PL207534B1

PL207534B1 - Zastosowania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4

Info

Publication number: PL207534B1
Application number: PL365942A
Authority: PL
Inventors: Robert Cohen; Suzette Carr; David Hagerty; Robert J. Peach; Jean-Claude Becker
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2001-07-02
Publication date: 2010-12-31
Also published as: EP1372696B1; SK17742002A3; HRP20030071A2; CY2008017I1; YU101102A; HUS1000008I1; RU2287340C2; EP1935427A2; HRP20030071B1; EP1935427A3; CY1120577T1; US7455835B2; IL153593A0; WO2002002638A3; KR20080075564A; LT2003002A; SK287940B6; ATE401909T1; BR0112104A; KR100895552B1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są zastosowania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 zawierającej zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki CTLA4 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia podmiotu z reumatoidalnym zapaleniem stawów, do zmniejszania lub profilaktyki uszkodzenia strukturalnego w chorobie reumatycznej oraz zastosowanie takiej cząsteczki w kombinacji z drugim środkiem.

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy generalnie dziedziny chorób reumatycznych. Konkretnie, wynalazek dotyczy zastosowań rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 w leczeniu chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, poprzez podawanie osobnikowi skutecznej ilości rozpuszczalnych zmutowanych cząsteczek CTLA4.

Tło wynalazku

Nie ma obecnie sposobu na wyleczenie chorób reumatycznych. Czynniki terapeutyczne są raczej stosowane dla leczenia objawów. Typowo, czynniki terapeutyczne podaje się przez dłuższy okres czasu, a wartość terapeutyczna jest często zmniejszana przez szkodliwe efekty uboczne.

Choroby reumatyczne obejmują grupę chorób, które atakują tkanki mięśniowo-szkieletowe lub tkankę łączną organizmu. Choroby te cechują się przewlekłym zapaleniem i często prowadzą do trwałego uszkodzenia tkanki, deformacji, atrofii i niepełnosprawności. Choroby reumatyczne atakują stawy, kość, tkankę miękką lub rdzeń kręgowy (Mathies, H. 1983 Rheuma) i są klasyfikowane jako ostry gościec stawowy, gościec zwyrodnieniowy, gościec pozastawowy lub choroby kolagenowe. Wiadomo, że niektóre choroby reumatyczne są chorobami autoimmunologicznymi powodowanymi przez zmienioną odpowiedź immunologiczną osobnika.

Reumatoidalne zapalenie stawów to postępująca choroba reumatyczna, dotykająca około 2% populacji dorosłych w krajach rozwiniętych (Utsinger, P. D., i wsp., 1985 Rheumatoid Arthritis, str. 140). Choroba ta cechuje się utrzymującym się zapaleniem błony maziowej, które powoduje zniszczenie chrząstki i erozję kości, prowadząc do deformacji stawów obwodowych. Objawy związane z reumatoidalnym zapaleniem stawów obejmują opuchliznę stawów, tkliwość stawów, zapalenie, sztywność poranną i ból, szczególnie przy zginaniu. Osoby w zaawansowanych stadiach zapalenia stawów cierpią z powodu uszkodzenia strukturalnego, włączając w to zniszczenie stawu i erozję kości (w „Principals of Internal Medicine, Harrison, wydanie 13, strony 1648-1655). Ponadto, pacjenci mogą wykazywać inne objawy kliniczne różnych uszkodzeń narządów, włączając w to uszkodzenia skóry, nerek, serca, płuc, centralnego układu nerwowego i oczu na skutek zapalenia naczyń związanego z procesem autoimmunologicznym.

Inne objawy, które korelują z reumatoidalnym zapaleniem stawów obejmują zwiększoną szybkość sedymentacji erytrocytów i zwiększone poziomy białka C-reaktywnego w surowicy (CRP) i/lub rozpuszczalnego receptora IL-2 (IL-2r). Szybkość sedymentacji erytrocytów jest zwiększona u prawie wszystkich pacjentów z aktywnym reumatoidalnym zapaleniem stawów. Poziom białka C-reaktywnego w surowicy jest również zwiększony i koreluje z aktywnością choroby i prawdopodobieństwem postę pującego uszkodzenia stawów. Dodatkowo, poziom rozpuszczalnej IL-2r, produktu aktywowanych komórek T, jest podwyższony w surowicy krwi i płynie maziówkowym pacjentów z aktywnym reumatoidalnym zapaleniem stawów (patrz: „Principals of Internal Medicine, Harrison, wydanie 13, strona 1650).

Uważa się, że reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą autoimmunologiczną, w której pośredniczą komórki T, obejmującą niespecyficzne wobec antygenu międzykomórkowe oddziaływania między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Generalnie, wielkość odpowiedzi komórek T jest zdeterminowana przez odpowiedź kostymulującą wzbudzaną przez oddziaływanie pomiędzy powierzchniowymi cząsteczkami komórek T i ich ligandami (Mueller i wsp., 1989 Ann. Rev. Immunol. 7: 445-480). Kluczowe kostymulujące sygnały są przekazywane przez oddziaływanie pomiędzy powierzchniowymi receptorami komórek T, CD28 i CTLA4, i ich ligandami, takimi jak cząsteczki związane z B7, CD80 (tj. B7-1) i CD86 (tj. B7-2), na komórkach prezentujących antygen (Linsley, P. i Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212).

Aktywacja komórek T w nieobecności kostymulacji prowadzi do anergicznej odpowiedzi komórek T (Schwartz, R. H., 1992 Cell 71: 1065-1068), kiedy układ immunologiczny przestaje odpowiadać na stymulację.

PL 207 534 B1

Ponieważ sądzi się, że reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą autoimmunologiczną, w której poś redniczą komórki T, jedną ze strategii rozwoju nowych czynników do leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów jest identyfikacja cząsteczek, które blokują sygnały kostymulacyjne pomiędzy limfocytami T i komórkami prezentującymi antygen, poprzez blokowanie oddziaływań pomiędzy endogennym CD28 lub CTLA4 a B7. Potencjalne cząsteczki obejmują rozpuszczalne cząsteczki CTLA4, które są tak zmodyfikowane, aby wiązać B7 z wyższą zachłannością (ang. avidity) niż CTLA4 typu dzikiego (sekwencja którego jest pokazana na Fig. 19) lub CD28, blokując w ten sposób sygnały kostymulujące.

Skonstruowano rozpuszczalne postaci CD28 i CTLA4 poprzez połączenie zewnątrzkomórkowych domen typu zmiennego (V) CD28 i CTLA4 z domenami stałymi immunoglobuliny (Ig) z otrzymując CD28Ig i CTLA4Ig. Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa CTLA4Ig jest pokazana na Fig. 20, przy czym białko zaczyna się od metioniny w pozycji +1 lub od alaniny w pozycji -1 i kończy lizyną w pozycji +357. CTLA4Ig wi ąże się zarówno z komórkami CD80-dodatnimi jak i CD86-dodatnimi silniej niż CD28Ig (Linsley, P., i wsp., 1994 Immunity 1: 793-80). Stwierdzono, że wiele zależnych od komórek T odpowiedzi immunologicznych jest blokowanych przez CTLA4Ig zarówno in vitro jak i in vivo. (Linsley, P., i wsp., 1991b, jak wyżej; Linsley, P., i wsp., 1992a Science 257: 792-795; Linsley, P., i wsp., 1992b J. Exp. Med. 176: 1595-1604; Lenschow, D. J., i wsp., 1992 Science 257: 789-792; Tan, P., i wsp., 1992 J. Exp. Med. 177: 165-173; Turka, L. A., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11102-11105).

W celu zmiany powinowactwa wiązania z naturalnymi ligandami, takimi jak B7, fuzyjne rozpuszczalne cząsteczki CTLA4Ig modyfikuje się poprzez mutacje aminokwasów w części CTLA4 cząsteczki. Regiony CTLA4, które po zmutowaniu zmieniają powinowactwo albo zachłanność wiązania ligandów B7 obejmują region determinujący dopasowanie 1 (CDR-1), jak opisano w patentach USA 6090914, 5773253, 5844095; w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA numer seryjny 60/214065; i w Peach i wsp., 1994. J. Exp. Med., 180: 2049-2058) oraz regiony podobne do regionu determinującego dopasowanie 3 (CDR-3) (CDR-3 to konserwowany region zewnątrzkomórkowej domeny CTLA4, jak opisano w patentach USA 6090914, 5773253 i 5844095; w rozpatrywanym jednocześnie zgłoszeniu patentowym USA numer seryjny 60/214, 065; i w Peach, R. J., i wsp., J Exp. Med. 1994 180: 2049-2058. Region CDR-3-podobny obejmuje region CDR-3 i rozciąga się na kilka aminokwasów przed i/lub za motywem CDR-3. Region CDR-3- podobny zawiera heksapeptydowy motyw MYPPPY, który jest wysoce konserwowany u wszystkich członków rodziny CD28 i CTLA4. Skaningowa mutageneza alaninowa na obszarze motywu heksapeptydowego w CTLA4 i w wybranych resztach w CD28Ig zmniejszała albo znosiła wiązanie z CD80 (Peach, R. J., i wsp. J. Exp. Med. 1994 180: 2049-2058).

Dokonano dalszych modyfikacji w rozpuszczalnych cząsteczkach CTLA4Ig poprzez wymianę homologicznych regionów CTLA4 i CD28. Te chimerowe homologiczne zmutowane cząsteczki CTLA4/CD28 zidentyfikowały heksapeptydowy motyw MYPPPY wspólny dla CTLA4 i CD28, jak również pewne niekonserwowane reszty aminokwasowe w CDR-1- i CDR-3- podobnych regionach CTLA4, jako regiony odpowiedzialne za zwiększenie zachłanności wiązania CTLA4 z CD80 (Peach, R. J., i wsp., 1994 J. Exp. Med. 180: 2049-2058).

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4, takie jak CTLA4Ig, zmutowane cząsteczki CTLA4 lub chimerowe homologiczne mutanty CTLA4/CD28 jak opisano powyżej, wprowadzają nową grupę leków terapeutycznych do leczenia chorób reumatycznych.

Obecnie stosowane leczenie chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, obejmuje podawanie niespecyficznych cytotoksycznych leków immunosupresyjnych, takich jak metotreksat, cyklofosfamid, azatiopryna, cyklosporyna A oraz blokerów lub antagonistów czynnika martwicy nowotworów-alfa (TNFa). Te leki immunosupresyjne przyhamowują cały układ immunologiczny osobnika, a długoterminowe stosowanie zwiększa ryzyko infekcji. Ponadto, leki te jedynie spowalniają rozwój reumatoidalnego zapalenia stawów, co powoduje jego przyspieszenie po przerwaniu leczenia. Dodatkowo, przedłużające się leczenie tymi niespecyficznymi lekami daje toksyczne efekty uboczne, włączając w to tendencję do rozwoju pewnych nowotworów, niewydolności nerek, supresji szpiku kostnego, zwłóknienia płuc, nowotworów, cukrzycy i zaburzeń czynności wątroby. Leki te ponadto przestają być stopniowo skuteczne po 2-5 latach (Kelley's Textbook of Rheumatology, wydanie 6, strony 1001-1022).

Alternatywnie, czynniki terapeutyczne, które są niespecyficznymi lekami immunosupresyjnymi i przeciwzapalnymi były stosowane do uzyskania złagodzenia objawów. Leki te są zależne od dawki i nie chronią przed postępami choroby. Leki te obejmują związki steroidowe, takie jak prednizon i me4

PL 207 534 B1 tyloprednizolon. Steroidy mają również znaczące toksyczne efekty uboczne związane z ich długoterminowym stosowaniem (Kelley's Textbook of Rheumatology, wyd. 6, strony 829-833).

A zatem obecne leczenie reumatoidalnego zapalenia stawów ma ograniczoną skuteczność, daje znaczące toksyczne efekty uboczne i nie może być stosowane stale przez dłuższe okresy czasu.

A zatem istnieje potrzeba leczenia, które jest skuteczne i silniejsze w leczeniu chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów i pozbawione jest wad konwencjonalnych sposobów i czynników, a którego celem jest patofizjologiczny mechanizm autoimmunologiczny.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 zawierającej zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki CTLA4, przy czym zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 obejmuje aminokwasy pokazane na Fig. 19 rozpoczynające się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończące się kwasem asparaginowym w pozycji +124, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia podmiotu z reumatoidalnym zapaleniem stawów, przy czym podmiot nie odpowiedział na co najmniej jeden przeciwreumatyczny lek modyfikujący przebieg choroby (DMARD).

Korzystnie DMARD stanowi metotreksat, cyklofosfonoamid, azatriopryna, cyklosporyna A albo bloker lub antagonista czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFa).

Korzystnie zastosowanie przeznaczone jest do łagodzenia objawu reumatoidalnego zapalenia stawów.

Korzystniej objaw wybrany jest z grupy składającej się z opuchnięcia stawu, tkliwości stawu, zapalenia, sztywności porannej i bólu.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest do podawania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 w ilości 10 mg/kg masy ciała podmiotu.

Korzystnie rozpuszczalna fuzyjna cząsteczka CTLA4 zawiera region stały immunoglobuliny lub jego część.

Korzystniej rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig.

Jeszcze korzystniej rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig pokazana na Fig. 20 posiadająca sekwencję rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończącą się lizyną w pozycji +357.

Jeszcze korzystniej rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLAIg kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego oznaczoną numerem ATCC 68629.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 zawierającej zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki CTLA4, przy czym zewnątrzkomórkową domena cząsteczki CTLA4 obejmuje aminokwasy pokazane na Fig. 19 rozpoczynające się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończące się kwasem asparaginowym w pozycji +124, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania lub profilaktyki uszkodzenia strukturalnego u podmiotu z chorobą reumatyczną.

Korzystnie uszkodzenie strukturalne stanowi erozja kości lub stawu.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest do podawania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 w ilości pomiędzy 0,5 a 20 mg/kg masy ciała podmiotu.

