6-7) jak tu opisano w Przykładzie 1.

Fig. 19: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa L104EA29YIg (SEK ID NR: 8-9) jak tu opisano w Przykładzie 1.

Fig. 20: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa L104EA29LIg (SEK ID NR: 10-11) jak tu opisano w Przykładzie 1.

Fig. 21: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa L104EA29TIg (SEK ID NR: 12-13) jak tu opisano w Przykładzie 1.

Fig. 22: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa L104EA29WIg (SEK ID NR: 14-15) jak tu opisano w Przykładzie 1.

Fig. 23: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa receptora CTLA4 (SEK ID NR: 16-17).

Fig. 24: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa CTLA4lg (SEK ID NR: 18-19).

Fig. 25: Żel SDS (Fig. 25A) dla CTLA4Ig (ścieżka 1), L104EIg (ścieżka 2) i L104EA29YIg (ścieżka 3A) oraz chromatogramy z sączenia molekularnego CTLA4Ig (Fig. 25B) i L104EA29YIg (Fig. 25C).

Fig. 26 (część lewa i prawa): Diagram wstążkowy sfałdowania zewnątrzkomórkowej domeny IgV-podobnej CTLA4 stworzony na podstawie struktury w roztworze ustalonej przez spektroskopię NMR.

Fig. 26 (część prawa) pokazuje rozszerzony widok regionu CDR-1 (S25-R33) i regionu MYPPPY ze wskazaniem położenia i orientacji łańcucha bocznego na mutacje zwiększające zachłanność wiązania, L104 i A29.

Fig. 27A i 27B: Testy FACS pokazujące wiązanie L104EA29YIg, L104EIg i CTLA4Ig do komórek CHO transfekowanych ludzkimi CD80 lub CD86 jak tu opisano w Przykładzie 2.

Fig. 28A i 28B: Wykresy pokazujące hamowanie proliferacji komórek CHO CD80-dodatnich i CD86-dodatnich jak tu opisano w Przykładzie 1.

Fig. 29A i 29B: Wykresy pokazujące, że L104EA29YIg skuteczniej niż CTLA4Ig hamuje proliferację pierwotnych i wtórnych allostymulowanych komórek T jak tu opisano w Przykładzie 2.

Fig. 30A-C: Wykresy ilustrujące, że L104EA29YIg skuteczniej niż CTLA4Ig hamuje IL-2 (Fig. 30A), IL-4 (Fig. 30B) i wytwarzanie cytokin - interferonu gamma (γ) (Fig. 30C) w allostymulowanych ludzkich komórkach T jak tu opisano w Przykładzie 2.

Fig. 31: Wykres pokazujący, że L104EA29YIg skuteczniej niż CTLA4Ig hamuje proliferację stymulowanych fitohemaglutyniną (PHA) małpich komórek T, jak tu opisano w Przykładzie 2.

Fig. 32: Wykres pokazujący analizę równowagi wiązania L104EA29YIg, L104EIg i CTLA4Ig typu dzikiego z CD86Ig.

Fig. 33A i B: Obniżenie poziomów rozpuszczalnej ICAM-1 i rozpuszczalnej E-selektyny, średnia zmiana względem linii odniesienia w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 3.

Szczegółowy opis wynalazku

Definicje

Wszystkie terminy naukowe i techniczne stosowane w tym zgłoszeniu mają znaczenia powszechnie używane w tej dziedzinie, chyba, że zaznaczono inaczej. Stosowane w tym zgłoszeniu poniższe słowa lub wyrażenia mają wyszczególnione znaczenia.

Stosowany tutaj termin „ligand” oznacza cząsteczkę, która specyficznie rozpoznaje i wiąże inną cząsteczkę, na przykład ligandem dla CTLA4 jest cząsteczka B7.

Stosowany tutaj termin „CTLA4 typu dzikiego” lub „niezmutowany CTLA4” oznacza cząsteczkę, która posiada sekwencję aminokwasową naturalnie występującego CTLA4 o pełnej długości, jak pokazano na Fig. 23 (także opisanego w patentach USA nr 5434131, 5844095, 5851795) lub dowolną jego część lub pochodną, która rozpoznaje i wiąże B7 lub oddziałuje z B7 w taki sposób, że blokuje wiązanie do CD28 i/lub CTLA4 (np. endogenny CD28 i/lub CTLA4). W poszczególnych wykonaniach zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 typu dzikiego zaczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się na kwasie asparaginowym w pozycji +124 lub zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 typu dzikiego zaczyna się od alaniny w pozycji -1 i kończy się na kwasie asparaginowym w pozycji +124. CTLA4 typu dzikiego jest białkiem występującym na powierzchni komórki i posiadającym N-końcową domenę zewnątrzkomórkową, domenę transbłonową oraz C-końcową domenę cytoplazmatyczną. Domena zewnątrzkomórkowa wiąże się do docelowych cząsteczek, takich jak cząsteczka B7. W komórce naturalnie występujące białko CTLA4 typu dzikiego ulega translacji jako niedojrzały polipeptyd, który zawiera peptyd sygnałowy na końcu N. Niedojrzały polipeptyd ulega obróbce potranslacyjnej, która

PL 212 205 B1 obejmuje cięcie i usunięcie peptydu sygnałowego w celu wytworzenia produktu cięcia CTLA4 posiadającego nowo utworzony koniec N, który różni się od końca N formy niedojrzałej. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że może wystąpić dodatkowa obróbka potranslacyjna, która usunie jeden lub większą liczbę aminokwasów z nowo utworzonego końca N produktu cięcia CTLA4. Alternatywnie, peptyd sygnałowy może nie być usunięty całkowicie, generując cząsteczki, które zaczynają się przed zazwyczaj występującym aminokwasem początkowym, metioniną. Tak więc dojrzałe białko CTLA4 może zaczynać się od metioniny w pozycji +1 lub alaniny w pozycji -1. Dojrzała forma cząsteczki CTLA4 obejmuje domenę zewnątrzkomórkową lub dowolny jej fragment, który wiąże się z B7.

Stosowany tutaj termin „zmutowana cząsteczka CTLA4” oznacza CTLA4 typu dzikiego, jak pokazano na Fig. 23, albo dowolny jej fragment lub pochodną, która posiada mutację lub mutacje wielokrotne (dogodnie w zewnątrzkomórkowej domenie CTLA4 typu dzikiego). Zmutowana cząsteczka CTLA4 posiada sekwencję, która jest podobna, lecz nie identyczna z sekwencją cząsteczki CTLA4 typu dzikiego, lecz nadal wiąże się z B7. Mutacje mogą obejmować jedną lub większą ilość reszt aminokwasowych zastąpionych przez aminokwasy mające konserwatywną (np. podstawienie leucyny przez izoleucynę) lub niekonserwatywną (np. podstawienie glicyny przez tryptofan) strukturę lub właściwości chemiczne, delecje aminokwasów, addycje, przesunięcia ramki odczytu lub skrócenia. Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą zawierać cząsteczkę inną niż CTLA4 lub mogą być do niej dołączone. Zmutowane cząsteczki mogą być rozpuszczalne (tj. mogą występować w krążeniu) lub mogą być związane z powierzchnia komórki. Dodatkowe zmutowane cząsteczki CTLA4 obejmują te opisane w zgłoszeniach patentowych USA o numerach seryjnych 09/865321, 60/214065 i 60/287576; w patentach USA o numerach 6090914, 5844095 i 5773253; oraz opisane przez Peach, R. J., i wsp., w J Exp Med 180:2049-2958 (1994)). Zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą być otrzymane w sposób syntetyczny lub przy użyciu technik rekombinowania DNA.

„CTLA4Ig” jest rozpuszczalnym białkiem fuzyjnym zawierającym domenę zewnątrzkomórkowa CTLA4 typu dzikiego przyłączoną do końca Ig lub jej fragmentem wiążącym B7. Specyficzne wykonanie obejmuje domenę zewnątrzkomórkowa CTLA4 typu dzikiego (jak pokazano ja Fig. 23) zaczynającą się od metioniny w pozycji +1 a kończącą kwasem asparaginowym w pozycji +124; lub zaczynającą się alaniną w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; łącznikową resztę aminokwasowa, glutaminy, w pozycji +125; oraz fragment immunoglobuliny obejmujący kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357 (DNA kodujący CTLA4lg został zdeponowany 31 maja 1991 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim i uzyskał numer dostępu ATCC 68629; Linsley, P., i wsp., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, linia komórkowa Jajników Chomika Chińskiego (CHO) z ekspresją CTLA4Ig została zdeponowana 31 maja 1991 pod numerem identyfikacyjnym ATCC CRL-10762). Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4Ig używane w sposobach i/lub zestawach tu opisanych mogą, ale nie koniecznie, zawierać sekwencje peptydu sygnałowego (liderowego). Typowo w sposobach i/lub zestawach tu opisanych, cząsteczki nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

„L104EA29YIg” jest białkiem fuzyjnym, które jest rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA-4 zawierającą domenę zewnątrzkomórkowa dzikiego CTLA4 ze zmianami aminokwasów A29Y (reszta aminokwasowa tyrozyny podstawiona za alaninę w pozycji 29) i L104E (reszta aminokwasowa kwasu glutaminowego podstawiona za leucynę w pozycji +104) lub jej część, która wiąże cząsteczkę B7, przyłączoną do końca Ig (włączoną do Fig. 19; DNA kodujący L104EA29YIg został zdeponowany 20 lipca 2000 pod numerem ATCC PTA-2104; także zawarte w zgłoszeniach patentowych USA o numerach seryjnych 09/579927, 60/287576 i 60/214065). Rozpuszczalne cząsteczki L104EA29YIg stosowane w sposobach i/lub zestawach tu opisanych mogą, ale nie koniecznie, zawierać sekwencję peptydu sygnałowego (liderowego). Typowo w sposobach i/lub zestawach tu opisanych cząsteczki nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

Stosowany tutaj termin „rozpuszczalny” odnosi się do dowolnej cząsteczki lub jej fragmentów lub pochodnych niezwiązanych ani nieprzyłączonych do komórki, tj. występujących w krążeniu. Na przykład, CTLA4, B7 lub CD28 mogą być doprowadzone do stanu rozpuszczalnego poprzez przyłączenie fragmentu immunoglobulinowego (Ig) do domeny zewnątrzkomórkowej odpowiednio, CTLA4, B7 lub CD28. Alternatywnie, cząsteczkę taką jak CTLA4 można uczynić rozpuszczalną przez usunięcie domeny transbłonowej. Typowo cząsteczki rozpuszczalne używane w sposobach tu opisanych nie zawierają sekwencji sygnałowej (lub liderowej).

Stosowany tutaj termin „rozpuszczalne cząsteczki CTLA4” oznacza cząsteczki CTLA4 nie związane z powierzchnią komórki (tj. występujące w krążeniu) lub dowolny funkcjonalny fragment

PL 212 205 B1 cząsteczki CTLA4, który wiąże B7, włączając w to, lecz nieograniczająco: białka fuzyjne CTLA4Ig (np. ATCC 68629), w których domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 jest połączona z fragmentem immunoglobulinowym (Ig) czyniącym cząsteczkę fuzyjną rozpuszczalną, lub ich fragmentów i pochodnych; białka z zewnątrzkomórkowa domeną CTLA4 połączoną z fragmentem białka aktywnego biologicznie lub aktywnego chemicznie, takiego jak produkt genu E7 wirusa brodawczaka (CTLA4-E7), antygen p97 związany z czerniakiem (CTLA4-p97) lub białko env wirusa HIV (CTLA4-env gp120), lub ich fragmenty i pochodne; hybrydowe (chimerowe) białka fuzyjne, takie jak CD28/CTLA4Ig, lub ich fragmenty i pochodne; cząsteczki CTLA4 z usuniętą domeną transbłonową w celu uczynienia białka rozpuszczalnym (Oaks, M. K., i wsp., 2000 Cellular Immunology 201:144-153), lub ich fragmenty i pochodne.

Termin „rozpuszczalne cząsteczki CTLA4” obejmuje także ich fragmenty, części lub pochodne oraz zmutowane cząsteczki CTLA4 posiadające aktywność wiązania charakterystyczną dla CTLA4. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 używane w sposobach tu opisanych mogą, ale nie koniecznie, zawierać sekwencję peptydu sygnałowego (liderowego). Typowo w sposobach tu opisanych cząsteczki nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

Stosowany tutaj termin „zewnątrzkomórkowa domena CTLA4” jest częścią CTLA4, która rozpoznaje i wiąże ligandy CTLA4, takie jak cząsteczki B7. Na przykład, zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 zawiera metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (Fig. 23). Alternatywnie, zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 obejmuje alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (Fig. 23). Domena zewnątrzkomórkowa obejmuje fragmenty lub pochodne CTLA4, które wiążą cząsteczkę B7. Zewnątrzkomórkowa domena CTLA4, jak pokazano na Fig. 23 może obejmować także mutacje, które zmieniają aktywność wiązania cząsteczki CTLA4 do cząsteczki B7.

Stosowany tutaj termin „mutacja” oznacza zmianę w sekwencji nukleotydowej lub aminokwasowej cząsteczki typu dzikiego, na przykład, zmianę w sekwencjach zewnątrzkomórkowej domeny CTLA4 typu dzikiego. Mutacja w DNA może zmienić kodon, prowadząc do zmiany w sekwencji aminokwasowej. Zmiana DNA może obejmować substytucje, delecje, insercje, alternatywne składanie RNA lub skrócenia łańcucha. Zmiana aminokwasów może obejmować substytucje (podstawienia), delecje, insercje, addycje, skrócenia łańcucha lub błędy w obróbce lub cięciu białka. Alternatywnie, mutacje w sekwencji nukleotydowej mogą powodować mutację cichą w sekwencji aminokwasowej, co jest dobrze znane w tej dziedzinie. Ma to uzasadnienie w tym, że niektóre kodony kodują ten sam aminokwas. Przykłady obejmują kodony nukleotydowe CGU, CGG, CGC i CGA kodujące aminokwas argininę (R) lub kodony GAU i GAC kodujące aminokwas kwas asparaginowy (D). Tak więc, białko może być kodowane przez jedną lub większą liczbę cząsteczek kwasu nukleinowego, które różnią się w ich specyficznej sekwencji nukleotydowej, ale nadal kodują cząsteczki białka mające identyczne sekwencje. Sekwencja kodująca aminokwas jest następująca:

Aminokwas	Symbol	Symbol jedno- literowy	Kodony
1	2	3	4
Alanina	Ala	A	GCU,GCC,GCA,GCG
Cysteina	Cys	C	UGU,UGC
Kwas asparaginowy	Asp	D	GAU,GAC
Kwas glutaminowy	Glu	E	GAA,GAG
Fenyloalanina	Phe	F	UUU,UUC
Glicyna	Gly	G	GGU,GGC,GGA,GGG
Histydyna	His	H	CAU,CAC
Izoleucyna	Ile	I	AUU,AUC,AUA
Lizyna	Lys	K	AAA,AAG
Leucyna	Leu	L	UUA,UUG,CUU,CUC,CUA,CUG
Metionina	Met	M	AUG
Asparagina	Asn	N	AAU,AAC

PL 212 205 B1 ciąg dalszy

1	2	3	4
Prolina	Pro	P	CCU,CCC,CCA,CCG
Glutamina	Gln	Q	CAA,CAG
Arginina	Arg	R	CGU,CGC,CGA,CGG,AGA,AGG
Seryna	Ser	S	UCU,UCC,UCA,UCG,AGU,AGC
Treonina	Thr	T	ACU,ACC,ACA,ACG
Walina	Val	V	GUU,GUC,GUA,GUG
Tryptofan	Trp	W	UGG
Tyrozyna	Tyr	Y	UAU,UAC

Zmutowana cząsteczka może posiadać jedną lub większą liczbę mutacji.

Stosowany tutaj termin „sekwencja białkowa inna niż CTLA4” lub „cząsteczka inna niż CTLA4” oznacza dowolną cząsteczkę białka, która nie wiąże B7 i nie przeszkadza przy wiązaniu CTLA4 z jego celami. Przykłady obejmują region stały immunoglobuliny (Ig) lub jego części. Dogodnie region stały Ig jest ludzkim lub małpim regionem stałym Ig, np. ludzkim C(gamma)1, włączając zawias, regiony CH2 i CH3. Region stały Ig może być zmutowany w celu zmniejszenia jego funkcji efektorowych (patenty USA 5637481, 5844095 i 5434131).

Stosowany tutaj termin „fragment” lub „część” jest dowolnym odcinkiem lub segmentem cząsteczki CTLA4, w szczególności zewnątrzkomórkowej domeny CTLA4 lub jej odcinka lub segmentu, który rozpoznaje i wiąże jej cel, np. cząsteczkę B7.

Stosowany tutaj termin „B7” dotyczy rodziny cząsteczek B7, w tym między innymi B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) i B7-3, które mogą rozpoznawać i wiązać się z CTLA4 i/lub CD28.

Stosowany tutaj termin „komórki B7-dodatnie” dotyczy dowolnych komórek z ekspresją na ich powierzchni jednego lub większej liczby typów cząsteczek B7.

Stosowany tutaj termin „pochodna” dotyczy cząsteczki, która wykazuje homologię sekwencji i aktywność tej cząsteczki wyjściowej. Na przykład, pochodna CTLA4 obejmuje rozpuszczalną cząsteczkę CTLA4 mającą sekwencję aminokwasowa podobną przynajmniej w 70% do zewnątrzkomórkowej domeny CTLA4 typu dzikiego, która rozpoznaje i wiąże B7, np. CTLA4Ig lub rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4, L104EA29YIg.

Stosowany tutaj termin „blokować” lub „hamować” receptor, sygnał lub cząsteczkę oznacza przeszkadzanie w aktywacji receptora, sygnału lub cząsteczki, przy oznaczaniu testem stosowanym w danej dziedzinie. Na przykład, zablokowanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej może być wykrywane przez oznaczanie zmniejszenia objawów związanych z chorobą reumatyczną. Blokowanie lub hamowanie może być częściowe lub całkowite.

Stosowany tutaj termin „blokowanie oddziaływań B7” oznacza zakłócanie wiązania B7 z jego Ligandami, takimi jak CD28 i/lub CTLA4 prowadzące do hamowania oddziaływania komórek T z komórkami B7-dodatnimi. Przykłady czynników, które blokują interakcje B7 obejmują cząsteczki, takie jak przeciwciało (lub jego część lub pochodną), która rozpoznaje i wiąże się z dowolną cząsteczką CTLA4, CD28 lub B7 (np. B7-1, B7-2); rozpuszczalną formę (lub jej część lub pochodną) cząsteczki, takiej jak CTLA4; fragment peptydu lub inna mała cząsteczka zaprojektowana tak, aby zakłócać sygnał komórkowy przez oddziaływanie za pośrednictwem CTLA4/CD28/B7. Zgodnie z wynalazkiem czynnikiem blokującym jest rozpuszczalna cząsteczka CTLA4, taka jak CTLA4Ig (ATCC 68629) lub L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), ewentualnie może to być rozpuszczalna cząsteczka CD28, taka jak CD28Ig (ATCC 68628), rozpuszczalna cząsteczka B7, taka jak B7Ig (ATCC 68627), przeciwciało monoklonalne anty-B7 (np. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 i przeciwciała monoklonalne opisane przez Anderson i wsp. w Patencie USA 6113898 lub Yokochi i wsp., 1982. J Immun., 128(2)823-827), przeciwciało monoklonalne anty-CTLA4 (np. ATCC HB-304, przeciwciała monoklonalne opisane w odesłaniach 82-83) i/lub przeciwciało monoklonalne anty-CD28 (np. ATCC HB 11944 i mAb 9.3 opisane przez Hansen (Hansen i wsp., 1980. Immunogenetics 10:247-260) lub Martin (Martin i wsp., 1984. J. Clin. Immun., 4(1):18-22)).

