CZ20024261A3 - Způsoby pro léčbu revmatických onemocnění za použití solubilní CTLA@ molekuly - Google Patents

Způsoby pro léčbu revmatických onemocnění za použití solubilní CTLA@ molekuly Download PDF

Info

Publication number
CZ20024261A3
CZ20024261A3 CZ20024261A CZ20024261A CZ20024261A3 CZ 20024261 A3 CZ20024261 A3 CZ 20024261A3 CZ 20024261 A CZ20024261 A CZ 20024261A CZ 20024261 A CZ20024261 A CZ 20024261A CZ 20024261 A3 CZ20024261 A3 CZ 20024261A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ctla4
molecule
soluble
soluble ctla4
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
CZ20024261A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303959B6 (cs
Inventor
Cohenárobert
Carrásuzette
Hagertyádavid
Peachárobertáj
Beckerájean@Claude
Original Assignee
Bristol@Myersásquibbácompany
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22804919&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ20024261(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol@Myersásquibbácompany filed Critical Bristol@Myersásquibbácompany
Publication of CZ20024261A3 publication Critical patent/CZ20024261A3/cs
Publication of CZ303959B6 publication Critical patent/CZ303959B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A61K38/13—Cyclosporins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Description

Způsoby pro léčbu revmatických onemocnění za použití solubilní CTLA4 molekuly
Oblast techniky
Předkládaný vynález se obecně týká revmatických onemocnění. Konkrétně se vynález týká způsobů a prostředků pro léčbu revmatických onemocnění, jako je revmatoidní artritis, podávání účinného množství solubilní CTLA4 mutantní molekuly jedinci.
Dosavadní stav techniky
V současnosti neexistuje kurativní léčba pro revmatická onemocnění. Terapeutická činidla jsou používána pro léčbu příznaků. Obvykle jsou terapeutická činidla podávána po dlouhou dobu a terapeutická hodnota těchto léků je často snížena jejich nežádoucími účinky.
Revmatická onemocnění jsou skupinou onemocnění postihujících musculo-skeletální systém a pojivovou tkáň. Tato onemocnění jsou charakterizována chronickým zánětem, který často vede k permanentnímu poškození tkání, deformitám, atrofii a invaliditě. Revmatická onemocnění postihují klouby, kosti, měkké tkáně nebo míchu {Mathies, H., 1983, Rheuma) a jsou klasifikována jako zánětlivý revmatizmus, degenerativní revmatizmus, extra-artikulární revmatizmus nebo onemocnění kolagenu.
některých revmatických onemocněních je známo, že jsou autoimunitními onemocněními způsobenými chybnou imunitní odpovědí j edince.
Revmatoidní artritida je progresivní revmatické onemocnění postihující přibližně 2% dospělé populace v rozvinutých zemích * 9 (Utsinger, P. D., et al., 1985 Rheumatoid Arthritis, str?. 140). Toto onemocnění je charakterizováno persistentní inflamatorní synovitidou, která způsobuje destrukci chrupavky a erosi kosti, což vede ke strukturálním deformitám v periferních kloubech. Mezi příznaky spojené s revmatoidní artritidou patří otoky kloubů, citlivost kloubů, zánět, ranní ztuhlost a bolest, zejména při flexi. Jedinci s pokročilými stadii artritidy trpí strukturálním postižením, včetně destrukce kloubu s erozí kosti (v: Principals of Internal Medicine, Harrison, 13.vydání, str. 1648-1655). Kromě toho mohou mít pacienti jiné příznaky, včetně lézí na kůži, ledvinách, srdci, plících, centrálním nervovém systému a očích, které jsou způsobené vaskulitidou související s autoimunitním procesem.
Mezi další příznaky související s revmatoidní artritidou patří zvýšená sedimentace erytrocytů a zvýšená sérová koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) a/nebo solubilního IL-2 receptorů (IL-2r). Sedimentace erytrocytů je zvýšena téměř u všech pacientů s aktivní revmatoidní artritidou. Koncentrace C-reaktivního proteinu v séru je také zvýšená a koreluje s aktivitou onemocnění a pravděpodobností progresivního postižení kloubů. Dále, sérová koncentrace solubilního IL-2r, produktu aktivovaných T-lymfocytů, je zvýšena v séru a synoviální kapalině u pacientů s aktivní revmatoidní artritidou (viz Principals of Internal Medicine, Harrisson, 13. vydání, strana 1650).
Revmatoidní artritis se považuje za autoimunitní onemocnění zprostředkované T-lymfocyty, na kterém se podílí antigen-nespecifické intercelulární interakce mezi T-lymfocyty a buňkami prezentujícími antigen. Obecně, velikost reakce T-lymfocytů je určena ko-stimulační reakcí vyvolanou interakcí mezi povrchovými molekulami T-lymfocytů a jejich ligandy (Mueller et al., 1989 Ann. Rev. Imunol. 7:445-480). Klíčové kostimulační signály jsou dodávány interakcí mezi povrchovými receptory T-lymfocytů, CD28 a CTLA4, a jejích ligandy, jako jsou molekuly CD80 podobné B7 {tj.. B7-1) a CD86 (t.j. B7-2), na buňkách prezentujících antigen (Linslev, P. a Ledhetter, J., 1993 Ann.
Rev. Imunol. 11:191-212).
Aktivace T-lymfocytů za absence ko-stimulace vede k alergické reakci T-lymfocytů (Schwartz, R. H., 1992 Cell 71:1065-1068), při které imunitní systém přestává reagovat na stimulaci.
Protože se revmatoidní artritida považuje za autoimunítní onemocnění zprostředkované T-lymfocyty, je jednou strategií pro vývoj nových činidel pro léčbu revmatoidní artritidy snaha o identifikací molekul, které blokují ko-stímulační signály mezi T-lymfocyty a buňkami prezentujícími antigen, blokováním interakce mezi endogenním CD28 nebo CTLA4 a B7. Mezi potenciální molekuly patří solubilní CTLA4 molekuly, které jsou modifikovány tak, aby byly schopny se vázat na B7 s vyšší avidítou než přirozený CTLA4 (jehož sekvence je uvedena na Obr. 23) nebo CD28, čímž dojde k blokování ko-stimulačních signálů.
Solubilní formy CD25 a CTLA4 byly připraveny fúzováním variabilních (V)-like extracelulárních domén CD28 a CTLA4 na imunogl obul ino vé (Ig) konstantní domény, což vede ke vzniku CD28Ig a CTLA4Ig. Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTLA4Ig je uvedena na Obr. 24 s tím, že protein začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici-1 a končí lysinem v pozici +357. CTLA4Ig se váže na CD80-pozitivní a CD86-pozitivní buňky silněji než CD28Ig (Linsley. P., et al., 1994, Immunity 1:793-80). Bylo zjištěno, že mnoho imunitních reakcí zprostředkovaných T-lymfocyty je blokováno CTLA4Ig jak in vitro, tak in vivo. (Linsley, P., et at., 1991b, výše: Linsley, P., et at., 1992a Science 257:792-795; Linsley, P., et al. 1992b J. Exp.
> · · · · I • ·
Med 176:1595-1604; Lenschow. D.J., et at. 1992 Science 257:789-792; Tan, P., et al., 1992 J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L.A., 1992 Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105).
Pro pozměnění vazebné afinity k přirozeným ligandům, jako je B7, byly solubilní CTLA4Ig fúzní molekuly modifikovány mutací aminokyselin v CTLA4 části molekuly. Regiony CTLA4, které po mutaci mění vazebnou afinitu nebo aviditu pro B7 ligandy zahrnují komplementaritu určující region 1 (CDR-1, jak je popsán v U.S. Patentech 6090914, 5773253, 5844095; v související U.S. Patentové přihlášce pořadové č. 60/214065: a v Peach et al., 1994, J. Exp. Med., 180:2049-2058) a regiony podobné komplementaritu určujícímu regionu 3 (CDR-3-like regiony (CDR-3 je konzervovaný region CTLA4 extracelulární domény, jak je popsáno v U.S. Patentech 6090914, 5773253 a 5844095; v související US patentově přihlášce pořadové č. 60/214065; a v Peach, R.J., et at., J. Exp Med 1994 180:2049-2058. CDR-3-podobný region obsahuje CDR-3 region a dalších několik aminokyselin před a/nebo za CDR-3 motivem.
CDR-3-podobný region obsahuje hexapeptidový motiv MYPPPY, který je vysoce konzervován ve všech členech CD25 a CTLA4 rodiny. Alaninová skenovací mutagenese v hexapeptidovém motivu v CTLA4, a ve vybraných zbytcích v CD28Ig, vedla ke snížení nebo eliminaci vazby na CD8O (Peach, R.J., et al., J Exp Med 1994, 160:2049-2058).
Další modifikace v solubilní CTLA4Ig molekule byly provedeny záměnou homologních regionů CTLA4 a CD28. Tyto chimérické CTLA4/CD28 homologní mutantní molekuly identifikovaly MYPPPY hexapeptidový motiv společný CTLA4 a CD28, stejně jako některé nekonzervované aminokyselinové zbytky v CDR-1 a CDR-3-podobných regionech CTLA4, jako regiony odpovědné za zvýšení vazebné avidity CTLA4 s CD8O (Peach, R. J., et al., 1994 J Exp Med 180:2049-2058).
Solubilní CTLA4 molekuly, jako je CTLA4Ig, CTLA4 mutantní ···· »· ·.
• · .. . ··....
···.
: *: :··:·· · \
....... ·..· · · molekuly nebo chimérické CTLA4/CD28 homologní mutanty, jak byly popsány výše, tvoří novou skupinu terapeutických léků pro léčbu revmatických onemocnění.
Současná léčba revmatických onemocnění, jako je revmatoidní artritis, zahrnuje podávání nespecifických cytotoxických imunosupresivních léků, jako je methotrexat, cyklofosfamid, azathioprim, cyklosporin A, blokátory nebo antagonisté faktoru nekrosy nádoru alfa (TNF-alfa). Tyto imunosupresivní léky potlačují celou imunitní odpověď jedince a dlouhodobé používání zvyšuje riziko infekci. Kromě toho tyto léky pouze zpomaluji progresi revmatoidní artritidy, což vede k akceleraci stavu poté, co je terapie přerušena. Dále dlouhodobá terapie těmito nespecifickými léky má toxické nežádoucí účinky, včetně tendence ke vzniku některých malignit, selhávání ledvin, suprese kostní dřeně, plicní fibrosy, malignit, diabetů a narušení jaterních funkcí. Účinnost těchto léků také postupně během 2-5 let vymizí (Kelley's Textbook of Rheumatology, 6. vydání, strany 1001-1022).
Alternativně jsou k dosaženi syraptomatické úlevy používána terapeutická činidla, který jsou nespecificky imunosupresivní a protizánětlivá. Tyto léky jsou závislé na dávce a nebrání progresi onemocnění, mezi takové léky patří steroidní sloučeniny, jako je prednison a methylprednisolon. Steroidy mají také významné nežádoucí účinky při dlouhodobé terapii {Kelley's Textbook of Rheumatology, 6. vydání, strany 829-833).
Tak má současná léčba revmatoidní artritidy omezenou účinnost, významné nežádoucí účinky a nemůže být použita po dlouhou dobu.
Proto existuje potřeba nové léčby, která je účinná a lepší pro léčbu revmatických onemocnění, jako je revmatoidní artritida, a která nemá nevýhody běžných terapií a léků, neboť postihuje autoimunitní patofyziologické mechanismy.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje prostředky a způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému, pří kterých jsou jedincům podány solubilní CTLA4 molekuly, které se váží na B7 molekuly na B7-pozitivních buňkách, čímž inhibují endogenní B7 molekuly z vazby na CTLA4 a/nebo CD2S na T-lymfocytech. Mezi solubilní CTLA4 molekuly použité ve způsobech podle předkládaného vynálezu patří CTLAAIg a solubilní CTLA4 mutantní molekula L404EA29YIg.
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro inhibování funkce T-lymfocytů, ale ne pro depleci T-lymfocytů u člověka, pomocí kontaktování B7-pozitivních buněk u člověka se solubilním CTLA4. Příklady solubilních CTLA4 jsou CTLA4Ig a solubilní CTLA4 mutantní molekula, jako je L104EA29YIg.
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro léčbu (například redukci příznaků) revmatických onemocnění, jako je revmatoidní artritis, podáním solubilní CTLA4 molekuly, jako je CTLA4Ig a/nebo solubilní CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg, jedinci s revmatoidní artritidou. CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg, která například začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí lysinem v pozici +357, jak je uvedeno na Obr. 19, je výhodná pro použití ve způsobech podle předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro redukování patofyziologických změn asociovaných s revmatickým onemocněním, jako je strukturální postižení, podáním solubilní CTLA4 molekuly jedinci s revmatoidní artritidou.
• · · ·· ···· • a • · · ·
Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutické kompozice pro léčbu onemocněni imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění, které obsahují farmaceuticky přijatelný nosič a biologicky účinné činidlo, jako jsou solubilní CTLA4 molekuly.
Kity obsahující terapeutické farmaceutické prostředky pro onemocnění imunitního systému jsou také zahrnuty v předkládaném vynálezu. V jednom provedení je kit obsahující jeden nebo více farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu použit pro léčbu onemocnění imunitního systému, např. revmatoidní artritidy. Například obsahuje farmaceutická kompozice podle předkládaného vynálezu účinné množství solubilní CTLA4 mutantní molekuly, která se váže na B7 molekuly na B7-pozitivních buňkách, čímž blokuje B7 molekuly od vazby CTLA4 a/nebo CD28 na T-lymfocytech. Dále může kit obsahovat jedno nebo více imunosupresivních činidel použitých současně s farmaceutickou kompozicí podle předkládaného vynálezu . Mezi potenciální imunosupresivní činidla patří, například, kortikosteroidy, nesteroidní antirevmatika (např. Cox-2 inhibitory), cyklosporin, prednison, azathioprin, methotrexát, blokátory nebo antagonisté TNF-alfa, infliximab, jakékoliv biologické činidlo působící na zánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazoprin, soli zlata, etanercept a anakira.
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro snížení sedimentace erytrocytů, která je asociován s revmatoidní artritidou.
Dále předkládaný vynález poskytuje způsoby pro snížení koncentrace některých složek krevního séra, které jsou asociovány s revmatoidní artritidou, včetně C-reaktivního proteinu, solubilního ICAM-l, solubilní E-selektinu a/nebo solubilního • · · · · ·
·· ...···
IL-2r.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1A: Demografická data kohort pacientů. Demografická data zahrnují pohlaví, rasu a trvání onemocnění, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 1B: Demografická data kohort pacientů. Demografická data zahrnují pohlaví, věk, hmotnost a aktivitu onemocnění, jak je hodnocena pacientem a lékařem, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 1C: Demografická data kohort pacientů, jak je popsáno v příkladu 3, dále. Demografická data zahrnují aktivitu onemocnění, sedimentaci erytrocytů (ESR), fyzikální funkce (neschopnost hodnocená podle dotazníku) a C-reaktivní protein (CRP).
Obr. ID: Demografická data kohort pacientů, jak je popsáno v příkladu 3, dále. Demografická data zahrnují otoky kloubů, citlivost kloubů, ranní ztuhlost a bolest.
Obr. IE: Demografická data kohort pacientů, jak je popsáno v příkladu 3. Demografická data zahrnují předchozí léčbu.
Obr. 2: Souhrn důvodů přerušení léčby v den 85, podle příkladu 3, dále.
Obr. 3A: ACR reakce v den 85, podle příkladu 3, dále: ACR-20, -50 a -7 0 reakce.
Obr. 3B: ACR-20 reakce v den 85, včetně reakce na placebo, podle příkladu 3, dále: ACR-20 reakce s 95% intervalem spolehlivosti.
·· ·· • ♦ « • · · » · · • » · • · · · · • · · • · · • · · · *
Obr. 3C: ACR-20 reakce v den 85 podle příkladu 3, dále: Rozdíly v ACR-20 reakci s 95% intervaly spolehlivosti.
Obr. 4A: Základní (20% zlepšení) klinická odpověď z hlediska otoku a citlivosti kloubů v procentu pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: základní klinická odpověď. ACR-20.
Obr. 4B: Klinické odpovědi (v procentech zlepšení) u oteklých a citlivých kloubů v procentu pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změna klinické odpovědi v procentu zlepšení.
Obr. 5A: Reakce z hlediska bolesti (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny skóre bolesti od základní hodnoty.
Obr. 5B: Celkové změny aktivity onemocnění hodnocené lékařem (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny celkové aktivity onemocnění.
Obr. 5C: Celkové změny aktivity onemocnění hodnocené lékařem (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny celkové aktivity onemocnění.
Obr. 5D: Bolest (podle Likertovi stupnice v průměrném počtu jednotek od základní hodnoty) v procentech pacientů v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: změny od základní hodnoty.
Obr. 6A: Celkové hodnocení změny aktivity onemocnění od základní hodnoty podle pacienta po 2 jednotkách v den 85, jak je popsáno ·· ···· * · · • · · · v příkladu 3; zlepšení aktivity onemocnění.
Obr. 6B: Celkové hodnocení změny aktivity onemocnění od základní hodnoty podle lékaře po 2 jednotkách v den 85, jak je popsáno v příkladu 3; zlepšení aktivity onemocnění.
Obr. 7A: Procentuální redukce koncentrací C-reaktivního proteinu (CRP) v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále; procento snížení koncentrace CRP vzhledem k základní hodnotě.
Obr. 7B: Rozdíl ve snížení koncentrací C-reaktívního proteinu (CRP) v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: procentuální snížení rozdílu v koncentracích CRP v 95% intervalu spolehlivosti.
Obr. 7C: Průměrně snížení koncentrace C-reaktívního proteinu (CRP) v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná zrněna od základní hodnoty.
Obr. 8: Redukce koncentrace solubílního IL-2 receptorů, průměrná změna od základní hodnoty v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 9A: Efekt CTLA4Ig na citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 9B: Efekt CTLA4Ig na citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrný rozdíl od základní hodnoty.
Obr. 10A: Efekt CTLA4Ig na otok kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 10B: Efekt CTLA4Ig na otok kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrný rozdíl od základní hodnoty.
Obr. 11: Efekt CTLA4Ig na bolest podle průměrné změny od základní hodnoty za čas, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 12A: Efekt CTLA4Ig na hodnocení aktivity onemocnění pacientem podle průměrné změny od základní hodnoty za čas, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 12B: Efekt CTLA4Ig na hodnocení aktivity onemocněni pacientem podle průměrné změny od základní hodnoty za čas, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 13A: Efekt L104EA29YIg citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 13B: Efekt L104EA29YIg na citlivé klouby v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty.
Obr. 14A: Efekt L104EA29YIg na otoky kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: medián rozdílu od základní hodnoty.
Obr. 14B: Efekt L104EA29Ylg na otoky kloubů v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty.
Obr. 15: Efekt L104EA29YIg na hodnocení bolesti v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty za čas.
Obr. 16A: Efekt L104EA29YIg na hodnocení bolesti pacientem v čase, jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty za čas.
Obr. 16B: Efekt LlO4EA29YIg na hodnocení bolesti lékařem v čase, • · ♦ · jak je popsáno v příkladu 3, dále: průměrná změna od základní hodnoty za čas.
Obr. 17: Procentuální zlepšení nezpůsobilosti pacienta podle dotazníku hodnotícího zdravotní stav (HAQ) ve srovnání s výchozí stavem v den 85 s léčbou CTLA4Ig a L104EA29YIg, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
Obr. 18: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence LlO4EIg, jak je popsána v příkladu 1, dále.
Obr. 19: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29YIg, jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
Obr. 20: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29LIg jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
Obr. 21: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29TIg, jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
Obr. 22: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence L104EA29WIg, jak jsou popsány v příkladu 1, dále.
Obr. 23: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTLA4 receptoru.
Obr. 24: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence CTLA4Ig.
Obr. 25: SDS gel (obr. 25A} pro CTIiA4Ig (dráha 1), LI04EIg (dráha
2) , a L104EA29YIg (dráha 3A) ; chromatogramy s vylučováním podle velikosti pro CTLA4Ig (obr. 25B) a L104EA29YIg (Obr. 25C).
Obr. 26 (levý a pravý obr.): Diagram složeného CTLA4 extracelulárního Ig V-typu připraveného podle struktury určené NMR spektroskopií. Obr. 26 (pravý} ukazuje rozšířený pobledl na CDR-1 (S25-R33) region a MYPPPY region ukazující umístění a orientaci vedlejších řetězců mutací zvyšujících avídítu, L104 a A29.
Obr. 27A a 27B: FACS testy ukazující vazbu L104EA29Ylg, L104EIg a CTLA4Ig na lidské CD8O- nebo CD86-transfektované CHO buňky, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 28A a 28B: Grafy ukazující Inhibici proliferace
CD80-pozitivních a CD86-pozítivních CHO buněk, jak je popsána v příkladu 2, dále.
Obr. 29A a 29B: Grafy ukazující že L104EA29YTg je účinnější než CTLA4Ig v inhibování proliferace primárních sekundárních allostimulovaných T-lymfocytů, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 30A-C: Grafy ilustrující, že L104EA29YTg je účinnější než CTLA4Ig v inhibování produkce IL-2 (obr. 30A), IL-4 (obr. 30B) a gamma-interferonu (FIG. 30C) al los tímul ovánými lidskými T-lymfocyty, jak je popsáno v příkladu 2, dále
Obr. 31: Graf ukazující, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v inhibování proliferace fytohemaglutininera (PHA) stimulovaných opičích T-lymfocytů, jak je popsáno v příkladu 2, dále.
Obr. 32: Graf ukazující analýzu vazebné rovnováhy pro
L104EA29YIg, E104EIg a přirozený CTLA4Ig k CD86Ig.
Obr. 33A a 13: Redukce koncentrace solubilního ICAM-1 a solubilního E-selektinu jako průměrné změny od základní hodnoty v den 85, jak je popsáno v příkladu 3, dále.
• · · · · « ’ · · • · . ·· .., : * · ··· · ί i
..· ·..·· • · · I
Podrobný popis vynálezu
Definice
Všechny vědecké a technické termíny uvedené v této přihlášce mají významy běžně používané v oboru, pokud není uvedeno jinak. Následující výrazy nebo fráze mají následující významy.
Termín ligand označuje molekulu, která specificky rozpoznává a váže se na jinou molekulu, například ligandem pro CTLA4 je B7 molekula.