Korzystnie choroba reumatyczna wybrana jest z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia wielomięśniowego, twardziny skóry, mieszanej choroby tkanki łącznej, gośćca stawowego, ostrego gośćca stawowego, gośćca pozastawowego, chorób kolagenowych, przewlekłego zapalenia wielostawowego, łuszczycy stawowej, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, guzkowego zapalenia tętnic, tocznia rumieniowatego układowego, postępującej twardziny układowej, zespołu bolesnego barku, dny moczanowej, chondrokalcynozy, zapalenia skórno-mięśniowego, gośćca mięśniowego, zapalenia mięśni i stwardnienia mi ęśni.

Korzystniej chorobę reumatyczną stanowi reumatoidalne zapalenie stawów.

Korzystniej rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig.

Jeszcze korzystniej rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę cCTLA4 stanowi CTLA4Ig pokazana na Fig. 20 posiadająca sekwencję rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończącą się lizyną w pozycji +357.

Jeszcze korzystniej rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego oznaczoną numerem ATCC 68629.

PL 207 534 B1

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie pierwszego środka i drugiego środka, przy czym

a) pierwszy środek stanowi rozpuszczalna fuzyjna cząsteczka CTLA4 zawierająca zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki CTLA4, przy czym zewnątrzkomórkowa domena cząsteczki CTLA4 obejmuje aminokwasy pokazane na Fig. 19 rozpoczynające się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a koń czą ce się kwasem asparaginowym w pozycji +124, i

b) drugi środek wybrany jest z grupy składającej się z kortykosteroidów, niesteroidowych leków przeciwzapalnych, prednizonu, azatiopryny, metotreksatu, blokerów albo antagonistów TNFa, hydroksychlorochiny, sulfasalazyny, soli złota, anakinry, cyklofosfamidu i leflunomidu, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby reumatycznej.

Korzystnie bloker lub antagonistę TNFa stanowi infliksimab albo etanercept.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest do sekwencyjnego lub jednoczesnego podawania pierwszego i drugiego środka.

Korzystnie choroba reumatyczna wybrana jest z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia wielomięśniowego, twardziny skóry, mieszanej choroby tkanki łącznej, gośćca stawowego, ostrego gośćca stawowego, gośćca pozastawowego, chorób kolagenowych, przewlekłego zapalenia wielostawowego, łuszczycy stawowej, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, guzkowego zapalenia tętnic, tocznia rumieniowatego układowego, postępującej twardziny układowej, zespołu bolesnego barku, dny moczanowej, chondrokalcynozy, zapalenia skórno-mięśniowego, gośćca mięśniowego, zapalenia mięśni i stwardnienia mięśni.

Korzystniej chorobę reumatyczną stanowi reumatoidalne zapalenie stawów.

Korzystniej rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig.

Zgodnie z wynalazkiem MARD może stanowić metotreksat, cyklofosfamid, azatiopryna, cyklosporyna A albo bloker lub antagonista czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFa).

Zastosowania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 zgodnie z niniejszym wynalazkiem pozwalają w szczególności na złagodzenie objawu reumatoidalnego zapalenia stawów zwłaszcza objawu wybranego z grupy składającej się z opuchlizny stawu, tkliwości stawu, zapalenia, porannej sztywności i bólu.

Zastosowanie pierwszego i drugiego środka zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmuje wytwarzanie kompozycji farmaceutycznej do sekwencyjnego lub jednoczesnego podawania tych środków.

Zastosowania według wynalazku dotyczą leczenia chorób układu immunologicznego poprzez podawanie podmiotowi rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, które wiążą się z cząsteczkami B7 albo komórkami B7-dodatnimi, przez co hamowane jest wiązanie się endogennych cząsteczek B7 z CTLA4 i/lub CD28 na komórkach T. Zgodnie z wynalazkiem rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 obejmuje CTLA4Ig.

Zastosowania według wynalazku dotyczą również hamowania funkcji komórek T, ale bez zmniejszania liczby komórek T, poprzez doprowadzanie do kontaktu komórek B7-dodatnich u ludzi z rozpuszczalną cząsteczką CTLA4. Przykłady rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 obejmują CTLA4Ig.

Zastosowania według wynalazku dotyczą również leczenia (to znaczy łagodzenia objawów) chorób reumatycznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, poprzez podawanie podmiotowi z rozpoznanym reumatoidalnym zapaleniem stawów rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, takich jak CTLA4Ig.

Zastosowania według wynalazku dotyczą także zmniejszania zmian patofizjologicznych związanych z chorobą reumatyczną, takich jak uszkodzenie strukturalne, poprzez podawanie podmiotowi z rozpoznanym reumatoidalnym zapaleniem stawów rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, takich jak CTLA4Ig.

PL 207 534 B1

Krótki opis figur

Fig. 1A: Dane demograficzne grup pacjentów. Dane demograficzne obejmujące płeć, rasę i czas trwania choroby jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 1B: Dane demograficzne grup pacjentów. Dane demograficzne obejmujące płeć, wiek, masę i aktywność choroby ocenione przez pacjenta i przez lekarza jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 1C: Dane demograficzne grup pacjentów jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej. Dane demograficzne obejmujące aktywność choroby, szybkości sedymentacji erytrocytów (ESR), funkcje fizyczne (niepełnosprawność oceniana przy użyciu kwestionariusza zdrowia) i białko C-reaktywne (CRP).

Fig. 1D: Dane demograficzne grup pacjentów jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej. Dane demograficzne obejmujące opuchliznę stawów, tkliwość stawów, sztywność poranną i ból.

Fig. 1E: Dane demograficzne grup pacjentów jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej. Dane demograficzne obejmujące wcześniejsze leczenie.

Fig. 2: Zestawienie przerwania w 85 dniu z powodów opisanych tu w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 3A: Odpowiedzi ACR w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: odpowiedzi ACR-20, -50, i -70.

Fig. 3B: Odpowiedzi ACR-20 w dniu 85, włączając w to odpowiedź placebo, jak tu opisano w Przykł adzie 2, poniż ej: odpowiedź ACR-20 z 95% poziomem ufnoś ci.

Fig. 3C: Odpowiedzi ACR-20 w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: różnice w odpowiedzi ACR-20 w odniesieniu do 95% przedziałów ufności.

Fig. 4A: Podstawowe odpowiedzi kliniczne (20% poprawa) pod względem opuchlizny stawów i tkliwoś ci stawów u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykł adzie 2, poniż ej: podstawowa odpowiedź kliniczna, ACR-20.

Fig. 4B: Odpowiedzi kliniczne (odsetek poprawy) pod względem opuchlizny stawów i tkliwości stawów u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: zmiana w odpowiedzi klinicznej w procentach poprawy.

Fig. 5A: Odpowiedź bólowa (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: zmiany oceny punktowej bólu w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 5B: Ogólne zmiany choroby w opinii pacjenta (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: ogólne zmiany aktywności choroby w opinii pacjenta.

Fig. 5C: Ogólne zmiany choroby w opinii lekarza (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: ogólne zmiany aktywności choroby w opinii lekarza.

Fig. 5D: Ból (przy użyciu skali Likerta jako średnia jednostkowa zmiana w stosunku do linii odniesienia) u odsetka pacjentów w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: zmiany bólu w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 6A: Ogólna ocena przez pacjenta zmiany aktywności choroby w stosunku do linii odniesienia w zakresie 2 jednostek w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: zwiększenie aktywności choroby.

Fig. 6B: Ogólna ocena przez lekarza zmiany aktywności choroby w stosunku do linii odniesienia w zakresie 2 jednostek w dniu 85 jak tu opisano w Przykł adzie 2, poniż ej: zwię kszenie aktywności choroby.

Fig. 7A: Procentowa redukcja poziomów białka C-reaktywnego (CRP) w dniu 85 jak tu opisano w Przykł adzie 2, poniż ej: procent redukcji poziomów CRP w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 7B: Różnice w redukcji poziomów białka C-10 reaktywnego (CRP) w dniu 85 jak tu opisano w Przykł adzie 2, poniż ej: procent redukcji poziomów CRP z 95% poziomem ufno ś ci.

Fig. 7C: Średnie obniżenie poziomów białka C-reaktywnego (CRP) w dniu 85 jak tu opisano w Przykł adzie 2, poniż ej: ś rednia zmiana wzglę dem linii odniesienia.

Fig. 8: Obniżenie poziomów rozpuszczalnego receptora IL-2, średnia zmiana względem linii odniesienia w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 9A: Wpływ CTLA4Ig na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

PL 207 534 B1

Fig. 9B: Wpływ CTLA4Ig na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 10A : Wpływ CTLA4Ig na opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 10B: Wpływ CTLA4Ig na opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 11: Wpływ CTLA4Ig na ocenę bólu, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 12A: Wpływ CTLA4Ig na ocenę aktywności choroby przez pacjenta, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 12B: Wpływ CTLA4Ig na ocenę aktywności choroby przez lekarza, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 13A: Wpływ L104EA29YIg na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 13B: Wpływ L104EA29YIg na tkliwość stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 14A: Wpływ L104EA29YIg on opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: mediana różnicy w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 14B: Wpływ L104EA29YIg on opuchliznę stawów w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 15: Wpływ L104EA29YIg ocenę bólu w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej: średnia różnica w stosunku do linii odniesienia.

Fig. 16A: Wpływ L104EA29YIg na ocenę aktywności choroby przez pacjenta, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 16B: Wpływ L104EA29YIg na ocenę aktywności choroby przez lekarza, średnia różnica w stosunku do linii odniesienia w czasie jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 17: Procent poprawy niepełnosprawności pacjenta oceniony przy pomocy kwestionariusza Health Assessment Questionnaire (HAQ) w porównaniu do linii odniesienia w dniu 85 dla leczenia CTLA4Ig i L104EA29YIg jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Fig. 18: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa L104EA29YIg (SEK ID NR: 8-9) jak tu opisano w Przykładzie 1.

Fig. 19: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa receptora CTLA4 (SEK ID NR: 16-17),

Fig. 20: Sekwencja nukleotydowa i aminokwasowa CTLA4Ig (SEK ID NR: 18-19).

Fig. 21: Żel SDS (Fig. 21A) dla CTLA4Ig (ścieżka 1), L104EIg (ścieżka 2) i L104EA29YIg (ścieżka 3A) oraz chromatogramy z sączenia molekularnego CTLA4Ig (Fig. 21B) i L104EA29YIg (Fig. 21C).

Fig. 22A i 22B: Obniżenie poziomów rozpuszczalnej ICAM-1 i rozpuszczalnej E-selektyny, średnia zmiana względem linii odniesienia w dniu 85 jak tu opisano w Przykładzie 2, poniżej.

Szczegółowy opis wynalazku

Definicje

Wszystkie terminy naukowe i techniczne stosowane w tym zgłoszeniu mają znaczenia powszechnie używane w tej dziedzinie, chyba, że zaznaczono inaczej. Stosowane w tym zgłoszeniu poniższe słowa lub wyrażenia mają wyszczególnione znaczenia.

Stosowany tutaj termin „ligand oznacza cząsteczkę, która specyficznie rozpoznaje i wiąże inną cząsteczkę, na przykład ligandem dla CTLA4 jest cząsteczka B7.

Stosowany tutaj termin „CTLA4 typu dzikiego lub „niezmutowany CTLA4 oznacza cząsteczkę, która posiada sekwencję aminokwasową naturalnie występującego CTLA4 o pełnej długości, jak pokazano na Fig. 19 (także opisanego w patentach USA nr 5434131, 5844095, 5851795) lub dowolną jego część lub pochodną, która rozpoznaje i wiąże B7 lub oddziałuje z B7 w taki sposób, że blokuje wiązanie do CD28 i/lub CTLA4 (np. endogenny CD28 i/lub CTLA4). W poszczególnych wykonaniach zewnątrzkomórkową domeną CTLA4 typu dzikiego zaczyna się od metioniny w pozycji +1 i kończy się na kwasie asparaginowym w pozycji +124 lub zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 typu dzikiego zaczyna się od alaniny w pozycji -1 i kończy się na kwasie asparaginowym w pozycji +124. CTLA4 typu dzikiego jest białkiem występującym na powierzchni komórki i posiadającym N-końcową domenę zewnątrzkomórkową, domenę transbłonową oraz C-końcową domenę cytoplazmatyczną. Domena zewnątrzkomórkowa wiąże się do docelowych cząsteczek, takich jak cząsteczka B7. W komórce natu8

PL 207 534 B1 ralnie występujące białko CTLA4 typu dzikiego ulega translacji jako niedojrzały polipeptyd, który zawiera peptyd sygnałowy na końcu N. Niedojrzały polipeptyd ulega obróbce potranslacyjnej, która obejmuje cięcie i usunięcie peptydu sygnałowego w celu wytworzenia produktu cięcia CTLA4 posiadającego nowo utworzony koniec N, który różni się od końca N formy niedojrzałej. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że może wystąpić dodatkowa obróbka potranslacyjna, która usuwa jeden lub większą liczbę aminokwasów z nowo utworzonego końca N produktu cięcia CTLA4. Alternatywnie, peptyd sygnałowy może nie być usunięty całkowicie, generując cząsteczki, które zaczynają się przed zazwyczaj występującym aminokwasem początkowym, metionina. Tak więc, dojrzałe białko CTLA4 może zaczynać się od metioniny w pozycji +1 lub alaniny w pozycji -1. Dojrzała forma cząsteczki CTLA4 obejmuje domenę zewnątrzkomórkową lub dowolny jej fragment, który wiąże się z B7.