Stosowany tutaj termin „choroba układu immunologicznego” oznacza dowolną chorobę, w której pośredniczą oddziaływania komórek T z komórkami B7-dodatnimi, włączając w to między innymi

PL 212 205 B1 choroby autoimmunologiczne, zaburzenia związane z przeszczepami i choroby immunoproliferacyjne. Przykłady chorób układu immunologicznego obejmują chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) (np. taką, która może być pojawić się po przeszczepie szpiku kostnego lub przy wzbudzaniu tolerancji), choroby immunologiczne związane z odrzuceniem przeszczepu, przewlekłym odrzuceniem oraz tkankowymi lub komórkowymi przeszczepami allo- lub ksenogenicznymi, włączając w to narządy lite, skórę, wysepki trzustkowe, mięśnie, hepatocyty, neurony. Przykłady chorób immunoproliferacyjnych obejmują łuszczycę, chłoniaka z komórek T, ostrą białaczkę limfoblastyczną z udziałem komórek T, angiocentrycznego chłoniaka jąder z udziałem komórek T, łagodne limfocytarne zapalenie naczyń, tocznia (np. tocznia rumieniowatego, zapalenie nerek w toczniu układowym), zapalenie tarczycy Hashimoto, obrzęk śluzowaty pierwotny, chorobę Gravesa, anemię złośliwą, autoimmunologiczny zanikowy nieżyt żołądka, chorobę Adisona, cukrzycę (np. cukrzycę insulino-zależną, cukrzycę typu I, cukrzycę typu II), zespół dobrego pasterza, miastenię, pęcherzycę, chorobę Crohna, współczulne zapalenie naczyniówki, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka, stwardnienie rozsiane, autoimmunologiczną anemię hemolityczną, małopłytkowość idiopatyczną, pierwotną żółciową marskość wątroby, aktywne przewlekłe zapalenie wątroby, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół Sjogrena, choroby reumatyczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów), zapalenie wielomięśniowego, twardzinę skóry i mieszaną chorobę tkanki łącznej.

Stosowany tutaj termin „choroby reumatyczne” oznacza dowolną chorobę, która atakuje stawy, kość, tkankę miękką lub rdzeń kręgowy (Mathies, H. 1983 Rheuma) i obejmuje ostry gościec stawowy, gościec zwyrodnieniowy, gościec pozastawowy i choroby kolagenowe. Ponadto choroby reumatyczne obejmują przewlekłe zapalenie wielostawowe, postępujący gościec przewlekły, łuszczycę stawową, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, reumatoidalne zapalenie stawów, uogólnione guzkowate zapalenie stawów, układowego tocznia rumieniowatego, postępującą układową twardzinę skóry, zespół bolesnego barku, dnawe zapalenie stawów, chondrokalcynozę, zapalenie skórno-mięśniowe, gościec mięśniowy, zapalenie mięśni i miejscowe stwardnienie mięśnia. O niektórych chorobach reumatycznych wiadomo, że są chorobami autoimmunologicznymi powodowanymi przez zmienioną odpowiedź immunologiczną osobnika.

Stosowany tutaj termin „terapia genowa” jest procesem leczenia przez manipulację genetyczną w ten sposób, że sekwencja kwasu nukleinowego jest przenoszona do komórki, a następnie w komórce dowolny produkt genetyczny kodowany przez ten kwas nukleinowy ulega ekspresji. Na przykład, jak to jest dobrze znane przez specjalistów w tej dziedzinie, przenoszenie kwasu nukleinowego może być wykonane przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego zawierającego kwas nukleinowy będący przedmiotem zainteresowania do komórki ex vivo lub in vitro na wiele sposobów włączając w to, na przykład, precypitację chlorkiem wapnia, dietyloaminoetylodekstranem, glikolem polietylenowym (PEG), elektroporację, bezpośrednie wstrzyknięcie, lipofekcję lub infekcję wirusową (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman and Co, New York, N.Y., 1993) i Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993). Alternatywnie, sekwencje kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania mogą być przeniesione do komórki in vivo w różnych wektorach i na różne sposoby włączając w to na przykład, bezpośrednie podanie osobnikowi kwasu nukleinowego (Williams i wsp., 1991 PNAS 88:2726-2730) lub wstawienie kwasu nukleinowego do wektora wirusowego i infekcję osobnika wirusem (Battleman i wsp., 1993 J Neurosci 13:94-951; Carroll i wsp., 1993 J Cell Biochem 17E:241; Lebkowski i wsp., patent USA 5354678; Davison i Elliott, Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)). Inne sposoby stosowane do przeniesienia kwasu nukleinowego in vivo obejmują zamknięcie kwasu nukleinowego w liposomach i bezpośrednie przeniesie do osobnika liposomów lub liposomów połączonych z hemaglutynującym wirusem Sendai (patent USA nr 5824655 włączony tu jako odniesienie). W komórkach transfekowanych lub nastrzykniętych ekspresji ulegają produkty białkowe kodowane przez kwas nukleinowy w celu złagodzenia choroby lub objawów choroby.

Aby tu opisywany wynalazek był lepiej zrozumiały przedstawiony jest poniższy opis.

Kompozycje i sposoby według niniejszego wynalazku.

Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje i sposoby do leczenia chorób układu immunologicznego, takich jak choroby reumatyczne, przez podawanie osobnikowi skutecznej dawki ligandu, który wiąże cząsteczkę B7, na przykład rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 (takich jak CTLA4Ig i/lub

L104EA29YIg) i mAb, które rozpoznają i wiążą B7. Skuteczna dawka jest zdefiniowana jako ilość rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, która, kiedy są one związane z cząsteczkami B7 na komórkach

PL 212 205 B1

B7-dodatnich, hamuje wiązanie się cząsteczek B7 z endogennymi Ligandami, takimi jak CTLA4 i CD28.

Wynalazek dotyczy zastosowania w leczeniu choroby reumatycznej. Choroby reumatyczne są dowolnymi chorobami, które charakteryzują się (i) zapaleniem lub zwyrodnieniem struktur ciała z tkanki mięśniowo-szkieletowej lub łącznej, w szczególności stawów, włączając w to mięśnie, ścięgna, chrząstkę, tkanki maziówkowe i włókniste, (ii) z towarzyszącą mu opuchlizną stawów, tkliwością stawów, zapaleniem, sztywnością poranną i/lub bólem lub upośledzeniem poruszania się lub funkcji tych struktur i w pewnych przypadkach (iii) z częstym towarzyszącym mu dowodem serologicznym - czynnikiem reumatoidalnym i innymi zastępczymi markerami zapalenia.

Choroby reumatyczne obejmują reumatoidalne zapalenie stawów. Objawy reumatoidalnego zapalenia stawów obejmują opuchliznę, tkliwość stawów, zapalenie, sztywność poranną i ból prowadzący do niepełnosprawności fizycznej. Pacjenci będący w zaawansowanych stadiach zapalenia stawów cierpią na objawy uszkodzenia strukturalnego i wycieńczający ból. Inne narządy także mogą być upośledzone przez mechanizm autoimmunologiczny.

Kompozycje

Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje do leczenia chorób immunologicznych, takich jak choroby reumatyczne, zawierające rozpuszczalne cząsteczki CTLA4. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje zawierające czynnik biologiczny, który poprzez kontakt komórek B7-dodatnich z rozpuszczalnym CTLA4 w organizmie człowieka hamuje funkcjonowanie komórek T, ale nie powoduje ubytku komórek T u człowieka. Przykłady rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 np. L104EA29YIg.

Cząsteczki CTLA4 o sekwencjach zmutowanych lub typu dzikiego mogą być uczynione rozpuszczalnymi przez delecję transbłonowego segmentu CTLA4 (Oaks, M. K., i wsp., 2000 Cellular Immunology 201:144-153).

Alternatywnie, rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 o sekwencjach zmutowanych lub typu dzikiego mogą być białkami fuzyjnymi, w których cząsteczki CTLA4 są przyłączone do części innych niż CTLA4, takich jak cząsteczki immunoglobuliny (Ig), które czynią cząsteczki CTLA4 rozpuszczalnymi. Na przykład, białko fuzyjne CTLA4 może zawierać zewnątrzkomórkowa domenę CTLA4 połączoną ze domeną stałą immunoglobuliny, dając w rezultacie cząsteczkę CTLA4Ig (Fig. 24) (Linsley, P. S., i wsp., 1994 Immunity 1:793-80).

W przypadku protokołów klinicznych zaleca się, aby region immunoglobuliny nie wzbudzał szkodliwej odpowiedzi immunologicznej u osobnika. Zalecanym ugrupowaniem jest region stały immunoglobuliny, w tym regiony stałe immunoglobulin człowieka i małpy. Jednym z przykładów odpowiedniego regionu immunoglobuliny są ludzkie regiony Cy1, w tym zawias, regiony CH2 i CH3, które mogą pośredniczyć w funkcjach efektorowych, takich jak wiązanie z receptorami Fc, pośrednicząc w cytotoksyczności zależnej od układu dopełniacza (CDC) lub pośrednicząc w cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC). W obrębie ugrupowania immunoglobuliny może występować jedna lub więcej mutacji (np. w domenie CH2 w celu zmniejszenia funkcji efektorowych, takich jak CDC lub ADCC), gdzie mutacja moduluje zdolność wiązania immunoglobuliny z jej ligandem poprzez zwiększenie lub zmniejszenie zdolności wiązania immunoglobuliny do receptorów Fc. Na przykład, mutacje w immunoglobulinie mogą obejmować zmiany w dowolnej lub we wszystkich resztach cysteiny w domenie zawiasu, na przykład cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione przez serynę (Fig. 24). Cząsteczka immunoglobuliny może także zawierać prolinę w pozycji +148 podstawioną seryną, jak pokazano na Fig. 24. Ponadto, mutacje w składniku immunoglobulinowym mogą obejmować podstawienie leucyny w pozycji +144 przez fenyloalaninę, podstawienie leucyny w pozycji +145 kwasem glutaminowym lub podstawienie glicyny w pozycji +147 alaniną.

Dodatkowe ugrupowania inne niż CTLA4 do zastosowania w rozpuszczalnych cząsteczkach CTLA4 lub rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczkach CTLA4 obejmują cząsteczkę p97, cząsteczkę env gp120, cząsteczkę E7 i cząsteczkę ova (Dash, B. i wsp. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6) : 1389 -97; Ikeda, T., i wsp. 1994 Gene 138 (1-2) : 193-6; Falk, K., i wsp. 1993 Cell. Immunol. 150 (2) : 447 -52; Fujisaka, K. i wsp. 1994 Virology 204 (2):789-93). Inne cząsteczki są także możliwe (Gerard, C. i wsp. 1994 Neuroscience 62 (3) : 721; Byrn, R. i wsp. 1989 63 (10) : 4370; Smith, D. i wsp. 1987 Science 238 : 1704; Lasky, L. 1996 Science 233 : 209).

Rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 tu opisana może także obejmować sekwencję peptydu sygnałowego przyłączoną do końca N fragmentu CTLA obejmującego domenę zewnątrzkomórkowa. Peptyd sygnałowy może być dowolną sekwencją, która pozwoli na sekrecję cząsteczki, w tym peptyd

PL 212 205 B1 sygnałowy z onkostatyny M (Malik, i wsp., (1989) Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853) lub CD5 (Jones, N. H. i wsp., (1986) Nature 323:346-349J) lub peptyd sygnałowy z dowolnego białka zewnątrzkomórkowego.

Rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 tu opisana może zawierać peptyd sygnałowy onkostatyny M przyłączony na końcu N domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 oraz cząsteczkę ludzkiej immunoglobuliny (np. region zawiasowy, CH2 i CH3) przyłączoną na końcu C domeny zewnątrzkomórkowej (typu dzikiego lub zmutowanej) CTLA4. Cząsteczka ta zawiera peptyd sygnałowy onkostatyny M obejmujący sekwencję aminokwasowa z metioniną w pozycji -26 do alaniny w pozycji -1, część CTLA4 obejmujący sekwencję aminokwasowa z metioniną w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasowa, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357.

Konkretnie, rozpuszczalnymi zmutowanymi cząsteczkami CTLA4 tu opisanymi zawierającymi opisane tu zmutowane sekwencje CTLA4 mogą być cząsteczki fuzyjne zawierające ludzkie ugrupowanie IgCy1 połączone ze zmutowanymi fragmentami CTLA4.

W jednym z wykonań rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierają IgC/1 połączoną z fragmentem CTLA4 zawierającym mutację w jednym miejscu w domenie zewnątrzkomórkowej. Domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 zawiera metioninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (np. Fig. 23). Zewnątrzkomórkowa część CTLA4 może zawierać alaninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (np. Fig. 23). Przykłady mutacji w jednym miejscu obejmują następujące, gdzie leucyna w pozycji +104 jest zmieniona na dowolny inny aminokwas:

Pojedynczy mutant:	Zmiana kodonu:
L104EIg	Kwas glutaminowy GAG
L104SIg	Seryna AGT
L104TIg	Treonina ACG
L104AIg	Alanina GCG
L104WIg	Tryptofan TGG
L104QIg	Glutamina CAG
L104KIg	Lizyna AAG
L104RIg	Arginina CGG
L104GIg	Glicyna GGG

Ponadto, wynalazek dostarcza zmutowanych cząsteczek mających domenę zewnątrzkomórkowa CTLA4 z dwiema mutacjami, połączoną z resztą IgCy1. Przykłady obejmują następujące, gdzie leucyna w pozycji +104 jest zmieniona na inny aminokwas (np. kwas glutaminowy) i glicyna w pozycji +105, seryna w pozycji +25, treonina w pozycji +30 lub alanina w pozycji +29 jest zmieniona jakikolwiek inny aminokwas:

Podwójne mutanty:	Zmiana kodonu:
L104EG105FIg	Fenyloalanina TTC
L104EG105WIg	Tryptofan TGG
L104EG105LIg	Leucyna CTT
L104ES25RIg	Arginina CGG
L104ET30GIg	Glicyna GGG
L104ET30NIg	Asparagina AAT
L104EA29YIg	Tyrozyna TAT
L104EA29LIg	Leucyna TTG
L104EA29TIg	Treonina ACT
L104EA29WIg	Tryptofan TGG

PL 212 205 B1

Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano zmutowane cząsteczki mające domenę zewnątrzkomórkowa CTLA4 z trzema mutacjami, połączoną z resztą IgCy1. Przykłady obejmują następujące, gdzie leucyna w pozycji +104 jest zmieniona na inny aminokwas (np. kwas glutaminowy), alanina w pozycji +29 jest zmieniona na inny aminokwas (np. tyrozynę), a seryna w pozycji +25 jest zmieniona na inny aminokwas:

Potrójne mutanty:	Zmiany kodonu:
L104EA29YS25KIg	Lizyna AAA
L104EA29YS25KIg	Lizyna AAG
L104EA29YS25NIg	Asparagina AAC
L104EA29YS25RIg	Arginina CGG

Rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 tu opisane mogą mieć łącznikową resztę aminokwasowa, która jest położona pomiędzy częścią CTLA4 i częścią Ig cząsteczki. Łącznikowym aminokwasem może być dowolny aminokwas, włączając w to glutaminę. Łącznikowy aminokwas można wprowadzić metodami molekularnymi albo syntezy chemicznej znanymi w tej dziedzinie.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające sekwencję peptydu sygnałowego przyłączoną na końcu N domeny zewnątrzkomórkowej części CTLA4 zmutowanej cząsteczki. Sekwencją sygnałową może być dowolna sekwencja, która umożliwia wydzielanie zmutowanej cząsteczki włączając w to peptyd sygnałowy onkostatyny M (Malik i wsp., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853) lub CD5 (Jones, N. H. i wsp., 1986 Nature 323: 346-349) albo peptyd sygnałowy dowolnego białka zewnątrzkomórkowego.

Zgodnie z wynalazkiem opisano zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające mutację w jednym miejscu w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104EIg (zamieszczoną na Fig. 18) lub L104SIg, gdzie L104EIg i L104SIg są zmutowane w swoich sekwencjach CTLA4, tak że leucyna w pozycji +104 jest zastąpiona odpowiednio kwasem glutaminowym albo seryną. Cząsteczki z pojedynczymi mutacjami zawierają ponadto części CTLA4 obejmujące metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasowa, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasowa mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinową zmutowanej cząsteczki może być również zmutowana, tak że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są zastąpione seryną, a prolina w pozycji +148 jest zastąpiona seryną. Alternatywnie, rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 z pojedynczą mutacją może mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Zgodnie z wynalazkiem opisano zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające podwójną mutację w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg lub L104EA29WIg, gdzie leucyna w pozycji +104 jest zastąpiona przez kwas glutaminowy, a alanina w pozycji +29 jest zmieniona odpowiednio, na tyrozynę, leucynę, treoninę i tryptofan. Sekwencje dla L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg i L104EA29WIg, rozpoczynające się od metioniny w pozycji +1 a kończące lizyną w pozycji +357, plus sekwencja peptydu sygnałowego (lidera) są objęte sekwencjami pokazanymi odpowiednio na Fig. 19-22. Cząsteczki zmutowane w dwóch miejscach zawierają ponadto części CTLA4 obejmujące metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasowa, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126, do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinową zmutowanej cząsteczki może być również zmutowana, tak że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są zastąpione seryną, a prolina w pozycji +148 jest zastąpiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji + 124.

Zgodnie z wynalazkiem opisano też zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające podwójną mutację w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104EG105FIg, L104EG105WIg i L104EG105LIg, gdzie leucyna w pozycji +104 jest zastąpiona kwasem glutaminowym, a glicyna w pozycji +105 jest zastąpiona odpowiednio fenyloalaniną, tryptofanem i leucyną. Cząsteczki zmutowane w dwóch miejscach zawierają ponadto części CTLA4 obejmujące metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126, do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinową zmutowanej cząsteczki może

PL 212 205 B1 być również zmutowana, tak że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są zastąpione seryną, a prolina w pozycji +148 jest zastąpiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto L104ES25RIg, która jest zmutowaną cząsteczką CTLA4 zawierającą podwójną mutację obejmującą część CTLA4 zawierającą metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część mająca domenę zewnątrzkomórkowa CTLA4 jest zmutowana tak, że leucyna w pozycji +104 jest zastąpiona kwasem glutaminowym. Alternatywnie, L104ES25RIg może mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające podwójną mutację w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104ET30GIg i L104ET30NIg, gdzie leucyna w pozycji +104 jest zastąpiona kwasem glutaminowym, a treonina w pozycji +30 jest zastąpiona odpowiednio glicyną i asparaginą. Cząsteczki zmutowane w dwóch miejscach zawierają ponadto części CTLA4 obejmujące metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinową zmutowanej cząsteczki może być również zmutowana, tak że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są zastąpione seryną, a prolina w pozycji +148 jest zastąpiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 zawierające potrójną mutację w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4, takie jak L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg, gdzie leucyna w pozycji +104 jest zmieniona na kwas glutaminowy, alanina w pozycji +29 jest zmieniona na tyrozynę, a seryna w pozycji +25 jest zmieniona odpowiednio na lizynę, asparaginę i argininę. Cząsteczki zmutowane w trzech miejscach zawierają ponadto części CTLA4 obejmujące metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową, glutaminę, w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357. Część immunoglobulinową zmutowanej cząsteczki może być również zmutowana, tak że cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są zastąpione seryną, a prolina w pozycji +148 jest zastąpiona seryną. Alternatywnie, te zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą mieć część CTLA4 obejmującą alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124.

Dodatkowe rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 obejmują zmutowane chimerowe cząsteczki homologów CTLA4/CD28, które wiążą się z B7 (Peach, R. J., i wsp., 1994 J. Exp. Med. 180: 2049-2058). Przykłady tych zmutowanych chimerowych cząsteczek homologów CTLA4/CD28 obejmują HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 i HS14 (patent USA numer 5773253).

Zalecanymi wykonaniami są rozpuszczalne cząsteczki CTLA4, takie jak CTLA4Ig (jak pokazano na Fig. 24, rozpoczynające się od metioniny w pozycji +1, a kończące się na lizynie w pozycji +357) i rozpuszczalna zmutowana CTLA4 - L104EA29YIg (jak pokazano na Fig. 19, rozpoczynająca się od metioniny w pozycji +1, a kończąca się lizyną w pozycji +357). Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje aminokwasowe odpowiadające rozpuszczalnym cząsteczkom CTLA4 tu opisanym. W jednym z wykonań, cząsteczką kwasu nukleinowego jest DNA (np. cDNA) albo jego hybryda. DNA kodujący CTLA4Ig (Fig. 24) zdeponowano 31 maja, 1991 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 i przypisano mu numer dostępu ATCC, ATCC 68629. DNA kodujący L104EA29YIg (sekwencja na Fig. 19) zdeponowano 19 czerwca, 2000 w ATCC i przypisano mu numer dostępu ATCC, PTA-2104. Alternatywnie, cząsteczkami kwasu nukleinowego są RNA albo ich hybrydy.

