BG66454B1

BG66454B1 - Използване на разтворими ctla4 мутантни молекули за лечение на ревматоидни заболявания

Info

Publication number: BG66454B1
Application number: BG110611A
Authority: BG
Inventors: David Hagerty; Jean-Claude Becker; Robert Cohen; Robert Peach; Suzette Carr
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2014-10-31
Also published as: BR0112104A; AU7317401A; ES2310557T3; YU101102A; HUP0301727A2; PL212205B1; SI1935427T1; NO20026264L; KR100864120B1; SI1372696T1; CA2413190A1; BG110611A; PT1372696E; EP2281568A2; CY2008017I2; EP1935427B1; EP2281568A3; HRP20030071A2; CA2413190C; PE20020772A1

Abstract

Изобретението се отнася до използване на разтворими СТLА4 мутантни молекули, които блокират ендогенни В7 молекули от свързване с техни лиганди, заедно с имуносупресивни средства, за производство на фармацевтични състави за лечение на ревматоидни заболявания и по-специално на ревматично заболяване.

Description

(54) ИЗПОЛЗВАНЕ НА РАЗТВОРИМИ CTLA4 МУТАНТНИ МОЛЕКУЛИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА РЕВМАТОИДНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася като цяло до областта на ревматичните заболявания. По-специално, изобретението се отнася до състави и тяхното използване за лечение на ревматични заболявания, такива като ревматоиден артрит, чрез прилагане към индивид на ефективно количество разтворими CTLA4 мутантни молекули.

Предшестващо състояние на техниката

Понастоящем не съществува лечение на ревматичните заболявания. По-скоро, терапевтичните средства се използват за лечение на симптомите. Обикновено, терапевтичните средства се прилагат за продължителни периоди от време и терапевтичната стойност често намалява вследствие неблагоприятни странични ефекти.

Ревматичните заболявания обхващат група заболявания, които засягат мускулно-скелетната и съединителната тъкан на тялото. Тези заболявания се характеризират с хронично възпаление, което често води до постоянно тъканно увреждане, до деформация, атрофия или инвалидизиране. Ревматичните заболявания засягат стави, кости, меки тъкани или гръбначния мозък (Mathies, Н. 1983 Rheuma) и се класифицират като възпалителен ревматизъм, дегенеративен ревматизъм, извънставен ревматизъм или колагенови заболявания. Известно е, че някои ревматични заболявания са автоимунни заболявания, причинени от изменен имунен отговор на индивид.

Ревматоидният артрит е прогресиращо ревматично заболяване, което засяга приблизително 2% от възрастното население на развитите страни (Utsinger, Р. D., et al., 1985 Rheumatoid Arthritis, стр. 140). Това заболяване се характеризира с персистиращ възпалителен синовит, който причинява деструкция на хрущяла и костна ерозия, водещи до структурни деформации в периферните стави. Симптомите, свързани с ревматоиден артрит, включват отичане на ставите, отслабване на ставите, възпаление, сутрешна вкованост и болка, поспециално след прегъване. Индивиди с напреднали стадии на артрит страдат от структурно увреждане, включващо деструкция на ставите с костна ерозия (в: Principals of Internal Medicine, Harrison, 13-то издание, страници 1648-1655). В допълнение, болни могат да покажат други клинични симптоми на различни органични поражения, включително поражение на кожата, на бъбреците, на сърцето, на бял дроб, на централната нервна система и на очите, вследствие васкулит, свързан с автоимунния процес.

Други симптоми, които корелират с ревматоиден артрит, включват повишени скорости на утаяване на еритроцитите и повишени нива на серумен С-реактивен протеин (CRP) и/ или разтворим рецептор на IL-2 (IL-2r). Скоростта на утаяване на еритроцитите се повишава при почти всички болни с активен ревматоиден артрит. Нивото на серумен С-реактивен протеин също се повишава и съответства на активността на заболяването и на възможността за прогресиращо ставно увреждане. Допълнително, нивото на разтворим lL-2r, продукт на активирани Т-клетки, се повишава в кръвния серум и в синовиалната течност на болни с активен ревматоиден артрит (виж: Principals of Internal Medicine, Harrison, 13-то издание, страница 1650).

Счита се, че ревматоидният артрит е автоимунно заболяване, медиирано от Т-клетки, включващо антиген-неспецифични междуклетъчни взаимодействия между Т-лимфоцити и антиген-представляващи клетки. Най-общо, степента на Т-клетъчния отговор се определя посредством състимулиращия отговор, породен от взаимодействието между молекули на Тклетъчна повърхност и техни лиганди (Mueller, et al., 1989 Ann. Rev. Immunol. 7:445-480). Ключови състимулиращи сигнали се осигуряват от взаимодействието между Т-клетъчни повърхностни рецептори. CD28 и CTLA4, и техни лиганди, такива като В7-сродни молекули CD80 (т.е. В7-1) и CD86 (т.е. В7-2), върху клетки, представляващи антиген (Linsley, Р. and Ledbetter, J. 1993 Ann. Rev. Immunol. 11:191-212).

Активирането на Т-клетки в отсъствието на състимулация води до анергичен Т-клетъчен

66454 Bl отговор (Schwartz, R. Η., 1992 Cell 71:10651068), при което имунната система става нереагираща на стимулация.

Тъй като се счита, че ревматоидният артрит е заболяване на имунната система, медиирано от Т-клетки, една стратегия за разработване на нови средства за лечение на ревматоиден артрит е да се идентифицират молекули, които блокират състимулиращи сигнали между Т-лимфоцити и клетки, представляващи антиген чрез блокиране на взаимодействието между ендогенна CD28 или CTLA4 и В7. Потенциални молекули включват разтворими CTLA4 молекули, които са модифицирани да се свързват с В7 с по-висок авидитет, отколкото див тип CTLA4 (чиято последователност е показана на Фигура 23) или CD28, като по този начин се блокират състимулиращи сигнали.

Конструирани са разтворими форми на CD28 и CTLA4 чрез сливане на вариабилни (V)образни извънклетъчни домени на CD28 и CTLA4 с имуноглобулин (1g) константни домени, което води до CD28Ig и CTLA4Ig. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на CTLA4Ig е дадена на Фигура 24 с протеин, започващ с метионин в позиция +1 или аланин позиция -1 и завършващ с лизин в позиция +357. CTLA4Ig се свързва, както с СО80-позитивни, така и с СО86-позитивни клетки, по-силно, отколкото CD28Ig (Linsley, Р., et al., 1994 Immunity 1:79380). Установено е, че много Т-клетъчно зависими имунни отговори могат да се блокират от CTLA4Ig, както in vitro, така и in vivo. (Linsley, Р., el al., 1991b, no-rope: Linsley, P., et al., 1992a Science 257: 792-795; Linsley, P., et al., 1992b J. Exp. Med. 176:1595-1604; Lenschow, D.J., et al. 1992 Science 257:789-792; Tan, P., et al., 1992 J. Exp. Med. 177:165-173: Turka, L.A., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105).

За да се промени афинитетът на свързване с природни лиганди, такива като В7, разтворими слети молекули CTLA4Ig се модифицират посредством мутация на аминокиселини в CTLA4 частта на молекулите. Области на CTLA4, които, когато мутират променят свързващия афинитет или авидитет за В7 лиганди, включват комплементарно определящата област 1 (CDR-1, както е описано в патенти на САЩ, U.S. №№ 6,090,914, 5,773,253, 5,844,095; във висяща заявка за патент на САЩ сериен номер 60/214,065; и от Peach et al. 1994, J. Exp. Med., 180:2049-2058) и комплементарно определяща област 3 (CDR-3)подобни области (CDR-3 е запазената област от 5 CTLA4 извънклетъчния домен, както е описано в патенти на САЩ, U.S. №№ 6,090,914,5,773,253 и 5,844,095; във висяща заявка за патент на САЩ сериен номер 60/214,065; и от Peach, R.J., et al. J. Exp. Med. 1994 180:2049-2058. CDR-310 подобната област обхваща CDR-3 областта и продължава, посредством няколко аминокиселини, в посока upstream и/или в посока downstream на CDR-3 мотива). CDR-3-подобната област включва хексапептиден мотив MYPPPY, който е 15 много запазен във всички членове на фамилните CD28 и CTLA4. Аланин сканираща мутагенеза през хексапептидния мотив в CTLA4 и в избрани остатъци в CD28Ig, редуцира или унищожава свързване със CD80 (Peach, R.J., et al J. Exp.

Med. 1994 180:2049-2058).

Правени са други модификации на разтворими молекули CTLA4Ig чрез редуване на хомоложни области на CTLA4 и CD28. Тези химерни CTLA4/CD28 хомоложни мутантни 25 молекули идентифицират MYPPPY хексапептидния мотив, общ за CTLA4 и CD28, както и някои незапазени аминокиселинни остатъци в CDR-1н CDR-3-подобните области на CTLA4, като области, отговорни за повишаване на свързващия 30 авидитет на CTLA4 със CD80 (Peach, R. J., et al., 1994 J. Exp. Med. 180:2049-2058).

Разтворими молекули CTLA4, такива като CTLA4Ig, CTLA4 мутантни молекули или химерни CTLA4/CD28 хомоложни мутанти, както 35 е описано по-горе, въвеждат нова група от терапевтични лекарства за лечение на ревматични заболявания.

Съществуващите лечения на ревматични заболявания, такива като ревматоиден артрит, 40 включват прилагане на неспецифични цитотоксични имуносупресивни лекарства, такива като метотрексат, циклофосфамид, азатиоприн, циклоспорин А и блокери или антагонисти на тумор некротизиращ фактор-алфа (ТЖалфа). 45 Тези имуносупресивни лекарства потискат цялата имунна система на индивида и продължителната им употреба повишава риска от инфекция. Освен това, тези лекарства само забавят развитието на ревматоидния артрит, което се възобновява с 50 ускорен темп след като се прекрати терапията.

66454 Bl

Допълнително, продължителна терапия с тези неспецифични лекарства дава токсични странични ефекти, включително склонност към развиване на някои злокачествени заболявания, бъбречна недостатъчност, потискане на костен 5 мозък, белодробна фиброза, злокачественост, диабет и нарушения в чернодробната функция. Тези лекарства, също, постепенно престават да бъдат ефикасни след около 2-5 години (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6-то издание, стр. 10 1001-1022).

Алтернативно, терапевтични средства, които са неспецифични имуносупресивни и противовъзпалителни лекарства, са използвани за получаване на симптоматично облекчение. 15 Тези лекарства са доза-зависими и не предпазват от прогресиране на заболяването. Тези лекарства включват стероидни съединения, такива като преднизон и метилпреднизолон. Стероидите също имат значителни токсични странични ефекти, 20 свързани с тяхната продължителна употреба. (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6-то издание, стр. 829-833).

Следователно, съществуващите лечения на ревматоиден артрит имат ограничена ефикасност, 25 включват значителни токсични странични ефекти и не могат да се прилагат непрекъснато за продължителни периоди от време.

Ето защо, съществува необходимост от лечения, които са ефикасни и по-силно действа- 30 щи при лечение на ревматични заболявания, такива като ревматоиден артрит, и с които се избягват недостатъците на общоприетите методи и средства, чрез прицелване в патофизиологичния механизъм на автоимунитета. 35

Техническа същност на изобретението

Изобретението предлага използване на първо средство, представляващо разтворима CTLA4 мутантна молекула, и второ средство, 40 избрано от групата, състояща се от кортикостероиди, нестероидни противовъзпалителни лекарства, циклоспорин, преднизон, азатиоприн, метотрексат, ТТМЕалфа блокери или антагонисти, инфиликсимаб и биологично 45 средство, насочено към възпалителен цитокин, хидроксихлорокин, сулфасалазоприн, златни соли, етанерсепт и анакинра, в производството на фармацевтичен състав за блокиране на взаимо действия на В7 със CTLA4 и/или CD28. Използваните разтворими CTLA4 мутантни молекули в изобретението включват CTLA4Ig и L104EA29YIg молекули.

Разтворимата CTLA4 мутантна молекула може да съдържа мутация в +104, при което левцин в позиция +104, както е показано на фигура 23, е заместен с която и да е друга аминокиселина или съдържа една първа мутация в позиция +104 на CTLA4, при което левцин в позиция +104, както е показано на фигура 23 е заместен с глутаминова киселина.

Разтворимата CTLA4 мутантна молекула може да бъде LI 04EIg, започваща с метионин в позиция +1 или с аланин в позиция -1 до лизин в позиция +357, както е показано на фигура 18.

Разтворимата CTLA4 мутантна молекула може да бъде: a) L104EA29YIg, започваща с метионин в позиция +1 или с аланин в позиция -1 и завършваща с лизин в позиция +357, както е показано на фигура 10; b) L104EA29LIg започваща с метионин в позиция +1 или с аланин в позиция -1 и завършваща с лизин в позиция +357, както е показано на фигура 20; с) L104EA29Tlg, започващ с метионин в позиция +1 или с аланин в позиция -1 и завършваща с лизин в позиция +357, както е показано на Фигура 21; или d) L104EA29WIg, започваща с метионин в позиция +1 или с аланин в позиция -1 и завършваща с лизин в позиция +357, както е показано на Фигура 22.

С изобретението може да се постигне ограничаване на патофизиологични изменения, свързани с ревматично заболяване, такива като структурно увреждане, чрез прилагане към индивид, диагностициран с ревматоиден артрит, на разтворими CTLA4 молекули.

Изобретението предлага и инхибиране на Т-клетъчна функция, но не и изчерпване на Тклетки у човек чрез контактуване на В7позитивни клетки у човека с разтворима CTLA4 молекула, такава като CTLA4Ig и разтворима CTLA4 мутантна молекула, такава като L104EA29Ylg.

Изобретението предлага също фармацевтичен състав за лечение на заболявания на имунната система, такива като ревматични заболявания, съдържащ фармацевтично приемлив носител и биологично ефективно средство, такова като CTLA4 молекули.

л

66454 Bl

Фигура 4А. Базови (24% подобрение) клинични отговори в подута и слаба става, изчислени в процента болни на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: базов клиничен 5 отговор. ACR-20.

Фигура 4В. Клинични отговори (в процента подобрение) в подута и слаба става, изчислени в процента болни на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: изменение в 10 клиничен отговор в процента подобрение.

Фигура 5А. Отговор на болка (по скалата на Likert чрез средно единично изменение от основната линия) в процента болни на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: изменения 15 в болковия резултат от основната линия.

Фигура 5В. Общи изменения в заболяването според болния (по скалата на Likert чрез средно единично изменение от основната линия) в процента болни на 85-тия ден, както е 20 описано в Пример 3, по-долу: общи изменения в активността на заболяването според болния.

Фигура 5С. Фигура 5В. Общи изменения в заболяването според лекаря (по скалата на Likert чрез средно единично изменение от 25 основната линия) в процента болни на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: общи изменения в активността на заболяването според лекаря.

Фигура 5D. Болка (по скалата на Likert 30 чрез средно единично изменение от основната линия) в процента болни на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: болкови изменения от основната линия.

Фигура 6А. Обща преценка на болния 35 относно изменение в активността на заболяването от основната линия в обхвата от 2 единици на 85-тия ден, както е описано в Пример 3. по-долу: подобрение в активността на заболяването.

Фигура 6В. Обща преценка на лекаря относно изменение в активността на заболяването от основната линия в обхвата от 2 единици на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: подобрение в активността на заболяването.

Фигура 7А. Процентно понижение на нивата на С-реактивен протеин (CRP) на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: процентно понижение на нивата на CRP по 5 0 отношение на основната линия.

Изобретението предлага също методи за понижаване скоростта на еритроцитно утаяване, което е свързано с ревматоиден артрит.

Допълнително, изобретението предлага понижаване нивата на някои компоненти на кръвния серум, които са свързани с ревматоиден артрит, включващи С-реактивен протеин, ICAM1, разтворим Е-селектин и/или IL-2r.

Кратко описание на фигурите

Фигура 1А. Демографски данни за контингенти от болни. Демографските данни включват пол, раса и продължителност на заболяването, както е описано в Пример 3, подолу.

Фигура 1В. Демографски данни за контингенти от болни. Демографските данни включват пол, възраст, тегло и активност на заболяването, преценена от болния и от лекаря, както е описано в Пример 3. по-долу.

Фигура 1С. Демографски данни за контингенти от болни, както са дадени в Пример 3, по-долу. Демографските данни включват активност на заболяването, скорост на еритроцитно утаяване (ESR), физическа функция (инвалидност, преценена от здравна анкета), и С-реактивен протеин (CRP).

Фигура 1D. Демографски данни за контингенти от болни, както са дадени в Пример 3, по-долу. Демографските данни включват подуване на ставите, слабост на ставите, сутрешна скованост и болка.

Фигура 1Е. Демографски данни за контингенти от болни, както са дадени в Пример 3, по-долу. Демографските данни включват предходни лечения.

Фигура 2. Обобщение на прекратяванията на 85-тия ден по причина, описана в Пример 3, по-долу.

Фигура ЗА. ACR отговори на 85-тия ден, 40 както е дадено в Пример 3, по-долу: ACR-20, 50 и -70 отговори.

Фигура ЗВ. ACR-20 отговори на 85-тия ден, включително отговор към плацебо, както е дадено в Пример 3, по-долу: отговор към ACR- 45 20 с 95% доверителен интервал.

Фигура ЗС. ACR-20 отговори на 85-тия ден, както е дадено в Пример 3, по-долу: разлика в отговор към ACR-20 по отношение на 95% доверителен интервал.

66454 Bl

Фигура 7B: Разлика в понижението на нивата на С-реактивен протеин (CRP) на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: процентна разлика на понижението на нивата на CRP с 95% доверителен интервал. 5

Фигура 7С. Средно понижение на нивата на С-реактивен протеин (CRP) на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу: средно изменение от основната линия.

Фигура 8. Понижение в средното 10 изменение на нивата на разтворим рецептор на IL-2 от основната линия на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу.

Фигура 9А. Влиянието на CTLA4Ig върху слаби стави с течение на времето, както е описано 15 в Пример 3, по-долу: междинна разлика от основната линия.

Фигура 9В. Влиянието на CTLA4Ig върху слаби стави с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу: средна разлика от основната 20 линия.

Фигура 10А. Влиянието на CTLA4Ig върху подути стави с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу: междинна разлика от основната линия. 25

Фигура 10В. Влиянието на CTLA4Ig върху подути стави с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу: средна разлика от основната линия.

Фигура 11. Влиянието на CTLA4Ig върху 30 преценката за болка, средна разлика от основната линия с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу.

Фигура 12А. Влиянието на CTLA4Ig върху преценката на болния за активност на 35 заболяването, средна разлика от основната линия с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу.

Фигура 12В. Влиянието на CTLA4Ig върху преценката на лекаря за активност на 40 заболяването, средна разлика от основната линия с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу.

Фигура 13А. Влиянието на L104EA29Ylg върху слаби стави с течение на времето, както е 45 описано в Пример 3, по-долу: междинна разлика от основната линия.

Фигура 13В. Влиянието на L104EA29YIg върху слаби стави с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу: средно изменение 50 от основната линия.

Фигура 14А. Влиянието на LI 04EA29Ylg върху подути стави с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу: междинна разлика от основната линия.

Фигура 14В. Влиянието на L104EA29Ylg върху подути стави с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу: средно изменение от основната линия.

Фигура 15. Влиянието на L104EA29YIg върху преценката за болка с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу: средно изменение от основната линия.

Фигура 16А. Влиянието на L104EA29YIg върху преценката на болния за активност на заболяването, средна разлика от основната линия с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу.

Фигура 16В. Влиянието HaL104EA29YIg върху преценката на лекаря за активност на заболяването, средна разлика от основната линия с течение на времето, както е описано в Пример 3, по-долу.

Фигура 17. Процентно подобрение в инвалидността (нетрудоспособността) на болен, преценено с помощта на Въпросник за здравна преценка (HAQ), в сравнение с основната линия на 85-тия ден при лечение с CTLA4Ig и с L104EA29Ylg, както е описано в Пример 3, подолу.

Фигура 18. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на LI 04Eig, както е дадена в Пример 1, по-долу.

Фигура 19. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на LI 04EA29YIg, както е описана в Пример 1, по-долу.

Фигура 20. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на LI 04EA29LIg, както е описана в Пример 1, по-долу.

Фигура 21. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на L104EA29TIg, както е описана в Пример 1, по-долу.

Фигура 22. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на L104ЕА29 Wig, както е описана в Пример 1, по-долу.

Фигура 23. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на рецептор на CTLA4.

Фигура 24. Нуклеотидна и аминокиселинна последователност на рецептор на

66454 Bl

Всички научни и технически термини, използвани в тази заявка, имат обичайно използваните в тази област значения, ако не е посочено друго. Както се използват в тази 5 заявка, следващите думи или изрази имат точно определените значения.

Както се използва тук, лиганд се отнася до молекула, която специфично разпознава и се свързва с друга молекула, например, лиганд за 10 CTLA4 е В7 молекула.