Přirozený CTLA4 nebo nemutovaný CTLA4 má aminokyselinovou sekvenci přirozeného, kompletního CTLA4, jak je uveden na Obr. 23 (též jak je popsán v U.S. Patentech č. 5434131, 5844095,
5851795), nebo jakékoliv jeho části, která rozpoznává a váže se na B7 nebo interferuje s B7 tak, že blokuje vazbu na CD28 a/nebo CTLA4 (např., endogenní CD28 a/nebo CTLA4). V konkrétních provedeních začíná extracelulární doména přirozeného CTLA4 methioninem v pozici +1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124, nebo začíná extracelulární doména přirozeného CTLA4 alaninem v pozici -1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124 . Přirozený CTLA4 je buněčný povrchový protein mající N-terminální extracelulární doménu, transmembranovou doménu a C-terminální cytoplasmatickou doménu. Extracelulární doména se váže na cílové molekuly, jako je B7 molekula. V buňkách je přirozený CTLA4 protein translatován jako nezralý polypeptid, který obsahuje signální peptid na N-terminálním konci. Nezralý polypeptid je post-translačně zpracováván, což zahrnuje štěpení signálního peptidu za zisku CTLA4 štěpeného produktu majícího nový N-terminální konec, který se liší od N-termináln£ho konce nezralé formy. Odborníkům v oboru bude jasné, že může proběhnout další post-translační zpracování, které odstraní jednu nebo více • · » · • · · ·
aminokyselin z nového N-terminálního konce CTLA4 vzniklého štěpením. Alternativně nemusí být signální peptid odstraněn zcela, za zisku molekuly, která začíná před obvyklým počátečním methioninem. Tak může zralý CTLA4 protein začínat methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1. Zralá forma CTLA4 molekuly obsahuje extracelulámí doménu nebo jakoukoliv její část, která se váže na B7.
Termín CTLA4 mutantní molekula“ označuje přirozený CTLA4 jak je uveden na obr. 23 nebo jakoukoliv jeho část nebo derivát, který obsahuje mutaci nebo vícečetně mutace (výhodně v extracelulámí doméně přirozeného CTLA4). CTLA4 mutantní molekula má sekvenci, která je podobná, ale ne identická sekvenci přirozené CTLA4 molekuly, ale která se stále ještě váže na B7. Mutace mohou postihovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků, kde tyto zbytky jsou substituované aminokyselinovou mající konzervativní (např., leucin za isoleucin) nebo nekonzervativní (např. glycin za tryptofan) strukturu nebo chemické vlastnosti, a dále se může jednat o aminokyselinové delece, adice, posuny čtecího rámce nebo zkrácení. CTLA4 mutantní molekuly mohou zahrnovat non-CTLA4 molekuly navázané na mutantní CTLA4 molekuly. Mutantní molekuly mohou být solubilní (t.j., cirkulující) nebo vázané na buněčný povrch. Mezí další CTLA4 mutantní molekuly patří molekuly popsané v U.S. Patentové přihlášce pořadové č. 09/865321, 60/214065 a 60/287576; v U.S. Patentech č. 6090914, 5844095 a 5773253; a v Peach, R. J. et al., v J Exp Med 180:2049-2058 (1994)). CTLA4 mutantní molekuly mohou být připraveny synteticky nebo rekombinantně.
CTLA4Ig je solubilní fúzní protein obsahující extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 navázanou na Ig koncovku, nebo jeho část, která se váže na B7. Konkrétní provedení obsahuje extracelulámí doménu přirozeného CTLA4 (jak je uvedena na obr. 23) začínající • · · · methioninem v pozici +1 a končící kyselinou asparagovou v pozici +124; nebo začínající alanínem v pozici -1 a končící kyselinou asparagovou v pozici + 124; spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125; a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357 (DNA. kódující CTLA4Ig byla uložena 31.5.1991 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, YA 20110-2209, podle podmínek Budapešťské smlouvy, pod ATCC přírůstkovým č. ATCC 68629; Linsley, P., et al., 1994 Immunity 1:793-80). CTLA4Ig-24, buněčná linie ovariálních buněk čínského křečka (CHO) exprimující CTLA4Ig, byla uložena 31.5.1991 pod ATCC Identifikačním č. CRL-10762. Solubilní CTLA4Ig molekuly použité ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat signální (vedoucí) peptidovou sekvenci. Obvykle ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují sekvenci signálního peptidu.
L104EA29YIg je fúzní protein, který je solubilní CTLA4 mutantní molekulou obsahující extracelulární doménu přirozeného CTLA4 s aminokyselinovými změnami A29Y (tyrosin substituující alanin v pozici 29) a L104E (kyselina glutamová substituující leucin v pozici +104), nebo její část, která se váže na B7 molekulu, navázanou na Ig koncovku (obsaženou na obr. 19; DNA kódující L104EA29YIg byla uložena 20.6.2000 s ATCC číslem PTA-2104; jak je uvedeno v souvisejících U.S. Patentových přihláškách pořadové č. 09/579,927, 60/287,576 a 60/214,065, které jsou zde uvedeny jako odkazy). Solubilní L104EA29YIg molekuly použité ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat sekvenci signálního (vedoucího) peptidu. Obvykle ve způsobech a/nebo kitech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují sekvenci signálního peptidu.
Termín solubilní, jak je zde použit, označuje jakoukoliv • * • 4 ···· • · ·· molekulu, nebo její fragmenty a deriváty, nenavázanou nebo nepřipojenou buňku, t.j., cirkulující. Například, CTLA4, B7 nebo CD28 mohou být učiněny solubilními navázáním ímunoglobulínové (Ig) skupiny na extracelulární doménu CTLA4, B7 nebo CD28, v příslušném pořadí. Alternativně, molekula jako je CTLA4 může být učiněna solubilní odstraněním její transmembránové domény. Obvykle ve způsobech podle předkládaného vynálezu solubilní molekuly neobsahují sekvenci signálního peptidu.
Termín solubilní CTLA4 molekuly označuje CTLA4 molekuly, nebo jakoukoliv funkční část CTLA4 molekuly, nevázanou na povrch buněk (tj. cirkulující), která se váže na B7 včetně, například: CTLA4Ig fúzních proteinů (např. ATCC 68629), kde je extracelulární doména CTLA4 fúzovaná na ímunoglobulinovou (Ig) skupinu, čímž se stane fúzní molekula solubilní, nebo fragmenty a deriváty těchto proteinů s extracelulární doménou CTLA4 fúzovanou nebo spojenou s částí biologicky aktivního nebo chemicky aktivního proteinu, jako je produkt papilomavirového E7 genu (CTLA4-E7), antigen p97 asociovaný s melanomem (CTLA4-p97) nebo HIV env protein (CTLA4-env gpl20), nebo jejich fragmenty a deriváty; hybridní (chimérické) fúzní proteiny, jako je CD28./CTLA4Ig, nebo jejich fragmenty a deriváty; CTLA4 molekuly s odstraněnou transmembránovou doménou pro dosažení solubility proteinu (Oaks,
Μ. K., et al., 2000, Cellular Iraunology 201:144-153), nebo jejich fragmenty a deriváty. Solubilní CTLA4 molekuly také zahrnují jejich fragmenty, části a deriváty a solubilní CTLA4 mutantní molekuly mající CTLA4 vazebnou aktivitu. Solubilní CTLA4 molekuly použité ve způsobech podle předkládaného vynálezu mohou a nemusí obsahovat sekvenci signálního (vedoucího) peptidu. Obvykle ve způsobech podle předkládaného vynálezu molekuly neobsahují sekvence signálního peptidu.
Termín extracelulární doména CTLA4, jak je zde použit, •9 ····
9 9 * označuje část CTLA4, která rozpoznává a váze se na CTLA4 ligandy, jako jsou B7 molekuly. Například, extracelulární doména CTLA4 obsahuje methíonín v pozicí +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (Obr. 23). Alternativně, extracelulární doména CTLA4 obsahuje alanin v pozici -1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 (Obr.
23). Extracelulární doména zahrnuje fragmenty nebo deriváty CTLA4 se váží na B7 molekulu. Extracelulární doména CTLA4, jak je uvedena na Obr. 23, může také obsahovat mutace, které mění vazebnou aviditu CTLA4 molekuly pro B7 molekulu.
Termín mutace”, jak je zde použít, označuje změnu v nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci přirozené molekuly, například, změnu v DNA a/nebo aminokyselinové sekvenci přirozené CTLA4 extracelulární domény. Mutace v DNA může měnit kodon, což vede ke změně aminokyselinové sekvence. Změny v DNA zahrnují substituce, delece, inserce, alternativní sestřih a zkrácení. Změny v aminokyselinách mohou zahrnovat substituce, delece, inserce, adice, zkrácení nebo změny v modifikaci či štěpení proteinu. Alternativně, mutace v nukleotidové sekvencí mohou způsobovat silentní mutace v aminokyselinové sekvenci, jak je v oboru dobře známo. Některé nukleotidové kodony kódují stejné aminokyseliny. Příklady jsou nukleotidové kodony CGU, CGG, CGC a CGA kódující aminokyselinu argínin (R) ; nebo kodony GAU a GAC kódující aminokyselinu kyselinu asparagovou (D). Tak může být protein kódován jedno nebo více molekulami nukleové kyseliny, které se liší ve specifické nukleotidové sekvenci, ale které kódují proteinové molekuly mající identické sekvence. Kódující sekvence pro aminokyseliny jsou následující:
Aminokyselina VU-llMpiOlilVlillJ symbol Kodony
Alanin Ala A GCU, GCC. GCA, GCG
Cystein Cys C UGU, UGC
kyselina asparagová Asp D GAU, GAC
kyselina glutamová Glu E GAA, GAG
Fenylalanin Phe F UUU, UUC
Glycin Gly G GGLí, GGC, GGA, GGG
Histidin His H CAU, CAC
Isoleucin Ile I AUU, AUC, AUA
Lysin Lys K AAA, AAG
Leucin. Leu L UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG
Methionin Met M AUG
Asparagin Asn N AAU, AAC
Prolin Pro P CCU, CCC, CCA, CCG
Glutamin Gin Q CAA, CAG
Arginin Arg R CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
Serin Ser S UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, AGC
Tlireonin Thr T ACU. ACC, ACA, ACG
Valin Val v GUU, GUC, GUA, GUG
Tryptofan Trp w UGG
Tyrosin Tyr ¥ UAU, UAC
Mutantní molekula může obsahovat jednu nebo více mutací.
Termín non -CTLA4 proteinová sekvence nebo non-CTLA4
molekula, jak je zde použit, označuje jakoukoliv proteinovou molekulu, která se neváže na B7 a neinterferuje s vazbou CTLA4 na cílovou molekulu. Příkladem jsou imunoglobulinový (Ig) konstantní region nebo jeho část. Výhodně je Ig konstantní region z lidského nebo opičího Ig, např., lidský C{gamma)l, včetně pantového regionu, CH2 a CH3 regionů. Konstantní region Ig může být mutován pro redukci jeho efektorových funkcí (U.S. Patenty 5637481, • ·
5544095 a 5434131).
Termín fragment nebo část označuje jakoukoliv část nebo segment CTLA4 molekuly, výhodně extracelulární doménu CTLA4 nebo její část nebo segment, který rozpoznává a váže se na cílovou molekulu, např. B7 molekulu.
Termín B7, jak je zde použit, označuje B7 rodinu molekul včetně, ale nejen, B7-1 {CD8O), B7-2 (CD86) a B7-3, které rozpoznávají a váží se na CTLA4 a/nebo CD28.
Termín B7-pozitivní buňky, jak je zde použit, označuje jakékoliv buňky s jedním nebo více typy B7 molekul exprimovanými na povrchu buněk.
Termín derivát, jak je zde použit, označuje molekulu, která vykazuje homologní sekvenci a aktivitu původní molekuly.
Například, derivát CTLA4 je solubilní CTLA4 molekula mající aminokyselinovou sekvenci alespoň ze 70% podobnou extracelulární doméně přirozeného CTLA4, a která rozpoznává a váže se na B7, např. CTLA4Ig nebo solubilní CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg.
Termíny blokovat” nebo inhibovat” receptor, signál nebo molekulu znamenají interferovat s aktivací receptoru, signálu nebo molekuly, jak je detekováno za použití testů znaných v oboru. Například, blokáda buňkami zprostředkované imunitní reakce může být detekována stanovením redukce příznaků asociovaných s revmatickým onemocněním. Blokáda nebo inhibice může být částečná nebo úplná.
Termín blokování B7 interakce znamená interferenci s vazbou B7 na jeho ligandy, jako je CD28 a/nebo CTLA4, čímž dochází k blokádě interakci mezi T-lymfocyty a B7-pozitivními buňkami.
• ♦ · ·
Příklady činidel, která blokují B7 interakce, jsou, například, molekuly jako je protilátka (nebo její část nebo derivát), která rozpoznává a váže se na jakoukoliv CTLA4, CD25 nebo B7 molekulu (např. B7-1, B7-2); solubilní forma (nebo její část nebo derivát) molekuly, jako je solubilní CTLA4; peptidový fragment nebo jiná malá molekula navržená tak, aby interferovala s buněčným signálem prostřednictvím CTLA4/CD28/B7-zprostředkovaných interakcí. Ve výhodném provedení je blokovací činidlo solubilní CTLA4 molekula, jako je CTLA4Tg (ATCC 68629) nebo LlG4EA29YTg (ATCC PTA-2104), solubilní CD28 molekula, jako je CD28Ig (ATCC 68628), solubilní B7 molekula, jako je B7Ig (ATCC 68627), anti-B7 monoklonální protilátka (např. ATCC HB253, ATCC CRL-2223, ATCC GRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341 a monoklonální protilátky popsané v Anderson et al. v U.S. Patentu 6113898 nebo Yokochi et al., 1982. J.
Irnmun., 128(2)823-827), antí-CTLA4 monoklonální protilátka (např. ATCC HB-304, monoklonální protilátky, jak jsou popsané v odkazech 82-83) a/nebo anti-CD28 monoklonální protilátka (např. ATGG HB 11944 a mAb 9.3, jak je popsána v Hansen (Hansen et al., 1980. Imunogenetícs 10: 247-260) nebo Martin (Martin et al., 1984. J. Clin. Irnmun., 40:18-22)).
Termín onemocnění imunitního systému označuje jakékoliv onemocnění zprostředkované interakcemi T-lymfocytů s B7-pozitivními buňkami, včetně, například autoimunitních onemocnění, onemocnění souvisejících s transplantáty a imunoproliferativních onemocnění. Příklady onemocnění imunitního systému jsou reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) (např. při transplantaci kostní dřeně nebo při indukcí tolerance), imunologické poruchy asociované a odmítnutím transplantátu, chronické rejekce, tkáňové nebo buněčné allo- nebo xenotransplantáty, včetně orgánových, kožních, ostrůvků pankreatu, svalů, hepatocytů a neuronů. Příklady imunoproliferativních onemocnění jsou, například, psoriasa, T-lymfocytární lymfom, • · ·
T-Iymfocytární akutní lymfoblastická leukemie, testikulární angiocentrický T-lymfocytární lymfom, benigní lymfocytární angíítís, lupus (např. lupus ery thematosus, lupusová nefritis), Hashimotova thyroiditis, primární myxedem, Gravesova nemoc, perniciosní anemie, autoimunní atrofická gastritis, Addisonova nemoc, diabetes (např. insulin dependentní diabetes mellitus, diabetes mellitus typu I, diabetes mellitus typu II),
Goodpasteurův syndrom, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnova nemoc, sympathetická ophthalmia, autoimunní uveitis, roztroušená sklerosa, autoimunní hemolytická anemie, idiopatická trombocytopenie, primární bíliární círhosa, chronická hepatitis, ulcerosní colitis, Sjogrenův syndrome, revmatická onemocnění (např. revmatoidní artritis), polymyositis, sclerodermie a smíšené onemocnění poj ivové tkáně.
Termín revmatická onemocnění označuje jakákoliv onemocnění, která postihují klouby, kosti, měkké tkáně nebo míchu (Mathies. H. 1983 Rheuma) a patří mezi ně zánětlivý revmatízmus, degenerativní revmatizmus, extraartikulární revmatízmus a kolagenosy. Dále mezi revmatická onemocnění patří, například, chronická polyartritis, psoriasis artropathica, ankylosující spondylitis, revmatoidní artritis, panarteriitís nodosa, systémový lupus erythematodes, progresivní systémová sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondorkalcinosis, dermatomyositis, svalový revmatizmus, myositis a myogelosis. 0 některých revmatických onemocněních je známo, že se jedná o autoimunitní onemocnění způsobené chybnou imunitní reakcí jedince.
Termín genová terapie, jak je zde použit, označuje způsob léčby onemocnění genetickou manipulací tak, že se sekvence nukleové kyseliny přenese do buňky a buňka potom exprimuje genetický produkt kódovaný nukleovou kyselinou. Například, jak je dobře známo odborníkům v oboru, přenos nukleové kyseliny může být • · proveden insercí expresního vektoru obsahujícího danou nukleovou kyselinu do buněk ex vivo nebo in vitro různými způsoby, včetně, například, srážení fosforečnanem vápenatým, diethyaminoethyldextraném, polyethylenglykolera (PEG), elektroporací, přímou injekcí, lipofekcí nebo virovou infekcí (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Kriegler M. Gene Transfer ad Expression: A Laboratory Manual (W. H. Freeman a Go, New York,
N.Y., 1993) a Wu, Methods in Enzymology (Academie Press, New York, 1993), které jsou zde uvedeny jako odkazy). Alternativně, požadované sekvence nukleové kyseliny mohou být přeneseny do buňky in vivo v různých vektorech a různými způsoby, včetně, například, přímého podání nukleové kyseliny jedinci (Williams et al., 1991 PNAS 88:2726-2730), nebo insercí nukleové kyseliny do virového vektoru a infekci jedince vírem (Battleman et al., 1993 J.
Neurosci 13:94-951; Carroll et al, 1993 J Cell Biochem. 17E:241; Lebkowski et al., U.S. Patent 5354678; Davison a et al., Molecular Virology: A Practical Approach (IRL Press, New York, 1993)) . Další způsoby používané pro ín vivo transfer zahrnují enkapsulaci nukleové kyseliny do liposoraů, přímý přenos liposomů nebo liposomů kombinovaných s hemaglutinačním Sěndai virem jedinci (U.S. Patent 5824655, který je zde uveden jako odkaz). Transfektováné nebo infikované buňky exprimují proteinové produkty kódované nukleovou kyselinou za zmírnění onemocnění nebo příznaků onemocnění.
Vynález bude nyní podrobněji popsán v následujícím popisu.
Prostředky a způsoby podle předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje prostředky a způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění, při kterých je jedinci podáno účinné množství ligandu, který se váže na B7, například, solubilní CTLA4 molekuly (jako je CTLA4Lg • · · · • Λ • · · · • . - - ~ ~ » · * • ::···· • · · » · · a/nebo L104EA29YIg) a mAb, které rozpoznávají a váží se na B7. Účinné množství je definováno jako množství solubilních CTLA4 molekul, které, po navázání na B7 molekuly na B7-pozitivních buňkách, inhibuje B7 molekuly z vazby endogenních ligandů, jako je CTLA4 a CD25.
Ve výhodném provedení je onemocněním imunitního systému revmatické onemocnění. Revmatická onemocnění jsou onemocnění, která jsou charakterizována (i) zánětem nebo degenerací muskulo-skeletálního systému nebo pojivové tkáně, zejména kloubů, ale také svalů, šlach, chrupavek, synovialní a fíbrosní tkáně, (ii) otoky kloubů, citlivost kloubů, zánětem, ranní ztuhlostí a/nebo bolestí, nebo narušením pohyblivostí nebo funkce těchto struktur a, v některých případech, jsou také charakterizována (íii) serologickýmí důkazy revmatoídního faktoru a jiných doprovodných zánětlivých markérů.
Mezi revmatická onemocnění patří, například, revmatoídní artritis. Příznaky revmatoídní artritis zahrnují otoky kloubů, citlivost kloubů, zánět, ranní ztuhlost a bolest vedoucí k fyzické neschopnosti. Jedinci s pokročilými stadii artritis trpí strukturálním poškozením a invalidizující bolestí. Autoimunitními mechanismy mohou být postiženy i další orgány.
Prostředky
Předkládaný vynález poskytuje prostředky pro léčbu autoimunitních onemocnění, jako jsou revmatická onemocnění, které obsahují solubilní CTLA4 molekuly. Dále předkládaný vynález poskytuje prostředky obsahující biologické činidlo, které inhibuje funkci T-lymfocytů, ale nezpůsobuje depleci T-lymfocytů, u člověka tak, že kontaktuje B7-pozitivní buňky člověka se solubilní CTLA4 molekulou. Příklady solubilní CTLA4 jsou CTLA4Ig a solubilní • ·
CTLA4 mutantní molekula, např. LiO4EA29YJg.
CTLA4 molekuly, s mutantními nebo přirozenými sekvencemi, mohou být učiněny solubilními pomocí deletování CTLA4 transmembránového segmentu (Oaks, Μ. K., et al., 2000 Cellular Imunology
201:144-153) .
Alternativně mohou být solubilní CTLA4 molekuly, s mutantními nebo přirozenými sekvencemi, fúzní proteiny, kde CTLA4 molekuly jsou fúzované na non-CTLA4 skupinu, jako je imunoglobulínová (Ig) molekula, která činí CTLA4 molekulu solubilní. Například, CTLA4 fúzní protein může obsahovat extracelulární doménu CTLA4 fúzovanou na konstantní doménu imunoglobulinu, což vede k zisku CTLA4Ig molekuly (Obr. 24) (Linsley, P. S., et al., 1994 Immunity 1:793-80).
Pro klinické použití je výhodné, aby imunoglobulinovy region nevyvolával škodlivou imunitní reakci u jedince. Výhodnou skupinou je konstantní region imunoglobulinu, včetně lidských nebo opičích imunoglobulinových konstantních regionů. Jedním příkladem vhodného imunoglobullnového regionu je lidský Cgammal, včetně pantového,
CH2 a CH3 regionu, který může provádět efektorové funkce, jako je vazba na Fc receptory, zprostředkování cytotoxicity závislé na komplementu (CDC), nebo zprostředkování buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC). Imunoglobulinová skupina může mít jednu nebo více mutací, (např. v CH2 doméně, pro redukci efektorových funkcí, jako je CDC nebo ADCC), kde mutace moduluje vazebnou schopnost imunoglobulinu na jeho ligand tím, že zvyšuje nebo snižuje vazebnou schopnost imunoglobulinu na Fc receptory. Například, mutace v imunoglobulinu mohou zahrnovat změny ve všech nebo některých cysteinových zbytcích v pantové doméně, například, cysteinech v pozicích +130, +136 a +139, které jsou substituované serinem (Obr. 24). Imunoglobulínová molekula může také obsahovat • · • · · · • · · · prolin v pozici 148 substituovaný serinem, jak je ukázáno na obr. 24. Dále, mutace v imunoglobulinové skupině mohou být leucin v pozici +144 substituovaný fenylalaninem, leucin v pozici +145 substituovaný kyselinou glutamovou nebo glycin v pozici 147 substituovaný alaninem.
Dalšími non-CTLA4 skupinami pro použití v solubílních CTLA4 molekulách nebo solubilních CTLA4 mutantních molekulách jsou, například, p97 molekula, env gp!2O molekula, E7 molekula a ova molekula (Dash, B. et al. 1994, J Gen. Viral. 75 (Pt 6) :1389-97,Ikeda, I., et al. 1994 Gene 138(1-2):193-6,- Falk, K., et al. 1993 Cell. J. Immunol. 150(2) :447-52,- Fujisaka. K. et al. 1994 Virology 204(2):789-93). Použitelné jsou i další molekuly (Gerard, C. et al., 1994 Neuroscience 62(3):721; Byrn, R. et al. 1989 63 (10):4370,- Smith, D. et al. 1987 Science 238:1704; Lásky, L.