Dodatkowo zgodnie z wynalazkiem opisano wektor, który zawiera sekwencje nukleotydowe tu opisane. Przykłady wektorów ekspresyjnych obejmują wektory dla ssaczych komórek gospodarzy (np.

BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life

Technologies); wektory pVPakc, wektory pCMV, wektory pSG5 (Stratagene)), wektory retrowirusowe (np. wektory pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) lub ich zmodyfikowane postaci, wektory

PL 212 205 B1 adenowirusowe; wektory związane z adenowirusami, wektory bakulowirusowe, wektory drożdżowe (np. wektory pESC (Stratagene)).

Zgodnie z wynalazkiem opisano również wektorowy układ gospodarza. Wektorowy układ gospodarza obejmuje opisany tu wektor w odpowiedniej komórce gospodarza. Przykłady odpowiednich komórek gospodarza obejmują komórki prokariotyczne i eukariotyczne. Odpowiednimi komórkami gospodarza są też komórki eukariotyczne. Przykłady komórek eukariotycznych obejmują dowolną komórkę zwierzęcą, czy to pierwotną, czy unieśmiertelnioną, drożdżową (np. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe i Pichia pastoris) oraz komórkę roślinną. Komórki szpiczaka, COS i CHO są przykładami komórek zwierzęcych, które można użyć jako gospodarzy. Konkretne komórki CHO obejmują między innymi, DG44 (Chasin, i wsp., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC nr CCL-61), linię komórek CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO oznaczone jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO klon B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF oznaczone ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) i RR-CHOK1 oznaczone ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Przykładowe komórki roślinne obejmują tytoń (całe rośliny, hodowlę komórkową lub kalus), komórki kukurydzy, soi i ryżu. Dopuszczalne są również nasiona kukurydzy, soi i ryżu.

Opisane tu zmutowane cząsteczki CTLA4 można wyizolować jako naturalnie występujące polipeptydy albo z dowolnego źródła czy to naturalnego, syntetycznego, półsyntetycznego czy rekombinowanego. A zatem opisane tu zmutowane cząsteczki CTLA4 można wyizolować jako naturalnie występujące białka z dowolnego gatunku, a w szczególności ssaka, włączając w to bydło, owce, myszy, konie, a w szczególności człowieka. Alternatywnie, zmutowane cząsteczki CTLA4 tu opisane można wyizolować jako rekombinowane polipeptydy, które są wyrażane w eukariotycznych albo prokariotycznych komórkach gospodarza albo wyizolowane jako polipeptyd zsyntetyzowany syntetycznie.

Specjalista w tej dziedzinie może łatwo zastosować standardowe metody izolacji w celu otrzymania wyizolowanych zmutowanych cząsteczek CTLA4. Charakter i stopień izolacji będzie zależał od źródła i zamierzonych zastosowań wyizolowanych cząsteczek.

Zmutowane cząsteczki CTLA4 i ich fragmenty oraz pochodne można wytworzyć metodami rekombinowania DNA. A zatem, wyizolowaną sekwencję nukleotydowa kodującą CTLA4 typu dzikiego można poddać manipulacjom w celu wprowadzenia mutacji, prowadzących do powstania sekwencji nukleotydowych, które kodują zmutowane cząsteczki polipeptydowe CTLA4. Przykładowo, sekwencję nukleotydowa kodującą zmutowane cząsteczki CTLA4 można wytworzyć poprzez metody ukierunkowanej mutagenezy, stosując startery i amplifikacje PCR. Startery mogą zawierać specyficzne sekwencje zaprojektowane do wprowadzenia pożądanych mutacji. Alternatywnie, startery można zaprojektować tak, aby zawierały sekwencje randomizowane albo półrandomizowane w celu wprowadzenia mutacji losowych. Standardowe metody rekombinowania DNA (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Sambrook, Fritch i Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press) i technologię PCR (patent USA nr 4603102) można zastosować do wytworzenia i wyizolowania zmutowanych polinukleotydów CTLA4 kodujących zmutowane polipeptydy CTLA4.

Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje farmaceutyczne do zastosowania w leczeniu chorób układu immunologicznego zawierające skuteczną farmaceutycznie dawkę rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4. W pewnym wykonaniu w chorobach układu immunologicznego pośredniczą oddziaływania CD28/CTLA4/B7. Zalecanymi rozpuszczalnymi cząsteczkami CTLA4 są rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 z sekwencjami typu dzikiego i/lub rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 mające jedną lub dwie mutacje w domenie zewnątrzkomórkowej CTLA4. Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać rozpuszczalne cząsteczki białka i/lub rozpuszczalne cząsteczki kwasów nukleinowych CTLA4 i/lub wektory kodujące te cząsteczki. W zalecanych wykonaniach rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 mają sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 jak pokazano na Fig. 24 lub 19 (CTLA4Ig lub L104EA29Y, odpowiednio). Dogodniej rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4 jest L104EA29YIg jak tu ujawniono. Kompozycje mogą zawierać dodatkowo inne czynniki terapeutyczne, włączając w to między innymi leki- toksyny, enzymy, przeciwciała lub koniugaty.

Zgodnie ze standardową praktyką w tej dziedzinie, opisano też kompozycje farmaceutyczne zawierające cząsteczki tu opisane zmieszane z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem albo adiuwantem, który jest znany specjalistom w tej dziedzinie. Zalecane kompozycje farmaceutyczne zawierają odpowiednie nośniki i adiuwanty, które obejmują dowolny materiał, który w połączeniu z cząsteczką tu opisaną (np. rozpuszczalną cząsteczką CTLA4, taką jak CTLA4Ig lub L104EA29Y) zachowuje aktywność cząsteczki i nie wykazuje reakcji z układem immunologicznym gospodarza. Te nośniki i adiuwanty

PL 212 205 B1 obejmują między innymi wymieniacze jonowe, tlenek glinu, stearynian glinu, lektynę, białka surowicze, takie jak albumina surowicy ludzkiej, substancje buforujące, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasowy, mieszaniny częściowych glicerydów nasyconych roślinnych kwasów tłuszczowych, roztwory soli fizjolologicznej buforowanej fosforanem, wodę, emulsje (np. emulsja olej/woda), sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy, wodorofosforan disodowy, wodorofosforan potasowy, chlorek sodowy, sole cynku, krzemionkę koloidalną, trikrzemian magnezowy, poliwinylopirolidon, substancje oparte na celulozie i glikol polietylenowy. Inne nośniki mogą również obejmować sterylne roztwory, tabletki, włączając w to tabletki powlekane i kapsułki. Typowo, takie nośniki zawierają zaróbki, takie jak skrobia, mleko, cukier (np. sacharoza, glukoza, maltoza), pewne typy gliny, żelatyna, kwas stearynowy, lub jego sole, stearynian magnezowy lub wapniowy, talk, tłuszcze lub oleje roślinne, gumy, glikole lub inne znane zaróbki. Takie nośniki mogą również zawierać dodatki smakowe lub barwne i inne składniki. Kompozycje zawierające takie nośniki są wytwarzane konwencjonalnymi sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Takie kompozycje można również wytwarzać z różnymi kompozycjami lipidowymi, takimi jak na przykład, liposomy, jak również w różnych kompozycjach polimerowych, takich jak mikrokulki.

Sposoby

Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby regulowania funkcjonalnych oddziaływań komórek CTLA4- i CD28-dodatnich z komórkami B7-dodatnimi. Sposoby te obejmują doprowadzanie do kontaktu komórek B7-dodatnich z rozpuszczalną cząsteczką CTLA4 tu opisaną w celu utworzenia rozpuszczalnych kompleksów CTLA4/B7, które to kompleksy zakłócają reakcję endogennej cząsteczki CTLA4 i/lub CD28 z cząsteczką B7.

Zgodnie z wynalazkiem opisano również sposoby hamowania funkcji komórek T, ale nie usuwania komórek T, u ludzi poprzez doprowadzanie do kontaktu komórek B7 z rozpuszczalną CTLA4 tu opisaną. Przykłady rozpuszczalnej CTLA4 obejmują CTLA4Ig i rozpuszczalną zmutowaną cząsteczkę

CTLA4 np. L104EA29YIg.

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto sposoby leczenia chorób układu immunologicznego, takich jak choroby reumatyczne. Sposoby te obejmują podawanie osobnikowi kompozycji terapeutycznej zawierającej rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane w ilości skutecznej do złagodzenia co najmniej jednego z objawów związanych z chorobami układu immunologicznego. Dodatkowo, wynalazek może dostarczać długoterminowej terapii chorób układu immunologicznego poprzez blokowanie oddziaływań komórki T/komórki B7-dodatniej, blokując w ten sposób stymulację komórek T przez sygnały kostymulacyjne, takie jak wiązanie się B7 z CD28, prowadząc do indukcji anergii lub tolerancji komórek T. Choroby układu immunologicznego odejmują między innymi choroby autoimmunologiczne, choroby immunoproliferacyjne i zaburzenia związane z przeszczepami. Przykłady chorób układu immunologicznego obejmują reakcję przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) (np. taką, która może być pojawić się po przeszczepie szpiku kostnego lub przy wzbudzaniu tolerancji), choroby immunologiczne związane z odrzuceniem przeszczepu, przewlekłym odrzuceniem oraz tkankowymi lub komórkowymi przeszczepami allo- lub ksenogenicznymi, włączając w to narządy lite, skórę, wysepki trzustkowe, mięśnie, hepatocyty, neurony. Przykłady chorób immunoproliferacyjnych obejmują łuszczycę, chłoniaka z komórek T, ostrą białaczkę limfoblastyczną z udziałem komórek T, angiocentrycznego chłoniaka jąder z udziałem komórek T, łagodne limfocytarne zapalenie naczyń, tocznia (np. tocznia rumieniowatego, zapalenie nerek w toczniu układowym), zapalenie tarczycy Hashimoto, obrzęk śluzowaty pierwotny, chorobę Gravesa, anemię złośliwą, autoimmunologiczny zanikowy nieżyt żołądka, chorobę Adisona, cukrzycę (np. cukrzycę insulino-zależną, cukrzycę typu I, cukrzycę typu II), zespół dobrego pasterza, miastenię, pęcherzycę, chorobę Crohna, współczulne zapalenie naczyniówki, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka, stwardnienie rozsiane, autoimmunologiczną anemię hemolityczną, małopłytkowość idiopatyczną, pierwotną żółciowej marskość wątroby, aktywne przewlekłe zapalenie wątroby, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół Sjogrena, choroby reumatyczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów), zapalenie wielomięśniowego, twardzinę skóry i mieszaną chorobę tkanki łącznej.

Opisane tu rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 wykazują właściwości hamujące in vivo. W warunkach, gdzie oddziaływania komórki T/komórki B7-dodatniej, na przykład oddziaływania komórki T/komórki B zachodzą na skutek kontaktu pomiędzy komórkami T a komórkami B7-dodatnimi, wiązanie się wprowadzonych cząsteczek CTLA4 jako reakcja z komórkami B7-dodatnimi, na przykład komórkami B może przeszkadzać, tj. hamować oddziaływania komórki T/komórki B7-dodatnie prowadząc do regulacji odpowiedzi immunologicznych.

PL 212 205 B1

Zgodnie z wynalazkiem opisano sposoby zmniejszania odpowiedzi immunologicznych. Zmniejszanie odpowiedzi immunologicznych przez rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane może nastąpić poprzez hamowanie albo blokowanie odpowiedzi immunologicznej, która już trwa albo może obejmować zapobieganie odpowiedzi immunologicznej. Opisane tu rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 mogą hamować funkcje aktywowanych komórek T, takie jak proliferacja komórek T i/lub wydzielenie cytokin poprzez supresję odpowiedzi komórek T lub indukcję tolerancji w komórkach T. Co więcej, opisane tu cząsteczki CTLA4 oddziaływujące ze ścieżką CTLA4/CD28/B7 mogą hamować proliferację komórek T i/lub wydzielanie cytokin, a zatem prowadzić do zmniejszonej destrukcji tkanek i indukcji braku odpowiedzi lub anergii komórek T.

Zalecane wykonanie obejmuje zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4, L104EA29YIg, w regulowaniu funkcjonalnych oddziaływań komórek CTLA4- i CD28-dodatnich z komórkami B7-dodatnimi w celu leczenia chorób układu immunologicznego, takich jak choroby reumatyczne i/lub w celu obniżania odpowiedzi immunologicznych. Opisana tu L104EA29YIg jest rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4 zawierającą co najmniej dwie zmiany aminokwasowe, zmianę leucyny (L) na kwas glutaminowy (E) w pozycji +104 i alaniny (A) w tyrozynę (Y) w pozycji +29. Cząsteczka L104EA29Ylg może ponadto zawierać mutacje poza tymi dwiema tu wymienionymi.

Zalecane wykonanie obejmuje leczenie choroby reumatycznej, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, poprzez podawanie osobnikowi skutecznej ilości rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4. Podawanie skutecznej ilości kompozycji terapeutycznej łagodzi u osobnika co najmniej jeden z objawów związanych z chorobą, włączając w to opuchliznę stawów, tkliwość stawów, zapalenie, sztywność poranną i ból oraz uszkodzenia strukturalne prowadzące do niepełnosprawności fizycznej. Sposoby tu opisane można również zastosować do łagodzenia co najmniej jednego z objawów związanych z reumatoidalnym zapaleniem stawów, w tym do obniżania szybkości sedymentacji erytrocytów, poziomów białka C-reaktywnego, rozpuszczalnej ICAM-1, rozpuszczalnej E-selektyny i/lub rozpuszczalnego IL-2r w surowicy.

Poziom łagodzenia objawów zapewniony przez niniejszy wynalazek można mierzyć przy zastosowaniu dowolnego z przyjętych kryteriów ustalonych dla mierzenia i dokumentacji łagodzenia objawów w warunkach klinicznych. Przyjęte kryteria dla mierzenia łagodzenia objawów mogę obejmować wyniki w oparciu o kryteria ustalone przez American College of Rheumatology (np. ACR 20), dla czterech miar łagodzenia objawów (w „CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA 1988) i kwestionariusza oceny zdrowia (Health Assessment Questionnaire, HAQ) (Fries, J. F., i wsp., 1982 J. of Rheumatology 9: 789-793). Dla ogólnego opisu tych kryteriów patrz „Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA)”, luty 1999.

Osobniki leczone zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmują ssaki, w tym człowieka, małpę, małpę człekokształtną, psa, kota, krowę, konia, królika, mysz i szczura.

Zgodnie z wynalazkiem opisano różne sposoby, miejscowe albo ogólnoustrojowe, podawania rozpuszczanej cząsteczki CTLA4. Sposoby obejmują metody dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe, doustne, inhalacje i podskórne, jak również wszczepialną pompę, stałe wlewy, terapię genową, liposomy, czopki, kontakt miejscowy, pęcherzyki, kapsułki i iniekcje. Czynnik terapeutyczny, zmieszany z nośnikiem, liofilizuje się zwykle w celu przechowywania i rozpuszcza w wodzie albo buforowanym roztworze o pH obojętnym (pH około 7-8, np. 7,5) przed podaniem.

Zgodnie ze standardową praktyką w tej dziedzinie, kompozycje tu opisane można podawać osobnikowi w dowolnej z akceptowalnych postaci.

Sposoby tu opisane obejmują podawanie osobnikowi rozpuszczanych cząsteczek CTLA4 tu opisanych w celu regulowania funkcjonalnych oddziaływań komórek CTLA4- i CD28-dodatnich z komórkami B7-dodatnimi. Doprowadza się do kontaktu komórki B7-dodatnie ze skuteczną ilością rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 tu opisanych albo ich fragmentów lub pochodnych tak, aby utworzyć rozpuszczalne kompleksy CTLA4/B7. Kompleksy zakłócają oddziaływanie pomiędzy endogennymi cząsteczkami CTLA4 i CD28 z cząsteczkami z rodziny B7.

Rozpuszczane cząsteczki CTLA4 można podawać osobnikowi w ilości i przez czas (np. długość czasu i/lub ilość razy) wystarczający do blokowania u osobnika endogennych cząsteczek B7, uniemożliwiając wiązanie się ich odpowiednich ligandów. Blokowanie wiązania endogennych ligandów/B7 hamuje oddziaływanie między komórkami B7-dodatnimi a komórkami CTLA4- i CD28-dodatnimi.

Dawkowanie czynnika terapeutycznego zależy od wielu czynników, w tym typu dotkniętej tkanki, typu leczonej choroby autoimmunologicznej, ostrości choroby, zdrowia osobnika i odpowiedzi na

PL 212 205 B1 leczenie czynnikami. A zatem dawka czynnika może wahać się w zależności od danego pacjenta i sposobu podawania. Rozpuszczane cząsteczki CTLA4 można podawać osobnikowi w ilości między 0,1 a 20,0 mg/kg masy ciała pacjenta/dzień, dogodnie między 0,5 a 10,0 mg/kg/dzień.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie kompozycji według wynalazku razem z innymi czynnikami farmaceutycznymi do leczenia chorób układu immunologicznego. Przykładowo, choroby reumatyczne można leczyć cząsteczkami tu opisanymi w połączeniu z immunosupresorami, takimi jak kortykosteroidy, cyklosporyna (Mathiesen 1989 Caocer Lett. 44 (2): 151-156), prednizon, azatioprina, metotreksat (R. Handschumacher, w: „Drugs Used for Immunosuppression” strony 1264-1276), blokery lub antagoniści TNFa (New England Journal of Medicine, tom. 340: 253-259,1999; The Lancet tom. 354: 1932-39,1999, Annals of Internal Medicine, tom. 130: 478-486), lub dowolny inny czynnik biologiczny, którego celem jest dowolna cytokina zapalna, niesteroidowe leki przeciwzapalne/inhibitory Cox-2, hydroksychlorokina, sulfasalazopryina, sole złota, etanercept, infliksimab, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, azatiopryna, takrolismus, bazyliksimab, cytoksan, interferon beta-1a, interferon beta-1b, octan glatirameru, chlorowodorek mitoksantronu, anakinra i inne czynniki biologiczne.

W celu regulowania odpowiedzi immunologicznej rozpuszczane cząsteczki CTLA4 (w szczególności L104EA29YIg) można również zastosować w połączeniu z jednym albo większą liczbą następujących czynników: rozpuszczalną gp39 (znaną również jako ligand CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), rozpuszczalną CD29, rozpuszczalną CD40, rozpuszczalną CD80 (np. ATCC 68627), rozpuszczalną CD86, rozpuszczalną CD28 (np. 68628), rozpuszczalną CD56, rozpuszczalną Thy-1, rozpuszczalną CD3, rozpuszczalną TCR, rozpuszczalną VLA-4, rozpuszczalną VCAM-1, rozpuszczalną LECAM-1, rozpuszczalną ELAM-1, rozpuszczalną CD44, przeciwciałami reagującymi z gp39 (np. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 i ATCC HB-12056), przeciwciałami reagującymi z CD40 (np. ATCC HB-9110), przeciwciałami reagującymi z B7 (np. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB11341, itd.), przeciwciałami reagującymi z CD28 (np. ATCC HB-11944 lub mAb 9.3 opisano przez Martin i wsp. (J. Clin. Immun. 4 (1): 18-22,1980), przeciwciałami reagującymi z LFA-1 (np. ATCC HB-9579 i ATCC TIB-213), przeciwciałami reagującymi z LFA- 2, przeciwciałami reagującymi z IL-2, przeciwciałami reagującymi z IL-12, przeciwciałami reagującymi z IFN-gamma, przeciwciałami reagującymi z CD2, przeciwciałami reagującymi z CD48, przeciwciałami reagującymi z dowolną ICAM (np. ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 i ICAM-3), przeciwciałami reagującymi z CTLA4 (np. ATCC HB-304), przeciwciałami reagującymi z Thy-1, przeciwciałami reagującymi z CD56, przeciwciałami reagującymi z CD3, przeciwciałami reagującymi z CD29, przeciwciałami reagującymi z TCR, przeciwciałami reagującymi z VLA-4, przeciwciałami reagującymi z VCAM-1, przeciwciałami reagującymi z LECAM-1, przeciwciałami reagującymi z ELAM-1, przeciwciałami reagującymi z CD44. W pewnych wykonaniach, zalecane są przeciwciała monoklonalne. W innych wykonaniach zalecane są fragmenty przeciwciała. Jak będzie to łatwo zrozumiałe dla specjalisty w tej dziedzinie, kombinacja może zawierać rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane i inny czynnik immunosuppresyjny, rozpuszczalne CTLA4 cząsteczki z dwoma innymi czynnikami immunosuppresyjnymi, rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 z trzema innymi czynnikami immunosuppresyjnymi, itd. Można ustalić optymalną kombinację i dawkę oraz dokonać optymalizacji stosując metody dobrze znane w tej dziedzinie.