Както се използва тук, див тип CTLA4 или немутирала CTLA4 има аминокиселинната последователност на природно срещаща се, с пълна дължина CTLA4, както е показана на Фигура 23 (описана е също в патенти на САЩ U.S. №№ 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), или нейна част или нейно производно, която разпознава и се свързва с В7 или възпрепятства В7, така че блокира свързването със CD28 и/ или CTLA4 (например, ендогенна CD28 и/или CTLA4). В конкретни изпълнения, извънклетъчният домен на див тип CTLA4 започва с метионин в позиция +1 и завършва с аспарагинова киселина в позиция +124. Див тип CTLA4 е повърхностен клетъчен протеин, който има N-краен извънклетъчен домен, трансмембранен домен и С-краен цитоплазмен домен. Извънклетъчният домен се свързва с прицелни молекули, такива като В7 молекула. В клетка, която се среща в природата, див тип CTLA4 протеин се транслира като незрял полипептид, който включва сигнален пептид в N-терминалния край. Незрелият полипептид претърпява пост-транслационно преобразуване, 35 което включва разцепване и отнемане на сигналния пептид, за да се получи продукт на CTLA4 разцепване, който има новосъздаден Nтерминален край, различаващ се от Nтерминалния край в незрялата форма. 40 Специалистът в тази област ще приеме, че може да настъпи допълнително пост-транслационно преобразуване, което отнема една или повече от аминокиселините от новосъздадения Nтерминален край на продукта на разцепване на 45 CTLA4. Алтернативно, сигналният пептид може да не бъде отнет напълно, като се получават молекули, които започват преди обичайно започващата аминокиселина метионин. По този начин, зрелият CTLA4 протеин може да започне с метионин в позиция +1 или аланин в позиция CTLA4Ig.

Фигура 25. SDS гел (Фиг. 25А) за CTLA4Ig (ивица 1), L104EIg (ивица 2) и L104EA29YIg (ивица ЗА); и хроматографии с изключване по размер на CTLA4Ig (Фиг. 25В) и Ь104ЕА29У^(Фиг.25С).

Фигури 26 (ляво и дясно изображение): Лентова диаграма на CTLA4 извънклетъчен Vобразно нагънат 1g, генериран от структурата на разтвор, определена чрез ЯМР спектроскопия.

Фигура 26 (дясно изображение) показва увеличен изглед на CDR-1 (S25-R33) областта и на MYPPPY областта, показващ разположението и ориентацията на странична верига на авидитетусилващите мутации, L104 и А29. 15

Фигури 27А & 27В. FACS анализи, показващи свързване на L104ЕА29Yig, L104Eig и CTLA4Ig с човешки CD80- или CD86трансфектирани СНО клетки, както е описано в Пример 2, по-долу. 20

Фигури 28А & 28В. Графики, показващи инхибиране на пролиферация на СЕ)80-позитивни и СП86-позитивни СНО клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигури 29А & 29В. Графики, показващи, 25 че L104ЕА29 Yig е по-ефективна от CTLA4Ig при инхибиране на пролиферация на първично или вторично алостимулирани Т клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигури 30А-С. Графики, илюстриращи, че L104EA29YIg е по-ефективна от CTLA4Ig при инхибиране на IL-2 (Фиг. 30А), IL-4 (Фиг. ЗОВ) и гама-интерферон (Фиг. ЗОС) продуцирането на цитокин на алостимулирани човешки Т клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигура 31. Графика, показваща, че L104EA29YIg е по-ефективна от CTLA4Ig при инхибиране пролиферацията на фитохемаглутинин - (РНА) стимулирани маймунски Т клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигура 32. Графика, показваща анализа на равновесно свързване на L104EA29YIg, L104Eig и див тил CTLA4Ig със CD86Ig.

Фигури ЗЗА & В. Понижение в нивата на разтворим 1САМ-1 н разтворим Е-селектин, средно изменение от основната линия на 85-тия ден, както е описано в Пример 3, по-долу.

Подробно описание на изобретението

Дефиниции

66454 Bl

1. Зрялата форма на CTLA4 молекулата включва извънклетъчния домен или някаква негова част, която се свързва с В7.

Както се използва тук, CTLA4 мутантна молекула означава див тип CTLA4, както е 5 показано на Фигура 23 или която и да е нейна част или нейно производно, които имат мутация или множество мутации (за предпочитане, в извънклетъчния домен на див тип CTLA4). CTLA4 мутантна молекула има последователност, която 10 е подобна, но не идентична на последователността на див тип CTLA4 молекула, но все пак се свързва с В7. Мутациите могат да включват един или повече аминокиселинни остатъци, заместени с аминокиселина, която има консервативна 15 (например, замества левцин с изолевцин) или неконсервативна (например, замества глицин с триптофан) структура или химични свойства, аминокиселинни делеции, добавяния, мутации с изместване на рамката или окастряния. CTLA4 20 мутантни молекули могат да включват не-СТЬА4 молекула в тях или присъединена към тях. Мутантните молекули могат да бъдат разтворими (т.е., циркулиращи) или свързани с клетъчна повърхност. Други CTLA4 мутантни молекули 25 включват такива, описани в заявки за патент на САЩ, серийни номера 09/865,321,60/214,065 и 60/287,576; в патенти на САЩ, U.S. №№ 6,090,914, 5,844,095 и 5,773,253; и както е описано от Peach, R. J., et al., в J. Exp. Med. 30 180:2049-2058 (1994). CTLA4 мутантни молекули могат да се получат синтетично или рекомбинантно.

synthetically or recombinantly.

CTLA4Ig е разтворим слят протеин, 35 съдържащ извънклетъчен домен на див тип CTLA4, присъединен към 1g опашка, или негова част, която се свързва с В7. Конкретно изпълнение включва извънклетъчния домен на див тип CTLA4 (както е показано на Фигура 23), започващ с 40 метионин в позиция +1 и завършващ с аспарагинова киселина в позиция +124; или започващ с аланин в позиция -1 до аспарагинова киселина в позиция +124; свързващ аминокиселинен остатък глутамин в позиция 45 + 125; и имуноглобулинова част, включваща глутаминова киселина в позиция +126 посредством лизин в позиция +357 (ДНК, кодираща CTLA41g е депозирана на 31 май, 1991 в American Type Culture Collection (ATCC), 10801 50

University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, при условията на Будапещенския договор и е записана с номер на постъпване в колекцията АТСС 68629; Linsley, Р., et al., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, клетъчна линия от яйчник на китайски хамстер (СНО), експресираща CTLA4, е депозирана на 31 май, 1991 с АТСС идентификационен номер CRL10762). Разтворимите CTLA4Ig молекули, използвани в методите и/или китовете съгласно изобретението, могат да включват или да не включват сигнална (водеща) пептидна последователност. Обикновено, в методите и/ или китовете съгласно изобретението, молекулите не включват сигнална пептидна последователност.

L104EA29YIg е слят протеин, който е разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща извънклетъчен домен на див тип CTLA4 с аминокиселинни изменения A29Y (тирозинен аминокиселинен остатък, заместващ аланин в позиция 29) и LI 04Е (аминокиселинен остатък на глутаминова киселина, заместващ левцин в позиция +104) или нейна част, която се свързва с В7 молекула, присъединена към 1g опашка (включена във Фигура 19; ДНК кодиращ L104EA29YIg е депозиран на 20 юни, 2000 с АТСС номер РТА-2104; висящ в заявки за патент на САЩ, серийни номера 09/579,927,60/287,576 и 60/214,065, включени тук чрез цитиране). Разтворимите L104EA29YIg молекули, използвани в методите и/или китовете съгласно изобретението, могат да включват или да не включват сигнална (водеща) пептидна последователност. Обикновено, в методите и/ или китовете съгласно изобретението, молекулите не включват сигнална пептидна последователност.

Както се използва тук, разтворима се отнася до всяка молекула или нейни фрагменти или производни, която не е свързана или прикрепена към клетка, т.е., е циркулираща. Например, CTLA4, В7 или CD28 могат да станат разтворими чрез присъединяване на имуноглобулинова (1g) част към извънклетъчния домен на CTLA4, В7 или CD28, съответно. Алтернативно, молекула като CTLA4 може да се превърне в разтворима чрез отстраняване на нейния трансмембранен домен. Обикновено, разтворимите молекули, използвани в методите

Q

66454 Bl съгласно изобретението, не включват сигнална (или водеща) последователност.

Както се използва тук, разтворими CTLA4 молекули означава несвързани с клетъчна повърхност (т.е., циркулиращи) CTLA4 молекули или която и да е функционална част на CTLA4 молекула, която се свързва с В7, включително, без ограничение до изброените: CTLA4Ig слети протеини (например, АТСС 68629), при което извънклетъчният домен на CTLA4 е слят с имуноглобулинова (1g) част, която прави слятата молекула разтворима, или техни фрагменти, или техни производни; протеини, в които извънклетъчният домен на CTLA4 е слят или съединен с част от биологично активен или химично активен протеин, такъв като генен продукт на папиломавирус Е7 (CTLA4-E7), меланома-свързан антиген р97 (CTLA4-p97) или HIV env протеин (CTLA4-env gpl20) или техни фрагменти и производни; хибридно (химерно) слети протеини, такива като CD28/CTLA4Ig, или техни фрагменти и производни; CTLA4 молекули с трансмембранен домен, на които е отстранен трансмембранният домен, за да се превърне протеинът в разтворим (Oaks, Μ. К., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144-153), или техни фрагменти и производни. Разтворими CTLA4 молекули включват също техни фрагменти, части или производни и разтворими CTLA4 мутантни молекули, които имат CTLA4 свързваща активност. Разтворимите CTLA4 молекули, които се използват в методите съгласно изобретението, могат да включват или да не включват сигнална (водеща) пептидна последователност. Обикновено, в методите съгласно изобретението, молекулите не включват сигнална пептидна последователност.

Както се използва тук, извънклетъчният домен на CTLA4 е частта на CTLA4, която разпознава и се свързва с лиганди на CTLA4, такива като В7 молекули. Например, извънклетъчен домен на CTLA4 включва метионин в позиция +1 до аспарагинова киселина в позиция +124 (Фигура 23). Алтернативно, извънклетъчен домен на CTLA4 съдържа аланин в позиция -1 до аспарагинова киселина в позиция +124 (Фигура 123). Извънклетъчният домен включва фрагменти или производни на CTLA4, които се свързват с В7 молекула. Извънклетъчният домен на CTLA4, както е показан на Фигура 23, може да включва също мутации, които променят свързващият авидитет на CTLA4 молекулата за В7 молекула.

Както се използва тук, мутация означава изменение в нуклеотидната или аминокиселинната последователност на див тип молекула, например, промяна в ДНК и/или в аминокиселинни последователности на див тип CTLA4 извънклетъчен домен. Мутация в ДНК може да измени кодон, което води до промяна в аминокиселинната последователност. Промяна в ДНК може да включва субституции, делеции, инсерции, алтернативно снаждане или окастряния. Аминокиселинната промяна може да включва субституции, делеции, инсерции, добавяния, окастряния или обработка, или грешки при разцепване на протеина. Алтернативно, мутации в нуклеотидна последователност могат да имат за резултат мълчалива мутация в аминокиселинната последователност, както е добре известно в предшестващото състояние на техниката. В тази връзка, някои нуклеотидни кодони кодират същата аминокиселина.

Примери включват нуклеотидни кодони CGU, CGG, CGC и CGA, кодиращи аминокиселината, аргинин (R); или кодони GAU и GAC, кодиращи аминокиселината, аспарагинова киселина (D). Следователно, един протеин може да бъде кодиран от една или повече молекули на нуклеинова киселина, които се различават по тяхна специфична нуклеотидна последователност, но все пак кодират протеинови молекули, имащи идентични последователности. Последователностите, кодиращи аминокиселина, са както следва:

66454 Bl

Аминоки- селина	Обозначение	Обозначение c една буква	Кодони
аланин	Ala	A	GCU, GCC, GCA. GCG
uисгеин	Cys	C	UGU, UGC
аспарагинова	Asp	D	GAU, GAC
киселина
глутаминова	Glu	E	GAA, GAG
киселина
фенилаланин	Phe	F	uuu, uuc
глицин	Gly	G	GGU, GGC, GGA. GGG
хистидин	His	H	CAU, CAC
изолевцин	He	1	AUU, AUC, AUA
лизи н	Lys	K	AAA, AAG
левнин	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC.
			CUA. CUG
метионин	Met	M	AUG
аспарагин	Asn	N	AAU, AAC

Аминоки-	Обозна-	Обозначение	Кодони
селина	чение	c една буква
пролин	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
глутамин	Gin	Q	CAA, CAG
аргинин	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG,
			AGA, AGG
серин	Ser	S	UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
треонин	Thr	T	ACU, ACC, ACA, ACG
валин	Vai	V	GUU, GUC, GUA, GUG
триптофан	Trp	w	UGG
тирозин	Tyr	Y	UAU, UAC

66454 Bl

Мутантната молекула може да има една или повече мутации.

Както се използва тук, не-СТТА4 протеинова последователност или не-СТЬА4 молекула означава всяка протеинова молекула, 5 която не се свързва с В7 и не участва в свързването на CTLA4 с неговата мишена. Един пример включва, без ограничение до изброените, имуноглобулинова (1g) постоянна област или част от нея. За предпочитане, 1g постоянната област е 10 постоянна област на човешки или маймунски 1g, например, човешки С(гама)1, включващ hinge, СН2 и СНЗ области. Постоянната 1g област може да мутира, за да се намалят нейните ефекторни функции (патенти на САЩ, U.S. №№ 5,637,481, 15 5,844,095 и 5,434,131).

Както се използва тук, фрагмент или част е всяка част или сегмент на CTLA4 молекула, за предпочитане извънклетъчният домен на CTLA4 или негова част или сегмент, 20 която разпознава и се свързва с нейна мишена, например В7 молекула.

Както се използва тук, В7 се отнася до семейството на В7 молекулите, включващи, без ограничение до тях, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86) и 25 В7-3, които могат да разпознаят и се свържат със CTLA4 и/или CD28.

Както се използва тук, В7-позитивни клетки са всякакви клетки с един или повече типове В7 молекули, експресирани върху 30 клетъчната повърхност.

Както се използва тук, производно е молекула, която има обща хомоложна последователност и активност с нейната родителска молекула. Например, производно на 35 CTLA4 включва разтворима CTLA4 молекула, която има аминокиселинна последователност с поне 70% подобие с извънклетъчния домен на див тип CTLA4 и която разпознава и се свързва с В7, например, CTLA4Ig или разтворима CTLA4 40 мутантна молекула L104EA29YIg.

Както се използва тук, блокиране или инхибиране на рецептор, сигнал или молекула означава намеса (възпрепятстване) в активирането на рецептора, сигнала или молекулата, както е 45 установено чрез утвърден за целта тест. Например, блокиране на клетъчно-медииран имунен отговор може да се открие чрез установяване на намаляването на симптоми, свързани с ревматично заболяване. Блокирането 50 или инхибирането може да бъде частично или пълно.

Както се използва тук, блокиране на взаимодействие на В7 означава възпрепятстване на свързването на В7 с негови лиганди, такива като CD28 и/или CTLA4, като по този начин се препятстват взаимодействията на Тклетки и В7-позитивни клетки. Примери на средства, които блокират взаимодействията на В7, включват, без ограничение до изброените, молекули, такива като антитяло (или негова част или производно), което разпознава и се свързва с всяка от CTLA4, CD28 или В7 молекулите (например, В7-1, В7-2); разтворима форма (или техни части или производни) на молекулите, такава като разтворима CTLA4; пептиден фрагмент или друга малка молекула, предназначена да участва в клетъчния сигнал посредством СТЕА4/С028В7-медиираното взаимодействие. В предпочитано изпълнение, блокиращото средство е разтворима CTLA4 молекула, такава като CTLA4Ig (АТСС 68629) или L104EA29YIg (АТСС РТА-2104), разтворима CD28 молекула, такава като CD28Ig (АТСС 68628), разтворима В7 молекула, такава като B7Ig (АТСС 68627), анти-В7 моноклонално антитяло (например, АТСС НВ-253, АТСС CRL2223, АТСС CRL-2226, АТСС НВ-301, АТСС НВ11341 и моноклонални антитела, както са дадени от Anderson et al. в патент на САЩ, U.S. 6,113,898 или от Yokochi et al., 1982, J. Immun., 128(2)823827), анти-СТЕА4 моноклонално антитяло (например, АТСС НВ-304 и моноклонални антитела, както са описани в литературни източници 82-83), и/или анти-СО28 моноклонално антитяло (например, АТСС MB 11944 и mAb 9.3, както са описани от Hansen (Hansen et al., 1980, Immunogenetics 10: 247-260) или от Martin (Martin et al., 1984, J. Clin. Immun., 4( 1): 1822)).

Както се използва тук, заболяване на имунната система означава всяко заболяване, медиирано от Т-клетъчни взаимодействия с В7позитивни клетки, включително, без ограничение до изброените, автоимунни заболявания, нарушения, свързани с трансплантат и имунопролиферативни заболявания. Примери на заболявания на имунната система включват трансплантат срещу гостоприемник заболяване (GVHD) (например, такова, което t 1

66454 Bl може да се дължи на трансплантация на костен мозък или на индуцирането на поносимост), имунни нарушения, свързани с отхвърляне на присаден трансплантат, хронично отхвърляне и тъканни или клетъчни ало- или ксенотрансплан- 5 тати, включително твърди органи, кожа, острови, мускули, хепатоцити, неврони. Примери на имунопролиферативни заболявания включват, без ограничение до тях, псориазис, Т-клетъчен лимфом, Т-клетъчна остра лимфобластна 10 левкемия, тестикуларен ангиоцентричен Тклетъчен лимфом, доброкачествен лимфоцитен ангит, лупус (например, еритематозен лупус, нефритен лупус), тироидит на Хашимото, първичен микседем, базедова болест, 15 пернициозна анемия, автоимунен атрофичен гастрит, болест на Адисън, диабети (например, инсулин зависим захарен диабет, захарен диабет тип 1, захарен диабет тип II), синдром на добро пасище, миастения гравис, пемфигус, болест на 20 Крон, възпаление на симпатиковия нерв на окото, автоимунен увеит, множествена склероза, автоимунна хемолитична анемия, идиопатична тромбоцитопения, първична цироза на жлъчка, хронично действащ хепатит, улцурозен колит, 25 синдром на Шагрен (ксеродерматоза), ревматични заболявания (например, ревматоиден артрит), полиомиозит, склеродерма и смесено заболяване на съединителна тъкан.

Както се използва тук, ревматични 30 заболявания означава заболяване, което поразява ставите, костите, меките тъкани или гръбначния мозък (Mathies, Η. 1983 Rheuma) и включва възпалителен ревматизъм, дегенеративен ревматизъм, извънставен ревматизъм и 35 колагенови заболявания. Допълнително, ревматичните заболявания включват, без ограничение до изброените, хроничен полиартрит, артропатичен псориазис, анкилозиращ спондилит, ревматоиден артрит, нодозен панар- 40 териит, системен еритематозен лупус, прогресираща системна склеродермия, хумероскапуларен периартрит, подагра, хондрокалциноза, дерматомиозит, мускулен ревматизъм, миозит и миогелоза. Известно е, че някои ревматични забо- 45 дявания са автоимунни заболявания, причинени от изменен имунен отговор на индивида.

Както се използва тук, генна терапия е метод за лечение на заболяване чрез генетична манипулация, при която последователност на 50 нуклеинова киселина се пренася в клетка, след което клетката експресира всеки генетичен продукт, кодиран от нуклеиновата киселина. Например, както е добре известно на специалиста в тази област, пренос на нуклеинова киселина може да се осъществи чрез инсерция на експресионен вектор, съдържащ въпросната нуклеинова киселина в клетки ex vivo или in vitro, посредством различни методи, включващи, например, утаяване на калциев фосфат, диетиламиноетилдекстран, полиетиленгликол (ПЕГ), електропорация, директно инжектиране, линофекция или вирусна инфекция (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman and Co, New York, N.Y., 1993) и Wu, Methods in Enzymology (Academic Press, New York, 1993), всеки от които е включен тук чрез цитиране). Алтернативно, последователности на нуклеинова киселина, представляващи интерес, могат да се пренесат в клетка in vivo чрез различни вектори и чрез различни методи, включващи например, директно прилагане на нуклеиновата киселина в индивида (Williams et al., 1991 PNAS 88:27262730) или инсерция (вмъкване) на нуклеиновата киселина във вирусен вектор и инфектиране на индивида с вируса (Battleman et al, 1993 J. Neurosci 13:94-951; Carroll et aL, 1993 J Cell Biochem. 17E:241; Lebkowski et al. патент U.S. 5,354,678; Davison and Elliott, Molecular Virology: A Practical Approach (1RL Press, New York, 1993)). Други методи, които се използват за пренос in vivo включват инкапсулиране на нуклеиновата киселина в липозоми и директен пренос на липозомите или на липозоми, комбинирани с хемаглутиниращ Sendai вирус, в индивид (патент U.S. 5,824,655, включен тук чрез цитиране). Трансфекгираните или инфектираните клетки експресират протеиновите продукти, кодирани от нуклеиновата киселина, за да се подобри заболяването или да се облекчат симптомите на заболяването.