1996 Science 233:209).
Solubilní CTLA4 molekula podle předkládaného vynálezu může obsahovat signální peptidovou sekvenci navázanou na N-terminální konec extracelulámí domény CTLA4 části molekuly. Signální peptid může být jakákoliv sekvence, která umožňuje sekreci molekuly, včetně signálního peptidu z oncostatínu M (Malík, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), nebo CD5 (Jones, Ν. H. et al., (1986) Nátuře 323:346-349), nebo signálního peptidu z jakéhokoliv extracelulárního proteinu.
Solubilní CTLA4 molekula podle předkládaného vynálezu může obsahovat signální peptid oncostatínu M navázaný na N-terminální konec extracelulámí domény CTLA4, a lidskou imunoglobulínovou molekulu (např. pantový region, CH2 a CH3) navázaný na
C-terminální konec extracelulámí domény (přirozené nebo mutované) CTLA4. Tato molekula obsahuje signální peptid oncostatínu M mající aminokyselinovou sekvenci mající methionin v pozici -26 až alanin v pozici -1, CTLA4 část tvořenou aminokyselinovou sekvencí od methioninu v pozici +1 do kyseliny asparagové v pozici +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125, a imunoglobulinou část tvořenou aminokyselinovou sekvencí od kyseliny glutamové v pozici 126 do lysinu v pozici +357.
Konkrétně, solubilní CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu, obsahující mutované CTLA4 sekvence popsané dále, jsou fúzní molekuly obsahující lidské IgCgammal skupiny fúzované na mutované CTLA4 fragmenty.
V jednom provedení obsahují solubilní CTLA4 mutantní molekuly IgCgammal fúzovanou na CTLA4 fragment obsahující jedlinou bodovou mutací v extracelulární doméně. Extracelulární doména CTLA4 obsahuje methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124 {např. obr. 23). Extracelulární část CTLA4 může být tvořena alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124 {např. obr. 23). Příklady bodových mutací jsou mutace, kdy je leucin v pozici +104 změněn na jakoukoli jinou aminokyselinu:
Mutanti s jednou mutací Změna kodonu
L104EIg kyselina glutamová QrR\ G
L104SIg Šerm-' AGT
L104TIg Threonin ACG
L104AIg /Manin GCG
LI04WIg Tryptophan TGG (
L104QIg Glutamin CAG
L104Klg i Lysin AAG
L104RIe Arginin CGG
Li 04GIg Glycin; GGG 1
• · • · ♦ · ·· ···
Dále vynález poskytuje mutantní molekuly mající extracelulární doménu CTLA4 se dvěmi mutacemi, fúzovanou na IgCgaramal skupinu. Příklady jsou následující molekuly, ve kterých je leucín v pozici -104 změněn na jinou aminokyselinu {např. kyselinu glutamovou) a glycin v pozici +105, serin v pozici +25, threonin v pozici 30 nebo alanin v pozici +29 změněn na jakoukoli jinou aminokyselinu:
Mutanti se dvěma mutacemi Změna kodonu
L104EG105FIg TTC fenylalaiun
L104EG105WIg Tryptophan TGG
L104EG105LIg Leucin. CTT
L104ES25RIg Arginin CGG
L104ET30GIg Glycin. GGG
L104ET30NIg Asparagin AAT
L104EA29Yíg Tyrosin TAT
L104EA29LIg Leucin. TTG
L104EA29Tíg Threonin · ACT
L104EA29WIg Tryptophan TGG
Dále vynález poskytuje mutantní molekuly mající extracelulární doménu CTLA.4 obsahující tři mutace, fúzovanou na IgCgaramal skupinu. Příklady jsou následující molekuly, kde je leucin v pozici +104 změněn na jinou aminokyselinu {např. kyselinu glutamovou), alanin v pozici +29 je změněn na jinou aminokyselinu (např. tyrosin) a serin v pozici 25 je změněn na jinou aminoky sel inu:
Mutanti se třemi mutacemi | Změna kodonu
L104EA29YS25Klg i Lysin .. AAA
L104EA29YS25Kíg Lysin· AAG
L104EA29YS25Níg Asparagin AAC
L104EA29YS25RIg Arginin CGG
• · • * * · • · · · • · · · • · · · • · · · · · • · · • · • · · · • ·
Solubilní CTLA4 mutantní molekuly mohou obsahovat spojovací aminokyselinový zbytek, který je umístěn mezí CTLA4 částí a Ig částí molekuly. Spojovací aminokyselinou může být jakákoliv aminokyselina, včetně glutaminu. Spojovací aminokyselina může být vložena jakýmikoliv molekulárními nebo chemickými způsoby známými v oboru.
Předkládaný vynález poskytuje CTLA4 mutantní molekuly obsahující signální peptidovou sekvenci navázanou na N-terminální konec extracelulární domény CTLA4 části mutantní molekuly. Signálním peptidem může být jakákoliv sekvence, která umožňuje sekreci mutantní molekuly, včetně signálního peptidu z oncostatinu M (Malík, et al., 1989 Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), nebo CD5 (Jones, Ν. H. et al., 1986 Nátuře 323:346-349), nebo signálního peptidu z jakéhokoliv extracelulámího proteinu.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující bodové mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104EIg (jak je uveden na Obr. 18) nebo L104SIg, kde L104EIg a L104SLg mají mutace jejich CTLA4 sekvencí, při kterých je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou nebo serinem, v příslušném pořadí. Mezi mutantní molekuly s bodovou mutací dále patří CTLA4 části obsahující methionin v pozici +1 až kyselinu asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutaminem v pozici +125, a imunoglobulinovou část obsahující kyselinu glutamovou v pozici 126 až lysin v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutována tak, že cysteiny v pozicích +130, +136, a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, solubilní CTLA4 mutantní molekula s bodovou mutací může obsahovat CTLA4 část obsahující alanin v pozicí -1 až kyselinu asparagovou v pozici +124.
• · · ·
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující dvoubodové mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104EA29YIg, L104EA29Llg, L104EA29TIg nebo L104EA29WIg, ve kterých je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou a alanin v pozici +29 je změněn na tyrosin, leucin, threonin a tryptofan, v příslušném pořadí. Sekvence pro L104EA29YIg, L104EA29LIg, L104EA29TIg a L104EA29WIg, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357, plus signální (vedoucí) peptidovou sekvenci, jsou ukázány na Obr. 19-22, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly s dvojitými mutacemi dále zahrnují CTLA4 částí obsahující methíonín v pozici +1 az kyselinu asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125, a imunoglobulinou část obsahující kyselinu glutamovou v pozici +126 až lysin v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou obsahovat CTLA4 část obsahující alanin v pozicí -1 až kyselinu asparagovou v pozicí +124.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující dvě bodové mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104EG105FIg, L104EG105WIg a L104EG105LIg, kde leucin v pozici +104 je substituovaný kyselinou glutamovou a glycin v pozici +105 je substituovaný fenylalaninem, tryptofanem a leucinem, v příslušném pořadí. Mezi mutantní molekuly se dvěma mutacemi dále patří CTLA4 částí tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125, a imunoglobulinovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozicí +357.
Imunoglobulinová část může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto ·*> ί mutantní molekuly mohou mít CTLA4 část tvořenou alanínem v pozici
-1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje L104ES25RIg, což je mutantní molekula se dvěma bodovými mutacemi obsahující CTLA4 část tvořenou methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, a spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125, a imunoglobulinou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Část mající extracelulární doménu CTLA4 je mutována tak, že serin v pozici +25 je substituovaný argininem a leucin v pozici + 104 je substituovaný kyselinou glutamovou. Alternativně, L104ES25RIg může mít CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující dvě bodové mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104ET3OGIg a L104ET3ONIg, kde je leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou a threonin v pozici +30 je substituovaný glycinem a asparaginem, v příslušném pořadí.
Mutantní molekuly se dvěma bodovými mutacemi dále obsahují CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinu glutamin v pozici +125, a imunoglobulinou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem, a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně, tyto mutantní molekuly mohou mít CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Vynález poskytuje solubilní CTLA4 mutantní molekuly obsahující tři mutace v extracelulární doméně CTLA4, jako je L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg, L104EA29YS25RIg, ve kterých je ·· ···· • « • · · » •A · · · ♦ leucin v pozici +104 substituovaný kyselinou glutamovou, alanin v pozici +29 je změněn na tyrosin a serin v pozici +25 je změněn na lysin, asparagin a arginin, v příslušném pořadí. Mutantní molekuly se třemi mutacemi dále obsahují CTLA4 části tvořené methioninem v pozici +1 až kyselinou asparagovou v pozici +124, spojovací aminokyselinový zbytek glutamin v pozici +125, a imunoglobulínovou část tvořenou kyselinou glutamovou v pozici +126 až lysinem v pozici +357. Imunoglobulinová část mutantní molekuly může být také mutovaná tak, že cysteiny v pozicích +130, +136 a +139 jsou substituované serinem a prolin v pozici +148 je substituovaný serinem. Alternativně mohou tyto mutantní molekuly mít CTLA4 část tvořenou alaninem v pozici -1 až kyselinou asparagovou v pozici +124.
Dalšími provedeními solubilní CTLA4 mutantní molekuly jsou chimérické CTLA4/CD28 homolog mutantní molekuly, které se váží na B7 (Peach, R. J. , et al., 1994 J Exp Med 180:2049-2058). Příklady těchto chimérických CTLA4/CD28 mutantních molekul jsou HS1, HS2, HS3, HS4, HS5, HS6, HS4A, HS4B, HS7, HS8, HS9, HS10, HS11, HS12, HS13 a HS14 (U.S. patent č. 5773253).
Výhodnými provedeními předkládaného vynálezu jsou solubilní CTLA4 molekuly, jako je CTLA4Ig (jak je ukázán na Obr. 24, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +357) a solubilní CTLA4 mutant L104EA29YIg (jak je ukázán na Obr. 19, začínající methioninem v pozici +1 a končící lysinem v pozici +3 57) . Vynález dále poskytuje molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence odpovídající solubilní CTLA4 molekule podle předkládaného vynálezu. V jednom provedení je molekulou nukleové kyseliny DNA (např. cDNA) nebo její hybrid. DNA kódující CTLA4Ig (Obr. 24) byla uložena 31.5.1991 v American Type Culture Collection (ATCC),
10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, pod ATCC ·· ··*· *
» · » · přírůstkovým č. ATCC 68629. DNA kódující L104EA29YIg (sekvence uvedená na Obr. 19) byla uložena 19.6.2000 v ATCC pod ATCC přírůstkovým č. PTA-2104. Alternativně je molekulou nukleové kyseliny RNA nebo její hybrid.
Dále vynález poskytuje vektor, který obsahuje nukleotídové sekvence podle předkládaného vynálezu. Příklady expresních vektorů jsou vektory pro savčí hostitelské buňky (např., BPV-l, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis),- pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVl (Life Technologies); pVPakc Vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovirové vektory (např., pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invítrogen) nebo jejich modifikované formy, adenovirové vektory; adeno-associované virové vektory, baculovirové vektory, kvasinkové vektory (např., pESC vektory (Stratagene)).
Vynález také poskytuje systémy vektor-hostitel. Systém vektor-hostitel obsahuje vektor podle předkládaného vynálezu ve vhodné hostitelské buňce. Příklady vhodných hostitelských buněk jsou, například, prokaryotické a eukaryotické buňky. V provádění předkládaného vynálezu jsou eukaryotické buňky také vhodnými buňkami. Příklady eukaryotických buněk jsou všechny živočišné buňky, primární nebo imortalízované, kvasinky (např.,
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, a Pichia pastoris) a rostlinné buňky. Myelomové, COS a CHO buňky jsou příklady živočišných buněk, které mohou být použity jako hostitelské buňky. Mezi konkrétní CHO buňky patří, například,
DG44 (Chasm. et la., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-On buněčná linie (Clontech), CHO označené jako ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshíre, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genová, IT), CHO klon B (GEIMG, Genová, IT), CHO-K1/SF označené ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK) • · ···· λ α · • · * · · 5 * · · · • ···· « ·· · ♦ « · • · 9·· ·····♦ * · a RR-CHOKI označené ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire,
UK). Příklady rostlinných buněk jsou buňky tabáku (celých rostlin, kultury nebo kalu), kukuřice, sóji a rýze. Také přijatelné jsou buňky semen kukuřice, sóji a rýže.
CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být izolované jako přirozené polypeptidy, nebo z jakéhokoliv jiného zdroje, ať. přírodního, syntetického, semi-syntetického nebo rekombinantního. Tak mohou být CTLA4 mutantní polypeptidové molekuly izolovány jako přirozené proteiny z jakéhokoliv druhu, zejména od savců, konkrétně od skotu, ovcí, prasat, myší, koní a nejlépe od člověka. Alternativně mohou být CTLA4 mutantní polypeptidové molekuly izolovány jako rekombinantní polypeptidy, které jsou exprimovány v prokaryotícké nebo eukaryotické hostitelské buňce, nebo které jsou izolovány jako chemicky syntetizovaný polypeptid.
Odborník v oboru snadno použije standardní způsoby izolace pro získání izolovaných CTLA4 mutantních molekul. Charakter a stupeň izolováni bude záviset na zdroji a zamýšleném použití izolované molekuly.
CTLA4 mutantní molekuly a jejich fragmenty nebo deriváty mohou být připraveny rekombinantními způsoby. Tak mohou být izolované nukleotidové sekvence kódující přirozené CTLA4 molekuly upraveny tak, aby obsahovaly mutace, které vedou k zisku nukleotidových sekvencí, které kódují CTLA4 mutantní polypeptidové molekuly. Například mohou být nukleotidové sekvence kódující CTLA4 mutantní molekuly připraveny způsoby místně cílené mutagenese, za použití primerů a PCR amplifikace. Primery mohou obsahovat specifické sekvence navržené tak, aby vkládaly do sekvence požadované mutace. Alternativně mohou být primery navrženy tak, aby obsahovaly randomizované nebo semi-randomizované sekvence pro vkládání • · · « • « • · » · • · * · náhodných mutací. Standardní rekombinantní způsoby (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2 vydání, Sambrook, Fritch, a Maniatís 1989, Cold Spring Harbor Press) a PCR technologie (U. S. Patent č. 4603102) mohou být použity pro přípravu a izolování CTLA4 mutantních polynukleotidů kódujících CTLA4 mutantní polypeptidy.
Vynález dále zahrnuje farmaceutické prostředky pro použití v léčbě onemocnění imunitního systému obsahující farmaceuticky účinné množství solubilní CTLA4 molekuly. V některých provedeních jsou onemocnění imunitního systému zprostředkované CD28/CTLA4/B7 interakcemi. Solubilní CTLA4 molekuly jsou výhodně solubilní CTLA4 molekuly s přirozenou sekvencí a/nebo solubilní CTLA4 molekuly mající jednu nebo více mutací v extracelulámí doméně CTLA4. Farmaceutické prostředky mohou obsahovat solubilní CTLA4 proteinové molekuly a/nebo molekuly nukleové kyseliny, a/nebo vektory kódující molekuly. Ve výhodných provedeních mají solubilní CTLA4 molekuly aminokyselinovou sekvenci extracelulámí domény CTLA4, jak je ukázána na Obr. 24 nebo 19 (CTLA4Ig nebo L104EA29Y, v příslušném pořadí). Ještě lépe je solubilní CTLA4 mutantní molekulou L104EA29YIg, jak je zde popsána. Prostředky mohou dále obsahovat jiná terapeutická činidla, včetně toxínů, enzymů, protilátek nebo konjugátů.
Jak je standardní praxi v oboru, jsou poskytnuty farmaceutické prostředky obsahující molekuly podle předkládaného vynálezu smísené s přijatelným nosičem nebo adjuvans, která jsou známá odborníkům v oboru. Farmaceutické prostředky výhodně obsahují vhodné nosiče a adjuvans, které mohou obsahovat jakýkoliv materiál, který si při kombinování s molekulou podle předkládaného vynálezu (např., solubilní CTLA4 molekulou, jako je, CTLA4Ig nebo L104EA29Y) zachovává aktivitu molekuly a je nereaktivní s imunitním systémem jedince. Mezi takové nosiče a adjuvans patří, • * • · · · · ♦ · · » t • · · · · · · · · · · · * · · ♦ · ····»· · · například, iontoměniče, kamenec, aluminum-stearát, lecitin, sérové proteiny, jako je lidský sérový albumin, pufrovací substance, jako jsou fosfáty, glycin, kyselina sorbová, kalíum-sorbát, parciální glyceridové směsi nasycených rostlinných mastných kyselin, fosfátem pufrované salinické roztoky, voda, emulze (např. emulze olej/voda), soli nebo elektrolyty, jako je protamin-sulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidní oxid křemičitý, křemičitan hořečnatý, polyvinylpyrrolidon, substance na bázi celulosy a polyethylenglykol. Mezi další nosiče patří sterilní roztoky; tablety, včetně potahovaných tablet a kapsli. Typicky takové nosiče obsahují přísady, jako je škrob, mléko, cukr (např. sacharosa, glukosa, maltosa}, některé typy hlinek, želatina, kyselina stearová nebo její soli, magnesium- nebo kalciumstearát, talek, rostlinné tuky nebo oleje, klovatiny, glykoly, nebo jiné známé přísady. Mezi takové nosiče patří též chučová korigens a barviva a jiné přísady. Prostředky obsahující takové nosiče jsou připraveny běžnými způsoby. Takové prostředky mohou být také formulovány s různými lípídovými přípravky, jako jsou, například, liposomy, stejně jako s různými polymerními prostředky, jako jsou polymerické mikrosféry.
Způsoby
Vynález poskytuje způsoby pro regulování funkčních interakcí CTLA4- a CD28- pozitivních buněk s B7-pozitivními buňkami. Způsoby zahrnují kontaktování B7-pozitivních buněk se solubilní CTLA4 molekulou podle předkládaného vynálezu tak, že je tvořen komplex solubilní CTLA4/B7, komplex interferující s reakcí endogenní CTLA4 a/nebo CD28 molekuly s B7 molekulou.
Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro inhibování funkce T-lymfocytů bez deplece T-lymfocytů u člověka tak, že • · · · · · · · · « · • · ··· ······ · umožňuje kontaktování B7-pozitivních buněk u člověka s solubilní CTLA4. Příklady solubilní CTLA4 jsou CTLA4Ig a solubilní CTLA4 mutantní molekula, např. L104EA29YIg. Předkládaný vynález dále poskytuje způsoby pro léčbu onemocnění imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění. Způsoby zahrnují podání terapeutické kompozice obsahující solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu jedinci v množství účinném pro zmírnění alespoň jednoho příznaku asociovaného s onemocněním imunitního systému. Dále vynález poskytuje dlouhodobou terapií onemocnění imunitního systému, při které jsou blokovány interakce
T-lymfocytů/B7-pozitivních buněk, čímž se blokuje stimulace T-lymfocytů ko-stimulačními signály, jako je vazba B7 na CD28, což vede k indukci anergie nebo tolerance T-lymfocytů. Mezi onemocnění imunitního systému patří například autoimunitní onemocnění, onemocnění souvisejících s transplantáty a imunoproliterativních onemocnění. Příklady onemocnění imunitního systému j sou reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) (např. při transplantaci kostní dřeně nebo při indukci tolerance), imunologické poruchy asociované a odmítnutím transplantátu, chronické rejekce, tkáňové nebo buněčné allo- nebo xenotransplantáty, včetně orgánových, kožních, ostrůvků pankreatu, svalů, hepatocytů a neuronů. Příklady imunoproliferativních onemocnění jsou, například, psoriasa, T-lymfocytární lymfom, T-lymfocytámí akutní lymfoblastická leukemie, testikulární angiocentrický T-lymfocytární lymfom, benigní lymfocytární angiitis, lupus {např. lupus erythematosus, lupusová nefritis), Hashimotova thyroiditis, primární myxedem, Gravesova nemocí, perniciosní anemie, autoimunní atrofická gastritis, Addisonova nemoc, diabetes (např. insulin dependentní diabetes mellitus, diabetes mellitus typu I, diabetes mellitus typu II), Goodpasteurův syndrom, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnova nemoc, sympathetická ophthalmia, autoimunní uveitis, roztroušená sklerosa, autoimunní hemolytická anemie, idiopatická trombocytopenie, primární biliární cirhosa, chronická hepatitis, • · • · · · ·· · · · · ·· « · » ··»» · · · • ···· · « · · · · · • · «·· ····*· · « ··* ···* ’· ··* *··**·'* ulcerosní colitis, Sjogrenův syndrome, revmatická onemocnění (např. revmatoidní artritis), polymyositís, sclerodermie a smíšené onemocnění pojivové tkáně.
Solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu vykazují inhibiční vlastností in vivo. Za podmínek, kdy se vyskytují interakce T-lymfocytů/B7-pozitivních buněk, například interakce T-lymfocyty/B buňky, které se vyskytují v důsledku kontaktu mezi T-lymfocyty a B7-pozitivními buňkami, může vazba podané CTLA4 molekuly s B7-pozitivními buňkami, například B lymfocyty, interferovat, t.j., inhibovat, interakce T-lymfocyty/B7-pozitivní buňky, což vede k regulaci imunitní reakce.
Vynález poskytuje způsoby pro inhibici imunitní reakce.
Inhibice imunitní reakce solubilní CTLA4 molekulou podle předkládaného vynálezu může být cestou pro inhibování nebo blokování již probíhající imunitní reakce nebo může bránit rozvoji imunitní reakce. Solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu mohou inhibovat funkce aktivovaných T-lymfocytů, jako je proliferace T lymfocytů a sekrece cytokinů, tím, že potlačují reakce T-lymfocytů nebo indukují specifickou toleranci u T-lymfocytů, nebo oběma cestami. Dále, solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, interferující s CTLA4/CD28/B7 dráhou, mohou inhibovat proliferaci T-lymfocytů a/nebo sekreci cytokinů, a to vede ke snížení destrukce tkáně a indukci nízké reaktivity nebo anergie T-lymfocytů.
Výhodným provedením předkládaného vynálezu je použití solubilní CTLA4 mutantní molekuly L104EA29YIg pro regulaci funkčních interakcí CTLA4- a CD28- pozitivních buněk s B7-pozitivními buňkami za účelem léčby onemocnění imunitního systému, jako jsou revmatická onemocnění a/nebo pro inhibici imunitních reakcí. L104EA29YIg podle předkládaného vynálezu je solubilní CTLA4 *·.·...· ·..* ..· ·..·*..· mutantní molekula obsahující alespoň dvě aminokyselinové změny, leucin (L) na kyselinu glutamovou (E) v pozici + 104 a alanin (A) na tyrosin (Y) v pozici +29. L104EA29Ylg molekula může kromě těchto dvou mutací obsahovat i další mutace.