Niektóre konkretne kombinacje obejmują co następuje: L104EA29YIg i przeciwciała monoklonalne (mAb) dla CD80; L104EA29YIg i mAb dla CD86L104EA29YIg, mAb dla CD80 i mAb dla CD86; L10EA29YIg i mAb dla gp39; L104EA29YIg i mAb dla CD40; L104EA29YIg i mAb dla CD28; L10EA29YIg, CD80 i mAb dla CD86 oraz mAb dla gp39; L104EA29YIg, CD80 i mAb dla CD86 i mAb dla CD40; oraz L104EA29YIg, mAb anty-LFA1 i mAb anti-gp3 9. Konkretnym przykładem mAb dla gp39 jest MR1. Specjalista w tej dziedzinie łatwo dostrzeże i zrozumie inne kombinacje.

Rozpuszczane cząsteczki CTLA4 tu opisane, na przykład L104EA29YIg, można podawać jako jedyny czynnik aktywny albo razem z innymi lekami immunomodulującymi albo innymi czynnikami przeciwzapalnymi, np. do leczenia albo profilaktyki ostrego lub przewlekłego odrzucania przeszczepów allo- lub ksenogenicznych, albo chorób zapalnych lub autoimmunologicznych albo do indukowania tolerancji. Przykładowo, mogą być one stosowane w połączeniu z inhibitorem kalcyneuryny, np. cyklosporyną A lub FK506; immunosupresyjnym makrolidem, np. rapamycyną lub jej pochodnymi; np. 40-O-(2-hydroksy)etylorapamycyną, czynnikiem zasiedlającym limfocytów, np. FTY720 lub jego analogiem; kortykosteroidami; cyklofosfamidem; azatioprenem; metotreksatem; leflunomidem lub jego analogiem; mizorybiną; kwasem mykofenolowym; mykofenolanem mofetylu; 15-deoksyspergualiną lub jej analogiem; immunosupresyjnymi monoklonalnymi przeciwciałami, np. monoklonalnymi przeciwciałami

PL 212 205 B1 wobec receptorów leukocytów, np. MHC, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB lub ich ligandów; albo innymi związkami immunomodulującymi, np. CTLA4/CD28-Ig lub innymi inhibitorami cząsteczek adhezyjnych, np. mAb lub inhibitorami niskocząsteczkowymi, włączając w to antagonistów LFA-1, antagonistów selektyny i antagonistów VLA-4. Związek jest szczególnie przydatny w połączeniu ze związkiem, który przeszkadza CD40 i jego ligandowi, np. przeciwciałem wobec CD40 i przeciwciałem wobec CD40-L.

W przypadku gdy opisane tu rozpuszczane zmutowane cząsteczki CTLA4 podaje się w połączeniu z inną terapią immunosupresyjną/immunomodulującą lub przeciwzapalną, np. jak wymieniono powyżej, dawkowanie podawanego jednocześnie związku immunosupresyjnego, immunomodulującego lub przeciwzapalnego będzie oczywiście różne w zależności od typu użytego jednocześnie leku, np. czy to będzie steriod czy cyklosporyna, od konkretnego użytego leku, leczonego stanu i tak dalej.

Zgodnie z powyższym w jeszcze jednym aspekcie opisano także sposoby jak zdefiniowano powyżej, obejmujące skojarzone podawanie np. jednoczesne lub po kolei, skutecznej leczniczo ilości rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 tu opisanych, np. CTLA4Ig i/lub L104EA29YIg, w postaci wolnej albo dopuszczalnej farmaceutycznie soli, i drugiego leku, przy czym drugi lek jest lekiem immunosupresyjnym, immunomodulującym lub przeciwzapalnym, np. jak wskazano powyżej. Ponadto opisano tu połączenie farmaceutyczne np. zestaw, np. do zastosowania w dowolnym innym zdefiniowanym powyżej sposobie, zawierający rozpuszczalną cząsteczkę CTLA4 w postaci wolnej lub w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli do użycia jednocześnie lub po kolei z co najmniej jedną kompozycją farmaceutyczną zawierającą lek immunosupresyjny, immunomodulujący lub przeciwzapalny. Zestaw może zawierać instrukcję jego podawania.

Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto sposób wytwarzania rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4 tu opisanych. Ekspresja rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4 może zachodzić w komórkach prokariotycznych lub eukariotycznych.

Organizmy prokariotyczne są najczęściej reprezentowane przez różne szczepy bakteryjne. Bakterie mogą być gram-dodatnie albo gram-ujemne. Zazwyczaj zalecane są bakterie gram-ujemne, takie jak E. coli. Można również użyć innych szczepów bakterii. Sekwencje kodujące rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 można wstawić do wektora zaprojektowanego do ekspresji obcych sekwencji w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli. Wektory te mogą zawierać powszechnie stosowane prokariotyczne sekwencje kontrolne, które są tu zdefiniowane jako obejmujące promotory do inicjacji transkrypcji, ewentualnie z operatorem, razem z sekwencjami miejsca wiązania rybosomów, włączając w powszechnie stosowane promotory, takie jak systemy promotorowe beta-laktamazy (penicylinazy) i laktozy (lac) (Chang, i wsp., (1977) Nature 198: 1056), system promotorowy tryptofanu (trp) (Goeddel, i wsp., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057), promotor PL pochodzący z lambda i miejsce wiązania rybosomu genu N (Shimatake, i wsp., (1981) Nature 292: 128).

Takie wektory ekspresyjne będą również zawierać miejsca inicjacji replikacji i markery selekcyjne, takie jak gen beta laktamazy i fosfotransferazy neomycyny, nadające oporność na antybiotyki, tak, że wektory mogą replikować się w bakteriach i komórki niosące plazmid można selekcjonować, kiedy rosną w obecności antybiotyków, takich jak ampicylina lub kanamycyna.

Plazmidy ekspresyjne można wprowadzać do komórek prokariotycznych przy zastosowaniu rozmaitych standardowych metod, włączając w to między innymi szok CaCl2 (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 oraz Sambrook i wsp. (wyd.), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, wyd. 2 Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)) i elektroporację.

Komórki eukariotyczne są również przydatnymi komórkami gospodarza. Przykłady komórek eukariotycznych obejmują dowolną komórkę zwierzęcą, czy to pierwotną czy unieśmiertelnioną, drożdżową (np. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oraz Pichia pastors) i komórkę roślinną. Komórki szpiczaka, COS i CHO są przykładami komórek zwierzęcych, które można zastosować jako gospodarzy. Konkretne komórki CHO obejmują między innymi DG44 (Chasin, i wsp., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909), CHO- K1 (nr ATCC CCL-61), linię komórek CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO oznaczone jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), klon 13 CHO (GEIMG, Genova, IT), klon B CHO (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF oznaczone ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) oraz RR-CHOK1 oznaczone ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Przykładowe komórki roślinne obejmują tytoń (całe rośliny, hodowlę komórkową lub kalus), komórki kukurydzy, soi i ryżu. Dopuszczalne są również nasiona kukurydzy, soi i ryżu.

PL 212 205 B1

Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące zmutowane cząsteczki CTLA4 można również wstawić do wektora zaprojektowanego do ekspresji obcych sekwencji w gospodarzu eukariotycznym. Elementy regulacyjne wektora mogą różnić się w zależności do konkretnego gospodarza eukariotycznego.

Powszechnie stosowane sekwencje kontrolne do zastosowania w wektorach ekspresyjnych obejmują promotory i sekwencje kontrolne zgodne z komórkami ssaczymi, takie jak na przykład promotor CMV (wektor CDM8) i ptasi wirus mięsaka (ASV) (wektor TdLN). Inne powszechnie stosowane promotory obejmują wczesne i późne promotory z małpiego wirusa 40 (SV40) (Fiers, i wsp., (1973) Nature 273: 113), lub inne promotory wirusowe, takie jak pochodzące z polyoma, adenowirusa 2 i bydlęcego wirusa brodawczaka. Można również użyć promotorów indukowalnych, takich jak, hMTII (Karin, i wsp., (1982) Nature 299: 797-802).

Wektory do ekspresji zmutowanych cząsteczek CTLA4 w organizmach eukariotycznych mogą również zawierać sekwencje zwane regionami wzmacniaczy. Są one ważne do optymalizacji ekspresji genów i znajdują się bądź przed bądź za regionem promotorowym.

Przykłady wektorów ekspresyjnych dla komórek eukariotycznych obejmują między innymi wektory dla ssaczych komórek gospodarzy (np. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); wektory pVPakc, wektory pCMV, wektory pSG5 (Stratagene)), wektory retrowirusowe (np. wektory pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) lub ich zmodyfikowane postaci, wektory adenowirusowe; wektory związane z adenovirusami, wektory bakulowirusowe, wektory drożdżowe (np. wektory pESC (Stratagene)).

Sekwencje kwasu nukleinowego kodujące zmutowane cząsteczki CTLA4 mogą włączać się do genomu eukariotycznej komórki gospodarza i replikować wraz z replikacją genomu gospodarza. Alternatywnie, wektor niosący zmutowane cząsteczki CTLA4 może zawierać miejsce inicjacji replikacji umożliwiające replikację pozachromosomową.

Do ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego w Saccharomyces cerevisiae można zastosować miejsce inicjacji replikacji z endogennego plazmidu drożdżowego, kółka 2μ. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). Alternatywnie, można zastosować sekwencje z drożdży zdolne do promowania autonomicznej replikacji (patrz, na przykład, Stinchcomb i wsp., (1979) Nature 282: 39); Tschemper i wsp., (1980) Gene 10: 157 oraz Ciarke i wsp., (1983) Meth. Enz. 101: 300).

Transkrypcyjne sekwencje kontrolne dla wektorów drożdżowych obejmują promotory do syntezy enzymów glikolitycznych (Hess i wsp., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland. i wsp., (1978) Biochemist 17: 4900). Dodatkowe promotory znane w tej dziedzinie obejmują promotor CMV dostarczony w wektorze CDM8 (Toyama i Okayama, (1990) FEBS 268: 217-221); promotor kinazy 3-fosfoglicerynowej (Hitzeman i wsp., (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073) oraz te dla innych enzymów glikolitycznych.

Inne promotory są indukowalne, ponieważ mogą być regulowane przez bodźce środowiskowe albo poprzez pożywkę do hodowli komórek. Promotory indukowalne obejmują te z genów dla białek szoku cieplnego, dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochromu C, kwaśnej fosfatazy, enzymów związanych z katabolizmem azotu i enzymów odpowiedzialnych za wykorzystanie maltozy i galaktozy.

Sekwencje regulacyjne mogą być również umieszczone na końcu 3' sekwencji kodujących. Sekwencje te mogą stabilizować informacyjny RNA. Takie terminatory znajdują się w nieulegającym translacji regionie 3' za sekwencjami kodującymi w kilku genach pochodzących z drożdży i genach ssaczych.

Przykładowe wektory dla roślin i komórek roślinnych obejmują między innymi plazmidy Ti Agrobacterium, wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) i wirusa złotej mozaiki pomidorów (TGMV).

Ogólne aspekty układu transformacji ssaczych komórek gospodarza zostały opisane przez Axel (patent USA nr 4399216 wydany 16 sierpnia 1983). Komórki ssacze można transformować metodami obejmującymi, między innymi, transfekcję w obecności fosforanu wapniowego, mikrowstrzyknięcia, elektroporację albo poprzez transdukcję wektorami wirusowymi.

Sposoby wprowadzania sekwencji DNA do genomów roślin i drożdży obejmują (1) metody mechaniczne, takie jak mikrowstrzyknięcie DNA do pojedynczej komórki albo protoplastów, wytrząsanie komórek na worteksie z kuleczkami szklanymi w obecności DNA lub strzelanie do komórek kulkami wolframu albo złota opłaszczonymi DNA; (2) wprowadzanie DNA poprzez uczynienie błon komórkowych przepuszczalnymi dla makrocząsteczek poprzez traktowanie glikolem polietylenowym albo poddanie pulsom elektrycznym o wysokim napięciu (elektroporacja); albo (3) użycie liposomów (zawierających cDNA), które łączą się z błonami komórkowymi.

PL 212 205 B1

Po ekspresji zmutowanych cząsteczek CTLA4 tu opisanych, można je zebrać sposobami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak liza komórek (np. sonikacja, lizozym i/lub detergenty) i przeprowadzić odzyskiwanie białka przy użyciu standardowych sposobów oczyszczania białka, np. chromatografii powinowactwa lub jonowymiennej, aby uzyskać zasadniczo czysty produkt (R. Scopes w: „Protein

Purification, Principles and Practice”, Wydanie trzecie, Springer-Verlag (1994); Sambrook i wsp.

(wyd.), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Wydanie 2, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Ekspresję zmutowanych cząsteczek CTLA4 można wykryć sposobami znanymi w tej dziedzinie. Przykładowo, zmutowane cząsteczki CTLA4 można wykryć poprzez barwienie Coomassie żeli SDS-PAGE i reakcję immunologiczną na filtrach przy użyciu przeciwciał, które wiążą się z CTLA4.

Następujące przykłady są przedstawione dla zilustrowania niniejszego wynalazku i ułatwienia specjaliście w tej dziedzinie jego wykonywaniu i stosowania. Przykłady nie mają w żaden sposób ograniczać zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Poniżej przedstawiono opis metod zastosowanych do wytwarzania sekwencji nukleotydowych kodujących cząsteczki CTLA4 tu opisane.

W pierwszej kolejności skonstruowano plazmid kodujący CTLA4Ig i wykazano jego zdolność do ekspresji cząsteczek CTLA4Ig, jak opisano w patentach USA nr 5434131, 5885579 oraz 5851795. Następnie, wykorzystując sekwencję kodującą CTLA4Ig uzyskano cząsteczki zmutowane w pojedynczym miejscu (np. L104EIg), poddano je ekspresji i sprawdzono pod względem kinetyki wiązania z różnorodnymi cząsteczkami B7. Sekwencję nukleotydową L104EIg (którą przedstawiono w sekwencji przedstawionej na Fig. 18) wykorzystano jako matrycę do wytworzenia sekwencji CTLA4 posiadających mutację w dwóch miejscach (jak to zostało zawarte w sekwencjach przedstawionych na Fig. 19-22), w wyniku ekspresji których otrzymano białka i które badano pod względem kinetyki wiązania. Do zmutowanych w dwóch miejscach sekwencji CTLA4 zaliczają się: L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg oraz L104EA29WIg. Uzyskano także sekwencje posiadające trzy miejsca mutacji.

Konstruowanie CTLA4Ig

Skonstruowano genetyczny konstrukt kodujący CTLA4Ig zawierający zewnątrzkomórkową domenę białka CTLA4 oraz domenę IgC gamma1 w sposób opisany w patentach USA nr 5434131, 5844095 oraz 5851795. Zewnątrzkomórkową domenę genu kodującego CTLA4 sklonowano za pomocą metody PCR przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów odpowiadających opublikowanej sekwencji (Dariavach i wsp., Eur. Journ. Immunol. 18:1901-1905 (1998)).

Ponieważ w genie CTLA4 nie wykryto peptydu sygnałowego dla CTLA4, koniec N przewidywanej sekwencji CTLA4 połączono w dwuetapowym procesie z peptydem sygnałowym onkostatyny M (Malik i wsp., Mol. And Cell. Biol. 9:2847 (1989)) za pomocą zachodzących na siebie oligonukleotydów. W pierwszym etapie, oligonukleotyd o sekwencji:

CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC (SEK NR ID: 1) (kodujący 15 C-końcowych aminokwasów pochodzących z peptydu sygnałowego onkostatyny M połączonych z 7 N-końcowymi aminokwasami białka CTLA4) zastosowano jako lewy starter (ang. forward), zaś jako starter prawy (ang. reverse) użyty został oligonukleotyd o sekwencji TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEK NR ID: 2) (kodujący reszty aminokwasowe 119-125 sekwencji aminokwasowej receptora dla CTLA4 oraz zawierający miejsce trawienia enzymu restrykcyjnego Bel I). Matrycę w tym etapie stanowił cDNA zsyntetyzowany z 1 pg całkowitego RNA pochodzącego z komórek H38 (linia białaczkowych limfocytów T zainfekowana wirusem HTLV II, otrzymana od dr Salahudin oraz dr Gallo, NCI, Bethesda, MD). Część produktu PCR otrzymanego w pierwszym etapie została ponownie poddana amplifikacji przy użyciu zachodzącego lewego startera o sekwencji

CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC (SEK NR ID: 3) kodującego N-końcową część peptydu sygnałowego onkostatyny M i zawierającego miejsce trawienia endonukleazy restrykcyjnej HindIII oraz tego samego prawego startera. Produkt reakcji PCR poddano trawieniu enzymem HindIII oraz Bell i ligacji z fragmentem cDNA uzyskanym w wyniku trawienia enzymami BClI/XbaI, kodującym sekwencje aminokwasowe odpowiadające zawiasowym regionom CH2 i CH3 dla IgC(gamma)1, do wektora ekspresyjnego trawionego enzymami HindIII/XbaI o nazwie CDM8 oraz wektora ekspresyjnego piLN (znanego także jako HN) trawionego enzymami HindIII/XbaI.

PL 212 205 B1

DNA kodujący sekwencję aminokwasową odpowiadającą CTLA4Ig zdeponowano w ATCC zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim 31 Maja 1991 r. i opatrzono numerem dostępu ATCC 68629.

Mutageneza kodonowa w cząsteczce CTLA4Ig:

Opracowano strategię mutagenezy i przeszukiwania do identyfikacji zmutowanych cząsteczek CTLA4Ig, które mają niższą szybkość dysocjacji („off”) niż cząsteczki CD80 i/lub CD86 tj. zwiększoną zdolność wiązania. W tym wykonaniu, mutacje zostały wprowadzone w miejsce i/lub okolicę reszt aminokwasowych regionów CDR-1, CDR-2 (znanych także jako łańcuch C') i/lub regiony CDR-3 zewnątrzkomórkowej domeny białka CTLA4 (jak to zostało opisane w patentach USA 6090914, 5773253 oraz 5844095; w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA nr seryjny 60/214,065; oraz przez Peach, R.J. i wsp., J Exp. Med. 1994 180:2049-2058. Regiony CDR-podobne obejmują każdy region CDR i rozciągają się na odcinku kilku aminokwasów poniżej i/lub powyżej motywu CDR). Miejsca te wybrano na podstawie badań nad chimerowymi białkami fuzyjnymi CD28/CTLA4 (Peach i wsp., J. Exp. Med., 1994, 180:2049- 2058) oraz modelu, dzięki któremu można przewidywać, która reszta aminokwasowa z łańcuchów bocznych będzie wystawiona na działanie rozpuszczalnika, brano także pod uwagę brak identyczności lub homologii pomiędzy resztami aminokwasowymi w danych miejscach pomiędzy CD28 i CTLA4. Brana jest także pod uwagę każda reszta aminokwasowa znajdująca się przestrzennie w dużej bliskości (5 do 20 jednostek Angstroma) względem zidentyfikowanych reszt aminokwasowych.