„CTLA4Ig jest rozpuszczalnym białkiem fuzyjnym zawierającym domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 typu dzikiego przyłączoną do końca Ig, lub jego fragmentem wiążącym B7. Specyficzne wykonanie obejmuje domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 typu dzikiego (jak pokazano jak Fig. 19) zaczynającą się od metioniny w pozycji +1 a kończącą kwasem asparaginowym w pozycji +124; lub zaczynającą się alaniną w pozycji -1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124; łącznikową resztę aminokwasową glutaminę, w pozycji +125; oraz fragment immunoglobuliny obejmujący kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357 (DNA kodujący CTLA4Ig został zdeponowany 31 maja 1991 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim i uzyskał numer dostępu ATCC 68629; Linsley, P., i wsp., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, linia komórkowa Jajników Chomika Chińskiego (CHO) z ekspresją CTLA4Ig została zdeponowana 31 maja 1991 z numerem identyfikacyjnym ATCC CRL-10762). Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4Ig używane w sposobach i/lub zestawach tu opisanych mogą, ale nie koniecznie, zawierać sekwencję peptydu sygnałowego (liderowego). Typowo w sposobach i/lub zestawach tu opisanych, cząsteczki nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

„L104EA29YIg jest białkiem fuzyjnym, które jest rozpuszczalną zmutowaną cząsteczką CTLA4 zawierającą domenę zewnątrzkomórkową CTLA4 typu dzikiego ze zmianami aminokwasów A29Y (reszta aminokwasowa tyrozyny podstawiona za alaninę w pozycji 29) i L104E (reszta aminokwasowa kwasu glutaminowego podstawiona za leucynę w pozycji +104) lub jej część, która wiąże cząsteczkę B7, przyłączoną do końca Ig (włączoną do Fig. 18; DNA kodujący L104EA29YIg został zdeponowany 20 lipca 2000 z numerem ATCC PTA-2104; także zawarte w zgłoszeniach patentowych USA o numerach seryjnych 09/579927, 60/287576 i 60/214065).

Stosowany tutaj termin „rozpuszczalny odnosi się do dowolnej cząsteczki lub jej fragmentów lub pochodnych nie związanych ani nie przyłączonych do komórki, tj. występujących w krążeniu. Na przykład, CTLA4, B7 lub CD28 mogą być doprowadzone do stanu rozpuszczalnego poprzez przyłączenie fragmentu immunoglobulinowego (Ig) do domeny zewnątrzkomórkowej odpowiednio, CTLA4, B7 lub CD28. Alternatywnie, cząsteczkę, taką jak CTLA4 można uczynić rozpuszczalną przez usunięcie jej domeny transbłonowej. Typowo cząsteczki rozpuszczalne używane w sposobach tu opisanych nie zawierają sekwencji sygnałowej (lub liderowej).

Stosowany tutaj termin „rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 oznacza cząsteczki CTLA4 nie związane z powierzchnią komórki (tj. występujące w krążeniu) lub dowolny funkcjonalny fragment cząsteczki CTLA4, który wiąże B7, włączając w to, nieograniczająco, białka fuzyjne CTLA4Ig (np. ATCC 68629), w których domena zewnątrzkomórkowa CTLA4 jest połączona z fragmentem immunoglobulinowym (Ig) czyniącym cząsteczkę fuzyjną rozpuszczalną, lub ich fragmentów i pochodnych; białka z zewnątrzkomórkową domeną CTLA4 połączoną z fragmentem białka aktywnego biologicznie lub aktywnego chemicznie, takiego jak produkt genu E7 wirusa brodawczaka (CTLA4-E7), antygen p97 związany z czerniakiem (CTLA4-p97) lub białko env wirusa HIV (CTLA4-env gp120), lub ich fragmenty i pochodne; cząsteczki CTLA4 z usuniętą domeną transbłonową w celu uczynienia białka rozpuszczalnym (Oaks, M. K., i wsp., 2000 Cellular Immunology 201:144-153) lub ich fragmenty i pochodne. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 używane w sposobach tu opisanych mogą, ale nie koniecznie, zawierać sekwencję peptydu sygnałowego (liderowego). Typowo w sposobach tu opisanych cząsteczki nie zawierają sekwencji peptydu sygnałowego.

Stosowany tutaj termin „zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 jest częścią CTLA4, która rozpoznaje i wiąże ligandy CTLA4, takie jak cząsteczki B7. Na przykład, zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 zawiera metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124 (Fig. 19). Alternatywnie, zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 obejmuje alaninę w pozycji -1 do kwasu asparaginowego

PL 207 534 B1 w pozycji +124 (Fig. 19). Domena zewną trzkomórkowa obejmuje fragmenty lub pochodne CTLA4, które wiążą cząsteczkę B7.

Stosowany tutaj termin „sekwencja białkowa inna niż CTLA4 lub „cząsteczka inna niż CTLA4 oznacza dowolną cząsteczkę białka, która nie wiąże B7 i nie przeszkadza przy wiązaniu CTLA4 z jego celami. Przykład obejmuje region stały immunoglobuliny (Ig) lub jego części. Dogodnie region stały Ig jest ludzkim lub małpim regionem stałym Ig, np. ludzkim C(gamma)1, włączając zawias, regiony CH2 i CH3. Region stały Ig może być zmutowany w celu zmniejszenia jego funkcji efektorowych (patenty USA 5637481, 5844095 i 5434131).

Stosowany tutaj termin „fragment lub „część jest dowolnym odcinkiem lub segmentem cząsteczki CTLA4, w szczególności zewnątrz komórkowej domeny CTLA4 lub jej odcinka lub segmentu, który rozpoznaje i wiąże jej cel, np. cząsteczkę B7.

Stosowany tutaj termin „B7 dotyczy rodziny cząsteczek B7, włączając B7-1 (CD80), B7-2 (CD86) i B7-3, które mogą rozpoznawać i wiązać się z CTLA4 i/lub CD28.

Stosowany tutaj termin „komórki B7-dodatnie dotyczy dowolnych komórek z ekspresją na ich powierzchni jednego lub większej liczby typów cząsteczek B7.

Stosowany tutaj termin „pochodna dotyczy cząsteczki, która wykazuje homologię sekwencji i aktywność jej cząsteczki wyjściowej. Na przykład, pochodna CTLA4 obejmuje rozpuszczalną cząsteczkę CTLA4 mającą sekwencję aminokwasową podobną przynajmniej w 70% do zewnątrzkomórkowej domeny CTLA4 typu dzikiego, która rozpoznaje i wiąże B7, np. CTLA4Ig.

Stosowany tutaj termin „blokować lub „hamować receptor, sygnał lub cząsteczkę oznacza przeszkadzanie w aktywacji receptora, sygnału lub cząsteczki, przy oznaczaniu testem stosowanym w danej dziedzinie. Na przykład, zablokowanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej moż e być wykrywane przez oznaczanie zmniejszenia objawów związanych z chorobą reumatyczną. Blokowanie lub hamowanie może być częściowe lub całkowite.

Stosowany tutaj termin „blokowanie oddziaływania B7 oznacza przeszkadzanie w wiązaniu B7 z jego ligandami, takimi jak CD28 i/lub CTLA4 prowadzą ce do hamowania oddzia ł ywania komórek T z komórkami B7-dodatnimi. Przykłady czynników, które blokują interakcje B7 obejmują cząsteczki, takie jak przeciwciało (lub jego część lub pochodna), które rozpoznaje i wiąże się z dowolną cząsteczką CTLA4, CD28 lub B7 (np. B7-1, B7-2); rozpuszczalna forma (lub jej część lub pochodna) cząsteczki, takiej jak CTLA4; fragment peptydu lub inna mała cząsteczka zaprojektowana tak, aby interferować z sygnał em komórkowym przez oddziaływanie za poś rednictwem CTLA4/CD28/B7. Zgodnie z wynalazkiem czynnikiem blokującym jest rozpuszczalna cząsteczka CTLA4, taka jak CTLA4Ig (ATCC 68629).

Stosowany tutaj termin „choroba układu immunologicznego oznacza dowolną chorobę, w której pośredniczą oddziaływania komórek T z komórkami B7 dodatnimi, włączając w to choroby autoimmunologiczne, zaburzenia związane z przeszczepami i choroby immunoproliferacyjne. Przykłady chorób układu immunologicznego obejmują chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) (np. taką, która może pojawić się po przeszczepie szpiku kostnego lub przy wzbudzaniu tolerancji), choroby immunologiczne związane z odrzuceniem przeszczepu, przewlekłym odrzuceniem oraz tkankowymi lub komórkowymi przeszczepami allo- lub ksenogenicznymi, włączając w to narządy lite, skórę, wysepki trzustkowe, mięśnie, hepatocyty, neurony. Przykłady chorób immunoproliferacyjnych obejmują łuszczycę, chłoniaka z komórek T, ostrą białaczkę limfoblastyczną z udziałem komórek T, angiocentrycznego chłoniaka jąder z udziałem komórek T, łagodnego limfocytarnego zapalenia naczyń, tocznia (np. tocznia rumieniowatego, zapalenie nerek w toczniu układowym), zapalenie tarczycy Hashimoto, obrzęk śluzowaty pierwotny, chorobę Gravesa, anemię złośliwą, autoimmunologiczny zanikowy nieżyt żołądka, chorobę Adisona, cukrzycę (np. cukrzycę insulino-zależną, cukrzycę typu I, cukrzycę typu II), zespół dobrego pasterza, miastenię, pęcherzycę, chorobę Crohna, współczulne zapalenie naczyniówki, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka, stwardnienie rozsiane, autoimmunologicznej anemię hemolityczną, małopłytkowość idiopatyczną, pierwotną żółciową marskość wątroby, aktywne przewlekłe zapalenie wątroby, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół Sjogrena, choroby reumatyczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów), zapalenie wielomięśniowe, twardzinę skóry i mieszaną chorobę tkanki łącznej.

Stosowany tutaj termin „choroby reumatyczne oznacza dowolną chorobę, która atakuje stawy, kość, tkankę miękką lub rdzeń kręgowy (Mathies, H. 1983 Rheuma) i obejmuje ostry gościec stawowy, gościec zwyrodnieniowy, gościec pozastawowy i choroby kolagenowe. Ponadto choroby reumatyczne obejmują przewlekłe zapalenie wielostawowe, postępujący gościec przewlekły, łuszczycę stawową,

PL 207 534 B1 zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, reumatoidalne zapalenie stawów, uogólnione guzkowate zapalenie stawów, układowego tocznia rumieniowatego, postępującą układową twardzinę skóry, zespół bolesnego barku, dnawe zapalenie stawów, chondrokalcynoza, zapalenie skórno-mięśniowe, gościec mięśniowy, zapalenie mięśni i lokalne stwardnienie mięśnia. O niektórych chorobach reumatycznych wiadomo, że są chorobami autoimmunologicznymi powodowanymi przez zmienioną odpowiedź immunologiczną osobnika.

Stosowany tutaj termin „terapia genowa jest procesem leczenia choroby przez manipulację genetyczną w ten sposób, że sekwencja kwasu nukleinowego jest przenoszona do komórki, a następnie w komórce dowolny produkt genetyczny kodowany przez ten kwas nukleinowy ulega ekspresji. Na przykład, jak to jest dobrze znane przez specjalistów w tej dziedzinie, przenoszenie kwasu nukleinowego może być wykonane przez wprowadzenie wektora ekspresyjnego zawierającego kwas nukleinowy będący przedmiotem zainteresowania do komórki ex vivo lub in vitro na wiele sposobów włączając w to, na przykład, precypitację chlorkiem wapnia, dietyloaminoetylodekstranem, glikolem polietylenowym (PEG), elektroporację, bezpośrednie wstrzyknięcie, lipofekcję lub infekcję wirusową (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman and Co, New York, N.Y., 1993) i Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993). Alternatywnie, sekwencje kwasu nukleinowego będącego przedmiotem zainteresowania mogą być przeniesione do komórki in vivo w różnych wektorach i na różne sposoby włączając w to, na przykład, bezpośrednie podanie osobnikowi kwasu nukleinowego (Williams i wsp., 1991 PNAS 88:2726-2730) lub wstawienie kwasu nukleinowego do wektora wirusowego i infekcję osobnika wirusem (Battleman i wsp., 1993 J Neurosci 13:94-951; Carroll i wsp., 1993 J Cell Biochem 17E:241; Lebkowski i wsp., patent USA 5354678; Davison i Elliott, Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)). Inne sposoby stosowane do przeniesienia kwasu nukleinowego in vivo obejmują zamknięcie kwasu nukleinowego w liposomach i bezpośrednie przeniesie do osobnika liposomów lub liposomów połączonych z hemaglutynującym wirusem Sendai (patent USA nr 5824655 włączony tu jako odniesienie). W komórkach transfekowanych lub nastrzyknię tych ulegają ekspresji biał kowe produkty kodowane przez kwas nukleinowy w celu złagodzenia choroby lub objawów choroby.

Aby tu opisywany wynalazek był lepiej zrozumiały przedstawiony jest poniższy opis.

Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje do leczenia chorób układu immunologicznego, takich jak choroby reumatyczne, przez podawanie osobnikowi skutecznej ilości ligandu, który wiąże się z czą steczką B7, na przykł ad rozpuszczalnych czą steczek CTLA4 (takich jak CTLA4Ig), które rozpoznają i wiążą B7. Skuteczna ilość jest zdefiniowana jako ilość rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4, która po związaniu z cząsteczkami B7 na komórkach B7-dodatnich, hamuje wiązanie się cząsteczek B7 z endogennymi ligandami, takimi jak CTLA4 i CD28.

Zastosowania według wynalazku dotyczą leczenia podmiotu z chorobą reumatyczną. Choroby reumatyczne są dowolnymi chorobami, które cechują się (i) zapaleniem lub zwyrodnieniem struktur ciała z tkanki mięśniowo-szkieletowej lub łącznej, w szczególności stawów, i włączając w to mięśnie, ścięgna, chrząstkę, tkanki maziówkowe i włókniste, (ii) z towarzyszącą mu opuchlizną stawów, tkliwością stawów, zapaleniem, sztywnością poranną i/lub bólem lub upośledzeniem poruszania się lub funkcji tych struktur i w pewnych przypadkach (iii) z częstym towarzyszącym mu serologicznym dowodem - czynnikiem reumatoidalnym i innymi zastępczymi znacznikami zapalenia.

Choroby reumatyczne obejmują reumatoidalne zapalenie stawów. Objawy reumatoidalnego zapalenia stawów obejmują opuchliznę, tkliwość stawów, zapalenie, sztywność poranną i ból prowadzący do niepełnosprawności fizycznej. Pacjenci będący w zaawansowanych stadiach zapalenia stawów cierpią na objawy uszkodzenia strukturalnego i wycieńczający ból. Inne narządy także mogą być upośledzone przez mechanizm autoimmunologiczny.