Výhodnými provedeními jsou způsoby pro léčbu revmatického onemocnění, jako je revmatoidní artritis, pomocí podání účinného množství solubilní CTLA4 molekuly jedinci. Podání účinného množství terapeutická kompozice zmírní u jedince alespoň jeden z příznaků asociovaný s onemocněním, včetně redukce: otoku kloubů, citlivost kloubů, zánětu, ranní ztuhlosti, bolesti a strukturálního postižení snižujícího fyzické schopnosti. Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro zmírnění alespoň jednoho z příznaků spojeného s revmatoidní artritis, včetně snížení sedimentace erytrocytů, sérové koncentrace C-reaktivního proteinu, solubilniho ICAM-1, solubilního E-selektinu a/nebo solubilního IL-2r.
Úroveň zmírnění příznaků dosažené pomocí předkládaného vynálezu může být měřena za použití jakýchkoliv akceptovatelných kriterií používaných pro měření a dokumentování zlepšení příznaků v klinické praxi. Přijatelnými kriterii pro měření úlevy příznaků jsou skoré na bázi kriterií daných American College of
Rheumatology (např., ACR 20), pro měření zmírnění příznaků (v: CDER Guideline for Clinical Evaluation of Anti-Inflammatory a Antirheumatic Drugs-FDA 1988), a Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries, I. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 5: 789-793). Pro obecný popis těchto kriterií viz Guidance for Industry: Clinical Development Programe for Drugs, Devices, a Biological products for Treatment of Rheumatoid arthritis (RA), February 1999 .
Mezi jedince léčené způsoby podle předkládaného vynálezu patří savci, včetně lidí, opic, lidoopů, psů, koček, koní, králíků, myší • · · · • fc a krys.
Předkládaný vynález poskytuje různé způsoby, lokální nebo systémové, pro podání solubilní CTLA4 molekuly. Způsoby zahrnují intravenosní, intramuskulární, intraperitoneální, orální, inhalační a podkožní způsoby podání, stejně jako použití implantovatelných pump, kontinuálních infúzní, genové terapie, liposomů, čípků, lokálního kontaktu, vesikulí, kapslí a injekcí. Terapeutické činidlo, připravené s nosičem, je často lyofilizováno pro skladování a je rekonstituováno vodou nebo pufrovaným roztokem, s neutrálním pH (pH přibližně 7-8, např., pH 7,5) před podáním.
Jak je v oboru standardní praxí, jsou prostředky podle předkládaného vynálezu podávány jedinci v jakékoliv farmaceuticky přijatelné formě.
Podle předkládaného vynálezu způsoby zahrnují podání solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu jedinci pro regulaci interakcí CD28- a/nebo CTLA4-pozitivních buněk s B7-pozitivními buňkami. B7-pozitivní buňky jsou kontaktovány s účinným množstvím solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, nebo jejími fragmenty nebo deriváty, takže dojde ke tvorbě komplexů solubilní CTLA4/B7. Komplexy interferují s interakcemi mezi endogenní CTLA4 a CD28 molekulou a B7 rodinou molekul.
Solubilní CTLA4 molekuly mohou být podávány jedinci v množství a po dobu (např. po dobu a/nebo opakovaně) dostatečnou pro blokování vazby endogenní B7 molekuly na její ligandy u jedince. Blokáda vazby endogenní B7/ligand inhibuje interakce mezi B7-pozitivními buňkami a CD28-a/nebo CTLA4-pozitivními buňkami.
Dávka terapeutického činidla je závislá na mnoha faktorech,
• včetně typu postižené tkáně, typu léčeného autoimunitního onemocnění, závažnosti onemocnění, a reakce jedince na léčbu činidlem. Dávky činidla jsou tedy různé u každého jedince a způsobu podání. Solubilní CTLA4 molekuly mohou být podány v dávce mezi 0,1 a 20,0 mg/kg hmotnosti a den, lépe mezi 0,5 a 10,0 mg/kg/den.
Vynález také zahrnuje použití prostředků podle předkládaného vynálezu společně s jinými farmaceutickými činidly pro léčbu onemocnění imunitního systému. Například, revmatická onemocnění mohou být léčena molekulami podle předkládaného vynálezu společně s, například, imunosupresivy, jako jsou kortikosteroidy, cyklosporin (Mathiesen, 1989, Cancer Lett. 44(2):151-155), prednison, azathioprin, methotrexat (R. Handschumacher, v: Drugs Ušed for Imunosuppression str. 1264-1276), TNF-alfa blokátory nebo antagonisty (New England Journal of Médičine, vol. 340: 253-259, 1999; Lancet vol. 354: 1932-39, 1999, Annals of Internal Medicine, vol. 130: 478-486), nebo jakákoliv jiná biologická činidla ovlivňující jakýkoliv zánětlivý cytokin, nesteroidní antirevmatika/Cox-2 inhibitory, hydroxychlorochin, sulfasalazoprym, soli zlata, etanercept, infliximab, rapamycin, mykofenolatmofetil, azathioprin, tacrolísmus, basiliximab, cytoxan, interferon beta-la, interferon beta-lb, glatiramer acetát, mitoxantron hydrochlorid, anakinra a/nebo jiná biologická činidla.
Solubilní CTLA4 molekuly (výhodně L104EA29YIg) mohou být také použita v kombinaci s jedním nebo více následujícími činidly pro regulaci imunitní reakce. Mezi taková činidla patří: solubilní gp39 (též známý jako CD4O ligand (CD4OL), CD154, T-BAM, TRAP), solubilní CD29, solubilní CD4O, solubilní CD8O (např. ATCC 68627), solubilní CD56, solubilní CD28 (např. 68628), solubilní CD56, solubilní Thy-1, solubilní CD3, solubilní TCR, solubilní
VLA-4, solubilní VCAM-1, solubilní LECAM-1, solubilní ELAM-1, solubilní CD44, protilátky reaktivní s gp39 (např. ATCC HB-10916, ATCC HB-12055 a ATCC HB-12056), protilátky reaktivní s CD40 (např. ATCC HB-9110), protilátky reaktivní s B7 (např. ATCC HB-253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB11341, etc), protilátky reaktivní s CD28 (např. ATCC HB-11944 nebo mAb 9.3, jak je popsána v Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1):18-22, 1980), protilátky reaktivní s LFA-1 (např. ATCC HB-9579 a ATCC HB-213), protilátky reaktivní s LFA-2, protilátky reaktivní s IL-2, protilátky reaktivní s IL-12, protilátky reaktivní s IFN-gamma, protilátky reaktivní s CD2, protilátky reaktivní s CD48, protilátky reaktivní s jakoukoliv ICAM (např., ICAM-1 (ATCC CRL-2252), ICAM-2 a ICAM-3), protilátky reaktivní s CTLA4 (např. ATCC HB-304),, protilátky reaktivní s Thy-1, protilátky reaktivní s CD56, protilátky reaktivní s CD3, protilátky reaktivní s CD29, protilátky reaktivní s TCR, protilátky reaktivní s VLA-4, protilátky reaktivní s VCAM-1, protilátky reaktivní s LECAM- 1, protilátky reaktivní s ELAM-1, protilátky reaktivní s CD44.
V některých provedeních jsou výhodné monoklonální protilátky.
V jiných provedeních jsou výhodné protilátkové fragmenty. Jak bude odborníkům v oboru jasné, může kombinace obsahovat solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu a jedno další imunosupresivní činidlo, solubilní CTLA4 molekuly s dvěma dalšími imunosupresivními činidly, solubilní CTLA4 molekuly třemi dalšími imunosupresivními činidly atd. Určení optimální kombinace a dávky může být provedeno za použití optimalizačních způsobů dobře známých v oboru.
Mezi některé konkrétní kombinace patří následující:
L104EA29YIg a CD8O monoklonální protilátka (mAbs); L104EA29YIg a CD86 mAbs; L104EA29YIg, CD8O mAbs a CD86 mAbs; L104EA29YIg a gp39 mAbs; L104EA29YIg a CD40 mAbs; L104EA29YIg a CD28 mAbs; L104EA29YIg, CD8O a CD86 mAbs, a gp39 mAbs; L104EA29YIg, CD8O « · · · · · • · · Μ · a CD86 mAbs a CD40 mAbs; a L104EA29YIg, anti-LFAl mAb, a anti-gp39 mAb. Konkrétním příkladem gp39 mAb je MR1. Jiné kombinace budou zřejmé odborníkům v oboru.
Solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, například L104EA29YIg, mohou být podány jako jediná aktivní složka nebo dohromady s dalšími léky v ímunomodulačních režimech nebo s jinými protizánětlivými činidly, např. pro léčbu nebo prevenci akutní nebo chronické rejekce allo- nebo xenotransplantátu, nebo zánětlivých nebo autoimunitních onemocnění, nebo pro indukci tolerance. Například mohou být tyto molekuly použity v kombinaci s kalcineurinovým inhibitorem, např. cyklosporinem A nebo FK506; imunosupresivníra makrolidem, např. rapamycinem nebo jeho derivátem, např. 40-0-(2-hydroxy)ethyl-rapamycinem, činidlem způsobujícím homing lymfocytů, např. FTY72O nebo jeho analogem, kortikosteroidy; cyklofosfamidem; azathioprenem; methotrexatem; leflunomidem nebo jeho analogem; mizoribinem; kyselinou mykofenolovou; mykofenolát-mofetilem; 15-deoxyspergualinem nebo jeho analogem; imunosupresivní monoklonální protilátkou, např., monoklonální protilátkou k leukocytárním receptorům, např., MHC, CD2, CD3, CD4, CDlla/CDI8, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), 0X40, 4-IBB nebo jejich ligandy; nebo jinými imunomodulačními sloučeninami, např. CTLA4/CD28-Ig, nebo jinými inhibitory adhesních molekul, např. mAb nebo inhibitory s nízkou molekulovou hmotností, včetně LFA-1 antagonistů, antagonistů selektinu a VLA-4 antagonistů. Sloučeniny jsou zejména použitelné v kombinaci se sloučeninami, které interferují s CD4O a jeho ligandy, jako jsou např. protilátky k CD40 a protilátky k CD40-L.
Když jsou solubilní CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu podávány společně s jinými imunosupresivními/imunomodulačními nebo protizánětlivými léky, jak • · bylo např. uvedeno výše, tak jsou dávky současně podávaných imunosupresivních, imunomodulačních nebo protizánětlivých molekul různé podle typu použitého léku, například podle toho, zda se jedná o steroid nebo cyklosporin, podle konkrétního použitého léku, podle léčeného onemocnění a tak dále.
Proto v dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje v ještě dalším aspektu způsoby definované výše zahrnující současné podání, například konkomitantní nebo sekvenční, terapeuticky účinného množství solubilní CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu, např. CTLA4Ig a/nebo L104EA29YIg, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, a druhého léčiva, kde uvedené druhé léčivo je imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo, jak bylo uvedeno výše. Dále vynález poskytuje terapeutické kombinace, např. kity, např. pro použití v jakémkoliv způsobu definovaném výše, obsahující solubilní CTLA4 molekulu, ve volné formě nebo ve formě farmaceuticky přijatelné soli, která má být použita současně nebo sekvenčně s alespoň jednou farmaceutickou kompozicí obsahující imunosupresivní, imunomodulační nebo protizánětlivé léčivo. Kit může obsahovat návod pro podání.
Vynález také poskytuje způsoby pro přípravu solubilní CTLA4 mutantní molekuly podle předkládaného vynálezu. Exprese solubilní CTLA4 mutantní molekuly může být provedena v prokaryotické buňce nebo eukaryotické buňce.
Prokaryota jsou nej častěji reprezentována různými kmeny bakterií. Bakteria mohou být gram-pozitivní nebo gram- negativní. Obvykle jsou výhodné gram-negativní bakterie, jako je E. coli. Mohou být použity také jiné mikrobiální kmeny. Sekvence kódující solubilní CTLA4 mutantní molekuly mohou být insertovány do vektoru navrženého pro exprimování cizorodých sekvencí v prokaryotických buňkách, jako je E. coli. Tyto vektory mohou obsahovat běžně • · · · · · • · * · • · · · · · • · · · · • · používané prokaryotické kontrolní sekvence, které obsahují promotory pro iniciaci transkripce, volitelně s operátorem, společně s ribosomálními vazebnými sekvencemi, včetně běžně používaných promotorů, jako je beta-laktamasový (penicillinasový) a laktosový (lac) promotorovy systém (Chang, et al., (1977) Nátuře
198:1056), tryptofanový (trp) promotorovy systém (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) a PL promotor a N-genové ribosomální vazebné místo z lambda promotoru (Shimatake, et al., (1981) Nátuře 292:128).
Takové expresní vektory také obsahují sekvence rozpoznávající počátek replikace a selektovatelné markéry, jako je beta-laktamasový nebo neomycin-fosfotransferasový gen udělující resistenci na antibiotika, takže se vektory mohou replikovat v bakteriích buňky nesoucí plasmidy mohou být selektovány při kultivaci za přítomnosti antibiotik, jako je ampicilin nebo kanamycin.
Expresní plasmid může být vložen do prokaryotických buněk různými způsoby, včetně CaC12-šoku (Cohen, (1972) Proč. Nati.
Acad. Sci. USA 69:2110, a Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Press, (1989)) a elektroporace.
Při provádění předkládaného vynálezu jsou eukaryotické buňky také vhodnými hostitelskými buňkami. Příklady eukaryotických buněk jsou živočišné buňky, aú primární, nebo imortalízované, kvasinky (např., Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, a Pichia pastořis), a rostlinné buňky. Myelomové, COS a CHO buňky jsou příklady živočišných buněk, které mohou být použity jako hostitelské buňky. Mezi konkrétní CHO buňky patří, například,
DG44 (Chasm, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909), CHO-K1 (ATCC č.
• · ··· ·····» · • ···· · · · · · · β • · · · · ··«··· · ·
- - ·· ··· ·· ·· ··*··*
CCL-61), CH0-K1 Tet-On buněčná linie (Clontech), CHO označená ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO klon 13 (GEIMG, Genová, IT), CHO klon B (GEIMG, Genová, IT), CHO-K1/SF označená ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), a RR-CHOK1 označená ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire,
UK). Příklady rostlinných buněk jsou buňky tabáku (celých rostlin, kultury nebo kalu), kukuřice, sóji a rýže. Také přijatelné jsou buňky semen kukuřice, sóji a rýže.
Sekvence nukleové kyseliny kódující CTLA4 mutantní molekuly mohou být také insertovány do vektoru navrženého pro expresi cizorodých sekvencí v eukaryotickém hostiteli. Regulační elementy vektoru mohou být různé podle konkrétního eukaryotického hostitele.
Mezi běžně používané eukaryotické kontrolní sekvence pro použití v expresních vektorech patří promotory a kontrolní sekvence kompatibilní se savčími buňkami, jako je, například, CMV promotor (CDM8 vektor) a virus ptačího sarkomu (ASV) (píLN vektor). Mezi další běžně používané promotory patří časný a pozdní promotor Opičího Viru 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nátuře
273:1 13), nebo jiné virové promotory, jako jsou promotory odvozeny od polyomaviru, adenoviru 2 a hovězí papilloma virus.
Také může být použit indukovatelný promotor, jako je hMTII (Karin, et al., (1982) Nátuře 299:797-802).
Vektory pro expresi CTLA4 mutantní molekuly v eukaryotech mohou také obsahovat sekvence označované jako zesilovače transkripce. Tyto sekvence jsou důležité pro optimalizaci genové exprese a vyskytují se buď před, nebo za promotorem.
Příklady expresních vektorů pro eukaryotické hostitelské buňky jsou, například, vektory savčí hostitelské buňky (např., BPV-1, • · · · · · «· ·· • · · ···· · • · · · · « ·· · · • · ··· *····· pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFVI (Life Technologies); pVPakc vektory, pCMV vektory, pSG5 vektory (Stratagene)), retrovirové vektory (např., pFB vektory (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen) nebo jejich modifikované formy, adenovirové vektory; adeno-asociované virové vektory, baculovirové vektory, kvasinkové vektory (např., pESC vektory (Stratagene)).
Sekvence nukleové kyseliny kódující CTLA4 mutantní molekuly se mohou integrovat do genomu eukaryotické hostitelské buňky a mohou se replikovat s replikací genomu hostitelské buňky. Alternativně mohou vektory nesoucí CTLA4 mutantní molekuly obsahovat sekvence rozpoznávající počátek replikace umožňující extrachromosomální replikaci.
Pro expresi sekvencí nukleové kyseliny v Saccharomyces cerevisiae může být použita sekvence rozpoznávající počátek replikace z endogenního kvasinkového plasmidu, 2u circle. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Alternativně mohou být použity sekvence z kvasinkového genomu schopné vyvolat autonomní replikaci (viz, například, Stinchcomb et al.. (1979) Nátuře 282:391; Tschemper et al., (1980) Gene 10:157; a Clarke et al., (1983)
Meth. Enz. 101:300).
Transkripční kontrolní sekvence pro kvasinkové vektory jsou, například, promotory pro syntetizování glykolytických enzymů (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland et al., (1978)
Biochemistry 17:4900). Mezi další promotory známé v oboru patří CMV promotor poskytnutý v CDM8 vektoru (Toyama a Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); promotor pro 3-fosfoglycerát-kinasu (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073) a promotory pro jiné glykolytické enzymy.
4 · 4 · · ·· 4 4 4 4 4 4 4 4
4·· 4444 44 4 • 4444 · · · 4 4 4 *
4 444 444444 4 4
4-4 44 44
Jiné promotory jsou indukovatelné, protože mohou být regulovány stimuly z prostředí nebo růstovým mediem. Mezi tyto indukovatelné promotory patří promotory z genů pro proteiny tepelného šoku, alkohol-dehydrogenasu 2, isocytochrom C, kyselou fosfatasu, enzymy asociované s katabolismem dusíku a enzymy odpovědné za využití maltosy a galaktosy.
Regulační sekvence mohou být také umístěny na 31 konec kódujících sekvencí. Tyto sekvence mohou stabilizovat mRNA. Takové terminátory se vyskytují v 3' netranslatovaném regionu po kódujících sekvencích v několika savčích a kvasinkových genech.
Mezi vektory vhodné pro rostliny a rostlinné buňky patří, například, Agrobacteriové T-plasmidy, virus květákové mozaiky (CaMV) a virus zlaté mozaiky rajčat (TGMV).
Obecné aspekty transformace savčích hostitelských buněk jsou popsány v Axel (U.S. Patent č. 4399216, udělený 16.8.1983). Savčí buňky mohou být transformovány například transfekci za přítomnosti fosforečnanu vápenatého, mikroinjekcí, elektroporací nebo via transdukcí virovými vektory.
Způsoby pro vkládání cizorodých DNA sekvencí do rostlinných a kvasinkových genomů zahrnují (1) mechanické způsoby, jako je mikroinjekce DNA do jedné buňky nebo protoplastů, vortexování buněk se skleněnými korálky za přítomnosti DNA, nebo vstřelování DNA-potažené na wolframová nebo zlatá zrna do buněk nebo protoplastů; (2) vkládání DNA pomocí zvýšení propustnosti buněčné membrány pro makromolekuly za použití zpracování polyethylenglykolera nebo pomocí elektrických pulsů s vysokým napětím (elektroporace); nebo (3) použití liposomů (obsahujících cDNA), které fúzují s buněčnými membránami.
Po exprimování CTLA4 mutantních molekul podle předkládaného vynálezu mohou být tyto molekuly získány způsoby dobře známými v oboru, jako je lyžování buněk {např. soníkací, lysozymem a/nebo detergenty) a protein se potom získá za použití standardních způsobů pro přečištění proteinů, např. afinitní chromatografií nebo iontoměničovou chromatografií, za zisku významně přečištěného produktu (R. Scopes v: Protein Purification, Principles a Practice, 3. vydání, Springer-Verlag (1994); Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Exprese CTLA4 mutantní molekuly může být detekována způsoby známými v oboru. Například, mutantní molekuly mohou být detekovány pomocí Coomassie barvených SDS-PAGE gelů a imunoblottingu za použití protilátek, které se váží na CTLA4.
Následující příklady jsou uvedeny pro dokreslení předkládaného vynálezu a aby napomohly odborníkům v oboru při provádění předkládaného vynálezu. Příklady nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Tento příklad poskytuje popis způsobů použitých pro přípravu nukleotidových sekvencí kódujících CTLA4 molekuly podle předkládaného vynálezu.
Nejprve se připraví CTLA4Ig kódující plasmid a ověří se, že exprimuje CTLA41g molekuly, jak je popsáno v U.S. Patentech č. 5434131, 5885579 a 5851795. Potom se mutantní molekuly obsahující jednu mutaci (např., L104EIg) připraví z CTLA4Ig kódující sekvence, exprimuji se a testují se na vazebné kinetiky pro různé • ♦ · · • ·
B7 molekuly. L104EIg nukleotidová sekvence (jak je uvedena na obr. 18) se použije jako templát pro generování CTLA4 mutantních sekvencí s dvěma mutacemi (jak jsou uvedené na Obr. 19-22), které se exprimují jako proteiny a testují se na kinetiky vazby. Mezi CTLA4 mutantní sekvence se dvěma mutacemi patří: L104EA29YJg, L104EA29LIg. L104EA29TIg, a L104EA29WIg. Také se připraví mutanti s třemi mutacemi.
Konstrukce CTLA4Ig
Genetický konstrukt kódující CTLA4Ig obsahující extracelulární doménu CTLA4 a IgCgammal doménu se připraví způsobem popsaným v U.S. Patentech 5434131, 5844095 a 5851795, jejichž obsahy jsou zde uvedeny jako odkazy. Gen pro extracelulární doménu CTLA4 se klonuje PCR za použití syntetických oligonukleotidů odpovídajících publikované sekvenci (Dariavach et al., Eur. Journ. Immunol. 18:1901-1905 (1988)) .
Protože signální peptid pro CTLA4 nebyl v CTLA4 genu identifikován, je N-konec předpokládané sekvence CTLA4 fúzován na signální peptid oncostatinu M (Malík et al., Mol. a Cell. Biol. 9:2847 (1989)) ve dvou krocích za použití přesahujících oligonukleotidů. Pro první krok se oligonukleotid
CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCG AGCATGGCAATGCCGTGGCCCAGCC (který kóduje C terminálních 15 aminokyselin ze signálního peptidu onkostatinu M fúzovaných na N-terminálních 7 aminokyselin CTLA4) použije jako kódující primer, a TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG (kódující aminokyselinové zbytky 119-125 aminokyselinové sekvence CTLA.4 receptoru a obsahující Bcl-1 restrikční místo) se použije jako reverzní primer. Templátem pro tento krok je cDNA syntetizovaná z 1 ug celkové RNA z H38 buněk (HTLV II infikovaná buněčná linie T-lymfocytární leukemie získaná od Dr. Salahudin a Gallo, NCI, Bethesda, MD). Část PCR produktu z prvního stupně se • · • · · · • · · · · ♦ · · · • ···· · « · · · · • · · · · ······ · reamplifikuje za použití překrývajícího se kódujícího primeru kódujícího N terminální část signálního peptidu onkostatinu M a obsahující Hind III restrikční místo,
CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGTCAGTCTGGTCCTT GCACTC a stejného reverzního primeru. Produkt PCR reakce se tráví Hind III a Bel I a liguje se s Bel I/Nba I štěpeným cDNA fragmentem kódujícím aminokyselinové sekvence odpovídající pantovému, CH2 a CH3 regionu IgC(gamma)l do Hind III/Nba I štěpeného expresního vektoru. CDM8 nebo Hind III/Nba I štěpeného expresního vektoru piLN (který je těž známý jako píLN).