W celu wytworzenia i poszukiwania rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4 ze zmienionym powinowactwem dla cząsteczki B7 (np. CD80, CD86) posłużono się strategią procesu dwuetapowego. Doświadczenia obejmowały w pierwszej kolejności wytworzenie biblioteki mutacji w specyficznym kodonie zewnątrzkomórkowej domeny CTLA4, a następnie przeszukiwanie jej za pomocą analizy BIAcore celem identyfikacji mutantów o zmienionej reaktywności względem B7. Układ analizy BIAcore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) oparty jest na zastosowaniu systemu wykrywania powierzchniowego rezonansu plazmonowego, który zasadniczo wykorzystuje kowalencyjne wiązanie cząsteczki CD80Ig bądź CD86Ig do czujnika mikroprocesorowego opłaszczonego dekstranem umieszczonego w detektorze. Poddana testowi cząsteczka może zatem zostać wstrzyknięta do komory zawierającej czujnik mikroprocesorowy, a oznaczeniu podlega ilość komplementarnego, wiążącego się białka, dzięki zmianie jego masy cząsteczkowej, jako że jest ono fizycznie połączone z opłaszczoną dekstranem stroną czujnika mikroprocesorowego; zmiana masy cząsteczkowej może zostać zmierzona za pomocą systemu detekcji.

Konkretnie, wytworzono sekwencje posiadające mutację w jednym miejscu, wykorzystując jako matrycę niezmutowany DNA (np. DNA typu dzikiego) kodujący CTLA4Ig (patenty USA nr 5434131, 5844095; 5851795 oraz 5885796; nr dostępu ATCC 68629). Do celów losowej mutagenezy określonego kodonu zaprojektowano mutagenne startery oligonukleotydowe do PCR poprzez umożliwienie przyłączania się dowolnej zasady w pozycjach 1 oraz 2 kodonu, lecz wyłącznie guaniny lub tyminy w pozycji 3 (XXG/T również określane jako NNG/T). W ten sposób określony kodon kodujący dany aminokwas może zostać poddany losowej mutacji, w wyniku czego kodować może każdy spośród 20 aminokwasów. Z tego względu mutageneza XXG/T dostarcza 32 potencjalne kodony kodujące każdy spośród 20 aminokwasów. Produkty PCR kodujące mutacje znajdujące się w dużej bliskości pętli CDR3-podobnej cząsteczki CTLA4Ig (MYPPPY) strawiono za pomocą enzymów SacI/Xbal, po czym subklonowano do podobnie pociętego wektora ekspresyjnego rLN dla CTLA4Ig (jak przedstawiono na Fig. 24). Metodę tę zastosowano do wytworzenia cząsteczki CTLA4 posiadającej pojedynczą mutację - L104EIg (jak przedstawiono na Fig. 18).

Celem przeprowadzenia mutagenezy w pobliżu pętli CDR-1-podobnej cząsteczki CTLA4Ig, najpierw, metodą mutagenezy kierowanej przez startery PCR, wprowadzono milczące miejsce restrykcyjne NheI w położeniu 5' względem tej pętli. Produkty PCR strawiono za pomocą enzymów Nhel/Xbal i subklonowano do podobnie trawionego ekspresyjnego wektora CTLA4Ig albo L104EIg. Sposób ten zastosowano do wytworzenia cząsteczki CTLA4 zmutowanej w dwóch miejscach - L104EA29YIg (jak przedstawiono na Fig. 19). Konkretnie, celem uzyskania cząsteczki CTLA4 zmutowanej w dwóch miejscach, L10L104EA29YIg, jako matrycy użyto cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej cząsteczkę CTLA4 zmutowaną w pojedynczym miejscu - L104EIg.

Sekwencje nukleotydowe posiadające mutacje w dwóch miejscach kodujące zmutowane cząsteczki CTLA4, takie jak L104EA29YIg (zdeponowana 19 czerwca 2000 r. w American Type Culture

Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassa, VA 20110-2209 pod numerem dostępu ATCC,

PTA-2104), wytworzono poprzez powtarzanie opisanej powyżej procedury mutagenezy za pomocą

PL 212 205 B1

L104EIg jako matrycy. Metoda ta została zastosowana do wytworzenia licznych podwójnie zmutowanych sekwencji nukleotydowych, takich jak sekwencje kodujące zmutowane cząsteczki CTLA4: L104EA29YIg (jak to zostało zawarte w sekwencji przedstawionej na Fig. 20), L104EA29TIg (jak to zawarto w sekwencji przedstawionej na Fig. 21) oraz L104EA29WIg (jak to zawarto w sekwencji przedstawionej na Fig. 22). Uzyskano także potrójne mutanty, takie jak kodujące L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg oraz L104EA29YS25RIg.

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 poddano ekspresji z sekwencji nukleotydowych i wykorzystano w II fazie badań klinicznych opisanych w Przykładzie 3, poniżej.

Dla wszystkich specjalistów w tej dziedzinie zrozumiałym będzie, że replikacja sekwencji kwasów nukleinowych, szczególnie za pomocą amplifikacji PCR z łatwością wprowadza podstawowe zmiany do nici DNA. Jednakże zmiany nukleotydowe niekoniecznie przekładają się na zmiany aminokwasowe ponieważ niektóre kodony nadmiarowo kodują taki sam aminokwas. Jakiekolwiek zmiany nukleotydu w sekwencji pierwotnej lub typu dzikiego, ciche (tj. niepowodujące zmiany w kodowanym aminokwasie) lub inne, pomimo, że nie są wyraźnie tutaj opisane, mieszczą się w zakresie wynalazku.

P r z y k ł a d 2

Następujący przykład dostarcza opisu metod przeszukiwania wykorzystanych w celu identyfikacji polipeptydów CTLA zmutowanych w jednym i w dwóch miejscach, wyrażanych z konstruktów opisanych w Przykładzie 1, które wykazują wyższe powinowactwo wiązania się z cząsteczkami B7 w porównaniu do niezmutowanych cząsteczek CTLA4Ig.

Aktualne badania in vitro oraz in vivo wskazują, że CTLA4Ig jest samo z siebie niezdolne do całkowitego blokowania wzbudzania specyficznych wobec antygenu aktywowanych komórek T. Badania in vitro z udziałem CTLA4Ig oraz przeciwciała monoklonalnego swoistego względem CD80 lub CD86, mierzące hamowanie proliferacji komórek T wskazują, że przeciwciało monoklonalne antyCD80 nie zwiększa hamowania CTLA4Ig. Jednakże, przeciwciało monoklonalne anty-CD86 zwiększa hamowanie, co wskazuje, że CTLA4Ig nie było tak skuteczne w blokowaniu oddziaływań CD86. Dane te potwierdzają wcześniejsze wyniki badań uzyskane przez Linsley'a i wsp. (Immunity, (1994), 1:793 - 801) wskazujące, że hamowanie odpowiedzi komórkowych, w których pośredniczy CD80, wymaga około 100-krotnie niższych stężeń CTLA4Ig niż w przypadku odpowiedzi, w których pośredniczy CD86. Na podstawie tych wyników wysunięto wniosek, że rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 posiadające wyższą zachłanność wiązania względem CD86 niż CTLA typu dzikiego, powinny być lepiej przystosowane do blokowania wzbudzania specyficznych wobec antygenu aktywowanych komórek niż CTLA4Ig.

W tym celu, rozpuszczalne zmutowane cząsteczki CTLA4 opisane w Przykładzie 1 powyżej przeszukiwano za pomocą nowej procedury w celu identyfikacji kilku mutacji w zewnątrzkomórkowej domenie CTLA4, które zwiększają powinowactwo wiązania się z CD80 i CD86. Ta strategia przeszukiwania zapewnia skuteczną metodę bezpośredniego identyfikowania mutantów z widocznie niższą szybkością dysocjacji („off”) bez konieczności oczyszczania białka lub ilościowego określania jako, że określenie szybkości „off” jest niezależne od stężenia (O'Shannessey i wsp., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

Komórki COS transfekowano poszczególnymi preparatami oczyszczonego DNA plazmidowego i namnażano przez kilka dni. Trzydniowe kondycjonowane pożywki hodowlane nakładano na mikroprocesory (chipy) biosensorowe BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) pokryte rozpuszczalnymi CD80Ig lub CD86Ig. Za pomocą metody powierzchniowego rezonansu plazmonowego (O'Shannessy, D.J., i wsp., 1997 Anal. Biochem. 212:457-468) mierzono specyficzne wiązanie i dysocjację zmutowanych białek. Wszystkie doświadczenia przeprowadzano na biosensorach BIAcore™ lub BIAcore™ 2000 w 25°C. Ligandy unieruchamiano na podłożu badawczym mikroprocesorów sensorowych NCM5 (Pharmacia) za pomocą standardowego sprzęgania N-etylo-N'-(dimetylaminopropylo)karbodiimido-N-hydroksysukcynoimidem (Johnsson, B., i wsp. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277; Khilko, S.N., i wsp. (1993) J. Biol. Chem. 268:5425-15434).

Metoda przeszukiwania

Komórki COS hodowane w 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych były przejściowo transfekowane zmutowanym CTLA4Ig. Pożywki hodowlane zawierające wydzielane rozpuszczalne CTLA4Ig zbierano 3 dni później.

Kondycjonowane pożywki z hodowli komórek COS przepuszczano przez biosensory na chipach BIAcore opłaszczone CD86Ig i CD80Ig (jak opisano w Greene i wsp., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762 -26771), a cząsteczki zmutowane identyfikowano jako te posiadające wolniejsze tempo dysocjacji niż

PL 212 205 B1 obserwowane dla CTLA4Ig typu dzikiego. Cząsteczki DNA odpowiadające wyselekcjonowanym próbkom pożywek sekwencjonowano, po czym przygotowywano więcej DNA celem przeprowadzenia przejściowej transfekcji komórek COS na większą skalę, z których otrzymano zmutowane białko CTLA4Ig po uprzednim oczyszczeniu z pożywek hodowlanych za pomocą białka A.

Warunki analizy BIAcore i analizy danych dotyczących równowagi wiązania przeprowadzono jak opisano w J. Greene i wsp., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 oraz w zgłoszeniach patentowych USA numery seryjne 09/579927, a także 60/214065, które włączono tu jako odniesienie.

Analiza danych uzyskanych z BIAcore

Przed rozpoczęciem analiz linie podstawowe sensogramu zostały znormalizowane do wartości zero jednostek odpowiedzi (RU, ang. response units). Próbki przepuszczono przez komory przepływowe stanowiące ślepą próbę celem określenia wartości RU dla tła z uwagi na duże różnice współczynnika załamania pomiędzy roztworami. Stałe równowagi dysocjacji (Kd) wyliczono z wykresów Req względem C, gdzie Req stanowi odpowiedź w stanie równowagi minus odpowiedź uzyskana dla ślepej próby, a C jest stężeniem molowym badanego czynnika. Krzywe wiązania analizowano za pomocą komercyjnego oprogramowania dopasowującego krzywe nieliniowe (Prism, GraphPAD Sowtware).

Dane doświadczalne początkowo dopasowywano do modelu dla pojedynczego ligandu łączącego się z pojedynczym receptorem (model pojedynczego miejsca, tj. prosty układ Langmuira A+B> >AB), a stałe równowagowi dysocjacji (K_d=[A]-[B]\[AB]) obliczono na podstawie równania R=R_max-C/ (Kd+C). Następnie, dane dopasowano do najprostszego modelu dwu-miejscowego wiązania się ligandu (tj. do receptora posiadającego dwa nie wykazujące oddziaływania ze sobą niezależne miejsca przyłączania, jak to opisano za pomocą równania R=R_max1-C\(K_d1+C) + R_max2-C\(K_d2+C).

Dokładność dopasowania tych dwóch modeli analizowano wizualnie poprzez porównanie z danymi doświadczalnymi oraz statystycznie za pomocą testu F sumy kwadratów. Prostszy model jednomiejscowy został wybrany jako najlepiej pasujący, chyba, że model dwu-miejscowy pasował znacząco lepiej (p<0,1).

Analizy asocjacji i dysocjacji przeprowadzano za pomocą oprogramowania do szacowania BIA 2.1 (Pharmacia). Stałą szybkości asocjacji kon obliczano dwoma sposobami, zakładając w obu przypadkach homogenne oddziaływania pomiędzy pojedynczymi miejscami i równoległe oddziaływania między dwoma miejscami. W przypadku oddziaływań między pojedynczym miejscem wartości kon obliczano według równania Rt=Req(1-exp^-ks(t-t0), gdzie RT jest odpowiedzią w danym czasie, t; Req jest odpowiedzią w stanie równowagi; t0 jest czasem na początku wstrzyknięcia; oraz ks=dR/dt+kon-Ckoff, gdzie C stanowi stężenie badanego czynnika, obliczone w przeliczeniu na monomerowe miejsca wiązania. W przypadku oddziaływań między dwoma miejscami wartości kon obliczano według równania Rt=Req1 (1-exp^-ks(t-t0)+Req2 (1-exp^{ks2 <t-t0}). Dla każdego modelu wartości k_on ustalano z obliczonego nachylenia (do około 70% maksymalnej asocjacji) wykresów ks w funkcji C.

Dane dysocjacyjne analizowano względem modeli pojedynczego miejsca (AB=A+B) lub dwóch miejsc (AiBj =Ai+Bj ), a stałe szybkości (koff) obliczano na podstawie najlepiej dopasowanych krzywych. Stosowano model wiązania jednego miejsca za wyjątkiem sytuacji, kiedy pozostałości były większe niż tło urządzenia (2-10 RU, zgodnie z urządzeniem), w którym to przypadku stosowano model wiązania dwóch miejsc. Czas połowicznego zajęcia receptora obliczano za pomocą zależności ^t1/2^{=0, 693/k}off^.

Cytometria przepływowa:

Mysie mAb L307.4 (anty-CD80) nabyto w Becton Dickinson (San Jose, California), a IT2.2 (anty-B7-0 [znane także jako CD86]) z Pharmingen (San Diego, California). W celu barwienia immunologicznego, komórki CHO CD80-dodatnie i/lub CD86-dodatnie, pobierano z odpowiednich naczyń hodowlanych za pomocą inkubacji w fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (PBS) zawierającym ₅ mM EDTA. Komórki CHO (1-10 x 10⁵) inkubowano początkowo z mAb lub białkami fuzyjnymi immunoglobulin w DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), następnie płukano i inkubowano ze związanymi z izotiocjanianem fluoresceiny kozimi anty-mysimi lub anty-ludzkimi immunoglobulinowymi odczynnikami drugorzędowymi (Tago, Burlingame, California). Komórki poddawano końcowemu płukaniu i analizowano na FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE oraz sączenie molekularne.

SDS-PAGE przeprowadzano w 4-20% żelu akryloamidowym Tris/glicyna (Novex, San Diego,

CA). Żele analityczne barwiono Coomassie Blue, a zdjęcia mokrych żeli otrzymywano za pomocą skanowania. CTLA4Ig (25 pg) oraz L104EA29YIg (25 pg) analizowano za pomocą sączenia molekularnego z wykorzystaniem kolumny TSK-GEL G300 SWXL (7,8 x 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA)

PL 212 205 B1 równoważonej solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającym 0,02% NAN3 przy szybkości przepływu 1,0 ml/min.

CTLA4XC120S oraz L104EA29Y.

Pojedynczy łańcuch CTLA4XC120S otrzymano w sposób uprzednio opisany (Linsley i wsp., (1995) J. Biol. Chem. 270:15417-15424). W skrócie, jako matrycę zastosowano plazmid ekspresyjny dla onkostatyny M CTLA4 (OMCTLA4), wybrano lewy starter

GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG (SEK NR ID: 4) w celu dopasowania do sekwencji w wektorze, a prawy starter

GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC (SEK NR ID: 5) odpowiadał siedmiu końcowym aminokwasom (tj. aminokwasom 118-124 w zewnątrzkomórkowej domenie CTLA4 i zawierał miejsce dla enzymu restrykcyjnego oraz kodon stop TGA). Prawy starter wprowadzał mutację C120S (zamiana cysteiny na serynę w pozycji 120). Konkretnie, sekwencja nukleotydowa GCA (nukleotydy od 34 do 36) przedstawionego powyżej prawego startera została zastąpiona przez jedną spośród następujących sekwencji nukleotydowych: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT lub GCT. Dla specjalistów tej dziedzinie oczywiste będzie, że nukleotydowa sekwencja GCA jest odwrotnie komplementarna względem kodonu TGC kodującego cysteinę. Podobnie, sekwencje nukleotydowe AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, bądź GCT są odwrotnie komplementarne względem kodonów kodujących serynę. Produkty łańcuchowej reakcji polimerazy strawiono enzymami HindIII/XbaI i subklonowano bezpośrednio do ekspresyjnego wektora ^LN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXC120S otrzymano w identyczny sposób. Każdy konstrukt sprawdzano za pomocą sekwencjonowania DNA.

Identyfikacja i charakterystyka biochemiczna mutantów o wysokiej zachłanności wiązania

Do celów mutagenezy wybrano dwadzieścia cztery aminokwasy, a otrzymane ok. 2300 zmutowanych białek poddano testom na wiązanie CD86Ig metodą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR; jak opisano powyżej). Główne efekty mutagenezy w każdym z miejsc zostały zebrane w Tabeli II, poniżej. Losowa mutageneza niektórych aminokwasów w regionie CDR-1 (S25-R33) nie zmieniła w sposób widoczny wiązania ligandu. Mutageneza E31 i R33 oraz reszt M97-Y102 w sposób widoczny spowodowała obniżone wiązanie ligandu. Mutageneza reszt S25, A29 oraz T30, K93, L96, Y103, L104 i G105 spowodowała powstanie białek cechujących się powolną szybkością przyłączania się i/lub odłączania od ligandu (szybkości „on” i „off”). Wyniki te stanowią potwierdzenie poprzednich wyników świadczących o tym, że reszty aminokwasowe w regionie CDR-1 (S25-R33) oraz reszty w obszarze M97-Y102 bądź w jego pobliżu mają wpływ na wiązanie ligandu (Peach i wsp., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).

Mutageneza pozycji S25, T30, K93, L96, Y103 oraz G105 doprowadziła do identyfikacji niektórych zmutowanych białek cechujących się wolniejszą szybkością odłączania się (szybkość „off”) niż CD86Ig. Jednakże w takim wypadku, powolna szybkość odłączania zrównoważona była przez powolną szybkość przyłączania, a zatem powstałe zmutowane białka wykazywały całkowite powinowactwo względem CD86Ig najwyraźniej podobne do obserwowanego w przypadku CTLA4Ig. Dodatkowo, mutageneza K93 dawała w wyniku silną agregację, która mogła leżeć u podstaw obserwowanych zmian kinetyki.

Metodą losowej mutagenezy L104, a następnie transfekacji komórek COS i przeszukiwania za pomocą SPR próbek pożywek hodowlanych w obecności unieruchomionych CD86Ig, uzyskano sześć próbek pożywek zawierających zmutowane białka z około 2-krotnie wolniejszą szybkością odłączania od ligandu niż u CTLA4Ig typu dzikiego. Po zsekwencjonowaniu odpowiadającego tym mutantom cDNA, okazało się, że każde koduje mutację polegającą na zamianie leucyny na kwas glutaminowy (L104E). Zamiana leucyny 104 na kwas asparaginowy (L104D) nie miała najwyraźniej wpływu na wiązanie CD86Ig.

Mutagenezę powtórzono następnie w każdym miejscu, zamieszczonym w Tabeli II, tym razem matrycę do PCR stanowiło L104E, a nie CTLA4Ig typu dzikiego, jak to opisano powyżej. Za pomocą analizy SPR, ponownie z użyciem unieruchomionych CD86Ig, zidentyfikowano sześć próbek pożywek hodowlanych pochodzących z mutagenezy pozycji alaniny 29, które zawierały białka o około 4-krotnie wolniejszej szybkości odłączania (szybkość „off”) niż CTLA4Ig typu dzikiego. Dwa najwolniejsze miały podstawienia tyrozynowe (L104EA29Y), dwa leucynowe (L104EA29L), jedno tryptofanowe (L104EA29W) i jedno treoninowe (L104EA29T). Nie zidentyfikowano natomiast mutantów ze spowolnioną szybkością odłączania (szybkość „off”) w przypadku, gdy losowej mutacji alaniny 29 dokonywano w samym CTLA4Ig typu dzikiego.