С цел да се разбере по-пълно описаното тук изобретение, е дадено следващото описание.

Състави и методи на изобретението Настоящото изобретение предлага състави и използването им за лечение на заболявания на имунната система, такива като ревматични т

66454 Bl заболявания, чрез прилагане към индивид на ефективно количество лиганд, който се свързва с В7, например, разтворими CTLA4 молекули (такива като CTLA41g и/или L104EA29 Yig) и mAbs, които разпознават и се свързват с В7. 5 Ефективното количество се определя като количество разтворими CTLA4 молекули, което, когато се свързва с В7 молекули върху В7позитивни клетки, инхибира свързването на В7 молекули с ендогенни лиганди, такива като 10 CTLA4 и CD28.

В предпочитано изпълнение, имунното заболяване е ревматично заболяване. Ревматични заболявания се характеризират с (i) възпаление или дегенериране на мускулно-скелетни или на 15 съединителна тъкан структури на тялото, поспециално на ставите и включва мускули, сухожилия, хрущяли, синовиални и фиброзни тъкани; (ii) съпътствани са от подуване на ставите, слабост на ставите, възпаление, сутрешна 20 скованост и/или болка, или увреждане на движението или функцията на такива структури, в някои случаи; (iii) често се съпътстват от серологично доказателство за ревматоиден фактор и други заместващи възпаление белези. 25 Ревматичните заболявания включват, без ограничение до изброените, ставен оток, отслабване на ставите, възпаление, сутрешна скованост и болка, водеща до физична неспособност. Индивиди, поразени от напреднали 3 0 стадии на артрит, страдат от симптоми на структурно увреждане и омаломощаваща болка. И други органи могат да бъдат засегнати от автоимунния механизъм.

Състави 35

Настоящото изобретение предлага състави за лечение на имунни заболявания, такива като ревматични заболявания, съдържащи разтворими CTLA4 молекули. Освен това, настоящото изобретение предлага състави, съдържащи 40 биологично средство, което инхибира Т-клетъчна функция, но не и изчерпване на Т-клетки у човека, чрез контактуване на В7-позитивни клетки в човека с разтворима CTLA4. Примери на разтворима CTLA4 включват CTLA4Ig и 45 разтворима CTLA4 мутантна молекула, като например L104EA29YIg.

CTLA4 молекули, с мутантни или див тип последователности, могат да станат разтворими чрез деления на CTLA4 трансмембранния сегмент 50 (Oaks, Μ. К., et al., 2000 Cellular Immunology 201:144-153).

Алтернативно, разтворими CTLA4 молекули, с мутантни или див тип последователности, могат да бъдат слети протеини, при което CTLA4 молекулите се сливате не-СТЬА4 части, такива като имуноглобулинови (1g) молекули, които правят CTLA4 молекулите разтворими. Например, CTLA4 слят протеин може да включва извънклетъчния домен на CTLA4, слят с имуноглобулинов постоянен домен, което води до получаване на CTLA4 молекулата (Фигура 24) (Linsley, Р. S., et al., 1994 Immunity 1:79380).

За клинични протоколи, се предпочита имуноглобулиновата област да не предизвиква вреден имунен отговор у индивида. Предпочитаната част е имуноглобулиновата постоянна част, включително човешки или маймунски имуноглобулинови постоянни части. Един пример за подходяща имуноглобулинова част е човешки Сгама1, включително hinge, СН2 и СНЗ области, които могат да медиират ефекторни функции, такива като свързване с Fc рецептори, като медиират комплементзависима цитотоксичност (CDC) или медиират антитяло-зависима клетъчно-медиирана цитотоксичност (ADCC). Имуноглобулиновата част може да има една или повече мутации в нея (например, в СН2 домена, за да ограничи ефекторни функции, такива като CDC или ADCC), при което мутацията модулира способността за свързване на имуноглобулина с негов лиганд, чрез повишаване или намаляване на свързващата способност на имуноглобулина с Fc рецептори. Например, мутации в имуноглобулина могат да включват изменения във всеки от или всички негови цистеинови остатъци в hinge домена, например, цистеините в позиции +130. +136 и +139 се субституират със серин (Фигура 24). Имуноглобулиновата молекула може да включва също пролинът в позиция +148, заместен със серин, както е показано на Фигура 24. Освен това, мутациите в имуноглобулиновата част могат да включват наличието на левцин в позиция +144, заместен с фенилаланин, левцин в позиция +145, заместен с глутаминова киселина или с глицин в позиция +147, заместен с аланин.

Допълнително, не-СТЬА4 части за използване в разтворимите CTLA4 молекули или

66454 Bl пептид на онкостатин М, обхващащ аминокиселинната последователност, която има метионин в позиция -26 до аланин в позиция -1, CTLA4 частта, обхващаща аминокиселинната последо5 вателност, която има метионин в позиция +1 до аспарагинова киселина в позиция +124, свързване на аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125 и имуноглобулиновата част, обхващаща аминокиселинна последователност, 10 която има глутаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357.

По-конкретно, разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението, съдържащи мутиралите CTLA4 последователности, описани по-долу, са слети молекули, съдържащи човешки IgCraMal части, слети с мутиралите CTLA4 фрагменти.

В едно изпълнение, разтворимите CTLA4 мутантни молекули съдържат IgCraMal, слят с CTLA4 фрагмент, съдържащ едносайтова мутация в извънклетъчния домен. Извънклетъчният домен на CTLA4a съдържа метионин в позиция +1 до аспарагинова киселина в позиция +124 (например фигура 23). Извънклетъчната част на CTLA4 може да съдържа аланин в позиция -1 до аспарагинова киселина в позиция + 124 (например фигура 23). Примери за едносайтови мутации включват следващите, в които левцинът в позиция +104 е заменен с всяка друга аминокиселина:

разтворими CTLA4 мутанти молекули включват, без ограничение до изброените. р97 молекула, env gp 120 молекула, Е7 молекула и ova молекула (Dash, В. et al. 1994 J. Gen. Virol. 75 (Pt 6):138997; Ikeda, T., et al. 1994 Gene 138 (1-2): 193-6; Falk, K., et al. 1993 Cell. Immunol. 150(2):44752; Fujisaka, K. et al. 1994 Virology 204(2):78993). Възможни са и други молекули (Gerard, С. et al. 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R. et al. 1989 63( 10):4370; Smith, D. et al. 1987 Science 238:1704; Lasky, L. 1996 Science 233:209).

Разтворимата CTLA4 молекула съгласно изобретението може да включва сигнална пептидна последователност, свързана с Nтерминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4 частта на молекулата. Сигналният пептид може да бъде всяка последователност, която би позволила секретиране на молекулата, включително сигналният пептид от онкостатин М (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847- 20 2853), или от CDS (Jones, N. H. el al., (1986) Nature 323:346-349), или сигналният пептид от всеки извънклетъчен протеин.

Разтворимата CTLA4 молекула съгласно изобретението може да включва сигнален пептид 25 на онкостатин М, свързан с N-терминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4, и човешката имуноглобулинова молекула (например, hinge, СН2 и СНЗ), свързана със С-терминалния край на извънклетъчния домен (див тип или мутантен) 3 на CTLA4. Тази молекула включва сигналния

Едносайтови мутации	Промяна в кодона
L104E!g	Глутаминова киселина GAG
L104Slg	Серин AGT
L104Tlg	Треонин ACG
L104Alg	Аланин GCG
L104Wlg	Триптофан TGG
L104Qlg	Глутамин GAG
L104Klg	Лизин AAG
L104Rlg	Аргинин OGG
L104Glg ..................	Глицин GGG

А

66454 Bl

Разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да имат свързващ аминокиселинен остатък, който е разположен между CTLA4 частта и 1g частта на молекулата. Свързващата аминокиселина може да бъде всяка 5 аминокиселина, включително глутаминова. Свързващата аминокиселина може да бъде въведена посредством методи на молекулярен или химичен синтез, известни за целта.

Настоящото изобретение предлага CTLA4 10 мутантни молекули, включващи сигнална пептидна последователност, свързваща с Nтерминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4 частта на мутантната молекула. Сигналният пептид може да бъде всяка 15 последователност, която ще позволи секретиране на мутантната молекула, включително сигналния пептид от онкостатин М (Malik et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2863), или от CD5 (Jones, N. H. et al., 1986 Nature 323:346-349), или 20 сигналният пептид от извънклетъчния протеин.

Изобретението предлага CTLA4 мутантни молекули, съдържащи едносайтова мутация в извънклетъчния домен на CTLA4, такива като L104Elg (както е дадено на фигура 18) или 25 L104Sig, като L104EIg и L104SIg са мутирали в техните CTLA4 последователности, така че левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина или серин, съответно. Едносайтови мутантни молекули допълнително включват 30 CTLA4 части, обхващащи метионин в позиция +1 до аспарагинова киселина в позиция +125 и имуноглобулинова част, обхващаща глутаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357. Имуноглобулиновата част на мутантната 35 молекула може също да бъде мутирала така, че цистеините в позиция +130, +136 и +139 са заместени със серин и пролинът в позиция +148 е заместен със серин. Алтернативно, разтворимата CTLA4 мутантна молекула с едносайтова 40 мутация може да съдържа CTLA4 част, обхващаща аланин в позиция -1 до аспарагинова киселина в позиция +124.

Алтернативно, тези мутантни молекули могат да съдържат CTLA4 част, обхващаща 45 аланин в позиция -1 до аспарагинова киселина в позиция +124.

В други изпълнения на изобретението, разтворимите CTLA4 мутантни молекули включват химерни CTLA4/CD28 хомоложни 50 мутантни молекули, които се свързват с В7 (Peach, R. J„ et al., 1994 J. Exp. Med. 180:20492058). Примери на такива химерни CTLA4/CD28 мутантни молекули включват HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 и HS14 (патент на САЩ. U.S. № 5,773,253).

Предпочитани изпълнения на изобретението са разтворими CTLA4 молекули, такива като CTLA4Ig (както е показано на Фигура 24, започваща с метионин в позиция +1 и завършваща с лизин в позиция +357) и разтворим CTLA4 мутант L104EA29YIg (както е показано на Фигура 19, започваща с метионин в позиция +1 и завършваща с лизин в позиция +357). Изобретението предлага допълнително молекули на нуклеинова киселина, съдържащи нуклеотидни последователности, кодиращи аминокиселинните последователности, съответстващи на разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението. В едно изпълнение, молекулата на нуклеинова киселина е ДНК (например, кДНК) или неин хибрид. ДНК, кодираща CTLA4Ig (Фигура 24), е депозирана на 31 май, 1991 в American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 и е вписана c ATCC номер на постъпване ATCC 68629. ДНК, кодираща L104EA29YIg (последователност, включена във Фигура 19), е депозирана на 19 юни, 2000 в АТСС и е вписана с АТСС номер на постъпване РТА-2104. Алтернативно, молекулите на нуклеинова киселина са РНК или неин хибрид.

Освен това, изобретението предлага вектор, който включва нуклеотидните последователности съгласно изобретението. Примери на експресионни вектори включват, без ограничение до изброените, вектори за клеткигостоприемници от бозайници (например, BPV1, pHyg, pRSV, pSV2, рТК2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV (Life Technologies); pVPakc вектори, pCMV вектори, pSG5 вектори (Stratagene)), ретровирусни вектори (например, pFB вектори (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) или техни модифицирани форми, аденовирусни вектори; аденосвързани вирусни вектори, бакуловирусни вектори, дрождени вектори (например, pESC вектори (Stratagene)).

Предлага се и система гостоприемник

66454 Bl вектор. Тази система гостоприемник-вектор включва вектора съгласно изобретението в подходяща клетка-гостоприемник. Примери за подходящи клетки-гостоприемници включват, без ограничение до изброените, прокариотни и 5 еукариотни клетки. Съгласно практиката на настоящото изобретение, еукариотните клетки са също подходящи клетки-гостоприемници. Примери на еукариотни клетки включват всяка животинска клетка, независимо дали е първична 10 или имортализирана, дрождена (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Pichia pastoris) и растителни клетки. Миеломни, COS и CHO клетки са примери на животински клетки, които могат да бъдат 15 използвани като гостоприемници. Конкретни СНО клетки включват, без ограничение до изброените, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCCNo.CCL- 20 61), CHO-K1 Tet-On клетъчна линия (Clontech), CHO, обозначена като ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO клон 13 (GEIMG, Geneva, IT), CHO клон B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF, обозначена като ECACC 93061607 25 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) и RRCHOK1, обозначена като ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примерни растителни клетки включват тютюневи (цели растения, клетъчна култура или калус), царевични, соеви и оризови 30 клетки. Приемливи са и царевични, соеви и оризови семена.

CTLA4 мутантните молекули съгласно изобретението могат да бъдат изолирани като природно срещащи се полипептиди или от всеки 3 5 друг източник, независимо дали е природен, синтетичен, полусинтетичен или рекомбинантен. Съответно, CTLA4 мутантните полипептидни молекули могат да бъдат изолиран като природно срещащи се протеини от всеки вид, по- 40 специално от бозайник, включително говежди, овчи, свински, миши, конски и за предпочитане, човешки. Алтернативно, CTLA4 мутантните полипептидни молекули могат да бъдат изолирани като рекомбинантни полипептиди, 45 които се експресират в прокариотни или еукариотни клетки-гостоприемници или се изолират като химично синтезирани полипептиди.

Специалистът в тази област лесно ще приложи стандартните методи за изолиране, за 50 да получи изолирани CTLA4 мутантни молекули. Характерът и степента на изолиране ще зависи от източника и предвиденото използване на изолираните молекули.

CTLA4 мутантни молекули и техни фрагменти или производни могат да бъдат получени по рекомбинантни методи. Съответно, върху изолирана нуклеотидна последователност, кодираща див тип CTLA4 молекули, може да се въздейства така, че да се въведат мутации, което води до нуклеотидни последователности, които кодират CTLA4 мутантните полипептидни молекули. Например, нуклеотидните последователности, кодиращи CTLA4 мутантните молекули, могат да бъдат получени чрез методи на сайт-насочена мутагенеза, с използване на праймери и PCR амплификация. Праймерите могат да включват специфични последователности, проектирани да въведат желани мутации. Алтернативно, праймерите могат да бъдат проектирани да включват рандомизирани или полурандомизирани последователности, за да въведат случайни мутации. Могат да се приложат стандартни рекомбинантни методи (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2-po издание, Sambrook, Fritch, and Maniatis 1989, Cold Spring Harbor Press) и PCR технология (патент на САЩ, U. S. No. 4,603,102) за генериране и изолиране на CTLA4 мутантни полинуклеотиди, кодиращи CTLA4 мутантни полипептиди.

Изобретението включва фармацевтични състави за използване при лечението на заболявания на имунната система, съдържащи фармацевтично ефективни количества от разтворими CTLA4 молекули. В някои изпълнения, заболяванията на имунната система са медиирани от CD28/CTLA4/B7 взаимодействия. Разтворимите CTLA4 молекули са, за предпочитане, разтворими CTLA4 молекули с див тип последователност и/или разтворими CTLA4 молекули, които имат една или повече мутации в извънклетъчния домен на CTLA4. Фармацевтичните състави могат да включват разтворими CTLA4 протеинови молекули и/или молекули на нуклеинова киселина, и/или вектори, кодиращи молекулите. В предпочитани изпълнения, разтворимите CTLA4 молекули имат аминокиселинната последователност на извънклетъчния домен на CTLA4, както е показано на с

66454 Bl

Фигури 24 или 19 (CTLA4Ig или L104EA29Y, съответно). Като още повече се предпочита, разтворимата CTLA4 мутантна молекула да е L104EA29YIg, както е дадено тук. Съставите могат да съдържат допълнително други 5 терапевтични средства, включително, без ограничение до изброените, лекарствени токсини, ензими, антитела или конюгати.

Съгласно стандартната практика в състоянието на техниката, се предлагат 10 фармацевтични състави, съдържащи молекулите съгласно изобретението, смесени с приемлив носител или помощно средство, което е добре известно на специалиста в тази област. Фармацевтичните състави, за предпочитане, 15 съдържат подходящи носители и помощни средства, които включват който и да е материал, който в комбинация с молекулата съгласно изобретението (например, разтворима CTLA4 молекула, такава като CTLA4Ig или L104ЕА29 Y), 20 запазва активността на молекулата и не е реактивоспособен с имунната система на индивида. Тези носители и помощни добавки включват, без ограничение до изброените, йонообменни вещества, алуминиев диоксид, 25 алуминиев стеарат, лецитин, серумни протеини, такива като човешки серумен албумин, буферни вещества, такива като фосфати, глицин, сорбинова киселина, калиев сорбат, частични глицеридни смеси на наситени растителни мастни 3 0 киселини, фосфатно-буфериран физиологичен разтвор, вода, емулсии (например, масло/вода емулсия), соли или електролити, такива като протаминов сулфат, двунатриев хидрогенфосфат, калиев хидрогенфосфат, натриев хлорид, цинкови 3 5 соли, колоиден силициев диоксид, магнезиев трисиликат, поливинилпиролидон, вещества на целулозна основа и полиетиленгликол. Други носители могат да включват също стерилни разтвори; таблетки, включително обвити таблетки 40 и капсули. Обикновено, такива носители съдържат пълнители, такива като нишесте, мляко, захар (например, захароза, глюкоза, малтоза), някои видове глина, желатин, стеаринова киселина или нейни соли, магнезиев или калциев 45 стеарат, талк, растителни мазнини или масла, смоли, гликоли или други известни за целта пълнители. Такива носители могат да включват също вкусови добавки и оцветители или други ингредиенти. От състави, съдържащи такива 50 носители, се приготвят лекарствени форми с помощта на добре познати общоприети методи. Такива състави могат да се изготвят като лекарствени форми в различни липидни състави, такива като, например, липозоми, както и в различни полимерни състави, такива като полимерни микросфери.

Методи

Изобретението предлага методи за регулиране на функционални взаимодействия на CTLA4- и СО28-позитивни клетки с В7-позитивни клетки. Методите включват контактуване на В7-позитивните клетки с разтворима CTLA4 молекула съгласно изобретението, така че да се получат разтворими CTLA4/B7 комплекси, комплексите се намесват в реакцията на ендогенна CTLA4 и/или CD28 молекула с В7 молекула.

Настоящото изобретение предлага също методи за инхибиране на Т-клетъчна функция, но не и изчерпването на Т-клетки у човек, чрез контактуване на В7-позитивни клетки в човек с разтворима CTLA4 молекула. Примери на разтворима CTLA4 молекула включват CTLA41g и разтворима CTLA4 мутантна молекула, като например LI 04EA29YIg.

Настоящото изобретение предлага, освен това, методи за лечение на заболявания на имунната система, такива като ревматични заболявания. Тези методи включват прилагане на терапевтичен състав, съдържащ разтворими CTLA4 молекули съгласно изобретението, към индивид, в количество, което е ефективно да облекчи поне един от симптомите, свързани със заболяване на имунната система. Допълнително, изобретението може да предложи дългосрочно лечение на заболявания на имунната система чрез блокиране на взаимодействието Т-клетки/ В7-позитивни клетки, като по този начин се блокира Т-клетъчната стимулация чрез състимулаторни сигнали, такова като свързване на В7 с CD28, което води до индуциране на Тклетъчна енергия или толерантност. Заболявания на имунната система включват, без ограничение до изброените, автоимунни заболявания, нарушения, свързани с трансплантат и имунопролиферативни заболявания. Примери на заболявания, свързани с трансплантат, включват трансплантат срещу гостоприемник заболяване (GVHD) (например, такова, което може да се

7

66454 Bl дължи на трансплантация на костен мозък или на индуцирането на поносимост), имунни нарушения, свързани с отхвърляне на присаден трансплантат, хронично отхвърляне и тьканни или клетъчни ало- или ксенотрансплантати, 5 включително твърди органи, кожа, острови (на Лангерханс), мускули, хепатоцити, неврони. Примери на имунопролиферативни заболявания включват, без ограничение до изброените, псориазис, Т-клетъчен лимфом, Т-клетъчна 10 остра лимфобластна левкемия, тестикуларен ангиоцентричен Т-клетъчен лимфом, доброкачествен лимфоцитен ангит; и автоимунни заболявания, такива като лупус (например, еритематозен лупус, нефритен лупус), тироидит 15 на Хашимото, първичен микседем, базедова болест, пернициозна анемия, автоимунен атрофичен гастрит, болест на Адисън, диабети (например, инсулинзависим захарен диабет, захарен диабет тип I, захарен диабет тип II), 20 синдром на добро пасище, миастения гравис, пемфигус, болест на Крон, възпаление на симпатиковия нерв на окото, автоимунен увеит, множествена склероза, автоимунна хемолитична анемия, идиопатичнатромбоцитопения, първична 25 цироза на жлъчка, хронично действащ хепатит, улцерозен колит, синдром на Шагрен (ксеродерматоза), ревматични заболявания (например, ревматоиден артрит), полиомиозит, склеродерма и смесено заболяване на 30 съединителна тъкан.

Разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението проявяват инхибиращи свойства in vivo. При условия, при които настъпват взаимодействия между Т-клетки и В7-позитивии 3 5 клетки, например Т-клетъчни/В-клетъчни взаимодействия, в резултат на контакт между Т клетки и В7-позитивни клетки, може да се намеси свързване на въведени CTLA4 молекули, за да реагират е В7-позитивни клетки, например 40 В клетки, т.е., то може да инхибира взаимодействията между Т клетки и В7-позитивни клетки, което води до регулиране на имунни отговори.

Изобретението предлага методи за 45 регулиране на имунни отговори в отрицателна посока. Отрицателната регулация на имунен отговор чрез разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението може да стане чрез инхибиране или блокиране на имунен отговор, 50 който е възникнал вече или може да включва предотвратяване на индуцирането на имунен отговор. Разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението могат да инхибират функциите на активирани Т клетки, такива като Т лимфоцитна пролиферация и цитокиново секретиране, чрез потискане на Т клетъчни отговори или чрез предизвикване на специфична толерантност в Т клетки, или и чрез двете. Освен това, разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението, като се намесвате CTLA4/CD28/ В7 биосинтетичния път, могат да инхибират Тклетъчна пролиферация и/или цитокиново секретиране и по този начин да доведат до намаляване на тъканна деструкция и индуциране на Т-клетъчна невъзможност за отговор или анергия.

Предпочитано изпълнение съгласно изобретението включва използване на разтворимите CTLA4 мутантни молекули L104EA29 Yig за регулиране на функционални взаимодействия на CTLA4- и СВ28-позитивни клетки с В7позитивни клетки при лечение на заболявания на имунната система, такива като ревматични заболявания и/или за регулиране на имунни отговори в отрицателна посока. L104EA29YIg съгласно изобретението е разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща най-малко две аминокиселинни промени, на левцина (L) в глутаминова киселина (Е) в позиция +104 и на аланина (А) в тирозин (Y) в позиция +29. L104EA29YIg молекулата може да включва и други мутации извън двете конкретизирани тук.

Предпочитаното изпълнение включва методи за лечение на ревматично заболяване, такова като ревматоиден артрит, чрез прилагане на ефективно количество от разтворима CTLA4 молекула към индивид. Прилагането на ефективно количество от терапевтичния състав облекчава индивида в поне един от симптомите, свързани със заболяването, като намалява включително: ставния оток, отслабването на стави, възпаление, сутрешна скованост и болка и структурно увреждане, с което впоследствие се намалява физическата неспособност. Методите съгласно изобретението могат да бъдат използвани също за ограничаване на най-малко един симптом, свързан с ревматоиден артрит, включително понижаване на скоростта на еритроцитно утаяване, на серумните нива на С реактивен протеин, разтворим ICAM-1, разтворим Е-селектин и/или разтворим IL-2r.

Степента на облекчаване на симптомите, осигурена от настоящото изобретение, може да се определи като се използва всеки от 5 възприетите критерии, създадени за определяне и документиране на облекчение на симптоми в клинична обстановка. Приемливи критерии за определяне облекчението на симптоми могат да включват резултати, базирани на критериите, 10 установени от American College of Rheumatology (например, ACR20), четирите измервания на облекчение на симптоми (в: CDER Guideline for the Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory and Antirheumatic Drugs-PDA 1988), и Health Assess- 15 ment Questionnaire (HAQ) (Fries. J. F., el al., 1982 J. of Rheumatology 9:789-793). За общо описание на тези критерии, виж Guidance for Industry: Clinical Development Programs for Drugs, Devices, and Biological products for the Treatment of Rheu- 20 matoid Arthritis (RA), февруари 1999.

Индивидите, третирани съгласно настоящото изобретение, включват бозайници, включително човек, маймуна, човекоподобна маймуна, куче, котка, кон, заек, мишка и плъх. 25 Настоящото изобретение предлага различни методи, локални или системни, за прилагане на разтворимата CTLA4 молекула. Методите включват интравенозни, интрамускулни, интраперитонеални, перорални, инхалационни 3 0 и субкутанни методи, както и прилагане чрез имплантиране на помпа, непрекъсната инфузия, генна терапия, липозоми, супозитории, локален контакт, везикули, капсули и инжекции. Терапевтичното средство, в смес с носител, 35 обикновено се лиофилизира за съхранение и се реконституира с вода или с буфериран разтвор с неутрално pH (pH около 7-8, например, pH 7.5). преди употреба.

Съгласно обичайната практика в тази 40 област, съставите на изобретението могат да се прилагат към индивида във всяка фармацевтично приемлива форма.

Съгласно практиката на изобретението, методите включват прилагане към индивид на 45 разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението, за да регулират взаимодействията на CD28- и/или СТЬА4-позитивни клетки с В7позитивни клетки. В7-позитивните клетки контактуват с ефективно количество от 50

В1 разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението, или с техни фрагменти или производни, така че се получават разтворими CTLA4/B7 комплекси. Тези комплекси се намесват във взаимодействието между ендогенни CTLA4 и CD28 молекули със семейство В7 молекули.

Разтворимите CTLA4 молекули могат да се прилагат към индивид в такова количество и с такава продължителност от време (например, продължително време и/или многократно), достатъчни, за да се блокират ендогенни В7 молекули от свързване с техни съответни лиганди, у индивида. С блокиране на свързването между ендогенна В7 молекула и лиганд се инхибират взаимодействията между В7позитивни клетки и CD28- и/или CTLA4позитивни клетки.

Дозирането на едно терапевтично средство зависи от много фактори, включително, без ограничение до посочените, от вида на засегнатата тъкан, от вида на автоимунното заболяване, което подлежи на лечение, от остротата на заболяването, от общото здраве на индивида и от отговора към лечението със средствата. Съответно, дозите от средствата могат да варират за всеки индивид и в зависимост от начина на приложение. Разтворимите CTLA4 молекули могат да се прилагат в количество между 0.1 и 20.0 mg/kg тегло на индивида/дневно, за предпочитане между 0.5 и 10.0 mg/kg/дневно.

В обхвата на изобретението е и използването на съставите съгласно изобретението заедно с други фармацевтични средства, предназначени за лечение на заболявания на имунната система. Например, ревматични заболявания могат да бъдат лекувани с молекули съгласно изобретението, заедно с, без ограничение до посочените, имуносупресанти, такива като кортикостероиди, циклоспорин (Mathiesen 1989 Cancer Lett. 44(2): 151-156), преднизон, азатиоприн, метотрексат (R. Handschumacher, в: Drugs Used for Immunosuppression, страници 1264-1276), ТИРалфа блокери или антагонисти (New England Journal of Medicine, том 340: 253-259, 1999; The Lancet том 354: 1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, том 130: 478-486), или всяко друго биологично средство, насочено към какъвто и

66454 Bl да е възпалителен цитокин, нестероидни противовъзпалителни лекарства/инхибитори на Сох-2, хидроксихлорохин, сулфасалазоприн, златни соли, етанерсепт, инфликсимаб, рапамицин, микофенолат мофетил, азатиоприн, такролисмус, басиликсимаб, цитаксан, интерферон бета-1а, интерферон бета-lb, глатирамер ацетат, митоксантрон хидрохлорид, анакинра и/ или други биологични средства.

Разтворимите CTLA4 молекули (за предпочитане, L104EA29YIg) могат да се използват също в комбинация с едно или повече от следващите средства, за да се регулира имунен отговор: разтворим gp39 (известен още като CD40 лиганд (CD40L), CD 154, Т-ВАМ, TRAP), разтворим CD29, разтворим CD40, разтворим CD80 (например, АТСС 68627), разтворим CD86, разтворим CD28 (например, 68628), разтворим CD56, разтворим Thy-1, разтворим CD3, разтворим TCR, разтворим VLA4, р разтворим VCAM-1, разтворим LECAM-1, разтворим ELAM-1, разтворим CD44, антитела, реактивни с gp39 (например, АТСС НВ-10916, АТСС НВ-12055 и АТСС НВ-12056), антитела, реактивни с CD40 (например, АТСС НВ-9110), антитела, реактивни с В7 (например, АТСС НВ253, АТСС CRL-2223, АТСС CRL-2226, АТСС НВ-301; АТСС НВ-11341 и други), антитела, реактивни с CD28 (например, АТСС НВ-11944 или гпАЬ 9.3, както е описано от Martin et al (J. Clin. Immun. 4(1): 18-22, 1980), антитела, реактивни c LFA-1 (например, АТСС HB-9579 и АТСС TIB-213), антитела, реактивни с LFA-2, антитела, реактивни с IL-2, антитела, реактивни с IL-12, антитела, реактивни с IFN-гама, антитела, реактивни с CD2, антитела, реактивни с CD48, антитела, реактивни с всеки ICAM (например, ICAM-1 (АТСС CRL-2252), ICAM-2 и ICAM-3), антитела, реактивни с CTLA4 (например, АТСС НВ-304). антитела, реактивни с Thy-Ι, антитела, реактивни с CD56, антитела, реактивни с CD3, антитела, реактивни с CD29, антитела, реактивни с TCR, антитела, реактивни с VLA-4, антитела, реактивни с VCAM-1, антитела, реактивни с LECAM-1, антитела, реактивни с ELAM-1, антитела, реактивни с CD44. В някои изпълнения, се предпочитат моноклонални антитела. В други изпълнения, се предпочитат фрагменти на антитела. Както се подразбира лесно от специалиста в тази област, комбинацията може да включва разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението и едно друго имуносупресивно средство, разтворимите CTLA4 молекули и две други имуносупресивни 5 средства, разтворимите CTLA4 молекули и три други имуносупресивни средства и така нататък. Определянето на оптималната комбинация и дозите може да стане и да се оптимизира като се използват известни методи за тази цел.

Някои специфични комбинации включват следващите: L104EA29YIg и CD80 моноклонални антитела (mAbs); L104EA29YIg и CD86 mAbs; L104EA29YIg, CD80 mAbs, и CD86 mAbs; L104EA29 Yig и gp39 mAbs; L104EA29YIg и CD40 15 mAbs; L104EA29Ylg и CD28 mAbs;

L104EA29YIg, CD80 и CD86 mAbs, и gp39 mAbs; LI 04EA29YIg, CD80 и CD86 mAbs и CD40 mAbs; и L104EA29YIg, анти-LFAl mAb, и антиgp39 mAb. Конкретен пример на gp39 mAb e 20 MR1. Други комбинации се подразбират лесно от специалистите в тази област.

Разтворимите CTLA4 молекули съгласно изобретението, например L104EA29YIg, могат да се прилагат като самостоятелен активен 25 ингредиент или заедно с други лекарства в имуномодулиращи схеми или с други противовъзпалителни средства, например за лечение или превенция на ало- или ксенотрансплантат или хронично отхвърляне, 30 или при възпалителни или автоимунни нарушения, или за индуциране на толерантност. Например, те могат да се използват в комбинация с инхибитор на калциневрин, например циклоспорин А или FK506; имуносупресивен 35 макролид, например рапамицин или негово производно; например. 40-О-(2-хидрокси)етилрапамицин, насочено към лимфоцит средство, например, FTY720 или негов аналог; кортикостероиди; циклофосфамиди; азатиопрен; 40 метотрексат; лефлуномид или негов аналог; мизорибин; микофенолна киселина; микофеналот мофетил; 15-деоксиспергуалин или негов аналог; имуносупресивни моноклонални антитела, например, моноклонални антитела за 45 левкоцитни рецептори, например МНС, CD2, CD3, CD4, CD 11 a/CD 18, CD7, CD25, CD27, В7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD 50 (SLAM), 0X40, 4-1ВВ или техни лиганди; или други имуномодулиращи съединения, такива като 50 например, CTLA4/CD28-Ig, или други

66454 Bl инхибитори на адхезионни молекули, например, e.g. mAbs или инхибитори с ниско молекулно тегло, включващи LFA-1 антагонисти, антагонисти на селектин и на VLA-4. Съединението е особено подходящо за използване в комбинация 5 със съединение, което влияе върху CD40 и нейни лиганди, например, антитела за CD40 и антитела за CD40-L.

Когато разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението се прилагат 10 заедно с друга имуносупресивна/имуномодулираща терапия или противовъзпалителна терапия, например посочените тук, по-горе, дозите на прилаганото съвместно имуносупресивно, имуномодулиращо или противовъз- 15 палително съединение, ще зависят, разбира се, от вида на използваното сълекарство, например в зависимост от това дали то е стероид или циклоспорин, от конкретното използвано лекарство, от състоянието, което подлежи на 20 лечение и така нататък.

В съответствие с горното, настоящото изобретение осигурява в още един допълнителен аспект методи, както са определени по-горе, включващи съприложение, например 25 едновременно или последователно, на терапевтично ефективно количество от разтворими CTLA4 молекули съгласно изобретението, например CTLA4Ig и/или L104EA29YIg, в свободна форма или във 30 формата на фармацевтично приемлива сол и второ лекарствено вещество, като второто лекарствено вещество е имуносупресивно, имуномодулиращо или противовъзпалително лекарство, например, както е дадено по-горе. 35 Допълнително се предлагат терапевтични комбинации, например, кит, например за използване във всеки от дефинираните по-горе методи, съдържащ разтворима CTLA4 молекула, в свободна форма или във формата на 40 фармацевтично приемлива сол, който да се използва едновременно или последователно с поне един фармацевтичен състав, съдържащ, имуносупресивно, имуномодулиращо или противовъзпалително лекарство. Китът може да 45 съдържа инструкции за неговото приложение.

Изобретението предлага също методи за получаване на разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението. Разтворимите CTLA4 мутантни молекули могат да експресират 50 в прокариотни клетки или еукариотни клетки.

Прокариотите най-често са представени от различни бактериални щамове. Бактериите могат да бъдат грам положителни или грам отрицателни. Обикновено, се предпочитат грам отрицателни бактерии, такива като Е. coli. Могат да се използват и други микробни щамове. Последователности, кодиращи разтворими CTLA4 мутантни молекули, могат да бъдат вмъкнати във вектор, предназначен да експресира чужди последователности в прокариотни клетки, такива като Е. coli. Тези вектори могат да включват обичайно използвани прокариотни контролни последователности, които са определени тук, че включват промотори за иницииране на транскрипция, по желание с оператор, заедно е последователности на рибозом свързващ сайт, включително такива обичайно използвани промотори като беталактамазните (пеницилиназни) и лактозни (lac) промоторни системи (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), триптофановата(йр) промоторна система (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) и ламбда производния PL промотор и N-генен рибозом свързващ сайт (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128).

Такива експресионни вектори ще включват също източници на репликация и избираеми маркери, такива като бета-лактамаза или неомицинфосфотрансферазен ген, придаващ резистентност към антибиотици, така че векторите могат да репликират в бактерии и клетки, носещи плазмиди, могат да бъдат селектирани, когато са култивирани в присъствието на антибиотици, такива като ампицилин или канамицин.

Експресионният плазмид може да бъде въведен в прокариотни клетки с помощта на различни стандартни методи, включващи, без ограничение до изброените, СаС12-шок (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, и Sambrook et al. (редактори), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-po издание, Cold Spring Harbor Press, (1989)) и електропорация.

В съответствие с практиката на изобретението, еукариотни клетки са също подходящи клетки-гостоприемници. Примери на еукариотни клетки включват всяка животинска клетка, независимо дали е първична или имортализирана, дрожди (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Pichia pastoris) и растителни клетки. Миеломна, COS и CHO клетки са примери на животински клетки, които могат да се използват като гостоприемници. По-специално, СНО клетките включват, без ограничение до изброените, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:1090110909), CHO-K.1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K.1 Tet-On клетъчна линия (Clontech), CHO, обозначена ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO клон 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO клон B (GEIMG, Genova, IT), CHOKl/SF, обозначена ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) и RR-CHOK1, обозначена ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примерни растителни клетки включват клетки от тютюн (цели растения, клетъчна култура или калус), царевица, соя и ориз. Приемливи са също и царевични, соеви и оризови семена.

Последователности на нуклеинова киселина, кодиращи CTLA4 мутантните молекули, могат също да бъдат вмъкнати във вектор, предназначен да експресира чужди последователности в еукариотен гостоприемник. Регулаторните елементи на вектора могат да варират в зависимост от конкретния еукариотен гостоприемник.

Обичайно използвани еукариотни контролни последователности за използване в експресионни вектори включват промотори и контролни последователности, съвместими с клетки на бозайник, такива, като например, CMV промотор (CDM8 вектор) и птичи саркома вирус (ASV) ( 35 πΕΝ вектор). Други обичайно използвани промотори включват ранните и късните промотори от Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273:113) или други вирусни промотори, такива като тези, производни от 40 полиома, Adenovirus 2 и вирус на говежда папилома. Може да се използва също индуцируем промотор, такъв като hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 299:797-802).

Вектори за експресиране на CTLA4 45 мутантни молекули в еукариоти могат също да имат последователности, наречени усилващи области. Те са съществени за оптимизиране на генна експресия и се намират, както в ориентация upstream, така и в ориентация downstream на 50 >454 В1 промоторната област.

Примери на експресионни вектори за еукариотни клетки гостоприемници включват, без ограничение до изброените, вектори за клетки 5 гостоприемници на бозайник (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, рТК2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV 1 (Life Technologies); pVPakc Vectors, pCMV вектори, pSG5 вектори (Stratagene)), ретровирусни 10 вектори (например, pFB вектори (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) или техни модифицирани форми, аденовирусни вектори; аденосвързани вирусни вектори, бакуловирусни вектори, дрождеви вектори (например, pESC вектори 15 (Stratagene)).

Последователности на нуклеинови киселини, кодиращи CTLA4 мутантни молекули, могат да се интегрират в генома на еукариотната клетка гостоприемник и да репликират когато 20 репликира геномът-гостоприемник. Алтернативно, векторът, пренасящ CTLA4 мутантни молекули, може да съдържа начало на репликация, като с това позволява извънхромозомна репликация.

За експресиране на последователности на нуклеинови киселини в Saccharomyces cerevisiae, може да се използва началото на репликация от ендогенен дрождев плазмид, μ2 кръг, (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307).

Алтернативно, могат да се използват последователности от дрождевия геном, които са способни да промотират автономна репликация (виж, например, Stinchcomb el aL, (1979) Nature 282:39); Tschemper et aL, (1980) Gene 10:157; и Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300).

Транскрипционни контролни последователности за дрождеви вектори включват промотори за синтеза на гликолитични ензими (Hess et aL, (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900). Допълнителни промотори, известни в тази област, включват CMV промотора, осигурен в CDM8 вектора (Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); промоторътза 3-фосфоглицераткиназа (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chern. 255:2073) и такива за други гликолитични ензими.

Други промотори са индуцируеми, тъй като те могат да бъдат регулирани посредством

66454 Bl стимули от заобикалящата среда или посредством хранителната среда на клетките. Тези индуцируеми промотори включват такива от гените за протеини от топлинен шок, алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела 5 фосфатаза, ензими, свързани с азотен катаболизъм и ензими, отговорни за разходване на малтоза и галактоза.

Регулаторни последователности могат да бъдат разположени в 3'-края на кодиращите 10 последователности. Тези последователности могат да действат за стабилизиране на информационна РНК. Такива терминатори се намират в З-нетранслираната област, следваща кодиращите последователности в някои гени, получени от 15 дрожди и бозайници.

Примерни вектори за растения и растителни клетки включват, без ограничение до изброените. Agrobacterium Ti плазмиди, вирус на мозайката по карфиола (CaMV) и вирус на златистата 20 мозайка по доматите (TGMV).

Основни аспекти на трансформациите на система на клетки-гостоприемници от бозайници са описани от Axel (патент наСАЩЬю. 4,399,216, издаден на 16 август, 1983). Клетки на бозайници 25 мотат да бъдат трансформирани по методи, включващи, но без ограничение до изброените, трансфекция в присъствието на калциев фосфат, микроинжектиране, електропорация или посредством трансдукция с вирусни вектори. 30

Методи за въвеждане на чужди ДНК последователности в растителни и дрождеви геноми включват: (1) механични методи, такива като микроинжектиране на ДНК в сигнални клетки или протопласти, обработване на клетки 35 във вортекс апарат със стъклени перли в присъствието на ДНК или бомбардиране на покрити с ДНК волфрамови или златни сфери в клетки или протопласти; (2) въвеждане на ДНК чрез превръщане на клетъчни мембрани в 40 пропускливи за макромолекули чрез обработване с полиетиленгликол или като се подлагат на действието на високоволтови електрически импулси (електропорация); или (3) използването на липозоми (съдържащи кДНК), които се сливат 45 с клетъчни мембрани.

След като експресират CTLA4 мутантните молекули съгласно изобретението, те могат да бъдат събрани посредством добре известни за целта методи, такива като клетъчен лизис 50 (например, ултразвукова обработка, обработка с лизозим и/или с детергенти) и отделяне на протеина може да се осъществи, като се използват стандартни методи за пречистване на протеини, като например, афинитетна хроматография или йонообменна хроматография, при което се получава по същество чист продукт (R. Scopes в: Protein Purification, Principles and Practice, трето издание, SpringerVerlag (1994); Sambrook et al. (редактори), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-po издание, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Експресия на CTLA4 мутантни молекули може да бъде открита посредством известни за целта методи. Например, мутантните молекули могат да бъдат открити чрез оцветяване с Coomassie на SDS-PAGE гелове и имуноблотинг с използване на антитела, които се свързват с CTLA4.