Kompozycje

Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje do leczenia chorób immunologicznych, takich jak choroby reumatyczne, zawierające rozpuszczalne cząsteczki CTLA4. Ponadto, zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje zawierające czynnik biologiczny, który poprzez kontakt komórek B7-dodatnich z rozpuszczalnym CTLA4 w organizmie człowieka hamuje funkcjonowanie komórek T, ale nie powoduje ubytku komórek T u człowieka. Przykłady rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 obejmują CTLA4Ig.

PL 207 534 B1

Cząsteczki CTLA4 o sekwencjach dzikiego typu mogą być uczynione rozpuszczalnymi przez delecję transbłonowego segmentu CTLA4 (Oaks, M. K., i wsp., 2000 Cellular Immunology 201:144-153).

Opisane tu rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 o sekwencjach dzikiego typu mogą być białkami fuzyjnymi, w których cząsteczki CTLA4 są przyłączone do części innych niż CTLA4, takich jak cząsteczki immunoglobuliny (Ig), które czynią cząsteczki CTLA4 rozpuszczalnymi. Na przykład, białko fuzyjne CTLA4 może zawierać zewnątrzkomórkową domenę CTLA4 połączoną z domeną stałą immunoglobuliny dając w rezultacie cząsteczkę CTLA4Ig (Fig. 20) (Linsley, P. S., i wsp., 1994 Imunity 1:793-80).

W przypadku protokołów klinicznych zaleca się, aby region immunoglobuliny nie wzbudzał szkodliwej odpowiedzi immunologicznej u osobnika. Zalecanym ugrupowaniem jest region stały immunoglobuliny, w tym regiony stałe immunoglobulin człowieka i małpy. Jednym z przykładów odpowiedniego regionu immunoglobuliny są ludzkie regiony Cy1, w tym zawias, regiony CH2 i CH3, które mogą pośredniczyć w funkcjach efektorowych, takich jak wiązanie z receptorami Fc, pośrednicząc w cytotoksyczności zależnej od układu dopełniacza (CDC) lub pośrednicząc w cytotoksyczności zależnej od przeciwciał (ADCC). W obrębie ugrupowania immunoglobuliny może występować jedna lub więcej mutacji (np. w domenie CH2 w celu zmniejszenia funkcji efektorowych, takich jak CDC lub ADCC), gdzie mutacja moduluje zdolność wiązania immunoglobuliny z jej ligandem poprzez zwiększenie lub zmniejszenie zdolności wiązania immunoglobuliny do receptorów Fc. Na przykład, mutacje w immunoglobulinie mogą obejmować zmiany w dowolnej lub we wszystkich resztach cysteiny w domenie zawiasowej, na przykład cysteiny w pozycjach +130, +136 i +139 są podstawione przez serynę (Fig. 20). Cząsteczka immunoglobuliny może także zawierać prolinę w pozycji +148 podstawioną seryną, jak pokazano na Fig. 20. Ponadto, mutacje w ugrupowaniu immunoglobuliny mogą obejmować podstawienie leucyny w pozycji +144 fenyloalaniną, leucyny w pozycji +145 kwasem glutaminowym lub glicyny w pozycji +147 alaniną.

Dodatkowe ugrupowania inne niż CTLA4 do zastosowania w rozpuszczalnych cząsteczkach CTLA4 obejmują cząsteczkę p97, cząsteczkę env gp120, cząsteczkę E7 i cząsteczkę ova (Dash, B. i wsp. 1994 J. Gen. Virol. 75(Pt 6):1389-97; Ikeda, T., i wsp. 1994 Gene 138(1-2): 193-6; Falk, K., i wsp. 1993 Cell. Immunol. 150(2):447-52; Fujisaka, K. i wsp. 1994 Virology 204 (2):789-93). Inne cząsteczki są także możliwe (Gerard, C. i wsp. 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R. i wsp. 1989 63(10):4370; Smith, D. i wsp. 1987 Science 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).

Rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 tu opisana może także obejmować sekwencję peptydu sygnałowego przyłączoną do końca N fragmentu CTLA obejmującego domenę zewnątrzkomórkową. Peptyd sygnałowy może być dowolną sekwencją, która pozwoli na sekrecję cząsteczki, włączając peptyd sygnałowy z onkostatyny M (Malik, i wsp., (1989) Molec. Cell. Biol. 9:2847-2853) lub CD5 (Jones, N. H. i wsp., (1986) Nature 323:346-349J), lub peptyd sygnałowy z dowolnego białka zewnątrzkomórkowego.

Rozpuszczalna cząsteczka CTLA4 tu opisana może zawierać peptyd sygnałowy onkostatyny M przyłączony na końcu N domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 oraz cząsteczkę ludzkiej immunoglobuliny (np. region zawiasowy, CH2 i CH3) przyłączoną na końcu C domeny zewnątrzkomórkowej (typu dzikiego lub zmutowanej) CTLA4. Cząsteczka ta zawiera peptyd sygnałowy onkostatyny M obejmujący sekwencję aminokwasową mającą metioninę w pozycji -26 do alaniny w pozycji -1, część CTLA4 obejmującą sekwencję aminokwasową mającą metioninę w pozycji +1 do kwasu asparaginowego w pozycji +124, łącznikową resztę aminokwasową glutaminę w pozycji +125 oraz część immunoglobulinową obejmującą sekwencję aminokwasową mającą kwas glutaminowy w pozycji +126 do lizyny w pozycji +357.

Zalecanymi wykonaniami są rozpuszczalne cząsteczki CTLA4, takie jak CTLA4Ig (jak pokazano na Fig. 20, rozpoczynające się od metioniny w pozycji +1, a kończące się na lizynie w pozycji +357), Zgodnie z wynalazkiem opisano ponadto cząsteczki kwasu nukleinowego zawierające sekwencje nukleotydowe kodujące sekwencje aminokwasowe odpowiadające rozpuszczalnym cząsteczkom CTLA4 tu opisanym. W jednym z wykonań, cząsteczką kwasu nukleinowego jest DNA (np. cDNA) albo jego hybryda. DNA kodujący CTLA4Ig (Fig. 20) zdeponowano 31 maja, 1991 w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 i przypisano mu numer dostępu ATCC, ATCC 68629. Alternatywnie, cząsteczkami kwasu nukleinowego są RNA albo ich hybrydy.

PL 207 534 B1

Dodatkowo, zgodnie z wynalazkiem opisano wektor, który zawiera opisane tu sekwencje nukleotydowe. Przykłady wektorów ekspresyjnych obejmują wektory dla ssaczych komórek gospodarza (np. BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); wektory pVPakc, wektory pCMV, wektory pSG5 (Stratagene)), wektory retrowirusowe (np. wektory pFB (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) lub ich zmodyfikowane postaci, wektory adenowirusowe; wektory związane z adenowirusami, wektory bakulowirusowe, wektory drożdżowe (np. wektory pESC (Stratagene)).

Opisano również wektorowy układ gospodarza. Wektorowy układ gospodarza zawiera wektor tu opisany w odpowiedniej komórce gospodarza. Przykłady odpowiednich komórek gospodarza obejmują komórki prokariotyczne i eukariotyczne. Zgodnie z realizacją wynalazku, komórki eukariotyczne są również odpowiednimi komórkami gospodarza. Przykłady komórek eukariotycznych obejmują dowolną komórkę zwierzęcą, czy to pierwotną czy unieśmiertelnioną, drożdżową (np. Saccharomyces ceravisiea, Schizosaccharomyces pombe i Pichia pastoris) oraz komórkę roślinną. Komórki szpiczaka, COS i CHO są przykładami komórek zwierzęcych, które można użyć jako gospodarzy. Konkretne komórki CHO obejmują DG44 (Chasin, i wsp., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC nr CCL-61), linię komórek CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO oznaczone jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO klon B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF oznaczony ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) i RR-CHOKl oznaczony ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Przykładowe komórki roślinne obejmują tytoń (całe rośliny, hodowlę komórkową lub kalus), komórki kukurydzy, soi i ryżu. Dopuszczalne są również nasiona kukurydzy, soi i ryżu.

Zgodnie z wynalazkiem opisano kompozycje farmaceutyczne do zastosowania w leczeniu chorób układu immunologicznego zawierające skuteczne farmaceutycznie ilości rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4. W pewnych wykonaniach w chorobach układu immunologicznego pośredniczą oddziaływania CD28/CTLA4/B7. Rozpuszczalnymi cząsteczkami CTLA4 są rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 o sekwencjach typu dzikiego. Kompozycje farmaceutyczne mogą zawierać rozpuszczalne czą steczki białka CTLA4 i/lub rozpuszczalne cząsteczki kwasów nukleinowych CTLA4 i/lub wektory kodujące te cząsteczki. W zalecanych wykonaniach rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 mają sekwencję aminokwasową domeny zewnątrzkomórkowej CTLA4 jak pokazano na Fig. 20 (CTLA4Ig). Kompozycje mogą zawierać dodatkowo inne czynniki terapeutyczne, w tym leki-toksyny, enzymy, przeciwciała lub koniugaty.

Zgodnie ze standardową praktyką w tej dziedzinie, opisano kompozycje farmaceutyczne zawierające cząsteczki tu opisane zmieszane z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem albo adiuwantem, znanym specjalistom w tej dziedzinie. Zalecane kompozycje farmaceutyczne zawierają odpowiednie nośniki i adiuwanty, które obejmują dowolny materiał, który w połączeniu z cząsteczką tu opisaną (np. rozpuszczalną cząsteczką CTLA4, taką jak CTLA4Ig) zachowuje aktywność cząsteczki i nie wykazuje reakcji z układem immunologicznym gospodarza. Te nośniki i adiuwanty obejmują wymieniacze jonowe, tlenek glinu, stearynian glinu, lektynę, białka surowicze, takie jak albumina surowicy ludzkiej, substancje buforujące, takie jak fosforany, glicyna, kwas sorbowy, sorbinian potasowy, mieszaniny częściowych glicerydów nasyconych roślinnych kwasów tłuszczowych, roztwory soli fizjologicznej buforowane fosforanem, wodę, emulsje (np. emulsja olej/woda), sole lub elektrolity, takie jak siarczan protaminy, wodorofosforan disodowy, wodorofosforan potasowy, chlorek sodowy, sole cynku, krzemionkę koloidalną, trikrzemian magnezowy, poliwinylopirolidon, substancje oparte na celulozie i glikol polietylenowy. Inne nośniki mogą również obejmować sterylne roztwory, tabletki, włączając w to tabletki powlekane i kapsułki. Typowo, takie nośniki zawierają zaróbki, takie jak skrobia, mleko, cukier (np. sacharoza, glukoza, maltoza), pewne typy gliny, żelatyna, kwas stearynowy, lub jego sole, stearynian magnezowy lub wapniowy, talk, tłuszcze lub oleje roślinne, gumy, glikole lub inne znane zaróbki. Takie nośniki mogą również zawierać dodatki smakowe lub barwne i inne składniki. Kompozycje zawierające takie nośniki są wytwarzane konwencjonalnymi sposobami dobrze znanymi w tej dziedzinie. Takie kompozycje można również preparować w różne kompozycje lipidowe, takie jak na przykład, liposomy, jak również w różne kompozycje polimerowe, takie jak mikrosfery.

Zastosowania

Zastosowania według wynalazku dotyczą regulowania funkcjonalnych oddziaływań komórek CTLA4- i CD28-dodatnich z komórkami B7-dodatnimi. Obejmuje to doprowadzanie do kontaktu komórek B7-dodatnich z rozpuszczalną cząsteczką CTLA4 tu opisaną w celu utworzenia rozpuszczalnych

PL 207 534 B1 kompleksów CTLA4/B7, które to kompleksy zakłócają reakcję endogennej cząsteczki CTLA4 i/lub CD28 z cząsteczką B7.

Zastosowania według wynalazku dotyczą również hamowania funkcji komórek T, ale nie usuwania komórek T, u ludzi poprzez doprowadzanie do kontaktu komórek B7 z rozpuszczalną cząsteczką CTLA4 tu opisaną. Przykłady rozpuszczalnej cząsteczki CTLA4 obejmują CTLA4Ig.

Zastosowania według wynalazku dotyczą ponadto leczenia chorób układu immunologicznego, takich jak choroby reumatyczne. Obejmuje to podawanie osobnikowi kompozycji terapeutycznej zawierającej rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane w ilości skutecznej do złagodzenia co najmniej jednego z objawów związanych z chorobami układu immunologicznego. Dodatkowo, wynalazek może dostarczać długoterminowej terapii chorób układu immunologicznego poprzez blokowanie oddziaływań komórki T/komórki B7-dodatniej, blokując w ten sposób stymulację komórek T przez sygnały kostymulacyjne, takie jak wiązanie się B7 z CD28, prowadząc do indukcji anergii lub tolerancji komórek T. Choroby układu immunologicznego odejmują choroby autoimmunologiczne, choroby immunoproliferacyjne i zaburzenia związane z przeszczepami. Przykłady chorób układu immunologicznego obejmują reakcję przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) (np. taką, która może pojawić się po przeszczepie szpiku kostnego lub przy wzbudzaniu tolerancji), choroby immunologiczne związane z odrzuceniem przeszczepu, przewlekłym odrzuceniem oraz tkankowymi lub komórkowymi przeszczepami allolub ksenogenicznymi, włączając w to narządy lite, skórę, wysepki trzustkowe, mięśnie, hepatocyty, neurony. Przykłady chorób immunoproliferacyjnych obejmują łuszczycę, chłoniaka z komórek T, ostrą białaczkę limfoblastyczną z udziałem komórek T, angiocentrycznego chłoniaka jąder z udziałem komórek T, łagodnego limfocytarnego zapalenia naczyń, tocznia (np. tocznia rumieniowatego, zapalenie nerek w toczniu układowym), zapalenie tarczycy Hashimoto, obrzęk śluzowaty pierwotny, chorobę Gravesa, anemię złośliwą, autoimmunologiczny zanikowy nieżyt żołądka, chorobę Adisona, cukrzycę (np. cukrzycę insulino-zależną, cukrzycę typu I, cukrzycę typu II), zespół dobrego pasterza, miastenię, pęcherzycę, chorobę Crohna, współczulne zapalenie naczyniówki, autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka, stwardnienie rozsiane, autoimmunologiczną anemię hemolityczną, małopłytkowość idiopatyczną, pierwotną żółciową marskość wątroby, aktywne przewlekłe zapalenie wątroby, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, zespół Sjogrena, choroby reumatyczne (np. reumatoidalne zapalenie stawów), zapalenie wielomięśniowe, twardzinę skóry i mieszaną chorobę tkanki łącznej.