PL 212 205 B1

Względna masa cząsteczkowa i stan agregacji oczyszczonego L104E oraz L104EA29YIg oznaczano za pomocą SDS-PAGE oraz sączenia molekularnego. L104EA29YIg (~1 ąg; ścieżka 3) oraz L104EIg (~1 ąg; ścieżka 2) najwyraźniej posiadały taką samą ruchliwość elektroforetyczną jak CTLA4Ig (~1 ąg; ścieżka 1) zarówno warunkach redukujących (~50 kDa; +3ME; plus 2-merkaptoetanol), jak i nieredukujących (~100 kDa; -3ME) (Fig. 25A). Sączenie molekularne wykazało, że L104EA29YIg (Fig. 25C) posiada taką samą ruchliwość jak dimerowy CTLA4Ig (Fig. 25B). Główne piki odpowiadają dimerowi białkowemu, podczas gdy szybko wymywany mniejszy pik na Fig. 25B odpowiada agregatom o większej masie cząsteczkowej. Około 5,0% CTLA4Ig występowało w postaci agregatów o wyższej masie cząsteczkowej, nie było jednak dowodów na agregację L104EAYIg lub L104EIg. Zatem silniejsze łączenie się z CD86Ig widoczne w przypadku L104EIg oraz L104EA29YIg nie mogło być związane z agregacją wywołaną przez mutagezezę.

Analiza równowagi i kinetyki wiązania

Analizę równowagi oraz kinetyki wiązania przeprowadzono na oczyszczonym za pomocą białka A CTLA4Ig, L104EIg oraz L104EA29YIg przy zastosowaniu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Wyniki przedstawiono w Tabeli I, poniżej. Zaobserwowane stałe dysocjacji równowagowej (Kd; Tabela I) obliczono na podstawie krzywych wiązania uzyskanych w wyniku stosowania przedziału stężeń (5,0-200 nM). L104EA29YIg wiąże się mocniej do CD80 niż L104EIg lub CTLA4Ig. Niższa wartość Kd dla L104EA29YIg (3,21 nM) niż dla L104EIg (6,06 nM) czy CTLA4Ig (13,9 nM) wskazuje na wyższą zachłanność wiązania L104EA29YIg do CD86Ig. Niższa wartość Kd dla L104EA29YIg (3,66 nM) niż L104EIg (4,47 nM) czy CTLA4Ig (6,51 nM) wskazuje na wyższą zachłanność wiązania L104EA29YIg do CD80Ig.

Analiza kinetyki wiązania wykazała, że względne wartości szybkości przyłączania („on) dla CTLA4Ig, L104EIg oraz L104EA29YIg wiążących się do CD80 były podobne, tak samo jak w przypadku szybkości przyłączania dla CD86lg (Tabela I). Jednakże, szybkości odłączania dla tych cząsteczek nie były takie same (Tabela I). W porównaniu z CTLA4Ig, L104EA29YIg miało około 2-krotnie niższą szybkość odłączania się od CD80 i około 4-krotnie niższą szybkość odłączania się od CD86Ig. Szybkości odłączania dla L104E były pośrednie pomiędzy wartościami uzyskanymi dla L104EA29YIg i CTLA4Ig. Ponieważ wprowadzenie tych mutacji nie wpłynęło znacząco na szybkość przyłączania, wzrost powinowactwa względem CD80Ig i CD86Ig obserwowany w przypadku L104EA29YIg wynikał prawdopodobnie z obniżenia wartości szybkości odłączania.

Aby ustalić czy wzrost zachłanności wiązania L104EA29YIg z CD86Ig i CD80Ig wynikał z mutacji wpływających na sposób w jaki monomery łączyły się w dimer, czy też obecne były wprowadzone do każdego monomeru zmiany strukturalne wzmacniające zachłanność, przygotowano zbudowane z pojedynczego łańcucha konstrukty domen zewnątrzkomórkowych CTLA4Ig i L104EA29Y, po uprzednim przeprowadzeniu mutagenezy cysteiny 120 do seryny, jak to opisano powyżej oraz przez Linsley i wsp., (1995) J. Biol. Chem. 270:15417-15424 (84). Chromatografia sączenia molekularnego wykazała, że oczyszczone białka CTLA4XC120S oraz L104EA29YXC120S są monomerami (Linsley i wsp., (1995), powyżej), zanim jeszcze ich właściwości wiązania ligandu zostały przeanalizowane za pomocą SPR. Wyniki pokazały, że zachłanność wiązania obu monomerowych białek do CD86lg była około 35-80 razy mniejsza niż dla odpowiadających im dimerów (Tabela I). Zgadza się to z wcześniej opublikowanymi danymi, gdzie ustalono, że dimeryzacja CTLA4 wymagana była do uzyskania wysokiej zachłanności wiązania ligandu (Green i wsp., (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).

L104EA29YXC120S wiązało się z około 2-krotnie wyższą zachłannością niż CTLA4C120S zarówno do CD80Ig, jak i CD86lg. To zwiększone powinowactwo wynikało z około 3-krotnie niższej szybkości dysocjacji od obu ligandów. Zatem, silniejsze wiązanie się z ligandem przez L104EA29Y wynikało raczej ze zmian strukturalnych wzmacniających zachłanność wiązania, które to zmiany zostały wprowadzone do każdego monomerowego łańcucha, niż ze zmian powodujących dimeryzację cząsteczki.

Lokalizacja i analiza strukturalna mutacji wzmacniających zachłanność wiązania

Struktura rozpuszczonej zewnątrzkomórkowej domeny podobnej do Ig-V z CTLA4 została ostatnio ustalona za pomocą spektroskopii NMR (Metzler i wsp. (1997) Nature Struct. Biol., 4:527 -531). Pozwala to na dokładne zlokalizowanie leucyny 104 i alaniny 29 w trójwymiarowym sfałdowaniu (Fig. 26 lewy i prawy opis). Leucyna 104 znajduje się w pobliżu wysoce konserwatywnej sekwencji aminokwasowej MYPPPY. Alanina 29 znajduje się w pobliżu C-końca regionu CDR-1 (S25-R33), który przylega przestrzennie do regionu MYPPPY. Chociaż istnieje znaczne oddziaływanie pomiędzy resztami na poziomie tych dwóch regionów, wydaje się, że nie ma bezpośredniego oddziaływania pomiędzy L104 i A29 pomimo, że oba składają się na część ciągłego hydrofobowego rdzenia w białku.

PL 212 205 B1

Za pomocą modelowania oszacowano skutki dwóch wzmacniających zachłanność wiązania mutacji dla struktury białka. Mutacja A29Y może być z łatwością wprowadzona w szczelinie pomiędzy regionem CDR-1 (S25-R33), a regionem MYPPPY i może stabilizować konformację regionu MYPPPY. W białku CTLA4 typu dzikiego, L104 twarzy silne hydrofobowe oddziaływania z L96 i V94 w pobliżu regionu MYPPPY. Wydaje się bardzo nieprawdopodobne, by mutacja kwasu glutaminowego powodowała powstanie zbliżonej konformacji do konformacji L104 z dwóch powodów. Po pierwsze, nie ma wystarczająco dużo miejsca do umieszczenia dłuższego łańcucha bocznego kwasu glutaminowego w strukturze białka bez powodowania zaburzeń względem CDR-1 (region S25-R33). Po drugie, koszty energetyczne utrzymania ujemnego ładunku łańcucha bocznego kwasu glutaminowego w regionie hydrofobowym byłyby zbyt wysokie. Badania modelowania wskazują natomiast, że łańcuch boczny kwasu glutaminowego przemieszczany jest na powierzchnię białka, gdzie jego ładunek może być stabilizowany za pomocą solwatacji. Taka zmiana konformacji może być w łatwy sposób wprowadzona za pomocą G105 przy minimalnym odkształceniu względem innych reszt aminokwasowych w tym regionie.

Wiązanie mutantów o wysokiej zachłanności do komórek CHO wyrażających CD80 lub CD86

Przeprowadzono analizę FACS (Fig. 27) wiązania CTLA4Ig oraz cząsteczek zmutowanych do stabilnie transfekowanych komórek CD80+ i CD86+CHO w sposób opisany poniżej. Komórki CHO CD80-dodatnie oraz CD86-dodatnie inkubowano we wzrastających stężeniach CTLA4Ig, L104EA29YIg lub L104EOIg, a następnie płukano. Związane białko fuzyjne immunoglobuliny wykrywano za pomocą sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny koziej immunoglobuliny antyludzkiej.

₅

Jak pokazano na Fig. 27, komórki CHO CD80-dodatnie lub CD86-dodatnie (1,5x10⁵) inkubowano ze wskazanymi stężeniami CTLA4Ig (kwadraty zamknięte), L104EA29YIg (koła), bądź L104EIg (trójkąty) przez 2 godziny w 23°C, płukano i inkubowano ze sprzężonym z izotiocjanianem fluoresceiny kozim przeciwciałem przeciwko ludzkiej immunoglobulinie. Analizowano wiązanie na w sumie 5000 żywych komórek (pojedyncze oznaczanie) za pomocą FACScan i posługując się histogramami sporządzonymi na podstawie otrzymanych danych określano średnią intensywność fluorescencji (ang. mean fluorescence intensity, MFI) przy użyciu PC-LYSYS. Przeprowadzono korektę danych pod względem fluorescencji tła mierzonej dla komórek inkubowanych jedynie z odczynnikiem drugorzędowym (odczynnik w drugim etapie reakcji) (MFI = 7). W przypadku kontrolnego mAb L6 (80 ąg/ml) otrzymano MFI<30. Wyniki te są reprezentatywne dla czterech niezależnie wykonanych doświadczeń.

Wiązanie L104EA29YIg, L104EIg oraz CTLA4Ig do ludzkich komórek CHO transfekowanych CD80 jest w przybliżeniu jednakowe (Fig. 27A). L104EA29YIg oraz L104EIg silniej niż CTLA4Ig wiążą się do komórek CHO stabilnie transfekowanych ludzkimi CD86 (Fig. 27B).

Testy funkcjonalne:

Ludzkie CD4-dodatnie komórki T izolowano metodą immunomagnetycznej selekcji negatywnej (Linsley i wsp., (1992) J.Exp.Med. 176: 1595-1604). Wyizolowane CD4-dodatnie komórki T stymulowano octanem mirystynianu forbolu (PMA) z dodatkiem CD80-dodatnich lub CD86-dodatnich komórek CHO w obecności mianowanych stężeń inhibitora. CD4-dodatnie komórki T (8-10x10⁴/studzienkę) hodowano w obecności 1 nM PMA z dodatkiem lub bez stymulatorów napromieniowanych komórek ₃

CHO. Odpowiedź proliferacyjną mierzono poprzez dodanie 1 ąCi/studzienkę [³H]-tymidyny w trakcie 7 końcowych godzin trwającej 72 godziny hodowli. Stosując L104EA29YIg oraz CTLA4Ig przeprowadzono inhibicję stymulowanych za pomocą PMA komórek T z dodatkiem komórek CHO CD80-dodatnich, bądź komórek CHO CD86-dodatnich. Wyniki przedstawiono na Fig. 28. L104EA29YIg hamuje proliferację komórek CHO CD80-dodatnich traktowanych PMA, w większym stopniu niż CTLA4Ig (Fig. 28A). L104EA29YIg skuteczniej także niż CTLA4Ig hamuje proliferację komórek CHO CD86-dodatnich traktowanych PMA (Fig. 28B). A zatem L104EA29YIg jest silniejszym inhibitorem kostymulacji komórek T z udziałem zarówno CD80, jak i CD86.

Figura 29 przedstawia inhibicję wywoływaną przez L104EA29YIg oraz CTLA4Ig allostymulowanych ludzkich komórek T przygotowanych jak wyżej, a następnie allostymulowanych komórkami ludzkiej limfoblastoidalnej linii komórek B (LCL) zwanej PM, wyrażającymi CD80 i CD86 (komórki T w liczbie 3,0x10⁴/studzienkę i PM - 8,0x10³/studzienkę). Pierwotna allostymulacja trwała przez 6 dni, na₃ stępnie komórki poddano pulsacji ³H-tymidyną przez 7 godzin zanim określono wbudowanie radioaktywnego znacznika.

Wtórną allostymulację przeprowadzono w następujący sposób. Po siedmiodniowej pierwotnej allostymulacji komórki T zbierano na pożywkę do separacji limfocytów (LSM) (ICN, Aurora, OH) i zostawiano na 24 godz. Następnie komórki T ponownie stymulowano (wtórnie) w obecności zmiareczkowanej

PL 212 205 B1 ilości CTLA4Ig lub L104EA29YIg, poprzez dodanie PM w takich samych proporcjach jak powyżej. Stymulację prowadzono przez 3 dni, następnie komórki traktowano pulsowo znacznikiem radioaktywnym i zbierano jak powyżej. Wpływ L104EA29YIg na pierwotnie allostymulowane komórki T przedstawiony został na Fig. 29A. Wpływ L104EA29YIg na wtórnie allostymulowane komórki T przedstawiono na Fig. 29B. L104EA29YIg skuteczniej niż CTLA4Ig hamuje zarówno pierwotną, jak i wtórną odpowiedź proliferacyjną komórek T.

W celu pomiaru poziomu wytwarzania cytokin (Fig. 30), ponownie zastosowano wtórną allostymulację na płytkach. Po upływie 3 dni pożywkę hodowlaną poddawano oznaczeniu za pomocą zestawu ELISA (Biosource, Camarrillo, CA) stosując warunki polecane przez producenta. Okazało się, że L104EA29YIg w większym stopniu niż CTLA4Ig blokowało następujące po wtórnej allogenetycznej stymulacji wytwarzanie przez komórki T cytokin IL-2, IL-4 oraz γ-INF (Fig. 30A-C).

Wpływ L104EA29YIg oraz CTLA4Ig na odpowiedź mieszanej populacji limfocytów (ang. mixed lymphocyte response, MLR) małpy przedstawiono na Fig. 31. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC; 3,5x10⁴ komórek/studzienkę z każdej małpy) pochodzące od dwóch małp oczyszczano na pożywce do separacji limfocytów (LSM) i mieszano z 2 μg/ml fitohemaglutyniny (PHA). Komórki stymulowano 3 dni, a następnie dodawano radioaktywny znacznik na 16 godz. przed zbieraniem. L104EA29YIg silniej niż CTLA4Ig hamowało proliferację małpich komórek T.

T a b e l a I

Stałe równowagi i kinetyki przedstawiono w poniższej tabeli (wartości są wartościami średnimi ± odchylenie standardowe z trzech różnych doświadczeń)

Unieruchomione białko	Badany związek	Kon(x10⁵)M'¹S'¹	Koff(x10'³)S’¹	Kd nM
CD80Ig	CTLA4Ig	3,44±0,29	2,21±0,18	6,51±1,08
CD80Ig	L104EIg	3,02±0,05	1,35±0,08	4,47±0,36
CD80Ig	L104EA29YIg	2,96±0,20	1,08±0,05	3,66±0,41
CD80Ig	CTLA4c120s	12,011,0	230±10	195±25
CD80Ig	L104EA29Yc120	8,3±0,26	71±5	85±2,5
	s
CD86Ig	CTLA4Ig	5,95±0,57	8,16±0,52	13,9±2,27
CD86Ig	L104EIg	7,03±0,22	4,26±0,11	6,06±0,05
CD86Ig	L104EA29YIg	6,42±0,40	2,06±0,03	3,21±0,23
CD86Ig	CTLA4Xc120s	16,5±0,5	840±55	511±17
CD86Ig	L104EA29YXc120	11,4±1,6	300±10	267±29
	s

T a b e l a II

Wpływ mutagenezy CTLA4Ig w pozycjach zamieszczonych w wykazie na wiązanie CD86Ig, ustalano za pomocą SPR, jak to zostało opisane powyżej. Przeważający wpływ oznaczono znakiem „+”.

Miejsce mutagenezy	Wpływ mutagenezy
brak widocznego efektu	zwolniona szybkość „on”/ /zwolniona szybkość „off”	Ograniczone wiązanie ligandu
1	2	3	4
S25		+
P26	+
G27	+
K28	+
A29		+

PL 212 205 B1 ciąg dalszy Tabeli 1

1	2	3	4
T30		+
E31			+
R33			+
K93		+
L96		+
M97			+
Y98			+
P99			+
P100			+
P101			+
Y102			+
Y103		+
L104		+
G105		+
I106	+
G107	+
Q111	+
Y113	+
I115	+

P r z y k ł a d 3

Poniżej przedstawiono opis II fazy badań klinicznych z udziałem pacjentów - ludzi otrzymujących rozpuszczalną zmutowaną postać cząsteczek białka CTLA4 - L104EA29YIg (znaną też jako LEA29Y bądź LEA) lub CTLA4Ig, celem złagodzenia co najmniej jednego z objawów związanych z reumatoidalnym zapaleniem stawów, w tym zmniejszenia: opuchlizny stawów, tkliwości stawów, stanów zapalnych, sztywności porannej oraz bólu. Jak pokazano to na Fig. 24 sekwencja aminokwasowa zastosowanej w niniejszych badaniach cząsteczki CTLA4Ig rozpoczyna się metioniną w pozycji +1 (lub alternatywnie alaniną w pozycji -1), kończy zaś lizyną w pozycji +357. DNA kodujący opisaną tu postać cząsteczki CTLA4Ig zdeponowano jako ATCC 68629. Jak przedstawiono to na Fig. 19 sekwencja aminokwasowa zastosowanej tutaj cząsteczki L104EA29YIg rozpoczyna się metioniną w pozycji +1 (bądź alternatywnie alaniną w pozycji -1), kończy zaś lizyną w pozycji +357. DNA kodujący opisaną tu postać cząsteczki L104EA29YIg zdeponowano jako ATCC PTA 2104.

Dodatkowo, poniżej przedstawiono opis doświadczenia z udziałem pacjentów traktowanych L104EA29YIg lub CTLA4Ig w celu łagodzeniu co najmniej jednego z objawów towarzyszących reumatoidalnemu zapaleniu stawów, w tym zmniejszenia szybkości sedymentacji etytrocytów oraz obniżenia poziomu białka C-reaktywnego i/lub receptora dla IL2 w surowicy.

Grupy pacjentów

W badaniu brało udział 214 pacjentów, w tym 54 mężczyzn i 160 kobiet (Fig. 1A, 1B). Średnia długość trwania choroby u pacjentów na poziomie podstawowym wynosiła 3,4 lata (±2,0), a próba leczenia za pomocą co najmniej jednego z leków należących do modyfikujących chorobę leków przeciwreumatycznych (ang. Disease Modifying Antirheumatic Drug, DMARD) nie powiodła się. Leki należące do grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych (ang. Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs (NSAIDS) lub steroidy (< 10 mg/dzień) dopuszczono do stosowania, zaś towarzyszące leki z grupy DMARDS wycofano. Pacjentów losowo przypisano do liczących od 25 do 32 osób grup leczenia. Trzydziestu dwóm pacjentom podano placebo, 92 podano L104EA29YIg, zaś 90 podano CTLA4Ig. Pacjenci, którzy postępowali według wytycznych protokołu i nie przerwali doświadczenia przed dniem 57,

PL 212 205 B1 otrzymali w sumie 4 dożylne wlewy, po jednym wlewie w dniu 1, 15, 29 i 57. Wszyscy pacjenci poddawani byli ocenie w dniu 1, 15, 29, 43, 57, 71 oraz 85. Podawane dawki zawierały 0,5, 0,2 lub 10,0 mg/kg L104EA29YIg (oznaczony na Fig. 1A-1E odpowiednio jako LEA5, LEA2 oraz LEA10) bądź CTLA4Ig (oznaczony na Fig. 1A-1E odpowiednio jako CTLA5, CTLA2 i CTLA10).