Следващите примери са дадени, за да илюстрират настоящото изобретение и да подпомогнат специалиста в тази област в получаването и използването на същото. Примерите не са предназначени по никакъв начин да ограничат обхвата на изобретението.

Пример 1

Следващият пример дава описание на методите, използвани за генериране на нуклеотидни последователности, кодиращи CTLA4 молекулите съгласно изобретението.

Първоначално се конструира CTLA4Ig кодиращ плазмид и за него е показано, че експресира CTLA4Ig молекули, както е описано в патенти на САЩ. U.S. № № 5,434,131, 5,885,579 и 5,851,795. След това се получават молекули с едносайтова мутация (например, L104EIg) от CTLA4Ig кодиращата последователност, експресират и се тестват за свързващи кинетики по отношение на различни В7 молекули. L104EIg нуклеотидната последователност (както е включена в последователността, показана на Фигура 18) се използва като матрица за създаване на двусайтови CTLA4 мутантни последователности (както е включена в последователността, показана на Фигури 1922), които се експресират като протеини и се изследват за свързващи кинетики. Двусайтовите CTLA4 мутантни последователности включват: L104EA29YIg, L104EA29Llg, L104EA29TIg и L104EA29WIg. Могат да се

66454 Bl получат и трисайтови мутанти.

CTLA4Ig структура

Генетичен конструкт, кодиращ CTLA4Ig, съдържащ извънклетъчния домен на CTLA4 и един IgC-гама! домен се конструират, както е 5 описано в патенти на САЩ U.S. №№ 5,434,131, 5,844,095 и 5,851,795, чието съдържание е включено тук чрез цитиране. Извънклетъчният домен на CTLA4 гена се клонира чрез PCR, като се използват синтетични олигонуклеотиди, 10 съответстващи на публикуваната последователност (Dariavach et al., Eur. Journ. Immunol. 18:1901-1905 (1988)).

Тъй като в CTLA4 гена не е идентифициран сигнален пептид, N-края на набелязаната 15 последователност на CTLA4 се слива със сигналния пептид на онкостатин М (Malik et al., Mol. and Cell, Biol. 9:2847 (1989)) в два етапа, като се използват припокриващи се олигонуклеотиди. За първия етап, олигонукдеотидът, 20 CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCA CGTGGCCCAGCC (който кодира С-крайните 15 аминокиселини от сигналния пептид на онкостатин М, слят с N-крайните 7 аминокисе- 25 лини на CTLA4) се използва като прав праймер, a TTTGGGCTCCTGATCAG AATCTGGGCACGGTTG (кодиращ аминокиселинни остатъци 119125 на аминокиселинната последователност, кодираща рецептор на CTLA4 и съдържаща Bel 30 I рестрикционен ензимен сайт) като обратен праймер. Матрицата за този етап е кДНК, синтезирана от 1 микро g от обща РНК от Н38 клетки (Т-клетъчна левкемична клетъчна линия, инфектирана с HTLV II, доставена от Drs. 35 Salahudin and Gallo, NCI, Bethesda, MD). Част от продукта от PCR от първия етап се реамплифицира, като се използва препокриващ се прав праймер, кодиращ N крайния участък на сигналния пептид от онкостатин М и съдържащ 40 Hind III рестрикционен ендонуклеазен сайтц CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTG САСТС и същия обратен праймер. Продуктът от PCR реакцията се разгражда 45 с Hind III и Bel I и се лигира заедно с Bel 1/ХЬа I разцепен кДНК фрагмент, кодиращ аминокиселинните последователности, съответстващи на hinge, СН2 и СНЗ области на IgC (гама)1 в Hind ΙΠ/Xba I разцепен експресионен вектор. 50

CDM8 или Hind Ill/Xba I разцепен експресионен вектор piLN (известен също като πΕΝ).

ДНК, кодираща аминокиселинната последователност, съответстваща на CTLA41g е депозирана в АТСС, съгласно Будапещенския договор, на 31 май, 1991 и й е присвоен АТСС номер на постъпване 68629.

Мутагенеза на база CTLA4Ig кодон

Разработени са мутагенезна и скринингова стратегия за идентифициране на мутантни CTLA4Ig молекули, които имат по-ниски скорости на дисоциация (off скорости) от CD80 и/или CD86 молекули, т. е., имат подобрена свързваща способност. В това изпълнение, мутациите се осъществяват в и/или около остатъците в CDR-1, CDR-2 (известни също като С верига) и/или CDR-3 области на извънклетъчния домен на CTLA4 (както е описано в патенти на САЩ 6,090,914,5,773,253 и 5,844,095; във висяща патентна заявка на САЩ, сериен номер 60/214,065; и от Peach, R.J., et al. J Exp Med 1994 180: 2049-2058. CDRподобна област обхваща всяка CDR област и продължава посредством няколко аминокиселини, в посока upstream и/или downstream на CDR мотива). Тези сайтове са избрани въз основа на изследвания на химерни CD28/CTLA4 слети протеини (Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058) и на модел, предполагащ кой аминокиселинен остатък на странични вериги ще бъде подложен на действието на разтворител и липса на идентичност на аминокиселинни остатъци или хомоложност в определени позиции между CD28 и CTLA4. Освен това, всеки остатък, който пространствено е в непосредствена близост (5 до 20 Ангстьома единици) с идентифицираните остатъци, се счита като част от настоящото изобретение.

За синтезиране и провеждане на скрининг на разтворими CTLA4 мутантни молекули с променени афинитети към В7 молекула (например, CD80, CD86), се възприема двуетапна стратегия. Експериментите водят до първоначално генериране на библиотека от мутации в специфичен кодон на извънклетъчна част на CTLA4 и следващ неин скрининг с BIAcore анализ за идентифициране на мутанти с променена реактивност към В7. Biacore анализната система (Pharmacia, Piscataway, N.J.) използва детекторна система за повърхностен

66454 Bl плазмонен резонанс, която по същество включва ковалентно свързване на CD80Ig или CD86Ig със сензорен чин, покрит с декстран, който е разположен в детектор. След това, опитната молекула може да се инжектира в камерата, 5 съдържаща сензорния чип и може да се анализира количеството комплементарен протеин, което се свързва, въз основа на изменението в молекулна маса, което е физически свързано с покритата с декстран страна на сензорния чип; изменението 10 в молекулната маса може да се определи с помощта на детекторна система.

Характерно, едносайтови мутантни нуклеотидни последователности се генерират с използване на немутирала (например, див тип) 15 ДНК кодираща CTLA4Ig (патенти на САЩ, U.S. №№ 5,434.131,5,844,095; 5,851,795; и 5,885,796: АТСС номер на постъпване 68629) като матрица. Конструирани са мутагенни олигонуклеотидни PCR праймери за случайна мутагенеза на 20 специфичен кодон чрез толериране на всяка база в позиции 1 и 2 на кодона, но само гуанин или тимин в позиция 3 (XXG/T или също отбелязана като NNG/T). По този начин, специфичен кодон, кодиращ аминокиселина, може да бъде 25 произволно мутирал да кодира за всяка от 20-те аминокиселини. В това отношение, XXG/T мутагенеза дава 32 потенциални кодона, кодиращи всяка от двадесетте аминокиселини. PCR продукти, кодиращи мутации в непосредствена 30 близост до CDRj-подобна бримка на CTLA4Ig (MYPPPY), се разграждат със Sacl/Xbal и се субклонират в по същия начин отрязан CTLA4Ig (както е включено във Фигура 24) πΕΝ експресионен вектор. Този метод се използва за гене- 35 риране на едносайтова CTLA4 мутантна молекула L104EIg (както е включено във Фигура 18).

За мутагенеза в близост до CDR-1 -подобната бримка на CTLA4Ig, рестрикционно място за мълчалива Nhel се въвежда първоначално в 40 позиция 5' на тази бримка чрез PCR праймернасочена мутагенеза. PCR продукти се конструират с Nhel/Xbal и се субклонират в подобно отрязани CTLA4Ig или L104EIg експресионни вектори. Този метод се използва за получаване на дву- 45 сайтови CTLA4 мутантни молекули LI04EA29YIg (както е дадено на Фигура 19). По-специално, молекулата нуклеинова киселина, кодираща едносайтовата CTLA4 мутантна молекула, L104EIg, се използва като матрица за получаване 5 0 на двусайтовата CTLA4 мутантна молекула, L104EA29YIg.

Двусайтовите мутантни нуклеотидни последователности, кодиращи CTLA4 мутантни молекули, такива като L104ЕА29 Yig (депозирана на 19 юни, 2000, в American Type Culture Collection (АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA и вписана c АТСС номер на постъпване РТА2104), се генерират чрез повтаряне на мутагенезната процедура, описана по-горе, с използване на L104EIg като матрица. Този метод се използва за създаване на различни двусайтови мутантни нуклеотидни последователности, такива като тези, кодиращи CTLA4 молекули, L104EA29YIg (както са включени в последователността, показана на Фигура 19). L104EA29LIg (както са включени в последователността, показана на Фигура 20), L104EA29Tlg (както са включени в последователността, показана на Фигура 22). Получени са също трисайтови мутанти, такива като тези, кодиращи L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg и L104EA29YS25RIg.

Разтворимите CTLA4 молекули се експресират от нуклеотидните последователности и се използват във фаза II на клинични изследвания, описани в Пример 3, по-долу.

Както ще разбере специалистът в тази област, репликация на последователности на нуклеинова киселина, по-специално чрез PCR амплификация, лесно въвежда базови замени в ДНК вериги. Все пак, нуклеотидни изменения не се транслират задължително в аминокиселинни промени, тъй като някои кодони кодират в излишък същата аминокиселина. Всякакви замени на нуклеотид от началната или див тип последователност, мълчаливи (т.е., не предизвикващи изменение в транслираната аминокиселина) или по друг начин, ако изрично не е дадено тук, влизат в обхвата на изобретението.

Пример 2

Следващият пример дава описание на скринингови методи, използвани за идентифициране на едно- и двусайтови мутантни CTLA полипептиди, експресирани от конструктите, описани в Пример 1, които проявяват по-голяма способност за свързване с В7 молекули, в сравнение с немутиралите CTLA4Ig молекули.

Съвременни in vitro и in vivo изследвания показват, че самата CTLA4Ig не е способна да

66454 Bl блокира изцяло получаването на праймери на антиген-специфично активирани Т клетки. In vitro изследвания със CTLA4Ig и моноклонално антитяло, специфично за CD80 или за CD86, определящи инхибирането на Т-клетъчна 5 пролиферация, показват, че анти-СО80 моноклонално антитяло не усилва инхибирането на CTLA4Ig. Независимо от това, анти-СО86 моноклонално антитяло усилва инхибирането, което показва, че CTLA4Ig не е толкова 10 ефективна при блокиране на взаимодействия на CD86. Тези данни са в подкрепа на по-ранни открития на Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793801). показващи, че инхибиране на CD80медиирани клетъчни отговори изискват 15 приблизително 100 пъти по-ниски концентрации на CTLA4Ig, в сравнение с необходимите за СО86-медиирани отговори. Въз основа на тези констатации, е обобщено, че разтворими CTLA4 мутантни молекули, които имат по-висок авидитет 20 за CD86, отколкото див тип CTLA4, ще бъдат по-способни да блокират получаването на праймери на антиген-специфично активирани клетки, в сравнение с CTLA4Ig.

В крайна сметка, разтворимите CTLA4 25 мутантни молекули, описани в Пример 1, по-горе, се подлагат на скрининг, като се използва нова скринингова процедура за идентифициране на няколко мутации в извънклетъчния домен на CTLA4, който подобрява свързващия авидитет 30 за CD80 и CD86. Тази скринингова стратегия дава ефективен метод за директно идентифициране на мутанти с привидно по-ниски off' скорости, без да е необходимо пречистване на протеин или количествено определяне, тъй 35 като определянето на off скорост е независимо от концентрацията (O'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

COS клетки се трансфектират c отделна miniprep пречистена плазмидна ДНК и се 40 размножават няколко дни. Тридневна кондиционирана хранителна среда се прилага към BIAcore биосензорни чипове (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), покрити е разтворима CD80Ig или CD86Ig. Специфичното 45 свързване и дисоцииране на мутантни протеини се измерва чрез повърхностен плазмонен резонанс (O'Shannessy, D. J., et al., 1997 Anal. Biochem. 212:457-468). Всички опити са проведени върху BIAcore™ или BIAcore™ 2000 50 биосензори при 25°С. Лиганди се имобилизират върху изследователски клас NCM5 сензорни чипове (Pharmacia), като се използва стандартен свързващ М-етил-№-(диметиламинопропил)карбодиимид14-хидроксисукцинимид (Johnsson, В., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko, S.N., et al. (1993) J. Biol. Chern. 268:5425-15434).

Скринингов метод

COS клетки, култивирани в 24-ямкови плаки с тъканна култура преходно се трансфектират с мутантна CTLA4Ig. Хранителната среда, съдържаща секретирана разтворима мутантна CTLA4Ig, се събира 3 дни по-късно.

Кондиционирана COS клетъчна хранителна среда се оставя да тече върху BIAcore биосензорни чипове, дериватизирани с CD86Ig или CD801g (както е описано в Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771) и се идентифицират мутантни молекули с по-ниски off¹ скорости, в сравнение е тези, наблюдавани за див тип CTLA4Ig. ДНК-киселините, съответстващи на проби от селектирана среда, се секвенират и се получава още ДНК за осъществяване на едромащабно COS клетъчно преходно трансфектиране, от което се получава CTLA4Ig мутантен протеин след пречистване на протеин А от хранителна среда.

Изпълняват се условия на BIAcore анализ и се получават анализни резултати за равновесно свързване, както е описано в J. Greene et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 и в заявки за патент на САЩ, серийни номера 09/579,927 и 60/214,065, които са включени тук чрез цитиране.

Резултати от BIAcore анализ

Сеносограмни изходни линии се нормализират до нула единици на отговор (RU) преди анализа. Пробите се пускат върху mockдериватизирани поточни клетки, за да се определят фонови RU стойности, дължащи се на големи разлики в показателя на пречупване между разтвори. Равновесни дисоциационни константи (Kd) се изчисляват от графики Req по отношение на концентрацията (С), където Req е отговорът в стабилно състояние минус отговора върху mock-дериватизиран чип, а С е моларната концентрация на аналита. Кривите на свързване се анализират като се използва търговски софтуер, използващ нелинейна крива

66454 Bl (Prism, GraphPAD Software).

Опитните данни първоначално се апроксимират към модел за едно лигандно свързване с един рецептор (1-сайтов модел, т.е., проста система на Langmuir, А+В θ АВ) и 5 равновесни асоциационни константи (Kd = [А] • [В]\[АВ]) се изчисляват от уравнението R=Rmax*C/(Kd+C). Впоследствие, данните се апроксимират към най-простия двусайтов модел на лигандно свързване (т. е., с рецептор, имащ 10 две независими места на свързване, които не си влияят взаимно, както е описано от уравнението

R=Rmaxl *C\(Kdl +C)+Rmax2»C\(Kd2+C).

Доброто нагаждане (апроксимиране) на тези два модела се анализира визуално чрез 15 сравнение с експериментални данни и статистически с F тест на сумата от квадратите. По-простият едносайтов модел се избира като найдоброто апроксимиране, ако двусайтовият модел не апроксимира значимо по-добре (р<0.1). 20

Провеждат се асоциационен и дисоциационен анализ като се използва BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Асоциационните скоростни константи kon се изчисляват по два начина, като се допускат хомогенни едносайтови взаимо- 25 действия и паралелни двусайтови взаимодействия. За едносайтови взаимодействия, kon стойности се изчисляват съгласно уравнението Rt = Req (1 -exp ^ks(wo), където Rt е отговор в дадено време, t; Req е отговорът в стабилно състояние; 30 to е времето в началото на инжектирането; и ks = dR/dt = kon»Ckoff, където С е концентрация на аналит, изчислена по отношение на мономерни места на свързване. За двусайтови взаимодействия kon стойности се изчисляват съгласно 35 уравнението Rt = Req(l-exp^ksl(t'‘o) + Req2(lexp^ks2<t_'o). За всеки модел, стойностите на kon се определят от изчисления наклон (до около 70% максимално асоцииране) на графики ks срещу С. 40

Дисоциационни резултати се анализират в съответствие с едносайтов (АВ=А+В) или двусайтов (AiBj = Ai+Bj) модели и скоростни константи (koff) се изчисляват от най-добре апроксимирани криви. Моделът на свързващо 45 място се използва, освен, когато остатъците са по-големи от машинния фон (2-10RU, в съответствие с машината), в който случай се използва моделът на сайт с двойно свързване. Полувремена на рецепторно обитаване се 50 изчисляват, като се използва отношението 11 /2 = 0.693/koff.

Поточна цитометрия

Миши mAh L307.4 (анти-CDSO) се доставят от Becton Dickinson (San Jose, California), a 1T2.2 (анти-В7-0 [известни също като CD86]), от Pharmingen (San Diego, California). За имуностимулиране, СО80-позитивни и/или СО86-позитивни СНО клетки се отделят от техните съдове за култивиране чрез инкубация във физиологичен разтвор, буфериран фосфатно (PBS), съдържащ 10 тМ ЕДТА. СНО клетки (1 -10 х 105) се инкубират първоначално с mAbs или с имуноглобулинови слети протеини в DMEM, съдържаща 10% фетален телешки серум (FBS), след което се промиват и се инкубират с флуоресцеин изотиоцианатконюгирани кози анти-миши или анти-човешки имуноглобулинови реагенти за втори етап (Tago, Burlingame, California). На клетките се прилага последно промиване и се анализират на FACScan (Becton Dickinson).

SDS-PAGE и хроматография с изключване по размер

SDS-PAGE се провежда върху Tris/глицин 4-20% акриламидни гелове (Novex, San Diego, СА). Аналитични гелове се оцветяват с Coomassie Blue и се получават изображения на мокри гелове чрез цифрово сканиране. CTLA4Ig (25 microg) и L104EA29YIg (25 microg) се анализират чрез хроматография с изключване по размер, като се използва TSKGEL G300 SWXL колона (7.8 х 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, РА), уравновесена във фосфатно-буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0.02% NAN3 при скорост на потока 1.0 ml/tnin.

CTLA4XC120S и L104EA29YXC120S

Едноверижен CTLA4XC120S се получава, както е описано преди това (Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424). Накратко, използва се онкостатин М CTLA4 (OMCTLA4) експресионен плазмид като матрица, правият праймер, GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG се избира да съответства на последователности във вектора; а обратният праймер, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC съответства на последните седем аминокиселини (т.е., аминокиселини 118-124) в извънклетъчния

66454 Bl общ авидитет за CD86Ig, който е очевидно подобен на този, който се установява за див тип CTLA41g. В допълнение, мутагенеза наК93 води до значителна агрегация, която може да бъде отговорна за наблюдаваните кинетични изменения.

Случайна мутагенеза на L104, следвана от COS клетъчна трансфекция и провеждане на скрининг чрез SPR на проби от хранителна среда върху имобилизирани CD86Ig дава шест средни проби, съдържащи мутантни протеини с приблизително два пъти по-ниски off' скорости от див тип CTLA4Ig. Когато съответната кДНК на тези мутанти се секвенира, се установява, че всяка кодира мутация левцин до глутаминова киселина (L104E). Очевидно, заместване на левцин 104 с аспарагинова киселина (L104D) не влияе върху CD86Ig свързване.

След това, мутагенезата се повтаря във 20 всяко място, посочено в Таблица II, като междувременно се използва L104E като матрица за PCR вместо див тип CTLA41g, както е описано по-горе. Анализ чрез SPR, отново с използване на имобилизирани CD861g, идентифицира шест проби от хранителна среда от мутагенеза на аланин 29 с протеини, които имат приблизително четири пъти по-ниски off' скорости от див тип CTLA4Ig. Двете най-бавни са тирозинови субституции (L104EA29Y), две са левцинови (L104EA29L), една е триптофанова (L104ЕА29 W) и една е треонинова (L104ЕА29Т). Очевидно е, че мутанти без ниска off' скорост се идентифицират, когато аланин 29 е случайно мутирал, самостоятелно, в див тип CTLA4Ig.