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane wykazują właściwości hamujące in vivo. W warunkach, gdzie oddziaływania komórki T/komórki B7-dodatniej, na przykład oddziaływania komórki T/komórki B zachodzą na skutek kontaktu pomiędzy komórkami T a komórkami B7-dodatnimi, wiązanie się wprowadzonych cząsteczek CTLA4 jako reakcja z komórkami B7- dodatnimi, na przykład komórkami B może przeszkadzać, tj. hamować oddziaływania komórki T/komórki B7-dodatnie prowadząc do regulacji odpowiedzi immunologicznych.

Zastosowania według wynalazku dotyczą także zmniejszania odpowiedzi immunologicznych. Zmniejszanie odpowiedzi immunologicznych przez rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane może nastąpić poprzez hamowanie albo blokowanie odpowiedzi immunologicznych która już trwa albo może obejmować zapobieganie indukcji odpowiedzi immunologicznej. Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane mogą hamować funkcje aktywowanych komórek T, takie jak proliferacja limfocytów T i/lub wydzielanie cytokin poprzez supresję odpowiedzi komórek T lub indukcję tolerancji w komórkach T. Co więcej cząsteczki CTLA4 tu opisane oddziaływujące ze ścieżką CTLA4/CD28/B7 mogą hamować proliferację komórek T i/lub wydzielanie cytokin, a zatem prowadzić do zmniejszonej destrukcji tkanek i indukcji braku odpowiedzi lub anergii komórek T.

Zalecane wykonanie obejmuje leczenie choroby reumatycznej, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, poprzez podawanie osobnikowi skutecznej ilości kompozycji terapeutycznej, co łagodzi u osobnika co najmniej jeden z objawów związanych z chorobą, włączając w to opuchliznę stawów, tkliwość stawów, zapalenie, sztywność poranną i ból oraz uszkodzenia strukturalne prowadzące do niepełnosprawności fizycznej. Wynalazek można również zastosować do łagodzenia co najmniej jednego z objawów związanych z reumatoidalnym zapaleniem stawów, w tym obniżania szybkości sedymentacji erytrocytów, poziomów białka C-reaktywnego, rozpuszczalnego ICAM-1 rozpuszczalnej E-selektyny i/lub rozpuszczalnej IL-2r w surowicy.

Poziom łagodzenia objawów zapewniany przez wynalazek można mierzyć przy zastosowaniu dowolnego z przyjętych kryteriów ustalonych dla mierzenia i dokumentacji łagodzenia objawów w warunkach klinicznych. Przyjęte kryteria dla mierzenia łagodzenia objawów mogę obejmować wyniki oparte na kryteriach ustalonych przez American College of Rheumatology (np. ACR 20), dla czterech

PL 207 534 B1 miar łagodzenia objawów (w „CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-FDA 1988) i kwestionariuszach oceny zdrowia (Health Assessment Ouestionnaire, HAQ) (Fries, J. F., i wsp., 1982 J. of Rheumatology 9: 789-793). Dla ogólnego opisu tych kryteriów patrz „Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheumatoid Arthritis (RA), luty 1999.

Osobniki leczone zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmują ssaki, w tym człowieka, małpę, małpę człekokształtną, psa, kota, krowę, konia, królika, mysz i szczura.

Zgodnie z wynalazkiem opisano różne sposoby, miejscowe albo ogólnoustrojowe, podawania rozpuszczanej cząsteczki CTLA4. Sposoby obejmują metody dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe, doustne, inhalacje i podskórne, jak również wszczepialną pompę, stałe wlewy, terapię genową, liposomy, czopki, kontakt miejscowy, pęcherzyki, kapsułki i iniekcje. Czynnik terapeutyczny, zmieszany z nośnikiem, liofilizuje się zwykle w celu przechowywania i rozpuszcza w wodzie albo buforowanym roztworze o pH obojętnym (pH około 7-8, np. 7,5) przed podaniem.

Zgodnie ze standardową praktyką w tej dziedzinie, kompozycje tu opisane można podawać osobnikowi w dowolnej z akceptowalnych postaci.

Zgodnie z realizacją wynalazku, zastosowania obejmują podawanie osobnikowi rozpuszczanych cząsteczek CTLA4 tu opisanych w celu regulowania funkcjonalnych oddziaływań komórek CTLA4- i CD28-dodatnich z komórkami B7-dodatnimi. Komórki B7-dodatnie doprowadza się do kontaktu ze skuteczną ilością rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 tu opisanych albo ich fragmentów lub pochodnych, tak aby utworzyć rozpuszczalne kompleksy CTLA4/B7. Kompleksy przeszkadzają w oddziaływaniu pomiędzy endogennymi cząsteczkami CTLA4 i CD28 z cząsteczkami z rodziny B7.

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 można podawać osobnikowi w ilości i przez czas (np. długość czasu i/lub ilość razy) wystarczający do blokowania u osobnika endogennych cząsteczek B7, uniemożliwiając wiązanie się ich odpowiednich ligandów. Blokowanie wiązania endogennych ligandów/B7 hamuje oddziaływanie pomiędzy komórkami B7-dodatnimi a komórkami CTLA4- i CD28dodatnimi.

Dawkowanie czynnika terapeutycznego zależy od wielu czynników, w tym między innymi typu dotkniętej tkanki, typu leczonej choroby autoimmunologicznej, ostrości choroby, stanu zdrowia osobnika i odpowiedzi na leczenie tymi czynnikami. A zatem dawka czynnika może wahać się w zależności od danego pacjenta i sposobu podawania. Rozpuszczane cząsteczki CTLA4 można podawać osobnikowi w ilości między 0,1 a 20,0 mg/kg masy ciała pacjenta/dzień, zwłaszcza między 0,5 a 10,0 mg//kg/dzień.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie kompozycji tu opisanej razem z innymi czynnikami farmaceutycznymi w leczeniu chorób układu immunologicznego. Przykładowo, choroby reumatyczne można leczyć cząsteczkami tu opisanymi w połączeniu z immunosupresorami, takimi jak kortykosteroidy, cyklosporyna (Mathiesen 1989 Caocer Lett. 44 (2): 151-156), prednizon, azatioprina, metotreksat (R. Handschumacher, w: „Drugs Used for Immunosuppression strony 1264-1276), blokery lub antagoniści TNFa (New England Journal of Medicine, tom. 340: 253-259,1999; The Lancet tom. 354: 1932-39,1999, Annals of Internal Medicine, tom. 130: 478-486), lub dowolny inny czynnik biologiczny, którego celem jest dowolna zapalna cytokina, niesteroidowe leki przeciwzapalne/inhibitory Cox-2, hydroksychlorokina, sulfasalazopryina, sole złota, etanercept, infliksimab, rapamycyna, mykofenolan mofetylu, azatiopryna, takrolismus, bazyliksimab, cytoksan, interferon beta-1a, interferon beta-1b, octan glatirameru, chlorowodorek mitoksantronu, anakinra i inne czynniki biologiczne.

W celu regulowania odpowiedzi immunologicznej rozpuszczane cząsteczki CTLA4 można również zastosować w połączeniu z jedną albo większą liczbą następujących cząsteczek: rozpuszczalną gp39 (znaną również jako ligand CD40 (CD40L), CD154, T-BAM, TRAP), rozpuszczalną CD29, rozpuszczalną CD40, rozpuszczalną CD80 (np. ATCC 68627), rozpuszczalną CD86, rozpuszczalną CD28 (np. 68628), rozpuszczalną CD56, rozpuszczalną Thy-1, rozpuszczalną CD3, rozpuszczalną TCR, rozpuszczalną VLA-4, rozpuszczalną VCAM-1, rozpuszczalną LECAM-1, rozpuszczalną ELAM-1, rozpuszczalną CD44, przeciwciałami reagującymi z gp39 (np. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 i ATCC HB-12056), przeciwciałami reagującymi z CD40 (np. ATCC HB-9110), przeciwciałami reagującymi z B7 (np. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB11341, itd.), przeciwciałami reagującymi z CD28 (np. ATCC HB-11944 lub mAb 9.3 opisano przez Martin i wsp. (J. Clin. Immun. 4 (1): 18-22,1980), przeciwciałami reagującymi z LFA-1 (np. ATCC HB-9579 i ATCC TIB-213), przeciwciałami reagującymi z LFA-2, przeciwciałami reagującymi z IL-2, przeciwciałami reagującymi z IL-12, przeciwciałami reagującymi z IFN-gamma, przeciwciałami reagującymi

PL 207 534 B1 z CD2, przeciwciał ami reagują cymi z CD48, przeciwciał ami reagują cymi z dowolną ICAM (np. ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 i ICAM-3), przeciwciałami reagującymi z CTLA4 (np. ATCC HB-304), przeciwciałami reagującymi z Thy-1, przeciwciałami reagującymi z CD56, przeciwciałami reagującymi z CD3, przeciwciałami reagującymi z CD29, przeciwciałami reagującymi z TCR, przeciwciałami reagującymi z VLA-4, przeciwciałami reagującymi z VCAM-1, przeciwciałami reagującymi z LECAM-1, przeciwciałami reagującymi z ELAM-1, przeciwciałami reagującymi z CD44. W pewnych wykonaniach zalecane są przeciwciała monoklonalne. W innych wykonaniach zalecane są fragmenty przeciwciała. Co będzie łatwo zrozumiałe przez specjalistę w tej dziedzinie, kombinacja może zawierać rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 tu opisane i inny czynnik immunosupresyjny, rozpuszczalne CTLA4 cząsteczki z dwoma innymi czynnikami immunosupresyjnymi, rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 z trzema innymi czynnikami immunosupresyjnymi, itd. Można ustalić optymalną kombinację i dawkę oraz dokonać optymalizacji stosując metody dobrze znane w tej dziedzinie.

Rozpuszczane cząsteczki CTLA4 tu opisane można podawać jako jedyny czynnik aktywny albo razem z innymi lekami w schematach immunomodulujących albo innymi czynnikami przeciwzapalnymi, np. w celu leczenia albo profilaktyki ostrego lub przewlekłego odrzucania przeszczepów allo- lub ksenogenicznych, albo chorób zapalnych lub autoimmunologicznych, albo w celu indukowania tolerancji. Przykładowo, mogą one być stosowane w połączeniu z inhibitorem kalcyneuryny, np. cyklosporyną A lub FK506; immunosupresyjnym makrolidem, np. rapamycyną lub jej pochodnymi; np. 40-O-(2hydroksy)etylorapamycyną, czynnikiem zasiedlającym limfocytów, np. FTY720 lub jego analogiem; kortykosteroidami; cyklofosfamidem; azatioprenem; metotreksatem; leflunomidem lub jego analogiem; mizorybiną; kwasem mykofenolowym; mykofenolanem mofetylu; 15-deoksyspergualiną lub jej analogiem; immunosupresyjnymi monoklonalnymi przeciwciałami, np. monoklonalnymi przeciwciałami wobec receptorów leukocytów, np. MHC, CD2, CD3, CD4, CD11a/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB lub ich ligandów; albo innymi związkami immunomodulującymi, np. CTLA4/CD28-Ig lub innymi inhibitorami cząsteczek adhezyjnych, np. mAb lub inhibitorami niskocząsteczkowymi, włączając w to antagonistów LFA-1, antagonistów selektyny i antagonistów VLA-4. Zwią zek jest szczególnie przydatny w połączeniu ze zwią zkiem, który interferuje pomiędzy CD40 i jego ligandem, np. przeciwciałami wobec CD40 i przeciwciałami wobec CD40-L.

W przypadku gdy rozpuszczalne zmutowane czą steczki CTLA4 tu opisane podaje się w połączeniu z inną terapią immunosupresyjną/immunomodulującą lub przeciwzapalną, np. jak wymieniono powyżej, dawkowanie podawanego jednocześnie związku immunosupresyjnego, immunomodulującego lub przeciwzapalnego będzie oczywiście różne w zależności od typu użytego jednocześnie leku, np. czy to będzie steriod czy cyklosporyna, od konkretnego użytego leku, leczonego stanu i tak dalej.

Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek dostarcza w jeszcze jednym aspekcie zastosowania jak zdefiniowano powyżej, obejmujące skojarzone podawanie np. jednoczesne lub po kolei, skutecznej leczniczo ilości rozpuszczalnych cząsteczek CTLA4 tu opisanych, np. CTLA4Ig, w postaci wolnej albo dopuszczalnej farmaceutycznie soli, i drugiego leku, przy czym druga substancja lecznicza jest lekiem immunosupresyjnym, immunomodulującym lub przeciwzapalnym jak wskazano powyżej. Ponadto opisano połączenia farmaceutyczne np. zestaw, np. do zastosowania zdefiniowanego powyżej, zawierające rozpuszczalną cząsteczkę CTLA4 w postaci wolnej lub w postaci dopuszczalnej farmaceutycznie soli do użycia jednocześnie lub po kolei z co najmniej jedną kompozycją farmaceutyczną zawierającą lek immunosupresyjny, immunomodulujący lub przeciwzapalny. Zestaw może zawierać instrukcję jego podawania.