Wszystkich badanych monitorowano pod kątem wystąpienia w okresie okołoinfuzyjnym niepożądanych objawów ubocznych oraz pod kątem ogólnego bezpieczeństwa za pomocą formularza ankietowego z listą potencjalnych niepożądanych objawów ubocznych. Pacjentów pytano o potencjalne objawy uboczne mogące pojawić się w przeciągu dwudziestu czterech godzin po wlewie. Dodatkowo, pacjentów zachęcano do samorzutnego relacjonowania wszelkich objawów niepożądanych jakich doświadczyli. Lekarze rutynowo kontrolowali próbki laboratoryjne pochodzące od pacjentów pod względem nieprawidłowości w chemicznych właściwościach krwi i hematologii np. oznaczali poziomy związków pośredniczących w odpowiedzi zapalnej, takich jak cytokiny (TNF, IL-6), tryptaza oraz dopełniacz. Pierwotnym punktem końcowym była proporcja badanych spełniających kryteria ACR20 w dniu 85 doświadczenia.

Przechowywanie materiałów do testu

CTLA4Ig oraz L104EA29YIg dostarczano w jednorazowych szklanych fiolkach zawierających 200 mg CTLA4Ig/fiolkę lub 100 mg L104EA29YIg/fiolkę. Do wlewów, CTLA4Ig oraz L104EA29YIg rozcieńczano sterylną wodą do iniekcji (SWFI), do końcowego stężenia 25 mg/ml.

Protokół podawania leku

Wszystkie wlewy odbywały się dożylnie przez 1 godz. (Fig. 1 do 17). Wszyscy badani otrzymali co najmniej jeden wlew badanego leku.

Grupa 1: 32 pacjentów, CTLA4Ig lub L104EA29YIg zestawione z placebo

Grupa 2: 26 pacjentów; dawka 0,5 mg/kg CTLA4Ig.

Grupa 3: 32 pacjentów; dawka 2,0 mg/kg CTLA4Ig.

Grupa 4: 32 pacjentów; dawka 10,0 mg/kg CTLA4Ig.

Grupa 5: 32 pacjentów; dawka 0,5 mg/kg L104EA29YIg.

Grupa 6: 29 pacjentów; dawka 2,0 mg/kg L104EA29YIg.

Grupa 7: 31 pacjentów; dawka 10,0 mg/kg L104EA29YIg.

Monitorowanie kliniczne

Przed każdym wlewem pacjentów oceniano pod względem podstawowych objawów aktywności choroby. Podstawowe objawy stanowiące kryterium oceny obejmowały: opuchliznę stawów, wrażliwość stawów, stan zapalny, sztywność poranną, aktywność choroby ocenianą przez pacjentów i lekarzy, jak również niepełnosprawność ocenianą za pomocą Formularza Ankietowego Oceny Zdrowia Health Questionnaire Assessment (HAQ) (nazywanego punktacją funkcjonowania fizycznego, Fig. 1C) oraz ból (Figury 1A do ID). Dodatkowo, podstawowe objawy stanowiące kryterium oceny obejmowały szybkość sedymentacji erytrocytów (OB) oraz poziomy białka C-reaktywnego (CRP) i rozpuszczalnego receptora dla IL-2 (IL-2r) w surowicy (Fig. 1C do 1D).

Badania odpowiedzi klinicznej oparto na kryteriach ustalonych przez American College of Rheumatology (ACR). Osoba spełniała kryterium ACR20 w przypadku, gdy 20 procentowej poprawie ulegała tkliwość i opuchlizna stawów oraz gdy 20 procentowej poprawie uległy trzy z pięciu pozostałych mierzonych objawów, takich jak ogólne zmiany chorobowe w ocenie pacjenta i lekarza, ból, niepełnosprawność oraz czynnik fazy ostrej (Felson, D. T., i wsp., 1993 Arthritis and Rheumatism 36:729 -740; Felson, D. T., i wsp., 1995 Arthritis and Rheumatism 38:1-9).

Biomarkery

Oznaczano także potencjalne biomarkery aktywności chorobowej (czynnik reumatoidalny, CRP, OB, rozpuszczalny IL-2R, rozpuszczalna ICAM-1, rozpuszczalne selektyny-E oraz MMP-3). W celu ustalenia stężenia IL-2sRa, sICAM-1, sE-selektyny i MMP w surowicy wykorzystywano wystandaryzowane metody enzymatycznego oznaczania immunologicznego (EIA). Oznaczeń TNFa oraz IL-6 dokonywano przed i 2 godz. po wlewie, w razie konieczności.

Za pomocą dostępnych na rynku kolorymetrycznych zestawów EIA otrzymanych z R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) dokonywano pomiarów IL-2sRa, sICAM-1 oraz sE-selektyny. Górną i dolną granicą pomiaru były odpowiednio 312-20,000 pg/ml, 40-907 ng/ml oraz 10-206 ng/ml. Międzypomiarowy współczynnik zmienności wahał się odpowiednio pomiędzy 4,48-8,4%, 3,8-5,0% oraz

5,5-9,0%. Według producenta zestawu, prawidłowe wartości w surowicy wahają się odpowiednio pomiędzy 676-2,132 pg/ml.

PL 212 205 B1

Za pomocą dostępnego na rynku, kolorymetrycznego zestawu EIA z Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) dokonywano pomiaru MMP-3. Górna i dolna granica pomiaru to 30-7,680 ng/ml. Międzypomiarowy współczynnik zmienności wahał się odpowiednio pomiędzy 6,3-10,6%. Według producenta zestawu, prawidłowe wartości w surowicy wahają się odpowiednio pomiędzy 28-99 pg/ml.

Za pomocą dostępnych na rynku, chemiluminescencyjnych zestawów EIA z R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) dokonywano pomiaru IL-6 oraz TNFa. Górne i dolne granice pomiaru to odpowiednio 0,3-3,000 pg/ml i 0,7-7,000 pg/ml. Międzypomiarowy współczynnik zmienności wahał się odpowiednio pomiędzy 3,1-5,7% a 6,4-20,7%. Według producenta zestawu, prawidłowe wartości w surowicy wahają się odpowiednio pomiędzy <0,3-12 pg/ml a <0,7-7,5 pg/ml.

Testowanie przeciwciał

Pierwszego dnia doświadczenia przed rozpoczęciem podawania leków, a także w przybliżeniu w dniu 15, 29, 57, 85 oraz 169 pobrano próbki surowicy celem oznaczenia specyficznych względem stosowanych środków przeciwciał. Z uwagi na wcześniej istniejące, wysokie miano przeciwciał skierowanych przeciw immunoglobulinowej (Ig) części badanych cząsteczek, oznaczano również tworzenie specyficznych przeciwciał skierowanych przeciw cząsteczkom CTLA4Ig oraz LEA29Y bez regionów stałych Ig.

96-studzienkowe płytki Immulon II ELISA (Dynex, Chantilly, Virginia) opłaszczono cząsteczkami CTLA4Ig, CTLA4Ig bez regionów stałych Ig oraz LEA29Y, bądź LEA29Y bez regionów stałych Ig w stężeniu odpowiednio 2, 4, 2 lub 1 pg/ml roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem (PBS), i inkubowano przez noc w temperaturze 2-8°C. Płytki przepłukiwano PBS zawierającym 0,05% Tween 20 i poddawano blokowaniu roztworem PBS zawierającym albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie, płytki przepłukiwano i do odpowiednich studzienek na płytce dodawano kolejne rozcieńczenia surowicy oznaczanej lub surowice stanowiące kontrolę jakości (Quality control, QC) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Surowicę rozcieńczano trzykrotnie w PBS zawierającym 0,25% BSA i 0,05% Tween 20 poczynając od rozcieńczenia 1:10. Płytki przemywano i dodawano mieszaninę sprzężonych z fosfatazą alkaliczną kozich anty-ludzkich przeciwciał kappa i lambda (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C płytki płukano i do każdej studzienki dodawano fosforan para-nitrofenylu w stężeniu 1 mg/ml buforu dielanolaminowego. Po upływie 30 minut, podczas których reakcja zachodziła w temperaturze 25°C, reakcje zatrzymywano za pomocą 3N NaOH i dokonywano pomiaru absorbancji (przy zastosowaniu dwóch długości fal: 405 i 550 nm). Wyniki wyrażono jako miano punktu końcowego (ang. endpoint titer, EPT), przez który rozumie się odwrotność największego rozcieńczenia, przy którym odczyt absorbancji był pięciokrotnie wyższy lub równy średniej absorbancji tła dla płytki. Tło dla płytki określano jako pomiar absorbancji przeprowadzony przy braku surowicy. Wartości uznawano za dodatnie dla serokonwersji, o ile pochodziły z co najmniej dwóch seryjnych rozcieńczeń (9-krotne) lub wyższych w stosunku do wartości EPT dla próbki pobranej przed dawkowaniem. Próbki surowicy QC dodatnie pod względem przeciwciał specyficznych wobec CTLA4Ig bądź LEA29Y pozyskano od immunizowanych małp. W przebiegu każdego analitycznego pomiaru oznaczano równe ilości próbek QC. Pomiary analityczne uznawano za właściwe jedynie w przypadku, gdy próbki QC spełniały kryteria zgodności.

Wyniki

Ogólnie, CTLA4Ig oraz L104EA29YIg były dobrze tolerowane we wszystkich stosowanych dawkach. W przypadku stosowania wszystkich dawek wystąpiły podobne niepożądane skutki uboczne za wyjątkiem objawu bólu głowy. Przy stosowaniu leku w dawce 0,5, 2,0 lub 10,0 mg/kg, 85 dnia liczba pacjentów cierpiących na ból głowy, traktowanych CTLA4Ig, wzrastała w zależności od dawki osiągając odpowiednio 23%, 44% i 53%, zaś w przypadku pacjentów przyjmujących L104EA29YIg osiągając odpowiednio 34%, 45% i 61%. W przeciwieństwie do powyższych wyników, w grupie osób otrzymujących placebo 31% pacjentów doświadczało bólu głowy.

Odsetek pacjentów, u których przerwano badania kliniczne ze względu na nawrót objawów zapalenia stawów oraz inne niepożądane objawy została zestawiona na Fig. 2. O wiele wyższy odsetek pacjentów przyjmujących placebo przerwał leczenie z powodu nawrotu objawów zapalenia stawów. W przypadku pacjentów otrzymujących CTLA4Ig wraz ze wzrastającą dawką leku następował spadek liczby przypadków przerywania leczenia. Bardzo niewielu pacjentów przerywało leczenie w grupie traktowanej L104EA29YIg. Wyniki te wskazują na istnienie prawidłowej, odwrotnej w zależności od dawki odpowiedzi w przypadku stosowania CTLA4Ig i silniejszej odpowiedzi w przypadku terapii L104EAYIg.

PL 212 205 B1

Odpowiedzi ACR-20, -50 i -70 u pacjentów traktowanych CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo na dzień 85 zestawiono na Fig. 3A. Podobnie, Figury 3B oraz C opisują odpowiedzi ACR-20 przy 95% przedziale ufności. Odpowiedzi wydają się być zależne od dawki z wyraźnie znaczącą odpowiedzią w przypadku traktowania dawką 10 mg/kg masy ciała pacjenta.

Odsetek pacjentów, u których nastąpiło zmniejszenie opuchnięcia i tkliwości stawów w porównaniu z pacjentami, u których nie wywołano odpowiedzi po działaniu CTLA4Ig, L104EA29YIg bądź placebo została przedstawiona na Fig. 4A i B. Odpowiedź na leczenie wydaje się być zależna od dawki. U większego odsetka pacjentów wykazano poprawę rzędu 20, 50, 70, a nawet 100% w przypadku stosowania dawek 2 mg/kg i 10 mg/kg dla obu produktów.

Odsetek pacjentów, u których stwierdzono zmniejszenie bólu, aktywności chorobowej oszacowanej przez pacjenta i lekarza, średniej punktacji dla CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo, pokazano na Fig. 5A, B, C i D. Kontrolowane za pomocą skali Likerta odpowiedzi na leczenie określane 85 dnia doświadczenia wydają się być zależne od dawki w przypadku grup pacjentów traktowanych związkami aktywnymi w porównaniu z grupą placebo. Skala Likerta jest wiarygodną skalą werbalnej oceny posługującą się przymiotnikami celem ustalenia stopnia objawów (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36 (6): 729-740).

Dokonywaną przez pacjentów i lekarzy ocenę zmiany przebiegu aktywności chorobowej względem poziomu odniesienia wynoszącą co najmniej 2 jednostki, będącej wynikiem stosowania CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo pokazano na Fig. 6A i B. Stopień odpowiedzi na działanie leku wydaje się zależeć od dawki, przy czym bardziej znacząca poprawa widoczna jest dla wyższych dawek związków aktywnych.

Procentowe obniżenie poziomów białka C-reaktywnego (CRP) u pacjentów, którym podawano CTLA4Ig, L104EA29YIg bądź placebo przedstawiono na Fig. 7A i B. Odpowiedzi wydają się być zależne od dawki z wyraźnym obniżeniem w przypadku stosowania związków aktywnych w dawkach 2 i 10 mg/kg. Dodatkowo, na Fig. 7B pokazano, że różnica jest dosyć znacząca w porównaniu z grupą, w której stosowano placebo przy 95% przedziale ufności. Fig. 7C przedstawia zmiany w poziomach surowicy w stosunku do poziomu odniesienia 85 dnia doświadczenia.

Ilość rozpuszczonego receptora dla IL-2 w surowicy u pacjentów, którym podawano CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo przedstawiono na Fig. 8. Obniżenie poziomów rozpuszczalnego receptora dla IL-2 wydaje się być zależne od dawki.

Ilość obecnego w surowicy rozpuszczalnego ICAM-1 oraz rozpuszczalnej E-selektyny u pacjentów traktowanych CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo przedstawiono na Fig. 33. Obniżenie poziomów rozpuszczalnej formy ICAM-1 i rozpuszczalnej E-selektyny wydaje się być zależne od dawki.

Mediana oraz średnia liczba tkliwych stawów u pacjentów traktowanych CTLA4Ig lub placebo w czasie, pokazane są na Fig. 9A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. zmniejszenie tkliwości stawów) wydaje się być bardziej istotna w grupach traktowanych lekami w dawce 2 i 10 mg/kg niż w grupie traktowanej placebo, bądź dawką 0,5 mg/kg.

Medianę i średnią liczbę opuchniętych stawów u pacjentów, u których stosowano CTLA4Ig lub placebo w czasie przedstawiono na Fig. 10A i B. Zmiana w stosunku do poziomu podstawowego (np. zmniejszenie opuchlizny stawów) wydaje się być bardziej istotna w grupach traktowanych dawką 2 i 10 mg/kg niż w grupie traktowanej placebo lub dawką 0,5 mg/kg.

Średnią ocenę punktową bólu w czasie u pacjentów traktowanych CTLA4Ig lub placebo przedstawiono na Fig. 11. Zmiana w stosunku do poziomu odniesienia (np. obniżenie aktywności chorobowej) wydaje się być bardziej istotna w grupach, w których stosowano dawkę 2 i 10 mg/kg w porównaniu z placebo i dawką 0,5 mg/kg.

Średnią ocenę punktową aktywności chorobowej u pacjentów traktowanych CTLA4Ig bądź placebo w czasie, dokonywanej przez pacjentów lub lekarzy, przedstawiono na Fig. 12A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. obniżenie aktywności choroby) wydaje się być bardziej istotna w grupach traktowanych dawką 2 i 10 mg/kg niż w grupie traktowanej placebo lub 0,5 mg/kg.

Medianę i średnią liczbę wrażliwych stawów u pacjentów traktowanych L104EA29YIg (oznaczone na figurach jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 13A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. zmniejszenie tkliwości stawów) wydaje się być zależna od dawki.

Mediana i średnia liczba opuchniętych stawów u pacjentów, którym podawano L104EA29YIg (na figurach zaznaczone jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 14A i B. Zmiana

PL 212 205 B1 w stosunku do linii odniesienia (np. zmniejszenie opuchlizny stawów) wydaje się być bardziej istotna w grupach traktowanych dawką 2 i 10 mg/kg niż w grupie traktowanej placebo lub 0.5 mg/kg.

Średnią ocenę punktową bólu u pacjentów, którym podawano L104EA29YIg (oznaczane na figurach jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 15. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. zmniejszenie bólu) wydaje się być zależna od dawki.

Średnie wyniki oceny aktywności choroby oszacowane przez pacjentów i lekarzy u pacjentów traktowanych L104EA29YIg (oznaczane na figurach jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 16A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. obniżenie aktywności chorobowej) wydaje się być zależna od dawki.

Odsetek poprawy stanu niepełnosprawności oznaczony za pomocą formularza ankietowego HAQ w dniu 85 dla pacjentów traktowanych CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo został przedstawiony na Fig. 17 (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J.F., i wsp., 1982 J. of Rheumatology

9:789- 793). Istnieje wyraźna poprawa zależna od dawki wyrażona tym parametrem.

Zmiany względem linii odniesienia dla poziomów rozpuszczalnego IL-2r i białka C-reaktywnego w obu grupach poddawanych leczeniu były zależne od dawki. Po terapii, poziomy rozpuszczalnego IL-2r wynosiły -2%, -10% i -22% w przypadku stosowania CTLA4Ig oraz -4%, -18% i -32% w przypadku stosowania L104EA29YIg odpowiednio dla dawek 0,5, 2,0 i 10,0 mg/kg, w porównaniu do +3% w przypadku podawania placebo. Poziomy białka C-reaktywnego wynosiły +12%, -15% i -32% w przypadku stosowania CTLA4Ig oraz +47%, -33% i -47% w przypadku stosowania L104EA2 9YIg odpowiednio dla dawek 0,5, 2,0 i 10,0 mg/kg, w porównaniu do +20% w przypadku podawania placebo (Fig. 7A).

Za wyjątkiem niewielkiej supresji w poziomach IgA i IgG przy stosowaniu najwyższych dawek obu leków, rutynowe testy hematologiczne czy chemiczne testy laboratoryjne nie wykazały żadnych znaczących klinicznie nieprawidłowości, nie zaobserwowano również nieprawidłowości w objawach fizycznych czy też ocenie czynności życiowych. Godne uwagi jest to, że żaden ze stosowanych środków nie spowodował indukcji specyficznych względem nich przeciwciał.

P r z y k ł a d 4

Poniższe przykłady opisują II fazę badań klinicznych, w których posługiwano się zgodnymi z normą skalami radiograficznymi, u pacjentów otrzymujących L104EA29YIg w celu zmniejszenia lub profilaktyki zniszczeń strukturalnych obejmujących kość lub erozję stawu. Poprawa skuteczności w obniżaniu lub profilektyce strukturalnego zniszczenia równolegle z poprawą kliniczną mierzoną za pomocą parametrów klinicznych.

Stan struktury kości kontrolowany jest w przypadku niektórych pacjentów przed rozpoczęciem podawania CTLA4Ig lub L104EA29YIg. Pacjentom tym podaje się CTLA4Ig lub L104EA29YIg w dawce pomiędzy 0,5 a 20 mg/kg, w sposób regularny, co dwa do dwanaście tygodni (leki podawane są same lub w połączeniu z innymi czynnikami) celem utrzymania w czasie ich leczniczego wpływu. W uprzednio określonych odstępach czasu wykonywane są radiogramy rąk i stóp pacjentów: co 6 miesięcy, następnie co rok, jak jest to zalecane przez wytyczne FDA. Pacjenci ci są kontrolowani długoterminowo po 6 i 12 miesiącach, a następnie co roku, w celu określenia czy leczenie z użyciem CTLA4I F lub L104EA29YIg zmniejsza postęp degradacji kości. Pacjenci kontrolowani są za pomocą metod radiograficznych obejmujących stosowanie promieniowania rentgenowskiego i/lub obrazowanie za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI), zgodnie ze standardami praktyki lekarskiej (Larsen, A. K. oraz M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481-491; Sharp, J. T., i wsp., 1985 Arthris and Rheumatism 28:1326-1335). Wyniki danych radiograficznych oceniane są pod kątem profilaktyki zniszczenia strukturalnego, obejmującej spowolnienie procesu erozji kości i zniszczenia chrząstki ze zmniejszaniem się przestrzeni stawowej i/lub profilaktyki nowej erozji.