DNA kódující aminokyselinový sekvence odpovídající CTLA4Ig byla uložena v ATCC podle Budapešřské smlouvy 31.5.1991 pod ATCC přírůstkovým č. 68629.
CTLA4Ig mutagenese na bázi kodonů:
Mutagenní a skríningová strategie byla vyvinuta pro identifikaci mutantní CTLA4Ig molekuly, která má pomalejší disociaci (off rychlost) z CD8O a/nebo CD86 molekuly, t.j. má lepší vazebnou schopnost. V tomto provedení byly mutace provedeny v a/nebo přibližně v zbytcích v CDR-1, CDR-2 (též známém jako C' řetězec) a/nebo CDR-3 regionu extracelulární domény CTLA4 (jak je popsáno v U.S. Patentech 6090914, 5773253 a 5844095; v související U.S. Patentové přihlášce pořadové č. 60/214065; a v Peach, R.J., et al., J Exp Med 1994 180:2049-2058. CDR-like region zahrnuje každý CDR region a je delší o několik aminokyselin před a/nebo za CDR motivem). Tato místa byla vybrána podle pokusů na chimérických CD28/CTLA4 fuzních proteinech (Peach et al., J. Exp. Med., 1994, 180:2049-2058), a podle modelování určujícího, které vedlejší řetězce aminokyselin budou vystaveny působení rozpouštědla, a podle chybění identity nebo homologie některých aminokyselinových zbytků v některých pozicích mezi CD28 a CTLA4.
• · ···«·· ·· *·· · · · · · ’ · • ···· · · · · · « • · · · · ······ · • · ··♦ · · · · · ·
Dále, jakýkoliv zbytek, který je v těsné blízkosti (5-20
Angstromů) k identifikovaným zbytkům je považován za součást předkládaného vynálezu.
Pro syntetizování a testování solubilní CTLA4 mutantní molekuly s pozměněnou afinitou k B7 molekule (např. CD80, CD56), se použila dvoustupňová strategie. Pokusy zahrnovaly nejprve generování knihovny mutací ve specifickém kodonu extracelulární části CTLA4 a potom testování těchto knihoven za použití BlAcore analýzy pro identifikaci mutantů s pozměněnou reaktivitou k B7. Biacore testovací systém {Pharmacia, Piscataway, N.J.) využívá senzoru na bázi povrchové plasmonové rezonance, který využívá kovalentní vazby CD80Ig nebo CD86Ig na dextranem-potažený sensorový čip, který je umístěn v detektoru. Testovaná molekula může být potom injikována do komůrky obsahující sensorový čip a množství komplementárního proteinu, který se naváže, může být hodnoceno podle změny molekulové hmotnosti, která je fyzikálně asociovaná s dextranem potaženou stranou sensorového čipu; změna v molekulové hmotnosti může být měřena detektorovým systémem.
Konkrétně, připravily se mutantní nukleotídové sekvence obsahující jednu mutaci za použití nemutované (např., přirozené) DNA kódující CTLA4Ig (U.S. Patent Č.: 5434131, 5844095; 5851795; a 5885796; ATCC přírůstkové č. 68629) jako templátu. Mutagenní oligonukleotidvé PCR primery se navrhly pro náhodnou mutagenesi specifických kodonů tak, že se povolily jakékoliv baze v pozicích 1 a 2 kodonu, ale pouze guanin nebo thymin v pozici 3 (XXG/T nebo také psáno jako NNG/T). Tímto způsobem může být specifický kodon kódující aminokyselinu náhodně mutován tak, aby kodoval jakoukoliv ze 20 aminokyselin. Tak vede XXG/T mutagenese k zisku 32 potenciálních kodonů kódujících každou ze 20 aminokyselin. PCR produkty kódující mutace v těsné blízkosti CDR3-like smyčky CTLA4Ig (MYPPPY) se trávily Sacl/Xbal a subklonovaly se do podobně »· ···· ·« ·* It ···· ··* · * · · b · · ····· · « · · ·· · • · ··· ······ · · • · · · · · · · · · ·· »·· ·· ·· ·« ·· tráveného CTLA4Ig (jak je uvedeno na Obr. 24) rtLN expresního vektoru. Tento způsob se použil pro přípravu CTLA4 mutantní molekula obsahující jednu mutaci L104EIg (jak je uvedena na Obr. 18) .
Pro mutagenesi v blízkosti CDR-l-like smyčky CTLA4Ig se nejprve silentní Nhel restrikční místo vložilo 5’ do této smyčky, za použití PCR primerem řízené mutagenese. PCR produkty se trávily Nhel/Xbal a subklonovaly se do podobně trávených CTLA4Ig nebo L104EIg expresních vektorů. Tento způsob se použil pro generování CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg obsahující dvě mutace (jak je uvedeno na obr. 19). Konkrétně, nukleová kyselina kódující CTLA4 mutantní molekula s jednou mutací, L104EIg, se použila jako templát pro generování CTLA4 mutantní molekula obsahující dvě mutace, LlO4EA29YIg.
Mutantní nukleotidové sekvence kódující CTLA4 mutantní molekuly, jako je L104EA29YIg (uložená 19.6.2000 v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, pod ATCC přírůstkovým č. PTA-2104), se připravily opakováním mutagenese popsané výše, za použití L104EIg jako templátu. Tento způsob se použil pro generování mnoha mutantních nukleotidových sekvencí se dvěma mutacemi, jako jsou sekvence kódující CTLA4 molekuly L104EA29YIg (jak je uvedena na Obr. 19), L104EA29LIg (jak je uvedena na Obr. 20), L104EA29TIg (jak je uvedena na Obr. 21) a L104EA29WIg (jak je uvedena na Obr. 22).
Také se připravily mutanty se třemi mutacemi, jako jsou sekvence kódující L104EA29YS25KIg, L104EA29YS25NIg a L104EA29YS25RIg.
Solubilní CTLA4 molekuly se exprimovaly z nukleotidových sekvencí a použily se v klinických studiích fáze II, které jsou popsány v příkladu 3, dále.
·· ···* ·
• 9 99
9 9 • *> » · » • t
9 9 9 » 9 9 • 9 * 9 9 9 t • ······ í » ·» · · 9 9 9 9
99 9· 99
Jak je odborníkům v oboru známo, replikace sekvencí nukleové kyseliny, zejména PCR amplifikace, snadno vkládá změny baží do DNA řetězců. Nicméně, nukleotídové změny nejsou nutně translatovány do aminokyselinových změn, protože některé kodony kódují stejné aminokyseliny. Jakékoliv změny nukleotidů v původní nebo přirozené sekvenci, silentní (t.j. nezpůsobující změnu v translatované aminokyselině) nebo jiné, spadají, ač to není výslovně uvedeno, do rozsahu předkládaného vynálezu.
Příklad 2
Následující příklad popisuje skríningové metody použité pro identifikaci mutantních CTLA polypeptidů s jednou nebo dvěmi mutacemi, exprimovaných z konstruktů popsaných v příkladu 1, které mají vyšší vazebnou aviditu pro B7 molekuly, ve srovnání s nemutovanými CTLA4Ig molekulami.
Současné pokusy in vitro a in vivo ukazují, že CTLA4Ig sám není schopen zcela blokovat aktivaci specifickým antigenem aktivovaných T-lymfocytů. Pokusy in vitro s CTLA4Ig a bud’ monoklonální protilátkou specifickou pro CD8O, nebo CD86, měřící inhibici proliferace T-lymfocytů ukázaly, že anti-CD8O monoklonální protilátka nezvyšuje CTLA4Ig inhibici. Nicméně, anti-CD86 monoklonální protilátka zvyšovala inhibici, což naznačuje, že CTLA4Ig není tak účinný v blokování CD86 interakce. Tato data podporují dřívější zjištění Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793-801) ukazující, že inhibice CD80-zprostředkované buněčné reakce vyžaduje přibližně 100-krát nižší koncentrace CTLA4Ig než inhibice CD86-zprostředkované reakce. Podle těchto zjištění se předpokládá, že solubilní CTLA4 mutantní molekuly mající vyšší aviditu pro CD86 než přirozená CTLA4 molekula by mohly lépe blokovat priming antigen-specifických aktivovaných buněk než CTLA4Ig.
• · • » · · • * · • · · · • ♦ · • · · • · · · · ·
Proto byly solubilní CTLA4 mutantní molekuly popsané v příkladu 1 testovány za použití nové skríningové procedury za účelem identifikace několika mutací v extracelulární doméně CTLA4, které zlepšují vazebnou aviditu pro CD8O a CD86. Tato skríningová strategie poskytuje účinný způsob pro přímou identifikaci mutantů s významně pomalejší disociaci bez potřeby přečištění nebo kvantifikace proteinu, protože určení off rate je nezávislé na koncentraci {0'Shannessy et al., (1993) Anal. Biochem.,
212:457-468) .
COS buňky se transfektovály jednotlivými plasmidovými DNA přečištěnými na miniprep a propagovaly se po dobu několika dnů.
Tři dny kondicionované kultivační medium s aplikovalo na BIAcore biosensorové čipy (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) potažené solubilním CD8OIg nebo CD86Ig. Specifická vazba a dissociace mutantních proteinů se měřila povrchovou plasmonovou resonancí (0'Shannessy, D. J., et al., 1997 Anal. Biochem. 212:457-468). Všechny pokusy byly provedeny na BIAcoreTM nebo BIAcoreTM 2000 biosensorech při 25 OC. Ligandy byly imobilizované na NCM5 sensorových čipech (Pharmacia) za použití standardního N-ethyl-Ν' -(dimethylaminopropyl)karbodiimid-N-hydroxysukcinimidové kondenzace (Johnsson, B.. et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko, S.N., et al.(1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434).
Skríningový způsob
COS buňky kultivované ve 24-jamkových tkáňových kultivačních plotnách se dočasně transfektovaly mutantním CTLA4Ig. Kultivační medium obsahující secernovaný solubilní mutantní CTLA4Ig se odebíralo o 3 dny později.
• 9 • · • · · #
Kondicionované kultivační medium COS buněk se nechalo protékat skrz BIAcore biosensor čipy derivátizované CD86Ig nebo CD8OIg (jak je popsáno v Greene et al., 1996 J. Biol. Chem. 271 :26762-2677
1), a identifikovaly se mutantní molekuly s off-rates pomalejším než je tato hodnota pro přirozený CTLA4Ig. DNA odpovídající vybraným vzorkům media se sekvencovaly a připravilo se více DNA pro provedení dočasně transfekce COS buněk ve větším měřítku, ze kterých může být CTLA4Ig mutantní protein připraven po přečištění kultivačního media na proteinu A.
BIAcore analýza a analýza dat vazebné rovnováhy se provedly způsobem popsaným v J. Greene et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771 a v U.S. Patentové přihlášce pořadové č..
09/579927, a 60/214065, které jsou zde uvedeny jako odkazy.
Analýza BIAcore dat
Základní senosorgramy se před analýzou normalizovaly na odezvu nula jednotek (RU). Vzorky se nechaly projít falešně derivatizovanou průtokovou kyvetou pro určení RU hodnot pozadí z důvodu velkých rozdílů v indexu lomu mezi roztoky. Rovnovážné disociační konstanty (K^) se vypočetly z grafů R^ versus C, kde Req je rovnovážná odpověď minus odpověď na falešně derivátizovaném čipu, a C je molární koncentrace analytu. Vazebné křivky se analyzovaly za použití komerčního softwaru pro hodnocení nelineárních křivek (Prism, GrafPAD Software).
Experimentální data se nejprve upravila pro model vazby jednoho ligandu na jeden receptor (l-místný model, t.j., jednoduchý langmuir systém, A+B-AB), a rovnovážné asociační \konstanty (Kd=[A].Β][AB]) se vypočetly z rovnice R=R C/(K +C). Potom se data upravila pro nej jednodušší model vazby ligandu na dvě místa (t.j., pro receptor mající dvě neinteragující/nezávislá vazebná • · · · « · • · · · místa, jak je popsán rovnicí R=R l.C(K +C)+R .C(K +C).
Přiléhavost těchto dvou modelů se analyzovala vizuálně srovnáním s experimentálními daty a statisticky za použití F testu součtu čtverců, jednodušší jednocestný model byl vybrán jako lepší, pokud nevyhovoval dvou-místný model významně lépe (p<0.1).
Asociační a disociační analýzy se provedly za použití BIA evaluation 2.1 Software {Pharmacia). Asociační rychlostní konstanty kori se vypočítaly dvěma způsoby, za předpokladu homogenní interakce na jednom místu a paralelní interakce na dvou místech. Pro interakce na jednom místě se hodnoty kon vypočetly podle rovnice R =R (l-exp-^θct co>, kde R je odpověď za daný χ t- ^cg t čas, t; Recj je rovnovážná odpověď; tQ je čas na začátku injekce; a ksdR/d =koii.Cko;cť; kde C je koncentrace analytu vypočtená ve smyslu monomerních vazebných míst. Pro interakce na dvou místech se hodnoty kon vypočetly podle rovnice
Rt=Re^l {l-exp-k_;KS <t_to)+Reca2 {l-exp-:k;s <t_fco) . Pro každý model se hodnoty kon určily pro vypočtený sklon {přibližně do 70% maximální asociace) grafu ks versus C.
Disociační data se analyzovala za použití jednomístného (AB=A+B) a dvoumstného modelu (AiBj=Ai+Bj), a rychlostní konstanty (koff) se vypočetly z nejlépe odpovídajících křivek. Použil se model vazebného místa, pokud nebyla residua větší než základní hodnoty přístroje (2-10 RU podle přístroje), kdy se použil model dvou vazebných míst. Poločasy obsazení receptoru se vypočetly podle vztahu t =0,693k
Průtoková cytometrie
Myší mAb L307.4 (anti-CD8O) se zakoupila od Becton Dickinson (San Jose, California) a IT2.2 (anti-B7-0 [též CD86]), od ► · · · · • · » · · 9 • · • 9 · · ·
Pharmingen (San Diego, California). Pro imunobarvení se
CD80-pozitivní a/nebo CD86-pozitivní CHO buňky odstranily z kultivačních nádob inkubaci v fosfátem pufrováném salinickém roztoku (PBS) obsahujícím 10 mM EDTA. CHO buňky (1-10 x 10) se nejprve inkubovaly s mAb nebo imunoglobulinovými fúzními proteiny v DMEM obsahujícím 10% fetální hovězí konstantní (FBS), potom se promyly a inkubovaly se s kozím anti-myším nebo anti-lidským imunoglobulinem konjugovaným s fluoresceinem isothiokyanátem jako činidlem druhého stupně (Tágo, Burlingame, California). Buňky se promyly a analyzovaly se na FACScan (Becton Dickinson).
SDS-PAGE a chromatografie s vylučováním podle velikosti
SDS-PAGE se provedla na Tris/glycinových 4-20% akrylamidových gelech (Novex, San Diego, CA). Analytické gely se barvily Coomassie Blue, a obrazy vlhkých gelů se provedly digitálním skenováním. CTLA4Ig (25 pg) a L104EA29YIg (25 ug) se analyzovaly chromatografií s vylučováním podle velikosti za použití TSK-GEL G300 SWXL kolony (7,8 χ 300 mm, Tosohaas, Montgomeryville, PA) uvedené do rovnováhy ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku obsahujícím 0,02% NAN3 při průtoku 1,0 ml/min.
CTLA4XC12OS a L104EA29YXC12OS
Jednořetězcová CTLA4XC12OS se připravila způsobem popsaným dříve (Litisiey et al., (1995) J Biol. Chem., 270:15417-15424).
Stručně, expresní plasmid pro oncostatin M CTLA4 (OMCTLA4) se použil jako templát, kódující primer,
GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG, byl vybrán tak, aby odpovídal sekvencím ve vektoru; a reversní primer, GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCrGGGCACGGTTC, odpovídal posledním sedmi aminokyselinám (t.j. aminokyselinám 118-124) v extracelulámí doméně CTLA4, a obsahoval místo pro restrikční • · · · • · · · • · · enzym a stop kodon (TGA). Reversní primer určoval C120S (cystein na serin v pozici 120) mutaci. Konkrétně, nukleotidová sekvence GCA (nukleotidy 34-36) reversního primeru uvedeného výše se nahradila jednou z následujících nukleotidových sekvencí: AGA,
GGA, TGA, CGA, ACT, nebo GCT. Jak bude odborníkům v oboru jasné, nukleotidová sekvence GCA je revertovaná komplementární sekvence kodonu TGC pro cystein. Podobně, nukleotidové sekvence AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, nebo GCT jsou revertované komplementární sekvence kodonů pro serin. Produkty polymerasové řetězové reakce se trávily HindlII/Xbal a přímo se subklonovaly do expresního vektoru píLN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L104EA29YXc~os was prepared in an identical manner. Každý konstrukt se ověřil DNA sekvenováním.
Identifikace a biochemická charakterizace mutantů s vysokou aviditou aminokyselin se vybralo pro mutagenesi a vzniklých asi 2300 mutantních proteinů se testovalo na CD86Ig vazbu pomocí povrchové plasmonové resonance (SPR; jak je popsána výše). Predominantní efekty mutagenese v každém místě jsou shrnuty v tabulce II, dále. Náhodná mutagenese některých aminokyselin v CDR-1 regionu (S25-R33) jasně neměnila vazbu na ligand. Mutagenese E31 a R33 a zbytků M97-Y102 vedla ke snížení vazby ligandu. Mutagenese zbytků S25, A29, a T30, K93, L96, Y103, L104 a G105 vedla ke vzniku proteinů pomalou asociací” a/nebo pomalou disociací.
Tyto výsledky potvrzují dřívější zjištění, že zbytky v CDR-1 (S25-R33) regionu, a zbytky v nebo poblíž M97-Y102, ovlivňují vazbu ligandu (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058).
Mutagenese míst S25, T30, K93, L96, Y103 a G105 vedla k identifikaci některých mutantních proteinů, které mají pomalejší disociaci z CD86Ig. Nicméně, v těchto případech byla pomalejší • · · · disociace spojena s pomalou asociací, což vedlo k zisku mutantních proteinů, jejichž celková avidita pro CD86Ig byla podobná jako u přirozeného CTLA4Ig. Dále, mutagenese K93 vedla k významné agregaci, která může být odpovědná za pozorované změny kinetiky.
Náhodná mutagenese L104 následovaná transfekci COS buněk a testováním vzorků kultivačního media na imobilizovaném CD86Ig pomocí SPR vedly k zisku šesti vzorků media obsahujících mutantní proteiny s přibližně 2-krát pomalejší disociací než má přirozený CTLA4Ig. Když se sekvencovaly příslušné cDNA těchto mutantů, bylo u každého zjištěno, že kóduje leucin na kyselinu glutamovou mutaci (L104E). Je zřejmé, že substituce leucinu 104 na kyselinu asparagovou (L104D) neovlivňuje vazbu CD86Ig.
Mutagenese se potom opakovala pro každé místo uvedené v tabulce II, tentokrát za použití L104E jako PCR templátu místo přirozeného CTLA4Ig, jak bylo popsáno výše. SPR analýza, opět za použití imobilizovaného CD86Ig, identifikovala šest vzorků kultivačního media z mutagenese alaninu 29 s proteiny majícími přibližně 4-krát pomalejší disociaci než přirozený CTLA4Ig. Dva nejpomalejší měly substituce tyrosinu (L104EA29Y), dva leucinu (L104EA29L), jeden tryptofanu (L104EA29W), a jeden threoninu (L104EA29T).
Nebyly identifikovány žádné mutanty s pomalou disociací, když byl mutován pouze alanin 29 v přirozeném CTLA4Ig.
Relativní molekulová hmotnost a stav agregace přečištěného L104E a LlO4EA29YIg se hodnotily SDS-PAGE a chromatografií s vylučováním podle velikosti. L104EA29YIg {1 ug; dráha 3) a L104EIg (1 ug; dráha 2) měly stejnou elektroforetickou mobilitu jako CTLA4Ig (1 ug; dráha 1) za redukujících {50 kDa; +betaME; plus 2-merkaptoethanol) a neredukujících (100 kDa; -betaME) podmínek {obr. 25A). Chromatografie s vylučováním podle velikosti ukázala, že L104EA29YIg (obr. 25C) má stejnou mobilitu jako • · dimerní CTLA4Ig (obr. 25B). Hlavní píky představují proteinový dimer, zatímco rychleji eluovaný menší pík na obr. 25B představuje agregáty s vyšší molekulovou hmotností. Přibližně 5,0% CTLA4Ig bylo přítomno ve formě agregátů s vyšší molekulovou hmotností, ale nebyly pozorovány důkazy agregace L104EA29YIg nebo L104Elg. Proto nemůže být silnější vazba na CD86Ig pozorovaná u L104Elg a L104EA29YIg přisouzena agregaci indukované mutagenesí.
Analýza rovnováhy a kinětiky vazby
Analýza rovnováhy a kinetiky vazby se provedla na proteinem A přečištěných CTLA4Ig, L104EIg, a L104EA29YIg za použití povrchové plasmonové resonance (SPR). Výsledky jsou uvedeny v tabulce I, dále. Pozorované rovnovážné disociační konstanty (Kd; Tabulka I) byly vypočteny z křivek vazby získaných za použití různých koncentrací (5,0-200 nM) . L104EA29YIg se váže silněji na CD86Ig než L104EIg nebo CTLA4Ig. Nižší Kd pro L104EA29YIg (3,21 nM) než L104EIg (6,06 nM) nebo CTLA4Ig (13,9 nM) ukazuje na vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg k CD86Ig. Nižší Kd pro L104EA29YIg (3,66 nM) než L104EIg (4,47 nM) nebo CTLA4Ig (6,51 nM) ukazuje na vyšší vazebnou aviditu L104EA29YIg k CD8OIg.
Analýza kinetiky vazby ukázala, že rychlosti asociace CTLA4Ig, L104EIg a L104EA29YIg na CD8O byly podobné, stejně jako rychlosti asociace pro CD86Ig (Tabulka I). Nicméně, rychlosti disociace pro tyto molekuly nebyly ekvivalentní (Tabulka I). Ve srovnání s CTLA4Ig měl L104EA29YIg přibližně 2-krát nižší rychlost disociace z CD8Olg, a přibližně 4-krát nižší rychlost disociace z CD86Jg. L104E má rychlost disociace mezi L104EA29YIg a CTLA4Ig. Protože vkládání těchto mutací neovlivňuje významně rychlosti asociace, je za zvýšení avidity pro CDSOIg a CD86Ig u L104EA29YIg primárně odpovědné snížení rychlosti disociace.