Następujące przykłady są przedstawione dla zilustrowania niniejszego wynalazku i ułatwieniu specjaliście w tej dziedzinie jego realizacji i stosowania. Przykłady nie mają w żaden sposób ograniczać zakresu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Poniżej przedstawiono opis metod zastosowanych do wytwarzania sekwencji nukleotydowych kodujących cząsteczki CTLA4 tu opisane

W pierwszej kolejnoś ci skonstruowano plazmid kodują cy CTLA4Ig i wykazano jego zdolno ść do ekspresji cząsteczek CTLA4Ig, jak opisano w patentach USA nr 5434131, 5885579 oraz 5851795. Następnie, wykorzystując sekwencję kodującą CTLA4Ig uzyskano cząsteczki zmutowane w pojedynczym miejscu (np. L104EIg), poddano je ekspresji i sprawdzono pod względem kinetyki wiązania z róż norodnymi cząsteczkami B7. Sekwencję nukleotydową L104EIg wykorzystano jako matrycę do wytworzenia sekwencji CTLA4 posiadającej mutację w dwóch miejscach L104EA29YIg (jak to zostało

PL 207 534 B1 zawarte w sekwencji przedstawionej na Fig. 18), w wyniku ekspresji której otrzymano białko i które badano pod względem kinetyki wiązania.

Konstruowanie CTLA4Ig

Skonstruowano genetyczny konstrukt kodujący CTLA4Ig zawierający zewnątrzkomórkową domenę białka CTLA4 oraz domenę IgCgamma1 w sposób opisany w patentach USA nr 5434131, 5844095 oraz 5851795. Zewnątrzkomórkową domenę genu kodującego CTLA4 sklonowano za pomocą metody PCR przy użyciu syntetycznych oligonukleotydów odpowiadających opublikowanej sekwencji (Dariavach i wsp., Eur. Journ. Immunol. 18:1901-1905 (1998)).

Ponieważ w genie CTLA4 nie wykryto peptydu sygnałowego dla CTLA4, koniec N przewidywanej sekwencji CTLA4 połączono w dwuetapowym procesie z peptydem sygnałowym onkostatyny M (Malik i wsp.. Mol. And Cell. Biol. 9:2847 (1989)) za pomocą zachodzących na siebie oligonukleotydów. W pierwszym etapie, oligonukleotyd o sekwencji:

CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCA CGTGGCCCAGCC (SEK NR ID: 1) (kodujący 15 C-końcowych aminokwasów pochodzących z peptydu sygnałowego onkostatyny M połączonych z 7 N-końcowymi aminokwasami białka CTLA4) zastosowano jako lewy starter (forward), zaś jako starter prawy (reverse) użyty został oligonukleotyd o sekwencji TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (SEK NR ID: 2) (kodujący reszty aminokwasowe 119-125 sekwencji aminokwasowej receptora dla CTLA4 oraz zawierający miejsce trawienia enzymu restrykcyjnego Bell). Matrycę w tym etapie stanowiło cDNA zsyntetyzowane z 1 μg całkowitego RNA pochodzącego z komórek H38 (linia białaczkowych limfocytów T zainfekowana wirusem HTLV II, otrzymana od dr Salahudin oraz dr Galio, NCI, Bethesda, MD). Część produktu PCR otrzymanego w pierwszym etapie została ponownie poddana amplifikacji przy użyciu zachodzącego lewego startera o sekwencji CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGC TCAGTCTGGTCCTTGCACTC, (SEK NR ID: 3) kodującego N-końcową część peptydu sygnałowego onkostatyny M i zawierającego miejsce trawienia restrykcyjnej endonukleazy Hindlll oraz tego samego prawego startera. Produkt reakcji PCR poddano trawieniu enzymem Hindlll oraz Bell i ligacji z fragmentem cDNA uzyskanym w wyniku trawienia enzymami BClI/XbaI, kodującym sekwencje aminokwasowe odpowiadające zawiasowym regionom CH2 i CH3 dla IgC(gamma)1, do wektora ekspresyjnego trawionego enzymami HindIII/XbaI o nazwie CDM8 oraz wektora ekspresyjnego piLN (znanego także jako TnLN) trawionego enzymami HindIII/Xbal.

DNA kodujący sekwencję aminokwasowa odpowiadającą CTLA4Ig zdeponowano w ATCC zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim 31 Maja 1991 r. i opatrzono numerem dostępu ATCC 68629.

Sekwencje nukleotydowe posiadające mutacje w dwóch miejscach kodujące zmutowaną cząsteczkę CTLA4 L104EA29YIg zdeponowano 19 czerwca 2000 r. w American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassa, VA 20110-2209 pod numerem dostępu ATCC, PTA-2104.

Rozpuszczalne cząsteczki CTLA4 poddano ekspresji z sekwencji nukleotydowych i wykorzystano w II fazie badań klinicznych opisanych w Przykładzie 2, poniżej.

P r z y k ł a d 2

Poniżej przedstawiono opis II fazy badań klinicznych z udziałem pacjentów ludzi otrzymujących rozpuszczalną cząsteczkę białka CTLA4 - L104EA29YIg (znaną też jako LEA29Y bądź LEA) lub CTLA4Ig, celem złagodzenia co najmniej jednego z objawów związanych z reumatoidalnym zapaleniem stawów, w tym zmniejszenia: opuchlizny stawów, tkliwości stawów, stanów zapalnych, sztywności porannej oraz bólu. Jak pokazano to na Fig. 20 sekwencja aminokwasowa zastosowanej w niniejszych badaniach cząsteczki CTLA4Ig rozpoczyna się metioniną w pozycji +1 (lub alternatywnie alaniną w pozycji -1), kończy zaś lizyną w pozycji +357. DNA kodujący opisaną tu postać cząsteczki CTLA4Ig zdeponowano jako ATCC 68629. Jak przedstawiono to na Fig. 18 sekwencja aminokwasowa zastosowanej tutaj cząsteczki L104EA29YIg rozpoczyna się metioniną w pozycji +1 (bądź alternatywnie alaniną) w pozycji -1), kończy zaś lizyną w pozycji +357. DNA kodujący opisaną tu postać cząsteczki L104EA29YIg zdeponowano jako ATCC PTA 2104.

Dodatkowo, poniżej przedstawiono opis doświadczenia z udziałem pacjentów traktowanych L104EA29YIg lub CTLA4Ig w celu łagodzenia co najmniej jednego z objawów towarzyszących reumatoidalnemu zapaleniu stawów, w tym zmniejszenia szybkości sedymentacji erytrocytów oraz obniżenia poziomu białka C-reaktywnego białka i/lub receptora dla IL2 w surowicy.

Grupy pacjentów

W badaniu brało udział 214 pacjentów, w tym 54 mężczyzn i 160 kobiet (Fig. 1A, 1B). Średnia długość trwania choroby u pacjentów na poziomie podstawowym wynosiła 3,4 lata (±2,0), a próba

PL 207 534 B1 leczenia za pomocą co najmniej jednego z leków należących do modyfikujących chorobę leków przeciwreumatycznych (ang. Disease Modifying Antirheumatic Drug, DMARD) nie powiodła się. Leki należące do grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych (ang. Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs (NSAIDS) lub steroidy (< 10 mg/dzień) dopuszczono do stosowania, zaś towarzyszące leki z grupy DMARDS zostały zakazane. Pacjentów losowo przypisano do liczących od 25 do 32 osób grup leczenia. Trzydziestu dwóm pacjentom podano placebo, 92 podano L104EA29YIg, zaś 90 podano CTLA4Ig. Pacjenci, którzy postępowali według wytycznych protokołu i nie przerwali eksperymentu przed dniem 57, otrzymali w sumie 4 dożylne wlewy, po jednym wlewie w dniu 1, 15, 29 i 57. Wszyscy pacjenci poddawani byli ocenie w dniu 1, 15, 29, 43, 57, 71 oraz 85. Podawane dawki zawierały 0,5, 0,2 lub 10,0 mg/kg L104EA29YIg (oznaczony na Fig. 1A-1E odpowiednio jako LEA5, LEA2 oraz LEA10) bądź CTLA4Ig (oznaczony na Fig. 1A-1E odpowiednio jako CTLA5, CTLA2 i CTLA10).

Wszystkich badanych monitorowano pod kątem wystąpienia w okresie okołoinfuzyjnym niepożądanych objawów ubocznych oraz pod kątem ogólnego bezpieczeństwa za pomocą formularza ankietowego z listą potencjalnych niepożądanych objawów ubocznych. Pacjenci zapytywani byli o potencjalne objawy uboczne mogące pojawić się w przeciągu dwudziestu czterech godzin po wlewie. Dodatkowo, pacjentów zachęcano do samorzutnego relacjonowania wszelkich objawów niepożądanych jakich doświadczyli. Lekarze rutynowo kontrolowali próbki laboratoryjne pochodzące od pacjentów pod względem nieprawidłowości w chemicznych właściwościach krwi i hematologii np. oznaczali poziomy związków pośredniczących w odpowiedzi zapalnej, takich jak cytokiny (TNF, IL-6), tryptaza oraz dopełniacz. Pierwotnym punktem końcowym była proporcja badanych spełniających kryteria ACR20 w dniu 85 doświadczenia.

Przechowywanie materiału do testu

CTLA4Ig oraz L104EA29YIg dostarczano w jednorazowych szklanych fiolkach zawierających 200 mg CTLA4Ig/fiolkę lub 100 mg L104EA29YIg/fiolkę. Do wlewów, CTLA4Ig oraz L104EA29YIg rozcieńczano sterylną wodą do iniekcji (SWFI) do końcowego stężenia 25 mg/ml.

Protokół podawania leku

Wszystkie wlewy odbywały się dożylnie przez 1 godz. (Fig. 1 do 17). Wszyscy badani otrzymali co najmniej jeden wlew badanego leku.

Grupa 1: 32 pacjentów, CTLA4Ig lub L104EA29YIg dopasowane z placebo

Grupa 2: 26 pacjentów; dawka 0,5 mg/kg CTLA4Ig.

Grupa 3: 32 pacjentów; dawka 2,0 mg/kg CTLA4Ig.

Grupa 4: 32 pacjentów; dawka 10,0 mg/kg CTLA4Ig.

Grupa 5: 32 pacjentów; dawka 0,5 mg/kg L104EA29YIg.

Grupa 6: 29 pacjentów; dawka 2,0 mg/kg L104EA29YIg.

Grupa 7: 31 pacjentów; dawka 10,0 mg/kg L104EA29YIg.

Monitorowanie kliniczne

Przed każdym wlewem pacjentów oceniano pod względem podstawowych objawów aktywności choroby. Podstawowe objawy stanowiące kryterium oceny obejmowały: opuchliznę stawów, tkliwość stawów, stan zapalny, sztywność poranną, aktywność choroby ocenianą przez pacjentów i lekarzy, jak również niepełnosprawność ocenianą za pomocą Formularza Ankietowego Oceny Zdrowia - Health Questionnaire Assessment (HAQ) (nazywane punktacją fizycznego funkcjonowania. Fig. 1C) oraz ból (Figury 1A do 1D). Dodatkowo, podstawowe objawy stanowiące kryterium oceny obejmowały szybkość sedymentacji erytrocytów (OB) oraz poziomy białka C-reaktywnego (CRP) i rozpuszczalnego receptora dla IL-2 (IL-2r) w surowicy (Fig. 1C do 1D).

Badania odpowiedzi klinicznej oparto na kryteriach ustalonych przez American College of Rheumatology (ACR). Osoba spełniała kryterium ACR20 w przypadku, gdy 20 procentowej poprawie ulegała tkliwość i opuchlizna stawów oraz gdy procentowej poprawie uległy trzy z pięciu pozostałych mierzonych objawów, takich jak ogólne zmiany chorobowe w ocenie pacjenta i lekarza, ból, niepełnosprawność oraz czynnik fazy ostrej (Felson, D. T., i wsp., 1993 Arthritis and Rheumatism 36:729-740; Felson, D. T., i wsp., 1995 Arthritis and Rheumatism 38:1-9).

Biomarkery

Oznaczano także potencjalne biomarkery aktywności chorobowej (czynnik reumatoidalny, CRP, OB, rozpuszczalne IL-2R, rozpuszczalne ICAM-1, rozpuszczalne E-selektyny oraz MMP-3). W celu ustalenia stężenia IL-2sRa, sICAM-1, sE-selektyny i MMP w surowicy wykorzystywano wystandaryzowane metody enzymatycznego oznaczania immunologicznego (EIA). Oznaczeń TNFa oraz IL-6 dokonywano przed i 2 godz. po wlewie, w razie konieczności.

PL 207 534 B1

Za pomocą dostępnych na rynku kolorymetrycznych zestawów EIA z R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) dokonywano pomiarów IL-2sRa, sICAM-1 oraz sE-selektyny. Górną i dolną granicą oceny ilościowej były odpowiednio 312-20,000 pg/ml, 40-907 ng/ml oraz 10-206 ng/ml. Międzypomiarowy współczynnik zmienności wahał się odpowiednio pomiędzy 4,48-8,4%, 3,8-5,0% oraz 5,5-9,0%. Według producenta zestawu, prawidłowe wartości w surowicy wahają się odpowiednio pomiędzy 6762,132 pg/ml.

Za pomocą dostępnego na rynku, kolorymetrycznego zestawu EIA z Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) dokonywano pomiaru MMP-3. Górna i dolna granica pomiaru to 30-7,680 ng/ml. Międzypomiarowy współczynnik zmienności wahał się odpowiednio pomiędzy 6,3-10,6%. Według producenta zestawu, prawidłowe wartości w surowicy wahają się odpowiednio pomiędzy 28-99 pg/ml.

Za pomocą dostępnych na rynku chemiluminescencyjnych zestawów EIA z R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN) dokonywano pomiaru IL-6 oraz TNFa. Górne i dolne granice pomiaru to odpowiednio 0,3-3,000 pg/ml i 0,7-7,000 pg/ml. Międzypomiarowy współczynnik zmienności wahał się odpowiednio pomiędzy 3,1-5,7% a 6,4-20,7%. Według producenta zestawu, prawidłowe wartości w surowicy wahają się odpowiednio pomiędzy <0,3-12 pg/ml a <0,7-7,5 pg/ml.

Testowanie przeciwciał

Pierwszego dnia doświadczenia przed rozpoczęciem podawania leków, a także w przybliżeniu w dniu 15, 29, 57, 85 oraz 169 pobrano próbki surowicy celem oznaczenia specyficznych względem stosowanych środków przeciwciał. Z uwagi na wcześniej istniejące, wysokie miano przeciwciał skierowanych przeciw immunoglobulinowej (Ig) części badanych cząsteczek, oznaczano również tworzenie specyficznych przeciwciał skierowanych przeciw cząsteczkom CTLA4Ig oraz LEA29Y bez regionów stałych Ig.