PL 212 205 B1

Lista sekwencji <110» Cohen, Robert Carr, Suzette Hagerty, David Peacb, Robert J Becker, Jean-Claude Bristol-Myers Sąuibb Company <120> Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 <130» D0030PCT; 30436.55WOU1 <140» PCT/USO1/21204 <141» 2001-07-02 <150» 50/215913 <151» 2000-07-03 <160» 19 <170» Patent In Ver. 2.1 <210» 1 <211» 65 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» <223» Opis sztucznej sekwencji: CTLA4 przyłączona do onkostatyny M, starter lewy ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcc <210» 2 <211» 33 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4 przyłączona do onkostatyny M, starter prawy <400» ² --Cttgggctcc tgatcagaat ctgggcacgg ttg <210» 3 <211> 72 <212» DNA <213» Sekwencja sztuczna <220» . .

<223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4 z oncostatyną M i Hind III <400» 3 ctagccactg aagcttcacc aatgggtgta ctgctcacac agaggacgct gctcagtctg gtccttgcac tc <210» 4 <211» 41 <212» DNA

PL 212 205 B1 <213> Sekwencja sztuczna <22C>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter lewy dla onkostatyny M CTŁA4 (OMCTLA4) <400> 4 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter prawy dla onkostatyny M CTLAl (OMCTLA4) ' ' <400> 5 „ gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc 42 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: LlOiEIg <400> 6

atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	SC
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca.	tctccaggca	aagccactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gcgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgacctfccct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	360
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacgag	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	430
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	730
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	840
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	960
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	lceo
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140
ccgggtaaat	ga					1152

<210> 7 <211> 333 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sztucznej sekwencji: LiO4a.lg <400> 7

Met 1

Gly

Val

Leu 5

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro 20

Ser

Met

Ala

Ser

Met 25

Ala

Met

His

Val

Ala 30

Gin

Pro

Ala

Val

Leu

Ala

Sar

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

PL 212 205 B1

40 43

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Giu

7al

Arg Vai

Thr

/3 i

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

vai

Thr

Giu

7al

Cys

Ala Aia

Thr

Tyr

Met

55

70

75

30

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile Cys

Thr

Giy

Thr

Sar

35

30

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Giy Leu

Arg

Ala

Met

A3?

100

1C5

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cy3

Lys

val

Giu

Leu

Met Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Giy

Asn

Giy

Thr

Gin

Ile

Tyr Val

Ile

Asp

Pro

Giu

130

135

140

ero

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Giu

Leu

Leu Gly

Gly

Ser

7ai

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Ly3

Asp

Thr

Leu Met

Ile

Ser

Arg

Tar

180

135

130

Pro

Glu

Val

Thf

Cys

val

Val

Asp

Val

Ser His

Giu

Asp

Pro

Giu

135

200

205

Ala

Lys'

Phe

Asn

Trp

Tyr

Vai

Asp

Gly

Vai

Glu Val

His

Asn

Aia

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn Giy

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Ly3

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys.

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

273

230

235

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Ly3

Asn

Gin

Val Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

230

235

300

vai

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val Glu

Trp

Giu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro Pro

Vai

Leu

Asp

Ser

325

330

335

A3p

Giy

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Giy

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Vai Met

His

Giu

Aia

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu Sar-

Pro

Gly

Lys

370

375

330

<210> 8 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104SA23YIg <400> 8 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctcGaggca aatatactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 3S0 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gattca-gta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac 430 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt ccccttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgcggtggtg 600

PL 212 205 B1 gargtgagcr argaagarsr tgaggrraag tccaartggt argtggaogg cgtggaggtg cataatgcsa agacaaagcc grgggaggag cagtasaara grargtacrg tgtggtrag; gtcctracsg trctgcacca ggactggctg aatggraagg agtacaagtg caaggtctor aasaaagccc tcceagccco catcgagaaa aocatccsca aagrraaagg gragrtorga gaaroaoagg tgtaoacset gurcooatcr cgggatgagr tgaccaagaa craggtrago ctgacrtgsn tggtcaaagg ctcctatccc agrgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg ectcccgtgc tggaotccga cggctccttr ttcctctaca gcaagctcas cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgotccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgr agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ga <2l0> 9 <211> 393 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

553 123 733 3 40 903 950

1020

1030

1140

1152

<22

3> Opis

sztu

czne

j se

kwen

Cji:

L10

4ZA2

9TIg

<43

0> 9

Met

Gly

Val

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

val

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Tyr

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gir.

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

30

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Giy

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Mat

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

13C

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Vai

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

135

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

233

235

240

val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

A3p

Trp

Leu

A3.Q

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

27 5

280

235

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asr.

305

310

315

323

Gly

Gir.

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

333

335

As?

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

343 345 353

PL 212 205 B1

Trp Gin	Gin Gly Asn 355	Vai		Sar Cvs 360	Sar	Vai Mat	His 355	Glu Ala Leu
His Asn 370	His Tyr Thr	Sir.	Lys 375	Ser La^:_i	Sar	Leu Ser 330	?ro	Giy Lys

<210 10 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220

<223> Opis	sztucznej i	sekwencji: !	1104EA29LIg
<400> 10
atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	60
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	rggtactggc	cagcagocga	120
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aattgactga	ggtccgggtg	180
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	240
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	300
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	330
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacgag	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctga	caaaactcac	430
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctggggggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	600
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	660
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagc	720
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	760
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accacctcca	aagccaaagg	gcagccccga	340
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	950
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1030
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140
ccgggtaaat	ga					1152

<210> 11 <211> 333 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: L104EA29LIg <400> 11

Met 1

Gly Val

Leu

Leu 5

Thr Gin Arg Thr

Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala

10

15

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Leu

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

val

Thr

Glu

val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

30

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Giy

Thr

Ser

35

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Giy

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Ty*

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Giy

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

A3P

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Ly3

Ser

Asp

Lys

Thr

His

PL 212 205 B1

145

153

155

150

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Leu

La u

siy

'0-7

Ser

val

155

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Łys

ASO

Thr

Leu

Met

ile

Ser

Arg

Thr

130

135

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

7ai

Val

Aso

7al

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

ASO

Gly

7al

Glu

7ai

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

C-lu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

7al

Sar

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Tr?

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Tle

Glu

Lys

Thr

Ile

260

255

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

230

235

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

vai

Sar

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Sar

As?

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Sar

A3n

335

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Sar

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Α3Π

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

355

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

330

<210> 12 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220> _ <223> Opis sztucznej sekwencji: L104SA29TIg <400> 12 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 50 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 123 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aaastactga ggtccgggtg 130 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgca-gg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 3S0 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gattcatgta 420 attgatccag aaccgtgcce agattctgac caggagccca aatcttctga caaaactcac 430 acatccccac cgtccccagc acctgaaccc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag tccaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 650 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 730 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 340 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1030 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct crccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 13 <211> 333 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna

PL 212 205 B1 <220>

<223> 0pi3 sztucznej sekwencji: L104tA29TIg <400> 13

Met 1 X

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

7ai

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

val

7al

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Ly3

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Aso

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Vai

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

As?

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

93

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cy3

Lys

Vai

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Ty_S

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Ly3

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

ISO

135

193

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

ASn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

230

235

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Vai

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Vai

Glu

Trp

Glu

Sar

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

A3n

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Sar

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

A3p

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

380

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

C-ln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

330

<210> 14 <2I1> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji:: L104SA29»Ig <400> 14 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact

PL 212 205 B1

agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtattggc	cagcagccga	123
ggcatcgcta	gctttgtgtg	tgagtatgca	tctccaggta	aaiggaccga	ggtccgggcg	133
acagrgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	g^gcggcaac	craca.garg	243
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcac-ctccag	tggaaaccaa	333
gtgaacctca	ctatccaagg	a-ctgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	36^
gagctcatgt	acccaccgcc	ataccasgag	ggcataggca	acggaaccca	gatt-atgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagscca	aatcttctga	caaaactcac	4 33
acaCscccac	cgtccccagc	acctgaactc	crggggggat	cgtcagtctt	cctcttcscc	543
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctc-c	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	OvY
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	ScC
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	sagtacaaca	gcacgtaccg	tgtggtcagt	720 7 a n
	tcctgeacca	ggactggctg	aacggcaagg	ag_a-aag*g	caaggtctcc
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	azcatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	340
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	900
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttciatccc	a gc ga ca cg	ccgtggagtg	ggagagcaat	950
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagstcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgccttctca	1033
tąctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaag-gcct	ctccccgtcc	1140
ccgggtaaat	ęa					1152

<210> 15 <2L1> 333 <2L2> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: LI04EA29WIg <400> 15

Met Gly 1

Val Leu

Leu 5

Thr Gir. Arg Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Vai

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Yal

Cy3

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Trp

Thr

Glu

Val

Arg

Vai

Thr

Vai

Leu

Arg

50

S5

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gir.

Val

Thr

Glu

Yal

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

60

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

35

90

95

Ser

Gly

Asn

Gir.

Yal

Asn

Leu

Thr

Ile

Gir.

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

ICO

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Vai

Ile

Aso

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gir,

Glu

Pro

Ly3

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

150

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Sar

Ser

Yal

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

130

135

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

val

A3p

Val

Sar

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Ly3

Phe

Asn

Trp

Tyr

Vai

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

AS Γ-

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Vai

Yal

Ser

225

230

235

240

val

Leu

Thr

Vai

Leu

His

Gin

Aso

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

255

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Yal

Tyr

Thr

Leu

Pro

PL 212 205 B1

275

233

235

Ser

Arg

Asp

Glu

Lsu

TJ·* r·

Lys

Asn

j—r.

7ei

Ser

Leu Thr

Cys

L^a j.

2 30

235

300

ν a L

ŁyS

Gly

?hs

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Vai

Glu

Trp Glu

Ser

Asn

30 5

310

315

320

Giy

Gir.

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

?ro

Pro

7ai Leu

Asp

Ser

Gly

323

330

335

Asp

Ser

Phe

Lec

Tyr

Ser

Lys

Lsu

Thr

Vai

Asp Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

”al

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His Glu

Ala

Leu

355

350

355

His

Asn

Hi 3

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Sar

Le-

Ser

Pro Gly

Lys

370

375

330

<210> 16 <211> 636 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 130 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 350 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgac ttcctcctct ggatccttgc agcagttagt 430 tcggggttgt ttttttatag ctttctcctc acagctgttt cttcgagcaa aatgctaaag 540 aaaagaagcc ctcttacaac aggggtctat gtgaaaatgc ccccaacaga gccagaacgt 600 gaaaagcaat ttcagcctta ttttattccc atcaat 635 <210> 17 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Met 1

Gly

Vai

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg Thr

Leu Leu 10

Ser Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro 20

Ser

Met

Ala

Ser Met 25

Ala Met

His Val

Ala 30

Gin

Pro

Ala

Vai

Val 35

Leu

Ala

Ser

Arg Gly 40

Ile Ala

Sar Phe 45

Vai

Cys

Glu

'•T·.,»

Ala 50

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala 55

Thr Glu

Val Arg

Val Thr 60

Vai

Leu

Arg

Gin 65

Ala

Asp

Ser

Gin

val 70

Thr

Glu Val

Cys Ala 75

Ala Thr

Tyr

Met

Met 80

Giy

Asn

Glu

Leu

Thr 85

Phe

Leu

Asp Asp

Ser Ile 90

Cys Thr

Giy

Thr 95

Ser

Giy

Asn

Gin 100

Val

Α3Π

Leu

Thr Ile 105

Gin Gly

Leu Arg

Ala 110

Met

Asp

Thr

Gly

Leu 115

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val Glu 120

Leu Met

Tyr Pro 125

Pro

Tyr

Leu 130

Gly

Ile

Gly

Asn

Glv 135

Thr Gln

Ile Tyr

Val Ile 140

Aso

Pro

Glu

Pro 145

Cys

Pro

Asp

Sar

Asp 150

Phe

Leu Leu

Trp Ile 155

Leu Ala

Ala

Vai

Ser 150

Ser

Giy

Leu

Phe

Phe 165

Tyr

Ser

Phe Leu

Leu Thr 170

Ala Val

Ser

Leu 175

Ser

Lys

Mat

Leu

Lys 130

Lys

Arg

Ser

Pro Leu 135

Thr Thr

Giy Val

Tyr 190

V a 1

Lys

Met

Pro

Pro 195

Thr

Glu

Pro

Glu

Cys Glu 200

Lys Gin

Phe Gin 205

Pro

Tyr

?he

PL 212 205 B1

Ile Pro Ile Asn 210 <210 13 <2il> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220

<223> Opis	sztucznej ;	sekwencji:	GTLA4Ig
<4C0> 13
atgggtgtac	tgctcacaca	gaggacgctg	ctcagtctgg	tccttgcact	cctgtttcca	63
agcatggcga	gcatggcaat	gcacgtggcc	cagcctgctg	tggtactggc	cagcagccga	120
ggcatcgcta	gctctgcgtg	tgagtatgca	tctccaggca	aagccactga	gg·. ..cg ^g.g	130
acagtgcttc	ggcaggctga	cagccaggtg	actgaagtct	gtgcggcaac	ctacatgatg	243
gggaatgagt	tgaccttcct	agatgattcc	atctgcacgg	gcacctccag	tggaaatcaa	3 A J
gtgaacctca	ctatccaagg	actgagggcc	atggacacgg	gactctacat	ctgcaaggtg	350
gagctcatgt	acccaccgcc	atactacctg	ggcataggca	acggaaccca	gatttatgta	420
attgatccag	aaccgtgccc	agattctgat	caggagccca	aatcttctg3	caaaactcac	430
acatccccac	cgtccccagc	acctgaactc	ctgggtggat	cgtcagtctt	cctcttcccc	540
ccaaaaccca	aggacaccct	catgatctcc	cggacccctg	aggtcacatg	cgtggtggtg	500
gacgtgagcc	acgaagaccc	tgaggtcaag	ttcaactggt	acgtggacgg	cgtggaggtg	650
cataatgcca	agacaaagcc	gcgggaggag	cagtacaaca	gcacgtaccg	ggtggtcagc	7 20
gtcctcaccg	tcctgcacca	ggactggctg	aatggcaagg	agtacaagtg	caaggtctcc	730
aacaaagccc	tcccagcccc	catcgagaaa	accatctcca	aagccaaagg	gcagccccga	940
gaaccacagg	tgtacaccct	gcccccatcc	cgggatgagc	tgaccaagaa	ccaggtcagc	90C
ctgacctgcc	tggtcaaagg	cttctatccc	agcgacatcg	ccgtggagtg	ggagagcaat	953
gggcagccgg	agaacaacta	caagaccacg	cctcccgtgc	tggactccga	cggctccttc	1020
ttcctctaca	gcaagctcac	cgtggacaag	agcaggtggc	agcaggggaa	cgtcttctca	1030
tgctccgtga	tgcatgaggc	tctgcacaac	cactacacgc	agaagagcct	ctccctgtct	1140
ccgggtaaat	ga					1152

<210 19 <211> 333 <212> PRT <2L3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4I-;

<400> 19

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg

Thr

Len 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Len

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

7al

Val

Leu

Ala

Sar

Arg

Giy

Ile

Ala

Ser

Phe

Vai

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Vai

Arg

Vai

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

vai

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

55

70

75

30

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

35

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Tb r

Ile

Gin

Giy

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

ICO

105

110

Thr

Giy

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Vai

Glu

Lęu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Len

Gly

Ile

Gly

Asn

Giy

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

150

Thr

Sar

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Len

Gly

Ser

Val

165

• 7

175

PL 212 205 B1

Phe

Pro 130

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp 135

Thr

Lau

Ms Z

“ ] a

Ser 190

Arg Thr

Ρ'Ο

Glu

'Za i

Thr

Cys

Val

'Za i

'Zal

A3p

vai

Ser

His

Glu

Asp

Pro Glu

195

200

205

Vai

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

'Zal

Asp

t

Val

Glu

'Zal

His

Asn

Ala Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Zal

zal Sar

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Lau

His

Gin

A3p

Trp

Leu

Asn

Giy

Lys

Glu

Tyr Lys

245

250

255

-ys

Lys

Val

Sar

Asn

Lys

Alą

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr lis

260

255

270

Sar

Lys

Ala

Ly3

Giy

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

ΤΪ12Γ

Leu Pro

275

230

235

Pro

Sar

Arg

Asp

Glu

Lau

Thr

Lys

Α3Γ-

Gin

Val

Sar

Leu

Thr

Cy3 Leu

290

295

300

'Zal

Lys

Giy

Phe

Tyr

Pro

Ser

ASp

Ile

Ala

Vai

Glu

Trp

Glu

Ser Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Ęro

Glu

Asn

Tyr

Ly3

Thr

Pro

'Zal

Lau

Aso Ser

325

330

335

Asp

Gly

Sar

Pha

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Sar Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Α3Π

Val

Pha

Ser

Cys

Ser

Vai

Met

His

Glu

Ala Lau

355

350

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Giy

Lys

370

375

33 0

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4, która wiąże się z cząsteczką B7, i która to rozpuszczalna zmutowana cząsteczka CTLA4 zawiera pierwszą mutację w pozycji +104 CTLA4, przy czym leucyna w pozycji +104 jak pokazano na Fig. 23 jest podstawiona kwasem glutaminowym oraz drugą mutację w pozycji +29 CTLA4, przy czym alanina w pozycji +29 jak pokazano na Fig. 23 jest podstawiona tyrozyną, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby reumatycznej.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że rozpuszczalną zmutowaną cząsteczkę

CTLA4 stanowi L104EA29YIg.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że L104EA29YIg rozpoczyna się metioniną w pozycji +1 a kończy się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 19.
4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że L104EA29YIg rozpoczyna się alaniną w pozycji -1 a kończy się lizyną w pozycji +357 jak pokazano na Fig. 19.
5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że L104EA29YIg kodowana jest przez sekwencję DNA oznaczoną numerem ATCC PTA-2104.
6. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że chorobę reumatyczną stanowi reumatoidalne zapalenie stawów.
7. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że kompozycja jest użyteczna do łagodzenia objawu związanego z chorobą reumatyczną wybranego z grupy składającej się z opuchnięcia stawu, bólu, tkliwości, sztywności porannej, uszkodzenia strukturalnego, podwyższonego poziomu białka C-reaktywnego w surowicy, podwyższonego poziomu rozpuszczalnej IL-2r, podwyższonego poziomu rozpuszczalnej ICAM-1, podwyższonego poziomu rozpuszczalnej E-selektyny i podwyższonej szybkości sedymentacji erytrocytów.
8. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeznaczona jest do miejscowego lub układowego podawania tych środków.
9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że podawanie wybrane jest z grupy składającej się z podawania dożylnego, domięśniowego, podskórnego, wszczepialnej pompy, wlewu ciągłego, terapii genowej oraz podawania z użyciem liposomów i podawania doustnego.
10. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeznaczone jest do podawania rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości pomiędzy około 0,5 a 100 mg/kg masy ciała podmiotu.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeznaczone jest do podawania podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości 0,5 mg/kg masy ciała podmiotu.
12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeznaczone jest do podawania podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości 2 mg/kg masy ciała podmiotu.
13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że przeznaczone jest do podawania podmiotowi rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4 w ilości 10 mg/kg masy ciała podmiotu.
14. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeznaczone jest do leczenia podmiotu wybranego z grupy składającej się z człowieka, małpy, małpy człekokształtnej, psa, kota, krowy, konia, królika, myszy i szczura.
15. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że przeznaczone jest do indukowania zmiany patofizjologicznej związanej z chorobą reumatyczną.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że zmianę patofizjologiczną związaną z chorobą reumatyczną stanowi zmniejszone uszkodzenie strukturalne.
17. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje ponadto drugi środek wybrany z grupy składającej się z kortykosteroidów, niesteroidowych leków przeciwzapalnych, cyklosporyny, prednizonu, azatiopryny, metotreksatu, blokerów lub antagonistów TNFa, infliksimabu, dowolnego środka biologicznego, którego celem jest cytokina zapalna, hydroksychlorochiny, sulfasalazopiryny, soli złota, etanerceptu i anakinry.