• · * ·
Pro určení toho, zda zvýšení avidity L104EA29YIg pro CD86Ig a CD8OIg je způsobeno mutacemi postihujícími způsob asociace monomerů v dimer, nebo strukturálními změnami zesilujícími aviditu v každém monomeru, se připravily jednořetězcové konstrukty CTLA4 a L104EA29Y extracelulární domény po mutagenesi cysteinu 120 na serin, jak je popsáno výše a v Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424 (84). Přečištěné proteiny CTLA4Xcl205 a L104EA29YXcl205 se analyzovaly jako monomerní, podle gelové permeační chromatografie (Linsley et al., (1995), výše), před tím, než byly jejich vazebné vlastnosti analyzované SPR. Výsledky ukázaly, že vazebná afinita obou monomerních proteinů pro CD86Ig byla přibližně 35-80-krát nižší než pro příslušné dimery (Tabulka
I). Toto podporuje dříve publikovaná data uvádějící, že dimerizace CTLA4 je nutná pro vysokou aviditu vazby ligandu (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762-26771).
L104EA29YXcl205 se váže s přibližně 2-krát vyšší affinitou než CTLA4Xcl205 jak na CD8OIg, tak na CD86Ig. Vyšší afinita je způsobena přibližně 3-krát nižší rychlostí disociace z obou ligandů. Proto je silnější vazba ligandu L104EA29Y s největší pravděpodobností způsobena strukturálními změnami ovlivňujícími aviditu, které byly vloženy do každého monomerního řetězce, a ne alteracemi dimerizace molekuly.
Analýza pozice a struktury mutací zvyšujících aviditu
Struktura extracelulární IgV-like domény CTLA4 byla nedávno určena NMR spektroskopií (Metzler et al., (1997) Nátuře Struct.
Biol., 4:527-531). Toto umožnilo přesné určení leucinu 104 a alaninu 29 ve trojrozměrném složení (obr. 26, pravý a levý obrázek). Leucin 104 je situován poblíž vysoce konzervované MYPPPY aminokyselinové sekvence. Alanin 29 je situován poblíž C-terminálního konce CDR-1 (S25-R33) regionu, který prostorově • · • · · · • · sousedí s MYPPPY regionem. Zatímco je jednoznačná interakce mezi zbytky v bázi těchto dvou regionů, není přítomná interakce mezi L104 a A29, ačkoliv jsou oba součásti hydrofobního jádra proteinu. Strukturální následky dvou mutací zvyšujících aviditu byly hodnoceny modelováním. A29Y mutace může být snadno vložena do mezery mezi CDR-1 (S25-R33) region a MYPPPY region, a může sloužit pro stabilizaci N4YPPPY regionu. V přirozeném CTLA4 tvoří L104 extensivní hydrofobní interakce s L96 a V94 poblíž MYPPPY regionu. Je značně nepravděpodobné, že by mutace kyseliny glutamové způsobovaly konformaci podobnou jako L104, a to ze dvou důvodů. Za prvé, není dostatek prostoru pro delší vedlejší řetězec kyseliny glutamové ve struktuře bez významného narušení CDR-1 (S25-R33 regionu). Za druhé, energetické nároky na negativní náboj vedlejšího řetězce kyseliny glutamové v hydrofobním regionu jsou značné. Místo toho modelování předpovídá, že vedlejší řetězec kyseliny glutamové vyčnívá na povrch, kde může být jeho náboj stabilizován solvatací. Taková změna konformace může být snadno upravena G105, s minimálním narušením dalších zbytků v regionech.
Vazba mutantů s vysokou aviditou na CHO Buňky exprimující CD80 nebo CD86
FACS analýza (obr. 27) CTLAAIg a analýza vazby mutantní molekuly na stabilně transfektované CD8O+ a CD86+ CHO buňky se provedla následujícím způsobem. CD80-pozitivní a CD86-pozitivní CHO buňky se inkubovaly se stoupajícími koncentracemi CTLA4Ig, L104EA29YIg, nebo L104EIg, a potom se promyly. Navázaný imunoglobulinový fúzní protein se detekoval za použití kozího anti-lidského imunoglobulinu navázaného na fluorescein isothiokyanát.
Jak je ukázáno na obr. 27, CD80-pozitivní nebo CD86-pozitivní CHO buňky (1,5x106) se inkubovaly s uvedenými koncentracemi • · • 9
• · · · • · « · • · • · • · · · ·
CTLA4Ig (plné čtverečky), LlO4EA29YIg (kroužky), nebo L104EIg (trojúhelníčky) po dobu 2 hodin při 230C, promyly se a inkubovaly se s kozím antí-lidským imunoglobulinem navázaným na fluorescein isothiokyanát. Vazba na celkem 5000 živých buněk se analyzovala (jedno měření) za použití FACScan, a průměrná intenzita fluorescence (MFI) se určila z histogramů za použití PC-LYSYS.
Data se korigovala na fluorescenci pozadí měřenou na buňkách inkubovaných pouze s činidlem druhého kroku (MET 7). Kontrolní L6 mAb (80 pg/ml) měla MFI < 30. Tyto výsledky jsou reprezentativní výsledky ze čtyř nezávislých pokusů.
Vazba Ll04EA29YIg, Ll04EIg a CTLA4Ig na lidské CD80-transfektované CHO buňky je přibližně ekvivalentní (Obr.
27A). L104EA29YIg a L104EIg se váží silněji na CHO buňky stabilně transfektováné lidským CD86 než CTLA4Ig (obr. 27B).
Funkční testy
Lidské CD4-pozitivní T-lymfocyty se izolovaly imunomagnetickou negativní selekcí (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med.
176:1595-1604). Izolované CD4-pozitivní T-lymfocyty se stimulovaly forbolmyristátacetátem (PMA) plus CD8O-požitivními nebo CD86-pozitivními CHO buňkami za přítomnosti titračních koncentrací inhibitoru. CD4-pozitivní T-lvmfocyty (8-10 x 104/jamku) se kultivovaly za přítomnosti 1 nM PMA s nebo bez ozářených stimulačních CHO buněk. Proliferativní reakce se měřily přidáním 1 uCi/jamku [3H]thymidinu během posledních 7 hodin 72 hodinové kultivace. Provedla se inhibice PMA plus CD80-pozitivn£mi CHO, nebo CD86-pozitivními CHO, stimulovaných T-lymfocytů za použití L104EA29YIg a CTLA4Ig. Výsledky jsou uvedeny na obr. 28. L104EA29YIg inhibuje proliferaci CD80-pozitivních PMA ošetřených CHO buněk více než CTLA4Ig (obr. 28A). L104EA29YJg je také účinnější než CTLA4Ig v inhibování proliferace CD86-pozitivních • · · ·
PMA ošetřených CHO buněk (obr. 28B) . Proto je L104EA29YIg účinější inhibitor CD8O- i CD86-zprostředkované kostimulace T-lymfocytů.
Obr. 29 ukazuje inhibici allostimulovaných lidských T-lymfocytů L104EA29YIg a CTLA4Ig, a kde tyto T-lymfocyty byly dále allostimulované lidskou B lymfoblastoidní buněčnou linií (LCL) označovanou jako PM, která exprimuje CD8O a CD86 (T-lymfocyty v koncentraci 3,0x10/jamku a PM při koncentraci 8,0x103/jamku). Primární allostimulace probíhala po dobu 6 dnů a potom se buňky pulsovaly 3H-thymidinem po dobu 7 hodin před tím, než se určovala inkorporace radioaktivního markéru.
Druhá allostimulace se provedla následujícím způsobem. Sedm dnů primárně allostimulované T-lymfocyty se odebíraly přes lymfocytární separační medium (LSM) (JCN, Aurora, OH) a nechaly se v klidu po dobu 24 hodin. T-lymfocyty se potom restimulovaly (sekundárně), za přítomnosti titračních množství CTLA4Ig nebo L104EA29YTg, přidáním PM ve stejném poměru jako výše. Stimulace probíhala po dobu 3 dnů a potom se buňky pulsovaly radioaktivním markérem a odebraly se způsobem uvedeným výše. Efekt L104EA29YIg na primárně allostimulované T-lymfocyty je uveden na obr. 29A. Efekt L104EA29YIg na sekundárně allostimulované T-lymfocyty je uveden na obr. 29B. L104EA29YIg inhibuje jak primární, tak sekundární proliferativní reakce T-lymfocytů lépe než CTLA4Ig.
Pro měření produkce cytokinů (Obr. 30) se provedly dvojité sekundární allostimulace. Po třech dnech se kultivační medium testovalo za použití ELISA kitů (Biosource, Camarillo, CA) za použití podmínek doporučovaných výrobcem. Bylo zjištěno, že L104EA29YIg je účinnější než CTLA4Ig v blokování produkce IL-2, IL-4 a gamma-IFN cytokinů T-lymfocyty po sekundárním allogením podnětu (Obr. 30A-C).
• · • · · ·
Efekty LlO4EA29YIg a CTLA4Ig ona reakci směsi opičích lymfocytů (MLR) jsou uvedeny na Obr. 31. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC; 3,5x104 buněk/jamku od každé opice) od dvou opic se přečistily přes lymfocytární separační medium (LSM) a smísily se s 2 ug/ml fytohemaglutininu (PHA). Buňky se stimulovaly 3 dny a potom se pulsovaly radioaktivním markérem po dobu 16 hodin před tím, než se odebraly. L104EA29YIg inhiboval proliferaci opičích T-lymfocytů lépe než CTLA4Ig.
Tabulka I:
Následující tabulka ukazuje rovnovážné a kinetické konstanty (hodnoty jsou průměry standardní odchylka ze tří různých pokusů):
Imobilizovaný Anályt protein
Áo„ (x 105) ko(t (χ 10'3)
M1 S·' N1 nM
CD80Ig CTLA4Ig 3.44 ± 0.29 2.21 ± 0.18 6.51 ± 1.08
CD80Ig L104EIg 3.02 ± 0.05 1.35 ±0.08 4.47 ±0.36
CD80Ig L104EA29YIg 2.96 ± 0.20 1.08 ± 0.05 3.66 ±0.41
CD80Ig CTLA4Xci2os 12.0 ± 1.0 230 ±10 195 ± 25
CDSOIg LlO4EA29YXci2os 8.3 ± 0.26 71 ±5 85.0 ±2.5
CD86Ig CTLA4íg 5.95 ± 0.57 8.16 ± 0.52 13.9 ±2.27
CD86Ig L104EIg 7.03 ± 0.22 4.26 ±0.11 6.06 ±0.05
CD86Ig L104EA29YIg 6.42 ± 0.40 2.06 ±0.03 3.21 ±0.23
CD86Ig CTLA4Xci2os 16.5 ±0.5 840 ± 55 511 ± 17
CD86Ig LlO4EA29YXCi2os 11.4 ± 1.6 300 ± 10 267 ± 29
• « · · · • · ·· ·· » ♦ · « » · · t • · · ·
Tabulka II
Efekt mutagenese CTLA4Ig v uvedených místech na vazbu na CD86Ig určený SPR, jak je popsána výše. převládající účinek je označen + .
Místo mutagenese
Efekt mutagenese
Bez Jasné zpomalení asociace/ efektu zpomalení disociace
Redukovaná vazba ligandu
S25 4
P26 +
G27 +
K2S +
A29 4-
T30 4
E31 +
R.33 +
K93 4
L96 4
M97 +
Y98 +
e
P99 +
P100 +
mm
r iui +
Y102 +
Y103 4
L3O4 4
G105 4-
1106 +
G107 +
Q1U +
Yl 13 +
1175 +
• · • · · ·
Příklad 3
Následující příklad popisuje klinické studie fáze II na pacientech, kterým byla podávána solubilní CTLA4 mutantní molekula L104EA29YIg (též označovaná jako LEA29Y nebo LEA) nebo CTLA4Ig, pro zmírnění alespoň jednoho příznaku asociovaného s revmatoidní artritis, včetně redukce: otoku kloubů, citlivost kloubů, zánětu, ranní ztuhlosti a bolesti. Použitá CTLA4Ig molekula začíná methioninem v pozici +1 (nebo alternativně alaninem v pozici -1) a končí lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na Obr. 24. DNA kódující provedení CTLA4Ig molekuly byla uložena pod ATCC 68629. Použitá L104EA29YIg molekula začíná methioninem v pozici +1 (nebo alternativně alaninem v pozici -1) a končí lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na Obr. 19. DNA kódující provedení L104EA29YIg molekuly byla uložena pod ATCC PTA 2104.
Dále tento příklad popisuje pacienty, kterým byl podán L104EA29YIg nebo CTLA4Ig pro zmírnění alespoň jednoho biologického markéru asociovaného s revmatoidní artritis, včetně snížení sedimentace erytrocytů, sérové koncentrace C-reaktivního proteinu a/nebo IL2 receptoru.
Kohorty pacientů
Na studii participovalo celkem 214 pacientů, 54 mužů a 160 žen (Obr. 1A, IB). Pacienti měly na začátku průměrné trvání onemocnění 3,4 ( 2,0) roku a měly za sebou selhání alespoň jednoho antirevmatika modifikujícího onemocnění {DMARD). Bylo povoleno současné užívání nesteroidních protizánětlivých léků (NSAIDS) nebo steroidů ( 10 mg/den) a současné podávání DMARDS bylo zakázáno. Pacienti byli randomizováni do skupin po 25 až 32 pacientech na skupinu. 32 pacientů dostávalo placebo, 92 dostávalo Ll04EA29YIg a 90 dostávalo CTLA4Ig. Pacienti, jejichž léčba probíhala podle • · ···· • · « t protokolu a nepřerušily léčbu do dne 57 dostaly celkem 4 intravenosní infúze, vždy jednu infusi v den 1, 15, 29 a 57. Všichni pacienti byly hodnoceni v den 1, 15, 29, 43, 57, 71 a 85. Podané dávky byly 0,5, 2,0 nebo 10,0 mg/kg L104EA29YIg (označeno jako LEA.5, LEA2 a LEA1O, v příslušném pořadí na Obr. 1A-1E) nebo CTLA4Ig (označeno jako CTLA.5, CTLA2 a CTLA1O, v příslušném pořadí na obr. 1A-1E).
Všichni jedinci byly sledováni na peri-infúzní nežádoucí účinky za použití otázek a dotazníku na potenciální nežádoucí účinky. Pacienti byli dotazováni na potenciální nežádoucí účinky, které se mohou vyskytovat během 24 hodin po infusi. Dále byli pacienti vyzváni, aby spontánně udávali jakékoliv nežádoucí účinky, které pociťovali. Lékaři rutině monitorovaly laboratorní vzorky od pacientů na abnormality v biochemii a hematologii, např. hodnotili koncentrace mediátorů zánětu, jako jsou cytokiny (TNF, IL-6), tryptasa a komplement. Primárním cílem byl podíl pacientů splňujících ACR 20 kriteria v den 85.
Skladování testovacích materiálů
CTLA4Ig a L104EA29YIg byly dodány ve skleněných lékovkách pro jedno použití obsahujících 200 mg/lékovku CTLA4Ig nebo 100 mg/lékovku LlO4EA29YIg, v příslušném pořadí. Před infusi se CTLA4Ig a L104EA29YIg naředily na konečnou koncentraci 25 mg/ml sterilní vodu pro injekce (SWFI).
Protokol pro aplikaci
Všechny infúze byly podány intravenosně během 1 hodiny (Obr. 1 až 17). Všichni jedinci dostávaly alespoň jednu infúzi studované medikace.
*· ···· « 4 « * 9 9 99 • · « * · · · • · · 9 · • · 9 ·· 99 • · 9 f * « « · s * · 4 • » 9
9 9 9 ·« 99
Skupina 1: 32 pacientů, placebo odpovídající CTLA4Ig nebo L104EA29YIg.
Skupina 2: 26 pacientů; dávka 0,5 mg/kg CTLA4Ig.
Skupina 3: 32 pacientů; dávka 2,0 mg/kg CTLA4Ig.
Skupina 4: 32 pacientů; dávka 10,0 mg/kg CTLA4Ig.
Skupina 5: 32 pacientů; dávka 0,5 mg/kg L104EA29YIg.
Skupina 6: 29 pacientů; dávka 2,0 mg/kg L104EA29YIg.
Skupina 7:31 pacientů; dávka 10,0 mg/kg L104EA29YIg.
Klinické sledování
Pacienti byli hodnoceni na výchozí hodnoty aktivity onemocnění před tím, než jim byla podána jakákoliv infuse. Základní hodnocení zahrnovalo: otok kloubů, citlivost kloubů, zánět, ranní ztuhlost, aktivitu onemocnění hodnocenou pacientem a lékařem, stejně jako omezení pohyblivosti hodnocené podle Health Questionnaire Assessment (HAQ) {uvedeno jako skůre funkcí podle lékaře na Obr. IC), a bolesti (Obr. 1A až ID). Dále mezi základní vyšetření patřila sedimentace erytrocytů (ESR) a sérová koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) a solubilního IL-2 receptoru (IL-2r) (Obr. IC a ID).
Klinická odpověď ve studii byla hodnocena podle kriterií daných American College of Rheumatology (ACR). Jedinec splňoval ACR2O kriterium, pokud došlo ke 20% zlepšení v citlivosti a otoku kloubu a ke 20% zlepšení ve třech z pěti zbývajících měřených příznaků, jako jsou celkové změny onemocnění, bolest, neschopnost • · » · • · • · • · * · » · · » · · · « • ···· · · · · · · · • · · · · ······ t ·
7ΐ’ ’·’ · ·’* *··’ ’··* a reaktanty akutní fáze (Felson, D. T., et al., 1993 Artritis a Rheumatism 36:729-740; Felson, D. T., et al., 1995 Artritis a Rheumatism 38:1-9).
Biologické markéry
Hodnoceny byly také potenciální biomarkery aktivity onemocnění (revmatoidní faktor, CRP, ESR, solubilní IL-2R, solubilní ICAM-1, solubilní E-selektinu a MMP-3). zavedené imunotesty (EIA) byly použity pro stanovení sérových koncentrací IL2sRalfa, sICAM-1, sE-selektinu a MMP-3. TNFalfa a IL6 byly hodnoceny před infusí a 2 hodiny po infusi, pokud to bylo nutné.
IL-2sRalfa, sICAM-l a sE-selektin se měřily za použití komerčně dostupných kolorimetrických EIA kitů od R&D Systems, lne. (Minneapolis, MN). Dolní a horní limity měření byly 312-20000 pg/ml, 40-907 ng/ml a 10-206 ng/ml, v příslušném pořadí.
Koeficient variace mezi testy byl v rozmezí od 4,48-8,4%,
3,8-5,0% a 5,5-9,0%, v příslušném pořadí. Podle výrobce kitu jsou normální sérové koncentrace v rozmezí 676-2132 pg/ml, v příslušném pořadí.
MMP-3 se měřila za použití komerčně dostupného kolorimetrického EIA kitu od Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Dolní a horní limity měření byly 30-7680 ng/ml. Koeficient variace mezi testy byl v rozmezí od 6,3-10,6. Podle výrobce kitu jsou normální sérové koncentrace v rozmezí 28-99 ng/ml.
IL-6 a TNFalfa se měřily za použití komerčně dostupných chemiluminscentních EIA kitů od R&D Systems, lne. (Minneapolis,
MN). Dolní a horní limity měření byly 0,3-3000 pg/ml a 0,7-7000 pg/ml, v příslušném pořadí. Koeficient variace mezi testy byl v rozmezí od 3,1-5,7% a 6,4-20,7%, v příslušném pořadí. Podle » · · a · a · aaaa • · · «
72· — výrobce kitu jsou normální sérové koncentrace v rozmezí 0,-12 pg/ml a 0,7-7,5 pg/ml, v příslušném pořadí.
Testování protilátek
Vzorky séra se odebraly pro hodnocení protilátek specifických pro lék před aplikací v den 1 a přibližně ve dny 15, 29, 57, 85 a 169. Vzhledem k vysokým, preexistujícím titrům namířeným proti imunoglobulinové (Ig) části molekuly se také hodnotila specifická protilátka proti CTLA4Ig a LEA29Y bez Ig konstantních regionů.
96-jamkové Immulon II ELISA plotny (Dynex, Chantilly, Virginia) se potáhly CTLA4Ig, CTLA4Ig bez Ig konstantních regionů, LEA29Y, nebo LEA29Y bez Ig konstantních regionů v koncentraci 2, 4, 2 nebo ug/ml ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS), v příslušném pořadí, a provedla se inkubace přes noc při 2-80C. Plotny se promyly PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 a blokovaly se po dobu 1 hodiny při 370C PBS obsahujícím 1% hovězí sérový albumin (BSA). Plotny se potom promyly a sériová ředěním testovaného séra nebo kontrolního (QC) séra se přidaly do vhodných jamek a provedla se inkubace po dobu 2 hodin při 370C. Sérum se naředilo třikrát v PBS s 0,25% BSA a 0,05% Tween 20, od ředění 1:10. Plotny se promyly a přidala se směs kozích protilátek proti lidským kappa a lambda řetězcům konjugovaných s alkalickou-fosfatasou (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). Po 1 hodině inkubace při 370C se plotny promyly a 1 mg/ml para-nitrofenyl-fosfát v diethanolaminovém pufru se přidal do každé. Po 30 minutách při 250C se reakce ukončila 3N NaOH a změřila se absorbance (dvě vlnové délky: 405 nm a 550 nm). Výsledky byly vyjádřeny jako konečný titr (EPT), který je definován jako převrácená hodnota nejvyššího ředění, které vedlo k absorbanci pětkrát vyšší než je základní absorbance. Základní absorbance plotny se určila jako absorbance za nepřítomnosti séra.
• · · · · · • · · · ·
Hodnoty se považovaly za pozitivní na serokonverzi tehdy, pokud byly alespoň o dvě sériová ředění (9-krát) nebo vícekrát vyšší než hodnoty EPT před aplikací dávky. QC vzorky séra pozitivní na CTLA4Ig- nebo LEA29Y-specifickou protilátku se připravily od imunizovaných opic. Podíly vhodných QC vzorků se testovaly během každého analytického měření. Analytická měření se akceptovala pouze tehdy, když byly QC vzorky v přijatelných hranicích.
Výsledky
CTLA4Ig a LlO4EA29YIg byly při nízkých dávkách dobře tolerovány. Peri-infusní nežádoucí účinky byly podobné ve všech skupinách, s výjimkou bolestí hlavy. Bolest hlavy se u pacientů v den 85 zvyšovala v závislosti na dávce, 23%, 44% a 53% u CTLA4Ig-léčených pacientů, a 34%, 45% a 61% u L104EA99Ylg-léčených pacientů, při dávce 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v příslušném pořadí. Naopak, 31% pacientů, kterým bylo podáváno placebo, udávalo bolest hlavy.