Относителната молекулна маса и агрегираното състояние на пречистени LI 04Е а.и L104EA29YIg се преценяват чрез SDS-PAGE и чрез хроматография с изключване по размер. L104EA29YIg (~1 microg: ивица 3) и L104EIg (~1 microg; ивица 2), както изглежда имат една и съща електрофоретична подвижност със CTLA4Ig (~1 microg; ивица 1) при редуциращи (—50 kDa; +бетаМЕ; плюс 2-меркаптоетанол) и нередуциращи (—100 kDa; -бетаМЕ) условия (фиг. 25А). Хроматография с изключване по размер показва, че L104EA29YIg (фиг. 25С) безспорно има същата подвижност, както димерна CTLA4Ig (фиг. 25В). Главните пикове представляват протеинов димер, докато по-бързо елуиращият се второстепенен пик на фиг. 25В домен на CTLA4 и съдържа рестрикционен ензимен сайт и стопкодон (TGA). Обратният праймер определя точно C120S (цистеин до серин в позиция 120) мутация. По-специално, нуклеотидната последователност GCA 5 (нуклеотиди 34-36) на обратния праймер, даден по-горе, се замества с една от следващите нуклеотидни последователности: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT или GCT. Както ще се схване от специалиста в тази област, нуклеотидната 10 последователност GCA е обратна комплементарна последователност на кодона TGC за цистеин. Подобно, нуклеотидните последователности AGA, GGA, TGA, CGA, ACT или GCT са обратните комплементарни последователности на 15 кодоните за серин. Продукти на полимеразна верижна реакция се разграждат с HindIII[/XbaI и насочено субклонират в експресионния вектор πΕΝ (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXC120S се получава по идентичен начин. Всеки конструкт се потвърждава чрез ДНК секвениране.

Идентифициране и биохимично охарактеризиране на мутанти с висок авидитет

Избират се двадесет и четири аминокис- 25 елини за мутагенеза и получените —2300 мутантни протеини се анализират за CD861g свързване чрез повърхностен плазмонен резонанс (SPR; както е описано по-горе). Преобладаващите ефекти на мутагенеза във всяко място са 30 обобщени в Таблица II, по-долу. Случайна мутагенеза на някои аминокиселини в CDR-1 област (S25-R33) очевидно не променя лигандното свързване. Мутагенеза на ЕЗ1 и R33 и остатъци M97-Y102 очевидно води до 35 намаляване на лигандното свързване. Мутагенеза на остатъците S25, А29 и ТЗО, К93, L96, Y103, L104 и G105, води до протеини с ниска on и/ или ниска off скорост. Тези резултати потвърждават предходни открития, че остатъци 40 в CDR-1 (S25-R33) областта и остатъци в или близко до M97-Y102 влияят върху лигандното свързване (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).

Мутагенеза на сайтове S25, ТЗО, К93, L96, 45 Y103 и G105 води до идентифициране на някои мутантни протеини, които имат по-ниски off’ скорости от CD86Ig. Все пак, в тези случаи, ниската ''off' скорост се компрометира с ниска on скорост, което води до мутантни протеини с 50

9S

66454 Bl представлява високомолекулни агрегати. Приблизително 5.0% от CTLA4Ig са представени като високомолекулни агрегати, но няма доказателство за агрегация на L104ЕА29Yig или L104EIg. Следователно, по-силния свързващ 5 афинитет към CD86Ig, установен за L104Elg и L104EA29YIg, не може да се обясни с агрегация, индуцирана от мутагенеза.

Анализ на равновесно и кинетично свързване 10

Анализ на равновесно и кинетично свързване се провежда върху пречистени от протеин A CTLA41g, L104EIg и L104EA29YIg, като се използва повърхностен плазмонен резонанс (SPR). Резултатите са дадени в Таблица 15 1, по-долу. Установените равновесни дисоциационни константи (Kd; Таблица I) се изчисляват от криви на свързване, получени за интервал от концентрации (5.0-200 пМ). L104EA29YIg се свързва по-силно с CD86Ig, 20 отколкото L104EIg или CTLA4Ig. По-ниската Kd на L104ЕА29 Yig (3.21 пМ) в сравнение с тази на L104EIg (6.06 пМ) или CTLA4Ig (13.9 пМ) показва по-висок свързващ авидитет на L104ЕА29Yig в сравнение с CD861g. По-ниската 25 Kd на L104ЕА29Yig (3.66 пМ) в сравнение с тази на LI 04EIg (4.47 пМ) или HaCTLA4Ig(6.51 пМ) показва по-висок свързващ авидитет на L104EA29YIg в сравнение с CD80Ig.

Анализът на кинетично свързване 30 разкрива, че сравнителните on скорости за свързване на CTLA4Ig, LI04EIg и LI04EA29Ylg с CD80 са подобни, както и on скоростите за CD86Ig (Таблица I). Независимо от това, off¹скоростите за тези молекули не са еквивалентни 35 (Таблица I). В сравнение с CTLA4Ig, L104EA29YIg има приблизително два пъти пониска off скорост от CD80Ig и приблизително четири пъти по-ниска off скорост от CD86Ig. L104Е има off скорости, средни между тези на 40 L104EA29YIg и на CTLA4Ig. Тъй като въвеждането на тези мутации не засяга съществено on скоростите, установеният повишен авидитет за CD80Ig и CD86Ig с L104EA29YIg е възможно да се дължи главно на понижение в 45 off скорости.

За да се определи дали повишеният авидитет на L104EA29YIg за CD86Ig и CD801g се дължи на мутациите, засягащи начина, по който всеки мономер се асоциира като димер или 50 то дали има структурни изменения, усилващи авидитета, въведени във всеки мономер, се получават едноверижни конструкти на CTLA4 и L104EA29Y извънклетъчни домени след мутагенеза на цистеин 120 до серин, както е описано по-горе и от Linsley ef al., (1995) J. Biol. Chern., 270:15417-15424 (84). За пречистените протеини CTLA4XC120S и LI 04EA29YXC120S е показано, че са мономерни чрез гелпроникваща хроматография (Linsley et aL, (1995), по-горе), преди да бъдат анализирани техните свойства да се свързват с лиганд чрез SPR. Резултатите показват, че свързващият афинитет на двата мономерни протеина за CD861g е приблизително 35-80 пъти по-нисък от този, установен за съответните им димери (Таблица I). Това е в подкрепа на публикувани преди това данни, които установяват, че е необходима димеризация на CTLA4 за по-висок авидитет на лигандно свързване (Greene et al., (1996) J. Biol. Chern., 271:26762-26771).

L104EA29YXC120S се свързва c приблизително два пъти по-силен афинитет от този на CTLA4XC120S, както с CD801g, така и с CD86Ig. Повишеният афинитет се дължи на приблизително трикратно по-ниска скорост на дисоциация от двата лиганда. Следователно, посилното лигандно свързване HaL104EA29Y, найвероятно се дължи, по-скоро, на структурни изменения, усилващи авидитета, които са въведени във всяка мономерна верига, отколкото на измененията, при които молекулата димеризира.

Локализиране и структурен анализ на мутации, усилващи авидитета

Неотдавна е определена структурата на разтвор на извънклетъчния IgV-подобен домен на CTLA4 чрез ЯМР спектроскопия (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4:527-531). Това позволява точно определяне на местоположението на левцин 104 и аланин 29 в пространственото нагъване (фиг. 26 ляво и дясно изображение). Левцин 104 е разположен близо до силно запазена MYPPPY аминокиселинна последователност. Аланин 29 е разположен близо до С-терминалния край на CDR-1 (S25R33) участъка, който е пространствено в съседство с MYPPPY областта. Макар и да има значително взаимодействие между остатъци в базата на тези две области, както изглежда няма

66454 Bl директно взаимодействие между L104 и А29, въпреки че те и двата включват част от съседно хидрофобно ядро в протеина. Структурните последователности на двата усилващи авидитета мутанта се анализират чрез моделиране. A29Y 5 мутацията може лесно да бъде поместена в процепа между CDR-1 (S25-R33) областта и MYPPPY областта и може да служи за стабилизиране на конформацията на MYPPPY областта. В див тип CTLA4, L104 показва 10 различни хидрофобни взаимодействия с L96 и V94 близо до MYPPPY областта. Съвсем неправдоподобно е, мутацията на глутаминова киселина да приема конформация, подобна на тази на L104 поради две причини. Първо, няма 15 достатъчно място за вместване на по-дълга странична верига на глутаминова киселина в структурата без значително отклонение към CDR-1 (S25-R33 област). Второ, енергетичните разходи за неутрализиране на отрицателния заряд 20 на страничната верига на глутаминовата киселина в хидрофобната област ще бъдат големи. Вместо това, изследвания с моделиране предвиждат, че страничната верига на глутаминовата киселина се завърта на повърхността, където нейният заряд 25 може да се стабилизира чрез солватиране. Такова конформационно изменение може лесно да се вмести чрез G105, с минимално изместване към други остатъци в областите.

Свързване на мутанти с висок авидитет 30 със СНО клетки, експресиращи CD80 или CD86

FACS анализ (фиг. 27) на CTLA4Ig и мутантни молекули, които се свързват с устойчиво трансфектирани CD80+ и CD86+ СНО клетки се провежда, както е описано тук. CD80- 35 позитивни и СО86-позитивни СНО клетки се инкубират с нарастващи концентрации на CTLA4Ig, L104EA29YIg или L104EIg и след това се промиват. Свързан имуноглобулинов слят протеин се открива с използване на флуоресцеин 40 изотиоцианат-конюгиран кози античовешки имуноглобулин.

Както е показано на Фигура 27, CD80позитивни и СО86-позитивни СНО клетки (1.5 х 105) се инкубират с посочените концентрации на 45 CTLA4Ig (затворени квадрати), L104EA29YIg (кръгове) или L104EIg (триъгълници) в продължение на 2 h, при 23°С, промиват се и се инкубират с флуоресцеин изотиоцианат-конюгирано козе античовешко имуноглобулиново 50 антитяло. Анализира се свързване на общо 5,000 жизнеспособни клетки (едно определяне) на FACScan и се определя средна флуоресцентна интензивност (MFI) от хистограми с данни, като се използва PC-LYSYS. Данните се коригират за фонова флуоресценция, измерена върху клетки, инкубирани само с реагент за втори етап (MFI = 7). Контролна L6 inAb (80 microg/ml) дава MF1 < 30. Тези резултати са представителни за четири независими опита.

Свързване на L104EA29YIg, L104EIg и CTLA41g с човешки СО80-трансфектирани СНО клетки е приблизително еквивалентно (фиг. 27А). L104EA29Ylg и L104EIg се свързват по-силно със СНО клетки, устойчиво трансфектирани с човешки CD86, отколкото CTLA4Ig (фиг. 27В).

Функционални анализи

Човешки СО4-позитивни Т клетки се изолират чрез имуномагнитна отрицателна селекция (Lins ley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Изолирани СО4-позитивни T клетки се стимулират с форбалмиристат ацетат (РМА) плюс СО80-позитивни или С086-позитивни СНО клетки в присъствието натитриращи концентрации на инхибитор. СО4-позитивни Т клетки (810 х 104/гнездо) се култивират в присъствието на 1 пМ РМА със или без облъчени СНО клетъчни стимулатори. Пролиферативни отговори се определят чрез добавянето на 1 microCi/гнездо от [ЗН]тимидин през последните 7 h на 72часово култивиране. Провежда се инхибиране на РМА плюс СО80-позитивни СНО или CD86позитивни СНО, стимулирани Т клетки с L104EA29YIg и CTLA4Ig. Резултатите са дадени на фиг. 28. L104EA29YIg инхибира пролиферация на СО80-позитивни, третирани с РМА, СНО клетки в по-голяма степен от CTLA4Ig (фиг. 28А). L104ЕА29Yig е също по-ефективни от CTLA4Ig при инхибиране на пролиферация на CD86позитивни, третирани с РМА, СНО клетки (фиг. 28В). Следователно, L104EA29YIg е по-мощен инхибитор на CD80- и СО86-медиирана съвместна стимулация на Т клетки.

Фигура 29 показва инхибиране с LI04EA29YIg и CTLA4Ig на алостимулирани човешки Т клетки, получени по-горе и следващо алостимулиране с човешка В лимфобластоидна клетъчна линия (LCL), наречена РМ, която експресира CD80 и CD86 (Т клетки с концентрация 3.0 х 104/гнездо и РМ с 8.0 х 103/

ЗП

66454 Bl гнездо). Първична алостимулация се получава за 6 дни, след което клетките вибрират с ЗН-тимидин в продължение на 7 h, преди да се определи включване на радиомаркер.

Вторична алостимулация се осъществява 5 както следва: събират се Т клетки, подложени на първична алостимулация в продължение на 7 дни, върху среда за лимфоцитно разделяне (LSM) (ICN, Aurora, OH) и се оставят да преседят 24 h. След това, Т клетки се стимулират повторно 10 (вторично) в присъствието на титриращи количества от CTLA4Ig или LI 04EA29YIg, с добавяне на РМ в същото съотношение, както по-горе. Стимулацията става за три дни, след което клетките се подлагат на вибриране с радиомаркер 15 и се събират, както по-горе. Влиянието на L104ЕА29 Yig върху първично алостимулирани Т клетки е показано на фиг. 29А. Влиянието на L104ЕА29 Yig върху вторично алостимулирани Т клетки е показано на фиг. 29В. L104EA29YIg 20 инхибира, както първични, така и вторични Т клетъчни пролиферативни отговори по-добре отколкото CTLA4Ig.

За да се измери цитокиново производство (Фигура 30), се използват две успоредни плаки с вторична алостимулация. След три дни, хранителната среда се анализира с помощта на ELISA китове (Biosource, Camarillo, СА), като се прилагат условията, препоръчани от производителя. Установява се, че L104EA29YIg има по-силно действие от CTLA4Ig при блокиране на Т клетъчно IL-2, IL-4 и гама-IFN цитокиново производство след вторичен алогенен дразнител (фигури 30А-С).

Въздействията на LI 04EA29YIg и CTLA4Ig върху маймунски смесен лимфоцитен отговор (MLR) са дадени на Фигура 31. Периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMCS; 3.5 х 104 клетки/гнездо от всяка маймуна) от 2 маймуни се пречистват върху среда за лимфоцитно разделяне (LSM) и се смесват с 2 microg/ml фитохемаглутинин (РНА). Клетките се стимулират 3 дни, след което се подлагат на вибрации с радиомаркер в продължение на 16 h, преди да бъдат събрани. L104EA29YIg инхибира маймунска Т клетъчна пролиферация по-добре от CTLA4Ig.

Таблица 1:

В следващата таблица са дадени равновесни и привидни кинетични константи (стойностите са средни ± стандартно отклонение от три различни опита):

имобилиз и р а н протеин	аналит	fc,„;(X 10^?) M-'S'¹	*<>//( x S'¹	IO'³)	k (/ nM
CDSOIg	CTLA4Ig	3.44 ± 0.29	2.21 ±	0.18	6.51 ± 1.08
CD80Ig	L104Elg	3.02 ± 0.05	1.35 ±	0.08	4.47 ± 0.36
CDSOIg	L104EA29YIg	2.96 ± 0.20	1.08 ±	0.05	3.66 ±0.41
CD80Ig	CTLA4X_c12Os	12.0 ± 1.0	230 ±	10	195 ± 25
CD801g	L104EA29YX_c	120s 8.3 ± 0.26	75 ± 5		85.0 ± 2.5
CD861g	CTLA4Ig	5.95 ± 0.57	8.16 ±	0.52	13.9 ± 2.27
CD86Ig	L104EIg	7.03 ± 0.22	4.26 ±	0.1 1	6.06 ± 0.05

66454 Bl

CD861g L104EA29YIg 6.42 ± 0.40 2.06 + 0.03 3.21 ±0.23

CD86lg CTLA4X₍-|2os 16.5 + 0.5 840 + 55 5 H + 17

CD86Ig L104EA29YX_(l2()S 11.4 +1.6 300 +10 267 + 29

Таблица II

Влиянието върху CD86Ig свързване на мутагенеза на CTLA4Ig в изброените места се определя чрез SPR, описан по-горе. Преобладаващият ефект е посочен със знак+

мутагенеза	ефекти на мутагенеза
място
	няма ефект забележим ниска “оп”скорост/ πυ-слабо лшапд
	ниска off” скорост свързване
S25	+
Р26	+
G27	+
К28	+
А29	+
ТЗО	+
Е31	+
R33	+
К93	+
L96	+
М97	+
Y98	+
Р99	+
Р100	+
Р101	+
Y102	+
Y103	+
L104	+

66454 Bl (продължение) мутагенеза ефекти на мутагенеза .място няма ефект забележим ниска *‘оп”скорост/ по-слабо лиганд ниска “off⁷скорост свързване

G 105+

1106+

G107+

Q111+

Y 1 13+

1115+

Пример 3

Следва описание на фаза II на клинични изследвания на болни хора, на които е приложена разтворима CTLA4 мутантна молекула L104EA29YIg (известна още като LEA29Y или LEA) или CTLA4Ig, за облекчаване на поне един 25 симптом, свързан с ревматоиден артрит, включително ограничаване на: подуване на стави, слабост в ставите, възпаление, сутрешна скованост и болка. Използваната тук CTLA4Ig молекула започва с метионин в позиция +1 (или 3θ алтернативно с аланин в позиция -1) и завършва с лизин в позиция +357, както е показано на Фигура 24. ДНК кодиращо изпълнение на CTLA4Ig молекулата е депозирано като АТСС 68629. Използваната тук LI 04EA29YIg молекула 35 започва с метионин в позиция +1 (или алтернативно с аланин в позиция -1) и завършва с лизин в позиция +357, както е показано на Фигура 19. ДНК кодиращо изпълнение на L104EA29YIg молекулата е депозирано като 40 АТСС РТА2104.

В допълнение, следва описание на болни хора, към които са приложени L104EA29YIg или CTLA4Ig за облекчаване на поне един биологичен маркер-заместител, свързан с 45 ревматоиден артрит, включително понижаване скорости на утаяване на еритроцити и на серумни нива на С-реактивен протеин и/или на IL2 рецептор.

Групи болни

Общо 214 болни, включващи 54 мъже и 160 жени, участват в изследването (Фигури 1 А, 1В). Болните в начална позиция (от основната линия) имат средна продължителност на заболяването 3.4 (±2.0) години и несполучливо лечение с поне едно модифициращо заболяването антиревматично лекарство (DMARD). Позволени са постоянни нестероидни противовъзпалителни лекарства (NSAIDS) или стероиди (< 10 mg/дневно), но едновременно приложение на DMARDS е забранено. Болните се избират на случаен принцип (рандомизирано) в групи от 25 до 32 болни в третирана група. Тридесет и двама болни получават плацебо, 92-ма получават L104EA29YIg и 90 получават CTLA4Ig. Болните, които следват протоколни указания и не прекратяват изследването преди 57-мия ден, получават общо 4 интравенозни инфузии, по една инфузия на всеки от дните 1, 15,29 и 57. Всички болни се преценяват в дните 1, 15, 29, 43, 57, 71 и 85. Приложените дози включват 0.5, 2.0 или 10.0 mg/kg от L104EA29YIg (обозначена като LEA.5, LEA2 и LEA 10), съответно на Фигури 1А-1Е) или от CTLA4Ig (обозначена като CTLA.5, CTLA2 и CTLA10, съответно на Фигури 1А-1Е).

Всички индивиди се проследяват за периинфузионни неблагоприятни ефекти и обща безопасност като отговарят на въпросник с изброени потенциални неблагоприятни инциденти. На болните се задават въпроси относно потенциални неблагоприятни инциденти, които може да са настъпили 24 h след инфузия. В допълнение, болните се насърчават да съобщават доброволно за всеки неблагоприятен инцидент, който са претърпели. Лекарите рутинно следят лабораторни проби от болните за отклонения в кръвната химия и хематологията, например преценяват нивата на възпалителен отговор на медиатори, такива като цитокини (TNF, IL-6), триптаза и комплемент. Първата крайна цел е делът на индивидите, които отговарят на ACR 20 критериите на 85-тия ден.

Съхранение на опитен материал

CTLA41g и L104EA29YIg се поставят в стъклени флакони за еднократна употреба, съдържащи 200 mg/флакон от CTLA4Ig или 100 mg/флакон от LI04EA29YIg, съответно. Преди инфузия, CTLA4Ig и L104ЕА29Yig се разреждат 20 до крайна концентрация 25 mg/ml със стерилна вода за инжектиране (SWFI).

Протокол за приложение

Всички инфузии се прилагат интравенозно в продължение на 1 h (Фигури 1 до 17). На всички 25 индивиди се прилага най-малко една инфузия от изследвано лекарство.

Група 1: 32 болни, CTLA4Ig или L104EA29YIg, равностойно на плацебо.

Група 2: 26 болни; доза 0.5 mg/kg 30 CTLA4Ig.

Група 3: 32 болни; доза 2.0 mg/kg CTLA4Ig.

Група 4: 32 болни; доза 10.0 mg/kg CTLA4Ig. 35

Група 5: 32 болни; доза 0.5 mg/kg L104EA29YIg.

Група 6: 29 болни; доза 2.0 mg/kg L104EA29YIg.

Група 7: 31 болни; доза 10.0 mg/kg 40 L104EA29YIg.

Клинично наблюдение

Болни се преценяват за основни (изходни) симптоми на болестна активност преди да им приложат някакви инфузии. Тези първоначални 45 преценки включват: подуване на стави, слабост в стави, възпаление, сутрешна скованост, активност на болестта, преценена от болния и лекаря, както и нетрудоспособност, преценена с помощта на Health Questionnaire Assessment 50

454 Bl (HAO) (дадена като резултат за физическа работа във Фигура 1С) и болка (Фигури от 1А до 1D). Допълнително, първоначалните преценки включват скорости на утаяване на еритроцити 5 (ESR) и серумни нива на С-реактивен протеин (CRP) и разтворим рецептор на IL-2 (IL-2r) (Фигури 1С и 1D).