96-studzienkowe płytki Immulon II ELISA (Dynex, Chantilly, Virginia) opłaszczono cząsteczkami CTLA4Ig, CTLA4Ig bez regionów stałych Ig oraz LEA29Y, bądź LEA29Y bez regionów stałych Ig w stężeniu odpowiednio, 2, 4, 2 lub 1 μg/ml roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem (PBS) i inkubowano przez noc w temperaturze 2-8°C. Płytki przepłukiwano PBS zawierającym 0,05% Tween 20 i poddawano blokowaniu roztworem PBS zawierającym albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie, płytki przepłukiwano i do odpowiednich studzienek na płytce dodawano kolejne rozcieńczenia surowicy oznaczanej lub surowice stanowiące kontrolę jakości (Quality control, QC) i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37°C. Surowicę rozcieńczano trzykrotnie w PBS zawierającym 0,25% BSA i 0,05% Tween 20 poczynając od rozcieńczenia 1:10. Płytki przemywano i dodawano mieszaninę sprzężonych z fosfatazą alkaliczną kozich antyludzkich przeciwciał kappa i lambda (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). Po 1 godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C płytki płukano i do każdej studzienki dodawano fosforan para-nitrofenylu w stężeniu 1 mg/ml buforu dielanolaminowego. Po upływie 30 minut, podczas których reakcja zachodziła w temperaturze 25°C, reakcje zatrzymywano za pomocą 3N NaOH i dokonywano pomiaru absorbancji (przy zastosowaniu dwóch długości fal: 405 i 550 nm). Wyniki wyrażono jako miano punktu końcowego (ang. endpoint titer, EPT), przez który rozumie się odwrotność największego rozcieńczenia, przy którym odczyt absorbancji był pięciokrotnie wyższy lub równy średniej absorbancji tła dla płytki. Tło dla płytki określano jako pomiar absorbancji przeprowadzony przy braku surowicy. Wartości uznawano za dodatnie dla serokonwersji, o ile pochodziły z co najmniej dwóch seryjnych rozcieńczeń (9-krotne) lub wyższych w stosunku do wartości EPT dla próbki pobranej przed dawkowaniem. Próbki surowicy QC dodatnie pod względem przeciwciał specyficznych wobec CTLA4Ig bądź LEA29Y pozyskano od immunizowanych małp. W przebiegu każdego analitycznego pomiaru oznaczano równe ilości próbek QC. Pomiary analityczne uznawano za właściwe jedynie w przypadku, gdy próbki QC spełniały kryteria zgodności.

Wyniki

Ogólnie, CTLA4Ig oraz L104EA29YIg były dobrze tolerowane we wszystkich stosowanych dawkach. W przypadku stosowania wszystkich dawek wystąpiły podobne niepożądane skutki uboczne za wyjątkiem objawu bólu głowy. Przy stosowaniu leku w dawce 0,5, 2,0 lub 10,0 mg/kg, 85 dnia liczba pacjentów cierpiących na ból głowy, traktowanych CTLA4Ig wzrastała w zależności od dawki osiągając odpowiednio 23%, 44% i 53%, zaś w przypadku pacjentów przyjmujących L104EA29YIg osiągając odpowiednio 34%, 45% i 61%. W przeciwieństwie do powyższych wyników, w grupie osób otrzymujących placebo 31% pacjentów doświadczało bólu głowy.

Odsetek pacjentów, u których przerwano badania kliniczne ze względu na nawrót objawów zapalenia stawów oraz inne niepożądane objawy zostały zestawione na Fig. 2. O wiele wyższy odsetek

PL 207 534 B1 pacjentów przyjmujących placebo przerwał leczenie z powodu nawrotu objawów zapalenia stawów. W przypadku pacjentów otrzymujących CTLA4Ig wraz ze wzrastającą dawką leku następował spadek liczby przypadków przerywania leczenia. Bardzo niewielu pacjentów przerywało leczenie w grupie traktowanej L104EA29YIg. Wyniki te wskazują na istnienie prawidłowej, odwrotnej w zależności od dawki odpowiedzi w przypadku stosowania CTLA4Ig i silniejszej odpowiedzi w przypadku terapii L104EAYIg.

Odpowiedzi ACR-20, -50 i -70 u pacjentów traktowanych CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo na dzień 85 zestawiono na Fig. 3A. Podobnie, Figury 3B oraz C opisują odpowiedzi ACR-20 przy 95% przedziale ufności. Odpowiedzi wydają się być zależne od dawki z wyraźnie znaczącą odpowiedzią w przypadku traktowania dawką 10 mg/kg masy ciała pacjenta.

Odsetek pacjentów, u których nastąpiło zmniejszenie opuchnięcia i tkliwości stawów w porównaniu z pacjentami, u których nie uzyskano odpowiedzi po działaniu CTLA4Ig, L104EA29YIg bądź placebo został przedstawiony na Fig. 4A i B. Odpowiedź na leczenie wydaje się być zależna od dawki. U większego odsetka pacjentów wykazano poprawę rzędu 20, 50, 70, a nawet 100% w przypadku stosowania dawek 2 mg/kg i 10 mg/kg dla obu produktów.

Odsetek pacjentów, u których stwierdzono zmniejszenie bólu, aktywności chorobowej oszacowanej przez pacjenta i lekarza, średniej punktacji dla CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo, pokazano na Fig. 5A, B, C i D. Kontrolowane za pomocą skali Likerta odpowiedzi na leczenie określane 85 dnia doświadczenia wydają się być zależne od dawki w przypadku grup pacjentów traktowanych związkami aktywnymi w porównaniu z grupą placebo. Skala Likerta jest wiarygodną skalą werbalnej oceny posługującą się przymiotnikami celem ustalenia stopnia objawów (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6):729-740).

Dokonywaną przez pacjentów i lekarzy ocenę zmiany przebiegu aktywności chorobowej względem poziomu odniesienia wynoszącą co najmniej 2 jednostki, będącej wynikiem stosowania CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo pokazano na Fig. 6A i B. Stopień odpowiedzi na działanie leku wydaje się zależeć od dawki, przy czym bardziej znacząca poprawa widoczna jest dla wyższych dawek związków aktywnych.

Procentowe obniżenie poziomów białka C-reaktywnego (CRP) u pacjentów, którym podawano CTLA4Ig, L104EA29YIg bądź placebo przedstawiono na Fig. 7A i B. Odpowiedzi wydają się być zależne od dawki z wyraźnym obniżeniem w przypadku stosowania związków aktywnych w dawkach 2 i 10 mg/kg. Dodatkowo, na Fig. 7B pokazano, że różnica jest dosyć znacząca w porównaniu z grupą, w której stosowano placebo przy 95% przedziale ufności. Fig. 7C przedstawia zmiany w poziomach w surowicy w stosunku do poziomu odniesienia 85 dnia doświadczenia.

Ilość rozpuszczalnego receptora dla IL-2 w surowicy u pacjentów, którym podawano CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo przedstawiono na Fig. 8. Obniżenie poziomów rozpuszczalnego receptora dla IL-2 wydaje się być zależne od dawki.

Ilość obecnego w surowicy rozpuszczalnego ICAM-1 oraz rozpuszczalnej E-selektyny u pacjentów traktowanych CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo przedstawiono na Fig. 22. Obniżenie poziomów rozpuszczalnej formy ICAM-1 i rozpuszczalnej E-selektyny wydaje się być zależne od dawki.

Mediana oraz średnia liczba tkliwych stawów u pacjentów traktowanych CTLA4Ig lub placebo w czasie, pokazane są na Fig. 9A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. obniżenie tkliwości stawów) wydaje się być bardziej istotna w grupach traktowanych dawką 2 i 10 mg/kg niż w grupie traktowanej placebo, bądź dawką 0,5 mg/kg.

Medianę i średnią liczbę opuchniętych stawów u pacjentów, u których stosowano CTLA4Ig lub placebo w czasie przedstawiono na Fig. 10A i B. Zmiana w stosunku do poziomu podstawowego (np. zmniejszenie opuchlizny stawów) wydaje się być bardziej istotna w grupach traktowanych dawką 2 i 10 mg/kg niż w grupie traktowanej placebo lub dawką 0,5 mg/kg.

Średnią ocenę punktową oceny bólu w czasie u pacjentów traktowanych CTLA4Ig lub placebo przedstawiono na Fig. 11. Zmiana w stosunku do poziomu odniesienia (np. obniżenie aktywności chorobowej) wydaje się być bardziej istotna w grupach, w których stosowano dawkę 2 i 10 mg/kg niż w grupie placebo i dawką 0,5 mg/kg.

Średnią ocenę punktową oceny aktywności chorobowej u pacjentów traktowanych CTLA4Ig bądź placebo w czasie, dokonywanej przez pacjentów lub lekarzy, przedstawiono na Fig. 12 A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. obniżenie aktywności choroby) wydaje się być bardziej istotna dla grup traktowanych dawką 2 i 10 mg/kg niż dla grupy traktowanej placebo lub 0,5 mg/kg.

PL 207 534 B1

Medianę i średnią liczbę tkliwych stawów u pacjentów traktowanych L104EA29YIg (oznaczone na figurach jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 13 A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. obniż enie tkliwoś ci stawów) wydaje się być zależ na od dawki.

Medianę i średnią liczbę opuchniętych stawów u pacjentów, którym podawano L104EA29YIg (na figurach oznaczone jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 14A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. zmniejszenie opuchlizny stawów) wydaje się być bardziej istotna dla grup traktowanych dawką 2 i 10 mg/kg niż dla grupy traktowanej placebo lub 0,5 mg/kg.

Średnią ocenę punktową oceny bólu u pacjentów, którym podawano L104EA29YIg (oznaczane na figurach jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 15. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. zmniejszenie bólu) wydaje się zależna od dawki.

Średnie wyniki oceny aktywności choroby oszacowanej przez pacjentów i lekarzy u pacjentów traktowanych L104EA29YIg (oznaczane na figurach jako LEA) bądź placebo w czasie przedstawiono na Fig. 16 A i B. Zmiana w stosunku do linii odniesienia (np. obniżenie aktywności chorobowej) wydaje się być zależna od dawki.

Odsetek poprawy stanu niepełnosprawności oznaczony za pomocą formularza ankietowego HAQ w dniu 85 dla pacjentów traktowanych CTLA4Ig, L104EA29YIg lub placebo został przedstawiony na Fig. 17 (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J.F., i wsp., 1982 J. of Rheumatology 9:789-793). Istnieje wyraźna poprawa zależna od dawki wyrażona tym parametrem.

Zmiany względem linii odniesienia dla poziomów rozpuszczalnego IL-2r i białka C-reaktywnego w obu grupach poddawanych leczeniu były zależne od dawki. Po terapii, poziomy rozpuszczalnego IL-2r wynosiły -2%, -10% i -22% w przypadku stosowaniu CTLA4Ig oraz -4%, -18% i -32% w przypadku stosowaniu L104EA29YIg odpowiednio dla dawek 0,5, 2,0 i 10,0 mg/kg, w porównaniu do +3% w przypadku podawania placebo. Poziomy biał ka C-reaktywnego wynosił y +12%, -15% i -32% w przypadku stosowania CTLA4Ig oraz +47%, -33% i -47% w przypadku stosowania L104EA29YIg odpowiednio, dla dawek 0,5, 2,0 i 10,0 mg/kg, w porównaniu do +20% w przypadku podawania placebo (Fig. 7A).

Za wyjątkiem niewielkiej supresji w poziomach IgA i IgG przy stosowaniu najwyższych dawek obu leków, rutynowe testy hematologiczne czy chemiczne testy laboratoryjne nie wykazały żadnych znaczących klinicznie nieprawidłowości, nie zaobserwowano również nieprawidłowości w objawach fizycznych czy też ocenie czynnoś ci ż yciowych. Godne uwagi jest to, ż e żaden ze stosowanych środków nie spowodował indukcji specyficznych względem nich przeciwciał.

P r z y k ł a d 3

Poniższe przykłady opisują II fazę badań klinicznych, w których posługiwano się zgodnymi z normą skalami radiograficznymi, u pacjentów otrzymują cych L104EA29YIg w celu zmniejszenia lub profilaktyki zniszczeń strukturalnych obejmujących kość lub erozję stawu. Poprawa skuteczności w zmniejszaniu lub profilaktyce strukturalnego zniszczenia przebiega równolegle z poprawą kliniczną mierzoną za pomocą parametrów klinicznych.

Stan struktury kości kontrolowany jest w przypadku niektórych pacjentów przed rozpoczęciem podawania CTLA4Ig lub L104EA29YIg. Pacjentom tym podaje się CTLA4Ig lub L104EA29YIg w dawce pomiędzy 0,5 a 20 mg/kg, w sposób regularny, co dwa do dwanaście tygodni (leki podawane są same lub w połączeniu z innymi czynnikami) celem utrzymania w czasie ich leczniczego wpływu. W uprzednio określonych odstępach czasu wykonywane są radiogramy rąk i stóp pacjentów: co 6 miesięcy, następnie co rok, jak jest to zalecane przez wytyczne FDA. Pacjenci ci są kontrolowani długoterminowo po 6 i 12 miesiącach, a następnie co roku, w celu określenia czy leczenie z użyciem CTLA4IF lub L104EA29YIg zmniejsza postęp degradacji kości. Pacjenci kontrolowani są za pomocą metod radiograficznych obejmujących stosowanie promieniowania rentgenowskie i/lub obrazowanie za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI), zgodnie ze standardami praktyki lekarskiej (Larsen, A. K. oraz M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481491; Sharp, J.T., i wsp., 1985 Arthris and Rheumatism 28:1326-1335). Wyniki danych radiograficznych oceniane są pod kątem profilaktyki zniszczenia strukturalnego, obejmującej spowolnienie procesu erozji kości i zniszczenia chrząstki ze zmniejszaniem się przestrzeni stawowej i/lub profilaktyki nowej erozji.