Procento pacientů, kteří byli vyřazeni z klinické studie v důsledku zhoršení artritidy, je shrnuto na Obr. 2. Mnohem vyšší procento pacientů na placebu přerušilo léčbu v důsledku zhoršení artritidy. Pacienti léčení CTLA4Ig přerušovali léčbu méně se stoupající dávkou. Velmi málo pacientů léčených L104EA29YIg přerušilo léčbu. Tyto výsledky ukazují na dobrou inverzní závislost odpovědí na dávce pro CTLA4Ig, a lepší terapeutickou odpověď na terapii L104EA29YIg.
ACR-20, -50 a -70 odpovědi pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg, nebo placebem v den 85 jsou shrnuty na Obr. 3A. Obdobně, obr. 3B a C popisují ACR-20 reakce s 95% intervalem spolehlivosti. Odpovědi se zdají být závislé na dávce s jasnou signifikantní reakcí při 10 mg/kg tělesné hmotnosti pacienta.
Procento pacientů s redukcí otoku a citlivosti kloubu ve srovnání s pacienty nemajícími žádnou odezvu na léčbu CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, je uvedeno na obr. 4A a B. Terapeutická odpověď se zdá být závislá na dávce. Větší procento pacientů vykazuje zlepšení o 20, 50, 70 a dokonce i 100% při 2 a 10 mg/kg obou produktů.
Procento pacientů s redukovanou bolestí, aktivitou onemocnění podle pacienta a skóre dle lékaře při léčbě CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, je uvedeno na obr. 5A, B, C a D. Terapeutické odpovědi, monitorované podle Likertova skóre, se zdají být závislé na dávce a jsou lepší pro skupiny s aktivní léčbou než skupiny s placebem v den 85. Likertovo skóre je zavedené verbální skóre pro hodnocení příznaků (The American College of Rheumatology Preliminary Core Set of Disease Activity Measures for Rhematoid Arthritis Clinical Trials: Artritis and Rheumatism, June 1993,
36(6):729-740).
Změny hodnocení aktivity onemocnění pacientem a lékařem o alespoň dvě jednotky od výchozí hodnoty při léčbě CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, jsou uvedeny na obr. 6A a B. Odpovědi se zdají být závislé na dávce s výraznějším zlepšením při vyšších dávkách aktivních léků.
Procentuální snížení koncentrací C-reaktivního proteinu (CRP) u pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, jsou uvedeny na obr. 7A a B. Odpovědi se zdají být závislé na dávce s jasným snížením pro skupiny léčené 2 a 10 mg/kg aktivního léku. Dále, obr. 7B ukazuje, že rozdíl je dosti signifikantní ve srovnání s placebem v 95% intervalech spolehlivosti. Obr. 7C ukazuje změny sérových koncentrací ve srovnání s výchozí hodnotou v den 85.
• · · · ·
Sérové koncentrace solubilního IL-2 receptorů u pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem, jsou uvedeny na obr.
8. Snížení koncentrace solubilního IL-2 receptorů se zdá být závislé na dávce.
Sérové koncentrace solubilního ICAM-1 a solubilního E-selektinu u pacientů léčených CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem jsou uvedeny na obr. 33. Snížení koncentrací solubilního ICAM-1 a solubilního E-selektinu se zdá být závislé na dávce.
Medián a průměr počtu citlivých kloubů u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 9A a B. Změny od základní hodnoty {např. redukce citlivých kloubů) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Medián a průměr počtu oteklých kloubů u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 10A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce počtu oteklých kloubů) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Průměrná skóre hodnocení bolesti u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem jsou uvedena na obr. 11. Změny od základní hodnoty (např. redukce bolesti) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Průměrná skóre aktivity onemocnění podle lékaře a pacienta u pacientů léčených CTLA4Ig nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 12A a B. Změny od základní hodnoty (např. snížení aktivity onemocnění) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 • · · · « · ♦ · • ··· ·· · a ·· • · · · · · « • · · · · · · « t • · · · β···· · ··· ·· ·· »·* mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Medián a průměr počtu citlivých kloubů u pacientů léčených L104EA29YIg {označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 13A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce počtu citlivých kloubů) se zdají být závislé na dávce.
Medián a průměr počtu oteklých kloubů u pacientů léčených L104EA29YIg (označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 14A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce počtu oteklých kloubů) se zdají být významnější ve skupinách léčených 2 a 10 mg/kg než ve skupinách léčených placebem nebo 0,5 mg/kg.
Průměrná skóre bolesti u pacientů léčených L104EA29YIg (označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 15. Změny od základní hodnoty (např. redukce bolesti) se zdají být závislé na dávce.
Průměrná skóre aktivity onemocnění podle lékaře nebo pacienta u pacientů léčených L104EA29YIg (označeného na obr. jako LEA) nebo placebem za čas jsou uvedeny na obr. 16A a B. Změny od základní hodnoty (např. redukce aktivity onemocnění) se zdají být závislé na dávce.
Procentuální zlepšení fyzické nezpůsobilosti podle HAQ v den 85 pro pacienty léčené CTLA4Ig, L104EA29YIg nebo placebem je uvedeno na obr. 17 (Health Assessment Questionnaire (HAQ); Fries, J. F., et al., 1982 J. of Rheumatology 9:789-793). Je patrná jasná závislost tohoto zlepšení na dávce.
Změny v koncentraci solubilního IL-2r a C-reaktivního proteinu vzhledem k výchozí hodnotě byly závislé na dávce v obou léčených • ο» « · · • · · · <
• · · fc skupinách. Po léčbě byly koncentrace solubilního IL-2r -2%, -10% a -22% pro CTLA4Ig a -4%, -18% a -32% pro L104EA29YIg, při dávce 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v příslušném pořadí, ve srovnání s +30% pro placebo. Koncentrace C-reaktivního proteinu byly -12%, -15% a -32% pro CTLA4Ig a +47%, -33% a -47% pro L104EA29YIg při dávce 0,5, 2,0 a 10,0 mg/kg, v příslušném pořadí, ve srovnání s +20% pro placebo (Obr. 7A).
Žádné klinicky významné zjištění s ohledem na běžné hematologické parametry, biochemické laboratorní nálezy (s výjimkou mírného snížení koncentrací IgA a IgG při vyšších dávkách), nebo s ohledem na vitální funkce nebyly pozorovány. Důležité je, že žádná medikace neindukovala protilátky specifické pro lék.
Příklad 4
Následující příklad popisuje klinické studie fáze II provedené na lidských pacientech, kterým byl podáván L104EA29YIg za účelem redukce nebo prevence strukturálního poškození, včetně eroze kosti nebo kloubu, při hodnocení za použití zavedených radiografických stupnic. Toto zlepšení v redukci nebo prevenci strukturálního poškození je paralelní ke klinickému zlepšení měřenému podle klinických parametrů.
Stav struktury kosti se sledoval u některých pacientů před léčbou CTLA4Ig nebo L104EA29YIg. Těmto pacientům se chronicky podávalo mezi 0,5 a 20 mg/kg CTLA4Ig nebo L104EA29YIg každé dva až dvanáct týdnů (samostatně nebo v kombinaci s jinými léky) pro udržení terapeutického zlepšení po delší dobu. Rentgenové snímky rukou a nohou pacientů se prováděly v předem určených intervalech: 6 měsíců a potom jednou ročně, jak je doporučováno v PDA guidelines. Tito pacienti byly sledováni dlouhodobě po 6 a 12 • · · · · 4 • « • · » · ···· ·· I « * · · «··· φ
9999 · ·· · v • · · 9 9 · ···*· » · · · · » ft ·« , # měsících pro určení toho, zda léčba CTLA4Ig nebo L104EA29YIg redukuje progresi kostního postižení, a potom se pacienti sledovali jednou za rok. Pacienti se sledovali za použití radiografických metod, včetně rentgenového vyšetření a/nebo vyšetření magnetickou rezonancí {MRI), standardními způsoby (Larsen, A. K. a M. Eek 1977 Acta. Radiol. Diag. 18:481-491;
Sharp, I. Τ., et al., 1985 Arthritis a Rheumatism 28:1326-1335). Výsledky těchto vyšetření jsou hodnoceny z hlediska prevence strukturálního poškození, včetně zpomalení eroze kosti a poškození chrupavek, zúžení kloubních štěrbin a/nebo prevence nových erozí.

Claims (80)

1. Použití prvního činidla a druhého činidla, přičemž
a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 molekula a
b) druhé činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexát, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutické kompozice pro blokování B7 interakce s CTLA4 a/nebo CD28.
2. Použití prvního činidla a druhého činidla, přičemž
a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 molekula a
b) druhé činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexát, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení onemocnění imunitního systému.
3. Použití solubilní CTLA4 molekuly pro výrobu farmaceutické kompozice pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství • · · · • · -» * · · · · přibližně od 0,5 do 100 mg/kg hmotnosti jedince, 0,5 mg/kg hmotnosti jedince, 2 mg/kg hmotnosti jedince, 10 mg/kg hmotnosti jedince, přibližně od 0,5 do 10 mg/kg hmotnosti jedince nebo přibližně od 0,1 do 20 mg/kg hmotnosti jedince, pro blokování B7 interakce s CTLA4 a/nebo CD28.
4. Použití solubilní CTLA4 molekuly pro výrobu farmaceutické kompozice pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství přibližně od 0,5 do 100 mg/kg hmotnosti jedince, 0,5 mg/kg hmotnosti jedince, 2 mg/kg hmotnosti jedince, 10 mg/kg hmotnosti jedince, přibližně od 0,5 do 10 mg/kg hmotnosti jedince nebo přibližně od 0,1 do 20 mg/kg hmotnosti jedince, pro léčení onemocnění imunitního systému.
5. Použití podle nároku 1 nebo 3, kde blokující B7 interakce s CTLA4 a/nebo CD28 reguluje produkci cytokinu.
6. Použití podle nároku 1 nebo 3, kde blokující B7 interakce s CTLA4 a/nebo CD28 zlepšuje ACR 20, 50 a/nebo 70 odezvu krys.
7. Použití podle nároku 2 nebo 4, kde léčení onemocnění imunitního systému reguluje produkci cytokinu.
8. Použití podle nároku 2 nebo 4, kde léčení onemocnění imunitního systému zlepšuje ACR 20, 50 a/nebo 70 odezvu krys.
9. Použití podle nároku 1, 2, 3 nebo 4, kde solubilní CTLA4 molekula zahrnuje extracelulární doménu CTLA4 molekuly, která se váže na B7 antigen exprimovaný na aktivovaných B buňkách.
10. Použití podle nároku 9, kde extracelulární doména CTLA4 molekuly zahrnuje aminokyseliny znázorněné na obr. 23 (SEQ ID • * ♦ « · · » c · ···· · · · ·3 • » ♦ · · · · ····
NO: 17) počínaje methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a konče kyselinou asparagovou v pozici +124 aminokyselinové sekvence extracelulární domény CTLA4 molekuly.
11. Použití podle nároku 1, 2, 3 nebo 4, kde solubilní CTLA4 molekulou je CTLA 4 fúzní molekula.
12. Použití podle nároku 11, kde CTLA4 fúzní molekula zahrnuje extracelulární doménu CTLA4 molekuly, která se váže na B7 antigen exprimovaný na aktivovaných B buňkách připojených k non-CTLA4 molekule.
13. Použití podle nároku 12, kde non-CTLA4 molekula zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která mění solubilitu nebo afinitu solubilní CTLA4 molekuly.
14. Použití podle nároku 13, kde aminokyselinová sekvence, která mění solubilitu nebo afinitu, zahrnuje imunoglobulinovou část.
15. Použití podle nároku 14, kde imunoglobulinovou částí je imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část.
16. Použití podle nároku 15, kde imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část je mutován pro redukci efektorových funkcí.
17. Použití podle nároku 14, kde imunoglobulinová část obsahuje jednu nebo více mutací pro redukci efektorových funkcí.
18. Použití podle nároku 15, kde imunoglobulinový konstantní * · · · » · • ···· · ··« • · ··· ·«·· region obsahuje pantové, CH2 a CH3 regiony imunoglobulinové molekuly.
19. Použití podle nároku 15, kde imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část je lidský nebo opičí imunoglobulinový konstantní region.
20. Použití podle nároku 1, 2, 3 nebo 4, kde solubilní CTLA4 dále zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která dovoluje sekreci solubilní CTLA4 molekuly.
21. Použití podle nároku 20, kde aminokyselinová sekvence, která dovoluje sekreci, zahrnuje signální peptid onkostatinu
M.
22. Použití podle nároku 11, kde CTLA4 fúzní molekulou je CTLA4Ig.
23. Použití podle nároku 22, kde CTLA4Ig začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na obr. 24 (SEQ ID NO: 19).
24. Použití podle nároku 1, 2, 3 nebo 4, kde solubilní CTLA4 molekulou je solubilní CTLA4 mutantní molekula.
25. Použití podle nároku 24, kde solubilní CTLA4 mutantní molekula se váže na B7 antigen exprimovaný na aktivovaných B buňkách a zahrnuje mutaci v extracelulámí doméně CTLA4 molekuly.
26. Použití podle nároku 24, kde solubilní CTLA4 mutantní molekula zahrnuje extracelulámí doménu CTLA4,
a) kde extracelulární doména CTLA4 začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je ukázáno na obr. 23 nebo 24 (SEQ ID NO: 17 nebo 19) a
b) kde v pozici +104 extracelulární domény CTLA4 je leucin substituován jakoukoli jinou aminokyselinou.
27. Použití podle nároku 24, kde solubilní CTLA4 mutantní molekula zahrnuje extracelulární doménu CTLA4,
a) kde extracelulární doména CTLA4 začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je ukázáno na obr. 23 nebo 24 (SEQ ID NO: 17 nebo 19) a
b) kde v pozici +104 extracelulární domény CTLA4 je leucin substituován glutamovou kyselinou a
c) kde v pozici +29 extracelulární domény CTLA4 je alanin substituován tyrosinem.
28. Použití podle nároku 24, kde solubilní CTLA4 mutantní molekulou je L104EA29YIg, jak je uvedeno na obr. 19 (SEQ ID NO: 9), začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na obr. 19 (SEQ ID NO: 9).
29. Použití kombinace solubilní CTLA4 a druhého činidla, přičemž
a) solubilní CTLA4 je CTLA4Ig začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící lysinem v pozici # 4 ····· « • « ♦·· ··· • · · · · * • « b · ·· »·· +357, jak je ukázáno na obr. 24 (SEQ ID NO: 19) a
b) druhé činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení onemocnění imunitního systému.
30. Použití kombinace solubilní CTLA4 a druhého činidla, přičemž
a) solubilní CTLA4 zahrnuje extracelulární doménu CTLA4 molekuly, jak je znázorněno na obr. 23 (SEQ ID NO: 17), začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící asparagovou kyselinou v pozici +124 a
b) druhé činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení onemocnění imunitního systému.
31. Použití kombinace solubilní CTLA4 a druhého činidla, přičemž
a) solubilní CTLA4 je CTLA4 mutantní molekula, která se váže na B7 molekulu, zahrnující mutaci v pozici +104 CTLA4, kde lecitin v pozici +104, jak je znázorněno na obr. 23 (SEQ ID NO: 17), je substituován glutamovou kyselinou a mutaci v pozici +29 CTLA4, kde alanin v pozici +29, jak je znázorněno na obr. 23 (SEQ ID NO: 17), je substituován tyrosinem, a
b) druhé činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení onemocnění imunitního systému.
32. Použití kombinace solubilní CTLA4 a druhého činidla, přičemž
a) solubilní CTLA4 je L104EA29YIg začínající methioninem v pozici +1 nebo alanínem v pozici -1 a končící lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na obr. 19 (SEQ ID NO: 9) a
b) druhé činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid, pro výrobu farmaceutické kompozice pro léčení onemocnění • · · · « · » · · · · • · · · imunitního systému.
33. Použití podle nároku 2, 6, 29, 30, 31 nebo 32, kde onemocněním imunitního systému je onemocnění revmatické.
34. Použití podle nároku 33, kde revmatickým onemocněním je revmatoidní artritida.
35. Použití podle nároku 2, 4, 29, 30, 31 nebo 32, kde onemocnění imunitního systému je zvoleno z autoimunitních onemocnění, imunitních onemocnění souvisejících s reakcí štěpu při transplantaci, psoriasy, T-lymfocytárního lymfomu, T-lymfocytární akutní lymfoblastické leukemie, testikulárního angiocentrického T-lymfocytárního lymfomu, benigní lymfocytární angiitidy, lupus erythematosus, Hashimotovy thyroiditidy, primárního myxedemu, Gravesovy nemoci, perniciosní anemie, autoimunní atrofické gastritidy, Addisonovy nemoci, insulin dependentního diabetes mellitus, Goodpasteurova syndromu, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnovy nemoci, sympathetické ophthalmie, autoimunního uveitis, roztroušené sklerosy, autoimunní hemolytické anemie, idiopatické trombocytopenie, primární biliární cirhosy, chronické hepatitidy, ulcerosni colitidy, Sjogrenova syndromu, revmatického onemocnění, revmatoidní artritidy, polymyositidy, sclerodermie, smíšeného onemocnění pojivové tkáně, zánětlivého revmatizmu, degenerativního revmatizmu, extraartikulárního revmatizmu, kolagenosy, chronické polyartritidy, psoriasis artropathica, ankylosující spondylitidy, juvenilní revmatoidní artritidy, panarteriitis nodosa, systémového lupus erythematodes, progresivní systémové sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondrokalcinosis, dermatomyositidy, svalového revmatizmu, myositidy a myogelosis.
• ·
36. Použití podle nároku 2, 4, 29, 30, 31 nebo 32, kde onemocněním imunitního systému je zvoleno z poruchy asociované se štěpem, chronické rejekce, tkáňovými nebo buněčnými allo- nebo xenoimplantáty, kožními allo- nebo xenoimplantáty, allo- nebo xenoimplantáty ostrůvků pankreatu, allo- nebo xenoimplantáty svalů, allo- nebo xenoimplantáty hepatocytů a allo- nebo xenoimplantáty neuronů.
37. Použití podle nároku 2, 4, 29, 30, 31 nebo 32, kde se zmírňují příznaky asociované s onemocněním imunitního systému a kde příznaky jsou zvoleny ze souboru zahrnujícího otoku kloubů, bolest kloubů, citlivost kloubů, ranní ztuhlost, strukturální postižení, zvýšené sérové koncentrace
C-reaktivního proteinu, zvýšené koncentrace solubilního IL-2r, zvýšené koncentrace solubilního ICAM-1, zvýšené koncentrace solubilního E-selektinu a zvýšené rychlosti sedimentace erytrocytů.
38. Použití podle nároku 2, 4, 29, 30, 31 nebo 32 pro navození patofyziologické změny asociované s onemocněním imunitního systému.
39. Použití podle nároku 38, kde patofyziologickou změnou asociovanou s onemocněním imunitního systému je snižováno strukturální postižení.
40. Použití podle nároku 1, 2, 29, 30, 31 nebo 32 pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství mezi přibližně 0,5 a 100 mg/kg hmotnosti jedince.
41. Použití podle nároku 1, 2, 29, 30, 31 nebo 32 pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství 0,5 mg/kg hmotnosti jedince.
42. Použití podle nároku 1, 2, 29, 30, 31 nebo 32 pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství 2 mg/kg hmotnosti jedince.
43. Použití podle nároku 1, 2, 29, 30, 31 nebo 32 pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství 10 mg/kg hmotnosti jedince.
44. Použití podle nároku 1, 2, 29, 30, 31 nebo 32 pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství mezi přibližně 0,5 a 10 mg/kg hmotnosti jedince.
45. Použití podle nároku 1, 2, 29, 30, 31 nebo 32 pro podávání jedinci solubilní CTLA4 v množství mezi přibližně 0,1 a 20 mg/kg hmotnosti jedince.
46. Použití solubilní CTLA4 mutantní molekuly, zahrnující sekvenci znázorněnou na obr. 19 (SEQ ID NO: 9) počínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a konče kyselinou asparagovou v pozici +124, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, které je zvoleno z autoimunitních onemocnění, imunitních onemocnění souvisejících s reakcí štěpu při transplantaci, psoriasy, T-lymfocytárního lymfomu, T-lymfocytární akutní lymfoblastické leukemie, testikulárního angiocentrického T-lymfocytárního lymfomu, benigní lymfocytární angiitidy, lupus erythematosus, Hashimotovy thyroiditidy, primárního myxedemu, Gravesovy nemoci, perniciosní anemie, autoimunní atrofické gastritidy, Addisonovy nemoci, insulin dependentního diabetes mellitus, Goodpasteurova syndromu, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnovy nemoci, sympathetické ···· · · · ··· · · · • · · » · · · • · ···· · ·· • · · · · · · ·· ophthalmie, autoimunního uveitis, roztroušené sklerosy, autoimunní hemolytické anemie, idiopatické trombocytopenie, primární biliární cirhosy, chronické hepatitidy, ulcerosní colitidy, Sjogrenova syndromu, revmatického onemocnění, revmatoidní artritidy, polymyositidy, sclerodermie, smíšeného onemocnění pojivové tkáně, zánětlivého revmatizmu, degenerativního revmatizmu, extraartikulárního revmatizmu, kolagenosy, chronické polyartritidy, psoriasis artropathica, ankylosující spondylitidy, juvenilní revmatoidní artritidy, panarteriitis nodosa, systémového lupus erythematodes, progresivní systémové sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondrokalcinosis, dermatomyositidy, svalového revmatizmu, myositidy a myogelosis.
47. Použití solubilní CTLA4 mutantní molekuly L104EA29YIg, zahrnující sekvenci znázorněnou na obr. 19 (SEQ ID NO: 9) počínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a konče kyselinou asparagovou v pozici +357, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, které je zvoleno z autoimunitních onemocnění, imunitních onemocnění souvisejících s reakcí štěpu při transplantaci, psoriasy, T-lymfocytárního lymfomu, T-lymfocytární akutní lymfoblastické leukemie, testikulárního angiocentrického T-lymfocytárního lymfomu, benigní lymfocytární angiitidy, lupus erythematosus, Hashiraotovy thyroiditidy, primárního myxedemu, Gravesovy nemoci, perniciosní anemie, autoimunní atrofické gastritidy, Addisonovy nemoci, insulin dependentního diabetes mellitus, Goodpasteurova syndromu, myasthenia gravis, pemphigus, Crohnovy nemoci, sympathetické ophthalmie, autoimunního uveitis, roztroušené sklerosy, autoimunní hemolytické anemie, idiopatické trombocytopenie, primární biliární cirhosy, chronické hepatitidy, ulcerosní colitidy, Sjogrenova syndromu, revmatického onemocnění, revmatoidní artritidy, polymyositidy, sclerodermie, smíšeného onemocnění pojivové tkáně, zánětlivého revmatizmu, degenerativního revmatizmu, extraartikulárního revmatizmu, kolagenosy, chronické polyartritidy, psoriasis artropathica, ankylosující spondylitidy, juvenilní revmatoidní artritidy, panarteriitis nodosa, systémového lupus erythematodes, progresivní systémové sklerodermie, periartritis humeroscapularis, artritis uratica, chondorkalcinosis, dermatomyositidy, svalového revmatizmu, myositidy a myogelosis.