Изследванията на клиничен отговор се основават на критерии, установени от American 10 College of Rheumatology (ACR). Един индивид отговаря на ACR20 критерия, ако има 20 процента подобрение в преброени слаби и подути стави и 20 процента подобрение в три от петте оставащи наблюдавани симптома, такива като общи 15 болестни изменения според болния и според лекаря, болка, нетрудоспособност и остра фаза на реагиране (Felson, D. Т., et al., 1993 Arthritis and Rheumatism 36:729-740; Felson, D. T., et al., 1995 Arthritis and Rheumatism 38:1-9).

Биомаркери

Изследват се също потенциални биомаркери за активност на заболяването (ревматоиден фактор, CRP, ESR, разтворим IL-2R, разтворим ICAM-1, разтворим Е-селектин и ММР-3). Използват се утвърдени ензимни имуноанализни (EIA) методи за определяне на серумната концентрация на IL-2sRaлφa, sICAM-1, sEселектин и ММР-3. Т№алфа и IL-6 се изследват при инфузия, преди и 2 h след това, ако е необходимо.

1Ь-2зКалфа, sICAM-Ι и sE-селектин се измерват, като се използват предлагани на пазара колориметрични EIA китове от R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Най-ниската и найвисоката граница на количественото определяне са 312-20,000 pg/ml, 40-907 ng/ml и 10-206 ng/ ml, съответно. Междуанализният коефициент на вариация е в интервала от 4.48-8.4 %, 3.8-5.0 % и 5.5-9.0 %, съответно. В съответствие с производителя на кита, нормалните серумни стойности са в границите от 676-2,132 pg/ml, съответно.

ММР-3 се измерва, като се използва предлаган на пазара колориметричен EIA кит от Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Най-ниската и най-високата граница на количественото определяне са 30-7,680 ng/ml. Междуанализният коефициент на вариация е в интервала от 6.3-10.6%. В съответствие с производителя на кита, нормалните серумни

66454 Bl стойности са в границите от 28-99 ng/ml.

IL-6 и ТИБалфа се измерват, като се използват предлагани на пазара хемилуминесцентни EIA китове от R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Най-ниската и най- 5 високата граница на количественото определяне са 0.3-3.000 pg/ml и 0.7-7.000 pg/ml, съответно. Междуанализният коефициент на вариация е в интервала от 3.1-5.7% и 6.4-20.7%, съответно. В съответствие с производителя на кита, 10 нормалните серумни стойности са в границите от <0.3-12 pg/ml <0.7-7.5 pg/ml.

Изследване на антитяло

Получават се серумни проби за изследване на лекарствено специфични антитела преди 15 дозиране в 1 -вия ден и приблизително в дните 15, 29, 57, 85 и 169. Поради високи, вече съществуващи титри, насочени към имуноглобулиновата (1g) част на молекулата, се изследва също образувано специфично антитяло 20 срещу CTLA4Ig и LEA29Y без 1g константни области.

Деветдесет и шест-гнездови Immulon II ELISA плаки (Dynex, Chantilly, Virginia) се покриват с CTLA41g, CTLA4Ig без Ig константни 25 области. LEA29Y или LEA29Y без Ig константните области с концентрация 2, 4, 2, или 1 microg/ml във фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS), съответно и се инкубират една нощ при 2-8°С. Плаките се промиват с PBS, съдържаш 30 0.05% Tween 20 и се блокират 1 h при 37°С с PBS, съдържащ 1% телешки серумен албумин (BSA). След това, плаките се промиват и се добавят серийни разреждания на опитните серуми или качествени контролни (QC) серуми към 35 съответните гнезда и се инкубират 2 h при 37°С. Серумите се разреждат трикратно в PBS с 0.25% BSA и 0.05% Tween 20, като се започва от разреждане 1:10. Плаките се промиват и се добавя коктейл от конюгирано с алкална фосфатаза козе 40 античовешко капа и ламбда антитяло (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). След едночасова инкубация при 37°С, плаките се промиват и към всяко гнездо се добавя 1 mg/ml пара-нитрофенил фосфат в 45 диетаноламинен буфер. След 30 min при 25°С, реакциите се спират с 3N NaOH и се отчита абсорбцията (две дължини на вълната: 405 nm и 550 nm). Резултатите се представят като краен титър (ЕРТ), определен като реципрочната 50 стойност на най-голямото разреждане, което води до отчетена стойност (показание) на абсорбция петкратно по-висока от или равна на средната фонова за плака абсорбция. Плаковият фон се определя като абсорбционната стойност, отчетена в отсъствието на серум. Стойностите се приемат за положителни за сероконверсия, ако те са поне две серийни разреждания (деветкратно) или повече по отношение на предварително дозирани ЕРТ стойности. Серумни QC проби, положителни за CTLA4Ig- или LEA29 Yспецифични антитела, се получават от имунизирани маймуни. Аликвотна част от съответната QC проба се анализира по време на всяка аналитична серия. Аналитичните серии се приемат само когато QC пробите отговарят на анализните критерии.

Резултати

CTLA4Ig и L104EA29YIg обикновено се понасят добре при всички дози. Периинфузионните неблагоприятни инциденти са подобни за групите с различни приложени дози, с изключение на главоболията. Главоболието, с което реагират болни на 85-тия ден, нараства в зависимост от дозата 23%, 44% и 53% при болни, третирани с CTLA4Ig и 34%, 45% и 61% при болни, третирани с LI 04EA29YIg, при дози 0.5, 2.0 и 10.0 mg/kg, съответно. Противоположно, 31 % от болните, на които е приложено плацебо имат главоболие.

Процентът болни, които прекратяват клиничното изследване поради остри прояви на артрит и други неблагоприятни инциденти, е обобщен на Фигура 2. Много по-висок процент болни, които приемат плацебо, прекратяват третирането поради остра проява на артрит. Болните, третирани с CTLA4Ig, които преустановяват третирането, намаляват с нарастване на дозите. Много малко болни, третирани с L104EA29YIg, преустановяват лечението. Тези резултати показват добър обратен доза-зависим отговор за CTLA41g и посилен терапевтичен отговор при терапия с L104EA29YIg.

Отговорите на болни, третирани с CTLA4Ig, L104ЕА29Yig или плацебо, към ACR20, -50 и -70, на 85-тия ден са обобщени на Фигура ЗА. Подобно, Фигури ЗВ и С описват отговорите към ACR-20 с 95% доверителен интервал. Може да се счита, че отговорите са в

66454 Bl

LI 04EA29Ylg или плацебо, е дадено на Фигура 8. Понижението в нивата на разтворим IL-2 рецептор се оказва, че е доза-зависимо.

Количеството серумен разтворим ICAM5 1 и разтворим Е-селектин у болни, третирани с CTLA41g, LI 04HA29YIg или плацебо, е показано на Фигура 33. Понижението в нивата на разтворим ICAM-I и на разтворим Е-селектин се оказва, че е доза-зависимо.

Междинните и средните отчитания за болезнена става у болни, третирани с CTLA4Ig или плацебо през цялото време, са показани на Фигури 9А и В. Изменението от основната линия (например, намаление на болезнени стави) се 15 оказва, че е по-съществено в групите, третирани с 2 и 10 mg/kg, отколкото в групите, третирани с плацебо или с 0.5 mg/kg.

Междинните и средните отчитания за подута става у болни, третирани с CTLA4Ig или 20 плацебо през цялото време, са показани на Фигури 10А и В. Изменението от основната линия (например, намаление на подути стави) се оказва, че е по-съществено в групите, третирани с 2 и 10 mg/kg, отколкото в групите, третирани с плацебо или с 0.5 mg/kg.

Средните резултати относно преценката за болка през цялото време за болни, третирани с CTLA4Ig или плацебо, са дадени на Фигура 11. Изменението от основната линия (например, намаляване на болката) се оказва, че е посъществено в групите, третирани с 2 и 10 mg/ kg, отколкото в групите, третирани с плацебо или с 0.5 mg/kg.

Средните резултати относно преценката за активност на заболяването, направена от болен или лекар, за болни, третирани с CTLA4Ig или плацебо през цялото време, са дадени на Фигури 12А и В. Изменението от основната линия (например, намаляване на активността на заболяването) се оказва, че е по-съществено в групите, третирани с 2 и 10 mg/kg, отколкото в групите, третирани с плацебо или с 0.5 mg/kg.

Междинните и средните отчитания за болезнена става у болни, третирани с L104ЕА29 YIg (обозначена като LEA на фигурите) или плацебо през цялото време, са показани на Фигури 13А и В, Изменението от основната линия (например, намаление на болезнени стави) се оказва, че е доза-зависимо.

Междинните и средните отчитания за зависимост от дозата (доза-зависими) с отчетлив значим отговор при 10 mg/kg/телесно тегло на болния.

Процентът болни с отчетено намаление в подуването на стави или в отслабването на стави, в сравнение с болните, които не реагират на лечението с CTLA41g, L104EA29Ylg или плацебо, е даден на Фигури 4А и В. Може да се счита, че терапевтичните отговори са дозазависими. По-висок процент болни показват подобрение с 20, 50, 70 и дори със 100% в групите, на които са приложени 2 и 10 mg/kg от двата продукта.

За процента болни, при които е намаляла болката, активността на заболяването, преценена от болния и от лекаря, означава резултат в единици с CTLA4Ig, L104ЕА29 Yig или плацебо, както е дадено на Фигури 5А, В, С и D. Терапевтичните отговори, както се следят по скалата на Ликерт, може да се допусне, че са доза-зависими в полза на групите с активно лечение, в сравнение с тези, които са на плацебо, на 85-тия ден. Скалата на Ликерт е утвърдена вербална рейтингова скала, която използва прилагателни, за да категоризира симптомите 25 (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rheumatoid Arthritis Clinical Trials: Arthritis and Rheumatism, June 1993, 36(6):729-740).

Оценките на болния и лекаря относно 30 активността на заболяването се променят от основната линия с поне две единици, което се дължи на лечение с CTLA4Ig, L104EA29Ylgwm плацебо, както е показано на Фигури 6А и В. Отговорите, може да се счита, че са доза- 35 зависими с по-забележимо подобрение при повисоките дози от активни лекарства.

Процентното понижение в нивата на Среактивния протеин (CRP) при болни, лекувани с CTLA4Ig, L104EA29YIg или плацебо, е 40 показано на Фигури 7А и В. Отговорите изглежда са доза-зависими с отчетливо понижение за групите с активно лечение с 2 и 10 mg/kg. В допълнение, Фигура 7В показва, че разликата е твърде значима в сравнение с плацебо с 95% 45 доверителен интервал. Фигура 7С показва измененията в серумни нива, отчетени от изходните, на 8 5-тия ден.

Количеството серумен разтворим IL-2 рецептор у болни, третирани с CTLA4Ig, 50

66454 Bl подута става у болни, третирани с L104ЕА29Yig (обозначена като LEA на фигурите) или плацебо през цялото време, са показани на Фигури 14А и В. Изменението от основната линия (например, намаление на подути стави) се оказва, че е по- 5 съществено в групите, третирани е 2 и 10 mg/kg, отколкото в групите, третирани с плацебо или с 0.5 mg/kg.

Средните резултати относно преценката за болка у болни, третирани с L104EA29YIg 10 (обозначена като LEA на фигурите) или плацебо през цялото време, са дадени на Фигура 15. Изменението от основната линия (например, намаляване на болката) се оказва, че е доза-зависимо. 15

Средните резултати относно преценката за активност на заболяването, направена от болен или лекар, за болни, третирани с L104EA29YIg (обозначена като LEA на фигурите) или плацебо през цялото време, са дадени на Фигури 16А и 20 В. Изменението от основната линия (например, намаляване на активността на заболяването) се оказва, че е доза-зависимо.

Процентното подобрение във физичната неспособност, определено чрез HAQ на 85-тия 25 ден за болни, третирани с CTLA4Ig, L104ЕА29 Yig или плацебо, са дадени на Фигура 17 (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J. F., et al., 1982 J of Rheumatology 9:789-793). Има подчертано подобрение на този параметър, в 30 зависимост от дозата.

Измененията от основната линия за разтворим IL-2r и С-реактивен протеин са дозазависими в двете третирани групи. След третиране, нивата на разтворим IL-2r са -2%, -10% и -22% 35 за CTLA4Ig и -4%, -18% и -32% за L104EA29YIg, при дози 0.5, 2.0 и 10.0 mg/kg, съответно, в сравнение е +3% за плацебото. Нивата на С-реактивен протеин са+12%, -15% и -32% за CTLA4Ig и +47%, -33% и -47% за 40 L104EA29YIg, при дози 0.5, 2.0 и 10.0 mg/kg, съответно, в сравнение с +20% за плацебото (Фигура 7А).

Няма клинично значими резултати по отношение на рутинното хематологично 45 изследване и химичното лабораторно изследване, с изключение на незначителни задържания в нивата на IgA и IgG при високи дози от двете лекарства, проследяват се оценки за физични резултати или жизнени признаци. За отбелязване е, че нито едно от лекарствата не индуцира лекарствено-специфични антитела.

Пример 4

Следващите примери описват фаза II на клинични изследвания на болни хора, на които ще се прилага L104EA29 Yig, за да се ограничат или предотвратят структурни увреждания, включващи костна или ставна ерозия, с утвърдени радиографични скали. Подобрението в ограничаване или предотвратяване на структурно увреждане е успоредно с клиничното подобрение, определено от клиничните параметри.

Състоянието на костната структура се контролира при някои от болните хора преди третирането с CTLA4Ig или с L104EA29YIg. На тези болни се прилагат между 0.5 и 20 mg/kg CTLA4Ig или L104ЕА29Yig постоянно всеки две до дванадесет седмици (самостоятелно или в комбинация с други средства), за да се поддържа тяхното терапевтично подобрение през цялото време. Правят се рентгенограми на ръцете и краката на болни в предварително зададени интервали от време: 6 месеца и след това годишно, както се препоръчва от FDA наръчника. Тези болни се следят и дълго след 6-те и 12-те месеца, за да се определи дали лечението със CTLA4Ig или L104EA29YIg намалява прогресирането на костно разрушение, а след това само годишно. Болните се контролират с рентгенографски методи, включващи рентгеново изображение и/или изобразяване с магнитен резонанс (MRI), съгласно познатата досега стандартна практика (Larsen, А. К. and М. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481-491; Sharp, J. T„ et al., 1985 Arthritis and Rheumatism 28:13261335). Резултатите от рентгенографските изследвания се преценяват за предотвратяване на структурно увреждане, включващо забавяне прогресирането на костна ерозия и хрущялно увреждане, със стесняване на ставно пространство и/или предотвратяване на нови ерозии.

66454 Bl

Листинг на последователностите <110> Cohen, Robert Carr, Suzette Hagerty, David Peach, Robert J Becker, Jean-Claude Bristol-Myers Squibb Company < 120> ИЗПОЛЗВАНЕ HA РАЗТВОРИМИ CTLA4 МУТАНТНИ МОЛЕКУЛИ ЗА ЛЕЧЕНИЕ НА РЕВМАТОИДНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ <130> D0030PCT;30436.55WOU1 <140> PCT/US01/21204 <141> 2001-07-02 <150> 60/215,913 <151> 2000-07-03 <160> 19 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 <211> 65 ^<212> ДНК < 213 > Синтетична последователност <220>

< 2 2 3 > Описание на синтетична последователност: CTLA4 слята с онкостатин М, прав праймер <400> 1 ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc 60 cagcc 65 <210> 2 <211> 33 <212> ДНК <213> Синтетична последователност <220>

< 2 2 3 > Описание на синтетична последователност: CTLA4 слята с онкостатин М, обратен праймер <400> 2 tttgggctcc tgatcagaat ctgggcacgg ttg 33

Ч210> 3 <211> 72 <212> ДНК < 213 > Синтетична последователност <220>

вймИ’·--·66454 Bl <22 3> Описание на синтетична последователност: CTLA4 с онкостагин М и Hind III <400> 3 ctagccactg aagcttcacc aatgggtgta ctgctcacac agaggacgct gctcagtctg 60 gtccttgcac tc 7 2 <210> 4 <211> 41 <212> ДПК <213> Синтетична последователност ' <220>

<22 3> Описание на синтетична последователност: Онкостагин М CTLA4(OMCTLA4) прав праймер <400> 4 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 5 <21L> 42 ^<212> Л11К <213> Си1пегичпа iioc.iejoHUieniioci <220>

^<222> Описание на синтетична последователност: Онкостагин М CTLA4(OMCTLA4) обратен праймер <400> 5 gtggtgtatt ggtetagate aatcagaatc tgggcacggt tc42 <210> 6 <211> 1152 <212> _дн1< <213> Синтетична последователност' <220>

<223> Описание на синтетична последователност: L104Elg <400 6 atgggtgtac tgctcacaca gaggaegetg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca60 ageatggega gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg eggtaetgge cagcagccga120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgea tctccaggca aagccactga ggtccgggtg130 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg aetgaagtet gtgcggcaac ctacatgatg240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atetgeaegg gcacctccag tggaaatcaa300 gtgaacctca ctatccaagg aetgagggee atggacacgg gactctacat etgeaaggtg360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta420 attgatccag aaccgtgccc agattetgat caggagccca aatcttctga caaaactcac430 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat egteagtett cctcttcccc540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg600 gaegtgagee acgaagaccc tgaggteaag ttcaactggt aegtggaegg cgtggaggtg660 cataatgcca agacaaagcc gegggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga840

66454 Bl gaaccaoagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga ccgggtaaat tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac cgggatgagc agcgacatcg cctcccgrgc agcaggtggc cactacacgc cgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct ccaggtcagt ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct <210> 7 <211> 383 c212> ]»_R-| <213> CnineiMMiia noeae.iouaicaiioci <220>

<223> Описание на синтетична последователност: LlO4E!g <400> 7

Met Gly Vai Leu Leu Thr Gin Arg 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser 20

Ala Vai Vai Leu Ala Ser Ser Arg 3540

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr 5055

Gin Ala Asp Ser Gin Vai Thr Glu

6570

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp 85

Ser Gly Asn Gin Vai Asn Leu Thr 100

Thr Gly Leu Tyr He Cys Lys Vai 115120

Tyr Glu Gly He Gly Asn Gly Thr

130 '135

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu

145150

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro 165

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 180

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai

195200

Thr Leu Leu Ser Leu Vai Leu Ala 1015

Met Ala Met His Vai Ala Gin Pro 2530

Gly He Ala Ser Phe Vai Cys Glu 45

Glu Vai Arg Vai Thr Vai Leu Arg 60

Vai Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 75 ·80

Asp Ser He Cys Thr Gly Thr Ser 9095He Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 105HO

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 125

Gin He Tyr Vai He Asp Pro Glu 140

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 155160

Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Vai 170175

Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr 185190

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 205

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys

66454 Bl

210

Thr Lys Pro Arg Glu 225 '

Vai Leu Thr Vai Leu

245

Cys Lys Vai Ser Asn 260

Ser Lys Ala Lys Gly 275

Pro Ser Arg Asp Glu 290

Vai Lys Gly Phe Tyr 305

Gly Gin Pro Glu Asn 325

Asp Gly Ser Phe Phe 340

Trp Gin Gin Gly Asn 355 *

His Asn His Tyr Thr 37C

215

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 230 ' 235

His Gin Asp Trp Leu Asn 250

Lys Ala Leu Pro Ala Pro 265

Gin Pro Arg Glu Pro Gin 280

Leu Thr Lys Asn Gin Vai 295

Pro Ser Asp lie Ala Vai

310 315

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 330

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 345

Vai Phe Ser Cys Ser Vai 360

Gin Lys Ser Leu Ser Leu 375

220

Tyr Arg Vai Vai Ser 240

Gly Lys Glu Tyr Lys 255 lie Glu Lys Thr lie 270

Val Tyr Thr Leu Pro 285

Ser Leu Thr Cys Leu 300

Glu Trp Glu Ser Asn

320

Pro Val Leu Asp Ser 335

Val Asp Lys Ser Arg 350

Met His Glu Ala Leu 365

Ser Pro Gly Lys 380 <210> 8 <211> 1152 ^<212> ДИК <213> Синтетична последователност <220>

<22 3> Описание на синтетична последователност: L104EA29Ylg <400> 8 atgggtgtac tgctcacaca gaggaegetg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca60 ageatggega gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgea tctccaggca aatatactga ggtccgggrg180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg aetgaagtet gtgcggcaac ctacatgatg240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atetgeaegg gcacctccag tggaaatcaa300 gtgaacctca ctatccaagg aetgagggee atggacacgg gactetacat etgeaaggtg360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta420 attgatccag aaccgtgccc agattetgat caggagccca aatcttctga caaaactcac480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat egteagtett cctcttcccc540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg600 gaegtgagee acgaagaccc tgaggteaag ttcaactggt aegtggaegg cgtggaggtg660 cataatgcca agacaaagcc gegggaggag cagtacaaca gcacgtaccg cgtggtcagc720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc egggatgage tgaccaagaa ccaggtcaqc900

66454 Bl ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct1140 ccgggtaaat ga1152 <210> 9 <211> 383 <212> PRT < 213 > Синтетична последователност <220>

< 2 2 3 > Описание на синтетична последователност: L104ЕА29 Yig < 400> 9

Met Gly Vai Leu Leu Thr Gin Arg 1 5.