PL 207 534 B1

Lista sekwencji <110> Cohen, Robert Carr, Suzette Hagerty, David Peach, Robert J Becker, Jean-Claude Bristol-Myers Sąuibb Company <120> Zastosowania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 <130> D0030PCT; 30436.55WOU1 <140> PCT/US01/21204 <141> 2001-07-02 <150> 60/215913 <151> 2000-07-03 <160> 19 <170> Patent In Ver. 2.1 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4 przyłączona do onkostatyny M, starter lewy <400> 1 ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc 60 cagcc 65 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4 przyłączona do onkostatyny M, starter prawy <400> 2 tttgggctcc tgatcagaat ctgggcacgg ttg <210> 3 <211> 72 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4 z oncostatyną M i Hind III <400> 3 ctagccactg aagcttcacc aatgggtgta ctgctcacac agaggacgct gctcagtctg 60 gtccttgcac tc 72 <210> 4 <211> 41 <212> DNA

PL 207 534 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter lewy dla onkostatyny M CTLA4 (OMCTLA4) <400> 4 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter prawy dla onkostatyny M CTLA4 (0MCTLA4) <400> 5 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc <210> 6 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104EIg <400> 6 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ccgggtaaat ga <210> 7 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: LI04EIg cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1152 <400> 7

Met 1

Gly

Val

Leu 5

Leu

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

PL 207 534 B1

Tyr

Ala 50

Ser

Pro

Gly Lys

Ala 55

Thr

Glu Val Arg Val 60

Thr Val

Leu

Arg

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

185

190

Pro

Glu

Val

Thf

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Ala

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Vai

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Giy

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370 375 380 <210> 8 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104EA29YIg <400> 8 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctcGaggca aatatactga acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

PL 207 534 B1 cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc gcacgtaccg agtacaagtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1152 <210> 9 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104EA29YIg <400> 9

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gln Arg Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gln

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Tyr

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gln

Ala

Asp

Ser

Gln

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gln

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gln

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gln

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gln

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

185

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gln

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

PL 207 534 B1

Trp

Gin

Gin 355

Gly

Asn

Val

Phe

Ser 360

Cys

Ser

Val

Met

His 365

Glu

Ala Leu

His

Asn 370

His

Tyr

Thr

Gin

Lys 375

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser 380

Pro

Gly

Lys

<210> 10 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104EA29LIg <400> 10 atgggtgtac agcatggcga ggcatcgcta acagtgcttc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attgatccag acatccccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat tgctcacaca gcatggcaat gctttgtgtg ggcaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc cgtccccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga gaggacgctg gcacgtggcc tgagtatgca cagccaggtg agatgattcc actgagggcc atactacgag agattctgat acctgaactc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgąagtct atctgcacgg atggacacgg ggcataggca caggagccca ctggggggat cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc tccttgcact tggtactggc aattgactga gtgcggcaac gcacctccag gactctacat acggaaccca aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg agtacaagtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1152 <210> 11 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104EA29LIg <400> 11

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Leu

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

PL 207 534 B1

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

185

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370 375 380 <210> 12 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104EA29TIg <400> 12 atgggtgtac agcatggcga ggcatcgcta acagtgcttc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attgatccag acatccccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat tgctcacaca gcatggcaat gctttgtgtg ggcaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc cgtccccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga gaggacgctg gcacgtggcc tgagtatgca cagccaggtg agatgattcc actgagggcc atactacgag agattctgat acctgaactc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgaagtct atctgca~gg atggacacgg ggcataggca caggagccca ctggggggat cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc tccttgcact tggtactggc aaactactga gtgcggcaac gcacctccag gactctacat acggaaccca aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg agtacaagtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1152 <210> 13 <211> 383 <212> PRT

PL 207 534 B1 <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: L104EA29TIg <400> 13

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

185

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

A$n

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

380

<210>	14
<211>	1152
<212>	DNA
<213>	Sekwencja sztuczna
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji:;	; L104EA29WIg
<400>	14

PL 207 534 B1 atgggtgtac agcatggcga ggcatcgcta acagtgcttc gggaatgagt gtgaacctca gagctcatgt attgatccag acatccccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat tgctcacaca gcatggcaat gctttgtgtg ggcaggctga tgaccttcct ctatccaagg acccaccgcc aaccgtgccc cgtccccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga gaggacgctg gcacgtggcc tgagtatgca cagccaggtg agatgattcc actgagggcc atactacgag agattctgat acctgaactc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac ctcagtctgg cagcctgctg tctccaggca actgaagtct atctgcacgg atggacacgg ggcataggca caggagccca ctggggggat cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgc agcaggtggc cactacacgc tccttgcact tggtactggc aatggactga gtgcggcaac gcacctccag gactctacat acggaaccca aatcttctga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg agtacaagtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtgqagtg tggactccga agcaggggaa agaag~gcct cctgtttcca cagcagccga ggtccgggtg ctacatgatg tggaaatcaa ctgcaaggtg gatttatgta caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagt caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1152 <210> 15 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: LI04EA29WIg <400> 15

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Trp

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Glu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Ser

Val

165

170

175

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

185

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

PL 207 534 B1

Ser

Lys

Ala 275

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg 280

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr 285

Thr

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gln

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

380

<210> 16 <211> 636 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgac ttcctcctct ggatccttgc agcagttagt 480 tcggggttgt ttttttatag ctttctcctc acagctąttt ctttgagcaa aatgctaaag 540 aaaagaagcc ctcttacaac aggggtctat gtgaaaatgc ccccaacaga gccagaatgt 600 gaaaagcaat ttcagcctta ttttattccc atcaat 636 <210> 17 <211> 212 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gln

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gln

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gln

Ala

Asp

Ser

Gln

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gln

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gln

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Leu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gln

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Phe

Leu

Trp

Ile

Leu

Ala

Val

Ser

145

150

155

160

Ser

Gly

Leu

Phe

Tyr

Ser

Phe

Leu

Thr

Ala

Val

Ser

Leu

Ser

165

170

175

Lys

Met

Leu

Lys

Arg

Ser

Pro

Leu

Thr

Gly

Val

Tyr

Val

Lys

180

185

190

PL 207 534 B1

Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 195 200 205

Ile Pro Ile Asn 210 <210> 18 <211> 1152 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4Ig <400> 18 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg 180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa 300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctg3 caaaactcac 480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctgggtggat cgtcagtctt cctcttcccc 540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 19 <211> 383 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: CTLA4Ig <400> 19

Met 1

Gly

Val

Leu

Leu 5

Thr

Gin

Arg

Thr

Leu 10

Leu

Ser

Leu

Val

Leu 15

Ala

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Ala

Ser

Met

Ala

Met

His

Val

Ala

Gin

Pro

20

25

30

Ala

Val

Leu

Ala

Ser

Arg

Gly

Ile

Ala

Ser

Phe

Val

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Ala

Thr

Glu

Val

Arg

Val

Thr

Val

Leu

Arg

50

55

60

Gin

Ala

Asp

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Met

65

70

75

80

Gly

Asn

Glu

Leu

Thr

Phe

Leu

Asp

Ser

Ile

Cys

Thr

Gly

Thr

Ser

85

90

95

Ser

Gly

Asn

Gin

Val

Asn

Leu

Thr

Ile

Gin

Gly

Leu

Arg

Ala

Met

Asp

100

105

110

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ile

Cys

Lys

Val

Glu

Lęu

Met

Tyr

Pro

Tyr

115

120

125

Tyr

Leu

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Thr

Gin

Ile

Tyr

Val

Ile

Asp

Pro

Glu

130

135

140

Pro

Cys

Pro

Asp

Ser

Asp

Gin

Glu

Pro

Lys

Ser

Asp

Lys

Thr

His

145

150

155

160

PL 207 534 B1

Thr

Ser

Pro

Ser 165

Pro

Ala

Pro Glu

Leu 170

Leu

Gly

Ser

Ser 175

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

180

185

190

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

195

200

205

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

210

215

220

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

225

230

235

240

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

245

250

255

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Vał

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

290

295

300

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

305

310

315

320

Gly

Gl-n

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

325

330

335

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

340

345

350

Trp

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

355

360

365

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

370

375

380

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 zawierającej zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki CTLA4, przy czym zewnątrzkomórkowa domena CTLA4 obejmuje aminokwasy pokazane na Fig. 19 rozpoczynające się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończące się kwasem asparaginowym w pozycji +124, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia podmiotu z reumatoidalnym zapaleniem stawów, przy czym podmiot nie odpowiedział na co najmniej jeden przeciwreumatyczny lek modyfikujący przebieg choroby (DMARD).
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że DMARD stanowi metotreksat, cyklofosfonoamid, azatriopryna, cyklosporyna A albo bloker lub antagonista czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFa).
3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że przeznaczone jest do łagodzenia objawu reumatoidalnego zapalenia stawów.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że objaw wybrany jest z grupy składającej się z opuchnięcia stawu, tkliwości stawu, zapalenia, sztywności porannej i bólu.
5. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest do podawania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 w ilości 10 mg/kg masy ciała podmiotu.
6. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienne tym, że rozpuszczalna fuzyjna cząsteczka CTLA4 zawiera region stały immunoglobuliny lub jego część.

PL 207 534 B1
7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, ż e rozpuszczalną fuzyjną czą steczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, ż e rozpuszczalną fuzyjną czą steczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig pokazana na Fig. 20 posiadająca sekwencję rozpoczynającą się metionina w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończącą się lizyną w pozycji +357.
9. Zastosowanie według zastrz. 7, znamienne tym, że rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego oznaczoną numerem ATCC 68629.
10. Zastosowanie rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 zawierającej zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki CTLA4, przy czym zewnątrzkomórkowa domena cząsteczki CTLA4 obejmuje aminokwasy pokazane na Fig. 19 rozpoczynające się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a koń czą ce się kwasem asparaginowym w pozycji +124, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do zmniejszania lub profilaktyki uszkodzenia strukturalnego u podmiotu z chorobą reumatyczną.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że uszkodzenie strukturalne stanowi erozja kości lub stawu.
12. Zastosowanie według zastrz. 10 albo 11, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest do podawania rozpuszczalnej fuzyjnej cząsteczki CTLA4 w ilości pomiędzy 0,5 a 20 mg/kg masy ciała podmiotu.
13. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że choroba reumatyczna wybrana jest z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia wielomięśniowego, twardziny skóry, mieszanej choroby tkanki łącznej, gośćca stawowego, ostrego gośćca stawowego, gośćca pozastawowego, chorób kolagenowych, przewlekłego zapalenia wielostawowego, łuszczycy stawowej, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, guzkowego zapalenia tętnic, tocznia rumieniowatego układowego, postępującej twardziny układowej, zespołu bolesnego barku, dny moczanowej, chondrokalcynozy, zapalenia skórno-mięśniowego, gośćca mięśniowego, zapalenia mięśni i stwardnienia mięśni.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że chorobę reumatyczną stanowi reumatoidalne zapalenie stawów.
15. Zastosowanie według jednego z zastrz. 10 do 14, znamienne tym, że rozpuszczalna fuzyjna cząsteczka CTLA4 zawiera region stały immunoglobuliny lub jego część.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig pokazana na Fig. 20 posiadająca sekwencję rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończącą się lizyną w pozycji +357.
18. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego oznaczoną numerem ATCC 68629.
19. Zastosowanie pierwszego środka i drugiego środka, przy czym

a) pierwszy środek stanowi rozpuszczalna fuzyjna cząsteczka CTLA4 zawierająca zewnątrzkomórkową domenę cząsteczki CTLA4, przy czym zewnątrzkomórkową domeną cząsteczki CTLA4 obejmuje aminokwasy pokazane na Fig. 19 rozpoczynające się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończące się kwasem asparaginowym w pozycji +124, i

b) drugi środek wybrany jest z grupy składającej się z kortykosteroidów, niesteroidowych leków przeciwzapalnych, prednizonu, azatiopryny, metotreksatu, blokerów albo antagonistów

TNFa, hydroksychlorochiny, sulfasalazyny, soli złota, anakinry, cyklofosfamidu i leflunomidu, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia choroby reumatycznej.
20. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że bloker lub antagonistę TNFa stanowi infliksimab albo etanercept.
21. Zastosowanie według zastrz. 19 albo 20, znamienne tym, że kompozycja farmaceutyczna przeznaczona jest do sekwencyjnego lub jednoczesnego podawania pierwszego i drugiego środka.
22. Zastosowanie według zastrz. 19, znamienne tym, że choroba reumatyczna wybrana jest z grupy składającej się z reumatoidalnego zapalenia stawów, zapalenia wielomięśniowego, twardziny skóry, mieszanej choroby tkanki łącznej, gośćca stawowego, ostrego gośćca stawowego, gośćca pozastawowego, chorób kolagenowych, przewlekłego zapalenia wielostawowego, łuszczycy stawowej, zesztywniającego zapalenia stawów kręgosłupa, młodzieńczego reumatoidalnego zapalenia stawów, guzkowego zapalenia tętnic, tocznia rumieniowatego układowego,

PL 207 534 B1 postępującej twardziny układowej, zespołu bolesnego barku, dny moczanowej, chondrokalcynozy, zapalenia skórno-mięśniowego, gośćca mięśniowego, zapalenia mięśni i stwardnienia mięśni.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że chorobę reumatyczną stanowi reumatoidalne zapalenie stawów.
24. Zastosowanie według jednego z zastrz. 19 do 23, znamienne tym, że rozpuszczalna fuzyjna cząsteczka CTLA4 zawiera region stały immunoglobuliny lub jego część.
25. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig.
26. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA4 stanowi CTLA4Ig pokazana na Fig. 20 posiadająca sekwencję rozpoczynającą się metioniną w pozycji +1 albo alaniną w pozycji -1 a kończącą się lizyną w pozycji +357.
27. Zastosowanie według zastrz. 24, znamienne tym, że rozpuszczalną fuzyjną cząsteczkę CTLA44 stanowi CTLA4Ig kodowana przez cząsteczkę kwasu nukleinowego oznaczoną numerem ATCC 68629.