48. Použití solubilní CTLA4 mutantní molekuly, mající sekvenci znázorněnou na obr. 19 (SEQ ID NO: 9) počínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a konče kyselinou asparagovou v pozici +124, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, které je zvoleno z poruchy asociované se štěpem, chronické rejekce, tkáňovými nebo buněčnými allo- nebo xenoimplantáty, kožními allo- nebo xenoimplantáty, allo- nebo xenoimplantáty ostrůvků pankreatu, allo- nebo xenoimplantáty svalů, allo- nebo xenoimplantáty hepatocytů a allo- nebo xenoimplantáty neuronů.
49. Použití solubilní CTLA4 mutantní molekuly L104EA29YIg, mající sekvenci znázorněnou na obr. 19 (SEQ ID NO: 9) počínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a konče kyselinou asparagovou v pozici +357, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění, které je zvoleno z poruchy asociované se štěpem, chronické rejekce, tkáňovými nebo buněčnými allo- nebo xenoimplantáty, kožními allo- nebo xenoimplantáty, allo- nebo xenoimplantáty ostrůvků pankreatu, allo- nebo xenoimplantáty svalů, allo- nebo • · · · xenoimplantáty hepatocytů a allo- nebo xenoimplantáty neuronů.
50. Použití podle nároku 46 nebo 47, pro léčení revmatického onemocnění.
51. Použití podle nároku 46, 47, 48 nebo 49 pro podávání jedinci solubilní CTLA4 mutantní molekuly v množství mezi přibližně 0,5 a 100 mg/kg hmotnosti jedince, 0,5 mg/kg hmotnosti jedince, 2 mg/kg hmotnosti jedince, 10 mg/kg hmotnosti jedince, mezi přibližně 0,5 a 10 mg/kg hmotnosti jedince nebo mezi přibližně 0,1 a 20 mg/kg hmotnosti jedince.
52. Použití podle nároku 46, 47, 48 nebo 49, kde léčení onemocnění imunitního systému reguluje produkci cytokinu.
53. Použití podle nároku 46, 47, 48 nebo 49, kde léčení onemocnění imunitního systému zlepšuje ACR 20, 50 a/nebo 70 odezvu krys.
54. Použití podle nároku 46, 47, 48 nebo 49, kde solubilní CTLA4 molekula zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která dovoluje sekreci solubilní CTLA4 mutantní molekuly.
55. Použití podle nároku 54, kde aminokyselinová sekvence, která dovoluje sekreci, zahrnuje signální peptid onkostatinu
M.
56. Použití podle nároku 1, 2, 3, 4, 29, 30, 31, 32, 46, 47, 48 nebo 49, pro lokální nebo systémové podávání činidla.
57. Použití podle nároku 56, kde podávání je zvoleno ze souboru zahrnujícího intravenosní, intramuskulární, ···· · · · · · · · · · subkutánní podávání, podávání implantovatelnou pumpou, kontinuální infúzní podávání, podávání genovou terapii, lipososomální a orální podávání.
58. Použití podle nároku 1, 2, 3, 4, 29, 30, 31, 32, 46, 47, 48 nebo 49, pro léčení jedince, který je vybrán ze souboru zahrnujícího člověka, opice, lidoopy, psi, kočky, dobytek, koně, králíky, myši a krysy.
59. Použití podle nároku 22 nebo 29, kde CTLA4Ig je kódován molekulou nukleové kyseliny s označením ATCC č. 68629.
60. Použití podle nároku 32, 47 nebo 49, kde L104EA29YIg je kódován DNA sekvencí s označením ATCC PTA-2104.
61. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a účinné množství prvního činidla a druhého činidla, přičemž
a) prvním činidlem je solubilní CTLA4 molekula a
b) druhé činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexat, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept, anakinra, cyklofosfamid a leflunomid.
62. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyznačující se tím, že solubilní CTLA4 zahrnuje extracelulární doménu CTLA4 molekuly, která se váže na B7 antigen exprimovaný na aktivovaných B buňkách.
63. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyznačující se tím, že solubilní CTLA4 je CTLA4 fúzní molekula.
64. Farmaceutický prostředek podle nároku 63, vyznačující se tím, že CTLA4 fúzní molekula zahrnuje extracelulární doménu CTLA4 molekuly, která se váže na B7 antigen exprimovaný na aktivovaných B buňkách připojených k non-CTLA4 molekule.
65. Farmaceutický prostředek podle nároku 64, vyznačující se tím, že non-CTLA4 molekulou je alespoň část molekuly imunoglobulinu.
66. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyznačující se tím, že soluibilní CTLA4 molekula zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která mění solubilitu nebo afinitu CTLA4 molekuly.
67. Farmaceutický prostředek podle nároku 66, vyznačující se tím, že aminokyselinová sekvence, která mění solubilitu nebo afinitu, zahrnuje imunoglobulinovou část.
68. Farmaceutický prostředek podle nároku 67, vyzn ačující se tím, že imunoglobulinem je imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část.
69. Farmaceutický prostředek podle nároku 68, vyzn ačující se tím, že imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část je mutován pro redukci efektorových funkcí.
70. Farmaceutický prostředek podle nároku 68, vyzn aču- jící se tím, že imunoglobulinový konstantní region obsahuje pantové, CH2 a CH3 regiony ímunoglobulínové molekuly.
71. Farmaceutický prostředek podle nároku 68, vyznačující se tím, že imunoglobulinový konstantní region nebo jeho část je lidský nebo opičí imunoglobulinový konstantní region.
72. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyznačující se tím, že solubilní CTLA4 zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která dovoluje sekreci CTLA4 molekuly.
73. Farmaceutický prostředek podle nároku 72, vyznačující se tím, že aminokyselinová sekvence, která dovoluje sekreci, zahrnuje signální peptid onkostatinu M.
74. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyznačující se tím, že solubilní CTLA4 zahrnuje extracelulární doménu CTLA4, která začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je ukázáno na obr. 24 (SEQ ID NO: 19).
75. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyznačující se tím, že solubilní CTLA4 molekula je CTLA4Ig začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na obr. 24 (SEQ ID NO: 19) .
76. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyzn ačující se tím, že solubilním CTLA4 je solubilní CTLA4 mutantní molekula.
77. Farmaceutický prostředek podle nároku 76, vyznačující se tím, že solubilní CTLA4 mutantní molekula začíná methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končí kyselinou asparagovou v pozici +124, jak je ukázáno na obr. 19 (SEQ ID NO: 9).
78. Farmaceutický prostředek podle nároku 76, vyznačující se tím, že solubilní CTLA4 mutantní molekulou je L104EA29YIg, začínající methioninem v pozici +1 nebo alaninem v pozici -1 a končící lysinem v pozici +357, jak je ukázáno na obr. 19 (SEQ ID NO: 9).
79. Farmaceutický prostředek podle nároku 61, vyznačující se tím, že farmaceuticky přijatelný nosič je vybrán ze souboru zahrnujícího iontoměniče, kamenec, stearát hlinitý, lecitin, sérové proteiny, jako je lidský sérový albumin, pufrovací substance, glycin, kyselinu sorbovou, sorbát draselný, parciální glyceridové směsi nasycených rostlinných mastných kyselin, fosfátem pufrované salinické roztoky, vodu, emulze, soli nebo elektrolyty, koloidní oxid křemičitý, křemičitan hořečnatý, polyvinylpyrrolidon, substance na bázi celulosy, polyethylenglykol, sterilní roztoky, tablety, přísady, sacharosu, glukosu, maltosu, chuřová korigens a barviva, lipidové přípravky a polymerní přípravky.
80. Kombinace farmaceutického prostředku obsahujícího solubilní CTLA4 s farmaceutickým prostředkem, který zahrnuje činidlo vybrané ze souboru zahrnujícího kortikosteroidy, nesteroidní protizánětlivé léky, prednison, azathioprin, methotrexát, blokátory a antagonisty TNF-alfa, infliximab, jakákoliv biologická činidla ovlivňující prozánětlivý «· ···· cytokin, hydroxychlorochin, sulfasalazopryin, soli zlata, etanercept a anakinra, cyklofosfamid a leflunomid pro použití pro léčení.
CZ20024261A 2000-07-03 2001-07-02 Solubilní CTLA4 fúzní molekula, farmaceutický prostredek s jejím obsahem a její pouzití CZ303959B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21591300P 2000-07-03 2000-07-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20024261A3 true CZ20024261A3 (cs) 2004-08-18
CZ303959B6 CZ303959B6 (cs) 2013-07-17

Family

ID=22804919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20024261A CZ303959B6 (cs) 2000-07-03 2001-07-02 Solubilní CTLA4 fúzní molekula, farmaceutický prostredek s jejím obsahem a její pouzití

Country Status (39)

Country Link
US (1) US7455835B2 (cs)
EP (4) EP1372696B1 (cs)
JP (1) JP2004517806A (cs)
KR (3) KR20030017606A (cs)
CN (1) CN1318086C (cs)
AR (2) AR035037A1 (cs)
AT (1) ATE401909T1 (cs)
AU (2) AU2001273174B2 (cs)
BG (2) BG66024B1 (cs)
BR (1) BR0112104A (cs)
CA (2) CA2413190C (cs)
CY (3) CY1109786T1 (cs)
CZ (1) CZ303959B6 (cs)
DE (1) DE60135029D1 (cs)
DK (2) DK1935427T3 (cs)
EE (1) EE05378B1 (cs)
ES (2) ES2667203T3 (cs)
HK (1) HK1058486A1 (cs)
HR (1) HRP20030071B1 (cs)
HU (3) HU227669B1 (cs)
IL (2) IL153593A0 (cs)
IS (1) IS2834B (cs)
LT (2) LT1935427T (cs)
LV (1) LV12993B (cs)
MX (1) MXPA02012603A (cs)
MY (1) MY137552A (cs)
NO (3) NO20026264L (cs)
PE (1) PE20020772A1 (cs)
PL (2) PL212205B1 (cs)
PT (2) PT1372696E (cs)
RS (1) RS50811B (cs)
RU (1) RU2287340C2 (cs)
SI (3) SI1935427T1 (cs)
SK (1) SK287940B6 (cs)
TR (1) TR201807700T4 (cs)
TW (2) TWI322153B (cs)
UY (1) UY26815A1 (cs)
WO (1) WO2002002638A2 (cs)
ZA (1) ZA200210058B (cs)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
EP0892643B2 (en) * 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
UY26723A1 (es) * 2000-05-26 2001-12-28 Bristol Myers Squibb Co Moléculas mutantes de ctla4 solubles y usos de las mismas
KR20030007899A (ko) * 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
TWI322153B (en) * 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PL204899B1 (pl) 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4
WO2003088991A1 (en) * 2002-04-19 2003-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for treating an autoimmune disease using a soluble ctla4 molecule and a dmard or nsaid
WO2004058800A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
ES2354610T5 (es) * 2002-12-23 2020-09-14 Bristol Myers Squibb Co Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
BRPI0413326A (pt) * 2003-08-04 2006-10-10 Bristol Myers Squibb Co métodos para tratar doença cardiovasculares empregando-se uma molécula ctla4 solúvel
AU2004287431B2 (en) 2003-10-27 2010-03-11 Amgen Inc. Compositions and methods to modulate an immune response to an immunogenic therapeutic agent
US7815765B2 (en) * 2004-04-01 2010-10-19 Swei Mu Wang Method for forming laminated synthetic leather
US9309316B2 (en) 2005-12-20 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Stable subcutaneous protein formulations and uses thereof
AR058568A1 (es) 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
PL2253644T3 (pl) * 2005-12-20 2014-04-30 Bristol Myers Squibb Co Kompozycje i sposoby wytwarzania kompozycji
CN101822820A (zh) * 2005-12-20 2010-09-08 布里斯托尔—迈尔斯斯奎布公司 稳定蛋白质制剂
US7528111B2 (en) * 2006-05-12 2009-05-05 Bristol-Myers Squibb Company Method of vaccinating subjects receiving immune modulating therapy
GB0620934D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
AU2014250683B2 (en) * 2007-11-01 2015-11-26 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
EP2612868B1 (en) * 2007-11-01 2018-08-15 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
AU2012202324B2 (en) * 2007-11-01 2014-08-28 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) * 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
US8475790B2 (en) 2008-10-06 2013-07-02 Bristol-Myers Squibb Company Combination of CD137 antibody and CTLA-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
EP2365823B1 (en) * 2008-10-30 2016-11-30 Yeda Research And Development Company Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
EP2459251B1 (en) 2009-07-30 2014-03-12 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
CN102030828B (zh) * 2009-09-25 2014-10-29 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 一种高亲和力的CTLA4-Ig融合蛋白突变体
CN103038251B (zh) * 2010-02-19 2016-08-17 Xencor公司 新颖ctla4-ig免疫粘附素
KR20130049775A (ko) 2010-03-12 2013-05-14 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. Ｃｔｌａ４ 단백질 및 이의 용도
US9527912B2 (en) 2010-05-17 2016-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
CA2810631A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
CN103282047B (zh) 2010-09-08 2016-08-24 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
WO2013010537A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 Aarhus Universitet Method of treating morphea
CN103930130B (zh) 2011-09-08 2016-07-06 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
MX2015000237A (es) 2012-06-27 2015-08-14 Orban Biotech Llc Proteinas de fusion ctla4 para el tratamiento de la diabetes.
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
WO2014151230A2 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Bristol-Myers Squibb Company Method of treating granulomatosis with polyangiitis
CN104740608A (zh) * 2013-12-30 2015-07-01 上海中信国健药业股份有限公司 可溶性ctla4分子用于制备治疗类风湿性关节炎药物的用途
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
AU2015249656A1 (en) * 2014-04-25 2016-11-03 Bristol-Myers Squibb Company Use of CTLA4 compound for achieving drug-free remission in subjects with early RA
KR20240046641A (ko) 2015-04-17 2024-04-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 조율가능한 친화성을 갖는 면역조절 단백질
CA2991690A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory t cells and use of same in immunotherapy
EP3192805A1 (en) 2016-01-15 2017-07-19 Humanitas Mirasole S.p.A. Inhibitors of t cell activation or stimulation and uses thereof
MA43552A (fr) 2016-04-15 2018-11-07 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices à variants de cd80 et leurs utilisations
CN110392736A (zh) 2017-01-18 2019-10-29 耶达研究及发展有限公司 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
MA50360A (fr) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices de variants de ctla-4 et leurs utilisations
KR20200085777A (ko) 2017-10-18 2020-07-15 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 변이체 icos 리간드 면역조절 단백질 및 관련 조성물 및 방법
EP3765065A2 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from secretogranin v and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
WO2019175384A2 (en) 2018-03-16 2019-09-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from urocortin 3 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
EP3765064A1 (en) 2018-03-16 2021-01-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antigenic peptides deriving from pcsk2 and uses thereof for the diagnosis and treatment of type 1 diabetes
AU2020208909A1 (en) 2019-01-15 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Mutated interleukin-34 (IL-34) polypeptides and uses thereof in therapy
WO2023112992A1 (ja) * 2021-12-16 2023-06-22 レグセル株式会社 免疫系の異常に関連する疾患、障害または症状を処置するための医薬組成物

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US644792A (en) * 1899-09-14 1900-03-06 Stanhope Boal Heater.
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
DE3424893A1 (de) 1984-07-06 1986-02-06 Agfa-Gevaert Ag, 5090 Leverkusen Photographisches silberhalogenidaufzeichnungsmaterial
US6905680B2 (en) * 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6685941B1 (en) * 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
CA2003455C (en) * 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US7070776B1 (en) * 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5580756A (en) * 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6277969B1 (en) * 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
DE122007000078I2 (de) 1991-06-27 2011-01-13 Bristol Myers Squibb Co CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung
US5851795A (en) * 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5637481A (en) * 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6090914A (en) * 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
US5770197A (en) * 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US5624823A (en) * 1991-11-22 1997-04-29 The General Hospital Corporation DNA encoding procine interleukin-10
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection
JPH07508711A (ja) 1992-04-07 1995-09-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン Ｃｄ２８経路免疫調節
US5747034A (en) * 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
ATE293686T1 (de) 1993-06-04 2005-05-15 Us Navy Verfahren zur selektiven stimulierung der t- zellproliferation.
AU7107794A (en) 1993-06-10 1995-01-03 Regents Of The University Of Michigan, The Cd28 pathway immunosuppression
WO1995006481A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Trustees Of Dartmouth College Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance
RU2141318C1 (ru) * 1993-12-01 1999-11-20 Санкио Компани Лимитед Ингибитор образования воспалительного цитокина, средство для профилактики и лечения воспалительных заболеваний пищеварительного тракта и синдрома бехчета, способ профилактики и лечения воспалительных заболеваний и язвенного колита
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
AU1333195A (en) 1994-06-03 1996-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
US6719972B1 (en) * 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
AU2701895A (en) 1994-06-07 1996-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
US5634055A (en) * 1994-09-27 1997-05-27 Bidplus, Inc. Method for selecting assignments
WO1996014865A1 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Repligen Corporation Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
US5824655A (en) 1995-02-15 1998-10-20 The University Of Utah Anti-transforming growth factor-β gene therapy
US5993800A (en) * 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US6750334B1 (en) * 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
EP0892643B2 (en) * 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
JPH1067653A (ja) * 1996-06-17 1998-03-10 Eisai Co Ltd 関節疾患治療剤
US6495579B1 (en) * 1996-12-02 2002-12-17 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Method for treating multiple sclerosis
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
ZA98533B (en) 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
CA2291338A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive t lymphocyte mediated immune responses
EP0947524A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-06 Upither B.V. Novel peptides for the treatment of autoimmune diseases
PT1066060E (pt) * 1998-04-03 2003-12-31 Osiris Therapeutics Inc Celulas estaminais mesenquimais como imunossupressores
CA2333726A1 (en) * 1998-06-05 1999-12-09 Supergen, Inc. Compositions comprising methotrexate and pentostatin for treating rheumatoid arthritis
JP2000086519A (ja) * 1998-09-17 2000-03-28 Mitsui Chemicals Inc 抗リウマチ薬効果増強剤
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
US6040292A (en) * 1999-06-04 2000-03-21 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating diabetes
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
AU2001264936A1 (en) 2000-05-23 2001-12-03 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
UY26723A1 (es) * 2000-05-26 2001-12-28 Bristol Myers Squibb Co Moléculas mutantes de ctla4 solubles y usos de las mismas
US7094874B2 (en) 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
KR20030007899A (ko) * 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
US20040022787A1 (en) * 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
TWI322153B (en) * 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PL204899B1 (pl) * 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4

Also Published As

Publication number Publication date
EP1372696B1 (en) 2008-07-23
SK17742002A3 (sk) 2004-11-03
HRP20030071A2 (en) 2005-02-28
CY2008017I1 (el) 2009-11-04
YU101102A (sh) 2006-01-16
HUS1000008I1 (hu) 2019-06-28
RU2287340C2 (ru) 2006-11-20
EP1935427A2 (en) 2008-06-25
HRP20030071B1 (hr) 2014-01-03
EP1935427A3 (en) 2011-05-25
CY1120577T1 (el) 2019-07-10
US7455835B2 (en) 2008-11-25
IL153593A0 (en) 2003-07-06
WO2002002638A3 (en) 2003-10-30
KR20080075564A (ko) 2008-08-18
LT2003002A (en) 2003-07-25
SK287940B6 (sk) 2012-05-03
ATE401909T1 (de) 2008-08-15
BR0112104A (pt) 2004-07-20
KR100895552B1 (ko) 2009-04-29
TW200902546A (en) 2009-01-16
CZ303959B6 (cs) 2013-07-17
EP3384924A1 (en) 2018-10-10
CN1477968A (zh) 2004-02-25
HUP0301727A2 (hu) 2003-09-29
TWI311564B (en) 2009-07-01
DK1372696T3 (da) 2008-11-03
KR100864120B1 (ko) 2008-10-16
SI1935427T1 (en) 2018-05-31
HK1058486A1 (en) 2004-05-21
AU2001273174C1 (en) 2002-01-14
PT1372696E (pt) 2008-10-24
BG66454B1 (bg) 2014-10-31
LT1935427T (lt) 2018-05-10
SI1372696T1 (sl) 2008-12-31
EP2281568A2 (en) 2011-02-09
KR20080025216A (ko) 2008-03-19
SI21078A (sl) 2003-06-30
EE05378B1 (et) 2011-02-15
ES2310557T3 (es) 2009-01-16
CA2413190A1 (en) 2002-01-10
NO20100579L (no) 2003-02-19
AR035037A1 (es) 2004-04-14
PE20020772A1 (es) 2002-09-06
US20030083246A1 (en) 2003-05-01
NO20100580L (no) 2003-02-19
LT5063B (lt) 2003-11-25
EP1372696A2 (en) 2004-01-02
KR20030017606A (ko) 2003-03-03
DK1935427T3 (en) 2018-06-06
PT1935427T (pt) 2018-05-16
CY1109786T1 (el) 2011-04-06
WO2002002638A2 (en) 2002-01-10
DE60135029D1 (de) 2008-09-04
IS2834B (is) 2013-05-15
TR201807700T4 (tr) 2018-06-21
CN1318086C (zh) 2007-05-30
AU7317401A (en) 2002-01-14
LV12993B (en) 2003-10-20
MXPA02012603A (es) 2003-05-14
CY2008017I2 (el) 2016-08-31
EP1935427B1 (en) 2018-03-07
JP2004517806A (ja) 2004-06-17
PL207534B1 (pl) 2010-12-31
AU2001273174B2 (en) 2006-05-18
HUP0301727A3 (en) 2008-08-28
IL153593A (en) 2009-09-01
BG107362A (bg) 2003-09-30
MY137552A (en) 2009-02-27
CA2413190C (en) 2009-04-07
CA2630062A1 (en) 2002-01-10
BG66024B1 (bg) 2010-11-30
EE200300004A (et) 2004-10-15
ZA200210058B (en) 2005-02-23
HU227669B1 (en) 2011-11-28
CA2630062C (en) 2014-10-14
RS50811B (sr) 2010-08-31
IS6667A (is) 2003-01-02
TWI322153B (en) 2010-03-21
ES2667203T3 (es) 2018-05-10
PL365942A1 (en) 2005-01-24
HU226847B1 (en) 2009-12-28
EP2281568A3 (en) 2013-04-24
NO20026264L (no) 2003-02-19
PL212205B1 (pl) 2012-08-31
BG110611A (bg) 2010-05-31
NO20026264D0 (no) 2002-12-27
UY26815A1 (es) 2002-01-31
AR066511A2 (es) 2009-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210115107A1 (en) Methods of treatment using ctla4 molecules
EP1935427B1 (en) Uses of soluble CTLA4 mutant molecules
US9296808B2 (en) Methods for treating scleroderma by administering a soluble CTLA4 molecule
AU2001263466C1 (en) Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
AU2001273174A1 (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble CTLA4 molecule

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20221123