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser 20

Ala Vai Vai Leu Ala Ser Ser Arg 3540

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr 5055

Gin Ala Asp Ser Gin Vai Thr Glu 6570

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp 85

Ser Gly Asn Gin Vai Asn Leu Thr 100

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Vai 115120

Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr 130135

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu

145150

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro 165

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 180

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 195200

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 210215

Thr Leu Leu Ser Leu Vai Leu Ala 1015

Met Ala Met His Vai Ala Gin Pro

2530

Gly He Ala Ser Phe Vai Cys Glu 45

Glu Vai Arg Vai Thr Vai Leu Arg 60

Vai Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 7580

Asp Ser He Cys Thr Gly Thr Ser 9095

He Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

105110

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 125

Gin lie Tyr Vai lie Asp Pro Glu 140

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His

155160

Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Vai 170175

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr 185190

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 205

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 220

66454 Bl

Thr Lys Pro Arg Glu 225

Vai Leu Thr Vai Leu

245

Cys Lys Vai Ser Asn 260

Ser Lys Ala Lys Gly 275

Pro Ser Arg Asp Glu 290

Vai Lys Gly Phe Tyr 305

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 230 235

His Gin Asp Trp Leu Asn 250

Lys Ala Leu Pro Ala Pro 265

Gin Pro Arg Glu Pro Gin 290

Leu Thr Lys Asn Gin Vai 295

Pro Ser Asp lie Ala Vai 310 315

Tyr Arg Vai Vai Ser 240

Gly Lys Glu Tyr Lys 255 lie Glu Lys Thr He 270

Vai Tyr Thr Leu Pro 285

Ser Leu Thr Cys Leu 300

Glu Trp Glu Ser Asn

320

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

325 330

Pro Pro Vai Leu Asp Ser

335

Asp Gly Ser Phe

340

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys

345 350

Ser Arg

Trp Gin Gin Gly Asn 355

His Asn His Tyr Thr 370

Vai Phe Ser Cys Ser Vai 360

Gin Lys Ser Leu Ser Leu 375

Met His Glu Ala Leu

365

Ser Pro Gly Lys

380 <210> 10 <211> 1152 <212> док * •213> Синтетична последователност <220>

< 2 2 3 > Описание на синтетична последователност: L104EA29Lig < 400> 10 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aattgactga ggtccgggtg180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa300 gtgaacctca otatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta420 attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg500 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc780 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga840 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat960

66454 Bl gggcagccgg agaacaacca caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 11 <211> 383 <212> _PRT < 213 > Синтетична последователност <220>

<223> Описание на синтетична последователност: L104EA29LIg <400 11

Met Gly Vai Leu Leu 1 5

Leu Leu Phe Pro Ser 20

Ala Vai Vai Leu Ala 35

Tyr Ala Ser Pro Gly 50

Gin Ala Asp Ser Gin 65

Gly Asn Glu Leu Thr 85

Ser Gly Asn Gin Vai 100

Thr Gly Leu Tyr lie 115

Tyr Glu Gly lie Gly 130

Pro Cys Pro Asp Ser 145

Thr Ser Pro Pro Ser 165

Phe Leu Phe Pro Pro 180

Pro Glu Vai Thr Cys 195

Vai Lys Phe Asn Trp

210

Thr Gin Arg Thr Leu Leu 10

Met Ala Ser Met Ala Met 25

Ser Ser Arg Gly lie Ala 40

Lys Leu Thr Glu Vai Arg 55

Val Thr Glu Vai Cys Ala 70 75

Phe Leu Asp Asp Ser lie 90

Asn Leu Thr lie Gin Gly 105

Cys Lys Val Glu Leu Met 120

Asn Gly Thr Gin He Tyr 135

Asp Gin Glu Pro Lys Ser 150 155

Pro Ala Pro Glu Leu Leu 170

Lys Pro Lys Asp Thr Leu 185

Val Val Val Asp Val Ser 200

Tyr Val Asp Gly Val' Glu 215

Ser Leu Val Leu Ala 15

His Val Ala Gin Pro 30

Ser Phe Val Cys Glu 45

Val Thr Val Leu Arg 60

Ala Thr Tyr Met Met 80

Cys Thr Gly Thr Ser 95

Leu Arg Ala Met Asp 110

Tyr Pro Pro Pro Tyr 125

Val He Asp Pro Glu 140

Ser Asp Lys Thr His 160

Gly Gly Ser Ser Val 175

Met lie Ser Arg Thr 190

His Glu Asp Pro Glu 205

Val His Asn Ala Lys 220

66454 Bl

Thr Lys 225

Vai Leu

Cys Lys

Ser Lys

Pro Ser

290

Vai Lys 305

Gly Gin

Asp Gly

Trp Gin

His Asn

370

Pro Arq

Thr Vai

Vai Ser 2 60

Ala Lys 275

Arg Asp

Gly Phe

Pro Glu

Ser Phe

340

Gin Gly 355

His Tyr

Glu Glu 230

Leu His 2 4 5

Asn Lys

Gly Gin

Glu Leu

Tyr Pro 310

Asn Asn 32 5

Phe Leu

Asn Vai

Thr Gin

Gin Tyr

Gin Asp

Ala Leu

Pro Arg

280

Thr Lys 295

Ser Asp

Tyr Lys

Tyr Ser

Phe Ser

360

Lys Ser 375

Asn Ser

Trp Leu 250

Pro Ala 265

Glu Pro

Asn Gin lie Ala

Thr Thr 330

Lys Leu 345

Cys Ser

Leu Ser

Thr Tyr 235

Asn Gly

Pro lie

Gin Vai

Vai Ser 300

Vai Glu 315

Pro Pro

Thr Vai

Vai Met

Leu Ser

380

Arg Vai

Lys Glu

Glu Lys 270

Tyr Thr 285

Leu Thr

Trp Glu

Vai Leu

Asp Lys 350

His Glu 365

Pro Gly

Vai Ser 24 0

Tyr Lys 255 '

Thr He

Leu Pro

Cys Leu

Ser Asn 320

Asp Ser 335

Ser Arg

Ala Leu

Lys <210> 12 <211> 1152 ^<212> ДПК < 213> Синтетична noc.ie.iouare.iiiocr <22O>

<223> Описание на синтетична последователност: L104EA29Tlg <400> 12 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgca tctocaggca aaactactga ggtccgggtg acagtgcttc. ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcapgg gcacctccag tggaaatcaa gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta attgatccag aaccgtgccc agattctgat caggagccca aatcttctga caaaactcac acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat ggacagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc

120

180

240

300

360

420

480

0

600

660

720

780

840

900

960

1020

66454 Bl ctcctctaca gcaagctcac cgcggacaag agcaggcggc agcaggggaa cgtcttctca 1080 tgctccgtga cgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagccc crccctgcct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 13 <211> 383 < 212> p_Rj < 213> СинIетична иоснедошпc.iiioci <220>

< 223> Описание на синтетична последователност: LI04EA29TI” < 400> 13

Met Gly Vai Leu Leu Thr Gin Arg 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser 20

Ala Vai Vai Leu Ala Ser Ser Arg 3540

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Thr Thr 5055

Gin Ala Asp Ser Gin Vai Thr Glu 6570

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp 85

Ser Gly Asn Gin Vai Asn Leu Thr 100

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Vai 115120

Tyr Glu Gly lie Gly Asn Gly Thr 130135

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu 145150

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro 165

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 180

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 195 200

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 210 215

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr

Thr Leu Leu Ser Leu Vai Leu Ala 10 15

Met Ala Met His Vai Ala Gin Pro 25 30

Gly lie Ala Ser Phe Vai Cys Glu 45

Glu Vai Arg Vai Thr Vai Leu Arg 60

Vai Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 7580

Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 9095 lie Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

105110

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 125

Gin lie Tyr Vai He Asp Pro Glu 140

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 155160

Glu Leu Leu Gly Gly Ser Ser Vai 170175

Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr

185190

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 205

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys % 220

Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser

66454 Bl

225 230

Vai Leu Thr Vai Leu Hus Gin Asp 245

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu 260

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 275280

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 290295

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

305310

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 325

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser ^k340

Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser ' 355360

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser

370375

235240

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 250255

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

265270

Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 285

Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu 300

He Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn 315320

Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser 330335

Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg

345350

Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 380 <210> 14 <2L1> 1152 ^{< 212>} ДИК < 213> Синтетични iioc.icuobutc.iiioci <220>

< 223> Описание на синтетична последователност: LI04EA29WIe <400> 14 atgggtgtac tgctcacaca gaggaegetg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca60 ageatggega gcatggcaat gcacgtggcc cagcctcctg tggtactggc cagcagccga120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgea tctccaggca aatggactga ggtccgggtg180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg aetgaagtet gtgcggcaac ctacatgatg240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atetgeaegg gcacctccag tggaaatcaa300 gtgaacctca ctatccaagg aetgagggee atggacaegg gactctacat etgeaaggtg360 gagctcatgt acccaccgcc atactacgag ggcataggca acggaaccca gatttatgta420 attgatecag aaccgtgccc agattetgat caggagccca aatcttctga caaaactcac480 acatccccac cgtccccagc acctgaactc ctggggggat egteagtett cctcttcccc540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg600 gaegtgagee acgaagaccc tgaggteaag ttcaactggt aegtgeaegg cgtggaggtg660 cataatccca agacaaagcc gegggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc790 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga840 gaaocacagg tgtacaccct gcccccatcc egggatgage tgaccaagaa ccaggtcagc900 ctgacctgcc tggtcaaagg Cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc1020 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcacgggaa cgtcttctca1080

66454 Bl tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1140 ccgggtaaat ga 1152 <210> 15 <211> 383 <212> PRT < 213 > Синтетична последователност <220>

<223> Описание на синтетична последователност: L104EA29WIg <400> 15

Met Gly Vai Leu Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu Ser Leu Vai Leu Ala 15 1015

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Met His Vai Ala Gin Pro 20 2530

Ala Vai Vai Leu Ala Ser Ser Arg Gly He Ala Ser Phe Vai Cys Glu 35 4045

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Trp Thr Glu Vai Arg Vai Thr Vai Leu Arg 50 5560

Gin Ala Asp Ser Gin Vai Thr Glu Vai Cys Ala Ala Thr Tyr MetMet

70 7580

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser lie Cys Thr Gly ThrSer

9095

Ser Gly Asn Gin Vai Asn Leu Thr He Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp 100 105110

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Vai Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120125

Tyr Glu Gly He Gly Asn Gly Thr Gin lie Tyr Vai He Asp Pro Glu 130 135140

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys ThrHis

145 150 155160

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Ser SerVai

165 170175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr 180 185190

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200205

Vai Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr Vai 215

Asp Gly

Vai

Glu

Vai 220

His

Asn

Ala

Lys

210

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Vai

.Ser

225

230

235

240

Λ n

66454 Bl

............

Val Leu Thr Vai Leu His Gin Asp 245

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 260

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg

275280

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 290295

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 305310

Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 340

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 355360

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 370375

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 250255

Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He 265270

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 285

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 300

He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 315320

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 330335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 345350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 380 <210> 16 <211> 636 <212> ДНК <213> Homo sapiens <400> 16 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga120 ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca aagccactga ggtccgggtg180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg gcacctccag tggaaatcaa300 gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg gactctacat ctgcaaggtg360 gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca acggaaccca gatttatgta420 attgatccag aaccgtgccc agattctgac ttcctcctct ggatccttgc agcagttagt480 tcggggttgt ttttttatag ctttctcctc acagctgttt ctttgagcaa aatgctaaag540 aaaagaagcc ctcttacaac aggggtctat gtgaaaatgc ccccaacaga gccagaatgt600 gaaaagcaat ttcagcctta ttttattccc atcaat636 <210> 17 <2H> 212 <212> pRT < 213 > Homo sapiens <400> 17

Met Gly Val Leu Leu Thr 6-J.n Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 15 10 15

--------------_r,:i - ιιιιιιΐίΜΐΐΗίπτπί.Ίίο:

66454 Bl

Leu Leu Piie Pre Ser Met Ala Ser 20

Ala val val Leu Ala Ser Ser Arg 3540

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr 5055

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu 6570

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp 85

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr 100

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val 115120

Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr 130135

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Phe Leu

145150

Ser Gly Leu Phe Phe Tyr Ser Phe 165

Lys Met Leu Lys Lys Arg Ser Pro 180

Met Pro Pro Thr Glu Pro Glu Cys 195 200 lie Pro lie Asn

210

Met Ala Met His Val Ala Cln Pro 25 30

Gly Ue Ala Ser Phe Val Cys Glu 45

Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg 60

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 7580

Asp Ser Ue Cys Thr Gly Thr Ser 9095

He Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

105110

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 125

Gin lie Tyr Val He Asp Pro Glu 140

Leu Trp lie Leu Ala Ala Val Ser 155160

Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser 170175

Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys

185190

Glu Lys Gin Phe Gin Pro Tyr Phe 205 <210> 18 <211> 1152 ^<212> ДНК <213> Сишетична iioc.ie/ioBuic.nioui <22 0>

<223> Описание на синтетична последователност: CTLA41g <400> 18 atgggtgtac tgctcacaca gaggaegetg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca60 ageatggega gcatggcaac gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga120 ggcatcgcta gctttgtgtg tgagtatgea tctccaggca aagccactga ggtccgggtg180 acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg aetgaagtet gtgcggcaac ctacatgatg240 gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atetgeaegg gcacctccag tggaaatcaa300 gtgaacctca ctatccaagg aetgagggee atggacacgg gactctacat etgeaaggtg360 gagctcatgt acccaccgoc atactacccg ggcataggca acggaaccca gatttatgta420 attgatccag aaccgtgccc agattetgat caggagccca aatcttctga caaaactcac480

66454 Bl acatccccac cgtccccagc acctgaactc ccgggtggat ogccagtctt cctcttcccc540 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg600 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggccaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg660 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc720 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc790 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga940 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc900 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat960 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc cggactccga cggctccttc1020 ttcctccaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca1080 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagect ctccctgtct1140 ccgggtaaat ga1152 <210> 19 <2H> 383 <212> PRf <213> Синтетична последователност <220>

<223> Описание на синтетична последователност: СТЕА4!ц <400> 19

Met Gly Val Leu Leu Thr Gin Arg 15

Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser 20

Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg 3540

Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr 5055

Gin Ala Asp Ser Gin Val Thr Glu 6570

Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp 85

Ser Gly Asn Gin Val Asn Leu Thr 100

Thr Gly Leu Tyr lie Cys Lys Val 115120

Tyr Leu Gly lie Gly Asn Gly Thr 130135

Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Glu

145150

Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro

165X

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala 1015

Met Ala Met His Vai Ala Gin Pro 2530

Gly lie Ala Ser Phe Val Cys Glu 45

Glu Vai Arg Val Thr Val Leu Arg 60

Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met 7580

Asp Ser lie Cys Thr Gly Thr Ser 9095

He Gin Gly Leu Arg Ala Met Asp

105110

Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 125

Gin He Tyr Val He Asp Pro Glu 140

Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 155 160

Glu Leu Leu Gly Glv Ser Ser Val 170 ' 175

Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

66454 Bl

180 185 19C

Pro G.u Val Thr Cys Val Val Val 195200

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 210215

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 225230

Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp 245

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu .260

Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg 275280

Pro Ser Arg Asp Glu Leu ThrLys

290295

Val Lys Gly Phe Tyr Pro SerAsp

305 '310

Gly Gin Pro Glu Asn Asn TyrLys

325

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 340

Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 355360

His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 370375

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 205

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 220

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 235240

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 250255

Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr He 265270

Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 285

Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu 300

He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 315320

Thr Thr Pro Pre Val Leu Asp Ser 330335

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

345' 350

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 365

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 380

Claims

1. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване при блокиране на В7 взаимодействие с CTLA4 и/или CD28, $ където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е 1g слят протеин, който включва извънклетъчния домен на CTLA4, а извънклетъчният домен на CTLA4 включва мутация в позиция +104 на CTLA4, където левцин в позиция +104 е заместен θ с глутаминова киселина.

2. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване при лечение на реакция присадка срещу гостоприемник, имунни разстройства, асоциирани с отхвърляне на трансплантирана присадка, хронично отхвърляне и тъканен или клетъчен алографт или ксенографт, псориазис, Т-клетъчен лимфом, Т-клетъчна остра лимфобластна левкемия, ангиоцентричен Т-клетъчен лимфом на тестисите, доброкачествен лимфоцитен ангиит, лупус, тиреоидит на Хашимото, първичен микседем, болест на Грейвс, пернициозна анемия, автоимунен атрофичен гастрит, заболяване на Адисон, диабет, синдром на добро пасище, миастения гравис, пемфигус, 25 болест на Крон, симпатикова олфталмия, автоимунен увеит, мултиплена склероза, автоимунна хемолитична анемия, идиопатична тромбоцитопения, първична билярна цироза, хепатит с хронично действие, язвен колит, синдром на Сьогрен, ревматоиден артрит, полимиози, склеродерматит и смесена болест на съединителна тъкан, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е 1g слят протеин, включващ извънклетъчния домен на CTLA4 и извънклетъчният домен на CTLA4 включва мутация в позиция +104 на CTLA4, при което левцин в позиция+104 е заместен с глутаминова киселина.

3. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване при лечение или предотвратяване на остро или хронично отхвърляне на алографт или ксенографт, за използване при индуциране на толерантност, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е 1g слят протеин, включващ извънклетъчния домен на CTLA4 и извънклетъчният домен на CTLA4 включва мутация в позиция +104 на CTLA4, при което левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина.

4. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване съгласно която и да е претенция от 1 до 3, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е L L104EIg, започващ с метионин в позиция +1 до лизин в позиция +357 или L L104EIg, започващ с аланин в позиция -1 до лизин в позиция +357.

5. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване съгласно която и да е претенция от 1 до 3, където извънклетъчния домен на CTLA4 включва втора мутация в позиция +29 на CTLA4, където аланин в позиция +29 е заместен с тирозин.

6. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване съгласно претенция 5, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е L104EA29YIg, започващ с метионин в позиция +1 и свършващ с лизин в позиция +357 или L104EA29YIg, започващ с аланин в позиция -1 и свършващ с лизин в позиция +357.

7. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване съгласно която и да е претенция от 1 до 3, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е L104ЕА29Yig и се кодира ДНК последователност, наречена АТСС РТА-2104.

8. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване съгласно която и да е претенция от 1 до 3, където извънклетъчния домен на CTLA4 включва мутация в

а. позиция +29 на CTLA4, където аланин в позиция +29, е заместен от глутаминова киселина,

Ь. позиция +29 на CTLA4, където левцин в позиция +104 е заместен с тирозин, и

с. позиция +25 на CTLA4, където серин в позиция +25 е заместен с която и да е друга аминокиселина.

9. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване съгласно която и да е претенция от 1 до 8, където кортикостероидът е преднизон.

10. Разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид за използване съгласно която и да е претенция от 1 до 9, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула и кортикостероидът се прилагат едновременно или последователно.

11. Фармацевтичен състав, включващ фармацевтично приемлив носител и ефективно

66454 Bl количество разтворима CTLA4 мутантна молекула и кортикостероид, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е 1g слят протеин, който включва извънклетъчния домен на CTLA4, а извънклетъчният домен на CTLA4 включва 5 мутация в позиция +104 на CTLA4, където левцин в позиция +104, е заместен с глутаминова киселина и мутация в позиция +29 на CTLA4, където аланин в позиция +29, е заместен с тирозин. 10

12. Фармацевтичен състав съгласно претенция 11, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула е L104ЕА29 Yig.

13. Фармацевтичен състав съгласно претенция 12, където L104EA29YIg започва с 15 метионин в позиция +1 и завършва с лизин в позиция +357.

14. Фармацевтичен състав съгласно претенция 12, където L104EA29YIg започва с аланин в позиция -1 и завършва с лизин в 20 позиция +357.

15. Фармацевтичен състав съгласно която и да е претенция от 11 до 14, където кортикостероидът е преднизон.

16. Фармацевтичен състав съгласно претенция 11, където фармацевтично приемливият носител е избран измежду йонообменни вещества, алуминиев триоксид, алуминиев стеарат, лецитин, серумни протеини, такива като човешки серумен албумин, буферни вещества, глицин, сорбинова киселина, калиев сорбат, частични глицеридни смеси на наситени растителни мастни киселини, буфериран с фосфат физиологичен разтвор, вода, емулсии, соли или електролити, колоидален силиций, магнезиев трисиликат, поливинил пиролидон, основаващи се на целулоза вещества, полиетиленгликол, стерилни разтвори, таблетки, инертни пълнители, захароза, глюкоза, малтоза, овкусители и оцветители, липидни вещества и полимерни състави.